BR112020004307A2 - análogos de tailanestatina - Google Patents

análogos de tailanestatina Download PDF

Info

Publication number
BR112020004307A2
BR112020004307A2 BR112020004307-9A BR112020004307A BR112020004307A2 BR 112020004307 A2 BR112020004307 A2 BR 112020004307A2 BR 112020004307 A BR112020004307 A BR 112020004307A BR 112020004307 A2 BR112020004307 A2 BR 112020004307A2
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
compound
antibody
mmol
formula
fact
Prior art date
Application number
BR112020004307-9A
Other languages
English (en)
Inventor
Vasu Jammalamadaka
Kimberly Ann Tipton
Sanjeev Satyal
Hoyoung Huh
Original Assignee
Ph Pharma Co., Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ph Pharma Co., Ltd. filed Critical Ph Pharma Co., Ltd.
Publication of BR112020004307A2 publication Critical patent/BR112020004307A2/pt

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D493/00—Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system
    • C07D493/02—Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D493/10—Spiro-condensed systems
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/35—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom
    • A61K31/351—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom not condensed with another ring
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/4196—1,2,4-Triazoles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/42—Oxazoles
    • A61K31/422—Oxazoles not condensed and containing further heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/4245—Oxadiazoles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6817—Toxins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6839—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting material from viruses
    • A61K47/6841—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting material from viruses the antibody targeting a RNA virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6855—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from breast cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6867—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from a cell of a blood cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D493/00—Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system
    • C07D493/02—Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D493/04—Ortho-condensed systems

Abstract

A presente invenção refere-se a compostos citotóxicos e conjugados citotóxicos compreendendo tais compostos citotóxicos e agentes de ligação celular. Mais especificamente, esta invenção refere-se a análogos da tailanestatina A, úteis como toxinas citotóxicas de moléculas pequenas em conjugados de anticorpo-fármaco (ADCs). A presente invenção refere-se ainda a composições incluindo esses compostos citotóxicos e ADCs, e métodos para usar tais toxinas e ADCs para tratar condições patológicas, incluindo câncer.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANÁLO- GOS DE TAILANESTATINA”".
REFERÊNCIA CRUZADA AOS PEDIDOS RELACIONADOS
[0001] Este pedido é um pedido não provisório depositado sob 37 C.F.R 8153 (b) (1), reivindicando prioridade sob 35 U.S.C 8119 (e) pa- ra Pedidos Provisórios número de série 62/561,060, depositado em 20 de setembro de 2017, e 62/686,781, depositado em 19 de junho de 2018, cujo conteúdo é incorporado neste documento por referência na sua totalidade.
CAMPO TÉCNICO
[0002] A presente invenção refere-se a novos compostos citotóxi- cos, e conjugados citotóxicos compreendendo estes compostos citotó- xicos e agentes de ligação celulares. Mais especificamente, esta in- venção se refere a novos análogos da tailanestatina A, úteis como to- xinas citotóxicas de moléculas pequena em conjugados de anticorpo- fármaco (ADCs). A presente invenção se refere ainda a composições incluindo esses compostos citotóxicos e ADCs, e métodos para usar tais toxinas e ADCs para tratar condições patológicas, incluindo cân- cer.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
[0003] A conjugação de fármacos a anticorpos, diretamente ou via ligantes, envolve uma consideração de vários fatores, incluindo a iden- tidade e a localização do grupo químico para conjugação do fármaco, o mecanismo de liberação do fármaco, os elementos estruturais que fornecem a liberação do fármaco e a modificação estrutural ao fárma- Co livre liberado. Além disso, se o fármaco for liberaoa após a interna- lização do anticorpo, o mecanismo de liberação da fármaco devem ser consonantes com o tráfego intracelular do conjugado.
[0004] Os conjugados anticorpo-fármaco (ADC, também conheci- dos como imunoconjugados) demonstraram considerável utilidade co-
mo agentes anticâncer. Em um ADC, um agente terapêutico (também referido como fármaco ou toxina citotóxica) é covalentemente ligado a um anticorpo cujo antígeno é expresso por um câncer ou outra célula proliferativa (antígeno associado ao tumor). O anticorpo, ao se ligar ao antígeno, transmite o ADC ao local do câncer. Ali, a clivagem da liga- ção covalente ou a degradação do anticorpo leva à liberação do agen- te terapêutico. Por outro lado, enquanto o ADC circula no sistema san- guíneo, o agente terapêutico está inativo devido à sua ligação ao anti- corpo. Assim, o agente terapêutico usado em um ADC pode ser muito mais potente que os agentes quimioterápicos comuns, devido à sua liberação altamente localizada.
[0005] Embora várias classes de fármacos diferentes tenham sido testadas para transmissão via anticorpos, apenas algumas classes de fármacos provaram ser eficazes como conjugados anticorpo-fármaco, embora possuíssem um perfil de toxicidade adequado. Uma classe de fármacos bem-sucedida inclui análogos de FR901464, como spliceos- tatina C e tailanestatina A, que são inibidores extremamente potentes do splicing de RNA eucariótico. Estes compostos se ligam firmemente à subunidade SF3b do subcomplexo de snRNA U2, um componente essencial do spliceossoma (Puthenveetila, S., et al., Bioconjugate Chem., 2016, 27: 1880-1888).
[0006] As Patentes US 9.169.264 e 9.504.669 (ambas Subra- manyam et al.) divulgam compostos à base de spliceostatina úteis co- mo cargas em ADCs e compostos ligantes de carga úteis em conexão com ADCs. As patentes divulgam ainda o uso desses compostos no tratamento de condições patológicas, incluindo câncer.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0007] A presente invenção refere-se a compostos e composições farmacêuticas que os contêm, à sua preparação e a usos para os compostos, principalmente, mas não exclusivamente, agentes anticân-
cer.
[0008] De acordo com um aspecto, a presente invenção refere-se a um composto ou compostos de Fórmula (l): D> N Ho" 9 H 9 (1) em que: R é selecionado a partir do grupo que consiste em: -(CH>2)n- R'; -C5.6 heteroarila, opcionalmente substituído por um ou mais dentre halogênio, -CF3, -C1-6 alquil e -O-C1-6 alquila; --C(R2)=N-R3; -CH(CF3)NH(CH2)mCH3; -C(RºRP)NH(CH2)m CHs; --C(halogênio)=CH(CH2)mCH3; = --SO2-NH(CH2)mMCH3; —-O (CO)-arila; -O(CO)-heteroarila; -NRºRº; e --NH-heteroarila; em que R' é -O-CRºRº(CH2)mCH3 ou -N-CRºRº(CH2)mCHs; em que Rº e Rº, juntamente com os átomos aos quais es- tão ligados, formam um anel C3-10 heterociclila; R? é -CN ou -NH(CH2)mCHsa; R3 é -(CH2)mCH3 ou -O-(CH2)mCHs; X é —-H ou -CHs; cada n é independentemente 1, 20u3;e cada m é independentemente O, 1, 2 ou 3; ou um sal farmaceuticamente aceitável deste.
[0009] De acordo com um aspecto, a presente invenção refere-se a um composto ou compostos de Fórmula (Il): SON HO" 9 H º (11) ou um sal farmaceuticamente aceitável deste, em que: L é um ligante peptídico;
R é selecionado a partir do grupo que consiste em: -(CH>2)n- R'; -C5.6 heteroarila, opcionalmente substituído por um ou mais dentre halogênio, -CF3, -C1-salquil e -O-C1-6 alquila; -C(R2)=N-R3; -CH(CF3))NH(CH2)mCH3; -C(RºRP)NH(CH>2)m CH; -C(halogênio)=CH(CH2)mCH3; -SO2-NH(CH2)mCH3; -O(CO)-arila; - O(CO)-heteroarila; -NRºRº; e --NH-heteroarila; em que R' é -O-CRºRº(CH2)mCH3 ou -N-CRºRº(CH2)mCHsa; em que Rº e Rº, juntamente com os átomos aos quais es- tão ligados, formam um anel C3-10 heterociclila; R? é -CN ou -NH(CH2)nCHs; R? é -(CH2)mCH3 ou -O-(CH2)mCHs; cada n é independentemente 1, 20u3;e cada m é independentemente O, 1, 2 ou 3.
[0010] De acordo com um aspecto, a presente invenção refere-se a um composto ou compostos de Fórmula (Ill): T-L'-Ab (11) ou um sal farmaceuticamente aceitável deste, caracterizado pelo fato de que: L é uma porção do ligante peptídico; T é um radical de Fórmula (1): R o o. ARA o As H º (P) em que: R é selecionado a partir do grupo que consiste em: -(CH>2)n- R'; -C5.6 heteroarila, opcionalmente substituído por um ou mais dentre halogênio, -CF3, -C1-salquil e -O-C1-6 alquila; --C(R2)=N-R3; --CH(CF3)NH(CH2)mCHsa; --C(RºR)NH(CH2)m CHs3; -C(halogênio)=CH(CH2)mCHsa; --SO2-NH(CH2)mCHa; -O(CO)-arila; -O(CO)-heteroarila; -NRºRº; e --NH-heteroarila;
em que R' é -O-CRºRº(CH2)mCH3 ou -N-CRºRº(CH2)mCHsa; em que Rº e Rº, juntamente com os átomos aos quais es- tão ligados, formam um anel C3-10 heterociclila; R? é -CN ou -NH(CH2)mCHsa; R? é -(CH2)mCH3 ou -O-(CH2)mCHs; cada n é independentemente 1, 2 ou 3; cada m é independentemente O, 1, 20u3;e Ab é um anticorpo.
[0011] Ainda de acordo com outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma composição farmacêutica de um composto ou com- postos de Fórmula (1) ou Fórmula (Ill) e/ou um sal ou sais destes, compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz do(s) com- posto(s) ou sal(is) e um diluente, carreador ou excipiente farmaceuti- camente aceitável. Tais composições farmacêuticas podem incluir adi- cionalmente uma quantidade terapeuticamente eficaz de outro agente quimioterapêutico conhecido dos versados na técnica.
[0012] De acordo com outro aspecto, a presente invenção refere- se a um método para o tratamento de câncer, compreendendo a ad- ministração a um paciente em necessidade de uma quantidade tera- peuticamente eficaz do composto de Fórmula (1) ou Fórmula (Ill) e/ou um sal ou sais destes, sendo a referida quantidade eficaz para matar ou inibir a proliferação das células tumorais ou células cancerígenas.
[0013] De acordo com um aspecto adicional, a presente invenção refere-se a um método de produção de um composto ou Fórmula (III), o método compreendendo a reação de um anticorpo com um compos- to de Fórmula (II).
[0014] De acordo com outro aspecto, a presente invenção refere- se a um kit para tratamento de câncer compreendendo a composição farmacêutica da invenção e instruções de uso.
[0015] Outros objetos da invenção podem ser evidentes para um versado na técnica após a leitura do seguinte relatório descritivo e rei- vindicações.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0016] A FIGURA 1 apresenta medições médias do volume tumo- ral +/- SEM (erro padrão da média) em tumores derivados de NCI-N87 em camundongos nude BALB/c fêmeas após tratamento com várias doses de Composto 10, Composto 11, Kadcyla& ou veículo sozinho. As setas pretas indicam os dias em que os ratos foram injetados com o artigo de teste.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[0017] Esta aplicação não se limita a metodologias particulares ou as composições específicas descritas, como tais, podem variar. Tam- bém deve ser entendido que a terminologia utilizada neste documento tem a finalidade de descrever modalidades particulares somente, e não pretende ser limitante, uma vez que o escopo do presente pedido será limitado somente pelas reivindicações anexas e seus equivalen- tes.
[0018] A presente invenção refere-se a novos compostos análogos da tailanestatina úteis como pequenas moléculas citotóxicas em con- jugados anticorpo-fármaco (ADCs) e compostos ligantes peptídicos de toxinas, alternativamente conhecidos como compostos ligantes peptí- dicos de fármacos, úteis em conexão com ADCs. A presente invenção se refere ainda a composições incluindo esses compostos citotóxicos e ADCs, e métodos para usar tais toxinas e ADCs para tratar condi- ções patológicas, incluindo câncer. Definições e Abreviações
[0019] A menos que definido de outra forma, todos os termos téc- nicos e científicos usados neste documento têm o mesmo significado conforme comumente entendido por alguém versado na técnica à qual esta invenção pertence. Embora quaisquer métodos e materiais seme-
lhantes ou equivalentes àqueles descritos neste documento possam ser usados na prática ou teste do presente pedido, os métodos e ma- teriais preferenciais são agora descritos.
[0020] O termo "anticorpo" (ou "Ab" ou "AB"), conforme usado nes- te documento, inclui moléculas de imunoglobulina (Ig). Em certas mo- dalidades, o anticorpo é um anticorpo de comprimento total que com- preende quatro cadeias de polipeptídeo, ou seja, duas cadeias pesa- das (HC) e duas cadeias leves (LC) interligadas por ligações de dissul- feto. Cada cadeia pesada é compreendida por uma região variável de cadeia pesada (HCVR ou VH) e uma região constante de cadeia pe- sada (CH). A região constante da cadeia pesada é composta de três domínios, CH1, CH2 e CH3. Cada cadeia leve é compreendida por uma região variável de cadeia leve (LCVR ou VL) e uma região cons- tante de cadeia leve, que é composta de um domínio, CL. As regiões VH e VL podem ser ainda subdivididas em regiões de hipervariabilida- de, designadas regiões determinantes da complementaridade (CDRs). Intercaladas com tais regiões estão as regiões de framework (FR) mais conservadas. Cada VH e VL é composta por três CDRs e quatro FRs, dispostas a partir do amino-terminal para o carbóxi-terminal na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, e FRA4.
[0021] O termo "anticorpo" neste documento é usado no sentido mais amplo e abrange especificamente anticorpos monoclonais, anti- corpos policlonais, dímeros, multímeros, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos) e fragmentos de anticorpos, desde que exibam a atividade biológica desejada (Miller, et al., J. Immunology, 2003, 170:4854-4861). Os anticorpos podem ser muri- nos, humanos, humanizados, quiméricos ou derivados de outras espé- cies. Um anticorpo é uma proteína gerada pelo sistema imunológico que é capaz de reconhecer e se ligar a um antígeno específico (Jane- way, C., et al., Inmuno Biology, 5º Ed., 2001, Garland Publishing, No-
va York). Um antígeno alvo geralmente possui inúmeros sítios de liga- ção, também chamados de epítopos, reconhecidos pelas CDRs em múltiplos anticorpos. Cada anticorpo que se liga especificamente a um epítopo diferente tem uma estrutura diferente. Assim, um antígeno po- de ter mais de um anticorpo correspondente. Um anticorpo inclui uma molécula de imunoglobulina de comprimento total ou uma porção imu- nologicamente ativa de uma molécula de imunoglobulina de compri- mento total, isto é, uma molécula que contém um sítio de ligação a an- tígeno que se liga imunoespecificamente a um antígeno de um alvo de interesse ou parte deste, tais alvos incluindo, mas não se limitando a, células cancerosas ou células que produzem anticorpos autoimunes associados a uma doença autoimune. A imunoglobulina divulgada nes- te documento pode ser de qualquer tipo (por exemplo, IgG, IgE, IgM, IgD e IgA), classe (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) ou subclasse da molécula de imunoglobulina. As imunoglobulinas po- dem ser derivadas de qualquer espécie. Em um aspecto, no entanto, a imunoglobulina é de origem humana, murina ou de coelho.
[0022] "Fragmentos de anticorpo" compreende uma porção de um anticorpo de comprimento total, geralmente a região de ligação ao an- tígeno ou região variável desta. Exemplos de fragmentos de anticorpos incluem Fab, Fab', F(ab')2 e fragmentos de Fv; diacorpos; anticorpos lineares; minicorpos (Olafsen et al., Protein Eng. Design Sel., 2004, 17(4): 315-323), fragmentos produzidos por uma biblioteca de expres- são Fab, anticorpos anti-idiotípicos (anti-ld), CDR (região determinante da complementariedade) e fragmentos de ligação a epítopos de qual- quer um dos descritos neste documento que se ligam imunoespecifi- camente a antígenos de células cancerígenas, antígenos virais ou an- tígenos microbianos, moléculas de anticorpo de cadeia única; e anti- corpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpo.
[0023] Em certas modalidades, o anticorpo é IgG, IgA, IgE, IgD ou
IgM. Em certas modlidades, o anticorpo é I9G1, IgG2, IgG3, ou Ig9G4; ou IgA1 ou IgA2.
[0024] Em certas modalidades, o agente de ligação celular é uma "porção de ligação ao antígeno" de um anticorpo monoclional, compar- tilhando sequências críticas para a ligação ao antígeno com um anti- corpo (como huMy9-6 ou seus anticorpos relacionados descritos nas Patentes US Nos. 7.342.110 e 7.557.189, incorporadas neste docu- mento por referência).
[0025] Conforme usado neste documento, o termo "porção de liga- ção ao antígeno" de um anticorpo (ou algumas vezes referido inter- cambiavelmente neste documento como "fragmentos de anticorpo") inclui um ou mais fragmentos de um anticorpo que retêm a capacidade de se ligar especificamente a um antígeno. Demonstrou-se que a fun- ção de ligação a antígeno de um anticorpo pode ser executada por de- terminados fragmentos de um anticorpo de comprimento total. Exem- plos de fragmentos de ligação abrangidos pelo termo "porção de liga- ção ao antígeno" de um anticorpo incluem (sem limitação): (i) um fra- gmento Fab, um fragmento monovalente que consiste nos domínios VL, VH, CL e CH1 (por exemplo, um anticorpo digerido pela papaína produz três fragmentos: dois fragmentos Fab de ligação ao antígeno e um fragmento Fc que não se liga ao antígeno); (ii) um fragmento F(ab'), um fragmento bivalente compreendendo dois fragmentos Fab ligados por uma ponte dissulfeto na região de dobradiça (por exemplo, um anticorpo digerido por pepsina produz dois fragmentos: um F(ab') de ligação a antígeno bivalente e um fragmento pFc' que não se liga ao antígeno) e sua unidade monovalente F(ab') relacionada; (ili) um fragmento Fd que consiste nos domínios VH e CH1 (isto é, a porção da cadeia pesada que está incluída no Fab); (iv) um fragmento Fv consistindo nos domínios VL e VH de um único braço de um anticorpo e o Fv ligado a dissulfeto relacionado; (v) um fragmento dAb (anticorpo de domínio) ou sdAb (anticorpo de domínio único), que consiste em um domínio VH; e (vi) uma região determinante da complementarieda- de isolada (CDR). Em certas modalidades, a porção de ligação ao an- tígeno é um sdAb (anticorpo de domínio único).
[0026] Em certas modalidades, a porção de ligação ao antígeno também inclui certos derivados manipulados ou recombinantes (ou "anticorpos derivados") que também incluem um ou mais fragmentos de um anticorpo que retêm a capacidade de se ligar especificamente a um antígeno, além de elementos ou sequências que pode não ser en- contrado em anticorpos naturalmente existentes.
[0027] Por exemplo, embora os dois domínios de fragmento Fv, VL e VH, sejam codificados por genes separados, eles podem ser unidos, usando métodos recombinantes padrão, por um ligante peptídico sinté- tico que os permita serem produzidos como uma única cadeia de pro- teína em que as regiões VL e VH se combinam para formar moléculas monovalentes (conhecidas como Fv de cadeia única (scFv)). Em todas as modalidades descritas neste documento, o terminal N de um scFv pode ser um domínio VH (ou seja, N-VH-VL-C) ou um domínio VL (ou seja, N-VL-VH-C).
[0028] Fragmentos variáveis de cadeia única divalentes (ou biva- lentes) (di-scFvs, bi-scFvs) podem ser projetados ligando dois scFvs. Isto produz uma única cadeia peptídica com duas regiões VH e duas regiões VL, obtendo-se um scFv tandem (tascFv). Mais repetições em tandem, tais como tri-scFv, podem ser produzidas de forma semelhan- te, ligando três ou mais scFv de uma forma de cabeça-a-cauda.
[0029] Em certas modalidades, os scFvs podem ser ligados atra- vés de ligantes peptídicos que são muito curtos (cerca de cinco ami- noácidos) para as duas regiões variáveis se enovelarem, forçando os scFvs a se dimerizarem e formar diacorpos. Os diacorpos podem ser biespecíficos ou monoespecíficos. Os diacorpos demonstraram possu-
ir constantes de dissociação superiores a 40 vezes menos do que o scFv correspondente, ou seja, tendo uma afinidade muito mais eleva- da para o alvo.
[0030] Os ligantes peptídicos ainda mais curtos (um ou dois ami- noácidos) levam à formação de trímeros, os assim chamados triacor- pos ou tricorpos. Tetracorpos também foram produzidos de forma se- melhante. Eles exibem uma afinidade ainda maior aos seus alvos do que diacorpos. Os diacorpos, triacorpos e tetracorpos às vezes são chamados coletivamente de agentes de ligação celular "YAVIBODY Tu" (ou "AVIBODY" em abreviação). Ou seja, AVIBODY com dois, três, ou quatro Regiões de Ligação Alvo (TBRs - "Target Binding Regions") são comumente conhecidos como Dia-, Tria- e Tetracorpos. Ver, por exemplo, Publicações U.S. Nos. 2008/0152586 e 2012/0171115 para mais detalhes, os ensinamentos inteiros das quais são incorporados neste documento por referência.
[0031] Todos estes formatos podem ser compostos a partir de fra- gmentos variáveis com especificidade para dois ou mais antígenos di- ferentes, caso em que eles são tipos de anticorpos bi ou multiespeciífi- cos. Por exemplo, determinados di-scFvs tandem biespecíficos, são conhecidos como acopladores biespecíficos de células T (BITEs). Em certas modalidades, cada scFv no scFv tandem ou diacorpo/triacorpo/ tetracorpo podem ter a mesmo ou diferente especificidade de ligação, e cada um pode ter, independentemente, um VH do terminal N ou VL do terminal N.
[0032] Fcabs são fragmentos de anticorpos projetados a partir da região constante Fc de um anticorpo. Fcabs podem ser expressos co- mo proteínas solúveis, ou podem ser projetadas de volta em um anti- corpo de comprimento total, tais como IgG, para criar mAb2. Um mAb2 é um anticorpo de comprimento total com um Fcab no lugar da região Fc normal. Com estes sítios de ligação adicionais, os anticorpos mo-
noclonais biespecíficos mAb2 podem ligar dois alvos diferentes ao mesmo tempo.
[0033] Os anticorpos naturais são monoespecíficos, mas bivalen- tes, na medida em que expressam dois domínios de ligação ao antí- geno idênticos. Em contraste, em certas modalidades, certos deriva- dos de anticorpo projetados são moléculas bi- ou multiespecíficas que possuem dois ou mais diferentes domínios de ligação ao antígeno, ca- da um com diferente especificidade de alvo. Os anticorpos biespeciífi- cos podem ser gerados através da fusão de duas células produtoras de anticorpos, cada uma delas com especificidade distinta. Estes "quadromas" produziram múltiplas espécies moleculares, já que as duas cadeias leves distintas e duas cadeias pesadas distintas estavam livres para recombinar nos quadromas em várias configurações. Des- de então, Fabs biespecíficos, scFvs e os mAbs de tamanho total foram gerados utilizando uma variedade de tecnologias (ver acima).
[0034] A proteína de imunoglobulina de domínio variável duplo (DVD-lg) é um tipo de IgG dupla específica que tem como alvo simul- taneamente dois antígenos/epítopos. A molécula contém uma região Fc e regiões constantes em uma configuração semelhante à de uma IgG convencional. No entanto, a proteína de DVD-lg é única na medi- da em que cada braço da molécula contém dois domínios variáveis (VDs). Os VDs dentro de um braço estão ligados em tandem e podem possuir diferentes especificidades de ligação.
[0035] Moléculas derivadas de anticorpos triespecíficos podem também ser geradas através da, por exemplo, expressão de anticor- pos biespecíficos com dois Fabs distintos e um Fc. Um exemplo é uma anti-Ep-CAM de IgG2a de camundongo, quadroma de anti-CD3 de IgG2b de rato, chamado BiUII, que pensa-se permitir a co-localização de células tumorais que expressam Ep-CAM, células T que expressam CD3, e macrófagos que expressam FcsRlI, assim potenciando as fun-
ções de co-estimuladoras e antitumorais das células imunes.
[0036] Procorpos são anticorpos monoclonais totalmente recombi- nantes mascarados que permanecem inertes em tecido saudável, mas são ativados especificamente no microambiente da doença (por exemplo, através de clivagem da protease por uma protease especiífi- ca ou enriquecida em um microambiente de doença). Técnicas de mascaramento semelhantes podem ser utilizadas para qualquer um dos anticorpos ou suas porções de ligação ao antígeno respectivas descritas neste documento.
[0037] Um intracorpo é um anticorpo que foi modificado para loca- lização intracelular, para trabalhar dentro da célula para se ligar a um antígeno intracelular. O intracorpo pode permanecer no citoplasma, ou pode ter um sinal de localização nuclear, ou pode ter uma sequência KDEL para direcionamento a ER. O intracorpo pode ser um anticorpo de cadeia simples (scFv), os domínios VL de imunoglobulina modifica- dos com hiperestabilidade, anticorpo seleccionado resistente ao ambi- ente intracelular mais redutor, ou expresso como uma proteína de fu- são com a proteína de ligação de maltose ou outras proteínas intrace- lulares estáveis. Tais optimizações melhoraram a estabilidade e estru- tura dos intracorpos, e podem ter aplicabilidade geral para qualquer um dos anticorpos ou suas porções de ligação ao antígeno descritas neste documento.
[0038] As porções de ligação ao antígeno ou anticorpos derivados da invenção pode ter substancialmente as mesmas ou idênticas (1) regiõês CDR3 de cadeia leve e/ou de cadeia pesada; (2) regiões CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve e/ou cadeia pesada; ou (3) regi- ões de cadeia leve e/ou cadeia pesada, em comparação com um anti- corpo a partir das quais são derivadas/projetadas. Sequências dentro destas regiões podem conter substituições conservadoras de aminoá- cidos, incluindo substituições nas regiõês CDR. Em certas modalide-
des, não há mais do que 1, 2, 3, 4, ou 5 substituições conservadoras. Em uma alternativa, as porções de ligação ao antígeno ou anticorpos derivados têm uma região de cadeia leve e/ou uma região de cadeia pesada que é pelo menos cerca de 90%, 95%, 99% ou 100% idêntica à de um anticorpo a partir do qual são derivadas/projetadas. Estas porções de ligação ao antígeno ou anticorpos derivados podem ter substancialmente a mesma especificidade de ligação e/ou afinidade para o antígeno alvo em comparação com o anticorpo. Em certas mo- dalidades, os valores Ka e/ou kKor das porções de ligação ao antígeno ou anticorpos derivados estão dentro de 10 vezes (maior ou menor), 5 vezes (maior ou menor), três vezes (maior ou menor), ou duas vezes (maior ou menor) de um anticorpo descrito neste documento.
[0039] Em certas modalidades, as porções de ligação ao antígeno ou anticorpos derivados podem ser derivados/projetados a partir de anticorpos totalmente humanos, anticorpos humanizados, ou anticor- pos quiméricos, e podem ser produzidos de acordo com quaisquer mé- todos reconhecidos na técnica.
[0040] O termo "anticorpo monoclonal" usado neste documento se refere a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, isto é, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos exceto pelas mutações de ocorrência natural possíveis que podem estar presentes em quantida- des menores. Os anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo direcionados contra um único sítio antigênico. O modificador "monoclonal" indica o caráter do anticorpo como sendo obtido de uma população substancialmente homogênea de anticorpos e não deve ser interpretado como exigindo a produção do anticorpo por qualquer mé- todo em particular.
[0041] O termo "anticorpos monoclionais" inclui especificamente anticorpos "quiméricos", nos quais uma porção da cadeia leve e/ou pesada é idêntica ou homóloga às sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécie em particular ou pertencentes a uma classe ou subclasse de anticorpo em particular, enquanto o res- tante da(s) cadeia(s) é (são) idêntica(s) ou homóloga(s) às sequências correspondentes de anticorpos derivados de outra espécie ou perten- centes a outra classe ou subclasse de anticorpos, bem como fragmen- tos de tais anticorpos, contanto que eles exibam a atividade biológica desejada.
[0042] As formas "humanizadas" de anticorpos não humanos (por exemplo, roedores) são anticorpos quiméricos que contêm uma se- quência mínima derivada de imunoglobulina não humana. No geral, os anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo re- ceptor) em que resíduos de uma região hipervariável do receptor são substituídos por resíduos de uma região hipervariável de uma espécie não humanas (anticorpo doador), tais como camundongo, rato, coelho ou primata não humano, possuindo a especificidade, afinidade e capa- cidade desejadas. Em alguns casos, resíduos da região de framework (FR) da imunoglobulina humana são substituídos pelos corresponden- tes resíduos não humanos. Além disso, anticorpos humanizados po- dem compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo re- ceptor ou no anticorpo doador. Estas modificações são feitas para adi- cionalmente refinar o desempenho do anticorpo. Em geral, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente a totalidade de pelo me- nos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, nos quais todos, ou substancialmente todos, os laços hipervariáveis correspondem àque- les de uma imunoglobulina não humana e todas, ou substancialmente todas, as FRs são aquelas de uma sequência de imunoglobulina hu- mana. O anticorpo humanizado opcionalmente compreenderá também pelo menos uma parte de uma região constante de imunoglobulina (Fc), normalmente o de uma imunoglobulina humana.
[0043] Um "anticorpo manipulado por cisteína" é um anticorpo no qual um ou mais resíduos de um anticorpo são substituídos por resí- duos de cisteína. De acordo com a presente descrição, o(s) grupo(s) tiol dos anticorpos manipulados com cisteína pode ser conjugado com uma toxina análoga à tailanestatina da Fórmula | ou um composto de Fórmula Il de ligação peptídica aos fármacos para formar um compos- to conjugado anticorpo-fármaco (ADC). Em modalidades específicas, os resíduos substituídos ocorrem em locais acessíveis do anticorpo. Ao substituir esses resíduos por cisteína, os grupos tiol reativos são assim posicionados em sítios acessíveis do anticorpo e podem ser usados para conjugar o anticorpo à porção do fármaco para criar um ADC, como descrito mais adiante neste documento. Por exemplo, um anticorpo manipulado com cisteína pode ser um anticorpo com uma única mutação de um resíduo nativo não cisteína em uma cisteína na cadeia leve (por exemplo, G64C, K149C ou R142C de acordo com a numeração Kabat) ou na cadeia pesada (por exemplo, D101C ou V184C ou T205C de acordo com a numeração Kabat). Em exemplos específicos, um anticorpo manipulado com cisteína possui uma única mutação de cisteína na cadeia pesada ou leve, de modo que cada an- ticorpo completo (isto é, um anticorpo com duas cadeias pesadas e duas cadeias leves) tenha dois resíduos de cisteína manipulados. An- ticorpos manipulados com cisteína e métodos preparatórios são divul- gados pelo Pedido Publicado U.S. No. 2012/0121615, Patente U.S. No. 7.521.541; Shen, B. et al., Nat. Biotechnol., 2012, 30(2): 184-189; Sukumaran et a/l., Pharm. Res., 2015, 32:1884-1893 (incorporada por referência neste documento em sua totalidade).
[0044] O termo “quantidade terapeuticamente eficaz” refere-se a uma quantidade de um fármaco eficaz para tratar uma doença ou dis- túrbio em um mamífero. No caso do câncer, a quantidade terapeuti- camente eficaz do fármaco pode reduzir o número de células cancerí-
genas; reduzir o tamanho do tumor; inibir (isto é, abrandar até certo ponto e preferencialmente interromper) a infiltração da célula cancerí- gena dentro de órgãos periféricos; inibir (isto é, abrandar até certo ponto e preferencialmente interromper) a metástase do tumor; inibir, até certo ponto, o crescimento do tumor; e/ou aliviar até certo ponto um ou mais sintomas associados com o câncer. Na medida em que o fármaco possa inibir o crescimento e/ou a eliminar as células cancero- sas existentes, ela pode ser citostática e/ou citotóxica. Para o trata- mento do câncer, a eficácia pode ser medida, por exemplo, avaliando- se o tempo de progressão da doença (TTP) e/ou determinando a taxa de resposta (RR). A quantidade terapeuticamente eficaz variará de acordo com o composto, a gravidade da doença ou distúrbio a ser tra- tado e a idade, peso, etc., do paciente a ser tratado.
[0045] O termo "quantidade substancial" refere-se à maioria, ou seja, mais de 50% da população, de uma mistura ou amostra.
[0046] O termo "atividade citotóxica" ou "citotoxicidade" refere-se a um efeito de morte celular, citostático ou anti-proliferativo de um ADC ou um metabólito intracelular do referido ADC. A atividade citotóxica pode ser expressa como o valor de ICs5o, que é a concentração (molar ou de massa) por unidade de volume na qual metade das células so- brevive.
[0047] Um "distúrbio" é qualquer condição que se beneficiaria do tratamento com um fármaco ou conjugado anticorpo-fármaco. Isto in- clui distúrbios ou doenças crônicas e agudas incluindo as condições patológicas que predispõem o mamífero ao distúrbio em questão. Exemplos não limitativos de distúrbios a serem tratados neste docu- mento incluem cânceres benignos e malignos; leucemia e malignida- des linfóides, distúrbios neuronais, gliais, astrocitários, hipotalâmicos e outros distúrbios glandulares, macrofágicos, epiteliais, estromais e blastocélicos; e distúrbios inflamatórios, angiogênicos e imunológicos.
[0048] Os termos "câncer" e "canceroso" se referem ou descrevem a condição ou distúrbio fisiológico em mamíferos que é tipicamente caracterizado pelo crescimento celular não regulado. Um "tumor" com- preende uma ou mais células cancerosas.
[0049] O termo "paciente" refere-se a um mamífero, preferencial- mente um ser humano.
[0050] Os termos "tratar" ou "tratamento", a menos que indicado de outra forma pelo contexto, referem-se a tratamento terapêutico e medidas profiláticas para evitar recaídas, em que o objetivo é inibir ou desacelerar (diminuir) uma alteração ou distúrbio fisiológico indeseja- do, como o desenvolvimento ou disseminação de câncer. Para os pro- pósitos desta invenção, os resultados clínicos benéficos ou desejados incluem, mas não se limitam a, amenização dos sintomas, diminuição da amplitude da doença, estado da doença estabilizado (isto é, sem pioras), retardo ou abrandamento do progresso da doença, melhoria ou paliação do estado da doença e remissão (parcial ou total), detec- táveis ou indetectáveis. "Tratamento" pode significar também prolongar a sobrevida em relação à sobrevida esperada se não receberem tra- tamento. Aqueles que necessitam de tratamento incluem aqueles que já têm a condição ou distúrbio, bem como aqueles propensos a ter a condição ou distúrbio.
[0051] No contexto de câncer, o termo "tratamento" inclui toda ou qualquer inibição do crescimento de células tumorais, células cancerí- genas ou de um tumor; inibir a replicação de células tumorais ou célu- las cancerígenas, diminuir a carga tumoral total ou diminuir o número de células cancerígenas e melhorar um ou mais sintomas associados à doença.
[0052] No contexto de uma doença autoimune, o termo "tratamen- to" inclui toda ou qualquer inibição da replicação de células associadas a um estado de doença autoimune, incluindo, mas não se limitando a,
células que produzem um anticorpo autoimune, diminuindo a carga de anticorpos autoimunes e melhorando um ou mais sintomas de uma doença autoimune.
[0053] No contexto de uma doença infecciosa, o termo "tratamen- to" inclui qualquer um ou todos dentre: inibir o crescimento, multiplica- ção ou replicação do patógeno que causa a doença infecciosa e me- lhorar um ou mais sintomas de uma doença infecciosa.
[0054] Salvo indicação em contrário, o termo "alquil" por si só ou como parte de outro termo refere-se a um hidrocarboneto saturado de cadeia linear ou ramificada com o número indicado de átomos de car- bono (por exemplo, C1-Cg alquil" refere-se a um grupo alquil que pos- sui de 1 a 8 átomos de carbono). Quando o número de átomos de car- bono não é indicado, o grupo alquil possui de 1 a 8 átomos de carbo- no, preferencialmente de 1 a 6 átomos de carbono. O termo "alquil" destina-se especificamente a incluir grupos possuindo qualquer grau ou nível de saturação, isto é, grupos que têm ligações carbono- carbono exclusivamente individuais, grupos tendo uma ou mais liga- ções duplas carbono-carbono, grupos tendo uma ou mais ligações carbono-carbono triplas e grupos tendo misturas de ligações carbono- carbono simples, duplas e triplas. Sempre que um determinado nível de saturação é pretendido, são usadas as expressões "alcanil", "alce- nil" e "alcinil". C1-Cg alquilos de cadeia linear representativos incluem, mas não estão limitados a, metila, etila, n-propila, n-butila, n-pentila, n- hexila, n-heptila e n-octila; enquanto C1-Cs alquilas ramíificados inclu- em, mas não estão limitados a, -isopropila, -sec-butila, -isobutila, -terc- butila, -isopentila e -2-metilbutila; C2-Cg alquilas insaturados incluem, mas não estão limitados a, vinila, alila, 1-butenila, 2-butenila, isobutile- nila, 1-pentenila, 2-pentenila, 3-metil-1-butenila, 2-metil-2-butenila, 2,3- dimetil-2-butenila, 1-hexila, 2-hexila, 3-hexila, acetilenila, propinila, 1- butinila, 2-butinila, 1-pentinila, 2-pentinila e 3-metil-1-butinila.
[0055] Salvo indicação em contrário, "alquileno", por si só como parte de outro termo, refere-se a um radical de hidrocarboneto cíclico, de cadeia linear ou ramificada, saturada, com o número indicado de átomos de carbono, tipicamente 1-18 átomos de carbono, e com dois centros radicais monovalentes derivados da remoção de dois átomos de hidro- gênio do mesmo ou dois átomos de carbono diferentes de um alcano pa- rental. Os radicais alquileno típicos incluem, mas não estão limitados a, metileno (-CH2-), 1,2-etileno -CH2CH2-), 1,3-propileno (-CH2CH2CH>-), 1,4-butileno (-CH2CH2CH2C0H>2-), e similar. Um “C1-Ci0o” alquileno de cadeia linear é um grupo hidrocarboneto saturado de cadeia linear da fórmula -(CH2)1-10—. Exemplos de C1-C10o alquileno incluem metileno, etileno, propileno, butileno, pentileno, hexileno, heptileno, octileno, no- nileno e decaleno. Em certas modalidades da invenção, os alquilenos têm de 1 a 9, de 1 a 8, de 1 a7 e de 1 a 6 carbonos.
[0056] O termo "composto" ou "compostos", conforme utilizado neste documento, refere-se a análogos da tailanestatina e inclui quais- quer compostos específicos abrangidos por fórmulas genéricas divul- gadas neste documento. Os compostos podem ser identificados por sua estrutura química e/ou nome químico. Quando a estrutura química e o nome químico entram em conflito, a estrutura química é determi- nante da identidade do composto. Os compostos podem conter um ou mais centros quirais e/ou ligações duplas e, portanto, podem existir como estereoisômeros, como isômeros de ligação dupla (isto é, isôme- ros geométricos), enantiômeros ou diastereômeros. Por conseguinte, quando a estereoquímica nos centros quirais não é especificada, as estruturas químicas descritas neste documento abrangem todas as configurações possíveis nesses centros quirais, incluindo a forma este- reoisomericamente pura (por exemplo, geometricamente puras, enan- tiomericamente puras ou diastereomericamente puras) e misturas enantioméricas e estereoisoméricas. As misturas enantioméricas e es-
tereoisoméricas podem ser resolvidas em seus componentes enantiô- meros ou estereoisômeros usando técnicas de separação ou técnicas de síntese quiral bem conhecidas por aqueles versados na técnica. Os compostos também podem existir em várias formas tautoméricas, in- cluindo a forma enol, a forma ceto e as suas misturas. Consequente- mente, as estruturas químicas representadas neste documento englo- bam todas as formas tautoméricas possíveis dos compostos ilustra- dos. Os compostos descritos também incluem compostos marcados isotopicamente em que um ou mais átomos têm uma massa atômica diferente da massa atômica convencionalmente encontrada na nature- za. Exemplos de isótopos que podem ser incorporados nos compostos incluem, mas não estão limitados a, 2H, 3H, ºC, ºC, **N, 7O, e *8O. Os compostos podem existir em formas não solvatadas, bem como em formas solvatadas, incluindo formas hidratadas e como N-óxidos. Em geral, as formas hidratada, solvatada e N-óxido estão dentro do esco- po da presente descrição. Determinados compostos podem existir em múltiplas formas cristalinas ou amorfas. Em geral, todas as formas físi- cas são equivalentes para os usos contemplados neste documento e se destinam a estar dentro do escopo da presente descrição. Além disso, deve ser entendido, quando estruturas parciais dos compostos são ilustradas, que colchetes indicam o ponto de ligação da estrutura parcial ao resto da molécula.
[0057] Salvo indicação em contrário, o termo "heteroalquil", por si só ou em combinação com outro termo, significa, salvo afirmação con- trária, um hidrocarboneto estável de cadeia linear ou ramificada ou su- as combinações, totalmente saturado ou contendo de 1 a 3 graus de insaturação, consistindo do número declarado de átomos de carbono e de um a três heteroátomos selecionados do grupo que consiste em O, N, Si, S e/ou P, e em que os átomos de nitrogênio e enxofre podem opcionalmente ser oxidados e o heteroátomo de nitrogênio pode ser opcionalmente quaternizado. O(s) heteroátomo(s) O, N e S pode(m) ser colocado(s) em qualquer posição interior do grupo heteroalquil. O heteroátomo Si pode ser colocado em qualquer posição do grupo hete- roalquila, incluindo a posição na qual o grupo alquil está ligada ao res- tante da molécula. Até dois heteroátomos podem ser consecutivos.
[0058] "Halo" ou "halogênio" refere-se a flúor, cloro, bromo e iodo.
[0059] "Halo (C1-6-alquil)" refere-se a grupos C1-6-alquila substituí- dos por 1 a 3 ou 1 a 2 grupos halo, em que C1-6-alquila e halo são con- forme definidos neste documento. O termo inclui, por exemplo, CFs3.
[0060] O termo "epóxi", ou "grupo epóxi" ou "resíduo epóxi" refere- se a um anel de três membros que compreende átomos de carbono e um átomo de oxigênio ligado por ligações simples. Por conseguinte, o termo "epóxido" refere-se a um composto que compreende pelo me- nos um grupo epóxi conforme definido.
[0061] Salvo indicação em contrário, "arila", por si só ou parte de outro termo, significa um radical hidrocarboneto aromático monovalen- te substituído ou não substituído de 6 a 20 átomos de carbono, prefe- rencialmente de 6 a 14 átomos de carbono, derivado da remoção de um átomo de hidrogênio de um único átomo de carbono de um siste- ma de anéis aromáticos parentais. Grupos aril típicos incluem, mas não estão limitados a, radicais derivados de aceantrileno, acenatftileno, acefenantrileno, antraceno, azuleno, benzeno, criseno, coroneno, fluo- ranteno, fluoreno, hexaceno, hexafeno, hexaleno, as-indaceno, s- indaceno, indano, indeno, naftaleno, octaceno, octafeno, octaleno, ovaleno, penta-2,4-dieno, pentaceno, pentaleno, pentafeno, perileno, fenaleno, fenantreno, piceno, pleiadeno, pireno, pirantireno, rubiceno, trifenileno, trinftaleno e similares. Preferencialmente, um grupo arila compreende de 6 a 20 átomos de carbono, mais preferencialmente entre 6 a 12 átomos de carbono. Um grupo aromático substituído (por exemplo, um grupo arila) pode ser substituído por um ou mais, de pre-
ferência 1 a 5, dos seguintes grupos: C1-Cs alquila, -O—(C1-Cg alqui- la), —C(O)JR', —OC(O)R', —C(0)OR, —C(O)NH2, —C(O)NHR', — C(O)N(R ")), —NHC(O)R', —S (O)2R ', —S(O)R', -OH, halogênio, — NH(R'), —-N(R') o e -CN; em que cada R 'é selecionado independente- mente de -H, C1-Cg alquila, C1-Cg heteroalquila e arila. Em algumas modalidades, um grupo aromático substituído pode incluir ainda um ou mais dentre: —YNHC(=NH)NH2, —YNHCONH>2, —S (=0O)2R' e —SR '.
[0062] O termo "heteroaril", conforme utilizado neste documento, refere-se a um anel heterociclo aromático de 5 a 14 membros, como 5 a 6 membros, tendo pelo menos um heteroátomo selecionado dentre nitrogênio, oxigênio e enxofre e contendo pelo menos 1 átomo de car- bono. Os heteroarilos podem ser sistemas de anéis monocíclicos, bicí- clicos ou tricíclicos. Heteroarilos representativos são triazolila, tetrazoli- la, oxadiazolila, piridila, furila, benzofuranila, tiofenila, benzotiofenila, quinolinila, pirrolila, indolila, oxazolila, benzoxazolila, imidazolila, ben- zimidazolila, tiazolila,benzotiazolila, isoxazolila, pirazolila, isotiazolila, piridazinila, pirimidinila, pirazinila, triazinila, cinolinila, ftalazinila, quina- zolinila, pirimidila, azepinila, oxepinila e quinoxalinila. Heteroarilos são opcionalmente substituídos. Substituintes típicos incluem, mas não es- tão limitados a, —X, —R, —O—, —OR, —SR, —S—, —NR2, —NR;, =NR, —CX3, —CN, —OCN, —NRC(=O)R, —C(=O)NR2, —SO3H, — S(=O)2R, —OS(=0)2OR, —S(=O) NR, —S(=O)R, —OP(=0O)(OR)2, — P(=O)(OR)2, PO3H2, —C(=O)R, —C(=O)X, —C(=S)R, —CO2R, — CO—, —C(=S)OR, —C(=O)JSR, —C(=S)SR, —C(=O)NR, — C(=S)NR2, —C(=NR)NR2, C1-C2o heteroalquila, Ce-Caooarila, Ca- Cs heterociclila, um grupo protetor ou uma porção pró-fármaco, onde cada X é independentemente um halogênio: —F, —CI, —Br, ou —l; e cada R é independentemente —H ou C1-Cs alquila.
[0063] O termo "hidróxi" refere-se ao grupo - OH.
[0064] O termo "alquila substituída" significa um alquil no qual um ou mais átomos de hidrogênio são substituídos independentemente por um substituinte. Substituintes típicos incluem, mas não estão limi- tados a, —X, —R, —O—, —OR, —SR, —S—, —NR2, —NR3, =NR, — CX3, —CN, —OCN, =N2, —NRC(=O)R, —C(=O)NR2, —SO3—, — SO3H, —S(=O)R, —OS(=0)-OR, —S(=O) NR, —S(=O)JR, — OP(=0O)(OR)2, —P(=0O)(OR)2, —POz?”, POsH2, —AsO2H2, —C(=O)R, —C(=O0)X, —C(=S)R, —CO2R, —CO2, —C(=S)OR, —C(=O)SR, — C(=S)SR, — —C(=O)NR, ——C(=S)NR, — —C(=NRJ)NR>, C1- C2o heteroalquila, Ce-C20 arila, C3a-Cg heterociclila, um grupo protetor ou uma porção pró-fármaco, onde cada X é independentemente um halo- gênio: —F, —CI, —Br, ou —l; e cada R é independentemente —H ou C1-Cs alquila. Uma alquila substituída, substituído com um halogênio é algumas vezes referido aqui como uma haloalquila. Arila, alquileno, heteroalquileno e outros grupos contendo ou não uma porção alquila ou alquileno como descrito neste documento também podem ser subs- tituídos de maneira semelhante.
[0065] Salvo indicação em contrário, "aralquila" por si só ou parte de outro termo, significa um grupo alquila, conforme definido acima, substituído por um grupo arila, conforme definido acima.
[0066] Salvo indicação em contrário, "C3-Cg heterociclila" por si só ou como parte de outro termo, refere-se a um sistema de anel monocí- clico ou bicíclico, aromático ou não aromático, substituído ou não substituído, monovalente ou divalente com 3 a 8 átomos de carbono (também conhecido como membros do anel) e um a quatro heteroá- tomos membros do anel selecionados independentemente de N, O, P ou S e derivados pela remoção de um átomo de hidrogênio de um átomo do anel de um sistema de anéis parental. Da mesma forma, a menos que indicado de outra forma, "C3-C10 heterociclil" por si só ou como parte de outro termo, refere-se a um sistema de anel monocícli- co ou bicíclico, aromático ou não aromático, substituído ou não substi-
tuído, monovalente ou divalente, com 3 a 10 átomos de carbono (tam- bém referido em como membros do anel) e um a quatro heteroátomos membros do anel selecionados independentemente de N, O, PouS e derivados pela remoção de um átomo de hidrogênio de um átomo do anel de um sistema de anéis parental. Um ou mais átomos de N, C ou S no heterociíclila podem ser oxidados. O anel que inclui o heteroáto- mo pode ser aromático ou não-aromático. Grupos heterociíclila com mais de 10 carbonos, por exemplo anéis ou sistemas de anéis com 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 carbonos, também são possíveis e estão abrangidos, juntamente com os C3-C109 heterociclilos, quando o termo "heterociclila" é empregado sem referência a um número especí- fico de carbonos. Da mesma forma, grupos heterociclil com menos de 3 carbonos, por exemplo anéis com 1 ou 2, são possíveis e são abrangidos quando o termo "heterociclila" é empregado sem referência a um número específico de carbonos. O termo "heterocicloalquila" re- fere-se a anéis heterocíclicos não aromáticos ou sistemas de anéis em que todos os átomos de carbono estão saturados (isto é, ligados a um hidrogênio ou outro substituinte como observado abaixo, sem ligações duplas ou triplas). Em certas modalidades, os grupos heterocicloalquila têm tipicamente 3 a 5 membros e 1 a 2 heteroátomos. Em certas mo- dalidades, heterocicloalquila pode ser epóxi.
[0067] Salvo indicação em contrário, a heterociclila é ligada ao seu grupo pendente em qualquer heteroátomo ou átomo de carbono que resulte em uma estrutura estável. Exemplos representativos de uma C3-Cg heterociíclila incluem, mas não estão limitados a, tetra- hidrofuranila, oxetanila, piranila, pirrolidinila, piperidinila, benzofuranila, benzotiofeno, indolila, benzopirazolila, pirrolila, tiofenil (tiopeno), furani- la, tiazolila, imidazolila, pirazolila, triazolila, quinolinila, pirimidinila, piri- dinila, piridonila, pirazinila, piridazinila, isotiazolila, isoxazolil e tetrazolil. Uma C3-Cg heterociclila, ou uma C3-C10 heterociclila, pode ser substitu-
ída com até sete grupos incluindo, mas não limitado a, C1-Cg alquila, C1-Cg heteroalquila, —OR, arila, —C(O)R', —OC(O)R', —C(0)OR, — C(O)NH2, —C(O)NHR', —C(O)N(R'), —NHC(O)R', —S(=O)2R', — S(O)R', halogênio, —NH(R'), —N(R') e—CN; em que cada R' é inde- pendentemente selecionado a partir de —H, C1-Cg alquila, C1-Cs hete- roalquila e arila. Em algumas modalidades, uma heterociclila substituí- da também pode incluir um ou mais dentre—NHC(=NH)NH2, — NHCONH>2, —S(=O)2R' e —SR"'.
[0068] Salvo indicação em contrário, "heteroalquila" por si só ou parte de outro termo, significa um grupo alquila, conforme definido acima, substituído por um grupo heterociclila, conforme definido acima.
[0069] Salvo indicação em contrário, "C3-Cg carbociclil"por si só ou como parte de outro termo, é um anel carbocíclico monocíclico ou bicí- clico, não aromático, saturado ou insaturado, substituído ou não subs- tituído, monovalente ou divalente, com 3-, 4-, 5-, 6-, 7-, ou 8- mem- bros, derivado da remoção de um átomo de hidrogênio ou de dois átomos de hidrogênio de um átomo do anel de um sistema de anéis parental. Da mesma forma, a menos que indicado de outra forma, "C3- C1o carbociclil" por si só ou como parte de outro termo, é um anel car- bocíclico monocíclico ou bicíclico, não aromático, saturado ou insatu- rado, substituído ou não substituído, monovalente ou divalente de 3-, 4-, 5-, 6-, 7-, 8-, 9- ou 10- membros derivado da remoção de um átomo de hidrogênio de um átomo do anel de um sistema de anéis parental. C3-Cg carbociclila representativo inclui, mas não se limita a, ciclopropi- la, ciclobutila, ciclopentila, ciclopentadienila, ciclo-hexila, ciclo-hexenila, 1,3-ciclo-hexadienila, 1,4-ciclo-hexadienila, ciclo-heptila, 1,3-ciclo-hepta- dienila, 1,3,5-ciclo-heptatrienila, ciclooctila, ciclooctadienila, biciclo(111) pentano e biciclo(222)octano. Um grupo C3-Cs carbociclila, ou um gru- po C3-C10 carbociclila, pode ser substituído ou não susbtituído com até sete grupos incluindo, mas não limitado a C1-Cs alquila, C1-Cg hetero-
alquila, —OR', arila, —C(O)R', —-OC(O)R', —C(0)OR, —C(O)NH>2, — C(O)NHR', —C(O)N(R'), —NHC(O)R', —S(=0O)2R', —S(=O)R', — OH, -halogênio, —NH(R'), —N(R')- e —CN; onde cada R' é independente- mente selecionado a partir de —H, C1-Cg alquila, C1-Cg heteroalquila e arila. Grupos carbociclila com mais de 10 carbonos, por exemplo, sis- temas de anéis com 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 carbonos, também são possíveis e estão abrangidos, juntamente com os C3-C1o carbociclilos, quando o termo "carbociclila" é empregado sem referên- cia a um número específico de carbonos.
[0070] O termo "cicloalquila" refere-se a anéis carbocíclicos ou sis- temas de anéis em que todos os átomos de carbono estão saturados (isto é, ligados a um hidrogênio ou outro substituinte conforme obser- vado abaixo, sem ligações duplas ou triplas).
[0071] O termo "quiral" se refere a moléculas que têm a proprieda- de de não-sobreposição do parceiro de imagem espelhada, enquanto o termo "aquiral" se refere a moléculas que são sobrepostas em seu parceiro de imagem espelhada.
[0072] O termo "estereoisômeros" refere-se a compostos que têm constituição química idêntica, mas diferem em relação ao arranjo dos átomos ou grupos no espaço.
[0073] "Diastereômero" se refere a um estereoisômero com dois ou mais centros de quiralidade e cujas moléculas não são imagens espelhadas umas das outras. Diastereômeros têm diferentes proprie- dades físicas, por exemplo, pontos de fusão, pontos de ebulição, pro- priedades espectrais e reatividades. As misturas de diastereômeros podem se separar sob procedimentos analíticos de alta resolução, como a electroforese e cromatografia.
[0074] Os termos "mistura racêmica" e "racemato" se referem a uma mistura equimolar de duas espécies enantioméricas, desprovidas de atividade óptica.
[0075] Um "derivado" de aminoácido inclui um aminoácido pos- suindo substituições ou modificações por ligação covalente de um aminoácido parental, como, por exemplo, por alquilação, glicosilação, acetilação, fosforilação e semelhantes. Ainda incluído na definição de "derivado" está, por exemplo, um ou mais análogos de um aminoácido com ligações substituídas, bem como outras modificações conhecidas na técnica.
[0076] Um "aminoácido natural" refere-se a arginina, glutamina, fenilalanina, tirosina, triptofano, lisina, glicina, alanina, histidina, serina, prolina, ácido glutâmico, ácido aspártico, treonina, cisteína, metionina, leucina, asparagina, isoleucina e valina, salvo indicação em contrário pelo contexto.
[0077] A frase "sal farmaceuticamente aceitável" conforme utiliza- da neste documento refere-se a sais orgânicos ou inorgânicos farma- ceuticamente aceitáveis de um composto. O composto contém tipica- mente pelo menos um grupo amino, e consequentemente sais de adi- ção de ácido podem ser formados com este grupo amino. Sais exem- plares incluem, mas não se limitam a, sulfato, citrato, acetato, oxalato, cloreto, brometo, iodeto, nitrato, bissulfato, fosfato, ácido fosfato, iso- nicotinato, lactato, salicilato, ácido citrato, tartarato, oleato, tanato, pan- totenato, bitartarato, ascorbato, succinato, maleato, gentisinato, fuma- rato, gluconato, glucuronato, sacarato, formato, benzoato, glutamato, metanossulfonato, etanossulfonato, benzenossulfonato, p-toluenossul- fonato e sais de pamoato (isto é, 1,1'-metileno[bis-(2-hidróxi-3-nafto- ato)). Um sal farmaceuticamente aceitável pode envolver a inclusão de outra molécula como um íon acetato, um íon sucinato ou outro contra- íon. O contraíon pode ser qualquer fração orgânica ou inorgânica que estabiliza a carga sobre o composto parental. Além disso, um sal far- maceuticamente aceitável pode ter mais de um átomo carregado em sua estrutura. Instâncias onde múltiplos átomos carregados fazem par-
te do sal farmaceuticamente aceitável podem ter múltiplo contraíons. Portanto, um sal farmaceuticamente aceitável pode ter um ou mais átomos carregados e/ou um ou mais contraíon.
[0078] Os termos "carga" ou "carga de fármaco" representam ou se referem ao número médio de compostos citotóxicos por anticorpo em uma molécula de ADC. A carga de fármaco pode variar de 1 a 10 fármacos por anticorpo. Às vezes, isso é chamado de DAR, ou razão fármaco/anticorpo. As composições dos ADCs descritos neste docu- mento têm tipicamente DARs de 1-20, e em certas modalidades de 1- 8, 2-8, 2-6, 2-5 e 2-4. Os valores típicos de DAR são 2, 4, 6 e 8. O nú- mero médio de fármacos por anticorpo, ou valor DAR, pode ser carac- terizado por meios convencionais, como espectroscopia UV/visível, espectrometria de massa, ensaio ELISA e HPLC. O valor quantitativo de DAR também pode ser determinado. Em alguns casos, a separa- ção, purificação e caracterização de ADCs homogêneos com um valor DAR particular pode ser alcançada por meios como HPLC de fase re- versa ou eletroforese.
[0079] O DAR pode ser limitado pelo número de sítios de ligação no anticorpo. Dois meios típicos de ligação são através de uma ligação sulfeto com um resíduo de tiol da cisteína e uma ligação amida com um resíduo lisina. Ver Puthenveetil, S., et al., Bioconjugate Chem., 2016, 27:1880-1888. Por exemplo, onde o anexo é um tiol da cisteína, um anticorpo pode ter apenas um ou vários grupos tiol de cisteína, ou pode ter apenas um ou vários grupos tiol suficientemente reativos através dos quais uma unidade de ligante peptídico pode ser anexado. Em algumas modalidades, a cisteína tiol é um grupo tiol de um resíduo de cisteína que forma uma ligação dissulfeto inter-cadeia. Em algumas modalidades, o tiol da cisteína é um grupo tiol de um resíduo de cisteí- na que não forma uma ligação dissulfeto intercadeia. A maioria dos resíduos de cisteína tiol nos anticorpos existe como pontes dissulfeto e deve ser reduzida com um agente redutor, como o ditiotreitol (DTT). Tipicamente, é conjugado com um anticorpo durante uma reação de conjugação menos do que o máximo teórico de porções de fármaco. Um anticorpo pode conter, por exemplo, muitos resíduos de lisina que não reagem com um ligante ou intermediário de ligante. Somente os grupos lisina mais reativos podem reagir com um reagente ligante rea- tivo para formar uma ligação amida com o anticorpo. O anticorpo pode ser sujeito a condições desnaturantes para revelar grupos nucleofílicos reativos, como lisina ou cisteína.
[0080] A carga (razão fármaco/anticorpo) de um ADC pode ser controlada de várias maneiras diferentes incluindo: (i) limitando o ex- cesso molar de fármaco-ligante em relação ao anticorpo, (ii) limitando o tempo de reação de conjugação ou temperatura e, (iii) usando con- dições redutoras parciais ou limitantes para a modificação de tiol de cisteína. Quando mais de um grupo nucleofílico reage com um ligante de fármacos, o produto resultante é uma mistura de ADCs com uma distribuição de uma ou mais porções de fármacos por anticorpo. O número médio de fármacos por anticorpo pode ser calculado a partir da mistura por um ensaio de anticorpo de ELISA duplo, que é específi- co para anticorpo e específico para o fármaco. Moléculas ADC indivi- duais podem ser identificadas na mistura por espectroscopia de massa e separadas por HPLC, por exemplo, cromatografia de interação hidro- fóbica.
[0081] O termo "grupo protetor" refere-se a um agrupamento de átomos que, quando ligado a um grupo funcional reativo em uma mo- lécula mascara, reduz ou impede a reatividade do grupo funcional. Exemplos de grupos de proteção podem ser encontrados em Green et al., "Protective Groups in Organic Chemistry", (Wiley, 2º ed. 1991) e Harrison et al., “Compendium of Synthetic Organic Methods”, Vols. 1-8 (John Wiley and Sons, 1971-1996). Grupos protetores de nitrogênio representativos incluem, mas não estão limitados a, formila, acetila, trifluoroacetila, benzila, benziloxicarbonila (“CBZ”), terc-butoxicarbonila (“Boc”), trimetilsilila (TMS”), 2-trimetilsilil-etanossulfonila (“TES”), tritila e grupos tritila substituídos, aliloxicarbonila, 9-fluorenilmetiloxicarbonila (“FMOC”), nitro-veratriloxicarbonila (“NVOC”) e similares. Grupos de proteção de hidroxi representantes incluem, mas não estão limitados àqueles onde o grupo hidroxil é acilado ou alquilado como éteres ben- Zílico e tritílico, bem como éteres alquílicos, éteres tetra-hidropiranílico, éteres trialquilsilílicos e éteres alílicos.
[0082] Agora será feita referência detalhada a certos métodos pre- feridos de tratamento, compostos e métodos de administração desses compostos. A invenção não está limitada àqueles compostos e méto- dos preferidos, mas é definida pelas reivindicações aqui emitidas. Compostos de Toxinas de Fármacos
[0083] Os compostos de fármaco da presente invenção são análo- gos do composto citotóxico de ocorrência natural tailanestatina A ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis. A thailanstatina A é um dos três produtos naturais estruturalmente semelhantes (A, B e C) identifi- cados a partir de um caldo de cultura de B. thailandensis MSMB43. Estes produtos naturais possuem atividade inibidora de pré-mRNA po- tente in vitro e atividades antiproliferativas em linhagens celulares de câncer humano (Liu, et al., J. Nat. Prod. 2013, 76(4): 685-693).
[0084] De acordo com um aspecto, a presente invenção refere-se a um composto ou compostos de Fórmula (l): O OO x D> N HO" 9 H 9 (1) em que: R é selecionado a partir do grupo que consiste em: -(CH>2)n- R'; -C5.6 heteroarila, opcionalmente substituído por um ou mais dentre halogênio -CF3, -C1-salquila e -O-C1-6 alquila; --C(R2)=N-R3; --CH(CF3)NH(CH2)mCHa; --C(RºRP)NH(CH2)m CH; --C(halogênio)=CH(CH2)mCHsg; --SO2-NH(CH2)mnCHsa; -O(CO)-arila; -O(CO)-heteroarila; --NRºRº; e --NH-heteroarila; em que R' é -O-CRºRº(CH2)mCHs3 ou -N-CRºRº(CH2)mCHs; em que Rº e Rº, juntamente com os átomos aos quais es- tão ligados, formam um anel C3-10 heterociclila; R? é -CN ou -NH(CH2)mCHsa; Rº é -(CH2)mCH3 ou -O-(CH2)mCHs; X é -H ou -CH;; cada n é independentemente 1, 20u3;e cada m é independentemente O, 1, 2 ou 3; ou um sal farmaceuticamente aceitável deste.
[0085] Em certas modalidades exemplares, R é selecionado do grupo que consiste em: o. 4 N o. N No o o & NON N Rory Sana E RE AL O o x Z vo N% so ON NO ; [ DNA | | : O | DAE / A AZA SO A ] % ON -O NX N O. O. N NT O DA x Nó Do A q = AS %& ON on NH oo
É MA Í ESTA O “nm E NE SO 4 ot N 1/7 Os, Of, “E x N=, " o—Ê o—ê 2 o
SL QN N
N NES A" o N-N s H ,e o.
[0086] Em outra modalidade, um composto da invenção é selecio- nado do grupo que consiste em: o ASA*9 O >CooCH; o 9 Ro 1 F Nº ASA*R O" >cooMe o O RA 2 Sn o ASA O >cCooCcH 3
NBR Wo o 3 = o ADA O >coocHs o = S N HN HO" o WRo 4 q o o PD “>coocH NE) º o HN HO" s o SS SO 5 Xv o ASA O >coocH 3 O = & O Ho" o SS o 6 o o ADÔAR O >coocH; Ron Ho" WTÃo o 7
[0087] Os métodos para a síntese dos compostos da invenção são apresentados na seção de Exemplos abaixo. Unidade de ligação (L) e porção de ligação (L')
[0088] De acordo com outro aspecto, a presente invenção refere- se a um composto ou compostos de Fórmula (Il): à n Ho" z 9 (Il) ou um sal farmaceuticamente aceitável deste, em que: L é um |i- gante; R é selecionado a partir do grupo que consiste em: -(CH2)1-R'; -Cs5-6 heteroarila, opcionalmente substituído por um ou mais dentre halogê- nio -CF3, -C1-6alquila e -O-C1-6 alquila; --C(R2)=N-R3; --CH(CF3)NH(CH2)mCHsa; --C(RºR)NH(CH2)m CH; --C(halogênio)=CH(CH2)mCHsg; --SO2-NH(CH2)mnCHsa; -O(CO)-arila; -O(CO)-heteroarila; --NRºRº; e --NH-heteroarila; em que R' é -O-CRºRº(CH2)mCH3 ou -N-CRºRº(CH2)mCHsa; em que Rº e Rº, juntamente com os átomos aos quais es- tão ligados, formam um anel C3-10 heterociclila; R? é -CN ou -NH(CH2)mCHsa; R? é -(CH2)mCH3 ou -O-(CH2)mCHs; cada n é independentemente 1, 20u3;e cada m é independentemente O, 1, 2 ou 3; ou um sal farmaceuticamente aceitável deste.
[0089] Em certas modalidades exemplares, L é selecionado do grupo que consiste na Fórmula (A'), Fórmula (A?), Fórmula (Aº?), Fór-
H o
AAA o o mula (Aº) e Fórmula (A): (A) H HH ? bd 1h 90 H o (A?) o Ed (A?)
F A) o Oo o De o o NH ME Jo mo on O q
NF o NH (Aº) em que q é 3,4,5,6,7,8,90u10;e % à E ( YéBr,lou [E
[0090] Em outras modalidades exemplares, R é selecionado den- tre o grupo que consiste em:
H o ? o e nº nº | Romy Sana E AE MA no o O -o x Z N N z A N : | NH | | : / | DAE QD AA O Am -O N N O. o. >N AR NI A A Ai
NH % SN & On se en % oo E A NR Í ESTA [0 KA NH E NH SO % ot N Vo F o Co FT N - “OD o—Ê oi . N o K 2 NH
N
N NES A od : H je “*,
[0091] Um ligante é um composto bifuncional ou multifuncional que pode ser usado para ligar uma fármaco e um anticorpo para formar um conjugado anticorpo-fármaco (ADC). Tais conjugados são úteis, por exemplo, na formação de imunoconjugados direcionados contra antí- genos associados a tumores. Tais conjugados permitem a transmissão seletiva de fármacos citotóxicas às células tumorais. Em uma ADC, o ligante serve para anexar a toxina ao anticorpo.
[0092] No contexto da invenção, um "Ligante" (L) é uma porção bifuncional ou multifuncional que pode ser usada para ligar uma ou mais porções de fármacos tóxicas a um anticorpo (Ab) para formar o conjugado anticorpo-fármaco (ADC) da Fórmula Ill. Em algumas mo- dalidades, os conjugados anticorpo-fármaco (ADC) podem ser prepa- rados usando um Ligante com funcionalidades reativas para ligação covalente ao fármaco e ao anticorpo. Por exemplo, em algumas moda- lidades, um tiol de cisteína de um anticorpo (Ab) pode formar uma |i- gação com um grupo funcional reativo de um ligante ou de um inter- mediário de fármaco-ligante para produzir um ADC.
[0093] O Ligante L é ligado covalentemente através de um sítio reativo de um composto bifuncional, deixando o outro sítio funcional disponível para ligação subsequente a um anticorpo. O Ligante L é uma porção com 1-200 átomos não hidrogênio selecionados de C, N, O, S ou halogênio e, opcionalmente, incorpora éter, oxo, carboxila, carboxamida, carboxamidila, uretanila, ramificado, cíclico, aminoácido, porções heterocíclicas, aromáticas ou heteroaromáticas. O ligante L pode ser não ramiíficado ou ramificado, flexível ou rígido, curto ou lon- go e pode incorporar qualquer combinação de porções consideradas úteis. Em algumas modalidades, pelo menos uma porção do ligante L pode ter uma região polimérica de óxido de polialquileno, que pode aumentar a solubilidade do composto de Fórmula (Ill). Em algumas modalidades, o Ligante L pode ter uma unidade repetida de etileno gli- col e pode ter um número de unidades repetidas de etileno glicol de cerca de 1 a cerca de 25, ou qualquer número entre elas. Em algumas modalidades, L pode incluir cerca de 1 a cerca de 4, cerca de 3 a cer- ca de 20, cerca de 4 a cerca de 15, cerca de 5 a cerca de 12 ou cerca de 6 a cerca de 10 unidades de etileno glicol.
[0094] Em algumas modalidades, pelo menos uma porção do Li- gante L pode incluir uma ou mais porções de aminoácidos que podem fornecer solubilidade aprimorada para o composto da Fórmula (Ill) ou podem fornecer sequências de aminoácidos para melhorar a ligação ao alvo, melhorar a compatibilidade com um agente de ligação ao alvo ou aprimorar o reconhecimento de ligação ao destino. Em outras mo- dalidades, o Ligante L pode incluir uma ou mais porções de aminoáci- dos que fornecem um motivo de substrato adequado para uma pro-
tease. Tais modalidades incluem aminoácidos selecionados dentre gli- cina, alanina, fenilalanina, lisina, arginina, valina e citrulina. Quando um conjunto de porções de aminoácidos é incorporado no ligante L que fornece um motivo de substrato específico para uma protease se- lecionada, o composto de fármaco citotóxico de Fórmula (Ill) pode ser liberado a partir de um conjugado ligado ao alvo para fornecer efeitos citotóxicos localizados. Tais motivos de substrato são conhecidos na técnica e podem ser incorporados no Ligante L conforme desejado pa- ra fornecer liberação seletiva a partir do conjugado ligado ao alvo. Esta seletividade pode ser baseada na presença conhecida de uma pro- tease desejada dentro da região de transmissão localizada do conju- gado fármaco-anticorpo. Outros tipos poliméricos de porções podem ser incorporados no Ligante L, como poliácidos, polissacarídeos ou poliaminas. Outras porções, tais como porções aromáticas ou heteroa- romáticas substituídas, podem ser utilizadas para aumentar a rigidez ou fornecer sítios sinteticamente acessíveis nos substituintes para |i- gação às porções reativas ou ao composto de Fórmula (Ill).
[0095] O outro segundo sítio funcional do Ligante L está disponível para ligação subsequente a um anticorpo, ligando assim covalente- mente a toxina da invenção a um anticorpo através de um ligante. Este segundo sítio reativo é, por exemplo, um grupo eletrofílico que é reati- vo a um grupo nucleofílico presente em uma unidade de anticorpo (por exemplo, um anticorpo). Grupos nucleofílicos úteis em um anticorpo incluem, mas não estão limitados aos grupos sulfidrila, hidroxila e ami- no. O heteroátomo do grupo nucleofílico de um anticorpo é reativo a um grupo eletrofílico em uma unidade de ligação e forma uma ligação covalente a uma unidade de ligação. Grupos eletrofílicos úteis incluem, mas não estão limitados aos grupos maleimida e haloacetamida. O grupo eletrofílico fornece um sítio conveniente para a ligação de anti- corpos.
[0096] Em outra modalidade, uma unidade de ligação tem um sítio reativo que possui um grupo nucleofílico que é reativo a um grupo ele- trofílico presente em um anticorpo. Grupos eletrofílicos úteis sobre um anticorpo incluem, mas não estão limitados a grupos aldeído e carbonil de cetona. O heteroátomo de um grupo nucleofílico de uma unidade de ligação pode reagir com um grupo eletrofílico em um anticorpo e formar uma ligação covalente com uma unidade de anticorpo. Os gru- pos nucleofílicos úteis em uma unidade de ligação incluem, mas não estão limitados a, hidrazida, oxima, amino, hidrazina, tiossemicarbazo- na, carboxilato de hidrazina, e aril-hidrazida. O grupo electrofílico de um anticorpo fornece um sítio conveniente para a ligação a uma uni- dade de ligação. Em algumas modalidades, os grupos eletrofílicos in- cluem: x e - (en O, O "- onde as linhas onduladas indicam as ligações à L, e Rº é NO», CI, F, CN, ou Br, e gé 0, 1, ou 2.
[0097] Os grupos amino funcionais também são sítios reativos úteis para uma unidade de ligação, porque podem reagir com ácido carboxílico ou ésteres ativados de um composto para formar uma liga- ção amida. Normalmente, os compostos à base de peptídeo da inven- ção podem ser preparadas pela formação de uma ligação peptídica entre dois ou mais aminoácidos e/ou fragmentos de peptídeo.
[0098] Em um aspecto, um ligante tem uma funcionalidade que é capaz de reagir com uma cisteína livre presente em um anticorpo para formar uma ligação covalente. Exemplos não limitantes dessas funcio- nalidades reativas incluem maleimida, haloacetamidas, a-haloacetila, piridil dissulfeto, ésteres ativados tais como ésteres de succinimida, N- hidroxissuccinimida, ésteres de 4-nitrofenila, ésteres de pentafluorofe- nila, ésteres de tetrafluorofenila, anidridos, cloretos de ácido, cloretos de sulfonila, isocianatos, e isotiocianatos. Ver, por exemplo, o método de conjugação na página 766 de Klussman, et al., Bioconjugate Che- mistry, 2004, 15(4):765-773, e os Exemplos neste documento.
[0099] Em algumas modalidades, um ligante tem uma funcionali- dade que é capaz de reagir com um grupo eletrofílico presente em um anticorpo. Exemplos desses grupos eletrofílicos incluem, mas não es- tão limitados a, grupos carbonil de aldeído e cetona. Em algumas mo- dalidades, um heteroátomo da funcionalidade reativa do ligante pode reagir com um grupo eletrofílico em um anticorpo e formar uma ligação covalente a uma unidade do anticorpo. Exemplos não limitantes des- sas funcionalidades reativas incluem, mas não estão limitados a, hi- drazida, oxima, amino, hidrazina, tiossemicarbazona, carboxilato de hidrazina, e aril-hidrazida.
[00100] Um ligante pode compreender um ou mais componentes de ligante, incluindo, mas não se limitando a, uma unidade expansora, uma unidade peptidomimética, uma unidade peptídica e uma unidade espaçadora. Ver J. Lu., Et al. (Int. J. Mol. Sci., 2016, 17: 561). Exem- plos de componentes de ligação e reagentes de ligação incluem, mas não estão limitados a, ácido p-aminobenzóico-valina-citrulina ("PABA- val-cit"), 6G-maleimidocaproil ("MC"), maleimidopropanoil ("MP"), valina- citrulina ("val-cit" ou "vc"), valina-alanina ("val-ala" ou "va"), alanina- fenilalanina ("ala-phe"), fenilalanina-lisina (phe-lis), glicina-fenilalanina- leucina-glicina ("GFLG"), p-aminobenziloxicarbonila ("PAB"), N-succini- midil 4-(2-piridiltio) pentanoato ("SPP"), 4-(N-maleimidometil) ciclo- hexano-1 carboxilato ("'MCC"), éster de N-hidroxissuccinimida do ácido 4-(N-maleimidometil)ciclo-hexanocarboxílico ("(SMCC"), N-succinimidil 4-(2-piridilditio )butanoato ("SPDB") e sulfo-N-succinimidil 4-(2-piridildi- tio)butirato ("sulfo-SPDB"). Vários componentes de ligação são co- nhecidos na técnica, alguns dos quais são descritos neste documento. Exemplos de componentes de ligação incluem, mas não limitados a,
"VC-2xPEG", "VA-2xPEG" e "VC-8xPEG" e "VA-8xPEG", onde uma unidade valina-citrulina está ligada a dois ou mais unidades de etileno- oxi (PEG), por exemplo, duas a 10 unidades PEG.
[00101] Um ligante pode ser um "ligante clivável", facilitando a libe- ração de uma fármaco ou toxina. Exemplos não limitantes de ligantes cliváveis incluem ligantes lábeis a ácidos (por exemplo, compreenden- do hidrazona), ligantes sensíveis a protease (por exemplo, sensíveis a peptidase), ligantes fotolábeis ou ligantes contendo dissulfeto (Chari et al., Cancer Research, 1992, 52:127-131; Patente US Nº 5.208.020).
[00102] Outros exemplos de modalidades de ligantes são descritos na Patente US Nº 7.498.298, que é expressamente incorporada neste documento por referência.
[00103] No contexto da presente invenção, a porção L' é a porção central de um ligante bifuncional que permanece em um conjugado anticorpo-fármaco após a fármaco ter sido covalentemente ligada ao anticorpo através dessa porção central. A fração L' é como descrito acima para o Ligante L, exceto que o segundo sítio funcional, um gru- po eletrofílico ou nucleofílico, reagiu como descrito acima com um an- ticorpo para formar uma ligação covalente. Um exemplo não limitante de uma fração L', derivado de um ligante éster de acetato de N- hidroxissuccinimida (éster NHS), e capaz de se ligar a um resíduo de lisina em um anticorpo como descrito acima, é mostrado na Fórmula (B"):
H AoA: 4 0 (B) em que q é 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10. Um outro exemplo não limitante de uma porção L', incluindo uma unidade de maleimida capaz de se ligar a um resíduo de cisteína em um anticorpo, é mostrado na Fórmula
(8º): H H O o
VA AA 90 H É (8º) em que q é 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10. Um outro exemplo não limitante de uma fração L', incluindo uma unidade amida capaz de se ligar a um resíduo de cisteína em um anticorpo, é mostrado na Fórmula (B?): o A ; (8º). Outro exemplo não limitante de uma fração L', incluindo uma unidade amida capaz de se ligar a um resíduo de cisteína em um anticorpo, é mostrado na Fórmula (Bº): o NEN o o o “O no onto (Bº) em que q é 3,4, 5,6,7,8,9 ou 10.
[00104] Nos casos em que L compreende a Fórmula (Aº), o yr e AI um grupo —NH> disponível no anticorpo, por exemplo, de um resíduo de lisina, desloca a Fórmula (A), resultando em uma ligação direta entre o anticorpo e o composto da Fórmula (1).
[00105] Unidade de Anticorpo (Ab ou AB)
[00106] Como observado acima, o termo "anticorpo" (ou "Ab" ou "AB") neste documento é usado no sentido mais amplo e abrange es- pecificamente anticorpos monoclonais intactos, anticorpos policlonais,
anticorpos monoespeciíficos, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos) e fragmentos de anticorpo que exibem a ati- vidade biológica desejada. Além disso, embora certos aspectos da in- venção descritos neste documento se refiram a conjugados anticorpo- fármaco, é ainda previsto que a porção de anticorpo do conjugado possa ser substituída por qualquer coisa que se ligue especificamente Ou se associe reativamente ou se complexe a um receptor, antígeno ou outra porção receptora associada a uma dada população de célu- las-alvo. Por exemplo, em vez de conter um anticorpo, um conjugado da invenção podem conter uma molécula de direcionamento que se liga a complexos com, ou reage com um receptor, antígeno ou outra porção receptiva de uma população de células procurada ser modifi- cada terapeuticamente ou de outro modo biologicamente. Exemplos de tais moléculas incluem proteínas de menor peso molecular, polipep- tídeo ou peptídeos, lectinas, glicoproteínas, não peptídeos, vitaminas, moléculas de transporte de nutrientes (como, entre outras, transferri- na) ou qualquer outra molécula ou substância de ligação celular. Em certos aspectos, o anticorpo ou outra referida molécula de direciona- mento atua para transmitir um fármaco à população de células alvo específica com a qual o anticorpo ou outra molécula alvo interage.
[00107] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um composto conjugado anticorpo-fármaco de Fórmulas Ill, em que o an- ticorpo AB é selecionado dentre: gemtuzumabe, trastuzumabe (Her- ceptinO), pertuzumabe (PerjetaO), iratumumabe, inotuzumabe, pinatu- zumabe, epratuzumabe, polatuzumabe, coltuximabe, lovotuzumabe, sacituzumabe, anetumabe, aprutumabe, aratumumabe, atezolizuma- be, avelumabe, azintuxizumabe, bevacizumabe (AvastinO), bivatuzu- mabe, brentuximabe, camidanlumabe, cantuzumabe, cetuximabe (Er- bituxO), cofetuzumabe, denintuzumabe, durvalumabe, elotuzumabe, enfortumabe, glembatumumabe, ibritumomabe, iladatuzumabe, inda-
tuximabe, industuzumabe, labetuzumabe, ladiratuzumabe, laprituxima- be, lifastuzumabe, loncastuximabe, lorvotuzumabe, lupartumabe, mila- tuzumabe, mirvetuximabe, naratuximabe, natalizumabe, necitumuma- be, obinutuzumabe, ocrelizumabe, ofatumumabe, olaratumabe, pani- tumumabe, pertuzumabe, rituximabe (RituxanO), rovalpituzumabe, sir- tratumabe, sofituzumabe, telisotuzumabe, tositumomabe, trastuzuma- be, e vadastuximabe. Em certas modalidades preferidas, o anticorpo AB é selecionado do grupo que consiste em: trastuzumabe, pertuzu- mabe, gemtuzumabe e vadastuximabe.
[00108] Os heteroátomos que podem estar presentes em uma uni- dade de anticorpo incluem enxofre (em uma modalidade, a partir de um grupo sulfidril de um anticorpo), oxigênio (em uma modalidade, a partir de um grupo carbonila, carboxila ou hidroxila de um anticorpo) e nitrogênio (em uma modalidade, a partir de um grupo amina primário ou secundário de um anticorpo). Estes heteroátomos podem estar pre- sentes no anticorpo no estado natural do anticorpo, por exemplo, um anticorpo de ocorrência natural ou podem ser introduzidos no anticor- po por modificação química.
[00109] Em uma modalidade, uma unidade de anticorpo possui um grupo sulfidrila e a unidade de anticorpo se liga através do átomo de enxofre do grupo sulfidrila.
[00110] Em outra modalidade, o anticorpo possui resíduos de lisina que podem reagir com ésteres ativados (tais ésteres incluem, entre outros, ésteres de N-hidroxissuccinimda, pentafluorofenila e p- nitrofenila) e, assim, formam uma ligação amida que consiste no áto- mo de nitrogênio da unidade de anticorpo e um carbonil.
[00111] Em ainda outro aspecto, a unidade de anticorpo possui um ou mais resíduos de lisina que podem ser quimicamente modificados para introduzir um ou mais grupos sulfidrila. Os reagentes que podem ser utilizados para modificar lisinas incluem, mas não estão limitados a, éster acetato de N-hidroxisuccinimida (NHS éster), N-succinimidil-S- acetiltivacetato (SATA) e cloridrato de 2-iminotiolano (Reagente de Traut).
[00112] Em uma outra modalidade, a unidade de anticorpo pode ter um ou mais grupos de carboidratos que podem ser quimicamente mo- dificados para terem um ou mais grupos sulfidrila.
[00113] Em ainda outra modalidade, a unidade de anticorpo pode ter um ou mais grupos de carboidratos que podem ser oxidados para fornecer um grupo aldeído. O aldeído correspondente pode formar uma ligação com um sítio reativo, como, por exemplo, hidrazina e hi- droxilamina. Outros protocolos para a modificação de proteínas para a ligação ou associação de fármacos são descritos em Coligan et al., Current Protocols in Protein Science, vol. 2, John Wiley & Sons (2002).
[00114] — Anticorpos policlonais úteis são populações heterogêneas de moléculas de anticorpo derivadas dos soros de animais imuniza- dos. Anticorpos monoclonais úteis são populações homogêneas de anticorpos para um determinado determinante antigênico (por exem- plo, um antígeno de célula cancerígena, um antígeno viral, um antíge- no microbiano, uma proteína, um peptídeo, um carboidrato, um produ- to químico, ácido nucleico ou seus fragmentos). Um anticorpo mono- clonal (mAb) a um antígeno de interesse pode ser preparado usando qualquer técnica conhecida na técnica que forneça a produção de mo- léculas de anticorpo por linhagens celulares contínuas em cultura.
[00115] — Anticorpos monoclonais úteis incluem, mas não estão limi- tados a, anticorpos monoclonais humanos, anticorpos monoclionais humanizados, fragmentos de anticorpos ou anticorpos monocionais quiméricos. Os anticorpos monoclonais humanos podem ser produzi- dos por qualquer uma das numerosas técnicas conhecidas na técnica.
[00116] O anticorpotambém pode ser um anticorpo biespecífico. Os métodos para preparar anticorpos biespecíficos são conhecidos na técnica.
[00117] O anticorpo pode ser um fragmento funcionalmente ativo, derivado ou análogo de um anticorpo que se liga imunoespecificamen- te às células alvo (por exemplo, antígenos associados a tumores, antí- genos de células cancerígenas, antígenos virais ou antígenos microbi- anos) ou outros anticorpos que se ligam a células ou matriz tumorais. A este respeito, "funcionalmente ativo" significa que o fragmento, deri- vado ou análogo é capaz de extrair anticorpos anti-anti-idiotipo que reconhecem o mesmo antígeno que o anticorpo do qual o fragmento, derivado ou análogo é derivado e reconhecido. Especificamente, em uma modalidade exemplar, a antigenicidade do idiotipo da molécula de imunoglobulina pode ser aumentada pela deleção do framework e das sequências de CDR que são C-terminais para a sequência de CDR que reconhece especificamente o antígeno. Para determinar quais se- quências de CDR se ligam ao antígeno, peptídeos sintéticos contendo as sequências de CDR podem ser utilizados em ensaios de ligação com o antígeno por qualquer método de ensaio de ligação conhecido na técnica (por exemplo, o ensaio de núcleo BIA).
[00118] Outros anticorpos úteis incluem fragmentos de anticorpos, tais como, mas não limitados a, fragmentos F(ab')», fragmentos Fab, Fvs, anticorpos de cadeia única, diacorpos, triacorpos, tetracorpos, scFv, scFv-FV ou qualquer outra molécula com a mesma especificida- de que o anticorpo.
[00119] — Adicionalmente, os anticorpos recombinantes, tais como anticorpos monoclonais quiméricos e humanizados, compreendendo porções humanas e não humanas que podem ser feitos usando técni- cas padrão de DNA recombinante, são anticorpos úteis. Um anticorpo quimérico é uma molécula na qual diferentes porções são derivadas de diferentes espécies animais, como, por exemplo, aquelas que pos- suem uma região variável derivada de regiões constantes de imuno-
globulina humana e murino monoclonal. Anticorpos humanizados são moléculas de anticorpo de espécies não humanas com uma ou mais regiões determinantes de complementaridade (CDRs) da espécie não humana e uma região de framework de uma molécula de imunoglobu- lina humana. Os referidos anticorpos monoclonais humanizados e quiméricos podem ser produzidos por técnicas de DNA recombinante conhecidas na técnica.
[00120] Os anticorpos completamente humanos são particularmen- te desejáveis e podem ser produzidos, usando camundongos transgê- nicos, que são incapazes de expressar os genes das cadeias pesada e leve da imunoglobulina endógena, mas que podem expressar os ge- nes das cadeia pesada e leve humana. Os camundongos transgênicos são imunizados da forma normal com um antígeno selecionado, por exemplo, a totalidade ou uma porção de um polipeptídeo da invenção. Os anticorpos monoclonais direcionados contra o antígeno podem ser obtidos usando uma tecnologia de hibridoma convencional. Os trans- genes de imunoglobulina humana abrigados pelos camundongos transgênicos rearranjam-se durante a diferenciação das células B, e subsequentemente sofrem troca de classe e mutação somática. As- sim, utilizando essa técnica, é possível produzir anticorpos IgG, IgA, IgM e IgE terapeuticamente úteis usando métodos conhecidos por um versado na técnica. Outros anticorpos humanos podem ser obtidos comercialmente de inúmeras empresas.
[00121] — Anticorpos completamente humanos que reconhecem um epítopo selecionado podem ser gerados utilizando uma técnica conhe- cida como "seleção guiada". Nesta abordagem um anticorpo monoclo- nal selecionado não-humano, por exemplo, um anticorpo de camun- dongo, é utilizado para guiar a seleção de um anticorpo completamen- te humano reconhecendo o mesmo epítopo. Os anticorpos humanos podem ser produzidos utilizando várias técnicas conhecidas na técni-
ca, incluindo bibliotecas de exibição de fago.
[00122] Em outras modalidades, o anticorpo é uma proteína de fu- são de um anticorpo, ou um fragmento funcionalmente ativo do mes- mo, por exemplo, no qual o anticorpo é fundido através de uma ligação covalente (por exemplo, uma ligação peptídica), no terminal N ou no terminal C a uma sequência de aminoácidos de outra proteína (ou por- ção dela, de preferência pelo menos 10, 20 ou 50 porções de aminoá- cidos da proteína) que não é de um anticorpo. De preferência, o anti- corpo ou seu fragmento está covalentemente ligado à outra proteína no terminal N do domínio constante.
[00123] — Anticorpos também incluem análogos e derivados que são modificados, isto é, por ligação covalente de qualquer tipo de molécu- la, desde que tal ligação covalente permita que o anticorpo retenha a sua imunoespecificidade de ligação ao antígeno. Por exemplo, mas não à título de limitação, os derivados e análogos dos anticorpos in- cluem aqueles que foram adicionalmente modificados, por exemplo, por glicosilação, acetilação, peguilação, fosforilação, amidação, deriva- tização por grupos de proteção/bloqueio conhecidos, clivagem proteo- lítica, ligação a uma unidade de anticorpo celular ou outra proteína etc. Qualquer uma das inúmeras modificações químicas pode ser realizada por técnicas conhecidas, incluindo, mas não se limitando a clivagem química específica, acetilação, formilação, síntese metabólica na pre- sença de tunicamicina etc. Além disso, o análogo ou derivado pode conter um ou mais aminoácidos não naturais.
[00124] Os anticorpos podem ter modificações (por exemplo, substi- tuições, deleções ou adições) em resíduos de aminoácidos que intera- gem com receptores de Fc. Em particular, os anticorpos podem ter modificações nos resíduos de aminoácidos identificados como envol- vidos na interação entre o domínio anti-Fc e o receptor FcRn.
[00125] — Anticorpos imunoespecíficos para um antígeno de célula cancerígena podem ser obtidos comercialmente ou produzidos por qualquer método conhecido de um versado na técnica, tais como, por exemplo, técnicas de síntese química ou de expressão recombinante. A sequência de nucleotídeos que codifica os anticorpos imunoespecií- ficos para um antígeno de células de câncer pode ser obtida, por exemplo, a partir da base de dados GenBank ou uma base de dados semelhantes, as publicações da literatura, ou por clonagem e sequen- ciação de rotina.
[00126] Em uma modalidade específica, podem ser utilizados anti- corpos conhecidos para o tratamento de câncer. Anticorpos imunoes- pecíficos para um antígeno de célula cancerígena podem ser obtidos comercialmente ou produzidos por qualquer método conhecido de um versado na técnica, tais como, por exemplo, técnicas de expressão recombinante. A sequência de nucleotídeos que codifica os anticorpos imunoespecíficos para um antígeno de células de câncer (antígenos associados ao tumor) pode ser obtida, por exemplo, a partir da base de dados GenBank ou uma base de dados semelhantes, as publica- ções da literatura, ou por clonagem e sequenciação de rotina.
[00127] Exemplos de antígenos associados a tumores (TAA) inclu- em, mas não estão limitados a, TAA (1)-(100) listados neste documen- to. Por conveniência, na maioria dos casos, as informações relaciona- das a esses antígenos, todos conhecidos na técnica, estão listadas neste documento e incluem, na maioria dos casos, nomes, nomes al- ternativos, números de acesso ao GenBank e referência(s) primária(s), seguido do ácido nucleico e convenções de identificação de sequência de proteínas do Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia (NCB]). As sequências de ácidos nucléicos e proteínas corresponden- tes a TAA (1)-(100) estão disponíveis em bancos de dados públicos, como o GenBank. Os antígenos associados ao tumor direcionados por anticorpos incluem todas as variantes e isoformas da sequência de aminoácidos que possuem pelo menos cerca de 70%, 80%, 85%, 90% ou 95% de identidade de sequência em relação às sequências identifi- cadas nas referências citadas, ou que exibem substancialmente as mesmas propriedades ou características biológicas de um TAA com uma sequência encontrada nas referências citadas. Por exemplo, um TAA possuindo uma sequência variante geralmente é capaz de se |i- gar especificamente a um anticorpo que se liga especificamente ao TAA com a sequência correspondente listada. As sequências e descri- ção na referência especificamente recitada neste documento são ex- pressamente incorporadas por referência.
[00128] Exemplos específicos não limitantes de TAA incluem: (1) BMPR1B (receptor de proteína morfogenética óssea tipo IB, Núme- ro de Acesso GenBank NM 001203); ten Dijke, P., et al., Science, 1994, 264 (5155):101-104; Oncogene, 1997, 14(11):1377-1382), WO 2004/063362 (Reivindicação 2); WO 2003/042661 (Reivindicação 12); US 2003/134790 (Página 38-39); WO 2002/102235 (Reivindicação 13; Página 296); WO 2003/055443 (Página 91-92); WO 2002/99122 (Exemplo 2; Página 528-530); WO 2003/029421 (Reivindicação 6); WO 2003/024392 (Reivindicação 2; Figura 112); WO 2002/98358 (Reivindicação 1; Página 183); WO 2002/54940 (Página 100-101); WO 2002/5937 7(Página 349-350); WO 2002/30268 (Reivindicação 27; Pá- gina 376); WO 2001/48204 (Exemplo; Figura 4) NP 001194 receptor de proteína morfogênica ósseo, tipo IB/pid=NP 001194.1 - Referência cruzada: MIM:603248; NP 001194.1; AYO65994.
(2) E16 (LAT1I, SLC7A5, Número de Acesso GenBank NM 003486); Biochem. Biophys. Res. Commun., 1999, 255(2), 283- 288; Nature, 1998, 395(6699):288-291; Gaugitsch, H.W., et al., J. Biol. Chem., 1992, 267(16):11267-11273); WO 2004/048938 (Exemplo 2); WO 2004/032842 (Exemplo IV); WO 2003/042661 (Reivindicação 12); WO 2003/016475 (Reivindicação 1); WO 2002/78524 (Exemplo 2);
WO 2002/99074 (Reivindicação 19; Página 127-129); WO 2002/86443 (Reivindicação 27; Páginas 222, 393); WO 2003/003906 (Reivindica- ção 10; Página 293); WO 2002/64798 (Reivindicação 33; Página 93- 95); WO 2000/14228 (Reivindicação 5; Página 133-136) US 2003/224454 (Figura 3); WO 2003/025138 (Reivindicação 12; Página 150); NP 003477 família transportadora de soluto 7 (transportador de aminoácidos catiônico, sistema y+), membro 5 /pid=NP 003477.3 - Homo sapiens Referências cruzadas: MIM: 600182; NP 003477.3; NM 015923; NM 003486 1.
(3) STEAP1 (antígeno epitelial de seis transmembranas de próstata, Número de Acesso GenBank NM 012449); Cancer Res., 2001, 61(15), 5857-5860; Hubert, RS, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96 (25):14523-14528); WO 2004/065577 (Reivindicação 6); WO 2004/ 027049 (Figura 1L); EP 1394274 (Exemplo 11); WO 2004/016225 (Reivindicação 2); WO 2003/042661 (Reivindicação 12); US 2003/ 157089 (Exemplo 5); US 2003/185830 (Exemplo 5); US 2003/064397 (Figura 2); WO 2002/89747 (Exemplo 5; Página 618-619), WO 2003/022995 (Exemplo 9; Figura 13A, Exemplo 53; Página 173, Exemplo 2; Figura 2A); NP 036581 antígenos epiteliais de seis trans- membranas da próstata Referências cruzadas: MIM: 604415; NP 036581.1; NM 012449 1.
(4) 0772P (CA125, MUC16, Número de Acesso GenBank AF361486); J. Biol. Chem., 2001, 276(29):27371-27375; WO 2004/ 045553 (Reivindicação 14); WO 2002/92836 (Reivindicação 6; Figura 12); WO 2002/83866 (Reivindicação 15; Página 116-121); US 2003/ 124140 (Exemplo 16). Referências cruzadas: Gl: 34501467; AAK7T4120.3; AF361486 1.
(5) MPF (MPF, MSLN, SMR, fator de potenciamento de megacariócitos, mesotelina, Número de Acesso GenBank NM 005823); Yamaguchi, N. et a/., Biol. Chem., 1994, 269(2), 805-808; Proc. Natl.
Acad. Sci. EUA, 1999, 96(20):11531-11536; Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, 1996, 93(1):136-140; J. Biol. Chem., 1995, 270(37):21984-21990; WO 2003/101283 (Reivindicação 14); (WO 2002/102235 (Reivindica- ção 13; Página 287-288); WO 2002/101075 (Reivindicação 4; Página 308-309); WO 2002/71928 (Página 320-321);, WO 9410312 (Página 52-57); Cruz -referências: MIM: 601051; NP 005814.2; NM 005823 1.
(6) Napi3b (NAPI-3B, NPTIIb, SLC34A2, família 34 do carre- ador de soluto (fosfato de sódio), membro 2, transportador de fosfato de- pendente de sódio 3b tipo Il, Número de acesso GenBank NM 006424); J. Biol. Chem., 2002, 277(22):19665-19672; Genomics, 1999, 62(2): 281-284; Feild, J.A., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1999, 258(3): 578-582),; WO 2004/022778 (Reivindicação 2); EP 1394274 (Exemplo 11); WO 2002/102235 (Reivindicação 13; Página 326); EP 875569 (Reivindicação 1; Página 17-19); WO 2001/57188 (Reivindica- ção 20; Página 329); WO 2004/032842 (Exemplo IV); WO200175177 (Reivindicação 24; Página 139-140); Referências cruzadas: MIM: 604217; NP 006415.1; NM 006424 1.
(7) Sema 5b (FLJ10372, KIAA1I445, Mm.42015, SEMASB, SEMAG, Sematforina 5b Hlog, domínio sema, sete repetições de trom- bospondina (tipo 1 e similar a tipo 1), domínio de transmembrana (TM) e domínio citoplasmático curto, (semaforina) 5B, Número de Acesso GenBank ABO40878); Nagase T. et al, DNA Res., 2000, 7(2):143- 150); WO 2004/000997 (Reivindicação 1); WO 2003/003984 (Reivindi- cação 1); WO 2002/06339 (Reivindicação 1; Página 50); WO 2001/ 88133 (Reivindicação 1; Página 41-43, 48-58); WO 2003/054152 (Rei- vindicação 20); WO 20031/01400 (Reivindicação 11); Adesão: Q9P283; EMBL; ABO40878; BAA95969.1. Genew; HGNC:10737.
(8) PSCA hlg (27/00050C12Rik, C530008016Rik, RIKEN CcDNA 2700050C12, gene RIKEN cDNA 2700050C12, Número de Acesso GenBank AY358628); Ross et al., Cancer Res., 2002, 62:
2546-2553; US 2003/129192 (Reivindicação 2); US 2004/044180 (Rei- vindicação 12); US 2004/044179 (Reivindicação 11); US 2003/096961 (Reivindicação 11); US 2003/232056 (Exemplo 5); WO 2003/105758 (Reivindicação 12); US 2003/206918 (Exemplo 5); EP 1347046 (Rei- vindicação 1); WO 2003/025148 (Reivindicação 20); Referências cru- zadas: Gl: 37182378; AAQ88991.1; AY358628 1.
(9) ETBR (receptor tipo B de endotelina, número de acesso GenBank AY275463); Nakamuta M. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1991, 177:34-39; Ogawa Y. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1991, 178, 248-255; Arai, H. et al., Jpn. Circ. J., 1992, 56: 1303-1307; Arai, H. et al., J. Biol. Chem., 1993, 268: 3463-3470; Sa- kamoto A., Yanagisawa M.,., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1991, 178:656-663; Elshourbagy NA et al., J. Biol. Chem., 1993, 268: 3873-3879; Haendler B. et al., J. Cardiovasc. Pharmacol., 1992, 20:s1- S4; Tsutsumi M. et ai., Gene, 1999, 228:43-49; Strausberg, RL, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA., 2002, 99:16899-16903; Bourgeois C., et al., J. Clin. Endocrinol. Metab., 1997, 82, 3116-3123; Okamoto Y. et al., Biol. Chem., 1997, 272:21589-21596; Verheij, JB, alt. J. Med. Ge- net., 2002, 108:223-225; Hofstra, RMW, et al., Eur. J. Hum. Genet,, 1997, 5:180-185; Puffenberger, EG, et al., Cell, 1994, 79:1257-1266; Attie T. et al., Hum. Mol. Genet., 1995, 4:2407-2409; Auricchio A., et al., Hum. Mol. Genet., 1996, 5: 351-354; Amiel J. et al. Hum. Mol. Ge- net. 5, 355-357, 1996; Hofstra R.M.W,, et al Nat. Genet., 1996, 12:445- 447; Svensson, PJ, et al., Hum. Genet., 1998, 103:145-148; Fuchs, S. et al., Mol. Med. 2001, 7:115-124; Pingault V. et al., Hum. Genet., 2002, 111:198-206; WO 2004/045516 (Reivindicação 1); WO 2004/048938 (Exemplo 2); WO 2004/040000 (Reivindicação 151); WO 2003/087768 (Reivindicação 1); WO 2003/016475 (Reivindicação 1); WO 2003/016475 (Reivindicação 1); WO 2002/61087 (Figura 1); WO 2003/016494 (Figura 6); WO 2003/025138 (Reivindicação 12; Página
144); WO 2001/98351 (Reivindicação 1; Página 124-125); EP 522868 (Reivindicação 8; Figura 2); WO 2001/77172 (Reivindicação 1; Página 297-299); US 2003/109676; US 6,518,404 (Figura 3); US 5,773,223 (Reivindicação 1a; Col 31-34); WO 2004/001004.
(10) MSG783 (RNF124, proteína hipotética FLJ20315, Nú- mero de Acesso GenBank NM 017763); WO 2003/104275 (Reivindi- cação 1); WO 2004/046342 (Exemplo 2); WO 2003/042661 (Reivindi- cação 12), WO 2003/083074 (Reivindicação 14; Página 61); WO 2003/018621 (Reivindicação 1); WO 2003/024392 (Reivindicação 2; Figura 93); WO 2001/66689 (Exemplo 6); Referências cruzadas: Locu- SID: 54894; NP 060233.2; NM 017763 1.
(11) STEAP2 (HGNC 8639, IPCA-1, PCANAP1, STAMP1, STEAP2, STMP, gene associado ao câncer de próstata 1, proteína associada ao câncer da próstata 1, antígenos epiteliais de seis trans- membranas da próstata 2, proteínas da próstata de seis transmembra- nas, Número de acesso GenBank AF455138) Lab. Invest. 82 (11):1573-1582 (2002)); WO 2003/087306; US 2003/064397 (Reivindi- cação 1; Figura 1); WO 2002/72596 (Reivindicação 13; Página 54-55); WO 2001/72962 (Reivindicação 1; Fig 4B); WO 2003/104270 (Reivin- dicação 11); WO 2003/104270 (Reivindicação 16); US 2004/005598 (Reivindicação 22); WO 2003/042661 (Reivindicação 12); US 2003/ 060612 (Reivindicação 12; Figura 10); WO 2002/26822 (Reivindicação 23; Figura 2); WO 2002/16429 (Reivindicação 12; Figura 10); Referên- cias cruzadas: Gl: 22655488; AANO4080.1; AF455138 1.
(12) TrpM4 (BR22450, FLJ20041, TRPM4, TRPMA4B, canal de cátion potencial do receptor transiente, subfamília M, membro 4, Número de Acesso GenBank NM 017636) Xu, XZ et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA., 2001, 98(19):10692-10697; Cell, 2002, 109(3):397- 407; J. Biol. Chem., 2003, 278(33):30813-30820; US 2003/143557 (Reivindicação 4); WO 2000/40614 (Reivindicação 14; Página 100-
103); WO 2002/10382 (Reivindicação 1; Fig 9A); WO 2003/042661 (Reivindicação 12); WO 2002/30268 (Reivindicação 27; Página 391); US 2003/219806 (Reivindicação 4), WO 2001/62794 (Reivindicação 14; Fig 1A-D); Referências cruzadas: MIM: 606936; NP 060106.2; NM 017636 1.
(13) CRIPTO (CR, CR1, CRGF, CRIPTO, TDGF1, fator de crescimento derivado de teratocarcinoma, Número de Acesso Gen- Bank NP 003203 ou NM 003212); Ciccodicola, A., et al., EMBO J., 1989, 8(7):1987-1991; Am. J. Hum. Genet., 1991, 49(3):555-565; US 2003/224411 (Reivindicação 1); WO 2003/083041 (Exemplo 1); WO 2003/034984 (Reivindicação 12); WO 2002/88170 (Reivindicação 2; Página 52-53), WO 2003/024392 (Reivindicação 2; Figura 58); WO 2002/16413 (Reivindicação 1; Página 94-95, 105), WO 2002/22808 (Reivindicação 2; Figura 1); US 5.854.399 (Exemplo 2; Col 17-18); US
5.792.616 (Figura 2); Referências cruzadas: MIM: 187395; NP 003203.1; NM 003212 1.
(14) CD21 (CR2 (Receptor de complemento 2) ou C3DR (receptor do vírus C3d/Epstein Barr) ou Hs.73792, número de acesso GenBank M26004); Fujisaku et al., J. Biol. Chem., 1989, 264(4):2118- 2125); Weis JJ, et al., J. Exp. Med. 1988, 167:1047-1066; Moore M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA,1987, 84:9194-9198; Barel M. et al., Mol. Immunol., 1998, 35:1025-1031; Weis JJ, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,1986, 83:5639-5643; Sinha SK, et al., J. Immunol., 1993, 150:5311-5320; WO 2004/045520 (Exemplo 4); US 2004/005538 (Exemplo 1); WO 2003/062401 (Reivindicação 9); WO 2004/045520 (Exemplo 4); WO 9102536 (Figura 9.1-9.9); WO 2004/020595 (Reivin- dicação 1); Adesão: P20023; Q13866; Q14212; EMBL; MZ26004; AAA35786.1.
(15) CD79b (CD79B, CD79B, IGb (beta associada à imuno- globulina), B29, Número de Acesso GenBank NM 000626 ou
11038674); Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, 2003, 100(7):4126-4131; Blo- od, 2002, 100(9):3068-3076; Muller, et al., Eur. J. Immunol., 1992, 22(6): 1621-1625; WO 2004/016225 (reivindicação 2, Figura 140); WO 2003/087768, US 2004/101874 (reivindicação 1, página 102); WO 2003/062401 (reivindicação 9); WO 2002/78524 (Exemplo 2); US 2002/150573 (reivindicação 5, página 15); US 5,644,033; WO 2003/048202 (reivindicação 1, páginas 306 e 309); WO 99/558658, US
6.534.482 (reivindicação 13, Fig 17A/B); WO 2000/55351 (reivindica- ção 11, páginas 1145-1146); Referências cruzadas: MIM: 147245; NP 000617.1; NM 000626 1.
(16) FcRH2 (IFGP4, IRTA4, SPAP1IA (domínio SH2 con- tendo proteína âncora de fosfatase 1a), SPAP1B, SPAP1C, número de acesso GenBank NM 030764, AY358130); Genome Res., 2003, 13(10):2265-2270; Immunogenetics, 2002, 54(2): 87-95; Blood, 2002, 99(8): 2662-2669; Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, 2001, 98(17):9772-9777; Xu, MJ, et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 2001, 280(3):768- 775; WO 2004/016225 (Reivindicação 2); WO 2003/077836; WO 2001/38490 (Reivindicação 5; Figura 18D-1-18D-2); WO 2003/097803 (Reivindicação 12); WO 2003/089624 (Reivindicação 25); Referências cruzadas: MIM: 606509; NP 110391.2; NM 030764 1.
(17) HER2 (ErbB2, Número de Acesso GenBank M11730); Coussens, L. et al., Science, 1985, 230(4730): 1132-1139); Yamamo- to, T. et al., Nature, 1986, 319: 230-234; Semba, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, 1985, 82:6497-6501; Swiercz, J.M., et al., J. Cell Biol., 2004, 165:869-880; Kuhns, J.J., et al, J. Biol. Chem., 1999, 274:36422-36427; Cho H.-S., et al, Nature, 1993, 421: 756-760; Ehsani, A. et al, Genomics, 1993, 15:426-429; WO 2004/048938 (Exemplo 2); WO 2004/027049 (Figura 11); WO 2004/009622; WO 2003/081210; WO 2003/089904 (Reivindicação 9); WO 2003/016475 (Reivindicação 1); US 2003/118592; WO 2003/008537 (Reivindicação
1); WO 2003/055439 (Reivindicação 29; Figura 1A-B); WO 2003/025228 (Reivindicação 37; Figura 5C); WO 2002/22636 (Exem- plo 13; Página 95-107); WO 2002/12341 (Reivindicação 68; Figura 7); WO 2002/13847 (página 71-74); WO 2002/14503 (Página 114-117); WO 2001/53463 (Reivindicação 2; Página 41-46); WO 2001/41787 (Página 15), WO 2000/44899 (Reivindicação 52; Figura 7); WO 2000/20579 (Reivindicação 3; Figura 2); US 5.869.445 (Reivindicação 3; Col 31-38); WO 9630514 (Reivindicação 2; Página 56-61); EP 1439393 (Reivindicação 7); WO 2004/043361 (Reivindicação 7); WO 2004/022709; WO 2001/00244 (Exemplo 3; Figura 4); Adesão: PO4626; EMBL; M11767; AAA3S5808.1. EMBL; M11761; AMA3S5808.1.
(18) NCA (CEACAM6, Número de acesso GenBank M18728); Barnett T. et al., Genomics, 1988, 3:59-66; Tawaragi, Y., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1988, 150: 89-96; Strausberg, RL, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, 2002, 99:16899-16903; WO 2004/063709; EP 1439393 (Reivindicação 7); WO 2004/044178 (Exemplo 4); WO 2004/031238; WO 2003/042661 (Reivindicação 12); WO 2002/78524 (Exemplo 2); WO 2002/86443 (Reivindicação 27; Pá- gina 427); WO 2002/60317 (Reivindicação 2); Acesso: P40199; Q14920; EMBL; M29541; AAAS9915.1. EMBL; M18728.
(19) MDP (DPEP1, Número de Acesso GenBank BCO017023); Proc. Natl. Acad. Sci. EUA., 2002, 99(26):16899-16903; WO 2003/016475 (Reivindicação 1); WO 2002/64798 (Reivindicação 33; Página 85-87); JP 05003790 (Figura 6-8); WO 9946284 (Figura 9); Referência cruzada: MIM:179780; AAH17023.1; BC017023 1.
(20) IL20Roa. (IL20Ra, ZOCYTOR7, Número de Acesso Gen- Bank AF184971); Clark H.F., et al., Genome Res., 2003, 13:2265- 2270; Mungall A.J., et al., Nature, 2003, 425:805-811; Blumberg H., et al., Cell, 2001, 104: 9-19; Dumoutier L. et al., J. Immunol., 2001, 167: 3545-3549; Parrish-Novak J., et al., J. Biol. Chem., 2002, 277: 47517-
47523; Pletnev, S., et al, Biochemistry, 2003, 42: 12617-12624; Sheikh F., et al., J. Immunol., 2004, 172:2006-2010; EP 1394274 (Exemplo 11); US 2004/005320 (Exemplo 5); WO 2003/029262 (pági- na 74-75), WO 2003/002717 (Reivindicação 2; Página 63), WO 2002/22153 (Página 45-47); US 2002/042366 (página 20-21); WO 2001/46261 (Página 57-59), WO 2001/46232 (Página 63-65), WO 9837193 (Reivindicação 1; Página 55-59), Adesão: Q9UHFA4; Q6UWAS; Q96SH8; EMBL; AF184971; AAFO01320.1.
(21) Brevican (BCAN, BEHAB, Número de Acesso Gen- Bank AF229053); Gary SC, et al., Gene, 2000, 256: 39-147; Clark HF et al., Genome Res., 2003, 13:2265-2270; Strausberg, RL, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, 2002, 99:16899-16903; US 2003/186372 (Rei- vindicação 11); US 2003/186373 (Reivindicação 11); US 2003/119131 (Reivindicação 1; Figura 52); US 2003/119122 (Reivindicação 1; Figu- ra 52); US 2003/119126 (Reivindicação 1); US 2003/119121 (Reivindi- cação 1; Figura 52); US 2003/119129 (Reivindicação 1); US 2003/119130 (Reivindicação 1); US 2003/119128 (Reivindicação 1; Figura 52), US 2003/119125 (Reivindicação 1); WO 2003/016475 (Reivindicação 1); WO 2002/02634 (Reivindicação 1).
(22) EphB2R (DRT, ERK, Hek5, EPHT3, Tyro5, Número de Acesso GenBank NM 004442) Chan, J. e Watt, V.M., Oncogene, 1991, 6(6): 1057-1061; Oncogene, 1995, 10(5): 897-905; Annu. Rev. Neurosci., 1998, 21: 309-345; Int. Rev. Cytol., 2000, 196: 177-244; WO 2003/042661 (Reivindicação 12); WO 2000/53216 (Reivindicação 1; Página 41); WO 2004/065576 (Reivindicação 1); WO 2004/020583 (Reivindicação 9) WO 2003/004529 (página 128-132); WO 2000/53216 (Reivindicação 1; Página 42); Referências cruzadas: MIM: 600997; NP 004433.2; NM 004442 1.
(23) ASLG659 (B7h, Número de Acesso GenBank AX092328) US20040101899 (Reivindicação 2), WO 2003/104399
(Reivindicação 11); WO 2004/000221 (Figura 3), US 2003/165504 (Reivindicação 1); US 2003/124140 (Exemplo 2); US 2003/065143 (Fi- gura 60); WO 2002/102235 (Reivindicação 13; Página 299); US 2003/091580 (Exemplo 2); WO 2002/10187 (Reivindicação 6; Figura 10); WO 2001/94641 (Reivindicação 12; Figura 7b); WO 2002/02624 (Reivindicação 13; Figura 1A-1B); US 2002/034749 (Reivindicação 54; Páginas 45-46); WO 2002/06317 (Exemplo 2; Página 320-321, Reivin- dicação 34; Página 321-322); WO 2002/71928 (página 468-469); WO 2002/02587 (Exemplo 1; Figura 1); WO 2001/40269 (Exemplo 3; Pági- nas 190-192); WO 2000/36107 (Exemplo 2; Página 205-207);, WO 2004/053079 (Reivindicação 12); WO 2003/004989 (Reivindicação 1); WO 2002/71928 (Página 233-234, 452-453); WO 0116318.
(24) PSCA (precursor do antígeno de células-tronco da próstata, Número de acesso do GenBank AJ297436) Reiter R.E., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, 95:1735-1740; Gu Z,., et al., On- cogene, 2000, 19:1288-1296; Biochem. Biophys. Res. Commun., 2000, 275(3):783-788; WO 20040/22709; EP 1394274 (Exemplo 11); US 2004/018553 (Reivindicação 17); WO 2003/008537 (Reivindicação 1); WO 2002/81646 (Reivindicação 1; Página 164); WO 2003/003906 (Reivindicação 10; Página 288); WO 2001/40309 (Exemplo 1; Figura 17); US 2001/055751 (Exemplo 1; Figura 1b); WO 2000/32752 (Rei- vindicação 18; Figura 1); WO 1998/51805 (Reivindicação 17; Página 97); WO 1998/51824 (Reivindicação 10; Página 94); WO 1998/40403 (Reivindicação 2; Figura 1B); Adesão: O43653; EMBL; AFO043498; AAC39607.1.
(25) GEDA (Número de Acesso GenBank AY260763); Pro- teína semelhante a parceiro de fusão HAPG de lipoma AAP14954 Ipid=AAP14954.1 - Homo sapiens Espécie: Homo sapiens (humano) WO 2003/054152 (Reivindicação 20), WO 2003/000842 (Reivindica- ção 1); WO 2003/023013 (Exemplo 3, Reivindicação 20); US
2003/194704 (Reivindicação 45); Referências cruzadas: Gl: 30102449; AAP14954.1; AY260763 1.
(26) BAFF-R (receptor do fator de ativação de células B, receptor BLyS 3, BR3, número de acesso ao GenBank AF116456); Receptor BAFF / pid=NP 443177.1 - Homo sapiens Thompson, JS, et al., Science, 2001, 293(5537): 2108-2111; WO 2004/058309; WO 2004/011611; WO 2003/045422 (Exemplo; Página 32-33) WO 2003/014294 (Reivindicação 35; Figura 6B); WO 2003/035846 (Rei- vindicação 70; Página 615-616); WO 2002/94852 (Col 136-137); WO 2002/38766 (Reivindicação 3; Página 133); WO 2002/24909 (Exemplo 3; Figura 3); Referências cruzadas: MIM: 606269; NP 443177.1; NM 052945 1; AF132600.
(27) CD22 (isoforma do receptor CD22-B das células B, BL- CAM, Lyb-8, Lyb8, SIGLEC-2, FLJ22814, Número de Acesso Gen- Bank AKO026467); Wilson, et al., J. Exp. Med.1991, 173:137-146; WO 2003/072036 (Reivindicação 1; Figura 1); Referências cruzadas: MIM: 107266; NP 001762.1; NM 001771 1.
(28) CD79a (CD79A, CD79a, alfa associado à imunoglobu- lina, proteína específica de células B que interage covalentemente com Ig beta (CD79B) e forma um complexo na superfície com molécu- las de IgM, transduz um sinal envolvido na diferenciação de células B), pl: 4,84, MW: 25028 TM: 2 [P] cromossomo do gene: 19913.2, número de acesso ao GenBank NP 001774.10) WO 2003/088808, US 2003/0228319; WO 2003/062401 (reivindicação 9); US 2002/150573 (reivindicação 4, páginas 13-14); WO 9958658 (reivindicação 13, Figu- ra 16); WO 9207574 (Figura 1); US 5,644,033; Ha, et al., J. Immunol., 1992, 148(5):1526-1531; Mueller et al., Eur. J. Biochem., 1992, 22: 1621-1625; Hashimoto, et al., Inmunogenetics, 1994, 40(4): 287-295; Preud'homme et al., Clin. Exp. Immunol., 1992, 90(1):141-146; Yu, et al., J. Immunol., 1992, 148(2) 633-637; Sakaguchi et al., EMBOJ.,
1988, 7(11):3457-3464.
(29) O CXCRS5 (receptor de linfoma de Burkitt 1, um recep- tor acoplado a proteína G que é ativado pela quimiocina CXCL13, fun- ções na migração de linfócitos e defesa humoral, desempenha um pa- pel na infecção pelo HIV-2 e, talvez, desenvolvimento de AIDS, linfo- ma, mieloma, e leucemia); 372 aa, pl: 8,54 MW: 41959 TM: 7 [P] Cro- mossoma de Gene: 119233, Número de Acesso Genbank NP 001707.1) WO 2004/040000; WO 2004/015426; US 2003/105292 (Exemplo 2); US 6.555.339 (Exemplo 2); WO 2002/61087 (Figura 1); WO 2001/57188 (Reivindicação 20, página 269); WO 2001/72830 (pá- ginas 12-13); WO 2000/22129 (Exemplo 1, páginas 152-153, Exemplo 2, páginas 254-256); WO 1999/28468 (reivindicação 1, página 38); US
5.440.021 (Exemplo 2, col 49-52); WO 9428931 (páginas 56-58); WO 1992/17497 (reivindicação 7, Figura 5); Dobner et al., Eur. J. Immunol., 1992, 22: 2795-2799; Barella et al., Biochem. J., 1995, 309: 773-779.
(30) HLA-DOB (subunidade beta da molécula MHC de clas- se Il (antigênio la) que liga os peptídeos e os apresenta aos linfócitos T CD4+); 273 aa, pl: 6,56 MW: 30820 TM: 1 [P] Cromossoma de Ge- ne: 6p21.3, número de acesso GenBank NP 002111.1); Tonnelle et al., EMBO J., 1985, 4(11): 2839-2847; Jonsson et al., Inmunogenetics, 1989, 29(6): 411-413; Beck et al., J. Mol. Biol., 1992, 228: 433-441; Strausberg et al., Proc. Natl. Acad. Sci EUA, 2002, 99: 16899-16903; Servenius et al., J. Biol. Chem., 1987, 262: 8759-8766; Beck et al., J. Mol. Biol., 1996, 255: 1-13; Naruse et al., Tissue Antigens, 2002, 59: 512-519; WO 9958658 (reivindicação 13, Figura 15); US 6,153.408 (Col 35-38); US 5.976.551 (col 168-170); US 6.011.146 (col 145-146); Kasahara et al., Inmunogenetics, 1989, 30(1): 66-68; Larhammar, et al., J. Biol. Chem., 1985, 260(26):14111-14119.
(31) P2X5 (canal iônico dependente de ligante P2X do re- ceptor purinérgico 5, um canal iônico dependente de ATP extracelular,
pode estar envolvido na transmissão sináptica e neurogênese, a defi- ciência pode contribuir para a fisiopatologia da instabilidade idiopática do detrusor); 422 aa), pl: 7,63, MW: 47206 TM: 1 [P] Cromossoma de Gene: 17p13.3, número de acesso GenBank NP 002552.2); Le, et al., FEBS Lett, 1997, 418(1-2):195-199; WO 2004/047749; WO 2003/072035 (reivindicação 10); Touchman et al., Genome Res., 2000, 10: 165-173; WO 2002/22660 (reivindicação 20); WO 2003/093444 (reivindicação 1); WO 2003/087768 (reivindicação 1); WO 2003/029277 (página 82).
(32) CD72 (antígeno de diferenciação de células B CD72, Lyb-2), pl: 8,66, MW: 40225 TM: 1 [P] cromossomo do gene: 9p13.3, número de acesso ao GenBank NP 001773.1) WO2004042346 (rei- vindicação 65); WO 2003/026493 (páginas 51-52, 57-58), WO 2000/75655 (páginas 105-106); Von Hoegen et al., J. Immunol., 1990, 144(12): 4870-4877; Strausberg et al., Proc. Natl. Acad. Sci EUA, 2002, 99:16899-16903.
(33) LY64 (antígeno linfocitário 64 (RP105), proteína de membrana do tipo | da família de repetição rica em leucina (LRR), re- gula a ativação e a apoptose das células B, a perda de função está associada ao aumento da atividade da doença em pacientes com lú- pus eritematoso sistêmico); 661 aa, pl: 6,20, MW: 74147 TM: 1 [P] Cromossoma de Gene: 5912, Número de Acesso GenBank NP 005573.1) US 2002/193567; WO 9707198 (reivindicação 11, pági- nas 39-42); Miura et al., Genomics, 1996, 38(3): 299-304; Miura et al., Blood, 1998, 92:2815-2822; WO 2003/083047; WO 9744452 (reivindi- cação 8, páginas 57-61); WO 2000/12130 (páginas 24-26).
(34) FcRH1 (Proteína similar de receptor Fc 1, um receptor putativo para o domínio Fc de imunoglobulina que contém domínios tipo C2 similar a Ig e ITAM, pode ter um papel na diferenciação de lin- fócitos B); 429 aa, pl: 5.28, MW: 46925 TM: 1 [P] cromossomo de Ge-
ne: 1921-1922, número de acesso Genbank NP 443170.1) WO 2003/077836; WO 2001/38490 (reivindicação 6, Figura 18E-1-18-E-2); Davis et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 2001, 98(17):9772-9777; WO 2003/089624 (reivindicação 8); EP 1347046 (reivindicação 1); WO 2003/089624 (reivindicação 7).
(35) IRTA?2 (transferência de receptores de superfamília de imunoglobulina associada 2, um imunorreceptor putativo com possí- veis papéis no desenvolvimento de células B e linfomagênese; a des- regulamentação do gene por translocação ocorre em algumas maligni- dades de células B); 977 aa, pl: 6,88 MW: 106468 TM: 1 [P] Cromos- soma de Gene: 1921, Número de acesso do GenBank Humano: AF343662, AF343663, AF343664, AF343665, AF369794, AF397453, AKO90423, AKO90475, AL834187, AY358085; Camundongo: AKO89756, AY158090, AY506558; NP 112571.1. WO 2003/024392 (reivindicação 2, Figura 97); Nakayama et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 2000, 277(1): 124-127; WO 2003/077836; WO 2001/38490 (reivindica- ção 3, Figura 18B-1-18B-2).
(36) TENB2 (TMEFF2, tomoregulina, TPEF, HPP1, TR, pro- teoglicano transmembranar putativo, relacionado à família de fatores de crescimento EGF/heregulina e folistatina); 374 aa, NCBI de acesso: AAD55776, AAF91397, AAG49451, NCBI RefSeg: NP 057276; NCBI Gene: 23671; OMIM: 605734; SwissProt Q9UIK5; Número de acesso do GenBank AF179274; AY358907, CAF85723, CQ782436 WO 2004/074320; JP 2004113151; WO 2003/042661; WO 2003/009814; EP 1295944 (páginas 69-70); WO 2002/30268 (página 329); WO 2001/90304; US 2004/249130; US 2004/022727; WO 2004/063355; US 2004/197325; US 2003/232350; US 2004/005563; US 2003/124579; Horie et al., Genomics, 2000, 67: 146-152; Uchida et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1999, 266: 593-602; Liang et al., Cancer Res., 2000, 60: 4907-12; Glynne-Jones et al., Int. J. Cancer,
2001, 94(2):178-84.
(37) PMEL1I7 (homólogo da prata; SILV; D12S53E; PMEL17; SI; SIL); MEZ20; gp100) BCO01414; BTOO07202; M32295; M77348; NM 006928; McGlinchey, R.P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA., 2009, 106(33):13731-13736; Kummer, M.P., et al., J. Biol. Chem., 2009, 284 (4):2296-2306.
(38) TMEFF1 (proteína transmembranar com domínios do tipo EGF e dois do tipo folistatina 1; Tomoregulina-1); H7365; C9orf2; C9O0RF2; U19878; X83961; NM 080655; NM 003692; Harms, PW, Genes Dev., 2003, 17(21):2624-2629; Gery, S., et al., Oncogene, 2003, 22(18): 2723-2727.
(39) GDNF-Ra1 (receptor da família GDNF alfa 1; GFRA1; GDNFR; GDNFRA; RETL1; TRNR1; RET1L; GDNFR-alfa1; GFR- ALFA-1); U95847; BC0 14962; NM 145793 NM 005264; Kim, M.H,, et al., Mol. Cell. Biol., 2009, 29(8):2264-2277; Treanor, JJ, et al., Nature, 1996, 382(6586):80-83.
(40) Ly6E (complexo do antígeno de linfócito 6, locus E; Ly67,RIG-E,SCA-2,TSA-1); NP 002337.1; NM 002346.2; de Nooij-van Dalen, A.G., et al., Int. J. Cancer, 2003, 103(6): 768-774; Zammit, DJ et al., Mol. Cell. Biol., 2002, 22(3):946-952.
(41) TMEMA46 (homólogo de shisa 2 (Xenopus laevis); SHI- SA2); NP 001007539.1; NM 001007538.1; Furushima, K,, et al., Dev. Biol., 2007, 306(2): 480-492; Clark, HF et al., Genome Res., 2003, 13(10):2265-2270.
(42) LyYSG6D (complexo de antígeno de linfócito 6, locus G6D; Ly6-D, MEGT1); NP 067079.2; NM 021246.2; Mallya, M. et al., Genomics, 2002, 80(1): 113-123; Ribas, G., et al., J. Immunol., 1999, 163(1):278-287.
(43) LGR5 (receptor 5 acoplado à proteína G contendo re- petições ricas em leucinay GPR49, GPR67); NP 003658.1;
NM 003667.2; Salanti, G., et al., Am. J. Epidemiol., 2009, 170(5):537- 545; Yamamoto, Y. et al., Hepatology, 2003, 37(3):528-533.
(44) RET (ret-proto-oncogene;MEN2A; HSCR1; MENZB; MTC1; PTC; CDHF12; Hs.168114; RET51; RET-ELE1); NP 066124.1; NM 020975.4; Tsukamoto, H., et al., Cancer Sci., 2009 100(10): 1895- 1901; Narita, N., et al., Oncogene, 2009, 28(34):3058-3068.
(45) LY6K (complexo de antígeno linfocitário 6, locus K; LY6K; HSJO01348; FLJ35226); NP 059997.3; NM 017527.3; Ishika- wa, N. et al., Cancer Res., 2007, 67(24): 11601-11611; de Nooij-van Dalen, AG, et al., Int. J. Cancer, 2003, 103(6):768-774.
(46) GPR19 (receptor 19 acoplado à proteína G; Mm.4787); NP 006134.1; NM 006143.2; Montpetit, A. and Sinnett, D. Hum. Ge- net., 1999, 105(1-2):162-164; O'Dowd, BF et al., FEBS Lett., 1996, 394(3):325-329.
(47) GPR54 (receptor KISS1; KISSIR; GPR54; HOT7T175; AXOR12); NP 115940.2; NM 032551.4; Navenot, J.M., et al., Mol. Pharmacol., 2009, 75(6):1300-1306; Hata, K. et al., Anticancer Res. 2009, 29(2):617-623.
(48) ASPHD1 (domínio da aspartato beta-hidroxilase con- tendo 1; LOC253982); NP 859069.2; NM 181718.3; Gerhard, D.S,, et al., Genome Res., 2004, 14(10B):2121-2127.
(49) Tirosinase (TYR; OCAIA; OCATA; tirosinase; SHEP3); NP 000363.1; NM 000372.4; Bishop, D.T., et al., Nat. Genet., 2009, 41(8):920-925; Nan, H,., et al., Int. J. Cancer, 2009, 125(4):909-917.
(50) TMEM118 (proteína de dedo anelar, transmembrana 2; RNFT2; FLJ14627); NP 001103373.1; NM 001109903.1; Clark, H.F., et al., Genome Res., 2003, 13(10):2265-2270; Scherer, S.E., et al., Na- ture, 2006, 440(7082):346-351.
(51) GPR172A (receptor 172A acoplado à proteína G; GPCRA41; FLJ11856; D1SErtd747e); NP 078807.1; NM 024531.3;
Ericsson, T.A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,2003, 100(11):6759- 6764; Takeda, S., et al., FEBS Lett., 2002, 520(1-3):97-101.
(52) CD33, um membro da ligação de ácido siálico, família de lectina semelhante à imunoglobulina, é uma proteína transmembra- nar glicosilada 67 kDa. A CD33 é expressa na maioria das células de leucemia mieloide e monocítica, além de células progenitoras mielo- monociíticas e eritroides comprometidas. Ela não é vista nas primeiras células-tronco pluripotentes, nos granulócitos maduros, nas células linfoides nem nas células não-hematopoiéticas (Sabbath et al., J. Clin. Invest., 1985, 75:756-56; Andrews et al., Blood, 1986, 68:1030-5). À CD33 contém dois resíduos de tirosina em sua cauda citoplasmática, cada uma deles seguido de resíduos hidrofóbicos semelhantes ao mo- tivo inibidor derivado de tirosina do imunorreceptor (ITIM) observado em muitos receptores inibitórios.
(53) CLL-1 (CLEC12A, MICL e DCAL2) codifica um mem- bro da superfamília do domínio semelhante à lectina tipo C/lectina tipo C (CTL/CTLD). Os membros desta família compartilham uma dobra de proteína comum e têm diversas funções, tais como adesão celular, si- nalização célula-célula, turnover de glicoproteína, e papéis na inflama- ção e resposta imune. A proteína codificada por este gene é um regu- lador negativo da função de granulócitos e monócitos. Várias variantes de transcritos de splice alternativos deste gene foram descritos, mas a natureza de comprimento total de algumas dessas variantes não foi determinada. Este gene está intimamente ligado a outros membros da superfamília de CTL/CTLD na região do complexo do gene natural kil- ler no cromossomo 12p13 (Drickamer, K., Curr. Opin. Struct. Biol., 1999, 9(5):585-90; van Rhenen, A. et a/., Blood, 2007, 110(7):2659- 66; Chen, CH, et al., Blood, 2006, 107(4):1459-67; Marshall, A.S., et al., Eur. J. Immunol., 2006, 36(8):2159-69; Bakker, AB, et al., Cancer Res., 2005, 64(22):8443-50; Marshall, AS, et al., J. Biol. Chem., 2004,
279 (15):14792-802). Foi demonstrado o CLL-1 como um receptor transmembrana tipo Il compreendendo um domínio único semelhante à lectina tipo C (que prevê-se não se ligando nem ao cálcio nem ao açúcar), uma região de base, um domínio transmembrana e uma cau- da citoplasmática curta contendo um motivo ITIM).
(54) CD70 (ligante CD27; CD27-L); citocina que se liga ao CD27) desempenha um papel na ativação das células T e induz a pro- liferação de células T co-estimuladas e melhora a geração de células T citolíticas. A proteína CD70 é expressa em linfócitos altamente ativa- dos, como linfomas de células T e B (Israel, B.F., et al., Mol. Cancer Ther., 2005, 4(12):2037 44; O'Neill, R.E., et al., J. Immunol., 2017, 199(10):3700-3710; Leigh, N. D., et al., J. Immunol., 2017, 199(1):336- 347; Itani, H. A., et al., Circ. Res., 2016, 118(8):1233-43; Burchill, M.A., et al., Eur. J. Immunol., 2015, 45(11):3140-9; Allam, A., et al., J. Immu- nol., 2014, 193(2):871-8).
(55) CLDN18.2 (variante 2 de splice de Claudin-18); CLDN'18 codifica o gene humano, Claudin 18. Também pode ser co- nhecido como: Claudin-18; SFTAS5; e SFTPJ. A proteína codificada tem um comprimento de aminoácido de 261 e uma massa de 27,9 kDa. CLDN18 é um membro da família Claudin (WO 2013/167295; WO 2016/166122). A molécula de junção estreita claudin 18 isotipo 2 (CLDN 18.2) é uma variante de splice associada ao câncer de Claudin
18. O CLDN 18.2 é uma proteína transmembrana de 27,8 kDa que compreende quatro domínios abrangentes da membrana com duas pequenas alça extracelulares (alça1 abraçada pela região hidrofóbica 1 e região hidrofóbica 2; alça2 abraçada pelas regiões hidrofóbicas 3 e 4). O CLDN 18.2 é um antígeno de linhagem gástrica altamente seleti- vo, expresso exclusivamente em células epiteliais gástricas diferencia- das de vida curta e não detectável em nenhum outro tecido humano normal. O antígeno é expresso ectopicamente em níveis significativos em uma diversidade de cânceres humanos, incluindo câncer gastroes- ofágico e pancreático (Sahin, U., et al., Clin. Cancer Res., 2008, 14(23):7624-34). A proteína CLDN18.2 também é frequentemente de- tectada nas metástases linfonodais do câncer gástrico e nas metásta- ses distantes. O CLDN 18.2 parece estar envolvido na proliferação de células tumorais positivas para o CLDN 18.2, uma vez que a regulação negativa do alvo pela tecnologia siRNA resulta na inibição da prolifera- ção de células cancerígenas gástricas. 1MAB362 é um anticorpo mo- noclonal quimérico do subtipo IgGI direcionado contra CLDN 18.2. 1MAB362 reconhece o primeiro domínio extracelular do CLDN 1 8.2 com alta afinidade e especificidade e não se liga a nenhum outro membro da família claudin, incluindo a variante de splice 1 intimamen- te relacionada de Claudin 18.
(56) CD151 (Cluster de diferenciação 151, Tspan24, PETA- 3, SFA-1); gene humano do grupo sanguíneo Raph. A proteína codifi- cada pelo gene CD151 é um membro da superfamília transmembranar 4, também conhecida como família tetraspanina. A maioria desses membros são proteínas da superfície celular caracterizadas pela pre- sença de quatro domínios hidrofóbicos. As proteínas mediam eventos de transdução de sinal que desempenham um papel na regulação do desenvolvimento, ativação, crescimento e motilidade celular. Esta pro- teína codificada é uma glicoproteína da superfície celular que é conhe- cida por complexar com integrinas e outras proteínas da superfamília transmembranar 4. Está envolvido em processos celulares, incluindo a adesão celular e pode regular o tráfego e/ou a função da integrina. Es- ta proteína aumenta a motilidade celular, invasão e metástase de célu- las cancerígenas. Múltiplas variantes transcritas que sofreram splicing de forma alternativa que codificam a mesma proteína foram descritas para esse gene (Berditchevski F., J. Cell Sci., 2002, 114(Pt 23): 4143- 51; Ashman, LK, Jy. Biol. Regul. Homeost. Agents, 2003, 16(3):223-6;
Sincock, PM, et al., J. Histochem. Cytochem., 1997, 45(4):515-25; Fit- ter S, et al., Biochim. Biophys. Acta., 1998, 1398(1):75-85; Sincock, P.M,, et al., J. Cell Sci., 1999, 112(Pt 6): 833-44; Sterk, L.M., et al., J. Cell Biol., 2000, 149(4):969-82; Zhang, X.A., Mol. Biol. Cell., 2002, 13(1):1-11).
(57) ITGaV (integrina alfa-V, CD51; MSK8; VNRA; VTNR); uma proteína em humanos é codificada pelo gene ITGAV (Sosnoski, D.M.,, et al., J. Clin. Invest., 1988, 81(6):1993-8). O ITGAV codifica a cadeia alfa da integrina V. As integrinas são proteínas de membrana integrais heterodiméricas compostas por uma cadeia alfa e uma ca- deia beta. Alfa V sofre clivagem pós-tradução para produzir cadeias pesadas e leves ligadas a dissulfeto que se combinam com múltiplas cadeias beta de integrina para formar integrinas diferentes. Entre as cadeias beta associadas conhecidas (cadeias beta 1,3,56 e 8; 'ITGB1', ''TGB3', ''TGB5', '' TGB6' e ''TGB8'), cada uma pode interagir com ligantes da matriz extracelular; a integrina alfa V beta 3, talvez a mais estudada, é referida como receptor de vitronectina (VNR). Além da adesão, muitas integrinas são conhecidas por facilitar a transdução de sinal. A superexpressão do gene ITGAV está associada à progres- são e disseminação do câncer colorretal (Waisberg, J., et al., Antican- cer Res., 2014, 34(10):5599—607) e câncer de próstata (Cooper, C.R., et al., Neoplasia, 2002, 4(3):191-4). Os anticorpos monoclonais inte- tumumab e abituzumab têm como alvo essa proteína que é encontra- da em algumas células tumorais (Élez, E., et al., Ann. Oncology, 2015, 26(1):132—40).
[00129] Outros antígenos exemplares incluem, mas não estão limi- tados a: (58) Nectina-4; (59) FGFR2; (60) FGFR3; (61) goNMB; (62) GUCY2C; (63) CLDNG6; (64) cMET; (65) CEACAMA4; (66) CEACAMB5; (67) CD29; (68) CD37; (69) CD352; (70) CD248; (71) MUC1; (72) CD123; (73) BOCMA; (74) ADAMS; (75) 5T4; (76) P-caderina; (77) CAS;
(78) CD138; (79) CD166; (80) CD71; (81) CD22; (82) CD20; (83) CD74; (84) DLL3; (85) Receptor de Folato alfa; (86) 1ITGa2; (87) ITGa3; (88) LAMP1; (89) LIV-1; (90) MMP14; (91) LRCC15; (92) MSLN; (93) PMSA; (94) PRLR; (95) PTK7; (96) SLAMF7; (97) SCL44A4; (98) SLTRKS5; (99) TMA4SF1; e (100) TROP?2.
[00130] Em certas modalidades da presente invenção, os TAA são selecionados do grupo que consiste em HER2, CD33, CD70, MUC1/CanAg, MUC16, CD151 e ITGaV. Compostos de conjugado anticorpo-fármaco (anticorpo-ligante-toxina)
[00131] De acordo com outro aspecto, a presente invenção refere- se a um composto ou compostos de Fórmula (Ill): T-L'-Ab (11) ou um sal farmaceuticamente aceitável deste, em que: L' é uma porção do ligante; T é um radical de Fórmula (1): SN HO" 9 à. õ () em que: R é selecionado a partir do grupo selecionado que consiste em: -(CH2)Jh-R'; -Cs5.6 heteroarila, opcionalmente substituída por um ou mais dentre halogênio, -CF3, -C1-salquila, e -O-C1-6 alquila; -C(R2)=N-R?%; --CH(CF3NH(CH2)JmCHa; --C(RºRP)NH(CH2)m CHs; -C(halogênio)=CH(CH2)mCHs3; --SO2-NH(CH2)mCH3; -O(CO) -arila; -O(CO)-heteroarila; --NRºRº; and --NH-heteroarila; em que R' é -O-CRºRº(CH2)mCH3 ou -N-CRºRº(CH2)mCHsa; em que Rº e Rº, juntamente com os átomos aos quais estão ligados, formam um anel C3-10 heterociclila;
R? é -CN ou -NH(CH2)mCHsa; R3 é -(CH2)mCH3 ou -O-(CH2)mCHs; cada n é independentemente 1, 2 ou 3; cada m é independentemente O, 1, 20u3;e Ab é um anticorpo.
[00132] Em certas modalidades exemplares, L' é selecionado do grupo que consiste na Fórmula (B!), Fórmula (B?), Fórmula (B?) e Fór- mula (B”):
H AoA: 4 0 (8) H W 9 o Cb 90 H - º (82) o ds . (Bº); o Oo o Oo o “OEA O q nº A NH (B ) em que q é 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10.
[00133] Em certas modalidades exemplares, R é selecionado do grupo que consiste em:
H H Ro 2 ot E Wo O) TF, NÉ DES : NM : As 2%
O o) O Fo) o 7Z N N z A N : | NH VAZ | 3 / | DAE Vs AZA o Al s o N -O N O. O. > AR O Da Xi
NH % SN & On se en % oo fe Pie du É OR % NH E NH % SS = ot N mm Of Of RN DES " o—Ê o—ê 2 o K 2 NH
N e NES RN o, H e o.
[00134] Um exemplo não limitativo da Fórmula (Ill) compreende a Fórmula (C'): A o. ARA O Mp To a SN Ho" 9 9 o (0) em que R e q são como descritos acima e Ab é um anticorpo como descrito acima. Um outro exemplo não limitante da Fórmula (Ill) com- preende a Fórmula (C?): H H o J Jd o Ro QRO AA SS A Ago NNE A UXÇÃIO TAPA Oo» ú : o em que R é como descrito acima e Ab é um anticorpo como descrito acima. Outro exemplo não limitativo da Fórmula (Ill) compreende a
Fórmula (Cº): o axo ON HO" º o (0?) em que R é como descrito acima e Ab é um anticorpo como descrito acima. Um outro exemplo não limitante da Fórmula (Ill) compreende a Fórmula (Cº): R o AMARO .* ne o (0º) em que R é como descrito acima, Ab é um anticorpo como descrito acima e n é 1, 2 ou 3 como descrito acima. Outro exemplo não limitati- vo da Fórmula (Il!) compreende a Fórmula (C”): UXC” TR fosto Add Lys Pó () em que R é como descrito acima, Ab é um anticorpo como descrito acima e q é 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 como descrito acima.
[00135] Em uma modalidade exemplar, o anticorpo liga-se a um ou mais antígenos associados ao tumor ou receptores de superfície celu- lar selecionados dentre (1)-(100): (1) BMPR1B (receptor de proteína morfogênica óssea tipo IB); (2) E16 (LAT1, SLC7A5); (3) STEAP1 (antígeno epitelial de seis transmembranas da próstata); (4) MUC16 (0772P, CA125); (5) MPF (MPF, MSLN, SMR, fator potenciador de megacariócito, mesotelina); (6) Napi2b (NAPI-3B, NPTIlIb, SLC34A2, família carreadora do soluto 34 (fosfato sódico), membro 2, transportador de fosfato dependente de sódio 3b do tipo 1I); (7) Sema 5b (FLJ10372, KIAA1445, Mm.42015, SEMAS5B, SEMAG, Semaforina 5b Hlog, domínio sema, sete repeti-
ções de trombospondina (tipo 1 e semelhante ao tipo 1), domínio transmembranar (TM) e domínio citoplasmático curto, (semaforina) 5B); (8) PSCA hlg (27/00050C12Rik, C530008016Rik, RIKEN cDNA 2700050C12, RIKEN cDNA 2700050C12 gene); (9) ETBR (receptor tipo B de Endotelina); (10) MSG783 (RNF124, proteína hipotética FLJ20315); (11) STEAP2 (HGNC 8639, IPCA-1, PCANAP1, STAMP1, STEAP2, STMP, gene 1 associado ao câncer de próstata, proteína 1 associada ao câncer de próstata, antígeno epitelial de seis transmem- branas da próstata 2, proteína da próstata de seis transmembranas); (12) TrpM4 (BR22450, FLJ20041, TRPM4, TRPM4B, canal de cátion receptor transiente do potencial, subfamília M, membro 4); (13) CRIP- TO (CR, CR1, CRGF, CRIPTO, TDGF1, fator de crescimento derivado do teratocarcinoma); (14) CD21 (CR2 (receptor complementar 2) ou C3DR (receptor do vírus C3d/Epstein Barr) ou Hs 73792); (15) CD79b (CD79B, CD79B8, IGb (beta acossiado à imunoglobulina), B29); (16) FcRH2 (IFGPA4, IRTA4, SPAP1A (proteína de âncora 1a do domínio SH2 contendo fosfatase), SPAP1B, SPAP1C); (17) HER2; (18) NCA; (19) MDP; (20) IL20Ra; (21) Brevican; (22) EphB2R; (23) ASLG659; (24) PSCA; (25) GEDA; (26) BAFF-R (receptor do fator de ativação de célula B, BLyS receptor 3, BR3); (27) CD22 (isoforma CD22-B do re- ceptor de célula B); (28) CD79a (CD79A, CD79a, alfa associado à imunoglobulina); (29) CXCRS5 (receptor do linfoma de Burkitt 1); (30) HLA-DOB (molécula de MHC classe Il subunidade Beta (antígeno la)); (31) P2X5 (canal iônico 5 direcionado por ligante P2X de receptor pu- rinérgico); (32) CD72 (antígeno de diferenciação de célula B CD7?2, Lyb-2); (33) LY64 (antígeno do linfócito 64 (RP105), proteína de mem- brana tipo | da família de repetição rica em leucina (LRR) family); (34) FcRH1 (proteína 1 semelhante ao receptor Fc); (35) FCRH5 (IRTA2, translocação do receptor da superfamília de imunoglobulina associado 2); (386) TENB2 (protoglicano de transmembrana putativa); (37)
PMEL17 (homólogo da prata; SILV; D12S53E; PMEL 17; SI; SIL); (38) TMEFF1 (proteína 1 de transmembrana com domínios semelhante a EGF e dois domínios semelhantes à folistatina; Tomorregulina-1); (39) GDNF-Ra1 (receptor de família GDNF alfa 1; GFRA1; GDNFR; GDN- FRA; RETL1; TRNR1; RET1L; GDNFR-alfa1; GFR-ALFA-1); (40) LySE (complexo de antígeno de linfócito 6, locus E; Ly67,RIG-E,SCA-2,TSA- 1); (41) TMEMA46 (homólogo shisa 2 (Xenopus laevis); SHISA2); (42) Ly6G6D (complexo de antígeno de linfócito 6, locus G6D; Ly6-D, MEGT1); (43) LGR5 (receptor 5 acoplado à proteína G contendo repe- tição rica em leucina; GPR49, GPR67); (44) RET (ret proto-oncogene; MEN?ZA; HSCR1; MEN2B; MTC1; PTC; CDHF12; Hs.168114; RET51; RET-ELE1); (45) LY6K (complexo de antígeno de linfócito 6, locus K; LY6K; HSJO01348; FLJ35226); (46) GPR19 (receptor 19 acoplado à proteína G; Mm.4787); (47) GPR54 (receptor KISS1; KISSIR; GPR54; HOT7T175; AXOR12); (48) ASPHD1 (domínio aspartato beta- hidroxilase contendo 1; LOC253982); (49) Tirosinase (TYR; OCAIA; OCAT1A; tirosinase; SHEP3); (50) TMEM118 (proteína de dedo anelar, transmembrana 2; RNFT2; FLJ14627); (51) GPR172A (receptor 172A acoplado à proteína G; GPCR41; FLJ11856; D1ISErtd747e); (52) CD33; (53) CLL-1; (54) CD70 (ligante CD27; CD27-L); (55) CLDN18.2 (Variante 2 de Splice Claudina-18); (56) CD151 (Cluster de diferencia- ção 151, Tspan24, PETA-3, SFA-1); (57) ITGaV (integrina alfa-V, CD51; MSK8; VNRA; VTNR); (58) Nectin-4; (59) FGFR2; (60) FGFR3; (61) goNMB; (62) GUCY2C; (63) CLDNG6; (64) cMET; (65) CEACAMA; (66) CEACAMS5; (67) CD29; (68) CD37; (69) CD352; (70) CD248; (71) MUC1; (72) CD123; (73) BCMA; (74) ADAMS9; (75) 5T4; (76) P- caderina; (77) CA9; (78) CD138; (79) CD166; (80) CD71; (81) CD22; (82) CD20; (83) CD74; (84) DLL3; (85) Receptor de Folato alfa; (86) ITGa2; (87) ITGa3; (88) LAMP1; (89) LIV-1; (90) MMP14; (91) LRCC15; (92) MSLN; (93) PMSA; (94) PRLR; (95) PTK7; (96)
SLAMF7; (97) SCL44A4; (98) SLTRK5; (99) TM4SF1; e (100) TROP2.
[00136] Em certas modalidades exemplares da invenção, o anticor- po é ligado através de um polipeptídeo contendo Fc ou Fab manipula- do com uma etiqueta contendo glutamina doadora de acil (por exem- plo, etiquetas Q ou etiquetas peptídicas contendo Gln) ou uma gluta- mina endógena feita reativa (ou seja, a capacidade de formar uma |i- gação covalente como um doador de acil na presença de uma amina e uma transglutaminase) por manipulação de polipeptídeos (por exem- plo, via deleção de aminoácidos, inserção, substituição, mutação ou qualquer combinação destes no polipeptídeo), na presença de trans- glutaminase.
[00137] Em certas modalidades, a presente invenção refere-se a qualquer um dos conjugados anticorpo-fármaco mencionados acima e definições correspondentes, em que o conjugado anticorpo-fármaco compreende entre 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 compostos da inven- ção. Em certas modalidades exemplares, o conjugado anticorpo- fármaco compreende 1, 2, 3 ou 4 compostos da invenção.
[00138] O número de toxinas covalentemente ligadas a um anticor- po pode variar de acordo com o composto tóxico específico e o anti- corpo. Em uma modalidade, 1 a 4 toxinas estão ligadas. Em outra mo- dalidade, de cerca de 1 a cerca de 4 toxinas estão ligadas. Em uma outra modalidade, de cerca de 1 a cerca de 6 toxinas estão ligadas. Nas modalidades em que mais de uma toxina está ligada, o anticorpo (Ab) de Fórmula (Ill) possui várias unidades T-L'- ligadas covalente- mente a ele.
[00139] A carga (razão fármaco/anticorpo) de um conjugado fárma- co/anticorpo pode ser controlada de diferentes formas, e, por exemplo, por: (i) limitação do excesso molar do composto de Formula (11) do in- termediário fármaco-ligante em relação ao anticorpo, (ii) limitação da reação de conjugação tempo ou temperatura, e (ili) condições reduto-
ras parciais ou limitantes para a modificação de cisteína tiol.
[00140] Deve ser entendido que onde mais de um grupo nucleofílico reage com uma fármaco, então o produto resultante é uma mistura de compostos conjugados anticorpo-fármaco de Fórmula (Ill) com uma distribuição de uma ou mais porções de fármacos ligadas a um anti- corpo. O número médio de fármacos por anticorpo pode ser calculado a partir da mistura por um ensaio de anticorpo de ELISA duplo, que é específico para anticorpo e específico para a fármaco. As moléculas de anticorpo-fármaco conjugadas individuais podem ser identificadas na mistura por espectroscopia de massa e separadas por HPLC, por exemplo, cromatografia de interação hidrofóbica (ver, por exemplo, McDonagh, et al., Prot. Engr. Design Sel., 2006, 19(7):299-307; Ham- blett et al., Clin. Cancer Res., 2004, 10:7063-7070; Hamblett, K.J., et al. “Effect of drug loading on the pharmacology, pharmacokinetics, and toxicity of an anti-CD30 antibody-drug conjugate,” Resumo No. 624, American Association for Cancer Research, Reunião Anual de 2004, 27-31 de Março, 2004, Anais da AACR, Volume 45, Março de 2004; Alley, S.C., et al., “Controlling the location of drug attachment in anti- body-drug conjugates,” Resumo No. 627, American Association for Cancer Research, Reunião Anual de 2004, 27-31 de Março, 2004, Anais AACR, Volume 45, Março de 2004). Em determinadas modali- dades, um conjugado anticorpo-fármaco homogêneo com um valor de carga único pode ser isolado da mistura de conjugação por eletrofore- se ou cromatografia. Ensaios de Proliferação de Células in vitro
[00141] Os compostos citotóxicos de fármacos e os conjugados fármaco-anticorpo da invenção podem ser avaliados quanto à sua ca- pacidade para suprimir a proliferação de várias linhagens celulares de câncer in vitro.
[00142] Geralmente, a atividade citotóxica ou citostática de uma fármaco citotóxica ou ADC é medida por: exposição de células de mamíferos com proteínas receptoras, por exemplo, HER2, ao anticor- po do ADC em um meio de cultura celular, cultivando as células por um período de cerca de 6 horas a cerca de 5 dias e medição da viabi- lidade celular. Ensaios in vitro baseados nas célula foram usados para medir a viabilidade (proliferação), citotoxicidade e indução de apoptose (ativação de caspase) do ADC da invenção.
[00143] Por exemplo, a potência in vitro de um fármaco citotóxico ou ADC é medida por um ensaio de proliferação celular. O Ensaio de Viabilidade Celular Luminescente CellTiter-Gloº é um método de en- saio homogêneo comercialmente disponível (Promega Corp., Madison, WI) com base na expressão recombinante de Coleoptera luciferase (Patentes US 5.583.024; 5.674.713; e 5.700.670). Este ensaio de proli- feração celular determina o número de células viáveis na cultura com base na quantificação do ATP presente, um indicador de células me- tabolicamente ativas (Crouch, et al., J. Immunol. Meth., 1993, 160: 81- 88; Patente US No. 6.602.677). O ensaio de CellTiter-Gloº é conduzi- do em formato de 96 poços, tornando-se passível de triagem automa- tizada de elevado rendimento ("high-throughput screening", HTS) (Cree et al., AntiCancer Drugs, 1995, 6 :398-404). O procedimento de ensaio homogêneo envolve a adição de reagente único (Reagente de CellTiter-Gloº) diretamente nas células cultivadas em meio suplemen- tado por soro. Lavagem de célula, remoção do meio e várias etapas de pipetagem não são necessários. O sistema detecta tão pouco quanto células/poço em um formato 384 poços em 10 minutos após a adi- ção de reagentes e mistura. As células podem ser tratadas continua- mente com compostos de fármacos citotóxicas ou ADC, ou podem ser tratadas e separadas a partir de compostos de fármacos citotóxicas ou ADC. Geralmente, as células tratadas rapidamente, ou seja, por 3 ho- ras, mostraram os mesmos efeitos de potência como as células conti-
nuamente tratadas. Eficácia in vivo
[00144] A eficácia in vivo de um fármaco citotóxico ou ADC da in- venção pode ser testada por estudos de xenoenxerto tumoral em ca- mundongos para medir a potência dependente do alvo e dependente da dose na inibição do crescimento do tumor. A eficácia da fármaco citotóxica ou ADC pode estar correlacionada com a expressão do antí- geno-alvo das células tumorais.
[00145] A eficácia da fármaco citotóxica ou ADC é medida in vivo implantando aloenxertos ou xenoenxertos de células cancerígenas em roedores e tratando os tumores com o fármaco citotóxico ou ADC. Os resultados variáveis devem ser esperados dependendo da linhagem celular, a dose do fármaco citotóxico, a especificidade da ligação do anticorpo do ADC aos receptores presentes nas células cancerosas, regime de dosagem e outros fatores. A eficácia in vivo do fármaco cito- tóxico ou ADC pode ser medida usando um modelo de camundongo explante transgênico que expressa níveis moderados a altos de um antígeno associado a um tumor, incluindo KPL4 que expressa Her2 e BJAB que expressa CD22. Os sujeitos foram tratados uma vez com o fármaco citotóxico ou ADC e monitorados durante várias, por exemplo, 3-6 semanas para medir o tempo de duplicação de tumores, calcular a morte celular e encolhimento do tumor. Experimentos de respostas a dose e de múltiplas doses podem ser conduzidos em seguida.
[00146] Por exemplo, a eficácia in vivo de um ADC anti-HER2 da invenção pode ser medida por um modelo de camundongo de explante transgênico HER2 de expressão elevada (Phillips et al., Cancer Res., 2008, 68: 9280-90). Um aloenxerto é propagado a partir do camun- dongo transgênico Fo5 mmtv que não responde ou responde mal à terapia de HERCEPTINAG (Genentech, Inc.). Os sujeitos são tratados uma vez ou mais com ADC em certos níveis de dose (mg/kg) e contro-
le de tampão placebo (Veículo) e monitorados por duas semanas ou mais para medir o tempo de duplicação do tumor, calcular a morte ce- lular e encolhimento do tumor. Composições Farmacêuticas e Métodos de Administração
[00147] Em outras modalidades, outro aspecto da invenção se rela- ciona a composições farmacêuticas ou formas de dosagem incluindo uma quantidade eficaz de um composto da invenção e/ou conjugado anticorpo-fármaco desta e um carreador ou veículo farmaceuticamente aceitável.
[00148] As presentes composições farmacêuticas podem estar em qualquer forma que permita que a composição seja administrada a um paciente. Por exemplo, a composição farmacêutica pode ser na forma de um sólido ou líquido. As vias de administração típicas incluem, sem limitação, parentérica, ocular e intra-tumoral. Administração parentéri- ca inclui injeções subcutâneas, intravenosas, intramusculares, intras- ternais e técnicas de infusão. Em um aspecto, as composições são administradas por via parentérica. Em uma modalidade específica, as composições são administradas por via intravenosa.
[00149] As composições farmacêuticas podem ser formuladas de modo a permitir que um composto da invenção e/ou seu conjugado seja biodisponível ao ser administrada a composição a um paciente. As composições podem assumir a forma de uma ou mais unidades de dosagem, onde, por exemplo, um comprimido pode ser uma unidade de dosagem única, e um recipiente de um composto da invenção e/ou seu conjugado anticorpo-fármaco na forma líquida pode conter uma pluralidade de unidades de dosagem.
[00150] O carreador ou veículo farmaceuticamente aceitável pode ser sólido ou particulado, para que as composições farmacêuticas se- jam, por exemplo, em forma de comprimido ou pó. O(s) carreadore(s) pode(m) ser líquido(s). Além disso, o(s) carreadore(s) pode(m) ser par-
ticulado(s).
[00151] A composição pode estar na forma de um líquido, por exemplo, uma solução, emulsão ou suspensão. Em uma composição para administração por injeção, um ou mais de um surfactante, con- servante, agente umectante, agente dispersante, agente de suspen- são, tampão, estabilizante e agente isotônico também pode ser incluí- do.
[00152] As composições líquidas, sejam elas soluções, suspensões ou outras formas afins, podem também incluir um ou mais dos seguin- tes: diluentes esterilizados como água para injeção, solução salina, preferencialmente soro fisiológico, solução de Ringer, cloreto de sódio isotônico, óleos fixos como mono ou diglicerídeos sintéticos que po- dem servir como o meio solvente ou de suspensão, polietileno glicóis, glicerina, ciclodextrina, propileno glicol ou outros solventes; agentes antibacterianos como álcool benzílico ou metil parabeno; antioxidantes como ácido ascórbico ou bissulfito de sódio; agentes quelantes como ácido etilenodiaminotetracélico; tampões como acetatos, citratos, fos- fatos ou aminoácidos e agentes para o ajuste da tonicidade como clo- reto de sódio ou dextrose. Uma composição parenteral pode ser colo- cada em ampolas, seringas descartáveis ou frascos de doses múltiplas de vidro, plástico ou outro material. Soro fisiológico é um adjuvante exemplar. Uma composição injetável é preferencialmente estéril.
[00153] A quantidade de um composto da invenção e/ou seu conju- gado anticorpo-fármaco desta que é eficaz no tratamento de um dis- túrbio ou condição particular dependerá da natureza do distúrbio ou condição e pode ser determinada por técnicas clínicas padrão. Além disso, ensaios in vitro ou in vivo podem ser empregados para ajudar a identificar os intervalos ideais de dosagem. A dose precisa a ser utili- zada nas composições também dependerá da via de administração e deve ser decidida de acordo com o julgamento do médico e as circuns-
tâncias de cada paciente. O nível de dose específico para qualquer indivíduo em particular dependerá de uma variedade de fatores, inclu- indo a atividade do composto ou conjugado anticorpo-fármaco, idade, peso corporal, saúde física e mental geral, fatores genéticos, influên- cias ambientais, sexo, dieta, tempo administração, via de administra- ção, taxa de excreção e gravidade do problema específico que está sendo tratado.
[00154] As composições compreendem uma quantidade eficaz de um composto da invenção e/ou seu conjugado anticorpo-fármaco, de modo que seja obtida uma dosagem adequada. Tipicamente, esta quantidade é pelo menos cerca de 0,01% de um composto da inven- ção e/ou seu conjugado anticorpo-fármaco em peso da composição. Em uma modalidade exemplar, as composições farmacêuticas são preparadas de modo que uma unidade de dosagem parenteral conte- nha de cerca de 0,01% a cerca de 2% em peso da quantidade de um composto da invenção e/ou seu conjugado anticorpo-fármaco.
[00155] Para administração intravenosa, a composição pode com- preender de cerca de 0,01 a cerca de 100 mg de um composto da in- venção e/ou seu conjugado anticorpo-fármaco por kg de peso corporal do paciente. Em um aspecto, a composição pode incluir de cerca de 1 a cerca de 100 mg de um composto da invenção e/ou seu conjugado anticorpo-fármaco por kg de peso corporal do paciente. Em outro as- pecto, a quantidade administrada estará na faixa de cerca de 0,1 a cerca de 25 mg/kg de peso corporal de um composto da invenção e/ou seu conjugado anticorpo-fármaco.
[00156] Geralmente, a dosagem de um composto da invenção e/ou seu conjugado anticorpo-fármaco administrado a um paciente é tipi- camente de cerca de 0,01 mg/kg a cerca de 20 mg/kg do peso corpo- ral do paciente. Em um aspecto, a dosagem administrada a um paci- ente está entre cerca de 0,01 mg/kg a cerca de 10 mg/kg do peso cor-
poral do paciente. Em outro aspecto, a dosagem administrada a um paciente está entre cerca de 0,1 mg/kg e cerca de 10 mg/kg do peso corporal do paciente. Em ainda outro aspecto, a dosagem administra- da a um paciente está entre cerca de 0,1 mg/kg e cerca de 5 mg/kg do peso corporal do paciente. Em ainda outro aspecto, a dosagem admi- nistrada está entre cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 3 mg/kg do peso corporal do paciente. Em um outro aspecto, a dosagem administrada está entre cerca de 1 mg/kg a cerca de 3 mg/kg do peso corporal do paciente.
[00157] Em modalidades específicas, pode ser desejável adminis- trar um ou mais compostos da invenção e/ou seus conjugados anticor- po-fármaco desta localmente na área que precisa de tratamento. Isto pode ser conseguido, por exemplo, e não à título de limitação, por in- fusão local durante cirurgia, aplicação tópica, por exemplo, em conjun- to com um curativo após cirurgia, por injeção, por meio de um cateter; ou por meio de um implante, em que o implante é de um material po- roso, não-poroso, ou gelatinoso, incluindo membranas, como mem- branas silásticas, ou fibras. Em uma modalidade, a administração po- de ser por injeção direta em um local (ou antigo local) de um câncer, tumor ou tecido neoplásico ou pré-neoplásico. Em outra modalidade, a administração pode ser por injeção direta no local (ou local anterior) de uma manifestação de uma doença autoimune.
[00158] Em ainda outra modalidade, o composto da invenção e/ou seu conjugado anticorpo-fármaco pode ser transmitido em um sistema de liberação controlada, tal como, mas não limitado a, uma bomba ou vários materiais poliméricos podem ser usados. Em ainda outra moda- lidade, um sistema de liberação controlada pode ser colocado próximo do alvo do composto da invenção e/ou seu conjugado anticorpo- fármaco, por exemplo, o fígado, exigindo assim apenas uma fração da dose sistêmica.
[00159] O termo "carreador" refere-se a um diluente, adjuvante ou excipiente, com o qual é administrado um composto ou seu conjugado anticorpo-fármaco. Esses carreadores farmacêuticos podem ser líqui- dos, como água e óleos, incluindo aqueles de origem petrolífera, ani- mal, vegetal ou sintética. Os carreadores podem ser solução salina e afins. Além disso, agentes auxiliares, estabilizadores e outros podem ser usados. Em uma modalidade, quando administrado a um paciente, o composto ou o conjugado e os carreadores farmaceuticamente acei- táveis são estéreis. A água é um carreador exemplar quando o com- posto ou o conjugado são administrados por via intravenosa. Soluções salinas e soluções de glicerol e dextrose aquosa também podem ser empregadas como carreadores líquidos, particularmente para soluções injetáveis. As presentes composições, se desejado, também podem conter quantidades menores de agentes umidificantes ou emulsifican- tes, ou agentes de tamponamento de pH.
[00160] Em uma modalidade, o composto da invenção e/ou seu conjugado anticorpo-fármaco são formulados de acordo com procedi- mentos conhecidos por versados na técnica para a fabricação de uma composição farmacêutica adaptada para administração intravenosa. Normalmente, os carreadores ou veículos para a administração intra- venosa são soluções tamponadas aquosas isotônicas estéreis. Sem- pre que necessário, as composições também podem incluir um agente solubilizante. As composições para administração intravenosa podem opcionalmente compreender um anestésico local, tal como lidocaína para aliviar a dor no local da injeção. Geralmente, os ingredientes são fornecidos separadamente ou misturados em forma de unidade de do- sagem, por exemplo, como um pó seco liofilizado ou concentrado sem água em um recipiente hermeticamente vedado, tal como uma ampola indicando a quantidade do agente ativo. Quando um composto da in- venção e/ou seu conjugado anticorpo-fármaco é para ser administrado por infusão, ele pode ser dispensado, por exemplo, com uma garrafa de infusão contendo água ou solução salina estéril de grau farmacêuti- co. Quando o composto da invenção e/ou seu conjugado anticorpo- fármaco é administrado por injeção, uma ampola de água estéril para injeção ou solução salina pode ser fornecida para que os ingredientes possam ser misturados antes da administração.
[00161] Seja na forma sólida ou líquida, as presentes composições podem incluir um(ns) agente(s) terapêutico(s) adicional(ais) usado(s) no tratamento de câncer. Por exemplo, os compostos ou seus conju- gados anticorpo-fármaco podem ser administrados em combinação com, incluindo anticorpos, agentes alquilantes, inibidores de angiogê- nese, antimetabólitos, clivadores de DNA, reticuladores de DNA, inter- caladores de DNA, ligantes de sulco menores de DNA, enediinos, ini- bidores da proteína 90 de choque térmico, inibidores de histona desa- cetilase, imunomoduladores, estabilizadores de microtúbulos, análo- gos de nucleosídeo (purina ou pirimidina), inibidores de exportação nuclear, inibidores de proteassoma, inibidores de topoisomerase (| ou II), inibidores de tirosina quinase e inibidores de serina/treonina qui- nase. Agentes terapêuticos específicos incluem adalimumabe, ansami- tocina P3, auristatina, bendamustina, bevacizumabe, bicalutamida, bleomicina, bortezomibe, bussulfano, calistatina A, camptotecina, ca- pecitabina, carboplatina, carmustina, cetuximabe, cisplatina, cladribina, citarabina, criptoficinas, dacarbazina, dasatinibe, daunorrubicina, doce- taxel, doxorrubicina, duocarmicina, dinemicina A, epotilonas, etoposí- deo, floxuridina, fludarabina, 5-fluorouracil, gefitinibe, gencitabina, ipi- limumabe, hidroxiureia, imatinibe, inflixóimabe, interferons, interleuci- nas, beta-lapacona, lenalidomida, irinotecano, maitansina, meclioreta- mina, melfalano, 6-mercaptopurina, metotrexato, mitomicina C, nilotini- be, oxaliplatina, paclitaxel, procarbazina, ácido hidroxâmico de sube- roilanilida (SAHA), 6-tioguanidina, tiotepa, teniposídeo, topotecano,
trastuzumabe, tricostatina A, vinblastina, vincristina e vindesina. Usos Terapêuticos de Compostos e Conjugados Anticorpo-Fármaco
[00162] Outro aspecto da invenção refere-se a um método de utili- zação dos compostos da invenção, seus conjugados anticorpo- fármaco e suas composições farmacêuticas para o tratamento de cân- cer. Em certas modalidades, os conjugados fornecem direcionamento para fármacos contra o câncer ou tumor específico da conjugação, re- duzindo assim a toxicidade geral dos compostos da invenção. Em ou- tra modalidade, a unidade de anticorpo se liga à célula tumoral ou cé- lula cancerosa. Em outra modalidade, a unidade de anticorpo se liga a uma célula tumoral ou antígeno de célula cancerígena que está na su- perfície da célula tumoral ou célula cancerígena. Em outra modalidade, a unidade de anticorpo se liga a uma célula tumoral ou antígeno de célula cancerígena que é uma proteína da matriz extracelular associa- da à célula tumoral ou célula cancerígena. A especificidade da unidade de anticorpo para uma célula tumoral ou célula cancerosa específica pode ser importante para determinar os tumores ou cânceres que são tratados com mais eficácia.
[00163] Tipos particulares de cânceres que podem ser tratados com um composto da invenção e/ou seu conjugado anticorpo-fármaco in- cluem, mas não limitados a, carcinomas da bexiga, mama, colo do úte- ro, cólon, endométrio, rim, pulmão, esôfago, ovário próstata, pâncreas, pele, estômago e testículos; e cânceres de origem no sangue, incluin- do, mas não limitados a, leucemias e linfomas.
[00164] Em um aspecto, um conjugado anticorpo-fármaco fornecido neste documento é usado em um método de inibição da proliferação de uma célula cancerígena, o método compreendendo a exposição da célula ao conjugado anticorpo-fármaco sob condições permissivas pa- ra a ligação do anticorpo ouconjugado anticorpo-fármaco a um antíge- no associado ao tumor na superfície da célula, inibindo assim a prolife-
ração da célula. Em determinadas modalidades, o método é um méto- do in vitro ou in vivo. Em outras modalidades, a célula é um linfócito, linfoblasto, monócito ou célula mielomonócita.
[00165] Em outro aspecto, é fornecido um composto de fármaco citotóxica ou ADC para uso como medicamento. Em aspectos adicio- nais, é fornecido um composto de fármaco citotóxica ou ADC para uso em um método de tratamento. Em certas modalidades, é fornecido um composto de fármaco citotóxica ou ADC para uso no tratamento de câncer. Em certas modalidades, a invenção fornece um composto de fármaco citotóxico ou ADC para uso em um método de tratamento de um indivíduo compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz do composto de fármaco citotóxica ou ADC. Em uma referida modalidade, o método compreende ainda a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de pelo menos um agente terapêutico adici- onal, por exemplo, conforme descrito neste documento.
[00166] Em um aspecto adicional, a invenção fornece o uso de um composto de fármaco citotóxica ou ADC na fabricação ou preparação de um medicamento. Em uma modalidade, o medicamento é para tra- tamento de câncer, o método compreendendo a administração a um indivíduo com câncer de uma quantidade eficaz do medicamento. Em uma referida modalidade, o método compreende ainda a administra- ção ao indivíduo de uma quantidade eficaz de pelo menos um agente terapêutico adicional, por exemplo, conforme descrito neste documen- to.
[00167] Em um outro aspecto, a invenção fornece um método para o tratamento de câncer. Em uma modalidade, o método compreende a administração a um indivíduo com o referido câncer, caracterizado pe- la detecção de um antígeno que expressa um associado ao tumor, uma quantidade eficaz de um conjugado anticorpo-fármaco da inven- ção. Em uma referida modalidade, o método compreende adicional-
mente administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de pelo menos um agente terapêutico adicional, conforme descrito abaixo.
[00168] Os compostos de fármacos citotóxicos ou ADC da invenção podem ser utilizados sozinhos ou em combinação com outros agentes em uma terapia. Por exemplo, um composto de fármaco citotóxico ou ADC da invenção pode ser co-administrado com pelo menos um agen- te terapêutico adicional, como um agente quimioterapêutico.
[00169] Essas terapias de combinação observadas acima abran- gem a administração combinada (onde dois ou mais agentes terapêu- ticos estão incluídos nas mesmas formulações ou formulações sepa- radas), e a administração separada, em cujo caso, a administração do composto de fármaco citotóxica ou ADC da invenção pode ocorrer an- tes, simultaneamente, e/ou após, a administração do agente terapêuti- co adicional e/ou adjuvante. Os compostos de fármacos citotóxicos ou ADC da invenção também podem ser utilizados em combinação com terapia de radiação.
[00170] Um composto de fármaco citotóxica ou ADC da invenção (e qualquer agente terapêutico adicional) pode ser administrado por qualquer meio adequado, incluindo parenteral, intrapulmonar e intra- nasal e, se desejado para tratamento local, administrada por meio in- tralesional. As infusões parentéricas incluem a administração intra- muscular, intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal ou subcutânea. Dosagem pode ser por qualquer rota apropriada, por exemplo inje- ções, como injeções intravenosas ou subcutâneas, dependendo em parte se a administração é breve ou crônica. São contemplados neste documento muitos esquemas de dosagem incluindo, mas não se limi- tando a administrações únicas ou múltiplas durante vários momentos, a administração em bolus e a infusão em pulso.
[00171] Os seguintes exemplos são oferecidos a título de ilustração e não a título de limitação.
EXEMPLOS Procedimentos Experimentais Sintéticos
[00172] Os experimentos são geralmente realizadas sob atmosfera inerte (nitrogênio ou argônio), particularmente nos casos em que são utilizados reagentes ou intermediários sensíveis ao oxigênio ou à umi- dade. Solventes e reagentes comerciais são geralmente usados sem purificação adicional, incluindo solventes anidros, quando apropriado. Os dados de espectrometria de massa são relatados a partir de cro- matografia líquida-espectrometria de massa (LCMS) ou ionização química de pressão atmosférica (APCI). Os deslocamentos químicos dos dados de ressonância magnética nuclear (RMN) são expressos em partes por milhão (ppm, 5) referenciados aos picos residuais dos solventes deuterados empregados.
[00173] Em geral, as reações são seguidas por cromatografia em camada fina, LCMS ou HPLC, e submetidas a tratamento quando apropriado. As purificações podem variar entre os experimentos: em geral, os solventes e as proporções de solventes usadas para eluen- tes/gradientes são escolhidos para fornecer tempos de retenção apro- priados. A menos que especificado de outro modo, as frações de HPLC de fase reversa são concentradas por liofilização/criodesseca- ção. Os compostos intermediários e finais são armazenados a (0ºC) ou à temperatura ambiente em frascos ou balões fechados sob nitro- gênio.
[00174] “Procedimento Geral A1. Preparação de Compostos de Toxina Analógica de Tailanestatina. A primeira etapa na preparação dos compostos da invenção com os grupos R descritos acima envolve o acoplamento de um ácido carboxílico contendo o grupo R, Fórmula (IV), ao amino pirano (Composto 8) para produzir a amida intermediá- ria Fórmula (V).
R. O. Praia R. O. > EDC Ca Formula (IV) 8 Formula (V)
[00175] —N-metilmorfolina (NMM) (0,12 mL, 1,0 mmol, 6,0 equiv), 1- etil-3- (dimetilaminopropil)carbodiimida (EDCI) (196 mg, 1,0 mmol, 6,0 equiv) e uma solução de Fórmula ácida (IV) (108 mg, 0,68 mmol, 2,0 equiv) em diclorometano (0,6 mL) foram adicionados sequencialmente a uma solução agitada de amina 8 dissolvida em diclorometano (5 mL) a 25ºC. Após 2 h, a mistura de reação foi extinta com uma solução aquosa saturada de cloreto de amônio (5,0 ml) e as fases foram sepa- radas. A camada aquosa foi extraída com EtOAc (3 x 2 ml) e as cama- das orgânicas combinadas foram secas com sulfato de sódio anidro e concentradas in vacuo. O resíduo obtido foi purificado por cromatogra- fia em coluna rápida (sílica-gel, 10-30% de acetato de etila em hexa- nos) para fornecer a Fórmula de amida (V) (74 mg, 0,24 mmol, 73%) como um óleo incolor.
[00176] A amida intermediária de Fórmula (V) foi convertida na Fórmula (1), em que X é metila, essencialmente de acordo com o pro- cedimento descrito por A.K. Ghosh et al. (J. Org. Chem., 2018, 83(9):5187-5198). D> N HO" 9 H 9 (1)
[00177] Procedimento Geral A2. Preparação de Compostos de Toxina Analógica de Tailanestatina. Alternativamente, a primeira etapa na preparação dos compostos da invenção com os grupos R descritos acima envolve o acoplamento de um ácido carboxílico con- tendo o grupo R, Fórmula (IV), ao amino pirano (2R,3R,58,68S)-2,5- dimetil-6-((E)-3-metilpenta-2,4-dien-1-il)tetra-hidro-2H-piran-3-amina (Composto 8) para produzir a amida intermediária da Fórmula (V). À amida intermediária da Fórmula (V) é reagida com 2-((3R,58,7R,8R)- 8-hidróxi-7-vinil-1, 6-dioxaespiro[2.5]octan-5-il) acetato de metila (Com- posto 9) usando o Catalisador de 2a Geração de Grubb (catalisador de Grubb-ll para fornecer o composto de Fórmula (1), onde X é metil. Ro HaN TP Se NH Formula (IV) 8 Formula (V) + .o “EoocHs Catalisador de Grubb MOXICIO mo o H O: 9 Formula (1)
[00178] O composto 8 (2 equiv.) E o ácido carboxílico de Fórmula (IV) (1 equiv.) Foram dissolvidos em tetra-hidrofurano (THF) e N,N- diisopropiletilamina (DIPEA) (8,3 equiv.) e T;PG& (anidrido propilfosfôni- co; 50% em acetato de etilo) (5 equiv.) foram adicionados à temperatu- ra ambiente. A mistura de reação foi agitada durante aproximadamen- te três horas até os materiais de partida serem consumidos como de- terminado por cromatografia em camada fina (TLC). A mistura foi con- centrada in vacuo para obter o produto bruto. O produto bruto foi puri- ficado por cromatografia em coluna para fornecer a amida intermediá- ria desejada de Fórmula (V).
[00179] A amida intermediária purificada de Fórmula (V) (1 equiv.) Foi dissolvida em diclorometano (DCM) e o Composto 9 (2 equiv.)e o catalisador Grubb-ll (3,3 equiv.) foram adicionados com agitação à temperatura ambiente sob atmosfera de argônio. A mistura foi agitada a 40ºC durante aproximadamente 5 horas até os materiais de partida serem consumidos como determinado por TLC. A mistura de reação foi filtrada através de um filtro de celite e lavada com DCM. O solvente foi removido in vacuo para obter o produto bruto, o qual foi purificado por HPLC preparativa para fornecer o composto de Fórmula (1).
[00180] “Procedimento Geral B1. Preparação de Compostos Ligan- tes de Toxina o WA N HO" DIEA o (1)
O COST SS N HO" O H º (11)
[00181] A síntese dos compostos ligantes de toxina da invenção com os grupos R descritos acima envolve a formação de uma ligação amida entre a porção de ácido carboxílico na Fórmula (1) e uma amina no Ligante escolhido para fornecer a Fórmula (Il).
[00182] Uma mistura de toxina de Fórmula (1) (0,47 mmol, 1,0 eq), 3-óxido hexafluorofosfato de 1-[bis(dimetilamino)metileno]-1H-1,2,3- triazolo[4,5-b]piridínio (HATU ) (0,58 mmol, 1,2 eq) e DIEA (base Hu- nigs, 0,1 mL) em DMF (2,0 mL) é agitada à temperatura ambiente du- rante 60 min. À mistura foi adicionado o ligante (0,50 mmol, 1,06 eq) juntamente com DIEA (base de Hunigs) (0,1 mL). A mistura resultante é agitada durante 30 minutos. A reação é submetida a tratamento aquoso. O produto de Fórmula (II) desejado contendo a toxina acoplada ao ligan- te é obtido por purificação adicional por cromatografia rápida.
[00183] “Procedimento Geral B2. Preparação de Compostos Li- gantes de Toxina. Alternativamente, a síntese dos compostos ligantes de toxinas da invenção com os grupos R e L acima descritos pode ser preparada como mostrado no Esquema (1), Esquema (Il) ou Esquema (11).
Esquema (|) o od . : O NA NãO CooMe LIOHH2O D “cooL OH Ho” TI v — THF:H,O,16 h Ho DCC, THF o o o Terc-butil-idroperóxido o (5,5 M em decano) O.
O,, - O >= É N so oÉ Acetoacetonato de vanadila : “ ” DCM, RT, 26 h HO" > o o O. aa R o HN o FPRARIO 3 OA SS So R 7“ ——n—— TX HO" o Catalisador de Grubb Il (0.2 eq) RARO o DCM, 409raus — C,6h Esquema (Il) o A NH o AA o “Ss 1 NH2 So R . o > HN HO" ÓÕ HATU, DIEA SeÀÃo o DMF, RT, 6h H o o ASA SA o WÃÃo Esquema (Ill) o o Id o ANA Oo O HoN o s O DS o TFA WÃo (2)
o Am O. N oH
[00184] “Procedimento Geral C1. Preparação de Conjugados An- ticorpo-Fármaco. O anticorpo terapêutico disponível comercialmente (Ab) é dializado em Solução Salina Tamponada com Fosfato de Dul- becco (DPBS, Lonza). O anticorpo dialisado (5-10 mg/mL) é então re- agido com o composto de ligação à toxina da Fórmula (11) (3-12 equi- valentes) 10 mM em dimetilsulfóxido (DMSO)) contendo o éster de N- hidroxissuccinimida reativo ou a maleimida à temperatura ambiente durante 2 h em 50 mM tampão de borato a pH 8,7. Em alguns casos, 50 mM tampão de borato a pH 8,7, é substituído pela Solução Salina Tamponada com Fosfato da Dulbecco (DPBS, Lonza). Em alguns ca- sos, para melhorar a solubilidade/reatividade da toxina de ligante, é adicionada dimetilacetamida (DMA) ou DMSO para obter 10-15% (v/v) do componente de solvente orgânico total na mistura de reação final. À mistura de reação é então trocada de tampão para DPBS (pH 7,4) usando as colunas de troca de tampão GE Healthcare Sephadex G-25 M de acordo com as instruções do fabricante. O material bruto é purifi- cado por cromatografia de exclusão por tamanho (SEC) usando um sistema GE AKTA Explorer com uma coluna GE Superdex 200 e elu- ente DPBS (pH 7,4). A fração de monômero agrupada de AKTA é en- tão concentrada e trocada de tampão para 10 mM tampão de succina- to de sódio, trealose a 5,4% a pH 5,1 usando colunas de troca de tam- pão Sephadex G-25M da GE Healthcare, de acordo com as instruções do fabricante. A Fórmula ADC (Ill) é ainda caracterizada através da cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) para espectrometria de massa em tandem de ionização-eletropulverização por cromatografia líquida e pureza (LC-ESI MS) para calcular a razão fármaco-anticorpo (carregamento). A concentração de proteína é determinada via espec-
trofotômetro UV.
[00185] Procedimento Geral C2. Preparação Alternativa de Con- jugados Anticorpo-Fármaco. Alternativamente, após redução e reo- xidação para preparar a conjugação, um anticorpo manipulado por cis- teína é dissolvido em tampão PBS (solução salina tamponada com fosfato) e resfriado em gelo. Um excesso, de cerca de 1,5 molar a 20 equivalentes de um intermediário de ligante de fármaco de acordo com a Fórmula (Il), ativado com um grupo reativo a tiol, como dissulfeto de piridila, maleimida ou bromoacetamida, é dissolvido em DMSO, diluído em acetonitrila e água e adicionado ao anticorpo resfriado, reduzido e reoxidado em PBS. Tipicamente, o ligante da fármaco é adicionado a partir de um estoque de DMSO a uma concentração de cerca de 20 mM em 50 mM Tris a pH 8, ao anticorpo e monitorado até a reação estar concluída de cerca de 1 a cerca de 24 horas, conforme determi- nado pela análise por LC-MS da mistura de reação. Quando a reação está completa, um excesso de um reagente de capping, como malei- mida de etila, é adicionado para extinguir a reação e cobrir qualquer grupo de tiol de anticorpo que não reagiu. A mistura de conjugação pode ser carregada e eluída através de uma coluna HiTrap SP FF para remover o excesso de ligante dos fármacos e outras impurezas. A mis- tura de reação é concentrada por ultrafiltração centrífuga e o conjuga- do anticorpo-fármaco manipulado com cisteína é purificado e dessali- nizado por eluição através da resina G25 em PBS, filtrado através de filtros de 0,2 um sob condições estéreis e congelado para armazena- mento.
[00186] Por exemplo, o conjugado anticorpo-fármaco bruto é apli- cado a uma coluna de troca catiônica após diluição com 20 mM succi- nato de sódio a pH 5. A coluna é lavada com pelo menos 10 volumes de coluna de 20 mM succinato de sódio a pH 5, e o anticorpo foi eluído com PBS. Os conjugados anticorpo-fármaco são formulados em 20 mM de His/acetato a pH 5, com 240 mM sacarose usando colunas de filtração em gel. Os conjugados anticorpo-fármaco foram caracteriza- dos por espectroscopia de UV para determinar a concentração de pro- teína, SEC analítica (cromatografia de exclusão de tamanho) para análise de agregação e LC-MS antes e após o tratamento com Lisina C endopeptidase. Exemplo 1 Síntese de benzoato de (Z)-5-((2R, 3R, 5S, 6S)-6-((2E, 4E)-5-((3R, 4R, 5R, 7S)-4-hidróóxi-7-(2-metóóxi-2-0x0etil)-1,6-dioxaespiro[2.5] octan-5-il)-3-metilpenta-2,4-dienil)-2,5-dimetiltetra-hidro-2H-piran- 3-ilamino)-5-oxopent-3-en-2-ila, Composto 1
[00187] ParteA: o =4 mecmo — HA Ce Re. o —2 maeon Tr o En oc cone É DA, 1a Etapa 1 PA + Etapa 2 3a x Catalisador Lindiar o. Ox A TFA,DCM a COOoH Efapa 3 4a Etapa 4 5a
[00188] Etapa 1. 4-hidroxipent-2-inoato de terc-butila, Compos- to 2a. A uma solução de propiolato de terc-butil Composto 1a (10 9, 79,28 mmol) em THF (600 mL) foi adicionado LDA (2,0 M em THF) (43,6 mL, 87,20 mmol) a -78ºC. A mistura de reação foi agitada a - 78ºC durante 50 minutos e depois foi adicionado acetaldeído (4,45 ml, 79,28 mmol) gota a gota à mesma temperatura. A mistura de reação foi agitada à mesma temperatura durante 2 h. O progresso da reação foi monitorado por TLC (25% de EtOAc em éter de petróleo, RF=0,2, KMnOa.ativo) até o material de partida ser consumido. A mistura de re- ação foi extinta com solução de NH.CI sat. aq. (400 ml) e agitada du-
rante 20 min. O produto foi então extraído em éter dietílico (2 x 400 ml) e seco sobre sulfato de sódio anidro. O solvente foi removido sob pressão reduzida e o produto bruto foi isolado. O produto foi purificado por cromatografia em coluna (100-200 sílica-gel/eluente 20% EtOAc em éter de petróleo) para produzir o Composto 2a (7 g, 52%) como um líquido amarelo. *H RMN (400 MHz, DMSO-ds) 5 = 5,66 (d, J = 5,7 Hz, 1H), 4,50 (quin, J = 6,4 Hz, 1H), 1,43 (s, 9H), 1,32 (d, J = 6,6 Hz, 3H).
[00189] Etapa 2. Síntese de benzoato de 5-(terc-butóóxi)-5- oxopent-3-in-2-ila, Composto 3a. Uma solução do Composto 2a (2 9, 11,76 mmol) em DCM seco (60 mL) foi resfriada a -10ºC e, em segui- da, trietilamina (8,02 ml, 58,82 mmol) e DMAP (143 mg, 1,176 mmol) foram adicionadas. Após 5 minutos, cloreto de benzoílo (1,36 ml, 11,764 mmol) foi adicionado gota a gota à mistura de reação. A mistu- ra de reação foi aquecida à temperatura ambiente durante 2 h. O pro- gresso da reação foi monitorado por TLC (10% de EtOAc em éter de petróleo, RF = 0,5, UV e KMnO; ativo). Após a conclusão da reação, a mistura de reação foi diluída com DCM (200 ml) e depois lavada com água e solução de salmoura (1 x 60 ml) e seca sobre sulfato de sódio anidro. O solvente foi removido sob pressão reduzida e purificado por cromatografia em coluna (100-200 silica gel/eluente 6% EtOAc em éter de petróleo) para dar o Composto 3a (1,35 g, 42%) como um líquido gomoso amarelo. *H RMN (400 MHz, DMSO-ds) 5 = 7,99 (d, J = 7,5 Hz, 2H), 7,74 - 7,67 (m, 1H), 7,60 - 7,53 (m, 2H), 5,76 (q, J = 6,7 Hz, 1H), 1,62 (d, J = 6,8 Hz, 3H), 1,44 (s, 9H).
[00190] Etapa 3. Benzoato de 5-(terc-butóxi)-5-oxopent-3-en-2- ila, Composto 4a. A uma solução do Composto 3a (1 g, 3,64 mmol) em EtOAC:hexano (30 ml + 10 ml) foi adicionada quinolina (0,4 ml) e catalisador Lindlar (496 mg, 4,67 mmol) sob purga de argônio. Após 5 minutos de purga, a mistura de reação foi agitada sob pressão de ba- lão de hidrogênio por 3 h. O progresso da reação foi monitorado por
TLC (5% EtOAc em éter de petróleo, RF=0,3, UV e KMnO;. ativo). Após a conclusão da reação, a mistura de reação foi filtrada através de celite, o filtrado concentrado sob vácuo e o produto bruto isolado. O produto bruto foi purificado por cromatografia em coluna (100-200 síli- ca-gel, eluente 12% EtOAc em éter de petróleo) e concentrado e seco sob vácuo para dar o Composto 4a (600 mg, 60%) como um líquido amarelo. *H RMN (400 MHz, DMSO-ds) 5 = 7,97 (d, J = 7,5 Hz, 2H), 7,70 - 7,63 (m, 1H), 7,57 - 7,49 (m, 2H), 6,39 - 6,27 (m, 2H), 5,79 (d, J = 10,3 Hz, 1H), 1,50 - 1,38 (m, 12H).
[00191] Etapa 4. Ácido (Z)-4-(benzoilóxi)pent-2-enoico, Compos- to 5a. A uma solução agitada do Composto 4a (600 mg, 2,173 mmol) em DCM seco (20 mL), foi resfriada a -10ºC e foi adicionado ácido tri- fluoroacético (2,4 ml) gota a gota à mistura de reação. A mistura de reação foi deixada aquecer até 25ºC e foi agitada durante 3 h. O pro- gresso da reação foi monitorado por TLC (30% EtOAc em éter de pe- tróleo, RF=0,15, UV e KMnO; ativo) até o material de partida ser con- sumido. Após a conclusão da reação, o produto bruto foi lavado com 50% éter dietílico em n-pentano (2 x 10 ml) e seco sob vácuo para produzir o Composto 5a (220 mg, 46%) como um sólido esbranquiça- do. *H RMN (400 MHz, DMSO-ds) 5 = 12,64 (br s, 1H), 7,97 (d, J=7,5 Hz, 2H), 7,70 - 7,64 (m, 1H), 7,57 - 7,50 (m, 2H), 6,44 - 6,32 (m, 2H), 5,84 (d, J = 10,7 Hz, 1H), 1,43 (d, J = 6,1 Hz, 3H); D2O(400 MHz, DMSO-ds) 5 = 8,01 - 7,94 (m, 2H), 7,70 - 7,63 (m, 1H), 7,58 - 7,51 (m, 2H), 6,44 - 6,34 (m, 2H), 5,89 - 5,83 (m, 1H), 1,44 (d, J = 6,1 Hz, 3H); LCMS: 95,41% (221,23, M+H), RT = 2,08 min.
[00192] ParteB:
OH O». Or. BF2.EO ' A pecou 22 Dimetoxipropano “lo DIBAL-H, DCM Xddo NHsoc Bor OMe Boc 1 Etapa 1 20 Etapa 2 30 Prometo! XLS pao sulfônico canforado TT As us O KOtBu, THF Boc Etapa 4 Bo AgzO, DMF, RT, 24h Etapa 3 4 Etapa 5 A D Grubbs Il o 0-0 Ô. C TIE TBHP, Ceite > ii) Po(OAc), BocHiTnA EX Etapa6 77 Etapa 7 EM
EO ma as nf Bo Etapa 8 Boct oh Etapa 9 100 * catalisador metacroleina o FO Et,SiH, CF,CH,OH o nitro-grela BF,EtO, DCM Ss ss PERES BocHW Etapa 11 o o 126 Etapa 10 116 Oo. FÊ o. OSÊ Ph3PCH:Br HN 2nBR(G5eM) | KOtBu, THF oo HoN Etapa 12 e 13b Etapa 13 c to 8
[00193] Etapa 1. (4S, 5R)-3-terc-butil 4-metil 2, 2, 5-trimetiloxa- zolidina-3,4-dicarboxilato, Composto 2b. Adicionou-se 2,2-dime- toxipropano (159,1 mL, 1285 mmol) a uma solução agitada do com- posto 1b (150 g, 642 mmol) em DCM (1500 mL) a 23ºC e dietil eterato de trifluoreto de boro (3,96 mL, 32,13 mmol) foi adicionado. A mistura de reação foi agitada a 23ºC durante 30 min. O progresso da reação foi monitorado por TLC (50% de EtOAc em hexano; Rr: 0,6, PMA visí- vel). Após a conclusão da reação, a mistura foi extinta com salmoura (1000 ml). A camada orgânica foi separada, seca sobre sulfato de só- dio anidro e depois filtrada e concentrada in vacuo para obter o produ- to bruto. O resíduo bruto foi purificado por cromatografia rápida (1 a 5% de EtOAc em hexanos) em sílica (malha 100-200) para fornecer o Composto 2b (145 g, 82,85%) como um óleo incolor. 1H RMN (400 MHz, clorofórmio-d) 5: 1,36 - 1,42 (m, 9 H) 1,48 (s, 3 H) 1,54 - 1,67 (m, 6 H) 3,76 (s, 3 H) 3,86 - 4,02 (m, 1 H) 4,07 - 4,19 (m, 1 H).
[00194] Etapa 2.(4S, 5R)-terc-butil 4-formil-2,2,5-trimetiloxazoli- dina-3-carboxilato, Composto 3b. A uma solução agitada do Com- posto 2b (130 g, 475,6 mmol) em tolueno seco (750 ml) a -78ºC foi adicionado DIBAL-H (1 min de tolueno) (713 ml, 713 mmol). Após a adição, a mistura foi agitada a -78ºC por mais 10 min e extinta por adi- ção lenta de MeOH frio (220 ml) a -78ºC. A emulsão branca resultante foi vertida em 1N HCI gelado (2000 ml) com agitação durante 15 min e a mistura aquosa foi então extraída com EtOAc (1000 ml x 2), seca sobre sulfato de sódio anidro, filtrada e concentrada in vácuo para ob- ter o produto bruto. O resíduo bruto foi purificado por cromatografia rápida (1 a 5% de EtOAc em hexanos) em sílica (mesh 100-200) para produzir o Composto 3b (100 g, 86,95%) como um óleo incolor. *H RMN (400 MHz, clorofórmio-d) 5: 1,36 (d, J=6,10 Hz, 3 H) 1,40 - 1,52 (m, 9 H) 1,57 - 1,72 (m, 6 H) 3,67 - 3,84 (m, 1 H) 4,02 - 4,10 (m, 1 H) 9,36 - 9,47 (m, 1 H).
[00195] Etapa 3.(4R, 5R)-terc-Butil 2, 2, 5-trimetil-4-viniloxazoli- dina-3-carboxilato, Composto 4b. A uma solução de brometo de me- tiltrifenilfosfônio (293 g, 822 mmol) em THF (750 ml) a 0ºC foi adicio- nado KOtBu (92 g, 822 mmol) em uma porção. A mistura resultante foi agitada durante uma hora à mesma temperatura, após o qual foi adici- onado o composto 3b (100 g, 411 mmol) em THF (250 ml) e a mistura foi agitada a 50ºC durante 12 h. O progresso da reação foi monitorado por TLC (10% de EtOAc em hexano, Rr: 0,5, PMA visível). Após resfri- amento até 23ºC, a mistura de reação foi extinta com solução saturada de NH4CI (1000 ml), extraída com EtOAc (1000 ml x 2). As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com salmoura (1000 ml), secas sobre sulfato de sódio anidro, filtradas e concentradas in vacuo para obter o composto bruto. O resíduo bruto foi purificado por cromatogra- fia rápida (1 a 5% de EtOAc em hexanos) em sílica (mesh 100-200) para fornecer o Composto 4b (80 g, 80,80%) como um óleo incolor. *H RMN (400 MHz, clorofórmio-d) 5 ppm 1,28 (d, J=5,99 Hz, 3 H) 1,38 - 1,49 (m, 9 H) 1,51 (s, 3 H) 1,56 - 1,63 (m, 3 H) 3,72 (br d, J=1,31 Hz, 1 H) 3,78 - 3,86 (m, 1 H) 5,16 (br d, J=7,85 Hz, 2 H) 5,66 (br d, J=6,43 Hz, 1 H).
[00196] Etapa 4. (3R, 4R)-4-hidroxipent-1-en-3-ilcarbamato de terc-butila, Composto 5b. À solução agitada do Composto 4b (80 g, 331,4 mmol) em MeOH (2,0 |) a 23ºC, foi adicionado ácido canforos- sulfônico (7,7 g, 33,14 mmol). A mistura de reação foi agitada a 23ºC durante 48 h. O progresso da reação foi monitorado por TLC (40% de EtOAc em hexano, Rr: 0,25, PMA visível). Após a conclusão, a mistura de reação foi extinta com solução saturada de NaHCO;3 (1000 ml) e a maior parte do solvente foi removida in vacuo. O resíduo aquoso foi extraído com EtOAc (1000 mL x 2). As camadas orgânicas combina- das foram lavadas com salmoura (1000 ml), secas sobre sulfato de sódio anidro, filtradas e concentradas in vacuo para obter o composto bruto. O resíduo bruto foi purificado por cromatografia rápida (10 — 40% EtOAc em hexanos) em sílica (mesh 100-200) para produzir o Composto 5b (58 g, 86,95%) como um óleo incolor. *H RMN (400 MHz, clorofórmio-d) 5 ppm 1,23 (d, J=6,32 Hz, 3 H) 1,46 (s, 9 H) 1,94 (br s, 1 H) 3,87 (br dd, J=5,99, 3,05 Hz, 1 H) 4,02 - 4,12 (m, 1 H) 4,87 (br s, 1 H) 5,21 - 5,26 (m, 1 H) 5,28 - 5,381 (m, 1 H) 5,84 (ddd, J=17,19,
10,49, 5,12 Hz, 1 H); LCMS: 94,36% (202,14, M+H), RT: 1,50 min.
[00197] Etapa 5. (3R, 4R)-4-(2-metilallilóxi)pent-1-en-3-ilcarba- mato de terc-butila, Composto 6b. À solução agitada do Composto 5b (40 g, 198,73 mmol) em DMF (250 ml) a 23ºC, foi adicionado bro- meto metalílico (107,3 g, 795,9 mmol). O balão foi embrulhado com folha de alumínio e foi adicionado óxido de prata (69 g, 298 mmol). A mistura de reação foi agitada a 23ºC durante 24 h. O progresso da re- ação foi monitorado por TLC (10% de EtOAc em hexano, Rr: 0,4, PMA visível). Após 24 h a 23ºC, a mistura de reação foi diluída com éter (500 mil), filtrada através de celite e lavada com éter adicional (500 ml). O filtrado foi então extraído com água (5 x 500 ml), salmoura (50 ml), seco sobre Na2SO. anidro, filtrado e concentrado in vacuo. O resíduo bruto foi purificado por cromatografia rápida (2,5 — 10% EtOAc em hexanos) em sílica (100-200 mesh) para gerar o Composto 6b (40,5 9, 79,88%) como um óleo incolor. *H RMN (400 MHz, clorofórmio-d) & ppm 1,16 (d, J=6,32 Hz, 3 H) 1,45 (s, 9 H) 1,68 - 1,77 (m, 3 H) 3,51 - 3,63 (m, 1 H) 3,75 - 3,86 (m, 1 H) 3,89 - 4,01 (m, 1 H) 4,12 (br d, J=7,08 Hz, 1 H) 4,79 - 4,91 (m, 2 H) 4,94 (d, J=0,87 Hz, 1 H) 5,09 - 5,25 (m, 2 H) 5,89 (ddd, J=17,22, 10,46, 5,45 Hz, 1 H); LCMS: 78,48% (256,33, M+H), RT: 2,69 min.
[00198] Etapa 6. ((2R3R)-2,5-dimetil-3,6-di-hidro-2H-piran-3-il) carbamato de terc-Butila, Composto 7b. A uma solução agitada do Composto 6b (35 g, 137 mmol) em benzeno (500 ml) foi adicionado catalisador de Grubbs-ll (2,3 g, 2,74 mmol) a 23ºC sob uma atmosfera de nitrogênio. A reação foi então refluxada por 3 h. Após arrefecimento até 23ºC, tetra-acetato de chumbo (1,8 g, 4,11 mmol) foi adicionado e agitado por mais 12 horas a 23ºC. A reação foi monitorada por TLC (10% EtOAc em hexano, Rr=0,3, PMA visível). O solvente foi então removido in vacuo e o resíduo bruto foi purificado por cromatografia rápida (2,5 — 10% EtOAc em hexanos) em sílica (100-200 mesh) para gerar o Composto 7b (26 g, 83,60%) como um sólido branco. *H RMN (400 MHz, clorofórmio-d) à ppm 1,16 - 1,22 (m, 3 H) 1,44 (s, 9 H) 1,61 (s, 3 H) 3,57 - 3,66 (m, 1 H) 3,86 - 3,94 (m, 1 H) 3,97 (s, 1 H) 3,98 - 4,06 (m, 1 H) 4,60 (br d, J=9,66 Hz, 1 H) 5,56 - 5,62 (m, 1 H); LCMS: 94,00% (228,29, M+H), RT: 2,35 min.
[00199] Etapa 7. ((2R,3R)-2,5-dimetil-6-0x0-3,6-di-hidro-2H-piran -3-il)carbamato de terc-Butila, Composto 8b. A uma solução agitada do Composto 7b (30 g, 132,1 mmol) em benzeno (1200 ml) a 23ºC foi adicionado celite (120 g), dicromato de piridínio (99,3 g, 364,3 mmol) e hidroperóxido de terc-butila (70% em peso em água, 47,5 ml, 528,6 mmol). Após 5 h a 23ºC, a mistura de reação foi filtrada através de ce- lite, lavada com acetato de etila (500 ml), seca sobre Na2SO. anidro, filtrada e concentrada in vacuo. O resíduo bruto foi purificado por cro- matografia rápida (7,5 — 30% EtOAc em hexanos) em sílica-gel (100- 200 mesh) para gerar o Composto 8b (18 g, 56,60%) como um sólido branco. *H RMN (400 MHz, clorofórmio-d) 5 ppm 1,38 (d, J=6,44 Hz, 3 H) 1,42 - 1,49 (m, 9 H) 1,92 - 1,97 (m, 3 H) 4,21 - 4,31 (m, 1 H) 4,51 - 4,65 (m, 2 H) 6,63 (dd, J=6,32, 1,43 Hz, 1 H); LCMS: 96,91% (242,17, M+H), RT: 1,68 min.
[00200] Etapa 8. ((2R, 3R, 5S)-2,5-dimetil-6-oxotetra-hidro-2H- piran-3-il)carbamato de terc-Butila, Composto 9b. A uma solução agitada do Composto 8b (25 g, 103,61 mmol) em etanol (500 ml) a 23ºC foi adicionado PtO> (470 mg, 2,07 mmol) e a atmosfera no balão de reação foi alterada para hidrogênio. A mistura de reação foi agitada a 23ºC por 24 h com monitoramento por TLC (30% EtOAc em hexano, Rr=0,35, PMA visível). Após 24 h a 23ºC, a mistura de reação foi filtra- da através de papel de filtro e o solvente foi removido in vacuo para gerar o Composto 9b (25g, 99%) como um sólido branco. *H RMN (400 MHz, clorofórmio-d) à ppm 1,16 - 1,25 (m, 4 H) 1,29 - 1,38 (m, 5 H) 1,39 - 1,54 (m, 12 H) 2,49 - 2,71 (m, 2 H) 4,03 - 4,19 (m, 1 H) 4,41 -
4,55 (m, 1 H) 4,64 - 4,82 (m, 1 H).
[00201] Etapa 59.((2R,3R, 5S)-6-alil-6-hidróxi-2,5-dimetiltetra-hidro -2H-piran-3-il)carbamato de terc-Butila, Composto 10b. A uma so- lução agitada do Composto 9b (25 g, 102,7 mmol) em THF (300 ml) a - 78ºC foi adicionado cloreto de alil magnésio (solução 1,4 M em THF, 146 ml, 205,4 mmol) pelos lados do balão sob uma atmosfera de nitro- gênio. Após 1,5 h à mesma temperatura, a reação foi interrompida com NHA.CI aquoso saturado (500 ml). O resíduo aquoso foi extraído com EtOAc (2 x 500 ml). As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com salmoura (500 ml), secas sobre Na2SO. anidro, filtradas e concentradas in vacuo. O resíduo bruto foi purificado por cromatografia rápida (10 — 50% EtOAc em hexanos) em sílica (100-200 mesh) para gerar o Composto 10b (20 g, 68,25%) como um óleo amarelo pálido. 1H RMN (400 MHz, clorofórmio-d) ô ppm 1,13 (d, J=7,2 Hz, 3 H) 1,16 (d, J=6,3 Hz, 3 H) 1,45 (s, 9 H) 1,93 - 2,03 (m, 1 H) 2,10 - 2,29 (m, 1 H) 2,68 - 2,80 (m, 1 H) 3,24 - 3,39 (m, 2 H) 3,65 - 3,76 (m, 1 H) 4,71 (br d, J=9,06 Hz, 1 H) 5,05 - 5,22 (m, 2 H) 5,78 - 6,02 (m, 1 H).
[00202] Etapa 10. ((2R, 3R, 5S, 6S)-6-alil-2,5-dimetiltetra-hidro- 2H-piran-3-il)carbamato de terc-Butila, Composto 11b. A uma solu- ção agitada do Composto 10b (5 g, 17,54 mmol) em DCM (50 ml) foi adicionado 2,2,2-trifluoroetanol (10 ml, 140,3 mmol) e trietilsilano (28 ml, 175,4 mmol) a 23ºC sob uma atmosfera de nitrogênio. A reação foi resfriada a -78ºC e BF3ºOEt2 (8,6 ml, 70,16 mmol) foi adicionado len- tamente pelo lado do balão. Após mais 3 horas à mesma temperatura, NaHCO; aquoso saturado (100 ml) foi adicionado a -78ºC e as cama- das foram separadas. O resíduo aquoso foi extraído com EtOAc (3 x 50 ml). As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com sal- moura (100 ml), secas sobre Na2SO. anidro, filtradas e concentradas sob pressão reduzida. O resíduo resultante foi purificado por cromato- grafia rápida (2 — 12,5% EtOAc em hexanos) em sílica-gel (100-200 mesh) para gerar o Composto 11b (1,8 g, 38,29%) como um óleo inco- lor. *H RMN (400 MHz, clorofórmio-d) 5 ppm 0,98 - 1,07 (m, 3 H) 1,10 - 1,21 (m, 3 H) 1,45 (d, J=1,43 Hz, 9 H) 1,68 - 1,81 (m, 1 H) 1,95 (br d, J=2,74 Hz, 2 H) 2,03 - 2,20 (m, 1 H) 2,24 - 2,41 (m, 1 H) 3,37 - 3,68 (m, 3 H) 4,78 (br d, J=9,06 Hz, 1 H) 4,98 - 5,45 (m, 2 H) 5,71 - 5,88 (m, 1 H); LCMS: 60,33% (270,33, M+H), RT: 2,74 min.
[00203] Etapa 11. ((2R, 3R, 58, 6S)-2,5-dimetil-6-((E)-3-metil-4- oxobut-2-en-1-il)tetra-hidro-2H-piran-3-il)carbamato de terc-Butila, Composto 12b. A uma solução agitada do Composto 11b (3,6 9, 13,36 mmol) em DCM (50 ml) a 23ºC foi adicionada metacroleína (22 ml, 267,2 mmol) seguido pelo catalisador Nitro-Grela (897 mg, 1,336 mmol), sob uma atmosfera de nitrogênio. Após 12 h a 23ºC, o solvente foi removido in vacuo. O resíduo bruto foi purificado por cromatografia rápida (10 — 25% EtOAc em hexanos) em sílica (100-200 mesh) para gerar o Composto 12b (2,2 g, 52,88%) como um óleo amarelo pálido. 1H RMN (400 MHz, clorofórmio-d) 5 ppm 1,07 (d, J=7,34 Hz, 3 H) 1,16 (d, J=6,36 Hz, 3 H) 1,45 (s, 9 H) 1,76 (s, 3 H) 1,85 - 1,99 (m, 2 H) 2,34 - 245 (m, 1 H) 2,56 (dt, J=15,41, 7,46 Hz, 1 H) 3,53 - 3,68 (m, 3 H) 4,73 (br d, J=9,29 Hz, 1 H) 6,50 - 6,57 (m, 1 H) 9,42 (s, 1 H); LCMS: 86,69% (312,31, M+H), RT: 2,52 min.
[00204] Etapa 12. ((2R,3R,5S,6S)-2,5-dimetil-6-((E)-3-metilpen- ta-2,4-dien-1-il)tetra-hidro-2H-piran-3-il)carbamato de terc-Butila, Composto 13b. A uma suspensão agitada de brometo de metil trifenil fosfônio (3,7 g, 10,59 mmol) em THF (25 ml) a 0ºC foi adicionado KOtBu (1,1 g, 9,88 mmol) sob uma atmosfera de nitrogênio. Após 30 min, o Composto 12b (2,2 g, 7,064 mmol) em THF (15 ml) foi adicio- nado gota a gota por cânula à mesma temperatura e enxaguado com THF adicional (5 ml). Após 2 h a 23ºC, a reação foi interrompida com NHACI aquoso saturado (50 ml) e a maior parte do solvente foi removi- da in vacuo. O resíduo aquoso foi extraído com EtOAc (2 x 30 ml). As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com salmoura (50 ml), secas sobre Na2SO,. anidro, filtradas e concentradas in vacuo. O resí- duo bruto foi purificado por cromatografia rápida (1 — 10% EtOAc em hexanos) em sílica (100-200 mesh) para gerar o Composto 13b (1,59, 68,80%) como um óleo incolor. *H RMN (400 MHz, clorofórmio-d) 5 ppm 1,03 (d, J=7,41 Hz, 3 H) 1,15 (d, J=6,32 Hz, 3 H) 1,44 (s, 9 H) 1,72 - 1,80 (m, 3 H) 1,84 - 1,97 (m, 2 H) 2,19 - 2,30 (m, 1 H) 2,33 - 2,44 (m, 1 H) 3,51 (td, J=7,28, 2,67 Hz, 1 H) 3,54 - 3,66 (m, 2 H) 4,69 - 4,81 (m, 1 H) 4,95 (d, J=10,68 Hz, 1 H) 5,11 (d, J=17,44 Hz, 1 H) 5,46 (t, J=6,98 Hz, 1 H) 6,37 (dd, J=17,38, 10,74 Hz, 1 H); LCMS: 94,58% (310,37, M+H), RT: 2,96 min.
[00205] Etapa 13. (2R, 3R, 5S, 6S)-2,5-dimetil-6-((E)-3-metilpen- ta-2,4-dien-1-il)tetra-hidro-2H-piran-3-amina, Composto 8. À uma suspensão agitada do Composto 13b (1,5 g, 4,84 mmol) em DCM (40 ml) a 23ºC foi adicionado brometo de zinco (5,45 g, 24,23 mmol) sob uma atmosfera de nitrogênio. A mistura de reação foi agitada a 23ºC por 48 h. O progresso da reação foi monitorado por TLC (10% MeOH em DCM, Rr-0,1, UV visível). Após a conclusão, a mistura de reação foi diluída com DCM (50 ml), filtrada, lavada com DCM (100 ml), o fil- trado foi concentrado in vacuo para gerar o Composto 8 (1,6 g em bruto) como uma goma amarela pálida. Ele foi usado diretamente na etapa seguinte sem purificação adicional. *H RMN (400 MHz, clorofór- mio-d) ô ppm 1,03 - 1,20 (m, 3 H) 1,23 - 1,32 (m, 3 H) 1,34 - 1,43 (m, 3 H) 1,73 - 1,81 (m, 3 H) 1,88 - 2,00 (m, 1 H) 2,09 - 2,54 (m, 3 H) 3,42 - 3,53 (m, 1 H) 3,58 (br d, J=5,87 Hz, 1 H) 3,66 - 3,89 (m, 2 H) 4,87 - 5,04 (m, 1 H) 5,08 - 5,21 (m, 1 H) 5,36 - 5,53 (m, 1 H) 6,19 - 6,46 (m, 1 H) 6,70 - 7,12 (m, 3 H); LCMS: 81,62% (210,18, M+H), RT: 1,80 min.
[00206] ParteC: Ho o Pd(OAc),, Acetato de vinita HO om TBSCI, Imidazol! TBSO o | Ho" A TT tTeSO" OH o o & Etapa 1 2 Etapa 2 2 moon TESO Ox "> oOoe BF, ELO o. Etava 3 o Brometo de Metittrife- 4e nil fosfônio TBSO “““cooMe pPTS, MeOH KOtBu, THF = Etapa 5 Etapa 4 se Metiltrifenil fosfônio ah (COCI), DMSO =X ““cooMe bromido TBSO " TBSO" Etapa 6 Etapa 7 6c Te ““cooue “cool tbutil-hidroperóxido 2 “““cooMe " TBAF, THE . AA ' o .” acetoacetonato de vanadila <Q Etapa 8 o sc sc Etapa 9 Composto 9
[00207] Etapa 1. Síntese de (2R, 3R)-3-hidróxi-2-(hidroximetil)- 2H-piran-4(3H)-ona, Composto 2c. A uma mistura do Composto 1c (137,5 g, 0,941 mol), Pd(OAc)2 (5,9 g, 0,026 mol) em ACN (550 ml) foi adicionado acetato de vinila (250 g, 2,907 mol) à temperatura ambien- te. A mistura de reação foi agitada a 60ºC por 24 h. A mistura de rea- ção foi filtrada através de celite e lavada com EtOAc (100 ml). O sol- vente foi concentrado sob pressão reduzida para obter o produto bruto. O resíduo foi recristalizado a partir de uma mistura de acetona (68 ml) e EtOAc (68 ml) para gerar o Composto 2c (75 g, 55%) como um só- lido esbranquiçado. *H RMN (400 MHz, DMSO-ds) 5 = 7,60 (d, J = 5,9 Hz, 1H), 5,61 (d, J = 4,9 Hz, 1H), 5,30 (d, J = 5,4 Hz, 1H), 5,00 (t, J = 5,6 Hz, 1H), 4,16 - 4,06 (m, 2H), 3,82 - 3,76 (m, 1H), 3,73 - 3,66 (m, 1H).
[00208] Etapa 2. (2R, 3R)-3-(terc-Butildimetilsililóxi)-2-((terc-bu- tildimetilsililóxi) metil)-2H-piran-4(3H)-ona, Composto 3c. A uma solução do Composto 2c (100 g, 0,69 mol) em DMF (1900 mil) foi adi- cionado TBS-CI (277 g, 2,65 mol) e imidazol (140,9 g, 2,07 mol) em temperatura ambiente. A mistura de reação foi agitada em temperatura ambiente por 24 h. O progresso da reação foi monitorado por TLC (5% EtOAc em éter de petróleo, Rf:0,5, UV ativo). Após a conclusão da re- ação, a mistura de reação foi diluída com éter dietílico (2500 ml) e la- vada com água (1000 ml) e salmoura (1000 ml). A camada de éter die- tílico foi seca sobre sulfato de sódio anidro e depois filtrada e concen- trada para obter o produto bruto. O produto bruto foi purificado por cromatografia em coluna (100-200 sílica-gel/eluente 2% EtOAc em éter de petróleo) para gerar o Composto 3c (200 g, 77,5%) como um sólido esbranquiçado. *H RMN (400 MHz, clorofórmio-d) 5 = 7,30 - 7,25 (m, 1H), 5,30 (d, J = 5,8 Hz, 1H), 4,45 - 4,40 (m, 1H), 4,18 (td, J= 2,6, 12,2 Hz, 1H), 3,99 (d, J = 2,8 Hz, 2H), 0,91 (d, J = 2,5 Hz, 18H), 0,23 (s, 3H), 0,11 - 0,05 (m, 6H); LCMS: 99,48% (373,37, M+H), RT: 3,47 min.
[00209] Etapa 3.2-((2S,5R,6R)-5-(terc-butildimetilsililóxi)-6-((terc- butildimetilsililóxi)mMetil)-4-oxotetra-hidro-2H-piran-2-il)acetato — de metila, Composto 4c. A uma solução agitada do Composto 3c (55 9, 0,147 mol) em DCM (2000 ml) foi adicionada (1-metoxivinilóxi) dimetil- silano de terc-butila (55 g, 0,292 mol) em temperatura ambiente. À mistura de reação foi agitada em temperatura ambiente por 2 h, segui- do pela adição de BF3.Et2O (63,25 g, 3,03 mol) a -78ºC. A mistura de reação foi agitada a -78ºC por 1 h. O progresso da reação foi monito- rado por TLC (15% EtOAc em éter de petróleo, Rf:0,5, PMA ativo). À mistura de reação foi interrompida com NHaCI saturado (500 ml) e ex- traída com DCM (2 x 250 ml). A camada orgânica combinada foi lava- da com NaHCO; saturado (500 ml) e salmoura (500 ml). A camada orgânica foi seca sobre sulfato de sódio anidro e depois filtrada e con- centrada para obter o produto bruto. O produto bruto foi purificado por cromatografia em coluna (100-200 sílica-gel/eluente 3% EtOAc em éter de petróleo) para gerar o Composto 4c (25 g, 37,9%) como uma goma transparente. *H RMN (400 MHz, clorofórmio-d) 5 = 4,92 - 4,72 (m, 1H), 4,33 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 3,91 - 3,78 (m, 2H), 3,74 - 3,58 (m, 4H), 2,83 - 2,60 (m, 2H), 2,52 - 2,38 (m, 2H), 0,99 - 0,79 (m, 18H), 0,15 (s, 3H), 0,11 - 0,01 (m, 9H).
[00210] Etapa 4. 2-((2S, 5R, 6R)-5-(terc-butildimetilsililóxi)-6- ((terc-butildimetilsililóxi)metil)-4-metilenotetra-hidro-2H-piran-2- il)acetato de metila, Composto 5c. A uma suspensão de brometo de metil trifenil fosfônio (12 g, 0,033 mol) em THF (180 ml) a 0ºC, foi adi- cionada uma solução de THF (80 ml) de KOtBu (3,33 g, 0,029 mol). Após 1 h, uma solução de THF (60 ml) do Composto 4c (10 g, 0,022 mol) foi adicionada gota a gota. Depois, a mistura de reação foi deixa- da a 25ºC e agitada durante 1 hora. O progresso da reação foi monito- rado por TLC (5% EtOAc em éter de petróleo, RF=0,3, PMA ativo). À mistura de reação foi interrompida com NHaCI saturado (100 ml) e ex- traída com EtOAc (2 x 150 ml). A camada de EtOAc orgânica foi seca sobre sulfato de sódio anidro e depois filtrada e concentrada. O resí- duo bruto foi purificado por cromatografia em coluna (100-200 sílica- gel/eluente 5% EtOAc em éter de petróleo) para gerar o Composto 5c (4 g, 40,4%) como um líquido amarelo. *H RMN (400 MHz, clorofórmio- d) 5 = 5,07 (s, 1H), 4,89 - 4,86 (m, 1H), 4,30 - 4,23 (m, 1H), 4,02 (d, J= 6,5 Hz, 1H), 3,75 - 3,66 (m, 5H), 3,47 (td, J = 4,7, 6,4 Hz, 1H), 2,65 (dd, J = 7,3, 15,0 Hz, 1H), 2,48 (dd, J = 6,8, 15,0 Hz, 1H), 2,42 - 2,28 (m, 2H), 0,95 - 0,84 (m, 18H), 0,12 - 0,01 (m, 12H).
[00211] Etapa 5. Metil-2-((2S, 5S, 6R)-5-(terc-butildimetilsililóxi)- 6-(hidroximetil)-4-metilenotetra-hidro-2H-piran-2-il) acetato, Com- posto 6c. A uma solução agitada do Composto 5c (75,1 g, 0,168 mol)
em MeOH (751 ml) foi adicionado PPTS (59,4 g, 0,236 mol) em tempe- ratura ambiente. A mistura de reação foi agitada em temperatura am- biente durante 16 h. O progresso da reação foi monitorado por TLC (25% EtOAc em éter de petróleo, RF=0,3, PMA ativo). A mistura de reação foi interrompida com NaHCO; saturado (1270 ml) e extraída com EtOAc (2 x 1500 ml). A camada de EtOAc orgânica foi seca sobre sulfato de sódio anidro e depois filtrada e concentrada. O resíduo bruto foi purificado por cromatografia em coluna (100-200 sílica-gel/eluente 25% EtOAc em éter de petróleo) para gerar o Composto 6c (39 9, 69,8%) como uma goma de cor amarela. *H RMN (400 MHz, clorofór- mio-d) à = 5,11 (s, 1H), 4,88 (s, 1H), 4,42 - 4,35 (m, 1H), 3,93 (d, J = 7,3 Hz, 1H), 3,71 - 3,64 (m, 5H), 3,56 - 3,50 (m, 1H), 2,73 (dd, J= 8,8, 15,4 Hz, 1H), 2,51 - 2,42 (m, 2H), 2,31 (dd, J = 3,8, 13,4 Hz, 1H), 2,15 (t, J = 6,4 Hz, 1H), 0,94 - 0,91 (m, 9H), 0,10 - 0,08 (m, 3H), 0,05 - 0,03 (m, 3H); LCMS: 80,17% (331,39, M+H), RT: 2,78 min.
[00212] Etapa 6. 2-((2S, 5S, 6S)-5-(terc-butildimetilsililóxi)-6-for- mil-4-metilenotetra-hidro-2H-piran-2-il) acetato de metila, Compos- to 7c. A uma solução agitada de cloreto de oxalil (17,2 g, 0,136 mol) em DCM (214 ml) a -78ºC foi adicionado lentamente DMSO (21 9, 0,27 mol). A mistura de reação foi agitada de -78ºC a -60ºC por 20 min. Uma solução do Composto 6c (30 g, 0,09 mol) em DCM (414 ml) foi adicionada gota a gota a -78ºC por 30 min. A mistura de reação foi aquecida lentamente a -45ºC por 30 min. Foi adicionado TEA (52,8 9, 0,522 mol) a -45ºC e a mistura de reação foi aquecida a 0ºC ao longo de 10 min. O progresso da reação foi monitorado por TLC (20% EtOAc em éter de petróleo, RF=0,35, PMA ativo). A mistura de reação foi in- terrompida com NH.4CI saturado (500 ml) e extraída com DCM (2x500 ML). A camada orgânica foi lavada com salmoura (1000 ml). A camada orgânica foi seca sobre sulfato de sódio anidro e então filtrada e con- centrada. O resíduo bruto foi purificado por cromatografia em coluna
(100-200 sílica-gel/eluente 20% EtOAc em éter de petróleo) para pro- duzir o Composto 7c (22 g, 73,8%) como uma goma amarela. *H RMN (400 MHz, clorofórmio-d) 5 = 9,76 - 9,73 (m, 1H), 5,05 - 5,00 (m, 1H), 4,93 - 4,87 (m, 1H), 4,36 (d, J = 4,3 Hz, 1H), 4,29 - 4,20 (m, 1H), 4,12 - 4,08 (m, 1H), 3,73 - 3,67 (m, 4H), 2,78 - 2,69 (m, 1H), 2,55 - 2,40 (m, 1H), 2,27 - 2,20 (m, 2H), 0,96 - 0,87 (m, 9H), 0,12 - -0,02 (m, 6H); LCMS: 97,53% (329,34, M+H), RT: 2,60 min.
[00213] Etapa 7: 2-((2S,5S, 6R)-5-(terc-butildimetilsililóxi)-4-me- tileno-6-viniltetra-hidro-2H-piran-2-il) acetato de metila, Composto 8c. A uma suspensão de brometo de metil trifenil fosfônio (28 g, 0,078 mol) em THF (381 ml) a 0ºC foi adicionado KOtBu (7,9 g, 0,070 mol). Após 1 h, uma solução de THF (1361 ml) do Composto 7c (14 g, 0,042 mol) foi adicionada gota a gota. A mistura foi agitada durante 1 h a 0ºC. O progresso da reação foi monitorado por TLC (10% EtOAc em éter de petróleo, RF=0,5, PMA ativo). A mistura de reação foi inter- rompida com NH.CI saturado (1200 ml) e extraída com EtOAc (2 x 500 ml). A camada de EtOAc foi lavada com salmoura (1000 ml), seca so- bre sulfato de sódio anidro, filtrada e concentrada. O resíduo bruto foi purificado por cromatografia em coluna (100-200 sílica-gel/eluente 2% EtOAc em éter de petróleo) para produzir o Composto 8c (5,8 9, 41,7%) como uma goma transparente. *H RMN (400 MHz, clorofórmio- d) à ppm 0,04 (d, J=7,08 Hz, 6 H) 0,88 - 0,95 (m, 9 H) 2,30 - 2,39 (m, 1 H) 2,40 - 2,57 (m, 2 H) 2,70 (dd, J=14,99, 7,47 Hz, 1 H) 3,62 - 3,71 (m, 3 H) 3,83 (d, J=6,65 Hz, 1 H) 3,90 - 3,99 (m, 1 H) 4,37 (tt, J=6,96, 4,81 Hz, 1 H) 4,88 (d, J=0,65 Hz, 1 H) 5,09 (s, 1 H) 5,18 - 5,37 (m, 2 H) 5,83 (ddd, J=17,17, 10,74, 6,10 Hz, 1 H).
[00214] Etapa 8. 2-((2S,5S,6R)-5-hidróxi-4-metileno-6-viniltetra- hidro-2H-piran-2-il) acetato de metila, Composto 9c. A uma solução agitada do Composto 8c (5,6 g, 0,017 mol) em THF (52 ml) foi adicio- nado TBAF (5,15 g, 0,019 mol, 1 M em THF) a 0ºC. A mistura de rea-
ção foi agitada em RT por 8 h. O progresso da reação foi monitorado por TLC (30% EtOAc em éter de petróleo, RF=0,2, PMA ativo). A mis- tura de reação foi interrompida com NHA4CI saturado (100 ml) e extraí- da com EtOAc (2 x 300 ml). A camada orgânica foi lavada com sal- moura (600 ml), seca sobre sulfato de sódio anidro, filtrada e concen- trada. O produto bruto foi purificado por cromatografia em coluna (100- 200 sílica-gel/eluente 20% EtOAc em éter de petróleo) para produzir o Composto 9c (2,5 g, 68,8%) como uma goma amarela. *H RMN (400 MHz, clorofórmio-d) à ppm 1,97 - 2,08 (m, 1 H) 2,33 - 2,55 (m, 3 H) 2,68 (dd, J=15,13, 7,67 Hz, 1 H) 3,69 (s, 3 H) 3,93 (t, J=5,48 Hz, 1 H) 4,06 - 4,14 (m, 1 H) 4,34 (dt, J=12,44, 6,17 Hz, 1 H) 4,95 (s, 1 H) 5,12 (s, 1 H) 5,26 - 5,42 (m, 2 H) 5,86 (ddd, J=17,26, 10,80, 6,14 Hz, 1 H).
[00215] Etapa 9. 2-((3R, 5S, 7R, 8R)-8-hidróxi-7-vinil-1, 6-dioxa- espiro[2.5]octan-5-il) acetato de metila, Composto 9. O composto 9c (1,1 g, 0,0051 mol) foi dissolvido em DCM (86 ml) e arrefecido a - 20ºC. A isto foi adicionado acetoacetato de vanadila (125 mg, 0,00047 mol) seguido por uma solução de hidroperóxido de terc-butila (1,71 ml, 0,017 mol). Deixou-se a mistura aquecer lentamente até 0ºC durante 2 h. A mistura de reação foi agitada em temperatura ambiente por 24 h. O progresso da reação foi monitorado por TLC (40% EtOAc em éter de petróleo, Rf=0,2, PMA ativo). A mistura de reação foi purificada por cromatografia em coluna (100-200 sílica-gel/eluente EtOAc a 35% em éter de petróleo) para gerar o Composto 9 (600 mg) como uma goma incolor. *H RMN (300 MHz, clorofórmio-d) 5 ppm 1,76 - 1,93 (m, 2 H) 1,99 - 2,14 (m, 2 H) 2,60 - 2,74 (m, 2 H) 2,84 - 3,02 (m, 2 H) 3,43 - 3,55 (m, 1 H) 3,70 (s, 3 H) 4,17 - 4,29 (m, 1 H) 4,42 - 4,55 (m, 1 H) 5,26 - 5,45 (m, 2 H) 5,93 (ddd, J=17,45, 10,69, 5,48 Hz, 1 H).
[00216] ParteD: o Px ““cooc,
OE Y "OL Ho” ã Composto 1
[00217] Etapa 1.Benzoato de (Z)-5-((2R, 3R, 5S, 6S)-2,5-dimetil- 6-((E)-3-metilpenta-2,4-dienil)tetra-hidro-2H-piran-3-ilamino)-5-0x0- pent-3-en-2-ila, Composto 1d. A uma solução agitada do Composto 8 (200 mg, 0,955 mmol) e do Composto 5a (126 mg, 0,573 mmol) em THF (10 ml), DIPEA (616 mg, 4,755 mmol) e T;PO (50% EtOAc) (911 mg, 2,865 mmol) foram adicionados em temperatura ambiente. A mis- tura de reação foi agitada em temperatura ambiente durante 3 h. O progresso da reação foi monitorado por TLC (20% EtOAc em éter de petróleo, RF=0,5, UV ativo) até a matéria-prima ser consumida. O sol- vente de reação foi concentrado sob pressão reduzida para obter o produto bruto. O produto bruto foi purificado por cromatografia em co- luna (100-200 sílica-gel/eluente 12% EtOAc em éter de petróleo) para produzir o Composto 1d (120 mg, 30%) como uma goma incolor. *H RMN (400 MHz, clorofórmio-d) à ppm 8,01 - 8,11 (m, 2 H) 7,50 - 7,62 (m, 1 H) 7,39 - 7,47 (m, 2 H) 6,47 - 6,57 (m, 1 H) 6,26 - 6,44 (m, 2 H) 5,92 - 6,08 (m, 2 H) 5,70 - 5,80 (m, 1 H) 5,39 - 5,51 (m, 1 H) 5,11 (d, J=17,33 Hz, 1 H) 4,96 (d, J=10,79 Hz, 1 H) 3,92 - 4,04 (m, 1 H) 3,63 - 3,73 (m, 1 H) 3,50 - 3,58 (m, 1 H) 2,41 (da, J=15,10, 7,61 Hz, 1 H) 2,21 - 2,33 (m, 1 H) 1,89 - 2,02 (m, 3 H) 1,72 - 1,84 (m, 5 H) 1,48 - 1,59 (m, 8 H) 1,23 - 1,30 (m, 3 H) 1,13 - 1,20 (m, 4 H) 1,01 - 1,09 (m, 4 H) 0,81 - 0,96 (m, 2 H); LCMS: 85,71% (412,37, M+H), RT: 2,92 e 2,94 min.
[00218] Etapa 2. benzoato de (Z)-5-((2R, 3R, 5S, 6S)-6-((2E, 4E)- 5-((3R, 4R, 5R, 7 S)-4-hidróxi-7-(2-metóxi-2-o0xoetil)-1,6-dioxaespiro [2.5]octan-5-il)-3-metilpenta-2,4-dienil)-2,5-dimetiltetra-hidro-2H- piran-3-ilamino)-5-oxopent-3-en-2-ila, Composto 1. A uma solução agitada do Composto 1d (115 mg, 0,279 mmol) em DCM (5 mL), o Composto 9 (181 mg, 2,83 mmol) e o catalisador de Grubbs-ll (47 mg, 0,055 mmol) foram adicionados em temperatura ambiente sob atmos- fera de argônio. A mistura de reação foi agitada a 40ºC por 4 h. O pro- gresso da reação foi monitorado por TLC, que mostrou que ambas as matérias-primas ainda estavam presentes. A mistura de reação foi fil- trada através de celite e lavada com DCM (5 mL). O solvente foi con- centrado sob pressão reduzida para obter um resíduo. O resíduo foi novamente dissolvido em DCM (5 mL) e o catalisador de Grubbs-ll (47 mg, 0,055 mmol) foi adicionado. A mistura de reação foi agitada por 23 h a 40ºC. O progresso da reação foi monitorado por TLC (50% EtOAc em éter de petróleo, RF=0,1, UV ativo) até o Composto 9 ser consumido.
[00219] A mistura de reação foi filtrada através de um celite e lava- da com DCM (2 mL). O solvente foi concentrado sob pressão reduzida para obter produto bruto. O produto bruto foi purificado por HPLC pre- parativa [Fase Móvel A: 10 mm ABC, Fase Móvel B: acetonitrila; Colu- na: X-Bridge (150 x 19) mm, 5u; Método: (T/% B): 0/30, 2/30, 20/30, 20/60, 20,5, 90, 22/90; Vazão: 18 ml/min; Solubilidade: ACN + THF + água; Temperatura ambiente]. As frações foram liofilizadas para obter o Composto 1 puro (11 mg, 6%) como um sólido esbranquiçado. *H RMN (400 MHz, clorofórmio-d) à ppm 7,98 - 8,10 (m, 2 H) 7,49 - 7,59 (m, 1 H) 7,37 - 7,48 (m, 2 H) 6,47 - 6,57 (m, 1 H) 6,33 - 6,45 (m, 2 H) 6,28 (br d, J=8,99 Hz, 1 H) 5,93 - 6,09 (m, 1 H) 5,72 - 5,81 (m, 1 H) 5,62 (dd, J=15,79, 6,14 Hz, 1 H) 5,47 - 5,56 (m, 1 H) 4,44 - 4,54 (m, 1 H) 4,21 (br t, J=6,58 Hz, 1 H) 3,99 (br dd, J=4,82, 2,63 Hz, 1 H) 3,62 - 3,75 (m, 4 H) 3,47 - 3,57 (m, 2 H) 2,86 - 3,02 (m, 2 H) 2,53 - 2,74 (m, 2
H) 2,33 - 2,48 (m, 1 H) 2,20 - 2,31 (m, 3 H) 2,10 - 2,18 (m, 1 H) 1,89 - 2,04 (m, 4 H) 1,69 - 1,86 (m, 7 H) 1,38 - 1,50 (m, 3 H) 1,22 - 1,33 (m, 3 H) 1,14 - 1,20 (m, 3 H) 1,01 - 1,11 (m, 3 H) 0,79 - 0,93 (m, 1 H); LCMS: 93,71% (612,49, M+H), RT: 5,09, 5,13 min. Exemplo 2 Síntese de 4-fluorobenzoato de (Z)-5-((2R, 3R, 5S, 6S)-6-((2E, 4E)- 5-((3R, 4R, 5R, 7 S)-4-hidróxi-7-(2-metóxi-2-o0xoetil)-1,6-dioxaespiro [2.5]octan-5-il)-3-metilpenta-2,4-dienil)-2,5-dimetiltetra-hidro-2H- piran-3-ilamino)-5-oxopent-3-en-2-ila, Composto 2
[00220] Parte A: o F. DS, HO o o F > fe) 2 TER DOMCADWAP = o e Etapa 1 2 — Tone Hexano “O o o rraveu fes cooH Quinoina — F - À f DZ 3e Etapa 3 4e
[00221] Etapa 1. 4-fluorobenzoato de 5-(terc-Butóxi)-5-oxopent- 3-in-2-ila, Composto 2e. Uma solução do Composto 1e (1 g, 9,41 mmol) em DCM seco (50 mL) foi arrefecida a -10ºC, depois foi adicio- nada trietilamina (6,41 ml, 47,05 mmol) e DMAP (115 mg, 0,941 mmol). Após 5 minutos, cloreto de 4-fluorobenzoílo (1,43 ml, 12,233 mmol) foi adicionado em gotas à mistura de reação. A mistura de rea- ção foi deixada resfriar em temperatura ambiente por 2 horas. O pro- gresso da reação foi monitorado por TLC (10% EtOAc em éter de pe- tróleo, RF=0,3, UV e KMnO;. ativo). Após a conclusão da reação, a mistura de reação foi diluída com DCM (100 ml) e depois lavada com água e solução de salmoura (1 x 50 ml) e seca sobre sulfato de sódio anidro. O solvente foi removido sob pressão reduzida e o composto bruto foi isolado. O composto bruto foi purificado por cromatografia em coluna (100-200 sílica-gel/eluente 5% EtOAc em éter de petróleo) para produzir o Composto 2e (900 mg, 53%) como um sólido esbranquiça- do. *H RMN (400 MHz, clorofórmio-d) 5 = 8,12 - 8,04 (m, 2H), 7,17 - 7,07 (m, 2H), 5,76 (q, J = 6,8 Hz, 1H), 1,67 (d, J = 6,8 Hz, 3H), 1,49 (s, 9H).
[00222] Etapa 2. 4-fluorobenzoato de 5-(terc-Butóxi)-5-oxopent- 3-en-2-ila, Composto 3e. A uma solução do Composto 2e (900 mg, 3,08 mmol) em EtOAc:hexano (30 ml + 10 ml) foi adicionada quinolina (0,5 ml) e catalisador de Lindlar (520 mg, 4,88 mmol) sob purga de ar- gônio. Após 5 minutos de purga, a mistura de reação foi agitada sob pressão de balão de hidrogênio por 3 h. O progresso da reação foi monitorado por TLC (10% EtOAc em éter de petróleo, RF=0,36, UV e KMnO:, ativo). Após a conclusão da reação, a mistura de reação foi filtrada através de celite, o filtrado concentrado sob vácuo e o produto bruto isolado. O produto bruto foi purificado por cromatografia em co- luna (100-200 sílica-gel; eluente 6% EtOAc em éter de petróleo) e para render o Composto 3e (605 mg, 66%) como um líquido pegajoso ama- relo. *H RMN (400 MHz, DMSO-ds) 5 = 8,04 (dd, J = 5,6, 8,7 Hz, 2H), 7,36 (t, J = 8,8 Hz, 2H), 6,38 - 6,28 (m, 2H), 5,83 - 5,76 (m, 1H), 1,50 - 1,40 (m, 12H); LCMS: 85,63% (295,16, M+H), RT: 4,30 min.
[00223] Etapa 3. Ácido (2)-4-((4-Fluorobenzoil)óxi)pent-2-enoico, Composto 4e. A uma solução agitada do Composto 3e (600 mg, 2,04 mmol) em DCM seco (20 mL), foi arrefecida a -10ºC e foi adicionado ácido trifluoroacético (2,4 ml) em gotas à mistura de reação. A mistura de reação foi deixada aquecer até 25ºC e foi agitada por 3 h. O pro- gresso da reação foi monitorado por TLC (30% EtOAc em éter de pe- tróleo, RF=0,15, UV e KMnO; ativo). Após a conclusão da reação, a mistura de reação foi concentrada sob vácuo e o composto bruto foi lavado com éter dietílico a 50% em n-pentano (2 x 10 ml) e seco sob vácuo para produzir o Composto 4€e (383 mg, 78%) como um sólido esbranquiçado. *H RMN (400 MHz, DMSO-ds) 5 = 12,64 (br s, 1H), 8,03 (dd, J = 5,6, 8,7 Hz, 2H), 7,36 (t, J = 8,9 Hz, 2H), 6,43 - 6,32 (m, 2H), 5,84 (d, J = 10,5 Hz, 1H), 1,43 (d, J = 6,1 Hz, 3H); D2O (400 MHz, DMSO-ds) 5 = 8,07 - 8,02 (m, 2H), 7,39 - 7,33 (m, 2H), 6,42 - 6,33 (m, 2H), 5,88 - 5,83 (m, 1H), 1,46 - 1,41 (m, 3H).
[00224] ParteB: o O COooH CE a 00 o. FA TP(50% é EIOAC) Oo DEM Drs O o IS 8 " Te Ho” SF cattsacor e cunne1 O ROO SA" Etapa? 9 CS o Composto 2
[00225] Etapa 1. 4-fluorobenzoato de (Z)-5-((2R, 3R, 5S, 6S)-2,5- dimetil-6-((E)-3-metilpenta-2,4-dienil)tetra-hidro-2H-piran-3-ilami- no)-5-oxopent-3-en-2-ila, Composto 1f. A uma solução agitada do Composto 8 (400 mg, 1,91 mmol), o Composto 4e (273 mg, 1,14 mmol) em THF (12 ml), DIPEA (1,23 g, 9,55 mmol) e T3P (1,82 g) fo- ram adicionados em temperatura ambiente. A mistura de reação foi agitada em temperatura ambiente durante 4 h. O progresso da reação foi monitorado por TLC (30% EtOAc em éter de petróleo, RF=0,2, PMA ativo). A mistura de reação foi concentrada sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por cromatografia em coluna (100-200 síli- ca-gel/eluente 10% EtOAc em éter de petróleo) para produzir o Com- posto 1f (220 mg) como uma goma incolor. *H RMN (400 MHz, cloro-
fórmio-d) à ppm 0,99 - 1,08 (m, 3 H) 1,11 - 1,20 (m, 3 H) 1,36 - 1,44 (m, 3 H) 1,47 - 1,55 (m, 5 H) 1,69 - 1,85 (m, 4 H) 1,89 - 2,03 (m, 2 H) 2,19 - 2,32 (m, 1 H) 2,34 - 2,49 (m, 1 H) 3,49 - 3,59 (m, 1 H) 3,62 - 3,75 (m, 1 H) 3,91 - 4,04 (m, 1 H) 4,87 - 5,01 (m, 1 H) 5,11 (d, J=17,44 Hz, 1 H) 5,47 (br d, J=3,81 Hz, 1 H) 5,76 (ddd, J=11,61, 5,94, 1,20 Hz, 1 H) 5,88 - 6,09 (m, 2 H) 6,18 - 6,58 (m, 3 H) 7,05 - 7,16 (m, 2 H) 7,99 - 8,10 (m, 2 H); LCMS: 87,8% (430,07, M+H), RT: 2,50 min.
[00226] Etapa 2. 4-Fluorobenzoato de (Z)-5-((2R, 3R, 5S, 6S)-6- ((2E, 4E)-5-((3R, 4R, 5R, 7S)-4-hidróxi-7-(2-metóxi-2-0x0etil)-1,6- dioxaespiro[2.5]octan-5-il)-3-metilpenta-2,4-dienil)-2,5-dimetiltetra- hidro-2H-piran-3-ilamino)-5-oxopent-3-en-2-ila, Composto 2. A uma solução agitada do Composto 1f (100 mg, 0,232 mmol) em DCM (10 ml), o Composto 9 (150 mg, 0,657 mmol) e o catalisador de Grubbs-ll (41 mg, 0,2 mmol) foram adicionados em temperatura ambiente sob atmosfera de argônio. A mistura de reação foi agitada a 40ºC por 5 h. O progresso da reação foi monitorado por TLC (50% EtOAc em éter de petróleo, RF=0,1, UV ativo). A mistura de reação foi filtrada através de celite e lavada com DCM (2 ml). O solvente foi concentrado sob pres- são reduzida. O produto bruto foi purificado por HPLC preparativa [co- luna X Bridge (150 x 19) mm, 5 u; fase móvel A: 10 mm ABC; fase móvel B: acetonitrila; método: - (T/%B): 0/30, 2/30, 20/30; vazão: -18 ml/min; solubilidade: - ACN + THF + água; temperatura ambiente]. As frações resultantes foram liofilizadas para obter o Composto 2 (5,8 mg) puro como um sólido branco. *H RMN (400 MHz, clorofórmio-d) 5 ppm 0,99 - 1,09 (m, 3 H) 1,13 - 1,20 (m, 3 H) 1,22 - 1,36 (m, 1 H) 1,52 (br s, 1 H) 1,69 - 1,84 (m, 7 H) 1,88 - 2,05 (m, 3 H) 2,10 - 2,31 (m, 2 H) 2,33 - 2,47 (m, 1 H) 2,60 - 2,78 (m, 2 H) 2,88 - 3,04 (m, 2 H) 3,48 - 3,58 (m, 2 H) 3,62 - 3,76 (m, 4 H) 3,98 (br dd, J=5,26, 2,85 Hz, 2 H) 4,10 - 4,24 (m, 1 H) 4,40 - 4,56 (m, 1 H) 5,52 (br s, 1 H) 5,58 - 5,68 (m, 1 H) 5,72 - 5,81 (m, 2 H) 5,89 - 6,10 (m, 2 H) 6,32 - 6,58 (m, 2 H) 7,10 (t, J=8,55
Hz, 1 H) 7,95 - 8,11 (m, 2 H); LCMS: 94,37% (630,16, M+H), RT: 4,73 min e 4,77 min. Exemplo 3 Síntese de 2-((3R, 5S, 7R, 8R)-7-((1E, 3E)-5-((2S, 3S, 5R, 6R)-5-((Z)- 4-(3,5-dimetil-1H-1,2,4-triazol-1-il)pent-2-enamido)-3,6-dimetiltetra- hidro-2H-piran-2-il)-3-metilpenta-1,3-dienil)-8-hidróxi-1,6- dioxaespiro[2.5]octan-5-il) acetato de metila, Composto 3
[00227] Parte A: Me%HHo o ão sr coca Pa > iPrgaiia, É No. A Cs,CO,, ACN ARO THF,3h IL y Etapa 1 29 Etapa 2 30 v. Fe ooôue = Ono ” AE o KHMDS, THF, -78C A THF, H20 XI Etapa3 Etapa 4 E Etapa 5 &
[00228] Etapa 1. 2-(3,5-dimetil-1H-1,2,4-triazol-1-il)propanoato de etila, Composto 2g. A uma solução agitada do Composto 1g em ACN (100 ml) foram adicionados Cs2CO;3 (125,6 g, 386,15 mmol) e 2- bromopropanoato de etila (39,43 ml, 283,15 mmol) a 25ºC. A mistura foi agitada durante 16 h em temperatura ambiente. O progresso da re- ação foi monitorado por TLC (5% MeOH em DCM, Rf=0,5, PMA ativo). Após a conclusão da reação, a mistura de reação foi filtrada e lavada com EtOAc (300 ml). O filtrado foi lavado com água (2 x 200 ml), sal- moura (2 x 200 ml). A camada orgânica foi seca sobre sulfato de sódio anidro e depois concentrada para obter 35 g de produto bruto. O pro- duto bruto foi purificado por cromatografia em coluna de fase normal usando sílica (100-200 mesh), eluindo com 2% MeOH em DCM. As frações coletadas foram evaporadas para obter o Composto 2g (30 9, 59,17%) como um líquido amarelo pálido. O isômero desejado foi con-
firmado por análise NOE, *H RMN (400 MHz, DMSO-ds) 5 ppm: 5,22 - 5,34 (m, 1 H), 4,03 - 4,18 (m, 2 H), 2,32 (s, 3 H), 2,16 (s, 3 H), 1,60 (d, J=7,23 Hz, 3 H), 1,06 - 1,19 (m, 3 H); LCMS: 75,07% (198,17, M+H), RT =1,18 min.
[00229] Etapa 2. 2-(3,5-Dimetil-1H-1,2,4-triazol-1-il)-N-metóxi-N- metilpropanamida, Composto 3g. A uma solução agitada do Com- posto 2g (5 g, 25,38 mmol) em THF anidro (10 ml/mmol) foi adicionado cloridrato de N,O-dimetil hidroxilamina (4,9 g 50,76 mmol) e, em se- guida, complexo de cloreto de isopropil magnésio e cloreto de lítio (58,57 ml, 76,14 mmol, 1,8 M em THF) foi adicionado lentamente a 0ºC. A mistura foi agitada durante 3 h em temperatura ambiente. O progresso da reação foi monitorado por TLC (EtOAc puro, Rf=0,3, PMA ativo). Após a conclusão da reação, esta foi interrompida com solução de cloreto de amônio satd. aq., extraída com acetato de etila (3x50 ml) e seca com sulfato de sódio. O solvente foi evaporado sob pressão reduzida para obter o Composto 3g (3,9 g, 73,58%) como uma goma amarela pálida. *H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 5 ppm: 5,27 (m, 1 H), 3,38 (s, 3 H), 3,21 (s, 3 H), 2,43 (s, 3 H), 2,34 (s, 3 H), 1,66 (s, 3 H), 1,61 (d, 3 H); LCMS: 79,07% (213,01, M+H), RT = 1,40 min.
[00230] Etapa 3. 2-(3,5-Dimetil-1H-1,2,4-triazol-1-il)propanal, Composto 49. A uma solução agitada do Composto 3g (3,9 g, 18,39 mmol) em THF (8 ml) foi adicionado LAH (10,11 ml, 20,23 mmol, 2,0 M em THF). Após a adição, a mistura de reação foi agitada a 0ºC por 2 h. O progresso da reação foi monitorado por TLC (EtOAc puro, Rf=0,25, 2, 4- DNP ativo). Após a conclusão da reação, esta foi interrompida com solução de cloreto de amônio satd. aq., extraída com acetato de etila (3 x 50 ml) e seca sobre sulfato de sódio. O solvente foi evapora- do sob pressão reduzida para obter o Composto 49 (2,6 9, 92%). O produto bruto foi utilizado para o passo seguinte sem purificação. O composto aldeído foi confirmado por *H RMN.
[00231] Etapa 4. 4-(3,5-dimetil-1H-1,2,4-triazol-1-il)pent-2-enoato de Z-metila, Composto 5g. A uma solução agitada de 2-(bis(2,2,2- trifluoroetóxi)fosforil) acetato de metila (5,4 g, 16,9 mmol) em THF ani- dro (10 ml) foi adicionado 18-coroa-6 (22,43 g, 84,96 mmol) e KHMDS (16,99 ml, 16,99 mmol, 1,0 M em THF) a -75ºC e a mistura de reação foi agitada por 20 min. Em seguida, o Composto 49g (2,6 g, 16,993 mmol) em (5 ml) THF foi adicionado à mistura de reação, a qual foi deixada aquecer até 25ºC e agitada por 2 h. O progresso da reação foi monitorado por TLC (50% EtOAc em hexano, Rf=0,3, UV ativo). Após a conclusão da reação, esta foi interrompida com solução de cloreto de amônio satd. aq., o produto foi extraído com acetato de etila (3 x 50 ml) e seco sobre sulfato de sódio anidro. O solvente foi evaporado sob pressão reduzida para obter 3 g de produto bruto. O produto bruto foi purificado por coluna de sílica utilizando 50% EtOAc em hexano. O produto nas frações coletadas foi identificado por UV, que foi evapora- do sob pressão reduzida para obter o Composto 5g (500 mg, 14,08%) como uma goma amarela pálida. *H RMN (400 MHz, DMSO-d6s) 5 ppm: 6,48-6,53 (dd, J=8,8 Hz 1 H), 6,19-6,23 (m, 1 H), 5,87-5,84 (d, J=1,2 Hz 1 H), 3,76 (s, 3 H), 2,42 (s, 3 H), 2,34 (s, 3 H), 1,58- 1,60 (d, 3 H); LCMS: 74,79% (210,11, M+H), RT = 1,24 min.
[00232] Etapa 5. Ácido (2)-4-(3,5-dimetil-1H-1,2,4-triazol-1-il) pent-2-enoico, Composto 6g. À uma solução agitada do Composto 5g (500 mg, 16,99 mmol) em THF (8 ml) e água (2 ml) foi adicionado LiOH.H2O (120,57 g, 2,87 mmol). A mistura foi agitada durante 2 h em temperatura ambiente. O progresso da reação foi monitorado por TLC (20% MEOH em DCM, Rf=0,4, UV ativo). Após a conclusão da reação, o solvente foi evaporado sob pressão reduzida para obter o produto bruto, que foi tratado com um tratamento com ácido e com base. O composto bruto foi dissolvido em 1 ml de água e extraído com éter die- tílico (5 ml). A camada aquosa separada foi acidificada com ácido cítri-
co saturado (0,2 ml, pH=5) e extraída com 20% MeOH em DCM (2 x ml). A camada orgânica separada foi seca sobre sulfato de sódio anidro e o solvente foi evaporado sob pressão reduzida para obter 300 mg do produto desejado. Esses 300 mg do produto final foram combi- nados com o lote anterior (80 mg, LCMS 97%), lavados com água (1 ml) e o sólido filtrado seco sob vácuo para obter o Composto 6g (240 mg, 39,02%) como um sólido esbranquiçado. O acoplamento constan- te JJ da ligação dupla olefínica indicou que o composto é o isômero geométrico Z. *H RMN (400 MHz, DMSO-ds) 5 ppm: 12,76 (br s, 1 H), 6,36 (dd, J=11,18, 8,99 Hz, 1 H), 6,00 - 6,16 (m, 1 H), 5,83 (d, J=11,40 Hz, 1 H), 2,30 (s, 3 H), 2,18 (s, 3 H), 1,48 (d, J=6,58 Hz, 3 H); LCMS: 98,64% (196,22, M+H), RT = 1,10 min.
[00233] ParteB:
COOH O? e OA TP so in EtOAc) E OS Ho : DIPEA, THF, RT Tr TX Etapa 1 Wo 1h AXO ScoocHz o Catalisador de Grubbs-!l E O" DEM, 40 *C r TX Ho" ' Etapa 2 DS So Cc Composto 3
[00234] Etapa 1. (Z2)-4-(3,5-dimetil-1H-1,2,4-triazol-1-il)-N- ((2R, 3R, 5S, 6S)-2,5-dimetil-6-((E)-3-metilpenta-2,4-dienil)tetra-hidro-2H- piran-3-il)pent-2-enamida, Composto 1h. A uma solução agitada do Composto 8 (300 mg, 1,435 mmol), Composto 6g (167,6 mg, 0,85 mmol) em THF (10 ml), DIPEA (924 mg, 7,15 mmol) e T3P (50% EtO- Ac) (1,36 g, 4,29 mmol) foram adicionados em temperatura ambiente.
A mistura de reação foi agitada em temperatura ambiente durante 5 h.
O progresso da reação foi monitorado por TLC (EtOAc, RF=0,1, UV ativo). O solvente de reação foi concentrado sob pressão reduzida pa- ra obter o produto bruto.
O produto bruto foi purificado por cromatogra- fia em coluna (100-200 sílica-gel/eluente 90% EtOAc em éter de petró- leo) para produzir o Composto 1h (130 mg, 23,5%) como uma goma incolor. *H RMN (400 MHz, clorofórmio-d) 5 ppm 6,53 (br d, J=1,96 Hz, 1 H) 6,23 - 6,42 (m, 2 H) 5,81 - 5,94 (m, 1 H) 5,68 - 5,78 (m, 1 H) 5,45 (br t, J=7,09 Hz, 1 H) 5,30 (s, 2 H) 5,05 - 5,46 (m, 1 H) 4,88 - 5,03 (m, 1 H) 4,12 (q, J=7,34 Hz, 3 H) 3,89 - 3,99 (m, 1 H) 3,64 - 3,76 (m, 1 H) 3,51 - 3,60 (m, 1 H) 2,72 - 2,90 (m, 1 H) 2,32 - 2,50 (m, 7 H) 2,19 - 2,29 (m, 2 H) 2,08 - 2,14 (m, 3 H) 2,05 (s, 5 H) 1,87 - 1,98 (m, 3 H) 1,70 - 1,85 (m, 4 H) 1,59 (dd, J=6,60, 3,18 Hz, 3 H) 1,39 - 1,46 (m, 3 H) 1,19 - 1,33 (m, 11 H) 1,09 - 1,19 (m, 3 H) 1,01 (br dd, J=16,14, 7,34 Hz, 3 H) 0,81 - 0,92 (m, 2 H); LCMS: 82,3% (387,38, M+H), RT: 2,31, 2,35 min.
Etapa 2. 2-((3R, 58 de metila, 7R, 8R)-7-((1E, 3E)-5-((2S, 3S, 5R, 6R)-5-((2)-4-(3,5-dimetil-1H-1,2,4-triazol-1-il)pent-2-enamido)-3,6- dimetiltetra-hidro-2H-piran-2-il)-3-metilpenta-1,3-dienil)-8-hidróxi- 1,6-dioxaespiro[2.5]octan-5-il) acetato, Composto 3. A uma solução agitada do Composto 1h (100 mg, 0,258 mmol) e Composto 9 (100 mg, 0,438 mmol) em DCM (10 mL) foi adicionado catalisador de Gru- bbs-ll (65,7 mg, 0,0774 mmol) em temperatura ambiente sob atmosfe- ra de argônio.
A mistura de reação foi agitada a 40ºC por 5 h.
O pro- gresso da reação foi monitorado por TLC (100% EtOAc, UV ativo). À mistura de reação foi filtrada através de um filtro de celite e lavada com DCM (2 mL). O solvente foi concentrado sob pressão reduzida para obter o produto bruto.
O produto bruto foi purificado por HPLC preparativa [Fase Móvel A: 10 mm ABC; Fase móvel B: Acetonitrila; Coluna: X-Bridge (150 x 19 mm), 5u; Método: (T/% B): 0/30, 2/30, 20/30, 20/60, 20,5, 90, 22/90; Vazão: 18 ml/min; Solubilidade: - ACN + THF + água; Temperatura ambiente]. As fracções coletadas foram liofi- lizadas para obter o produto puro Composto 3 (3 mg, 1,9%) como um sólido esbranquiçado. *H RMN (400 MHz, clorofórmio-d) 5 ppm 6,44 - 6,60 (m, 1 H) 6,22 - 6,43 (m, 2 H) 5,86 (td, J=7,23, 1,32 Hz, 1 H) 5,77 (br d, J=9,21 Hz, 1 H) 5,58 - 5,72 (m, 1 H) 5,51 (br t, J=7,02 Hz, 1 H) 4,44 - 4,56 (m, 1 H) 4,20 (br t, J=6,80 Hz, 1 H) 3,87 - 4,00 (m, 2 H) 3,60 - 3,76 (m, 5 H) 3,45 - 3,57 (m, 3 H) 2,89 - 3,02 (m, 2 H) 2,61 - 2,78 (m, 4 H) 2,40 - 2,49 (m, 4 H) 2,29 - 2,38 (m, 9 H) 2,13 - 2,26 (m, 4 H) 2,07 - 2,11 (m, 3 H) 1,88 - 2,03 (m, 4 H) 1,71 - 1,85 (m, 6 H) 1,51 - 1,55 (m, 3 H) 1,47 (br d, J=2,85 Hz, 2 H) 1,43 (s, 6 H) 1,22 - 1,35 (m, 3 H) 1,16 (d, J=6,36 Hz, 3 H) 0,98 (d, J=7,45 Hz, 3 H); LOCMS: 75% (587,17, M+H), RT: 2,95 min. Exemplo 4 Síntese de 2-((3R, 5S, 7R, 8R)-8-hidróxi-7-((1E, 3E)-5-((2S8,3S,5R, 6R)-5-((2)-4-(isoxazol-3-il)pent-2-enamido)-3,6-dimetiltetra-hidro- 2H-piran-2-i1)-3-metilpenta-1,3-dien-1-i1)-1,6-dioxaespiro[2.5]octan- 5-il)acetato de metila, Composto 4
[00235] Parte A: COOEt NaBH,, EtoH « CBr,, TPP E KCN, DMSO E — LA —— Lo FA % Etapa 1 2i Etapa 2 3i ; Etapa3 ( | He! SN vel, K,CO, A 41 4M dioxano a A C — —— O jPrMgCl. Lic! o o o 4i Etapa 4 5i Etapa 5 6i Etapa 6 do Pros con = Pa LAH, THF Ps o AO). K LN o" LiHMDS RAN) T Etapa 7 bé Etapa 8 oi
RA A THF, HO N COOoH Etapa 9 10i
[00236] Etapa 1.lsoxazol-3-ilmetanol, Composto 2i. Uma solução agitada de isoxazol-3-carboxilato de etila (Composto 1i) (24 g, 170,2 mmol) em etanol (400 ml) foi resfriada até 0ºC, boro-hidreto de sódio (16,17 g, 425,5 mmol) foi adicionado e a mistura foi agitada por 3 h. O progresso da reação foi monitorado por TLC (10% metanol em DCM, Rf: 0,3, iodo e UV ativo). A mistura de reação foi evaporada sob pres- são reduzida, interrompida com água gelada (30 ml), extraída com 10% metanol em DCM (6X500 ml) e a camada orgânica seca sobre sulfato de sódio anidro. O solvente orgânico foi evaporado sob pressão reduzida para obter o Composto 2i (16,8 g, 99,32%) como um óleo in- color. GCMS: 56% (99 M/Z), RT: 5,109 min; *H RMN (400 MHz, cloro- fórmio-d) à ppm 2,238 (S, 1 H), 4,813 (s, 2 H) 6,428- 6,386 (d, J=2 Hz, 1 H) 8,392 (d, J=2 Hz, 1 H).
[00237] Etapa 2.3-(Bromometil)isoxazol, Composto 3i. Uma so- lução agitada do Composto 2i (16,8 g, 169,69 mmol) em DCM (350 ml) foi resfriada até 0ºC, trifenilfosfina (44,5 g, 169,69 mmol) e CBra (56,27 9, 169,69 mmol) foram adicionados e a mistura foi agitada por 4 h em temperatura ambiente. O progresso da reação foi monitorado por TLC (20% de acetato de etila em hexano, Rf: 0,7, iodo e UV ativo). A mistu- ra de reação foi lavada com água (2 x 100 ml), solução de salmoura (100 ml). A camada orgânica foi seca sobre Na2SO:, filtrada e concen- trada para obter o produto bruto como líquido amarelo pálido (23 9), o qual foi purificado por cromatografia em coluna de fase normal usando sílica-gel (100-200 mesh) e eluindo com 10% acetato de etila em he- xano. As frações coletadas foram evaporadas para obter o Composto 3i (16,5 g, 62,6%) como um líquido amarelo pálido. *H RMN (400 MHz, clorofórmio-d) 5 ppm 4,461 (s, 2 H) 6,463 (d, J=1,6 Hz, 1 H) 8,396 (d, J=1,6 Hz, 1 H); LCMS: 85% (162, M+H), RT: 1,69 min.
[00238] Etapa 3. 2-(isoxazol-3-il)acetonitrila, Composto 4i. À uma solução agitada do Composto 3i (16,5 g, 102,4 mmol) em DMSO (35 ml) e água (15 ml) foi adicionado KCN (9,92 g, 153,72 mmol) a 0ºC e, em seguida, a reação foi deixada aquecer até 25ºC e foi agitada du- rante 3 h. O progresso da reação foi monitorado por TLC (30% acetato de etila em hexano, Rf: 0,5, KMNO;, ativo). Em seguida, a mistura de reação foi diluída com água (100 ml) e extraída com acetato de etila (2 x 150 ml). As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com água (100 ml) e solução de salmoura (100 ml), secas sobre Na2SO. e concentradas sob pressão reduzida para obter o composto bruto (12 g), que foi purificado por cromatografia em coluna de fase normal usando sílica-gel (100-200 mesh) e 20% EtOAc em hexano como um eluente. As frações coletadas foram evaporadas para obter o Compos- to 4i (8 9, 72,7%) como um líquido amarelo pálido. *'H RMN (400 MHz, clorofórmio-d) à ppm 3,87 (s, 2 H) 6,49 (d, J=1,47 Hz, 1 H) 8,48 (d, J=1,47 Hz, 1 H); LCMS: 96,57% (109,09, M+H), RT: 1,49 min.
[00239] Etapa 4. 2-(isoxazol-3-il)propanonitrila, Composto 5i. À uma solução do Composto 4i (8 g, 92,5 mmol) em THF (300 ml) foi adicionado KOtBu (9,35 g, 83,33 mmol) a 0ºC e a mistura foi agitada por 20 min. Em seguida, foi adicionado iodeto de metila (28 ml, 462,5 mmol) à reação a 0ºC e a mistura de reação foi deixada aquecer até 25ºC e agitada por 16 h. O progresso da reação foi monitorado por TLC (30% acetato de etila em hexano, Rf=0,45, KMnO; ativo). Após a conclusão da reação, a mistura foi filtrada, o filtrado foi diluído com acetato de etila (250 ml) e lavado com água (100 ml) e solução de salmoura (100 ml). A camada orgânica foi seca sobre Na2SO. e con- centrada sob pressão reduzida para obter o composto bruto (15 9), o qual foi purificado por cromatografia em coluna de fase normal usando sílica-gel (100-200 mesh) e eluindo com 15% EtOAc em hexano. As frações coletadas foram evaporadas para obter o Composto 5i (5 9, 55,37%) como um líquido amarelo pálido. *H RMN (400 MHz, cloro- fórmio-d) à ppm 1,748-1,730 (d, J= 7, 3 H), 4,178- 4,113 (m, 1H), 6,49 (d, J=1,47 Hz, 1 H) 8,48 (d, J=1,47 Hz, 1 H); LCMS: 92,66% (123,16, M+H), RT: 1,44 min.
[00240] Etapa 5. 2-(Isoxazol-3-il)propanoato de etila, Composto 6i. A uma solução do Composto 5i (4,5 g, 36,88 mmol) em etanol (45 ml) foi adicionado HCI 4,0 M em 1,4-dioxano (45 ml) em um tubo de 250 ml, que foi então vedado. O tubo foi aquecido até 80ºC e agitado por 24 h. O progresso da reação foi monitorado por TLC (30 % acetato de etila em hexano, Rf=0,7, KMNO; ativo). Após a conclusão da rea- ção, a mistura de reação foi concentrada e o resíduo foi retomado em acetato de etila (100 ml) e lavado com solução de NaHCO; (2 x 50 ml), água (50 ml) e solução de salmoura (50 ml). A camada orgânica foi seca sobre Na2SO. e concentrada sob pressão reduzida para obter o composto bruto (3,5 g), o qual foi purificado por cromatografia em co- luna de fase normal usando sílica-gel (100-200 mesh) e eluindo com 10% acetato de etila em hexano. As frações coletadas foram evapora- das para obter o Composto 6i (6 g, 96,3%) como um líquido amarelo pálido. *H RMN (400 MHz, clorofórmio -d) 5 ppm 8,34 - 8,38 (m, 1 H) 6,37 - 6,42 (m, 1 H) 4,15 - 4,22 (m, 2 H) 3,96 - 4,03 (m, 1 H) 1,55 - 1,58 (m, 3 H) 1,25 - 1,28 (m, 3 H); LCMS: 88,80 % (170,16, M+H), RT: 1,97 min.
[00241] Etapa 6. 2-(Isoxazol-3-il)-N-metóxi-N-metilpropanamida, Composto 7i.
[00242] A uma solução agitada do Composto 6i (6 g, 35,5 mmol)
em THF (200 ml) foi adicionado cloridrato de N,O-dimetil-hidroxilamina (6,92 g, 71 mmol) e a mistura de reação foi arrefecida até 0ºC. Com- plexo de Cloreto de isopropil-magnésio e cloreto de lítio foi então adi- cionado (1,3 M) (109,2 ml, 142 mmol). A mistura de reação foi agitada por 3 h a 0ºC. O progresso da reação foi monitorado por TLC (50% acetato de etila em hexano, Rf: 0,4, KMNO, ativo). A mistura de rea- ção foi interrompida usando solução de cloreto de amônio aq., extraída com acetato de etila (3 x 100 ml). A camada orgânica combinada foi seca sobre sulfato de sódio e concentrada sob pressão reduzida para obter o composto bruto (9 g). O produto bruto foi purificado por coluna de sílica-gel utilizando 50% acetato de etila em hexano como um elu- ente. As frações puras foram coletadas e evaporadas sob pressão re- duzida para obter o Composto 7i (2 g, 30,62%) como um óleo amarelo pálido. *H RMN (400 MHz, clorofórmio-d) 5 ppm 1,50 (d, J=7,02 Hz, 3 H) 3,21 (s, 3 H) 3,63 - 3,71 (m, 3 H) 4,53 (br d, J=6,14 Hz, 1 H) 6,45 (d, J=1,53 Hz, 1 H) 8,33 (d, J=1,53 Hz, 1 H); LOCMS: 97,05% (185,22, M+H), RT: 1,23 min.
[00243] Etapa 7. 2-(isoxazol-3-il)Dropanal, Composto 8i. A uma solução agitada do Composto 7i (2 g, 10,87 mmol) em THF (50 ml) foi adicionado LAH (5,43 ml, 10,87 mmol, 2 M em THF) a -70ºC. Após a adição, a mistura de reação foi agitada a 0ºC por 1 h. O progresso da reação foi monitorado por TLC (50% acetato de etila em hexano, RF=0,15, 2,4-DNP ativo). Após a conclusão da reação, a mistura foi interrompida com uma pasta de sulfato de sódio e agitada por 30 min em temperatura ambiente. O sólido foi filtrado, lavado com acetato de etila (50 ml). O filtrado foi seco sobre sulfato de sódio anidro e evapo- rado sob pressão reduzida para gerar o Composto 8i (1,2 g). O produ- to bruto foi utilizado na próxima etapa sem purificação. A RMN de *H mostrou o próton de aldeído característico a 9,8 pom com um valor de integração de 0,12 (outros valores de pico não são listados devido ao composto impuro).
[00244] Etapa 8. 4-(1H-1,2,3-triazol-1-il) pent-2-enoato de (Z)- metila, Composto 9i. A uma solução agitada de 18-coroa-6 (19,18 9g, 72,58 mmol) e 2-(difenoxifosforil)acetato de terc-butila (3,34 g, 9,6 mmol) em THF (40 ml) foi adicionado KHMDS 1 M em solução de THF (9,6 ml, 9,6 mmol) gota a gota a -75ºC. Após a adição, a mistura de reação foi agitada a -75ºC por 20 min. Em seguida, o Composto 8i (1,2 9, 14,51 mmol) em THF (10 ml) foi adicionado à mistura de reação a - 75ºC. Após a adição, a mistura de reação foi agitada por 2 h em tem- peratura ambiente. O progresso da reação foi monitorado por TLC (30% acetato de etila em hexano, RF=0,6, UV ativo). Após a conclusão da reação, esta foi interrompida com solução de cloreto de amônio aquosa sat., extraída com acetato de etila (3 x 30 ml) e seca sobre sul- fato de sódio anidro. O solvente foi evaporado sob pressão reduzida e foram obtidos 4 g de produto bruto. O produto bruto foi purificado por coluna de sílica utilizando 15% acetato de etila em hexano como um gradiente. As frações puras foram coletadas e evaporadas sob pres- são reduzida para produzir o Composto 9i (430 mg, 19,6%) como uma goma amarela. *H RMN (400 MHz, clorofórmio-d) & ppm 1,42 (d, J=7,02 Hz, 3 H), 1,55 (s, 9 H) 5,002 — 4,961 (m, 1 H) 5,796-5,767 (d, J=11,6 Hz, 1 H) 6,255-6,196 (m, 2 H) 8,316-8,312 (d, J=1,6 Hz, 1H) O isômero geométrico Z confirma pelo valor de acoplamento constante JJ de ligação de olefina: 11,6 Hz; LCMS: 85,78% (224,26, M+H), RT: 2,49 min.
[00245] Etapa 9. Ácido (Z)-4-(isoxazol-3-il) pent-2-enoico, Com- posto 10i. A uma solução agitada do Composto 9i (420 mg, 1,88 mmol) em DCM (42 ml) foi adicionado TFA (4,2 ml, 41,50 mmol) a 25ºC e a mistura foi agitada por 4 h. O progresso da reação foi monito- rado por TLC (30% EtOAc em éter de petróleo, Rf=0,1, UV ativo). Após a conclusão da reação, o solvente foi evaporado a 25ºC sob pressão reduzida para obter o produto bruto. O composto em bruto foi purificado por HPLC preparativa [Fase móvel A: 10 FA; Fase móvel B: coluna de acetonitrila: fenil hexil Xselect (150 x 19) mm, Su; Vazão: 16 ml/min; Método: 0/20, 2/20, 10/50; Solubilidade: - ACN + Água + THF; Temperatura ambiente] para obter o Composto 10i (142 mg, 45,2%) como um óleo incolor. *H RMN (400 MHz, DMSO-ds) 5 ppm 1,33 (d, J=7,02 Hz, 3 H) 4,90 - 5,02 (m, 1 H) 5,81 (d, J=11,40 Hz, 1 H) 6,31 (t, J=10,74 Hz, 1 H) 6,57 (d, J=1,32 Hz, 1 H) 8,81 (d, J=1,32 Hz, 1 H) 12,31 (s, 1 H); LCMS: 98,16% (166,15, M-H), RT: 1,43 min.
[00246] ParteB: = 0, A A A oon 10i o do o AFP Ã TP o KR
DIPEA NÓ NT HN HoN' SS Composto 8 Etapa 1 o Ao “>coocH; HO" o- 9 o PÁ O Catalisador de Grubbs-ll o” IK É "CoocHs NÉ HN Ho" BRA o Etapa 2 So Composto 4
[00247] Etapa 1. (Z)-N-((2R, 3R, 5S, 68S)-2,5-dimetil-6-((E)-3- metilpenta-2,4-dien-1-il)tetra-hidro-2H-piran-3-il)-4-(isoxazo|-3- il)pent-2-enamida, Composto 1j. A uma solução agitada do Compos- to 8 (150 mg, 0,716 mmol) e Composto 10i (119 mg, 0,716 mmol) em THF (10 ml) a 23ºC, foi adicionado DIPEA (0,65 ml, 3,58 mmol) e T;P (50% EtOAc) (0,68 mL, 2,14 mmol). A mistura de reação foi agitada em temperatura ambiente durante 3 h. O progresso da reação foi mo- nitorado por TLC (50% EtOAc em hexano, R:=0,6, UV visível). Após a conclusão, a mistura de reação foi concentrada in vacuo para obter o composto bruto. O resíduo bruto foi purificado por cromatografia rápida (20 a 50% EtOAc em hexanos) em sílica (100-200 mesh) para gerar o Composto 1j (130 mg, 50,78%) como um líquido amarelo pálido. *H RMN (400 MHz, clorofórmio-d) ô ppm 8,27 - 8,32 (m, 1 H) 6,37 (dd, J=17,33, 10,68 Hz, 1 H) 6,24 - 6,380 (m, 1 H) 6,14 (td, J=11,20, 9,97 Hz, 1 H) 5,72 - 5,88 (m, 2 H) 5,40 - 5,50 (m, 1 H) 5,06 - 5,21 (m, 2 H) 4,96 (d, J=10,57 Hz, 1 H) 3,91 - 4,02 (m, 1 H) 3,63 - 3,73 (m, 1 H) 3,51 - 3,59 (m, 1 H) 2,33 - 245 (m, 1 H) 2,19 - 2,31 (m, 1 H) 1,91 - 1,99 (m, 2 H) 1,81 (ddd, J=9,92, 4,96, 2,45 Hz, 1 H) 1,76 (s, 3 H) 1,43 - 1,50 (m, 4 H) 1,24 - 1,28 (m, 3 H) 1,15 (dd, J=13,19, 6,43 Hz, 3 H) 1,02 (dd, J=13,95, 7,41 Hz, 3 H); LCMS: 93,58% (359,40, M+H), RT: 2,73 min e 2,75 min.
[00248] Etapa 2. 2-((3R,5S, 7R, 8R)-8-hidróxi-7-((1E, 3E)-5-((2S, 3S, 5R, 6R)-5-((2)-4-(isoxazol-3-il)pent-2-enamido)-3,6-dimetiltetra- hidro-2H-piran-2-il)-3-metilpenta-1,3-dien-1-i1)-1,6-dioxaespiro[2.5] octan-5-il)acetato de metila, Composto 4. A uma solução agitada do Composto 1j (120 mg, 0,335 mmol) em DCM (10 ml) a 23ºC, foram adicionados o Composto 9 (114 mg, 0,502 mmol) e o catalisador de Grubbs-ll (85 mg, 0,10 mmol) sob uma atmosfera de nitrogênio. A mis- tura de reação foi agitada a 40ºC por 5 h. O progresso da reação foi monitorado por TLC (50% EtOAc em hexanos, Rr= 0,1, UV visível). À mistura de reação foi filtrada através de celite e lavada com DCM (5 ml) e o filtrado foi concentrado sob pressão reduzida para obter o composto bruto. O resíduo bruto foi purificado por HPLC preparativa [Fase Móvel A: 10 mm ABC; Fase móvel B: acetonitrila; Coluna: X- select fenil-hexil (150 x 19) mm, 5u; Método: (T/% B): 0/20, 2/20, 12/55, 20,50/90, 22/90; Vazão: 16 ml/min; Temperatura ambiente]. As frações coletadas foram liofilizadas para gerar o Composto 4 (5 mg) como uma goma castanha pálida. *H RMN (400 MHz, clorofórmio-d) 5 ppm 8,30 (s, 1 H) 6,38 (br d, J=15,89 Hz, 1 H) 6,28 (dd, J=3,30, 1,59
Hz, 1 H) 6,07 - 6,20 (m, 1 H) 5,80 - 5,87 (m, 1 H) 5,76 (dd, J=11,13, 3,06 Hz, 1 H) 5,63 (dd, J=15,77, 6,24 Hz, 1 H) 5,52 (br t, J=6,85 Hz, 1 H) 5,05 - 5,23 (m, 1 H) 4,50 (ddd, J=11,68, 7,15, 4,89 Hz, 1 H) 4,21 (br t, J=6,72 Hz, 1 H) 3,92 - 4,01 (m, 1 H) 3,63 - 3,75 (m, 7 H) 3,46 - 3,58 (m, 2 H) 2,89 - 3,03 (m, 2 H) 2,60 - 2,74 (m, 2 H) 2,34 - 2,46 (m, 1 H) 2,13 - 2,32 (m, 3 H) 1,90 - 1,99 (m, 2 H) 1,71 - 1,85 (m, 6 H) 1,47 (dd, J=6,97, 2,57 Hz, 3 H) 1,15 (dd, J=13,45, 6,36 Hz, 3 H) 1,02 (dd, J=14,18, 7,34 Hz, 3 H); LCMS: 92,45% (559,3, M+H), RT: 4,75 min e 4,80 min. Exemplo 5 Síntese de 2-((3R, 5S, 7R, 8R)-8-hidróxi-7-((1E, 3E)-5-((2S8,3S,5R, 6R)-5-((2)-4-(3-metóxi-isoxazol-5-il)pent-2-enamido)-3,6- dimetiltetra-hidro-2H-piran-2-il)-3-metilpenta-1,3-dienil)-1,6- dioxaespiro[2.5]octan-5-il) acetato metila, Composto 5
[00249] Parte A: RS Mel, K;CO; » NsBH, o > necos É À = uooe E — se EX A 1 — Etapa1 FP Etapa 2 3 Etapa 3 4x » b KCN DMsO CDA Mel, K;CO, o LS Etapa 4 5 Etapa 5 6k MeOH » piexano HE neoos LA o Etapa 6 n 8 nei o > o b A Oo %O maio — Me A LAH HA FA 1 o o Etapa 7 s& Etapa 8 ok Etapa 9
“ »
HW D E TFA, DCM cod EE >, o 10k —Etapato 1
[00250] Etapa 1. 3-Metóxi-isoxazol-5-carboxilato de metila, Composto 2k. A uma solução agitada de 3-hidróxi-isoxazol-5- carboxilato de metila (Composto 1k) (23,5 g, 16,483 mmol) em DMF (200 ml) foi adicionado K2CO; (34,01 g, 24,65 mmol) a 0ºC e a mistura foi agitada por 10 minutos. Em seguida, foi adicionado iodeto de metila (15,35 ml) e a reação foi deixada aquecendo até 29ºC, agitada por 16 h. O progresso da reação foi monitorado por TLC (20% EtOAc em he- xano, Rf: 0,7, UV ativo). A mistura de reação foi diluída com água (100 ml) e acidificada por adição de 6 N HCI até pH4 e foi extraída com EtOAc (3 x 100 ml). A camada orgânica foi lavada com solução de salmoura (100 ml), seca sobre Na2SO:,, filtrada e concentrada para produzir o produto bruto (30 g), que foi purificado por cromatografia em coluna de fase normal usando sílica-gel (100-200 mesh) e eluindo com 10% EtOAc em éter de petróleo. As frações coletadas foram evapora- das para obter o Composto 2k (20 g, 72,8%) como um sólido esbran- quiçado. *H RMN (400 MHz, clorofórmio-d) 5 ppm: 3,95 (s, 3 H), 4,03 (s, 3 H), 6,54 (s, 1 H); LCMS: 99,16% (158,07, M+H), RT: 1,43 min.
[00251] Etapa 2. (3-metóxi-isoxazol-5-il) metanol, Composto 3k. A uma solução agitada do Composto 2k (20 g, 127,38 mmol) em me- tanol (200 ml) arrefecido até 0ºC, foi adicionado NaBHa (12,047 9, 318,47 mmol) em porções. A reação foi deixada aquecer até 20ºC e agitada por 5 h. O progresso da reação foi monitorado por TLC (50% EtOAc em hexano, Rf: 0,3, PMA ativo). A mistura de reação foi inter- rompida com NHaCI aquoso (20 ml) a 0ºC. O solvente foi evaporado sob pressão reduzida a 30ºC para obter um resíduo que foi diluído em água (100 ml) e extraído com 10% MeOH em DCM (3 x 200 ml). As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com salmoura (100 ml), secas sobre Na2SO:, filtradas e concentradas para obter o Com- posto 3k (13 g, 79%) como um líquido amarelo pálido. *H RMN (400 MHz, clorofórmio-d) 5 ppm: 2,49 (s, 1 H), 3,96 (s, 3 H), 4,64 (d, J=5,70 Hz, 2 H), 5,88 (s, 1 H); LCMS: 98,84% (130,06, M+H), RT: 0,90 min.
[00252] Etapa 3. 5-(Bromometil)-3-metóxi-isoxazol, Composto 4k. A uma solução agitada do Composto 3k (13 g, 100,77 mmol) em DCM (200 ml), TPP (26,4 g, 100,77 mmol) e CBra (33,42 g, 100 mmol) foram adicionados a 0ºC e, em seguida, a mistura de reação foi deixa- da aquecer até 25ºC e agitada por 2 h. O progresso da reação foi mo- nitorado por TLC (20% EtOAc em hexano, Rf: 0,8, UV ativo). A mistura de reação foi lavada com água (2 x 100 ml) e solução de salmoura (100 ml). A camada orgânica foi seca sobre Na2SO:, filtrada e concen- trada para obter o produto bruto como um líquido amarelo pálido (23 g), o qual foi purificado por cromatografia em coluna de fase normal usando sílica-gel (100-200 mesh) e eluindo com 10% EtOAc em éter de petróleo como um eluente. As frações coletadas foram evaporadas para obter o Composto 4k (15 g, 78%) como um líquido amarelo páli- do. *H RMN (400 MHz, clorofórmio-d) 5 ppm: 5,94 (s, 1H), 4,33 (s, 2H), 3,97 (S, 3H); LCMS: 92,15% (192,16, M+H), RT: 1,59 min.
[00253] Etapa 4.2-(3-Metóxi-isoxazol-5-il)acetonitrila, Composto B5k. A uma solução agitada do Composto 4k (15 g, 78,53 mmol) em DMSO (150 ml) e água (40 ml) foi adicionado KCN (7,65 g, 117,80 mmol) a 0ºC e a reação foi deixada aquecer até 25ºC e foi agitada du- rante 3 h. O progresso da reação foi monitorado por TLC (30% EtOAc em hexano, Rf: 0,3, ativo com iodo). A mistura de reação foi diluída com água (100 ml) e extraída com EtOAc (2 x 150 ml). As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com água (100 ml) e solução de salmoura (100 ml), secas sobre Na2SO, e concentradas sob pressão reduzida para obter o composto bruto (12 g), que foi purificado por cromatografia em coluna de fase normal usando sílica-gel (100-200 mesh) e eluindo com 15% EtOAc em éter de petróleo. As frações cole- tadas foram evaporadas para obter o Composto 5k (6 g, 55%) como um sólido amarelo pálido. *H RMN (400 MHz, clorofórmio-d) 5 ppm: 6,00 (s, 1 H), 3,98 (s, 3 H), 3,79 (s, 2 H); LCMS: 77,99% (138,92, M+H), RT: 1,54 min.
[00254] Etapa 5. 2-(3-Metóxi-isoxazol-5-il)propanonitrila, Com- posto 6k. A uma suspensão do Composto 5k (6 g, 43,478 mmol) em acetonitrila (60 ml) foi adicionado K2CO;3 (6,6 g, 47,825 mmol) a 0ºC e a reação foi agitada por 20 min. Adicionou-se iodeto de metila (16,22 ml, 260,86 mmol) em acetonitrila (20 ml) à reação a 0ºC. Após a adi- ção, a mistura de reação foi deixada aquecer até 25ºC e agitada por 48 h. O progresso da reação foi monitorado por TLC (30% EtOAc, RF = 0,4, KMnO; ativo). Após a conclusão da reação, a mistura foi filtrada, o filtrado foi diluído com EtOAc (150 ml) e lavado com água (50 ml) e solução de salmoura (50 ml). A camada orgânica foi seca sobre Na2SO. e concentrada sob pressão reduzida para obter o composto bruto (9 g), o qual foi purificado por cromatografia em coluna de fase normal usando sílica-gel (100-200 mesh) e eluindo com 8% EtOAc em éter de petróleo. As frações coletadas foram evaporadas para obter o Composto 6Kk (3 g, 45%) como um líquido amarelo pálido. *H RMN (400 MHz, clorofórmio-d) 5 ppm: 5,96 (s, 1 H), 4,01 (m, 1 H), 3,99 (s, 3 H), 1,71 (d, 3 H); LCMS: 85,72% (153,21, M+H), RT: 1,43 min.
[00255] Etapa 6. 2-(3-Metóxi-isoxazol-5-il)propanoato de metila, Composto 7k. A uma solução do Composto 6Kk (3 g, 19,736 mmol) em MeOH (20 ml) foi adicionado HCI 4,0 M em 1,4-dioxano (20 ml) em um tubo vedado de 100 ml, que foi aquecido até 70ºC e agitado por 24 h. O progresso da reação foi monitorado por TLC (30% EtOAc em hexa- no, RF=0,6, PMA ativo). Após a conclusão da reação, a mistura de re-
ação foi concentrada e o resíduo foi retomado em EtOAc (100 ml) e lavado com solução de NaHCO; (2 x 50 ml), água (50 ml) e solução de salmoura (50 ml). A camada orgânica foi seca sobre Na2SO. e concen- trada sob pressão reduzida para obter o composto bruto (3,5 g), o qual foi purificado por cromatografia em coluna de fase normal usando síli- ca-gel (100-200 mesh), eluindo com 5% EtOAc em éter de petróleo. As frações coletadas foram evaporadas para obter o Composto 7k (3 9, 83%) como uma goma amarela pálida. *H RMN (400 MHz, clorofórmio- d) ô ppm: 5,80 (s, 1 H), 3,95 (s, 3 H), 3,82 (m, 1 H), 3,73 (s, 3 H), 1,55 (d, 3H); LCMS: 94,48% (186,22, M+H), RT: 1,54 min.
[00256] Etapa 7. N-Metóxi-2-(3-metóxi-isoxazol-5-il)-N-metilpro- panamida, Composto 8k. A uma solução agitada do Composto 7k (3 g, 16,216 mmol) e cloridrato de N,O-dimetil hidroxilamina (3,16 9, 32,43 mmol) em THF (50 ml) foi adicionado complexo de cloreto de isopropil magnésio e cloreto de lítio (37,42 ml, 48,648 mmol) a 0ºC. Após a adição, a mistura reacional foi agitada durante 3 h em tempera- tura ambiente. O progresso da reação foi monitorado por TLC (50% EtOAc puro, Rf=0,3, PMA ativo). Após a conclusão, a mistura de rea- ção foi interrompida com solução saturada de cloreto de amônio a 0ºC e extraída com acetato de etila (3 x 100 ml). As camadas orgânicas combinadas foram secas sobre sulfato de sódio e concentradas sob pressão reduzida para obter o produto bruto (5 g), que foi purificado por cromatografia em coluna de fase normal usando sílica-gel (100- 200 mesh), eluindo com 20% EtOAc em éter de petróleo. As frações coletadas foram evaporadas para obter o Composto 8k (2,1 g, 60%) como um líquido amarelo pálido. *H RMN (400 MHz, clorofórmio-d) 5 ppm: 5,80 (s, 1 H), 4,31 (m, 1 H), 3,94 (s, 3H), 3,68 (s, 3 H), 3,21 (s, 3H), 1,47 (d, 3H); LCMS: 97,22% (215,23, M+H), RT: 1,40 min.
[00257] Passo 8. 2-(3-metóxi-isoxazol-5-il)Dropanal, Composto 9k. A uma solução agitada do Composto 8k (1,8 g, 8,411 mmol) em
THF (30 ml) foi adicionado LAH (4,2 ml, 8,411 mmol, 2 Mem THF) a - 78ºC e a mistura foi agitada por 30 minutos a -78ºC. O progresso da reação foi monitorado por TLC (30% EtOAc, RF=0,4, 2, 4- DNP ativo). Após a conclusão da reação, esta foi interrompida com uma pasta de sulfato de sódio e agitada por 30 min em temperatura ambiente. Os sólidos não dissolvidos foram filtrados e lavados com acetato de etila (50 ml). O filtrado foi seco com sulfato de sódio e evaporado sob pres- são reduzida para gerar o Composto 9k (1,1 g). O produto bruto foi utilizado para o passo seguinte sem purificação. A presença de um composto aldeído foi confirmada por *H RMN.
[00258] Etapa 9. 4-(3-metóxi-isoxazol-5-il)pent-2-enoato de (Z)- terc-butila, Composto 10k. A uma solução agitada de 18-coroa-6 (19,18 g, 72,58 mmol) e 2-(difenoxifosfino) acetato de terc-butila (4,61 9, 14,51 mmol) em THF (50 ml) foi adicionado LIHMDS (14,51 ml, 14,51 mmol, 1 M em THF) gota a gota a -78ºC. Após a adição, a mis- tura de reação foi agitada a -78ºC por 40 min. Em seguida, o Compos- to 9k (1,1 g, 14,51 mmol) em THF (10 ml) foi adicionado à mistura de reação a -78ºC. Após a adição, a mistura de reação foi agitada por 2 h em temperatura ambiente. O progresso da reação foi monitorado por TLC (20% EtOAc em hexano, RF=0,7, PMA ativo). Após a conclusão da reação, esta foi interrompida com solução de cloreto de amônio sa- turada, extraída com acetato de etila (3 x 100 ml) e seca com sulfato de sódio. O solvente foi evaporado sob pressão reduzida para obter o produto bruto (3 g), o qual foi purificado por coluna de sílica usando um EtOAc a 2% em gradiente de hexano. As frações puras foram cole- tadas e evaporadas sob pressão reduzida para o Composto 10k (350 mg, 19%) como um líquido amarelo. *H RMN (400 MHz, clorofórmio-d) õ ppm: 1,40 (d, J=7,02 Hz, 3 H), 1,45 - 1,52 (m, 9 H), 3,94 (s, 3 H), 4,87 - 4,97 (m, 1 H), 5,64 (s, 1 H), 5,77 (d, J=11,40 Hz, 1 H), 6,10 (dd, J=11,18, 9,87 Hz, 1 H); LCMS: 91,94% (254,31, M+H), RT: 2,60 min.
[00259] Etapa 10. Ácido (2)-4-(3-Metóxi-isoxazol-5-il)pent-2- enoico, Composto 11k. A uma solução agitada do Composto 10k (350 mg, 1,383 mmol) em DCM (35 ml) foi adicionado TFA (3,17 ml, 41,50 mmol) a 29ºC e a mistura foi agitada por 6 h. O progresso da reação foi monitorado por TLC (EtOAc a 30 % em éter de petróleo, RF=0,2, UV ativo). Após a conclusão da reação, o solvente foi evapo- rado a 25ºC sob pressão reduzida para obter o produto bruto. O com- posto bruto foi lavado com n-pentano (2 x 10 ml) e o resíduo sólido foi seco sob pressão reduzida para obter o Composto 11k (202 mg, 87%) como um sólido esbranquiçado. O valor constante do acoplamento JJ confirmou a formação do isômero geométrico Z. *H RMN (400 MHz, DMSO-ds) 5 ppm: 12,62 (br, 1H), 6,25 (dd, J=11,18, 9,87 Hz, 1 H), 6,06 (s, 1H), 5,87 (d, J=11,40 Hz, 1 H), 4,80 - 4,91 (m, 1 H), 3,86 (s, 3 H), 1,32 (d, J=7,02 Hz, 3 H); LCMS: 90,09% (198,24, M+H), RT: 2,54 min.
[00260] ParteB: y o = / à HOOC o o o. AÊ 11k o AÊ
RS TP NS H2N FA o HN 8 Etapa 1 am Oo Ao “coocH; HO" o 9 A o 2 O Catalisador de Grubbs-!l NO 7 e * "coocH;s FP o HN HO" o Etapa 2 SO Composto 5
[00261] Etapa 1. (Z)-N-((2R, 3R, 5S, 6S)-2,5-dimetil-6-((E)-3-
metilpenta-2,4-dienil)tetra-hidro-2H-piran-3-i1)-4-(3-metóxi- isoxazol-5-il)pent-2-enamida, Composto 1m. A uma solução agitada do Composto 8 (300 mg, 1,435 mmol), Composto 11k (170 mg, 0,861 mmol) em THF (10 mL), DIPEA (925 mg, 7,175 mmol) e T3P (50% EtOAc) (1,36 g, 4,305 mmol) foram adicionados em temperatura ambi- ente. A mistura de reação foi agitada em temperatura ambiente por 4 h. O progresso da reação foi monitorado por TLC (20% EtOAc em éter de petróleo, RF=0,5, UV ativo). O solvente de reação foi concentrado sob pressão reduzida para obter o produto bruto. O produto bruto foi purificado por cromatografia em coluna (100-200 sílica-gel/eluente 10% EtOAc em éter de petróleo) para produzir o Composto Im (90 mg, 16%) como uma goma incolor. *H RMN (400 MHz, clorofórmio-d) 5 ppm 6,37 (dd, J=17,61, 10,76 Hz, 1 H) 5,97 - 6,07 (m, 1 H) 5,70 - 5,81 (m, 2 H) 5,66 (s, 1 H) 5,46 (br t, J=7,09 Hz, 1 H) 5,07 - 5,22 (m, 2H) 4,96 (d, J=10,76 Hz, 1 H) 3,94 (d, J=1,96 Hz, 4 H) 3,68 (q, J=6,68 Hz, 1H) 3,55 (td, J=7,21, 2,69 Hz, 1 H) 2,34 - 2,46 (m, 1 H) 2,25 (dt, J=15,16, 7,58 Hz, 1 H) 1,95 (q, J=3,42 Hz, 2 H) 1,78 - 1,85 (m, 1 H) 1,76 (s, 3 H) 1,41 (dd, J=6,85, 1,96 Hz, 3 H) 1,21 - 1,380 (m, 2H) 1,15 (t, J=6,36 Hz, 3 H) 1,02 (t, J=7,34 Hz, 3 H); LCMS: 85,73% (389,36, M+H), RT: 2,71 e 2,74 min.
[00262] Etapa 2. 2((3R, 58, 7R, 8R)-8-hidróxi-7-((1E, 3E)-5-((2S, 3S, 5R, 6R)-5-((2)-4-(3-metóxi-isoxazol-5-il)pent-2-enamido)-3,6-di- metiltetra-hidro-2H-piran-2-il)-3-metilpenta-1,3-dienil)-1,6-dioxaes- piro[2.5]octan-5-il) acetato de metila, Composto 5. A uma solução agitada do Composto 1m (77 mg, 0,198 mmol) e do Composto 9 (77 mg, 0,337 mmol) em DCM (8 ml) foi adicionado catalisador de Grubbs- Il (50 mg, 0,059 mmol) em temperatura ambiente sob atmosfera de argônio. A mistura de reação foi agitada a 40ºC por 5 h. O progresso da reação foi monitorado por TLC (50% EtOAc em éter de petróleo, RF=0,1, UV ativo). A mistura de reação foi filtrada através de um filtro de celite e lavada com DCM (2 ml). O solvente foi concentrado sob pressão reduzida para obter o produto bruto. O produto bruto foi purifi- cado por HPLC preparativa [Fase Móvel A: 10 mm ABC; Fase móvel B: acetonitrila; Coluna: X-Bridge (150 x 19) mm, Su; Coluna: Método: (T/% B): 0/30, 2/30, 20/30,20/60, 20,5, 90, 22/90; Vazão: 18 ml/min; Solubilidade: ACN + THF+ água; Temperatura ambiente]. As frações combinadas foram liofilizadas para obter o composto 5 do produto pu- ro(7,5 mg, 6,4%) como um sólido esbranquiçado. *H RMN (400 MHz, clorofórmio-d) à ppm 6,37 (d, J=15,78 Hz, 1 H) 6,02 (ddd, J=11,18, 9,76, 2,52 Hz, 1 H) 5,68 - 5,80 (m, 2 H) 5,57 - 5,67 (m, 2 H) 5,51 (br t, J=7,13 Hz, 1 H) 5,06 - 5,22 (m, 1 H) 4,43 - 4,55 (m, 1 H) 4,20 (br t, J=6,69 Hz, 1 H) 3,94 (d, J=1,75 Hz, 4 H) 3,61 - 3,73 (m, 4 H) 3,46 - 3,57 (m, 2 H) 2,87 - 3,02 (m, 2 H) 2,60 - 2,74 (m, 2 H) 2,33 - 2,48 (m, 2 H) 2,20 - 2,32 (m, 2 H) 2,16 (dd, J=13,81, 5,48 Hz, 1 H) 1,90 - 1,98 (m, 2H) 1,71 - 1,85 (m, 6 H) 1,41 (dd, J=7,02, 1,97 Hz, 3 H) 1,14 (t, J=6,36 Hz, 3 H) 1,01 (t, J=7,34 Hz, 3 H); LCMS: 90,65% (589,11, M+H), RT: 3,95, 4,01 min. Exemplo 6 Síntese de 2-((3R, 5S, 7R, 8R)-7-((1E, 3E)-5-((2S, 3S, 5R, 6R)-3,6- dimetil-5-((Z2)-4-(5-metil-1,2,4-oxadiazol-3-il)pent-2-enamido)tetra- hidro-2H-piran-2-il)-3-metilpenta-1,3-dienil)-8-hidróxi-1,6-dioxaes- piro[2.5]octan-5-il) acetato de metila, Composto 6
[00263] Parte A: ON tão mN & AczO, piridina 9 < 'COOEt pa 2 mn 2n 3o LiOH, THF, H;O o ne NAMeONeRCL DIPEA o 9 ne —— <to Ro ————— SO Tr, Etapa 3 Ss Etapa 4 ' “ Etapa 5 4n sn
6n FscHaogeNaEA nel a o 6A = Vo Ros pode O toe 1 Etapa 6 7n Etapa 7 Composto 8n
[00264] Etapa 1. 3-(Hidroxilamino)-3-imino-2-metilpropanoato de etila, Composto 2n. A uma solução agitada de 2-cianopropanoato de etila (Composto 1n) (20 9, 15,7 mmol) em THF (500 ml) foi adicio- nada uma solução de KOtBu (314 ml, 31,4 mmol, 1 M em THF) a 0ºC. Após 10 min, foi adicionado cloridrato de hidroxilamina (27 g, 39,3 mmol) e a mistura de reação foi agitada em temperatura ambiente por 48 h. O progresso da reação foi monitorado por TLC (50% EtOAc em hexano, Rf: 0,1, KMnO;. ativo). A mistura de reação foi evaporada sob pressão reduzida e o resíduo foi purificado por coluna de sílica usando acetato de etila a 40% em hexano como um eluente. As frações puras foram coletadas e evaporadas sob pressão reduzida para obter o Composto 2n (5,5 g, 21,8%) como óleo incolor. *H RMN (400 MHz, DMSO-ds) 5 ppm 1,17 (t, J=7,15 Hz, 3 H), 1,24 (d, J=7,15 Hz, 3 H), 3,10 - 3,20 (m, 1 H), 3,92 - 4,23 (q, 2 H), 5,31 - 5,45 (br, 2 H); LCMS: 43,4% (161,13, M+H), RT = 0,37 min, e 49,48% (161,13, M+H), RT = 0,41 min.
[00265] Etapa 2. 2-(5-metil-1, 2, 4-oxadiazol-3-il) propanoato de etila, Composto 3n. A uma solução agitada do Composto 2n (5,5 9, 34,3 mmol) em piridina (50 ml) foi adicionado anidrido acético (9,7 ml, 10,3 mmol) em um tubo vedado em temperatura ambiente. A mistura de reação foi aquecida a 120ºC por 24 h. O progresso da reação foi monitorado por TLC (50% EtOAc em hexano, Rf: 0,5, KMnO; ativo). À mistura de reação foi evaporada sob pressão reduzida e o resíduo foi purificado por coluna de sílica usando 20% acetato de etila em hexano como um eluente. As frações puras foram coletadas e evaporadas sob pressão reduzida para obter o Composto 3n (4,5 g, 71,4%) como um óleo amarelo. *H RMN (400 MHz, clorofórmio-d) 5 ppm 1,26 (t, J = 7,09 Hz, 3 H), 1,58 - 1,62 (d, 3 H), 2,61 (s, 3 H), 3,89 - 4,00 (q, 1 H), 4,15 - 4,26 (q, 2 H); LCMS: 86,56% (185,22, M+H), RT = 1,48 min.
[00266] Etapa 3. Ácido 2-(5-Metil-1, 2, 4-oxadiazol-3-il) propa- noico, Composto 4n. A uma solução agitada do Composto 3n (4,59, 24,4 mmol) em MeOH:THF:H2O (45 ml, 4:4:1) foi adicionadoLiOH.H2O (4 g, 9,7 mmol) a 0ºC e a mistura de reação foi agitado em temperatu- ra ambiente durante 12 h. O progresso da reação foi monitorado por TLC (50% EtOAc em hexano, Rf: 0,1, KMnO; ativo). A mistura de rea- ção foi evaporada sob pressão reduzida, o pH do resíduo foi ajustado —1 usando 6N HCl (-10 ml) e depois extraído com acetato de etila (25 ml x 2). A camada orgânica combinada foi seca usando Na2SO. con- centrada sob pressão reduzida para obter o Composto 4n (3,5 g, 92%) como um óleo incolor. *H RMN (400 MHz, DMSO-ds) 5 ppm 1,41 (d, J =7,23 Hz, 3 H), 2,57 (s, 3 H), 3,88 - 3,97 (q, 1 H), 12,65 - 12,82 (br s, 1 H); LCMS: 94,38% (157,1, M+H), RT = 1,05 min.
[00267] Etapa 4. N-metóxi-N-metil-2-(5-metil-1,2,4-0xadiazol|-3-il) propanamida, Composto 5n. A uma solução agitada do Composto 4n (3,5 g, 22,4 mmol) em DCM (100 ml), EDC-HCI (6,4 g, 33,6 mmol), HOBt (4,5 g, 33,6 mmol) e DIPEA (11,7 ml, 67,2 mmol) foram adicio- nados a 0ºC. Após 10 minutos, foi adicionado cloridrato de N,O-dimetil hidroxilamina (3,2 g, 33,6 mol) a 0ºC. A mistura de reação foi agitada em temperatura ambiente por 12 h. O progresso da reação foi monito- rado por TLC (50% EtOAc em hexano, Rf: 0,2, KMnO: ativo). A mistu- ra de reação foi diluída com DCM (40 ml) e lavada com solução satu- rada de bicarbonato de sódio (30 ml). A camada orgânica foi separada e seca sobre sulfato de sódio. A camada orgânica foi evaporada sob pressão reduzida e 5 g de Composto 5n bruto foram obtidos. O com- posto bruto foi purificado por coluna de sílica utilizando 40% de acetato de etila em hexano como um eluente. As frações puras foram coleta- das e evaporadas sob pressão reduzida para obter o Composto 5n (2,2 g, 50%) como um óleo incolor, *H RMN (400 MHz, clorofórmio-d) 5 ppm 1,57 (d, J = 7,03 Hz, 3 H), 2,60 (s, 3 H), 3,26 (s, 3 H), 3,72 (s, 3 H), 4,34 - 4,42 (q, 1 H); LCMS: 96,65% (200,16, M+H), RT = 1,21 min.
[00268] Etapa 5. 2-(5-Metil-1, ,4-oxadiazol-3-il)Dropanal, Com- posto 6n. A uma solução agitada de LAH (380 mg, 10 mmol) em THF (10 ml) foi adicionado o Composto 5n (1 g, 50 mmol) em THF (20 ml) lentamente a 0ºC. A mistura de reação foi agitada em temperatura ambiente durante 1 h. O progresso da reação foi monitorado por TLC (40% EtOAc em hexano, Rf: 0,3, KMnO; ativo e 2, 4-DNP levemente ativo). A mistura de reação foi interrompida usando 1 N HCI (-3 ml) a 0ºC e agitada por 10 min e depois foi adicionado acetato de etila (20 ml). A mistura de reação foi então filtrada através de um leito de celite. O filtrado foi seco usando sulfato de sódio e o volume minimizado para 4 ml (-800 mg, bruto) do Composto6n. O composto 6n foi usado sem purificação adicional para a Etapa 6. ESMS: 40,4% (141,1, M+H), RT = 2,24 min (bruto); Nota: *H RMN não forneceu um espectro legível.
[00269] Etapa 6. (Z)-4-(5-metil-1, 2, 4-oxadiazol-3-il) pent-2- enoato de metila, Composto 7n. A uma solução agitada de 18-coroa- 6-éter (7,5 g, 28,5 m mol) em THF seco (30 ml) foi adicionado 2-(bis (2,2,2-trifluoroetóxi) fosforil) acetato de metila (1,3 ml, 6,2 m mol) a 0ºC, seguido de KHMDS 1 M em THF (6,2 ml, 6,2 mmol) a -78ºC. À mistura de reação foi mantida a -78ºC por 30 min e, em seguida, o Composto 6n (-800 mg) em THF seco (10 ml) foi adicionado a -78ºC. A mistura de reação foi deixada aquecer gradualmente até a tempera- tura ambiente e foi agitada à mesma temperatura por 2 h. O progresso da reação foi monitorado por TLC (30% EtOAc em hexano, Rf: 0,5,
KMnO:, ativo). A mistura de reação foi interrompida usando H2O (30 ml) e extraída em acetato de etila (50 ml x 2). As camadas orgânicas combinadas foram secas sobre sulfato de sódio e concentradas sob pressão reduzida para obter 600 mg do Composto 7n bruto. O com- posto bruto foi purificado por coluna de sílica utilizando 10% acetato de etila em hexano como um eluente. As frações puras foram coletadas e evaporadas sob pressão reduzida para obter o Composto 7n (420 mg, 59% puro por LCMS, 37%) como um óleo amarelo, *H RMN (400 MHz, clorofórmio-d) 5 ppm 1,44 - 1,48 (d, 3 H), 2,57 (s, 3 H) 3,74 (s, 3 H), 5,01 - 5,10 (q, 1 H), 5,92 — 5,89 (d, J = 10 Hz, 1 H), 6,35 - 6,46 (dd, J = Hz, 1 H); LOCMS: 59% (197,21, M+H), RT = 1,57 min. O isômero geométrico Z confirma pelo valor constante de acoplamento JJ de liga- ção de olefina: 10 Hz.
[00270] Etapa 7. Ácido (Z)-4-(5-metil-1, 2, 4-oxadiazol-3-il) pent- 2-enoico, Composto 8n. O Composto 7n (550 mg, 28 mmol, 80% pu- ro por LCMS) foi adicionado em dioxano (10 ml) e 2 N HCI (5 ml). À mistura de reação foi aquecida a 55ºC por 48 h. O progresso da rea- ção foi monitorado por TLC (30% EtOAc em hexano, Rf: 0,1, KMnO. ativo). A mistura de reação foi concentrada sob pressão reduzida e purificada utilizando HPLC preparativa para obter o Composto 8n puro (138 mg, 28,6%) como um óleo incolor. *H RMN (400 MHz, DMSO-d6) õ ppm 1,33 (d, J = 7,02 Hz, 3 H), 2,55 (s, 3 H), 4,86 - 5,08 (q, 1 H), 5,84 (dd, J = 11,40 Hz, 1 H), 6,24 (m, J = 10,52 Hz, 1 H), 11,64 - 12,96 (br s, 1 H); LCMS: 98,59% (183,21, M+H), RT = 1,4 min.
[00271] ParteB: < rose o Hon DIPEA, T;P NOx 8 Etapa 1 O 1p
Ao “>coocH; o Catalisador de Grubbs-1l do QTO "“coocHs N HN Ho" ! Etapa 2 E o Composto 6
[00272] Etapa 1.(Z)-N-((2R, 3R, 5S, 68)-2,5-dimetil-6-((E)-3-metil- penta-2,4-dienil)tetra-hidro-2H-piran-3-i1)-4-(5-metil-1,2,4-oxadio- zol-3-il)pent-2-enamida, Composto 1p. A uma solução agitada do Composto 8 (150 mg, 0,716 mmol), Composto 8n (130 mg, 0,716 mmol) em THF (5 ml) a 23ºC, foi adicionado DIPEA (0,65 ml, 2,385 mmol) e T3 (50% EtOAc) (0,68 ml, 1,431 mmol). A mistura de reação foi agitada a 23ºC por 3 h. O progresso da reação foi monitorado por TLC (50% EtOAc em hexano, Rr=0,6, UV visível). Após a conclusão, a mistura de reação foi concentrada in vacuo para obter o composto bru- to. O resíduo bruto foi purificado por cromatografia rápida (10 a 50% EtOAc em hexanos) em sílica (100-200 mesh) para gerar o Composto 1p (130 mg, 48,68%) como um líquido amarelo pálido. *H RMN (400 MHz, clorofórmio-d) 5 ppm 6,45-6,33 (m, 1 H) 6,17 - 6,42 (m, 1 H) 6,07 — 6,01 (m, 1 H) 5,85-5,79 (m, 1H) 5,46-5,45 (m, 1H) 5,13-5,09 (m, 1H) 4,97-4,88 (m, 1H) 3,96 (br, 1H) 3,68-3,66 (m, 1H) 3,55-3,52 (m, 1H) 2,56 9s, 3H) 2,39-2,35 (m, 1H) 2,27-2,21 (m, 1H) 2,04-1,98 (m, 1H) 1,93-1,90 (m, 2H) 1,82-1,76 (m, 3H) 1,49-1,46 (m, 3H) 1,28-1,21 (m 5H) 1,16-1,10 (m, 3H) 1,06-0,97 (m, 3H); LCMS: 85,98% (374,42, M+H), RT: 2,61 min e 2,63 min.
[00273] Etapa 2. 2-((3R, 5S, 7R, 8R)-7-((1E, 3E)-5-((2S, 3S, SR, 6R)-3,6-dimetil-5-((2)-4-(5-metil-1,2,4-oxadiazol-3-il)Dent-2-enami- do)tetra-hidro-2H-piran-2-il)-3-metilpenta-1,3-dienil)-8-hidróxi-1,6- dioxaespiro[2.5]octan-5-il)acetato de metila, Composto 6. À uma solução agitada do Composto 1p (120 mg, 0,321 mmol) em DCM (10 ml) a 23ºC, o Composto 9(109 mg, 0,481 mmol) e o catalisador de Grubbs-ll (81 mg, 0,096 mmol) foram adicionados sob uma atmosfera de nitrogênio. A mistura de reação foi agitada a 40ºC por 5 h. O pro- gresso da reação foi monitorado por TLC (50% EtOAc em hexanos, RrF=0,1, UV visível). A mistura de reação foi filtrada através de celite, lavada com DCM (5 ml) e o filtrado foi concentrado sob pressão redu- zida para obter o composto bruto. O resíduo bruto foi purificado por HPLC preparativa [Fase Móvel A: 10 mm ABC; Fase móvel B: acetoni- trila; Coluna: X-Bridge (150 x 19) mm, Su; Método: (T/% B): 0/30, 2/30, 20/60, 20,50/90, 22/90; Vazão: 18 ml/min; Solubilidade: ACN +THF+ Água; Temperatura ambiente]. As frações coletadas foram liofilizadas para gerar o Composto 6 (5 mg) como um sólido branco. *H RMN (400 MHz, clorofórmio-d) à ppm 6,31 - 6,44 (m, 1 H) 5,99 - 6,19 (m, 2 H) 5,77 - 5,89 (m, 1 H) 5,63 (br dd, J=15,89, 6,25 Hz, 1 H) 5,45 - 5,56 (m, 1H) 5,02 - 5,17 (m, 1 H) 4,83 - 4,96 (m, 1 H) 4,44 - 4,54 (m, 1 H) 4,20 (br t, J=6,69 Hz, 1 H) 3,90 - 4,02 (m, 1 H) 3,61 - 3,77 (m, 4 H) 3,44 - 3,58 (m, 3 H) 2,88 - 3,02 (m, 2 H) 2,61 - 2,76 (m, 2 H) 2,56 (s, 3 H) 2,38 (td, J=14,85, 7,34 Hz, 1 H) 2,12 - 2,29 (m, 2 H) 1,87 - 2,04 (m, 3 H) 1,70 - 1,84 (m, 5 H) 1,48 (dd, J=6,91, 4,71 Hz, 3 H) 1,08 - 1,20 (m, 3 H) 0,94 - 1,07 (m, 3 H); LCMS: 96,43% (574,15, M+H), RT: 3,59 min e 3,64 min. Exemplo 7 Síntese de 2-((3R, 58, 7R, 8R)-7-((1E, 3E)-5-((2S, 3S, 5R, 6R)-3,6- dimetil-5-((Z)-4-metil-5-((3-metiloxetan-3-il)óxi)pent-2-enamido) te- tra-hidro-2H-piran-2-il)-3-metilpenta-1,3-dien-1-i1)-8-hidróxi-1,6- dioxaespiro[2.5]octan-5-il) acetato de metila, Composto 7
[00274] Parte A: o MeMgBr o Br COzEt o Pdic o Y — O = Ron — om eos 1q Etapa 2q Etapa 2 4q sq
LAH e DMP e Femod oooue o so Etapa 4 “TT Etapa 5 o etapas o LioH O Tome Etapa 7 oo 8q 9q
[00275] Etapa 1. 3-Metiloxetan-3-ol, Composto 29. À uma solu- ção agitada de oxetan-3-ona (Composto 2q) (25 g, 346,9 mmol) em éter dietílico seco (1,25 |) foi adicionado gota a gota brometo de metil- magnésio 3 M em éter dietílico (127,2 mL, 381,6 mmol) a 0ºC durante um período de 2 h. A massa de reação foi agitada a 0ºC por 2h. O progresso da reação foi monitorado por TLC (40% EtOAc em hexano, Rf: 0,2, PMA ativo). A massa de reação foi interrompida usando Solu- ção de NH.CI sat. (-1 L) a 0ºC lentamente durante um período de 1 h. A camada orgânica foi separada e novamente a camada aquosa foi extraída com 10% MeOH em DCM (200 ml x 5). A camada orgânica combinada foi seca sobre Na2SOa anidro e evaporada sob pressão reduzida a 20ºC para obter o Composto 2q (16 g, 52%) como um óleo cor de laranja, *H RMN (400 MHz, DMSO-ds) 5 ppm 1,38 - 1,40 (s, 3 H) 4,26 (d, J = 6,58 Hz, 2 H), 4,43 (d, J = 5,92 Hz, 2 H), 5,50 (s, 1 H); GCMS = 98,87%.
[00276] Etapa 2. 2-(((3-metiloxetan-3-il)óxi)metil)acrilato de etila, Composto 4q. A uma solução agitada do Composto 2q (10,5 9, 119,16 mmol) em DMF (120 mL) foi adicionado NaH (5,72 g, 238,33 mmol) em porções a 0ºC. A mistura de reação foi agitada a 0ºC por 30 min seguida pela adição do Composto 3q (23 g, 119,16 mmol) a 0ºC e agitação em temperatura ambiente por 2 h. O progresso da reação foi monitorado por TLC (10% EtOAc em hexano, Rf: 0,5, UV e PMA ati- vo). A mistura de reação foi interrompida usando água gelada (120 ml)
e extraída usando éter dietílico (100 ml x 3). As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com água fria (100 ml x 3). A camada or- gânica foi separada e seca sobre sulfato de sódio anidro. A camada orgânica foi evaporada sob pressão reduzida e o resíduo foi purificado por coluna de sílica usando 10% acetato de etila em hexano como um eluente. As frações puras foram coletadas e evaporadas sob pressão reduzida para obter o Composto 4q (7 g, 29%) como um óleo incolor. 17H RMN (400 MHz, clorofórmio-d) 5 ppm 1,29 - 1,34 (t, 3 H), 1,58 - 1,60 (s, 3 H), 4,13 (s, J = 1,67 Hz, 2 H), 4,20 - 4,27 (q, 2 H), 4,37 - 4,40 (d, 2 H), 4,73 (d, J = 6,32 Hz, 2 H), 5,93 (s, 1 H) 6,32 (s, J= 1,55 Hz, 1 H); LCMS: 71,79% (201,23, M+H), RT = 1,57 min.
[00277] Etapa3. 2-Metil-3-((3-metiloxetan-3-il)óxi)propanoato de etila, Composto 5q. A uma solução agitada do Composto 4q (7 g, 35 mmol) em etanol (100 mL) foi adicionado 10% Pd/C (2 g) sob nitrogê- nio. A mistura de reação foi agitada em temperatura ambiente por 48 h sob atmosfera de hidrogênio usando uma bexiga de hidrogênio (-20 psi). O progresso da reação foi monitorado por TLC (10% EtOAc em Hexano, RF: 0,5, PMA ativo). A mistura de reação foi filtrada através de um leito de Celite e lavada com acetato de etila (200 ml x 2). A mis- tura de reação foi evaporada sob pressão reduzida para obter o Com- posto 5q (6 9, 84%) como um óleo incolor. *H RMN (400 MHz, DMSO- ds) 5 ppm 0,99 - 1,13 (d, 3 H), 1,14 - 1,26 (t, 3 H), 1,382 - 1,44 (s, 3 H), 2,57 - 2,67 (m, 1 H), 3,34 - 3,47 (m, 2 H), 4,00 - 4,14 (q, 2 H), 4,22 - 4,28 (d, 2 H), 4,40 - 4,48 (m, 2 H); LCMS: 85,89% (203,2, M+H), RT = 2,72 min.
[00278] Etapa 4. 2-Metil-3-((3-metiloxetan-3-il)óxi)propan-1-ol, Composto 6q. A uma solução agitada do Composto 5 q (1 9, 4,95 mmol) em THF seco (10 mL) foi adicionado LAH (282 mg, 7,42 mmol) a 0ºC e a mistura foi agitada em temperatura ambiente por 16 h. O progresso da reação foi monitorado por TLC (30% EtOAc em Hexano,
Rf: 0,2, KMnO; ativo). A mistura de reação foi interrompida usando água gelada (20 ml) a 0ºC e agitada em temperatura ambiente por 1 h. A mistura de reação foi filtrada através de um leito de celite e lavada com 10% MeOH em DCM (20 ml x 5). O produto foi extraído do licor mãe usando 10% MeOH em DCM (20 ml x 7). A camada orgânica foi separada e seca sobre sulfato de sódio anidro seguido de evaporação sob pressão reduzida para obter o Composto 6q bruto (700 mg, 88%) como um óleo incolor. *H RMN (400 MHz, DMSO-ds) 5 ppm 0,86 (d, J = 6,80 Hz, 3 H), 1,43 (s, 3 H), 1,66 - 1,76 (m, 1 H), 3,11 - 3,39 (m, 5H), 4,23 - 4,26 (d, 2 H), 4,37 - 4,41 (t, 1 H), 4,46 - 4,50 (d, 2H).
[00279] Etapa 5. 2-Metil-3-((3-metiloxetan-3-il)óxi)propanal, Composto 7q. A uma solução agitada do Composto 6q (500 mg, 3,12 mmol) em DCM (10 mL) foi adicionado periodinano de Dess-Martin (DMP) (1,72 g, 4,06 mmol) a 0ºC, agitado em temperatura ambiente por 2 h. O progresso da reação foi monitorado por TLC (30% EtOAc em hexano, Rf: 0,6, 2, 4-DNP e KMnO; ativo). A mistura de reação foi lavada com solução de NaHCO; saturado (-20 ml) e filtrada através de um leito de celite e lavada com diclorometano (30 ml x 2). O produto foi extraído do licor mãe usando diclorometano (20 ml x 2). As cama- das orgânicas combinadas foram separadas, secas sobre Na2SO. e evaporadas sob pressão reduzida. O resíduo foi purificado por uma coluna de sílica utilizando 15% acetato de etila em hexano como um eluente. As frações puras foram coletadas e evaporadas sob pressão reduzida para obter o Composto 7q (270 mg, 54%) como um compos- to pegajoso incolor. *'H RMN (400 MHz, clorofórmio-d) 5 ppm 1,17 (d, J =7,19 Hz, 3 H), 1,54 (s, 3 H), 2,48 - 2,71 (m, 1 H), 3,44 - 3,62 (m, 2H), 4,35 (d, J = 6,54 Hz, 2 H), 4,57 - 4,75 (d, 2 H), 9,60 - 9,80 (s, 1 H).
[00280] Etapa 6. (Z)-4-metil-5-((3-metiloxetan-3-il)óxi)pent-2- enoato de metila, Composto 8q. A uma solução agitada de 18-coroa- 6-éter (2,27 g, 8,54 mmol) em THF seco (10 ml) foi adicionado 2-
(bis(2,2,2-trifluoroetóxi)fosforil) acetato de metila (597 mg, 1,87 mmol) a 0ºC seguido pela adição de KHMDS 1 M em THF (1,7 ml, 1,70 mmol) a -78ºC. A mistura de reação foi mantida a -78ºC por 30 min e, em se- guida, foi adicionado o Composto 7q (270 mg, 1,70 mmol) em THF se- co (5 ml) a -78ºC e a mistura de reação foi deixada aquecer gradual- mente até a temperatura ambiente em 1,5 h. O progresso da reação foi monitorado por TLC (20% EtOAc em hexano, Rf: 0,5, KMnO; ativo). A mistura de reação foi interrompida usando água gelada (10 ml) e ex- traída em acetato de etila (10 ml x 2). A camada orgânica combinada foi seca sobre Na2SO. e evaporada sob pressão reduzida para obter 600 mg de Composto 7q bruto. O composto bruto foi purificado por coluna de sílica utilizando 8% acetato de etila em hexano como um eluente. As frações puras foram coletadas e evaporadas sob pressão reduzida para obter o Composto 7q (170 mg, 46%) como um óleo in- color. *H RMN (300 MHz, DMSO-d6s) 5 ppm 0,99 (d, J = 6,60 Hz, 3 H), 1,38 (s, 3 H) 3,25 (m, J = 6,42, 2,02 Hz, 2 H), 3,45 - 3,68 (m, 4 H), 4,24 (d, J=6,60 Hz, 2 H), 4,47 (m, J = 5,69 Hz, 2 H), 5,78 - 5,87 (d, 1 H), 6,14 - 6,24 (dd, 1 H); LCMS: 72% (215,4, M+H), RT = 1,68 min.
[00281] Etapa7. Ácido (Z)-4-metil-5-((3-metiloxetan-3-il)óxi)pent- 2-enoico, Composto 9q. A uma solução agitada do Composto 7q (170 mg, 0,794 mmol) em THF (2 ml) e H2 O (0,5 ml) foi adicionado LiOH.H2O (100 mg, 2,38 mmol) em temperatura ambiente. A mistura de reação foi agitada em temperatura ambiente durante 72 h. O pro- gresso da reação foi monitorado por TLC (70% EtOAc em hexano, Rf: 0,2, KMnO; ativo). A mistura de reação foi evaporada sob pressão re- duzida e diluída com água (10 ml) e lavada com 10% MeOH em DCM (5 ml x 10). A camada aquosa foi separada e acidificada usando 1 N HCI e ajustada para pH —2. O produto bruto foi extraído usando 10% MeOH em DCM (10 ml x 3). A camada orgânica foi separada e seca sobre sulfato de sódio anidro e evaporada sob pressão reduzida para obter o Composto 9q (119 mg, 75%) como um óleo incolor. *H RMN (400 MHz, DMSO-ds) à ppm 0,98 (d, J = 6,80 Hz, 3 H), 1,43 (s, 3 H), 3,24 (d, J = 6,36 Hz, 2 H), 3,51 - 3,65 (m, 1 H), 4,24 (d, J = 6,36 Hz, 2 H), 4,47 (t, J = 5,81 Hz, 2 H), 5,71 — 5,74 (dd, J = 12, 0,77 Hz, 1 H) 6,06 — 6,12 (dd, J = 10, 9,76 Hz, 1 H), 12,12 - 12,33 (br s, 1 H); ELSD: 98,47% (201,1, M+H), RT = 2,44 min; O isômero geométrico Z confir- ma pelo valor constante de acoplamento JJ de ligação de olefina: J=12,10 Hz.
[00282] ParteB: fo) x, o AA ão EL AM º ““coocH; o 9 o Nº ASA O >coocHs — Catalisador de Grubbs-!ll ae Ss o Etapa 2 º Composto 7
[00283] Etapa 1.(Z)-N-((2R, 3R, 58, 6S)-2,5-dimetil-6-((E)-3-metil- penta-2,4-dien-1-il)tetra-hidro-2H-piran-3-il)-4-metil-5-((3-metiloxe- tan-3-il)óxi)pent-2-enamida, Composto 1r. A uma solução agitada do Composto 8 (100 mg, 0,477 mmol), ácido (Z)-4-metil-5-((3-metilo- xetan-3-il)óxi)pent-2-enoico (Composto 1q) (95 mg, 0,477 mmol) em THF (5 ML) a 23ºC, foi adicionado DIPEA (0,43 mL, 2,385 mmol) e T;P (50% EtOAc) (0,45 mL, 1,431 mmol). A mistura de reação foi agitada em temperatura ambiente durante 3 h. O progresso da reação foi mo- nitorado por TLC (50% EtOAc em hexano, R:=0,5, UV visível). Após a conclusão, a mistura de reação foi concentrada in vacuo para obter o composto bruto. O resíduo bruto foi purificado por cromatografia rápida (10 a 50% EtOAc em hexanos) em sílica (100-200 mesh) para gerar o Composto 1r (75 mg, 40,10%) como um líquido amarelo pálido. *H RMN (400 MHz, clorofórmio-d) 5 ppm 6,37 (dd, J=17,38, 10,52 Hz, 1 H) 6,03 - 6,17 (m, 1 H) 5,68 - 5,85 (m, 2 H) 5,46 (br t, J=7,14 Hz, 1 H) 5,11 (d, J=17,44 Hz, 1 H) 4,96 (d, J=10,68 Hz, 1 H) 4,61 - 4,75 (m, 2 H) 4,28 - 4,37 (m, 2 H) 3,85 - 4,05 (m, 1 H) 3,47 - 3,73 (m, 4 H) 3,33 - 3,42 (m, 1 H) 3,14 - 3,25 (m, 1 H) 2,32 - 245 (m, 1 H) 2,19 - 2,30 (m, 1 H) 1,87 - 2,07 (m, 3 H) 1,49 - 1,64 (m, 12 H) 1,24 - 1,32 (m, 3 H) 1,16 - 1,22 (m, 2 H) 1,10 - 1,45 (m, 2 H) 1,05 (td, J=4,82, 2,23 Hz, 5 H) 0,99 (d, J=7,30 Hz, 2 H); LCMS: 89,55% (392,13, M+H), RT: 2,21 min.
[00284] Etapa 2. 2-((3R, 5S, 7R, 8R)-T-((1E, 3E)-5-((2S, 3S, 5R, 6R)-3,6-dimetil-5-((Z)-4-metil-5-((3-metiloxetan-3-il)óxi)pent-2- enamido)tetra-hidro-2H-piran-2-il)-3-metilpenta-1,3-dien-1-il)-8- hidróxi-1,6-dioxaespiro[2.5]octan-5-il) acetato, Composto 7. À uma solução agitada do Composto 1r (70 mg, 0,178 mmol) em DCM (10 ml) a 23ºC, foram adicionados o Composto 9 (61 mg, 0,268 mmol) e o ca- talisador de Grubbs-ll (45 mg, 0,053 mmol) sob uma atmosfera de ni- trogênio. A mistura de reação foi agitada a 40ºC por 5 h. O progresso da reação foi monitorado por TLC (50% EtOAc em hexanos, Rr= 0,1, UV visível). A mistura de reação foi filtrada através de celite, lavada com DCM (5 ml) e o filtrado foi concentrado sob pressão reduzida para obter o composto bruto. O resíduo bruto foi purificado por HPLC prepa- rativa [Fase Móvel A: 10mm ABC; Fase Móvel B: acetonitrila; Coluna: X-bridge (150 x 19) mm, Su; Método: (T/% B): 0/30,2/30,20/60,20.50/ 90,22/90; Vazão: 18 ml/min; Solubilidade: ACN +THF+ água; Tempe- ratura ambiente]. As frações coletadas foram liofilizadas para gerar o Composto 7 (3,5 mg) como um sólido branco. *H RMN (400 MHz, DMSO-ds) 5 ppm 7,57 (br dd, J=12,39, 8,00 Hz, 1 H) 6,28 (br d, J=15,78 Hz, 1 H) 5,99 - 6,08 (m, 1 H) 5,68 - 5,78 (m, 1 H) 5,58 (br dd,
J=16,00, 5,04 Hz, 1 H) 5,52 (br t, J=6,91 Hz, 1 H) 5,04 (br d, J=5,92 Hz, 1 H) 4,44 - 4,53 (m, 2 H) 4,19 - 4,32 (m, 4 H) 3,77 (ddt, J=15,65, 12,91, 6,55, 6,55 Hz, 1 H) 3,65 (br d, J=5,92 Hz, 2 H) 3,60 (s, 3 H) 3,46 - 3,54 (m, 1 H) 3,23 - 3,27 (m, 3 H) 3,20 (dd, J=6,25, 2,52 Hz, 2 H) 2,76 (d, J=5,26 Hz, 1 H) 2,67 (dt, J=4,00, 2,27 Hz, 3 H) 2,58 - 2,65 (m, 1 H) 2,15 - 2,36 (m, 3 H) 1,77 - 1,91 (m, 2 H) 1,70 (s, 3 H) 1,65 (br dd, J=6,47, 3,40 Hz, 3 H) 1,53 (br dd, J=12,93, 3,73 Hz, 1 H) 1,42 (s, 3 H) 1,03 - 1,11 (m, 3 H) 0,91 - 0,99 (m, 6 H); LCMS: 95,81% (592,24, M+H), RT: 3,72 min e 3,74 min. Exemplo 8 Síntese de 4-fluorobenzoato de (Z)-5-(((2R, 3R, 5S, 6S)-6-((2E, 4E)- 5-((38R, 4R, 5R, 78)-7-(2-((2,5-dioxopirrolidin-1-il)óxi)-2-0x0etil)-4- hidróxi-1,6-dioxaespiro[2.5]octan-5-il)-3-metilpenta-2,4-dien-1-il)- 2,5-dimetiltetra-hidro-2H-piran-3-il)amino)-5-oxopent-3-en-2-ila, Composto 10
[00285] Parte A: o Qt
F DZ o Oo Ha DIPEA S TX 8 Etapa 1 “o 1"
[00286] Etapa 1. 4-fluorobenzoato de (Z)-5-((2R, 3R, 5S, 6S)-2,5- dimetil-6-((E)-3-metilpenta-2,4-dienil)tetra-hidro-2H-piran-3-ilamino) -5-oxopent-3-en-2-ila, Composto 1f. A uma solução agitada do Com- posto 8 (400 mg, 1,91 mmol) em temperatura ambiente foram adicio- nados o Composto 4e (273 mg, 1,14 mmol) em THF (12 ml), DIPEA (1,23 g, 9,55 mmol) e T3P (50% EtOAc) (1,82 gd) em RT. A mistura de reação foi agitada em RT por 4 h. O progresso da reação foi monitora- do por TLC (30% EtOAc em éter de petróleo, Rr=0,2, PMA ativo). À mistura de reação foi concentrada sob pressão reduzida para obter o produto bruto. O produto bruto foi purificado por cromatografia em co- luna (100-200 sílica-gel/eluente 10% EtOAc em éter de petróleo) para produzir o Composto 1f (220 mg) como uma goma incolor. *H RMN (400 MHz, clorofórmio-d) 5 ppm 0,99 - 1,08 (m, 3 H) 1,11 - 1,20 (m, 3 H) 1,36 - 1,44 (m, 3 H) 1,47 - 1,55 (m, 5 H) 1,69 - 1,85 (m, 4 H) 1,89 - 2,03 (m, 2H) 2,19 - 2,32 (m, 1 H) 2,34 - 2,49 (m, 1 H) 3,49 - 3,59 (m, 1 H) 3,62 - 3,75 (m, 1 H) 3,91 - 4,04 (m, 1 H) 4,87 - 5,01 (m, 1 H) 5,11 (d, J=17,44 Hz, 1 H) 5,47 (br d, J=3,81 Hz, 1 H) 5,76 (ddd, J=11,61, 5,94, 1,20 Hz, 1 H) 5,88 - 6,09 (m, 2 H) 6,18 - 6,58 (m, 3 H) 7,05 - 7,16 (m, 2 H) 7,99 - 8,10 (m, 2 H); LCMS: 87,8% (430,07, M+H), RT: 2,50 min e 2,52 min.
[00287] ParteB:
OH QT: LoHHzO 2? ““cooH o SAD Ho Ho EDC.Ha no” Ô se Etapa 1 PP” Etapa 2 > o Terc-butil-hidroperóxido IND Acetoacetonato de vanadila = no“, o Etapa 3 ds
AE e: «a º Sã Catalisador de Grubbs-1| Etapa 4 o Oo Ho“ o,
[00288] Etapa 1. Ácido 2-((2S, 58, 6R)-5-hidróxi-4-metileno-6- viniltetra-hidro-2H-piran-2-il) acético, Composto 1s. A uma solução agitada do Composto 8c (600 mg, 2,83 mmol) em THF (9 mL) e água (1 mL) a 23ºC foi adicionado hidróxido de lítio monohidratado (178 mg,
4,24 mmol). A mistura de reação foi agitada a 23ºC por 16 h. O pro- gresso da reação foi monitorado por TLC (10% MeOH em DCM, Rr:0,1, PMA visível). Após a conclusão, o THF foi evaporado sob pressão reduzida. O resíduo resultante foi acidificado com ácido cítrico saturado, extraído com 10% MeOH em DCM (3 x 50 mL), seco sobre sulfato de sódio anidro, filtrado e concentrado in vacuo para gerar o Composto 1s (200 mg) como um líquido amarelo pálido. *H RMN (300 MHz, DMSO-ds) 5 ppm 12,15 (br s, 1 H) 5,87 (ddd, J=17,33, 10,73, 4,95 Hz, 1 H) 5,11 - 5,381 (m, 3 H) 5,05 (s, 1 H) 4,83 (s, 1 H) 4,14 - 4,26 (m, 1 H) 3,83 - 3,94 (m, 1 H) 3,68 (t, J=6,24 Hz, 1 H) 3,17 (d, J=5,14 Hz, 1 H) 2,43 (dd, J=6,97, 4,03 Hz, 2 H) 2,20 - 2,38 (m, 2H).
[00289] Etapa 2.2,5-dioxopirrolidin-1-il 2-((28S, 58, 6R)-5-hidróxi- 4-metileno-6-viniltetra-hidro-2H-piran-2-il) acetato, Composto 2s. À uma solução agitada do Composto 1s (200 mg, 1,008 mmol) e 1- hidroxipirrolidina-2,5-diona (174 mg, 1,513 mmol) em DCM (10 mL) a 23ºC foi adicionado cloridrato de EDC (289 mg, 1,513 mmol). A mistu- ra foi agitada a 23ºC por 12 h. O progresso da reação foi monitorado por TLC (sistema TLC: 50% EtOAc em hexano, R= 0,4, PMA visível). Após a conclusão da reação, o solvente foi concentrado sob pressão reduzida para obter o produto bruto. Este resíduo foi purificado por cromatografia rápida (20 a 50% EtOAc em hexano) em sílica (100-200 mesh) para gerar o Composto 2s (180 g, 60,60%) como um líquido amarelo pálido. *H RMN (400 MHz, clorofórmio-d) ô ppm 5,87 (ddd, J=17,44, 10,79, 5,99 Hz, 1 H) 5,31 - 5,44 (m, 2 H) 5,15 (s, 1 H) 5,02 (d, J=0,98 Hz, 1 H) 4,37 (qd, J=6,68, 4,36 Hz, 1 H) 4,14 - 4,22 (m, 1 H) 3,96 (t, J=5,34 Hz, 1 H) 2,89 (dd, J=6,54, 3,27 Hz, 2 H) 2,79 - 2,86 (m, 4 H) 2,51 - 2,59 (m, 1 H) 2,39 - 2,48 (m, 1 H) 2,30 (d, J=5,99 Hz, 1 H); LCMS: 79,10% (296,09, M+H), RT: 1,37 min.
[00290] Etapa 3. 2,5-dioxopirrolidin-1-il 2-((3R, 58, 7R, 8R)-8-hi- dróxi-7-vinil-1,6-dioxaespiro[2.5]octan-5-il) acetato, Composto 3s.
A uma solução do Composto 2s (180 mg, 0,609 mmol) em DCM (10 mL) a -20ºC foi adicionado acetoacetonato de vanadila (16 mg, 0,060 mmol) e hidroperóxido de terc-butila (TBHP) (5,5 M em decano) (0,22 mL). A mistura resultante foi então aquecida até 0ºC e agitada durante 2 h. Após 2 h, a mistura de reação foi aquecida até 23ºC e agitada por 18 h. Após a conclusão da reação como determinado por TLC (50% EtOAc em hexano, R= 0,2, PMA visível), o solvente foi concentrado sob pressão reduzida para obter o produto bruto. O resíduo bruto foi purificado por cromatografia rápida (30 a 60% EtOAc em hexano) em sílica (100-200 mesh) para gerar o Composto 3s (110 mg, 58,20%) como um líquido amarelo pálido. *H RMN (400 MHz, clorofórmio-d) 5 ppm 6,00 (s, 1 H) 5,44 (dt, J=17,41, 1,54 Hz, 1 H) 5,31 - 5,36 (mM, 1 H) 4,51 - 4,59 (m, 1 H) 4,20 - 4,27 (m, 1 H) 3,48 - 3,55 (m, 1 H) 3,10 - 3,20 (m, 1 H) 2,96 - 3,06 (m, 2 H) 2,79 - 2,90 (m, 6 H) 2,70 (d, J=4,47 Hz, 1 H) 2,05 (t, J=2,34 Hz, 1 H) 1,90 - 2,01 (m, 2 H).
[00291] Etapa 4. 4-fluorobenzoato de (Z)-5-(((2R, 3R, 58, 6S)-6- ((2E, 4E)-5-((38R,4R,5R,78)-7-(2-((2,5-dioxopirrolidin-1-il)óxi)-2-0x0- etil)-4-hidróxi-1,6-dioxaespiro[2.5]octan-5-il)-3-metilpenta-2,4-dien- 1-i1)-2,5-dimetiltetra-hidro-2H-piran-3-il)amino)-5-oxopent-3-en-2- ila, Composto 10. A uma solução agitada do Composto 1f (100 mg, 0,233 mmol) em DCM (10 ml) a 23ºC, o Composto 3s (108 mg, 0,502 mmol) e o catalisador de Grubbs-ll (59 mg, 0,069 mmol) foram adicio- nados sob um atmosfera de nitrogênio. A mistura de reação foi agitada a 40ºC por 6 h. O progresso da reação foi monitorado por TLC (50% EtOAc em hexano, Rr=0,1, UV visível). A mistura de reação foi filtrada através de celite e lavada com DCM (5 ml). O filtrado foi concentrado sob pressão reduzida para obter o produto bruto. A análise por LCMS mostrou um rendimento de 15% do produto desejado juntamente com o Composto 1f que não reagiu. O composto bruto foi purificado por HPLC preparativa. As frações coletadas foram liofilizadas para gerar o
Composto 10 (11 mg) como um sólido branco (7% de rendimento). O produto foi isolado como uma mistura de diastereômeros por HPLC preparativa [Fase Móvel A: ácido fórmico a 0,1%, Fase Móvel B: ace- tonitrila; Coluna: Synergy polar (250 x 21,2) mm, 4u; Método: (T/% B): 65:35 (isocrótico); Vazão: 18 ml/min; Solubilidade: ACN + THF + água; Temperatura ambiente]. *H RMN (400 MHz, clorofórmio-d) 5 ppm 8,05 (ddd, J=8,60, 5,65, 2,41 Hz, 2 H) 7,10 (t, J=8,55 Hz, 2 H) 6,36 - 6,58 (m, 2 H) 5,91 - 6,08 (m, 2 H) 5,76 (dd, J=11,62, 5,48 Hz, 1 H) 5,64 (dd, J=15,78, 5,92 Hz, 1 H) 5,54 (br s, 1 H) 4,48 - 4,60 (m, 1 H) 4,23 (br t, J=6,36 Hz, 1 H) 3,98 (br dd, J=5,26, 2,85 Hz, 1 H) 3,68 (q, J=6,28 Hz, 1H) 3,54 (br t, J=7,67 Hz, 2 H) 3,02 - 3,20 (m, 2 H) 2,99 (d, J=4,60 Hz, 1 H) 2,75 - 2,90 (m, 4 H) 2,69 (d, J=4,60 Hz, 1 H) 2,34 - 248 (m, 1 H) 2,11 - 2,31 (m, 2 H) 1,86 - 2,05 (m, 4 H) 1,73 - 1,84 (m, 4 H) 1,53 (br d, J=6,58 Hz, 3 H) 1,17 (t, J=6,14 Hz, 3 H) 1,04 (t, J=7,56 Hz, 3 H); LCMS: 96,58% (713,27, M+H), RT: 4,63 min & 4,67 min. Exemplo 9 Síntese de ADCs com Anticorpo Trastuzumabe, Composto 11 e Anticorpo Palivizumabe, Composto 12 O. LET ISA º "O, "e i 1 F. LES A Pe Ho" 3 9 º so 12
[00292] O composto 11, o Composto 10 conjugado com trastuzu- mabe, e o Composto 12, o Composto 10 conjugado com palivizumabe foram sintetizados em um procedimento adaptado de Arlotta, et al. (Antibodies, 2018, 7(1):6). Vinte e um mg de trastuzumabe comercial (Herceptin&O; Genentech; Pharmaceutical Buyers Inc., New Hyde Park, NY) e 5 mg de palivizumabe (Synagis&; Medimmune; Pharmaceutical Buyers Inc.) foram preparados para concentrações de 3 mg/mL nas formulações listadas na bula do fabricante original e dializados em tampão de conjugação [(50 mM de borato) (Alfa Aesar, Haverill, MA), 50 mM de NaCl (Sigma; St. Louis, MO), 2 mM de EDTA (Sigma), pH 8,5] usando dispositivos de diálise Slide-A-Lyzer"" (ThermoFisher Sci- entific, Waltham, MA). Adicionou-se dimetil acetamida (DMA; MP Bio- medicals, Santa Ana, CA) a cada formulação para trazer o conteúdo orgânico total para 10% v/v. Cada anticorpo foi então reagido com 8 equivalentes molares do Composto 10 a partir de um estoque de 20 mM em DMA. As reações de conjugação foram deixadas incubar em uma mesa agitadora por 2 h em temperatura ambiente. Para interrom- per o Composto 10 que não reagiu, 80 equivalentes molares de solu- ção salina tris tamponada com (TBS; Sigma) foram adicionados e in- cubados com agitação em temperatura ambiente durante 1 h. Os ADCs foram purificados e o tampão foi trocado para tampão de arma- zenamento [10 mM histidina (VWR), 50 mM trealose (Acros Organics, Waltham, MA), pH 6,0] usando as colunas de dessalinização Sephadex'y PD-10 G-25 (GE Healthcare, Chicago, IL). As recupera- ções finais e as concentrações de ADCs foram determinadas usando espectrofotometria UV/Vis (4 mL a 5,0 mg / mL Composto 11; 3,2mL a 1,1 mg/ml Composto 12). A razão fármaco-anticorpo (DAR) foi deter- minada por espectrofotometria UV/Vis e confirmada usando desvio de massa LC-MS (3,5 para o Composto 11; 2,8 para o Composto 12). À análise de agregação foi realizada para cada ADC usando cromatogra- fia de exclusão de tamanho (SEC) em uma coluna Superdex€O In- crease 5/150 GL (GE Healthcare) para garantir a integridade de espé- cies monoméricas (>98% para o Composto 11; > 99% para o Compos- to 12). O conteúdo de endotoxina para cada ADC foi confirmado como sendo < 1 EU/mL, utilizando um ToxinSensor'" Gel Clot Assay (GenS- cript; Georgetown, Grand Cayman, Ilhas Cayman).
[00293] Um procedimento semelhante é seguido para sintetizar
ADCSs adicionais da invenção divulgada, onde ligações amida a resí- duos de lisina formam o conjugado de fármaco. Diferentes toxinas po- dem ser substituídas pelo Composto 2 e ligantes que não amidas po- dem ser utilizados para produzir ADCs. Além disso, anticorpos que não o trastuzumabe e o palivizumabe podem ser substituídos depen- dendo das células cancerígenas alvo. Exemplo 10 Ensaios Celulares in vitro
[00294] No bDia1,as placas de 96 poços são semeadas com as |i- nhagens celulares de câncer SKBR3, HCC1954, MCF7 e MDAMB231 em meios a uma razão de número de células/poço predeterminada. A tailanstatina A é usada como um composto de teste de controle tóxico positivo para cada linhagem celular e diluente apenas como um con- trole negativo. As placas são incubadas em uma incubadora de CO, umidificada a 37ºC por 20 horas. No Dia 2, são preparadas diluições dos compostos de teste a serem testados. Os estoques de trabalho inici- ais das amostras são feitos em uma mídia apropriada. Uma diluição de 1/3 em série em meios é então preparada para cada composto de teste. ul da diluição são adicionados a cada poço de células de -100 ul. As concentrações finais da amostra variam de nM a pM (como diluições em série de 1/3). Pontos de dados duplicados ou triplicados são obtidos para todas as amostras. São produzidas três/duas amostras por placa usan- do poços nas linhas B, C, D, E, F, G. As placas são então incubadas em uma incubadora de CO> umidificada a 37ºC por 72 horas.
[00295] No Dia5, a viabilidade celular é analisada usando o rea- gente Cell-Titer Glo& usando o procedimento a seguir. O meio é aspi- rado da placa de 96 poços. 100 ul de reagente Cell-Titer Glo (Prome- ga, Inc., Madison, WI) são adicionados a cada poço. As placas são incubadas em RT por 10 min. A luminescência resultante é analisada usando um leitor de placas Tecan Ultra€.
[00296] Os dados resultantes são analisados e plotados como Via- bilidade Percentual vs. Concentração (nM). As curvas resultantes são ajustadas usando regressão não linear. A IC5so para cada composto de teste é então calculada e tabulada.
[00297] A toxicidade dos compostos da invenção pode ser determi- nada de maneira semelhante usando as seguintes linhagens celulares de câncer no ensaio acima descrito: linhagens celulares de leucemia incluindo CCRF-CEM, HL-60(TB), K-562, MOLT-4, RPMI-8226 e SR; linhagens celulares de câncer de pulmão de células não pequenas, incluindo AS49/ATCC, EKVX, HOP-62, HOP-92, NCI-H226, NCI-H23, NCI-H322M, NCI-H460 e NCI-H522; linhagens celulares de câncer de cólon incluindo COLO 205, HCC-2998, HCT-116, HCT-15, HT29, KM12 e SW-620; Linhagens celulares de câncer no SNC incluindo SF- 268, SF-539, SNB-19, SNB-75 e U251; linhagens celulares de mela- noma incluindo LOX IMVI, MALME-3M, M14, SK-MEL-2, SK-MEL-28, SK-MEL-5, UACC-257 e UACC-62; linhagens celulares de câncer de ovário, incluindo IGROV1, OVCAR-3, OVCAR-4, OVCAR-5, OVCAR-8 e SK-OV-3; linhagens celulares de câncer renal incluindo 786-0, A498, ACHN, CAKI-1, RXF 393, SN 12C, TK-10 e UO-31; linhagens celula- res de câncer de mama incluindo MCF7, HS 578T, MDA-MB-435, BT- 549, T-47D e MDA-MB-468; e linhagens celulares de câncer de prósta- ta PC-3 e DU-145. Exemplo 11 Ensaios celulares in vitro
[00298] —Alternativamente, a citotoxicidade in vitro dos compostos da invenção pode ser medida como descrito neste exemplo. 180 ul de cé- lulas HCT 116 (ATCC, Catt CCL-247) no McCoy's 5a Medium Modifi- ed (Sigma-AldrichO, St. Louis, MO) + 10% de soro fetal bovino foram semeados a uma densidade de 5.000 células/poço em uma placa opa- ca branca de 96 poços e incubados por 24 horas a 370ºC em uma in-
cubadora de 5% CO;». Vinte e quatro horas após a semeadura celular, 20 ul de 10X dos compostos de teste foram diluídos de modo que as concentrações finais dos compostos de teste estivessem na concen- tração de uM. Foram utilizadas diluições de meio log, começando de uM até 0,0001 uM. Puromicina e células não tratadas foram usadas como controles positivos. As células foram incubadas com os compos- tos por 72 horas a 370ºC em uma incubadora de 5%. CO», Após 72 horas, 100 ul/poço do reagente CellTiter-Glo& Luminescent Cell Viabi- lity Assay (Promega, Inc., Madison, WI; Cat. % G7573) foi adicionado às placas e incubado em temperatura ambiente por 30 minutos. Os sinais de luminescência foram capturados usando o EnVision 2105 Multimode Plate Reader (PerkinElmer, Waltham, MA). Os dados foram analisados usando o ajuste de curva de regressão não linear (resposta sigmoidal à dose) no software GraphPad Prism (GraphPad Software, La Jolla, CA) plotando a concentração da fármaco no eixo X e os valo- res de inibição percentuais médios no Y-eixo.
[00299] A Tabela 1 resume a citotoxicidade observada para os compostos de toxina indicados. Tabela 1 [eme to Test Team São 3 So pod ee Ro e "OX Ho 3 ,
[empossa ep] = OS o - NO DZ O o ECATO SS o o O. Ã O SS So o Fe] e Exemplo 12 Citotoxicidade in vitro de Compostos de Toxinas
[00300] Várias linhagens celulares de câncer foram obtidas da American Type Culture Collection (ATCCG). As células foram cultiva- das em uma incubadora umidificada de 5% CO>2 em um meio constitu- ído por RPMI 1640, L-glutamina e 10% FBS. As células foram transfe- ridas conforme necessário usando técnicas padrão de cultura de teci- dos. As células foram colhidas e plaqueadas em placas tratadas com cultura de tecidos de 96 poços a uma densidade de 5000 células por poço. Depois de deixar as células se equilibrarem durante — 24 horas em uma incubadora umidificada de 5% CO;,, as células foram tratadas com os compostos de teste nas concentrações indicadas. As células foram expostas aos compostos de teste por três dias sem mudança de meio. Após o período de tratamento, a solução reagente CellTiter- Glo& Luminescent Cell Viability Assay (Promega, Inc., Madison, WI; Cat. tt G7573) foi introduzida em cada poço. As placas contendo Cell TiterGlo foram então analisadas em um SpectroMaxO iD3 Multi-Mode Microplate Reader (Molecular Devices, LLC, San Jose, CA). O grau de luminescência foi determinado pela abundância de células vivas. As concentrações inibitórias citotóxicas a 50% (ICso) foram calculadas uti-
lizando a análise de regressão não linear GraphPad Prism 7.0 (Gra- phPad Software, La Jolla, CA).
[00301] As tabelas a seguir resumem a citotoxicidade (IC50), nM, observada para os compostos de toxinas especificados nas linhagens celulares de câncer indicadas, NCI-H23, DU145, SW480, SKOV3, A549, HT29, SK-MES-1, SKBR3, HCT116, MCF7, N87 e A431 (desig- nações ATCC). A Tabela 2 fornece a citotoxicidade para os Compos- tos 2,4 e6.
Tabela 2 o em Jess Jews
[00302] A Tabela3 mostra a citotoxicidade dos Compostos 1 a 7 em duas linhagens celulares de câncer de pâncreas humano, PANC
10.05 e PANC 05.04, usando a Tailanstatina A como controle positivo. Tabela 3 IC50, nM 1C50o, nM E as
[00303] A Tabela 4 fornece os dados de citotoxicidade para os Compostos 2, 4 e 6 nas linhagens celulares de câncer indicadas, HL60, KG-1, NCI-H69, SK-MEL-1, HEL-92.1.7 e K562 (designações ATCC).
Tabela 4 [NcrHSo os | os | om | [kz ess em eo | Exemplo 13 Citotoxicidade in vitro de ADCS
[00304] Em um procedimento semelhante ao descrito no Exemplo 12, a citotoxicidade do composto 11 de ADC foi determinada para as linhagens celulares de câncer indicadas. O composto 12 foi utilizado como um controle negativo. Tabela 3 : 1C5o (nM) IC5o (nM) Composto 12 Linhagens celulares Composto 11 (Controle) Exemplo 14 Estudo de eficácia in vivo no tratamento de NCI-N87 subcutâneo Xenoenxertos de Câncer Gástrico Humano em Camundongos Nu- de Balb/c Fêmeas
[00305] Um modelo de câncer de xenoenxerto de câncer gástrico humano, NCI=N87 (ATCCG Nº de Acesso CRL-58227Y), foi usado pa- ra testar a eficácia in vivo dos ADCs da invenção divulgada. 1 x 107 células tumorais NCI-N87 em 0,1 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) misturada com matrigel (1:1) foram injetadas no flanco direito de camundongos nude Balb/c fêmeas de 6 a 8 semanas de idade. A data da inoculação das células tumorais foi designada Dia O e o volume do tumor foi medido duas vezes por semana. Os volumes tumorais foram medidos em duas dimensões usando um paquímetro, e o volume expresso em mm? usando a fórmula: V = (C x L x L)/2, on- de V é o volume do tumor, C é o comprimento do tumor (a maior di- mensão do tumor) e L é a largura do tumor (a maior dimensão do tu- mor perpendicular a C). Quando o tamanho médio do tumor atingiu 150 - 300 mm?, os camundongos foram randomizados e segregados em 8 grupos de tratamento.
[00306] Os grupos de tratamento foram os seguintes, onde "Q4d*4"
significa que quatro doses totais de substância medicamentosa foram administradas com um intervalo de quatro dias entre cada dose, co- meçando no Dia 6: Grupo 1: Veículo (PBS) sozinho; Q4d*4; Grupo 2: 1 mg/kg de Composto 11; Q4d*4 Grupo 3: 3 mg/kg de Composto 11; Q4d*4; Grupo 4: 3 mg/kg de Composto 11; dose única no Dia 6; Grupo 5: 3 mg/kg de Composto 12; Q4d*4; Grupo 6: 10 mg/kg de Composto 11; dose única no Dia 6; Grupo 7: 10 mg/kg de Kadcyla; dose única no Dia 6; e Grupo 8: 3 mg/kg de Kadcyla; Q4d*4.
[00307] —Acada um dos oito grupos foi administrado o artigo de teste indicado por injeção i.v. O veículo (PBS) e o Composto 12 foram usa- dos como controles negativos para interrogar a influência do veículo (PBS) e direcionar os efeitos independentes do Composto 10 como uma molécula distribuída pelo ADC no estudo. Kadcyla& (ado- trastuzumabe emtansina; Genentech, South San Francisco, CA) foi administrado como um comparador e controle positivo de ADC.
[00308] O volume do tumor foi medido em cada camundongo no Dia 6, Dia 9, Dia 12, Dia 15, Dia 19, Dia 21, Dia 23, Dia 25, Dia 27, Dia 29 e Dia 31 após a injeção para determinar a eficácia de cada trata- mento em reduzir o volume do tumor. A análise dos dados foi realizada usando o software GraphPad Prism 7.04.
[00309] A Figura 1 mostra uma representação gráfica dos dados. As Tabelas 3A e 3B apresentam as bases numéricas da Figura 1, on- de Avg representa o volume Tumoral médio (mm?). SEM representa o erro padrão da média e N representa o número de animais individuais no grupo de estudo.
Tabela 3A Grupo 2-Composto 11 | Grupo 3-Composto 11 | Grupo 4-Composto 11 Grupo 1-PBS o 1mg/kg Q4*4 3 mg/kg Q4*4 3 mg/kg de Dose Unica p | 353,91 | 24,17 | 10 30187 18,21 | 10 [26749 22,43 | 10 |270,86 13,17 o Ss 235,06 15373| 1978 38,36 Bs j2Ks | e | ps pesas7TiTon as o 112203] 17.35 25,2 secs 1537] 6 | ps senior 127,58 314 | 154 | 6 | pro asas tea] 10 [136,60] 2448 2076 633 [1887 | 6 | pa pestoaaasos| 10 113661 | 2616 208 24 [1532] 6 | po poses aaatr| 10 |15264] 34,30 26,89 8966 [1662] 8 |
Tabela 3B Grupo 5-Composto 12 | Grupo 6-Composto 11 Grupo 7-Kadcyla Grupo 8-Kadcyla 3 mg/kg Q4*4 10 mg/kg Dose Única | 10 mg/kg Dose Única 3 mg/kg Q4*4 prdoEsdo sds] sem ] [mede [mm] Nº fem sev] Ns sen] nv Ss
[00310] Os resultados destas experiências in vivo demonstraram que os camundongos que foram tratados apenas com veículo PBS (Grupo 1) ou com o Composto 12 (Grupo 5) não apresentaram redu- ção observável no volume tumoral após o tratamento. De fato, os tu- mores nesses animais continuaram a aumentar ao longo do tempo. Como esperado, o Kadcyla de controle positivo (Grupos 7 e 8) reduziu o volume tumoral. A eficácia in vivo do Composto 11 em níveis e horá- rios de doses múltiplos (Grupos 2, 3, 4 e 6) foi claramente demonstra- da por uma redução no volume tumoral. O grau de redução do volume tumoral foi semelhante ao observado nos grupos de Kadcyla.
[00311] Perda de peso após a dose inicial foi observada nos Gru- pos 3, 4, 5 e 6; Composto 11 (3 mg/kg, Q4*4), Composto 11 (3 mg/kg, dose única), Composto 12 (3 mg/kg, Q4*4) e Composto 11 (10 mg/kg, dose única), respectivamente. Perda de peso que levando à morte foi observada nos Grupos 4, 5 e 6; Composto 11 (3 mg/kg, dose única), Composto 12 (3 mg/kg, s(Q4*4) e Composto 12 (10 mg/kg, dose úni- ca), respectivamente. O efeito mais grave foi observado no Grupo 6, Composto 11 (10 mg/kg, dose única), onde, no dia 9, 10 dos 10 ca- mundongos que compunham o grupo de tratamento morreram. Dois dos 10 camundongos do Grupo 3, Composto 11 (3 mg/kg, dose única), foram encontrados mortos no dia seguinte, apesar da hidratação e da intervenção baseada em dieta para tentar reverter a grave perda de peso (>15% do peso corporal inicial). Um camundongo no Grupo 5 do composto 12 foi encontrado com perda de peso de 15,94% e foi sacri- ficado. O número e a gravidade dos efeitos adversos correlacionaram- se com o nível de dosagem do Composto 10 de ADC administrado e foram observados com o Composto 12 não direcionado a HER2, bem como com o composto 11 direcionado a HER2. Portanto, a perda de peso e as mortes foram atribuídas aos efeitos do aumento dos níveis da toxina ligante Composto 10 em um contexto de ADC.
[00312] Todas as publicações e pedidos de patente mencionados neste relatório descritivo são incorporados neste documento por refe- rência na mesma medida como se cada publicação ou pedido de pa- tente individual fosse indicado especificamente e individualmente para ser incorporado por referência.
[00313] A partir do que foi exposto anteriormente, será apreciado que, apesar de as incorporações específicas da invenção terem sido descritas neste documento para finalidades de ilustração, várias modi- ficações podem ser feitas sem desviar do princípio e do escopo da in- venção. Por conseguinte, a invenção não é limitada, exceto conforme as reivindicações em anexo.

Claims (23)

REIVINDICAÇÕES
1. Composto, caracterizado pelo fato de que apresenta a Fórmula (|): NA o. ARA o ANSA > N Ho" 9 H o (1) em que: R é selecionado do grupo que consiste em: (CH2)n-R'; -C5-6 heteroarila, opcionalmente substituído por um ou mais dentre halogênio -CF3, -C1-6alquila e -O-C1-6 alquila; --C(R2)=N-R3; --CH(CF3)NH(CH2)mCHsa; --C(RºRP)NH(CH2)m CHs; --C(halogênio)=CH(CH2)mCH3; -SO2-NH(CH2)mCH3; -O(CO)- arila; -O(CO)-heteroarila; --NRºRº; e --NH-heteroarila; em que R' é -O-CRºRº(CH2)mCH3 ou -N-CRºRº(CH2)mCHs; em que Rº e Rº?, juntamente com os átomos aos quais estão ligados, formam um anel C3-109 heterociclila; R? é -CN ou -NH(CH2)mCHsa; R? é -(CH2)mCH3 ou -O-(CH2)mCHs; X é -H ou -CH;; cada n é independentemente 1, 20u3;e cada m é independentemente O, 1, 2 ou 3; ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
2. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que R é selecionado a partir do grupo que consiste em: . ? O. N We nº grs Russ AX ó E? MAs 2 o. o 7 -o O 7 -o N Nº s Nr N 2 | NH |” ! : > | 2H f >A AZ 3 so Al 3 &s N -Oo N N N. O. O. N AQ é TA NO ha = SN & ON Ss on fm NH oo
NH << NH> ur AS % ot N om F o No AS N = Na 2 o—Ê ot FP. N o N Nº K QE ASS * ; ya e PS
3. Composto, caracterizado pelo fato de que é selecionado a partir do grupo que consiste em: o AÔA*R O >CooCcH3 kh o O RA 1 F. O. PAS O. “cooMe Nor HO" fo) O Ro 2 Yes º ASA O >COOCH;
NO Fer HO" Oo SS No 3
— o ASA O >coocH; “o HO" WTÃo o 4 o A O A o “coocHs o HN HO" WRO o 5 Jd 2 O “>coocH; NE HO" s So º 6;e o o ASA O > coocHs “or HOY 3 So º 7.
4. Composto, caracterizado pelo fato de que apresenta a Fórmula (Il): “o o. ARA se > N Ho" 9 H o (11) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que : L é um ligante peptídico; R é selecionado a partir do grupo que consiste em: (CH2)n- R'; -C5.6 heteroarila, opcionalmente substituído por um ou mais dentre halogênio -CF3, -C1-salquila e -O-C1-6 alquila; --C(R2)=N-R3; --CH(CF3)NH(CH2)mCHsa; --C(RºRP)NH(CH2)m CHs; --C(halogênio)=CH(CH2)mCH3; -SO2-NH(CH2)mCH3; -O(CO)- arila; -O(CO)-heteroarila; --NRºR?; e --NH-heteroarila;
em que R' é -O-CRºRº(CH2)mCH3 ou -N-CRºRº(CH2)mCHs; em que Rº e Rº, juntamente com os átomos aos quais estão ligados, formam um anel C3-109 heterociclila; R? é -CN ou -NH(CH2)nCHs; R? é -(CH2)mCH3 ou -O-(CH2)mCHs; cada n é independentemente 1, 20u3;e cada m é independentemente O, 1, 2 ou 3.
5. Composto, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que L é selecionado a partir do grupo que consiste na Fór- mula (A'), Fórmula (A?), Fórmula (A%), Fórmula (Aº) e Fórmula (Aº):
O rt To NANA
O o (A) n E P NA FP” eF No A NÃ
AAA AOS o H o” (A?) o
IA (A; o á (A); e o oO o “Meo o "OS Ao o q nº NH, (A); em que q é 3, 4, 5, 6,7,8,90u10;e
% q
EA Y YéBr, leu ou o,
6. Composto, de acordo com a reivindicação 4 ou 5, carac- terizado pelo fato de que R é selecionado a partir do grupo que consiste em:
H H [ à / NÃZ ) VW TF , nO , Wo , S , " , “ , o. o 7/7 NO. NO Nó NO [| 2NH | | : UA | DA Á 277 AZA o A s$ %& N -Oo N N. O. o. N AR OD A AXO io = SN % ON on A NH CF. X qo O 3 F Se
NH Nm z NH> AS = ot N Tr” F o CX ÁS -N iba a o oi oi = N Oo Ca, N NE LQ Vas * ; H e Ps
7. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 4 a 6, caracterizado pelo fato de que tem a estrutura 10: o F o AA O. A o Ox HN HO" o Oo SS o oO
8. Composto, caracterizado pelo fato de que apresenta a Fórmula (Il): T-L'-Ab (111) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que : L é uma porção do ligante peptídico; T é um radical de Fórmula (1): R o Oo. ARA O SO H 9 (1) em que: R é selecionado a partir do grupo que consiste em: -(CH>2)n- R'; -C5.6 heteroarila, opcionalmente substituído por um ou mais dentre halogênio, -CF3, -C1-salquila e -O-C1.6 alquila; --C(R2)=N-R3; --CH(CF3)NH(CH2)mCHsa; --C(RºRP)NH(CH2)m CHs; --C(halogênio)=CH(CH2)mCH3; -SO2-NH(CH2)mCH3; -O(CO)- arila; -O(CO)-heteroarila; --NRºRº; e --NH-heteroarila; em que R' é -O-CRºRº(CH2)mCH3 ou -N-CRºRº(CH2)mCHsa; em que Rº e Rº?, juntamente com os átomos aos quais estão ligados, formam um anel C3-109 heterociclila; R? é -CN ou -NH(CH2)mCHsa; R? é -(CH2)mCH3 ou -O-(CH2)mCHs; cada n é independentemente 1, 2 ou 3; cada m é independentemente O, 1, 20u3;e Ab é um anticorpo.
9. Composto ou sal, de acordo com a reivindicação 8, carac- terizado pelo fato de que R é selecionado a partir do grupo que consiste em:
H | " / / om es A No MN o, Ne. NA NO NA o 7 3 3 | NH : 227 AZA HS AQA ra Nº O. O. >N AR O A TO ata = ” SS % ON % Tou NH oo
NH nm é NH> x = ot N om Of Os KH N= " ot o ” A o N Nº K ga É TE * ; ya e Pa
10. Composto, de acordo com a reivindicação 8 ou 9, carac- terizado pelo fato de que L' é selecionado a partir do grupo que consiste na Fórmula (B'), Fórmula (B?), Fórmula (B?) e Fórmula (Bº): NH O. Ps
A QE º E H Ho o Vl, 910 H Qº f (8?) o SM ndo (8?)
Lt ON o o = o o PA elo A O q no Ên: (8 em que q é 3,4, 5,6,7,8,9 ou 10.
11. Composto ou sal, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 8 a 10, caracterizado pelo fato de que o composto de Fór- mula (III) é selecionado a partir do grupo que consiste em: R. O. PÁ O, NH O. NH o XD " ATA ON Ab
UXCIO FAT o (E); KW n do o R. o o. ARARIO s N. [oO No N A
ALÇAS AAREATS f a (C; Oo SK o. AÁAO SALA Sa
Í SNI Ho" 9 o (0); KA o AA O Ni Tap O n ON HO" o (Cº)e
A À P Ro omAdaa o, ms ndo — o E UI AA ORA ma Lo r e. AXL to 5 Di Y oo] ut S Lys Pê (C); em que q é 3,4,5,6,7,8,90u 10; e né 1,2,3 ou4.
12. Composto, de acordo com a reivindicação 8, caracteri- zado pelo fato de que tem a estrutura 11: F vo ANA O A HS o º So n em que tras é trastuzumabe.
13. Composto ou sal, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 8 a 11, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é seleci- onado a partir do grupo que consiste em trastuzumabe, pertuzumabe, gemtuzumabe e vadastuximabe.
14. Composto ou sal, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 8 a 13, caracterizado pelo fato de que o anticorpo se liga a um ou mais antígenos associados a tumores ou receptores de superfície celular.
15. Composto ou sal, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 8 a 12 e 14, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é selecionado a partir do grupo que consiste em HER2, CD33, CD70, MUC1/CanAg, MUC16, CD151 e ITGaV.
16. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz do composto ou sal, como definido em qualquer uma das reivindicações 8 a 15, e um diluente, veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
17. Método para o tratamento de câncer, caracterizado pelo fato de que compreende administrar a um paciente uma quantidade te- rapeuticamente eficaz da composição farmacêutica, como definida na reivindicação 16.
18. Método para o tratamento de câncer, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o câncer é selecionado a partir de carcinomas de bexiga, mama, colo do útero, cólon, endomé- trio, rim, pulmão, esôfago, ovário, próstata, pâncreas, pele, estômago e testículos, leucemias e linfomas.
19. Método para o tratamento de câncer, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um se- gundo agente terapêutico.
20. Método para fabricação de um composto de Fórmula (III), como definido na reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o mé- todo compreende reagir um anticorpo com um composto de Fórmula (II), como definido na reivindicação 4.
21. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 16, caracterizada pelo fato de ser para uso em terapia.
22. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 17, para uso em um método de tratamento de câncer em um ser humano em necessidade, caracterizada pelo fato de que compreende administrar ao referido ser humano uma quantidade eficaz da composi- ção farmacêutica, em que o câncer é selecionado a partir de carcinomas de bexiga, mama, colo do útero, cólon, endométrio, rim, pulmão, esô- fago, ovário, próstata, pâncreas, pele, estômago e testículos, leucemias e linfomas.
23. Kit para tratamento de câncer, caracterizado pelo fato de que compreende: a) a composição farmacêutica como definida na reivindica- ção 16; e b) instruções de uso.
BR112020004307-9A 2017-09-20 2018-09-19 análogos de tailanestatina BR112020004307A2 (pt)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201762561060P 2017-09-20 2017-09-20
US62/561,060 2017-09-20
US201862686781P 2018-06-19 2018-06-19
US62/686,781 2018-06-19
PCT/US2018/051721 WO2019060398A1 (en) 2017-09-20 2018-09-19 ANALOGUES OF THAILANSTATINE

Publications (1)

Publication Number Publication Date
BR112020004307A2 true BR112020004307A2 (pt) 2020-11-10

Family

ID=63915348

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BR112020004307-9A BR112020004307A2 (pt) 2017-09-20 2018-09-19 análogos de tailanestatina

Country Status (14)

Country Link
US (4) US10301319B2 (pt)
EP (1) EP3684773A1 (pt)
JP (2) JP2020534300A (pt)
KR (2) KR20220156974A (pt)
CN (1) CN111788208B (pt)
AU (2) AU2018337815A1 (pt)
BR (1) BR112020004307A2 (pt)
CA (1) CA3074688A1 (pt)
IL (2) IL302943A (pt)
MX (1) MX2020003089A (pt)
RU (1) RU2020113749A (pt)
SG (1) SG11202001907QA (pt)
TW (1) TW201920192A (pt)
WO (1) WO2019060398A1 (pt)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL302943A (en) 2017-09-20 2023-07-01 Ph Pharma Co Ltd Thylanstatin analogs
CN110615790A (zh) * 2019-10-24 2019-12-27 北京融英医药科技有限公司 一种利格列汀制备工艺的改进方法
CN115491319A (zh) * 2021-06-18 2022-12-20 浙江珲达生物科技有限公司 一种伯克霍尔德菌及其发酵产fr901464的方法
CN113913343B (zh) * 2021-11-16 2023-10-13 浙江珲达生物科技有限公司 一株泰国伯克霍尔德菌、及其应用和发酵方法

Family Cites Families (250)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6098584A (ja) 1983-11-02 1985-06-01 Canon Inc カメラ―体形ｖｔｒ
US5583024A (en) 1985-12-02 1996-12-10 The Regents Of The University Of California Recombinant expression of Coleoptera luciferase
AU6355090A (en) 1989-08-23 1991-04-03 Scripps Clinic And Research Foundation Compositions and methods for detection and treatment of epstein-barr virus infection and immune disorders
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5256643A (en) 1990-05-29 1993-10-26 The Government Of The United States Human cripto protein
WO1992007574A1 (en) 1990-10-25 1992-05-14 Tanox Biosystems, Inc. Glycoproteins associated with membrane-bound immunoglobulins as antibody targets on b cells
EP0577752B2 (en) 1991-03-29 2007-07-11 Genentech, Inc. Human pf4a receptors and their use
US5440021A (en) 1991-03-29 1995-08-08 Chuntharapai; Anan Antibodies to human IL-8 type B receptor
US5543503A (en) 1991-03-29 1996-08-06 Genentech Inc. Antibodies to human IL-8 type A receptor
JP3050424B2 (ja) 1991-07-12 2000-06-12 塩野義製薬株式会社 ヒトエンドセリンリセプター
US5264557A (en) 1991-08-23 1993-11-23 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Polypeptide of a human cripto-related gene, CR-3
US6011146A (en) 1991-11-15 2000-01-04 Institut Pasteur Altered major histocompatibility complex (MHC) determinant and methods of using the determinant
US6153408A (en) 1991-11-15 2000-11-28 Institut Pasteur And Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale Altered major histocompatibility complex (MHC) determinant and methods of using the determinant
US20080152586A1 (en) 1992-09-25 2008-06-26 Avipep Pty Limited High avidity polyvalent and polyspecific reagents
IL107366A (en) 1992-10-23 2003-03-12 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Genes coding for megakaryocyte potentiator
US5644033A (en) 1992-12-22 1997-07-01 Health Research, Inc. Monoclonal antibodies that define a unique antigen of human B cell antigen receptor complex and methods of using same for diagnosis and treatment
US5869445A (en) 1993-03-17 1999-02-09 University Of Washington Methods for eliciting or enhancing reactivity to HER-2/neu protein
US5801005A (en) 1993-03-17 1998-09-01 University Of Washington Immune reactivity to HER-2/neu protein for diagnosis of malignancies in which the HER-2/neu oncogene is associated
US5773223A (en) 1993-09-02 1998-06-30 Chiron Corporation Endothelin B1, (ETB1) receptor polypeptide and its encoding nucleic acid methods, and uses thereof
US5750370A (en) 1995-06-06 1998-05-12 Human Genome Sciences, Inc. Nucleic acid encoding human endothlein-bombesin receptor and method of producing the receptor
JPH08336393A (ja) 1995-04-13 1996-12-24 Mitsubishi Chem Corp 光学活性なγ−置換−β−ヒドロキシ酪酸エステルの製造法
US5707829A (en) 1995-08-11 1998-01-13 Genetics Institute, Inc. DNA sequences and secreted proteins encoded thereby
US20020193567A1 (en) 1995-08-11 2002-12-19 Genetics Institute, Inc. Secreted proteins and polynucleotides encoding them
JP3646191B2 (ja) 1996-03-19 2005-05-11 大塚製薬株式会社 ヒト遺伝子
JP2000514281A (ja) 1996-05-17 2000-10-31 シェーリング コーポレイション ヒトｂ細胞抗原；関連する試薬
US5945511A (en) 1997-02-20 1999-08-31 Zymogenetics, Inc. Class II cytokine receptor
US20030185830A1 (en) 1997-02-25 2003-10-02 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of prostate cancer
US7033827B2 (en) 1997-02-25 2006-04-25 Corixa Corporation Prostate-specific polynucleotide compositions
US6261791B1 (en) 1997-03-10 2001-07-17 The Regents Of The University Of California Method for diagnosing cancer using specific PSCA antibodies
US6541212B2 (en) 1997-03-10 2003-04-01 The Regents Of The University Of California Methods for detecting prostate stem cell antigen protein
CA2281877C (en) 1997-03-10 2010-01-05 The Regents Of The University Of California Psca: prostate stem cell antigen
US6555339B1 (en) 1997-04-14 2003-04-29 Arena Pharmaceuticals, Inc. Non-endogenous, constitutively activated human protein-coupled receptors
US6319688B1 (en) 1997-04-28 2001-11-20 Smithkline Beecham Corporation Polynucleotide encoding human sodium dependent phosphate transporter (IPT-1)
WO1998051824A1 (en) 1997-05-15 1998-11-19 Abbott Laboratories Reagents and methods useful for detecting disease of the urinary tract
US6890749B2 (en) 1997-05-15 2005-05-10 Abbott Laboratories Reagents and methods useful for detecting diseases of the prostate
US6602677B1 (en) 1997-09-19 2003-08-05 Promega Corporation Thermostable luciferases and methods of production
US20030060612A1 (en) 1997-10-28 2003-03-27 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
US20020034749A1 (en) 1997-11-18 2002-03-21 Billing-Medel Patricia A. Reagents and methods useful for detecting diseases of the breast
US6110695A (en) 1997-12-02 2000-08-29 The Regents Of The University Of California Modulating the interaction of the chemokine, B Lymphocyte Hemoattractant, and its Receptor, BLR1
WO2004031238A2 (en) 2002-10-03 2004-04-15 Mcgill Univeristy Antibodies and cyclic peptides which bind cea (carcinoembryonic antigen) and their use as cancer therapeutics
DE69939527D1 (de) 1998-03-13 2008-10-23 Burnham Inst Zielsuchende verbindungen für verschiedene organe und gewebe
CA2685270C (en) 1998-05-13 2014-07-29 Pharmexa Inc. Expression vectors for stimulating an immune response and methods of using the same
US20020187472A1 (en) 2001-03-09 2002-12-12 Preeti Lal Steap-related protein
US20030064397A1 (en) 1998-05-22 2003-04-03 Incyte Genomics, Inc. Transmembrane protein differentially expressed in prostate and lung tumors
WO2000012130A1 (en) 1998-08-27 2000-03-09 Smithkline Beecham Corporation Rp105 agonists and antagonists
JP4689781B2 (ja) 1998-09-03 2011-05-25 独立行政法人科学技術振興機構 アミノ酸輸送蛋白及びその遺伝子
WO2000020579A1 (en) 1998-10-02 2000-04-13 Mcmaster University Spliced form of erbb-2/neu oncogene
WO2001057188A2 (en) 2000-02-03 2001-08-09 Hyseq, Inc. Novel nucleic acids and polypeptides
US6468546B1 (en) 1998-12-17 2002-10-22 Corixa Corporation Compositions and methods for therapy and diagnosis of ovarian cancer
US20020119158A1 (en) 1998-12-17 2002-08-29 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of ovarian cancer
US20030091580A1 (en) 2001-06-18 2003-05-15 Mitcham Jennifer L. Compositions and methods for the therapy and diagnosis of ovarian cancer
US6962980B2 (en) 1999-09-24 2005-11-08 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of ovarian cancer
US6858710B2 (en) 1998-12-17 2005-02-22 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of ovarian cancer
WO2000040614A2 (en) 1998-12-30 2000-07-13 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Characterization of the soc/crac calcium channel protein family
US20030009013A1 (en) 1998-12-30 2003-01-09 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
DE60044665D1 (de) 1999-01-29 2010-08-26 Corixa Corp Her2/neu fusionsproteine
GB9905124D0 (en) 1999-03-05 1999-04-28 Smithkline Beecham Biolog Novel compounds
AU3395900A (en) 1999-03-12 2000-10-04 Human Genome Sciences, Inc. Human lung cancer associated gene sequences and polypeptides
US7312303B2 (en) 1999-05-11 2007-12-25 Genentech, Inc. Anti-PRO4980 antibodies
WO2000075655A1 (fr) 1999-06-03 2000-12-14 Takeda Chemical Industries, Ltd. Procede de criblage avec cd100
PT2283867E (pt) 1999-06-25 2014-08-29 Immunogen Inc Métodos de tratamento usando conjugados de anticorpo antierbb- maitansinóide
US20030119113A1 (en) 1999-07-20 2003-06-26 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US7297770B2 (en) 1999-08-10 2007-11-20 Genentech, Inc. PRO6496 polypeptides
US7294696B2 (en) 1999-08-17 2007-11-13 Genentech Inc. PRO7168 polypeptides
EP1208202A2 (en) 1999-09-01 2002-05-29 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US20030206918A1 (en) 1999-09-10 2003-11-06 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of ovarian cancer
US20030232056A1 (en) 1999-09-10 2003-12-18 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of ovarian cancer
US20030129192A1 (en) 1999-09-10 2003-07-10 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of ovarian cancer
US6750054B2 (en) 2000-05-18 2004-06-15 Lexicon Genetics Incorporated Human semaphorin homologs and polynucleotides encoding the same
AU778199B2 (en) 1999-10-29 2004-11-25 Genentech Inc. Anti-prostate stem cell antigen (PSCA) antibody compositions and methods of use
ES2581239T3 (es) 1999-11-29 2016-09-02 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Aislamiento de cinco genes novedosos que codifican nuevos melanomas de tipo receptor de Fc implicados en la patogénesis del linfoma/melanoma
EP1248800A2 (en) 1999-11-30 2002-10-16 Corixa Corporation Compositions and methods for therapy and diagnosis of breast cancer
EP1239866A4 (en) 1999-12-10 2005-02-09 Epimmune Inc INDUCTION OF HER2 / NEU CELLULAR IMMUNE RESPONSES USING PEPTIDE AND NUCLEIC ACID-CONTAINING COMPOSITIONS
EP1857466B1 (en) 1999-12-23 2010-10-20 ZymoGenetics, Inc. Soluble interleukin-20 receptor
NZ502058A (en) 1999-12-23 2003-11-28 Ovita Ltd Isolated mutated nucleic acid molecule for regulation of ovulation rate
US6610286B2 (en) 1999-12-23 2003-08-26 Zymogenetics, Inc. Method for treating inflammation using soluble receptors to interleukin-20
JP2003535037A (ja) 1999-12-23 2003-11-25 ザイモジェネティクス，インコーポレイティド 炎症を治療する方法
US7294695B2 (en) 2000-01-20 2007-11-13 Genentech, Inc. PRO10268 polypeptides
US20030224379A1 (en) 2000-01-21 2003-12-04 Tang Y. Tom Novel nucleic acids and polypeptides
US20020039573A1 (en) 2000-01-21 2002-04-04 Cheever Martin A. Compounds and methods for prevention and treatment of HER-2/neu associated malignancies
US20030104562A1 (en) 2000-02-11 2003-06-05 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US20030219806A1 (en) 2000-02-22 2003-11-27 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Novel 18607, 15603, 69318, 12303, 48000, 52920, 5433, 38554, 57301, 58324, 55063, 52991, 59914, 59921 and 33751 molecules and uses therefor
WO2001062794A2 (en) 2000-02-22 2001-08-30 Millennium Pharmaceuticals, Inc. 18607, a human calcium channel
US20040002068A1 (en) 2000-03-01 2004-01-01 Corixa Corporation Compositions and methods for the detection, diagnosis and therapy of hematological malignancies
US20040005561A1 (en) 2000-03-01 2004-01-08 Corixa Corporation Compositions and methods for the detection, diagnosis and therapy of hematological malignancies
CA2402293A1 (en) 2000-03-07 2001-09-13 Hyseq, Inc. Novel nucleic acids and polypeptides
EP1268526A4 (en) 2000-03-24 2004-09-08 Fahri Saatcioglu NEW PROSTATE-SPECIFIC AND TESTIS-SPECIFIC NUCLEIC ACID MOLECULES, POLYPEPTIDES AND DIAGNOSTIC AND THERAPEUTIC PROCEDURES
AU2001250412A1 (en) 2000-03-31 2001-10-08 Ipf Pharmaceuticals Gmbh Diagnostic and medicament for analysing the cell surface proteome of tumour and inflammatory cells and for treating tumorous and inflammatory diseases, preferably using specific chemokine receptor analysis and the chemokine receptor-ligand interaction
AU2001253140A1 (en) 2000-04-03 2001-10-15 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Tumor markers in ovarian cancer
CA2402392A1 (en) 2000-04-07 2001-10-18 Arena Pharmaceuticals, Inc. Non-endogenous, constitutively activated known g protein-coupled receptors
AU2001274888A1 (en) 2000-05-19 2001-12-03 Human Genome Sciences, Inc. Nucleic acids, proteins, and antibodies
WO2001094641A2 (en) 2000-06-09 2001-12-13 Idec Pharmaceuticals Corporation Gene targets and ligands that bind thereto for treatment and diagnosis of ovarian carcinomas
JP2004523203A (ja) 2000-06-16 2004-08-05 インサイト・ゲノミックス・インコーポレイテッド Ｇタンパク質結合受容体
WO2002002587A1 (en) 2000-06-30 2002-01-10 Human Genome Sciences, Inc. B7-like polynucleotides, polypeptides, and antibodies
JP2004528003A (ja) 2000-06-30 2004-09-16 インサイト・ゲノミックス・インコーポレイテッド 細胞外マトリクスおよび細胞接着分子
EP1294885A2 (en) 2000-06-30 2003-03-26 Amgen, Inc. B7-like molecules and uses thereof
WO2002006339A2 (en) 2000-07-03 2002-01-24 Curagen Corporation Proteins and nucleic acids encoding same
US20040044179A1 (en) 2000-07-25 2004-03-04 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
AU2001283507A1 (en) 2000-07-27 2002-02-13 Mayo Foundation For Medical Education And Research B7-h3 and b7-h4, novel immunoregulatory molecules
AU2001287639A1 (en) 2000-07-28 2002-02-13 Ulrich Wissenbach Trp8, trp9 and trp10, markers for cancer
US7229623B1 (en) 2000-08-03 2007-06-12 Corixa Corporation Her-2/neu fusion proteins
AU2001283360A1 (en) 2000-08-14 2002-02-25 Corixa Corporation Methods for diagnosis and therapy of hematological and virus-associated malignancies
EP1366153A2 (en) 2000-08-14 2003-12-03 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of her-2/neu-associated malignancies
GB0020953D0 (en) 2000-08-24 2000-10-11 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
MXPA03001645A (es) 2000-08-24 2004-05-14 Genentech Inc Composiciones y metodos para el diagnostico y tratamiento de tumores.
EP1346040A2 (en) 2000-09-11 2003-09-24 Nuvelo, Inc. Novel nucleic acids and polypeptides
ATE333888T1 (de) 2000-09-15 2006-08-15 Zymogenetics Inc Verwendung eines polypeptids, welches die extrazelluläre domäne von il-20ra und il-20rb enthält, zur behandlung von entzündungen
US7491797B2 (en) 2000-09-15 2009-02-17 Genentech, Inc. PRO6308 polypeptide
US6613567B1 (en) 2000-09-15 2003-09-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense inhibition of Her-2 expression
NZ525380A (en) 2000-09-18 2008-06-30 Biogen Idec Inc Non-fucosylated forms of Cripto and their use as tumor blocking agents
UA83458C2 (uk) 2000-09-18 2008-07-25 Байоджен Айдек Ма Інк. Виділений поліпептид baff-r (рецептор фактора активації в-клітин сімейства tnf)
MXPA03003151A (es) 2000-10-13 2003-08-19 Eos Biotechnology Inc Metodos de diagnostico de cancer de prostata, composiciones y metodos para seleccionar moduladores de cancer de prostata.
JP2004516826A (ja) 2000-11-07 2004-06-10 ザイモジェネティクス，インコーポレイティド ヒト腫瘍壊死因子受容体
US20020150573A1 (en) 2000-11-10 2002-10-17 The Rockefeller University Anti-Igalpha-Igbeta antibody for lymphoma therapy
WO2002061087A2 (en) 2000-12-19 2002-08-08 Lifespan Biosciences, Inc. Antigenic peptides, such as for g protein-coupled receptors (gpcrs), antibodies thereto, and systems for identifying such antigenic peptides
EP1357828A2 (en) 2001-01-12 2003-11-05 University of Medicine and Dentistry of New Jersey Bone morphogenetic protein-2 in the treatment and diagnosis of cancer
US20030119119A1 (en) 2001-01-16 2003-06-26 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US20030119133A1 (en) 2001-01-16 2003-06-26 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US7754208B2 (en) 2001-01-17 2010-07-13 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
JP2005503760A (ja) 2001-01-24 2005-02-10 プロテイン デザイン ラブス， インコーポレイテッド 乳癌の診断方法、組成物および乳癌のモジュレーターのスクリーニング方法
US20030073144A1 (en) 2001-01-30 2003-04-17 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of pancreatic cancer
WO2002064780A1 (en) 2001-02-12 2002-08-22 Bionomics Limited Dna sequences for human tumour suppressor genes
US20030087250A1 (en) 2001-03-14 2003-05-08 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid molecules and proteins for the identification, assessment, prevention, and therapy of ovarian cancer
WO2002078524A2 (en) 2001-03-28 2002-10-10 Zycos Inc. Translational profiling
WO2003008537A2 (en) 2001-04-06 2003-01-30 Mannkind Corporation Epitope sequences
US6820011B2 (en) 2001-04-11 2004-11-16 The Regents Of The University Of Colorado Three-dimensional structure of complement receptor type 2 and uses thereof
CA2443617C (en) 2001-04-17 2013-12-10 The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Repeat sequences of the ca125 gene and their use for diagnostic and therapeutic interventions
CA2444691A1 (en) 2001-04-18 2002-10-31 Protein Design Labs, Inc. Methods of diagnosis of lung cancer, compositions and methods of screening for modulators of lung cancer
ATE420659T1 (de) 2001-04-26 2009-01-15 Biogen Idec Inc Criptoblockierende antikörper und deren verwendung
WO2002089747A2 (en) 2001-05-09 2002-11-14 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of prostate cancer
AU2002344326A1 (en) 2001-05-11 2002-11-25 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Nucleic acid sequence encoding ovarian antigen, ca125, and uses thereof
PL403488A1 (pl) 2001-05-24 2013-07-08 Zymogenetics, Inc. Zastosowanie bialka fuzyjnego TACI-immunoglobulina, bialko fuzyjne, czasteczka kwasu nukleinowego kodujaca bialko fuzyjne, kompozycja farmaceutyczna i sposób wytwarzania bialka fuzyjnego TACI-immunoglobulina
US7157558B2 (en) 2001-06-01 2007-01-02 Genentech, Inc. Polypeptide encoded by a polynucleotide overexpresses in tumors
JP2005518185A (ja) 2001-06-04 2005-06-23 キュラジェン コーポレイション 新規タンパク質およびそれをコード化する核酸
WO2002098358A2 (en) 2001-06-04 2002-12-12 Eos Biotechnology, Inc. Methods of diagnosis and treatment of androgen-dependent prostate cancer, prostate cancer undergoing androgen-withdrawal, and androgen-independent prostate cancer
CA2449289A1 (en) 2001-06-05 2002-12-12 Exelixis, Inc. Gfats as modifiers of the p53 pathway and methods of use
EP1402053A4 (en) 2001-06-05 2005-05-11 Exelixis Inc CHDS AS MODULATORS OF THE MECHANISM OF ACTION OF P53 AND USES THEREOF
US7235358B2 (en) 2001-06-08 2007-06-26 Expression Diagnostics, Inc. Methods and compositions for diagnosing and monitoring transplant rejection
WO2002101075A2 (en) 2001-06-13 2002-12-19 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Novel genes, compositions, kits, and methods for identification, assessment, prevention, and therapy of cervical cancer
US7189507B2 (en) 2001-06-18 2007-03-13 Pdl Biopharma, Inc. Methods of diagnosis of ovarian cancer, compositions and methods of screening for modulators of ovarian cancer
MXPA03011979A (es) 2001-06-18 2005-04-08 Eos Biotechnology Inc Metodos de diagnostico de cancer de ovario composiciones y metodos para rastrear moduladores de cancer de ovario.
US7705120B2 (en) 2001-06-21 2010-04-27 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Compositions, kits, and methods for identification, assessment, prevention, and therapy of breast cancer
US20030108958A1 (en) 2001-06-28 2003-06-12 Rene De Waal Malefyt Biological activity of AK155
WO2003004529A2 (en) 2001-07-02 2003-01-16 Licentia Ltd. Ephrin-tie receptor materials and methods
US20040076955A1 (en) 2001-07-03 2004-04-22 Eos Biotechnology, Inc. Methods of diagnosis of bladder cancer, compositions and methods of screening for modulators of bladder cancer
WO2003003984A2 (en) 2001-07-05 2003-01-16 Curagen Corporation Novel proteins and nucleic acids encoding same
US7446185B2 (en) 2001-07-18 2008-11-04 The Regents Of The University Of California Her2/neu target antigen and use of same to stimulate an immune response
WO2003009814A2 (en) 2001-07-25 2003-02-06 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Novel genes, compositions, kits, and methods for identification, assessment, prevention, and therapy of prostate cancer
IL160127A0 (en) 2001-08-03 2004-06-20 Genentech Inc Tacis and br3 polypeptides and uses thereof
EP1478772A2 (en) 2001-08-14 2004-11-24 The General Hospital Corporation Nucleic acid and amino acid sequences involved in pain
US20030092013A1 (en) 2001-08-16 2003-05-15 Vitivity, Inc. Diagnosis and treatment of vascular disease
AU2002313559A1 (en) 2001-08-23 2003-03-10 Oxford Biomedica (Uk) Limited Genes
AU2002357643A1 (en) 2001-08-29 2003-04-14 Vanderbilt University The human mob-5 (il-24) receptors and uses thereof
US20030124579A1 (en) 2001-09-05 2003-07-03 Eos Biotechnology, Inc. Methods of diagnosis of ovarian cancer, compositions and methods of screening for modulators of ovarian cancer
JP2005505271A (ja) 2001-09-06 2005-02-24 アジェンシス， インコーポレイテッド 癌の処置および検出において有用なｓｔｅａｐ−１と名称が与えられる核酸および対応するタンパク質
WO2003025138A2 (en) 2001-09-17 2003-03-27 Protein Design Labs, Inc. Methods of diagnosis of cancer compositions and methods of screening for modulators of cancer
DE60238143D1 (de) 2001-09-18 2010-12-09 Genentech Inc Zusammensetzungen und verfahren für die diagnose von tumoren
IL160933A0 (en) 2001-09-18 2004-08-31 Proteologics Inc Methods and compositions for treating ?cap associated diseases
WO2003025148A2 (en) 2001-09-19 2003-03-27 Nuvelo, Inc. Novel nucleic acids and polypeptides
WO2003026493A2 (en) 2001-09-28 2003-04-03 Bing Yang Diagnosis and treatment of diseases caused by mutations in cd72
AU2002362454A1 (en) 2001-10-03 2003-04-14 Origene Technologies, Inc. Regulated breast cancer genes
US20050130117A1 (en) 2001-10-03 2005-06-16 Davis Cong L. Modulators of lymphocyte activation and migration
US20050089957A1 (en) 2001-10-19 2005-04-28 Audrey Goddard Compositions and methods for the diagnosis and treatment of inflammatory bowel disorders
US20050123925A1 (en) 2002-11-15 2005-06-09 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
US20040241703A1 (en) 2002-08-19 2004-12-02 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
US7825089B2 (en) 2001-10-24 2010-11-02 National Jewish Health Three-dimensional structures of TALL-1 and its cognate receptors and modified proteins and methods related thereto
ATE349554T1 (de) 2001-10-31 2007-01-15 Alcon Inc Knochen-morphogene proteine (bmp), bmp-rezeptoren und bmp-bindungsproteine und ihre verwendung bei der diagnose und behandlung des glaukoms
WO2003042661A2 (en) 2001-11-13 2003-05-22 Protein Design Labs, Inc. Methods of diagnosis of cancer, compositions and methods of screening for modulators of cancer
US20030232350A1 (en) 2001-11-13 2003-12-18 Eos Biotechnology, Inc. Methods of diagnosis of cancer, compositions and methods of screening for modulators of cancer
EP1448226A1 (en) 2001-11-29 2004-08-25 Genset S.A. Agonists and antagonists of prolixin for the treatment of metabolic disorders
AU2002349784A1 (en) 2001-12-03 2003-06-17 Asahi Kasei Pharma Corporation Nf-kappab activating genes
EP1504099A4 (en) 2001-12-10 2006-05-10 Nuvelo Inc NEW NUCLEIC ACIDS AND POLYPEPTIDES
US20030134790A1 (en) 2002-01-11 2003-07-17 University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey Bone Morphogenetic Protein-2 And Bone Morphogenetic Protein-4 In The Treatment And Diagnosis Of Cancer
US7452675B2 (en) 2002-01-25 2008-11-18 The Queen's Medical Center Methods of screening for TRPM4b modulators
JP2005526044A (ja) 2002-02-21 2005-09-02 デューク ユニバーシティ 抗ｃｄ２２抗体を使用した治療方法
CA2476518A1 (en) 2002-02-22 2003-09-04 Genentech, Inc. Compositions and methods for the treatment of immune related diseases
WO2003074674A2 (en) 2002-03-01 2003-09-12 Exelixis, Inc. MSRAs AS MODIFIERS OF THE p53 PATHWAY AND METHODS OF USE
WO2003104399A2 (en) 2002-06-07 2003-12-18 Avalon Pharmaceuticals, Inc Cancer-linked gene as target for chemotherapy
EP2258712A3 (en) 2002-03-15 2011-05-04 Multicell Immunotherapeutics, Inc. Compositions and Methods to Initiate or Enhance Antibody and Major-histocompatibility Class I or Class II-restricted T Cell Responses by Using Immunomodulatory, Non-coding RNA Motifs
WO2004000997A2 (en) 2002-03-19 2003-12-31 Curagen Corporation Therapeutic polypeptides, nucleic acids encoding same, and methods of use
US7202033B2 (en) 2002-03-21 2007-04-10 Sunesis Pharmaceuticals, Inc. Identification of kinase inhibitors
JP2005520566A (ja) 2002-03-22 2005-07-14 バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド Ｃｒｉｐｔｏ特異的抗体
US7193069B2 (en) 2002-03-22 2007-03-20 Research Association For Biotechnology Full-length cDNA
WO2003089624A2 (en) 2002-03-25 2003-10-30 Uab Research Foundation Fc receptor homolog, reagents, and uses thereof
WO2003083074A2 (en) 2002-03-28 2003-10-09 Idec Pharmaceuticals Corporation Novel gene targets and ligands that bind thereto for treatment and diagnosis of colon carcinomas
US20030194704A1 (en) 2002-04-03 2003-10-16 Penn Sharron Gaynor Human genome-derived single exon nucleic acid probes useful for gene expression analysis two
CA2481503A1 (en) 2002-04-05 2003-10-23 Agensys, Inc. Nucleic acid and corresponding protein entitled 98p4b6 useful in treatment and detection of cancer
US20040101874A1 (en) 2002-04-12 2004-05-27 Mitokor Inc. Targets for therapeutic intervention identified in the mitochondrial proteome
CA2481507A1 (en) 2002-04-16 2003-10-30 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
AU2003239158A1 (en) 2002-04-17 2003-11-03 Baylor College Of Medicine Aib1 as a prognostic marker and predictor of resistance to encocrine therapy
WO2003093444A2 (en) 2002-05-03 2003-11-13 Incyte Corporation Transporters and ion channels
EP1572925A4 (en) 2002-05-15 2007-08-15 Avalon Pharmaceuticals CANCER-RELATED GENE AS A TARGET FOR CHEMOTHERAPY
US20030224454A1 (en) 2002-05-30 2003-12-04 Ryseck Rolf Peter Human solute carrier family 7, member 11 (hSLC7A11)
AU2003239969A1 (en) 2002-06-04 2003-12-19 Avalon Pharmaceuticals, Inc. Cancer-linked gene as target for chemotherapy
AU2003240495A1 (en) 2002-06-04 2003-12-19 Incyte Corporation Diagnostics markers for lung cancer
SG145559A1 (en) 2002-06-06 2008-09-29 Oncotherapy Science Inc Genes and polypeptides relating to human colon cancers
WO2003104270A2 (en) 2002-06-06 2003-12-18 Ingenium Pharmaceuticals Ag Dudulin 2 genes, expression products, non-human animal model: uses in human hematological disease
WO2003105758A2 (en) 2002-06-12 2003-12-24 Avalon Pharmaceuticals, Inc. Cancer-linked gene as target for chemotherapy
US20040249130A1 (en) 2002-06-18 2004-12-09 Martin Stanton Aptamer-toxin molecules and methods for using same
JP2005533794A (ja) 2002-06-18 2005-11-10 アーケミックス コーポレイション アプタマー−毒素分子およびこれを使用する方法
CA2489803A1 (en) 2002-06-20 2003-12-31 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for modulating lymphocyte activity
JP2005530856A (ja) 2002-06-21 2005-10-13 ジョンズ ホプキンス ユニバーシティー スクール オブ メディシン 膜関連腫瘍内皮マーカー
WO2004009622A2 (en) 2002-07-19 2004-01-29 Cellzome Ag Protein complexes of cellular networks underlying the development of cancer and other diseases
AU2003256836A1 (en) 2002-07-25 2004-02-16 Genentech, Inc. Taci antibodies and uses thereof
WO2004015426A1 (en) 2002-08-06 2004-02-19 Bayer Healthcare Ag Diagnostics and therapeutics for diseases associated with human cxc chemokine receptor 5(cxcr5)
JP2004121218A (ja) 2002-08-06 2004-04-22 Jenokkusu Soyaku Kenkyusho:Kk 気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患の検査方法
AU2003278725A1 (en) 2002-08-27 2004-03-19 Bristol-Myers Squibb Company Polynucleotide predictor set for identifying protein tyrosine kinase modulators
WO2004020595A2 (en) 2002-08-29 2004-03-11 Five Prime Therapeutics, Inc. Novel human polypeptides encoded by polynucleotides
AU2002951346A0 (en) 2002-09-05 2002-09-26 Garvan Institute Of Medical Research Diagnosis of ovarian cancer
EP1545610A4 (en) 2002-09-06 2006-11-08 Mannkind Corp EPITOPE SEQUENCES
JP2006513702A (ja) 2002-09-09 2006-04-27 ヌラ インコーポレーティッド Ｇタンパク質共役受容体およびその使用
JP2004113151A (ja) 2002-09-27 2004-04-15 Sankyo Co Ltd 癌遺伝子及びその用途
AU2003288918A1 (en) 2002-10-04 2004-05-04 Van Andel Research Institute Molecular sub-classification of kidney tumors and the discovery of new diagnostic markers
NZ539395A (en) 2002-11-07 2009-01-31 Immunogen Inc Anti-CD33 antibodies and method for treatment of acute myeloid leukemia using the same
CA2503748A1 (en) 2002-11-08 2004-05-27 Genentech, Inc. Compositions and methods for the treatment of natural killer cell related diseases
WO2004044178A2 (en) 2002-11-13 2004-05-27 Genentech, Inc. Methods and compositions for diagnosing dysplasia
CA2505919A1 (en) 2002-11-15 2004-06-03 The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Ca125 gene and its use for diagnostic and therapeutic interventions
EP1569685B8 (en) 2002-11-15 2012-12-05 MUSC Foundation For Research Development Complement receptor 2 targeted complement modulators
US20080213166A1 (en) 2002-11-20 2008-09-04 Biogen Idec Inc. Novel Gene Targets and Ligands that Bind Thereto for Treatment and Diagnosis of Colon Carcinomas
CA2507044A1 (en) 2002-11-21 2004-06-10 Mary Lucero Purinergic modulation of smell
WO2004048938A2 (en) 2002-11-26 2004-06-10 Protein Design Labs, Inc. Methods of detecting soft tissue sarcoma, compositions and methods of screening for soft tissue sarcoma modulators
AU2003302774A1 (en) 2002-12-06 2004-06-30 Diadexus, Inc. Compositions, splice variants and methods relating to ovarian specific genes and proteins
JP2004198419A (ja) 2002-12-13 2004-07-15 Bayer Healthcare Llc Ｔｉｍｐ１を用いた検出方法
CA2510315C (en) 2002-12-20 2014-01-28 Protein Design Labs, Inc. Antibodies against gpr64 and uses thereof
AU2003299819A1 (en) 2002-12-23 2004-07-22 Human Genome Sciences, Inc. Neutrokine-alpha conjugate, neutrokine-alpha complex, and uses thereof
CA2512536A1 (en) 2003-01-08 2004-07-29 Bristol-Myers Squibb Company Biomarkers and methods for determining sensitivity to epidermal growth factor receptor modulators
US20050227301A1 (en) 2003-01-10 2005-10-13 Polgen Cell cycle progression proteins
US20050181375A1 (en) 2003-01-10 2005-08-18 Natasha Aziz Novel methods of diagnosis of metastatic cancer, compositions and methods of screening for modulators of metastatic cancer
EP1583820A4 (en) 2003-01-14 2007-07-18 Bristol Myers Squibb Co ASSOCIATED POLYNUCLEOTIDES AND POLYPEPTIDES ASSOCIATED WITH THE NF-KB WAY
EP1583821A4 (en) 2003-01-15 2007-07-18 Millennium Pharm Inc METHODS AND COMPOSITIONS FOR TREATING UROLOGICAL DISORDERS USING GENES 44390, 54181, 211, 5687, 884, 1405, 636, 4421, 5410, 30905, 2045, 16405, 18560, 2047, 33751, 52872, 14063, 20739, 32544, 43239, 44373, 51164, 53010, 16852, 1587, 2207, 22245, 2387, 52908, 69112, 14990, 18547, 115, 579
US20060228710A1 (en) 2003-02-14 2006-10-12 Morris David W Novel therapeutic targets in cancer
US20030224411A1 (en) 2003-03-13 2003-12-04 Stanton Lawrence W. Genes that are up- or down-regulated during differentiation of human embryonic stem cells
KR101192496B1 (ko) 2003-11-06 2012-10-18 시애틀 지네틱스, 인크. 리간드에 접합될 수 있는 모노메틸발린 화합물
RU2412947C2 (ru) 2004-09-23 2011-02-27 Дженентек, Инк. Антитела, сконструированные на основе цистеинов, и их конъюгаты
PT1813614E (pt) 2006-01-25 2012-01-09 Sanofi Sa Agentes citotóxicos compreendendo novos derivados de tomaimicina
US7825267B2 (en) 2006-09-08 2010-11-02 University Of Pittsburgh-Of The Commonwealth System Of Higher Education Synthesis of FR901464 and analogs with antitumor activity
US8969405B2 (en) * 2008-06-21 2015-03-03 St. Jude Children's Research Hospital Anticancer compounds and methods of making and using same
US9315581B2 (en) 2009-12-23 2016-04-19 A Vipep Pty Limited Immuno-conjugates and methods for producing them
MX2012011900A (es) 2010-04-15 2013-03-21 Seattle Genetics Inc Conjugados de pirrolobenzodiazepina diana.
CA2816426A1 (en) 2010-11-17 2012-06-07 Genentech, Inc. Alaninyl maytansinol antibody conjugates
AU2012301466B2 (en) * 2011-08-27 2015-07-23 Marrone Bio Innovations, Inc. Isolated bacterial strain of the genus Burkholderia and pesticidal metabolites therefrom-formulations and uses
SI2780039T1 (en) 2011-11-17 2018-06-29 Pfizer Inc. Cytotoxic peptides and their conjugates between the antibody and the drug
CN104244718A (zh) * 2011-12-05 2014-12-24 伊格尼卡生物治疗公司 抗体-药物缀合物以及相关化合物、组合物和方法
EP2662371A1 (en) 2012-05-11 2013-11-13 Polichem SA (R)-Nifuratel and synthesis of (R) and (S)-Nifuratel
EP2917195B9 (en) 2012-11-05 2018-05-30 Pfizer Inc Spliceostatin analogs
AU2014353087B2 (en) 2013-11-19 2018-07-19 Purdue Research Foundation Anti-cancer agents and preparation thereof
PL3134127T3 (pl) * 2014-04-25 2020-07-27 Rinat Neuroscience Corp. Koniugaty przeciwciało-lek o dużym ładunku leku
WO2016165762A1 (en) 2015-04-15 2016-10-20 Ganymed Pharmaceuticals Ag Drug conjugates comprising antibodies against claudin 18.2
MX2018015269A (es) 2016-06-08 2019-09-18 Univ Rice William M Derivados de tailanstatina a, metodos de tratamiento y metodos de sintesis de los mismos.
IL302943A (en) 2017-09-20 2023-07-01 Ph Pharma Co Ltd Thylanstatin analogs

Also Published As

Publication number Publication date
AU2024201765A1 (en) 2024-04-04
CN111788208A (zh) 2020-10-16
US10815246B2 (en) 2020-10-27
WO2019060398A1 (en) 2019-03-28
IL273387B1 (en) 2023-06-01
KR20220156974A (ko) 2022-11-28
IL302943A (en) 2023-07-01
US20200216463A1 (en) 2020-07-09
TW201920192A (zh) 2019-06-01
EP3684773A1 (en) 2020-07-29
US20190233430A1 (en) 2019-08-01
JP2023138857A (ja) 2023-10-02
JP2020534300A (ja) 2020-11-26
IL273387B2 (en) 2023-10-01
CN111788208B (zh) 2023-11-24
IL273387A (en) 2020-05-31
RU2020113749A (ru) 2021-10-20
US10301319B2 (en) 2019-05-28
US11691982B2 (en) 2023-07-04
CA3074688A1 (en) 2019-03-28
US20200407369A1 (en) 2020-12-31
AU2018337815A1 (en) 2020-03-12
KR20200055065A (ko) 2020-05-20
MX2020003089A (es) 2020-10-15
US20190084996A1 (en) 2019-03-21
SG11202001907QA (en) 2020-04-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6743015B2 (ja) Ｋｓｐ阻害剤の脱グリコシル化抗ｔｗｅａｋｒ抗体との抗体薬物複合体（ａｄｃ類）
KR102405762B1 (ko) 펩타이드 모방체 화합물 및 이의 항체-약물 컨쥬게이트
US11691982B2 (en) Thailanstatin analogs
CN106604927B (zh) 细胞毒性苯并二氮杂䓬衍生物
CA2934617A1 (en) Antibody drug conjugates (adcs) with kinesin spindle protein (ksp)
US11365263B2 (en) Bifunctional cytotoxic agents containing the CTI pharmacophore
JP2021107392A (ja) ピロロベンゾジアゼピン複合体
ES2939494T3 (es) Conjugados de fármaco anticuerpo que comprenden derivados de ecteinascidina
KR20190122766A (ko) 자기희생적 펩티드 링커 및 이들의 접합체를 갖는 메이탄시노이드 유도체
JP2022126826A (ja) ヘテロアリールスルホンをベースとするコンジュゲーションハンドル、これらの調製のための方法、および抗体薬物コンジュゲートの合成におけるこれらの使用
US20230390411A1 (en) Conjugate and use thereof
CN107660208B (zh) 包含cti药效团的双功能细胞毒性剂
TW202412762A (zh) 奧瑞他汀衍生物及其結合物
WO2024038065A1 (en) Anthracyclins and conjugates thereof

Legal Events

Date Code Title Description
B350 Update of information on the portal [chapter 15.35 patent gazette]
B06W Patent application suspended after preliminary examination (for patents with searches from other patent authorities) chapter 6.23 patent gazette]