KR20190072663A - 약물이 고도로 로딩된 항체-약물 접합체 - Google Patents

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막달레나 도리왈스카
다비드 루치아노 폴레티
루쎌 조지 두쉰
데이비드 루이스 쉘톤
아르빈드 라즈팔
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리나트 뉴로사이언스 코프.
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Abstract

본 발명은 1) 글루타민-함유 태그, 내인성 글루타민, 및/또는 항체 조작 또는 조작된 트랜스글루타미나제 (예를 들어, 기질 특이성이 변경됨)에 의해 반응성이게 만들어진 내인성 글루타민; 및 2) 아민 공여체 단위, 링커, 및 작용제 모이어티를 포함하는 아민 공여체 작용제를 포함하는, 항체-약물 비 (DAR)가 높은 트랜스글루타미나제-매개 항체-약물 접합체로서, DAR이 적어도 약 5인 항체-약물 접합체를 제공한다. 본 발명은 이같은 더 고도로 약물이 로딩된 항체-약물 접합체의 제조 방법 및 사용 방법을 또한 제공한다.

Description

약물이 고도로 로딩된 항체-약물 접합체{ANTIBODY-DRUG CONJUGATES WITH HIGH DRUG LOADING}
관련 출원에 대한 교차-참조
본 출원은 미국 가출원 번호 61/984,645 (2014년 4월 25일 출원), 62/028,731 (2014년 7월 24일 출원), 62/103,999 (2015년 1월 15일 출원), 및 62/147,293 (2015년 4월 14일 출원)을 우선권 주장하고, 이들 모두는 이에 의해 전문이 참고로 포함된다.
서열 목록에 대한 참조
본 출원은 EFS-Web을 통해 전자 출원되고, .txt 양식의 전자 제출된 서열 목록을 포함한다. 이러한 .txt 파일은 2015년 4월 9일에 생성되고 크기가 9 KB인 파일명 "PC7207805SEQLISTING_ST25.txt"의 서열 목록을 함유한다. 이러한 .txt 파일에 함유된 서열 목록은 명세서의 일부이고, 전문이 본원에 참고로 포함된다.
분야
일반적으로 본 발명은 1) 글루타민-함유 태그, 내인성 글루타민, 및/또는 항체 조작 또는 조작된 트랜스글루타미나제 (예를 들어, 기질 특이성이 변경됨)에 의해 반응성이게 만들어진 내인성 글루타민; 및 2) 아민 공여체 단위, 링커 및 작용제 모이어티를 포함하는 아민 공여체 작용제를 포함하는, 약물-항체 비 (DAR)가 높은 트랜스글루타미나제-매개 항체-약물 접합체에 관한 것이다. 또한 본 발명은 이같은 항체-약물 접합체의 제조 방법 및 사용 방법에 관한 것이다.
배경
항체 요법은 다양한 장애, 예컨대 암 및 면역학적 질환에 걸린 환자에서 표적화된 치료적 처치를 제공하고, 따라서 생물학적 연구에서 중요한 역할을 해왔다. 항체-약물 접합체 (ADC)를 포함하는, 표적화된 항체 요법의 여러 접근법이 탐구되었다. 예를 들어, 문헌 [Doronina et al., Bioconj. Chem. 19:1960-1963 (2008)]; 및 [Junutula et al., Nat. Biotechnol. 26: 925-932 (2008)]을 참조한다.
항체-약물 접합체 (즉, 면역접합체)의 경우, 일반적으로 세포독성 소형 분자 (약물)가 약물 모이어티의 종양으로의 표적화된 국소 전달을 위해 항체에 연결 또는 접합된다. ADC를 위한 통상적인 접합 방법은 리신 측쇄 아민을 통한 또는 쇄간 디술피드 결합을 환원시킴으로써 활성화된 시스테인 술프히드릴 기를 통한 화학적 변형을 포함한다. 애드세트리스(ADCETRIS)® (브렌툭시맙 베도틴) 및 캐싸일라(KADCYLA)® (아도-트라스투주맙 엠탄신)은 이러한 통상적인 방법을 사용하는 ADC의 2가지 예이다. 예를 들어, 문헌 [Tanaka et al, FEBS Letters 579:2092-2096 (2005)]; 및 [Strop, Bioconj. Chem., (in press) (2014)]을 참조한다. 통상적인 ADC 접합 방법은 안전성 프로파일, 효능 및 소거율이 가변적인, 다양한 개수의 약물이 비-특이적 위치에서 부착된 비균질 혼합물이 산출되는 경향이 있다. 예를 들어, 문헌 [Wang et al., Protein Sci. 14: 2436-2446 (2005); 및 [Firer and Gellerman, J. of Hematology & Oncology, 5:70 (2012)]을 참조한다. 더 높은 치료 지수를 초래하는 생체-내 효능, 내약성 및 약동학의 관점에서 항체 당 2개 내지 4개의 약물이 있는 ADC가, 더 많이 로딩된 접합체 (예를 들어, 항체 당 4개를 초과하는 약물)보다 일반적으로 우수한 것으로 보고되었다. 예를 들어, 문헌 [Hamblett et al., Clinical Cancer Research, 10: 7063-7070 (2004)]을 참조한다.
항체-약물 접합체를 제조하기 위해 트랜스글루타미나제를 사용하는 효소 접근법이 최근에 또한 탐구되었다. 트랜스글루타미나제 (EC2.3.2.13; 단백질-글루타민:감마-글루타밀트랜스퍼라제; 단백질-글루타민:아민 γ-글루타밀트랜스퍼라제; CAS 80146-85-6)는 1급 아민에 대한 아실 부가를 촉매하는 효소들의 패밀리에 속하고, 여기서 펩티드에 결합된 γ-글루타밀 잔기의 감마-카르복사미드 기는 아실 공여체이고, 1급 아민은 아실 수용체 및 아민 공여체이다. 트랜스글루타미나제를 이용한 항체 및 약물 접합은 높은 선택성, 단순화된 반응 절차, 및 순한 반응 조건의 장점을 제공한다. 예를 들어, 문헌 [Strop et al., Chemistry & Biology, 20:161-167 (2013)]; 및 [Farias et al., Bioconj. Chem. 25(2):240-250 (2014)]을 참조한다. US20130230543 및 US2013/0122020은 항체 및 소형 분자의 트랜스글루타미나제-매개 부위-특이적 접합을 기술한다.
본원에서 인용된 모든 간행물, 특허, 및 특허 출원은 이에 의해 각각의 개별적인 간행물, 특허 및 특허 출원이 참조로 포함되는 것으로 구체적으로 및 개별적으로 지시된 것과 동일한 정도로 모든 목적을 위해 전문이 본원에 참조로 포함된다. 포함된 문헌 및 유사한 자료 중 하나 이상이 정의된 용어, 용어 용법, 기술된 기법 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는 본 출원과 상이하거나 모순되는 경우, 본 출원이 우선한다.
개요
일반적으로 본 발명은 1) 글루타민-함유 태그, 내인성 글루타민 (즉, 조작되지 않은 천연 글루타민, 예컨대 가변 도메인, CDR 등 내의 글루타민), 및/또는 항체 조작 또는 조작된 트랜스글루타미나제 (예를 들어, 기질 특이성이 변경됨)에 의해 반응성이게 만들어진 내인성 글루타민; 및 2) 아민 공여체 단위, 링커 및 작용제 모이어티를 포함하는 아민 공여체 작용제를 포함하는, 약물-항체 비 (DAR)가 높은 트랜스글루타미나제-매개 부위-특이적 항체-약물 접합체 (ADC)에 관한 것이다. 본 발명가들은 이러한 더 고도로 로딩된 부위-특이적 ADC (예를 들어, 적어도 5 이상의 DAR)가 말레이미드 결합을 이용하는 통상적인 더 고도로 로딩된 ADC와 비교하여 생체-내 효능이 더 높고 비-특이적 시험관-내 세포독성이 더 적다는 것을 뜻밖에 발견하였다. 본 발명가들은 이러한 더 고도로 로딩된 부위-특이적 ADC가 1) 마우스에서 비-접합 야생형 항체와 약동학 프로파일이 유사하고, 래트에서 약동학 프로파일이 개선되며, 2) 유사하게 로딩된 통상적인 ADC와 비교하여 필적하는 안전성 프로파일을 유지한다는 것을 추가로 발견하였다.
한 측면에서, 본 발명은 식 항체-(T-(X-Y-Za)b)c를 포함하는 ADC [식 중, T는 1) 특이적 부위에서 조작된 글루타민-함유 태그, 2) 내인성 글루타민, 및/또는 3) 항체 조작 또는 조작된 트랜스글루타미나제에 의해 반응성이게 만들어진 내인성 글루타민이고; X는 아민 공여체 단위이고; Y는 링커이며; Z는 작용제 모이어티이고; X-Y-Z는 글루타민-함유 태그, 내인성 글루타민 및/또는 반응성 내인성 글루타민에 부위-특이적으로 접합된 아민 공여체 작용제이고; a는 1 내지 6의 정수이고; b는 1 내지 6의 정수이고; c는 1 내지 20의 정수이며; a, b, 및 c의 곱 (약물-항체 비)은 적어도 약 5이다]를 제공한다.
일부 실시양태에서, 항체-(T-(X-Y-Za)b)c의 T는 적어도 1개의 내인성 글루타민 (예를 들어, 천연 또는 반응성 내인성 글루타민)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 반응성 내인성 글루타민은 탈글리코실화 (예를 들어, 효소에 의한 탈글리코실화)에 의해 또는 항체 내의 또 다른 아미노산의 아미노산 변형 (예를 들어, 위치 297에서의 아미노산 치환 예컨대 N297Q 또는 N297A (EU 넘버링 체계))에 의해 반응성이게 만들어진다.
일부 실시양태에서, 본 발명에서의 ADC (예를 들어, 더 고도로 로딩된 트랜스글루타미나제-매개 ADC)의 항체는 위치 K222, K340, 및/또는 K370에서의 제2 아미노산 변형 (예를 들어, K222R, K340R, 및/또는 K370R)을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, ADC의 아민 공여체 작용제 (X-Y-Z)는 1) 경쇄, 중쇄, 또는 경쇄 및 중쇄 양쪽 모두 중 어느 것의 카르복실 말단; 2) 경쇄, 중쇄, 또는 경쇄 및 중쇄 양쪽 모두 중 어느 것의 아미노 말단; 및 3) S60-R61, R108, T135, S160, S168, S190-S192, P189-S192, G200-S202, K222-T225, K222-T223, T223, L251-S254, M252-I253, E294-N297, E293-N297, N297, 및/또는 G385 (예를 들어, 표 1에 열거된 바와 같음) (여기서 글루타민-함유 태그는 항체 내에 삽입되거나 또는 항체 내의 하나 이상의 내인성 아미노산을 교체함)로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나 이상의 위치의 글루타민-함유 태그에 부위-특이적으로 접합된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 ADC는 a) 아민 공여체 작용제 (X-Y-Z)가 위치 295의 내인성 글루타민 및 위치 297의 치환된 글루타민에 부위-특이적으로 접합되는, 위치 N297Q 및 K222R에서의 아미노산 치환; 및 b) 아민 공여체 작용제가 항체의 경쇄의 카르복실 말단의 글루타민-함유 태그(들)에 부위-특이적으로 접합되는, 하나 이상의 글루타민-함유 태그를 포함하고, 약물-항체 비가 약 5-7이다. 일부 실시양태에서, 아민 공여체 작용제가 S60-R61, R108, T135, S160, S168, S190-S192, P189-S192, G200-S202, K222-T225, K222-T223, T223, L251-S254, M252-I253, E294-N297, E293-N297, N297, 및 G385로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 위치의 글루타민-함유 태그 (예를 들어, 표 1에 열거된 바와 같음) (여기서 글루타민-함유 태그는 항체 내에 삽입되거나 또는 항체 내의 하나 이상의 내인성 아미노산을 교체함)에 추가로 부위-특이적으로 접합되고, 약물-항체 비는 적어도 약 6이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 아민 공여체 작용제가 항체 중쇄 내의 아미노산 위치 T135 뒤에 삽입된 글루타민-함유 태그에 추가로 부위-특이적으로 접합되고, 약물-항체 비는 약 6-9이다. 다른 실시양태에서, 아민 공여체 작용제가 항체 경쇄 내의 아미노산 위치 G200-S202의 글루타민-함유 태그 (여기서 내인성 아미노산 잔기가 글루타민-함유 태그로 교체됨)에 추가로 부위-특이적으로 접합되고, 약물-항체 비는 약 6-11이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 ADC는 a) 항체의 경쇄의 카르복실 말단; b) 항체 중쇄 내의 아미노산 위치 T135 뒤; 및 c) 항체 경쇄 내의 아미노산 위치 G200-S202 (여기서 내인성 아미노산 잔기가 글루타민-함유 태그로 교체됨)의 글루타민-함유 태그에 부위-특이적으로 접합된 아민 공여체 작용제를 포함하고, 약물-항체 비가 약 5-7이다.
일부 실시양태에서, 아민 공여체 작용제 (X-Y-Z)는 알렉사(Alexa) 488 카다베린, 5-FITC 카다베린, 알렉사 647 카다베린, 알렉사 350 카다베린, 5-TAMRA 카다베린, 5-FAM 카다베린, SR101 카다베린, 5,6-TAMRA 카다베린, 5-FAM 리신, Ac-Lys-Gly (아세틸-리신-글리신)-MMAD, 아미노-PEG3-C2-MMAD, 아미노-PEG6-C2-MMAD, 아미노-PEG3-C2-아미노-노나노일-MMAD, 아미노카프로일-Val-Cit-PABC-MMAD, 아미노-PEG3-C2-Val-Cit-PABC-MMAD, 아미노-PEG6-C2-Val-Cit-PABC-MMAD, Ac-Lys-Val-Cit-PABC (아세틸-리신-발린-시트룰린-p-아미노벤질옥시카르보닐)-MMAD, 아미노카프로일-MMAD, Ac-Lys-β-Ala-MMAD, 아미노-PEG2-C2-MMAE, 아미노카프로일-MMAE, 아미노-PEG3-C2-MMAE, 아미노카프로일-MMAF, 아미노카프로일-Val-Cit-PABC-MMAE, 아미노-PEG-6-C2-Val-Cit-PABC-MMAE, Ac-Lys-Val-Cit-PABC-MMAE, 아미노카프로일-Val-Cit-PABC-MMAF, 아미노-PEG-6-C2-Val-Cit-PABC-MMAF, Ac-Lys-Val-Cit-PABC-MMAF, 아미노-PEG6-C2-Val-Cit-PABC-0101, Ac-Lys-Val-Cit-PABC-0101, 푸트레시닐-겔다나마이신, Ac-Lys-푸트레시닐-겔다나마이신, 아미노카프로일-3377, 아미노-PEG6-C2-3377, 아미노카프로일-0131, 아미노-PEG6-C2-0131, [(3R,5R)-1-{3-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]프로파노일}피페리딘-3,5-디일]비스-Val-Cit-PABC-MMAD, [(3R,5R)-1-{3-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]프로파노일}피페리딘-3,5-디일]비스-Val-Cit-PABC-MMAE, 2-아미노에톡시-PEG6-NODAGA, 및 N-2-아세틸-L-리실-L-발릴-N~5~-카르바모일-N-[4-({[(2-{[(3R,5S,7R,8R)-8-히드록시-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-히드록시펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]아세틸}히드라지닐)카르보닐]옥시}메틸)페닐]-L-오르니틴아미드로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 아민 공여체 작용제는 반응성 아민 및 작용제 모이어티를 포함하는 생체적합성 중합체이다.
일부 실시양태에서, 아민 공여체 단위-링커 (X-Y)는 선형 또는 분지형이다. 일부 실시양태에서, X-Y는 Ac-Lys-Gly, 아미노카프로산, Ac-Lys-β-Ala, 아미노-PEG2-C2, 아미노-PEG3-C2, 아미노-PEG6-C2, Ac-Lys-Val-Cit-PABC, 아미노-PEG6-C2-Val-Cit-PABC, 아미노카프로일-Val-Cit-PABC, [(3R,5R)-1-{3-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]프로파노일}피페리딘-3,5-디일]비스-Val-Cit-PABC, [(3S,5S)-1-{3-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]프로파노일}피페리딘-3,5-디일]비스-Val-Cit-PABC, 푸트레신, 및 Ac-Lys-푸트레신으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 작용제 모이어티 (Z)는 안트라시클린, 오리스타틴, 캄프토테신, 콤브레타스타틴, 돌라스타틴, 듀오카르마이신, 엔다이인, 겔다나마이신, 인돌리노-벤조디아제핀 이량체, 메이탄신, 퓨로마이신, 피롤로벤조디아제핀 이량체, 탁산, 빈카 알칼로이드, 튜불리신, 헤미아스테를린, 스플라이세오스타틴, 플라디에놀리드, 및 이들의 입체이성질체, 동배체, 유사체 또는 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 세포독성제이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 평균 약물-항체 비가 적어도 약 5.0인, 다수의 본원에 기술된 바와 같은 더 고도로 로딩된 ADC를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 한 변형에서, 적어도 하나의 ADC가 본원에 기술된 바와 같은 더 고도로 로딩된 ADC이고, 평균 약물-항체 비가 적어도 약 4.1인, 다수의 ADC를 포함하는 제약 조성물이 제공된다. 또 다른 변형에서, 본 발명은 본원에 기술된 바와 같은 더 고도로 로딩된 ADC 및 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 a) 항체 및 글루타민-함유 태그, 내인성 글루타민이 있는 항체, 및/또는 반응성 내인성 글루타민이 있는 항체를 포함하는 항체-T 분자를 제공하는 단계; b) 트랜스글루타미나제의 존재 하에 아민 공여체 단위, 링커 및 작용제 모이어티를 포함하는 아민 공여체 작용제 (X-Y-Z)를 항체-T 분자와 접촉시키는 단계; 및 c) 항체-T가 아민 공여체 작용제에 공유결합으로 연결되게 하여, 항체-약물 접합체를 형성시키는 단계를 포함하는, 본원에 기술된 바와 같은 ADC를 제조하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 접합체의 접합 효율은 적어도 약 51％이다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 방법은 ADC가 크로마토그래피 단계에 의해 정제되는 정제 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 트랜스글루타미나제는 미생물 트랜스글루타미나제, 정제된 트랜스글루타미나제, 또는 조작된 트랜스글루타미나제이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기술된 바와 같은 ADC를 포함하는 유효량의 제약 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 암 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기술된 바와 같은 ADC를 포함하는 유효량의 제약 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 종양 성장 또는 진행의 억제를 필요로 하는 대상체에서 종양 성장 또는 진행을 억제하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 a) ADC와 암-관련 단백질의 결합을 초래하는 조건 하에 대상체의 샘플을 본원에 기술된 바와 같은 ADC와 접촉시키는 단계, 및 b) 암-관련 단백질에 대한 ADC의 결합을 결정하는 단계를 포함하는, 암을 앓고 있는 것으로 추정되는 대상체에서 암을 진단하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 바와 같은 ADC 내의 항체는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 이중특이적 항체, 미니바디(minibody), 디아바디(diabody), 또는 항체 단편이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 바와 같은 ADC 내의 글루타민-함유 태그는 Q, LQG, LLQGG (서열식별번호(SEQ ID NO): 1), LLQG (서열식별번호: 2), LSLSQG (서열식별번호: 3), GGGLLQGG (서열식별번호: 4), GLLQG (서열식별번호: 5), LLQ, GSPLAQSHGG (서열식별번호: 6), GLLQGGG (서열식별번호: 7), GLLQGG (서열식별번호: 8), GLLQ (서열식별번호: 9), LLQLLQGA (서열식별번호: 10), LLQGA (서열식별번호: 11), LLQYQGA (서열식별번호: 12), LLQGSG (서열식별번호: 13), LLQYQG (서열식별번호: 14), LLQLLQG (서열식별번호: 15), SLLQG (서열식별번호: 16), LLQLQ (서열식별번호: 17), LLQLLQ (서열식별번호: 18), LLQGR (서열식별번호: 19), LLQGPP (서열식별번호: 20), LLQGPA (서열식별번호: 21), GGLLQGPP (서열식별번호: 22), GGLLQGA (서열식별번호: 23), LLQGPGK (서열식별번호: 25), LLQGPG (서열식별번호: 26), LLQGP (서열식별번호: 27), LLQP (서열식별번호: 28), LLQPGK (서열식별번호: 29), LLQAPGK (서열식별번호: 30), LLQGAPG (서열식별번호: 31), LLQGAP (서열식별번호: 32), 및 LLQLQG (서열식별번호: 36)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
도면의 간단한 설명
도 1은 DAR 7.2의 통상적으로 접합된 ADC에 비교하여 고도로 표적을 발현하는 BxPC3 세포에서의 증가성 DAR의 부위-특이적 ADC의 세포독성을 나타낸다. m7E6은 항-Trop2 (영양막 세포-표면 항원 2이고, M1S1, GA733-1, EGP-1, 또는 TACSTD2로도 공지됨) 항체이고, H7c, L11b, TG6, 및 LCQ04는 글루타민-함유 트랜스글루타미나제 태그 및 항체 내에서의 이같은 태그의 위치를 나타내고 (표 1 참조); N297Q는 Trop2 항체의 위치 297에서의 N → Q 아미노산 치환을 나타내며; K222R은 Trop2 항체의 위치 222에서의 K → R 아미노산 치환을 나타내고; 말레이미도는 시스테인 접합을 통한 통상적인 접합 방법을 나타낸다. 이러한 약어들은 본원에 기술된 모든 다른 도면에 적용된다.
도 2는 DAR 7.2의 통상적으로 접합된 ADC에 비교하여 중등도로 표적을 발현하는 Colo205 세포에서의 증가성 DAR의 부위-특이적 ADC의 세포독성을 나타낸다.
도 3은 DAR 7.2의 통상적으로 접합된 ADC에 비교하여 낮게 표적을 발현하는 CF-PAC1 세포에서 DAR의 증가에 따른 부위-특이적 ADC의 세포독성을 나타낸다.
도 4는 DAR 7.2의 통상적으로 접합된 ADC에 비교하여 표적을 발현하지 않는 SW620 세포에서 DAR의 증가에 따른 부위-특이적 ADC의 비-특이적 세포독성을 나타낸다.
도 5는 유사한 DAR의 통상적으로 접합된 ADC에 비교하여 중등도로 표적을 발현하는 Colo205 세포에서 본 발명의 더 고도로 로딩된 부위-특이적 ADC의 세포독성을 나타낸다.
도 6은 DAR 7.2의 통상적으로 접합된 ADC와 비교하여 Colo205 이종이식 모델에서 장기 종양 정체를 유도하는 것에서의 본 발명의 더 고도로 로딩된 부위-특이적 ADC의 효능을 나타낸다.
도 7은 유사한 DAR의 통상적으로 접합된 ADC와 비교하여 Colo205 이종이식 모델에서 장기 종양 정체를 유도하는 것에서의 본 발명의 더 고도로 로딩된 부위-특이적 ADC의 효능을 또한 나타낸다.
도 8a-8h는 비-접합 야생형 항체 및 유사한 DAR의 통상적인 ADC와 비교하여 본 발명의 더 고도로 로딩된 부위-특이적 ADC의 마우스 및 래트에서의 PK 프로파일을 나타낸다.
도 9a-9b는 접합 부위들이 상이하게 조합된 DAR 7.76 및 7.7의 본 발명의 더 고도로 로딩된 부위-특이적 ADC의 래트에서의 PK 프로파일을 나타낸다.
도 10a-10d는 C57B1/6 마우스에서의 더 고도로 로딩된 ADC의 독성학을 나타낸다. 도 10a는 200 mg/kg으로 투약된 DAR 7.8의 통상적으로 접합된 ADC 및 DAR 7.76의 부위-특이적 ADC의 ADC 독성동태학을 나타낸다. 도 10b는 DAR 5.85 및 DAR 7.71의 고도로 로딩된 부위-특이적 ADC 및 DAR 7.8의 통상적으로 접합된 ADC가 200 mg/kg으로 투약된 마우스의 체중 증가를 나타낸다. 도 10c 및 10d는 고도로 로딩된 부위-특이적 (SS) ADC인 "DAR6" (m7E6 N297Q/K222R/LCQ04 아미노-PEG6-C2-MMAD; DAR 5.85), 및 SS "DAR8" (m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/H7c 아미노-PEG6-C2-MMAD; DAR 7.76), 및 통상적인 ADC인 "Cys DAR8" (m7E6 말레이미도 PEG6-C2-MMAD; DAR 7.8)이 200 mg/kg으로 투약된 마우스로부터 제14일에 수득된 샘플로부터의 간 효소 활성 및 임상 병리학 파라미터를 나타낸다. AP, AST, 및 ALT는 각각 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제, 알라닌 트랜스아미나제, 및 알칼리성 포스파타제를 나타낸다.
도 11은 WT (m7E6-비-접합), SS DAR2 (LC) (부위-특이적 m7E6 LCQ04 아미노-PEG6-C2-MMAD), SS DAR4 (m7E6 N297Q/K222R 아미노-PEG6-C2-MMAD), SS DAR6 (m7E6 N297Q/K222R/LCQ04 아미노-PEG6-C2-MMAD), SS DAR8 (m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/H7c 아미노-PEG6-C2-MMAD), 및 Cys DAR8 (m7E6 말레이미도 PEG6-C2-MMAD)을 포함하는 다양한 ADC에서의 표적/IgG 상호작용의 동역학 분석을 나타낸다. 각각의 패널은 1.2, 3.7, 11, 33, 및 100 nM의 표적 (인간 Trop2) 농도로 소정의 IgG의 전반적인 분석을 나타낸다. 흑색 선은 측정된 데이터를 나타내고, 적색 선은 전반적 피트(global fit)를 나타낸다; 잔차가 각각의 오버레이 플롯 아래에서 제시된다.
도 12a-12c는 마우스 생체-내 샘플로부터의 질량 분광법에 의한 링커 및/또는 페이로드 안정성 분석을 나타낸다. 도면은 DAR 8의 통상적으로 접합된 ADC와 DAR 6 및 DAR 8의 고도로 로딩된 부위-특이적 ADC 사이에서 링커 안정성 (도 12a), 약물 안정성 (도 12b; 접합된 MMAD C-말단 안정성), 및 조합된 링커-약물 안정성 (도 12c)을 비교한다. "Cys DAR8"은 m7E6 말레이미도 PEG6-C2-MMAD를 나타내고, "SS DAR6"은 m7E6 N297Q/K222R/LCQ04 아미노-PEG6-C2-MMAD를 나타내며, SS "DAR8_1"은 m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/H7c 아미노-PEG6-C2-MMAD를 나타낸다.
도 13a-13b는 다양한 항체 농도로 여러 시점에 측정된 마우스에서의 통상적으로 접합된 ADC ("Cys DAR8": m7E6 말레이미도 PEG6-C2-MMAD) 및 고도로 로딩된 부위-특이적 ADC인 DAR6 (m7E6 N297Q/K222R/LCQ04 아미노-PEG6-C2-MMAD) 및 DAR8_1 (m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/H7c 아미노-PEG6-C2-MMAD)의 독성동태학을 나타낸다.
도 14는 더 낮은 DAR (예를 들어, 1.96 및 3.9)의 부위-특이적 ADC에 비교하여 고도로 표적을 발현하는 BxPC3 세포에서 DAR의 증가에 따른 부위-특이적 ADC의 세포독성을 나타낸다.
도 15는 더 낮은 DAR (예를 들어, 1.96 및 3.9)의 부위-특이적 ADC에 비교하여 중등도로 표적을 발현하는 Colo205 세포에서 DAR의 증가에 따른 부위-특이적 ADC의 세포독성을 또한 나타낸다.
도 16은 더 낮은 DAR (예를 들어, 1.96 및 3.9)의 부위-특이적 ADC에 비교하여 낮게 표적을 발현하는 CF-PAC1 세포에서 DAR의 증가에 따른 부위-특이적 ADC의 세포독성을 또한 나타낸다.
도 17은 더 낮은 DAR (예를 들어, 1.96 및 3.9)의 부위-특이적 ADC에 비교하여 표적을 발현하지 않은 SW620 세포에서 DAR의 증가에 따른 부위-특이적 ADC의 비-특이적 세포독성의 부재를 또한 나타낸다.
도 18a 및 18b는 더 낮은 DAR (예를 들어, 1.9 및 3.7)의 부위-특이적 ADC에 비교하여 낮게 및 중등도로 표적을 발현하는 L363 및 MM1.S 세포에서 DAR의 증가에 따른 부위-특이적 ADC의 시험관-내 효능을 나타낸다.
상세한 설명
일반적으로 본 발명은 1) 글루타민-함유 태그, 내인성 글루타민 (즉, 조작되지 않은 천연 글루타민, 예컨대 가변 도메인, CDR 등 내의 글루타민), 및/또는 항체 조작 또는 조작된 트랜스글루타미나제에 의해 반응성이게 만들어진 내인성 글루타민; 및 2) 아민 공여체 단위, 링커 및 작용제 모이어티를 포함하는 아민 공여체 작용제를 포함하는, 약물-항체 비 (DAR)가 높은 트랜스글루타미나제-매개 부위-특이적 항체-약물 접합체 (ADC)로서, DAR이 적어도 약 5인 항체-약물 접합체에 관한 것이다. DAR이 2 내지 4인 통상적인 말레이미드 결합을 이용하는 항체-약물 접합체가, 생체-내 효능, 내약성 및 약동학의 관점에서 이의 더 고도로 로딩된 대응물보다 우수하여 더 높은 치료 지수를 초래하는 것으로 기존에는 알려져 왔다. 본원에서는, 통상적인 더 고도로 로딩된 ADC에 비교하여 생체-내 효능이 더 높고 시험관-내 비-특이적 세포독성이 더 적은 더 고도로 로딩된 부위-특이적 ADC (예를 들어, 적어도 5 이상의 DAR)가 본원에서 기술된다. 단일 용량의 본원에서 개시된 더 고도로 로딩된 부위-특이적 ADC는 장기 종양 성장 정체의 관점에서 DAR이 유사한 통상적인 ADC를 현저하게 능가한다. 또한, 이러한 더 고도로 로딩된 부위-특이적 ADC는 마우스에서 비-접합 야생형 항체와 약동학 프로파일이 유사하고, 래트에서 DAR이 유사한 통상적인 더 고도로 로딩된 ADC보다 PK 프로파일이 개선된다. 이러한 더 고도로 로딩된 부위-특이적 ADC는 등가로 약물이 로딩된 통상적인 ADC와 비교하여 필적하는 안전성 프로파일을 또한 유지한다.
따라서, 각각의 ADC가 식 항체-(T-(X-Y-Za)b)c [식 중, T는 1) 특이적 부위에서 조작된 글루타민-함유 태그, 2) 내인성 글루타민, 및/또는 3) 항체 조작 또는 조작된 트랜스글루타미나제에 의해 반응성이게 만들어진 내인성 글루타민이고; X는 아민 공여체 단위이고; Y는 링커이며; Z는 작용제 모이어티이고; X-Y-Z는 글루타민-함유 태그, 내인성 글루타민, 및/또는 반응성 내인성 글루타민에 부위-특이적으로 접합된 아민 공여체 작용제이고; a는 1 내지 6의 정수이고; b는 1 내지 6의 정수이고; c는 1 내지 20의 정수이며; a, b, 및 c의 곱 (약물-항체 비)은 적어도 약 5이다]를 포함하는 더 고도로 로딩된 부위-특이적 ADC가 제공된다.
본원에 기술된 바와 같은 ADC를 포함하는 유효량의 제약 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 암 치료, 종양 성장 또는 진행의 억제, 암 세포 또는 종양의 전이의 억제, 또는 종양 퇴행의 유도를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하거나, 종양 성장 또는 진행을 억제하거나, 암 세포 또는 종양의 전이를 억제하거나, 또는 종양 퇴행을 유도하는 방법이 또한 제공된다.
a) 항체 및 글루타민-함유 태그, 및/또는 내인성 및/또는 반응성 내인성 글루타민이 있는 항체를 포함하는 항체-T 분자를 제공하는 단계; b) 트랜스글루타미나제의 존재 하에 아민 공여체 작용제를 항체-T 분자와 접촉시키는 단계; 및 c) 항체-T가 아민 공여체 작용제에 공유결합으로 연결되게 하여, ADC를 형성시키는 단계를 포함하는, 본원에 기술된 바와 같은 ADC를 제조하는 방법이 또한 제공된다. 일부 실시양태에서, 트랜스글루타미나제는 조작된 트랜스글루타미나제이다.
일반적인 기술 및 정의
본원에서 달리 정의되지 않는 한, 본 발명과 관련되어 사용된 과학 용어 및 기술 용어는 관련 기술 분야의 통상의 기술자가 통상적으로 이해하는 의미를 지녀야 한다. 또한, 맥락에 의해 달리 요구되지 않는 한, 단수형 용어는 복수를 포함하여야 하고, 복수형 용어는 단수를 포함하여야 한다. 일반적으로, 본원에 기술된 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 면역학, 미생물학, 유전학 및 단백질 및 핵산 화학 및 혼성화와 관련하여 사용된 용어법 및 이들의 기술은 관련 기술 분야에 널리 공지되어 있고 이러한 분야에서 통상적으로 사용되는 것이다.
일반적으로 본 발명의 방법 및 기술은 달리 지시되지 않는 한 관련 기술 분야에 널리 공지된 통상적인 방법에 따라, 그리고 본 명세서 전반에 걸쳐 인용 및 논의된 다양한 일반적이고 더 구체적인 참고문헌에 기술된 바와 같이 수행된다. 예를 들어, 문헌 [Sambrook J. & Russell D. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2000)]; [Ausubel et　al., Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, John & Sons, Inc. (2002)]; [Harlow and Lane Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1998)]; 및 [Coligan et al., Short Protocols in Protein Science, Wiley, John & Sons, Inc. (2003)]을 참조한다. 효소 반응 및 정제 기술은 제조사의 설명서에 따라, 관련 기술 분야에서 통상적으로 달성되는 바와 같이 또는 본원에 기술된 바와 같이 수행된다. 본원에 기술된 분자 생물학, 생화학, 면역학, 분석 화학, 합성 유기 화학, 및 의약 및 제약 화학과 관련하여 사용된 용어법 및 이들의 실험 절차 및 기술은 관련 기술 분야에 널리 공지되어 있고 이러한 분야에서 통상적으로 사용되는 것이다. 본 명세서 및 특허청구범위 전반에 걸쳐, "포함하다"라는 단어 또는 변형 예컨대 "포함하는"은 언급된 완전체 또는 완전체의 군을 포함하지만 임의의 다른 완전체 또는 완전체의 군을 배제하지 않는다는 것을 의미하는 것으로 이해될 것이다.
본원에서 사용된 바와 같은 "글루타민-함유 태그", "글루타민 태그", "Q-함유 태그", "Q-태그", 또는 "트랜스글루타미나제 태그"는 트랜스글루타미나제 반응에서 아민 수용체 또는 아실 공여체로서 작용하는 하나 이상의 Gln 잔기(들)를 함유하는 폴리펩티드 또는 단백질을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같은 "아민 공여체 작용제" 또는 "아실 수용체"는 하나 이상의 반응성 아민 (예를 들어, 1급 아민)을 함유하는 작용제를 지칭한다. 예를 들어, 아민 공여체 작용제는 아민 공여체 단위 (예를 들어, 1급 아민 NH2), 링커 (예를 들어, 아민 공여체 단위에 연결되고, 페이로드 예컨대 소형 분자, 폴리펩티드 또는 생체적합성 중합체에 부착되는 것을 위한 추가적인 관능기를 함유하는 분자), 및 작용제 모이어티 (예를 들어, 페이로드 예컨대 소형 분자)를 포함할 수 있다. 아민 공여체 작용제는 하나 이상의 반응성 리신, N-말단 또는 반응성 아민을 함유하는 폴리펩티드 (예를 들어, 항체) 또는 생체적합성 중합체일 수도 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "부위 특이성", "부위-특이적으로 접합된" 또는 "부위-특이적으로 가교된"이라는 용어는 글루타민-함유 태그, 내인성 글루타민, 및/또는 항체 조작 또는 조작된 트랜스글루타미나제에 의해 반응성이게 만들어진 내인성 글루타민을 통해 특정 부위 (예를 들어, 표 1에 열거된 다양한 위치)에서 아민 공여체 작용제가 항체에 특이적으로 접합 또는 가교되는 것을 지칭한다. 질량 분광법 (예를 들어, 매트릭스-보조 레이저 탈착 이온화 질량 분광법 (MALDI-MS), 전기분무 이온화 질량 분광법 (ESI-MS), 탠덤(tandem) 질량 분광법 (MS-MS), 및 비행 시간 질량 분광법 (TOF-MS), 소수성 상호작용 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 부위-지정 돌연변이유발, 형광-표지, 크기 배제 크로마토그래피, 및 X선 결정학을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 기술에 의해 부위 특이성을 측정할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "반응성이게 만들어진 내인성 글루타민 (Q)"이라는 용어는 항체 조작 (예를 들어, 효소에 의한 탈글리코실화 및/또는 아미노산 변형)에 의해 또는 조작된 트랜스글루타미나제에 의해 트랜스글루타미나제의 존재 하에 아민 공여체 작용제에 대해 접근성이게, 노출되도록 또는 반응성이게 만들어진 내인성 글루타민을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "생체적합성 중합체"라는 용어는 수용자에서 어떠한 바람직하지 않은 국소적 또는 전신성 효과도 유발하지 않으면서 수용자 (예를 들어, 인간)에서의 치료적 또는 의학적 처치에 적절한 중합체 (예를 들어, 반복되는 단량체성 또는 구조적 단위)를 지칭한다. 생체적합성 중합체 (합성, 재조합 또는 천연)는 수용성 또는 수불용성 중합체일 수 있다. 생체적합성 중합체는 또한 선형 또는 분지형 중합체일 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "항체"라는 용어는 면역글로불린 분자의 가변 영역에 위치하는 적어도 하나의 항원 인식 부위를 통해 표적, 예컨대 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, 지질, 폴리펩티드 등에 특이적으로 결합할 수 있는 면역글로불린 분자이다. 본원에서 사용된 바와 같이, 맥락적으로 달리 지시되지 않는 한, 이러한 용어는 무손상 폴리클로날 또는 모노클로날 항체뿐만 아니라, 이의 단편 (예컨대 Fab, Fab', F(ab')2, Fv), 단일쇄 (ScFv) 및 도메인 항체 (상어 및 낙타류 항체 포함)), 및 항체 부분을 포함하는 융합 단백질, 다가 항체 (예를 들어, COVX-BODY™), 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체 (단, 이는 원하는 생물학적 활성을 나타냄)) 및 본원에 기술된 바와 같은 항체 단편, 및 항원 인식 부위를 포함하는 면역글로불린 분자의 임의의 변형된 기타 형상을 또한 포함하도록 의도된다. 항체는 임의의 클래스, 예컨대 IgG, IgA, 또는 IgM (또는 이의 서브-클래스)의 항체을 포함하고, 항체가 임의의 특정 클래스일 필요는 없다. 중쇄의 불변 도메인의 항체 아미노산 서열에 따라, 면역글로불린은 상이한 클래스에 할당될 수 있다. IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM의 5가지 주요 면역글로불린 클래스가 있고, 이들 중 몇몇은 서브클래스 (아이소형), 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 추가로 분류될 수 있다. 면역글로불린의 상이한 클래스들에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 알파, 델타, 엡실론, 감마 및 뮤로 칭해진다. 면역글로불린의 상이한 클래스들의 서브유닛 구조 및 3차원 형상이 널리 공지되어 있다. 한 측면에서, 면역글로불린은 인간, 뮤린, 원숭이 또는 토끼 면역글로불린이다.
본원에서 사용된 바와 같은 "Fab 함유 폴리펩티드"라는 용어는 Fab 단편, Fab' 단편, 또는 "(Fab')2 단편"을 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. Fab-함유 폴리펩티드는 야생형 힌지(hinge) 서열의 일부분 또는 전체를 (일반적으로 폴리펩티드의 Fab 부분의 카르복실 말단에) 포함할 수 있다. Fab-함유 폴리펩티드는 임의의 적절한 면역글로불린으로부터, 예컨대 다양한 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 서브타입 중 적어도 하나로부터 또는 IgA, IgE, IgD 또는 IgM으로부터 수득되거나 유래될 수 있다. Fab-함유 폴리펩티드는 하나 이상의 폴리펩티드가 Fab-함유 폴리펩티드에 융합된 Fab-함유 융합 폴리펩티드일 수 있다. Fab 융합물은 면역글로불린의 Fab 폴리펩티드를 융합 파트너와 조합시키고, 융합 파트너는 일반적으로 임의의 단백질, 폴리펩티드 또는 소형 분자일 수 있다. 실제로 임의의 단백질 또는 소형 분자가 Fab 폴리펩티드에 연결되어 Fab-함유 융합 폴리펩티드가 생성될 수 있다. Fab-함유 융합 파트너는 수용체, 부착 분자, 리간드, 효소, 시토카인, 케모카인, 또는 일부 기타 단백질 또는 단백질 도메인의 표적-결합 영역을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
"Fab 단편"은 1개의 경쇄, 및 1개의 중쇄의 CH1 및 가변 영역으로 구성된다. Fab 분자의 중쇄는 또 다른 중쇄 분자와 디술피드 결합을 형성할 수 없다.
"Fab' 단편"은 1개의 경쇄, 및 VH 도메인 및 CH1 도메인을 함유하고 CH1 도메인과 CH2 도메인 사이의 영역을 또한 함유하는 1개의 중쇄의 일부분을 함유하여, F(ab')2 분자가 형성되도록 2개의 Fab' 단편의 2개의 중쇄 사이에서 쇄간 디술피드 결합이 형성될 수 있다.
"F(ab')2 단편"은 2개의 경쇄, 및 CH1 도메인과 CH2 도메인 사이의 불변 영역의 일부분을 함유하는 2개의 중쇄를 함유하여, 2개의 중쇄 사이에서 쇄간 디술피드 결합이 형성된다. 따라서 F(ab')2 단편은 2개의 중쇄 사이의 디술피드 결합에 의해 함께 유지되는 2개의 Fab' 단편으로 구성된다.
본원에서 사용된 바와 같은 "항체 단편"은 무손상 항체의 일부분만을 포함하고, 여기서 일부분은 무손상 항체 내에 존재할 때 이러한 일부분과 정상적으로 연관된 기능 중 적어도 하나, 바람직하게는 기능 대부분 또는 모두를 유지한다.
"다중특이적 항체"는 1개를 초과하는 항원 또는 에피토프를 표적화하는 것이다. "이중특이적", "이중-특이적" 또는 "이중기능성" 항체는 2개의 상이한 항원 결합 부위가 있는 하이브리드 항체이다. 이중특이적 항체는 다중특이적 항체의 일종이고, 하이브리도마의 융합, Fab' 단편의 연결, 또는 항체 힌지 및 CH3 도메인에서의 돌연변이를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 방법에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990)]; [Kostelny et al., J. Immunol. 148:1547-1553 (1992)]; 및 [Strop et al., J. Mol. Biol. 420(3):204-219 (2012)]을 참조한다. 이중특이적 항체의 2개의 결합 부위는 동일한 단백질 표적 또는 상이한 단백질 표적 상에 있을 수 있는 2개의 상이한 에피토프에 결합할 것이다.
본원에서 사용된 바와 같은 "모노클로날 항체"라는 용어는 실질적으로 균질한 항체들의 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하고, 즉 집단을 이루는 개별적인 항체들은 미량으로 존재할 수 있는 가능한 천연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 모노클로날 항체는 단일 항원에 대해 지시되어 고도로 특이적이다. 추가로, 상이한 결정인자 (에피토프)에 대해 지시된 상이한 항체들을 전형적으로 포함하는 폴리클로날 항체 제제와 대조적으로, 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정인자에 대해 지시된다.
본원에서의 모노클로날 항체는, 특정 실시양태에서, 중쇄 및/또는 경쇄의 일부분은 특정 종으로부터 유래되거나 특정 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체에서의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 한편, 쇄(들)의 나머지는 또 다른 종으로부터 유래되거나 또 다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체에서의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 "키메라" 항체, 뿐만 아니라 이같은 항체의 단편 (단, 원하는 생물학적 활성을 나타냄)를 명확하게 포함한다 (미국 특허 번호 4,816,567; 및 문헌 [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)]).
비-인간 (예를 들어, 뮤린) 항체의 "인간화" 형태는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대부분에 대해, 인간화 항체는 수용자의 초가변 영역으로부터의 잔기가 원하는 특이성, 친화력 및 능력이 있는 비-인간 종 (공여자 항체) 예컨대 마우스, 래트 또는 비-인간 영장류의 초가변 영역으로부터의 잔기로 교체된 인간 면역글로불린 (수용자 항체)이다. 일부 경우에, 인간 면역글로불린의 프레임워크 영역 (FR) 잔기가 상응하는 비-인간 잔기로 교체된다. 또한, 인간화 항체는 수용자 항체 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 항체 성능을 추가로 정련하기 위해 이루어진다. 일반적으로, 인간화 항체는 적어도 하나, 전형적으로는 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이고, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비-인간 면역글로불린의 것에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 면역글로불린 서열의 것이다. 인간화 항체는 면역글로불린 불변 영역 (Fc), 전형적으로는 인간 면역글로불린의 것의 적어도 일부분을 임의적으로 또한 포함할 것이다. 추가적인 상세사항을 위해, 문헌 [Jones et al., Nature 321:522-525 (1986)]; [Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988)]; 및 [Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)]을 참조한다. 하기의 리뷰 논문 및 이에 인용된 참고문헌을 또한 참조한다: [Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998)]; [Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995)]; [Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994)].
"인간 항체"는 인간에 의해 생산된 항체의 것에 상응하는 아미노산 서열을 포함하고/하거나 본원에 개시된 바와 같은 인간 항체 제조용 기술 중 어느 것을 사용하여 제조된 항체이다. 인간 항체의 이러한 정의는 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화 항체를 명확하게 배제한다.
본원에서 사용된 바와 같은 "힌지 영역", "힌지 서열" 및 이의 변형은 관련 기술 분야에 공지된 의미를 포함하고, 이는 예를 들어 문헌 [Janeway et al., ImmunoBiology: the immune system in health and disease, (Elsevier Science Ltd., NY) (4th ed., 1999)]; [Bloom et al., Protein Science (1997), 6:407-415]; [Humphreys et al., J. Immunol. Methods (1997), 209:193-202]에 설명되어 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 "Fc-함유 폴리펩티드"라는 용어는 면역글로불린 중쇄의 카르복실 말단 폴리펩티드 서열을 포함하는 폴리펩티드 (예를 들어, 항체 또는 이뮤노어드헤신(immunoadhesin))를 지칭한다. Fc-함유 폴리펩티드는 천연 또는 변이체 Fc 영역 (즉, 서열)을 포함할 수 있다. 면역글로불린의 Fc 영역은 일반적으로 2개의 불변 도메인 (CH2 도메인 및 CH3 도메인)을 포함하고, 임의적으로 CH4 도메인을 포함한다. Fc-함유 폴리펩티드는 야생형 힌지 서열의 일부분 또는 전체를 (일반적으로 Fc-함유 폴리펩티드의 아미노 말단에) 포함할 수 있다. Fc-함유 폴리펩티드는 또한 이량체일 수 있다. Fc-함유 폴리펩티드는 임의의 적절한 면역글로불린으로부터, 예컨대 다양한 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 서브타입 중 적어도 하나로부터, 또는 IgA, IgE, IgD 또는 IgM으로부터 수득되거나 유래될 수 있다. 면역글로불린 중쇄의 Fc 영역의 경계가 다양할 수 있지만, 예를 들어, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 일반적으로 위치 Glu216의 아미노산 잔기로부터 또는 Ala231로부터 이의 카르복실-말단까지에 달하는 것으로 일반적으로 정의된다. Fc 영역 내의 잔기의 넘버링은 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991]에서의 EU 인덱스의 것이다.
Fc-함유 폴리펩티드는 하나 이상의 폴리펩티드가 Fc-함유 폴리펩티드에 융합된 Fc-함유 융합 폴리펩티드일 수 있다. Fc 융합물은 면역글로불린의 Fc 폴리펩티드를 융합 파트너와 조합시키고, 융합 파트너는 일반적으로 임의의 단백질, 폴리펩티드 또는 소형 분자일 수 있다. 실제로 임의의 단백질 또는 소형 분자가 Fc 영역에 연결되어 Fc-함유 융합 폴리펩티드가 생성될 수 있다. Fc-함유 융합 파트너는 수용체, 부착 분자, 리간드, 효소, 시토카인, 케모카인, 또는 일부 기타 단백질 또는 단백질 도메인의 표적-결합 영역을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, "이뮤노어드헤신"이라는 용어는 이종성 단백질 ("부착소(adhesin)", 예를 들어 수용체, 리간드 또는 효소)의 "결합 도메인"이 면역글로불린 불변 도메인의 이펙터 성분 (즉, Fc 도메인)과 조합된 항체-유사 또는 면역글로불린-유사 분자를 가리킨다. 구조적으로, 이뮤노어드헤신은 항체의 항원 인식 및 결합 부위 (항원 조합 부위) 이외의 것인 (즉, "이종성"인), 원하는 결합 특이성이 있는 부착소 아미노산 서열과 면역글로불린 불변 도메인 서열의 융합물을 포함한다. 이뮤노어드헤신 내의 면역글로불린 불변 도메인 서열은 임의의 면역글로불린, 예컨대 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 서브타입, IgA, IgE, IgD 또는 IgM으로부터 수득될 수 있다.
"폴리펩티드", "올리고펩티드", "펩티드" 및 "단백질"이라는 용어는 임의 길이의 아미노산 쇄, 바람직하게는 비교적 짧은 아미노산 쇄 (예를 들어, 10-100개의 아미노산)를 지칭하도록 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 쇄는 선형 또는 분지형일 수 있고, 변형된 아미노산을 포함할 수 있고/있거나 비-아미노산으로 중단될 수 있다. 이러한 용어는 천연적으로, 또는 개입, 예를 들어, 디술피드 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 임의의 기타 조작 또는 변형, 예컨대 표지 성분과의 접합에 의해 변형된 아미노산 쇄를 또한 포함한다. 이러한 정의에는, 예를 들어, 하나 이상의 아미노산 유사체 (예를 들어, 비천연 아미노산 등을 포함함), 뿐만 아니라 관련 기술 분야에 공지된 기타 변형을 함유하는 폴리펩티드가 또한 포함된다. 폴리펩티드는 단일쇄 또는 회합된 쇄로서 발생할 수 있는 것으로 이해된다.
본원에서 사용된 바와 같이, "야생형 아미노산", "야생형 IgG", 또는 "야생형 mAb"이라는 용어는 특정 집단 (예를 들어, 인간, 마우스, 래트, 세포 등) 내에서 천연적으로 발생하는 아미노산 또는 핵산의 서열을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "접합 효율" 또는 "가교 효율"이라는 용어는 본원에 기술된 바와 같은 ADC의 실험적으로 측정된 양을 예상되는 최대 ADC 양으로 나눈 비이다. 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 널리 공지된 다양한 기술, 예컨대 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의해 접합 효율 또는 가교 효율을 측정할 수 있다. 여러 온도, 예컨대 실온 또는 37℃에서 접합 효율을 측정할 수도 있다.
"이펙터 기능"이라는 용어는 항체의 Fc 영역에 기인하는 생물학적 활성을 지칭한다. 항체 이펙터 기능의 예는 항체-의존적 세포-매개 세포독성 (ADCC), Fc 수용체 결합, 보체 의존적 세포독성 (CDC), 포식작용, C1q 결합, 및 세포 표면 수용체 (예를 들어, B 세포 수용체; BCR)의 하향 조절을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 미국 특허 번호 6,737,056을 참조한다. 일반적으로 이같은 이펙터 기능은 Fc 영역이 결합 도메인 (예를 들어, 항체 가변 도메인)과 조합되는 것을 요구하고, 이같은 항체 이펙터 기능을 평가하기 위한 관련 기술 분야에 공지된 다양한 검정법을 사용하여 평가될 수 있다. 예시적인 이펙터 기능 측정은 Fcγ3 및/또는 C1q 결합을 통한 것이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "항체-의존적 세포-매개 세포독성" 또는 "ADCC"는 Fc 수용체 (FcR)를 발현하는 비-특이적 세포독성 세포 (예를 들어 천연 킬러 (NK) 세포, 호중구, 및 대식세포)가 표적 세포 상의 결합된 항체를 인식하고, 이어서 표적 세포의 용해를 야기하는 세포-매개 반응을 지칭한다. 시험관-내 ADCC 검정법, 예컨대 미국 특허 번호 5,500,362 또는 5,821,337에 기술된 것을 사용하여 관심 분자의 ADCC 활성을 평가할 수 있다. 이같은 검정법을 위한 유용한 이펙터 세포는 말초혈 단핵 세포 (PBMC) 및 NK 세포를 포함한다. 대안적으로 또는 추가적으로, 관심 분자의 ADCC 활성을 생체 내에서, 예를 들어, 동물 모델 예컨대 문헌 [Clynes et al., 1998, PNAS (USA), 95:652-656]에 개시된 것에서 평가할 수 있다.
"보체 의존적 세포독성" 또는 "CDC"는 보체의 존재 하에 표적이 용해되는 것을 지칭한다. 보체 시스템의 제1 성분 (C1q)이 동족 항원과 복합체를 형성한 분자 (예를 들어 항체)에 결합하는 것에 의해 보체 활성화 경로가 개시된다. 보체 활성화를 평가하기 위해, 예를 들어 문헌 [Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods, 202: 163 (1996)]에 기술된 바와 같은 CDC 검정법을 수행할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "Fc 수용체" 및 "FcR"은 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 기술한다. 바람직한 FcR은 천연 서열 인간 FcR이다. 또한, 바람직한 FcR은 IgG 항체에 결합하는 것이고 (감마 수용체), FcγRI, FcγRII, FcγRIII, 및 FcγRIV 서브클래스의 수용체 (이러한 수용체들의 대립유전자 변이체 및 대안적으로 스플라이싱된 형태 포함)를 포함한다. FcγRII 수용체는 FcγRIIA ("활성화 수용체") 및 FcγRIIB ("억제 수용체")를 포함하고, 이들은 주로 이들의 세포질 도메인에서 상이한 유사한 아미노산 서열을 갖는다. 문헌 [Ravetch and Kinet, 1991, Ann. Rev. Immunol., 9:457-92]; [Capel et al., 1994, Immunomethods, 4:25-34]; [de Haas et al., 1995, J. Lab. Clin. Med., 126:330-41]; [Nimmerjahn et al., 2005, Immunity 23:2-4]에 FcR이 리뷰되어 있다. "FcR"은 모체 IgG를 태아에 전달하는 것을 담당하는 신생아 수용체 FcRn을 또한 포함한다 (문헌 [Guyer et al., 1976, J. Immunol., 117:587]; 및 [Kim et al., 1994, J. Immunol., 24:249]).
본원에서 사용된 바와 같이, "치료"는 이롭거나 원하는 임상 결과를 수득하기 위한 접근법이다. 본 발명의 목적을 위해, 이롭거나 원하는 임상 결과는 하기 중 하나 이상을 포함하지만 이에 제한되지 않는다: 신생물성 또는 암성 세포의 증식을 감소시킴 (또는 이러한 세포를 파괴함), 신생물성 세포의 전이를 억제함, 종양 크기를 축소 또는 감소시킴, 암 완화, 암 증상을 감소시킴, 암을 앓고 있는 이의 삶의 질을 증가시킴, 암을 치료하는데 요구되는 다른 약제의 용량을 감소시킴, 암 진행을 지연시킴, 암을 치유함, 및/또는 암 환자의 생존을 연장시킴.
본원에서 사용된 바와 같이, 약물, 화합물 또는 제약 조성물의 "유효 투여량" 또는 "유효량"은 임의의 하나 이상의 이롭거나 원하는 결과에 영향을 미치는데 충분한 양이다. 예방 용도의 경우, 이롭거나 원하는 결과는 위험을 제거하거나 감소시키는 것, 중증도를 감소시키는 것, 또는 질환 (질환의 생화학적, 조직학적 및/또는 거동적 증상, 이의 합병증, 및 질환 발달 동안 나타나는 중간의 병리학적 표현형을 포함함)의 개시를 지연시키는 것을 포함한다. 치료 용도의 경우, 이롭거나 원하는 결과는 다양한 암-관련 질환 또는 병태 (예컨대 위, 두경부, 폐, 난소 및 췌장 암)의 하나 이상의 증상의 발생을 감소시키거나 이를 호전시키는 것, 질환을 치료하는데 요구되는 다른 약제의 용량을 감소시키는 것, 또 다른 약제의 효과를 강화하는 것, 및/또는 환자에서 암이 진행되는 것을 지연시키는 것과 같은 임상 결과를 포함한다. 유효 투여량은 1회 이상의 투여로 투여될 수 있다. 본 발명의 목적을 위해, 약물, 화합물 또는 제약 조성물의 유효 투여량은 직접적으로 또는 간접적으로 예방적 또는 치료적 처치를 달성하는데 충분한 양이다. 임상 정황에서 이해되는 바와 같이, 약물, 화합물 또는 제약 조성물의 유효 투여량은 또 다른 약물, 화합물 또는 제약 조성물과 함께 달성될 수 있거나 또는 그렇지 않을 수 있다. 따라서, 하나 이상의 치료제를 투여하는 정황에서 "유효 투여량"이 고려될 수 있고, 단일 작용제는 하나 이상의 다른 작용제와 함께 바람직한 결과가 달성될 수 있거나 또는 달성되면 유효량으로 제공되는 것으로 고려될 수 있다.
"정제하다"라는 용어 및 이의 문법적 변형은 ADC 및 하나 이상의 불순물을 함유하는 혼합물로부터 적어도 하나의 불순물을 완전히든 또는 부분적으로든 제거하고, 이에 의해 (즉, 조성물 내의 불순물(들)의 양 (ppm)을 감소시킴으로써) 조성물 내의 ADC의 순도 수준을 개선하는 것을 의미하도록 사용된다.
본원에서 "약" ~의 값 또는 파라미터를 언급하는 것은 그러한 값 또는 파라미터 자체에 대해 지시된 실시양태를 포함 (및 기술)한다. 예를 들어, "약 X"를 언급하는 기술은 "X"의 기술을 포함한다. 수치 범위는 범위를 규정하는 숫자들을 포함한다.
"개체" 또는 "대상체"는 포유동물, 더 바람직하게는 인간이다. 포유동물은 가축, 스포츠 동물, 애완 동물, 영장류, 말, 개, 고양이, 마우스 및 래트를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본원에서 실시양태가 "포함하는"이라는 용어로 기술된 어떤 경우에도, "~로 이루어진" 및/또는 "본질적으로 ~로 이루어진"이라는 표현으로 기술된, 다른 면에서는 유사한 실시양태들이 또한 제공되는 것으로 이해된다.
본 발명의 측면 또는 실시양태가 마쿠시 군 또는 다른 대안적인 집단화의 표현으로 기술된 경우에, 본 발명은 총괄적으로 열거된 전체 군을 포함할 뿐만 아니라, 이러한 군의 개별적인 각각의 구성원 및 주요 군의 모든 가능한 하위군을 포함하고, 군 구성원 중 하나 이상이 부재하는 주요 군을 또한 포함한다. 본 발명은 청구된 발명에서 군 구성원 중 하나 이상의 임의의 군 구성원이 명확하게 배제되는 것을 또한 구상한다.
본 출원에서의 잔기 지정은 불변 도메인의 EU 넘버링 체계를 기초로 한다 (Edelman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 63(1):78-85 (1969).
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 통상의 기술자가 통상적으로 이해하는 바와 의미가 동일하다. 예시적인 방법 및 물질이 본원에서 기술되지만, 본원에서 기술된 것과 유사하거나 등가인 방법 및 물질이 본 발명의 실행 또는 테스트에서 또한 사용될 수 있다. 본원에서 언급된 모든 간행물 및 기타 참고문헌은 전문이 참고로 포함된다. 상충되는 경우, 정의를 포함하여 본 명세서가 우선할 것이다. 다수의 문헌이 본원에서 인용되지만, 이러한 인용은 임의의 이러한 문헌이 관련 기술 분야에서의 통상적인 일반 지식의 일부를 형성한다는 것을 인정하는 것이 아니다. 본 명세서 및 특허청구범위 전반에 걸쳐, "포함하다"라는 단어 또는 변형 예컨대 "포함하는"은 언급된 완전체 또는 완전체의 군을 포함하지만 임의의 다른 완전체 또는 완전체의 군을 배제하지 않는다는 것을 의미하는 것으로 이해될 것이다. 맥락에 의해 달리 요구되지 않는 한, 단수형 용어는 복수를 포함하여야 하고, 복수형 용어는 단수를 포함하여야 한다. 물질, 방법, 및 실시예는 예시적일 뿐이고, 제한적인 것으로 의도되지 않는다.
약물이 고도로 로딩된 항체-약물 접합체
본원의 항체-약물 접합체는 조작된 글루타민-함유 태그, 내인성 글루타민 (즉, 조작되지 않은 천연 글루타민, 예컨대 가변 도메인, CDR 등 내의 글루타민), 및/또는 반응성 내인성 글루타민을 통해 아민 공여체 작용제 (예를 들어, 아민 공여체 단위가 있는 링커에 커플링된 소형 분자)에 부위-특이적으로 접합된 항체를 포함하고, 여기서 약물-항체 비 (DAR)는 적어도 약 5 (예를 들어, 항체 당 적어도 5개의 약물/페이로드)이다. 항체 내의 하나 이상의 아미노산(들)을 변형시킴으로써 (예를 들어, 아미노산 결실, 삽입, 치환 또는 돌연변이), 효소에 의한 탈글리코실화에 의해, 또는 조작된 트랜스글루타미나제와 반응시킴으로써 내인성 글루타민이 반응성 (즉, 아민 및 트랜스글루타미나제의 존재 하에 아실 공여체로서 공유 결합을 형성하는 능력)이게 만들어질 수 있다. 따라서, 한 측면에서, 식 항체-(T-(X-Y-Za)b)c [식 중, T는 1) 특이적 부위에서 조작된 글루타민-함유 태그, 2) 내인성 글루타민, 및/또는 3) 항체 조작 또는 조작된 트랜스글루타미나제에 의해 반응성이게 만들어진 내인성 글루타민이고; X는 아민 공여체 단위이고; Y는 링커이며; Z는 작용제 모이어티이고; X-Y-Z는 글루타민-함유 태그, 내인성 글루타민 및/또는 반응성 내인성 글루타민에 부위-특이적으로 접합된 아민 공여체 작용제이고; a는 1 내지 6의 정수이고; b는 1 내지 6의 정수이고; c는 1 내지 20의 정수이며; a, b, 및 c의 곱 (약물-항체 비)은 적어도 약 5이다]를 포함하는 항체-약물 접합체 (ADC)가 제공된다. 항체 상의 글루타민-함유 태그, 내인성 글루타민 및/또는 반응성 글루타민, 및 본원에 기술된 아민 공여체 작용제 (X-Y-Z) 양쪽 모두가 트랜스글루타미나제의 기질이고, 글루타민-함유 태그 및/또는 내인성/반응성 글루타민과 아민 공여체 작용제 사이의 결합은 식 CH2-CH2-CO-NH- [식 중 NH-는 링커 및 작용제 모이어티에 연결된다]의 것이다.
트랜스글루타미나제는 단백질-글루타민 γ-글루타밀트랜스퍼라제 (EC 2.3.2.13)이고, 이는 전형적으로 글루타민 잔기와 리신 잔기의 pH-의존적 아미드교환(transamidation)을 촉매한다. 본원에 기술된 발명에서 사용된 트랜스글루타미나제는 다양한 공급원으로부터 수득 또는 제조될 수 있거나, 또는 하나 이상의 내인성 글루타민 잔기와 하나 이상의 리신 잔기 또는 하나 이상의 반응성 아민을 함유하는 아민 공여체 작용제의 아미드교환을 촉매하도록 조작될 수 있다. 일부 실시양태에서, 트랜스글루타미나제는 효소 형상 변화를 유도하고 효소 활성을 허용하기 위해 칼슘을 요구하는 칼슘 의존적 트랜스글루타미나제이다. 예를 들어, 트랜스글루타미나제가 기니 피그 간으로부터 유래될 수 있고, 시판원 (예를 들어, 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich) (미주리주 세인트루이스) 및 MP 바이오메디컬스(MP Biomedicals) (캘리포니아주 어바인))을 통해 수득될 수 있다. 일부 실시양태에서, 진균 단백질 (예를 들어, 오오미세테스(Oomycetes), 악티노미세테스(Actinomycetes), 사카로미세스(Saccharomyces), 칸디다(Candida), 크립토코쿠스(Cryptococcus), 모나스쿠스(Monascus), 또는 리조푸스(Rhizopus) 트랜스글루타미나제)로부터 mTGase 폴리펩티드가 유래된다. 일부 실시양태에서, 믹소미세테스(Myxomycetes) (예를 들어, 피사룸 폴리세팔룸(Physarum polycephalum) 트랜스글루타미나제)로부터 mTGase 폴리펩티드가 유래된다. 일부 실시양태에서, 박테리아 단백질, 예컨대 스트렙토베르티실리움(Streptoverticillium) 종 또는 스트렙토미세스(Streptomyces) 종 (예를 들어, 스트렙토미세스 모바렌시스(Streptomyces mobarensis) 또는 스트렙토베르티실리움 모바렌시스(Streptoverticillium mobarensis))으로부터의 트랜스글루타미나제로부터 mTGase 폴리펩티드가 유래된다. 일부 실시양태에서, 박테리아 단백질, 예컨대 스트렙토베르티실리움 모바렌시스, 스트렙토베르티실리움 그리세오카르네움(Streptoverticillium griseocarneum), 스트렙토베르티실리움 라다카눔(Streptoverticillium ladakanum), 스트렙토미세스 모바렌시스, 스트렙토미세스 비리디스(Streptomyces viridis), 스트렙토미세스 라다카눔(Streptomyces ladakanum), 스트렙토미세스 카니페루스(Streptomyces caniferus), 스트렙토미세스 플라텐시스(Streptomyces platensis), 스트렙토미세스 히그로스코피우스(Streptomyces hygroscopius), 스트렙토미세스 네트롭시스(Streptomyces netropsis), 스트렙토미세스 프라디아에(Streptomyces fradiae), 스트렙토미세스 로세오베르티빌라투스(Streptomyces roseovertivillatus), 스트렙토미세스 신나마오네우스(Streptomyces cinnamaoneous), 스트렙토미세스 그리세오카르네움(Streptomyces griseocarneum), 스트렙토미세스 라벤둘라에(Streptomyces lavendulae), 스트렙토미세스 리비단스(Streptomyces lividans), 스트렙토미세스 리디쿠스(Streptomyces lydicus), 스트렙토미세스 시오얀시스(Streptomyces sioyansis), 악티노마두라(Actinomadura) 종, 바실루스(Bacillus) (예를 들어, 바실루스 시르쿨란스(Bacillus circulans), 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 등), 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes), 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 클로스트리디움(Clostridium), 엔테로박테르(Enterobacter) 종, 미크로코쿠스(Micrococcus), 프로비덴시아(Providencia) 종, 또는 이의 단리물로부터의, 그러나 이에 제한되지 않는 트랜스글루타미나제로부터 mTGase 폴리펩티드가 유래된다. 일부 실시양태에서, 트랜스글루타미나제는 효소 형상 변화를 유도하고 효소 활성을 허용하기 위해 칼슘을 요구하지 않는 칼슘 비-의존적 트랜스글루타미나제이다. 일부 실시양태에서, 에스. 모바렌시스(S. mobarensis)로부터 mTGase 폴리펩티드가 유래된다. 시판되는 칼슘 비-의존적 트랜스글루타미나제 예컨대 액티바(ACTIVA)™ (아지노모토(Ajinomoto), 일본)가 본 발명에 또한 적절하다.
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 발명에서 사용된 트랜스글루타미나제는 항체 내의 하나 이상의 내인성 글루타민 잔기와 아민 공여체 작용제 내의 하나 이상의 리신 잔기 또는 반응성 아민의 아미드교환을 촉매하는 조작된 트랜스글루타미나제이다. 예를 들어, 천연 발생 트랜스글루타미나제 내의 하나 이상의 야생형 아미노산 잔기가 결실되거나, 또는 또 다른 아미노산 잔기(들)로 교체 또는 치환되어, 조작된 트랜스글루타미나제가 제조될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 발명에서 사용된 트랜스글루타미나제는 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 공지된 재조합 기술을 사용하여 생산된 재조합 단백질일 수도 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 발명에서 사용된 트랜스글루타미나제는 정제된 단백질일 수 있다. 예를 들어, 정제된 트랜스글루타미나제는 적어도 약 50％ 순수하다. 본원에서 사용된 바와 같이, "순수한" 또는 "정제된" 단백질은 다른 단백질 오염물이 없는 단백질 (예를 들어, 트랜스글루타미나제)을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 정제된 트랜스글루타미나제는 적어도 약 55％-60％, 60％-65％, 65％-70％, 70％-75％, 75％-80％, 80％-85％, 85％-90％, 90％-95％, 95％-98％, 또는 99％ 순수하다. 일부 실시양태에서, 정제된 트랜스글루타미나제는 약 50％, 55％, 60％, 65％, 70％, 75％, 80％, 85％, 90％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％, 또는 100％ 순수하다.
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 바와 같은 ADC의 글루타민-함유 태그는 항체 내의 반응성 Lys에 공간적으로 인접하지 않는다. 예를 들어, 글루타민-함유 태그는 폴리펩티드의 카르복실 말단, 아미노 말단, 또는 카르복실 및 아미노 말단 양쪽 모두 내의 반응성 Lys에 공간적으로 인접하지 않는다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 ADC는 항체 조작에 의해 또는 조작된 트랜스글루타미나제에 의해 아미드교환 반응에서 반응성이게 만들어진 적어도 1개의 내인성 글루타민을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 조작은 항체 탈글리코실화 (예를 들어, 효소에 의한 탈글리코실화); 또는 항체 상에서의 아미노산 결실, 삽입, 치환, 돌연변이, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 아미노산 변형이다. 예를 들어, 항체 내의 위치 297에서의 야생형 아미노산 Asn (N)이 아미노산 Ala (A)로 치환 또는 교체되어, 위치 297에서의 비-글리코실화 및 위치 295에서의 반응성 내인성 글루타민 (Q)이 초래된다. 또 다른 예에서, 항체에서의 아미노산 변형이 위치 297에서의 N → Q 아미노산 치환이어서, 위치 297에서의 비-글리코실화, 위치 295에서의 반응성 내인성 Q, 및 N297Q 및 Q295과 하나 이상의 아민 공여체 작용제 사이에서의 트랜스글루타미나제의 존재 하에서의 이러한 2개의 부위에서의 부위-특이적 접합이 초래된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 ADC는 1) 경쇄, 중쇄, 또는 경쇄 및 중쇄 양쪽 모두 중 어느 것의 카르복실 말단; 2) 경쇄, 중쇄, 또는 경쇄 및 중쇄 양쪽 모두 중 어느 것의 아미노 말단; 및 3) S60-R61, R108, T135, S160, S168, S190-S192, P189-S192, G200-S202, K222-T225, K222-T223, T223, L251-S254, M252-I253, E294-N297, E293-N297, N297, 및/또는 G385 (여기서 글루타민-함유 태그는 항체 내에 삽입되거나 또는 항체 내의 하나 이상의 내인성 아미노산을 교체함)를 포함하지만 이에 제한되지 않는 적어도 하나 이상의 위치에서 조작된 글루타민-함유 태그를 포함하고, 약물-항체 비는 적어도 약 5이다. 구체적인 글루타민-함유 태그 및 상응하는 조작된 위치의 예가 표 1에서 제공된다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명의 ADC는 적어도 약 5의 DAR (예를 들어, 항체 당 5개의 약물/페이로드), 및 표 1에 열거된 바와 같은 위치 중 임의의 하나 이상에서 조작된 글루타민-함유 태그를 포함한다.
<표 1>
Figure pat00001
Figure pat00002
일부 실시양태에서, 본 발명의 ADC의 항체는 위치(들) 222, 340, 및/또는 370 (EU 넘버링)에서 동일한 위치에서의 야생형 항체와 비교하여 제2 아미노산 변형을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형은 아미노산 결실, 삽입, 치환, 돌연변이, 또는 이들의 임의의 조합이다. 일부 실시양태에서, 치환은 야생형 아미노산을 또 다른 아미노산 (예를 들어, 비-야생형 아미노산)으로 교체하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 다른 (예를 들어, 비-야생형) 아미노산은 Arg (예를 들어, K222R, K340R, 또는 K370R)이다. 일부 실시양태에서, 다른 (예를 들어, 비-야생형) 아미노산은 Ala, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, 또는 Val이다.
따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명의 ADC는 a) 아민 공여체 작용제가 위치 295의 내인성 글루타민 및 위치 297의 치환된 글루타민에 부위-특이적으로 접합되는, 위치 N297Q 및 K222R에서의 아미노산 치환; 및 b) 아민 공여체 작용제가 항체의 경쇄의 카르복실 말단의 글루타민-함유 태그(들)에 부위-특이적으로 접합되는, 하나 이상의 글루타민-함유 태그(들)를 포함하고, 약물-항체 비 (DAR)가 약 5-7이다. 일부 실시양태에서, 항체의 경쇄의 카르복실 말단의 글루타민-함유 태그는 GGLLQGA (서열식별번호: 23) 또는 GGLLQGPP (서열식별번호: 22)이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 ADC는 a) 아민 공여체 작용제가 위치 295의 내인성 글루타민 및 위치 297의 치환된 글루타민에 부위-특이적으로 접합되는, 위치 N297Q 및 K222R에서의 아미노산 치환; b) 아민 공여체 작용제가 항체의 경쇄의 카르복실 말단의 글루타민-함유 태그(들)에 부위-특이적으로 접합되는, 하나 이상의 글루타민-함유 태그(들); c) 아민 공여체 작용제가 항체 내의 S60-R61, R108, T135, S160, S168, S190-S192, P189-S192, G200-S202, K222-T225, K222-T223, T223, L251-S254, M252-I253, E294-N297, E293-N297, N297, 및 G385로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 위치의 글루타민-함유 태그 (여기서 글루타민-함유 태그는 항체 내에 삽입되거나 또는 항체 내의 하나 이상의 내인성 아미노산을 교체함)에 추가로 부위-특이적으로 접합되는, 하나 이상의 글루타민-함유 태그(들)를 포함하고, 약물-항체 비는 적어도 약 6이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 발명의 ADC는 a) 아민 공여체 작용제가 위치 295의 내인성 글루타민 및 위치 297의 치환된 글루타민에 부위-특이적으로 접합되는, 위치 N297Q 및 K222R에서의 아미노산 치환; b) 아민 공여체 작용제가 항체의 경쇄의 카르복실 말단의 글루타민-함유 태그(들)에 부위-특이적으로 접합되는, 하나 이상의 글루타민-함유 태그(들); c) 아민 공여체 작용제가 항체의 중쇄의 카르복실 말단의 글루타민-함유 태그에 추가로 부위-특이적으로 접합되는, 하나 이상의 글루타민-함유 태그(들)를 또한 포함하고, 약물-항체 비 (DAR)는 약 6-9이다. 일부 실시양태에서, 항체의 경쇄의 카르복실 말단의 글루타민-함유 태그는 GGLLQGA (서열식별번호: 23) 또는 GGLLQGPP (서열식별번호: 22)이고, 항체의 중쇄의 카르복실 말단의 글루타민-함유 태그는 LLQGA (서열식별번호: 11) 또는 LLQGPP (서열식별번호: 20)이다.
한 변형에서, 본 발명의 ADC는 a) 아민 공여체 작용제가 위치 295의 내인성 글루타민 및 위치 297의 치환된 글루타민에 부위-특이적으로 접합되는, 위치 N297Q 및 K222R에서의 아미노산 치환; b) 아민 공여체 작용제가 항체의 경쇄의 카르복실 말단의 글루타민-함유 태그(들)에 부위-특이적으로 접합되는, 하나 이상의 글루타민-함유 태그(들); c) 아민 공여체 작용제가 항체의 중쇄 내의 아미노산 위치 T135 뒤에서 삽입된 글루타민-함유 태그에 추가로 부위-특이적으로 접합되는, 하나 이상의 글루타민-함유 태그(들)를 포함하고, 약물-항체 비 (DAR)는 약 6-9이다. 일부 실시양태에서, 항체의 경쇄의 카르복실 말단의 글루타민-함유 태그는 GGLLQGA (서열식별번호: 23) 또는 GGLLQGPP (서열식별번호: 22)이고, 항체의 중쇄 내의 T135 뒤에서 삽입된 글루타민-함유 태그는 LLQG (서열식별번호: 2)이다.
또 다른 변형에서, 본 발명의 ADC는 a) 아민 공여체 작용제가 위치 295의 내인성 글루타민 및 위치 297의 치환된 글루타민에 부위-특이적으로 접합되는, 위치 N297Q 및 K222R에서의 아미노산 치환; b) 아민 공여체 작용제가 항체의 경쇄의 카르복실 말단의 글루타민-함유 태그(들)에 부위-특이적으로 접합되는, 하나 이상의 글루타민-함유 태그(들); c) 아민 공여체 작용제가 항체의 중쇄 내의 아미노산 위치 G200-S202의 글루타민-함유 태그에 추가로 부위-특이적으로 접합되는, 하나 이상의 글루타민-함유 태그(들)를 포함하고, 약물-항체 비 (DAR)는 약 6-9이다. 일부 실시양태에서, 항체의 경쇄의 카르복실 말단의 글루타민-함유 태그는 GGLLQGA (서열식별번호: 23) 또는 GGLLQGPP (서열식별번호: 22)이고, 항체의 경쇄 내의 아미노산 위치 G200-S202의 글루타민-함유 태그는 LLQG (서열식별번호: 2)이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 ADC는 a) 아민 공여체 작용제가 위치 295의 내인성 글루타민 및 위치 297의 치환된 글루타민에 부위-특이적으로 접합되는, 위치 N297Q 및 K222R에서의 아미노산 치환; b) 아민 공여체 작용제가 항체의 경쇄의 카르복실 말단의 글루타민-함유 태그(들)에 부위-특이적으로 접합되는, 하나 이상의 글루타민-함유 태그(들); c) 아민 공여체 작용제가 항체의 경쇄 내의 아미노산 위치 G200-S202의 글루타민-함유 태그에 추가로 부위-특이적으로 접합되는, 하나 이상의 글루타민-함유 태그(들); (d) 아민 공여체 작용제가 항체의 중쇄 내의 아미노산 위치 T135 뒤에서 삽입된 글루타민-함유 태그에 추가로 부위-특이적으로 접합되는, 하나 이상의 글루타민-함유 태그(들)를 또한 포함하고, 약물-항체 비 (DAR)는 약 9-11이다. 일부 실시양태에서, 항체의 경쇄의 카르복실 말단의 글루타민-함유 태그는 GGLLQGA (서열식별번호: 23) 또는 GGLLQGPP (서열식별번호: 22)이고, 항체의 경쇄 내의 아미노산 위치 G200-S202의 글루타민-함유 태그는 LLQG (서열식별번호: 2)이며, 항체의 중쇄 내의 T135 뒤에서 삽입된 글루타민-함유 태그는 LLQG (서열식별번호: 2)이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 ADC는 a) 항체의 경쇄의 카르복실 말단; b) 항체 중쇄 내의 아미노산 위치 T135 뒤; 및 c) 항체 경쇄 내의 아미노산 위치 G200-S202 (여기서 내인성 아미노산 잔기가 글루타민-함유 태그로 교체됨)의 글루타민-함유 태그에 부위-특이적으로 접합된 아민 공여체 작용제를 또한 포함하고, 약물-항체 비는 약 5-7이다. 일부 실시양태에서, 항체의 경쇄의 카르복실 말단의 글루타민-함유 태그는 GGLLQGA (서열식별번호: 23) 또는 GGLLQGPP (서열식별번호: 22)이고, 항체의 경쇄 내의 아미노산 위치 G200-S202의 글루타민-함유 태그는 LLQG (서열식별번호: 2)이며, 항체의 중쇄 내의 T135 뒤에서 삽입된 글루타민-함유 태그는 LLQG (서열식별번호: 2)이다.
본 발명의 ADC의 약물-항체 비 (DAR)는 약 5 내지 약 720이다. 일부 실시양태에서, DAR은 적어도 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 및 710 중 어느 것이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 ADC에 대한 글루타민-함유 태그는 아미노산 서열 XXQX (서열식별번호: 37) [식 중, X는 본원에 기술된 바와 같은 통상적인 아미노산 또는 비-통상적인 아미노산일 수 있다]를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, X는 L (Leu), A (Ala), G (Gly), S (Ser), V (Val), F (Phe), Y (Tyr), H (His), R (Arg), N (Asn), E (Glu), D (Asp), C (Cys), Q (Gln), I (Ile), M (Met), P (Pro), T (Thr), K (Lys), 또는 W (Trp)이다. 일부 실시양태에서, 글루타민-함유 태그는 Q, LQG, LLQGG (서열식별번호: 1), LLQG (서열식별번호: 2), LSLSQG (서열식별번호: 3), GGGLLQGG (서열식별번호: 4), GLLQG (서열식별번호: 5), LLQ, GSPLAQSHGG (서열식별번호: 6), GLLQGGG (서열식별번호: 7), GLLQGG (서열식별번호: 8), GLLQ (서열식별번호: 9), LLQLLQGA (서열식별번호: 10), LLQGA (서열식별번호: 11), LLQYQGA (서열식별번호: 12), LLQGSG (서열식별번호: 13), LLQYQG (서열식별번호: 14), LLQLLQG (서열식별번호: 15), SLLQG (서열식별번호: 16), LLQLQ (서열식별번호: 17), LLQLLQ (서열식별번호: 18), LLQGR (서열식별번호: 19), LLQGPP (서열식별번호: 20), LLQGPA (서열식별번호: 21), GGLLQGPP (서열식별번호: 22), GGLLQGA (서열식별번호: 23), LLQGPGK (서열식별번호: 25), LLQGPG (서열식별번호: 26), LLQGP (서열식별번호: 27), LLQP (서열식별번호: 28), LLQPGK (서열식별번호: 29), LLQAPGK (서열식별번호: 30), LLQGAPG (서열식별번호: 31), LLQGAP (서열식별번호: 32), 및 LLQLQG (서열식별번호: 36)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 글루타민-함유 태그는 아미노산 서열 LLQGA (서열식별번호: 11), LQG, GGLLQGA (서열식별번호: 23), LLQGPA (서열식별번호: 21), LLQGPP (서열식별번호: 20), GGLLQGPP (서열식별번호: 22), LLQGSG (서열식별번호: 13), LLQG (서열식별번호: 2), LLQYQG (서열식별번호: 14), LLQLLQG (서열식별번호: 15), LLQLQG (서열식별번호: 36), LLQLLQ (서열식별번호: 18), LLQLQ (서열식별번호: 17), LLQGR (서열식별번호: 19), LLQYQGA (서열식별번호: 12), SLLQG (서열식별번호: 16), 또는 LLQLLQGA (서열식별번호: 10)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 아실 공여체 글루타민-함유 태그는 LGGQGGG (서열식별번호: 38), GGGQGGL (서열식별번호: 39), GXGQGGG (서열식별번호: 40), GGXQGGG (서열식별번호: 41), GGGQXGG (서열식별번호: 42), 및 GGGQGXG (서열식별번호: 43) [식 중, X는 G, A, S, L, V, F, Y, R, N, 또는 E이다]로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하지 않는다. 기타 예시적인 태그가, 예를 들어, US20130230543 및 US2013/0122020에 또한 기술되어 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 바와 같은 ADC의 항체는 카르복실 말단에서의 마지막 아미노산 위치에서 동일한 위치에서의 야생형 항체와 비교하여 아미노산 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형은 아미노산 결실, 삽입, 치환, 돌연변이, 또는 이들의 임의의 조합이다. 일부 실시양태에서, 치환은 야생형 아미노산을 또 다른 아미노산 (예를 들어, 비-야생형 아미노산)으로 교체하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 삽입은 하나 이상의 아미노산(들)을 삽입하는 것 (예를 들어, 1개, 2개, 3개 또는 이를 초과하는 개수의 아미노산을 삽입하는 것)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 다른 (예를 들어, 비-야생형) 또는 삽입된 아미노산은 Arg이다. 일부 실시양태에서, 다른 (예를 들어, 비-야생형) 아미노산은 Ala, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, 또는 Val이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 항체 (예를 들어 항체의 중쇄)의 카르복실 말단에서의 마지막 아미노산이 결실될 수 있고, 폴리펩티드의 C-말단에 조작된 글루타민-함유 태그는 아미노산 서열 LLQGA (서열식별번호: 11) 또는 LLQGPP (서열식별번호: 20)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체는 아미노 말단에서의 첫번째 아미노산 위치에서 동일한 위치에서의 야생형 항체와 비교하여 아미노산 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형은 아미노산 결실, 삽입, 치환, 돌연변이, 또는 이들의 임의의 조합이다. 일부 실시양태에서, 치환은 야생형 아미노산을 또 다른 (예를 들어, 비-야생형) 아미노산으로 교체하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 삽입은 아미노산을 삽입하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 비-야생형 또는 삽입된 아미노산은 Arg이다. 일부 실시양태에서, 다른 (비-야생형 또는 삽입된) 아미노산은 Ala, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, 또는 Val이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 ADC는 전장 항체 중쇄 및 항체 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 항체는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 이중특이적 항체, 미니바디, 디아바디, 또는 항체 단편이다.
일부 실시양태에서, 항체는 IgG이다. 일부 실시양태에서, IgG는 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 항체는 IgA, IgE, IgD, 또는 IgM이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 ADC의 이펙터 기능 (예를 들어, Fcγ3 및/또는 C1q 결합에 의해 측정되는 바와 같음)이 야생형 항체에 비교하여 약 1배, 2배, 3배, 4배, 또는 5배 이하로 감소된다. 일부 실시양태에서, ADC의 항체는 IgG의 이펙터 기능이 야생형 IgG에 비교하여 약 2배 이하로 감소된 IgG이다. 다른 실시양태에서, IgG의 이펙터 기능이 야생형 IgG에 비교하여 약 2배로 감소된다. 다른 실시양태에서, IgG의 이펙터 기능이 야생형 IgG에 비교하여 약 2배 초과로 감소된다. 일부 실시양태에서, ADC의 항체는 IgG의 이펙터 기능이 야생형 IgG에 비교하여 약 1배 이하로 감소된 IgG이다. 다른 실시양태에서, IgG의 이펙터 기능이 야생형 IgG에 비교하여 약 1배로 감소된다. 일부 실시양태에서, IgG의 이펙터 기능이 야생형 IgG에 비교하여 약 1배, 3배, 4배, 또는 5배 초과로 감소된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 ADC의 이펙터 기능 (예를 들어, Fcγ3 및/또는 C1q 결합에 의해 측정되는 바와 같음)이 야생형 항체에 비교하여 적어도 약 1배 내지 3000배 증가된다. 일부 실시양태에서, ADC의 이펙터 기능이 야생형 항체에 비교하여 적어도 약 1 내지 5배, 6 내지 10배, 11 내지 15배, 16 내지 20배, 21 내지 25배, 26 내지 30배, 31 내지 35배, 36 내지 40배, 41 내지 45배, 46 내지 50배, 51 내지 55배, 56 내지 60배, 61 내지 65배, 66 내지 70배, 71 내지 75배, 76 내지 80배, 81 내지 85배, 86 내지 90배, 91 내지 95배, 96 내지 100배, 101 내지 200배, 201 내지 300배, 301 내지 500배, 501 내지 1000배, 1001 내지 1500배, 1501 내지 2000배, 2001 내지 2500배, 2501 내지 3000배로 증가된다. 일부 실시양태에서, ADC의 항체는 IgG의 이펙터 기능이 야생형 IgG에 비교하여 약 1배 내지 300배 증가된 IgG이다. 일부 실시양태에서, IgG의 이펙터 기능이 야생형 IgG에 비교하여 약 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 15배, 20배, 40배, 60배, 80배, 100배, 150배, 200배, 250배, 300배, 400배, 500배, 600배, 700배, 800배, 900배, 1000배, 1500배, 2000배, 2500배, 또는 3000배로 증가된다.
일부 실시양태에서, 아민 공여체 작용제는 식 X-Y-Z [식 중, X는 아민 공여체 단위이고; Y는 링커이며; Z는 작용제 모이어티이다]를 갖는다.
항체에 접합될 수 있는 아민 공여체 작용제의 개수는 1) 항체에 연결/삽입된 글루타민-함유 태그의 개수, 뿐만 아니라 글루타민-함유 태그 상의 글루타민의 개수; 및/또는 2) 항체 상의 내인성 글루타민 (즉, 조작되지 않은 천연 글루타민, 예컨대 가변 도메인, CDR 등 내의 글루타민)의 개수; 및/또는 3) 본원에 기술된 바와 같은 항체 조작 또는 조작된 트랜스글루타미나제에 의해 반응성이게 만들어진 내인성 글루타민의 개수에 의존적이다. 예를 들어, 2개의 아민 공여체 작용제가 2개의 경쇄의 카르복실 말단에서 항체에 부위-특이적으로 접합될 수 있고, 4개의 아민 공여체 작용제가 위치 Q295 및 N297Q에서 항체에 부위-특이적으로 접합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 아민 공여체 작용제는 각각의 접합 위치에서 동일하거나 상이할 수 있다.
본 발명의 아민 공여체 단위는 트랜스글루타미나제에 대한 기질을 제공하여 작용제 모이어티가 글루타민-함유 태그, 내인성 글루타민, 및/또는 반응성 내인성 글루타민을 통해 항체에 접합되게 허용하는 1급 아민 (NH2)이다. 따라서, 글루타민-함유 태그, 내인성 글루타민 및/또는 반응성 내인성 글루타민과 아민 공여체 단위 사이의 결합은 식 CH2-CH2-CO-NH- [식 중 1개의 NH-는 1개의 링커 및 1개 이상의 작용제 모이어티에 연결된다]의 것이다.
본 발명의 링커는 절단성 또는 비-절단성 링커일 수 있다. 예를 들어, 링커 (및 아민 공여체 단위) 또는 아민 공여체 작용제가 항체로부터 방출될 수 있다. 일부 실시양태에서, 링커는 펩티드 링커 (예를 들어, 통상적 및/또는 비-통상적 아미노산(들)) 및/또는 비-펩티드 링커일 수 있다. 비-펩티드 링커의 예는 알킬 링커 및 PEG (폴리에틸렌 글리콜) 링커를 포함한다.
일부 실시양태에서, 아민 공여체 단위-링커 (예를 들어, X-Y)는 작용제 모이어티를 포함하는 선형 단위이다. 다른 실시양태에서, 아민 공여체 단위-링커는 적어도 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12개, 또는 이를 초과하는 개수의 작용제 모이어티를 포함하는 분지형 단위 (예를 들어, 적어도 2개의 단위)이다. 한 변형에서, 분지형 링커 상의 작용제 모이어티는 동일하거나 상이한 작용제 모이어티들일 수 있다.
예시적인 아민 공여체 단위-링커는 Ac-Lys-Gly, 아미노카프로산, Ac-Lys-β-Ala, 아미노-PEG2-C2, 아미노-PEG3-C2, 아미노-PEG6-C2, Ac-Lys-Val-Cit (시트룰린)-PABC (p-아미노벤질옥시카르보닐), 아미노-PEG3-C2-Val-Cit-PABC, 아미노-PEG6-C2-Val-Cit-PABC, 아미노카프로일-Val-Cit-PABC, [(3R,5R)-1-{3-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]프로파노일}피페리딘-3,5-디일]비스-Val-Cit-PABC, [(3S,5S)-1-{3-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]프로파노일}피페리딘-3,5-디일]비스-Val-Cit-PABC-, Ac-Lys-푸트레신, 또는 2-아미노에톡시를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 조작된 폴리펩티드의 작용제 모이어티는 소형 분자, 단백질 또는 폴리펩티드, 및 생체적합성 중합체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 소형 분자는 세포독성제, 면역억제제, 또는 영상화제 (예를 들어, 형광단)이다. 일부 실시양태에서, 세포독성제는 화학요법제이다.
세포독성제의 예는 안트라시클린, 오리스타틴, 돌라스타틴, 콤브레타스타틴, 듀오카르마이신, 피롤로벤조디아제핀 이량체, 인돌리노-벤조디아제핀 이량체, 엔다이인, 겔다나마이신, 메이탄신, 퓨로마이신, 탁산, 빈카 알칼로이드, 캄프토테신, 튜불리신, 헤미아스테를린, 스플라이세오스타틴, 플라디에놀리드, 및 이들의 입체이성질체, 동배체, 유사체 또는 유도체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
안트라시클린은 박테리아인 스트렙토미세스로부터 유래되고, 광범위한 암, 예컨대 백혈병, 림프종, 유방암, 자궁암, 난소암 및 폐암을 치료하는데 사용되었다. 예시적인 안트라시클린은 다우노루비신, 독소루비신 (즉, 아드리아마이신), 에피루비신, 이다루비신, 발루비신, 및 미톡산트론을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
돌라스타틴 및 이의 펩티드 유사체 및 유도체인 오리스타틴은 항암 및 항진균 활성이 있는 것으로 나타난 고도로 강력한 항유사분열제이다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,663,149 및 문헌 [Pettit et al., Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965, 1998]을 참조한다. 예시적인 돌라스타틴 및 오리스타틴은 돌라스타틴 10, 오리스타틴 E, 오리스타틴 EB (AEB), 오리스타틴 EFP (AEFP), MMAD (모노메틸 오리스타틴 D 또는 모노메틸 돌라스타틴 10), MMAF (모노메틸 오리스타틴 F 또는 N-메틸발린-발린-돌라이소류인-돌라프로인-페닐알라닌), MMAE (모노메틸 오리스타틴 E 또는 N-메틸발린-발린-돌라이소류인-돌라프로인-노르에페드린), 5-벤조일발레르산-AE 에스테르 (AEVB), 및 기타 신규 오리스타틴 (예컨대 미국 공개 번호 2013/0129753에 기술된 것)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 오리스타틴은 하기 구조를 갖는 0101 (2-메틸알라닐-N-[(3R,4S,5S)-3-메톡시-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일]-N-메틸-L-발린아미드)이다:
Figure pat00003
일부 실시양태에서, 오리스타틴은 하기 구조를 갖는 3377 (N,2-디메틸알라닐-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-카르복실-2-페닐에틸]아미노}-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필]피롤리딘-1-일}-2-메톡시-1-[(1S)-1-메틸프로필]-4-옥소부틸}-N-메틸-L-발린아미드)이다:
Figure pat00004
일부 실시양태에서, 오리스타틴은 하기 구조를 갖는 3377-OMe (N,2-디메틸알라닐-N-[(3R,4S,5S)-3-메톡시-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-3-{[(2S)-1-메톡시-1-옥소-3-페닐프로판-2-일]아미노}-2-메틸-3-옥소프로필]피롤리딘-1-일}-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일]-N-메틸L-발린아미드)이다:
Figure pat00005
다른 실시양태에서, 오리스타틴은 하기 구조를 갖는 0131 (2-메틸-L-프롤리-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-카르복시-2-페닐에틸]아미노}-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필]피롤리딘-1-일}-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일]-N-메틸-L-발린아미드)이다:
Figure pat00006
다른 실시양태에서, 오리스타틴은 하기 구조를 갖는 0121 (2-메틸-L-프롤리-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2S)-1-메톡시-1-옥소-3-페닐프로판-2-일]아미노}-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필]피롤리딘-1-일}-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일]-N-메틸-L-발린아미드)이다:
Figure pat00007
캄프토테신은 토포이소머라제 I 효소를 억제하는 세포독성 퀴놀린 알칼로이드이다. 캄프토테신 및 이의 유도체의 예는 토포테칸 및 이리노테칸, 및 이들의 대사산물, 예컨대 SN-38을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
콤브레타스타틴은 종양에서의 혈관 파괴 성질이 있는 천연 페놀이다. 예시적인 콤브레타스타틴 및 이의 유도체는 콤브레타스타틴 A-4 (CA-4) 및 옴브라불린을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
듀오카르마이신 및 CC-1065는 세포독성 효능이 있는 DNA 알킬화제이다. 문헌 [Boger and Johnson, PNAS 92:3642-3649 (1995)]을 참조한다. 예시적인 듀오카르마이신 및 CC-1065는 (+)-듀오카르마이신 A 및 (+)-듀오카르마이신 SA, (+)-CC-1065, 및
Figure pat00008
의 구조를 갖는 N~2~-아세틸-L-리실-L-발릴-N~5~-카르바모일-N-[4-({[(2-{[({(1S)-1-(클로로메틸)-3-[(5-{[(1S)-1-(클로로메틸)-5-(포스포노옥시)-1,2-디히드로-3H-벤조[e]인돌-3-일]카르보닐}티오펜-2-일)카르보닐]-2,3-디히드로-1H-벤조[e]인돌-5-일}옥시)카르보닐](메틸)아미노}에틸)(메틸)카르바모일]옥시}메틸)페닐]-L-오르니틴아미드,
Figure pat00009
의 구조를 갖는 N~2~-아세틸-L-리실-L-발릴-N~5~-카르바모일-N-[4-({[(2-{[({(8S)-8-(클로로메틸)-6-[(3-{[(1S)-1-(클로로메틸)-8-메틸-5-(포스포노옥시)-1,6-디히드로피롤로[3,2-e]인돌-3(2H)-일]카르보닐}비시클로[1.1.1]펜트-1-일)카르보닐]-1-메틸-3,6,7,8-테트라히드로피롤로[3,2-e]인돌-4-일}옥시)카르보닐](메틸)아미노}에틸)(메틸)카르바모일]옥시}메틸)페닐]-L-오르니틴아미드,
Figure pat00010
의 구조를 갖는 N~2~-아세틸-L-리실-L-발릴-N~5~-카르바모일-N-[4-({[(2-{[({(8S)-8-(클로로메틸)-6-[(4-{[(1S)-1-(클로로메틸)-8-메틸-5-(포스포노옥시)-1,6-디히드로피롤로[3,2-e]인돌-3(2H)-일]카르보닐}펜타시클로[4.2.0.0~2,5~.0~3,8~.0~4,7~]옥트-1-일)카르보닐]-1-메틸-3,6,7,8-테트라히드로피롤로[3,2-e]인돌-4-일}옥시)카르보닐](메틸)아미노}에틸)(메틸)카르바모일]옥시}메틸)페닐]-L-오르니틴아미드를 포함하지만 이에 제한되지 않는 국제 출원 PCT/IB2015/050280에 개시된 바와 같은 화합물을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
엔다이인은 9- 및 10-원 고리 또는 공액 삼중-이중-삼중 결합의 고리형 시스템의 존재를 특징으로 하는 항-종양 박테리아 생성물의 클래스이다. 예시적인 엔다이인은 칼리케아미신, 에스페라미신, 운시알라미신, 다이네미신, 및 이들의 유도체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
겔다나마이신은 Hsp90 (열 충격 단백질 90)에 결합하는 벤조퀴논 안사마이신 항생제이고, 항종양 약물로서 사용되었다. 예시적인 겔다나마이신은 17-AAG (17-N-알릴아미노-17-데메톡시겔다나마이신) 및 17-DMAG (17-디메틸아미노에틸아미노-17-데메톡시겔다나마이신)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
헤미아스테를린 및 이의 유사체 (예를 들어, HTI-286)는 튜불린에 결합하고, 일반적인 미세관 역학을 파괴하며, 화학양론적 양에서 미세관을 탈중합시킨다.
메이탄신 또는 이의 유사체인 메이탄시노이드는 튜불린 중합 억제를 통해 유사분열 동안 미세관 형성을 억제함으로써 세포 증식을 억제한다. 문헌 [Remillard et al., Science 189:1002-1005 (1975)]을 참조한다. 예시적인 메이탄신 및 메이탄시노이드는 메르탄신 (DM1) 및 이의 유도체, 뿐만 아니라 안사미토신을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
피롤로벤조디아제핀 이량체 (PBD) 및 인돌리노-벤조디아제핀 이량체 (IGN)는 이중나선 DNA에 결합하는 하나 이상의 이민 관능기 또는 이의 등가물을 함유하는 항종양제이다. PBD 및 IGN 분자는 천연 생성물인 아트라마이신을 기초로 하고, 퓨린-구아닌-퓨린 서열을 선호하여 서열-선택적 방식으로 DNA와 상호작용한다. 예시적인 PBD 및 이의 유사체는 SJG-136을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
스플라이세오스타틴 및 플라디에놀리드는 스플라이싱을 억제하고 스플라이세오솜, SF3b와 상호작용하는 항-종양 화합물이다. 스플라이세오스타틴의 예는 스플라이세오스타틴 A, FR901464, 및
Figure pat00011
의 구조를 갖는 (2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-(2-히드라지닐-2-옥소에틸)-4-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 플라디에놀리드의 예는 플라디에놀리드 B, 플라디에놀리드 D, 및 E7107을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
탁산은 항-튜불린 작용제 또는 유사분열 억제제로서 작용하는 디테르펜이다. 예시적인 탁산은 파클리탁셀 (예를 들어, 탁솔(TAXOL)®) 및 도세탁셀 (탁소티어(TAXOTERE)®)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
튜불리신은 미세관을 탈중합시키고 유사분열 정지를 유도하는 것으로 나타난 믹소박테리아 균주로부터 단리된 천연 생성물이다. 예시적인 튜불리신은 튜불리신 A, 튜불리신 B, 및 튜불리신 D를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
빈카 알칼로이드 또한 항-튜불린 작용제이다. 예시적인 빈카 알칼로이드는 빈크리스틴, 빈블라스틴, 빈데신 및 비노렐빈을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 실시양태에서, 작용제 모이어티는 면역억제제이다. 면역억제제의 예는 강시클로비어, 에타너셉트, 타크롤리무스, 시롤리무스, 보클로스포린, 시클로스포린, 라파마이신, 시클로포스파미드, 아자티오프린, 미코페놀레이트 모페틸, 메토트렉세이트, 및 글루코코르티코이드 및 이들의 유사체 및 유도체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 실시양태에서, 작용제 모이어티는 영상화제 (예를 들어, 형광단 또는 킬레이터), 예컨대 플루오레세인, 로다민, 란타니드 인광체, 및 이들의 유도체, 또는 킬레이터에 결합된 방사성 동위원소이다. 형광단의 예는 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC) (예를 들어, 5-FITC), 플루오레세인 아미디트 (FAM) (예를 들어, 5-FAM), 에오신, 카르복시플루오레세인, 에리트로신, 알렉사 플루오르(Alexa Fluor)® (예를 들어, 알렉사 350, 405, 430, 488, 500, 514, 532, 546, 555, 568, 594, 610, 633, 647, 660, 680, 700, 또는 750), 카르복시테트라메틸로다민 (TAMRA) (예를 들어, 5,-TAMRA), 테트라메틸로다민 (TMR), 및 술포로다민 (SR) (예를 들어, SR101)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 킬레이터의 예는 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-N,N',N'',N'''-테트라아세트산 (DOTA), 1,4,7-트리아자시클로노난-1,4,7-트리아세트산 (NOTA), 1,4,7-트리아자시클로노난, 1-글루타르산-4,7-아세트산 (데페록사민), 디에틸렌트리아민펜타아세트산 (DTPA), 및 1,2-비스(o-아미노페녹시)에탄-N,N,N',N'-테트라아세트산) (BAPTA)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 실시양태에서, 작용제 모이어티는 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 항체, 예컨대 인간화, 인간, 키메라, 또는 뮤린 모노클로날 항체이다.
일부 실시양태에서, 작용제 모이어티는 독소 폴리펩티드 (또는 독소 단백질)이다. 독소 폴리펩티드의 예는 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비-결합 활성 단편, 외독소 A 쇄, 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디이(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 피톨라카 아메리카나(Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII, 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아(momordica charantia) 억제제, 쿠르신, 사파오나리아 오피시날리스(sapaonaria officinalis) 억제제, 게올린, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신, 트리코테센, 억제제 시스틴 매듭 (ICK) 펩티드 (예를 들어, 세라토톡신), 및 코노톡신 (예를 들어, KIIIA 또는 SmIIIa)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 실시양태에서, 방사성동위원소 또는 기타 표지가 킬레이터를 보유하는 아민 공여체 작용제에 대한 항체의 접합을 위해 작용제 모이어티 내에 (예를 들어, 킬레이터에 결합하는 것에 의해) 혼입될 수 있다. 방사성 동위원소 또는 기타 표지의 예는 3H, 14C, 15N, 35S, 18F, 32P, 33P, 64Cu, 68Ga, 89Zr, 90Y, 99Tc, 123I, 124I, 125I, 131I, 111In, 131In, 153Sm, 186Re, 188Re, 211At, 212Bi, 및 153Pb를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 실시양태에서, 작용제 모이어티는 생체적합성 중합체이다. 항체의 생물학적 특성을 개선하기 위해, 예를 들어, 혈청 반감기 및 생물활성을 증가시키고/시키거나 생체-내 반감기를 연장시키기 위해, 항체가 글루타민-함유 태그, 내인성 글루타민, 및/또는 반응성 내인성 글루타민을 통해 생체적합성 중합체에 접합될 수 있다. 생체적합성 중합체의 예는 수용성 중합체, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 또는 이의 유도체, 및 쯔비터이온-함유 생체적합성 중합체 (예를 들어, 포스포릴콜린 함유 중합체)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 아민 공여체 작용제 (X-Y-Z)는
Figure pat00012
[식 중, X는 NH2이고 (즉, 따라서 CH2-CH2-CO-NH-로서 글루타민과 공유 결합을 형성함), m은 0 내지 20이고, n은 1 내지 8이고, p는 0 내지 3이고, q는 0 또는 1이고, 아미노산은 임의의 통상적 또는 비-통상적 아미노산이며, Z는 세포독성제 또는 영상화제이다]이다.
통상적 또는 천연 발생 아미노산은 공통적인 측쇄 성질을 기초로 하기의 군으로 분류된다: (1) 비-극성: Met, Ala, Val, Leu, Ile; (2) 전하 없이 극성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) 산성 (음으로 하전됨): Asp, Glu; (4) 염기성 (양으로 하전됨): Lys, Arg; 및 (5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro; 및 (6) 방향족: Trp, Tyr, Phe, His. 통상적인 아미노산은 L 또는 D 입체화학을 포함한다.
비-통상적 아미노산은 비-천연 발생 아미노산이다. 비-통상적 아미노산의 예는 아미노아디프산, 베타-알라닌, 베타-아미노프로피온산, 아미노부티르산, 피페리딘산, 아미노카프로산, 아미노헵탄산, 아미노이소부티르산, 아미노피멜산, 시트룰린, 디아미노부티르산, 데스모신, 디아미노피멜산, 디아미노프로피온산, N-에틸글리신, N-에틸아스파라긴, 히드록시리신, 알로-히드록시리신, 히드록시프롤린, 이소데스모신, 알로-이소류신, N-메틸글리신, 사르코신, N-메틸이소류신, N-메틸발린, 노르발린, 노르류신, 오르니틴, 4-히드록시프롤린, γ-카르복시글루타민, ε-N,N,N-트리메틸리신, ε-N-아세틸리신, O-포스포세린, N-아세틸세린, N-포르밀메티오닌, 3-메틸히스티딘, 5-히드록시리신, σ-N-메틸아르기닌, 및 기타 유사 아미노산 및 아미노산 유도체 (예를 들어, 4-히드록시프롤린)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다
일부 실시양태에서, 아민 공여체 작용제는 반응성 아민 및 작용제 모이어티를 포함하는 생체적합성 중합체이다.
일부 실시양태에서, 아민 공여체 작용제는 알렉사 488 카다베린, 5-FITC 카다베린, 알렉사 647 카다베린, 알렉사 350 카다베린, 5-TAMRA 카다베린, 5-FAM 카다베린, SR101 카다베린, 5,6-TAMRA 카다베린, 5-FAM 리신, Ac-Lys-Gly-MMAD, 아미노-PEG3-C2-MMAD, 아미노-PEG6-C2-MMAD, 아미노-PEG3-C2-아미노-노나노일-MMAD, 아미노카프로일-Val-Cit-PABC-MMAD, Ac-Lys-β-Ala-MMAD, 아미노카프로일-MMAD, 아미노-PEG6-C2-Val-Cit-PABC-MMAD, Ac-Lys-Val-Cit-PABC-MMAD, Ac-Lys-Val-Cit-PABC-0101, 아미노-PEG3-C2-Val-Cit-PABC-MMAD, 아미노-PEG6-C2-Val-Cit-PABC-0101, 아미노카프로일-MMAE, 아미노-PEG3-C2-MMAE, 아미노-PEG2-C2-MMAE, 아미노카프로일-MMAF, 아미노카프로일-Val-Cit-PABC-MMAE, 아미노-PEG6-C2-Val-Cit-PABC-MMAF, 아미노카프로일-Val-Cit-PABC-MMAF, 아미노-PEG2-C2-MMAF, 아미노-PEG3-C2-MMAF, 푸트레시닐-겔다나마이신, Ac-Lys-푸트레시닐-겔다나마이신, 아미노카프로일-3377, 아미노카프로일-0131, 아미노-PEG6-C2-0131, 아미노-PEG6-C2-3377, 아미노카프로일-0121, 아미노-PEG6-C2-0121, [(3R,5R)-1-{3-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]프로파노일}피페리딘-3,5-디일]비스-Val-Cit-PABC-MMAD, [(3R,5R)-1-{3-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]프로파노일}피페리딘-3,5-디일]비스-Val-Cit-PABC-MMAE, 2-아미노에톡시-PEG6-NODAGA (또는 2,2'-(7-(1-아미노-28-카르복시-25-옥소-3,6,9,12,15,18,21-헵타옥사-24-아자옥타코산-28-일)-1,4,7-트리아조난-1,4-디일)디아세트산), 및 N-2-아세틸-L-리실-L-발릴-N~5~-카르바모일-N-[4-({[(2-{[(3R,5S,7R,8R)-8-히드록시-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-히드록시펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]아세틸}히드라지닐)카르보닐]옥시}메틸)페닐]-L-오르니틴아미드로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 아민 공여체 작용제는 Ac-Lys-Val-Cit-PABC-MMAD, Ac-Lys-Val-Cit-PABC-0101, 또는 아미노-PEG6-C2-MMAD이다. 일부 실시양태에서, 아실 공여체 글루타민-함유 태그는 아미노산 서열 GGLLQGA (서열식별번호: 23) 또는 GGLLQGPP (서열식별번호: 22), 및 추가적으로 LLQGA (서열식별번호: 11), LLQGPP (서열식별번호: 20) 또는 LLQG (서열식별번호: 2)를 포함하고, 아민 공여체 작용제는 Ac-Lys-Val-Cit-PABC-MMAD, Ac-Lys-Val-Cit-PABC-0101, 및/또는 아미노-PEG6-C2-MMAD이다. 아민 공여체 작용제의 예시적인 구조가 표 2에서 열거된다.
<표 2>
Figure pat00013
Figure pat00014
Figure pat00015
Figure pat00016
Figure pat00017
Figure pat00018
더 고도로 로딩된 항체-약물 접합체의 제조 방법
본원에 기술된 ADC의 제조 방법이 또한 제공된다. 한 측면에서, 본 발명은 a) 항체 및 글루타민-함유 태그, 및/또는 내인성 및/또는 반응성 내인성 글루타민이 있는 항체를 포함하는 항체-T 분자를 제공하는 단계; b) 트랜스글루타미나제 (예를 들어, 조작된 트랜스글루타미나제 또는 정제된 트랜스글루타미나제)의 존재 하에 아민 공여체 작용제를 항체-T 분자와 접촉시키는 단계; 및 c) 항체-T가 아민 공여체 작용제에 공유결합으로 연결되게 하여, 항체-약물 접합체를 형성시키는 단계를 포함하는, 식 항체-(T-(X-Y-Za)b)c [식 중, T는 1) 특이적 부위에서 조작된 글루타민-함유 태그, 2) 내인성 글루타민, 및/또는 3) 항체 조작 또는 조작된 트랜스글루타미나제에 의해 반응성이게 만들어진 내인성 글루타민이고; X는 아민 공여체 단위이고; Y는 링커이며; Z는 작용제 모이어티이고; X-Y-Z는 글루타민-함유 태그, 내인성 글루타민, 및/또는 반응성 내인성 글루타민에 부위-특이적으로 접합된 아민 공여체 작용제이고; a는 1 내지 6의 정수이고; b는 1 내지 6의 정수이고; c는 1 내지 20의 정수이며; a, b, 및 c의 곱 (약물-항체 비)은 적어도 약 5이다]를 포함하는 ADC의 제조 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 항체-T 분자는 CHO 세포에서 발현된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 방법을 사용하여 제조된 ADC는 접합 효율이 적어도 약 51％이다. 일부 실시양태에서, ADC는 접합 효율이 약 51％-60％, 61％-70％, 71％-80％, 81％-90％, 또는 91％-100％이다. 일부 실시양태에서, ADC는 접합 효율이 약 55％, 60％, 65％, 70％, 75％, 80％, 85％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％, 99.5％, 99.6％, 99.7％, 99.8％, 99.9％, 또는 100％이다.
일부 실시양태에서, 접촉된 아민 공여체 작용제와 접촉된 항체-T 분자 사이의 몰 농도 비는 약 4:1 내지 약 10000:1이다. 예를 들어, 트랜스글루타미나제-촉매 접합 반응을 위해 로딩 또는 사용된 아민 공여체 작용제 (예를 들어, 세포독성 약물)과 항체 (예를 들어, 글루타민-함유 태그에 부착되거나 또는 천연/반응성 글루타민을 함유함) 사이의 몰 농도 비는 약 20:1일 수 있다. 일부 실시양태에서, 접촉된 아민 공여체 작용제와 접촉된 항체-T 분자 사이의 농도 비는 약 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 15:1, 20:1, 25:1, 30:1, 35:1, 40:1, 45:1, 50:1, 60:1, 70:1, 80:1, 90:1, 100:1, 200:1, 300:1, 400:1, 500:1, 600:1, 700:1, 800:1, 900:1, 1000:1, 2000:1, 3000:1, 4000:1, 5000:1, 6000:1, 7000:1, 8000:1, 9000:1, 또는 10000:1이다.
일부 실시양태에서, 항체가 특정 부위의 글루타민-함유 태그, 내인성 글루타민, 및/또는 반응성 내인성 글루타민을 통해 아민 공여체 작용제와 접합되는 경우, ADC는 더 안정적이고/이거나 (예를 들어, 생체-내 ADC 반감기가 더 길고/길거나), 노출이 더 높다. 예를 들어, N297Q 및 K222R의 아미노 변형; 항체의 경쇄 및/또는 중쇄의 카르복실 말단, 및/또는 본원에 기술된 바와 같은 항체 경쇄 또는 중쇄 내의 하나 이상의 위치 (예를 들어 표 1 참조)의 글루타민-함유 태그(들)를 포함하는 ADC는 말레이미드 결합이 있는 통상적인 ADC보다 더 안정적이다.
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 방법은 정제 단계를 추가로 포함한다. 본원에 기술된 ADC를 다양한 정제 방법, 예를 들어, 히드록실아파타이트 크로마토그래피; 투석; 친화력 크로마토그래피; 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC) (예를 들어, HIC 상에서의 분획화); 황산암모늄 침전; 폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜 유도체 침전, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피; 역상 HPLC; 실리카 상에서의 크로마토그래피; 크로마토포커싱; SDS-PAGE, 겔 여과, 크기 배제 크로마토그래피, 및 약한 분배성(weak partitioning) 크로마토그래피를 사용하여 정제할 수 있다.
일부 실시양태에서, 적어도 1회의 정제 단계가 친화력 크로마토그래피 방법의 단계를 포함한다. 단백질 A 리간드 (합성, 재조합 또는 천연)가 본원에 기술된 조작된 Fc-함유 폴리펩티드 접합체를 친화력-정제하는데 사용될 수 있다. 합성 또는 재조합 단백질 A 리간드를 지이 헬스케어(GE Healthcare) (뉴저지주 피스카타웨이), 피어스(Pierce) (일리노이주 록포드), 시그마-알드리치 (미주리주 세인트루이스), 또는 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems) (캘리포니아주 포스터 시티)로부터 상업적으로 구입할 수 있고, 천연 단백질 A 리간드 (예를 들어, 맵셀렉트(MABSELECT)™, 프로셉(PROSEP)™ Va, 및 프로셉™ 울트라 플러스(Ultra Plus))를 지이 헬스케어 (뉴저지주 피스카타웨이) 또는 밀리포어(Millipore) (매사추세츠주 빌레리카)로부터 상업적으로 구입할 수 있다.
일부 실시양태에서, 정제 단계로부터 생성된 본원에 기술된 바와 같은 정제된 ADC는 고도로 순수하고, 즉 적어도 약 70％-75％, 75％-80％, 80％-85％, 85％-90％, 90％-95％, 95％-98％, 또는 99％ 순수하다. 예를 들어, 정제된 ADC는 약 80％, 85％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 또는 99％ 순수하다.
약물이 고도로 로딩된 항체-약물 접합체의 사용 방법
본 발명의 ADC는 치료적 처치 방법 및 진단적 처치 방법을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 용도에서 유용하다.
한 측면에서, 본 발명은 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 바와 같은 ADC를 포함하는 유효량의 조성물 (예를 들어, 제약 조성물)을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 암 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법이 제공된다. 본원에서 사용된 바와 같이, 암은 고형 암 (예컨대 방광암, 유방암, 자궁경부암, 융모막암종, 결장암, 식도암, 위암, 교모세포종, 두경부암, 신장암, 폐암, 간암, 폐암 (예를 들어, 비-소세포 폐암 (NSCLC)), 구강암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 및 피부암); 및 액체 암 (예컨대 급성 림프모구성 백혈병 (ALL), 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 급성 골수성 백혈병 (AML), 만성 골수성 백혈병 (CML), 모발상 세포 백혈병 (HCL), T-세포 전림프구성 백혈병 (T-PLL), 거대 과립 림프구성 백혈병, 다발골수종, 비-호지킨 림프종 (NHL) (소포성 림프종 (FL) 및 미만성 거대 B-세포 림프종 (DLBCL) 포함), 및 성인 T-세포 백혈병)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 바와 같은 ADC를 포함하는 유효량의 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 종양 성장 또는 진행의 억제를 필요로 하는 대상체에서 종양 성장 또는 진행을 억제하는 방법이 제공된다. 다른 실시양태에서, 본원에 기술된 바와 같은 ADC를 포함하는 유효량의 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 암 세포 또는 종양 (예를 들어, 고형 또는 액체 종양)의 전이의 억제를 필요로 하는 대상체에서 암 세포 또는 종양 (예를 들어, 고형 또는 액체 종양)의 전이를 억제하는 방법이 제공된다. 다른 실시양태에서, 본원에 기술된 바와 같은 ADC를 포함하는 유효량의 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 종양 퇴행의 유도를 필요로 하는 대상체에서 종양 퇴행을 유도하는 방법이 제공된다.
또 다른 측면에서, 생체 내에서 또는 시험관 내에서 암-관련 단백질 (예를 들어, Trop-2, BRCA1, BRCA2, HER2, VEGF, CD20, CD25, EFGR, 5T4, CD22 등)과 연관된 병태를 검출, 진단 및/또는 모니터링하는 방법이 제공된다. 따라서, 일부 실시양태에서, a) ADC와 암-관련 단백질의 결합을 초래하는 조건 하에 대상체의 샘플을 본원에 기술된 바와 같은 ADC와 접촉시키는 단계, 및 b) 암-관련 단백질에 대한 ADC의 결합을 결정하는 단계를 포함하는, 암에 걸린 것으로 추정되는 대상체에서 암을 진단하는 방법이 제공된다.
본원에 기술된 바와 같은 ADC 내의 작용제 모이어티는 검출가능한 모이어티 예컨대 영상화제 및 효소-기질 표지일 수 있다. 본원에 기술된 바와 같은 ADC는 생체-내 진단 검정법, 예컨대 생체-내 영상화 (예를 들어, PET 또는 SPECT), 또는 염색 시약용으로 사용될 수도 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 방법은 대상체를 추가적인 형태의 요법으로 치료하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 추가적인 형태의 요법은 화학요법, 방사선, 수술, 호르몬 요법 및/또는 추가적인 면역요법을 포함하지만 이에 제한되지 않는 추가적인 항암 요법이다.
일부 실시양태에서, 추가적인 형태의 요법은 본원에 기술된 바와 같은 ADC에 더하여 하나 이상의 치료제를 투여하는 것을 포함한다. 치료제는 제2 ADC (예를 들어, 통상적인 ADC 예컨대 브렌툭시맙 베도틴 (애드세트리스®) 및 아도-트라스투주맙 엠탄신 (캐싸일라®)), 항체 (예를 들어, 항-VEGF 항체, 항-HER2 항체, 항-CD25 항체, 및/또는 항-CD20 항체), 혈관형성 억제제, 세포독성제 (예를 들어, 도세탁셀, 시스플라틴, 독소루비신, 미토마이신, 타목시펜, 또는 플루오로우라실), 및 항염증제 (예를 들어, 프레드니손, 및 프로게스테론)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
제약 조성물
본 발명은 제약상 허용되는 부형제 또는 담체 내의 본원에 기술된 바와 같은 더 고도로 로딩된 ADC를 포함하는 제약 조성물을 또한 제공한다. ADC는 단독으로 또는 하나 이상의 다른 본 발명의 ADC와 조합되어 또는 하나 이상의 다른 약물과 조합되어 (또는 이들의 임의의 조합으로서) 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 ADC는 통상적인 ADC (예를 들어, 1-4의 DAR) 또는 1-4의 DAR의 본원에 기술된 바와 같은 트랜스글루타미나제-매개 접합 기술을 이용한 부위-특이적 ADC와 조합되어 투여될 수 있다. 따라서 본 발명의 방법 및 용도는 하기에 상술된 바와 같은, 다른 활성 작용제와의 조합물 (공동-투여)의 실시양태를 또한 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "공동-투여", "공동-투여된", 또는 "~와 조합하여"라는 용어는 하기를 의미하도록 의도되고, 하기를 지칭한다: (i) 본원에 개시된 ADC 및 치료제(들)의 조합물을 치료를 필요로 하는 환자에게 동시에 투여하고, 여기서 이러한 성분들은 함께 단일 투여 형태로 제제화되고, 이러한 단일 투여 형태가 상기 성분들을 실질적으로 동시에 상기 환자에게 방출함; (ii) 본원에 개시된 ADC 및 치료제(들)의 조합물을 치료를 필요로 하는 환자에게 실질적으로 동시에 투여하고, 여기서 이러한 성분들이 서로 분리되어 개별적인 투여 형태로 제제화되고, 이러한 투여 형태들을 상기 환자가 실질적으로 동시에 복용하여, 상기 성분들이 실질적으로 동시에 상기 환자에게 방출됨; (iii) 본원에 개시된 ADC 및 치료제(들)의 조합물을 치료를 필요로 하는 환자에게 순차적으로 투여하고, 여기서 이같은 성분들은 서로 분리되어 개별적인 투여 형태로 제제화되고, 이러한 투여 형태들을 상기 환자가 각각의 투여 사이의 유의한 시간 간격으로 연속적으로 복용하여, 상기 성분들이 실질적으로 상이한 시간에 상기 환자에게 방출됨; 및 (iv) 본원에 개시된 ADC 및 치료제(들)의 조합물을 치료를 필요로 하는 환자에게 순차적으로 투여하고, 이때 이러한 성분들은 함께 단일 투여 형태로 제제화되고, 이러한 단일 투여 형태가 상기 성분들을 제어 방식으로 방출하여, 이들이 동반적으로, 연속적으로, 및/또는 중첩되어 동시에 및/또는 상이한 시간에 상기 환자에게 방출됨.
일반적으로, 본원에 개시된 ADC는 하나 이상의 제약상 허용되는 부형제(들)와 함께 제형으로서 투여되는데 적절하다. '부형제'라는 용어는 본 발명의 화합물(들) 이외의 임의의 성분을 기술하도록 본원에서 사용된다. 부형제(들)의 선택은 특정 투여 방식, 용해도 및 안정성에 대한 부형제의 효과, 및 투여 형태의 성질과 같은 요인에 크게 의존적이다. 본원에서 사용된 바와 같이, "제약상 허용되는 부형제"는 생리학적으로 상용성인 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항박테리아 및 항진균 작용제, 등장성 및 흡수 지연 작용제 등을 포함한다. 제약상 허용되는 부형제의 일부 예는 물, 염수, 포스페이트 완충 염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등, 뿐만 아니라 이들의 조합물이다. 일부 실시양태에서, 당, 폴리알콜 (예를 들어, 만니톨, 소르비톨) 또는 염화나트륨을 포함하지만 이에 제한되지 않는 등장성 작용제가 제약 조성물 내에 포함된다. 제약상 허용되는 물질의 추가적인 예는 습윤화제 또는 미량의 보조 물질 예컨대 습윤화 또는 유화 작용제, 방부제 또는 완충제를 포함하지만, 이에 제한되지 않고, 이들은 항체의 저장 기간 또는 유효성을 강화한다.
본 발명은 평균 약물-항체 비 (DAR)가 약 5.0 내지 약 720.0인, 다수의 본원에 기술된 바와 같은 본 발명의 더 고도로 로딩된 ADC를 포함하는 제약 조성물을 또한 제공한다. 일부 실시양태에서, 평균 DAR은 적어도 약 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9.0, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9, 10.0, 10.5, 11.0, 11.5, 12.0, 12.5, 13.0, 13.5, 14.0, 14.5, 15.0, 16.0, 16.5, 17.0, 17.5, 18.0, 18.5, 19.0, 19.5, 20.0, 30.0, 40.0, 50.0, 60.0, 70.0, 80.0, 90.0, 100.0, 110.0, 120.0, 130.0, 140.0, 150.0, 200.0, 250.0, 300.0, 350.0, 400.0, 450.0, 500.0, 550.0, 600.0, 650.0, 또는 700.0이다.
한 변형에서, 본 발명은 적어도 하나의 ADC가 본원에 기술된 바와 같은 본 발명의 고도로 로딩된 ADC이고, 평균 약물-항체 비가 약 4.1 내지 약 720.0인, 다수의 ADC를 포함하는 제약 조성물을 추가로 제공한다. 일부 실시양태에서, 평균 DAR은 적어도 약 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9.0, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9, 10.0, 10.5, 11.0, 11.5, 12.0, 12.5, 13.0, 13.5, 14.0, 14.5, 15.0, 16.0, 16.5, 17.0, 17.5, 18.0, 18.5, 19.0, 19.5, 20.0, 30.0, 40.0, 50.0, 60.0, 70.0, 80.0, 90.0, 100.0, 110.0, 120.0, 130.0, 140.0, 150.0, 200.0, 250.0, 300.0, 350.0, 400.0, 450.0, 500.0, 550.0, 600.0, 650.0, 또는 700.0이다. 예를 들어, 제약 조성물은 하나 이상의 본원에 기술된 바와 같은 DAR이 적어도 약 5인 부위-특이적 ADC, 및 하나 이상의 DAR이 1, 2, 3, 또는 4인 부위-특이적 ADC (본원에 기술된 바와 같은 트랜스글루타미나제-매개 접합 기술을 사용함)를 포함할 수 있다. 또 다른 예로서, 제약 조성물은 1) 하나 이상의 본원에 기술된 바와 같은 DAR이 적어도 약 5인 부위-특이적 ADC, 2) 하나 이상의 DAR이 1, 2, 3, 또는 4인 부위-특이적 ADC (본원에 기술된 바와 같은 트랜스글루타미나제-매개 접합 기술을 사용함), 및 3) 하나 이상의 DAR이 1, 2, 3, 4, 또는 이를 초과하는 값인 말레이미드 결합이 있는 통상적인 ADC를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 공지된 기술 예컨대 PCT 공개 WO98/52976 및 WO00/34317에 예를 들어 기술된 것을 사용하여 대상체에 투여했을 때 면역원성을 감소시키도록 본원에 기술된 ADC를 탈면역화시킬 수 있다.
본 발명의 제약 조성물 및 이의 제조 방법은 관련 분야의 통상의 기술자에게 자명하다. 예를 들어, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 22nd Edition (Mack Publishing Company, 2012)]에서 이같은 조성물 및 이의 제조 방법을 확인할 수 있다. 바람직하게는 제약 조성물이 GMP 조건 하에 제작된다.
본 발명의 제약 조성물은 벌크(bulk)로, 단일 단위 용량으로서, 또는 다수의 단일 단위 용량으로서 제조, 포장 또는 판매될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, "단위 용량"은 미리 정해진 양의 활성 성분을 포함하는 제약 조성물의 분리된 양이다. 일반적으로 활성 성분의 양은 대상체에게 투여될 활성 성분의 투여량, 또는 이같은 투여량의 편리한 분율, 예를 들어, 이같은 투여량의 1/2 또는 1/3과 동일하다. 관련 기술 분야에서 허용되는 펩티드, 단백질 또는 항체 투여를 위한 임의의 방법을 본원에 개시된 조작된 폴리펩티드 접합체에 적절하게 사용할 수 있다.
본 발명의 제약 조성물은 전형적으로 비경구 투여에 적절하다. 제약 조성물의 비경구 투여는 대상체의 조직에 물리적으로 구멍을 내고, 조직 내에 구멍을 통해 제약 조성물을 투여하여, 일반적으로 혈류, 근육 또는 내부 장기 내로의 직접적인 투여를 초래하는 것을 특징으로 하는 임의의 투여 경로를 포함한다. 예를 들어, 비경구 투여는 조성물의 주사, 수술 절개를 통한 조성물의 적용, 조직-투과성 비-수술 상처를 통한 조성물의 적용 등에 의한 제약 조성물 투여를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 특히, 비경구 투여는 피하, 복막내, 근육내, 흉골내, 정맥내, 동맥내, 경막내, 뇌실내, 요도내, 두개내, 활막내 주사 또는 주입; 및 신장 투석 주입 기술을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 비경구 투여는 정맥내 또는 피하 경로이다.
전형적으로, 비경구 투여에 적절한 제약 조성물의 제형은 제약상 허용되는 담체, 예컨대 멸균수 또는 멸균 등장 염수와 조합된 활성 성분을 일반적으로 포함한다. 이같은 제형은 볼루스 투여 또는 연속 투여에 적절한 형태로 제조, 포장 또는 판매될 수 있다. 주사가능한 제형은 단위 투여량 형태로, 예컨대 앰풀로 또는 방부제를 함유하는 다중 용량 용기로 제조, 포장 또는 판매될 수 있다. 비경구 투여용 제형은 현탁액, 용액, 유성 또는 수성 비히클 내의 에멀션, 페이스트 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 이같은 제형은 현탁제, 안정화제 또는 분산제를 포함하지만 이에 제한되지 않는 하나 이상의 추가적인 성분을 추가로 포함할 수 있다. 비경구 투여용 제형의 한 실시양태에서, 적절한 비히클 (예를 들어 발열원이 없는 멸균수)로 재구성시킨 후에 재구성된 조성물을 비경구 투여하기 위한 건조 (즉 분말 또는 과립) 형태로 활성 성분이 제공된다. 비경구 제형은 부형제 예컨대 염, 탄수화물 및 완충제 (바람직하게는 pH 3 내지 9)를 함유할 수 있는 수성 용액을 또한 포함하지만, 일부 용도의 경우, 이는 비-수성 멸균 용액으로서 또는 적절한 비히클 예컨대 발열원이 없는 멸균수와 함께 사용될 건조 형태로서 더 적절하게 제형될 수 있다. 예시적인 비경구 투여 형태는 멸균 수성 용액, 예를 들어, 수성 프로필렌 글리콜 또는 덱스트로스 용액 내의 용액 또는 현탁액을 포함한다. 원한다면, 이같은 투여 형태는 적절하게 완충될 수 있다. 비경구적으로 투여할 수 있는 유용한 기타 제형은 미세결정질 형태의 활성 성분 또는 리포솜 제제 내의 활성 성분을 포함하는 것을 포함한다. 비경구 투여용 제형은 즉각적이고/이거나 변형된 방출이도록 제형될 수 있다. 변형 방출 제형은 제어, 지연, 지속, 펄스형, 표적화 및 프로그램 방출 제형을 포함한다. 예를 들어, 한 측면에서, 필요하다면 상기 열거된 성분들 중 하나 또는 이들의 조합물과 함께, 조작된 Fc-함유 폴리펩티드, 예를 들어, 항체-약물 접합체 또는 이중특이적 항체를 필요한 양으로 적합한 용매 내에 혼입한 후, 멸균 여과함으로써 주사가능한 멸균 용액이 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 기본적인 분산 매질 및 상기 열거된 것들로부터의 필요한 기타 성분을 함유하는 멸균 비히클 내로 활성 화합물을 혼입함으로써 제조된다. 주사가능한 멸균 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 앞서 멸균 여과된 용액으로부터 활성 성분 + 임의의 추가적인 원하는 성분의 분말이 산출되는 진공 건조 및 동결 건조이다. 예를 들어, 코팅제 예컨대 레시틴의 사용, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지, 및 계면활성제의 사용에 의해, 용액의 적절한 유동성이 유지될 수 있다. 조성물 내에 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어, 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 포함시키는 것에 의해 주사가능한 조성물의 장기 흡수가 달성될 수 있다.
최적의 원하는 반응을 제공하도록 투여 요법이 조정될 수 있다. 예를 들어, 단일 볼루스가 투여될 수 있거나, 여러 분할 용량이 경시적으로 투여될 수 있거나, 또는 치료 상황의 요건에 의해 지시되는 바와 같이 용량이 비례적으로 감소 또는 증가될 수 있다. 투여 용이성 및 투여량 균일성을 위해 비경구 조성물을 투여량 단위 형태로 제형하는 것이 특히 유리하다. 투여량 단위 형태는, 본원에서 사용된 바와 같이, 치료될 환자/대상체에 대한 단위성 투여량으로서 적절한 물리적으로 분리된 단위를 지칭하고, 각각의 단위는 필요한 제약 담체와 함께 원하는 치료 효과를 일으키도록 계산된 미리 정해진 양의 활성 화합물을 함유한다. 본 발명의 투여량 단위 형태에 대한 상세사항은 (a) 작용제 모이어티 (예를 들어, 소형 분자 예컨대 세포독성제)의 독특한 특성, 및 달성될 특정한 치료 또는 예방 효과, 및 (b) 개체에서의 민감성의 처치를 위한 이같은 활성 화합물을 배합하는 분야의 고유한 제한사항에 의해 일반적으로 지시되고, 이에 직접적으로 좌우된다.
따라서, 통상의 기술자는, 본원에서 제공된 개시내용을 기초로, 치료 분야에 널리 공지된 방법에 따라 용량 및 투약 요법이 조정된다는 것을 이해할 것이다. 즉, 허용가능한 최대 용량이 쉽게 확립될 수 있고, 환자에게 검출가능한 치료 이익을 제공하는 유효량이 또한 결정될 수 있으며, 환자에게 검출가능한 치료 이익을 제공하도록 각각의 작용제를 투여하기 위한 일시적인 요구사항도 결정될 수 있다. 따라서, 특정 용량 및 투여 요법이 본원에서 예시되지만, 이러한 예는 본 발명의 실행에서 환자에게 제공될 수 있는 용량 및 투여 요법을 결코 제한하지 않는다.
투여량 값이 완화될 병태의 유형 및 중증도에 따라 변할 수 있고, 단일 또는 다중 용량을 포함할 수 있다는 것을 주지하여야 한다. 임의의 특정 대상체에 대해, 개별적인 요구 및 조성물을 투여하거나 투여를 감독하는 자의 전문적인 판단에 따라 구체적인 투여 요법이 경시적으로 조정되어야 한다는 것과 본원에 기재된 투여량 범위는 예시적일 뿐이고 청구된 조성물의 범주 또는 실행을 제한하도록 의도되지 않는다는 것을 추가로 이해하여야 한다. 추가로, 본 발명의 조성물의 투여 요법은 질환의 유형, 환자의 연령, 체중, 성별, 의학적 상태, 상태의 중증도, 투여 경로, 및 사용된 특정 항체를 포함하는 다양한 요인을 기초로 할 수 있다. 따라서, 투여 요법이 광범위하게 변할 수 있지만, 표준 방법을 사용하여 일상적으로 결정될 수 있다. 예를 들어, 임상 효과, 예컨대 독성 효과 및/또는 실험값을 포함할 수 있는 약동학 또는 약력학 파라미터를 기초로 용량이 조정될 수 있다. 따라서, 본 발명은 통상의 기술자에 의해 결정되는 바와 같은 환자-내 용량 상승을 포함한다. 적합한 투여량 및 요법을 결정하는 것은 관련 분야에 널리 공지되어 있고, 본원에 개시된 교시내용이 제공되면 통상의 기술자에 의해 달성되는 것으로 이해될 것이다.
인간 대상체에게 투여하는 경우, 당연히 투여 방식에 의존적으로, 본원에 개시된 ADC의 총 1개월 용량은 전형적으로 환자 당 약 0.01 mg 내지 약 1200 mg의 범위이다. 예를 들어, 정맥내 1개월 용량은 약 1 내지 약 1000 mg/환자를 요구할 수 있다. 총 1개월 용량은 단일 용량 또는 분할 용량으로 투여될 수 있고, 의사의 재량으로, 본원에서 제공된 전형적인 범위를 벗어날 수 있다.
본원에 개시된 바와 같은 ADC의 치료적 또는 예방적 유효량에 대한 예시적인 비-제한적 범위는 약 0.01 내지 약 1000 mg/환자/월이다. 특정 실시양태에서, ADC가 약 1 내지 약 200 또는 약 1 내지 약 150 mg/환자/월로 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 환자는 인간이다.
키트
본 발명은 상기 기술된 장애의 치료에서 사용하기 위한 키트 (또는 제작품)를 또한 제공한다. 본 발명의 키트는 정제된 ADC를 포함하는 하나 이상의 용기 및 질환 치료를 위해 접합체를 사용하기 위한 설명서를 포함한다. 예를 들어, 설명서는 질환, 예컨대 암 (예를 들어, 고형 또는 액체 암)을 치료하기 위해 ADC를 투여하는 것의 설명을 포함한다. 키트는 개체가 질환에 걸렸는지 여부 및 질환 단계를 확인하는 것을 기초로 치료에 적절한 개체를 선택하는 것의 설명을 추가로 포함할 수 있다.
ADC의 사용에 관련된 설명서는 의도된 치료를 위한 투여량, 투약 일정 및 투여 경로에 관한 정보를 일반적으로 포함한다. 용기는 단위 용량, 벌크 포장 (예를 들어, 다중-용량 포장), 또는 하위-단위 용량일 수 있다. 본 발명의 키트에서 공급되는 설명서는 전형적으로 표지 또는 포장 삽입물 (예를 들어, 키트 내에 포함된 종이 시트) 상의 서면 설명서이지만, 기계에서 판독가능한 설명서 (예를 들어, 자기 또는 광학 저장 디스크에 실린 설명서)가 또한 허용될 수 있다.
본 발명의 키트는 적절한 포장재 내에 존재한다. 적절한 포장재는 바이알, 병, 단지, 가요성 포장재 (예를 들어, 밀봉된 마일라(Mylar) 또는 플라스틱 백) 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 특정 장치, 예컨대 흡입기, 비강 투여 장치 (예를 들어, 연무기) 또는 주입 장치 예컨대 미니펌프와 함께 사용하기 위한 포장이 또한 구상된다. 키트에 멸균 접근 포트가 있을 수 있다 (예를 들어, 용기가 피하 주사 바늘이 관통할 수 있는 마개가 있는 바이알 또는 정맥내 용액 백일 수 있다). 용기에도 멸균 접근 포트가 있을 수 있다 (예를 들어, 용기가 피하 주사 바늘이 관통할 수 있는 마개가 있는 바이알 또는 정맥내 용액 백일 수 있다). 조성물 내의 적어도 하나의 활성 작용제가 본원에 기술된 바와 같은 더 고도로 로딩된 ADC이다. 용기는 제2의 제약상 활성인 작용제를 추가로 포함할 수 있다.
키트는 임의적으로 추가적인 성분 예컨대 완충제 및 설명적인 정보를 제공할 수 있다. 일반적으로, 키트는 용기, 및 용기 상에 있거나 용기와 함께 있는 표지 또는 포장 삽입물(들)을 포함한다.
실시예
본원에 기술된 실시예 및 실시양태는 단지 예시적인 목적을 위한 것이고, 이를 고려하여 다양한 변형 또는 변화가 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 제안될 것이며, 이러한 변형 또는 변화는 본 출원의 취지 및 범주 내에 포함되어야 하는 것으로 이해된다.
실시예 1: 표적을 고도로 발현하는 세포 (BxPC3, Trop2 +++)에서의 점차적으로 더 고도로 로딩된, 부위-특이적으로 접합된 항-Trop-2-ADC의 세포독성
본 실시예는 표적을 고도로 발현하는 BxPC3 세포에서의 더 고도로 로딩된 ADC (부위-특이적 및 통상적)의 시험관-내 세포독성을 예시한다.
항체-약물 접합
a. 트랜스글루타미나제-매개 항체-약물 접합
다양한 아미노산 위치의 글루타민-함유 트랜스글루타미나제 ("Q") 태그 (예를 들어, TG6, LCQ04, H7c, L11b (표 1 참조))로 조작되고 다양한 링커 및 페이로드 (예를 들어, 아미노카프로일-vc-PABC-MMAD (아미노카프로일-발린-시트룰린-p-아미노벤질옥시카르보닐-MMAD); 아미노-PEG6-C2-MMAD)와 접합된 인간 IgG1 서브타입으로서 키메라 마우스 항-Trop-2 항체가 발현되었다. 한 경우에, 트랜스글루타미나제 태그가 항체의 경쇄 및 중쇄 C-말단 양쪽 모두, 뿐만 아니라 인간 IgG의 위치 297 (EU 넘버링 체계)에서 조작되었다 (예를 들어, 야생형 아미노산 아스파라긴 (N)이 Trop-2 항체의 위치 297에서 글루타민으로 치환되었다 (N297Q)). 경쇄 및 중쇄 양쪽 모두, 또는 항체의 중쇄 및 경쇄 내의 다중 부위에서 조작된 태그들의 조합은 항체 당 다중 접합 부위를 보유하였다 (예를 들어, 4-10의 DAR). 그 후, 페이로드 (예를 들어, MMAD)에 대한 항-Trop-2 항체 접합이 특정 부위 (예를 들어, 중쇄 또는 경쇄의 카르복실 말단 및/또는 아미노 말단, 위치 297, 및/또는 항체의 또 다른 부위)에 글루타민-함유 태그(들)를 보유하는 항-Trop-2 항체와 페이로드 (예를 들어, MMAD)에 연결된 아민-함유 링커 사이의 미생물 트랜스글루타미나제-촉매 아미드교환 반응을 통해 달성되었다. 일부 경우에, 항체의 위치 222 (EU 넘버링 체계)의 야생형 아미노산 리신이 아미노산 아르기닌으로 교체되었다 ("K222R"). 예를 들어, K222R 치환은 더 균질한 항체 및 페이로드 접합체 조성, 및/또는 항체 경쇄의 C 말단 상의 글루타민 태그와의 쇄간 가교의 유의한 감소를 초래하는 뜻밖의 효과가 있는 것으로 발견되었다. 아미드교환 반응에서, 항체 상의 글루타민이 아실 공여체로서 작용하였고, 아민-함유 화합물이 아실 수용체 (아민 공여체)로서 작용하였다. 150 mM 염화나트륨 또는 황산나트륨, 및 25 mM MES, HEPES [4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산] 또는 트리스 HCl 완충제 (pH 범위 6.2 - 9.2)에서 1 - 3％ (w/v) 스트렙토베르티실리움 모바라엔스(Streptoverticillium mobaraense) 트랜스글루타미나제 (액티바™, 아지노모토 (일본))의 존재 하에 33 μM 농도의 정제된 항-Trop-2 항체를 33 - 3300 μM 범위의 10 - 100 M 과량의 아실 수용체와 함께 인큐베이션하였다. 개별적인 아실 수용체 유도체에 대해 반응 조건을 조정하였고, 150 mM NaCl, 25 mM 트리스 HCl, pH 8.5 내의 33 μM 항체, 660 μM 유도체, 및 2％ (w/v) 트랜스글루타미나제에 대해 전형적으로 최적의 효율 및 특이성이 관찰되었다. 37℃에서 16-20시간 동안 인큐베이션한 후, 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 공지된 표준 크로마토그래피 방법, 예컨대 시판되는 친화력 크로마토그래피 및 소수성 상호작용 크로마토그래피 (지이 헬스케어)를 사용하여 맵셀렉트 슈어(MabSelect SuRe)™ 수지 또는 부틸 세파로스™ 하이 퍼포먼스(Butyl Sepharose™ High Performance) (지이 헬스케어, 뉴저지주 피스카타웨이) 상에서 항체를 정제하였다.
b. 통상적인 항체-약물 접합
4의 평균 약물 로딩 (예를 들어, 항체 분자 당 4개의 MMAD)으로 통상적인 말레이미드 결합을 통해 PEG6-C2-MMAD와 접합된 항체 (예를 들어, 키메라 마우스 항-Trop-2 항체 (m7E6))를 생성시키기 위해, 먼저 5 mg/mL의 항체를 25 mM 트리스, pH 7.5, 150 mM NaCl을 함유하는 완충제 내의 7.5 몰 당량의 TCEP (트리스(2-카르복시에틸)포스핀)로 37℃에서 2시간 동안 환원시켰다. 실온 (약 22℃)에서 7.5 몰 과량의 말레이미도-PEG6-C2-MMAD를 환원된 항체에 첨가하고, 1시간 동안 인큐베이션하였다. 반응 혼합물을 4℃에서 PBS (포스페이트 완충 염수)에 대해 투석하고, 0.2 ㎛ 필터를 통해 멸균 여과하였다. 말레이미도-PEG6-C2-MMAD가 있는 m7E6을 8의 약물 로딩으로 생성시키기 위해, 항체를 50 mM EDTA (에틸렌디아민테트라아세트산)를 포함하는 상기와 같은 반응 완충제 내의 10 몰 과량의 TCEP으로 환원시켰다. 12 몰 과량의 말레이미도-PEG6-C2-MMAD를 환원된 항체에 첨가하고, 물질을 상기와 같이 프로세싱하였다. 말레이미도-PEG6MMAD와 접합된 m7E6을 6의 약물 로딩으로 생성시키기 위해, 항체를 DAR 8 환원에 대한 것과 같은 완충제 내의 8배 몰 과량의 TCEP로 환원시킨 후, 8배 몰 과량의 말레이미도-PEG6-C2-MMAD를 첨가하였다. DAR 6 종을 정제하기 위해, 반응 혼합물을 희석하여 0.75 M 황산암모늄, 25 mM 인산칼륨, pH 7의 완충제 조성물 (완충제 A)을 수득하였다. 이러한 물질을 연속적으로 연결된 2 × 1 ml 부틸 HP 하이 트랩(Hi Trap) (지이 헬스케어)에 적용하고, 2 CV (칼럼 부피)의 완충제 A로 세정하고, 20 CV의 선형 구배로 25 mM 인산칼륨, pH 7 + 20％ 이소프로판올 내로 용출시켰다. DAR 6을 함유하는 분획을 풀링(pooling)하고, PBS에 대해 투석하고, 10 kDa 아미콘 울트라(Amicon Ultra) 원심분리 필터 유닛 (밀리포어 코포레이션(Millipore Corporation))을 사용하여 농축하였다.
시험관-내 연구
키메라 항-Trop2 항체 m7E6 H7c 아미노-PEG6-C2-MMAD (DAR 1.96, 부위-특이적), m7E6 L11b 아미노-PEG6-C2-MMAD (DAR 1.96, 부위-특이적), m7E6 TG6 아미노-PEG6-C2-MMAD (DAR 1.99, 부위-특이적), m7E6 LCQ04/K222R 아미노 PEG6-C2-MMAD (DAR 1.97, 부위-특이적), m7E6 N297Q/K222R 아미노-PEG6-C2-MMAD (DAR 3.83, 부위-특이적), m7E6 N297Q/K222R/LCQ04 아미노-PEG6-C2-MMAD (DAR 5.85, 부위-특이적), m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/TG6 아미노-PEG6-C2-MMAD (DAR 7.71, 부위-특이적), m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/H7c 아미노-PEG6-C2-MMAD (DAR 7.76, 부위-특이적), m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/L11b 아미노-PEG6-C2-MMAD (DAR 7.80, 부위-특이적) 및 m7E6 말레이미도-PEG6-C2-MMAD (DAR 7.20, 통상적)의 시험관-내 세포독성 연구를 표적을 발현하는 BxPC3 세포로 수행하였다. 본원에서 기술된 바와 같은 이러한 실시예 및 기타 실시예에서의 DAR의 숫자는 항체 분자 당 페이로드의 비를 지칭한다. 사용된 링커는 PEG6이었고, 사용된 페이로드는 MMAD이었다. BxPc3은 고도의 표적 발현 수준 (Trop-2 +++)의 암 세포주이다. 처리 전에 24시간 동안 세포를 벽은 백색이고 바닥은 투명한 플레이트 상에 웰 당 2000개의 세포로 시딩(seeding)하였다. 세포를 4배 연속 희석된 항체-약물 접합체로 삼중으로 처리하였다. 처리하고 나서 96시간 후에 세포 생존력을 셀타이터-글로(CellTiter-Glo)® 발광성 세포 생존력 검정법 96 (프로메가(Promega), 위스콘신주 매디슨)에 의해 결정하였다. 미처리 대조군의 백분율로서 상대적 세포 생존력을 결정하였다. IC50 및 50％의 세포 사망 (즉, 세포독성)이 발생한 ADC 농도를 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) 5 소프트웨어로 계산하였고, 이는 농도 (nM)로 표현되었으며, 테스트된 ADC의 최고 농도에서 관찰된 최대 세포 사망이 미처리 대조군의 백분율로서 표현되었다. 세포독성 검정법의 결과가 도 1에서 제시되고, 표 3에서 요약된다. DAR이 7.71 (m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/TG6 아미노-PEG6-C2-MMAD), 7.76 (m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/H7c 아미노-PEG6-C2-MMAD) 및 7.80 (m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/L11b 아미노-PEG6-C2-MMAD)인 3개의 부위 특이적 분자가 DAR이 7.20인 통상적으로 접합된 ADC (m7E6 말레이미도-PEG6-C2-MMAD)만큼 강력하였다.
이러한 결과들은 고도로 표적을 발현하는 BxPC3 세포에서 모든 ADC가 이들의 페이로드 로딩과 관계없이 거의 완전한 세포 사망을 달성하였지만, 더 고도로 로딩된 접합체가 더 낮게 로딩된 접합체와 비교하여 더 강력하였음을 나타낸다.
<표 3>
Figure pat00019
실시예 2: 표적을 중등도로 발현하는 세포 (Colo205, Trop2 +)에서의 점차적으로 더 고도로 로딩된, 부위-특이적으로 접합된 항-Trop-2-ADC의 세포독성
본 실시예는 표적을 중등도로 발현하는 Colo205 세포에서의 더 고도로 로딩된 ADC (부위-특이적 및 통상적)의 시험관-내 세포독성을 예시한다.
키메라 항-Trop2 항체 m7E6 H7c 아미노-PEG6-C2-MMAD (DAR 1.96, 부위-특이적), m7E6 L11b 아미노-PEG6-C2-MMAD (DAR 1.96, 부위-특이적), m7E6 TG6 아미노-PEG6-C2-MMAD (DAR 1.99, 부위-특이적), m7E6 LCQ04/K222R 아미노-PEG6-C2-MMAD (DAR 1.97, 부위-특이적), m7E6 N297Q/K222R 아미노-PEG6-C2-MMAD (DAR 3.83, 부위-특이적), m7E6 N297Q/K222R/LCQ04 아미노-PEG6-C2-MMAD (DAR 5.85, 부위-특이적), m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/TG6 아미노-PEG6-C2-MMAD (DAR 7.71, 부위-특이적), m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/H7c 아미노-PEG6-C2-MMAD (DAR 7.76, 부위-특이적), m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/L11b 아미노-PEG6-C2-MMAD (DAR 7.80, 부위-특이적), 및 m7E6 말레이미도-PEG6-C2-MMAD (DAR 7.20, 통상적)의 시험관-내 세포독성 연구를 표적을 발현하는 Colo205 세포로 수행하였다; Colo205는 중등도의 표적 발현 수준 (Trop-2 +)의 암 세포주이다. 처리 전에 24시간 동안 세포를 벽은 백색이고 바닥은 투명한 플레이트 상에 웰 당 2000개의 세포로 시딩하였다. 세포를 4배 연속 희석된 항체-약물 접합체로 삼중으로 처리하였다. 처리하고 나서 96시간 후에 세포 생존력을 셀타이터-글로® 발광성 세포 생존력 검정법 96 (프로메가, 위스콘신주 매디슨)에 의해 결정하였다. 미처리 대조군의 백분율로서 상대적 세포 생존력을 결정하였다. IC50 및 50％의 세포 사망 (즉, 세포독성)이 발생한 ADC 농도를 그래프패드 프리즘 5 소프트웨어로 계산하였고, 이는 농도 (nM)로 표현되었으며, 테스트된 ADC의 최고 농도에서 관찰된 최대 세포 사망이 미처리 대조군의 백분율로서 표현되었다. 세포독성 검정법의 결과가 도 2에서 제시되고, 표 4에서 요약된다. DAR이 5.85 이상인 ADC가 충분한 세포 사망을 달성하였다. DAR이 7.71 (m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/TG6 아미노-PEG6-C2-MMAD), 7.76 (m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/H7c 아미노-PEG6-C2-MMAD) 및 7.80 (m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/L11b 아미노-PEG6-C2-MMAD)인 3개의 부위 특이적 분자가 DAR이 7.20인 통상적으로 접합된 ADC (m7E6 말레이미도-PEG6-C2-MMAD)에 꽤 필적하였다.
이러한 결과들은 중등도로 표적을 발현하는 Colo205 세포에서 증가된 세포 사망 활성 및 효능이 ADC의 페이로드 로딩과 양성으로 상호관련된다는 것을 나타낸다. 더 고도로 로딩된 분자 (예를 들어, 5.85 이상의 DAR)만 충분한 세포 사망을 달성할 수 있었다.
<표 4>
Figure pat00020
실시예 3: 표적을 낮게 발현하는 세포 (CF-PAC1, Trop2 (+))에서의 점차적으로 더 고도로 로딩된, 부위-특이적으로 접합된 항-Trop-2-ADC의 세포독성
본 실시예는 표적을 낮게 발현하는 CF-PAC1 세포에서의 더 고도로 로딩된 부위-특이적 ADC의 시험관-내 세포독성을 예시한다.
키메라 항-Trop2 항체 m7E6 H7c 아미노-PEG6-C2-MMAD (DAR 1.96, 부위-특이적), m7E6 L11b 아미노-PEG6-C2-MMAD (DAR 1.96, 부위-특이적), m7E6 TG6 아미노-PEG6-C2-MMAD (DAR 1.99, 부위-특이적), m7E6 LCQ04/K222R 아미노-PEG6-C2-MMAD (DAR 1.97, 부위-특이적), m7E6 N297Q/K222R 아미노-PEG6-C2-MMAD (DAR 3.83, 부위-특이적), m7E6 N297Q/K222R/LCQ04 아미노-PEG6-C2-MMAD (DAR 5.85, 부위-특이적), m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/TG6 아미노-PEG6-C2-MMAD (DAR 7.71, 부위-특이적), m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/H7c 아미노-PEG6-C2-MMAD (DAR 7.76, 부위-특이적), m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/L11b 아미노-PEG6-C2-MMAD (DAR 7.80, 부위-특이적) 및 m7E6 말레이미도-PEG6-C2-MMAD (DAR 7.20, 통상적)의 시험관-내 세포독성 연구를 표적을 발현하는 CF-PAC1 세포로 수행하였다; CF-PAC1은 저도의 표적 발현 수준 (Trop-2 (+))의 암 세포주이다. 처리 전에 24시간 동안 세포를 벽은 백색이고 바닥은 투명한 플레이트 상에 웰 당 2000개의 세포로 시딩하였다. 세포를 4배 연속 희석된 항체-약물 접합체로 삼중으로 처리하였다. 처리하고 나서 96시간 후에 세포 생존력을 셀타이터-글로® 발광성 세포 생존력 검정법 96 (프로메가, 위스콘신주 매디슨)에 의해 결정하였다. 미처리 대조군의 백분율로서 상대적 세포 생존력을 결정하였다. IC50 및 50％의 세포 사망 (예를 들어, 세포독성)이 발생한 ADC 농도를 그래프패드 프리즘 5 소프트웨어로 계산하였고, 이는 농도 (nM)로 표현되었으며, 테스트된 ADC의 최고 농도에서 관찰된 최대 세포 사망이 미처리 대조군의 백분율로서 표현된다. 표 5 및 도 3은 낮게 표적을 발현하는 CF-PAC1 세포에서 증가된 세포 사망 활성 및 효능이 ADC의 페이로드 로딩과 양성으로 상호관련된다는 것을 나타내고, 예를 들어, 페이로드 로딩이 높을수록, 세포 사망 활성이 더 높다. DAR이 7.71 (m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/TG6 아미노-PEG6-C2-MMAD), 7.76 (m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/H7c 아미노-PEG6-C2-MMAD) 및 7.80 (m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/L11b 아미노-PEG6-C2-MMAD)인 3개의 부위-특이적 분자가 DAR이 7.20인 통상적으로 접합된 ADC (m7E6 말레이미도-PEG6-C2-MMAD)에 꽤 필적하였다.
본 실시예는 낮게 표적을 발현하는 CF-PAC1 세포와 같은 세포에서 증가된 세포 사망 활성 및 효능이 ADC의 페이로드 로딩과 양성으로 상호관련된다는 것을 또한 실연한다.
<표 5>
Figure pat00021
실시예 4: 표적을 발현하지 않는 세포 (SW620, Trop2-)에서의 점차적으로 더 고도로 로딩된, 부위-특이적으로 접합된 항-Trop-2-ADC의 세포독성
본 실시예는 표적을 발현하지 않는 SW620 세포에서의 더 고도로 로딩된 부위-특이적 ADC의 시험관-내 비-특이적 세포독성을 예시한다.
키메라 항-Trop2 항체 m7E6 TG6 아미노-PEG6-C2-MMAD (DAR 1.99, 부위-특이적), m7E6 LCQ04/K222R 아미노-PEG6-C2-MMAD (DAR 1.88, 부위-특이적), m7E6 N297Q/K222R 아미노-PEG6-C2-MMAD (DAR 3.92, 부위-특이적), m7E6 N297Q/K222R/LCQ04 아미노-PEG6-C2-MMAD (DAR 5.85, 부위-특이적), m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/TG6 아미노-PEG6-C2-MMAD (DAR 7.71, 부위-특이적), m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/H7c 아미노-PEG6-C2-MMAD (DAR 7.76, 부위-특이적), m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/L11b 아미노-PEG6-C2-MMAD (DAR 7.80, 부위-특이적) 및 m7E6 말레이미도 PEG6-C2-MMAD (DAR 7.20, 통상적)의 시험관-내 세포독성 연구를 표적을 발현하지 않는 SW620 세포로 수행하였다; SW620은 표적 발현이 없는 암 세포주이다 (Trop-2 -). 처리 전에 24시간 동안 세포를 벽은 백색이고 바닥은 투명한 플레이트 상에 웰 당 2000개의 세포로 시딩하였다. 세포를 4배 연속 희석된 항체-약물 접합체로 삼중으로 처리하였다. 처리하고 나서 96시간 후에 세포 생존력을 셀타이터-글로® 발광성 세포 생존력 검정법 96 (프로메가, 위스콘신주 매디슨)에 의해 결정하였다. 미처리 대조군의 백분율로서 상대적 세포 생존력을 결정하였다. IC50 및 50％의 세포 사망 (즉, 세포독성)이 발생한 ADC 농도를 그래프패드 프리즘 5 소프트웨어로 계산하였고, 이는 농도 (nM)로 표현되었으며, 테스트된 ADC의 최고 농도에서 관찰된 최대 세포 사망이 미처리 대조군의 백분율로서 표현되었다. 본 실시예에서, ADC의 비-표적 의존적 세포독성 효과가 있었는지를 결정하기 위해 ADC의 출발 농도가 266 nM에서 3500 nM로 다른 시험관-내 실시예에 비교하여 13배를 초과하여 증가되었다. 세포독성 검정법의 결과가 도 4에서 제시되고, 표 6에서 요약된다. DAR이 7.71 (m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/TG6 아미노-PEG6-C2-MMAD), 7.76 (m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/H7c 아미노-PEG6-C2-MMAD) 및 7.80 (m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/L11b 아미노-PEG6-C2-MMAD)인 3개의 부위 특이적 분자가, DAR이 7.20인 통상적으로 접합된 ADC에 비교하여 비-특이적 세포독성이 유의하게 더 적었다.
이러한 결과들은 더 높은 ADC 농도에서, 비-표적 의존적 세포독성이 관찰되었다는 것과 이러한 세포독성이 통상적인 접합체에 비교하여 부위-특이적 ADC에서 더 낮았다는 것을 나타낸다.
<표 6>
Figure pat00022
실시예 5: 표적을 중등도로 발현하는 세포 (Colo205, Trop2 +)에서의 점차적으로 더 고도로 로딩된, 부위-특이적으로 접합된 항-Trop-2-ADC 대 통상적으로 접합된 항-Trop-2-ADC의 세포독성의 대조 비교
본 실시예는 표적을 중등도로 발현하는 Colo205 세포에서의 더 고도로 로딩된 부위-특이적 ADC의 시험관 내에서의 증가된 세포독성 및 효능을 예시한다.
키메라 항-Trop2 항체 m7E6 말레이미도-PEG65-C2-MMAD (DAR 4.13, 통상적), m7E6 N297Q/K222R 아미노-PEG6-C2-MMAD (DAR 3.86, 부위-특이적), m7E6 말레이미도-PEG6-C2-MMAD (DAR 6.09, 통상적), m7E6 N297Q/LCQ04/K222R 아미노-PEG6-C2-MMAD (DAR 5.86, 부위-특이적), m7E6 말레이미도-PEG6-C2-MMAD (DAR 7.80, 통상적), m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/H7c 아미노-PEG6-C2-MMAD (DAR 7.77, 부위-특이적) 및 대조군 IgG N297Q/LCQ04/K222R 아미노-PEG6-C2-MMAD (DAR 5.84, 부위-특이적)의 시험관-내 세포독성 연구를 표적을 발현하는 Colo205 세포에서 수행하였다; Colo205는 중등도의 표적 발현 수준 (Trop-2 +)의 암 세포주이다. 처리 전에 24시간 동안 세포를 벽은 백색이고 바닥은 투명한 플레이트 상에 웰 당 2000개의 세포로 시딩하였다. 세포를 4배 연속 희석된 항체-약물 접합체로 삼중으로 처리하였다. 처리하고 나서 96시간 후에 세포 생존력을 셀타이터-글로® 발광성 세포 생존력 검정법 96 (프로메가, 위스콘신주 매디슨)에 의해 결정하였다. 미처리 대조군의 백분율로서 상대적 세포 생존력을 결정하였다. IC50 및 50％의 세포 사망 (예를 들어, 세포독성)이 발생한 ADC 농도를 그래프패드 프리즘 5 소프트웨어로 계산하였고, 이는 농도 (nM)로 표현되었으며, 테스트된 ADC의 최고 농도에서 관찰된 최대 세포 사망이 미처리 대조군의 백분율로서 표현된다. 세포독성 검정법의 결과가 도 5에서 제시되고, 표 7에서 요약된다. DAR이 3.86 (m7E6 N297Q/K222R 아미노-PEG6-C2-MMAD), 5.86 (m7E6 N297Q/LCQ04/K222R 아미노-PEG6-C2-MMAD) 및 7.77 (m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/H7c 아미노-PEG6-C2-MMAD)인 3개의 부위 특이적 분자가 DAR이 각각 4.13 (m7E6 말레이미도-PEG6-C2-MMAD), 6.09 (m7E6 말레이미도-PEG6-C2-MMAD) 및 7.80 (m7E6 말레이미도-PEG6-C2-MMAD)인 통상적으로 접합된 ADC에 꽤 필적하였다.
이러한 결과들은 중등도로 표적을 발현하는 Colo205 세포에서 증가된 세포 사망 활성 및 효능이 ADC의 페이로드 로딩과 양성으로 상호관련된다는 것을 나타낸다 (예를 들어, 분자가 더 고도로 로딩될수록, 효능이 더 높다).
<표 7>
Figure pat00023
실시예 6: 약물-항체 비가 7.76인 항-Trop-2 7E6 부위-특이적 오리스타틴 접합체가 Colo205 이종이식 모델에서 장기 종양 정체를 유도하였다
본 실시예는 Colo205 이종이식 모델에서의 더 고도로 로딩된 부위-특이적 ADC의 효능을 예시한다.
m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/H7c 아미노-PEG6-C2-MMAD (DAR 7.76, 부위-특이적), m7E6 말레이미도-PEG6-C2-MMAD (DAR 7.20), 통상적), m7E6 N297Q/K222R 아미노-PEG6-C2-MMAD (DAR 3.92, 부위-특이적) 및 대조군 IgG N297Q/K222R 아미노-PEG6-C2-MMAD (DAR 3.68, 부위-특이적)의 생체-내 효능 연구를 표적을 발현하는 Colo205 이종이식 모델에서 수행하였다; Colo205는 중등도의 표적 발현 수준 (Trop-2 +)의 암 세포주이다. 3백만개의 Colo205 암 세포를 종양 크기가 약 250 ㎣에 도달할 때까지 5-8주령 nu/nu 마우스 내로 피하 이식하였다. 동물을 종양 크기에 의해 무작위화하고, 볼루스 꼬리 정맥 주사를 통해 투약하였다. 6 mg/kg의 mAb를 총 1회 용량에 대해 볼루스 꼬리 정맥 주사를 통해 투여하였다. 캘리퍼 장치를 사용하여 종양 부피를 1주일에 2회 측정하고, 하기 식을 사용하여 계산하였다: 종양 부피 = (길이 × 폭2) / 2. 종양 부피가 2000 ㎣에 도달하거나 체중이 20％를 초과하여 감소되면, 동물을 안락사시켰다. 도 6은 단일 용량의 부위-특이적 DAR 7.76 접합체가 통상적인 DAR 7.2 접합체를 유의하게 능가하여 장기 종양 정체를 초래하였음을 나타낸다.
추가로, 모든 ADC가 유사한 결합 동역학을 나타냈기 때문에, 부위-특이적 접합체와 통상적인 고-DAR 접합체 사이의 효능 차이는 ADC의 차별적인 표적 결합에 기인하지 않았다. 도 11 및 표 8. 비아코어(Biacore) T200 표면 플라즈몬 공명 바이오센서 (지이 라이프사이언시즈(GE Lifesciences), 뉴저지주 피스카타웨이)를 사용하여 도 11 및 표 8에 나타난 바와 같은 표적/IgG 상호작용의 결합 동역학을 결정하였다.
<표 8>
Figure pat00024
종합하면, 본 실시예는 본 발명의 ADC (예를 들어, DAR 7.76)가 장기 종양 정체를 유도하는 것에서 유사하거나 더 높은 DAR의 통상적인 ADC보다 더 효과적이라는 것과 DAR이 5 미만인 ADC는 이러한 모델에서 본질적으로 비-효과적이라는 것을 실연한다.
실시예 7: 약물-항체 비가 5.86 및 7.77인 항-Trop-2 7E6 부위-특이적 오리스타틴 접합체가 Colo205 이종이식 모델에서 상응하는 통상적인 접합체보다 더욱 효과적이고 장기 종양 정체를 유도한다
본 실시예는 Colo205 이종이식 모델에서의 더 고도로 로딩된 부위-특이적 ADC의 효능을 또한 예시한다.
m7E6 말레이미도-PEG6-C2-MMAD (DAR 4.13, 통상적), m7E6 N297Q/K222R 아미노-PEG6-C2-MMAD (DAR 3.86, 부위-특이적), m7E6 말레이미도-PEG6-C2-MMAD (DAR 6.09, 통상적), m7E6 N297Q/LCQ04/K222R 아미노-PEG6-C2-MMAD (DAR 5.86, 부위-특이적), m7E6 말레이미도-PEG6-C2-MMAD (DAR 7.80, 통상적), m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/H7c 아미노-PEG6-C2-MMAD (DAR 7.77, 부위-특이적) 및 대조군 IgG N297Q/LCQ04/K222R 아미노-PEG6-C2-MMAD (DAR 5.84, 부위-특이적)의 생체-내 효능 연구를 표적을 발현하는 Colo205 이종이식 모델에서 수행하였다; Colo205는 중등도의 표적 발현 수준 (Trop-2 +)의 암 세포주이다. 3백만개의 Colo205 암 세포를 종양 크기가 약 200 ㎣에 도달할 때까지 5-8주령 nu/nu 마우스 내로 피하 이식하였다. 동물을 종양 크기에 의해 무작위화하고, 볼루스 꼬리 정맥 주사를 통해 투약하였다. 6 mg/kg의 mAb를 총 1회 용량에 대해 볼루스 꼬리 정맥 주사를 통해 투여하였다. 캘리퍼 장치를 사용하여 종양 부피를 1주일에 2회 측정하고, 하기 식을 사용하여 계산하였다: 종양 부피 = (길이 × 폭2) / 2. 종양 부피가 2000 ㎣에 도달하거나 체중이 20％를 초과하여 감소되면, 동물을 안락사시켰다. 도 7은 단일 용량의 부위-특이적 DAR 5.86 (m7E6 N297Q/LCQ04/K222R 아미노-PEG6-C2-MMAD) 및 부위-특이적 DAR 7.77 (m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/H7c 아미노-PEG6-C2-MMAD) 접합체가 통상적인 DAR 6.09 (m7E6 말레이미도-PEG6-C2-MMAD) 및 DAR 7.80 (m7E6 말레이미도-PEG6-C2-MMAD) 접합체를 유의하게 능가하여 장기 종양 성장 정체를 초래하였음을 나타낸다. 실시예 6에서 논의된 바와 같이, 모든 ADC가 유사한 결합 동역학을 나타냈기 때문에, 효능 차이는 ADC의 차별적인 표적 결합에 기인하지 않았다.
따라서, 본 실시예는 본 발명의 ADC (예를 들어, 부위-특이적 DAR 5.86 및 7.77)가 장기 종양 정체를 유도하는 것에서 유사한 DAR의 통상적인 ADC보다 더 효과적이라는 것을 또한 실연한다.
실시예 8: 고도의 약물-항체 비의 항-Trop-2 7E6 부위-특이적 오리스타틴 접합체가 통상적인 ADC와 비교하여 더 양호한 약동학 (PK) 프로파일을 나타낸다
본 실시예는 마우스 및 래트 양쪽 모두에서의 통상적인 더 고도로 로딩된 ADC와 비교된 더 고도로 로딩된 부위-특이적 ADC에 대한 PK 프로파일을 예시한다.
본 발명의 ADC의 약동학 연구를 마우스 및 래트 양쪽 모두에서 수행하였고, ELISA (효소-결합 면역흡착 검정법)를 사용하여 분석하였으며, LC/MS (액체 크로마토그래피-질량 분광법)로 DAR을 분석하였다.
전체 항체 PK 검정법
96-웰 미량역가 플레이트 (눈크(NUNC))의 각각의 웰을 1×PBS (셀 그로(Cell Gro)) 내의 1 ug/mL의 Fc 특이적인 염소 항-인간 IgG 항체 (피어스(Pierce), 일리노이주 록포드) 100 uL로 코팅하였다. 플레이트를 4-8℃에서 철야로 인큐베이션하였다. 모든 세정 단계는 바이오텍(Biotek) ELx405 플레이트 세정기로 1× PBS/0.05％ 트윈(Tween)으로 수행하였다. 3회 세정한 후, 플레이트를 200 uL의 검정법 완충제 (1× PBS/0.5％BSA/0.05％ 폴리소르베이트 20)로 차단하고, 부드럽게 진탕시키면서 1-2시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 3회 세정하고, 100 uL의 표준물, 대조군 및 샘플 (검정법 완충제에 1:100 희석됨)을 상응하는 웰에 첨가하였다. 실온에서 부드럽게 진탕시키면서 2시간 동안 인큐베이션한 후, 플레이트를 6회 세정한 뒤에 검정법 완충제 내의 250 ng/mL로 희석된 검출 항체 (HRP-표지된 Fab 특이적 항-인간 IgG, 시그마(Sigma) (미주리주 세인트루이스)) 100 uL를 분배하였다. 플레이트를 실온에서 부드럽게 진탕시키면서 추가로 1시간 동안 인큐베이션한 후, 6회 세정하였다. 그 후, 100 uL의 TMB (3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘) (KPL, 메릴랜드주 게이더스버그)를 각각의 웰에 첨가하였다. 약 5분 동안 발색시킨 후, 100 uL의 1 M 인산으로 반응을 정지시켰다. 스펙트라맥스(SpectraMax) 340 플레이트 판독기 (몰레큘러 디바이시즈(Molecular Devices)) 상에서 650 nm를 기준으로 하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 소프트맥스 프로(SoftMax Pro) 5.2 소프트웨어를 사용하여, 4-파라미터 회귀로 표준 곡선을 피팅하고 샘플 농도를 계산하였다.
ADC PK 검정법
96-웰 미량역가 플레이트 (눈크)의 각각의 웰을 1×PBS (셀 그로) 내의 2 ug/mL의 염소 항-인간 IgG 항체 100 uL로 코팅하였다. 플레이트를 4-8℃에서 철야로 인큐베이션하였다. 모든 세정 단계는 바이오텍 ELx405 플레이트 세정기로 1× PBS/0.05％ 트윈으로 수행하였다. 3회 세정한 후, 플레이트를 200 uL/웰의 검정법 완충제 (1× PBS/0.5％BSA/0.05％ 폴리소르베이트 20)로 차단하고, 부드럽게 진탕시키면서 1-2시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 3회 세정하고, 100 uL의 표준물, 대조군 및 샘플 (검정법 완충제에 1:100 희석됨)을 상응하는 웰에 이중으로 첨가하였다. 실온에서 부드럽게 진탕시키면서 2시간 동안 인큐베이션한 후, 플레이트를 6회 세정한 뒤에 검정법 완충제 내의 4 ug/mL로 희석된 검출 항체 (비오틴화 항-MMAD 모노클로날 항체) 100 uL를 분배하였다. 플레이트를 실온에서 부드럽게 진탕시키면서 1.5시간 동안 인큐베이션한 후, 6회 세정하였다. 아비딘-HRP (벡터 랩스(Vector Labs), 캘리포니아주 벌링게임)를 검정법 완충제에서 0.5 ug/mL로 희석하고, 100 uL를 각각의 웰 내로 분배하였다. 플레이트를 또다시 1시간 동안 인큐베이션한 후, 6회 세정하였다. 그 후, 100 uL의 TMB (KPL, 메릴랜드주 게이더스버그)를 각각의 웰에 첨가하였다. 약 5분 동안 발색시킨 후, 100 uL의 1 M 인산으로 반응을 정지시켰다. 스펙트라맥스 340 플레이트 판독기 (몰레큘러 디바이시즈, 펜실베니아주 다우닝타운) 상에서 650 nm를 기준으로 하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 소프트맥스 프로 5.2 소프트웨어를 사용하여, 4-파라미터 회귀로 표준 곡선을 피팅하고 샘플 농도를 계산하였다.
ADC의 LC/MS 무손상 질량 분석 및 DAR 계산
LC/MS 분석 전에, ADC (부위 특이적 DAR6 및 DAR8 및 통상적 DAR8)를 37℃에서 철야로 비-변성 조건 하에 PNGase F (뉴 잉글랜드 바이오랩스 인크(New England Biolabs Inc.), 매사추세츠주 입시치)로 탈글리코실화시켰다. ADC (1 ㎍)를 중합체성 물질이 충전된 역상 칼럼 (마이크롬-브루커(Michrom-Bruker), 캘리포니아주 프리몬트) 내로 로딩하였다. 전기분무 이온 공급원이 있는 오르비트랩 벨로스 프로(Orbitrap Velos Pro) (써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific), 뉴저지주 서머셋) 질량 분광계에 커플링된, 바이너리(binary) HPLC 펌프, 탈기 장치,　온도 제어형 오토 샘플러(auto sampler), 칼럼 가열기 및 다이오드-어레이 검출기 (DAD)를 포함하는 애질런트(Agilent) 1100 시리즈 HPLC 시스템을 사용하여 LC/MS 분석을 수행하였다. 이동상은 용매 A (물 0.1％ 포름산) 및 용매 B (아세토니트릴 0.1％ 포름산)로 구성되었다. 10분 동안 3％ 용매 B의 등용매 유동 후, 1분에 걸쳐 97％ 용매 B로의 구배가 이어지고, 2분 동안 97％ 용매 B에서 유지된 후, 최종적으로 17분 동안 3％ 용매 B에서의 평형 단계가 이어지는 것으로 이루어지는 30분 실행에 걸친 용매 B의 증가하는 구배를 사용하여 HPLC를 수행하였다. 생성된 질량 스펙트럼을 프로매스(ProMass) 소프트웨어 (써모 피셔 사이언티픽, 뉴저지주 서머셋)를 사용하여 디콘볼루션(deconvolution)하였다. 부위 특이적 ADC는 ADC의 무손상 질량을 사용하여 DAR을 계산하였고, 통상적인 ADC는 중쇄 및 경쇄의 디콘볼루션된 스펙트럼으로부터 DAR을 계산하였는데, 통상적인 ADC는 분자간 디술피드 결합이 결여되고, 역상 조건 하에 쇄들이 분리되기 때문이다. DAR 계산은 관찰된 DAR 종의 상대적인 강도를 기초로 한다.
생체-내 연구
마우스에서, 모든 ADC의 단일 용량 (6 mg/kg)을 Colo205 이종이식 모델에서 테스트하였다. 이러한 조건 하에, (1) m7E6 N297Q/K222R/LCQ04 아미노-PEG6-C2-MMAD (DAR 5.85, 부위-특이적); 및 2) m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/H7c 아미노-PEG6-C2-MMAD (DAR 7.76, 부위-특이적)로서 PEG6MMAD에 접합된 항체 m7E6이 비-접합 야생형 항체 m7E6과 유사한 약동학 프로파일을 나타냈다. 전체 mAb 및 ADC 신호의 비교에서, 더 고도로 로딩된 ADC (mAb 또는 ADC m7E6 N297Q/K222R/LCQ04 아미노-PEG6-C2-MMAD (DAR 5.85, 부위-특이적); 또는 mAb 또는 ADC m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/H7c 아미노-PEG6-C2-MMAD (DAR 7.76, 부위-특이적))가 2주 기간에 걸쳐 페이로드 손실을 거의 나타내지 않았다는 것이 밝혀졌다. 도 8c 및 8d를 참조한다. 데이터는 아미노-PEG6-C2-MMAD의 트랜스글루타미나제-매개 결합이 안정적인 접합체를 초래한다는 것을 가리킨다. 대조적으로, 통상적인 방법을 사용하여 말레이미도-PEG6-C2-MMAD에 접합된 항체 m7E6 (m7E6 말레이미도-PEG6-C2-MMAD (DAR 7.8))은 전체 mAb 및 비-접합 항체 양쪽 모두에 비교하여 더 낮은 ADC 노출을 나타냈고, 이는 페이로드 손실을 시사한다. 도 8b를 참조한다. 말레이미드-기반 접합체로부터의 페이로드 손실이 이전에 기술되었고 (예를 들어, 문헌 [Alley et al., Bioconj. Chem. 19(3):759-765 (2008)]; 및 [Shen et al., Nat. Biotechnol. 30(2):184-189 (2012)] 참조), 이는 역-마이클 부가(retro-Michael addition) 메커니즘을 통해 발생하는 것으로 생각된다. DAR 8의 통상적인 접합체와 본 발명의 ADC 접합체 사이의 ADC 노출 차이가 생체 내에서의 통상적인 ADC의 하등한 활성의 원인일 것이다.
통상적인 ADC에 대해 ELISA 검정법에서 나타난 노출 감소는 이러한 실험에서 사용된 ADC 검정법이 항체로부터의 페이로드 손실을 과소평가하였을 가능성에 의해 강화될 수 있다. 더욱 구체적으로, ADC ELISA는 DAR 8뿐만 아니라 생체 내에서 생성된 더 낮게 로딩된 모든 다른 종에 대해서도 신호를 나타냈다. 이러한 효과는 더 고도로 로딩된 종의 경우에 더 명백하였는데, 통상적인 접합 방법을 사용한 DAR 8의 ADC의 경우에 ELISA 신호에서의 유의한 변화 없이 약물이 7개까지 손실될 수 있기 때문이다. 추가로, 비-절단성의 통상적인 접합체 예컨대 m7E6 말레이미도-PEG6-C2-MMAD (DAR 8)의 경우, 약물 손실이 낮은 생체-내 효능의 주요 원인이었을 것이다. 대조적으로, 본 발명의 비-절단성 ADC 접합체 (예를 들어, DAR 6 또는 DAR 8)는 말레이미드 불안정성을 겪지 않고, 중등도로 표적을 발현하는 Colo205 이종이식 모델에서 종양 성장을 유의하게 억제할 수 있다.
더 고도로 로딩된 ADC의 PK 연구를 래트에서 또한 수행하여 마우스에 비교하였다. 통상적인 접합 방법을 기초로 하는 ADC (m7E6 말레이미도-PEG6-C2-MMAD (DAR 7.8))가 여전히 혈행 내의 ADC 수준이 가장 낮았다. 도 8e를 참조한다. DAR 8의 본 발명의 ADC (예를 들어, m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/H7c 아미노-PEG6-C2-MMAD (DAR 7.76 부위-특이적))는 중간 수준의 혈행 내의 ADC를 나타냈고, DAR 6의 본 발명의 ADC (예를 들어, m7E6 N297Q/K222R/LCQ04 PEG6MMAD (DAR 5.85, 부위-특이적))는 비-접합 m7E6 항체에 필적하는, 최고 수준의 혈행 내의 ADC를 나타냈다. 도 8e를 참조한다. DAR 7.8의 통상적인 ADC는 비-접합 항체에 대해 가장 큰 차이를 나타냈고, 비-접합 항체 수준에 비교하여 전체 항체뿐만 아니라 ADC 양쪽 모두가 노출이 크게 감소되었다. 도 8f를 참조한다. m7E6 N297Q/K222R/LCQ04 PEG6MMAD (DAR 5.85, 부위-특이적)의 경우, 전체 mAb 수준 및 ADC 수준이 비-접합 항체 수준과 거의 등가였다. 도 8g 참조. m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/H7c PEG6MMAD에 대한 전체 mAb뿐만 아니라 ADC 수준이 비-접합 항체에 비교하여 감소되었다. 도 8h. 이는 본 발명의 DAR8 ADC가 비-접합 항체와 유사한 PK를 나타낸 마우스로부터의 PK 결과와 대조적이다. 이러한 결과들은 개별적으로 야생형 PK를 나타내는 접합 부위들의 조합이 노출 감소를 초래할 수 있다는 것을 시사한다.
마우스 생체-내 샘플의 질량 분광법 분석에서, 통상적인 ADC (예를 들어, m7E6 말레이미도-PEG6-C2-MMAD)는 링커-페이로드의 약 28％ 손실이 있는 한편, 트랜스글루타미나제 링커는 부위-특이적 접합체 DAR6 (m7E6 N297Q/K222R/LCQ04 PEG6MMAD) 및 DAR8_1 (m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/H7c 아미노-PEG6-C2-MMAD) 양쪽 모두에서 손상되지 않고 남는다는 것이 추가로 밝혀졌다. 도 12a를 참조한다. 질량 분광법 연구에서, 약물 MMAD의 C-말단 분해 수준이 부위-특이적 DAR6, SS DAR8_1 및 통상적인 DAR8 접합체에서 유사하다는 것이 또한 밝혀졌다 (도 12b). 접합체의 조합된 링커-페이로드 안정성이 도 12c에서 제시된다.
종합하면, 본 실시예는 본 발명의 더 고도로 로딩된 ADC가 마우스에서 비-접합 야생형 항체와 PK 프로파일이 유사하고, 래트에서 더 고도로 로딩된 통상적인 ADC보다 PK 프로파일이 더 양호하다는 것을 실연한다.
실시예 9: 개별적으로 야생형 약동학 프로파일을 나타내는 ADC 접합 부위들의 조합이 래트에서 노출 감소를 초래할 수 있다
본 실시예는 래트에서의 접합 부위들이 상이하게 조합된 더 고도로 로딩된 부위-특이적 ADC에 대한 PK 프로파일을 예시한다.
래트에서 접합 부위들이 상이하게 조합된 더 고도로 로딩된 ADC의 PK 연구를 또한 수행하였다. DAR 1.99의 부위-특이적 ADC (m7E6 H7c 아미노-PEG6-C2-MMAD)를 DAR 5.85의 부위-특이적 ADC (m7E6 N297Q/K222R/LCQ04 아미노-PEG6-C2-MMAD)와 조합함으로써 DAR 7.76 (m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/H7c 아미노-PEG6-C2-MMAD)의 부위-특이적 ADC가 생성되었다. DAR 5.85 및 1.99의 부위-특이적 ADC는 개별적으로 래트에서 야생형 PK 프로파일을 나타냈지만, DAR 7.76의 부위-특이적 ADC로서 함께 조합되었을 때 노출 감소를 나타냈다. 도 9a를 참조한다. 반면에, DAR 5.85의 동일한 부위-특이적 ADC (m7E6 N297Q/K222R/LCQ04 아미노-PEG6-C2-MMAD)를 DAR 1.96의 상이한 부위-특이적 ADC (m7E6 TG6 아미노-PEG6-C2-MMAD; m7E6 N297Q/K222R/LCQ04 아미노-PEG6-C2-MMAD의 접합 부위에서 먼, 항체 중쇄의 C-말단의 접합 부위)와 조합했을 때, 생성된 ADC (m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/TG6 아미노-PEG6-C2-MMAD (DAR 7.7 부위-특이적))는 추가적인 노출 감소를 나타내지 않았다 (예를 들어, m7E6 TG6 아미노-PEG6-C2-MMAD보다 크지 않은 감소를 나타냄). 도 9b를 참조한다.
이러한 데이터는 근접한 너무 많은 소수성 페이로드 (예를 들어, MMAD)가 래트에서 ADC의 PK 프로파일을 감소시킬 수 있다는 것을 시사한다. 데이터는 서로 멀리 있는 접합 부위의 경우, 조합된 부위의 PK 프로파일이 래트에서 가장 짧은 개별적인 PK 프로파일과 유사하다는 것을 또한 시사한다.
실시예 10: 마우스에서의 통상적인 ADC에 비교된 부위-특이적으로 접합된 항-Trop-2 7E6 오리스타틴 접합체의 안전성 및 내약성
본 실시예는 C57B1/6 마우스에서의 더 고도로 로딩된 부위-특이적 ADC의 안전성 및 내약성을 예시한다.
C57B1/6 마우스에게 단일 용량의 75, 125, 또는 200 mg/kg의 통상적으로 접합된 ADC (m7E6 말레이미도-PEG6-C2-MMAD "DAR8") 또는 PEG6-C2-MMAD 비-절단성 페이로드와 접합된 부위-특이적 ADC (m7E6 N297Q/K222R/LCQ04 아미노-PEG6-C2-MMAD ("DAR6") 및 m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/TG6 아미노-PEG6-C2-MMAD ("DAR8_1"))를 제공하였다. 임상 관찰, 체중, 약동학, 및 임상 병리학 파라미터를 평가하였다. 더욱 구체적으로, 동물을 즉각적으로, 그리고 주사하고 나서 2시간 후에 관찰한 후, 투약 후 2주 동안 매일 관찰하였다. 제0일, 제2일, 제5일, 제7일, 제9일, 제12일, 및 제14일에 체중을 기록하였다. 약동학을 위해 투약 5분 후, 7일 후 및 14일 후에, 임상 화학 및 혈액학 분석을 위해 제14일에 혈액 샘플을 취했다.
통상적인 접합체 및 부위-특이적 접합체 양쪽 모두 200 mg/kg의 매우 높은 용량까지 허용되었다. 독성을 지시하는 임상 관찰 또는 의미있는 체중 변화가 없었다. 도 10b를 참조한다. 　 연구 말기 (제14일)에 3개 모두의 접합체 (통상적인 ADC "DAR8" 및 2개의 부위-특이적 ADC "DAR8_1" 및 "DAR6")에 대해 임상 병리학 파라미터를 평가하였고, 독성학적으로 의미있는 또는 유의한 변화가 관찰되지 않았다. 도 10c 및 10d를 참조한다.　 예를 들어, 간 효소 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제 [AST], 알라닌 트랜스아미나제 [ALT] 및 알칼리성 포스파타제 [ALP]) 및 주요 혈액학적 파라미터 (호중구, 망상 적혈구, 및 혈소판)에서의 유의한 변화가 없었다.
총괄적으로, 이러한 결과들은 DAR이 8이고 PEG6-C2-MMAD가 있는 200 mg/kg의 고용량의 부위-특이적 접합체 및 통상적인 접합체 양쪽 모두가 마우스에서 잘 허용된다는 것을 가리킨다. 추가로, 통상적인 DAR8 접합체에 비교하여, 부위-특이적 DAR8_1 접합체가 약 55％ 더 높은 노출을 달성하였다. 도 10a. 추가로, DAR8의 통상적인 접합체가 고용량에서 예상보다 더 낮은 항체 농도를 또한 나타냈다. 도 13a. 이러한 현상은 부위-특이적 ADC DAR8_1에 대해 관찰되지 않았고, 이는 예상된 노출 증가를 200 mg/kg의 최고 테스트 용량에서도 나타냈다. 도 13b.
종합하면, 통상적인 접합체와 비교하여 부위-특이적 접합체가 더 높은 ADC 노출과 함께 양호한 안전성 프로파일을 나타냈다.
실시예 11: 표적을 고도로 발현하는 세포 (BxPC3, Trop2 +++)에서의 점차적으로 더 고도로 로딩된, 부위-특이적으로 접합된 항-Trop-2-ADC의 세포독성
본 실시예는 표적을 고도로 발현하는 BxPC3 세포에서의 더 고도로 로딩된 ADC (예를 들어, DAR 5.95-9.4 (부위-특이적 접합))의 시험관-내 세포독성을 예시한다.
키메라 항-Trop2 항체 m7E6 L11b 아미노-PEG6-C2-MMAD (DAR 1.96, 부위-특이적), m7E6 N297Q/K222R 아미노-PEG6-C2-MMAD (DAR 3.9, 부위-특이적), m7E6 N297Q/K222R/LCQ04 아미노-PEG6-C2-MMAD (DAR 5.95, 부위-특이적), m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/H7c 아미노-PEG6-C2-MMAD (DAR 7.6, 부위-특이적), 및 N297Q/K222R/LCQ04/L11b/H7c 아미노-PEG6-C2-MMAD (DAR 9.4, 부위-특이적)의 시험관-내 세포독성 연구를 표적을 발현하는 BxPC3 세포로 수행하였다. BxPc3은 고도의 표적 발현 수준 (Trop-2 +++)의 암 세포주이다. 처리 전에 24시간 동안 세포를 벽은 백색이고 바닥은 투명한 플레이트 상에 웰 당 2000개의 세포로 시딩하였다. 세포를 4배 연속 희석된 항체-약물 접합체로 삼중으로 처리하였다. 처리하고 나서 96시간 후에 세포 생존력을 셀타이터-글로® 발광성 세포 생존력 검정법 96 (프로메가, 위스콘신주 매디슨)에 의해 결정하였다. 미처리 대조군의 백분율로서 상대적 세포 생존력을 결정하였다. IC50 및 50％의 세포 사망 (즉, 세포독성)이 발생한 ADC 농도를 그래프패드 프리즘 5 소프트웨어로 계산하였고, 이는 농도 (nM)로 표현되었으며, 테스트된 ADC의 최고 농도에서 관찰된 최대 세포 사망이 미처리 대조군의 백분율로서 표현되었다. 세포독성 검정법의 결과가 도 14에서 제시되고, 표 9에서 요약된다. 이러한 결과들은 고도로 표적을 발현하는 BxPC3 세포에서 모든 ADC가 이들의 페이로드 로딩과 관계없이 거의 완전한 세포 사망을 달성하였지만, 더 고도로 로딩된 접합체가 더 낮게 로딩된 접합체와 비교하여 더 강력하였음을 나타낸다.
<표 9>
Figure pat00025
실시예 12: 표적을 중등도로 발현하는 세포 (Colo205, Trop2 +)에서의 점차적으로 더 고도로 로딩된, 부위-특이적으로 접합된 항-Trop-2-ADC의 세포독성
본 실시예는 표적을 중등도로 발현하는 Colo205 세포에서의 더 고도로 로딩된 ADC (예를 들어, DAR 5.95-9.4 (부위-특이적 접합))의 시험관-내 세포독성을 예시한다.
키메라 항-Trop2 항체 m7E6 L11b 아미노-PEG6-C2-MMAD (DAR 1.96, 부위-특이적), m7E6 N297Q/K222R 아미노-PEG6-C2-MMAD (DAR 3.9, 부위-특이적), m7E6 N297Q/K222R/LCQ04 아미노-PEG6-C2-MMAD (DAR 5.95, 부위-특이적), m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/H7c 아미노-PEG6-C2-MMAD (DAR 7.6, 부위-특이적), 및 N297Q/K222R/LCQ04/L11b/H7c 아미노-PEG6-C2-MMAD (DAR 9.4, 부위-특이적)의 시험관-내 세포독성 연구를 표적을 발현하는 Colo205 세포로 수행하였다; Colo205는 중등도의 표적 발현 수준 (Trop-2 +)의 암 세포주이다. 처리 전에 24시간 동안 세포를 벽은 백색이고 바닥은 투명한 플레이트 상에 웰 당 2000개의 세포로 시딩하였다. 세포를 4배 연속 희석된 항체-약물 접합체로 삼중으로 처리하였다. 처리하고 나서 96시간 후에 세포 생존력을 셀타이터-글로® 발광성 세포 생존력 검정법 96 (프로메가, 위스콘신주 매디슨)에 의해 결정하였다. 미처리 대조군의 백분율로서 상대적 세포 생존력을 결정하였다. IC50 및 50％의 세포 사망 (즉, 세포독성)이 발생한 ADC 농도를 그래프패드 프리즘 5 소프트웨어로 계산하였고, 이는 농도 (nM)로 표현되었으며, 테스트된 ADC의 최고 농도에서 관찰된 최대 세포 사망이 미처리 대조군의 백분율로서 표현되었다. 세포독성 검정법의 결과가 도 15에서 제시되고, 표 10에서 요약된다. 이러한 결과들은 중등도로 표적을 발현하는 Colo205 세포에서 증가된 세포 사망 활성 및 효능이 ADC의 페이로드 로딩과 양성으로 상호관련된다는 것을 나타낸다. 더 고도로 로딩된 분자 (예를 들어, 5.95 이상의 DAR)만 충분한 세포 사망을 달성할 수 있었다.
본 실시예는 접합체 N297Q/K222R/LCQ04/L11b/H7c 아미노-PEG6-C2-MMAD로 DAR을 9.4로 증가시키는 것이 DAR이 7.6인 접합체 m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/H7c 아미노-PEG6-C2-MMAD에 비해 증가된 효능을 초래하였다는 것을 또한 실연한다.
<표 10>
Figure pat00026
실시예 13: 표적을 낮게 발현하는 세포 (CF-PAC1, Trop2 (+))에서의 점차적으로 더 고도로 로딩된, 부위-특이적으로 접합된 항-Trop-2-ADC의 세포독성
본 실시예는 표적을 낮게 발현하는 CF-PAC1 세포에서의 더 고도로 로딩된 ADC (예를 들어, DAR 5.95-9.4 (부위-특이적 접합))의 시험관-내 세포독성을 예시한다.
키메라 항-Trop2 항체 m7E6 L11b 아미노-PEG6-C2-MMAD (DAR 1.96, 부위-특이적), m7E6 N297Q/K222R 아미노-PEG6-C2-MMAD (DAR 3.9, 부위-특이적), m7E6 N297Q/K222R/LCQ04 아미노-PEG6-C2-MMAD (DAR 5.95, 부위-특이적), m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/H7c 아미노-PEG6-C2-MMAD (DAR 7.6, 부위-특이적), 및 N297Q/K222R/LCQ04/L11b/H7c 아미노-PEG6-C2-MMAD (DAR 9.4, 부위-특이적)의 시험관-내 세포독성 연구를 표적을 발현하는 CF-PAC1 세포로 수행하였다; CF-PAC1은 저도의 표적 발현 수준 (Trop-2 (+))의 암 세포주이다. 처리 전에 24시간 동안 세포를 벽은 백색이고 바닥은 투명한 플레이트 상에 웰 당 2000개의 세포로 시딩하였다. 세포를 4배 연속 희석된 항체-약물 접합체로 삼중으로 처리하였다. 처리하고 나서 96시간 후에 세포 생존력을 셀타이터-글로® 발광성 세포 생존력 검정법 96 (프로메가, 위스콘신주 매디슨)에 의해 결정하였다. 미처리 대조군의 백분율로서 상대적 세포 생존력을 결정하였다. IC50 및 50％의 세포 사망 (예를 들어, 세포독성)이 발생한 ADC 농도를 그래프패드 프리즘 5 소프트웨어로 계산하였고, 이는 농도 (nM)로 표현되었으며, 테스트된 ADC의 최고 농도에서 관찰된 최대 세포 사망이 미처리 대조군의 백분율로서 표현된다. 표 11 및 도 16은 낮게 표적을 발현하는 CF-PAC1 세포에서 증가된 세포 사망 활성 및 효능이 ADC의 페이로드 로딩과 양성으로 상호관련된다는 것을 나타내고, 예를 들어, 페이로드 로딩이 높을수록, 세포 사망 활성이 더 높다. DAR이 9.4인 접합체 N297Q/K222R/LCQ04/L11b/H7c 아미노-PEG6-C2-MMAD은 최대 세포 사망 활성을 약간 증가시켰다.
본 실시예는 낮게 표적을 발현하는 CF-PAC1 세포와 같은 세포에서 증가된 세포 사망 활성 및 효능이 ADC의 페이로드 로딩과 양성으로 상호관련된다는 것을 또한 실연한다.
<표 11>
Figure pat00027
실시예 14: 표적을 발현하지 않는 세포 (SW620, Trop2-)에서의 점차적으로 더 고도로 로딩된, 부위-특이적으로 접합된 항-Trop-2-ADC의 세포독성
본 실시예는 표적을 발현하지 않는 SW620 세포에서의 더 고도로 로딩된 ADC (예를 들어, DAR 5.95 내지 9.40 (부위-특이적 접합))의 시험관-내 비-특이적 세포독성을 예시한다.
키메라 항-Trop2 항체 m7E6 L11b 아미노-PEG6-C2-MMAD (DAR 1.96, 부위-특이적), m7E6 N297Q/K222R 아미노-PEG6-C2-MMAD (DAR 3.9, 부위-특이적), m7E6 N297Q/K222R/LCQ04 아미노-PEG6-C2-MMAD (DAR 5.95, 부위-특이적), m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/H7c 아미노-PEG6-C2-MMAD (DAR 7.6, 부위-특이적), 및 N297Q/K222R/LCQ04/L11b/H7c 아미노-PEG6-C2-MMAD (DAR 9.4,부위-특이적)의 시험관-내 세포독성 연구를 표적을 발현하지 않는 SW620 세포로 수행하였다; SW620은 표적 발현이 없는 암 세포주이다 (Trop-2 -). 처리 전에 24시간 동안 세포를 벽은 백색이고 바닥은 투명한 플레이트 상에 웰 당 2000개의 세포로 시딩하였다. 세포를 4배 연속 희석된 항체-약물 접합체로 삼중으로 처리하였다. 처리하고 나서 96시간 후에 세포 생존력을 셀타이터-글로® 발광성 세포 생존력 검정법 96 (프로메가, 위스콘신주 매디슨)에 의해 결정하였다. 미처리 대조군의 백분율로서 상대적 세포 생존력을 결정하였다. IC50 및 50％의 세포 사망 (즉, 세포독성)이 발생한 ADC 농도를 그래프패드 프리즘 5 소프트웨어로 계산하였고, 이는 농도 (nM)로 표현되었으며, 테스트된 ADC의 최고 농도에서 관찰된 최대 세포 사망이 미처리 대조군의 백분율로서 표현되었다. 세포독성 검정법의 결과가 도 17에서 제시되고, 표 12에서 요약된다. 테스트된 농도 범위에서, 모든 접합체가 최소의 비-특이적 세포독성 활성을 나타냈다.
본 실시예는 접합체 N297Q/K222R/LCQ04/L11b/H7c 아미노-PEG6-C2-MMAD로 DAR을 9.4로 증가시키는 것이 더 낮은 DAR의 접합체에 비교하여 비-특이적 세포독성 활성의 증가를 초래하지 않았음을 실연한다.
<표 12>
Figure pat00028
실시예 15: 표적 BCMA를 낮게 발현하는 세포 및 고도로 발현하는 세포에서의 점차적으로 더 고도로 로딩된, 부위-특이적으로 접합된 항-BCMA ADC의 세포독성
본 실시예는 각각 표적을 저도 및 중등도로 발현하는 L363 및 MM1.S 세포에서의 더 고도로 로딩된 ADC (예를 들어, DAR 5.95 (부위-특이적 접합))의 시험관-내 세포독성을 예시한다.
Ab1-LCQ05/K222R-스플라이세오스타틴 ((2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-(2-히드라지닐-2-옥소에틸)-4-히드록시-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일}-2,5-디메틸테트라히드로-2H-피란-3-일]아미노}-5-옥소펜트-3-엔-2-일 아세테이트) (DAR 1.9, 부위-특이적), Ab1-LCQ04/K222R-스플라이세오스타틴 (DAR 1.9, 부위-특이적), Ab1-N297Q/K222R-스플라이세오스타틴 (DAR 3.7, 부위-특이적), 및 Ab1-N297Q/K222R/LCQ05-스플라이세오스타틴 (DAR 5.95, 부위-특이적)을 포함하는, 링커-페이로드와 접합된 인간 항-BCMA (B-세포 성숙 항원) 항체 (Ab1)의 시험관-내 세포독성 연구를 표적을 발현하는 L363 (저도의 표적 발현 수준 (BCMA (+))의 암 세포주) 및 MM1.S (중등도의 표적 발현 수준 (BCMA (++))의 암 세포주)에서 수행하였다. 세포를 바닥이 투명한 플레이트 상에 3000개의 세포/웰로 시딩하였다. 세포를 4배 연속 희석된 항체-약물 접합체로 삼중으로 처리하였다. 처리하고 나서 96시간 후에 세포 생존력을 셀타이터-글로® 발광성 세포 생존력 검정법 96 (프로메가, 위스콘신주 매디슨)에 의해 결정하였다. 미처리 대조군의 백분율로서 상대적 세포 생존력을 결정하였다. EC50을 프리즘 소프트웨어로 계산하였다. 도 18a 및 18b는 증가된 세포 사망 활성 및 효능이 ADC의 높은 (예를 들어 5.9) 페이로드 로딩에 비교하여 낮은 (예를 들어 1.9 및 3.7) 페이로드 로딩과 양성으로 상호관련된다는 것을 나타낸다.
따라서, 본 실시예는 낮게 표적을 발현하는 L363 및 고도로 표적을 발현하는 MM1.S와 같은 세포에서 증가된 세포 사망 활성 및 효능이 ADC의 페이로드 로딩과 양성으로 상호관련된다는 것을 또한 실연한다.
개시된 교시내용이 다양한 용도, 방법 및 조성물에 관하여 기술되었지만, 본원의 교시내용 및 하기의 청구된 발명을 벗어나지 않으면서 다양한 변화 및 변형이 이루어질 수 있다는 것이 이해될 것이다. 상기 예는 개시된 교시내용을 더 잘 예시하기 위해 제공되고, 본원에서 제시된 교시내용의 범주를 제한하도록 의도되지 않는다. 본 교시내용이 이러한 예시적인 실시양태의 관점에서 기술되었지만, 통상의 기술자는 이러한 예시적인 실시양태의 수많은 변경 및 변형이 과도한 실험 없이 가능하다는 것을 수월하게 이해할 것이다. 모든 이같은 변경 및 변형은 본 교시내용의 범주 내에 속한다.
특허, 특허 출원, 논문, 교재 등을 포함하는, 본원에서 인용된 모든 참고문헌, 및 이에 인용된 참고문헌은, 이미 포함되지 않은 한, 이에 의해 전문이 참조로 포함된다. 포함된 문헌 및 유사한 자료 중 하나 이상이 정의된 용어, 용어 용법, 기술된 기법 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 본 출원과 상이하거나 모순되는 경우, 본 출원이 우선한다.
상기의 상세한 설명 및 실시예는 본 발명의 특정한 구체적인 실시양태를 상술하고, 본 발명자들에 의해 구상된 최상의 방식을 기술한다. 그러나, 상기의 것이 문서에서 상세하게 나타날 수 있더라도, 본 발명이 다수의 방식으로 실행될 수 있고, 본 발명은 첨부된 특허청구범위 및 이의 임의의 등가물에 따라 해석되어야 한다는 것이 이해될 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> Pfizer Inc. Rinat Neuroscience Corp. STROP, Pavel DELARIA, Katherine DORYWALSKA, Magdalena L. FOLETTI, Davide L. DUSHIN, Russell G. SHELTON, David L. RAJPAL, Arvind <120> ANTIBODY-DRUG CONJUGATES WITH HIGH DRUG LOADING <130> PC72078A <150> 61/984,645 <151> 2014-04-25 <150> 62/028,731 <151> 2014-07-24 <150> 62/103,999 <151> 2015-01-15 <150> 62/147,293 <151> 2015-04-14 <160> 43 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 1 Leu Leu Gln Gly Gly 1 5 <210> 2 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 2 Leu Leu Gln Gly 1 <210> 3 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 3 Leu Ser Leu Ser Gln Gly 1 5 <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 4 Gly Gly Gly Leu Leu Gln Gly Gly 1 5 <210> 5 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 5 Gly Leu Leu Gln Gly 1 5 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 6 Gly Ser Pro Leu Ala Gln Ser His Gly Gly 1 5 10 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 7 Gly Leu Leu Gln Gly Gly Gly 1 5 <210> 8 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 8 Gly Leu Leu Gln Gly Gly 1 5 <210> 9 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 9 Gly Leu Leu Gln 1 <210> 10 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 10 Leu Leu Gln Leu Leu Gln Gly Ala 1 5 <210> 11 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 11 Leu Leu Gln Gly Ala 1 5 <210> 12 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 12 Leu Leu Gln Tyr Gln Gly Ala 1 5 <210> 13 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 13 Leu Leu Gln Gly Ser Gly 1 5 <210> 14 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 14 Leu Leu Gln Tyr Gln Gly 1 5 <210> 15 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 15 Leu Leu Gln Leu Leu Gln Gly 1 5 <210> 16 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 16 Ser Leu Leu Gln Gly 1 5 <210> 17 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 17 Leu Leu Gln Leu Gln 1 5 <210> 18 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 18 Leu Leu Gln Leu Leu Gln 1 5 <210> 19 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 19 Leu Leu Gln Gly Arg 1 5 <210> 20 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 20 Leu Leu Gln Gly Pro Pro 1 5 <210> 21 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 21 Leu Leu Gln Gly Pro Ala 1 5 <210> 22 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 22 Gly Gly Leu Leu Gln Gly Pro Pro 1 5 <210> 23 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 23 Gly Gly Leu Leu Gln Gly Ala 1 5 <210> 24 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 24 Leu Leu Gln Gly Ala 1 5 <210> 25 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 25 Leu Leu Gln Gly Pro Gly Lys 1 5 <210> 26 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 26 Leu Leu Gln Gly Pro Gly 1 5 <210> 27 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 27 Leu Leu Gln Gly Pro 1 5 <210> 28 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 28 Leu Leu Gln Pro 1 <210> 29 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 29 Leu Leu Gln Pro Gly Lys 1 5 <210> 30 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 30 Leu Leu Gln Ala Pro Gly Lys 1 5 <210> 31 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 31 Leu Leu Gln Gly Ala Pro Gly 1 5 <210> 32 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 32 Leu Leu Gln Gly Ala Pro 1 5 <210> 33 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 33 Leu Leu Gln Gly Pro Ala 1 5 <210> 34 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 34 Leu Leu Gln Gly Pro Pro 1 5 <210> 35 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 35 Gly Gly Leu Leu Gln Gly Pro Pro 1 5 <210> 36 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 36 Leu Leu Gln Leu Gln Gly 1 5 <210> 37 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> Xaa = Leu, Ala, Gly, Ser, Val, Phe, Tyr, His, Arg, Asn, Glu, Asp, Cys, Gln, Ile, Met, Pro, Thr, Lys, or Trp <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa = Leu, Ala, Gly, Ser, Val, Phe, Tyr, His, Arg, Asn, Glu, Asp, Cys, Gln, Ile, Met, Pro, Thr, Lys, or Trp <400> 37 Xaa Xaa Gln Xaa 1 <210> 38 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 38 Leu Gly Gly Gln Gly Gly Gly 1 5 <210> 39 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 39 Gly Gly Gly Gln Gly Gly Leu 1 5 <210> 40 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa = Gly, Ala, Ser, Leu, Val, Phe, Tyr, Arg, Asn, or Glu <400> 40 Gly Xaa Gly Gln Gly Gly Gly 1 5 <210> 41 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa = Gly, Ala, Ser, Leu, Val, Phe, Tyr, Arg, Asn, or Glu <400> 41 Gly Gly Xaa Gln Gly Gly Gly 1 5 <210> 42 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa = Gly, Ala, Ser, leu, Val, Phe, Tyr, Arg, Asn, or Glu <400> 42 Gly Gly Gly Gln Xaa Gly Gly 1 5 <210> 43 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa = Gly, Ala, Ser, Leu, Val, Phe, Tyr, Arg, Asn, or Glu <400> 43 Gly Gly Gly Gln Gly Xaa Gly 1 5

Claims (32)

  1. 식: 항체-(T-(X-Y-Za)b)c를 포함하는 항체-약물 접합체이며,
    여기서, T는 1) 특이적 부위에서 조작된 글루타민-함유 태그, 2) 내인성 글루타민, 및/또는 3) 항체 조작 또는 조작된 트랜스글루타미나제에 의해 반응성이게 만들어진 내인성 글루타민이고;
    X는 아민 공여체 단위이고; Y는 링커이며; Z는 작용제 모이어티이고;
    X-Y-Z는 글루타민-함유 태그, 내인성 글루타민, 및/또는 반응성 내인성 글루타민에 부위-특이적으로 접합된 아민 공여체 작용제이고;
    a는 1 내지 6의 정수이고;
    b는 1 내지 6의 정수이고;
    c는 1 내지 20의 정수이며;
    a, b, 및 c의 곱 (약물-항체 비)은 적어도 약 5인, 항체-약물 접합체.
  2. 제1항에 있어서, 항체가 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 이중특이적 항체, 미니바디(minibody), 디아바디(diabody), 또는 항체 단편인 접합체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, T가 적어도 1개의 내인성 글루타민 또는 반응성 내인성 글루타민을 포함하는 것인 접합체.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 반응성 내인성 글루타민이 탈글리코실화에 의해 또는 항체 내의 또 다른 아미노산의 아미노산 변형에 의해 반응성이게 만들어진 것인 접합체.
  5. 제4항에 있어서, 또 다른 아미노산 변형이 위치 297 (EU 넘버링 체계)에서의 치환인 접합체.
  6. 제5항에 있어서, 치환이 위치 297에서의 아스파라긴 (N)에서 글루타민 (Q)으로의 치환 또는 N에서 알라닌 (A)으로의 치환인 접합체.
  7. 제5항에 있어서, 항체가 위치 K222, K340, 및/또는 K370에서의 제2 아미노산 변형을 추가로 포함하는 것인 접합체.
  8. 제7항에 있어서, 제2 아미노산 변형이 리신에서 아르기닌으로의 치환인 접합체.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 아민 공여체 작용제가 1) 경쇄, 중쇄, 또는 경쇄 및 중쇄 양쪽 모두 중 어느 것의 카르복실 말단; 2) 경쇄, 중쇄, 또는 경쇄 및 중쇄 양쪽 모두 중 어느 것의 아미노 말단; 및 3) 글루타민-함유 태그가 항체 내에 삽입되거나 또는 항체 내의 하나 이상의 내인성 아미노산을 교체하는, 위치(들) S60-R61, R108, T135, S160, S168, S190-S192, P189-S192, G200-S202, K222-T225, K222-T223, T223, L251-S254, M252-I253, E294-N297, E293-N297, N297, 및/또는 G385로 이루어진 군으로부터 선택된 항체의 적어도 하나 이상의 위치에서의 글루타민-함유 태그에 부위-특이적으로 접합된 것인 접합체.
  10. 제8항에 있어서,
    a) 아민 공여체 작용제가 위치 295의 내인성 글루타민 및 위치 297의 치환된 글루타민에 부위-특이적으로 접합되는, 위치 N297Q 및 K222R에서의 아미노산 치환; 및
    b) 아민 공여체 작용제가 항체의 경쇄의 카르복실 말단의 글루타민-함유 태그(들)에 부위-특이적으로 접합되는, 하나 이상의 글루타민-함유 태그
    를 포함하고, 약물-항체 비가 약 5-7인 접합체.
  11. 제10항에 있어서, 아민 공여체 작용제가, 글루타민-함유 태그가 항체 내에 삽입되거나 또는 항체 내의 하나 이상의 내인성 아미노산을 교체하는 S60-R61, R108, T135, S160, S168, S190-S192, P189-S192, G200-S202, K222-T225, K222-T223, T223, L251-S254, M252-I253, E294-N297, E293-N297, N297, 및 G385로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 위치에서의 글루타민-함유 태그에 추가로 부위-특이적으로 접합되고, 약물-항체 비가 적어도 약 6인 접합체.
  12. 제10항에 있어서, 아민 공여체 작용제가 항체의 중쇄의 카르복실 말단의 글루타민-함유 태그에 추가로 부위-특이적으로 접합되고, 약물-항체 비가 약 6-9인 접합체.
  13. 제10항에 있어서, 아민 공여체 작용제가 항체 중쇄 내의 아미노산 위치 T135 뒤에 삽입된 글루타민-함유 태그에 추가로 부위-특이적으로 접합되고, 약물-항체 비가 약 6-9인 접합체.
  14. 제10항에 있어서, 아민 공여체 작용제가, 내인성 아미노산 잔기가 글루타민-함유 태그로 교체되는 항체 경쇄 내의 아미노산 위치 G200-S202의 글루타민-함유 태그에 추가로 부위-특이적으로 접합되고, 약물-항체 비가 약 6-11인 접합체.
  15. 제9항에 있어서, 아민 공여체 작용제가
    a) 항체의 경쇄의 카르복실 말단;
    b) 항체 중쇄 내의 아미노산 위치 T135 뒤; 및
    c) 내인성 아미노산 잔기가 글루타민-함유 태그로 교체되는 항체 경쇄 내의 아미노산 위치 G200-S202
    의 글루타민-함유 태그에 부위-특이적으로 접합되고,
    약물-항체 비가 약 5-7인 접합체.
  16. 제1항 또는 제2항에 있어서, 글루타민-함유 태그가 Q, LQG, LLQGG (서열식별번호(SEQ ID NO): 1), LLQG (서열식별번호: 2), LSLSQG (서열식별번호: 3), GGGLLQGG (서열식별번호: 4), GLLQG (서열식별번호: 5), LLQ, GSPLAQSHGG (서열식별번호: 6), GLLQGGG (서열식별번호: 7), GLLQGG (서열식별번호: 8), GLLQ (서열식별번호: 9), LLQLLQGA (서열식별번호: 10), LLQGA (서열식별번호: 11), LLQYQGA (서열식별번호: 12), LLQGSG (서열식별번호: 13), LLQYQG (서열식별번호: 14), LLQLLQG (서열식별번호: 15), SLLQG (서열식별번호: 16), LLQLQ (서열식별번호: 17), LLQLLQ (서열식별번호: 18), LLQGR (서열식별번호: 19), LLQGPP (서열식별번호: 20), LLQGPA (서열식별번호: 21), GGLLQGPP (서열식별번호: 22), GGLLQGA (서열식별번호: 23), LLQGPGK (서열식별번호: 25), LLQGPG (서열식별번호: 26), LLQGP (서열식별번호: 27), LLQP (서열식별번호: 28), LLQPGK (서열식별번호: 29), LLQAPGK (서열식별번호: 30), LLQGAPG (서열식별번호: 31), LLQGAP (서열식별번호: 32), 및 LLQLQG (서열식별번호: 36)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 접합체.
  17. 제16항에 있어서, 글루타민-함유 태그가 LLQGA (서열식별번호: 11), LQG, GGLLQGA (서열식별번호: 23), LLQGPA (서열식별번호: 21), LLQGPP (서열식별번호: 20), GGLLQGPP (서열식별번호: 22), LLQGSG (서열식별번호: 13), LLQG (서열식별번호: 2), LLQYQG (서열식별번호: 14), LLQLLQG (서열식별번호: 15), LLQLQG (서열식별번호: 36), LLQLLQ (서열식별번호: 18), LLQLQ (서열식별번호: 17), LLQGR (서열식별번호: 19), LLQYQGA (서열식별번호: 12), SLLQG (서열식별번호: 16), 또는 LLQLLQGA (서열식별번호: 10)인 접합체.
  18. 제1항에 있어서, 아민 공여체 단위-링커 (X-Y)가 선형 또는 분지형인 접합체.
  19. 제18항에 있어서, 아민 공여체 단위-링커 (X-Y)가 Ac-Lys-Gly (아세틸-리신-글리신), 아미노카프로산, Ac-Lys-β-Ala (아세틸-리신-β-알라닌), 아미노-PEG2 (폴리에틸렌 글리콜)-C2, 아미노-PEG3-C2, 아미노-PEG6-C2, Ac-Lys-Val-Cit-PABC (아세틸-리신-발린-시트룰린-p-아미노벤질옥시카르보닐), 아미노-PEG6-C2-Val-Cit-PABC, 아미노-PEG3-C2-Val-Cit-PABC, 아미노카프로일-Val-Cit-PABC, [(3R,5R)-1-{3-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]프로파노일}피페리딘-3,5-디일]비스-Val-Cit-PABC, [(3S,5S)-1-{3-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]프로파노일}피페리딘-3,5-디일]비스-Val-Cit-PABC, 푸트레신, 및 Ac-Lys-푸트레신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 접합체.
  20. 제1항에 있어서, 작용제 모이어티가 세포독성제인 접합체.
  21. 제20항에 있어서, 세포독성제가 안트라시클린, 오리스타틴, 캄프토테신, 콤브레타스타틴, 돌라스타틴, 듀오카르마이신, 엔다이인, 겔다나마이신, 인돌리노-벤조디아제핀 이량체, 메이탄신, 퓨로마이신, 피롤로벤조디아제핀 이량체, 탁산, 빈카 알칼로이드, 튜불리신, 헤미아스테를린, 스플라이세오스타틴, 플라디에놀리드, 및 이들의 입체이성질체, 동배체, 유사체 또는 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 접합체.
  22. 제1항, 제2항 및 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 아민 공여체 작용제가 알렉사(Alexa) 488 카다베린, 5-FITC 카다베린, 알렉사 647 카다베린, 알렉사 350 카다베린, 5-TAMRA 카다베린, 5-FAM 카다베린, SR101 카다베린, 5,6-TAMRA 카다베린, 5-FAM 리신, Ac-LysGly-MMAD, 아미노-PEG3-C2-MMAD, 아미노-PEG6-C2-MMAD, 아미노-PEG3-C2-아미노-노나노일-MMAD, 아미노카프로일-Val-Cit-PABC-MMAD, 아미노-PEG3-C2-Val-Cit-PABC-MMAD, 아미노-PEG6-C2-Val-Cit-PABC-MMAD, Ac-Lys-Val-Cit-PABC-MMAD, 아미노카프로일-MMAD, Ac-Lys-β-Ala-MMAD, 아미노-PEG2-C2-MMAE, 아미노카프로일-MMAE, 아미노-PEG3-C2-MMAE, 아미노카프로일-MMAF, 아미노카프로일-Val-Cit-PABC-MMAE, 아미노-PEG-6-C2-Val-Cit-PABC-MMAE, Ac-Lys-Val-Cit-PABC-MMAE, 아미노카프로일-Val-Cit-PABC-MMAF, 아미노-PEG-6-C2-Val-Cit-PABC-MMAF, Ac-Lys-Val-Cit-PABC-MMAF, 아미노-PEG6-C2-Val-Cit-PABC-0101, Ac-Lys-Val-Cit-PABC-0101, 푸트레시닐-겔다나마이신, Ac-Lys-푸트레시닐-겔다나마이신, 아미노카프로일-3377, 아미노-PEG6-C2-3377, 아미노카프로일-0131, 아미노-PEG6-C2-0131, 아미노카프로일-0121, 아미노-PEG6-C2-0121, [(3R,5R)-1-{3-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]프로파노일}피페리딘-3,5-디일]비스-Val-Cit-PABC-MMAD, [(3R,5R)-1-{3-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]프로파노일}피페리딘-3,5-디일]비스-Val-Cit-PABC-MMAE, 2-아미노에톡시-PEG6-NODAGA, 및 N-2-아세틸-L-리실-L-발릴-N~5~-카르바모일-N-[4-({[(2-{[(3R,5S,7R,8R)-8-히드록시-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-히드록시펜트-2-에노일]아미노}-3,6-디메틸테트라히드로-2H-피란-2-일]-3-메틸펜타-1,3-디엔-1-일}-1,6-디옥사스피로[2.5]옥트-5-일]아세틸}히드라지닐)카르보닐]옥시}메틸)페닐]-L-오르니틴아미드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 접합체.
  23. 제1항, 제2항 및 제18항 내지 제21항 중 어느 한 항의 접합체 및 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 제약 조성물.
  24. 평균 약물-항체 비가 적어도 약 5.0인, 다수의 제1항, 제2항 및 제18항 내지 제21항 중 어느 한 항의 접합체를 포함하는 제약 조성물.
  25. 적어도 하나의 항체-약물 접합체가 제1항, 제2항 및 제18항 내지 제21항 중 어느 한 항의 접합체이고, 평균 약물-항체 비가 적어도 약 4.1인 다수의 항체-약물 접합체를 포함하는 제약 조성물.
  26. 제23항에 있어서, 암 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하기 위해 사용되는 제약 조성물.
  27. 제23항에 있어서, 종양 성장 또는 진행의 억제를 필요로 하는 대상체에서 종양 성장 또는 진행을 억제하기 위해 사용되는 제약 조성물.
  28. a) 제1항의 접합체와 암-관련 단백질의 결합을 초래하는 조건 하에 대상체의 샘플을 제1항의 접합체와 접촉시키는 단계, 및 b) 암-관련 단백질에 대한 접합체의 결합을 결정하는 단계를 포함하는, 암을 앓고 있는 것으로 추정되는 대상체에서의 암 진단에 사용하기 위한 정보를 제공하는 방법.
  29. a) 항체 및 글루타민-함유 태그, 및/또는 내인성 및/또는 반응성 내인성 글루타민이 있는 항체를 포함하는 항체-T 분자를 제공하는 단계;
    b) 트랜스글루타미나제의 존재 하에 아민 공여체 작용제를 항체-T 분자와 접촉시키는 단계; 및
    c) 항체-T가 아민 공여체 작용제에 공유결합으로 연결되게 하여, 항체-약물 접합체를 형성시키는 단계
    를 포함하는, 제1항의 접합체를 제조하는 방법.
  30. 제29항에 있어서, 접합체의 접합 효율이 적어도 약 51％인 방법.
  31. 제29항에 있어서, 트랜스글루타미나제가 미생물 트랜스글루타미나제, 정제된 트랜스글루타미나제, 또는 조작된 트랜스글루타미나제인 방법.
  32. 제29항에 있어서, 접합체가 크로마토그래피 단계에 의해 정제되는 정제 단계를 추가로 포함하는 방법.
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