CN106604927B - 细胞毒性苯并二氮杂䓬衍生物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及具有抗增殖活性的新颖苯并二氮杂
Figure DDA0001239440430000011
衍生物，并且更具体地说，涉及式(I)‑(VI)的新颖苯并二氮杂
Figure DDA0001239440430000012
化合物。本发明还提供连接至细胞结合剂的苯并二氮杂

Description

细胞毒性苯并二氮杂䓬衍生物
相关申请的引用
本申请依据35U.S.C.§119(e)要求在2014年9月3日提交的美国临时申请号62/045,248、2014年12月3日提交的美国临时申请号 62/087,040、2015年4月17日提交的美国临时申请号62/149,370和 2015年5月20日提交的美国临时申请号62/164,305的提交日的权益，所述申请各自的完整内容(包括所有附图、式、说明书和权利要求)均以引用的方式并入本文。
发明领域
本发明涉及新颖细胞毒性化合物和包含这些细胞毒性化合物和细胞结合剂的细胞毒性缀合物。更具体地说，本发明涉及适用作药物，特别是用作抗增生剂的新颖苯并二氮杂
Figure BDA0001239440410000012
化合物、其衍生物、其中间体、其缀合物以及其药学上可接受的盐。
发明背景
苯并二氮杂
Figure BDA0001239440410000013
衍生物是用于治疗各种病症的有用化合物，并且包括诸如抗癫痫剂(咪唑并[2,1-b][1,3,5]苯并硫杂二氮杂
Figure BDA0001239440410000019
美国专利号 4,444,688；美国专利号4,062,852)、抗细菌剂(嘧啶并[1,2-c][1,3,5]苯并硫杂二氮杂
Figure BDA0001239440410000018
GB 1476684)、利尿剂和降血压剂(吡咯并(1,2-b)[1,2,5]苯并硫杂二氮杂
Figure BDA0001239440410000016
5,5二氧化物，美国专利号3,506,646)、降血脂药(WO 03091232)、抗抑郁剂(美国专利号3,453,266)、骨质疏松症(JP 2138272)的药物。
在动物肿瘤模型中已显示，苯并二氮杂
Figure BDA0001239440410000017
衍生物(如吡咯并苯并二氮杂
Figure BDA0001239440410000021
(PBD))充当抗肿瘤剂(N-2-咪唑基烷基取代的1,2,5-苯并硫杂二氮杂
Figure BDA0001239440410000022
-1,1-二氧化物，美国专利号6,156,746)、苯并-吡啶并或二吡啶并硫杂二氮杂
Figure BDA0001239440410000023
(WO 2004/069843)、吡咯并[1,2-b][1,2,5]苯并硫杂二氮杂
Figure BDA0001239440410000024
和吡咯并[1,2-b][1,2,5]苯并二氮杂
Figure BDA0001239440410000025
衍生物 (WO2007/015280)、托马霉素衍生物(例如，吡咯并[1,4]苯并二氮杂
Figure BDA0001239440410000026
)，如WO 00/12508、WO2005/085260、WO2007/085930和EP 2019104 中描述的那些。还已知苯并二氮杂
Figure BDA0001239440410000027
影响细胞生长和分化(Kamal A. 等人,Bioorg Med Chem.2008年8月15日；16(16):7804-10(和其中引用的参考文献)；Kumar R,Mini Rev Med Chem.2003年6月； 3(4):323-39(和其中引用的参考文献)；Bednarski J J等人,2004；Sutter A.P等人,2002；Blatt N B等人,2002),Kamal A.等人,Current Med. Chem.,2002；2；215-254；Wang J-J.,J.Med.Chem.,2206； 49:1442-1449；Alley M.C.等人,Cancer Res.2004；64:6700-6706；Pepper C.J.,Cancer Res 2004；74:6750-6755；Thurston D.E.和Bose D.S.,Chem Rev 1994；94:433-465；以及Tozuka,Z.等人,Journal of Antibiotics, (1983)36；1699-1708。PBD的一般结构描述于美国公布号20070072846中。所述PBD在取代基的数量、类型和位置；其芳香族A环和吡咯并C环；以及C环饱和度方面有所不同。其在小沟中形成加合物和交联DNA的能力使其能够干扰DNA加工，由此其有可能用作抗增生剂。
最先进入临床的吡咯并苯并二氮杂
Figure BDA0001239440410000028
SJG-136(NSC 694501)是引起DNA链间交联的有效细胞毒性剂(S.G Gregson等人,2001,J.Med. Chem.,44:737-748；M.C.Alley等人,2004,Cancer Res.,64: 6700-6706；J.A.Hartley等人,2004,Cancer Res.,64:6693-6699；C. Martin等人,2005,Biochemistry.,44:4135-4147；S.Arnould等人,2006, Mol.CancerTher.,5:1602-1509)。来自SJG-136的I期临床评价的结果揭示，这种药物在极低剂量(最大耐受剂量是45μg/m2)下具有毒性，并且观察到若干不良作用，包括血管渗漏综合征、外周性水肿、肝毒性和疲劳。在所有剂量下，在循环淋巴细胞中观察到DNA损伤(D. Hochhauser等人,2009,Clin.Cancer Res.,15:2140-2147)。因此，需要毒性较低且仍对于治疗诸如癌症的多种增生性疾病具有治疗活性的改进的苯并二氮杂
Figure BDA0001239440410000031
衍生物。
发明概述
本文所描述的新颖苯并二氮杂
Figure BDA0001239440410000032
化合物和其缀合物针对各种肿瘤细胞具有出人意料地高效力。
本发明的一个目的是提供一种由下式中的任一个表示的细胞毒性化合物：
Figure BDA0001239440410000041
或其药学上可接受的盐，其中：
L’、L”和L”’中的一个由下式表示：
-Z1-P-Z2-Rx-J (A)
且另外两个相同或不同，且独立地选自-H；任选取代的具有1至 10个碳原子的直链、支链或环状烷基、烯基或炔基；聚乙二醇单元 -(CH2CH2O)n-Rc；卤素；胍鎓[-NH(C＝NH)NH2]；-OR；-NR’R”；-NO2； -NR’COR”；-SR；-SOR’；-SO2R’；-SO3H；-OSO3H；-SO2NR’R”；氰基；叠氮基；-COR’；-OCOR’；和-OCONR’R”；
Z1和Z2中的一个是-C(＝O)-，且另一个为–NR5-；
P是氨基酸残基或含有介于2至20个之间的氨基酸残基的肽；
Rx是任选取代的具有1至10个碳原子的直链、支链或环状烷基、烯基或炔基；
J是包含能够将所述细胞毒性化合物共价连接至细胞结合剂的反应性基团的部分；
在N与C之间的双线
Figure BDA0001239440410000051
表示单键或双键，条件是当其为双键时， X不存在且Y是-H或具有1至4个碳原子的直链或支链烷基，且当其为单键时，X是-H或胺保护部分；
Y是选自以下的离去基团：-OR、-OCOR’、-OCOOR’、 -OCONR’R”、-NR’R”、-NR’COR”、-NR’NR’R”、任选取代的5元或6元含氮杂环(例如，通过氮原子连接的哌啶、四氢吡咯、吡唑、吗啉等)、由-NR’(C＝NH)NR’R”表示的胍鎓、氨基酸残基或由 -NRCOP’表示的肽、-SR、-SOR’、卤素、氰基、叠氮基、-OSO3H、亚硫酸酯基(-SO3H或-SO2H)、偏亚硫酸氢酯(H2S2O5)、单-、二-、三- 和四-硫代磷酸酯(PO3SH3、PO2S2H2、POS3H2、PS4H2)、硫代磷酸酯 (RiO)2PS(ORi)、RiS-、RiSO、RiSO2、RiSO3、硫代硫酸酯(HS2O3)、连二亚硫酸酯(HS2O4)、二硫代磷酸酯(P(＝S)(ORk’)(S)(OH))、羟肟酸 (Rk’C(＝O)NOH)和甲醛次硫酸根(HOCH2SO2 -)，或其混合物，其中Ri是具有1至10个碳原子的直链或支链烷基，且被至少一个选自 -N(Rj)2、-CO2H、-SO3H和-PO3H的取代基取代；Ri可进一步任选地被本文关于烷基所描述的取代基取代；Rj是具有1至6个碳原子的直链或支链烷基；Rk’是具有1至10个碳原子的直链、支链或环状烷基、烯基或炔基；芳基；杂环基；或杂芳基；
P’是氨基酸残基或含有介于2至20个之间的氨基酸残基的多肽；
R在每次出现时独立地选自由以下组成的组：-H；任选取代的具有1至10个碳原子的直链、支链或环状烷基、烯基或炔基；聚乙二醇单元-(CH2CH2O)n-Rc；任选取代的具有6至18个碳原子的芳基；任选取代的含有一个或多个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5元至18元杂芳基；或任选取代的含有1至6个独立地选自O、S、N和P 的杂原子的3元至18元杂环；
R’和R”各自独立地选自-H；-OH；-OR；-NHR；-NR2；-COR；任选取代的具有1至10个碳原子的直链、支链或环状烷基、烯基或炔基；聚乙二醇单元-(CH2CH2O)n-Rc；和任选取代的具有1至6个独立地选自O、S、N和P的杂原子的3元至18元杂环；
Rc是-H，或任选取代的具有1至4个碳原子的直链或支链烷基；
n是1至24的整数；
X’选自-H；胺保护基团；任选取代的具有1至10个碳原子的直链、支链或环状烷基、烯基或炔基；聚乙二醇单元-(CH2CH2O)n-Rc；任选取代的具有6至18个碳原子的芳基；任选取代的含有一个或多个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5元至18元杂芳基环；和任选取代的含有1至6个独立地选自O、S、N和P的杂原子的3元至18 元杂环；
Y’选自-H；氧代基团；任选取代的具有1至10个碳原子的直链、支链或环状烷基、烯基或炔基；任选取代的6元至18元芳基；任选取代的含有一个或多个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5元至18 元杂芳基环；任选取代的具有1至6个杂原子的3元至18元杂环；
R1、R2、R3、R4、R1’、R2’、R3’和R4’各自独立地选自由以下组成的组：-H；任选取代的具有1至10个碳原子的直链、支链或环状烷基、烯基或炔基；聚乙二醇单元-(CH2CH2O)n-Rc；卤素；胍鎓 [-NH(C＝NH)NH2]；-OR；-NR’R”；-NO2；-NCO；-NR’COR”；-SR； -SOR’；-SO2R’；-SO3 -H；-OSO3H；-SO2NR’R”；氰基；叠氮基；-COR’； -OCOR’；以及-OCONR’R”；
R6是-H、-R、-OR、-SR、-NR’R”、-NO2或卤素；
G是–CH-或–N-；
A与A’相同或不同，且独立地选自-O-、氧代(-C(＝O)-)、-CRR’O-、 -CRR’-、-S-、-CRR’S-、-NR5和-CRR’N(R5)-；并且
R5在每次出现时独立地是-H，或任选取代的具有1至10个碳原子的直链或支链烷基。
在一个实施方案中，对于具有结构式(I)-(VI)的化合物，G是–CH-。
本发明的第二目的是提供细胞结合剂与本发明的新颖苯并二氮杂
Figure BDA0001239440410000071
化合物或其衍生物的缀合物。这些缀合物适用作治疗剂，其被特异性递送至靶细胞且具有细胞毒性。
具体地说，本发明的缀合物可包含：细胞毒性化合物和细胞结合剂(CBA)，其中所述细胞毒性化合物共价连接至所述CBA，且其中所述细胞毒性化合物由下式中的任一个表示：
Figure BDA0001239440410000081
或其药学上可接受的盐，其中：
L’、L”和L”’中的一个由下式表示：
-Z1-P-Z2-Rx-J’ (A’)
且另外两个相同或不同，且独立地选自-H；任选取代的具有1至 10个碳原子的直链、支链或环状烷基、烯基或炔基；聚乙二醇单元 -(CH2CH2O)n-Rc；卤素；胍鎓[-NH(C＝NH)NH2]；-OR；-NR’R”；-NO2； -NR’COR”；-SR；由-SOR’表示的亚砜；由-SO2R’表示的砜；磺酸酯基-SO3M；硫酸酯基-OSO3M；由-SO2NR’R”表示的磺酰胺；氰基；叠氮基；-COR’；-OCOR’；以及-OCONR’R”；
J’是包含共价连接至所述细胞结合剂的连接基团的部分；并且
其余变量是如以上关于式(I)-(VI)所描述。
在一个实施方案中，对于结构式(I’)-(VI’)的缀合物，G是–CH-。
在另一个实施方案中，对于结构式(I’)-(VI’)的缀合物，所述细胞结合剂是抗叶酸受体抗体或其抗体片段。更具体地说，所述抗叶酸受体抗体是huMOV19抗体。
在又另一实施方案中，对于结构式(I’)-(VI’)的缀合物，所述细胞结合剂是抗EGFR抗体或其抗体片段。在一个实施方案中，所述抗 EGFR抗体是非拮抗剂抗体，包括例如WO2012058592(以引用的方式并入本文)中所描述的抗体。在另一个实施方案中，抗EGFR抗体是非功能性抗体，例如人源化ML66。更具体地说，抗EGFR抗体是 huML66。
本发明还包括一种组合物(例如，药物组合物)，其包含新颖苯并二氮杂
Figure BDA0001239440410000091
化合物、其衍生物或其缀合物(和/或其溶剂化物、水合物和/ 或盐)和载体(药学上可接受的载体)。本发明另外包括一种组合物(例如，药物组合物)，其包含新颖苯并二氮杂
Figure BDA0001239440410000101
化合物、其衍生物或其缀合物(和/或其溶剂化物、水合物和/或盐)和载体(药学上可接受的载体)，其还包含第二治疗剂。本发明的组合物适用于在哺乳动物(例如，人)中抑制异常细胞生长或治疗增生性病症。本发明的组合物适用于治疗哺乳动物(例如，人)的病状，如癌症、类风湿性关节炎、多发性硬化症、移植物抗宿主疾病(GVHD)、移植排斥、狼疮、肌炎、感染、免疫缺陷(如AIDS)和炎性疾病。
本发明包括一种在哺乳动物(例如，人)中抑制异常细胞生长或治疗增生性病症的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用单独或与第二治疗剂组合的治疗有效量的新颖苯并二氮杂
Figure BDA0001239440410000102
化合物、其衍生物或其缀合物(和/或其溶剂化物和盐)或其组合物。
本发明包括一种合成和使用新颖苯并二氮杂
Figure BDA0001239440410000103
化合物、其衍生物和其缀合物以在体外、原位和体内诊断或治疗哺乳动物细胞、生物体或相关病理病状的方法。
本发明的化合物、其衍生物或其缀合物和包含其的组合物适用于治疗或减轻诸如以细胞异常生长为特征的病症(例如，癌症)的严重程度。本发明的化合物和缀合物的其他应用包括但不限于，治疗哺乳动物(例如，人)的病状，如癌症、类风湿性关节炎、多发性硬化症、移植物抗宿主疾病(GVHD)、移植排斥、狼疮、肌炎、感染、免疫缺陷(如 AIDS)和炎性疾病。
附图简述
图1示出huMOV19-14缀合物与未缀合的抗体huMOV19在 T47D细胞上的结合亲和力的比较。
图2示出huMOV19-14缀合物的体外细胞毒性和特异性。
图3示出，huMOV19-14缀合物对相邻抗原阴性细胞表现出较弱的旁观者细胞毒性作用。
图4A、4B和4C示出huMy9-6-14缀合物针对各种细胞系的体外细胞毒性。
图5A和5B示出，huMy9-6-14缀合物对相邻抗原阴性细胞表现出旁观者细胞毒性作用。
图6示出huMOV19-80和huMOV19-90缀合物在携带 NCI-H2110的SCID小鼠中的体内功效。
图7A-7D示出本发明的代表性缀合物的质谱曲线。
图8示出huML66-90缀合物的质谱曲线。
图9示出huML66-90缀合物的体外细胞毒性和特异性。
图10、11和12示出huMOV19-90缀合物的体外细胞毒性和特异性。
图13示出，huMOV19-90缀合物对相邻抗原阴性细胞表现出较强的旁观者细胞毒性作用。
图14示出huMOV19-90缀合物在携带NCI-H2110的SCID小鼠中的体内功效。
图15A和15B示出huMOV19-90缀合物与未缀合的抗体 huMOV19在T47D细胞上的结合亲和力的比较。
图16示出本发明的代表性缀合物的质谱曲线。
图17示出huML66-90缀合物在携带NCI-H1703 NSCLC的SCID 小鼠中的体内功效。
图18示出huMOV19-90在CD-1小鼠中的药物动力学。
图19A和19B示出huMOV19-90缀合物的结构(图19A)，以及由在KB子宫颈癌细胞中体外形成的huMOV19-90缀合物得到的分解代谢物的孵育、纯化和分离方案(图19B)。示出通过LC-MS鉴别的三种分解代谢物以及质量计算值。
图20示出huMOV19-107缀合物与未缀合的抗体huMOV19在 T47D细胞上的结合亲和力的比较。
图21示出huMOV19-90缀合物和huMOV19-107缀合物的体外细胞毒性和特异性。
图22示出huMOV19-90缀合物在携带NCI-H2110 NSCLC异种移植物的SCID小鼠中的体内功效。
图23示出huMOV19-90缀合物在携带Hec-1b子宫内膜异种移植物的SCID小鼠中的体内功效。
图24示出huMOV19-90缀合物在携带Ishikawa子宫内膜异种移植物的SCID小鼠中的体内功效。
图25示出huMOV19-107缀合物在携带NCI-H2110 NSCLC异种移植物的SCID小鼠中的体内功效。
图26示出huCD123-6Gv4.7S3-90缀合物与未缀合的抗体在 HNT-34细胞上的结合亲和力的比较。
发明详述
现将更详细地提及本发明的某些实施方案，其实例以所附结构和式说明。尽管本发明将结合所列举的实施方案进行描述，但应了解，其不意图将本发明限于那些实施方案。相反，本发明意图涵盖可包括在由权利要求所限定的本发明的范围内的所有替代方案、修改和等效物。本领域的技术人员将认识到与本文所描述的方法和材料类似或等效的许多方法和材料，所述方法和材料可用于实践本发明。
应了解，除非明确地否定或不恰当，否则本文所描述的任何实施方案，包括在本发明的不同方面和本说明书不同部分(包括仅在实施例中描述的实施方案)下描述的那些实施方案(例如，化合物、化合物- 接头分子、缀合物、组合物、制备方法和使用方法)可与本发明的一个或多个其他实施方案组合。实施方案的组合不限于经由多个附属权利要求要求保护的那些具体组合。
定义
如本文所使用，术语“细胞结合剂”或“CBA”是指可结合细胞(例如，在细胞表面配体上)或结合与细胞缔合或邻近细胞的配体(优选以一种特异性方式结合)的化合物。在某些实施方案中，与细胞或者细胞上或细胞附近的配体结合是特异性的。CBA可包括肽和非肽。
如本文所使用，“直链或支链烷基”是指具有一至二十个碳原子的饱和直链或支链单价烃基。烷基的实例包括但不限于，甲基、乙基、 1-丙基、2-丙基、1-丁基、2-甲基-1-丙基、-CH2CH(CH3)2、2-丁基、2-甲基-2-丙基、1-戊基、2-戊基、3-戊基、2-甲基-2-丁基、3-甲基-2- 丁基、3-甲基-1-丁基、2-甲基-1-丁基、1-己基、2-己基、3-己基、2- 甲基-2-戊基、3-甲基-2-戊基、4-甲基-2-戊基、3-甲基-3-戊基、2-甲基 -3-戊基、2,3-二甲基-2-丁基、3,3-二甲基-2-丁基、1-庚基、1-辛基等。优选地，烷基具有一至十个碳原子。更优选地，烷基具有一至四个碳原子。
“直链或支链烯基”是指具有二至二十个碳原子和至少一个不饱和位点(即，碳-碳双键)的直链或支链单价烃基，其中烯基包括具有“顺式”和“反式”取向，或可替代地具有“E”和“Z”取向的基团。实例包括但不限于，乙烯基(ethylenyl/vinyl)(-CH＝CH2)、烯丙基(-CH2CH＝CH2) 等。优选地，烯基具有二至十个碳原子。更优选地，烯基具有二至四个碳原子。
“直链或支链炔基”是指具有二至二十个碳原子和至少一个不饱和位点(即，碳-碳三键)的直链或支链单价烃基。实例包括但不限于，乙炔基、丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、1-戊炔基、2-戊炔基、3-戊炔基、己炔基等。优选地，炔基具有二至十个碳原子。更优选地，炔基具有二至四个碳原子。
术语“碳环”、“碳环基”和“碳环状环”是指具有3至12个碳原子(单环形式)或具有7至12个碳原子(双环形式)的单价非芳香族饱和或部分不饱和环。具有7至12个原子的双环碳环可例如按双环[4,5]、[5,5]、 [5,6]或[6,6]系统形式布置，且具有9或10个环原子的双环碳环可按双环[5,6]或[6,6]系统形式布置，或按桥接系统形式布置，如双环[2.2.1] 庚烷、双环[2.2.2]辛烷和双环[3.2.2]壬烷。单环碳环的实例包括但不限于，环丙基、环丁基、环戊基、1-环戊-1-烯基、1-环戊-2-烯基、1- 环戊-3-烯基、环己基、1-环己-1-烯基、1-环己-2-烯基、1-环己-3-烯基、环己二烯基、环庚基、环辛基、环壬基、环癸基、环十一烷基、环十二烷基等。
术语“环状烷基”和“环烷基”可互换使用。它们是指单价饱和碳环基团。优选地，环状烷基是3元至7元单环基团。更优选地，环状烷基是环己基。
术语“环状烯基”是指在环结构中具有至少一个双键的碳环基团。
术语“环状炔基”是指在环结构中具有至少一个三键的碳环基团。
“芳基”意指通过自母体芳香族环系统的单一碳原子移除一个氢原子得到的6至18个碳原子的单价芳香族烃基。一些芳基在示例性结构中以“Ar”表示。芳基包括包含与饱和、部分不饱和环或芳香族碳环或杂环稠合的芳香族环的双环基团。典型的芳基包括但不限于，衍生自苯(苯基)、取代的苯、萘、蒽、茚基、二氢茚基、1,2-二氢萘、 1,2,3,4-四氢萘基等的基团。优选地，芳基是苯基。
术语“杂环”、“杂环基”和“杂环状环”在本文中可互换使用，且指其中至少一个环原子是选自氮、氧、磷和硫的杂原子且其余环原子为 C的3至18个环原子的饱和或部分不饱和(即，在环内具有一个或多个双键和/或三键)碳环基团，其中一个或多个环原子任选地独立地被一个或多个以下描述的取代基取代。杂环可以是具有3至7个环成员 (2至6个碳原子和1至4个选自N、O、P和S的杂原子)的单环，或具有7至10个环成员(4至9个碳原子和1至6个选自N、O、P和S 的杂原子)的双环，例如：双环[4,5]、[5,5]、[5,6]或[6,6]系统。杂环描述于Paquette,Leo A.；“Principles of Modern Heterocyclic Chemistry” (W.A.Benjamin,New York,1968)，具体地说，第1、3、4、6、7和9 章；“The Chemistry of HeterocyclicCompounds,A series of Monographs”(John Wiley&Sons,New York,1950至今)，具体地说，第13、14、16、19和28卷；和J.Am.Chem.Soc.(1960)82:5566中。“杂环基”还包括杂环基团与饱和、部分不饱和环或芳香族碳环或杂环稠合的基团。杂环的实例包括但不限于，吡咯烷基、四氢呋喃基、二氢呋喃基、四氢噻吩基、四氢吡喃基、二氢吡喃基、四氢硫代吡喃基、哌啶子基、吗啉代、硫代吗啉代、氧硫杂环己烷基、哌嗪基、高哌嗪基、氮杂环丁烷基、氧杂环丁烷基、硫杂环丁烷基、高哌啶基、氧杂环庚烷基、硫杂环庚烷基、氧氮杂
Figure BDA0001239440410000151
基、二氮杂
Figure BDA0001239440410000152
基、硫氮杂
Figure BDA0001239440410000153
基、 2-吡咯啉基、3-吡咯啉基、二氢吲哚基、2H-吡喃基、4H-吡喃基、二噁烷基、1,3-二氧戊环基、吡唑啉基、二噻烷基、二硫戊环基、二氢吡喃基、二氢噻吩基、二氢呋喃基、吡唑烷基、咪唑啉基、咪唑烷基、 3-氮杂双环[3.1.0]己基、3-氮杂双环[4.1.0]庚基和氮杂双环[2.2.2]己烷基。在此定义的范围内还包括螺部分。其中环原子被氧代(＝O)部分取代的杂环基团的实例是嘧啶酮基和1,1-二氧代-硫代吗啉基。
术语“杂芳基”是指含有一个或多个独立地选自氮、氧和硫的杂原子的5元或6元环的单价芳香族基团，且包括5-18个原子的稠环系统(其中至少一个为芳香族环)。杂芳基的实例是吡啶基(包括例如，2- 羟基吡啶基)、咪唑基、咪唑并吡啶基、嘧啶基(包括例如，4-羟基嘧啶基)、吡唑基、三唑基、吡嗪基、四唑基、呋喃基、噻吩基、异噁唑基、噻唑基、噁唑基、异噻唑基、吡咯基、喹啉基、异喹啉基、吲哚基、苯并咪唑基、苯并呋喃基、噌啉基、吲唑基、吲哚嗪基、酞嗪基、哒嗪基、三嗪基、异吲哚基、蝶啶基、嘌呤基、噁二唑基、三唑基、噻二唑基、呋咱基、苯并呋咱基、苯并噻吩基、苯并噻唑基、苯并噁唑基、喹唑啉基、喹喔啉基、萘啶基和呋喃并吡啶基。
如果可能，杂环或杂芳基可以是碳附接的(碳连接的)或氮附接的 (氮连接的)。作为举例且非限制，碳键合的杂环或杂芳基在吡啶的2、 3、4、5或6位键合，在哒嗪的3、4、5或6位键合，在嘧啶的2、4、 5或6位键合，在吡嗪的2、3、5或6位键合，在呋喃、四氢呋喃、硫代呋喃、噻吩、吡咯或四氢吡咯的2、3、4或5位键合，在噁唑、咪唑或噻唑的2、4或5位键合，在异噁唑、吡唑或异噻唑的3、4或5位键合，在氮丙啶的2或3位键合，在吖丁啶的2、3或4位键合，在喹啉的2、3、4、5、6、7或8位键合，或在异喹啉的1、3、4、5、 6、7或8位键合。
作为举例且非限制，氮键合的杂环或杂芳基在氮丙啶、吖丁啶、吡咯、吡咯烷、2-吡咯啉、3-吡咯啉、咪唑、咪唑烷、2-咪唑啉、3- 咪唑啉、吡唑、吡唑啉、2-吡唑啉、3-吡唑啉、哌啶、哌嗪、吲哚、二氢吲哚、1H-吲唑的1位；异吲哚或异二氢吲哚的2位；吗啉的4 位；和咔唑或O-咔啉的9位处键合。
杂芳基或杂环基中存在的杂原子包括氧化形式，如NO、SO和 SO2。
术语“卤代”或“卤素”是指F、Cl、Br或I。
上述烷基、烯基、炔基、环状烷基、环状烯基、环状炔基、碳环基、芳基、杂环基和杂芳基可任选地被一个或多个(例如，2、3、4、 5、6或更多个)取代基取代。
如果取代基被描述为“取代”，则非氢取代基是在所述取代基的碳、氧、硫或氮上氢取代基的位置。因此，例如，取代的烷基取代基是至少一个非氢取代基处于烷基取代基上氢取代基的位置的烷基取代基。为了说明，单氟烷基是被氟取代基取代的烷基，且二氟烷基是被两个氟取代基取代的烷基。应认识到，如果在一个取代基上存在多于一个取代，则每一非氢取代基可相同或不同(除非另外说明)。
如果一个取代基被描述为“任选取代的”，则所述取代基可以是(1) 未取代的，或(2)取代的。如果取代基的碳被描述为任选地被取代基列表中的一个或多个取代，则所述碳上的一个或多个氢(其范围为存在的任何数量)可独立地和/或一起被独立选择的任选的取代基置换。如果取代基的氮被描述为任选地被取代基列表中的一个或多个取代，则所述氮上的一个或多个氢(其范围为存在的任何数量)可各自被独立选择的任选的取代基置换。一个示例性取代基可被描绘为-NR’R”，其中R’和R”连同其所连接的氮原子一起可形成杂环。由R’和R”连同其所连接的氮原子一起形成的杂环可以是部分或完全饱和的。在一个实施方案中，杂环由3至7个原子组成。在另一个实施方案中，所述杂环选自由以下组成的组：吡咯基、咪唑基、吡唑基、三唑基、四唑基、异噁唑基、吡啶基和噻唑基。
本说明书可互换地使用术语“取代基”、“基团(radical)”和“基团 (group)”。
如果一组取代基共同地描述为任选地被取代基列表中的一个或多个取代，则所述组可包括：(1)不可取代的取代基；(2)未被任选的取代基取代的可取代的取代基；和/或(3)被一个或多个任选的取代基取代的可取代的取代基。
如果一个取代基被描述为任选地被特定数量的非氢取代基取代，则所述取代基可(1)未取代；或(2)被至多所述特定数量的非氢取代基或被至多所述取代基上最大数量的可取代位置取代，以数量较小的为准。因此，例如，如果一个取代基被描述为任选地被至多3个非氢取代基取代的杂芳基，则具有少于3个可取代位置的任何杂芳基将任选地被至多仅所述杂芳基所具有的可取代位置的数量的非氢取代基取代。在非限制性实例中，此类取代基可选自具有1至10个碳原子的直链、支链或环状烷基、烯基或炔基；芳基；杂芳基；杂环基；卤素；胍鎓[-NH(C＝NH)NH2]；-OR100；NR101R102；-NO2；-NR101COR102；-SR100；以-SOR101表示的亚砜；以-SO2R101表示的砜；磺酸酯基-SO3M；硫酸酯基-OSO3M；以-SO2NR101R102表示的磺酰胺；氰基；叠氮基；-COR101； -OCOR101；-OCONR101R102；和聚乙二醇单元(-CH2CH2O)nR101，其中 M是H或阳离子(如Na+或K+)，R101、R102和R103各自独立地选自H；具有1至10个碳原子的直链、支链或环状烷基、烯基或炔基；聚乙二醇单元(-CH2CH2O)n-R104，其中n是1至24的整数；具有6至10 个碳原子的芳基；具有3至10个碳原子的杂环以及具有5至10个碳原子的杂芳基；且R104是H或具有1至4个碳原子的直链或支链烷基，其中由R100、R101、R102、R103和R104表示的基团中的烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基和杂环基任选地被一个或多个(例如，2、3、4、 5、6或更多个)独立地选自以下的取代基取代：卤素、-OH、-CN、-NO2以及具有1至4个碳原子的未取代的直链或支链烷基。优选地，上述任选取代的烷基、烯基、炔基、环状烷基、环状烯基、环状炔基、碳环基、芳基、杂环基和杂芳基的取代基包括卤素、-CN、-NR102R103、 -CF3、-OR101、芳基、杂芳基、杂环基、-SR101、-SOR101、-SO2R101和-SO3M。
术语“化合物”或“细胞毒性化合物”、“细胞毒性二聚体”和“细胞毒性二聚体化合物”可互换使用。其意图包括结构或式或其任何衍生物已在本发明中公开，或结构或式或其任何衍生物已以引用的方式并入的化合物。所述术语还包括本发明中所公开的所有式的化合物的立体异构体、几何异构体、互变异构体、溶剂化物、代谢物、盐(例如，药学上可接受的盐)和前药，以及前药盐。所述术语还包括前述任一种的任何溶剂化物、水合物和多晶型物。在本申请中所描述的本发明的某些方面中，有关“立体异构体”、“几何异构体”、“互变异构体”、“溶剂化物”、“代谢物”、“盐”、“前药”、“前药盐”、“缀合物”、“缀合物盐”、“溶剂化物”、“水合物”或“多晶型物”的具体陈述不应解释为意图在未使用这些其他形式陈述术语“化合物”的本发明的其他方面中省略这些形式。
如本文所使用，术语“缀合物”是指连接至细胞结合剂的本文所描述的化合物或其衍生物。
如本文所使用，术语“可连接至细胞结合剂”是指包含至少一个适于将化合物或其衍生物键合至细胞结合剂的连接基团或其前体的本文所描述的化合物或其衍生物。
术语给定基团的“前体”是指可通过任何脱保护、化学改性或偶联反应而产生所述基团的任何基团。
术语“连接至细胞结合剂”是指包含经由合适连接基团或其前体结合至细胞结合剂的本文所描述的化合物(例如，式(I)-(IV)和 (VIII)-(XI)的化合物和本文所描述的药物-接头化合物)或其衍生物中的至少一种的缀合物分子。
术语“手性”是指具有镜像配偶体不可重叠性的特性的分子，而术语“非手性”是指在其镜像配偶体可重叠上的分子。
术语“立体异构体”是指具有相同化学构造和连接性，但其原子在空间中的取向不同且无法通过关于单键旋转而互变的化合物。
“非对映异构体”是指具有两个或更多个手性中心且分子间不呈镜像的立体异构体。非对映异构体具有不同的物理特性，例如熔点、沸点、光谱特性和反应性。非对映异构体的混合物可依据高解析度分析程序，如结晶、电泳和色谱法分离。
“对映异构体”是指一种化合物的具有彼此不可重叠的镜像的两种立体异构体。
本文所使用的立体化学定义和惯例一般遵循S.P.Parker编辑, McGraw-HillDictionary of Chemical Terms(1984)McGraw-Hill Book Company,New York；以及Eliel,E.和Wilen,S.,“Stereochemistry of Organic Compounds”,John Wiley&Sons,Inc.,New York,1994。本发明的化合物可含有不对称或手性中心，且因此以不同立体异构形式存在。预期本发明化合物的所有立体异构形式，包括但不限于非对映异构体、对映异构体和阻转异构体以及其混合物(如外消旋混合物)，形成本发明的一部分。许多有机化合物以光学活性形式存在，即，其能够旋转平面偏振光的平面。在描述光学活性化合物时，使用前缀D 和L，或R和S来指示所述分子关于其手性中心的绝对构型。前缀d 和l或(+)和(-)用于指示化合物旋转平面偏振光的标记，其中(-)或1意味着所述化合物是左旋的。具有前缀(+)或d的化合物是右旋的。对于给定化学结构，这些立体异构体是相同的，除了其彼此呈镜像。特定立体异构体还可称为对映异构体，且此类异构体的混合物常称为对映异构体混合物。对映异构体的50:50混合物被称为外消旋混合物或外消旋物，其可在化学反应或过程中无立体选择性或立体特异性情况下出现。术语“外消旋混合物”和“外消旋物”是指两种对映异构物质的等摩尔混合物，不管光学活性如何。
术语“互变异构体”或“互变异构形式”是指可经由低能量障壁互变的具有不同能量的结构异构体。例如，质子互变异构体(还称为质子转移互变异构体)包括经由质子迁移引起的互变，如酮-烯醇和亚胺- 烯胺异构。原子价互变异构体包括由一些键合电子再组织引起的互变。
如本申请中所使用，术语“前药”是指能够酶促或水解活化或者转化成更具活性的活性母体形式的本发明化合物的前体或衍生物形式。参见例如，Wilman,“Prodrugs inCancer Chemotherapy”,Biochemical Society Transactions,14,第375-382页,615thMeeting Belfast(1986)；和Stella等人,“Prodrugs:A Chemical Approach to TargetedDrug Delivery”,Directed Drug Delivery,Borchardt等人(编辑),第247-267页, HumanaPress(1985)。本发明的前药包括但不限于，含酯前药、含磷酸酯前药、含硫代磷酸酯前药、含硫酸酯前药、含肽前药、D-氨基酸修饰的前药、糖基化前药、含β-内酰胺的前药、含任选取代的苯氧基乙酰胺的前药、含任选取代的苯基乙酰胺的前药、5-氟胞嘧啶和其他 5-氟尿嘧啶前药，其可转化成更具活性的细胞毒性游离药物。可衍生化成用于本发明中的前药形式的细胞毒性药物的实例包括但不限于，本发明的化合物和化学治疗剂，如以上所描述。
术语“前药”还意指包括在生物条件(体外或体内)下可水解、氧化或以其他方式反应来提供本发明化合物的化合物的衍生物。前药可能仅在生物条件下反应时变得有活性，或其可在呈其未反应形式时具有活性。本发明所涵盖的前药的实例包括但不限于，具有本文所公开的任一式的化合物的类似物或衍生物，其包含可生物水解部分，如可生物水解的酰胺、可生物水解的酯、可生物水解的氨基甲酸酯、可生物水解的碳酸酯、可生物水解的酰脲和可生物水解的磷酸酯类似物。前药的其他实例包括包含-NO、-NO2、-ONO或-ONO2部分的具有本文所公开的任一式的化合物的衍生物。前药通常可使用熟知方法制备，如Burger’sMedicinal Chemistry and Drug Discovery(1995)172-178, 949-982(Manfred E.Wolff编辑,第5版)所描述的方法；还参见 Goodman和Gilman,The Pharmacological basis ofTherapeutics,第8版, McGraw-Hill,Int.编辑,1992,“Biotransformation of Drugs”。
本发明的前药的一种优选形式包括含在本发明的化合物/缀合物的亚胺键与亚胺反应性试剂之间形成的加合物的本发明化合物(有或无连接基团)和缀合物。本发明的前药的另一优选形式包括诸如式(I)- (IV)那些的化合物，其中当N与C之间的双线
Figure BDA0001239440410000211
表示单键时，X式H 或胺保护基团，且所述化合物变为前药。本发明的前药可含有本文所述前药的一种或两种形式(例如，含有在化合物/缀合物的亚胺键与亚胺反应性试剂之间形成的加合物，和/或当X是-H时含有Y离去基团)。
术语“亚胺反应性试剂”是指能够与亚胺基团反应的试剂。亚胺反应性试剂的实例包括但不限于，亚硫酸盐(H2SO3、H2SO2，或HSO3 -、 SO3 2-或HSO2 -与阳离子形成的盐)；偏亚硫酸氢盐(H2S2O5，或S2O5 2-与阳离子形成的盐)；单-、二-、三-和四-硫代磷酸盐(PO3SH3、PO2S2H3、POS3H3、PS4H3，或PO3S3-、PO2S2 3-、POS3 3-或PS4 3-与阳离子形成的盐)；硫代磷酸酯((RiO)2PS(ORi)、RiSH、RiSOH、RiSO2H、RiSO3H)；各种胺(羟胺(例如NH2OH)、肼(例如NH2NH2)、NH2O-Ri、Ri’NH-Ri、 NH2-Ri)、NH2-CO-NH2、NH2-C(＝S)-NH2；硫代硫酸盐(H2S2O3，或S2O3 2-与阳离子形成的盐)；连二亚硫酸盐(H2S2O4，或S2O4 2-与阳离子形成的盐)；二硫代磷酸盐(P(＝S)(ORk)(SH)(OH)，或其与阳离子形成的盐)；异羟肟酸(RkC(＝O)NHOH，或与阳离子形成的盐)；酰肼(RkCONHNH2)；甲醛次硫酸盐(HOCH2SO2H，或HOCH2SO2 -与阳离子形成的盐，如HOCH2SO2 -Na+)；糖化核苷酸(如GDP-甘露糖)；氟达拉滨；或其混合物，其中Ri和Ri’各自独立地是具有1至10个碳原子的直链或支链烷基且被至少一个选自-N(Rj)2、-CO2H、-SO3H和 -PO3H的取代基取代；Ri和Ri’可进一步任选地被本文关于烷基所描述的取代基取代；Rj是具有1至6个碳原子的直链或支链烷基；且 Rk是具有1至10个碳原子的直链、支链或环状烷基、烯基或炔基；芳基；杂环基；或杂芳基(优选地，Rk是具有1至4个碳原子的直链或支链烷基；更优选地，Rk是甲基、乙基或丙基)。优选地，所述阳离子是单价阳离子，如Na+或K+。优选地，亚胺反应性试剂选自亚硫酸盐、羟胺、尿素和肼。更优选地，亚胺反应性试剂是NaHSO3或 KHSO3。
如本文所使用且除非另外指示，否则术语“可生物水解的酰胺”、“可生物水解的酯”、“可生物水解的氨基甲酸酯”、“可生物水解的碳酸酯”、“可生物水解的酰脲”和“可生物水解的磷酸酯类似物”分别意指这样一种酰胺、酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、酰脲或磷酸酯类似物，其1)不会破坏所述化合物的生物活性且赋予所述化合物有利的体内特性，如吸收、作用持续时间或作用起始；或2)本身不具生物活性，但在体内转化成生物活性化合物。可生物水解的酰胺的实例包括但不限于，低级烷基酰胺、α-氨基酸酰胺、烷氧基酰基酰胺和烷基氨基烷基羰基酰胺。可生物水解的酯的实例包括但不限于，低级烷基酯、烷氧基酰氧基酯、烷基酰氨基烷基酯和胆碱酯。可生物水解的氨基甲酸酯的实例包括但不限于，低级烷基胺、取代的亚乙基二胺、氨基酸、羟基烷基胺、杂环和杂芳香族胺以及聚醚胺。特别有益的前药和前药盐是当将本发明的化合物施用至哺乳动物时，增加所述化合物的生物利用率的那些。
如本文所使用，短语“药学上可接受的盐”是指本发明的化合物的药学上可接受的有机或无机盐。示例性盐包括但不限于，硫酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、草酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、硝酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、酸式磷酸盐、异烟碱酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、酸式柠檬酸盐、酒石酸盐、油酸盐、丹宁酸盐、泛酸盐、酒石酸氢盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、龙胆酸盐、富马酸盐、葡糖酸盐、葡糖醛酸盐、糖酸盐、甲酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、甲烷磺酸盐(“甲磺酸盐”)、乙烷磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐、双羟萘酸盐(即， 1,1’-亚甲基-双-(2-羟基-3-萘酸盐))、碱金属(例如，钠和钾)盐、碱土金属(例如，镁)盐以及铵盐。药学上可接受的盐可涉及包含另一分子，如乙酸根离子、琥珀酸根离子或其他抗衡离子。所述抗衡离子可以是使母体化合物上的电荷稳定的任何有机或无机部分。另外，药学上可接受的盐可在其结构中具有多于一个带电原子。多个带电原子作为所述药学上可接受的盐的一部分的情况可具有多个抗衡离子。因此，药学上可接受的盐可具有一个或多个带电原子和/或一个或多个抗衡离子。
如果本发明的化合物是一种碱，则所需药学上可接受的盐可通过本领域中可用的任何合适方法来制备，例如，用诸如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、甲烷磺酸、磷酸等的无机酸，或用诸如乙酸、马来酸、琥珀酸、扁桃酸、富马酸、丙二酸、酮戊酸、草酸、乙醇酸、水杨酸、吡喃糖苷酸(如葡糖醛酸或半乳糖醛酸)、α羟基酸(如柠檬酸或酒石酸)、氨基酸(如天冬氨酸或谷氨酸)、芳香族酸(如苯甲酸或肉桂酸)、磺酸(如对甲苯磺酸或乙烷磺酸)等处理游离碱。
如果本发明的化合物是一种酸，则所需药学上可接受的盐可通过任何合适方法来制备，例如，用无机或有机碱，如胺(伯胺、仲胺或叔胺)、碱金属氢氧化物或碱土金属氢氧化物等处理游离酸。合适盐的说明性实例包括但不限于，衍生自氨基酸(如甘氨酸和精氨酸)、氨、伯胺、仲胺和叔胺，以及环状胺(如哌啶、吗啉和哌嗪)的有机盐，以及衍生自钠、钙、钾、镁、锰、铁、铜、锌、铝和锂的无机盐。
如本文所使用，术语“溶剂化物”意指还包括通过非共价分子间力结合的化学计算量或非化学计算量的溶剂的化合物，所述溶剂为诸如水、异丙醇、丙酮、乙醇、甲醇、DMSO、乙酸乙酯、乙酸和乙醇胺、二氯甲烷、2-丙醇等。化合物的溶剂化物或水合物易于通过向所述化合物中添加至少一摩尔当量羟基溶剂(如甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇或水)以引起亚胺部分的溶剂化或水合作用来制备。
术语“异常细胞生长”和“增生性病症”在本申请中可互换使用。除非另外指示，否则如本文中所使用，“异常细胞生长”是指独立于正常调控机制(例如，丧失接触抑制作用)的细胞生长。这包括例如以下各项的异常生长：(1)通过度表达突变的酪氨酸激酶或过度表达受体酪氨酸激酶来增殖的肿瘤细胞(肿瘤)；(2)发生异常酪氨酸激酶活化的其他增生性疾病的良性和恶性细胞；(3)通过受体酪氨酸激酶增殖的任何肿瘤；(4)通过异常丝氨酸/苏氨酸激酶活化而增殖的任何肿瘤；以及(5) 发生异常丝氨酸/苏氨酸激酶活化的其他增生性疾病的良性和恶性细胞。
术语“癌症”和“癌性”是指或描述哺乳动物中通常以不受调控的细胞生长为特征的生理病状。“肿瘤”包含一个或多个癌细胞，和/或良性或癌变前细胞。
“治疗剂”涵盖生物试剂，如抗体、肽、蛋白质、酶，或化学治疗剂。
“化学治疗剂”是适用于治疗癌症的化合物。
“代谢物”是通过特定化合物、其衍生物或其缀合物，或其盐在体内代谢产生的产物。化合物、其衍生物或其缀合物的代谢物可使用本领域中已知的常规技术鉴别，并且其活性可使用多种测试(诸如本文所描述的那些测试)测定。此类产物可例如由所施用的化合物的氧化、羟基化、还原、水解、酰胺化、脱酰胺、酯化、去酯化、酶裂解等产生。因此，本发明包括本发明的化合物、其衍生物或其缀合物的代谢物，包括通过包括使本发明的化合物、其衍生物或其缀合物与哺乳动物接触一段足以得到其代谢产物的时间的方法产生的化合物、其衍生物或其缀合物。
短语“药学上可接受的”指示，所述物质或组合物必须在化学上和 /或毒理学上与构成制剂的其他成分和/或用其治疗的哺乳动物相容。
术语“保护基团”或“保护部分”是指在化合物、其衍生物或其缀合物上的其他官能团反应时，通常用于阻断或保护特定官能团的取代基。例如，“胺保护基团”或“氨基保护部分”是附接至氨基以阻断或保护化合物中的氨基官能团的取代基。此类基团是本领域中熟知的(参见例如，P.Wuts和T.Greene,2007,Protective Groups in Organic Synthesis,第7章,J.Wiley&Sons,NJ)，且其实例有氨基甲酸酯，如氨基甲酸甲酯和氨基甲酸乙酯、FMOC、取代的氨基甲酸乙酯、通过 1,6-β-消除裂解的氨基甲酸酯(还称为“自我分解型”)、尿素、酰胺、肽、烷基和芳基衍生物。合适氨基保护基团包括乙酰基、三氟乙酰基、叔丁氧基羰基(BOC)、苄氧基羰基(CBZ)和9-芴基亚甲基氧基羰基 (Fmoc)。有关保护基团和其用途的一般说明，参见P.G.M.Wuts&T.W. Greene,Protective Groups in Organic Synthesis,JohnWiley&Sons, New York,2007。
术语“离去基团”是指在取代或置换期间离开的带电荷基团或不带电荷部分。此类离去基团是本领域中熟知的且包括但不限于，卤素、酯、烷氧基、羟基、甲苯磺酸酯、三氟甲磺酸酯、甲磺酸酯、腈、叠氮化物、氨基甲酸酯、二硫化物、硫酯、硫醚和重氮化合物。
术语“双官能交联剂”、“双官能接头”或“交联剂”是指具有两个反应性基团的改性剂；其中一个反应性基团能够与细胞结合剂反应，而另一个与细胞毒性化合物反应，以将两个部分连接在一起。此类双官能交联剂是本领域中熟知的(参见例如，Isalm和Dent,Bioconjugation, 第5章,第218-363页,Groves Dictionaries Inc.New York,1999)。例如，能够经由硫醚键来键联的双官能交联剂包括用以引入马来酰亚胺基的N-琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-1-甲酸酯 (SMCC)，或用以引入碘代乙酰基的N-琥珀酰亚胺基-4-(碘代乙酰基)- 氨基苯甲酸酯(SIAB)。在细胞结合剂上引入马来酰亚胺基或卤代乙酰基的其他双官能交联剂是本领域中熟知的(参见美国专利申请号 2008/0050310、20050169933，自Pierce Biotechnology Inc.P.O.Box 117、Rockland、IL 61105、USA获得)，且包括但不限于，双-马来酰亚胺基聚乙二醇(BMPEO)、BM(PEO)2、BM(PEO)3、N-(β-马来酰亚胺基丙氧基)琥珀酰亚胺酯(BMPS)、γ-马来酰亚胺基丁酸N-琥珀酰亚胺基酯(GMBS)、ε-马来酰亚胺基己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(EMCS)、 5-马来酰亚胺基戊酸NHS、HBVS、N-琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-1-羧基-(6-酰胺基己酸酯)(其为SMCC的“长链”类似物(LC-SMCC))、间马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯 (MBS)、4-(4-N-马来酰亚胺基苯基)-丁酸酰肼或盐酸盐(MPBH)、N- 琥珀酰亚胺基3-(溴代乙酰胺基)丙酸酯(SBAP)、N-琥珀酰亚胺基碘代乙酸酯(SIA)、κ-马来酰亚胺基十一烷酸N-琥珀酰亚胺基酯(KMUA)、 N-琥珀酰亚胺基4-(p-马来酰亚胺基苯基)-丁酸酯(SMPB)、琥珀酰亚胺基-6-(β-马来酰亚胺基丙酰胺基)己酸酯(SMPH)、琥珀酰亚胺基-(4- 乙烯基磺酰基)苯甲酸酯(SVSB)、二硫代双-马来酰亚胺基乙烷 (DTME)、1,4-双-马来酰亚胺基丁烷(BMB)、1,4双马来酰亚胺基-2,3- 二羟基丁烷(BMDB)、双-马来酰亚胺基己烷(BMH)、双-马来酰亚胺基乙烷(BMOE)、磺基琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基-甲基)环己烷 -1-甲酸酯(磺基-SMCC)、磺基-琥珀酰亚胺基(4-碘-乙酰基)氨基苯甲酸酯(磺基-SIAB)、间马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基磺基琥珀酰亚胺酯 (磺基-MBS)、N-(γ-马来酰亚胺基丁氧基)磺基琥珀酰亚胺酯(磺基 -GMBS)、N-(ε-马来酰亚胺基辛酰氧基)磺基琥珀酰亚胺酯(磺基 -EMCS)、N-(κ-马来酰亚胺基十一烷酰氧基)磺基琥珀酰亚胺酯(磺基 -KMUS)和磺基琥珀酰亚胺基4-(对马来酰亚胺基苯基)丁酸酯(磺基 -SMPB)。
异双官能交联剂是具有两个不同反应性基团的双官能交联剂。含有胺反应性N-羟基琥珀酰亚胺基(NHS基团)和羰基反应性肼基的异双官能交联剂还可用于连接本文所描述的细胞毒性化合物与细胞结合剂(例如抗体)。此类可商购的异双官能交联剂的实例包括琥珀酰亚胺基6-肼基烟碱酰胺丙酮腙(SANH)、琥珀酰亚胺基4-肼基对苯二甲酸酯盐酸盐(SHTH)和琥珀酰亚胺基肼烟碱酸酯盐酸盐(SHNH)。带有酸不稳定性键联的缀合物还可使用本发明的带有肼的苯并二氮杂
Figure BDA0001239440410000271
衍生物来制备。可使用的双官能交联剂的实例包括琥珀酰亚胺基-对甲酰基苯甲酸酯(SFB)和琥珀酰亚胺基-对甲酰基苯氧基乙酸酯 (SFPA)。
能够经由二硫键连接细胞结合剂与细胞毒性化合物的双官能交联剂是本领域中已知的且包括用以引入二硫代吡啶基的N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)、N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫代)戊酸酯(SPP)、N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯(SPDB)、N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫代)2-磺基丁酸酯(磺基 -SPDB)。可用于引入二硫基团的其他双官能交联剂是本领域中已知的且公开于美国专利6,913,748、6,716,821和美国专利公布20090274713 和20100129314中，其全部以引用的方式并入本文。或者，还可使用引入硫醇基团的交联剂，如2-亚胺基硫杂环戊烷、高半胱氨酸硫代内酯或S-乙酰基琥珀酸酐。
如本文所定义，“接头”、“接头部分”或“连接基团”是指将两个基团(如细胞结合剂和细胞毒性化合物)连接在一起的部分。通常，所述接头在连接其所连接的两个基团的条件下基本上呈惰性。双官能交联剂可包含两个反应性基团，在接头部分的每端一个，以使得一个反应性基团可首先与细胞毒性化合物反应以提供带有接头部分和第二反应性基团的化合物，接着所述第二反应性基团可与细胞结合剂反应。或者，双官能交联剂的一端可首先与细胞结合剂反应以提供带有接头部分和第二反应性基团的细胞结合剂，接着所述第二反应性基团可与细胞毒性化合物反应。连接部分可含有允许所述细胞毒性部分在特定位点释放的化学键。合适化学键是本领域中熟知的且包括二硫键、硫醚键、酸不稳定性键、光不稳定性键、肽酶不稳定性键和酯酶不稳定性键(参见例如，美国专利5,208,020、5,475,092、6,441,163、6,716,821、 6,913,748、7,276,497、7,276,499、7,368,565、7,388,026和7,414,073)。优选是二硫键、硫醚键和肽酶不稳定性键。可用于本发明中的其他接头包括不可裂解的接头，如美国公布号20050169933中详细描述的那些接头；或带电荷的接头或亲水性接头，其描述于US 2009/0274713、 US 2010/01293140和WO 2009/134976中，所述专利各自以引用的方式明确地并入本文。
在一个实施方案中，在一端附接有反应性基团(如反应性酯)的连接基团选自以下各项：-O(CR20R21)m(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p” Y’(CR24R25)q(CO)tX’、-O(CR20R21)m(CR26＝CR27)m’(CR22R23)n(OCH2CH2) p(CR40R41)p”Y’(CR24R25)q(CO)tX’、-O(CR20R21)m(炔基)n’(CR22R23)n(OCH2 CH2)p(CR40R41)p”Y’(CR24R25)q(CO)tX’、-O(CR20R21)m(哌嗪子基)t’(CR22R 23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p”Y’(CR24R25)q(CO)tX’、-O(CR20R21)m(吡咯并)t’ (CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p”Y’(CR24R25)q(CO)tX’、-O(CR20R21)mA”m”(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p”Y’(CR24R25)q(CO)tX’、-S(CR20R21)m (CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p”Y’(CR24R25)q(CO)tX’、-S(CR20R21)m(C R26＝CR27)m’(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p”Y’(CR24R25)q(CO)tX’、-S(C R20R21)m(炔基)n’(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p”Y’(CR24R25)q(CO)tX’、 -S(CR20R21)m(哌嗪子基)t’(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p”Y’(CR24R25) q(CO)tX’、-S(CR20R21)m(吡咯并)t’(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p”Y’(C R24R25)q(CO)tX’、-S(CR20R21)mA”m”(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p”Y’ (CR24R25)q(CO)tX’、-NR33(C＝O)p”(CR20R21)m(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p”Y’(CR24R25)q(CO)tX’、-NR33(C＝O)p”(CR20R21)m(CR26＝CR27)m’(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p”Y’(CR24R25)q(CO)tX’、-NR33(C＝O)p”(CR20R 21)m(炔基)n’(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p”Y’(CR24R25)q-(CO)tX’、-NR 33(C＝O)p”(CR20R21)m(哌嗪子基)t’(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p”Y’(C R24R25)q(CO)tX’、-NR33(C＝O)p”(CR20R21)m(吡咯并)t’(CR22R23)n(OCH2CH 2)p(CR40R41)p”Y’(CR24R25)q -(CO)tX’、-NR33(C＝O)p”(CR20R21)mA”m”(CR22 R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p”Y’(CR24R25)q(CO)tX’、-(CR20R21)m(CR22R23) n(OCH2CH2)p(CR40R41)p”Y’(CR24R25)q(CO)tX’、-(CR20R21)m(CR26＝CR27)m’ (CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p”Y’(CR24R25)q(CO)tX’、-(CR20R21)m(炔基)n’(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p”Y’(CR24R25)q(CO)tX’、-(CR20R21) m(哌嗪子基)t’(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p”Y’(CR24R25)q(CO)tX’、-(C R20R21)mA”m”(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p”Y’(CR24R25)q(CO)tX’、-(C R20R21)m(CR29＝N-NR30)n”(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p”Y’(CR24R25)q (CO)tX’、-(CR20R21)m(CR29＝N-NR30)n”(CR26＝CR27)m’(CR22R23)n(OCH2CH 2)p(CR40R41)p”Y’(CR24R25)q(CO)tX’、-(CR20R21)m(CR29＝N-NR30)n”(炔基)n’ (CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p”Y’(CR24R25)q -(CO)tX’、-(CR20R21)m(CR29＝N-NR30)n”A”m”(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p”Y’(CR24R25)q(CO)t X’，
m、n、p、q、m’、n’、t’是1至10的整数或任选地是0；
t、m”、n”和p”是0或1；
X”选自OR36、SR37、NR38R39，其中R36、R37、R38、R39是H，或具有1至20个碳原子的直链、支链或环状烷基、烯基或炔基，和或聚乙二醇单元-(OCH2CH2)n，当t＝1时R37任选地是硫醇保护基团， COX”形成选自N-羟基琥珀酰亚胺酯、N-羟基邻苯二甲酰亚胺酯、 N-羟基磺基琥珀酰亚胺酯、对硝基苯酯、二硝基苯酯、全氟苯酯及其衍生物的反应性酯，其中所述衍生物有助于酰胺键形成；
Y”不存在或选自O、S、S-S或NR32，其中R32具有以上关于R 所给出的相同定义；或
当Y”不是S-S且t＝0时，X”选自马来酰亚胺基、卤代乙酰基或 SR37，其中R37具有与上述相同的定义；
A”是氨基酸残基或含有介于2至20个之间的氨基酸残基的多肽；
R20、R21、R22、R23、R24、R25、R26和R27相同或不同，并且是-H 或具有1至5个碳原子的直链或支链烷基；
R29与R30相同或不同，并且是-H或具有1至5个碳原子的烷基；
R33是-H；或具有1至12个碳原子的直链、支链或环状烷基、烯基或炔基；聚乙二醇单元R-(OCH2CH2)n-，或R33是-COR34、-CSR34、 -SOR34或-SO2R34，其中R34是H或具有1至20个碳原子的直链、支链或环状烷基、烯基或炔基，或聚乙二醇单元-(OCH2CH2)n；且
R40和R41中的一个是任选地带负电荷或带正电荷的官能团且另一个是H或具有1至4个碳原子的烷基、烯基、炔基。
以上连接基团中的任一个均可存在于本发明的化合物、药物-接头化合物或缀合物中的任一个中，包括置换本文所描述的任一式中的连接基团。
术语“氨基酸”是指天然存在的氨基酸或非天然存在的氨基酸。在一个实施方案中，氨基酸由NH2-C(Raa’Raa)-C(＝O)OH表示，其中Raa和Raa’各自独立地是H；任选取代的具有1至10个碳原子的直链、支链或环状烷基、烯基或炔基；芳基；杂芳基；或杂环基，或Raa与N 末端氮原子一起可形成杂环(例如，如在脯氨酸中)。术语“氨基酸残基”是指当自氨基酸的胺端和/或羧基端移除一个氢原子时的相应残基，如-NH-C(Raa’Raa)-C(＝O)O-。
术语“阳离子”是指带有正电荷的离子。阳离子可以是单价的(例如，Na+、K+等)、二价的(例如，Ca2+、Mg2+等)或多价的(例如，Al3+等)。优选阳离子是单价的。
术语“治疗有效量”意指，在受试者体内引起所需生物反应的活性化合物或缀合物的量。此类反应包括相较于不存在所述治疗或预防、抑制或延迟疾病症状或疾病本身的发展的情况，减轻所治疗的疾病或病症的症状，预防、抑制或延迟疾病症状或疾病本身的复发，增加受试者的寿命。有效量的确定恰在本领域的技术人员的能力范围内，尤其是依据本文所提供的详细公开内容。化合物I的毒性和治疗功效可通过在细胞培养和实验动物中进行的标准药物程序确定。本发明化合物或缀合物或者待施用至受试者的其他治疗剂的有效量将取决于多发性骨髓瘤的分期、类别和状态，以及受试者的特征，如一般健康状况、年龄、性别、体重和耐药性。本发明化合物或缀合物或者待施用的其他治疗剂的有效量还将取决于施用途径和剂型。可单独地调整剂量和时间间隔以提供足以维持所需治疗作用的活性化合物的血浆水平。
细胞毒性化合物
在第一实施方案中，本发明涉及本文所描述的细胞毒性化合物 (例如，结构式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)或(VI)的化合物，或其药学上可接受的盐)。在某些实施方案中，所述细胞毒性化合物由结构式(I) 或其药学上可接受的盐表示。
在某些实施方案中，对于结构式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)和(VI)， L’、L”和L’”中的一个由式(A)表示，且其他各自独立地是–H、具有1 至6个碳原子的直链或支链烷基、卤素、-OH、(C1-C6)烷氧基或-NO2。具体地说，L’、L”和L’”中的一个由式(A)表示，并且其他是-H。
在第1具体实施方案中，对于结构式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V) 和(VI)，L’由式(A)表示，且L”和L”’两者均是–H；且其余变量是如以上在第一实施方案中所描述。
在第2具体实施方案中，对于结构式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V) 和(VI)，Rx使任选地被卤素、-OH、(C1-C3)烷基、(C1-C3)烷氧基、卤代(C1-C3)烷基或带电荷的取代基或可离子化基团Q取代的具有1至6 个碳原子的直链、支链或环状烷基；且其余变量是如以上在第一实施方案或第1具体实施方案中所描述。
在某些实施方案中，Q是i)-SO3H、-Z’-SO3H、-OPO3H2、 -Z’-OPO3H2、-PO3H2、-Z’-PO3H2、-CO2H、-Z’-CO2H、-NR11R12或 -Z’-NR11R12，或其药学上可接受的盐；或ii)-N+R14R15R16X-或 -Z’-N+R14R15R16X-；Z’是任选取代的亚烷基、任选取代的亚环烷基或任选取代的亚苯基；R14至R16各自独立地是任选取代的烷基；且X-是药学上可接受的阴离子；且其余变量是如以上在第2具体实施方案中所描述。更具体地说，Q是-SO3H或其药学上可接受的盐。
在第3具体实施方案中，对于结构式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V) 和(VI)，J是包含选自由NHRc1、-COOH和-COE组成的组的反应性基团的部分，其中-COE表示反应性酯且Rc1是-H或任选地被卤素、 -OH或(C1-C3)烷氧基取代的具有1至4个碳原子的直链或支链烷基；且其余变量是如以上在第一实施方案或第1或第2具体实施方案中所描述。
在某些实施方案中，J是COE，所述COE选自N-羟基琥珀酰亚胺酯、N-羟基磺基琥珀酰亚胺酯、硝基苯基(例如，2-硝基苯基或4- 硝基苯基)酯、二硝基苯基(例如，2,4-二硝基苯基)酯、磺基-四氟苯基 (例如，4-磺基-2,3,5,6-四氟苯基)酯和全氟苯基酯；且其余变量是如以上在第3具体实施方案中所描述。更具体地说，COE是N-羟基琥珀酰亚胺酯。
在第4具体实施方案中，对于结构式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V) 和(VI)，L’由下式表示：
-NR5-P-C(＝O)-(CRaRb)m-J (B1)；
-NR5-P-C(＝O)-Cy-(CRaRb)m’-J (B2)；
-C(＝O)-P-NR5-(CRaRb)m-J (C1)；或
-C(＝O)-P-NR5-Cy-(CRaRb)m’-J (C2)，
其中：
J是–COE；
Ra和Rb在每次出现时各自独立地是–H、(C1-C3)烷基，或带电荷的取代基或可离子化基团Q；
m是1至6的整数；
m’是0或1至6的整数；
Cy是任选地被卤素、-OH、(C1-C3)烷基、(C1-C3)烷氧基或卤代 (C1-C3)烷基取代的具有5或6个环碳原子的环状烷基；且其余变量是如以上在第一实施方案或第1、第2或第3具体实施方案中所描述。
在某些实施方案中，Ra和Rb两者均是H；式(B2)和(C2)中的Cy 是环己烷；且R5是H或Me；且其余变量是如以上在第4具体实施方案中所描述。更具体地说，式(B2)和(C2)中的m’是0或1。
在第5具体实施方案中，对于结构式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V) 和(VI)，L’由下式表示：
-NR5-P-C(＝O)-(CRaRb)m-S-Zs (B3)；或
-C(＝O)-P-NR5-(CRaRb)m-S-Zs (C3)，
其中：
Ra和Rb在每次出现时各自独立地是–H、(C1-C3)烷基，或带电荷的取代基或可离子化基团Q；
m是1至6的整数；
Zs是–H、-SRd、-C(＝O)Rd1，或选自下式中的任一个：
Figure BDA0001239440410000341
Figure BDA0001239440410000351
其中：
q是1至5的整数；
n’是2至6的整数；
M是阳离子(例如，H+、Na+或K+)；
Rd是具有1至6个碳原子的直链或支链烷基，或选自苯基、硝基苯基(例如，2-硝基苯基或4-硝基苯基)、二硝基苯基(例如，2,4-二硝基苯基)、羧基硝基苯基(例如，3-羧基-4-硝基苯基)、吡啶基或硝基吡啶基(例如，4-硝基吡啶基)；
Rd1是具有1至6个碳原子的直链或支链烷基；
且其余变量是如以上在第一实施方案或第1、第2、第3或第4 具体实施方案中所描述。
在一个实施方案中，Zs是–H。在另一个实施方案中，Zs是–SMe 或–SPy(Py是吡啶基)。
在又另一个实施方案中，Zs选自下式中的任一个：
Figure BDA0001239440410000361
Figure BDA0001239440410000371
其中U是-H或-SO3M；且其余变量是如以上关于式(a1’)-(a15’) 所描述。
在某些实施方案中，带电荷的取代基或可离子化基团Q是i) -SO3H、-Z’-SO3H、-OPO3H2、-Z’-OPO3H2、-PO3H2、-Z’-PO3H2、-CO2H、 -Z’-CO2H、-NR11R12或-Z’-NR11R12，或其药学上可接受的盐；或ii) -N+R14R15R16X-或-Z’-N+R14R15R16X-；Z’是任选取代的亚烷基、任选取代的亚环烷基或任选取代的亚苯基；R14至R16各自独立地是任选取代的烷基；且X-是药学上可接受的阴离子；且其余变量是如以上在第5具体实施方案中所描述。更具体地说，Q是–SO3H或其药学上可接受的盐。
在某些实施方案中，Ra和Rb两者均是–H且R5是H或Me；且其余变量是如以上在第5具体实施方案中所描述。
在某些实施方案中，-(CRaRb)m-是–(CH2)m”-C(Me2)-且m”是1至5 的整数；且其余变量是如以上在第5具体实施方案中所描述。
在第6具体实施方案中，对于结构式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V) 和(VI)，P是含有2至10个氨基酸残基的肽；且其余变量是如以上在第一实施方案或第1、第2、第3、第4或第5具体实施方案中所描述。
在某些实施方案中，P是含有2至5个氨基酸残基的肽；且其余变量是如以上在第6具体实施方案中所描述。
在某些实施方案中，P选自Gly-Gly-Gly、Ala-Val、Val-Ala、Val-Cit、 Val-Lys、Phe-Lys、Lys-Lys、Ala-Lys、Phe-Cit、Leu-Cit、Lle-Cit、Trp、 Cit、Phe-Ala、Phe-N9-甲苯磺酰基-Arg、Phe-N9-硝基-Arg、Phe-Phe-Lys、 D-Phe-Phe-Lys、Gly-Phe-Lys、Leu-Ala-Leu、Ile-Ala-Leu、Val-Ala-Val、 Ala-Leu-Ala-Leu、β-Ala-Leu-Ala-Leu和Gly-Phe-Leu-Gly、Val-Arg、 Arg-Val、Arg-Arg、Val-D-Cit、Val-D-Lys、Val-D-Arg、D-Val-Cit、 D-Val-Lys、D-Val-Arg、D-Val-D-Cit、D-Val-D-Lys、D-Val-D-Arg、 D-Arg-D-Arg、Ala-Ala、Ala-D-Ala、D-Ala-Ala、D-Ala-D-Ala、Ala-Met 和Met-Ala；且其余变量是如以上在第6具体实施方案中所描述。
在某些实施方案中，P是Gly-Gly-Gly、Ala-Val、Ala-Ala、 Ala-D-Ala、D-Ala-Ala和D-Ala-D-Ala；且其余变量是如以上在第6 具体实施方案中所描述。
在第7具体实施方案中，对于结构式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V) 和(VI)，在N与C之间的双线
Figure BDA0001239440410000391
表示双键；且其余变量是如以上在第一实施方案或第1、第2、第3、第4、第5或第6具体实施方案中所描述。
在第8具体实施方案中，对于结构式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V) 和(VI)，在N与C之间的双线
Figure BDA0001239440410000392
表示单键，X是-H或胺保护基团；且Y选自-H、-OR、-OCOR’、-SR、-NR’R”、任选取代的5或6元含氮杂环、-SO3H、-SO2H和-OSO3H；且其余变量是如以上在第一实施方案或第1、第2、第3、第4、第5、第6或第7具体实施方案中所描述。
在某些实施方案中，Y选自-H、-SO3M、-OH、-OMe、-OEt或–NHOH，其中M是–H、Na+或K+；且其余变量是如以上在第8具体实施方案中所描述。更具体地说，Y是–H、-SO3M或-OH。
在第9具体实施方案中，对于结构式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V) 和(VI)，X’选自由以下组成的组：-H；-OH；任选取代的具有1至10 个碳原子的直链、支链或环状烷基、烯基或炔基；和苯基；且其余变量是如以上在第一实施方案或第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7或第8具体实施方案中所描述。
在某些实施方案中，X’是–H、-OH、(C1-C3)烷基、卤代(C1-C3) 烷基或苯基；且其余变量是如以上在第9具体实施方案中所描述。更具体地说，X’是-H、-OH或–Me。甚至更具体地说，X’是-H。
在第10具体实施方案中，对于结构式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V) 和(VI)，Y’是-H、氧代基团、(C1-C3)烷基或卤代(C1-C3)烷基；且其余变量是如以上在第一实施方案或第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7、第8或第9具体实施方案中所描述。更具体地说，Y’是–H或氧代。甚至更具体地说，Y’是-H。
在第11具体实施方案中，对于结构式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V) 和(VI)，A与A’相同或不同，且选自-O-、-S-、-NR5-和氧代-(C＝O)-；且其余变量是如以上在第一实施方案或第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7、第8、第9或第10具体实施方案中所描述。更具体地说， A与A’相同或不同，且选自-O-和-S-。甚至更具体地说，A和A’是–O-。
在第12具体实施方案中，对于结构式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V) 和(VI)，R6是–OMe；且其余变量是如以上在第一实施方案或第1、第 2、第3、第4、第5、第6、第7、第8、第9、第10或第11具体实施方案中所描述。
在第13具体实施方案中，对于结构式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V) 和(VI)，R1、R2、R3、R4、R1’、R2’、R3’和R4’独立地是–H、卤素、 -NO2、-OH、(C1-C3)烷基、卤代(C1-C3)烷基或(C1-C3)烷氧基；且其余变量是如在第一实施方案或第1、第2、第3、第4、第5、第6、第 7、第8、第9、第10、第11或第12具体实施方案中所描述。更具体地说，R1、R2、R3、R4、R1’、R2’、R3’和R4’都是-H。
在第14具体实施方案中，对于结构式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V) 和(VI)，R、R’、R”和R5各自独立地是–H或(C1-C3)烷基；且其余变量是如在第一实施方案或第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7、第8、第9、第10、第11、第12或第13具体实施方案中所描述。
在第15具体实施方案中，对于结构式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V) 和(VI)，在N与C之间的双线
Figure BDA0001239440410000401
表示单键或双键，条件是当其为双键时，X不存在且Y是-H，且当其为单键时，X是-H，Y是-OH或-SO3M；
R1、R2、R3、R4、R1’、R2’、R3’和R4’都是-H；
R6是-OMe；
X’和Y’两者均是-H；
A和A’是-O-；
M是H、Na+或K+；且其余变量是如第一实施方案或第1、第2、第3、第4、第5或第6具体实施方案中所描述。
在第16具体实施方案中，本发明的细胞毒性化合物选自下式：
Figure BDA0001239440410000411
Figure BDA0001239440410000421
Figure BDA0001239440410000431
Figure BDA0001239440410000441
Figure BDA0001239440410000451
Figure BDA0001239440410000461
Figure BDA0001239440410000471
Figure BDA0001239440410000481
Figure BDA0001239440410000491
Figure BDA0001239440410000501
Figure BDA0001239440410000511
Figure BDA0001239440410000521
Figure BDA0001239440410000531
Figure BDA0001239440410000541
Figure BDA0001239440410000551
Figure BDA0001239440410000561
Figure BDA0001239440410000571
或其药学上可接受的盐，其中：
R100是–OH、–OMe或
Figure BDA0001239440410000572
Y是–H、-OH或-SO3M；且
M是药学上可接受的阳离子(例如，H+、Na+或K+)；
Zs是–H、-SRd、-C(＝O)Rd1，或选自以上描述的式(a1’)-(a15’)。
在一个具体实施方案中，Zs选自以上描述的式(a1)-(a15)。
在一个更具体的实施方案中，Zs选自式(a7)、(a8)、(a9)和(a15)。在一个甚至更具体的实施方案中，Zs由式(a9)表示。或者，Zs由式(a7) 表示。
在另一个具体实施方案中，Zs是–H。
在另一个具体实施方案中，Y是–SO3M。或者，Y是–OH。
本发明还包括本文所描述的任何细胞毒性化合物或细胞结合剂- 细胞毒性剂缀合物的代谢物。
细胞毒性化合物的合成
本发明的细胞毒性化合物可根据美国专利号8,765,740和美国申请公布号2012/0238731中所描述的方法来制备。
用于制备本发明的细胞毒性二聚体化合物的代表性方法在实施例1-10中示出。
细胞结合剂
本发明的缀合物作为治疗剂的有效性取决于适当细胞结合剂的谨慎选择。细胞结合剂可以是目前已知或将了解的任何种类，包括肽类和非肽类。一般来说，这些类别可以是抗体(如多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体)、淋巴因子、激素、生长因子、维生素(如叶酸等，其可结合至其细胞表面受体，例如叶酸受体)、营养转运分子(如转铁蛋白)或任何其他细胞结合分子或物质。
适当细胞结合剂的选择是一个选择问题，其部分取决于待靶向的特定细胞群，而在许多(但非全部)情况中，人单克隆抗体是良好的选择，如果适当抗体是可获得的。例如，单克隆抗体MY9是特异性地结合至CD33抗原的鼠类IgG1抗体(J.D.Griffin等人,LeukemiaRes., 8:521(1984))，且可在靶细胞表达CD33，如在急性骨髓性白血病(AML) 的情况下使用。
在某些实施方案中，细胞结合剂不是蛋白质。例如，在某些实施方案中，细胞结合剂可以是结合至维生素受体(如细胞表面受体)的维生素。在此方面，维生素A结合至视黄醇结合蛋白(RBP)以形成复合物，所述复合物进而以高亲和力结合STRA6受体且增加维生素A的摄入。在另一个实例中，叶酸/叶酸盐/维生素B9以高亲和力结合细胞表面叶酸受体(FR)，例如FRα。可使用叶酸或结合至FRα的抗体来靶向在卵巢肿瘤和其他肿瘤上表达的叶酸受体。此外，维生素D及其类似物结合至维生素D受体。
在其他实施方案中，细胞结合剂是蛋白质或多肽，或包含蛋白质或多肽的化合物，包括抗体、非抗体蛋白质或多肽。优选地，所述蛋白质或多肽包含一个或多个带有侧链–NH2基团的Lys残基。Lys侧链–NH2基团可共价连接至双官能交联剂，所述交联剂进而连接至本发明的二聚体化合物，由此将细胞结合剂缀合至本发明的二聚体化合物。每种基于蛋白质的细胞结合剂均可含有多个可用于通过双官能交联剂连接本发明的化合物的Lys侧链–NH2基团。
在一个实施方案中，GM-CSF(一种结合至骨髓细胞的配体/生长因子)可用作针对来自急性骨髓性白血病的患病细胞的细胞结合剂。结合至活化T细胞的IL-2可用于预防移植物排斥，用于治疗和预防移植物抗宿主疾病，和用于治疗急性T细胞白血病。结合至黑素细胞的MSH和可针对黑色素瘤的抗体可用于治疗黑色素瘤。表皮生长因子可用于靶向鳞状细胞癌，如肺和头颈部的鳞状细胞癌。生长抑素可用于靶向神经母细胞瘤和其他肿瘤类型。雌激素(或雌激素类似物)可用于靶向乳癌。雄激素(或雄激素类似物)可用于靶向睪丸。
在某些实施方案中，细胞结合剂可以是淋巴因子、激素、生长因子、集落刺激因子或营养转运分子。
在某些实施方案中，细胞结合剂是抗体模拟物，如锚蛋白重复序列蛋白、Centyrin、或adnectin/单域抗体。
在其他实施方案中，细胞结合剂是抗体、单链抗体、特异性地结合至靶细胞的抗体片段、单克隆抗体、单链单克隆抗体、特异性地结合至靶细胞的单克隆抗体片段(或“抗原结合部分”)、嵌合抗体、特异性地结合至靶细胞的嵌合抗体片段(“抗原结合部分”)、结构域抗体(例如，sdAb)，或特异性地结合至靶细胞的结构域抗体片段。
在某些实施方案中，细胞结合剂是人源化抗体、人源化单链抗体或人源化抗体片段(或“抗原结合部分”)。在一个具体实施方案中，人源化抗体是huMy9-6或另一种相关抗体，其在美国专利号7,342,110 和7,557,189中描述。在另一个具体实施方案中，人源化抗体是美国临时申请号61/307,797、61/346,595和61/413,172以及美国申请号 13/033,723(作为US 2012/0009181 A1公布)所描述的抗叶酸受体抗体。所有这些申请的教义以引用的方式整体并入本文。
在某些实施方案中，细胞结合剂是表面重构的抗体、表面重构的单链抗体、表面重构的抗体片段(或“抗原结合部分”)或双特异性抗体。
在某些实施方案中，细胞结合剂是微型抗体、亲合抗体(avibody)、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体、纳米抗体、蛋白水解激活抗体(probody)、结构域抗体或单抗体。
换言之，示例性细胞结合剂可包括抗体、单链抗体、特异性地结合至靶细胞的抗体片段、单克隆抗体、单链单克隆抗体、特异性地结合至靶细胞的单克隆抗体片段、嵌合抗体、特异性地结合至靶细胞的嵌合抗体片段、双特异性抗体、结构域抗体、特异性地结合至靶细胞的结构域抗体片段、干扰素(例如α、β、γ)、淋巴因子(例如，IL-2、 IL-3、IL-4和IL-6)、激素(例如，胰岛素、促甲状腺激素释放激素(TRH)、黑素细胞刺激激素(MSH)和类固醇激素(例如，雄激素和雌激素))、维生素(例如，叶酸)、生长因子(例如，EGF、TGF-α、FGF、VEGF)、集落刺激因子、营养转运分子(例如，转铁蛋白；参见O'Keefe等人 (1985)J.Biol.Chem.260:932-937，以引用的方式并入本文)、Centyrin (基于III型纤维连接蛋白(FN3)重复序列的共有序列的蛋白质支架；参见美国专利公布2010/0255056、2010/0216708和2011/0274623，以引用的方式并入本文)、锚蛋白重复序列蛋白(例如经设计的锚蛋白重复序列蛋白，称为DARPin；参见美国专利公布号2004/0132028、 2009/0082274、2011/0118146和2011/0224100，以引用的方式并入本文；且还参见C.Zahnd等人,Cancer Res.(2010)70:1595-1605；Zahnd 等人,J.Biol.Chem.(2006)281(46):35167-35175；和Binz,H.K., Amstutz,P.&Pluckthun,A.,Nature Biotechnology(2005) 23:1257-1268，以引用的方式并入本文)、锚蛋白样重复序列蛋白或合成肽(参见例如，参见美国专利公布号2007/0238667；美国专利号 7,101,675；WO 2007/147213；以及WO 2007/062466，以引用的方式并入本文)、Adnectin(纤维连接蛋白结构域支架蛋白；参见美国专利公布号2007/0082365、2008/0139791，以引用的方式并入本文)、亲合抗体(包括双功能抗体、三功能抗体和四功能抗体；参见美国公布号 2008/0152586和2012/0171115)、双受体重靶向(dual receptorretargeting，DART)分子(P.A.Moore等人,Blood,2011； 117(17):4542-4551；Veri MC等人,Arthritis Rheum.,2010年3月30日； 62(7):1933-43；Johnson,S等人,J.Mol.Biol.,2010年4月9 日；399(3):436-49)、细胞穿透超电荷蛋白(cell penetrating superchargedprotein)(Methods in Enzymol.502,293-319(2012)和其他细胞结合分子或物质。
在某些实施方案中，细胞结合剂可以是结合至靶细胞上的部分 (如细胞表面受体)的配体。例如，所述配体可以是生长因子或其结合至生长因子受体的片段，或可以是细胞因子或其结合至细胞因子受体的片段。在某些实施方案中，所述生长因子受体或细胞因子受体是细胞表面受体。
在细胞结合剂是抗体或其抗原结合部分(包括抗体衍生物)或某些抗体模拟物的某些实施方案中，CBA可结合至靶细胞上的配体，如细胞表面配体，包括细胞表面受体。
具体示例性抗原或配体可包括肾素；生长激素(例如人生长激素和牛生长激素)；生长激素释放因子；副甲状腺激素；促甲状腺激素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰岛素A链；胰岛素B链；胰岛素原；促卵泡激素；降钙素；促黄体激素；胰高血糖素；凝血因子(例如，因子vmc、因子IX、组织因子和血管性血友病因子)；抗凝血因子(例如，蛋白质C)；心房利钠肽；肺表面活性物质；纤溶酶原活化物(例如，尿激酶、人尿或组织型纤溶酶原活化物)；蛙皮素；凝血酶；造血生长因子；肿瘤坏死因子-α和肿瘤坏死因子-β；脑啡肽酶；RANTES(即，正常T细胞表达和分泌的活性调控蛋白)；人巨噬细胞炎性蛋白-1-α；血清白蛋白(人血清白蛋白)；苗勒抑制物质(Muellerian-inhibiting substance)；松弛素A链；松弛素B链；松弛素原；小鼠促性腺激素相关肽；微生物蛋白(β-内酰胺酶)；DNA酶；IgE；细胞毒性T-淋巴细胞相关抗原(例如CTLA-4)；抑制素；活化素；血管内皮生长因子；激素或生长因子受体；蛋白质A或D；类风湿因子；神经营养因子(例如，骨源性神经营养因子、神经营养素-3、神经营养素-4、神经营养素-5或神经营养素-6)、神经生长因子(例如NGF-β)；血小板源性生长因子；成纤维细胞生长因子(例如，aFGF和bFGF)；成纤维细胞生长因子受体2；表皮生长因子；转化生长因子(例如，TGF-α、TGF-β1、 TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4和TGF-β5)；胰岛素样生长因子-I和胰岛素样生长因子-II；des(1-3)-IGF-I(脑IGF-I)；胰岛素样生长因子结合蛋白；黑素转铁蛋白；EpCAM；GD3；FLT3；PSMA；PSCA；MUC1； MUC16；STEAP；CEA；TENB2；EphA受体；EphB受体；叶酸受体；FOLR1；间皮素；cripto；αvβ6；整联蛋白；VEGF；VEGFR；EGFR；转铁蛋白受体；IRTA1；IRTA2；IRTA3；IRTA4；IRTA5；CD蛋白(例如，CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD8、CD11、CD14、CD19、CD20、CD21、CD22、CD25、CD26、CD28、CD30、CD33、CD36、 CD37、CD38、CD40、CD44、CD52、CD55、CD56、CD59、CD70、 CD79、CD80CD81、CD103、CD105、CD123、CD134、CD137、CD138 和CD152)、一种或多种肿瘤相关抗原或细胞表面受体(参见美国公布号2008/0171040或美国公布号2008/0305044，以引用的方式整体并入)；红细胞生成素；骨诱导因子；免疫毒素；骨形态发生蛋白；干扰素(例如，干扰素-α、干扰素-β和干扰素-γ)；集落刺激因子(例如， M-CSF、GM-CSF和G-CSF)；白介素(例如，IL-1至IL-10)；超氧化物歧化酶；T细胞受体；表面膜蛋白；衰变加速因子；病毒抗原(例如，HIV包膜蛋白的一部分)；转运蛋白、归巢受体；地址素；调控蛋白；整联蛋白(例如，CD11a、CD11b、CD11c、CD18、ICAM、VLA-4 和VCAM)；肿瘤相关抗原(例如，HER2、HER3和HER4受体)；内皮素；c-Met；c-kit；1GF1R；PSGR；NGEP；PSMA；PSCA；TMEFF2；LGR5；B7H4；以及以上所列多肽中任一种的片段。
如本文所使用，术语“抗体”包括免疫球蛋白(Ig)分子。在某些实施方案中，所述抗体是全长抗体，其包含四条多肽链，即，通过二硫键互连的两条重链(HC)和两条轻链(LC)。每一重链包含重链可变区 (HCVR或VH)和重链恒定区(CH)。重链恒定区包含三个结构域，即CH1、CH2和CH3。每一轻链包含轻链可变区(LCVR或VL)和轻链恒定区，所述轻链恒定区包含一个结构域，即CL。VH区和VL区可进一步细分为高变区，称为互补决定区(CDR)。在所述区域中间杂有保守性较强的构架区(FR)。每一VH和VL由自氨基末端至羧基末端按以下次序排列的三个CDR和四个FR构成：FR1、CDR1、FR2、 CDR2、FR3、CDR3和FR4。
在某些实施方案中，所述抗体是IgG、IgA、IgE、IgD或IgM。在某些实施方案中，所述抗体是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4；或IgA1 或IgA2。
在某些实施方案中，细胞结合剂是单克隆抗体的“抗原结合部分”，其共有对于抗原与抗体结合至关重要的序列(如美国专利号 7,342,110和7,557,189中所描述的huMy9-6或其相关抗体，所述专利以引用的方式并入本文)。
如本文所使用，术语抗体的“抗原结合部分”(或有时可互换称为“抗体片段”)包括抗体的保持特异性地结合至抗原的能力的一个或多个片段。据显示，抗体的抗原结合功能可由全长抗体的某些片段执行。术语抗体的“抗原结合部分”内所涵盖的结合片段的实例包括(但不限于)：(i)Fab片段，一种由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段(例如，由木瓜蛋白酶消化的抗体得到三个片段：两个抗原结合 Fab片段，和一个不结合抗原的Fc片段)；(ii)F(ab’)2片段，一种包含在铰链区通过二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段(例如，由胃蛋白酶消化的抗体得到两个片段：二价抗原结合F(ab’)2片段，和不结合抗原的pFc’片段)及其相关F(ab’)单价单元；(iii)由VH和CH1 结构域组成的Fd片段(即，重链中包括在Fab中的部分)；(iv)由抗体单一臂的VL和VH结构域组成的Fv片段，和相关二硫键连接的Fv；(v)dAb(结构域抗体)或sdAb(单结构域抗体)片段(Ward等人,Nature 341:544-546,1989)，其由VH结构域组成；和(vi)分离的互补决定区 (CDR)。在某些实施方案中，所述抗原结合部分是sdAb(单结构域抗体)。
在某些实施方案中，抗原结合部分还包括某些工程化或重组的衍生物(或“衍生物抗体”)，所述衍生物除可能未见于天然存在的抗体中的元件或序列外，还包括抗体的保持特异性地结合至抗原的能力的一个或多个片段。
例如，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由单独基因编码，但其可使用标准重组法由合成接头连接，所述接头能够使其制造成 VL区与VH区配对以形成单价分子的单一蛋白链(称为单链Fv (scFv)；参见例如，Bird等人,Science 242:423-426,1988；和Huston 等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883,1988)。
在本文所描述的所有实施方案中，scFv的N末端可以是VH结构域(即，N-VH-VL-C)或VL结构域(即，N-VL-VH-C)。
二价(或双价)单链可变片段(di-scFv、bi-scFv)可通过连接两个 scFv进行工程化。这产生具有两个VH区和两个VL区的单一肽链，从而得到串联scFv(tascFv)。可通过以头至尾的方式连接三个或更多个scFv，类似地产生更多串联重复序列，如tri-scFv。
在某些实施方案中，scFv可通过接头肽连接，所述接头肽过短(约五个氨基酸)而无法使两个可变区折叠在一起，从而迫使scFv二聚合，并形成双功能抗体(参见例如，Holliger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448,1993；Poljak等人,Structure 2:1121-1123,1994)。双功能抗体可以是双特异性或单特异性的。据显示，双功能抗体的解离常数比相应scFv低达40倍，即对于靶标具有高得多的亲和力。
仍然较短的接头(一个或两个氨基酸)导致形成三聚体，或所谓的三功能抗体(triabodies/tribodies)。四功能抗体还以类似的方式产生。其对其靶标的亲和力甚至高于双功能抗体。双功能抗体、三功能抗体和四功能抗体有时统称为“AVIBODYTM”细胞结合剂(或简称为“AVIBODY”)。即，具有两个、三个或四个靶结合区(TBR)的AVIBODY 常称为双功能抗体、三功能抗体和四功能抗体。关于细节，参见例如，美国公布号2008/0152586和2012/0171115，其完整教义以引用的方式并入本文。
所有这些形式都可由对两种或更多种不同抗原具有特异性的可变片段构成，在这种情况下，其是双特异性或多特异性抗体类型。例如，某些双特异性串联di-scFv被称为双特异性T细胞衔接体(BiTE)。
在某些实施方案中，串联scFv或双功能抗体/三功能抗体/四功能抗体中的每个scFv可具有相同或不同的结合特异性，且各自可独立地具有N末端VH或N末端VL。
单链Fv(scFv)还可与Fc部分，如人IgG Fc部分融合以获得IgG 样特性，但尽管如此，其仍由单一基因编码。由于此类scFv-Fc蛋白质在哺乳动物体内的短暂产生可易于达到毫克量，所以这种衍生物抗体形式特别适合于许多研究应用。
Fcab是由抗体的Fc恒定区工程化的抗体片段。Fcab可表达为可溶性蛋白质，或其可重新工程化成全长抗体，如IgG，以产生mAb2。 mAb2是Fcab代替正常Fc区的全长抗体。利用这些另外的结合位点， mAb2双特异性单克隆抗体可同时结合两种不同靶标。
在某些实施方案中，所述工程化的抗体衍生物具有减小大小的抗原结合Ig源性重组蛋白(“微型化”的完整大小mAb)，其通过移除认为对功能不重要的结构域而产生。一个最佳实例是SMIP。
小模块免疫药物或SMIP是主要由抗体(免疫球蛋白)的部分构建的人工蛋白质且意图用作药物。SMIP具有与抗体类似的生物半衰期，但小于抗体，且因此可具有更佳组织渗透特性。SMIP是包含一个结合区、作为连接物的一个铰链区和一个效应子结构域的单链蛋白质。所述结合区包含经修饰的单链可变片段(scFv)，且所述蛋白质的其余部分可由抗体(如IgG1)的Fc(如CH2和作为效应子结构域的CH3)和铰链区构造。遗传修饰的细胞产生呈抗体样二聚体形式的SMIP，其比实际抗体小约30％。
此类工程化的微型化抗体的另一实例是“单抗体”，其中铰链区已自IgG4分子移除。IgG4分子不稳定且可彼此交换轻链-重链异二聚体。铰链区的缺失防止重链-重链完全配对，从而留下高度特异性的单价轻链/重链异二聚体，同时保留Fc区以确保体内稳定性和半衰期。
单结构域抗体(sdAb，包括但不限于由Ablynx称为纳米抗体的那些抗体)是由单一单体可变抗体结构域组成的抗体片段。与完整抗体相同，其能够选择性结合至特定抗原，但由于其分子量仅为12-15kDa 而小得多。在某些实施方案中，单结构域抗体由重链抗体(hcIgG)工程化得到。首例此类sdAb是基于在骆驼中发现的hcIgG工程化得到，称为VHH片段。在某些实施方案中，单结构域抗体是使用VNAR片段，由IgNAR(“免疫球蛋白新抗原受体”，参见下文)工程化得到。软骨鱼类(如鲨鱼)具有此类重链IgNAR抗体。在某些实施方案中，sdAb通过将来自常见免疫球蛋白G(IgG)，如来自人或小鼠的免疫球蛋白G 的二聚体可变结构域分离成单体来进行工程化。在某些实施方案中，纳米抗体衍生自重链可变结构域。在某些实施方案中，纳米抗体衍生自轻链可变结构域。在某些实施方案中，sdAb通过针对与靶抗原的结合筛选单结构域重链序列(例如，人单结构域HC)的文库来获得。
单一可变新抗原受体结构域抗体片段(VNAR，或VNAR结构域)衍生自软骨鱼类(例如，鲨鱼)免疫球蛋白新抗原受体抗体(IgNAR)。作为已知最小的基于免疫球蛋白的蛋白质支架之一，此类单结构域蛋白表现出有利的大小和隐蔽表位识别特性。成熟IgNAR抗体由一个可变新抗原受体(VNAR)结构域和五个恒定新抗原受体(CNAR)结构域的同二聚体组成。此分子具有高度稳定性，且具有高效结合特征。其固有稳定性可能归因于(i)潜在的Ig支架，相较于鼠类抗体中所见的常规抗体VH和VL结构域，其呈现相当大数量的带电荷和亲水性表面暴露残基；和(ii)使包括环间二硫桥和环内氢键模式在内的互补决定区 (CDR)环中的结构特征稳定。
微型抗体是包含连接至CH结构域，如CH3γ1(IgG1的CH3结构域)或CH4ε(IgE的CH4结构域)的scFv的工程化的抗体片段。例如，对癌胚抗原(CEA)具有特异性的scFv连接至CH3γ1以产生微型抗体，先前已证实，其结合体内快速清除作用而具有优异肿瘤靶向性 (Hu等人,Cancer Res.56:3055–3061,1996)。scFv可具有N末端VH或 VL。连接可以是产生非共价、无铰链的微型抗体的短肽(例如，两个氨基酸的接头，如ValGlu)。或者，所述连接可以是产生共价、铰链- 微型抗体的IgG1铰链和GlySer接头肽。
天然抗体是单特异性但二价的，因为其表达两个相同的抗原结合结构域。相比之下，在某些实施方案中，某些工程化的抗体衍生物是双特异性或多特异性分子，其具有两个或更多个不同的抗原结合结构域，各自具有不同的靶特异性。双特异性抗体可通过融合两个抗体产生细胞来产生，其各自具有不同的特异性。所述“四源杂交瘤”产生多种分子物质，因为两个不同的轻链与两个不同的重链在四源杂交瘤中以多种构型自由重组。自此，已使用多种技术(参见上文)产生双特异性Fab、scFvs和完整大小的mAb。
双可变结构域免疫球蛋白(DVD-Ig)是一类同时靶向两个抗原/表位的双特异性IgG(DiGiammarino等人,Methods Mol Biol.899:145-56, 2012)。所述分子含有Fc区和恒定区，其构型类似于常规IgG。然而， DVD-Ig蛋白的独特性在于，所述分子的每个臂均含有两个可变结构域(VD)。一个臂内的VD串联连接且可具有不同结合特异性。
还可通过例如表达具有两个不同Fab和一个Fc的双特异性抗体来产生三特异性抗体衍生物分子。一个实例是小鼠IgG2a抗Ep-CAM、大鼠IgG2b抗CD3四源杂交瘤(称为BiUII)，其被认为容许表达 Ep-CAM的肿瘤细胞、表达CD3的T细胞和表达FCγRI的巨噬细胞共定位，由此增强免疫细胞的共刺激和抗肿瘤功能。
蛋白水解激活抗体是在健康组织中保持惰性，但在疾病环境中特异性活化(例如，通过疾病环境中富集或特有的蛋白酶的蛋白酶裂解) 的完全重组的经掩蔽单克隆抗体。参见Desnoyers等人,Sci.Transl. Med.,5:207ra144,2013。可对本文所描述的任何抗体或其抗原结合部分使用类似掩蔽技术。
内抗体是经修饰以在细胞内定位，在细胞内作用以结合至细胞内抗原的抗体。内抗体可保留在细胞质中，或可具有核定位信号，或可具有供ER靶向的KDEL序列。内抗体可以是单链抗体(scFv)、具有超稳定性的经修饰免疫球蛋白VL结构域、所选择的对还原性较强的细胞内环境具有抗性的抗体，或以与麦芽糖结合蛋白或其他稳定细胞内蛋白质的融合蛋白形式表达。此类优化使内抗体的稳定性和结构得到改善，且可大体上适用于本文所描述的任何抗体或其抗原结合部分。
本发明的抗原结合部分或衍生物抗体与衍生/工程化得到其的抗体相比较，可具有基本上相同或同一的(1)轻链和/或重链CDR3区； (2)轻链和/或重链CDR1、CDR2和CDR3区；或(3)轻链和/或重链区。在所述区域内的序列可含有保守性氨基酸取代，包括在CDR区内的取代。在某些实施方案中，存在不超过1、2、3、4或5个保守性取代。在一个替代方案中，所述抗原结合部分或衍生物抗体具有与衍生 /工程化得到其的抗体至少约90％、95％、99％或100％相同的轻链区和/或重链区。相较于所述抗体，所述抗原结合部分或衍生物抗体可对靶抗原具有基本上相同的结合特异性和/或亲和力。在某些实施方案中，所述抗原结合部分或衍生物抗体的Kd和/或k解离值在本文所描述的抗体的10倍(更高或更低)、5倍(更高或更低)、3倍(更高或更低) 或2倍(更高或更低)内。
在某些实施方案中，所述抗原结合部分或衍生物抗体可衍生自/ 工程化自完全人抗体、人源化抗体或嵌合抗体，且可根据任何本领域认可的方法制备。
单克隆抗体技术允许产生特异性极高的呈特异性单克隆抗体形式的细胞结合剂。本领域中尤其熟知的是通过用目标抗原，如完整靶细胞、自靶细胞分离的抗原、完整病毒、减毒的完整病毒和病毒蛋白 (如病毒外壳蛋白)使小鼠、大鼠、仓鼠或任何其他哺乳动物免疫来产生单克隆抗体的技术。还可使用敏化的人细胞。产生单克隆抗体的另一方法是使用scFv(单链可变区)，尤其是人scFv的噬菌体文库(参见例如，Griffiths等人,美国专利号5,885,793和5,969,108；McCafferty 等人,WO 92/01047；Liming等人,WO 99/06587)。此外，还可使用美国专利号5,639,641中所公开的表面重构抗体，以及嵌合抗体和人源化抗体。
细胞结合剂还可以是由噬菌体展示技术(参见例如，Wang等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2011)108(17),6909-6914)或肽文库技术 (参见例如，Dane等人,Mol.Cancer.Ther.(2009)8(5):1312-1318)得到的肽。
在某些实施方案中，本发明的CBA还包括抗体模拟物，如 DARPin、亲和体、人泛素、affitin、抗运载蛋白、高亲和性多聚体、 Fynomer、Kunitz结构域肽、单抗体或nanofitin。
如本文所使用，术语“DARPin”和“(经设计)锚蛋白重复序列蛋白”可互换使用来指通常展现优先(有时特异性)靶结合的某些遗传工程化的抗体模拟蛋白。所述靶标可以是蛋白质、碳水化合物或其他化学实体，且结合亲和力可相当高。DARPin可衍生自含天然锚蛋白重复序列的蛋白质，且优选由所述蛋白质的至少三个、通常四个或五个锚蛋白重复基序(通常，每一锚蛋白重复基序中约33个残基)组成。在某些实施方案中，DARPin含有约四个或五个重复序列，且分子质量可分别为约14或18kDa。可在DNA层面上，使用多种技术，如核糖体展示或信号识别颗粒(SRP)噬菌体展示来产生具有随机化潜在靶相互作用残基和超过1012个变体的多样性的DARPin文库，以用于选择以皮摩尔浓度的亲和力和特异性结合所希望靶标的DARPin(例如，充当受体激动剂或拮抗剂、反向激动剂、酶抑制剂或简单靶蛋白结合剂)。关于DARPin制备，参见例如美国专利公布号2004/0132028、 2009/0082274、2011/0118146和2011/0224100；WO 02/20565和WO 06/083275(其完整教义以引用的方式并入本文)，且还参见C.Zahnd 等人(2010)Cancer Res.,70:1595-1605；Zahnd等人(2006)J.Biol.Chem.,281(46):35167-35175；和Binz,H.K.,Amstutz,P.&Pluckthun,A. (2005)NatureBiotechnology,23:1257-1268(都以引用的方式并入本文)。有关相关锚蛋白样重复序列蛋白或合成肽，还参见美国专利公布号2007/0238667；美国专利号7,101,675；WO 2007/147213；和WO 2007/062466(其完整教义以引用的方式并入本文)。
亲和体分子是工程化成以高亲和力结合至大量靶蛋白或肽，由此模拟单克隆抗体的小蛋白质。亲和体由含58个氨基酸的三个α螺旋组成且摩尔质量为约6kDa。据显示，其可耐受高温(90℃)或酸性和碱性条件(pH 2.5或pH 11)，且已通过原生文库选择获得亲和力低至亚纳摩尔浓度范围的结合剂，且已在亲和力成熟后获得具有皮摩尔浓度亲和力的结合剂。在某些实施方案中，亲和体与弱亲电子试剂缀合以共价结合至靶标。
单抗体(又称为Adnectin)是能够结合至抗原的遗传工程化的抗体模拟蛋白。在某些实施方案中，单抗体由94个氨基酸组成且分子质量为约10kDa。其基于人纤连蛋白的结构，更具体地说基于其III 型第十个细胞外结构域，其结构类似于抗体可变结构域，具有形成桶状的七个β折叠且在每一侧上具有对应于三个互补决定区的三个暴露的环。可通过修饰环BC(在第二个β折叠与第三个β折叠之间)和 FG(在第六个折叠与第七个折叠之间)来定制对不同蛋白质具有特异性的单抗体。
三功能抗体是基于小鼠和人软骨基质蛋白(CMP)的C末端卷曲螺旋区设计的自组装抗体模拟物，其自组装成平行的三聚体复合物。其通过使特定靶结合部分与衍生自CMP的三聚化结构域融合而产生的高度稳定的三聚体靶向配体。所得融合蛋白可高效地自组装成充分确定的具有高稳定性的平行同源三聚体。对所述三聚体靶向配体的表面等离子体共振(SPR)分析证实相较于相应单体明显增强的靶标结合强度。细胞结合研究证实，此类三功能抗体对于其对应受体具有优异结合强度。
Centyrin是可使用基于共有FN3结构域序列的构架构建的文库获得的另一抗体模拟物(Diem等人,Protein Eng.Des.Sel.,2014)。所述文库采用FN3结构域的C链、CD环、F链和FG环内的各种位置，且可针对特定靶标选择高亲和力Centyrin变体。
在一个实施方案中，细胞结合剂是抗叶酸受体抗体。更具体地说，抗叶酸受体抗体是特异性地结合人叶酸受体1(又称为叶酸受体α (FR-α))的人源化抗体或其抗原结合片段。除非另外指示，否则如本文所使用，术语“人叶酸受体1”、“FOLR1”或“叶酸受体α(FR-α)”是指任何天然人FOLR1。因此，所有这些术语均可指如本文所指示的蛋白质或核酸序列。术语“FOLR1”涵盖“全长”未加工的FOLR1以及由在细胞内加工得到的任何FOLR1形式。FOLR1抗体包含：(a)包含 GYFMN(SEQ ID NO:1)的重链CDR1、包含 RIHPYDGDTFYNQXaa1FXaa2Xaa3(SEQ ID NO:2)的重链CDR2，和包含YDGSRAMDY(SEQ ID NO:3)的重链CDR3；和(b)包含KASQSVSFAGTSLMH(SEQ ID NO:4)的轻链CDR1、包含RASNLEA (SEQ ID NO:5)的轻链CDR2，和包含QQSREYPYT(SEQ ID NO:6) 的轻链CDR3；其中Xaa1选自K、Q、H和R；Xaa2选自Q、H、N 和R；且Xaa3选自G、E、T、S、A和V。优选地，重链CDR2序列包含RIHPYDGDTFYNQKFQG(SEQ ID NO:7)。
在另一个实施方案中，抗叶酸受体抗体是特异性地结合人叶酸受体1的人源化抗体或其抗原结合片段，所述人叶酸受体1包含具有氨基酸序列QVQLVQSGAEVVKPGASVKISCKASGYTFTGYFMNWV KQSPGQSLEWIGRIHPYDGDTFYNQKFQGKATLTVDKSSNTAHM ELLSLTSEDFAVYYCTRYDGSRAMDYWGQGTTVTVSSASTKGPS VFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTF PAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVE PKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVV VDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVL TVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTL PPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPV LDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL SLSPGK(SEQ ID NO:8)的重链。
在另个一实施方案中，抗叶酸抗体受体是由2010年4月7日保藏在ATCC且ATCC保藏号为PTA-10772和PTA-10773或10774的质体DNA编码的人源化抗体或其抗原结合片段。
在另一个实施方案中，抗叶酸受体抗体是特异性地结合人叶酸受体1的人源化抗体或其抗原结合片段，所述人叶酸受体1包含具有氨基酸序列DIVLTQSPLSLAVSLGQPAIISCKASQSVSFAGTSLMHWY HQKPGQQPRLLIYRASNLEAGVPDRFSGSGSKTDFTLNISPVEAED AATYYCQQSREYPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSG TASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDST YSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SE Q ID NO:9)；或DIVLTQSPLSLAVSLGQPAIISCKASQSVSFAGTS LMHWYHQKPGQQPRLLIYRASNLEAGVPDRFSGSGSKTDFTLTIS PVEAEDAATYYCQQSREYPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSD EQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQ DSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNR GEC(SEQ ID NO:10)的轻链。
在另一个实施方案中，抗叶酸受体抗体是特异性地结合人叶酸受体1的人源化抗体或其抗原结合片段，所述人叶酸受体1包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:8的重链，和具有氨基酸序列SEQ ID NO:9或 SEQ ID NO:10的轻链。优选地，所述抗体包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:8的重链和具有氨基酸序列SEQ ID NO:10的轻链(hu FOLR1)。
在另一个实施方案中，抗叶酸受体抗体是由2010年4月7日保藏在ATCC且ATCC保藏号为PTA-10772和PTA-10773或10774的质体DNA编码的人源化抗体或其抗原结合片段。
在另一个实施方案中，抗叶酸受体抗体是特异性地结合人叶酸受体1且包含与QVQLVQSGAEVVKPGASVKISCKASGYTFTGYFMN WVKQSPGQSLEWIGRIHPYDGDTFYNQKFQGKATLTVDKSSNTA HMELLSLTSEDFAVYYCTRYDGSRAMDYWGQGTTVTVSS(SEQ I D NO:11)至少约90％、95％、99％或100％相同的重链可变结构域，和与DIVLTQSPLSLAVSLGQPAIISCKASQSVSFAGTSLMHWYHQKPGQQPRLLIYRASNLEAGVPDRFSGSGSKTDFTLNISPVEAEDAAT YYCQQSREYPYTFGGGTKLEIKR(SEQ IDNO:12)或DIVLTQSP LSLAVSLGQPAIISCKASQSVSFAGTSLMHWYHQKPGQQPRLLIYR ASNLEAGVPDRFSGSGSKTDFTLTISPVEAEDAATYYCQQSREYPY TFGGGTKLEIKR(SEQ ID NO:13)至少约90％、95％、99％或100％相同的轻链可变结构域的人源化抗体或其抗原结合片段。
在另一个实施方案中，抗叶酸受体抗体是huMov19或M9346A (参见例如，美国专利8,709,432、美国专利号8,557,966，和 WO2011106528，其均以引用的方式并入本文)。
在另一个实施方案中，细胞结合剂是抗EGFR抗体或其抗体片段。在一个实施方案中，所述抗EGFR抗体是非拮抗剂抗体，包括例如在WO2012058592(以引用的方式并入本文)中所描述的抗体。在另一个实施方案中，抗EGFR抗体是非功能性抗体，例如人源化ML66 或EGFR-8。更具体地说，抗EGFR抗体是huML66。
在又另一个实施方案中，抗EGFR抗体包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:14的重链和具有氨基酸序列SEQ ID NO:15的轻链。如本文所使用，加双下划线的序列表示重链或轻链序列的可变区(即，重链可变区或HCVR，和轻链可变区或LCVR)，而粗体序列表示CDR区 (即，自N末端至C末端，分别来自重链或轻链序列的CDR1、CDR2 和CDR3)。
Figure BDA0001239440410000741
Figure BDA0001239440410000751
在又另一个实施方案中，抗EGFR抗体包含SEQ ID NO:14的重链CDR1-CDR3，和/或SEQ ID NO:15的轻链CDR1-CDR3，且优选特异性地结合EGFR。
在又另一个实施方案中，抗EGFR抗体包含与SEQ ID NO:14至少约90％、95％、97％、99％或100％相同的重链可变区(HCVR)序列，和/或与SEQ ID NO:15至少约90％、95％、97％、99％或100％相同的轻链可变区(LCVR)序列，且优选特异性地结合EGFR。
在另一个实施方案中，抗EGFR抗体是8,790,649和WO 2012/058588(以引用的方式并入本文)中所描述的抗体。在一个实施方案中，抗EGFR抗体是huEGFR-7R抗体。
在一个实施方案中，抗EGFR抗体包含具有氨基酸序列
Figure BDA0001239440410000752
Figure BDA0001239440410000753
ASTKGPSVFPLAPS SKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDK THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSH EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQ DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRD ELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO:16)的免疫球蛋白重链区，和具有氨基酸序列
Figure BDA0001239440410000754
Figure BDA0001239440410000761
Figure BDA0001239440410000762
TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNN FYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSK ADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:17)的免疫球蛋白轻链区，或具有氨基酸序列
Figure BDA0001239440410000763
Figure BDA0001239440410000764
TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLN NFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLS KADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:18)的免疫球蛋白轻链区。
在另一个实施方案中，抗EGFR抗体包含具有SEQ ID NO:16中列出的氨基酸序列的免疫球蛋白重链区，和具有SEQ ID NO:17中列出的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链区。
在另一个实施方案中，抗EGFR抗体包含具有SEQ ID NO:16中列出的氨基酸序列的免疫球蛋白重链区，和具有SEQ ID NO:18中列出的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链区。
在又另一个实施方案中，抗EGFR抗体包含SEQ ID NO:16的重链CDR1-CDR3，和/或SEQ ID NO:17或18的轻链CDR1-CDR3，且优选特异性地结合EGFR。
在又另一个实施方案中，抗EGFR抗体包含与SEQ ID NO:16至少约90％、95％、97％、99％或100％相同的重链可变区(HCVR)序列，和/或与SEQ ID NO:17或18至少约90％、95％、97％、99％或100％相同的轻链可变区(LCVR)序列，且优选特异性地结合EGFR。
在另一个实施方案中，细胞结合剂是抗CD19抗体，如美国专利号8,435,528和WO2004/103272(以引用的方式并入本文)中所描述的那些抗体。在一个实施方案中，抗CD19抗体包含具有氨基酸序列 QVQLVQPGAEVVKPGASVKLSCKTSGYTFTSNWMHWVKQAPG QGLEWIGEIDPSDSYTNYNQNFQGKAKLTVDKSTSTAYMEVSSLR SDDTAVYYCARGSNPYYYAMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPL APSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVL QSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDV SHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLH QDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR DELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDS DGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP GK(SEQ ID NO:19)的免疫球蛋白重链区，和具有氨基酸序列EIVLTQSPAIMSASPGERVTMTCSASSGVNYMHWYQQKPGTSPRR WIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTDYSLTISSMEPEDAATYYCHQR GSYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNF YPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSK ADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:20)的免疫球蛋白轻链区。
在另一个实施方案中，抗CD19抗体是huB4抗体。
在又另一个实施方案中，抗CD19抗体包含SEQ ID NO:19的重链CDR1-CDR3，和/或SEQ ID NO:20的轻链CDR1-CDR3，且优选特异性地结合CD19。
在又另一个实施方案中，抗CD19抗体包含与SEQ ID NO:19至少约90％、95％、97％、99％或100％相同的重链可变区(HCVR)序列，和/或与SEQ ID NO:20至少约90％、95％、97％、99％或100％相同的轻链可变区(LCVR)序列，且优选特异性地结合CD19。
在又另一个实施方案中，细胞结合剂是抗Muc1抗体，如美国专利号7,834,155、WO2005/009369和WO 2007/024222(以引用的方式并入本文)中所描述的那些抗体。在一个实施方案中，抗Muc1抗体包含具有氨基酸序列
Figure BDA0001239440410000781
Figure BDA0001239440410000782
Figure BDA0001239440410000783
AST KGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG VHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVD KKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEV TCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQ VYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHY TQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:21)的免疫球蛋白重链区，和具有氨基酸序列
Figure BDA0001239440410000784
Figure BDA0001239440410000785
Figure BDA0001239440410000786
TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASV VCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLS STLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO:22)的免疫球蛋白轻链区。
在另一个实施方案中，抗Muc1抗体是huDS6抗体。
在又另一个实施方案中，抗Muc1抗体包含SEQ ID NO:21的重链CDR1-CDR3，和/或SEQ ID NO:22的轻链CDR1-CDR3，且优选特异性地结合Muc1。
在又另一个实施方案中，抗Muc1抗体包含与SEQ ID NO:21至少约90％、95％、97％、99％或100％相同的重链可变区(HCVR)序列，和/或与SEQ ID NO:22至少约90％、95％、97％、99％或100％相同的轻链可变区(LCVR)序列，且优选特异性地结合Muc1。
在另一个实施方案中，细胞结合剂是抗CD33抗体或其片段，如美国专利号7,557,189、7,342,110、8,119,787和8,337,855以及 WO2004/043344(以引用的方式并入本文)中所描述的抗体或其片段。在另一个实施方案中，抗CD33抗体是huMy9-6抗体。
在一个实施方案中，抗CD33抗体包含具有氨基酸序列
Figure BDA0001239440410000791
Figure BDA0001239440410000792
ASTKGPSVFPLAPSS KSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDK THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSH EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQ DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRD ELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO:23)的免疫球蛋白重链区，和具有氨基酸序列
Figure BDA0001239440410000793
Figure BDA0001239440410000794
TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVC LLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSST LTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:24)的免疫球蛋白轻链区。
在又另一个实施方案中，抗CD33抗体包含SEQ ID NO:23的重链CDR1-CDR3，和/或SEQ ID NO:24的轻链CDR1-CDR3，且优选特异性地结合CD33。
在又另一个实施方案中，抗CD33抗体包含与SEQ ID NO:23至少约90％、95％、97％、99％或100％相同的重链可变区(HCVR)序列，和/或与SEQ ID NO:24至少约90％、95％、97％、99％或100％相同的轻链可变区(LCVR)序列，且优选特异性地结合CD33。
在另一个实施方案中，细胞结合剂是抗CD37抗体或其抗体片段，如美国专利号8,765,917和WO 2011/112978(以引用的方式并入本文) 中所描述的那些抗体。在一个实施方案中，抗CD37抗体是huCD37-3 抗体。
在一个实施方案中，抗CD37抗体包含具有氨基酸序列
Figure BDA0001239440410000801
Figure BDA0001239440410000802
TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCL LNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTL TLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO: 25)的免疫球蛋白轻链区，和具有氨基酸序列
Figure BDA0001239440410000803
Figure BDA0001239440410000804
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSG GTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLS SVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVK FNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGK EYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQV SLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ IDNO:26)的免疫球蛋白重链区，或具有氨基酸序列
Figure BDA0001239440410000805
Figure BDA0001239440410000806
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSG GTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLS SVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVK FNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGK EYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQV SLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ IDNO:27)的免疫球蛋白重链区。
在另一个实施方案中，抗CD37抗体包含具有SEQ ID NO:25中列出的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链区，和具有SEQ ID NO:26中列出的氨基酸序列的免疫球蛋白重链区。
在又另一个实施方案中，抗CD37抗体包含具有SEQ ID NO:25 中列出的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链区，和具有SEQ ID NO:27中列出的氨基酸序列的免疫球蛋白重链区。
在又另一个实施方案中，抗CD37抗体包含SEQ ID NO:26或27 的重链CDR1-CDR3，和/或SEQ ID NO:25的轻链CDR1-CDR3，且优选特异性地结合CD37。
在又另一个实施方案中，抗CD37抗体包含与SEQ ID NO:26或 27至少约90％、95％、97％、99％或100％相同的重链可变区(HCVR) 序列，和/或与SEQ ID NO:25至少约90％、95％、97％、99％或100％相同的轻链可变区(LCVR)序列，且优选特异性地结合CD37。
在又另一个实施方案中，抗CD37抗体包含具有氨基酸序列
Figure BDA0001239440410000811
Figure BDA0001239440410000812
TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLN NFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLS KADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:28)的免疫球蛋白轻链区，和具有氨基酸序列
Figure BDA0001239440410000813
Figure BDA0001239440410000814
ASTKGPSVFPLAPSS KSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDK THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSH EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQ DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRD ELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO:29)的免疫球蛋白重链区。
在又另一个实施方案中，抗CD37抗体包含SEQ ID NO:29的重链CDR1-CDR3，和/或SEQ ID NO:28的轻链CDR1-CDR3，且优选特异性地结合CD37。
在又另一个实施方案中，抗CD37抗体包含与SEQ ID NO:29至少约90％、95％、97％、99％或100％相同的重链可变区(HCVR)序列，和/或与SEQ ID NO:28至少约90％、95％、97％、99％或100％相同的轻链可变区(LCVR)序列，且优选特异性地结合CD37。
在又另一个实施方案中，抗CD37抗体是huCD37-50抗体。
细胞结合剂-药物缀合物
本发明还提供细胞结合剂-药物缀合物，其包含经由多种接头，包括但不限于，二硫化物接头、硫醚接头、酰胺键合的接头、肽酶不稳定性接头、酸不稳定性接头、酯酶不稳定性接头连接至本发明的一种或多种细胞毒性化合物的细胞结合剂。
在第二实施方案中，本发明提供一种缀合物，其包含：细胞毒性化合物和细胞结合剂(CBA)，其中所述细胞毒性化合物共价连接至所述CBA，且其中所述细胞毒性化合物由结构式(I’)、(II’)、(III’)、(IV’)、 (V’)或(VI’)表示，其中变量是如以上所描述。
在某些实施方案中，所述细胞毒性化合物由结构式(I’)或其药学上可接受的盐表示。
在某些实施方案中，对于结构式(I’)、(II’)、(III’)、(IV’)、(V’)和 (VI’)，L’、L”和L’”中的一个由式(A’)表示：
-Z1-P-Z2-Rx-J’ (A’)，
并且其他是-H、具有1至6个碳原子的直链或支链烷基、卤素、 -OH、(C1-C6)烷氧基或-NO2。具体地说，L’、L”和L’”中的一个由式(A’) 表示，并且其他是-H。
在第1具体实施方案中，对于结构式(I’)、(II’)、(III’)、(IV’)、(V’) 和(VI’)，L’由式(A’)表示，且L”和L”’均为–H；且其余变量是如以上在第一实施方案中所描述。
在第2具体实施方案中，对于结构式(I’)、(II’)、(III’)、(IV’)、(V’) 和(VI’)，Rx是任选地被卤素、-OH、(C1-C3)烷基、(C1-C3)烷氧基、卤代(C1-C3)烷基或带电荷的取代基或可离子化基团Q取代的具有1至6 个碳原子的直链、支链或环状烷基；且其余变量是如以上在第一实施方案或第1具体实施方案中所描述。
在某些实施方案中，Q是i)-SO3H、-Z’-SO3H、-OPO3H2、 -Z’-OPO3H2、-PO3H2、-Z’-PO3H2、-CO2H、-Z’-CO2H、-NR11R12或 -Z’-NR11R12，或其药学上可接受的盐；或ii)-N+R14R15R16X-或 -Z’-N+R14R15R16X-；Z’是任选取代的亚烷基、任选取代的亚环烷基或任选取代的亚苯基；R14至R16各自独立地是任选取代的烷基；且X-是药学上可接受的阴离子；且其余变量是如以上在第2具体实施方案中所描述。更具体地说，Q是–SO3H或其药学上可接受的盐。
在第3具体实施方案中，对于结构式(I’)、(II’)、(III’)、(IV’)、(V’) 和(VI’)，J’包含共价连接至所述CBA的部分，且是-NRc1或-C(＝O)-，其中Rc1是-H或任选地被卤素、-OH或(C1-C3)烷氧基取代的具有1至 4个碳原子的直链或支链烷基；且其余变量是如以上在第一实施方案或第1或第2具体实施方案中所描述。
在某些实施方案中，J’是–C(＝O)-；且其余变量是如以上在第3 具体实施方案中所描述。
在第4具体实施方案中，对于结构式(I’)、(II’)、(III’)、(IV’)、(V’) 和(VI’)，L’由下式表示：
-NR5-P-C(＝O)-(CRaRb)m-J’ (B1’)；
-NR5-P-C(＝O)-Cy-(CRaRb)m’-J’ (B2’)；
-C(＝O)-P-NR5-(CRaRb)m-J’ (C1’)；或
-C(＝O)-P-NR5-Cy-(CRaRb)m’-J’ (C2’)，
其中：
J’是–C(＝O)-；
Ra和Rb在每次出现时各自独立地是–H、(C1-C3)烷基，或带电荷的取代基或可离子化基团Q；
m是1至6的整数；
m’是0或1至6的整数；且
Cy是任选地被卤素、-OH、(C1-C3)烷基、(C1-C3)烷氧基或卤代 (C1-C3)烷基取代的具有5或6个环碳原子的环状烷基；且其余变量是如以上在第一实施方案或第1、第2或第3具体实施方案中所描述。
在某些实施方案中，Ra和Rb两者均是H；式(B2’)和(C2’)中的 Cy是环己烷；且R5是H或Me；且其余变量是如以上在第4具体实施方案中所描述。更具体地说，式(B2’)和(C2’)中的m’是0或1。
在第5具体实施方案中，对于结构式(I’)、(II’)、(III’)、(IV’)、(V’) 和(VI’)，L’由下式表示：
-NR5-P-C(＝O)-(CRaRb)m-S-Zs1 (B3’)；或
-C(＝O)-P-NR5-(CRaRb)m-S-Zs1 (C3’)，
其中：
Ra和Rb在每次出现时各自独立地是–H、(C1-C3)烷基，或带电荷的取代基或可离子化基团Q；
m是1至6的整数；
Zs1选自下式中的任一个：
Figure BDA0001239440410000861
其中：
q是1至5的整数；
n’是2至6的整数；
U是–H或SO3M；
M是药学上可接受的阳离子(例如，H+、Na+或K+)；且其余变量是如以上在第一实施方案或第1、第2、第3或的第4具体实施方案中所描述。
在某些实施方案中，带电荷的取代基或可离子化基团Q是i) -SO3H、-Z’-SO3H、-OPO3H2、-Z’-OPO3H2、-PO3H2、-Z’-PO3H2、-CO2H、 -Z’-CO2H、-NR11R12或-Z’-NR11R12，或其药学上可接受的盐；或ii) -N+R14R15R16X-或-Z’-N+R14R15R16X-；Z’是任选取代的亚烷基、任选取代的亚环烷基或任选取代的亚苯基；R14至R16各自独立地是任选取代的烷基；且X-是药学上可接受的阴离子；且其余变量是如以上在第5具体实施方案中所描述。更具体地说，Q是–SO3H或其药学上可接受的盐。
在某些实施方案中，Ra和Rb两者均是–H且R5是H或Me；且其余变量是如以上在第5具体实施方案中所描述。
在某些实施方案中，-(CRaRb)m-是–(CH2)m”-C(Me2)-且m”是1至5 的整数；且其余变量是如以上在第5具体实施方案中所描述。
在第6具体实施方案中，对于结构式(I’)、(II’)、(III’)、(IV’)、(V’) 和(VI’)，P是含有2至10个氨基酸残基的肽；且其余变量是如以上在第一实施方案或第1、第2、第3、第4或第5具体实施方案中所描述。
在某些实施方案中，P是含有2至5个氨基酸残基的肽；且其余变量是如以上在第6具体实施方案中所描述。
在某些实施方案中，P选自Gly-Gly-Gly、Ala-Val、Val-Ala、Val-Cit、 Val-Lys、Phe-Lys、Lys-Lys、Ala-Lys、Phe-Cit、Leu-Cit、Lle-Cit、Trp、 Cit、Phe-Ala、Phe-N9-甲苯磺酰基-Arg、Phe-N9-硝基-Arg、Phe-Phe-Lys、 D-Phe-Phe-Lys、Gly-Phe-Lys、Leu-Ala-Leu、Ile-Ala-Leu、Val-Ala-Val、 Ala-Leu-Ala-Leu、β-Ala-Leu-Ala-Leu和Gly-Phe-Leu-Gly、Val-Arg、 Arg-Val、Arg-Arg、Val-D-Cit、Val-D-Lys、Val-D-Arg、D-Val-Cit、 D-Val-Lys、D-Val-Arg、D-Val-D-Cit、D-Val-D-Lys、D-Val-D-Arg、 D-Arg-D-Arg、Ala-Ala、Ala-D-Ala、D-Ala-Ala、D-Ala-D-Ala、Ala-Met、 Met-Ala；且其余变量是如以上在第6具体实施方案中所描述。
在某些实施方案中，P是Gly-Gly-Gly、Ala-Val、Ala-Ala、 Ala-D-Ala、D-Ala-Ala和D-Ala-D-Ala；且其余变量是如以上在第6 具体实施方案中所描述。
在第7具体实施方案中，对于结构式(I’)、(II’)、(III’)、(IV’)、(V’) 和(VI)，在N与C之间的双线
Figure BDA0001239440410000881
表示双键；且其余变量是如以上在第一实施方案或第1、第2、第3、第4、第5或第6具体实施方案中所描述。
在第8具体实施方案中，对于结构式(I’)、(II’)、(III’)、(IV’)、(V’) 和(VI’)，在N与C之间的双线
Figure BDA0001239440410000882
表示单键，X是-H或胺保护基团；且Y选自-H、-OR、-OCOR’、-SR、-NR’R”、任选取代的5-或6-元含氮杂环、-SO3H、-SO2H和-OSO3H；且其余变量是如以上在第一实施方案或第1、第2、第3、第4、第5、第6或第7具体实施方案中所描述。
在某些实施方案中，Y选自-H、-SO3M、-OH、-OMe、-OEt或–NHOH，其中M是–H、Na+或K+；且其余变量是如以上在第8具体实施方案中所描述。更具体地说，Y是–H、-SO3M或-OH。
在第9具体实施方案中，对于结构式(I’)、(II’)、(III’)、(IV’)、(V’) 和(VI’)，X’选自由以下组成的组：-H；-OH；任选取代的具有1至 10个碳原子的直链、支链或环状烷基、烯基或炔基；和苯基；且其余变量是如以上在第一实施方案或第1、第2、第3、第4、第5、第 6、第7或第8具体实施方案中所描述。
在某些实施方案中，X’是–H、-OH、(C1-C3)烷基、卤代(C1-C3) 烷基或苯基；且其余变量是如以上在第9具体实施方案中所描述。更具体地说，X’是-H、-OH或–Me。甚至更具体地说，X’是-H。
在第10具体实施方案中，对于结构式(I’)、(II’)、(III’)、(IV’)、 (V’)和(VI’)，Y’是-H、氧代、(C1-C3)烷基或卤代(C1-C3)烷基；且其余变量是如以上在第一实施方案或第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7、第8或第9具体实施方案中所描述。更具体地说，Y’是–H或氧代。甚至更具体地说，Y’是-H。
在第11具体实施方案中，对于结构式(I’)、(II’)、(III’)、(IV’)、 (V’)和(VI’)，A与A’相同或不同，且选自-O-、-S-、-NR5-和氧代-(C＝O)-；且其余变量是如以上在第一实施方案或第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7、第8、第9或第10具体实施方案中所描述。更具体地说， A与A’相同或不同，且选自-O-和-S-。甚至更具体地说，A和A’是–O-。
在第12具体实施方案中，对于结构式(I’)、(II’)、(III’)、(IV’)、 (V’)和(VI’)，R6是–OMe；且其余变量是如以上在第一实施方案或第 1、第2、第3、第4、第5、第6、第7、第8、第9、第10或第11 具体实施方案中所描述。
在第13具体实施方案中，对于结构式(I’)、(II’)、(III’)、(IV’)、 (V’)和(VI’)，R1、R2、R3、R4、R1’、R2’、R3’和R4’独立地是–H、卤素、-NO2、-OH、(C1-C3)烷基、卤代(C1-C3)烷基或(C1-C3)烷氧基；且其余变量是如以上在第一实施方案或第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7、第8、第9、第10、第11或第12具体实施方案中所描述。更具体地说，R1、R2、R3、R4、R1’、R2’、R3’和R4’均是-H。
在第14具体实施方案中，对于结构式(I’)、(II’)、(III’)、(IV’)、 (V’)和(VI’)，R、R’、R”和R5各自独立地是–H或(C1-C3)烷基；且其余变量是如以上在第一实施方案或第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7、第8、第9、第10、第11、第12或第13具体实施方案中所描述。
在第14具体实施方案中，对于结构式(I’)、(II’)、(III’)、(IV’)、 (V’)和(VI’)，在N与C之间的双线
Figure BDA0001239440410000901
表示单键或双键，条件是当其为双键时，X不存在且Y是-H，且当其为单键时，X是-H，Y是-OH 或-SO3M；
R1、R2、R3、R4、R1’、R2’、R3’和R4’均是-H；
R6是-OMe；
X’和Y’两者均是-H；
A和A’是-O-；
M是H、Na+或K+；且其余变量是如以上在第一实施方案或第1、第2、第3、第4、第5或第6具体实施方案中所描述。
在第15具体实施方案中，本发明的缀合物由以下结构式中的任一个表示：
Figure BDA0001239440410000911
Figure BDA0001239440410000921
Figure BDA0001239440410000931
Figure BDA0001239440410000941
Figure BDA0001239440410000951
Figure BDA0001239440410000961
Figure BDA0001239440410000971
Figure BDA0001239440410000981
Figure BDA0001239440410000991
Figure BDA0001239440410001001
Figure BDA0001239440410001011
Figure BDA0001239440410001021
Figure BDA0001239440410001031
Figure BDA0001239440410001041
Figure BDA0001239440410001051
Figure BDA0001239440410001061
Figure BDA0001239440410001071
Figure BDA0001239440410001081
Figure BDA0001239440410001091
Figure BDA0001239440410001101
Figure BDA0001239440410001111
Figure BDA0001239440410001121
Figure BDA0001239440410001131
Figure BDA0001239440410001141
Figure BDA0001239440410001151
Figure BDA0001239440410001161
Figure BDA0001239440410001171
Figure BDA0001239440410001181
Figure BDA0001239440410001191
Figure BDA0001239440410001201
Figure BDA0001239440410001211
或其药学上可接受的盐，其中：
r是1至10的整数；
Y是–H、-OH或-SO3M；且
M是药学上可接受的阳离子(例如H+、Na+或K+)。
更具体地说，Y是–SO3M。或者，Y是–OH。
在某些实施方案中，本文所描述的缀合物，如第二实施方案或第 1至第15具体实施方案中所描述的那些缀合物可包含1-10种细胞毒性化合物、2-9种细胞毒性化合物、3-8种细胞毒性化合物、4-7种细胞毒性化合物或5-6种细胞毒性化合物，每一细胞毒性化合物包含将所述细胞毒性化合物连接至CBA的连接基团，且在缀合物上的每一细胞毒性化合物均相同。
在任何缀合物实施方案中，如第二实施方案或第1至第15具体实施方案中，细胞结合剂可结合至选自以下的靶细胞：肿瘤细胞、感染病毒的细胞、感染微生物的细胞、感染寄生虫的细胞、自身免疫细胞、活化的细胞、骨髓细胞、活化的T细胞、B细胞或黑素细胞；表达CD4、CD6、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD37、CD38、 CD40、CD44、CD56、EpCAM、CanAg、CALLA或Her-2抗原、Her-3 抗原的细胞；或表达胰岛素生长因子受体、表皮生长因子受体和叶酸受体的细胞。
在任何缀合物实施方案，如第二实施方案或第1至第15具体实施方案中，所述细胞结合剂可以是抗体、单链抗体、特异性地结合至所述靶细胞的抗体片段、单克隆抗体、单链单克隆抗体或特异性地结合至靶细胞的单克隆抗体片段、嵌合抗体、特异性地结合至所述靶细胞的嵌合抗体片段、结构域抗体、特异性地结合至所述靶细胞的结构域抗体片段、淋巴因子、激素、维生素、生长因子、集落刺激因子或营养转运分子。
所述抗体可以是表面重构的抗体、表面重构的单链抗体或表面重构的抗体片段。
所述抗体可以是单克隆抗体、单链单克隆抗体或其单克隆抗体片段。
所述抗体可以是人源化抗体、人源化单链抗体或人源化抗体片段。
在以上任何缀合物实施方案，如第二实施方案或第1至第15具体实施方案中，细胞结合剂可以是抗叶酸受体抗体或其抗体片段。更具体地说，所述抗叶酸受体抗体是huMOV19抗体。
或者，在以上任何缀合物实施方案，如第二实施方案或第1至第 15具体实施方案中，细胞结合剂可以是抗EGFR抗体或其抗体片段。在一个实施方案中，所述抗EGFR抗体是非拮抗剂抗体，包括例如 WO2012058592(以引用的方式并入本文)中所描述的抗体。在另一个实施方案中，抗EGFR抗体是非功能性抗体，例如人源化ML66。更具体地说，抗EGFR抗体是huML66。
本发明还提供一种药物组合物，其包含本文所描述的任何缀合物和药学上可接受的载体。
本发明另外提供一种包含连接至细胞结合剂的任何主题化合物的缀合物。
本发明还提供一种在哺乳动物中抑制异常细胞生长或治疗增生性病症、自身免疫性病症、破坏性骨病症、感染性疾病、病毒疾病、纤维化疾病、神经退行性疾病、胰腺炎或肾病的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用治疗有效量的本发明的任何化合物(含或不含任何接头基团)或缀合物和任选地第二化学治疗剂。
在某些实施方案中，第二化学治疗剂依序或连续地施用给哺乳动物。
在某些实施方案中，所述方法用于治疗选自癌症、类风湿性关节炎、多发性硬化症、移植物抗宿主疾病(GVHD)、移植排斥、狼疮、肌炎、感染和免疫缺陷的病状。
在某些实施方案中，所述方法或缀合物用于治疗癌症。
在某些实施方案中，所述癌症是血液学癌症或实体肿瘤。更具体地说，所述癌症是卵巢癌、胰腺癌、子宫颈癌、黑色素瘤、肺癌(例如非小细胞肺癌(NSCLC))、乳癌、头颈部鳞状细胞癌、前列腺癌、子宫内膜癌、淋巴瘤(例如，非霍奇金淋巴瘤)、骨髓增生异常综合征(MDS)、腹膜癌或白血病(例如，急性骨髓性白血病(AML)、急性单核细胞性白血病、早幼粒细胞性白血病、嗜酸性粒细胞白血病、急性成淋巴细胞性白血病(例如B-ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)和慢性骨髓性白血病(CML))。
细胞结合剂-药物缀合物的制备
为了将本发明的细胞毒性化合物或其衍生物连接至细胞结合剂，所述细胞毒性化合物可包含键合至反应性基团的连接部分，如化合物 14(实施例1)、23(实施例2)、35(实施例3)、49(实施例4)、80(实施例5)、90(实施例6)、63(实施例7)或70(实施例8)。这些化合物可直接连接至细胞结合剂。用于将键合有反应性基团的细胞毒性化合物与细胞结合剂连接以产生细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物的代表性方法描述于实施例11、13、14-17、19和20中。
在一个实施方案中，可首先使双官能交联剂与细胞毒性化合物反应以提供带有键合至一个反应性基团的连接部分的化合物(即，药物- 接头化合物)，其可接着与细胞结合剂反应。或者，可首先使双官能交联试剂的一端与细胞结合剂反应以提供带有键合至一个反应性基团的连接部分的细胞结合剂，接着可使其与细胞毒性化合物反应。连接部分可含有允许所述细胞毒性部分在特定位点释放的化学键。适合化学键是本领域中熟知的且包括二硫键、硫醚键、酸不稳定性键、光不稳定性键、肽酶不稳定性键和酯酶不稳定性键(参见例如，美国专利5,208,020、5,475,092、6,441,163、6,716,821、6,913,748、7,276,497、 7,276,499、7,368,565、7,388,026和7,414,073)。优选是二硫键、硫醚键和肽酶不稳定性键。可用于本发明中的其他接头包括不可裂解的接头，如美国公布号2005/0169933中详细描述的那些接头；或带电荷的接头或亲水性接头，并且其描述于US 2009/0274713、US 2010/01293140和WO 2009/134976，其各自以引用的方式明确地并入本文。
在一个实施方案中，可将细胞结合剂(例如，抗体)于水性缓冲液中的溶液与摩尔过量的双官能交联剂，如N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫代)戊酸酯(SPP)、N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯 (SPDB)、N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫代)2-磺基丁酸酯(磺基 -SPDB)一起孵育，以引入二硫吡啶基。接着使经修饰的细胞结合剂(例如，经修饰的抗体)与本文所描述的含硫醇的细胞毒性化合物，如化合物98或99(实施例9和10)反应，以产生本发明的二硫化物连接的细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物。
在另一个实施方案中，可使本文所描述的含硫醇的细胞毒性化合物，如化合物98或99与双官能交联剂，如N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫代)戊酸酯(SPP)、N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯(SPDB)、N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫代)2-磺基丁酸酯(磺基 -SPDB)反应，以形成细胞毒性剂-接头化合物，接着可使其与细胞结合剂反应，以产生本发明的二硫化物连接的细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物。细胞毒性剂-接头化合物可在与细胞结合剂反应之前原位制备，无需纯化。代表性方法描述于实施例12和18中。或者，细胞毒性剂-接头化合物可在与细胞结合剂反应之前进行纯化。
细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物可使用本领域中已知的任何纯化方法，如美国专利号7,811,572和美国公布号2006/0182750(均以引用的方式并入本文)中所描述的那些方法纯化。例如，细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物可使用切向流过滤、吸附色谱法、吸附过滤法、选择性沉淀法、非吸附过滤法或其组合进行纯化。优选使用切向流过滤(TFF，又称为横流式过滤、超滤和渗滤)和/或吸附色谱树脂纯化所述缀合物。
或者，可将细胞结合剂(例如，抗体)与摩尔过量的抗体修饰剂，如2-亚胺基硫杂环戊烷、L-高半胱氨酸硫代内酯(或衍生物)或N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基硫代乙酸酯(SATA)一起孵育，以引入巯基。接着使经修饰的抗体与适当的含二硫化物的细胞毒性剂反应，以产生二硫化物连接的抗体-细胞毒性剂缀合物。接着，可通过以上描述的方法纯化抗体-细胞毒性剂缀合物。细胞结合剂还可进行工程化以引入硫醇部分，如美国专利号7,772485和7.855,275中所公开的半胱氨酸工程化的抗体。
在另一个实施方案中，可将细胞结合剂(例如，抗体)于水性缓冲液中的溶液与摩尔过量的抗体修饰剂一起孵育，如与N-琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-1-甲酸酯一起孵育以引入马来酰亚胺基，或与N-琥珀酰亚胺基-4-(碘代乙酰基)-氨基苯甲酸酯(SIAB) 一起孵育，以引入碘代乙酰基。接着使经修饰的细胞结合剂(例如，经修饰抗体)与含硫醇的细胞毒性剂反应，以产生硫醚连接的细胞结合剂-细胞毒性剂缀合物。接着，可通过以上描述的方法纯化所述缀合物。
可通过测量在280nm与在330nm下吸光度的比率，以分光光度法测定每一抗体分子结合的细胞毒性分子的数量。每一抗体分子可通过本文所描述的方法连接平均1-10个细胞毒性化合物。每一抗体分子连接的细胞毒性化合物的平均数量优选是2-5个，且最佳是2.5-4.0 个。
用于制备本发明的细胞结合剂-药物缀合物的代表性方法描述于 8,765,740和美国申请公布号2012/0238731中。这些参考文献的完整教义以引用的方式并入本文。
化合物和缀合物的细胞毒性
可对本发明的细胞毒性化合物和细胞结合剂-药物缀合物在体外抑制各种癌细胞增殖的能力进行评价。例如，可使用细胞系，如人子宫颈癌细胞系KB、人急性单核细胞性白血病细胞系THP-1、人早幼粒细胞性白血病细胞系HL60、人急性骨髓性白血病细胞系HNT-34来评估这些化合物和缀合物的细胞毒性。可使待评价的细胞暴露于所述化合物或缀合物1-5天，且通过已知方法在直接测定中测量细胞的存活分数。接着，可由所述测定的结果计算IC50值。或者或另外，可使用体外细胞系敏感性筛选，如美国国家癌症协会(U.S.NationalCancer Institute)所描述的筛选法(参见Voskoglou-Nomikos等人,2003, ClinicalCancer Res.9:42227-4239，以引用的方式并入本文)作为一种指导以确定可能对本发明的化合物或缀合物治疗敏感的癌症类型。
本发明的抗体-细胞毒性剂缀合物的体外效力和靶特异性的实例显示于图2和4中。所有所述缀合物对抗原阳性癌细胞具有极高细胞毒性，且IC50在较低皮摩尔浓度范围内。抗原阴性细胞系当暴露于所述缀合物时仍保持活力。
在一个实例中，测量了细胞结合剂/细胞毒性剂缀合物的体内功效。用huMov19-80和huMov19-90缀合物处理带有NCI-H2110肿瘤细胞的SCID小鼠且观察到在多种剂量下肿瘤显著消退，而未处理的小鼠肿瘤生长迅速(图6)。在低至5μg/kg剂量下观察到huMov19-90缀合物的活性。
组合物和使用方法
本发明包括一种组合物(例如药物组合物)，其包含本文所描述的新颖苯并二氮杂
Figure BDA0001239440410001271
化合物(例如，二氢吲哚并苯并二氮杂
Figure BDA0001239440410001272
或噁唑啶并苯并二氮杂
Figure BDA0001239440410001281
)、其衍生物或其缀合物(和/或其溶剂化物、水合物和 /或盐)和载体(药学上可接受的载体)。本发明还包括一种组合物(例如药物组合物)，其包含本文所描述的新颖苯并二氮杂
Figure BDA0001239440410001282
化合物、其衍生物或其缀合物(和/或其溶剂化物、水合物和/或盐)和载体(药学上可接受的载体)，还包含第二治疗剂。本发明的组合物可用于在哺乳动物(例如人)中抑制异常细胞生长或治疗增生性病症。本发明的组合物还适用于治疗哺乳动物(例如人)的抑郁症、焦虑症、应激症、恐怖症、惊慌、烦躁、心理障碍、疼痛和炎性疾病。
本发明包括一种在哺乳动物(例如人)中抑制异常细胞生长或治疗增生性病症的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用单独或与第二治疗剂组合的治疗有效量的本文所描述的新颖苯并二氮杂
Figure BDA0001239440410001283
化合物 (例如，二氢吲哚并苯并二氮杂
Figure BDA0001239440410001284
或噁唑啶并苯并二氮杂
Figure BDA0001239440410001285
)、其衍生物或其缀合物(和/或其溶剂化物、水合物和/或盐)或其组合物和载体 (药学上可接受的载体)。
本发明还提供治疗方法，所述方法包括向需要治疗的受试者施用有效量的以上所描述的任何缀合物。
类似地，本发明提供一种用于诱导所选细胞群中细胞死亡的方法，所述方法包括使靶细胞或含有靶细胞的组织与有效量的本发明的包含细胞毒性剂的任何细胞毒性化合物-结合剂(例如连接至细胞结合剂的二氢吲哚并苯并二氮杂
Figure BDA0001239440410001286
或噁唑啶并苯并二氮杂
Figure BDA0001239440410001287
二聚体)、其盐或溶剂化物接触。靶细胞是细胞结合剂能结合的细胞。
如果需要，可与所述缀合物一起施用其他活性剂，如其他抗肿瘤剂。
合适药学上可接受的载体、稀释剂和赋形剂是熟知的且可由本领域的普通技术人员依据临床情况所允许来确定。
合适载体、稀释剂和/或赋形剂的实例包括：(1)杜尔贝科氏磷酸盐缓冲生理食盐水(Dulbecco’s phosphate buffered saline)，约pH 7.4，含有或不含约1mg/mL至25mg/mL人血清白蛋白；(2)0.9％生理食盐水(0.9％w/v NaCl)；和(3)5％(w/v)右旋葡萄糖；且还可含有抗氧化剂(如色胺)和稳定剂(如Tween 20)。
用于诱导所选细胞群中细胞死亡的方法可在体外、体内或离体实行。
体外使用的实例包括自体骨髓在植入同一患者体内之前进行处理以便杀死患病细胞或恶性细胞；骨髓在移植之前进行处理以便杀死感受态T细胞且防止移植物抗宿主疾病(GVHD)；处理细胞培养物以便杀死除所需变体外的不表达靶抗原的所有细胞；或杀死表达非所需抗原的变体。
非临床体外使用的条件易于由本领域的普通技术人员决定。
临床上离体使用的实例是在自体移植以治疗癌症或治疗自身免疫疾病之前自骨髓移除肿瘤细胞或淋巴样细胞，或在移植之前由自体或异体骨髓移除T细胞和其他淋巴样细胞以便防止GVHD。治疗可如下进行。自患者或其他个体采集骨髓，且接着在约37℃下，在添加有浓度范围为约10μM至1pM的本发明细胞毒性剂的含血清培养基中孵育约30分钟至约48小时。浓度和孵育时间(即，剂量)的确切条件易于由本领域的普通技术人员决定。在孵育之后，用含血清的培养基洗涤骨髓细胞且根据已知方法，将其经静脉内回输给患者。在患者于骨髓采集时间与经处理细胞回输之间接受其他治疗，诸如消融性化学疗法或全身照射疗程的情况下，使用标准医疗设备将经处理骨髓细胞冷冻储存在液氮中。
对于临床上体内应用，所供应的本发明的细胞毒性剂将涉及无菌性和内毒素含量进行测试的溶液或冻干粉。适合施用缀合物的方案的实例如下。缀合物每周一次以静脉内推注给与，持续4周。推注剂量是在添加有5至10mL人血清白蛋白的50至1000mL标准生理食盐水中给与。每次静脉内施用的剂量将是10μg至2000mg(在每天100 ng至20mg/kg范围内)。治疗四周之后，患者可每周继续接受治疗。有关施用途径、赋形剂、稀释剂、剂量、时间等的具体临床方案可由本领域的普通技术人员根据临床情况的允许来决定。
可根据诱导所选细胞群中细胞死亡的体内或离体方法治疗的医学病状的实例包括任何类型的恶性疾病，包括例如，癌症；自身免疫疾病；如全身性狼疮、类风湿性关节炎和多发性硬化症；移植物排斥，如肾移植排斥、肝移植排斥、肺移植排斥、心脏移植排斥和骨髓移植排斥；移植物抗宿主疾病；病毒感染，如CMV感染、HIV感染、AIDS 等；和寄生虫感染，如贾第鞭毛虫病、阿米巴病、血吸虫病和本领域的普通技术人员所确定的其他疾病。
癌症疗法和其剂量、施用途径和推荐剂量是本领域中已知的且已描述于如Physician's Desk Reference(PDR)的文献中。PDR公开了用于治疗各种癌症的药剂的剂量。这些以上提及的在治疗上有效的化学治疗药物的给药方案和剂量将取决于所治疗的特定癌症、疾病程度和本领域的医师所熟悉的其他因素，且可由医师决定。PDR的内容以引用的方式清楚地整体并入本文。本领域的技术人员可评述PDR，使用以下一个或多个参数来确定可根据本发明的教义使用的化学治疗药物和缀合物的给药方案和剂量。所述参数包括：
综合指数
制造商
产品(公司或商标药物名)
种类索引
通用名/化学物质索引(非商标通用药物名)
药物的彩色图像
产品信息，与FDA标记相符
化学特性信息
功能/作用
适应症与禁忌症
试验研究、副作用、警告
类似物和衍生物
细胞毒性剂领域的技术人员将易于了解，本文所描述的每一细胞毒性剂可通过使所得化合物仍保持起始化合物的特异性和/或活性的方式进行修饰。熟练技术人员还应了解，这些化合物中有许多可代替本文所描述的细胞毒性剂使用。因此，本发明的细胞毒性剂包括本文所描述的化合物的类似物和衍生物。
本文和以下实施例中引用的所有参考文献均以引用的方式清楚地整体并入本文。
实施例
现将参照非限制性实例说明本发明。除非另外说明，否则所有百分比、比率、份数等均以重量计。所有试剂均购自Aldrich Chemical Co.(New Jersey)或其他商业来源。核磁共振(1H NMR)谱在Bruker 400 MHz仪器上获得。质谱在Bruker Daltonics Esquire3000仪器上获得且LCMS在带有Agilent 6120单四极MS的Agilent 1260Infinity LC 上使用电喷雾电离法获得。
以下溶剂、试剂、保护基团、部分和其他名称可通过括号中的缩写提及。
Me＝甲基；Et＝乙基；Pr＝丙基；i-Pr＝异丙基；Bu＝丁基；t-Bu＝叔丁基；Ph＝苯基；和Ac＝乙酰基
AcOH或HOAc＝乙酸
ACN或CH3CN＝乙腈
Ala＝丙氨酸
aq＝水溶液
BH3·DMS＝硼烷二甲硫醚复合物
Bn＝苯甲基
Boc或BOC＝叔丁氧羰基
CBr4＝四溴化碳
Cbz或Z＝苄氧基羰基
DCM或CH2Cl2＝二氯甲烷
DCE＝1,2-二氯乙烷
DMAP＝4-二甲基氨基吡啶
DI water＝去离子水
DIBAL＝氢化二异丁基铝
DIEA或DIPEA＝N,N-二异丙基乙胺
DMA＝N,N-二甲基乙酰胺
DMF＝N,N-二甲基甲酰胺
DMSO＝二甲亚砜
DTT＝二硫苏糖醇
EDC＝1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺
EEDQ＝N-乙氧基羰基-2-乙氧基-1,2-二氢喹啉
ESI或ES＝电喷雾电离
EtOAc＝乙酸乙酯
Gly＝甘氨酸
g＝克
h＝小时
HATU＝六磷酸N,N,N’N’-四甲基-O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)脲鎓盐
HPLC＝高效液相色谱
HOBt或HOBT＝1-羟基苯并三唑
LAH＝氢化锂铝
LC＝液相色谱
LCMS＝液相色谱质谱法
min＝分钟
mg＝毫克
mL＝毫升
mmol＝毫摩尔
μg＝微克
μL＝微升
μmol＝微摩尔
Me＝甲基
MeOH＝甲醇
MeI＝碘甲烷
MS＝质谱法
MsCl＝甲烷磺酰氯(甲磺酰氯)
Ms2O＝甲烷磺酸酐
NaBH(OAc)3＝三乙酰氧基硼氢化钠
NHS＝N-羟基琥珀酰胺
NMR＝核磁共振光谱
PPh3＝三苯基膦
PTLC＝制备型薄层色谱法
rac＝外消旋混合物
Rf＝滞留因子
RPHPLC或RP-HPLC＝反相高效液相色谱法
RT或rt＝室温(环境温度，约25℃)
sat或饱和＝饱和
STAB＝三乙酰氧基硼氢化钠(NaBH(OAc)3)
TBSCl或TBDMSCl＝叔丁基二甲基甲硅烷基氯化物
TBS＝叔丁基二甲基甲硅烷基
TCEP·HCl＝三(2-羧基乙基)膦盐酸盐
TEA＝三乙胺(Et3N)
TFA＝三氟乙酸
THF＝四氢呋喃
TLC＝薄层色谱
Val＝缬氨酸
实施例1.6-((2-((2-((2-((3-((((S)-8-甲氧基-6-氧代-11,12,12a,13-四氢-6H-苯并[5,6][1,4]二氮杂
Figure BDA0001239440410001352
并[1,2-a]吲哚-9-基)氧基)甲基)-5-((((S)-8-甲氧基-6-氧代-12a,13-二氢-6H-苯并[5,6][1,4]二氮杂
Figure BDA0001239440410001353
并[1,2-a]吲哚-9-基)氧基)甲基)苯基)氨基)-2-氧代乙基)氨基)-2-氧代乙基)氨基)-2-氧代乙基)氨基)-6-氧代己酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(化合物14)的合成
Figure BDA0001239440410001351
步骤1：将Z-Gly-Gly-OH化合物1(5.0g，18.78mmol)和 H-Gly-Ot-Bu·HCl化合物2(3.46g，20.66mmol)溶解于DMF(37.6mL) 中。将EDC·HCl(3.96g，20.66mmol)和HOBt(2.88g，18.78mmol) 添加至反应烧瓶中，随后添加DIPEA(8.18mL，46.9mmol)。在Ar 下，在室温下搅拌反应过夜。将反应混合物用CH2Cl2稀释，用饱和 NH4Cl、饱和NaHCO3，随后水和盐水洗涤。将有机层经Na2SO4干燥，过滤并浓缩。将粗产物通过硅胶快速色谱法(MeOH/DCM，梯度0％至5％)纯化，以得到呈白色固体状的纯化合物3(6.35g，89％产率)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ8.18-8.13(m,2H),7.48(t,1H,J＝6.0 Hz),7.37-7.36(m,3H),7.34-7.32(m,1H),5.04(s,2H),4.09(q,1H,J＝ 5.2Hz),3.74(t,4H,J＝6.1Hz),3.67(d,2H,J＝6.0Hz),3.17(d,2H,J ＝5.2Hz),1.41(s,9H)。LCMS＝4.28分钟(8分钟方法)。质量观察值 (ESI+):324.15(M-t-Bu+H)。
Figure BDA0001239440410001361
步骤2：将化合物3(6.3g，16.60mmol)溶解于MeOH(52.7mL) 和水(2.64mL)中。将反应混合物用Ar净化且脱气5分钟。缓慢添加 Pd/C(潮湿，10％)(0.884g，0.830mmol)。接着，以来自气球的H2鼓泡1分钟。在氢气球下，在室温下搅拌反应过夜。使反应混合物通过Celite过滤且滤饼用MeOH(30mL)洗涤并浓缩。将CH3CN(20mL) 添加至残余物并浓缩。将此操作再重复2次，以得到粘性固体。使残余物在EtOAc/己烷(2:1，50mL)中形成浆液且过滤，并用EtOAc/己烷(1:1，30mL)冲洗。将该固体在真空/N2下干燥1小时，以得到呈白色固体状的化合物4(3.66g，90％产率)。1HNMR(400MHz,DMSO-d6): δ8.21-8.18(m,1H),8.12(bs,1H),3.76(bs,2H),3.73(d,2H,J＝6.0Hz), 3.13(s,2H),1.93(bs,2H),1.41(s,9H)。
Figure BDA0001239440410001362
步骤3：将胺化合物4(1.0g，4.08mmol)和己二酸单甲酯(664μL， 4.48mmol)溶解于DMF(13.59mL)中。将EDC·HCl(860mg，4.48 mmol)和HOBt(624mg，4.08mmol)添加至反应混合物中，随后添加 DIEA(1.424mL，8.15mmol)。在室温下搅拌反应过夜。将反应混合物用DCM/MeOH(20mL，5:1)稀释且用饱和NH4Cl、饱和NaHCO3、水和盐水洗涤。将有机层经Na2SO4干燥，过滤并浓缩。将粗产物通过硅胶快速色谱法(梯度，0％至20％MeOH/DCM)纯化，以得到呈白色固体状的纯化合物5(1.5g，95％产率)。1HNMR(400MHz, DMSO-d6):δ8.17-8.06(m,3H),3.74-3.71(m,6H),3.59(s,3H),2.32 (bt,2H,J＝6.9Hz),2.14(bt,2H,J＝6.7Hz),1.52-1.49(m,4H),1.41(s, 9H)。
Figure BDA0001239440410001371
步骤4：在室温下，在TFA(5.97mL，77.0mmol)和去离子水(300 μL)中搅拌化合物5(1.5g，3.87mmol)过夜。将CH3CN(10mL)添加至反应混合物中并搅拌5分钟。混合物变浓稠并具有许多白色沉淀。再添加CH3CN(30mL)且再搅拌5分钟。将混合物过滤且在真空/N2下干燥1小时，以得到呈白色固体状的纯化合物6(0.7g，55％产率)。1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ12.56(s,1H),8.16-8.06(m,3H),3.73 (dt,6H,J＝8.6,6.1Hz),3.59(s,3H),2.32-2.29(m,2H),2.16-2.13(m, 2H),1.51(bt,4H,J＝3.5Hz)。
Figure BDA0001239440410001372
步骤5：在室温下，将苯胺化合物7(100mg，0.653mmol)和酸化合物6(227mg，0.685mmol)悬浮于CH2Cl2/MeOH(4.35mL/2.2 mL)中。添加EEDQ(323mg，1.306mmol)且在室温下搅拌反应过夜。浓缩溶剂且使残余物在EtOAc(15mL)中形成浆液并过滤。将固体用EtOAc(2×15mL)洗涤且在真空/N2下干燥，以得到呈白色固体状的化合物8(260mg，85％产率)。1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ9.74(s, 1H),8.21-8.19(m,2H),8.11-8.08(m,1H),7.45(s,2H),6.96(s,1H), 5.17(t,2H,J＝5.7Hz),4.45(d,4H,J＝5.6Hz),3.87(d,2H,J＝5.8Hz),3.75(dd,4H,J＝5.7,13.4Hz),3.58(s,3H),2.31-2.27(m,2H),2.16-2.13 (m,2H),1.52-1.48(m,4H)。LCMS＝0.886分钟(15分钟方法)。质量观察值(ESI+):489.3(M+Na)。
Figure BDA0001239440410001381
步骤6：将二醇化合物8(260mg，0.557mmol)和四溴化硼(555 mg，1.672mmol)溶解于DMF(5.57mL)中。添加三苯基膦(439mg， 1.672mmol)且将褐色混合物在Ar下在室温下搅拌4小时。将反应混合物用DCM/MeOH(10:1，30mL)稀释且用水和盐水洗涤。将有机层经Na2SO4干燥，过滤并浓缩。将粗残余物通过硅胶快速色谱法 (MeOH/DCM，0％至10％，梯度)纯化，以得到呈黄色固体状的化合物9。将产物在CH2Cl2/EtOAc(1:10，30mL)中形成浆液且接着过滤。将固体用EtOAc洗涤且在真空/N2下干燥，以得到呈灰白色固体状的纯化合物9(170mg，52％产率)。1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ9.95 (s,1H),8.25-8.20(m,2H),8.12-8.10(m,1H),7.65(s,2H),7.22(s,1H), 4.68(s,3H),3.89(d,2H,J＝5.8Hz),3.77(dd,4H,J＝5.7,7.4Hz),3.58 (s,3H),2.31-2.27(m,2H),2.16-2.13(m,2H),1.51-1.49(m,4H)。LCMS ＝3.335分钟(15分钟方法)。质量观察值(ESI+):593.2(M+H)。
Figure BDA0001239440410001382
步骤7：将二溴化物化合物9(109mg，0.184mmol)和IGN单体化合物10(119mg，0.405mmol)溶解于DMF(1.84mL)中。添加碳酸钾(63.6mg，0.460mmol)且在室温下搅拌过夜。将水(20mL)添加至反应混合物中以使产物沉淀。将浆液在室温下搅拌5分钟且接着过滤，并在真空/N2下干燥1小时。将粗产物通过硅胶快速色谱法 (MeOH/CH2Cl2，梯度0％至5％)纯化，以得到呈黄色固体状的化合物 11(160mg，60％产率，70％纯度)。LCMS＝5.240分钟(15分钟方法)。质量观察值(ESI+):1019.7(M+H)。
Figure BDA0001239440410001391
步骤8：将二亚胺化合物11(140mg，0.11mmol)溶解于1,2-二氯乙烷(1.1mL)中。将NaBH(OAc)3(23.29mg，0.11mmol)添加至反应混合物中且在室温下搅拌1小时。将反应物用CH2Cl2(30mL)稀释且用饱和aq NH4Cl溶液(15mL)淬灭。分离各层且用盐水洗涤，经Na2SO4干燥并浓缩。将粗残余物通过RPHPLC(C18管柱，CH3CN/H2O，梯度35％至55％)纯化，以得到呈白色蓬松固体状的单亚胺化合物12(33 mg，29％产率)且还回收到起始物质化合物11(25mg).LCMS＝7.091 分钟(15分钟方法)。质量观察值(ESI+):1021.7(M+H)。
Figure BDA0001239440410001392
步骤9：将甲酯化合物12(33mg，0.029mmol)溶解于THF(1.09 mL)和水(364μL)中。添加LiOH(6.97mg，0.291mmol)且在室温下搅拌反应1.5小时。将反应混合物用H2O(5mL)稀释且用0.5M HCl水溶液酸化直至约pH 4。将水层用CH-2Cl2/MeOH(3:1，3×20mL)萃取。将合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤并浓缩，以得到呈黄色固体状的粗化合物13(29mg，99％产率)。LCMS＝5.356分钟(15分钟方法)。质量观察值(ESI+):1007.7(M+H)。
Figure BDA0001239440410001393
步骤10：在室温下，将EDC·HCl(22.08mg，0.115mmol)添加至酸化合物13(29mg，0.023mmol)和N-羟基琥珀酰胺(21.21mg，0.184 mmol)于CH2Cl2(2.3mL)中的搅拌溶液中。搅拌反应混合物2小时。将反应混合物用CH2Cl2稀释且用水(1×15mL)和盐水(1×15mL)洗涤。将有机层经Na2SO4干燥，过滤并浓缩。将粗产物通过RPHPLC (C18管柱，CH3CN/H2O，梯度35％至55％)纯化。合并含产物的级分并冻干，以得到呈白色蓬松固体状的6-((2-((2-((2-((3-((((S)-8-甲氧基 -6-氧代-11,12,12a,13-四氢-6H-苯并[5,6][1,4]二氮杂
Figure BDA0001239440410001402
并[1,2-a]吲哚-9- 基)氧基)甲基)-5-((((S)-8-甲氧基-6-氧代-12a,13-二氢-6H-苯并[5,6][1,4]二氮杂
Figure BDA0001239440410001403
并[1,2-a]吲哚-9-基)氧基)甲基苯基)氨基)-2-氧代乙基)氨基)-2-氧代乙基)氨基)-2-氧代乙基)氨基)-6-氧代己酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯，即化合物14(8mg，31％产率)。LCMS＝5.867分钟(15 分钟方法)。质量观察值(ESI+):1104.7(M+H)。
实施例2.(1r,4r)-4-((2-((2-((2-((3-((((S)-8-甲氧基-6-氧代 -11,12,12a,13-四氢-6H-苯并[5,6][1,4]二氮杂
Figure BDA0001239440410001404
并[1,2-a]吲哚-9-基)氧基)甲基)-5-((((S)-8-甲氧基-6-氧代-12a,13-二氢-6H-苯并[5,6][1,4]二氮杂
Figure BDA0001239440410001405
并[1,2-a]吲哚-9-基)氧基)甲基)苯基)氨基)-2-氧代乙基)氨基)-2-氧代乙基)氨基)-2-氧代乙基)氨甲酰基)环己烷-甲酸2,5-二氧代吡咯烷 -1-基酯(化合物23)的合成
Figure BDA0001239440410001401
步骤1：将胺化合物4(200mg，0.815mmol)和1,4-反-环己烷二甲酸单甲酯化合物15(182mg，0.978mmol)溶解于DMF(2.72mL)中。将EDC·HCl(188mg，0.978mmol)和HOBt(125mg，0.815mmol) 添加至反应混合物中，随后添加DIEA(285μL，1.631mmol)。将混合物在室温下搅拌过夜。将反应混合物用CH2Cl2稀释且用饱和 NH4Cl、饱和NaHCO3、盐水和水洗涤。将有机层经Na2SO4干燥且浓缩成粘性残余物。将CH3CN(15mL)添加至残余物中并浓缩。将此操作再重复2次，以得到呈干燥白色粉末状的化合物16(300mg，85％产率)。1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ8.16(t,1H,J＝5.9Hz),8.04 (dt,2H,J＝5.6,14.8Hz),3.74-3.69(m,6H),3.59(s,3H),2.31-2.25(m, 1H),2.20-2.13(m,1H),1.94-1.91(m,2H),1.82-1.79(m,2H),1.41(s,9H),1.34(d,3H,J＝11.7Hz)。
Figure BDA0001239440410001411
步骤2：在室温下，将TFA(1.40mL，18.14mmol)和DI水(67.8μL) 添加至净化合物16(300mg，0.726mmol)中并搅拌3小时。将CH3CN (20mL)添加至反应混合物中并浓缩。将此操作再重复2次，以得到呈白色固体状的化合物17(230mg，89％产率)。1HNMR(400MHz, DMSO-d6):δ8.16-8.13(m,1H),8.07-8.01(m,2H),3.76-3.73(m,4H), 3.70(bd,2H,J＝5.1Hz),3.59(s,3H),2.31-2.25(m,1H),2.19-2.14(m, 1H),1.94-1.91(m,2H),1.82-1.79(m,2H),1.42-1.26(m,4H)。
Figure BDA0001239440410001412
步骤3：在室温下，将苯胺化合物7(135mg，0.881mmol)和酸化合物17(331mg，0.925mmol)悬浮于CH2Cl2/MeOH(2.9mL/1.5mL) 中。添加EEDQ(436mg，1.763mmol)且在室温下搅拌反应过夜。浓缩溶剂且使残余物在EtOAc(15mL)中形成浆液并过滤。将固体用 EtOAc(2×15mL)洗涤且在真空/N2下干燥，以得到呈白色固体状的化合物18(330mg，61％产率)。1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ9.73 (s,1H),8.18(dt,2H,J＝6.0,19.2Hz),8.09-8.01(m,2H),7.45(s,2H), 6.96(s,1H),5.17(t,2H,J＝5.7Hz),4.45(d,4H,J＝5.6Hz),3.88-3.84 (m,3H),3.77-3.69(m,8H),3.63(s,2H),3.59(s,6H),2.30-2.22(m,2H), 2.19-2.13(m,2H),1.94-1.90(m,4H),1.82-1.78)m,4H),1.41-1.26(m, 8H)。
Figure BDA0001239440410001421
步骤4：将化合物18(330mg，0.536mmol)和CBr4(533mg，1.608 mmol)溶解于DMF(5.36mL)中。将PPh3(422mg，1.608mmol)添加至反应混合物中，此时反应物变为黄色并伴随轻微放热。在Ar下搅拌反应4小时。将反应混合物用CH2Cl2稀释并用水和盐水洗涤。将有机层经Na2SO4干燥并浓缩。将粗残余物通过硅胶快速色谱法 (MeOH/CH2Cl2，梯度0％至10％)纯化，以得到呈白色固体状的化合物19(234mg，64％产率)。LCMS＝4.453分钟(8分钟方法)。质量观察值(ESI+):617.10(M+H)。
Figure BDA0001239440410001422
步骤5：化合物20以与实施例1中化合物11类似的方式制备。在纯化后获得呈黄色固体状的化合物20(264mg，60％产率)。LCMS ＝4.831分钟(8分钟方法)。质量观察值(ESI+):1045.20(M+H)。
Figure BDA0001239440410001423
步骤6：化合物21以与实施例1中化合物12类似的方式制备。在C18纯化后获得呈白色固体状的化合物21(51mg，31％产率)。 LCMS＝5.127分钟(8分钟方法)。质量观察值(ESI+):1047.30(M+H)。
Figure BDA0001239440410001431
步骤7：将甲酯化合物21(48mg，0.046mmol)溶解于1,2-二氯乙烷(3.06mL)中。将三甲基锡烷醇(124mg，0.688mmol)添加至反应混合物中且在80℃下加热过夜。将反应混合物冷却至室温且用水(15mL) 稀释。将水层用1M HCl酸化至约pH 4。将混合物用CH2Cl2/MeOH(10:1，3×20mL)萃取。将合并的有机层用盐水洗涤且经Na2SO4干燥并浓缩。将粗残余物通过短硅胶塞塞住且用CH2Cl2/MeOH(10:1，接着5:1，2×30mL)冲洗并浓缩。获得呈黄色固体状的酸化合物22且不经进一步纯化即用于下一步骤中(48mg，100％产率)。LCMS＝5.338 分钟(15分钟方法)。质量观察值(ESI+):1033.7(M+H)。
Figure BDA0001239440410001432
步骤8：化合物23以与实施例1中化合物13类似的方式制备。在C18纯化后获得呈白色固体状的(1r,4r)-4-((2-((2-((2-((3-((((S)-8-甲氧基-6-氧代-11,12,12a,13-四氢-6H-苯并[5,6][1,4]二氮杂
Figure BDA0001239440410001433
并[1,2-a]吲哚-9-基)氧基)甲基)-5-((((S)-8-甲氧基-6-氧代-12a,13-二氢-6H-苯并 [5,6][1,4]二氮杂
Figure BDA0001239440410001434
并[1,2-a]吲哚-9-基)氧基)甲基)苯基)氨基)-2-氧代乙基)氨基)-2-氧代乙基)氨基)-2-氧代乙基)氨甲酰基)环己烷甲酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯，即化合物23(8mg，19％产率)。LCMS＝6.007 分钟(15分钟方法)。质量观察值(ESI+):1130.8(M+H)。
实施例3.6-(((S)-1-(((S)-1-((3-((((S)-8-甲氧基-6-氧代-11,12, 12a,13-四氢-6H-苯并[5,6][1,4]二氮杂
Figure BDA0001239440410001435
并[1,2-a]吲哚-9-基)氧基)甲基)-5-((((S)-8-甲氧基-6-氧代-12a,13-二氢-6H-苯并[5,6][1,4]二氮杂
Figure BDA0001239440410001436
并[1,2-a]吲哚-9-基)氧基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基)-6-氧代己酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(化合物 35)的合成
Figure BDA0001239440410001441
步骤1：将Z-Val-OH化合物24(3.0g，11.94mmol)和L-Ala-OtBu 化合物25(1.907g，13.13mmol)溶解于DMF(23.88mL)中。将 EDC·HCl(2.52g，13.13mmol)和HOBt(2.011g，13.13mmol)添加至反应混合物中，随后添加DIEA(4.59mL，26.3mmol)。在Ar下在室温下搅拌反应过夜。将反应混合物用CH2Cl2稀释且用饱和NaHCO3、饱和NH4Cl、水和盐水洗涤。将有机层经Na2SO4干燥，过滤并浓缩。将粗残余物通过硅胶快速色谱法(EtOAc/己烷，梯度0％至50％)纯化，以得到呈白色固体状的化合物26(3.68g，81％产率)。1HNMR(400 MHz,CDCl3):δ7.39-7.29(m,5H),6.29(bd,1H,J＝6.9Hz),5.34(bd, 1H,J＝8.4Hz),5.11(s,2H),4.45(p,1H,J＝7.2Hz),4.02-3.98(m,1H), 2.18-2.09(m,1H),1.56(s,9H),1.37(d,3H,J＝7.0Hz),0.98(d,3H,J＝ 6.8Hz),0.93(d,3H,J＝6.8Hz)。LCMS＝5.571分钟(8分钟方法)。质量观察值(ESI+):323.25(M-tBu+H)。
Figure BDA0001239440410001442
步骤2：将化合物26(3.68g，9.72mmol)溶解于MeOH(30.9mL) 和水(1.543mL)中。将溶液用Ar净化并脱气5分钟。将Pd/C(10％,潮湿，0.517g)缓慢添加至反应混合物中。接着使H2在其中鼓泡一分钟。中止鼓泡且接着在氢气球下搅拌反应过夜。使反应混合物通过Celite 过滤且滤饼用MeOH(30mL)洗涤并浓缩，以得到呈白色固体状的化合物27(2.35g，99％产率)。1HNMR(400MHz,CDCl3):δ7.79-7.77(m, 1H),4.50(p,1H,J＝7.3Hz),3.27(d,1H,J＝3.9Hz),2.34-2.26(m,1H), 1.49(s,9H),1.40(d,3H,J＝7.1Hz),1.01(d,3H,J＝7.0Hz),0.86(d, 3H,J＝6.9Hz)。
Figure BDA0001239440410001451
步骤3：将胺化合物27(2.35g，9.62mmol)和己二酸单甲酯(1.69 g，10.58mmol)溶解于DMF(32.1mL)中。将EDC·HCl(1.94g，10.10 mmol)和HOBt(1.47g，9.62mmol)添加至反应混合物中，随后添加 DIEA(3.36mL，19.24mmol)。在室温下搅拌反应过夜。反应混合物用DCM/MeOH(20mL，5:1)稀释且用饱和NH4Cl、饱和NaHCO3、水和盐水洗涤。将有机层经Na2SO4干燥，过滤并浓缩。将粗产物通过硅胶快速色谱法(EtOAc/己烷，梯度0％至50％)纯化，以得到呈白色固体状的化合物28(2.77g，75％产率)。1HNMR(400MHz,CDCl3): δ6.29(d,1H,J＝7.2Hz),6.12(d,1H,J＝8.6Hz),4.43(p,1H,J＝7.2 Hz),4.27(dd,1H,J＝6.4,8.6Hz),3.66(s,3H),2.35-2.31(m,2H), 2.26-2.23(m,2H),2.12-2.03(m,1H),1.70-1.63(m,4H),1.46(s,9H), 1.36(d,3H,J＝7.1Hz),0.95(明显t,6H,J＝6.6Hz)。
Figure BDA0001239440410001452
步骤4：在室温下，将TFA(8.28mL，108.0mmol)和水(0.56mL) 添加至净化合物28(2.77g，7.17mmol)中并搅拌2.5小时。将CH3CN (30mL)添加至反应混合物中并浓缩。将此操作再重复2次，以得到呈浅黄色固体状的化合物29(2.0g，84％产率)。1HNMR(400MHz,CDCl3):δ8.11(bs,1H),7.29(d,1H,J＝8.9Hz),7.14(d,1H,6.8Hz), 4.58(p,1H,J＝7.1Hz),4.37(t,1H,J＝8.7Hz),3.68(s,3H),2.37-2.32 (m,4H),2.03-1.99(m,2H),1.69-1.63(m,4H),1.49(d,3H,J＝7.2Hz), 0.97(d,3H,J＝4.8Hz),0.96(d,3H,J＝4.8Hz)。
Figure BDA0001239440410001461
步骤5：在室温下，将苯胺化合物7(150mg，0.98mmol)和酸化合物29(340mg，1.03mmol)悬浮于CH2Cl2/MeOH(3.26mL，1.62mL) 中。添加EEDQ(484mg，1.96mmol)且在室温下搅拌反应过夜。浓缩溶剂且使残余物在EtOAc/Et2O(15mL，15mL)中形成浆液并过滤。将固体用Et2O(2×15mL)洗涤并在真空/N2下干燥，以得到呈白色固体状的化合物30(150mg，33％产率)。1HNMR(400MHz,CDCl3):δ 7.61(s,2H),7.47(d,1H,J＝7.1Hz),7.14(s,1H),6.64(d,1H,J＝8.0 Hz),4.82-4.75(m,1H),4.45-4.40(m,4H),3.64(s,3H),2.36-2.27(m, 4H),2.16-2.07(m,1H),1.68-1.59(m,4H),1.47(d,3H,J＝7.0Hz),0.98 (d,3H,J＝3.6Hz),0.95(d,3H,J＝4.8Hz)。LCMS＝3.073分钟(8分钟方法)。质量观察值(ESI+):466.25(M+H)。
Figure BDA0001239440410001462
步骤6：将二醇化合物30(150mg，0.322mmol)和CBr4(321mg， 0.967mmol)溶解于DMF(3222μl)中。将PPh3(254mg，0.967mmol) 添加至反应混合物中，此时反应物变为粉红色且伴随轻微放热。在 Ar下搅拌反应4小时。将反应混合物用CH2Cl2稀释并用水和盐水洗涤。将有机层经Na2SO4干燥并浓缩。将粗残余物通过硅胶快速色谱法(EtOAc/己烷，梯度0％至100％)纯化，以得到呈灰白色固体状的化合物31(473mg，75％产率)。1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ8.19(d, 1H,J＝6.6Hz),7.85(d,1H,J＝8.5Hz),7.64(s,2H),7.21(s,1H),4.68 (s,3H),4.37(p,1H,J＝7.0Hz),4.18(dd,1H,J＝7.2,8.4Hz),3.58(s, 3H),2.32-2.29(m,2H),2.33-2.12(m,2H),2.01-1.91(m,1H),1.53-1.49 (m,4H),1.31(d,3H,J＝7.1Hz),0.89(d,3H,J＝6.8Hz),0.85(d,3H,J ＝6.8Hz)。LCMS＝5.259分钟(8分钟方法)。质量观察值(ESI+):592.05 (M+H)。
Figure BDA0001239440410001471
步骤7：化合物32以与实施例1中化合物11类似的方式制备。在纯化后获得呈黄色固体状的化合物32(162mg，57％产率，70％纯度)。LCMS＝6.461分钟(15分钟方法)。质量观察值(ESI+):1018.7 (M+H)。
Figure BDA0001239440410001472
步骤8：化合物33以与实施例1中化合物12类似的方式制备。在C18纯化后获得呈白色固体状的化合物33(40mg，31％产率)。 LCMS＝5.528分钟(8分钟方法)。质量观察值(ESI+):1020.30(M+H)。
Figure BDA0001239440410001473
步骤9：化合物34以与实施例2中化合物22类似的方式制备。在二氧化硅塞后获得呈黄色固体状的化合物34(38mg，100％产率)。 LCMS＝5.211分钟(8分钟方法)。质量观察值(ESI+):1006.35(M+H)。
Figure BDA0001239440410001481
步骤10：化合物35以与实施例1中化合物14类似的方式制备。在C18纯化后获得呈白色固体状的6-(((S)-1-(((S)-1-((3-((((S)-8-甲氧基-6-氧代-11,12,12a,13-四氢-6H-苯并[5,6][1,4]二氮杂
Figure BDA0001239440410001483
并[1,2-a]吲哚 -9-基)氧基)甲基)-5-((((S)-8-甲氧基-6-氧代-12a,13-二氢-6H-苯并 [5,6][1,4]二氮杂
Figure BDA0001239440410001484
并[1,2-a]吲哚-9-基)氧基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代丙 -2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基)-6-氧代己酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯，即化合物35(8mg，20％产率)。LCMS＝7.031分钟(15 分钟方法)。质量观察值(ESI+):1103.7(M+H)。
实施例4.2-(3-((((S)-8-甲氧基-6-氧代-11,12,12a,13-四氢-6H-苯并 [5,6][1,4]二氮杂
Figure BDA0001239440410001485
并[1,2-a]吲哚-9-基)氧基)甲基)-5-((((S)-8-甲氧基-6- 氧代-12a,13-二氢-6H-苯并[5,6][1,4]二氮杂
Figure BDA0001239440410001486
并[1,2-a]吲哚-9-基)氧基) 甲基)苯基)-3,6,9,12-四氧代-2,5,8,11-四氮杂十七烷-17酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(化合物49)的合成
Figure BDA0001239440410001482
步骤1：将(5-氨基-1,3-亚苯基)二甲醇化合物7(5.0g，32.6mmol) 溶解于THF(65.3mL)中。添加TBSCl(12.30g，82mmol)和咪唑(6.67 g，98mmol)且在Ar下，在室温下搅拌过夜。将反应混合物用EtOAc 稀释且用饱和NH4Cl和盐水洗涤，经Na2SO4干燥且浓缩。将粗残余物通过硅胶快速色谱法(EtOAc/己烷，梯度0％至30％)纯化，以得到呈黄色油状的化合物37(13g，100％产率)。1HNMR(400MHz,CDCl3): δ6.71(s,1H),6.60(s,2H),4.65(s,4H),0.94(s,18H),0.10(s,12H)。
Figure BDA0001239440410001491
步骤2：将Cs2CO3(8.54g，26.2mmol)添加至苯胺化合物37(10 g，26.2mmol)于DMF(52.4mL)中的搅拌溶液中。添加碘甲烷(1.474 mL，23.58mmol)且在室温下搅拌反应3小时。将水(10mL)和EtOAc (30mL)添加至反应混合物中。分离各层且用EtOAc(2×)萃取。将有机层用水(4×)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并浓缩。将粗残余物通过硅胶快速色谱法(EtOAc/己烷，梯度0％至10％)纯化，以得到所需单甲基化产物化合物38(3.8g，37％产率)。1HNMR(400MHz,CDCl3):δ 6.63(s,1H),6.52(s,2H),4.67(s,4H),2.84(s,3H),0.94(s,18H),0.10(s, 12H)。
Figure BDA0001239440410001492
步骤3：将苯胺化合物38(1.0g，2.53mmol)和Z-Gly-OH(0.582g， 2.78mmol)溶解于DMF(8.42mL)中。将EDC·HCl(1.21g，6.32mmol) 和DMAP(340mg，2.78mmol)添加至反应混合物中且在80℃下加热过夜。将反应混合物用EtOAc稀释且用饱和NaHCO3和水(2×)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并浓缩。将粗残余物通过硅胶色谱法(EtOAc/ 己烷，梯度0％至30％至100％)纯化，以得到呈黄色粘性固体状的化合物39(780mg，53％产率)。1HNMR(400MHz,CDCl3):δ7.27(m,6H), 6.90(s,2H),4.94(s,2H),4.62(s,4H),3.58(s,2H),3.16(s.3H),0.83(s, 18H),0.00(s,12H)。
Figure BDA0001239440410001501
步骤4：将化合物39(1.26g，2.147mmol)溶解于MeOH(6.82mL) 和THF(6.8mL)中且将溶液用N2净化。添加Pd/C(10％,0.228g，0.215 mmol)且使H2在其中鼓泡数分钟。在氢气球下搅拌反应过夜。使反应混合物通过Celite过滤且用MeOH洗涤并浓缩，以得到纯化合物40(1 g，100％产率)。1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ7.41-7.30(m,2H), 7.27-7.21(m,1H),7.06(s,2H),4.65(s,4H),3.23(s,3H),3.12(s,2H), 0.82(s,18H),0.00(s,12H)。
Figure BDA0001239440410001502
步骤5：将胺化合物40(1.0g，1.988mmol)和Z-Gly-Gly-Gly-OH (662mg，2.385mmol)溶解于DMF(6.63mL)中。将EDC·HCl(457 mg，2.385mmol)和HOBT(304mg，1.988mmol)添加至反应混合物中，随后添加DIEA(694μL，3.98mmol)。在室温下搅拌反应过夜。将反应混合物用EtOAc稀释且用饱和NaHCO3、盐水和水(2×)洗涤。将有机层经Na2SO4干燥，过滤并浓缩。将粗残余物通过硅胶快速色谱法 (MeOH/DCM，梯度0％至10％)纯化，以得到呈白色粘性泡沫状的化合物41(994mg，71％产率)。1HNMR(400MHz,CDCl3):δ7.38-7.32(m,7H),7.31-7.27(m,2H),7.01(s,2H),5.13(s,2H),4.74(s,4H),3.97(d, 2H,J＝4.6Hz),3.92(d,2H,J＝5.3Hz),3.74(d,2H,J＝3.7Hz),3.27(s, 3H),0.94(s,18H),0.11(s,12H)。
Figure BDA0001239440410001511
步骤6：将化合物41(994mg，1.418mmol)悬浮于MeOH(6.65mL) 和水(443μL)中且用N2净化。添加Pd/C(10％湿度，302mg，0.284 mmol)且使H2在其中鼓泡数分钟。在氢气球下搅拌反应过夜。使溶液通过Celite过滤且用MeOH洗涤并浓缩，以得到纯化合物42(725mg，90％产率)。1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ8.10-7.97(m,1H), 7.91-7.85(m,1H),7.31-7.23(m,1H),7.05(s,2H),7.65(s,4H), 3.68-3.62(m,2H),3.56-3.45(m,1H),3.09(s,3H),3.08-3.06(m,2H), 3.06-3.03(m,2H),0.82(s,18H),0.00(s,12H)。LCMS＝5.574分钟(8 分钟方法)。质量观察值(ESI+):567.30(M+H)。
Figure BDA0001239440410001512
步骤7：将胺化合物42(725mg，1.279mmol)和己二酸单甲酯(246 mg，1.535mmol)溶解于DMF(6.5mL)中。将EDC·HCl(294mg，1.535 mmol)和HOBt(196mg，1.279mmol)添加至反应混合物中，随后添加 DIEA(447μL，2.56mmol)。在室温下搅拌反应过夜。将反应混合物用DCM(20mL)稀释且用饱和NH4Cl、饱和NaHCO3、水和盐水洗涤。将有机层经Na2SO4干燥，过滤并浓缩。将粗产物通过硅胶快速色谱法(MeOH/DCM，梯度0％至10％)纯化，以得到化合物43(425mg， 33％产率)。1HNMR(400MHz,CDCl3):δ7.30(s,1H),7.01(s,2H), 6.89-6.85(m,1H),6.75-6.72(m,1H),6.41-6.40(m,1H),4.73(s,4H), 3.98-3.96(m,4H),3.74(bd,2H,J＝3.5Hz),3.66(s,3H),3.27(s,3H), 2.33(t,2H,J＝6.8Hz),2.28(t,2H,J＝6.5Hz),0.94(s,18H),0.11(s, 12H)。LCMS＝7.709分钟(8分钟方法)。质量观察值(ESI+):709.35 (M+H)。
Figure BDA0001239440410001521
步骤8：将化合物43(422mg，0.417mmol)溶解于THF(1.89mL) 和水(189μL)中。添加HCl(水溶液，5M)(833μL，4.17mmol)且在室温下搅拌反应2.5小时。浓缩反应混合物。将ACN(约15mL)添加至残余物中并浓缩。将此操作再重复两次，以得到呈白色泡沫状的化合物44(200mg，100％产率)。LCMS＝0.389分钟(8分钟方法)。1HNMR (400MHz,DMSO-d6):δ8.09-8.04(m,2H),7.93-7.90(m,1H),7.30(bs, 1H),7.14(s,2H),4.52(s,4H),3.71-3.68(m,4H),3.58(s,3H),3.17(bs, 3H),2.22-2.18(m,2H),2.15-2.12(m,2H),1.53-1.47(m,4H)。
Figure BDA0001239440410001522
步骤9：将二醇化合物44(110mg，0.229mmol)和CBr4(228mg， 0.687mmol)溶解于DMF(2.29mL)中。将PPh3(180mg，0.687mmol) 添加至反应混合物中，此时反应物变为粉红色并伴随轻微放热。在 Ar下搅拌反应6小时。将反应混合物用CH2Cl2/MeOH(10:1)稀释并用水和盐水洗涤。将有机层经Na2SO4干燥并浓缩。将粗残余物通过硅胶快速色谱法(MeOH/CH2Cl2，梯度0％至10％)纯化，以得到化合物45(30mg，22％产率)。1HNMR(400MHz,CDCl3):δ7.46(bs,1H), 7.32-7.26(m,2H),7.26-7.19(m,2H),6.89-6.85(m,1H),4.60(d,2H,J＝3.6Hz),4.48(d,2H,J＝3.9Hz),3.98(d,4H,J＝5.1Hz),3.76(bs,1H), 3.67(s,3H),3.30(bs,3H),2.34(bt,2H,J＝6.7Hz),2.30(bt,2H,J＝6.6 Hz),1.70-1.64(m,4H)。LCMS＝4.326分钟(8分钟方法)。质量观察值 (ESI+):605.10(M+H)。
Figure BDA0001239440410001531
步骤10：化合物46以与实施例1中化合物11类似的方式制备。在纯化后获得呈黄色固体状的化合物46(40mg，59％产率)。LCMS＝ 4.751分钟(8分钟方法)。质量观察值(ESI+):1033.35(M+H)。
Figure BDA0001239440410001532
步骤11：化合物47以与实施例1中化合物12类似的方式制备。在C18纯化后获得呈白色固体状的化合物47(14mg，32％产率)。 LCMS＝5.857分钟(15分钟方法)。质量观察值(ESI+):1035.7(M+H)。
Figure BDA0001239440410001533
步骤12：化合物48以与实施例2中22类似的方式制备。在二氧化硅塞后获得呈黄色固体状的化合物48(7mg，100％产率)。LCMS ＝4.817分钟(8分钟方法)。质量观察值(ESI+):1021.35(M+H)。
Figure BDA0001239440410001534
步骤13：化合物49以与实施例1中化合物14类似的方式制备。在C18纯化后获得呈白色固体状的2-(3-((((S)-8-甲氧基-6-氧代 -11,12,12a,13-四氢-6H-苯并[5,6][1,4]二氮杂
Figure BDA0001239440410001535
并[1,2-a]吲哚-9-基)氧基)甲基)-5-((((S)-8-甲氧基-6-氧代-12a,13-二氢-6H-苯并[5,6][1,4]二氮杂
Figure BDA0001239440410001543
并[1,2-a]吲哚-9-基)氧基)甲基)苯基)-3,6,9,12-四氧代-2,5,8,11-四氮杂十七烷-17-酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯，即化合物49(6.5mg， 74％产率)。LCMS＝5.805分钟(15分钟方法)。质量观察值(ESI+): 1118.7(M+H)。
实施例5.6-(((S)-1-(((R)-1-((3-((((S)-8-甲氧基-6-氧代 -11,12,12a,13-四氢-6H-苯并[5,6][1,4]二氮杂
Figure BDA0001239440410001544
并[1,2-a]吲哚-9-基)氧基)甲基)-5-((((R)-8-甲氧基-6-氧代-12a,13-二氢-6H-苯并[5,6][1,4]二氮杂
Figure BDA0001239440410001545
并[1,2-a]吲哚-9-基)氧基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基)-6-氧代己酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(化合物80)的合成
Figure BDA0001239440410001541
步骤1：将(S)-2-(((苄氧基)羰基)氨基)丙酸(5g，22.40mmol)和 (R)-2-氨基丙酸叔丁酯盐酸盐(4.48g，24.64mmol)溶解于无水DMF (44.8ml)中。添加EDC·HCl(4.72g，24.64mmol)、HOBt(3.43g，22.40 mmol)且接着添加DIPEA(9.75ml,56.0mmol)。在氩气下在室温下搅拌反应过夜。将反应混合物用二氯甲烷稀释且接着用饱和氯化铵、饱和碳酸氢钠、水和盐水洗涤。将有机层经硫酸钠干燥并浓缩。将粗油状物经由硅胶色谱法(己烷/乙酸乙酯)纯化，以得到化合物71(5.6g， 71％产率)。1HNMR(400MHz,CDCl3):δ7.39-7.34(m,5H),6.54(s,1H) 5.28(s,1H),5.15(s,2H),4.47-4.43(m,1H),4.48(s,1H),1.49(s,9H), 1.42-1.37(m,6H)。
Figure BDA0001239440410001542
步骤2：将化合物71(5.6g，15.98mmol)溶解于甲醇(50.7mL)和水(2.54mL)中。将溶液用氩气净化五分钟。缓慢添加钯/碳(潮湿，10％) (0.850g，0.799mmol)。在氢气氛围下搅拌反应过夜。使溶液通过Celite 过滤，用甲醇冲洗并浓缩。将残余物与甲醇和乙腈共沸且将所得油状物直接置于高真空上，以得到化合物72(3.57g，100％产率)，其直接用于下一步骤中。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ7.67(s,1H),4.49-4.42 (m,1H),3.54-3.49(m,1H),1.48(s,9H),1.40(d,3H,J＝7.2Hz),1.36(d, 3H,J＝6.8Hz)。
Figure BDA0001239440410001551
步骤3：将化合物72(3.57g，16.51mmol)和己二酸单甲酯(2.69 mL，18.16mmol)溶解于无水DMF(55.0mL)中。添加EDC·HCl(3.48 g，18.16mmol)和HOBt((2.53g，16.51mmol)，随后添加DIPEA(5.77 mL，33.0mmol)。将混合物在室温下搅拌过夜。将反应物用二氯甲烷 /甲醇(80mL，5:1)稀释且用饱和氯化铵、饱和碳酸氢钠和盐水洗涤。将其经硫酸钠干燥，过滤并汽提。将所述化合物与乙腈(5x)共沸，接着在高真空上在35℃下抽吸，以得到化合物73(5.91g，100％产率)。粗物质不经纯化即用于下一步骤。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ6.67 (d,1H,J＝6.8Hz),6.22(d,1H,J＝7.2Hz),4.56-4.49(m,1H), 4.46-4.38(m,1H),3.68(s,3H),2.37-2.33(m,2H),2.27-2.24(m,2H), 1.70-1.68(m,4H),1.47(s,9H),1.40(s,3H),1.38(s,3H)。
Figure BDA0001239440410001552
步骤4：在室温下，在TFA(25.4mL，330mmol)和去离子水(1.3 mL)中搅拌化合物73(5.91g，16.5mmol)三小时。在乙腈存在下浓缩反应混合物且将其置于高真空上干燥，以得到粗化合物74(4.99g， 100％产率)。1HNMR(400MHz,CDCl3):δ7.44(d,1H,J＝7.2Hz,),6.97(d,1H,J＝8.0Hz),4.81-4.73(m,1H),4.59-4.51(m,1H),3.69(s,3H), 2.39-2.32(m,2H),2.31-2.23(m,2H),1.70-1.61(m,4H),1.48(d,3H,J＝ 7.2Hz),1.40(d,3H,J＝7.2Hz)。
Figure BDA0001239440410001561
步骤5：将化合物74(4.8g，15.88mmol)溶解于无水二氯甲烷(101 mL)和无水甲醇(50.4mL)中。添加(5-氨基-1,3-亚苯基)二甲醇(2.316g， 15.12mmol)和EEDQ(7.48g，30.2mmol)且在室温下搅拌反应过夜。去除溶剂且粗物质通过硅胶色谱法(二氯甲烷/甲醇)纯化，以得到化合物75(1.65g，25％产率)。1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ9.68(s,1H), 8.29(d,1H,J＝7.2Hz),8.11(d,1H,J＝6.4Hz),7.52(s,2H),6.97(s, 1H),5.15(s,2H),4.45(s,4H),4.39-4.32(m,1H),4.28-4.21(m,1H), 3.57(s,3H),2.30-2.27(m,2H),2.17-2.13(m,2H),1.54-1.45(m,4H) 1.30(d,3H,J＝7.2Hz),1.20(d,3H,J＝7.2Hz)。MS(m/z):460.2(M+Na)+。
Figure BDA0001239440410001562
步骤6：将化合物75(0.486g，1.111mmol)和四溴化碳(1.105g， 3.33mmol)溶解于无水DMF(11.11mL)中。添加三苯基膦(0.874g， 3.33mmol)且在氩气下搅拌反应四小时。将反应混合物用DCM/MeOH (10:1)稀释且用水和盐水洗涤。将其经硫酸钠干燥，过滤并浓缩。将粗物质通过硅胶色谱法(DCM/MeOH)纯化，以得到化合物76(250 mg，40％产率)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ9.82(s,1H),8.38(d, 1H,J＝7.2Hz),8.17(d,1H,J＝6.0Hz),7.76(s,2H),7.22(s,1H),4.66 (s,4H),4.38-4.31(m,1H),4.25-4.19(m,1H),3.56(s,3H),2.30-2.27 (m,2H),2.18-2.15(m,2H),1.53-1.51(m,4H),1.32(d,3H,J＝7.2Hz), 1.21(d,3H,J＝6.8Hz)。
Figure BDA0001239440410001571
步骤7：化合物77以与实施例1中11类似的方式制备。将粗物质通过硅胶色谱法(二氯甲烷/甲醇)纯化，以得到化合物77(340mg， 60％产率，77％纯度)。LCMS＝5.87分钟(15分钟方法)。MS(m/z):990.6 (M+1)+。
Figure BDA0001239440410001572
步骤8：化合物78以与实施例1中化合物12类似的方式制备。将粗物质经由RPHPLC(C18管柱，乙腈/水)纯化，以得到化合物78 (103mg，30％产率)。LCMS＝6.65分钟(15分钟方法)。MS(m/z):992.7 (M+1)+。
Figure BDA0001239440410001573
步骤9：化合物78以与实施例2中22类似的方式制备。使粗物质通过二氧化硅塞，以得到化合物79(38mg，55％产率，75％纯度)。 LCMS＝5.83分钟(15分钟方法)。MS(m/z):978.6(M+1)+。
Figure BDA0001239440410001574
步骤10：化合物80以与实施例1中化合物14类似的方式制备。将粗物质经由RPHPLC(C18管柱，乙腈/水)纯化，以得到 6-(((S)-1-(((R)-1-((3-((((S)-8-甲氧基-6-氧代-11,12,12a,13-四氢-6H-苯并[5,6][1,4]二氮杂
Figure BDA0001239440410001582
并[1,2-a]吲哚-9-基)氧基)甲基)-5-((((R)-8-甲氧基 -6-氧代-12a,13-二氢-6H-苯并[5,6][1,4]二氮杂
Figure BDA0001239440410001583
并[1,2-a]吲哚-9-基)氧基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基)-6-氧代己酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯，即化合物80(6.5mg，30％产率)。 LCMS＝6.53分钟(15分钟方法)。MS(m/z):1075.7(M+1)+和 1097.7(M+Na)+。
实施例6.6-(((S)-1-(((S)-1-((3-((((S)-8-甲氧基-6-氧代 -11,12,12a,13-四氢-6H-苯并[5,6][1,4]二氮杂
Figure BDA0001239440410001584
并[1,2-a]吲哚-9-基)氧基)甲基)-5-((((R)-8-甲氧基-6-氧代-12a,13-二氢-6H-苯并[5,6][1,4]二氮杂
Figure BDA0001239440410001585
并[1,2-a]吲哚-9-基)氧基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基)-6-氧代己酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯，化合物90的合成
Figure BDA0001239440410001581
步骤1：将(S)-2-(((苄氧基)羰基)氨基)丙酸(5g，22.40mmol)和 (S)-2-氨基丙酸叔丁酯盐酸盐(4.48g，24.64mmol)溶解于无水DMF (44.8mL)。添加EDC·HCl(4.72g，24.64mmol)、HOBt(3.43g，22.40 mmol)和DIPEA(9.75mL，56.0mmol)。在氩气下，在室温下搅拌反应过夜。将反应混合物用二氯甲烷稀释且接着用饱和氯化铵、饱和碳酸氢钠、水和盐水洗涤。将有机层经硫酸钠干燥并浓缩。将粗油状物经由硅胶色谱法(己烷/乙酸乙酯)纯化，以得到化合物81(6.7g，85％产率)。1HNMR(400MHz,CDCl3):δ7.38-7.31(m,5H),6.53-6.42(m, 1H),5.42-5.33(m,1H),5.14(s,2H),4.48-4.41(m,1H),4.32-4.20(m, 1H),1.49(s,9H),1.42(d,3H,J＝6.8Hz),1.38(d,3H,J＝7.2Hz)。
Figure BDA0001239440410001591
步骤2：将化合物81(6.7g，19.12mmol)溶解于甲醇(60.7mL)和水(3.03mL)中。将溶液用氩气净化五分钟。缓慢添加钯/碳(潮湿，10％) (1.017g，0.956mmol)。在氢气氛围下搅拌反应过夜。使溶液通过Celite 过滤，用甲醇冲洗并浓缩。使其与甲醇和乙腈共沸且所得油状物直接置于高真空上，以得到化合物82(4.02g，97％产率)，其直接用于下一步骤中。1HNMR(400MHz,CDCl3):δ7.78-7.63(m,1H),4.49-4.42 (m,1H),3.55-3.50(m,1H),1.73(s,2H),1.48(s,9H),1.39(d,3H,J＝ 7.2Hz),1.36(d,3H,J＝6.8Hz)。
Figure BDA0001239440410001592
步骤3：将化合物82(4.02g，18.59mmol)和己二酸单甲酯(3.03 mL，20.45mmol)溶解于无水DMF(62.0mL)中。添加EDC·HCl(3.92 g，20.45mmol)、HOBt(2.85g，18.59mmol)和DIPEA(6.49mL，37.2 mmol)。将混合物在室温下搅拌过夜。将反应物用二氯甲烷/甲醇(150mL，5:1)稀释且用饱和氯化铵、饱和碳酸氢钠和盐水洗涤。将其经硫酸钠干燥，过滤并汽提。使所述化合物与乙腈(5×)共沸，接着在高真空上在35℃下抽吸，以得到化合物83(6.66g，100％产率)。粗物质不经纯化即用于下一步骤。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ6.75(d,1H, J＝6.8Hz),6.44(d,1H,J＝6.8Hz),4.52-4.44(m,1H),4.43-4.36(m, 1H),3.65(s,3H),2.35-2.29(m,2H),2.25-2.18(m,2H),1.71-1.60(m, 4H),1.45(s,9H),1.36(t,6H,J＝6.0Hz)。
Figure BDA0001239440410001593
步骤4：在室温下，在TFA(28.6mL，372mmol)和去离子水(1.5 mL)中搅拌化合物83(5.91g，16.5mmol)三小时。在乙腈存在下浓缩反应混合物且将其置于高真空上，以得到呈粘性固体状的粗化合物 84(5.88g，100％产率)。1HNMR(400MHz,CDCl3):δ7.21(d,1H,J＝6.8Hz),6.81(d,1H,J＝7.6Hz),4.69-4.60(m,1H),4.59-4.51(m,1H), 3.69(s,3H),2.40-2.33(m,2H),2.31-2.24(m,2H),1.72-1.63(m,4H), 1.51-1.45(m,3H),1.42-1.37(m,3H)。
Figure BDA0001239440410001601
步骤5：将化合物84(5.6g，18.52mmol)溶解于无水二氯甲烷(118 mL)和无水甲醇(58.8mL)中。添加(5-氨基-1,3-亚苯基)二甲醇(2.70g， 17.64mmol)和EEDQ(8.72g，35.3mmol)且在室温下搅拌反应过夜。去除溶剂且添加乙酸乙酯。过滤所得浆液，用乙酸乙酯洗涤且在真空 /N2下干燥，以得到化合物85(2.79g，36％产率)。1HNMR(400MHz, DMSO-d6):δ9.82(s,1H),8.05,(d,1H,J＝9.2Hz),8.01(d,1H,J＝7.2 Hz),7.46(s,2H),6.95(3,1H),5.21-5.12(m,2H),4.47-4.42(m,4H), 4.40-4.33(m,1H),4.33-4.24(m,1H),3.58(s,3H),2.33-2.26(m,2H), 2.16-2.09(m,2H),1.54-1.46(m,4H),1.30(d,3H,J＝7.2Hz),1.22(d, 3H,J＝4.4Hz)。
Figure BDA0001239440410001602
步骤6：将化合物85(0.52g，1.189mmol)和四溴化碳(1.183g， 3.57mmol)溶解于无水DMF(11.89mL)中。添加三苯基膦(0.935g， 3.57mmol)且在氩气下搅拌反应四小时。将反应混合物用DCM/MeOH (10:1)稀释且用水和盐水洗涤，经硫酸钠干燥，过滤并浓缩。将粗物质通过硅胶色谱法(DCM/MeOH)纯化，以得到化合物86(262mg，39％产率)。1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ10.01(s,1H),8.11(d,1H,J＝ 6.8Hz),8.03(d,1H,J＝6.8Hz),7.67(s,2H),7.21(s,1H),4.70-4.64(m, 4H),4.40-4.32(m,1H),4.31-4.23(m,1H),3.58(s,3H),2.34-2.26(m, 2H),2.18-2.10(m,2H),1.55-1.45(m,4H),1.31(d,3H,J＝7.2Hz),1.21 (d,3H,J＝7.2Hz)。
Figure BDA0001239440410001611
步骤7：化合物87以与实施例1中化合物11类似的方式制备。将粗物质通过硅胶色谱法(二氯甲烷/甲醇)纯化，以得到化合物87(336 mg，74％产率)。LCMS＝5.91分钟(15分钟方法)。MS(m/z):990.6(M +1)+。
Figure BDA0001239440410001612
步骤8：化合物88以与实施例1中化合物12类似的方式制备。将粗物质经由RPHPLC(C18管柱，乙腈/水)纯化，以得到化合物88 (85.5mg，25％产率)。LCMS＝6.64分钟(15分钟方法)。MS(m/z):992.6 (M+1)+。
Figure BDA0001239440410001613
步骤9：化合物88以与实施例2中22类似的方式制备。使粗物质通过二氧化硅塞，以得到化合物89(48.8mg，80％产率)。LCMS＝ 5.89分钟(15分钟方法)。MS(m/z):978.6(M+1)+。
Figure BDA0001239440410001621
步骤10：化合物90以与实施例1中14类似的方式制备。将粗物质经由RPHPLC(C18管柱，乙腈/水)纯化，以得到 6-(((S)-1-(((S)-1-((3-((((S)-8-甲氧基-6-氧代-11,12,12a,13-四氢-6H-苯并[5,6][1,4]二氮杂
Figure BDA0001239440410001623
并[1,2-a]吲哚-9-基)氧基)甲基)-5-((((R)-8-甲氧基 -6-氧代-12a,13-二氢-6H-苯并[5,6][1,4]二氮杂
Figure BDA0001239440410001624
并[1,2-a]吲哚-9-基)氧基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基)-6-氧代己酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯，即化合物90(8.2mg，30％产率)。 LCMS＝6.64分钟(15分钟方法)。MS(m/z):1075.4(M+1)+。
实施例7.1-(3-((((S)-8-甲氧基-6-氧代-11,12,12a,13-四氢-6H-苯并 [5,6][1,4]二氮杂
Figure BDA0001239440410001625
并[1,2-a]吲哚-9-基)氧基)甲基)-5-((((S)-8-甲氧基-6- 氧代-12a,13-二氢-6H-苯并[5,6][1,4]二氮杂
Figure BDA0001239440410001626
并[1,2-a]吲哚-9-基)氧基) 甲基)苯基)-1,4,7,10-四氧代-2,5,8,11-四氮杂十四烷-14-酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(化合物63)的合成
Figure BDA0001239440410001622
步骤1：将Z-Gly-Gly-GlyOH化合物50(1.0g，3.09mmol)和β- 丙氨酸甲酯·HCl(453mg，3.25mmol)溶解于DMF(12.37mL)中。将 EDC·HCl(623mg，3.25mmol)和HOBt(497mg，3.25mmol)添加至反应混合物中，随后添加DIEA(1.08mL，6.19mmol)。在室温下搅拌反应过夜。次日，形成部分白色沉淀。将反应混合物用CH2Cl2/MeOH (5:1，30mL)稀释且用饱和NaHCO3、饱和NH4Cl和盐水洗涤。有机层变浑浊。添加EtOAc(15mL)至有机层中以使产物沉淀析出。过滤混合物且将固体用水(10mL)和CH3CN(2×15mL)洗涤，不经纯化得到呈白色粉末状的纯化合物51(880mg，70％产率)。1H NMR(400 MHz,DMSO-d6):δ8.16(bt,1H,J＝5.4Hz),8.11(bt,1H,J＝5.6Hz), 7.88-7.85(m,1H),7.49(bt,1H,J＝5.5Hz),7.40-7.31(m,5H),5.04(s, 2H),3.74(d,2H,J＝5.5Hz),3.67(t,4H,J＝6.2Hz),3.60(s,3H),3.29 (q,1H,J＝6.4Hz),2.47(t,3H,J＝6.9Hz)。
Figure BDA0001239440410001631
步骤2：将化合物51(876mg，2.145mmol)溶解于MeOH(20.4mL) 和水(1.02mL)中且用Ar净化。使溶液脱气5分钟。缓慢添加Pd/C (10％，用50％水润湿，228mg)。使H2经由气球在其中鼓泡一分钟。在氢气球下搅拌反应过夜。将H2O(约3mL)添加至反应混合物中以溶解形成的所有白色固体。接着使溶液通过Celite过滤且滤饼用 MeOH(30mL)洗涤并浓缩。将残余物溶解于CH3CN(20mL)中并浓缩。将此操作再重复2次。通过添加CH3CN(约15mL)使所得粘性固体沉淀析出。将浓稠白色浆液搅拌10分钟，过滤并用CH3CN洗涤。将固体在真空/N2下干燥1.5小时，以得到呈白色固体状的化合物52 (450mg，76％产率)。1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ8.18-8.12(m, 2H),7.88(t,1H,J＝5.4Hz),3.75(s,2H),3.65(d,2H,J＝5.9Hz),3.6(s, 3H),3.33-3.27(m,4H),2.47(t,2H,J＝7.0Hz),1.94(bs,1H)。
Figure BDA0001239440410001632
步骤3：将NaOH(1.665g，41.6mmol)添加至三甲基苯-1,3,5-三甲酸酯化合物53(5g，19.82mmol)于MeOH(66.1mL)和水(13.22mL) 中的搅拌溶液中。使反应混合物在Ar下回流3小时。形成大量白色沉淀。将溶液冷却至室温且用H2O稀释，直至所有固体均溶解。将混合物用5N HCl水溶液酸化至约pH 2-3，用EtOAc(3×)萃取，经 Na2SO4干燥，过滤并浓缩。将粗产物溶解于热EtOAc(50mL)中且缓慢冷却至室温。过滤沉淀(沉淀为副产物且并非产物)。浓缩母液，以得到呈白色固体状的化合物54(3.45g，78％产率)。1HNMR(400MHz, DMSO-d6):δ13.62(bs,2H),8.65(s,3H),3.93(s,3H)。LCMS＝3.209 分钟(8分钟方法)。质量观察值(ESI+):244.90(M+H)。
Figure BDA0001239440410001641
步骤4：将二酸化合物54(1.0g，4.46mmol)溶解于THF(17.84mL) 中。将溶液冷却至0℃且在Ar下缓慢添加BH3·DMS(2M的THF溶液)(8.92mL，17.84mmol)。在0℃下搅拌反应5分钟，接着升温至室温并搅拌过夜。将反应物对空气敞开且用MeOH缓慢淬灭，随后缓慢添加H2O，直至观察不到气体放出。将混合物用EtOAc(2×)萃取且分离各层。将有机层用约3％H2O2水溶液、柠檬酸水溶液和盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并浓缩。将粗残余物通过硅胶快速色谱法 (EtOAc/己烷，梯度20％至100％)纯化，以得到呈白色固体状的二醇化合物55(385mg，44％产率)。1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ7.81 (s,2H),7.52(s,1H),5.33(bs,2H),4.56(s,4H),3.86(s,3H)。
Figure BDA0001239440410001642
步骤5：在Ar下，将二醇化合物55(320mg，1.631mmol)溶解于DCM(10.9mL)中。将溶液冷却至-5℃且添加TEA(0.568mL，4.08 mmol)，随后缓慢添加MsCl(0.292mL，3.75mmol)，此时颜色在添加后立即变为黄色，接着变为深红/褐色。将反应混合物在Ar下在-5℃下搅拌1.5小时。将反应混合物用冰水淬灭且用EtOAc(2×)萃取。有机层用水(2×)洗涤，经干燥Na2SO4，过滤并浓缩，以得到粗二甲磺酸酯化合物56(435mg，76％产率)。
Figure BDA0001239440410001651
步骤6：将二甲磺酸酯化合物56(435mg，1.11mmol)溶解于DMF (5.55mL)中。添加IGN单体化合物10(719mg，2.444mmol)，随后添加K2CO3(384mg，2.78mmol)且在室温下在Ar下搅拌过夜。添加水(20mL)以使产物沉淀析出。将浆液搅拌5分钟，过滤且在真空/N2下干燥1.5小时。将粗残余物通过硅胶快速色谱法(EtOAc/己烷，梯度 50％至100％；接着5％MeOH/DCM)纯化，以得到呈黄色固体状的化合物57(535mg，64％产率，2个步骤)。LCMS＝6.973分钟(15分钟方法)。质量观察值(ESI+):749.4(M+H)。
Figure BDA0001239440410001652
步骤7：将化合物57(100mg，0.134mmol)溶解于DCE(1.34mL) 中。添加三甲基锡烷醇(362mg，2.003mmol)且在80℃下加热过夜。将反应混合物冷却至室温且用水稀释。将水层用1M HCl酸化至约 pH 4且用DCM(3×)萃取，经Na2SO4干燥，过滤并浓缩。将粗产物经由短二氧化硅塞塞住且用DCM/MeOH(10:1，50mL)冲洗并浓缩，以得到呈浅黄色固体状的化合物58(100mg，100％产率)。LCMS＝ 5.872分钟(15分钟方法)。质量观察值(ESI+):735.3(M+H)。
Figure BDA0001239440410001653
步骤8：将酸化合物58(80mg，0.087mmol)和胺化合物52(36 mg，0.131mmol)溶解于DMF(871μL)中。添加EDC·HCl(25mg，0.131 mmol)和DMAP(10.6mg，0.087mmol)且在室温下搅拌4小时。添加水(4mL)以使产物沉淀析出。将浆液搅拌5分钟，过滤并在真空/N2下干燥。将粗残余物通过硅胶快速色谱法(MeOH/DCM，梯度0％至 20％)纯化，以得到呈黄色固体状的化合物60(37mg,43％产率)。 LCMS＝4.605分钟(8分钟方法)。质量观察值(ESI+):991.35(M+H)。
Figure BDA0001239440410001661
步骤9：化合物61以与实施例1中化合物12类似的方式制备。在C18纯化后获得呈白色固体状的化合物61(8mg，25％产率)。LCMS ＝5.421分钟(15分钟方法)。质量观察值(ESI+):993.7(M+H)。
Figure BDA0001239440410001662
步骤10：化合物62以与实施例2中化合物22类似的方式制备。在经由短二氧化硅塞塞住之后，获得呈黄色固体状的粗化合物62(13 mg，90％产率)。LCMS＝4.693分钟(8分钟方法)。质量观察值(ESI+): 979.35(M+H)。
Figure BDA0001239440410001663
步骤11：化合物63以与实施例1中化合物14类似的方式制备。在C18纯化后获得呈白色固体状的1-(3-((((S)-8-甲氧基-6-氧代 -11,12,12a,13-四氢-6H-苯并[5,6][1,4]二氮杂
Figure BDA0001239440410001675
并[1,2-a]吲哚-9-基)氧基)甲基)-5-((((S)-8-甲氧基-6-氧代-12a,13-二氢-6H-苯并[5,6][1,4]二氮杂
Figure BDA0001239440410001674
并[1,2-a]吲哚-9-基)氧基)甲基)苯基)-1,4,7,10-四氧代-2,5,8,11-四氮杂十四烷-14-酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯，即化合物63(4mg，31％产率)。LCMS＝5.495分钟(15分钟方法)。质量观察值(ESI+):1076.7 (M+H)。
实施例8.3-((S)-2-((S)-2-(3-((((S)-8-甲氧基-6-氧代-11,12,12a,13- 四氢-6H-苯并[5,6][1,4]二氮杂
Figure BDA0001239440410001673
并[1,2-a]吲哚-9-基)氧基)甲基)-5-((((S)-8-甲氧基-6-氧代-12a,13-二氢-6H-苯并[5,6][1,4]二氮杂
Figure BDA0001239440410001672
并[1,2-a]吲哚-9-基)氧基)甲基)苯甲酰胺基)丙酰胺基)丙酰胺基)丙酸 2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(化合物70)的合成
Figure BDA0001239440410001671
步骤1：将Z-L-Ala-L-Ala-OH化合物64(3.0g，10.19mmol)和β- 丙氨酸甲酯·HCl(1.565g，11.21mmol)溶解于DMF(20.39mL)中。添加EDC·HCl(2.150g，11.21mmol)和HOBt(1.561g，10.19mmol)，随后添加DIPEA(4.44mL，25.5mmol)。在Ar下，在室温下搅拌反应过夜。将反应混合物用EtOAc稀释且用饱和NH4Cl、饱和NaHCO3和盐水洗涤。将己烷添加至有机层中，此时溶液变浑浊并沉淀。将浆液搅拌数分钟，过滤并用EtOAc/己烷(3:1)洗涤固体。将固体在真空/N2下干燥，以得到呈白色固体状的纯化合物65(3.11g，80％产率)。1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ7.91(d,2H,J＝7.0Hz),7.46(d,1H,J ＝7.4Hz),6.39-7.30(m,5H),5.02(d,2H,J＝2.3Hz),4.20(p,1H,J＝ 7.2Hz),4.04(p,1H,J＝7.3Hz),3.59(s,3H),3.30-3.22(m,1H),2.45(t, 2H,J＝6.8Hz),1.18(apparent t,6H,J＝7.2Hz)。LCMS＝3.942分钟(8 分钟方法)。质量观察值(ESI+):380.10(M+H)。
Figure BDA0001239440410001681
步骤2：将化合物65(1.0g，2.64mmol)溶解于甲醇(12.55mL)、水(0.628mL)和THF(2mL)中。将溶液用Ar净化且接着脱气5分钟。缓慢添加Pd/C(10％，用50％水润湿，0.140g)。使H2在溶液中鼓泡一分钟且在氢气球(1atm)下再搅拌反应过夜。使反应混合物通过Celite过滤且用MeOH(30mL)洗涤并浓缩。将CH3CN(15mL)添加至残余物中并浓缩。将此操作再重复2次，以得到呈灰白色固体状的化合物66(650mg，100％产率)。1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ 8.03-7.99(m,2H),4.24-4.18(m,1H),3.60(s,3H),3.31-3.22(m,5H), 2.46(t,2H,J＝6.8Hz),1.17(d,3H,J＝7.0Hz),1.12(d,3H,J＝6.9 Hz)。
Figure BDA0001239440410001682
步骤3：化合物67以与实施例7中60类似的方式制备。在硅胶快速色谱法之后，获得呈黄色固体状的化合物67(69mg，53％产率)。 LCMS＝4.843分钟(8分钟方法)。质量观察值(ESI+):962.25(M+H)。
Figure BDA0001239440410001683
步骤4：化合物68以与实施例1中化合物12类似的方式制备。在C18纯化后获得呈白色固体状的化合物68(11.5mg，19％产率)。 LCMS＝5.136分钟(8分钟方法)。质量观察值(ESI+):964.35(M+H)。
Figure BDA0001239440410001691
步骤5：化合物69以与实施例2中化合物22类似的方式制备。在通过短二氧化硅塞塞住之后，获得呈黄色固体状的粗化合物69(13 mg，100％产率)。LCMS＝5.640分钟(15分钟方法)。质量观察值(ESI+): 950.4(M+H)。
Figure BDA0001239440410001692
步骤6：化合物70以与实施例1中化合物14类似的方式制备。在C18纯化后，获得呈白色固体状的3-((S)-2-((S)-2-(3-((((S)-8-甲氧基-6-氧代-11,12,12a,13-四氢-6H-苯并[5,6][1,4]二氮杂
Figure BDA0001239440410001694
并[1,2-a]吲哚-9-基)氧基)甲基)-5-((((S)-8-甲氧基-6-氧代-12a,13-二氢-6H-苯并 [5,6][1,4]二氮杂
Figure BDA0001239440410001695
并[1,2-a]吲哚-9-基)氧基)甲基)苯甲酰胺基)丙酰胺基)丙酰胺基)丙酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯，即化合物70(5mg，35％产率)。LCMS＝6.138分钟(15分钟方法)。质量观察值(ESI+):1047.4 (M+H)。
实施例9.(12S,12aS)-9-((3-(2-(2-(2-(4-巯基-4-甲基戊酰胺基) 乙酰胺基)乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((((S)-8-甲氧基-6-氧代-11,12,12a,13- 四氢-6H-苯并[5,6][1,4]二氮杂
Figure BDA0001239440410001696
并[1,2-a]吲哚-9-基)氧基)甲基)苄基) 氧基)-8-甲氧基-6-氧代-11,12,12a,13-四氢-6H-苯并[5,6][1,4]二氮杂
Figure BDA0001239440410001697
并[1,2-a]吲哚-12-磺酸(化合物98)的合成
Figure BDA0001239440410001693
步骤1：将化合物4(2.0g，8.15mmol)和4-甲基-4-(甲基二硫基) 戊酸(1.743g，8.97mmol)溶解于无水DMF(27.2mL)中。添加EDC·HCl (1.719g，8.97mmol)和HOBt(1.249g，8.15mmol)，随后添加DIPEA (2.85mL，16.31mmol)。将混合物在室温下搅拌过夜。将反应物用二氯甲烷/甲醇(5:1)稀释且用饱和氯化铵、饱和碳酸氢钠和盐水洗涤。将其经硫酸钠干燥，过滤并汽提。将粗油状物与乙腈(3×)共沸，接着在高真空上在35℃下抽吸约1.5小时，以得到化合物91，不经进一步纯化即使用(3.44g，100％产率)。1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ8.18-8.09(m,3H),3.76-3.68(m,6H),2.41(s,3H),2.28-2.21(m,2H), 1.84-1.77(m,2H),1.41(s,9H),1.25(s,6H)。
Figure BDA0001239440410001701
步骤2：在室温下，在TFA(12.56mL，163mmol)和去离子水(0.65mL)中搅拌化合物91(3.44g，8.15mmol)3.5小时。将反应物用乙腈稀释且蒸发至干。用乙酸乙酯使粗固体形成浆液，过滤并用乙酸乙酯且接着二氯甲烷/甲醇(1:1)冲洗，以得到化合物92(2.98g，100％产率)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ8.19-8.08(m,3H),3.80-3.68 (m,6H),2.41(s,3H),2.28-2.20(m,2H),1.85-1.76(m,2H),1.25(s, 6H)。
Figure BDA0001239440410001702
步骤3：将化合物92(1.74g，4.76mmol)溶解于二氯甲烷(30.2mL) 和甲醇(15.11mL)中。添加N-乙氧基羰基-2-乙氧基-1,2-二氢喹啉 (2.243g，9.07mmol)和(5-氨基-1,3-亚苯基)二甲醇(0.695g，4.53mmol) 且在室温下搅拌反应过夜。移除溶剂且添加乙酸乙酯。使固体通过 Celite过滤且用乙酸乙酯且接着甲醇洗涤。蒸发滤液且通过硅胶色谱法(二氯甲烷/甲醇)纯化，以得到化合物93(569mg，25％产率)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ9.74(s,1H),8.24-8.15(m,3H),7.45(s, 2H),6.96(s,1H),5.17(t,2H,J＝5.6Hz),4.45(d,4H,J＝5.6Hz,),3.87 (d,2H,J＝6.0Hz,),3.77(d,2H,J＝6.0Hz,),3.73(d,2H,J＝5.6Hz,), 2.40(s,3H),2.28-2.21(m,2H),1.83-1.76(m,2H),1.24(s,6H)。
Figure BDA0001239440410001711
步骤4：将化合物93(305mg，0.609mmol)悬浮于无水DCM (5.992mL)中。添加无水DMF，直至溶液变均质(约2.5mL)。在丙酮 /干冰浴中将溶液冷却至-10℃。添加三乙胺(0.425mL，3.05mmol)，随后添加甲烷磺酸酐(274mg，1.523mmol)。将混合物在-10℃下搅拌1小时。将反应物用冰水淬灭且用冷乙酸乙酯/甲醇(20:1)萃取。将有机层用冰水洗涤且经无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩。将粗物质在高真空上干燥，以得到化合物94(380mg，95％产率)。LCMS＝4.2分钟(15 分钟方法)。MS(m/z):655.0(M-1)-。
Figure BDA0001239440410001712
步骤5：化合物95以与实施例7中化合物57类似的方式制备。将粗固体溶解于二氯甲烷/甲醇(10:1)中，用水洗涤且有机物经无水硫酸钠干燥。在真空中移除溶剂且通过硅胶色谱法(二氯甲烷/甲醇)纯化，以得到化合物95(445mg，42％产率，54％纯度)。LCMS＝6.64分钟(15分钟方法)。MS(m/z):1053.4(M+1)+和1051.3(M-1)-。
Figure BDA0001239440410001721
步骤6：将化合物95(445mg，0.423mmol)溶解于1,2-二氯乙烷 (2.82mL)中。在室温下添加三乙酰氧基硼氢化钠(80mg，0.359mmol) 并搅拌1小时。将反应物用二氯甲烷稀释且用饱和氯化铵洗涤。将有机层用盐水洗涤并干燥，以得到化合物95、96和96a的混合物(496mg)。将此粗混合物溶解于2-丙醇(39.17mL)和水(19.59mL)中。添加亚硫酸氢钠(245mg，2.35mmol)且在室温下搅拌3.5小时。将混合物冷冻并冻干，以得到蓬松白色固体，通过RPHPLC(C18，乙腈/水) 纯化，以得到化合物97(54mg，10％产率)和化合物96a(24mg，5％产率)。LCMS(化合物97)＝4.83分钟(15分钟方法)且LCMS(化合物 96a)＝8.05分钟(15分钟方法)。
Figure BDA0001239440410001722
步骤7：向化合物97(54mg，0.047mmol)于CH3CN(3.85mL) 中的搅拌溶液中添加新鲜制备的TCEP/pH 6.5缓冲溶液(TCEP·HCl (46.7mg)溶解于数滴去离子水中，随后逐滴添加饱和碳酸氢钠直至约 pH 6.5。将溶液用0.55mL的pH＝6.5，1M磷酸钠缓冲液)和甲醇(2.75 mL)稀释。将混合物在室温下搅拌3小时且接着冷冻并冻干。将固体通过RPHPLC(C18，乙腈/水)纯化，以得到(12S,12aS)-9-((3-(2-(2-(2-(4- 巯基-4-甲基戊酰胺基)乙酰胺基)乙酰胺基)乙酰胺基)-5-((((S)-8-甲氧基-6-氧代-11,12,12a,13-四氢-6H-苯并[5,6][1,4]二氮杂
Figure BDA0001239440410001723
并[1,2-a]吲哚 -9-基)氧基)甲基)苄基)氧基)-8-甲氧基-6-氧代-11,12,12a,13-四氢-6H- 苯并[5,6][1,4]二氮杂
Figure BDA0001239440410001724
并[1,2-a]吲哚-12-磺酸，即化合物98(2mg，4％产率)。LCMS＝4.32分钟(15分钟方法)。MS(m/z):1089.3(M-1)-。
实施例10.N-(2-((2-((2-((3,5-双((((S)-8-甲氧基-6-氧代 -11,12,12a,13-四氢-6H-苯并[5,6][1,4]二氮杂
Figure BDA0001239440410001732
并[1,2-a]吲哚-9-基)氧基)甲基)苯基)氨基)-2-氧代乙基)氨基)-2-氧代乙基)氨基)-2-氧代乙基)-4-巯基-4-甲基戊酰胺(化合物99)的合成
Figure BDA0001239440410001731
化合物99以与实施例9中化合物98类似的方式制备。在C18 纯化后，获得呈白色固体状的N-(2-((2-((2-((3,5-双((((S)-8-甲氧基-6- 氧代-11,12,12a,13-四氢-6H-苯并[5,6][1,4]二氮杂
Figure BDA0001239440410001733
并[1,2-a]吲哚-9-基) 氧基)甲基)苯基)氨基)-2-氧代乙基)氨基)-2-氧代乙基)氨基)-2-氧代乙基)-4-巯基-4-甲基戊酰胺，即化合物99(6.3mg，27％产率)。LCMS＝ 7.26分钟(15分钟方法)。MS(m/z):1033.5(M+Na)+。
实施例11.huMOV19-14的制备
使在50mM HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸)pH 8.5缓冲液和15％v/v DMA(N,N-二甲基乙酰胺)共溶剂中含有2.0mg/mL huMOV19抗体和8摩尔当量化合物14(用90:10DMA:水中的5倍过量的亚硫酸氢钠预处理)的反应物在25℃下缀合6小时。
反应后，使用NAP脱盐柱(Illustra Sephadex G-25DNA Grade,GE Healthcare)纯化所述缀合物且缓冲液交换成250mM甘氨酸、10mM 组氨酸、1％蔗糖、0.01％Tween-20、50μM亚硫酸氢钠配制缓冲液(pH 6.2)。在4℃下，利用Slide-a-Lyzer透析盒(ThermoScientific20,000 MWCO)以相同缓冲液透析20小时。
发现纯化的缀合物每个抗体连接有平均3.0个IGN91分子(通过 UV-Vis，对于化合物14，使用摩尔消光系数ε330nm＝15,280cm-1M-1和ε280nm＝30,115cm-1M-1，且对于huMOV19抗体，使用ε280nm＝ 201,400cm-1M-1)，具有90％单体(通过大小排阻色谱法)，<0.1％的未缀合化合物14(通过丙酮沉淀，反相HPLC分析)且最终蛋白质浓度为0.78mg/ml。通过凝胶芯片分析发现，缀合的抗体是>87％完整的。 MS光谱数据显示于图7A中。
实施例12.huMOV19-磺基-SPDB-98的制备
将在含10mM N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)的DMA中含有最终浓度为3.9mM的化合物98和3mM磺基-SPDB接头的原位混合物孵育 60分钟，随后将20倍过量的所得化合物98-磺基-SPDB-NHS添加至在15mM HEPES pH 8.5(90:10水:DMA)中含有4mg/ml huMOV19 抗体的反应物中。使所述溶液在25℃下缀合过夜。
反应后，使用NAP脱盐柱(Illustra Sephadex G-25DNA Grade,GE Healthcare)纯化所述缀合物且缓冲液交换成100mM精氨酸、20mM 组氨酸、2％蔗糖、0.01％Tween-20、50μM亚硫酸氢钠配制缓冲液(pH 6.2)。在4℃下，利用Slide-a-Lyzer透析盒(ThermoScientific10,000 MWCO)以相同缓冲液透析过夜。
发现纯化的缀合物每个抗体连接有平均3.7个分子的化合物98 (通过SEC，对于化合物98，使用摩尔消光系数ε330nm＝15,484cm-1M-1和ε280nm＝30,115cm-1M-1，且对于huMOV19抗体，使用ε280nm＝201,400 cm-1M-1)，具有99％单体(通过大小排阻色谱法)且最终蛋白质浓度为 0.18mg/ml。MS光谱数据显示于图7A中。
实施例13.huMOV19-35的制备
使在50mM HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸)pH 8.5缓冲液和15％v/v DMA(N,N-二甲基乙酰胺)共溶剂中含有2.5mg/mL huMOV19抗体和5摩尔当量化合物35(用90:10DMA:水中的5倍过量的亚硫酸氢钠预处理)的反应物在25℃下缀合6小时。
反应后，使用NAP脱盐柱(Illustra Sephadex G-25DNA Grade,GE Healthcare)纯化所述缀合物且缓冲液交换成250mM甘氨酸、10mM 组氨酸、1％蔗糖、0.01％Tween-20、50μM亚硫酸氢钠配制缓冲液(pH 6.2)。在室温下，利用Slide-a-Lyzer透析盒(ThermoScientific 10,000 MWCO)以相同缓冲液透析8小时。
发现纯化的缀合物每个抗体连接有平均2.9个分子的化合物35 (通过UV-Vis，对于IGN128，使用摩尔消光系数ε330nm＝15,484cm-1M-1和ε280nm＝30,115cm-1M-1，且对于huMOV19抗体，使用ε280nm＝201,400 cm-1M-1)，具有97％单体(通过大小排阻色谱法)，<1％的未缀合化合物 35(通过丙酮沉淀，反相HPLC分析)且最终蛋白质浓度为1.4mg/ml。 MS光谱数据显示于图7A中。
实施例14.huMOV19-63的制备
使在50mM HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸)pH 8.5缓冲液和15％v/v DMA(N,N-二甲基乙酰胺)共溶剂中含有2.0mg/mL huMOV19抗体和7摩尔当量化合物63(用90:10DMA:水中的5倍过量的亚硫酸氢钠预处理)的反应物在25℃下缀合6小时。
反应后，使用NAP脱盐柱(Illustra Sephadex G-25DNA Grade,GE Healthcare)纯化所述缀合物且缓冲液交换成250mM甘氨酸、10mM 组氨酸、1％蔗糖、0.01％Tween-20、50μM亚硫酸氢钠配制缓冲液(pH 6.2)。在4℃下，利用Slide-a-Lyzer透析盒(ThermoScientific20,000 MWCO)以相同缓冲液透析20小时。
发现纯化的缀合物每个抗体连接有平均2.7个分子的化合物63 (通过UV-Vis，对于IGN131，使用摩尔消光系数ε330nm＝15,280cm-1M-1和ε280nm＝30,115cm-1M-1，且对于huMOV19抗体，使用ε280nm＝201,400 cm-1M-1)，具有99％单体(通过大小排阻色谱法)，<0.1％的未缀合化合物63(通过丙酮沉淀，反相HPLC分析)且最终蛋白质浓度为1.6 mg/ml。通过凝胶芯片分析发现，缀合的抗体是>90％完整的。MS光谱数据显示于图7B中。
实施例15.huMOV19-80的制备
使在50mM HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸)pH 8.5缓冲液和15％v/v DMA(N,N-二甲基乙酰胺)共溶剂中含有2.0mg/mL huMOV19抗体和7摩尔当量化合物80(用溶于90:10DMA:水中的5 倍过量的亚硫酸氢钠预处理)的反应物在25℃下缀合6小时。
反应后，使用NAP脱盐柱(Illustra Sephadex G-25DNA Grade,GE Healthcare)纯化所述缀合物且缓冲液交换成250mM甘氨酸、10mM 组氨酸、1％蔗糖、0.01％Tween-20、50μM亚硫酸氢钠配制缓冲液(pH 6.2)。在4℃下，利用Slide-a-Lyzer透析盒(ThermoScientific20,000 MWCO)以相同缓冲液透析20小时。
发现纯化的缀合物每个抗体连接有平均2.5个分子的化合物80 (通过UV-Vis，对于化合物80，使用摩尔消光系数ε330nm＝15,280 cm-1M-1和ε280nm＝30,115cm-1M-1，且对于huMOV19抗体，使用ε280nm＝ 201,400cm-1M-1)，具有99％单体(通过大小排阻色谱法)，<0.1％的未缀合化合物80(通过丙酮沉淀，反相HPLC分析)且最终蛋白质浓度为2.4mg/ml。通过凝胶芯片分析发现，缀合的抗体是>90％完整的。
实施例16.huMOV19-90的制备
使在15mM HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸)pH 8.5缓冲液和15％v/v DMA(N,N-二甲基乙酰胺)共溶剂中含有2.0mg/mL huMOV19抗体和3.9摩尔当量化合物90(在25℃用95:5DMA:50mM 琥珀酸酯pH 5.5中的5倍过量的亚硫酸氢钠预处理4小时)的反应物在25℃下缀合4小时。反应后，使用NAP脱盐柱(Illustra Sephadex G-25DNA Grade,GEHealthcare)纯化所述缀合物且缓冲液交换成10 mM琥珀酸酯、50mM氯化钠、8.5％w/v蔗糖、0.01％Tween-20、50 μM亚硫酸氢钠配制缓冲液(pH 6.2)。利用Slide-a-Lyzer透析盒(ThermoScientific 30,000MWCO)在室温下以相同缓冲液透析4小时且接着在4℃下透析过夜。
发现纯化的缀合物的最终蛋白质浓度是1.8mg/ml且每个抗体连接有平均2.7个分子的化合物90(通过UV-Vis，对于IGN152，使用摩尔消光系数ε330nm＝15,280cm-1M-1和ε280nm＝30,115cm-1M-1，且对于huMOV19抗体，使用ε280nm＝201,400cm-1M-1)，具有98.3％单体(通过大小排阻色谱法)；和<1.1％的未缀合化合物90(通过丙酮沉淀，反相HPLC分析)。MS光谱数据显示于图7B中。
实施例17.huMOV19-49的制备
使在50mM HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸)pH 8.5缓冲液和10％v/v DMA(N,N-二甲基乙酰胺)共溶剂中含有2.0mg/mL huMOV19抗体和5摩尔当量化合物49(用溶于90:10DMA:水中的5 倍过量的亚硫酸氢钠预处理)的反应物在25℃下缀合4小时。
反应后，使用NAP脱盐柱(Illustra Sephadex G-25DNA Grade,GE Healthcare)纯化所述缀合物且缓冲液交换成250mM甘氨酸、10mM 组氨酸、1％蔗糖、0.01％Tween-20、50μM亚硫酸氢钠配制缓冲液(pH 6.2)。在室温下，利用Slide-a-Lyzer透析盒(ThermoScientific 20,000 MWCO)以相同缓冲液透析4小时。
发现纯化的缀合物每个抗体连接有平均2.8个分子的化合物49 (通过UV-Vis，对于化合物49，使用摩尔消光系数ε330nm＝15,280 cm-1M-1和ε280nm＝30,115cm-1M-1，且对于huMOV19抗体，使用ε280nm＝ 201,400cm-1M-1)，具有94％单体(通过大小排阻色谱法)，<0.1％的未缀合化合物49(通过丙酮沉淀，反相HPLC分析)且最终蛋白质浓度为1.5mg/ml。通过凝胶芯片分析发现，缀合的抗体是>95％完整的。 MS光谱数据显示于图7C中。
实施例18.huMOV19-磺基-SPDB-99的制备
将在含10mM N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)的DMA中含有最终浓度为1.95mM的化合物99和1.5mM磺基-SPDB接头的原位混合物孵育20分钟，随后用4mM马来酰亚胺基丙酸MPA封端。将6倍过量的所得99-磺基-SPDB-NHS添加至在15mM HEPES pH 8.5(82:18 水:DMA)中含有2.5mg/ml huMOV19抗体的反应物中。使所述溶液在25℃下缀合过夜。
反应后，使用NAP脱盐柱(Illustra Sephadex G-25DNA Grade,GE Healthcare)纯化所述缀合物且缓冲液交换成20mM组氨酸、50mM氯化钠、8.5％蔗糖、0.01％Tween-20、50μM亚硫酸氢钠配制缓冲液(pH 6.2)。在4℃下，利用Slide-a-Lyzer透析盒(ThermoScientific10,000 MWCO)以相同缓冲液透析过夜。
发现纯化的缀合物每个抗体连接有平均1.6个分子的化合物99 (通过UV/Vis，对于化合物99，使用摩尔消光系数ε330nm＝15,484 cm-1M-1和ε280nm＝30,115cm-1M-1，且对于huMOV19抗体，使用ε280nm＝ 201,400cm-1M-1)，具有99％单体(通过大小排阻色谱法)且最终蛋白质浓度为0.59mg/ml。MS光谱数据显示于图7C中。
实施例19.huMOV19-70的制备
使在50mM HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸)pH 8.5缓冲液和10％v/v DMA(N,N-二甲基乙酰胺)共溶剂中含有2.0mg/mL huMOV19抗体和5摩尔当量化合物70(用溶于90:10DMA:水中的5 倍过量的亚硫酸氢钠预处理)的反应物在25℃下缀合4小时。
反应后，使用NAP脱盐柱(Illustra Sephadex G-25DNA Grade,GE Healthcare)纯化所述缀合物且缓冲液交换成20mM组氨酸、100mM 精氨酸、2％蔗糖、0.01％Tween-20、50μM亚硫酸氢钠配制缓冲液(pH 6.2)。纯化后，在4℃下，利用Slide-a-Lyzer透析盒(ThermoScientific 20,000MWCO)以相同缓冲液透析18小时。
发现纯化的缀合物每个抗体连接有平均3.0个分子的化合物70 (通过UV-Vis，对于化合物70，使用摩尔消光系数ε330nm＝15,484 cm-1M-1和ε280nm＝30,115cm-1M-1，且对于huMOV19抗体，使用ε280nm＝ 201,400cm-1M-1)，具有94％单体(通过大小排阻色谱法)，<0.1％的未缀合化合物70(通过丙酮沉淀，反相HPLC分析)且最终蛋白质浓度为1.3mg/ml。
实施例20.huMOV19-23的制备
使在50mM HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸)pH 8.5缓冲液和15％v/v DMA(N,N-二甲基乙酰胺)共溶剂中含有2.5mg/mL huMOV19抗体和4摩尔当量化合物23(用90:10DMA:水中的5倍过量的亚硫酸氢钠预处理)的反应物在25℃下缀合6小时。
反应后，使用NAP脱盐柱(Illustra Sephadex G-25DNA Grade,GE Healthcare)纯化所述缀合物且缓冲液交换成250mM甘氨酸、10mM 组氨酸、1％蔗糖、0.01％Tween-20、50μM亚硫酸氢钠配制缓冲液(pH 6.2)。在室温下，利用Slide-a-Lyzer透析盒(ThermoScientific 10,000 MWCO)以相同缓冲液透析8小时。
发现纯化的缀合物每个抗体连接有平均2.8个分子的化合物23 (通过UV-Vis，对于化合物23，使用摩尔消光系数ε330nm＝15,484 cm-1M-1和ε280nm＝30,115cm-1M-1，且对于huMOV19抗体，使用ε280nm＝ 201,400cm-1M-1)，具有98％单体(通过大小排阻色谱法)，<3％的未缀合化合物23(通过丙酮沉淀，反相HPLC分析)且最终蛋白质浓度为 1.3mg/ml。MS光谱数据显示于图7D中。
实施例21.有关huMOV19-14、huMOV19-90和huMOV19-107 缀合物的结合亲和力的流式细胞术测定
在4℃下，在96孔板(Falcon，圆底)中，一式两份用FACS缓冲液(1％BSA，1x PBS)稀释起始浓度为3×10-8M的每孔100μl缀合物 huMOV19-14、huMOV19-90或huMOV19-107或抗体huMOV19且以FACS缓冲液进行3倍连续稀释。在PBS中将在补充有热灭活10％ FBS(LifeTechnologies)、0.1mg/ml/ml庆大霉素(gentamycin)(Life Technologies)和0.2IU牛胰岛素/ml(Sigma)的RPMI-1640(Life Technologies)中生长的T47D细胞(人乳房肿瘤)洗涤一次，且用 Versene(Life Technologies)移除。将T47D细胞再悬浮于生长培养基 (参见上文)中以中和versene，并在Coulter计数器上计数。接着在冷 FACS缓冲液中洗涤细胞两次，在每次洗涤之间以1200rpm离心5分钟。将100μl/ml的2×104个细胞/孔添加至含有缀合物、抗体或仅含 FACS缓冲液的孔中并在4℃下孵育2小时。孵育之后，如先前所述对细胞进行离心，且在每孔200μl的冷FACS缓冲液中洗涤一次。接着，在4℃下用每孔200μl缀合FITC的山羊抗人IgG-Fcγ第二抗体(所包括的对照物为未染色细胞和仅用第二抗体染色的所述细胞)对细胞染色，保持40分钟，离心且在每孔200μl的冷PBS-D中洗涤一次。将细胞固定于每孔200μl的1％甲醛/PBS-D中且在4℃下储存。储存之后，使用流式细胞术，在FACS Calibur(BD Biosciences)上检测缀合物或抗体的细胞表面染色。使用GraphPad Prism将几何平均值对缀合物或抗体的对数浓度作图，且经由非线性4参数逻辑回归分析 (non-linear 4-parameter logistic regression analysis)计算EC50。
对于huMOV19-90缀合物重复所述结合测定且数据显示于图 15B中。
如图1、图15A、图15B和图20中所示，在流式细胞术中所述缀合物以与未缀合抗体类似的方式结合至表达靶抗原的T47D细胞的表面，由此证实，结合不受缀合过程的影响。
实施例22.关于huMOV19-14缀合物的细胞毒性测定
在环境温度下，在96孔板(Corning，平底)中，一式三份用补充有热灭活10％FBS(Life Technologies)和0.1mg/ml庆大霉素(Life Technologies)的RPMI-1640(LifeTechnologies)稀释起始浓度为 3.5×10-9M至3.5×10-8M的每孔100μl huMOV19-14缀合物，并在上述培养基中进行3倍连续稀释。在PBS中洗涤在补充有热灭活10％ FBS(LifeTechnologies)和0.1mg/ml庆大霉素(Life Technologies)的 EMEM(ATCC)中生长的KB细胞(口腔表皮肿瘤)一次，并用0.05％胰蛋白酶-EDTA(Life Technologies)移除。将KB细胞再悬浮于生长培养基(参见上文)中以中和胰蛋白酶，并在Coulter计数器上计数。将100 μl/ml的1×103个细胞/孔添加至含有缀合物或仅含培养基的孔中，且在37℃且含5％CO2的恒温箱中，在存在和不存在1μM阻断性抗 FOLR1抗体(huMOV19)情况下孵育5天。总体积为每孔200μl。孵育之后，通过添加每孔20μl WST-8(Dojindo)并使其显影2小时来分析细胞活力。在板读取器上，在450和620nm下读取吸光度。用450nm 下的吸光度减去620nm下的吸光度。进一步用校正的吸光度减去仅含培养基的孔中的背景值且以Excel计算未处理细胞的存活分数 (SF)。使用Graph Pad Prism创建ADC浓度(M)随SF变化的XY曲线。
如图2中所示，所述缀合物对KB细胞具有高效力且IC50值为 4×10-12M。添加过量未缀合抗体使细胞毒性作用显著降低，从而表现出抗原特异性。
实施例23.关于huMOV19-14和huMOV19-90缀合物的旁观者细胞毒性测定
在96孔板(Falcon，圆底)中，一式六份用补充有热灭活的10％FBS (LifeTechnologies)、0.1mg/ml庆大霉素(Life Technologies)和βME (Life Technologies)的RPMI-1640(Life Technologies)中稀释浓度介于1 e-10M至4e-10M之间的每孔100μlhuMOV19-14或huMOV19-90。在Coulter计数器上对表达重组FOLR1(FR1#14)或无表达载体(亲本) 的300.19细胞(小鼠)进行计数。将50μl/ml每孔1000个FR1#14细胞添加至含有所述缀合物或仅含培养基的孔中，将50μl/ml每孔2000 个亲本细胞添加至含有所述缀合物或仅含培养基的孔中且将FR1#14 与亲本细胞一起添加至含有所述缀合物或仅含培养基的孔中。所有板在含5％CO2的37℃恒温箱中孵育4天。总体积为每孔150μl。孵育之后，通过添加每孔75μl Cell Titer Glo(Promega)且使其显影45分钟来分析细胞活力。在光度计上读取发光度且自所有值减去仅含培养基的孔的背景值。使用Graph Pad Prism绘制每一细胞处理的平均值的条形图。
如图3中所示，缀合物huMOV19-14对相邻抗原阴性细胞表现出较弱的旁观者细胞毒性作用。
如图13中所示，缀合物huMov19-90展现较强的旁观者杀死活性。
实施例24.关于huMy9-6-14缀合物的体外细胞毒性测定
将缀合物稀释液添加至96孔板中在适当生长培养基中含有每孔 2×103至1×104个细胞的孔中。在每一测定板中包括含有细胞和培养基但无测试化合物的对照孔，以及仅含培养基的孔。在含有6％CO2的潮湿氛围中在37℃下孵育所述板四至六天。接着将10％v/vWST-8 试剂(Dojindo Molecular Technologies,Gaithersburg,MD)添加至孔中，且所述板在37℃下孵育2至6小时。接着，在板读取器分光光度计上以双波长模式450nm/650nm测量吸光度，且减去在650nm下的吸光度(由细胞引起的非特异性光散射)。通过首先针对培养基背景吸光度校正，且接着用每一值除以对照孔(未处理孔)中所述值的平均值来计算每个孔中细胞的表观存活分数。
如图3中所示，所述缀合物对各种抗原阳性癌细胞具有高效力；而抗原阴性L-540细胞当暴露于所述缀合物时仍保持活力。
实施例25.关于huMy9-6-14缀合物的旁观者细胞毒性测定
进行初步测试以测定对抗原阴性RADA-1细胞无细胞毒性但杀死所有抗原阳性KARA细胞的huMy9-6-14浓度。将RADA-1(每孔 500个细胞)和KARA(每孔500、1000、2000、4000个细胞)接种于 96孔圆底板中。在细胞培养基(补充有10％热灭活胎牛血清和50mg/L庆大霉素的RPMI1640培养基)中制备huMy9-6-14的稀释液且将其添加至细胞中。在37℃下孵育板4天，且使用WST-8试剂(Dojindo Molecular Technologies,Inc.)测定每个孔中的细胞活力。为了测试缀合物的旁观者效力，将RADA-1细胞与KARA细胞以不同比率((500个RADA-1细胞加无KARA细胞；500个RADA-1细胞加500个KARA 细胞；500个RADA-1细胞加1000个KARA细胞；500个RADA-1 细胞加2000个KARA细胞；500个RADA-1细胞加4000个KARA 细胞)混合在一起，且将其接种于96孔圆底板中。接着，将1.0e-9M 或5.0e-10M huMy9-6-14(对RADA-1细胞无毒但杀死所有KARA细胞的浓度)添加至细胞混合物中。在37℃下孵育板4天，且使用WST-8 试剂(Dojindo Molecular Technologies,Inc.)测定每个孔中RADA-1细胞的活力。在板读取器分光光度计上以双波长模式450nm/650nm测量吸光度，且减去在650nm下的吸光度(由细胞引起的非特异性光散射)。
如图5中所示，所述缀合物对相邻抗原阴性细胞表现出旁观者杀死作用。
实施例26.单剂量的huMOV19-80和huMOV19-90针对雌性 SCID小鼠中NCI-H2110NSCLC异种移植物的抗肿瘤活性
自Charles River Laboratories获得6周龄的雌性CB.17 SCID小鼠。通过在右侧腹中皮下注射，用悬浮于0.1ml 50％基质胶/无血清培养基中的1×107个NCI-H2110肿瘤细胞接种小鼠。当肿瘤体积达到约100mm3(接种后第7天)时，基于肿瘤体积将动物随机分入5个组中，每组6只小鼠。第1天(接种后第8天)，动物接受单次静脉内施用的媒介物对照物(0.2ml/小鼠)、基于huMOV19-80或huMOV19-90 浓度的5μg/kg和25μg/kg的huMOV19-80或huMOV19-90。 huMOV19是选择性结合至叶酸受体1(FOLR1)的人源化单克隆抗体。
每周两到三次使用测径器以三个尺寸测量肿瘤大小。肿瘤体积使用式V＝长度×宽度×高度×1/2计算，以mm3表示。当肿瘤体积减小50％或更多时，认为小鼠具有部分消退(PR)，当无法检测到明显肿瘤时，认为具有完全肿瘤消退(CR)。肿瘤体积通过StudyLog软件测定。
肿瘤生长抑制(T/C值)使用下式测定：
T/C(％)＝治疗组的中值肿瘤体积/对照组的中值肿瘤体积× 100。
当媒介物对照组的肿瘤体积达到预定大小1000mm3时，同时测定治疗组(T)和媒介物对照组(C)的肿瘤体积。测定每一治疗组的每日中值肿瘤体积，包括无肿瘤小鼠(0mm3)。根据NCI标准，T/C≤42％是抗肿瘤活性的最低水准。T/C<10％被视为高抗肿瘤活性水准。
如图6中所示，huMOV19-90缀合物在5μg/kg和25μg/kg剂量下具有高活性；而huMOV19-80缀合物在25μg/kg剂量下具有高活性。
实施例27.huML66-90的制备
使在15mM HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸)pH 8.5缓冲液和10％v/v DMA(N,N-二甲基乙酰胺)共溶剂中含有2.0mg/mL huML66抗体、抗EGFR抗体(参见WO 2012/058592，以引用的方式整体并入本文)和3.5摩尔当量化合物90(在25℃用溶于90:10 DMA:50mM琥珀酸酯pH 5.5中的5倍过量的亚硫酸氢钠预处理4小时)的反应物在25℃下缀合4小时。反应后，使用NAP脱盐柱(Illustra Sephadex G-25 DNA Grade,GE Healthcare)纯化所述缀合物且缓冲液交换成20mM组氨酸、50mM氯化钠、8.5％w/v蔗糖、0.01％ Tween-20、50μM亚硫酸氢钠配制缓冲液(pH 6.2)。利用Slide-a-Lyzer 透析盒(ThermoScientific 30,000MWCO)在室温下以相同缓冲液透析 4小时且接着在4℃下透析过夜。
发现纯化的缀合物的最终蛋白质浓度为0.9mg/ml且每个抗体连接有平均2.7个分子的化合物90(通过UV-Vis，对于化合物90，使用摩尔消光系数ε330nm＝15,280cm-1M-1和ε280nm＝30,115cm-1M-1，且对于huML66抗体，使用ε280nm＝205,520cm-1M-1)，具有99.1％单体 (通过大小排阻色谱法)；和<1％的未缀合IGN149(通过丙酮沉淀，反相HPLC分析)。MS光谱数据显示于图8中。
实施例28.关于huML66-90缀合物的体外细胞毒性测定
使用体外细胞毒性测定测量huML66-90缀合物抑制细胞生长的能力。将靶细胞以每孔1-2,000个细胞接种于100μL完全RPMI培养基(RPMI-1640、10％胎牛血清、2mM谷氨酰胺、1％青霉素-链霉素，所有试剂均来自Invitrogen)中。使用3倍连续稀释在完全RPMI培养基中稀释抗体，且每孔添加100μL。最终浓度通常在3×10-8M至4.6 ×10-12M范围内。在37℃下，在含5％CO2的潮湿恒温箱中孵育细胞5至6天。通过比色WST-8测定(DojindoMolecular Technologies,Inc., Rockville,MD,US)测定残留细胞的活力。WST-8通过活细胞中的脱氢酶还原成可溶于组织培养基中的橙色甲臜产物。所产生的甲臜量与活细胞数量成正比。将WST-8添加至10％最终体积中且在37℃下，在含5％CO2的潮湿恒温箱中再孵育板2-4小时。通过在多孔板读取器中测量在450nm下的吸光度(A450)来分析板。自所有值中减去仅含培养基和WST-8的孔的背景A450吸光度。通过用每一经处理样品值除以含未处理细胞的孔的平均值来计算活力百分比。活力百分比＝ 100*(A450经处理样品–A450背景)/(A450未处理样品–A450背景)。对于每一处理，以半对数曲线绘制活力百分比值针对抗体浓度的曲线。通过非线性回归生成剂量-反应曲线且使用GraphPad Prism (GraphPadsoftware,San Diego,CA)计算每一曲线的EC50值。
体外细胞毒性活性
在存在和不存在过量未缀合抗体情况下评价huML66-90缀合物的体外细胞毒性且将其与非特异性huIgG-90缀合物在表达EGFR细胞中的活性相比较，且由典型细胞毒性测定得到的结果示于图9中。 huML66-90缀合物引起Detroit-562SCC-HN细胞的特异性细胞杀死作用，且EC50值为16pM。过量未缀合抗体的存在使活性显著降低且产生的EC50值为约2nM。类似地，含有非结合性huIgG对照抗体的huIgG-90缀合物引起细胞杀死作用且EC50值为约8nM。
同样，huML66-90缀合物引起NCI-H292 NSCLC细胞的特异性细胞杀死作用，且EC50值为12pM。过量未缀合抗体的存在使活性显著降低且产生的EC50值为约2nM。类似地，含有非结合性huIgG 对照抗体的huIgG-90缀合物引起细胞杀死作用且EC50值为约8nM。
类似地，还观察到对于NCI-H1703细胞的特异性细胞杀死作用。
表1.
Figure BDA0001239440410001861
实施例29.huMOV19-90的体外细胞毒性活性
在环境温度下，在96孔板(Corning，平底)中，一式三份用补充有热灭活10％FBS(Life Technologies)和0.1mg/ml庆大霉素(Life Technologies)的RPMI-1640(LifeTechnologies)分别稀释起始浓度为 3.5e-9M至3.5e-8M的每孔100μl huMOV19-90缀合物，并在上述培养基中进行3倍连续稀释。在PBS中洗涤在补充有热灭活10％FBS (LifeTechnologies)和0.1mg/ml庆大霉素(Life Technologies)的EMEM (ATCC)中生长的KB细胞(口腔表皮肿瘤)一次，并用0.05％胰蛋白酶 -EDTA(Life Technologies)移除。所测试的其他细胞是在补充有热灭活 10％FBS(Life Technologies)和0.1mg/ml庆大霉素(LifeTechnologies) 的RPMI-1640(LifeTechnologies)中生长的NCI-H2110(NSCLC)和 T47D(乳房上皮细胞)。T47D培养基还补充有0.2IU/ml牛胰岛素。所有细胞再悬浮于生长培养基(参见上文)中以中和胰蛋白酶，并在血细胞计数器上计数。将100μl/ml的1000个KB细胞/孔或2000个T47D 和NCI-H2110细胞/孔添加至含有缀合物或仅含培养基的孔中，且在 37℃且含5％CO2的恒温箱中，在存在和不存在1μM阻断性抗FOLR1 抗体(huMOV19)情况下孵育5天。总体积为每孔200μl。在KB细胞上每一缀合物的起始浓度是3.5e-9M，且对于T47D细胞和 NCI-H2110细胞，每一缀合物的起始浓度是3.5e-8M。孵育之后，通过添加每孔20μl WST-8(Dojindo)并使其显影2小时来分析细胞活力。在板读取器上，在450和620nm下读取吸光度。用450nm下的吸光度减去620nm下的吸光度。进一步用经校正的吸光度减去仅含培养基的孔中的背景值且以Excel计算未处理细胞的存活分数(SF)。使用Graph Pad Prism创建ADC浓度(M)随SF变化的XY曲线。
如图10-12和表2中所示，huMOV19-90缀合物对KB细胞、T47D 细胞和NCI-H2110细胞具有高效力。添加过量未缀合抗体使细胞毒性作用显著降低，从而表现出抗原特异性。
表2.
Figure BDA0001239440410001871
在另一实验中，使用基于WST-8的体外细胞毒性测定来测量缀合物抑制细胞生长的能力。用在适当细胞培养基中各种浓度的缀合物处理96孔板中的细胞(通常每孔1×103个)，且总体积为0.2ml。在每一分析板中包括含有细胞和培养基但无测试化合物的对照孔，以及仅含培养基的孔。在含有6％CO2的潮湿氛围中在37℃下孵育所述板4 至6天。接着将WST-8试剂(10％，体积/体积；Dojindo Molecular Technologies)添加至孔中，且取决于细胞系，将所述板在37℃下孵育 2至6天。接着，在板读取器分光光度计上以双波长模式450nm/620 nm测量吸光度，且减去在620nm下的吸光度(由细胞引起的非特异性光散射)。利用所得OD450值，使用GraphPad Prism v4(GraphPad software,San Diego,CA)计算细胞的表观存活分数。通过首先针对培养基背景吸光度校正，且接着用每一值除以对照孔(未处理孔)中所述值的平均值来计算每个孔中细胞的表观存活分数。使用S形曲线拟合，在GraphPad Prism中利用可变斜率，通过非线性回归来生成剂量反应曲线。通过所述软件产生IC50(抑制浓度50％)。
如图21和表3中所示，所述缀合物针对所测试的细胞系Ishikawa (子宫内膜癌)、KB(子宫颈癌)和NCI-H2110(非小细胞肺癌)具有活性。细胞杀死活性具有FOLR1依赖性，因为过量的未缀合huMOV19抗体(1μM)使所述缀合物的效力明显降低(20至200倍)。
表3.
Figure BDA0001239440410001881
实施例30.单剂量的huMOV19-90缀合物针对雌性SCID小鼠中NCI-H2110 NSCLC异种移植物的抗肿瘤活性
自Charles River Laboratories获得6周龄的雌性CB.17 SCID小鼠。通过在右侧腹中皮下注射，用悬浮于0.1ml 50％基质胶/无血清培养基中的1×107个NCI-H2110肿瘤细胞接种小鼠。当肿瘤体积达到约100mm3(接种后第7天)时，基于肿瘤体积将动物随机分入4个组中，每组6只小鼠。第1天(接种后第8天)，动物接受单次静脉内施用的媒介物对照物(每只小鼠0.2ml)，或基于化合物90浓度的1 μg/kg、3μg/kg和5μg/kg的huMOV19-90。
每周两到三次使用测径器以三个尺寸测量肿瘤大小。肿瘤体积使用式V＝长度×宽度×高度×1/2计算，以mm3表示。当肿瘤体积减小50％或更多时，认为小鼠具有部分消退(PR)，当无法检测到明显肿瘤时，认为具有完全肿瘤消退(CR)。肿瘤体积通过StudyLog软件测定。
肿瘤生长抑制(T/C值)使用下式测定：
T/C(％)＝治疗组的中值肿瘤体积/对照组的中值肿瘤体积× 100。
当媒介物对照组的肿瘤体积达到预定大小1000mm3时，同时测定治疗组(T)和媒介物对照组(C)的肿瘤体积。测定每一治疗组的每日中值肿瘤体积，包括无肿瘤小鼠(0mm3)。根据NCI标准，T/C≤42％为抗肿瘤活性的最低水准。T/C<10％被视为高抗肿瘤活性水准。
如图14中所示，huMOV19-90缀合物在3μg/kg剂量下具有活性且在5μg/kg剂量下具有高活性。
实施例31.化合物107的合成
Figure BDA0001239440410001891
步骤1：将化合物82(500mg，2.31mmol)、4-甲基-4-(甲基二硫基)戊酸(449mg，2.31mmol)、EDC·HCl(465mg，2.43mmol)、HOBt (354mg，2.31mmol)和DIPEA(0.81mL，4.62mmol)溶解于DMF(7.7 mL)中且搅拌过夜，直至反应完成。将反应物用乙酸乙酯稀释且用饱和碳酸氢钠、饱和氯化铵洗涤且用水洗涤两次。干燥有机物并真空浓缩，以得到化合物100(875mg，96％产率)，其直接用于下一步骤中。1H NMR(400MHz,DMSO):δ8.15(d,1H,J＝6.8Hz),8.02(d,1H,J＝ 6.8Hz),4.26-4.33(m,1H),4.03-4.12(m,1H),2.41(s,3H),2.18-2.22(m, 2H),1.76-1.80(m,2H),1.39(s,9H),1.24(s,6H),1.24(d,3H,J＝7.2 Hz),1.19(d,3H,J＝7.2Hz)。
Figure BDA0001239440410001901
步骤2：将TFA(2.6ml)和水(0.17ml)添加至净化合物100(875 mg，2.23mmol)中且在室温下搅拌，直至反应完成。稀释反应物且使其与乙腈共沸，以得到粘性油状物。接着将其用乙腈和水稀释，冷冻并冻干，以得到呈灰白色固体状的化合物101(1g，100％产率)，不经进一步纯化即使用。LCMS＝3.99分钟(8分钟方法)。MS(m/z):337.0 (M+1)+。
Figure BDA0001239440410001902
步骤3：将化合物101(923mg，1.65mmol)和(5-氨基-1,3-亚苯基) 二甲醇(240mg,1.57mmol)溶解于DMF(5.2ml)中。在室温下添加 EDC·HCl(601mg，3.13mmol)和DMAP(96mg，0.78mmol)且在室温下搅拌反应过夜。将反应物用乙酸乙酯稀释且用水洗涤三次。干燥有机层，真空浓缩且通过硅胶色谱法(DCM/MeOH)纯化，以得到化合物 102(150mg，20％产率)。LCMS＝3.91分钟(8分钟方法)。MS(m/z): 472.2(M+1)+。1H NMR(400MHz,MeOD):δ9.69(s,1H),8.21(d,1H, J＝6.8Hz),8.18(d,1H,J＝6.8Hz),7.52(s,2H),7.12(s,1H),4.58(s,4H),4.44-4.48(m,1H),4.29-4.32(m,1H),3.34(s,2H),2.38(s,3H), 2.34-2.40(m,2H),1.90-1.95(m,2H),1.43(d,3H,J＝7.2Hz),1.36(d, 3H,J＝7.2Hz),1.30(s,6H)。
Figure BDA0001239440410001911
步骤4：化合物102以与实施例9中化合物94类似的方式制备。将粗物质在高真空下干燥，以得到化合物103(174mg，101％产率)，其不经进一步纯化即直接用于下一步骤中。LCMS＝4.95分钟(8分钟方法)。
Figure BDA0001239440410001912
步骤5：化合物103以与实施例7中化合物57类似的方式制备。粗固体含有化合物104(203mg，44％产率，60％纯度)，其不经进一步纯化即使用。LCMS＝5.68分钟(8分钟方法)。MS(m/z):1024.3(M+ 1)+。
Figure BDA0001239440410001913
步骤6：化合物104以与实施例1中化合物12类似的方式制备。将粗残余物通过RPHPLC(C18管柱，CH3CN/H2O，梯度50％至65％) 纯化，以得到呈固体状的单亚胺化合物105(22mg，16％产率，90％纯度)。LCMS＝6.00分钟(8分钟方法)。MS(m/z):1027.3(M+1)+。
Figure BDA0001239440410001921
步骤7：在室温下，将化合物106溶解于THF(0.5mL)和ACN (0.23mL)中。接着以与实施例9中化合物98类似的方式制备。搅拌混合物直至完成且接着用DCM和DI水稀释。将有机层用盐水洗涤，干燥并过滤。浓缩滤液以得到粗硫醇，即化合物106(21mg，100％产率)，其直接用于下一反应中。LCMS＝5.67min(8分钟方法)。MS (m/z):980.4(M+1)+。
Figure BDA0001239440410001922
步骤8：将化合物106(21mg，0.021mmol)悬浮于2-丙醇(1428μl) 和水(714μl)中。添加偏亚硫酸氢钠(22.30mg，0.214mmol)且在室温下搅拌反应直至完成。将反应混合物用乙腈/水稀释，冷冻并冻干。所得白色粉末通过RPHPLC(C18管柱，CH3CN/H2O，梯度20％至40％) 纯化且收集所需级分并冻干，以得到化合物107(5.3mg，23％产率)。LCMS＝5.67分钟(8分钟方法)。MS(m/z):1060.2(M-1)-。
实施例32.huMOV19-磺基-SPDB-107(或huMOV19-107)缀合物的制备
将在琥珀酸盐缓冲液(pH 5):DMA(30:70)中含有最终浓度为1.95 mM的化合物107和1.5mM磺基-SPDB接头的原位混合物孵育6小时，随后将7倍过量的107-磺基-SPDB-NHS添加至在15mM HEPES pH 8.5(87:13，水:DMA)中含有4mg/ml huMOV19抗体的反应物中。使所述溶液在25℃下缀合过夜。
反应后，使用NAP脱盐柱(Illustra Sephadex G-25DNA Grade,GE Healthcare)纯化所述缀合物且缓冲液交换成10mM Tris、80mM NaCl、50uM亚硫酸氢盐、3.5％蔗糖、0.01％Tween-20配制缓冲液(pH 7.6)。在4℃下，利用Slide-a-Lyzer透析盒(ThermoScientific10,000 MWCO)以相同缓冲液透析过夜。
发现纯化的缀合物每个抗体连接有平均2.7个分子的化合物 107(通过UV/Vis和SEC，对于化合物107，使用摩尔消光系数ε330nm＝ 15,484cm-1M-1和ε280nm＝30,115cm-1M-1，且对于huMOV19抗体，使用ε280nm＝201,400cm-1M-1)，具有95％单体(通过大小排阻色谱法)且最终蛋白质浓度为1.1mg/ml。MS光谱数据显示于图16中。
实施例33.单剂量的huML66-90缀合物针对雌性SCID小鼠中 NCI-H1703 NSCLC异种移植物的抗肿瘤活性
自Charles River Laboratories获得6周龄的雌性CB.17 SCID小鼠。通过在右侧腹中皮下注射，用悬浮于0.2ml 50％基质胶/无血清培养基中的5×106个NCI-H1703肿瘤细胞接种小鼠。当肿瘤体积达到约100mm3(接种后第16天)时，基于肿瘤体积将动物随机分入4个组中，每组6只小鼠。第1天(接种后第17天)，动物接受单次静脉内施用的媒介物对照物(每只小鼠0.1ml)，或基于化合物90浓度的5 μg/kg、20μg/kg和50μg/kg的huML66-90缀合物。
每周两到三次使用测径器以三个尺寸测量肿瘤大小。肿瘤体积使用式V＝长度×宽度×高度×1/2计算，以mm3表示。当肿瘤体积减小50％或更多时，认为小鼠具有部分消退(PR)，当无法检测到明显肿瘤时，认为具有完全肿瘤消退(CR)。肿瘤体积通过StudyLog软件测定。
肿瘤生长抑制(T/C值)使用下式测定：
T/C(％)＝治疗组的中值肿瘤体积/对照组的中值肿瘤体积× 100。
当媒介物对照组的肿瘤体积达到预定大小1000mm3时，同时测定治疗组(T)和媒介物对照组(C)的肿瘤体积。测定每一治疗组的每日中值肿瘤体积，包括无肿瘤小鼠(0mm3)。根据NCI标准，T/C≤42％为抗肿瘤活性的最低水准。T/C<10％被视为高抗肿瘤活性水准。
如图17中所示，huML66-90缀合物在20μg/kg和50μg/kg下具有高活性，其中20μg/kg为最低有效剂量(MED)。
实施例34.单剂量的huMov19-90缀合物在雌性CD-1小鼠中的药物动力学
自Charles River Laboratories获得7周龄的雌性CD-1小鼠。小鼠接受经侧尾静脉以单次静脉内快速注射单次静脉内施用的 huMov19-90缀合物。每只小鼠接受基于Ab的2.5mg/kg剂量。所述剂量和注射体积是基于每只小鼠的体重个别化。注射使用配备27号 1/2英寸针的1.0mL注射器进行。在施用huMov19-90缀合物之后2分钟和30分钟，以及2小时、4小时和8小时，和1天、2天、3天、 5天、7天、10天、14天、21和28天，通过吸入异氟烷使小鼠麻醉，且经由右眼眶后血窦自小鼠收集约150μL血液放入肝素化的毛细管中。在每一时间点(自0至21天)，自一组全部三只小鼠收集血液。各组依序抽血；由此使所述组中的小鼠在24小时的时段内不会抽血超过两次。在最后一个时间点，即在施药后28天，所有小鼠均被包括用于样品收集。对血液样品离心以分离血浆。对于每一样品和时间点，将30μl血浆转移至独立标记的微量离心管中，且接着在-80℃下冷冻储存以便随后通过ELISA分析，使用抗二氢吲哚并苯并二氮杂
Figure BDA0001239440410001941
抗体，测定总Ab(未缀合Ab加完整缀合物)和完整缀合物的浓度。
如图18中所示，huMov19-90缀合物具有与所述抗体类似的清除率。
实施例35.通过用蛋白质A树脂亲和力捕获来富集代谢物
在5×T150组织培养板中培养表达叶酸受体α(FRα)的KB细胞。在37℃下，在用5％CO2缓冲的潮湿恒温箱中将饱和量的FRα靶向性huMov19-90缀合物与KB细胞一起孵育24小时。24小时之后，采集含有细胞流出的代谢物的培养基且汇集用于随后分析。
通过在4℃下孵育过夜，使饱和量的抗二氢吲哚并苯并二氮杂
Figure BDA0001239440410001951
抗体结合至蛋白质A树脂的浆液。在端至端旋转器上，用25mL培养基孵育1mL预先结合的蛋白质A/抗二氢吲哚并苯并二氮杂
Figure BDA0001239440410001952
抗体复合物数小时。以1000rpm轻柔地离心树脂且倾析上清液。用PBS 洗涤结合至代谢物的蛋白质A/抗二氢吲哚并苯并二氮杂
Figure BDA0001239440410001953
抗体树脂。通过丙酮萃取将代谢物释放至有机相中。将代谢物真空干燥过夜，直至有机溶液完全蒸发。将代谢物用20％乙腈水溶液复水，且通过 LC-MS进行分析。
MS分析
通过UHPLC/MS/MS，使用Q-Exactive高解析度质谱仪(Thermo) 鉴别细胞代谢物。使用萃取离子色谱图(XIC)鉴别并表征靶细胞代谢物。鉴别含有特征性二氢吲哚并苯并二氮杂
Figure BDA0001239440410001954
(286m/z)质量标志的所有代谢物质(参见图19A和19B)。
实施例36.单剂量的huMov19-90针对雌性CB.17 SCID小鼠中的NCI-H2110 NSCLC异种移植物、Hec-1b子宫内膜异种移植物和 Ishikawa子宫内膜异种移植物的抗肿瘤活性
自Charles River Laboratories获得6周龄的雌性CB.17 SCID小鼠。通过在右侧腹中皮下注射，用悬浮于0.1ml 50％基质胶/无血清培养基中的1×107个NCI-H2110肿瘤细胞接种一组小鼠。通过在右侧腹中皮下注射，用悬浮于0.1ml无血清培养基中的1×107个Hec-1b 肿瘤细胞接种第二组小鼠。通过在右侧腹中皮下注射，用悬浮于0.1ml 50％基质胶/无血清培养基中的1×107个Ishikawa肿瘤细胞接种第三组小鼠。
当肿瘤体积达到约100mm3(NCI-H2110在接种后第7天，Hec-1b 在接种后第7天且Ishikawa在接种后第17天)时，基于肿瘤体积，将动物随机分成阵列，每组6只小鼠。
在NCI-H2110异种移植物实验中，小鼠在第1天(接种后第8天) 接受单次静脉内施用的媒介物对照物(每只小鼠0.2ml)或基于药物浓度的1μg/kg、3μg/kg或5μg/kg的huMov19-90。
在Hec-1b异种移植物实验中，小鼠在第1天(接种后第8天)接受单次静脉内施用的媒介物对照物(每只小鼠0.2ml)或基于药物浓度的 10μg/kg或30μg/kg的huMov19-90，或30μg/kg的非靶向性对照缀合物chKTI-90。
在Ishikawa异种移植物实验中，小鼠在第1天(接种后第18天) 接受单次静脉内施用的媒介物对照物(每只小鼠0.2ml)或基于药物浓度的10μg/kg或30μg/kg的huMov19-90，或30μg/kg的非靶向性对照缀合物chKTI-90。
对于所有实验，每周两到三次使用测径器以三个尺寸测量肿瘤大小。肿瘤体积使用式V＝长度×宽度×高度×1/2计算，以mm3表示。当肿瘤体积减小50％或更多时，认为小鼠具有部分消退(PR)，当无法检测到明显肿瘤时，认为具有完全肿瘤消退(CR)。肿瘤体积系通过StudyLog软件测定。
肿瘤生长抑制(T/C值)使用下式测定：
T/C(％)＝治疗组的中值肿瘤体积/对照组的中值肿瘤体积× 100。
当媒介物对照组的肿瘤体积达到预定大小1000mm3时，同时测定治疗组(T)和媒介物对照组(C)的肿瘤体积。测定每一治疗组的每日中值肿瘤体积，包括无肿瘤小鼠(0mm3)。根据NCI标准，T/C≤42％为抗肿瘤活性的最低水准。T/C<10％被视为高抗肿瘤活性水准。
如图22中所示，在NCI-H2110异种移植物模型中，huMov19-90 缀合物在1μg/kg剂量下不具活性，在3μg/kg剂量下具有活性且具有13％的T/C和1/6PR，并在5μg/kg剂量下具有高活性且具有2％的T/C、6/6PR和4/6CR。
如图23中所示，在Hec-1b异种移植物模型中，huMov19-90缀合物在10μg/kg剂量下具有活性且具有15％的T/C和1/6PR，并在 30μg/kg剂量下具有高活性且具有9％的T/C、6/6PR和6/6CR。非靶向性对照缀合物chKTI-90在30μg/kg剂量下具有活性，且T/C为 34％。
如图24中所示，在Ishikawa异种移植物模型中，huMov19-90 缀合物在10μg/kg剂量下具有活性且具有27％的T/C、6/6PR和6/6 CR，并在30μg/kg剂量下具有活性且具有15％的T/C、6/6PR和6/6 CR。非靶向性对照缀合物chKTI-90在30μg/kg剂量下具有活性，且具有24％的T/C和4/6PR。
实施例37.单剂量的huMov19-107针对雌性CB.17 SCID小鼠中NCI-H2110 NSCLC异种移植物的抗肿瘤活性
根据以上实施例30中所描述的方案，在SCID小鼠中测定 huMOV19-107的体内抗肿瘤活性。如图25中所示，huMov19-107缀合物在10μg/kg剂量下具有高活性且具有6/6CR。
实施例38.CD123-90缀合物的结合亲和力
使用HNT-34细胞，通过流式细胞术测定示例性人源化抗CD123 抗体，即huCD123-6Gv4.7S3抗体的ADC缀合物的结合亲和力，并将其与相应未缀合抗体相比较。将HNT-34细胞(每份样品5×104个细胞)与在200μL FACS缓冲液(补充有2％正常山羊血清的DMEM培养基)中不同浓度的ADC和未缀合huCD123-6Gv4.7S3抗体一起孵育。接着使细胞集结成团，洗涤两次，并与100μL藻红蛋白(PE)缀合的山羊抗人IgG抗体(Jackson Laboratory)一起孵育1小时。再使细胞集结成团，用FACS缓冲液洗涤且使其再悬浮于含有1％甲醛的200μL PBS中。使用带有HTS多孔取样器的FACSCalibur流式细胞仪，或 FACS阵列流式细胞仪获取样品，且使用CellQuest Pro(均来自BD Biosciences,San Diego,US)进行分析。对于每一样品，计算出FL2的几何平均荧光强度且在半对数曲线中针对抗体浓度作图。通过非线性回归生成剂量-反应曲线，且使用GraphPad Prism v4(GraphPad software,San Diego,CA)计算每一曲线的EC50值，其对应于每一抗体的表观解离常数(Kd)。
如图26中所示，缀合仅适度地影响示例性抗CD123抗体的结合亲和力。
实施例39.huCD123-90的体外细胞毒性活性
使用体外细胞毒性测定测量huCD123-6(一种抗CD123抗体)的抗体-药物缀合物(ADC)杀死在细胞表面上表达CD123的细胞的能力。在由细胞供应商(ATCC或DSMZ)所推荐的细胞培养基中培养细胞系。将细胞以100μL培养基中2,000至10,000个添加至平底96孔板的每个孔中。为了阻断细胞表面上的Fc受体，细胞培养基补充有100 nM chKTI抗体(属于相同同种型的抗体)。使用3倍连续稀释在培养基中稀释缀合物，且每孔添加100μL。为了确定不依赖于CD123的细胞毒性贡献，在测试缀合物之前，向一些孔中添加CD123阻断剂(例如100nM chCD123-6抗体)。在每一分析板中包括含有细胞和培养基但无缀合物的对照孔，以及仅含培养基的孔。对于每一数据点，一式三份进行分析。在37℃下，在含6％CO2的潮湿恒温箱中孵育所述盘 4至7天。接着，使用基于WST-8的Cell Counting Kit-8(DojindoMolecular Technologies,Inc.,Rockville,MD)测定每个孔中存活细胞的相对数量。通过首先针对培养基背景吸光度校正，且接着用每一值除以对照孔(未处理孔)中所述值的平均值来计算每个孔中细胞的表观存活分数。将细胞存活分数以半对数曲线针对缀合物浓度作图。
在本研究中使用了不同起源(AML、B-ALL、CML和NHL)的十五种CD123阳性细胞系(表4)。大多数细胞系源自于带有恶性肿瘤且具有至少一个不良预后因子(例如P-糖蛋白的过度表达、EVI1的过度表达、p53改变、DNMT3A突变、FLT3内部串联重复)的患者。所述缀合物对所述细胞系展现高效力且IC50值在亚pM浓度至低nM浓度范围内(表4)。
表4.huCD123-6-90缀合物针对不同起源的CD123阳性细胞系的体外细胞毒性
细胞系 起源 不良预后因子 IC<sub>50</sub>(M)
THP1 AML p53缺失 6.7E-12
SHI-1 AML p53基因改变 1.3E-11
KO52 AML p53突变，Pgp过度表达 1.4E-11
KASUMI-3 AML EVI1和Pgp过度表达 9.8E-12
KG-1 AML p53突变，Pgp过度表达 2.2E-10
OCI-AML2 AML DNMT3A突变 8.8E-11
HNT-34 AML MECOM(EVI1)过度表达 2.0E-12
MV4-11 AML FLT3内部串联重复 5.6E-13
MOLM-13 AML FLT3内部串联重复 4.9E-13
EOL-1 AML 2.5E-12
MOLM-1 CML EVI1和Pgp过度表达 2.9E-11
KOPN8 B-ALL 1.1E-11
JM-1 B-ALL 2.4E-11
KCL-22 CML 3.0E-11
Granta519 NHL 1.2E-12
本文引用的所有出版物、专利、专利申请、互联网站和登录号/ 数据库序列(包括多核苷酸和多肽序列)均出于所有目的以引用的方式整体并入本文，其引用程度就如同特定且个别地指示每一个别出版物、专利、专利申请、互联网站或登录号/数据库序列如此以引用的方式并入一般。
序列表
<110> ImmunoGen, Inc.
<120> 细胞毒性苯并二氮杂䓬衍生物
<130> 121162-02120
<150> 62/045,248
<151> 2014-09-03
<150> 62/087,040
<151> 2014-12-03
<150> 62/149,370
<151> 2015-04-17
<150> 62/164,305
<151> 2015-05-20
<160> 29
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> FOLR1抗体重链CDR1
<400> 1
Gly Tyr Phe Met Asn
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<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> FOLR1抗体重链CDR2
<220>
<221> X
<222> (14)..(14)
<223> Lys、Gln、His或Arg
<220>
<221> X
<222> (16)..(16)
<223> Gln、His、Asn或Arg
<220>
<221> X
<222> (17)..(17)
<223> Gly、GLu、Thr、Ser、Ala或Val
<220>
<221> X
<222> (17)..(17)
<223> Gly、Glu、Thr、Ser、Ala或Val
<400> 2
Arg Ile His Pro Tyr Asp Gly Asp Thr Phe Tyr Asn Gln Xaa Phe Xaa
1 5 10 15
Xaa
<210> 3
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<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> FOLR1抗体重链CDR3
<400> 3
Tyr Asp Gly Ser Arg Ala Met Asp Tyr
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<220>
<223> FOLR1抗体轻链CDR1
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Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Phe Ala Gly Thr Ser Leu Met His
1 5 10 15
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> FOLR1抗体轻链CDR2
<400> 5
Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ala
1 5
<210> 6
<211> 9
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<213> 人工
<220>
<223> FOLR1抗体轻链CDR3
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Gln Gln Ser Arg Glu Tyr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 7
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> FOLR1抗体重链CDR2
<400> 7
Arg Ile His Pro Tyr Asp Gly Asp Thr Phe Tyr Asn Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 8
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> FOLR1抗体重链
<400> 8
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Phe Met Asn Trp Val Lys Gln Ser Pro Gly Gln Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile His Pro Tyr Asp Gly Asp Thr Phe Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala His
65 70 75 80
Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Tyr Asp Gly Ser Arg Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 9
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> FOLR1抗体轻链
<400> 9
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ile Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Phe Ala
20 25 30
Gly Thr Ser Leu Met His Trp Tyr His Gln Lys Pro Gly Gln Gln Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ala Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Lys Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile Ser
65 70 75 80
Pro Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Arg
85 90 95
Glu Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 10
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> FOLR1抗体轻链
<400> 10
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ile Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Phe Ala
20 25 30
Gly Thr Ser Leu Met His Trp Tyr His Gln Lys Pro Gly Gln Gln Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ala Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Lys Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Pro Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Arg
85 90 95
Glu Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 11
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> FOLR1抗体重链可变结构域
<400> 11
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Phe Met Asn Trp Val Lys Gln Ser Pro Gly Gln Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile His Pro Tyr Asp Gly Asp Thr Phe Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala His
65 70 75 80
Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Tyr Asp Gly Ser Arg Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 12
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> FOLR1抗体轻链可变结构域
<400> 12
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ile Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Phe Ala
20 25 30
Gly Thr Ser Leu Met His Trp Tyr His Gln Lys Pro Gly Gln Gln Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ala Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Lys Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile Ser
65 70 75 80
Pro Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Arg
85 90 95
Glu Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105 110
<210> 13
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> FOLR1抗体轻链可变结构域
<400> 13
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ile Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Phe Ala
20 25 30
Gly Thr Ser Leu Met His Trp Tyr His Gln Lys Pro Gly Gln Gln Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ala Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Lys Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Pro Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Arg
85 90 95
Glu Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105 110
<210> 14
<211> 445
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> huML66HC全长重链
<400> 14
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Leu Ser Leu Ala Ser Asn
20 25 30
Ser Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Val Ile Trp Asn His Gly Gly Thr Asp Tyr Asn Pro Ser Ile Lys
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys Val
85 90 95
Arg Lys Gly Gly Ile Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Val Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
<210> 15
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> huML66LC全长轻链
<400> 15
Asp Thr Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Leu Ala Val Ser Pro Gly Glu
1 5 10 15
Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Thr Leu Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Gln Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Leu Ala Ser His Arg Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp Pro Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Arg Asn Asp Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
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Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
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Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
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210
<210> 16
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 抗EGFR抗体免疫球蛋白重链
<400> 16
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Ala Lys Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Gln Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Cys Ile
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Gly Thr Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Thr Tyr Thr Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Asp Ala Pro Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
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Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
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Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
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Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
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Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
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Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
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Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
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Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
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Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
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Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
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Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
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Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
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<213> 人工
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<223> 抗EGFR抗体免疫球蛋白轻链
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Leu Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Gly Pro Lys Leu Leu Ile
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Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Ser Phe Ser Ile Ser Ser Leu Glu Pro
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Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Asn Leu Leu Tyr
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
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Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
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Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
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Phe Asn Arg Gly Glu Cys
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<210> 18
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<220>
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<400> 18
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<223> 抗Muc1抗体重链
<400> 21
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<400> 23
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<223> 抗CD37抗体免疫球蛋白轻链
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<211> 444
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<220>
<223> 抗CD37抗体免疫球蛋白重链
<400> 27
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<210> 28
<211> 213
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<223> 抗CD37抗体免疫球蛋白轻链
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Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 29
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 抗CD37抗体免疫球蛋白重链
<400> 29
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Leu Lys Pro Ser Gln
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100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly

Claims (75)

1.一种由下式表示的细胞毒性化合物：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
，
或其药学上可接受的盐，其中：
在N与C之间的双线
Figure DEST_PATH_IMAGE003
表示单键或双键，条件是当其为双键时，X不存在且Y是-H，并且当其为单键时，X是-H并且Y是-OH或-SO3M；
M是H、Na+或K+;
R1、R2、R3、R4、R1’、R2’、R3’和R4’ 都是-H;
R6是-OMe;
X’和Y’两者均是-H；
A和A’是-O-；
L’’和L’’’两者均是–H;
L’ 由下式表示:
-NR5-P-C(=O)-(CRaRb)m-J (B1)；
-NR5-P-C(=O)-Cy-(CRaRb)m’-J (B2)；或
-NR5-P-C(=O)-(CRaRb)m-S-Zs (B3)；
其中：
J是包含选自–COOH或–COE的反应性基团的部分，其中COE表示反应性酯；
P是含有介于2至5个之间的氨基酸残基的肽，其中P选自Gly-Gly-Gly、Ala-Val、Val-Ala、Val-Cit、Val-Lys、Phe-Lys、Lys-Lys、Ala-Lys、Phe-Cit、Leu-Cit、Lle-Cit、Trp-Cit、Phe-Ala、Phe-N9-甲苯磺酰基-Arg、Phe-N9-硝基-Arg、Phe-Phe-Lys、D-Phe-Phe-Lys、Gly-Phe-Lys、Leu-Ala-Leu、Ile-Ala-Leu、Val-Ala-Val、Ala-Leu-Ala-Leu、β-Ala-Leu-Ala-Leu和Gly-Phe-Leu-Gly、Val-Arg、Arg-Val、Arg-Arg、Val-D-Cit、Val-D-Lys、Val-D-Arg、D-Val-Cit、D-Val-Lys、D-Val-Arg、D-Val-D-Cit、D-Val-D-Lys、D-Val-D-Arg、D-Arg-D-Arg、Ala-Ala、Ala-D-Ala、D-Ala-Ala、D-Ala-D-Ala、Ala-Met以及Met-Ala；
R5是-H或(C1-C3)烷基；
Ra和Rb在每次出现时各自独立地是–H、(C1-C3)烷基或带电荷的取代基或可离子化基团Q，所述Q是-SO3H；
m是1至6的整数；
m’是0或1至6的整数；以及
Cy是任选地被卤素、-OH、(C1-C3)烷基、(C1-C3)烷氧基或卤代(C1-C3)烷基取代的具有5或6个环碳原子的环状烷基；
Zs是–H、-SRd、-C(=O)Rd1或选自下式中的任一个：
Figure 914272DEST_PATH_IMAGE004
(a1)；
Figure 254249DEST_PATH_IMAGE006
(a2)；
Figure 768407DEST_PATH_IMAGE008
(a3)；
Figure 835720DEST_PATH_IMAGE010
(a4)；
Figure 837043DEST_PATH_IMAGE012
(a5)；
Figure DEST_PATH_IMAGE013
(a6)；
Figure 79412DEST_PATH_IMAGE014
(a7)；
Figure DEST_PATH_IMAGE015
(a8)；
Figure 205500DEST_PATH_IMAGE016
(a9)；
Figure DEST_PATH_IMAGE017
(a10)；
Figure DEST_PATH_IMAGE019
(a11)；
Figure 499341DEST_PATH_IMAGE020
(a12)；
Figure 105902DEST_PATH_IMAGE022
(a13)；
Figure DEST_PATH_IMAGE023
(a14)；或
Figure 20638DEST_PATH_IMAGE024
(a15)，
其中：
q是1至5的整数；
n’是2至6的整数；
U是–H或SO3M；
Rd是具有1至6个碳原子的直链或支链烷基，或选自苯基、硝基苯基、二硝基苯基、羧基硝基苯基、吡啶基或硝基吡啶基；以及
Rd1是具有1至6个碳原子的直链或支链烷基。
2.如权利要求1所述的化合物，其中L’由下式表示：
-NR5-P-C(=O)-(CRaRb)m-J (B1)；或
-NR5-P-C(=O)-Cy-(CRaRb)m’-J (B2) 。
3.如权利要求2所述的化合物，其中Ra和Rb两者均是H；式(B2)中的Cy是环己烷；且R5是H或Me。
4.如权利要求2所述的化合物，其中m’是0或1。
5.如权利要求1所述的化合物，其中L’由下式表示：
-NR5-P-C(=O)-(CRaRb)m-S-Zs (B3)。
6.如权利要求5所述的化合物，其中Ra和Rb两者均是–H且R5是H或Me。
7.如权利要求5所述的化合物，其中-(CRaRb)m-是-(CH2)m”-C(Me2)-且m”是1至5的整数。
8.如权利要求1所述的化合物，其中P是Gly-Gly-Gly、Ala-Val、Ala-Ala、Ala-D-Ala、D-Ala-Ala和D-Ala-D-Ala。
9.如权利要求1所述的化合物，其中所述在N与C之间的双线
Figure DEST_PATH_IMAGE025
表示双键。
10.如权利要求1所述的化合物，其中所述在N与C之间的双线
Figure 155994DEST_PATH_IMAGE025
表示单键，X是-H，Y是-SO3M。
11.如权利要求1所述的化合物，其中所述化合物选自下式中的任一个：
Figure 361848DEST_PATH_IMAGE026
；
Figure DEST_PATH_IMAGE027
；
Figure 806604DEST_PATH_IMAGE028
；
Figure DEST_PATH_IMAGE029
；
Figure 596968DEST_PATH_IMAGE030
；
Figure DEST_PATH_IMAGE031
；
Figure 759965DEST_PATH_IMAGE032
；
Figure DEST_PATH_IMAGE033
；
Figure 392678DEST_PATH_IMAGE034
；
Figure DEST_PATH_IMAGE035
；
Figure 160783DEST_PATH_IMAGE036
；
Figure DEST_PATH_IMAGE037
；
Figure 918786DEST_PATH_IMAGE038
；
Figure DEST_PATH_IMAGE039
；
Figure 506762DEST_PATH_IMAGE040
；
Figure DEST_PATH_IMAGE041
；
Figure 257680DEST_PATH_IMAGE042
；
Figure DEST_PATH_IMAGE043
；
Figure 113247DEST_PATH_IMAGE044
；
Figure DEST_PATH_IMAGE045
；
Figure 806266DEST_PATH_IMAGE046
；
Figure DEST_PATH_IMAGE047
；
Figure 117424DEST_PATH_IMAGE048
；
Figure DEST_PATH_IMAGE049
；
Figure 921300DEST_PATH_IMAGE050
；
Figure DEST_PATH_IMAGE051
；
Figure 631374DEST_PATH_IMAGE052
；
Figure DEST_PATH_IMAGE053
；
Figure 495294DEST_PATH_IMAGE054
；
Figure DEST_PATH_IMAGE055
；
Figure 293748DEST_PATH_IMAGE056
；
Figure DEST_PATH_IMAGE057
；
Figure 386469DEST_PATH_IMAGE058
；
Figure DEST_PATH_IMAGE059
；
Figure 718093DEST_PATH_IMAGE060
；
Figure DEST_PATH_IMAGE061
；
Figure 251449DEST_PATH_IMAGE062
；
Figure DEST_PATH_IMAGE063
；或
Figure 35734DEST_PATH_IMAGE064
或其药学上可接受的盐，其中：
R100是–OH、–OMe或
Figure 994463DEST_PATH_IMAGE066
。
12.如权利要求11所述的化合物，其中所述化合物由下式表示：
Figure DEST_PATH_IMAGE067
；或
Figure 416479DEST_PATH_IMAGE068
，
或其药学上可接受的盐，其中：
R100是
Figure 684518DEST_PATH_IMAGE070
，U是H。
13.一种包含细胞毒性化合物与细胞结合剂(CBA)的缀合物，其中所述细胞毒性化合物共价连接至所述CBA，并且其中所述细胞毒性化合物由下式表示：
Figure DEST_PATH_IMAGE071
或其药学上可接受的盐，其中：
在N与C之间的双线
Figure 454635DEST_PATH_IMAGE072
表示单键或双键，条件是当其为双键时，X不存在且Y是-H，并且当其为单键时，X是-H，并且Y是-OH或-SO3M；
M是H、Na+或K+;
R1、R2、R3、R4、R1’、R2’、R3’和R4’ 都是-H;
R6是-OMe;
X’和Y’两者均是-H；
A和A’是-O-；
G是–CH-;
L’’和L’’’两者均是–H;
L’ 由下式表示:
-NR5-P-C(=O)-(CRaRb)m-J’ (B1’)；
-NR5-P-C(=O)-Cy-(CRaRb)m’-J’ (B2’)；
-NR5-P-C(=O)-(CRaRb)m-S-Zs1 (B3’)；
其中：
J是–C(=O)-；
P是含有介于2至5个之间的氨基酸残基的肽，其中P选自Gly-Gly-Gly、Ala-Val、Val-Ala、Val-Cit、Val-Lys、Phe-Lys、Lys-Lys、Ala-Lys、Phe-Cit、Leu-Cit、Lle-Cit、Trp-Cit、Phe-Ala、Phe-N9-甲苯磺酰基-Arg、Phe-N9-硝基-Arg、Phe-Phe-Lys、D-Phe-Phe-Lys、Gly-Phe-Lys、Leu-Ala-Leu、Ile-Ala-Leu、Val-Ala-Val、Ala-Leu-Ala-Leu、β-Ala-Leu-Ala-Leu、Gly-Phe-Leu-Gly、Val-Arg、Arg-Val、Arg-Arg、Val-D-Cit、Val-D-Lys、Val-D-Arg、D-Val-Cit、D-Val-Lys、D-Val-Arg、D-Val-D-Cit、D-Val-D-Lys、D-Val-D-Arg、D-Arg-D-Arg、Ala-Ala、Ala-D-Ala、D-Ala-Ala、D-Ala-D-Ala、Ala-Met以及Met-Ala；
R5是-H或(C1-C3)烷基；
Ra和Rb在每次出现时各自独立地是–H、(C1-C3)烷基或带电荷的取代基或可离子化基团Q，所述Q是-SO3H；
m是1至6的整数；
m’是0或1至6的整数；以及
Cy是任选地被卤素、-OH、(C1-C3)烷基、(C1-C3)烷氧基或卤代(C1-C3)烷基取代的具有5或6个环碳原子的环状烷基；
Zs1选自下式中的任一个：
Figure DEST_PATH_IMAGE073
(b1)；
Figure DEST_PATH_IMAGE075
(b2)；
Figure DEST_PATH_IMAGE077
(b3)；
Figure DEST_PATH_IMAGE079
(b4)；
Figure DEST_PATH_IMAGE081
(b5)；
Figure DEST_PATH_IMAGE083
(b6)；
Figure DEST_PATH_IMAGE085
(b7)；
Figure 295683DEST_PATH_IMAGE086
(b8)；
Figure 211687DEST_PATH_IMAGE088
(b9)；
Figure 86845DEST_PATH_IMAGE090
(b10)；
Figure 658772DEST_PATH_IMAGE092
(b11)；
Figure 208571DEST_PATH_IMAGE094
(b12)；
Figure 447922DEST_PATH_IMAGE096
(b13)；
Figure 496912DEST_PATH_IMAGE098
(b14)；和
Figure 556135DEST_PATH_IMAGE100
(b15),
其中：
q是1至5的整数；
n’是2至6的整数。
14.如权利要求13所述的缀合物，其中L’由下式表示：
-NR5-P-C(=O)-(CRaRb)m-J’ (B1’)；或
-NR5-P-C(=O)-Cy-(CRaRb)m’-J’ (B2’)。
15.如权利要求14所述的缀合物，其中Ra和Rb两者均是H；式(B2’)中的Cy是环己烷；且R5是H或Me。
16.如权利要求14所述的缀合物，其中m’是0或1。
17.如权利要求13所述的缀合物，其中L’由下式表示：
-NR5-P-C(=O)-(CRaRb)m-S-Zs1 (B3’)。
18.如权利要求17所述的缀合物，其中Ra和Rb两者均是–H且R5是H或Me。
19.如权利要求17所述的缀合物，其中-(CRaRb)m-是–(CH2)m”-C(Me2)-且m”是1至5的整数。
20.如权利要求13所述的缀合物，其中P是Gly-Gly-Gly、Ala-Val、Ala-Ala、Ala-D-Ala、D-Ala-Ala和D-Ala-D-Ala。
21.如权利要求13所述的缀合物，其中所述在N与C之间的双线
Figure 660357DEST_PATH_IMAGE025
表示双键。
22.如权利要求13所述的缀合物，其中所述在N与C之间的双线
Figure 472324DEST_PATH_IMAGE025
表示单键，X是-H，且Y是-SO3M。
23.如权利要求13所述的缀合物，其中所述缀合物选自下式中的任一个：
Figure DEST_PATH_IMAGE101
；
Figure 472641DEST_PATH_IMAGE102
；
Figure DEST_PATH_IMAGE103
；
Figure 439067DEST_PATH_IMAGE104
；
Figure DEST_PATH_IMAGE105
；
Figure 533931DEST_PATH_IMAGE106
；
Figure DEST_PATH_IMAGE107
；
Figure 701869DEST_PATH_IMAGE108
；
Figure DEST_PATH_IMAGE109
；
Figure 528880DEST_PATH_IMAGE110
;
Figure DEST_PATH_IMAGE111
;
Figure 880856DEST_PATH_IMAGE112
；
Figure DEST_PATH_IMAGE113
；
Figure 451514DEST_PATH_IMAGE114
；
Figure 51123DEST_PATH_IMAGE115
；
Figure 127663DEST_PATH_IMAGE116
；
Figure DEST_PATH_IMAGE117
；
Figure 868349DEST_PATH_IMAGE118
；
Figure DEST_PATH_IMAGE119
；
Figure 977119DEST_PATH_IMAGE120
；
Figure DEST_PATH_IMAGE121
；
Figure 382299DEST_PATH_IMAGE122
；
Figure DEST_PATH_IMAGE123
；
Figure 551112DEST_PATH_IMAGE124
；
Figure DEST_PATH_IMAGE125
；
Figure 44673DEST_PATH_IMAGE126
；
Figure DEST_PATH_IMAGE127
；
Figure 504604DEST_PATH_IMAGE128
；
Figure DEST_PATH_IMAGE129
；
Figure 203439DEST_PATH_IMAGE130
；
Figure DEST_PATH_IMAGE131
；
Figure 104005DEST_PATH_IMAGE132
；
Figure DEST_PATH_IMAGE133
；
Figure 52239DEST_PATH_IMAGE134
；
Figure DEST_PATH_IMAGE135
；
Figure 269855DEST_PATH_IMAGE136
；
Figure DEST_PATH_IMAGE137
；
Figure 885513DEST_PATH_IMAGE138
；
Figure DEST_PATH_IMAGE139
；
Figure 943599DEST_PATH_IMAGE140
；
Figure DEST_PATH_IMAGE141
；
Figure 346505DEST_PATH_IMAGE142
；
Figure DEST_PATH_IMAGE143
；
Figure 663086DEST_PATH_IMAGE144
；
Figure DEST_PATH_IMAGE145
；
Figure 572399DEST_PATH_IMAGE146
；
Figure DEST_PATH_IMAGE147
；
Figure 581812DEST_PATH_IMAGE148
；
Figure DEST_PATH_IMAGE149
；
Figure 206435DEST_PATH_IMAGE150
；
Figure DEST_PATH_IMAGE151
；
Figure 61127DEST_PATH_IMAGE152
；
Figure DEST_PATH_IMAGE153
；
Figure 136531DEST_PATH_IMAGE154
；
Figure DEST_PATH_IMAGE155
；
Figure 755993DEST_PATH_IMAGE156
；
Figure DEST_PATH_IMAGE157
；
Figure 431694DEST_PATH_IMAGE158
；
Figure DEST_PATH_IMAGE159
；
Figure 323033DEST_PATH_IMAGE160
；
Figure DEST_PATH_IMAGE161
；
Figure 705473DEST_PATH_IMAGE162
；
Figure DEST_PATH_IMAGE163
；
Figure 558154DEST_PATH_IMAGE164
；
Figure DEST_PATH_IMAGE165
；
Figure 393254DEST_PATH_IMAGE166
；或
Figure DEST_PATH_IMAGE167
，
或其药学上可接受的盐，其中：
r是1至10的整数。
24.如权利要求23所述的缀合物，其中所述缀合物由下式表示：
Figure 340482DEST_PATH_IMAGE125
，或
Figure 466176DEST_PATH_IMAGE126
，
或其药学上可接受的盐。
25.如权利要求13所述的缀合物，其中所述细胞结合剂(CBA)结合至选自以下的靶细胞：肿瘤细胞、感染病毒的细胞、感染寄生虫的细胞、自身免疫细胞、活化的细胞、骨髓细胞、B细胞或黑素细胞；表达CD4、CD6、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD37、CD38、CD40、CD44、CD56、EpCAM、CanAg、CALLA或Her-2抗原、Her-3抗原的细胞；或表达胰岛素生长因子受体、表皮生长因子受体和叶酸受体的细胞。
26.如权利要求13所述的缀合物，其中所述细胞结合剂是抗体、特异性地结合至靶细胞的抗体片段、淋巴因子、激素、维生素、生长因子、集落刺激因子或营养转运分子。
27.如权利要求13所述的缀合物，其中所述细胞结合剂是抗叶酸受体抗体或其抗体片段。
28.如权利要求13所述的缀合物，其中所述细胞结合剂是抗EGFR抗体或其抗体片段。
29.如权利要求13所述的缀合物，其中所述细胞结合剂是抗CD33抗体或其抗体片段。
30.如权利要求13所述的缀合物，其中所述细胞结合剂是抗CD19抗体或其抗体片段。
31.如权利要求13所述的缀合物，其中所述细胞结合剂是抗Muc1抗体或其抗体片段。
32.如权利要求13所述的缀合物，其中所述细胞结合剂是抗CD37抗体或其抗体片段。
33.如权利要求26所述的缀合物，其中所述抗体是表面重构抗体或表面重构的抗体片段。
34.如权利要求26所述的缀合物，其中所述抗体是单克隆抗体或其单克隆抗体片段。
35.如权利要求26所述的缀合物，其中所述抗体是人源化抗体或人源化抗体片段。
36.如权利要求27所述的缀合物，其中所述抗叶酸受体抗体是huMOV19抗体。
37.如权利要求27所述的缀合物，其中所述抗叶酸受体抗体包含：
a) SEQ ID NO:1的重链CDR1、SEQ ID NO:7的重链CDR2和SEQ ID NO:3的重链CDR3；以及
b) SEQ ID NO:4的轻链CDR1、SEQ ID NO:5的轻链CDR2和SEQ ID NO:6的轻链CDR3。
38.如权利要求27所述的缀合物，其中所述抗叶酸受体抗体包含：
a) 具有SED ID NO:11的氨基酸序列的重链可变区；以及
b) 具有SED ID NO:12或SEQ ID NO:13的氨基酸序列的轻链可变区。
39.如权利要求27所述的缀合物，其中所述抗叶酸受体抗体包含：
a) 具有SED ID NO:8的氨基酸序列的重链；以及
b) 具有SED ID NO:9或SEQ ID NO:10的氨基酸序列的轻链。
40.如权利要求27所述的缀合物，其中所述抗叶酸受体抗体包含：
a) 具有SED ID NO:8的氨基酸序列的重链；以及
b) 具有SED ID NO:10的氨基酸序列的轻链。
41.如权利要求28所述的缀合物，其中所述抗EGFR抗体是huML66抗体。
42.如权利要求28所述的缀合物，其中所述抗EGFR抗体包含：
a) 具有SED ID NO:14的氨基酸序列的重链；以及
b) 具有SED ID NO:15的氨基酸序列的轻链。
43.如权利要求28所述的缀合物，其中所述抗EGFR抗体是huEGFR-7R。
44.如权利要求28所述的缀合物，其中所述抗EGFR抗体包含：
a) 具有SED ID NO:16的氨基酸序列的免疫球蛋白重链；以及
b) 具有SED ID NO:17或SEQ ID NO:18的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链。
45.如权利要求29所述的缀合物，其中所述抗CD33抗体是huMy9-6抗体。
46.如权利要求29所述的缀合物，其中所述抗CD33抗体包含：
a) 具有SED ID NO:23的氨基酸序列的免疫球蛋白重链；以及
b) 具有SED ID NO:24的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链。
47.如权利要求30所述的缀合物，其中所述抗CD19抗体是huB4抗体。
48.如权利要求30所述的缀合物，其中所述抗CD19抗体包含：
a) 具有SED ID NO:19的氨基酸序列的免疫球蛋白重链；以及
b) 具有SED ID NO:20的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链。
49.如权利要求31所述的缀合物，其中所述抗Muc1抗体是huDS6抗体。
50.如权利要求31所述的缀合物，其中所述抗Muc1抗体包含：
a) 具有SED ID NO:21的氨基酸序列的免疫球蛋白重链；以及
b) 具有SED ID NO:22的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链。
51.如权利要求32所述的缀合物，其中所述抗CD37抗体是huCD37-3抗体。
52.如权利要求32所述的缀合物，其中所述抗CD37抗体包含：
a) 具有SED ID NO:26或SEQ ID NO:27的氨基酸序列的免疫球蛋白重链；以及
b) 具有SED ID NO:25的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链。
53.如权利要求32所述的缀合物，其中所述抗CD37抗体是huCD37-50抗体。
54.如权利要求32所述的缀合物，其中所述抗CD37抗体包含：
a) 具有SED ID NO:29的氨基酸序列的免疫球蛋白重链；以及
b) 具有SED ID NO:28的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链。
55.由下式表示的缀合物：
Figure 270184DEST_PATH_IMAGE125
，或
Figure 467947DEST_PATH_IMAGE126
，
或其药学上可接受的盐，其中：
R是1至10的整数；
M是H+、Na+ 或K+；且
CBA是抗叶酸受体抗体，其包含：
a) SEQ ID NO:1的重链CDR1、SEQ ID NO:2的重链CDR2和SEQ ID NO:3的重链CDR3；以及
b) SEQ ID NO:4的轻链CDR1、SEQ ID NO:5的轻链CDR2和SEQ ID NO:6的轻链CDR3。
56.如权利要求55所述的缀合物，其中所述重链CDR2包含SEQ ID NO:7。
57.如权利要求55所述的缀合物，其中所述抗叶酸受体抗体包含具有SED ID NO:11的氨基酸序列的重链可变区；以及具有SED ID NO:12或SEQ ID NO:13的氨基酸序列的轻链可变区。
58.如权利要求55所述的缀合物，其中所述抗叶酸受体抗体包含：具有SED ID NO:8的氨基酸序列的重链；以及具有SED ID NO:9或SEQ ID NO:10的氨基酸序列的轻链。
59.如权利要求55所述的缀合物，其中所述抗叶酸受体抗体是huMOV19抗体。
60.一种药物组合物，其包含如权利要求13-59中任一项所述的缀合物和药学上可接受的载体。
61.如权利要求1-12中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐或如权利要求13-59中任一项所述的缀合物或其药学上可接受的盐在制备用于在哺乳动物中治疗癌症的药物中的用途，其中所述癌症选自卵巢癌、子宫颈癌、肺癌、乳癌、头颈部鳞状细胞癌、子宫内膜癌、淋巴瘤和白血病。
62.如权利要求61所述的用途，其中所述癌症是淋巴瘤或白血病。
63.如权利要求61所述的用途，其中所述癌症选自非小细胞肺癌、非霍奇金淋巴瘤、急性骨髓性白血病(AML)、急性单核细胞性白血病、早幼粒细胞性白血病、嗜酸性粒细胞白血病、急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)和慢性骨髓性白血病(CML)。
64.如权利要求63所述的用途，其中所述癌症是B-ALL。
65.如权利要求63所述的用途，其中所述癌症是急性骨髓性白血病(AML)。
66.如权利要求63所述的用途，其中所述癌症是非小细胞肺癌。
67.如权利要求61所述的用途，其中所述癌症是卵巢癌。
68.如权利要求61所述的用途，其中所述癌症是非霍奇金淋巴瘤。
69.如权利要求13所述的缀合物，其中所述细胞结合剂(CBA)结合至感染微生物的细胞。
70.如权利要求13所述的缀合物，其中所述细胞结合剂(CBA)结合至活化的T细胞。
71.如权利要求13所述的缀合物，其中所述细胞结合剂是单链抗体。
72.如权利要求13所述的缀合物，其中所述细胞结合剂是单链单克隆抗体。
73.如权利要求13所述的缀合物，其中所述细胞结合剂是表面重构的单链抗体。
74.如权利要求13所述的缀合物，其中所述细胞结合剂是人源化单链抗体。
75.如权利要求13所述的缀合物，其中所述细胞结合剂是单克隆抗体、特异性地结合至靶细胞的单克隆抗体片段、嵌合抗体、特异性地结合至靶细胞的嵌合抗体片段、结构域抗体、特异性地结合至靶细胞的结构域抗体片段。
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