CN102596992B - 基于ⅲ型纤连蛋白结构域的支架组合物、方法及用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种基于人纤连蛋白的第10个III型纤连蛋白(FN3)重复序列的共有序列的蛋白质支架，包括编码蛋白质支架的分离的核酸分子、载体、宿主细胞、以及它们的制备和使用方法，上述各方面在诊断和/或治疗组合物、方法和装置中具有应用。具体而言，基于所述共有序列的结合IgG的蛋白质支架分子已被鉴定为可用于诊断和/或治疗应用。

Description

基于Ⅲ型纤连蛋白结构域的支架组合物、方法及用途
技术领域
本发明涉及具有新性质的蛋白质支架，所述新性质包括结合细胞靶标的能力。更具体而言，本发明涉及基于III型纤连蛋白(FN3)重复序列的共有序列的蛋白质支架。
背景技术
当需要对靶分子具有高亲和性和特异性时，单克隆抗体是最广泛使用的治疗性蛋白质类型。但是，可被工程改造成能结合这种靶标的非抗体蛋白质在生物医药行业中也具有很大的重要性。这些“另类的支架”蛋白质可具有优于传统抗体的优点，因为它们尺寸小、缺乏二硫键、稳定性高和能够在原核生物宿主中表达。新的纯化方法容易应用；它们容易缀合到药物/毒素、有效地渗透到组织中，并容易编排成多特异性结合物(Skerra 2000；Binz and Pluckthun 2005)。
一种这样的另类支架是免疫球蛋白(Ig)折叠。这个折叠存在于抗体以及数千种非抗体蛋白质的可变区。已证实，一种这样的Ig蛋白，即人纤连蛋白的第10个III型纤连蛋白(FN3)重复序列，能容忍表面所暴露的环中的许多突变而保持总体的Ig折叠结构。因此，已将氨基酸变体的文库建立到这些环内，并选择出针对多种不同靶标的特异性结合物(Koide等人，1998；Karatan等人，2004)。已发现这种经工程改造的FN3结构域能以高亲和力结合靶标，同时保持重要的生物物理性质(Parker等人，2005)。
潜在的另选支架分子的合乎需要的物理性质包括热稳定性高以及热折叠和解折叠之间可逆。已应用了几种方法来提高蛋白质和酶的表观热稳定性，包括基于与高度相似的热稳定性序列的比较进行的合理设计、稳定化的二硫键的设计、用以提高α-螺旋倾向的突变、盐桥的工程构建、蛋白质表面电荷的变更、定向进化和共有序列的组成(Lehmann和Wyss 2001)。高热稳定性是这种支架的期望性质，因为它可提高所获得的重组蛋白质的产率， 改善纯化的分子的溶解性，改善细胞内支架的活性，降低免疫原性和尽可能减少在制造中需要冷链。
发明内容
本发明提供基于III型纤连蛋白(FN3)重复序列蛋白的蛋白质支架、编码核酸或互补核酸、载体、宿主细胞、组合物、组合、制剂、装置以及制备和使用它们的方法。在一个优选的实施例中，蛋白质支架由多个来自人纤连蛋白的FN3结构域的共有序列构成。在又一个优选的实施例中，本发明的蛋白质支架是7个FN3结构域的共有序列。可将本发明的蛋白质支架设计成能结合各种分子，例如细胞靶标蛋白质。
本发明的蛋白质支架可包括另外的分子或部分，例如抗体的Fc区、白蛋白结合结构域或其他影响半寿期的部分。在另外的实施例中，可使本发明的蛋白质支架结合到可编码该蛋白质支架的核酸分子。
本发明还提供至少一种在宿主细胞中表达至少一种基于多个FN3结构域的共有序列的蛋白质支架的方法，所述方法包括将本文所述的宿主细胞在其中至少一种蛋白质支架能以可检测和/或可回收的量表达的条件下进行培养。
本发明还提供至少一种组合物，其包含：(a)基于多个FN3结构域的共有序列的蛋白质支架和/或本文所述的编码核酸；和(b)合适的和/或可药用的载体或稀释剂。
本发明还包括基于纤连蛋白III型(FN3)重复序列蛋白、优选多个FN3结构域的共有序列、更优选多个来自人纤连蛋白的FN3结构域的共有序列来产生蛋白质支架的文库的方法。该文库是通过在该支架的几个部分(例如环区域)中的特定位置改变(通过突变来改变)分子中的氨基酸或氨基酸数目来制备连续几代的支架而形成的。可通过改变单个环的氨基酸组成或者同时改变多个环来产生文库。被改变的环可相应地延长或缩短。可将这种文库产生成包括每个位置处的所有可能的氨基酸或者指定的氨基酸子集。文库成员可用于通过展示进行筛选，所述展示例如体外展示(DNA、RNA＝核糖体展示)和噬菌体展示。
本发明的蛋白质支架提供增强的生物物理性质，如在还原条件下的稳定性和在高浓度下的溶解性；它们可在原核生物系统(如大肠杆菌)中、在真核生物系统(如酵母)中和在体外转录/翻译系统(如兔网织红细胞溶解物系统)中表达和折叠。
在另外的一个方面，本发明提供通过用靶标淘选本发明的支架文库并检测结合物来产生能结合特定靶标的支架分子的方法。在其他相关的方面，本发明包括可用于产生具有期望的活性(例如能够以一定的亲和力结合靶标蛋白质)的蛋白质支架并使其亲和力成熟的方法。亲和力成熟可通过反复进行几轮诱变并用诸如噬菌体展示或体外展示的系统进行选择来完成。此过程中的诱变可以是对特定的支架残基的定点诱变、易错PCR所致的随机诱变、DNA改组和/或这些技术的组合所产生的结果。本发明还提供本文所述的任何发明。
附图说明
图1.FN3结构域的结构。人纤连蛋白的第10个FN3结构域的晶体结构(PDB 1TTF)(Main等人，Cell 71：671-8，1992)。标示出了已进行了多样化的B:C环、D:E环和F:G环。
图2A-N.纯化的人纤连蛋白FN3结构域(第7个结构域除外)的解链曲线，在PBS pH 7.4中通过DSC测定。
图3.人纤连蛋白的15个FN3结构域的多序列比对。比对是用VectorNTI软件生成。
图4.人纤连蛋白的FN3结构域1、5、8、10、12、14和15的多序列比对。比对是用VectorNTI软件生成。
图5A和B.fibcon的表达和纯化。A)4-12％SDS-PAGE分析，显示了总细胞裂解物、可溶性级份、Ni-NTA流过物、从Ni-NTA柱洗脱出的级份。B)fibcon在PBS中的Superdex 75纯化。箭头显示分子量标准物的洗脱体积和质量。
图6.fibcon在PBS pH 7.4中的差示扫描量热测定。
图7.Gu-HCl引起的fibcon解折叠，由内在色按荧光监测到。在280nm波长处激发，在365nm处发射。
图8.fibcon的氨基酸序列，显示了A-B环、B-C环、C-D环、D-E环、E-F环、F-G环的位置。
具体实施方式
本发明提供基于来自人纤连蛋白的纤连蛋白III型(FN3)重复序列蛋白的分离的、重组的和/或合成的蛋白质支架，包括但不限于哺乳动物来源的支架，以及包含至少一个编码基于第十个FN3结构域的蛋白质支架的多核苷酸的组合物和编码核酸分子。本发明还包括但不限于制备和使用这种核酸和蛋白质支架的方法，包括诊断组合物和治疗组合物、方法和装置在内。
本发明的蛋白质支架s具有优于常规治疗剂的优点，如能够局部给予、口服给予或者跨越血脑屏障给予；能够在大肠杆菌中表达，使得与哺乳动物细胞表达相比，蛋白质表达相对于资源而言提高；能够工程改造成可结合多个靶标或者同一靶标的多个表位的双特异性分子；能够缀合到药物、聚合物和探针；能够配制成高浓度；且这类分子能够有效地渗透患病组织和肿瘤。
此外，所述蛋白质支架具有抗体的许多性质，这和它们的与抗体可变区相仿的折叠有关。这个取向使得FN3环能够像抗体互补决定区(CDR)那样被暴露。它们应当能够结合细胞靶标，且可对环进行改变(例如亲和力成熟)以改善某些结合性质或相关性质。
本发明的蛋白质支架的六个环中有三个在拓扑学上对应于抗体的互补决定区(CDR 1-3)(即抗原结合区)，而其余三个环以与抗体CDR相似的方式在表面上暴露。这些环跨越SEQ ID NO：16的13-16、22-28、38-43、51-54、60-64和75-81，如下表3和图8中所示。优选地，改变残基22-28、51-54和75-81处的环区域的结合特异性和亲和力。对这些环区域作任意排列以扩充文库，并可从该文库选出对特定蛋白质靶标具有高亲和力的强效结合物。所述环区域中的一个或多个可像抗体CDR与靶标蛋白发生相互作用那样与该蛋白发生相互作用。
本发明的支架可掺入其他的亚单位，例如通过共价相互作用掺入。可将抗体恒定区的全部或一部分连接到该支架，以赋予抗体样性质，例如补体活性(ADCC)、半寿期等。例如，可例如通过修饰C1q结合和/或FcγR结合从而改变CDC活性和/或ADCC活性，来提供和/或控制效应子功能。“效 应子功能”负责激活或减弱生物活性(例如在受试者中)。效应子功能的例子包括但不限于：C1q结合、补体依赖性细胞毒性(CDC)、Fc受体结合、抗体依赖性细胞介导细胞毒性(ADCC)、吞噬作用、细胞表面受体(例如B细胞受体(BCR))的下调等。这类效应子功能可能要求Fc区与结合结构域(例如蛋白质支架环)相组合，可用各种测定法(例如Fc结合测定、ADCC测定、CDC测定等)进行评估。
另外，可将毒素缀合物、白蛋白或白蛋白结合物、聚乙二醇(PEG)分子连接到支架分子以获得期望的性质。任何这些融合物可通过标准的技术产生，例如通过从使用可公开获得的基因序列构建的重组融合基因表达融合蛋白来产生。
本发明的支架可以以单聚形式用作单特异性支架，或者以多聚体形式用作双特异性或多特异性支架(针对不同的蛋白质靶标或同一蛋白质靶标上的多个表位)。连接可以是共价连接或非共价连接。例如，二聚双特异性支架有一个亚单位对第一靶标蛋白或表位具有特异性，而第二个亚单位对第二靶标蛋白或表位有特异性。支架亚单位可以以多种能提高抗原结合的结合价从而提高抗原结合的亲合力的构象进行连接。
本文所用的“抗体”包括任何这样的含蛋白质或肽的分子，它包含免疫球蛋白分子的至少一部分，如但不限于重链或轻链的至少一个互补决定区(CDR)或其配体结合部分、重链或轻链可变区、重链或轻链恒定区、构架区、或者它们的任何部分。这种抗体任选地还影响特异性配体，如但不限于这种抗体在体外、在原位和/或在体内调节、降低、提高、拮抗、激动、缓和、减轻、阻断、抑制、消除和/或干扰至少一种活性或结合，或者干扰受体活性或结合。
术语“抗体”还意在涵盖抗体及其消化片段、指定部分和变体，包括但不限于抗体模拟物或者包含模拟某种抗体或其指定片段或部分的结构和/或功能的抗体部分，包括但不限于单链抗体、单结构域抗体及其片段。功能片段包括能结合特定靶标的抗原结合片段。例如本发明涵盖能够结合特定靶标或其部分的抗体片段，包括但不限于Fab片段(例如通过木瓜蛋白酶消化)、Fab′片段(例如通过胃蛋白酶消化和部分还原)和F(ab’)2片段(例如通过胃蛋白酶消化)、facb片段(例如通过纤溶酶消化)、pFc’片段(例如 通过胃蛋白酶或纤溶酶消化)、Fd片段(例如通过胃蛋白酶消化、部分还原和重聚集)、Fv或scFv片段(例如通过分子生物学技术)(参见例如Colligan，Immunology，出处同上)。
通过本领域中已知和/或本文描述的酶促切割、合成或重组技术可制备这些片段。使用其中在天然终止位点上游引入了一个或多个终止密码子的抗体基因也可以产生多种截短形式的抗体。例如，可以将编码F(ab’)2重链部分的组合基因设计成包括编码重链的CH1结构域和/或铰链区的DNA序列。抗体的各个部分可通过常规技术用化学方法连接在一起，或可使用遗传工程技术制备为连续蛋白质。
本发明的支架蛋白可用来在细胞、组织、器官或动物(包括哺乳动物和人类)中测量或引起至少一种如下的疾病或病症，用来诊断、监测、调节、治疗、减轻、帮助预防所述疾病或病症的发生，或者用来减少所述疾病或病症的症状，所述疾病或病症选自但不限于免疫障碍或疾病、心血管障碍或疾病、传染性、恶性和/或神经性障碍或疾病或者其他已知或指定的相关病症中的至少一种。
这种方法可包括将有效量的包含至少一种支架蛋白的组合物或药物组合物给予需要这种调节、治疗、减轻、预防或者症状减少、作用或机制的细胞、组织、器官、动物或患者。有效量可包括经由单次给予(例如推注(bolus))、多次给予或连续给予的约0.001-500mg/kg的量，或者经由单次给予、多次给予或连续给予的能实现0.01-5000μg/ml的血清浓度的量，或者其中的任何有效范围或数值，这按本文所述或相关领域所知使用已知的方法来进行和确定。
本发明的支架蛋白-生产和产生
至少一种本发明的支架蛋白可任选地通过细胞系、混合细胞系、无限增殖化细胞或无限增殖化细胞的克隆群体来生产，这是本领域公知的。参见例如Ausubel等人(编辑)，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，Inc.，NY，NY(1987-2001)；Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor，NY(1989)；Harlow和Lane，Antibodies，a Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，NY(1989)；Colligan等人(编辑)，Current Protocols in Immunology，John Wiley&Sons， Inc.，NY(1994-2001)；Colligan等人，Current Protocols in Protein Science，John Wiley&Sons，NY，NY，(1997-2001)。
可将支架蛋白的氨基酸进行改变、添加和/或缺失，以减少免疫原性或者降低、提高或修饰结合力、亲和力、结合速率(on-rate)、解离速率(off-rate)、亲合力、亲合力、半寿期、稳定性、溶解性或任何其他合适的特性，这是本领域知道的。
任选地，可对支架蛋白进行工程改造，但保留对抗原的高亲和力和其他有利的生物学性质。为实现这个目标，可任选地通过使用亲本序列和工程化改造序列的三维模型对亲本序列和各种概念性的工程改造产物进行分析的这么一个过程来制备支架蛋白。三维模型是本领域技术人员可公共获得的和熟悉的。有计算机程序可供图解和展示选定的候选序列的可能三维构象结构并能测量可能的免疫原性(例如Xencor，Inc.(Monrovia，CA)的Immunofilter程序)。对这些展示结果进行检查，可以分析残基在候选序列的功能发挥中的可能作用，即分析会影响候选支架蛋白结合其抗原的能力的残基。这样，可从亲本序列和参比序列选择残基并进行组合，使得获得期望的特性，如对靶标抗原的亲和力。作为另外一种选择，或者除上述程序之外，可使用其他合适的工程改造方法。
筛选
筛选能特异性结合类似的蛋白质或片段的蛋白质支架，这可便利地用核苷酸(DNA或RNA展示)或者肽展示文库(例如体外展示)来实现。这个方法涉及从一大批肽中筛选具有期望的功能或结构的个体成员。所展示的核苷酸或肽序列其长度可为3-5000个或更多个核苷酸或氨基酸，经常长5-100个氨基酸，通常长约8-25个氨基酸。除了用于产生肽文库的直接化学合成方法之外，有几种重组DNA方法也得到了描述。一种类型涉及在噬菌体或细胞表面上展示肽序列。每个噬菌体或细胞均含有编码具体展示的肽序列的核苷酸序列。这类方法描述于PCT专利申请No.91/17271、91/18980、91/19818和93/08278。
其他的用于产生肽文库的系统同时具有体外化学合成方法和重组方法的各方面。参见PCT专利公开文本No.92/05258、92/14843和96/19256。另参见美国专利No.5,658,754和5,643,768。肽展示文库、载体和筛选试剂盒 可从诸如Invitrogen(Carlsbad，CA)和Cambridge Antibody Technologies(Cambridgeshire，UK)的供应商市售获得。参见例如美国专利No.4704692、4939666、4946778、5260203、5455030、5518889、5534621、5656730、5763733、5767260、5856456(转让给Enzon)；5223409、5403484、5571698、5837500(转让给Dyax)；5427908、5580717(转让给Affymax)；5885793(转让给Cambridge Antibody Technologies)；5750373(转让给Genentech)；5618920、5595898、5576195、5698435、5693493、5698417(转让给Xoma)；Colligan(出处同上)；Ausubel(出处同上)或者Sambrook(出处同上)。
本发明的蛋白质支架能以宽范围的亲和力(KD)结合人蛋白质或其他哺乳动物蛋白质。在一个优选的实施例中，至少一个本发明的蛋白质支架能任选地以高亲和力结合靶标蛋白，例如以等于或小于约10-7M、如但不限于0.1-9.9(或其中的任何范围或数值)X 10-8、10-9、10-10、10-11、10-12、10-13、10-14、10-15或其中的任何范围或数值的KD结合靶标蛋白，这由本领域技术人员所惯用的表面等离子共振或Kinexa方法测定。
蛋白质支架对抗原的亲和力或亲合力可用任何合适的方法实验测定。(参见例如，Berzofsky等人，“Antibody-Antigen Interactions，”载于Fundamental Immunology，Paul，W.E.(编辑)，Raven Press：New York，NY(1984)；Kuby，Janis Immunology，W.H.Freeman and Company：New York，NY(1992)；以及本文所述的方法)。如果在不同的条件(例如盐浓度、pH)下测量，则所测得的某种特定蛋白质支架-抗原相互作用的亲和力可不同。因此，亲和力及其他的抗原结合参数(例如KD、Kon、Koff)的测量优选地用蛋白质支架和抗原的标准化溶液以及标准化缓冲液(如本文所述的缓冲液)来进行。
可用本发明的蛋白质支架进行竞争性测定法，以确定什么蛋白质、抗体和其他拮抗剂与本发明的蛋白质支架竞争与靶标蛋白的结合和/或共享表位区域。这些测定法是本领域普通技术人员熟知的，用来评估各种拮抗剂或配体之间对某种蛋白质上的有限数目的结合位点的竞争。将蛋白质和/或抗体在竞争之前或之后进行固定化或不溶解化，并将结合到靶标蛋白的样品与未结合的样品分离，例如通过倾析(在蛋白质/抗体进行预先不溶解化的情 况下)或通过离心(在蛋白质/抗体在竞争性反应后沉淀出来的情况下)进行分离。另外，可通过蛋白质支架与靶标蛋白的结合或无结合是否会使功能发生改变，例如蛋白质支架分子是否会抑制或增强(例如)标记物的酶活性，来确定竞争性结合。可使用ELISA和其他的功能测定法，这是本领域公知的。
核酸分子
本发明的编码蛋白质支架的核酸分子可为RNA的形式，如mRNA、hnRNA、tRNA或任何其他形式，或者为DNA的形式，包括但不限于克隆获得的或合成产生的cDNA和基因组DNA，以及它们的任何组合。DNA可以为三链的、双链的或单链的或它们的任何组合。DNA或RNA的至少一条链的任何部分可以是编码链，也称为有义链，或其可以是非编码链，也称作反义链。
本发明的分离的核酸分子可包括：包含开放阅读框(ORF)、任选地带有一个或多个内含子(例如但不限于至少一个蛋白质支架的至少一个指定区域)的核酸分子；包含能结合靶标蛋白的蛋白质支架或环区域的编码序列的核酸分子；和包含与上述那些核苷酸序列实质上不同的核苷酸序列、但由于遗传密码的简并性仍能编码该蛋白质支架的核酸分子，如本文中所述和/或本领域中所知的。当然，遗传密码是本领域所熟知的。因此，本领域技术人员产生这种编码本发明的特异性蛋白质支架的简并核酸变体将是常规之举。参见，例如Ausubel等人，同上，并且此类核酸变体包括在本发明中。
如本文所指出，本发明的包含编码蛋白质支架的核酸的核酸分子可包括但不限于：本身编码蛋白质支架片段的氨基酸序列的那些核酸分子；整个蛋白质支架或其部分的编码序列；蛋白质支架、片段或部分以及额外序列的编码序列，如至少一个信号肽或融合肽的编码序列，具有或不具有前述的额外编码序列，如至少一个内含子，与额外的非编码序列一起，包括但不限于非编码的5’序列和3’序列，如在转录、mRNA加工中起作用的经转录的非翻译序列，包括剪接信号和聚腺苷酸化信号(例如mRNA的核糖体结合和稳定化)；编码额外氨基酸(如提供额外功能性的氨基酸)的额外编码序列。因此，可将编码蛋白质支架的序列融合到标志物序列，如编码有利于包含蛋白质支架片段或部分的融合蛋白的纯化的肽的序列。
选择性地与本文所述的多核苷酸杂交的多核苷酸
本发明提供在选择性杂交条件下与本文所公开的多核苷酸杂交的分离的核酸。因而，本实施例的多核苷酸可用于分离、检测和/或定量包含此类多核苷酸的核酸。例如，本发明的多核苷酸可用于鉴定、分离或扩增寄存文库中的部分或全长克隆。在一些实施例中，多核苷酸是分离的基因组序列或cDNA序列，或与来自人或哺乳动物核酸文库的cDNA互补。
优选地，cDNA文库包含至少80％全长序列，优选地至少85％或90％全长序列，更优选地至少95％全长序列。cDNA文库可以进行标准化以增加罕见序列的表现。低或中等严格杂交条件通常但不是唯一地用于与互补序列的序列同一性较低的序列。中等和高严格条件可任选用于同一性较高的序列。低严格条件可使具有约70％序列同一性的序列进行选择性杂交，并且可用于鉴定直系同源或旁系同源序列。
任选地，本发明的多核苷酸将编码由本文所述的多核苷酸所编码的蛋白质支架的至少一部分。本发明的多核苷酸涵盖可用来与编码本发明的蛋白质支架的多核苷酸进行选择性杂交的核酸序列。参见，例如Ausubel，同上；Colligan，同上，各自以引用方式全文并入本文中。
核酸的构建
本发明的分离的核酸可用以下方法技术制备：
(a)重组方法、(b)合成技术、(c)纯化技术和/或
(d)它们的组合，这是本领域公知的。
所述核酸可方便地包含除了本发明的多核苷酸之外的序列。例如，可以将包含一个或多个内切核酸酶限制位点的多克隆位点插入核酸中以帮助该多核苷酸的分离。此外，可以插入可翻译序列以帮助分离翻译出的本发明多核苷酸。例如，六组氨酸标记序列为纯化本发明的蛋白质提供了便利手段。本发明的核酸除编码序列以外，任选是用于本发明的多核苷酸的克隆和/或表达的载体、衔接子或接头。
可将额外序列加入这些克隆和/或表达序列来优化它们在克隆和/或表达中的功能，以帮助分离所述多核苷酸，或改进该多核苷酸向细胞中的导入。克隆载体、表达载体、衔接子或接头的使用是本领域所熟知的(参见，例如，Ausubel，同上；或Sambrook，同上)。
用于构建核酸的重组方法
本发明的分离核酸组合物，例如RNA、cDNA、基因组DNA或它们的任何组合，可用多种本领域技术人员已知的克隆方法从生物来源获得。在一些实施例中，将在严格条件下与本发明多核苷酸选择性杂交的寡核苷酸探针用于在cDNA或基因组DNA文库中鉴定所需序列。RNA的分离及cDNA文库和基因组文库的构建是本领域普通技术人员公知的(参见例如Ausubel，出处同上；或者Sambrook，出处同上)。
核酸筛选和分离方法
cDNA或基因组文库可用基于本发明多核苷酸的序列(例如本文所公开的那些)的探针进行筛选。探针可用于与基因组DNA或cDNA序列杂交以分离相同或不同生物体中的同源基因。本领域的技术人员会知道，可以在测定中采用不同程度的杂交严格性；并且杂交或洗涤介质可以是严格的。随着用于杂交的条件变得更严格，在探针和靶之间必须存在更高程度的互补性才能使双链体形成得以发生。可通过温度、离子强度、pH和部分变性溶剂(如甲酰胺)的存在中的一者或多者，来控制严格性程度。例如，杂交的严格性可通过经由例如将甲酰胺浓度在0％至50％内操纵而改变反应物溶液的极性来方便地加以改变。可检测的结合所需的互补性(序列同一性)的程度将根据杂交介质和/或洗涤介质的严格性而变化。互补性程度将最佳为100％或70-100％或其中的任何范围或数值。然而应当理解，探针和引物中较小的序列变异可以通过减少杂交和/或洗涤介质的严格性进行补偿。
扩增RNA或DNA的方法是本领域熟知的，并且基于本文给出的教导和指导，无需过多实验即可根据本发明进行使用。
已知的DNA或RNA扩增方法包括(但不限于)聚合酶链反应(PCR)和相关扩增方法(参见，例如，授予Mullis等人的美国专利No.4,683,195、No.4,683,202、No.4,800,159、No.4,965,188；授予Tabor等人的No.4,795,699和No.4,921,794；授予Innis的No.5,142,033；授予Wilson等人的No.5,122,464；授予Innis等人的NO.5,091,310；授予Gyllensten等人的No.5,066,584；授予Gelfand等人的No.4,889,818；授予Silver等人的No.4,994,370；授予Biswas的No.4,766,067；Ringold的No.4,656,134)和RNA介导的扩增，该RNA介导的扩增使用靶序列的反义RNA作为双链 DNA合成的模板(授予Malek等人的美国专利No.5,130,238，商品名NASBA)，这些参考文献的全部内容以引用方式并入本文。(参见例如Ausubel，出处同上；或者Sambrook，出处同上。)
例如，可用聚合酶链反应(PCR)技术直接从基因组DNA或cDNA文库扩增本发明的多核苷酸和相关基因的序列。例如PCR和其他体外扩增方法也可用于克隆编码待表达的蛋白质的核酸序列、制备核酸以用作探针来检测样品中所需mRNA的存在，用于核酸测序，或用于其他目的。足以指导技术人员进行体外扩增方法的技术的例子可在Berger(同上)、Sambrook(同上)和Ausubel(同上)以及Mullis等人的美国专利No.4,683,202(1987)；和Innis等人，PCR Protocols A Guide to Methods and Applications，Eds.，Academic Press Inc.，San Diego，CA(1990)中找到。用于基因组PCR扩增的市售试剂盒是本领域已知的。参见例如，Advantage-GC Genomic PCR Kit(Clontech)。另外，例如，T4 gene 32 protein(Boehringer Mannheim)可用于提高长PCR产物的得率。
用于构建核酸的合成方法
本发明的分离的核酸还可通过已知方法通过直接化学合成进行制备(参见，例如Ausubel等人，同上)。化学合成一般会产生单链寡核苷酸，其可以通过与互补序列杂交，或通过用该单链作为模板用DNA聚合酶进行聚合而转变成双链DNA。本领域技术人员会认识到，虽然DNA的化学合成可能局限于约100个或更多个碱基的序列，但更长的序列可通过连接较短序列来获得。
重组表达盒
本发明还提供包含本发明核酸的重组表达盒。本发明的核酸序列，例如编码本发明的蛋白质支架的cDNA或基因组序列，可用来构建可被导入到至少一个期望的宿主细胞中的重组表达盒。重组表达盒通常会包含与转录起始调节序列可操作地连接的本发明多核苷酸，所述转录起始调节序列会引导所述多核苷酸在预定的宿主细胞中的转录。异源和非异源(即內源)启动子两者均可用于引导本发明核酸的表达。
在一些实施例中，可将充当启动子、增强子或其他元件的分离核酸导入在本发明多核苷酸的非异源形式的适当位置中(在上游、在下游或在内含 子中)，以上调或下调本发明的多核苷酸的表达。例如，可通过突变、缺失和/或替换在体內或体外改变內源启动子。
载体和宿主细胞
本发明还涉及包含本发明的分离核酸分子的载体、经遗传工程改造带有所述重组载体的宿主细胞，和涉及通过重组技术生产至少一种蛋白质支架，这是本领域公知的。参见，例如，Sambrook等人，同上；Ausubel等人，同上，各自以引用方式全文并入本文中。
可将所述多核苷酸任选与含有可选择标记的载体连接，以在宿主中增殖。一般来讲，质粒载体在沉淀物例如磷酸钙沉淀物中，或在与带电脂质的复合物中被导入。如果载体是病毒，其可用合适的包装细胞系在体外进行包装并随后转导至宿主细胞中。
应将DNA插入物与合适的启动子可操作地连接。表达构建体还会含有转录起始位点、终止位点以及在转录区中含有用于翻译的核糖体结合位点。该构建体表达的成熟转录物的编码部分将优选包括在待翻译的mRNA开始处的翻译起始密码子和在该mRNA末端适宜位置的终止密码子(例如，UAA、UGA或UAG)，对于哺乳动物或真核细胞表达优选UAA和UAG。
表达载体将优选但任选包括至少一个可选择标记。这类标记包括例如但不限于：对于真核细胞培养物，为甲氨喋呤(MTX)、二氢叶酸还原酶、(DHFR，美国专利No.4,399,216、4,634,665、4,656,134、4,956,288、5,149,636、5,179,017、氨苄青霉素、新霉素(G418)、霉酚酸或谷氨酰胺合成酶(GS，美国专利No.5,122,464、5,770,359、5,827,739)抗性，对于在大肠杆菌和其他细菌或原核生物中培养，为四环素或氨苄青霉素抗性基因(以上专利全部以引用方式并入本文)。用于上述宿主细胞的合适培养基和条件是本领域已知的。合适的载体对于技术人员来说将是显而易见的。载体构建体导入宿主细胞可通过磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、阳离子脂质介导的转染、电穿孔、转导、感染或其他已知方法来实现。此类方法已在本领域中有所描述，例如Sambrook(同上)，第1-4和16-18章；Ausubel(同上)，第1、9、13、15、16章。
至少一种本发明的蛋白质支架可以以修饰的形式(如融合蛋白)表达，并可不仅包括分泌信号，而且包括额外的异源功能区域。例如，可将额 外氨基酸特别是带电氨基酸的区域加到蛋白质支架的N末端，以改进在纯化过程中或者在后续的处理和保存过程中在宿主细胞中的稳定性和保持性。另外，可将肽部分加到本发明的蛋白质支架以有助于纯化。这类区域可在蛋白质支架或其至少一个片段的最终制备之前去除。这些方法在许多标准实验室手册有所描述，例如Sambrook，同上，第17.29-17.42和18.1-18.74章；Ausubel，同上，第16、17和18章。
本领域技术人员可认识到许多表达系统可用于表达编码本发明蛋白质的核酸。或者，可通过在含有编码本发明的蛋白质支架的内源DNA的宿主细胞中开启(通过操纵)，来在宿主细胞中表达本发明的核酸。此类方法是本领域熟知的，例如，如美国专利No.5,580,734、No.5,641,670、No.5,733,746和No.5,733,761中所述，所述专利以引用方式全文并入本文中。
示例性的可用于生产蛋白质支架、其指定部分或变体的细胞培养物有细菌细胞、酵母细胞和哺乳动物细胞，这是本领域知道的。哺乳动物细胞系统通常将是细胞单层的形式，但也可使用哺乳动物细胞悬浮液或生物反应器。在本领域中已经开发了许多能够表达完整糖基化蛋白的合适宿主细胞系，包括COS-1(例如ATCC CRL 1650)、COS-7(例如ATCC CRL-1651)、HEK293、BHK21(例如ATCC CRL-10)、CHO(例如ATCCCRL 1610)和BSC-1(例如ATCC CRL-26)细胞系，Cos-7细胞、CHO细胞、hep G2细胞、P3X63Ag8.653、SP2/0-Ag14、293细胞、HeLa细胞等，它们可容易地从(例如)美国典型培养物保藏中心(Manassas，Va(www.atcc.org))获得。优选的宿主细胞包括淋巴来源的细胞，如骨髓瘤细胞和淋巴瘤细胞。特别优选的宿主细胞是P3X63Ag8.653细胞(ATCC登记号CRL-1580)和SP2/0-Ag14细胞(ATCC登记号CRL-1851)。在尤其优选的实施例中，重组细胞是P3X63Ab8.653或SP2/0-Ag14细胞。
这些细胞的表达载体可包括例如但不限于以下的表达控制序列中的一者或多者：复制起点；启动子(例如晚期或早期SV40启动子、CMV启动子(美国专利No.5,168,062、5,385,839)、HSV tk启动子、pgk(磷酸甘油酸激酶)启动子、EF-1α启动子(美国专利No.5,266,491)、至少一个人启动子；增强子和/或加工信息位点，如核糖体结合位点，RNA剪接位点、聚腺苷酸化位点(例如SV40大T Ag聚A添加位点)和转录终止子序列。参 见，例如，Ausubel等人，同上；Sambrook，等人，同上。可用于产生本发明的核酸或蛋白质的其他细胞也是已知的和/或可例如从美国典型培养物保藏中心细胞系和杂交瘤目录(www.atcc.org)或其他已知的来源或商业来源得到。
当采用真核宿主细胞时，通常将多腺苷酸化或转录终止序列整合进载体内。终止序列的例子是来自牛生长激素基因的多腺苷酸化序列。还可包括用于准确剪接转录物的序列。剪接序列的例子是来自SV40的VP1内含子(Sprague等人，J.Virol.45：773-781(1983))。此外，如本领域所知，可将控制在宿主细胞中的复制的基因序列整合进载体内。
蛋白质支架的纯化
可通过公知的方法从重组细胞培养物回收和纯化蛋白质支架，所述方法包括但不限于A蛋白纯化、硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水相互作用层析、亲和层析、羟磷灰石层析和凝集素层析。高效液相层析(“HPLC”)也可以用于纯化。参见，例如Colligan，Current Protocols in Immunology或Current Protocols in Protein Science，John Wiley&Sons，NY，NY，(1997-2001)，例如第1、4、6、8、9、10章，各自以引用方式全文并入本文中。
本发明的蛋白质支架包括天然纯化的产物、化学合成程序的产物和通过重组技术从原核生物或真核生物宿主(包括例如大肠杆菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)产生的产物。取决于在重组生产程序中所采用的宿主，本发明的蛋白质支架可以是糖基化的，或者可以是非糖基化的。此类方法在许多标准实验室手册中有描述，例如Sambrook，同上，第17.37-17.42节；Ausubel，同上，第10、12、13、16、18和20章，Colligan，Protein Science，同上，第12-14章，所有参考文献都以引用方式全文并入本文中。
氨基酸代码
构成本发明的蛋白质支架的氨基酸往往用缩写表示。可通过氨基酸的单字母代码、三字母代码或者三核苷酸密码子来表示氨基酸，由此指示氨基酸名称，这是本领域众所周知的(参见Alberts，B.等人，Molecular Biology of The Cell，第三版，Garland Publishing，Inc.，New York，1994)。本发明的 蛋白质支架可包含一个或多个由天然突变或人工操纵产生的氨基酸置换、缺失或添加，如本文所指明。可通过本领域知道的方法来鉴定本发明的蛋白质支架中对于功能而言必需的氨基酸，所述方法如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(例如Ausubel，出处同上，第8、15章；Cunningham和Wells，Science244：1081-1085(1989))。后一方法在分子的每个残基处引入单个丙氨酸突变。然后对所产生的突变分子测试生物学活性，如但不限于至少一种中和活性。还可通过结构分析，如晶化、核磁共振或光亲和力标记，来鉴定对于蛋白质支架结合而言关键的位点(Smith等人，J.Mol.Biol.224：899-904(1992)以及de Vos等人，Science 255：306-312(1992))。
技术人员会认识到，本发明包括至少一种本发明的生物活性蛋白质支架。生物活性蛋白质支架的比活性为天然的(非合成的)、内源的或相关的和已知的蛋白质支架的比活性的至少20％、30％或40％，优选地至少50％、60％或70％，最优选地至少80％、90％或95％-1000％或更多。测定和定量酶活性和底物特异性的度量的方法是本领域技术人员公知的。
在另一个方面，本发明涉及通过共价连接有机部分进行修饰的本发明所述蛋白质支架和片段。这种修饰能产生具有改进的药代动力学性质(例如体内血清半寿期延长)的蛋白质支架片段。有机部分可以是线性或支化的亲水聚合基团、脂肪酸基团或脂肪酸酯基团。在具体实施例中，亲水聚合基团可以具有约800至约120,000道尔顿的分子量，并且可以是聚链烷二醇(例如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG))、碳水化合物聚合物、氨基酸聚合物或聚乙烯吡咯烷酮，并且脂肪酸或脂肪酸酯基团可包含约8至约40个碳原子。
本发明的修饰的蛋白质支架和片段可包含一个或多个直接或间接地共价键合到该抗体的有机部分。每个键合到本发明的蛋白质支架或片段的有机部分可独立地为亲水聚合物基团、脂肪酸基团或脂肪酸酯基团。如本文所用，术语“脂肪酸”包括单羧酸和二羧酸。“亲水聚合基团”，该术语在本文中使用时是指在水中比在辛烷中更易溶的有机聚合物。例如，聚赖氨酸在水中比在辛烷中更易溶。因此，本发明涵盖通过共价连接聚赖氨酸来进行修饰的蛋白质支架。适用于修饰本发明的蛋白质支架的亲水聚合物可以是线型的或者带支链的，包括例如聚烷二醇(例如PEG、单甲氧基-聚乙二醇 (mPEG)、PPG等)、碳水化合物(例如葡聚糖、纤维素、寡糖、多糖等)、亲水氨基酸的聚合物(例如聚赖氨酸、聚精氨酸、聚天冬氨酸等)、聚环氧烷烃(例如聚环氧乙烷、聚环氧丙烷等)和聚乙烯吡咯烷酮。优选地，修饰本发明的蛋白质支架的亲水聚合物作为单独的分子实体具有约800至约150,000道尔顿的分子量。例如可使用PEG5000和PEG20,000，其中下标是聚合物的平均分子量(道尔顿)。亲水聚合基团可以由1至约6个烷基、脂肪酸或脂肪酸酯基团取代。由脂肪酸或脂肪酸酯基团取代的亲水聚合物可以通过采用合适的方法制备。例如，可将包含胺基的聚合物与脂肪酸或脂肪酸酯的羧酸根偶联，且可将脂肪酸或脂肪酸酯上的活化羧酸根(如用N，N-羰基二咪唑活化)与聚合物上的羟基偶联。
适用于修饰本发明的蛋白质支架的脂肪酸和脂肪酸酯可以是饱和的，或者可含有一个或多个不饱和单位。适用于修饰本发明的蛋白质支架的脂肪酸包括例如正十二烷酸(C12，月桂酸)、正十四烷酸(C14，肉豆蔻酸)、正十八烷酸(C18，硬脂酸)、正二十烷酸(C20，花生酸)、正二十二烷酸(C22，山嵛酸)、正三十烷酸(C30)、正四十烷酸(C40)、顺式-Δ9-十八烷酸(C18，油酸)、全顺式-Δ5，8，11，14-二十碳四烯酸酯(C20，花生四烯酸)、辛二酸、十四烷二酸、十八烷二酸、二十二烷二酸等。合适的脂肪酸酯包括包含直链或支链的低级烷基的二羧酸的单酯。低级烷基基团可包含一个至约十二个碳原子，优选地一个至约六个碳原子。
修饰的蛋白质支架和片段可用合适的方法来制备，例如通过与一种或多种修饰剂反应来制备。本文所用的“修饰剂”是指包含活化基团的合适有机基团(例如亲水性聚合物、脂肪酸、脂肪酸酯)。“活化基团”是化学部分或官能团，它们可在合适条件下与第二化学基团反应，由此在修饰剂和第二化学基团之间形成共价键。例如，胺反应性活化基团包括亲电子基团，如甲苯磺酸酯、甲磺酸酯、卤素(氯、溴、氟、碘)、N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)等。可以与硫醇反应的活化基团包括，例如，马来酰亚胺、碘代乙酰基、丙烯酰基(acrylolyl)、吡啶基二硫化物、5-硫醇-2-硝基苯甲酸硫醇(TNB-硫醇)等。醛官能团可以与含胺或酰肼的分子偶联，并且叠氮基可以与三价含磷基团反应以形成氨基磷酸酯或磷酰亚胺键。将活化基团引入分子的合适方法是本领域已知的(参见例如Hermanson，G.T.，Bioconjugate  Techniques，Academic Press：San Diego，CA(1996)(Hermanson，G.T.，《生物交联技术》，Academic Press：San Diego(CA)，1996年))。可将活化基团直接键合到该有机基团(例如亲水性聚合物、脂肪酸、脂肪酸酯)，或者通过接头部分来键合，所述接头部分例如二价C1-C12基团，其中一个或多个碳原子可被杂原子如氧、氮或硫取代。合适的接头部分包括例如四乙二醇、-(CH2)3-、-NH-(CH2)6-NH-、-(CH2)2-NH-和-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH-NH-。包含接头部分的修饰剂，可例如通过使单-Boc-烷基二胺(例如单-Boc-乙二胺、单-Boc-二氨基己烷)与脂肪酸在1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺(EDC)存在下反应以在游离胺和脂肪酸羧酸酯之间形成酰胺键来产生。可通过用三氟乙酸(TFA)处理从产物除去Boc保护基以暴露出伯胺，后者可偶联到另一羧酸酯(如所描述)，或者可与马来酸酐反应且所得的产物环化以产生脂肪酸的活化马来酰亚胺基衍生物。(参见例如Thompson等人的WO 92/16221，该专利的全部教导内容以引用方式并入本文。)
可通过使蛋白质支架或片段与修饰剂反应，来生产本发明的修饰的蛋白质支架。例如，可通过采用胺反应性修饰剂(例如PEG的NHS酯)以非位点特异性方式将有机部分键合到蛋白质支架。可用合适的方法来制备包含键合到本发明蛋白质支架特定位点的有机部分的修饰的蛋白质支架和片段，所述方法例如逆蛋白水解作用(Fisch等人，Bioconjugate Chem.，3：147-153(1992)；Werlen等人，Bioconjugate Chem.，5：411-417(1994)；Kumaran等人，Protein Sci.6(10)：2233-2241(1997)；Itoh等人，Bioorg.Chem.，24(1)：59-68(1996)；Capellas等人，Biotechnol.Bioeng.，56(4)：456-463(1997))，以及在Hermanson，G.T.，Bioconjugate Techniques，Academic Press：San Diego，CA(1996)中描述的方法。
包含另外的治疗活性成分的蛋白质支架组合物
本发明的蛋白质支架组合物可任选地还包含有效量的至少一种选自以下至少一者的化合物或蛋白质(小分子或大分子)：抗感染药物、心血管(CV)系统药物、中枢神经系统(CNS)药物、自主神经系统(ANS)药物、呼吸道药物、胃肠(GI)道药物、激素药物、使流体或电解质平衡的药物、血液学药物、抗肿瘤药物、免疫调节药物、眼耳或鼻药物、局部用药物、营养药物等。这类药物是本领域公知的，包括本文给出的每种药物的制剂、适应症、 剂量和给予方式在内(参见例如Nursing 2001 Handbook of Drugs，第21版，Springhouse Corp.，Springhouse，PA，2001；Health Professional’s Drug Guide 2001年版.，Shannon，Wilson，Stang，Prentice-Hall，Inc，Upper Saddle River，NJ；Pharmcotherapy Handbook，Wells等人(编辑)，Appleton&Lange，Stamford，CT；每个文献都以引用方式全文并入本文)。
抗感染药物可为选自选自以下的至少一种：抗阿米巴药或者抗原虫药、抗蠕虫药、抗真菌药、抗疟药、抗结核药或者至少一种抗麻风药、氨基糖苷、青霉素、头孢菌素、四环素类、磺胺药物、氟喹诺、抗病毒药、大环内酯抗感染药和其他抗感染药。心血管药物可为选自以下的至少一种：正性肌力药物、抗心律失常药物、抗心绞痛药物、抗高血压药物、抗血脂药物和其他心血管药物。中枢神经系统药物可为非麻醉性镇痛药中的至少一种，或者选自以下的至少一种：解热药物、非甾体类抗炎药物、麻醉药物或者至少一种阿片样镇痛药物、镇静催眠药物、抗惊厥药物、抗抑郁药物、抗焦虑药物、抗精神病药物、中枢神经系统刺激剂、抗帕金森病药物和其他中枢神经系统药物。自主神经系统药物可为选自以下的至少一种：胆碱能药物(拟副交感神经药物)、抗胆碱能药物、肾腺素能药物(拟交感神经药物)、肾上腺素阻断剂(交感神经抑制剂)、骨骼肌松弛剂和神经肌肉阻断剂。呼吸道药物可为选自以下的至少一种：抗组胺剂、支气管扩张药物、祛痰药物或者至少一种镇咳药物以及其他呼吸道药物。胃肠道药物可为选自以下的至少一种：抗酸剂或者至少一种吸附剂或者至少一种排气药物、消化酶或者至少一种胆石增溶剂、止泻药物、缓泻药物、止吐药物和抗溃疡药物。激素药物可为选自以下的至少一种：皮质类固醇、雄激素或者至少一种促合成代谢类甾醇、雌激素或者至少一种孕酮、促性腺激素、抗糖尿病药物或者至少一种胰高血糖素、甲状腺激素、甲状腺激素拮抗剂、垂体激素和甲状旁腺激素样药物。使流体和电解质平衡的药物可为选自以下的至少一种：利尿剂、电解质或者至少一种置换溶液、酸化剂或者至少一种碱化剂。血液学药物可为选自以下的至少一种：补血剂、抗凝血剂、血液衍生物和溶栓酶。抗肿瘤药物可为选自以下的至少一种：烷基化药物、抗代谢药物、抗生素类抗肿瘤药、改变激素平衡的抗肿瘤药以及其他抗肿瘤药物。免疫调节药物可为选自以下的至少一种：免疫抑制剂、疫苗或者至少一种类毒素、抗毒素或者至少一种抗 蛇毒素、免疫血清和生物应答调节剂。眼耳鼻药物可为选自以下的至少一种：眼用抗感染剂、眼用抗炎剂、缩瞳剂、散瞳剂、眼用血管收缩剂、其他眼耳鼻药物。局部用药物可为选自以下的至少一种：局部抗感染剂、杀疥癣剂或者至少一种杀虱剂或局部用皮质类固醇。营养药物可为选自以下的至少一种：维生素、矿物质或热质。参见例如，Nursing 2001 Drug Handbook(同上)的內容。
该至少一种抗阿米巴药或抗原虫药可为选自以下的至少一种：阿托伐醌、盐酸氯喹、磷酸氯喹、甲硝唑、盐酸甲硝唑和依西酸喷他脒。该至少一种抗蠕虫药可为选自以下的至少一种：甲苯达唑、双羟萘酸噻嘧啶和噻苯达唑。该至少一种抗真菌药物可为选自以下的至少一种：两性霉素B、两性霉素B硫酸胆甾醇酯复合物、两性霉素B脂质复合物、两性霉素B脂质体、氟康唑、氟胞嘧啶、微粉化灰黄霉素、超微粉化灰黄霉素、伊曲康唑、酮康唑、制霉菌素和盐酸特比萘芬。该至少一种抗疟药物可为选自以下的至少一种：盐酸氯喹、磷酸氯喹、多西环素、硫酸羟氯喹、盐酸甲氟喹、磷酸伯氨喹、乙胺嘧啶以及乙胺嘧啶与磺胺多辛。该至少一种抗结核药物或抗麻风药物可为选自以下的至少一种：氯法齐明、环丝氨酸、氨苯砜、盐酸乙胺丁醇、异烟肼、吡嗪酰胺、利福布汀、利福平、利福喷汀和硫酸链霉素。该至少一种氨基糖苷可为选自以下的至少一种：硫酸阿米卡星、硫酸庆大霉素、硫酸新霉素、硫酸链霉素和硫酸托普霉素。该至少一种青霉素可为选自以下的至少一种：阿莫西林/克拉维酸钾、三水合阿莫西林、氨苄青霉素、氨苄青霉素钠、三水合氨苄青霉素、氨苄青霉素钠/舒巴坦钠、氯唑西林钠、二氯唑西林钠、美洛西林钠、萘夫西林钠、苯唑西林钠、青霉素G苄星、青霉素G钾、青霉素G普鲁卡因、青霉素G钠、青霉素V钾、哌拉西林钠、哌拉西林钠/三唑巴坦钠、替卡西林二钠和替卡西林二钠/克拉维酸钾。该至少一种头孢菌素可为选自以下的至少一种：头孢克洛、头孢羟氨苄、头孢唑林钠、头孢地尼、盐酸头孢吡肟、头孢克肟、头孢美唑钠、头孢尼西钠、头孢哌酮钠、头孢噻肟钠、头孢替坦二钠、头孢西丁钠、头孢泊肟普塞酯、头孢丙烯、头孢他啶、头孢布烯、头孢唑肟钠、头孢曲松钠、头孢呋辛醋氧乙酯、头孢呋辛钠、盐酸头孢氨苄、一水合头孢氨苄、头孢拉定和氯碳头孢。该至少一种四环素可为选自以下的至少一种：盐酸地美环素、多西环素钙、 海克多西环素、盐酸多西环素、一水合多西霉素、盐酸米诺环素和盐酸四环素。该至少一种磺胺药物可为选自以下的至少一种：复方新诺明、磺胺嘧啶、磺胺甲噁唑、硫代异噁唑和乙酰硫代异噁唑。该至少一种氟喹诺酮可为选自以下的至少一种：甲磺酸阿拉曲沙星、环丙沙星、依诺沙星、左氧氟沙星、盐酸洛美沙星、萘啶酸、诺氟沙星、氧氟沙星、司帕沙星和甲磺酸曲伐沙星。该至少一种氟喹诺酮可为选自以下的至少一种：甲磺酸阿拉曲沙星、环丙沙星、依诺沙星、左氧氟沙星、盐酸洛美沙星、萘啶酸、诺氟沙星、氧氟沙星、司帕沙星和甲磺酸曲伐沙星。该至少一种抗病毒药可为选自以下的至少一种：硫酸阿巴卡韦、阿昔洛韦钠、盐酸金刚烷胺、氨普那韦、西多福韦、甲磺酸地位韦啶、去羟肌苷、依法韦仑、泛昔洛韦、福米韦生钠、膦甲酸钠、更昔洛韦、硫酸茚地那韦、拉米夫定、拉米夫定/齐多夫定、甲磺酸奈非那韦、奈伟拉平、磷酸奥塞米韦、利巴韦林、盐酸金刚乙胺、利托那韦、沙奎那韦、甲磺酸沙奎那韦、司他夫定、盐酸伐昔洛韦、扎西他滨、扎那米韦和齐多夫定。该至少一种大环内酯抗感染药物可为选自以下的至少一种：阿奇霉素、克拉霉素、地红霉素、红霉素碱、依托红霉素、琥乙红霉素、乳糖酸红霉素和硬脂酸红霉素。该至少一种其他抗感染药物可为选自以下的至少一种：氨曲南、杆菌肽、氯霉素琥珀酸钠、盐酸克林霉素、盐酸克林霉素棕榈酸酯、磷酸克林霉素、亚胺培南和西司他汀钠、美罗培南、大结晶型呋喃妥因、微晶型呋喃妥因、奎奴普丁/达福普丁、盐酸壮观霉素、甲氧苄啶和盐酸万古霉素。(参见例如Nursing 2001 Drug Handbook的第24-214页。)
该至少一种正性肌力药物可为选自以下的至少一种：乳酸氨力农、地高辛和乳酸米力农。该至少一种心律失常药物可为选自以下的至少一种：腺苷、盐酸胺碘酮、硫酸阿托品、托西溴苄铵、盐酸地尔硫卓、丙吡胺、磷酸丙吡胺、盐酸艾司洛尔、醋酸氟卡尼、富马酸伊布利特、盐酸利多卡因、盐酸美西律、盐酸莫雷西嗪、苯妥英、苯妥英钠、盐酸普鲁卡因胺、盐酸普罗帕酮、盐酸普萘洛尔、酸式硫酸奎尼丁、葡糖酸奎尼丁、聚半乳糖醛酸奎尼丁、硫酸奎尼丁、索他洛尔、盐酸妥卡尼和盐酸维拉帕米。该至少一种抗心绞痛药物可为选自以下的至少一种：苯磺酸氨氯地平、亚硝酸戊酯、盐酸苄普地尔、盐酸地尔硫卓、硝酸异山梨酯、单硝酸异山梨酯、纳多洛尔、盐酸 尼卡地平、硝苯地平、硝化甘油、盐酸普萘洛尔、维拉帕米和盐酸维拉帕米。该至少一种抗高血压药物可为选自以下的至少一种：盐酸醋丁洛尔、苯磺酸氨氯地平、阿替洛尔、盐酸贝那普利、盐酸倍他洛尔、富马酸比索洛尔、坎地沙坦西酯、卡托普利、盐酸卡替洛尔、卡维地洛、可乐定、盐酸可乐定、二氮嗪、盐酸地尔硫卓、甲磺酸多沙唑嗪、依那普利、马来酸依那普利、甲磺酸依普罗沙坦、非洛地平、甲磺酸非诺多泮、福辛普利钠、醋酸胍那苄、硫酸胍那决尔、盐酸胍法辛、盐酸肼屈嗪、厄贝沙坦、伊拉地平、盐酸拉贝洛尔、赖诺普利、氯沙坦钾、甲基多巴、盐酸甲基多巴、琥珀酸美托洛尔、酒石酸美托洛尔、米诺地尔、盐酸莫尔普利、纳多洛尔、盐酸尼卡地平、硝苯地平、尼索地平、硝普钠、硫酸喷布洛尔、培哚普利特丁胺、甲磺酸酚妥拉明、吲哚洛尔、盐酸哌唑嗪、盐酸普萘洛尔、盐酸喹那普利、雷米普利、替米沙坦、盐酸特拉唑嗪、马来酸噻吗洛尔、群多普利、缬沙坦和盐酸维拉帕米。该至少一种抗血脂药物可为选自以下的至少一种：阿托伐他汀钙、西立伐他汀钠、消胆胺、盐酸考来替泊、非诺贝特(微粉)、氟伐他汀钠、吉非贝齐、洛伐他汀、烟酸、普伐他汀钠和辛伐他汀。该至少一种其他心血管药物可为选自以下的至少一种：阿昔单抗、前列地尔、盐酸阿布他明、西洛他唑、硫酸氢氯吡格雷、双嘧达莫、依替巴肽、盐酸米多君、己酮可可碱、盐酸噻氯匹定和盐酸替罗非班。(参见例如Nursing 2001 Drug Handbook的第215-336页。)
该至少一种非麻醉性镇痛药物或解热药物可为选自以下的至少一种：对乙酰氨基酚、阿司匹林、三水杨酸胆碱镁、二氟尼柳和水杨酸镁。该至少一种非甾体类抗炎药物可为选自以下的至少一种：塞来考昔、双氯芬酸钾、双氯芬酸钠、依托度酸、非诺洛芬钙、氟比洛芬、布洛芬、吲哚美辛、三水合吲哚美辛钠、酮洛芬、酮咯酸氨丁三醇、萘丁美酮、萘普生、萘普生钠、噁丙嗪、吡罗昔康、罗非考昔和舒林酸。该至少一种麻醉药物或阿片样镇痛药物可为选自以下的至少一种：盐酸阿芬太尼、盐酸丁丙诺啡、酒石酸布托啡诺、磷酸可待因、硫酸可待因、柠檬酸芬太尼、芬太尼透皮系统、芬太尼透粘膜片剂、盐酸二氢吗啡酮、盐酸哌替啶、盐酸美沙酮、盐酸吗啡、硫酸吗啡、酒石酸吗啡、盐酸纳布啡、盐酸羟考酮、果胶酸羟考酮、盐酸羟吗啡酮、盐酸喷他佐辛、盐酸喷他佐辛和盐酸纳洛酮、乳酸喷他佐辛、盐酸丙氧 芬、萘磺酸丙氧芬、盐酸瑞芬太尼、柠檬酸舒芬太尼和盐酸曲马多。该至少一种镇静催眠药物可为选自以下的至少一种：水合氯醛、舒乐安定、盐酸氟西泮、苯巴比妥、戊巴比妥钠、苯巴比妥钠、司可巴比妥钠、替马西泮、三唑仑、扎来普隆和酒石酸唑吡坦。该至少一种抗惊厥药物可为选自以下的至少一种：乙酰唑胺钠、卡马西平、氯硝西泮、氯氮卓二钾、地西泮、双丙戊酸钠、乙琥胺、磷苯妥英钠、加巴喷丁、拉莫三嗪、硫酸镁、苯巴比妥、苯巴比妥钠、苯妥英、苯妥英钠、苯妥英钠(延释)、扑米酮、盐酸噻加宾、托吡酯、丙戊酸钠和丙戊酸。该至少一种抗抑郁药物可为选自以下的至少一种：盐酸阿米替林、双羟萘酸阿米替林、阿莫沙平、盐酸安非他酮、氢溴酸西酞普兰、盐酸氯米帕明、盐酸地昔帕明、盐酸多塞平、盐酸氟西汀、盐酸丙咪嗪、双羟萘酸丙咪嗪、米氮平、盐酸奈法唑酮、盐酸去甲替林、盐酸帕罗西汀、硫酸苯乙肼、盐酸舍曲林、硫酸反苯环丙胺、马来酸曲米帕明和盐酸文拉法辛。该至少一种抗焦虑药物可为选自以下的至少一种：阿普唑仑、盐酸丁螺环酮、利眠宁、盐酸利眠宁、二钾氯氮卓、地西泮、盐酸多塞平、恩波酸羟嗪、盐酸羟嗪、双羟萘酸羟嗪、劳拉西泮、甲丙氨酯(mephrobamate)、盐酸咪达唑仑和奥沙西泮。该至少一种抗精神病药物可为选自以下的至少一种：盐酸氯丙嗪、氯氮平、氟非那嗪癸酸酯、氟非那嗪庚酸酯、盐酸氟非那嗪、氟哌啶醇、癸酸氟哌啶醇、乳酸氟哌啶醇、盐酸洛沙平、丁二酸洛沙平、苯磺酸美索达嗪、盐酸吗茚酮、奥氮平、奋乃静、匹莫齐特、丙氯拉嗪、富马酸喹硫平、利培酮、盐酸甲硫达嗪、氨砜噻吨、盐酸氨砜噻吨和盐酸三氟拉嗪。该至少一种中枢神经系统刺激剂可为选自以下的至少一种：硫酸苯丙胺、咖啡因、硫酸右苯丙胺、盐酸多沙普仑、盐酸甲基苯丙胺、盐酸哌甲酯、莫达非尼、匹莫林和盐酸芬特明。该至少一种抗帕金森病药物可为选自以下的至少一种：金刚烷胺盐酸盐、甲磺酸苯扎托品、盐酸比哌立登、乳酸比哌立登、甲磺酸溴隐亭、卡比多巴-左旋多巴、恩他卡朋、左旋多巴、甲磺酸培高利特、二盐酸普拉克索、盐酸罗匹尼罗、盐酸司来吉兰、托卡朋和盐酸苯海索。该至少一种其他中枢神经系统药物可为选自以下的至少一种：盐酸安非他酮、盐酸多奈哌齐、氟哌利多、马来酸氟伏沙明、碳酸锂、柠檬酸锂、盐酸那拉曲坦、尼古丁离子交换树脂复合物、尼古丁透皮系统、丙泊酚、苯甲酸利扎曲坦、盐酸西布曲明单水合物、琥珀酸舒 马曲坦、盐酸他克林和佐米曲坦。(参见例如Nursing 2001 Drug Handbook的第337-530页。)
该至少一种胆碱能药物(例如拟副交感神经药物)可为选自以下的至少一种：氯化氨甲酰甲胆碱、氯化腾喜龙氯、溴化新斯的明、甲硫酸新斯的明、水杨酸毒扁豆碱和溴化吡啶斯的明。该至少一种抗胆碱能药物可为选自以下的至少一种：硫酸阿托品、盐酸双环胺、吡咯糖、莨菪碱、硫酸莨菪碱、溴化丙胺太林、东莨菪碱、丁溴东莨菪碱和氢溴酸东莨菪碱。该至少一种肾腺素能药物(拟交感神经药物)可为选自以下的至少一种：盐酸多巴酚丁胺、盐酸多巴胺、重酒石酸间羟胺、重酒石酸去甲肾上腺素、盐酸肾上腺素、盐酸伪麻黄碱和硫酸伪麻黄碱。该至少一种肾上腺素阻断剂(交感神经抑制剂)可为选自以下的至少一种：甲磺酸二氢麦角胺、酒石酸麦角胺、马来酸二甲麦角新碱和盐酸普萘洛尔。该至少一种骨骼肌松弛剂可为选自以下的至少一种：巴氯芬、卡立普多、氯唑沙宗、盐酸环苯扎林、丹曲林钠、美索巴莫和盐酸替扎尼定。该至少一种神经肌肉阻断剂可为选自以下的至少一种：苯磺酸阿曲库铵、顺苯磺酸阿曲库铵、多库氯铵、米库氯铵、泮库溴铵、哌库溴铵、雷帕库溴铵、罗库溴铵、氯化琥珀胆碱、氯化筒箭毒碱和维库溴铵。(参见例如Nursing 2001 Drug Handbook的第531-84页。)
该至少一种抗组胺剂可为选自以下的至少一种：马来酸溴苯那敏、盐酸西替利嗪、马来酸氯苯那敏、富马酸氯马斯汀、盐酸赛庚啶、盐酸苯海拉明、盐酸非索非那定、氯雷他定、盐酸异丙嗪、茶氯酸异丙嗪和盐酸曲普利啶。该至少一种支气管扩张药物可为选自以下的至少一种：沙丁胺醇、硫酸沙丁胺醇、氨茶碱、硫酸阿托品、硫酸麻黄碱、肾上腺素、重酒石酸肾上腺素、盐酸肾上腺素、异丙托溴铵、异丙肾上腺素、盐酸异丙肾上腺素、硫酸异丙肾上腺素、盐酸左旋沙丁胺醇、硫酸奥西那林、胆茶碱、醋酸吡布特罗、羟萘甲酸沙美特罗、硫酸特布他林和茶碱。该至少一种祛痰药物或镇咳药物可为选自以下的至少一种：苯佐那酯、磷酸可待因、硫酸可待因、氢溴酸右美沙芬、盐酸苯海拉明、愈创甘油醚和盐酸氢吗啡酮。该至少一种其他呼吸道药物可为选自以下的至少一种：乙酰半胱氨酸、二丙酸倍氯米松、贝雷克坦、布地奈德、卡尔法坦、色甘酸钠、阿法链道酶、依前列醇钠、氟尼缩松、丙酸氟替卡松、盂鲁司特钠、奈多罗米钠、帕利珠单抗、曲安萘德、 扎鲁司特和齐留通。(参见例如Nursing 2001 Drug Handbook的第585-642页。)
该至少一种抗酸剂、吸附剂或排气药物可为选自以下的至少一种：碳酸铝、氢氧化铝、碳酸钙、镁铝水合物、氢氧化镁、氧化镁、西甲硅油和碳酸氢钠。该至少一种消化酶或胆石增溶剂可为选自以下的至少一种：胰酶制剂、胰脂肪酶和熊去氧胆酸。该至少一种止泻药物可为选自以下的至少一种：凹凸棒石粘土、次水杨酸铋、聚卡波非钙、盐酸地芬诺酯和硫酸阿托品、洛哌丁胺、醋酸奥曲肽、鸦片酊和鸦片酊(含樟脑)。该至少一种缓泻药物可为选自以下的至少一种：比沙可啶、聚卡波非钙、美鼠李皮、美鼠李皮芳香流浸膏、美鼠李皮流浸膏、蓖麻油、多库酸钙、多库酸钠、甘油、乳酮糖、柠檬酸镁、氢氧化镁、硫酸镁、甲基纤维素、矿物油、聚乙二醇或电解质溶液、欧车前、番泻叶和磷酸钠。该至少一种止吐药物可为选自以下的至少一种：盐酸氯丙嗪、茶苯海明、甲磺酸多拉司琼、屈大麻酚、盐酸格拉司琼、盐酸氯苯甲嗪、盐酸甲氧氯普胺、盐酸昂丹司琼、奋乃静、丙氯拉嗪、乙二磺酸丙氯拉嗪、马来酸丙氯拉嗪、盐酸异丙嗪、东莨菪碱、马来酸硫乙拉嗪和盐酸曲美苄胺。该至少一种抗溃疡药物可为选自以下的至少一种：西咪替丁、盐酸西咪替丁、法莫替丁、兰索拉唑、米索前列醇、尼扎替丁、奥美拉唑、雷贝拉唑钠、枸橼酸铋雷尼替丁、盐酸雷尼替丁和硫糖铝。(参见例如Nursing 2001 Drug Handbook的第643-95页。)
该至少一种皮质类固醇可为选自以下的至少一种：倍他米松、醋酸倍他米松或倍他米松磷酸钠、倍他米松磷酸钠、醋酸可的松、地塞米松、醋酸地塞米松、地塞米松磷酸钠、醋酸氟氢可的松、氢化可的松、醋酸氢化可的松、环戊丙酸氢化可的松、氢化可的松磷酸钠、氢化可的松琥珀酸钠、甲基泼尼松龙、醋酸甲基泼尼松龙、甲基泼尼松龙琥珀酸钠、泼尼松龙、醋酸泼尼松龙、泼尼松龙磷酸钠、泼尼松龙叔丁乙酯、泼尼松、曲安西龙、曲安萘德和二醋酸曲安西龙。该至少一种雄激素或促合成代谢类甾醇可为选自以下的至少一种：达那唑、氟甲睾酮、甲基睾酮、癸酸诺龙、苯丙酸诺龙、睾酮、环戊丙酸睾酮、庚酸睾酮、丙酸睾酮和睾酮透皮系统。该至少一种雌激素或孕酮可为选自以下的至少一种：酯化雌激素、雌二醇、环戊丙酸雌二醇、雌二醇/醋酸炔诺酮透皮系统、戊酸雌二醇、雌激素(缀合)、硫酸哌 嗪雌酮、炔雌醇、炔雌醇和去氧孕烯、炔雌醇和二醋酸炔诺醇、炔雌醇和去氧孕烯、炔雌醇和二醋酸炔诺醇、炔雌醇和左炔诺孕酮、炔雌醇和炔诺酮、炔雌醇和醋酸炔诺酮、炔雌醇和诺孕酯、炔雌醇和炔诺孕酮、炔雌醇和炔诺酮和醋酸和富马酸亚铁、左炔诺孕酮、醋酸甲羟孕酮、美雌醇和炔诺酮、炔诺酮、醋酸炔诺酮、炔诺孕酮以及孕酮。该至少一种促性腺激素可为选自以下的至少一种：醋酸加尼瑞克、醋酸戈那瑞林、醋酸组氨瑞林和尿促性素。该至少一种抗糖尿病药物或胰高血糖素可为选自以下的至少一种：阿卡波糖、氯磺丙脲、格列美脲、格列吡嗪、胰高血糖素、格列本脲、胰岛素、盐酸二甲双胍、米格列醇、盐酸吡格列酮、瑞格列奈、马来酸罗格列酮和曲格列酮。该至少一种甲状腺激素可为选自以下的至少一种：左甲状腺素钠、碘塞罗宁钠、liotrix和甲状腺剂。该至少一种甲状腺激素拮抗剂可为选自以下的至少一种：甲硫咪唑、碘化钾、碘酸钾(饱和溶液)、丙基硫尿嘧啶、放射性碘(碘化钠131I)、浓碘溶液。该至少一种垂体激素可为选自以下的至少一种：促肾上腺皮质激素、二十四肽促皮质素、醋酸去氨加压素、醋酸亮丙瑞林、库促肾上腺皮质激素、人蛋氨生长素、生长激素和血管升压素。该至少一种甲状旁腺激素样药物可为选自以下的至少一种：骨化二醇、降钙素(人类)、降钙素(鲑鱼)、骨化二醇、双氢速甾醇和依替膦酸二钠。(参见例如Nursing 2001 Drug Handbook的696-796页。)
该至少一种利尿剂可为选自以下的至少一种：乙酰唑胺、乙酰唑胺钠、盐酸阿米洛利、布美他尼、氯噻酮、依他尼酸钠、依他尼酸、速尿、二氢氯噻、吲达帕胺、甘露醇、美托拉宗、螺内酯、托拉塞米、氨苯喋啶、尿素。该至少一种电解质或置换溶液可为选自以下的至少一种：醋酸钙、碳酸钙、氯化钙、柠檬酸钙、葡乳醛酸钙、葡庚糖酸钙、葡萄糖酸钙、乳酸钙、磷酸氢钙、磷酸三钙、葡聚糖(高分子量)、右旋糖酐(低分子量体重)、羟乙基淀粉、氯化镁、硫酸镁、醋酸钾、碳酸氢钾、氯化钾、葡萄糖酸钾、林格注射液、林格注射液(加乳酸)和氯化钠。该至少一种酸化剂或碱化剂可为选自以下的至少一种：碳酸氢钠、乳酸钠和氨丁三醇。(参见例如Nursing 2001 Drug Handbook的797-833页。)
该至少一种补血剂可为选自以下的至少一种：富马酸亚铁、葡萄糖酸亚铁、硫酸亚铁、硫酸亚铁(干)、右旋糖酐铁、山梨醇铁、多糖铁复合物 和葡萄糖酸铁钠复合物。该至少一种抗凝血剂可为选自以下的至少一种：阿地肝素钠、达肝素钠、达那肝素钠、依诺肝素钠、肝素钙、肝素钠和华法林钠。该至少一种血液衍生物可为选自以下的至少一种：白蛋白5％、白蛋白25％、抗血友病因子、抗抑制子凝血复合物、抗凝血酶III(人类)、因子IX(人类)、因子IX复合物和血浆蛋白级分。该至少一种溶栓酶可为选自以下的至少一种：阿替普酶、阿尼普酶、瑞替普酶(重组)、链激酶和尿激酶。(参见例如Nursing 2001 Drug Handbook的834-66页。)
该至少一种烷基化药物可为选自以下的至少一种：白消安、卡铂、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、顺铂、环磷酰胺、异环磷酰胺、洛莫司汀、盐酸氮芥、美法仑、盐酸美法仑、链佐星、替莫唑胺和塞替派。该至少一种抗代谢药物可为选自以下的至少一种：卡培他滨、克拉屈滨、阿糖胞苷、氟尿苷、磷酸氟达拉滨、氟脲嘧啶、羟基脲、巯基嘌呤、甲氨蝶呤、甲氨蝶呤钠和硫鸟嘌呤。该至少一种抗生素类抗肿瘤药可为选自以下的至少一种：硫酸博莱霉素、更生霉素、柠檬酸柔红霉素脂质体、盐酸柔红霉素、盐酸阿霉素、盐酸阿霉素脂质体、盐酸表阿霉素、盐酸伊达比星、丝裂霉素、喷司他丁、普卡霉素和戊柔比星。该至少一种改变激素平衡的抗肿瘤药可为选自以下的至少一种：阿那曲唑、比卡鲁胺、雌莫司汀磷酸钠、依西美坦、氟他胺、醋酸戈舍瑞林、来曲唑、醋酸亮丙瑞林、醋酸甲地孕酮、尼鲁米特、枸橼酸他莫昔芬、睾内酯和枸橼酸托瑞米芬。该至少一种其他抗肿瘤药物可为选自以下的至少一种：天冬酰胺酶、卡介苗(BCG)的(活膀胱内)、达卡巴嗪、多西他赛、依托泊苷、磷酸依托泊苷、盐酸吉西他滨、盐酸伊立替康、米托坦、盐酸米托蒽醌、紫杉醇、培门冬酶、卟吩姆钠、盐酸甲基苄肼、美罗华、替尼泊甙、盐酸拓扑替康、曲妥珠单抗、维甲酸、硫酸长春碱、硫酸长春新碱和酒石酸长春瑞滨。(参见例如Nursing 2001 Drug Handbook的867-963页。)
该至少一种免疫抑制剂可为选自以下的至少一种：咪唑硫嘌呤、巴利昔单抗、环孢素、赛尼哌、淋巴细胞免疫球蛋白、莫罗单抗-CD3、麦考酚酸莫酯、盐酸麦考酚酸莫酯、西罗莫司和他克莫司。该至少一种疫苗或类毒素可为选自以下的至少一种：卡介苗疫苗、霍乱疫苗、白喉和破伤风类毒素(吸附)、白喉和破伤风类毒素和吸附无细胞百日咳疫苗、白喉和破伤风类 毒素和全细胞百日咳疫苗、嗜血杆菌b型缀合疫苗、甲肝疫苗(灭活)、乙肝疫苗(重组)、流感病毒疫苗1999-2000三价类型A和B(纯化表面抗原)、流感病毒疫苗1999-2000三价类型A和B(亚毒粒或纯化亚毒粒)、流感病毒疫苗1999-2000三价类型A和B(全毒粒)、日本脑炎病毒疫苗(灭活)、莱姆病疫苗(重组OspA)、麻疹和腮腺炎和风疹病毒疫苗(活)、麻疹和腮腺炎和风疹病毒疫苗(减毒活)、麻疹病毒疫苗(减毒活)、脑膜炎球菌多糖疫苗、腮腺炎病毒疫苗(活)、鼠疫疫苗、肺炎球菌疫苗(多价)、脊髓灰质炎疫苗(灭活)、脊髓灰质炎疫苗(活、口服、三价)、狂犬病疫苗(吸附)、狂犬病疫苗(人二倍体细胞)、风疹和腮腺炎病毒疫苗(活)、风疹病毒疫苗(活，减毒活)、破伤风类毒素(吸附)、破伤风类毒素(流体)、伤寒疫苗(口服)、伤寒疫苗(胃肠外)、伤寒Vi多糖疫苗、水痘病毒疫苗和黄热病疫苗。该至少一种抗毒素或抗蛇毒素可为选自以下的至少一种：黑寡妇蜘蛛抗蛇毒血清、响尾蛇科抗蛇毒血清(多价)、白喉抗毒素(马)以及金黄珊瑚蛇(Micrurus fulvius)抗蛇毒素。该至少一种免疫血清可为选自以下的至少一种：巨细胞病毒免疫球蛋白(静脉内)、乙肝免疫球蛋白(人类)、肌肉注射用免疫球蛋白、静脉注射用免疫球蛋白、狂犬病免疫球蛋白(人类)、静脉注射用呼吸道合胞病毒免疫球蛋白(人类)、Rh0(D)免疫球蛋白(人类)、静脉注射用Rh0(D)免疫球蛋白(人类)、破伤风免疫球蛋白(人类)和水痘带状疱疹免疫球蛋白。该至少一种生物应答调节剂可为选自以下的至少一种：阿地白介素、红细胞生成素α、非格司亭、注射用醋酸格拉替雷、干扰素α-1、干扰素α-2a的(重组)、干扰素α-2b(重组)、干扰素β-1a、干扰素β-1b(重组)、干扰素γ-1b、盐酸左旋咪唑、奥普瑞白介素和沙格司亭。(参见例如Nursing 2001Drug Handbook的964-1040页。)
该至少一种眼用抗感染剂可选自：杆菌肽、氯霉素、盐酸环丙沙星、红霉素、硫酸庆大霉素、氧氟沙星0.3％、硫酸多粘菌素B、磺胺醋酰钠10％、磺胺醋酰钠15％、磺胺醋酰钠30％、妥布霉素和阿糖腺苷。该至少一种眼用抗炎剂可为选自以下的至少一种：地塞米松、地塞米松磷酸钠、双氯芬酸钠0.1％、氟米龙、氟比洛芬钠、酮咯酸氨丁三醇、醋酸泼尼松龙(混悬剂)和泼尼松龙磷酸钠(溶液剂)。该至少一种缩瞳剂可为选自以下的至 少一种：氯化乙酰胆碱、卡巴可(眼内)、卡巴可(局部用)、依可碘酯、匹鲁卡品、盐酸匹鲁卡品和硝酸匹鲁卡品。该至少一种散瞳剂可为选自以下的至少一种：硫酸阿托品、盐酸环喷托酯、盐酸肾上腺素、硼酸肾上腺素、氢溴酸后马托品、盐酸苯肾上腺素、氢溴酸东莨菪碱和托吡卡胺。该至少一种眼用血管收缩剂可为选自以下的至少一种：盐酸萘甲唑林、盐酸羟甲唑啉和盐酸四氢唑啉。该至少一种其他眼用药物可为选自以下的至少一种：盐酸阿可乐宁、盐酸倍他洛尔、酒石酸溴莫尼定、盐酸卡替洛尔、盐酸地匹福林、盐酸多佐胺、二富马酸依美斯汀、荧光素钠、富马酸酮替芬、拉坦前列素、盐酸左布诺洛尔、盐酸美替洛尔、氯化钠(高渗)和马来酸噻吗洛尔。该至少一种耳用药物可为选自以下的至少一种：硼酸、过氧化脲、氯霉素以及三乙醇胺多肽油酸-凝析物。该至少一种鼻用药物可为选自以下的至少一种：二丙酸倍氯米松、布地奈德、硫酸麻黄碱、盐酸肾上腺素、氟尼缩松、丙酸氟替卡松、盐酸萘甲唑啉、盐酸羟甲唑啉、盐酸去氧肾上腺素、盐酸四氢唑啉、曲安奈德和盐酸赛洛唑啉。(参见例如Nursing 2001 Drug Handbook的1041-97页。)
该至少一种局部抗感染剂可为选自以下的至少一种：阿昔洛韦、两性霉素B、壬二酸霜、杆菌肽、硝酸布康唑、磷酸克林霉素、克霉唑、硝酸益康唑、红霉素、硫酸庆大霉素、酮康唑、醋酸磺胺米隆、甲硝唑(局部)、硝酸咪康唑、莫匹罗星、盐酸萘替芬、硫酸新霉素、呋喃西林、制霉菌素、磺胺嘧啶银、盐酸特比萘芬、特康唑、盐酸四环素、噻康唑和托萘酯。该至少一种杀疥癣剂或杀虱剂可为选自以下的至少一种：克罗米通、林丹、苄氯菊脂和除虫菊酯。该至少一种局部用皮质类固醇可为选自以下的至少一种：二丙酸倍他米松、戊酸倍他米松、丙酸氯倍他索、地索奈德、去羟米松、地塞米松、地塞米松磷酸钠、醋酸双氟拉松、醋酸氟轻松、氟轻松、氟氢缩松、丙酸氟替卡松、哈西奈德、氢化可的松、醋酸氢化可的松、丁酸氢化可的松、戊酸氢化可的松、糠酸莫米松和曲安奈德。(参见例如Nursing 2001Drug Handbook的1098-1136页。)
该至少一种维生素或矿物质可为选自以下的至少一种：维生素A、复合维生素B、氰钴维生素、叶酸、羟钴胺、亚叶酸钙、烟酸、烟酰胺、盐酸吡哆辛、核黄素、盐酸硫胺素、维生素C、维生素D、胆钙化甾醇、钙化 醇、维生素D类似物、多西骨化醇、帕立骨化醇、维生素E、维生素K类似物、植物甲萘醌、氟化钠、氟化钠(局部用)、微量元素、铬、铜、碘、锰、硒和锌。该至少一种热质可为选自以下的至少一种：氨基酸输液(结晶)、氨基酸输液(右旋葡萄糖中)、氨基酸输液(含电解质)、氨基酸输液(含电解质，右旋葡萄糖中)、用于肝功能衰竭的氨基酸输液、用于高代谢压力的氨基酸输液、用于肾功能衰竭的氨基酸输液、右旋葡萄糖、脂肪乳剂和中链甘油三酯。(参见例如Nursing 2001 Drug Handbook的1137-63页。)
本发明的蛋白质支架组合物还可包含任何合适和有效量的这样的组合物和药物组合物的至少一种，该组合物和药物组合物包含被接触或给予需要这种调节、治疗或疗法的细胞、组织、器官、动物或患者的蛋白质支架，任选还包含至少一种选自以下的药剂：至少一种TNF拮抗剂(例如但不限于TNF化学拮抗剂或蛋白质拮抗剂、TNF单克隆或多克隆抗体或片段、可溶性TNF受体(例如p55、p70或p85)或片段、它们的融合多肽、或者小分子TNF拮抗剂(例如TNF结合蛋白I或II(TBP-1或TBP-II))、奈瑞莫单抗、英夫利昔单抗、依那西普、CDP-571、CDP-870、阿非莫单抗、来那西普等)、抗风湿剂(例如甲氨蝶呤、金诺芬、金硫葡糖、硫唑嘌呤、依那西普、硫代苹果酸金钠、硫酸羟氯喹、来氟米特、柳氮磺吡啶)、肌肉松弛剂、麻醉剂(narcotic)、非甾类抗炎药物(NSAID)、止痛药、麻醉剂(anesthetic)、镇静剂、局部麻醉剂、神经肌肉阻断剂、抗微生物剂(例如氨基糖苷、抗真菌剂、抗寄生虫剂、抗病毒剂、碳青霉烯类、头孢菌素、氟喹诺酮、大环内酯、青霉素、磺胺药物、四环素、别的抗微生物剂)、抗牛皮癣剂、皮质类固醇、合成代谢类固醇、糖尿病相关药剂、矿物质、营养剂、甲状腺剂、维生素、钙相关激素、止泻剂、镇咳剂、止吐剂、抗溃疡剂、缓泻剂、抗凝血剂、促红细胞生成素(例如红细胞生成素α)、非格司亭(例如G-CSF、Neupogen)、沙格司亭(GM-CSF、Leukine)、免疫接种剂、免疫球蛋白、免疫抑制剂(例如巴利昔单抗、环胞菌素、达克珠单抗)、生长激素、激素替代药物、雌激素受体调节剂、散瞳剂、睫状肌麻痹剂、烷化剂、抗代谢物、有丝分裂抑制剂、放射性药物、抗抑郁药、抗躁狂剂、抗精神病药物、抗焦虑药物、催眠剂、拟交感神经药物、兴奋剂、多奈哌齐、他 克林、哮喘药物、β激动剂、吸入类固醇、白三烯抑制剂、甲基黄嘌呤、色甘酸、肾上腺素或类似物、阿法链道酶(Pulmozyme)、细胞因子或细胞因子拮抗剂。这种细胞因子的非限制性例子包括但不限于IL-1至IL-32中的任何一个(例如IL-1、IL-2等)。合适的剂量是本领域公知的。参见，例如，Wells等人(编辑)，Pharmacotherapy Handbook，第2版，Appleton and Lange，Stamford，CT(2000)；PDR Pharmacopoeia，Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000，Deluxe Edition，Tarascon Publishing，Loma Linda，CA(2000)，所述参考文献各自以引用方式全文并入本文中。
这种抗癌或抗感染药物还可包括与至少一个本发明的蛋白质支架缔合、结合、共配制或共给予的毒素分子。毒素可任选起到选择性杀死病理性细胞或组织的作用。病理性细胞可以是癌细胞或其他细胞。此类毒素可以是(但不限于)纯化的或重组的毒素或包含毒素的至少一个功能性细胞毒性结构域的毒素片段，所述毒素例如选自蓖麻毒素、白喉毒素、毒液毒素或细菌毒素中的至少一者。术语毒素还包括由任何天然存在的、突变型或重组型细菌或病毒产生的内毒素和外毒素，其可在人和其他哺乳动物中引起任何病理状况，包括毒素休克，这可导致死亡。此类毒素可包括(但不限于)肠产毒性大肠杆菌热不稳定肠毒素(LT)、热稳定肠毒素(ST)、志贺氏菌属(Shigella)细胞毒素、气单胞菌属(Aeromonas)肠毒素、中毒性休克综合征毒素-1(TSST-1)、葡萄球菌(Staphylococcal)肠毒素A(SEA)、B(SEB)或C(SEC)、链球菌(Streptococcal)肠毒素等。此类细菌包括(但不限于)下列细菌的菌株：肠产毒性大肠杆菌(ETEC)、肠出血性大肠杆菌(例如血清型O157:H7菌株)、葡萄球菌属(例如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、化脓性葡萄球菌(Staphylococcus pyogenes))、志贺氏菌属(例如痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)、弗氏志贺氏菌(Shigella flexneri)、鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)和宋内氏志贺氏菌(Shigella sonnei))、沙门氏菌属(例如伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、猪霍乱沙门氏菌(Salmonella cholera-suis)、肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis))、梭菌属(例如产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、艰难梭菌(Clostridium dificile)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum))、弯曲菌属(例如Camphlobacter jejuni、Camphlobacter fetus)、螺杆菌属(例如幽门螺杆菌(Heliobacter pylori))、气单 胞菌属(例如温和气单胞菌(Aeromonas sobria)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae))、Pleisomonas shigelloides、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersina enterocolitica)、弧菌属(例如霍乱弧菌(Vibrios cholerae)、副溶血弧菌(Vibrios parahemolyticus))、克雷伯氏菌属，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和链球菌属。参见，例如Stein(编辑)，INTERNAL MEDICINE，第3版，第1-13页，Little，Brown and Co.，Boston，(1990)；Evans等人(编辑)，Bacterial Infections of Humans：Epidemiology and Control，第2版，第239-254页，Plenum Medical Book Co.，New York(1991)；Mandell等人，Principles and Practice of Infectious Diseases，第3版，Churchill Livingstone，New York(1990)；Berkow等人(编辑)，The Merck Manual，第16版，Merck and Co.，Rahway，N.J.，1992；Wood等人，FEMS Microbiology Immunology，76：121-134(1991)；Marrack等人，Science，248：705-711(1990)，所述参考文献的内容以引用方式全文并入本文中。
本发明的蛋白质支架化合物、组合物或组合还可包含任何合适的辅助剂中的至少一种，所述辅助剂例如但不限于稀释剂、粘合剂、稳定剂、缓冲剂、盐、亲脂性溶剂、防腐剂、佐剂等。可药用辅助剂是优选的。制备这类无菌溶液的非限制性例子和方法是本领域公知的，如但不限于Gennaro(编辑)，Remington’s Pharmaceutical Sciences，第18版，Mack Publishing Co.(Easton，PA)1990。可按常规方式选择适合于蛋白质支架、片段或变体组合物的给予方式、溶解性和/或稳定性的药物可接受载体，如本领域所公知或者如本文所述。
可用于本发明组合物的药物赋形剂和添加剂包括但不限于蛋白质、肽、氨基酸、脂质和碳水化合物(例如糖类，包括单糖、双糖、三糖、四糖和寡糖；衍生糖，如醛醇、醛糖酸、酯化糖等；以及多糖或糖聚合物)，它们可单独存在或者以组合的方式存在，单独地或者组合在一起占1-99.99％(重量或体积)。示例性的蛋白质赋形剂包括血清白蛋白，如人血清白蛋白(HSA)、重组人白蛋白(rHA)、明胶、酪蛋白等。还能以缓冲能力起作用的代表性的氨基酸/蛋白质组分包括丙氨酸、甘氨酸、精氨酸、甜菜碱、组氨 酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、天冬甜素等。一种优选的氨基酸是甘氨酸。
适用于本发明的碳水化合物赋形剂包括例如单糖，如果糖、麦芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖等；双糖，如乳糖、蔗糖、海藻糖、纤维二糖等；多糖，如棉子糖、松三糖、麦芽糖糊精、右旋糖苷、淀粉等；以及醛醇，如甘露糖醇、木糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、木糖醇、山梨糖醇(葡萄糖醇)、肌醇等。用于在本发明中使用的优选碳水化合物赋形剂是甘露糖醇、海藻糖和棉子糖。
蛋白质支架组合物还可包括缓冲剂或pH调节剂；通常缓冲剂为从有机酸或有机碱制备的盐。代表性的缓冲剂包括有机酸盐，如柠檬酸、抗坏血酸、葡糖酸、碳酸、酒石酸、琥珀酸、乙酸或邻苯二甲酸的盐；Tris、盐酸氨丁三醇或磷酸盐缓冲剂。优选用于本发明组合物的缓冲剂是有机酸盐，如柠檬酸盐。
另外，本发明的蛋白质支架组合物可包括聚合赋形剂/添加剂，如聚乙烯吡咯烷酮、ficolls(一种聚合糖)、dextrates(例如环糊精，如2-羟丙基-β-环糊精)、聚乙二醇、矫味剂、抗微生物剂、甜味剂、抗氧化剂、抗静电剂、表面活性剂(例如聚山梨醇酯，如“TWEEN 20”和“TWEEN80”)、脂质(例如磷脂、脂肪酸)、类固醇(例如胆固醇)和螯合剂(例如EDTA)。
这些和另外的适用于本发明蛋白质支架、部分或变体组合物的已知药物赋形剂和/或添加剂是本领域知道的，例如列于“Remington：The Science&Practice of Pharmacy”，第19版，Williams&Williams，(1995)，和列于“Physician’s Desk Reference”，第52版，Medical Economics，Montvale，NJ(1998)，这两个参考文献的公开内容以引用方式全文并入本文。优选的载体或赋形剂材料是碳水化合物(例如糖和糖醇)和缓冲剂(例如柠檬酸盐)或聚合剂。示例性的载体分子是透明质酸这种黏多糖，其可用于进行关节内递送。
制剂
如上所指出，本发明提供优选包含具有盐水或选定的盐的磷酸盐缓冲剂的稳定制剂，以及含有防腐剂的防腐溶液和制剂，以及适合于医药用途或 兽医用途的多用途防腐制剂，这些制剂包含至少一种在可药用的配方中的蛋白质支架。防腐制剂含有至少一种处于水性稀释液中的已知防腐剂，所述防腐剂任选选自以下至少一种：苯酚、间甲酚、对甲酚、邻甲酚、氯甲酚、苄醇、亚硝酸苯汞、苯氧基乙醇、甲醛、氯丁醇、氯化镁(例如六水合物)、对羟基苯甲酸烷基酯(甲酯、乙酯、丙酯、丁酯等)、苯扎氯铵、苄索氯铵、脱氢乙酸钠和硫柳汞、它们的聚合物或混合物。可以使用本领域知道的任何合适的浓度或混合比，如约0.0015％，或者其中的任何范围、数值或分数。非限制性例子包括：无防腐剂、约0.1-2％间甲酚(例如0.2、0.3、0.4、0.5、0.9、1.0％)、约0.1-3％苄醇(例如0.5、0.9、1.1、1.5、1.9、2.0、2.5％)、约0.001-0.5％硫柳汞(例如0.005、0.01)、约0.001-2.0％苯酚(例如0.05、0.25、0.28、0.5、0.9、1.0％)、0.0005-1.0％对羟基苯甲酸烷基酯(例如0.00075、0.0009、0.001、0.002、0.005、0.0075、0.009、0.01、0.02、0.05、0.075、0.09、0.1、0.2、0.3、0.5、0.75、0.9、1.0％)等。
如上所指出，本发明提供一种这样的制品，其包括包装材料和至少一个小瓶，该小瓶包含至少一种蛋白质支架与任选地在水性稀释液中的规定的缓冲剂和/或防腐剂所成的溶液，其中所述包装材料包含一标签，该标签说明这种溶液可保持1、2、3、4、5、6、9、12、18、20、24、30、36、40、48、54、60、66、72小时或更长时间。本发明还包括这样的制品，其包括包装材料、包含经冷冻干燥的至少一种蛋白质支架的第一小瓶和包含规定的缓冲剂或防腐剂的水性稀释液的第二小瓶，其中所述包装材料包括一标签，该标签指导患者将该至少一种蛋白质支架在该水性缓冲液中进行复水以形成可保持24小时或更长时间的溶液。
按照本发明来使用的该至少一种蛋白质支架可通过重组方法生产，包括从哺乳动物细胞或转基因制品生产，或者可从其他生物来源纯化，如本文中所述或者如本领域所知。
至少一种蛋白质支架在本发明的产物中的含量范围包括这样的量，如果是在湿/干系统中，在复水时所述量会产生约1.0μg/ml至约1000mg/ml，尽管更低的和更高的浓度也是可行的且取决于预定的递送介质，例如溶液制 剂将不同于透皮贴剂方法、肺部方法、透粘膜方法或者渗透泵或微型泵方法。
优选的是，水性稀释液还任选包含可药用防腐剂。优选的防腐剂包括选自如下的那些：苯酚、间甲酚、对甲酚、邻甲酚、氯甲酚、苄醇、对羟基苯甲酸烷基酯(甲基酯、乙基酯、丙基酯、丁基酯等)、烷基苄基二甲基氯化铵、氯化苄乙氧铵、脱氢乙酸钠和硫柳汞或其混合物。在制剂中使用的防腐剂的浓度是足以产生抗微生物作用的浓度。该浓度取决于所选防腐剂且容易由技术人员确定。
其他的赋形剂，例如等渗剂、缓冲剂、抗氧化剂和防腐增强剂，也可任选地和优选地加到该稀释液中。等渗剂例如甘油常常以已知的浓度使用。优选加入生理学耐受的缓冲剂以提供改善的pH控制。制剂可以覆盖宽的pH范围，例如约pH 4至约pH 10，并且优选的范围是约pH 5至约pH 9，并且最优选的范围是约6.0至约8.0。优选地，本发明的制剂的pH在约6.8至约7.8之间。优选的缓冲液包括磷酸盐缓冲液，最优选地为磷酸钠，特别是磷酸缓冲盐水(PBS)。
其他的添加剂，如可药用的增溶剂，比如Tween 20(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单月桂酸酯)、Tween 40(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单棕榈酸酯)、Tween 80(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯)、Pluronic F68(聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物)和PEG(聚乙二醇)或者非离子型表面活性剂如聚山梨醇酯20或80或者泊洛沙姆184或188、Pluronicpolyls、其他嵌段共聚物，以及螯合物如EDTA和EGTA，可任选地添加到配方或组合物中以减少聚集现象。如果使用泵或塑料容器来给予制剂，则这些添加剂是特别有用的。可药用表面活性剂的存在减轻了蛋白质聚集的倾向。
本发明的制剂可通过这样的方法制备，该方法包括将至少一种蛋白质支架与选自以下的防腐剂在水性稀释液中混合：苯酚、间甲酚、对甲酚、邻甲酚、氯甲酚、苄醇、对羟基苯甲酸烷基酯(甲酯、乙酯、丙酯、丁酯等)、苯扎氯铵、苄索氯铵、脱氢乙酸钠和硫柳汞或者它们的混合物。将该至少一种蛋白质支架与防腐剂在水性稀释液中混合，是用常规的溶解和混合程序来进行。为制备合适的制剂，例如将量好数量的、在经缓冲的溶液中的至少一种蛋白质支架与所需的防腐剂在经缓冲的溶液中进行组合，后一经缓 冲的溶液其数量足以将所述蛋白质和防腐剂以所需的浓度提供。该方法的变型形式会是本领域普通技术人员认识到的。例如，组分添加的顺序、是否使用另外的添加剂、制剂制备时的温度和pH都是可以为所用的给药浓度和方式进行最优化的因素。
受权利要求书保护的制剂可作为澄清溶液提供给患者，或者以两个小瓶来提供给患者，其中一个小瓶装着经冷冻干燥的至少一种蛋白质支架，该蛋白质支架用装有水、在水性稀释液中的防腐剂和/或赋形剂(优选地，磷酸盐缓冲剂和/或盐水和选定的盐)的第二小瓶进行复水。单个溶液小瓶或需要复水的双小瓶都可以多次再次使用，并且可以满足患者治疗的单个或多个周期，且因此可以提供比目前可用的治疗方案更方便的治疗方案。
本发明受权利要求书保护的制品可用于从立即到24小时或更长的时间里进行给药。因此，本发明受权利要求书保护的制品能给患者提高明显优点。本发明的配方可任选地在约2℃至约40℃的温度下安全保藏并长时间保持蛋白质的生物活性，从而允许包装标签说明该溶液可在6、12、18、24、36、48、72或96小时或更长时间内保持和/或使用。如果使用防腐稀释剂，则该标签可说明使用期可长达1-12个月、半年、一年半和/或两年。
本发明的至少一种蛋白质支架的溶液可通过这样的方法进行制备，该方法包括将至少一种蛋白质支架在水性稀释液中进行混合。混合是用常规的溶解和混合程序来进行。为制备合适的稀释液，例如将量好数量的至少一种蛋白质支架在水或缓冲剂中进行组合，该水或缓冲剂的数量足以将该蛋白质和任选地将防腐剂或缓冲剂以所需的浓度提供。该方法的变型形式会是本领域普通技术人员认识到的。例如，组分添加的顺序、是否使用另外的添加剂、制剂制备时的温度和pH都是可以为所用的给药浓度和方式进行最优化的因素。
受权利要求书保护的产品可作为澄清溶液提供给患者，或者以两个小瓶来提供给患者，其中一个小瓶装着经冷冻干燥的至少一种蛋白质支架，该蛋白质支架用装有该水性稀释液的第二小瓶进行复水。单个溶液小瓶或需要复水的双小瓶都可以多次再使用，并且可以满足患者治疗的单个或多个周期，因而提供比目前可用治疗方案的更方便的治疗方案。
可通过将澄清溶液或两个小瓶提供给药房、诊所或其他此类机构和设施，来将受权利要求书保护的产品间接地提供给患者，所述两个小瓶中一个小瓶装着经冷冻干燥的至少一种蛋白质支架，该蛋白质支架用装有该水性稀释液的第二小瓶进行复水。在这个情况中透明溶液体积可最高达一升甚至更大，从而提供大的储备，从中可一次或多次获取该至少一种蛋白质支架溶液的小份供转移到更小的小瓶中，并由药房或诊所提供给它们的消费者和/或患者。
公认的包含单小瓶系统的装置包括用于递送溶液的笔式注射器装置，如BD Pens、BD Autojector、Humaject、NovoPen、B-DPen、AutoPen和OptiPen、GenotropinPen、Genotronorm Pen、Humatro Pen、Reco-Pen、Roferon Pen、Biojector、Iject、J-tip Needle-Free Injector、Intraject、Medi-Ject，例如由以下厂商制造或开发：Becton Dickensen(Franklin Lakes，NJ，www.bectondickenson.com)、Disetronic(Burgdorf，瑞士，www.disetronic.com；Bioject，Portland，Oregon(www.bioject.com)、National Medical Products，Weston Medical(Peterborough，UK，www.weston-medical.com)、Medi-Ject Corp(Minneapolis，MN，www.mediject.com)，以及类似的合适装置。公认的包含双小瓶系统的装置包括那些用于将冻干药物在药筒(cartridge)中复水以递送复水的溶液的笔式注射器系统，如HumatroPen。其他合适的装置的例子包括预充注射器、自动注射器、无针注射器和无针静脉输注组件。
本发明受权利要求书保护的产品包括包装材料。包装材料除了提供管理机构要求的信息之外，还提供本产品可得以使用的条件。对于两小瓶的湿/干产品，本发明的包装材料给患者提供说明，指导他们将至少一种蛋白质支架在水性稀释液中进行复水以形成溶液并在2-24小时或更长时间里使用该溶液。对于单小瓶溶液产品，标签标明此类溶液可以在2-24小时或更长时间段内使用。本发明受权利要求书保护的产品可用于人药物产品用途。
本发明的制剂可通过这样的方法进行制备，该方法包括将至少一种蛋白质支架与选定的缓冲剂(优选地，含有盐水或选定的盐的磷酸盐缓冲剂)进行混合。将至少一种蛋白质支架与缓冲剂在水性稀释液中混合，是用常规的溶解和混合程序来进行。为制备合适的制剂，例如将量好数量的、在水或 缓冲剂中的至少一种蛋白质支架与所需的缓冲剂在水中进行组合，后一水的数量足以将所述蛋白质和缓冲剂以所需的浓度提供。该方法的变型形式会是本领域普通技术人员认识到的。例如，组分添加的顺序、是否使用另外的添加剂、制剂制备时的温度和pH都是可以为所用的给药浓度和方式进行最优化的因素。
受权利要求书保护的稳定的或防腐的制剂可作为澄清溶液提供给患者，或者以两个小瓶来提供给患者，其中一个小瓶装着经冷冻干燥的蛋白质支架，该蛋白质支架用装有在水性稀释液中的防腐剂或缓冲剂和赋形剂的第二小瓶进行复水。单个溶液小瓶或需要复水的双小瓶都可以多次再使用，并且可以满足患者治疗的单个或多个周期，因而提供比目前可用治疗方案的更方便的治疗方案。
其他的使该蛋白质支架稳定的制剂或方法，可产生包含该蛋白质支架的冻干粉末的非澄清溶液。非透明的溶液包括包含颗粒悬浮液的制剂，所述颗粒为在尺寸不定的结构中含有该蛋白质支架(而形成)的组合物，所述结构有不同名称，如微球体、微颗粒、纳米颗粒、纳米微球或脂质体。这种含有活性剂的相对均匀、基本上球形的颗粒制剂可这样形成：使含有该活性剂和聚合物的水相与非水相进行接触，然后蒸发非水相以使颗粒从水相中凝聚出来，如美国专利4,589,330中所教导。多孔微颗粒可如下制备：使用含有活性剂和聚合物的第一相分散在连续溶剂中(所成的悬浮液)，通过冷冻干燥或稀释-提取-沉淀从该悬浮液除去所述溶剂，如美国专利4,818,542中所教导。用于这种制备的优选的聚合物为选自以下的天然或合成共聚物或聚合物：明胶、琼胶、淀粉、阿拉伯半乳聚糖、白蛋白、胶原、聚乙醇酸、聚乳酸、乙交酯-L(-)丙交酯、聚(ε-己酸内酯)、聚(ε-己酸内酯-CO-乳酸)、聚(ε-己酸内酯-CO-乙醇酸)、聚(β-羟基丁酸)、聚环氧乙烷、聚乙烯、聚(2-氰基丙烯酸烷基酯)、聚(甲基丙烯酸羟乙酯)、聚酰胺、聚(氨基酸)、聚(2-羟乙基DL-天冬酰胺)、聚(酯脲)、聚(L-苯丙氨酸/乙二醇/1，6-二异氰酸己烷)和聚(甲基丙烯酸甲酯)。特别优选的聚合物是聚酯，如聚乙醇酸、聚乳酸、乙交酯-L(-)丙交酯、聚(ε-己酸内酯)、聚(ε-己酸内酯-CO-乳酸)和聚(ε-己酸内酯-CO-乙醇酸)。可用于溶解聚合物和/或活性物的溶剂包括：水、六氟异丙醇、二氯甲烷、四氢呋喃、己烷、苯或六氟丙酮倍半水合物。将含有活性物的相与 第二相分散的方法可包括施加压力迫使所述第一相通过喷嘴中的孔口而实现小滴形成。
干粉制剂可由冷冻干燥以外的方法产生，如通过喷雾干燥或溶剂萃取、通过蒸发或者通过沉淀结晶组合物然后经过一个或多个步骤以除去水性溶剂或非水溶剂来产生。喷雾干燥的蛋白质支架制品的制备在美国专利6,019,968中有教导。可通过将蛋白质支架和任选的赋形剂于溶剂中(所成)的溶液或浆液在能提供可呼吸的干粉的条件下进行喷雾干燥，来生产基于蛋白质支架的干粉组合物。溶剂可包括极性化合物，如水和乙醇，它们可容易干燥。可通过在不存在氧的情况下进行喷雾干燥程序，例如在氮封下或者通过使用氮气作为干燥气体来进行喷雾干燥程序，来增强蛋白质支架的稳定性。另一种相对干燥的制剂，是多个穿孔的微结构分散于通常包含氢氟烷烃推进剂的悬浮介质中(所成)的分散体，如WO 9916419中所教导。可用计量剂量吸入器将该稳定化的分散体给予患者的肺。可用于喷雾干燥药物的商业制备中的设备由Buchi Ltd.或Niro Corp制造。
本文所述的处于稳定的或防腐的制剂或溶液中的至少一种蛋白质支架，可按照本发明通过多种递送方法给予患者，包括皮下注射或肌肉内注射；透皮给予、肺部给予、透粘膜给予、植入物给予、渗透泵给予、药筒(cartridge)给予、微型泵给予，或者技术人员知道的其他方式，如本领域所公知。
治疗应用
本发明还提供使用本发明的至少一种蛋白质支架来调节或治疗细胞、组织、器官、动物或患者中的本领域所知或本文所述的疾病的方法，例如用治疗有效量的蛋白质支架给予或接触该细胞、组织、器官、动物或患者。本发明还提供调节或治疗细胞、组织、器官、动物或患者中的疾病的方法，所述疾病包括但不限于肥胖症、免疫相关疾病、心血管疾病、传染病、恶性疾病或神经疾病中的至少一者。
本发明还提供调节或治疗细胞、组织、器官、动物或患者中的至少一种免疫相关疾病的方法、所述免疫相关疾病包括但不限于以下疾病中的至少一种：类风湿关节炎、青少年类风湿性关节炎、全身发病型青少年类风湿性关节炎、牛皮癣关节炎、关节强直性脊椎炎、胃溃疡、血清反应阴性关节 病、骨关节炎、骨质溶解、整形外科植入物的无菌性松动、炎性肠道疾病、溃疡性结肠炎、系统性红斑狼疮、抗磷脂综合征、虹膜睫状体炎/葡萄膜炎/视神经炎、特发性肺纤维化、系统性血管炎/韦格纳氏肉芽肿、肉样瘤病、睾丸炎/输精管切除术逆转过程、过敏性/特应性疾病、哮喘、过敏性鼻炎、湿疹、过敏性接触性皮炎、过敏性结膜炎、超敏性肺炎、移植、器官移植排斥、移植物抗宿主病、全身炎症反应综合征、脓毒症综合征、革兰氏阳性败血症、革兰氏阴性菌败血症、培养阴性败血症、真菌败血症、粒细胞减少性发热、尿脓毒症、脑膜炎球菌血症、创伤/出血、烧伤、电离辐射暴露、急性胰腺炎、成人呼吸窘迫综合症、类风湿关节炎、酒精性肝炎、慢性炎症性疾病、肉样瘤病、克罗恩氏病、镰状细胞性贫血、糖尿病、肾病、特应性疾病、超敏反应、过敏性鼻炎、干草热、常年性鼻炎、结膜炎、子宫内膜异位症、哮喘、荨麻疹、全身性过敏反应、皮炎、恶性贫血、溶血病、血小板减少症、任何器官或组织的移植排斥、肾移植排斥、心脏移植排斥、肝移植排斥、胰腺移植排斥、肺移植排斥、骨髓移植(BMT)排斥、皮肤同体移植排斥、软骨移植排斥、骨移植排斥、小肠移植排斥、胎儿胸腺移植排斥、甲状旁腺移植排斥、任何器官或组织的异种移植排斥、同种异体移植排斥、抗受体超敏反应、格雷夫斯氏病、雷诺氏病、B型胰岛素抗性糖尿病、哮喘、重症肌无力、抗体介导的细胞毒性、III型超敏反应、POEMS综合征(多神经病、器官巨大症、内分泌病、单克隆丙种球蛋白症和皮肤改变综合症)、多神经病、器官巨大症、内分泌病、单克隆丙种球蛋白症、皮肤变化综合征、抗磷脂综合征、天疱疮、硬皮病、混合性结缔组织病、特发性阿狄森氏病、糖尿病、慢性活动性肝炎、原发性胆管肝硬化、白癜风、血管炎、心肌梗塞后心切开术综合征、IV型超敏反应、接触性皮炎、超敏性肺炎、同种异体移植排斥、细胞内生物导致的肉芽肿、药物敏感性、代谢性/特发性、威尔森氏病、血色素沉着症、α-1-抗胰蛋白酶缺乏症、糖尿病性视网膜病变、桥本甲状腺炎、骨质疏松症、下丘脑-垂体-肾上腺轴评价、原发性胆汁性肝硬化、甲状腺炎、脑脊髓炎、恶病质、囊肿性纤维化、新生儿慢性肺病、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、家族性噬血性淋巴组织细胞增多症、皮肤病、牛皮癣、秃头症、肾病综合症、肾炎、肾小球肾炎、急性肾功能衰竭、血液透析、尿毒症、毒性、先兆子痫、okt3治疗、抗cd3治疗、细胞因子治疗、化 疗、放射治疗(例如包括但不限于乏力、贫血、恶病质等)、慢性水杨酸中毒等等。参见，例如《默克手册》(Merck Manual)，第12-17版，Merck&Company，Rahway，NJ(1972，1977，1982，1987，1992，1999)，《药物治疗手册》(Pharmacotherapy Handbook)，Wells等人(编辑)，第二版，Appleton和Lange，Stamford，Conn.(1998，2000)，各自全文以引用方式并入。
本发明还提供调节或治疗细胞、组织、器官、动物或患者中的至少一种心血管疾病的方法，所述心血管疾病包括但不限于以下疾病中的至少一种：心肌顿抑综合征、心肌梗塞、充血性心脏衰竭、中风、缺血性中风、出血、急性冠状动脉综合征、动脉硬化、动脉粥样硬化、再狭窄、糖尿病性动脉硬化疾病、高血压、动脉高血压、肾血管性高血压、昏厥、休克、心血管系统的梅毒、心脏衰竭、肺心病、原发性肺高血压、心律失常、心房异位搏动、心房扑动、心房颤动(持续或阵发性)、后灌注综合征、心肺旁路炎症反应、混乱性或多源性房性心动过速、规则窄QRS心动过速、特异性心律失常、心室颤动、希氏束心律失常、房室传导阻滞、束支传导阻滞、心肌缺血性疾病、冠心病、心绞痛、心肌梗塞、心肌病、扩张型充血性心肌病、限制型心肌病、心脏瓣膜病、心内膜炎、心包疾病、心脏肿瘤、主动脉和外周动脉瘤、主动脉剥离、主动脉的炎症、腹主动脉及其分支的闭塞、周围血管疾病、动脉闭塞性疾病、外周动脉硬化性疾病、血栓闭塞性脉管炎、功能外周动脉疾病、雷诺氏现象和疾病、手足发绀、红斑性肢痛病、静脉疾病、静脉血栓、静脉曲张、动静脉瘘、淋巴水肿、脂肪水肿、不稳定型心绞痛、再灌注损伤、后泵综合征、缺血再灌注损伤等等。这种方法可任选地包括将有效量的包含至少一种蛋白质支架的组合物或药物组合物给予需要这种调节、治疗或疗法的细胞、组织、器官、动物或患者。
本发明还提供调节或治疗细胞、组织、器官、动物或患者中的至少一种传染病的方法，所述传染病包括但不限于以下疾病中的至少一种：急性或慢性细菌性感染、急性和慢性寄生虫或感染过程(包括细菌、病毒和真菌感染)、HIV感染/HIV神经病、脑膜炎、肝炎(例如甲肝、乙肝或丙肝)、化脓性关节炎、腹膜炎、肺炎、会厌炎、大肠杆菌O157:h7、溶血性尿毒症综合征/溶栓血小板减少性紫癜、疟疾、登革热出血热、利什曼病、麻风病、中毒性休克综合征、链球菌肌炎、气性坏疽、分枝杆菌结核、鸟胞内分 枝杆菌、卡氏肺囊虫肺炎、盆腔炎、睾丸炎/附睾炎、军团菌、莱姆病、A型流感、EB病毒、病毒相关性噬血细胞综合征、病毒性脑炎/无菌性脑膜炎等等。
本发明还提供调节或治疗细胞、组织、器官、动物或患者中的至少一种恶性疾病的方法，所述恶性疾病包括但不限于以下疾病中的至少一种：白血病、急性白血病、急性急性淋巴母细胞白血病(ALL)、急性淋巴细胞性白血病、B细胞、T细胞或FAB ALL、急性髓细胞性白血病(AML)、急性骨髓性白血病、慢性粒细胞白血病(CML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、毛细胞性白血病、脊髓发育不良综合征(MDS)、淋巴瘤、霍奇金病、恶性淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、多发性骨髓瘤、卡波济氏肉瘤、结肠直肠癌、胰脏癌、鼻咽癌、恶性组织细胞增生症、恶性肿瘤的副肿瘤综合征/高钙血症、实体瘤、膀胱癌、乳腺癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、头癌、颈癌、遗传性非息肉性癌、霍奇金淋巴瘤、肝癌、肺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾细胞癌、睾丸癌、腺癌、肉瘤、恶性黑素瘤、血管瘤、转移性疾病、癌症相关骨吸收、癌症相关骨痛等等。
本发明还提供调节或治疗细胞、组织、器官、动物或患者中的至少一种神经疾病的方法，所述神经疾病包括但不限于以下疾病中的至少一种：神经退化性疾病；多发性硬化；偏头痛；艾滋病痴呆综合征；脱髓鞘疾病，如多发性硬化症和急性横贯性脊髓炎；锥体外系和小脑疾病，如皮质脊髓系统病变、基底神经节的疾病；过动症，如亨廷顿氏舞蹈病和老年性舞蹈病；药物引起的运动障碍，如由阻断中枢神经系统多巴胺受体的药物引起的那些运动障碍；少动症，如帕金森氏病；进行性核上麻痹；小脑的结构性病变；脊髓小脑变性，如脊髓共济失调、Friedreich共济失调、小脑皮层变性、多系统变性(Mencel、Dejerine-Thomas、Shi-Drager和Machado-Joseph)、系统性疾病(Refsum病、β-脂蛋白缺乏症、共济失调、毛细血管扩张和线粒体多系统疾病)；脱髓鞘核疾病(demyelinating core disorder)，如多发性硬化症、急性横贯性脊髓炎；以及运动单位的疾病，如神经性肌肉萎缩(前角细胞变性，如肌萎缩性侧索硬化症、小儿脊髓性肌肉萎缩症和少年脊髓性肌肉萎缩症)；阿尔茨海默病；中年唐氏综合症；弥漫性Lewy小体病、Lewy小体型老年性痴呆；Wemicke-Korsakoff综合征；慢性酒精中毒；Creutzfeldt- Jakob病；亚急性硬化性全脑炎、Hallerrorden-Spatz病、拳击员痴呆；神经创伤性损伤(例如脊髓损伤、脑损伤、脑震荡、反复震荡)；疼痛；炎症性疼痛；自闭症；抑郁症；中风；认知障碍；癫痫等等。此类方法可以任选包括将有效量的包含至少一种TNF抗体或特定部分或变体的组合物或药物组合物给予需要这种调节、处理或治疗的细胞、组织、器官、动物或患者。参见，例如Merck Manual，第16版，Merck&Company，Rahway，NJ(1992)。
本发明还提供调节或治疗细胞、组织、器官、动物或患者中的至少一种伤(wound)、创伤或组织损伤或相关慢性病症的方法，所述伤包括但不限于以下至少一者：身体损伤或者与口腔手术有关的创伤，所述口腔手术包括牙周手术、拔牙、根管治疗、牙种植体的插入、牙修复体的应用及使用；或者其中所述伤选自无菌伤、挫伤、切伤、裂伤、非穿透伤、开放伤、穿透伤、穿孔伤、刺伤、有菌伤、梗塞形成伤和皮下伤；或者其中所述伤选自局部缺血溃疡、压疮、瘘、严重咬伤、热烫伤和供体部位伤；或者其中所述伤为口疮伤、创伤性伤或疱疹相关的伤。
伤和/或溃疡通常可见从皮肤突出，或者在粘膜表面上，或者由器官中的梗塞形成(“中风”)所致。伤可能是软组织缺陷或病变的结果，或者是潜在性病症的结果。在本发明情形中，术语“皮肤”涉及动物(包括人在内)的身体的最外表面，涵盖完整或几乎完整的皮肤以及受损的皮肤表面。术语“粘膜”涉及动物(如人)的未受损坏或已受损坏的粘膜，可以是口粘膜、口腔粘膜、耳粘膜、鼻粘膜、肺粘膜、眼粘膜、胃肠粘膜、阴道粘膜或直肠粘膜。
在本发明情形中，术语“伤”表示破坏组织结构的正常完整性的身体损伤。该术语还意在涵盖术语“疮(sore)”、“损伤(lesion)”、“坏死”和“溃疡”。通常，术语“疮(sore)”是表示皮肤或黏膜的几乎任何损伤(lesion)的通用词语，术语“溃疡”是由坏死组织的脱落所产生的器官或组织表面的局部缺陷或露出。损伤通常涉及任何组织缺陷。坏死涉及由感染、伤害、炎症或梗塞形成所引起的死组织。
本发明情形中所用的术语“伤(wound)”表示任何伤(伤的分类见下文)，并表示在愈合过程中的任何特定阶段的伤，包括任何愈合开始之前的 阶段，或者甚至在作出特定的伤(如手术切口)(预防性治疗)之前的阶段。可按照本发明进行预防和/或治疗的伤的例子例如是无菌伤、挫伤、切伤、裂伤、非穿透伤(即其中皮肤没有破坏但对皮肤底下结构有损害的伤)、开放伤、穿透伤、穿孔伤、刺伤、有菌伤、皮下伤等。疮的例子有褥疮、口疮、铬疮、感冒疮、压疮等。溃疡的例子例如是消化性溃疡、十二指肠溃疡、胃溃疡、痛风性溃疡、糖尿病性溃疡、高血压性局部缺血性溃疡、淤积性溃疡、下肢溃疡(静脉性溃疡)、舌下溃疡、黏膜下溃疡、症状性溃疡、营养不良性溃疡、热带性溃疡和生殖器溃疡(例如由淋病引起)(包括尿道炎、宫颈黏膜炎和直肠炎)。可按照本发明得到成功治疗的与伤或疮相关的病症有烧伤、炭疽、破伤风、气性坏疽、猩红热、丹毒、须疮、毛囊炎、接触传染性脓疱疮或大疱性脓疱疮等。术语“伤”和“溃疡”以及“伤”和“疮”的使用之间往往有一定的重叠，此外，各个术语往往随意使用。因此，如上所述，在本发明情形中术语“伤”涵盖术语“溃疡”、“损伤”、“疮”和“梗死形成”，且各个术语任意使用，除非另有指明。
要按照本发明进行治疗的各种伤还包括：(i)一般的伤，例如手术伤、外伤、感染伤、局部缺血伤、热伤、化学伤和大泡伤；(ii)口腔特有的伤，例如拔牙后的伤、牙髓伤(特别是与囊肿和脓肿的治疗有关)、细菌病毒或自身免疫来源的溃疡和损伤、机械伤、化学伤、热伤、感染伤和青苔状伤(lichenoid wound)；疱疹性溃疡、口疮性口炎、急性坏死性溃疡性齿龈炎和灼口综合征为具体的例子；以及(iii)皮肤上的伤，例如赘生物、烧伤(例如化学伤、热伤)、损伤(细菌性、病毒性、自身免疫性)、咬伤和手术切口。伤的另一种分类法是分成：(i)由手术切口、轻微磨擦和轻微咬伤导致的组织小损失，或者(ii)组织大损失。后一组包括局部缺血性溃疡、压疮、瘘、裂伤、严重咬伤、热伤和供体部位伤(在软组织和硬组织中)以及梗塞形成。
其他对于本发明重要的伤是诸如局部缺血溃疡、压疮、瘘、严重咬伤、热伤和供体部位伤的伤。局部溃疡和压疮是通常只非常慢地愈合的伤，从而尤其在这种情况中，改进的和更快的愈合过程对于患者而言当然十分重要。此外，当愈合得到改进并更快地进行时，在遭受这类伤的患者的治疗中所涉及的费用明显降低。
供体部位伤是例如从身体的一个部位移取硬组织到身体的另一个部位(例如与移植相关)时出现的伤。由这种手术引起的伤是非常痛苦的，因此改进的愈合是十分有价值的。术语“皮肤”以十分广义的含义使用，涵盖皮肤的表皮层，且在大多数的其中皮肤表面或多或少受损的情况中，还涵盖皮肤的真皮层。除了角质层以外，皮肤的表皮层是外层(上皮层)，皮肤的更深的结缔组织层称为真皮。
本发明的任何方法可包括将有效量的包含至少一种蛋白质支架的组合物或药物组合物给予需要这种调节、治疗或疗法的细胞、组织、器官、动物或患者。这种方法可任选地还包括用于治疗这类疾病或病症的共给予或组合疗法，其中给予所述至少一种蛋白质支架、其指定部分或变体，且还包括在这之前、与此同时和/或在这之后给予至少一种选自以下的药剂：至少一种TNF拮抗剂(例如但不限于TNF化学拮抗剂或蛋白质拮抗剂、TNF单克隆或多克隆抗体或片段、可溶性TNF受体(例如p55、p70或p85)或其片段、融合多肽、或者小分子TNF拮抗剂、例如TNF结合蛋白I或II(TBP-1或TBP-II)、奈瑞莫单抗、英夫利昔单抗、依那西普(EnbrelTM)、adalimulab(HumiraTM)、CDP-571、CDP-870、阿非莫单抗、来那西普等)、抗风湿药物(例如甲氨蝶呤、金诺芬、金硫葡糖、硫唑嘌呤、硫代苹果酸金钠、硫酸羟氯喹、来氟米特、柳氮磺吡啶)、肌肉松弛剂、麻醉剂(narcotic)、非甾类抗炎药物(NSAID)、止痛药、麻醉剂(anesthetic)、镇静剂、局部麻醉剂、神经肌肉阻断剂、抗微生物剂(例如氨基糖苷、抗真菌剂、抗寄生虫剂、抗病毒剂、碳青霉烯类、头孢菌素、氟喹诺酮、大环内酯、青霉素、磺胺药物、四环素、别的抗微生物剂)、抗牛皮癣剂、皮质类固醇、合成代谢类固醇、糖尿病相关药剂、矿物质、营养剂、甲状腺剂、维生素、钙相关激素、止泻剂、镇咳剂、止吐剂、抗溃疡剂、缓泻剂、抗凝血剂、促红细胞生成素(例如红细胞生成素α)、非格司亭(例如G-CSF、Neupogen)、沙格司亭(GM-CSF、Leukine)、免疫接种剂、免疫球蛋白、免疫抑制剂(例如巴利昔单抗、环胞菌素、达克珠单抗)、生长激素、激素替代药物、雌激素受体调节剂、散瞳剂、睫状肌麻痹剂、烷化剂、抗代谢物、有丝分裂抑制剂、放射性药物、抗抑郁药、抗躁狂剂、抗精神病药物、抗焦虑药物、催眠剂、拟交感神经药物、兴奋剂、多奈哌齐、他克林、哮喘 药物、β激动剂、吸入类固醇、白三烯抑制剂、甲基黄嘌呤、色甘酸、肾上腺素或类似物、阿法链道酶(Pulmozyme)、细胞因子或细胞因子拮抗剂。合适的剂量是本领域公知的。参见例如Wells等人(编辑)，Pharmacotherapy Handbook，第2版，Appleton and Lange，Stamford，CT(2000)；PDR Pharmacopoeia，Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000，精装版，Tarascon Publishing，Loma Linda，CA(2000)；Nursing 2001 Handbook of Drugs，第21版，Springhouse Corp.，Springhouse，PA，2001；Health Professional’s Drug Guide 2001年版，Shannon，Wilson，Stang，Prentice-Hall，Inc，Upper Saddle River，NJ.，以上每个参考文献以引用方式全部并入本文。
细胞因子包括任何已知的细胞因子。参见例如CopewithCytokines.com。细胞因子拮抗剂包括但不限于任何蛋白质支架抗体、片段或模拟物，任何可溶性受体、片段或模拟物，任何小分子拮抗剂，或者它们的任何组合。
通常，病理状况的治疗是通过给予有效量或有效剂量的至少蛋白质支架组合物来实现，该有效量或有效剂量平均而言合计达至少约0.01-500毫克的至少一种蛋白质支架/千克患者/剂的范围，优选地为至少约0.1-100毫克的蛋白质支架/千克患者/单次或多次给予，这取决于该组合物中所含的活性剂的比活性。或者，有效血清浓度可包含0.1-5000μg/ml血清浓度/单次或多次给予。合适的剂量是医学从业者已知的，当然要取决于具体疾病状态、待给予组合物的比活性，以及接受治疗的具体患者。在某些情况下，为了达到所需治疗量，可能有必要提供重复给予，即重复单独给予特定的监控剂量或计量剂量，其中单独给予可以重复直至达到所需日剂量或效果。
优选的剂量可任选地包括约0.1-99和/或100-500mg/kg/次给予，或其任何范围、数值或分数，或者是为了实现这样的血清浓度：约0.1-5000μg/ml血清浓度/单次或多次给予，或其任何范围、数值或分数。本发明的蛋白质支架的优选剂量范围为约1mg/kg，直至约3、约6或约12mg/kg患者体重。
或者，给予的剂量可以根据已知因素而变化，所述因素例如为具体试剂的药物动力学特征及其给予方式和途径；接受者的年龄、健康状况和重量；症状的性质和程度、当前治疗的类型、治疗频率和所需效果。通常活性成分的剂量可以是约0.1至100毫克/千克体重。通常，每次给予0.1-50毫克 /公斤、优选地0.1-10毫克/公斤，或者以缓释形式给予该量，能有效获得所需的结果。
作为非限制性例子，可这样提供对人类或动物的治疗：在第1-40天中的至少一天，或者，作为另外一种选择或除此之外，在第1-52周中的至少一周，或者，作为另外一种选择或除此之外，在第1-20年中的至少一年，或者它们的任何组合，使用单剂量、输注剂量或重复剂量，每天一次性或者定期地投与本发明的至少一种蛋白质支架约0.1-100mg/kg或其任何范围、数值或分数。
适合于内部给予的剂型(组合物)，每单位或容器一般包含约0.001毫克至约500毫克的活性成分。在这些药物组合物中，基于组合物总重量，活性成分一般会以约0.5至99.999重量％的量存在。
对于胃肠外给予，可将蛋白质支架与药用的胃肠外介质一起配制成溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、散剂或冻干散剂，或者与药用的胃肠外介质分开提供。这类介质的例子有水、盐水、林格溶液、右旋葡萄糖溶液和约1-10％人血清白蛋白。也可使用脂质体和非水介质，如固定油。介质或冻干粉末可含有维持等渗性的添加剂(例如氯化钠、甘露糖醇)和维持化学稳定性的添加剂(例如缓冲剂和防腐剂)。可通过已知的或合适的技术对制剂进行灭菌。
合适的药学载体在Remington′s Pharmaceutical Sciences，A.Osol的最近版本(该领域的标准参考文本)中有描述。
另选的给予方式
可根据本发明使用许多已知的和已开发的模式来给予药物有效量的至少一种本发明的蛋白质支架。尽管在下文描述中使用的是经肺给予，但其他给予方式也可根据本发明使用，得到合适的结果。本发明的蛋白质支架可在载体中递送，作为溶液剂、乳剂、胶体剂或混悬剂体送，或者使用多种适合进行吸入给予的装置和方法中的任何一种或者本文所述或本领域知道的其他方式，作为干粉递送。
肠胃外用制剂及给予
胃肠外给予用的制剂可含有作为普通赋形剂的无菌水或盐水、聚亚烷基二醇(如聚乙二醇)、植物来源的油、氢化萘等。注射用水性或油性混悬 剂可通过使用合适的乳化剂或湿润剂和悬浮剂根据已知方法来制备。注射用介质可以是无毒、非口服给予的稀释剂，如含水溶液、在溶剂中(所成)的无菌可注射溶液或混悬液。作为可用的介质或溶剂，水、林格溶液、等渗盐水等是允许的；作为普通溶剂或悬浮溶剂，可使用无菌非挥发性油。为了这些目的，可以使用任何种类的不挥发性油和脂肪酸，包括天然的或合成的或半合成的脂肪油或脂肪酸；天然的或合成的或半合成的甘油单酯或甘油二酯或甘油三酯。胃肠外给予是本领域知道的，包括但不限于常规形式的注射、如美国专利No.5,851,198中所述的气压式无针注射装置和如美国专利No.5,839,446中所述的激光穿孔器装置。
另选的递送方式
本发明还涉及通过以下方式来给予至少一种蛋白质支架：胃肠外、皮下、肌肉内、静脉内、关节内、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、腹腔内、小脑内、脑室内、结肠内、子宫颈内、胃内、肝内、心肌内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸内、子宫内、膀胱内、病灶内、推注(bolus)、阴道、直肠、口腔、舌下、鼻内或透皮方式。可制备至少一种蛋白质支架组合物，供用于胃肠外给予(皮下、肌肉内或静脉内给予)或任何其他方式的给予，特别是以液体溶液剂或混悬剂的形式；供用于阴道或直肠给予，特别是以半固体形式，如但不限于乳膏剂和栓剂；供口腔或舌下给予，如但不限于以片剂或胶囊剂的形式；或者供鼻内给予，如但不限于以散剂、滴鼻剂或气溶胶或某些介质的形式；或者供透皮给予，如但不限于凝胶剂、软膏剂、洗剂、混悬剂或贴剂递送系统，其中含有化学增强剂(如二甲亚砜)以修饰皮肤结构或增加透皮贴剂中的药物浓度(Junginger，等人，载于“Drug Permeation Enhancement；”Hsieh，D.S.编辑，第59-90页(Marcel Dekker，Inc.New York 1994，全文以引用方式并入本文))，或者含有氧化剂以使得能够将含有蛋白质和肽的制剂施加到皮肤上(WO 98/53847)，或者施加电场以产生瞬间转运途径(如电穿孔)或者提高带电药物通过皮肤的迁移率(如离子电渗疗法)，或者施加超声波(如超声透入疗法)(美国专利No.4,309,989和No.4,767,402)(上述出版物和专利以引用方式全文并入本文中)。
经肺/鼻给予
对于经肺给予，优选地，将至少一种蛋白质支架组合物以能有效地到达肺下呼吸道或窦腔的颗粒大小进行递送。根据本发明，至少一种蛋白质支架可通过多种本领域所知的用于治疗剂的吸入给予的吸入装置或鼻装置中的任何一种进行递送。这些能够在患者的窦腔或肺泡中沉积气溶胶化制剂的装置包括定量吸入器、雾化器、干粉产生器、喷雾器等等。其他适合于管理蛋白质支架的经肺给予或经鼻给予的装置也是本领域知道的。所有这类装置都可使用适合于将蛋白质支架分配在气溶胶中来给予的制剂。此类气溶胶可由溶液(水性或非水性)或固体颗粒构成。
定量吸入器如Ventolin定量吸入器通常利用推进气体并且要求在吸气期间启动(参见，例如WO 94/16970、WO 98/35888)。干粉吸入器如TurbuhalerTM(Astra)、Rotahaler(Glaxo)、Diskus(Glaxo)、SpirosTM吸入器(Dura)、Inhale Therapeutics公司销售的装置以及Spinhaler粉末吸入器(Fisons)，都采用呼吸来驱动混合粉末(US 4668218(Astra)、EP 237507(Astra)、WO 97/25086(Glaxo)、WO 94/08552(Dura)、US 5458135(Inhale)、WO 94/06498(Fisons)，所有这些专利都以引用方式全文并入本文)。雾化器如AERxTM Aradigm、Ultravent雾化器(Mallinckrodt)和Acorn II雾化器(Marquest Medical Products)(US 5404871 Aradigm、WO 97/22376)(以上参考文献都以引用方式全文并入本文)从溶液产生气溶胶，而计量剂量吸入器、干粉吸入器等则产生小颗粒气溶胶。市售吸入装置的这些具体例子旨在代表适用于实施本发明的具体装置，并且无意于限制本发明的范围。
优选地，通过干粉吸入器或喷雾器递送包含至少一种蛋白质支架的组合物。吸入装置有几种合乎需要的特征适于给予本发明的至少一种蛋白质支架。例如，有利地，通过吸入装置进行的递送是可靠的、可再现的和准确的。吸入装置可任选地递送小的干燥颗粒，例如小于约10μm，优选地约1-5μm，以便容易呼吸。
蛋白质支架组合物作为喷雾来给予
可通过迫使至少一种蛋白质支架的悬浮液或溶液在压力下经过喷嘴，来产生包含蛋白质支架组合物的喷雾。可以选择喷嘴大小和构造、所施加的压力和液体加料速率来实现所需的输出和粒子大小。例如，通过电场结合毛细管或喷嘴加料，可产生电喷雾。有利地，通过喷雾器递送的至少一种蛋白 质支架组合物的颗粒具有小于约10μm的颗粒大小，优选地颗粒大小在约1μm至约5μm的范围内，最优选地在约2μm至约3μm的范围内。
适用于喷雾器的至少一种蛋白质支架组合物的制剂，通常是在含水溶液中包含蛋白质支架组合物，浓度为约0.1mg至约100mg的至少一种蛋白质支架组合物/ml溶液或mg/g，或其中的任何范围、数值或分数。该制剂可包含各种物剂，如赋形剂、缓冲剂、等渗剂、防腐剂、表面活性剂，且优选地包含锌。该制剂还可包含用于使蛋白质支架组合物稳定的赋形剂或物剂，如缓冲剂、还原剂、填充蛋白(bulk protein)或碳水化合物。可用于配制蛋白质支架组合物的填充蛋白包括白蛋白、鱼精蛋白等。可用于配制蛋白质支架组合物的代表性碳水化合物包括蔗糖、甘露糖醇、乳糖、海藻糖、葡萄糖等。该蛋白质支架组合物制剂还可包含表面活性剂，其可减少或防止表面诱导的蛋白质支架组合物的聚集现象，该聚集现象由形成气溶胶时溶液的雾化所引起。可以采用多种常规表面活性剂，例如聚氧乙烯脂肪酸酯和醇，以及聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯。以制剂的重量计，用量将通常在0.001至14％之间。对于本发明的目的而言特别优选的表面活性剂为聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯、聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯20等等。另外的本领域已知用于配制蛋白质如蛋白质支架或其指定部分或变体的物剂，也可包含在该制剂中。
通过雾化器给予蛋白质支架组合物
本发明的蛋白质支架组合物可通过雾化器来给予，如喷射式雾化器或超声波雾化器。通常，在喷射式雾化器中，用压缩空气源通过孔口产生高速喷气流。随着气体过了喷嘴后膨胀，有低压区域产生，从而通过与液体贮器连接的毛细管抽取蛋白质支架组合物的溶液。来自毛细管的液体流在其离开管时被剪切成不稳定的细丝或小滴，从而产生气溶胶。可以采用一系列构造、流速和挡板类型从给定的喷射式雾化器产生所需性能特征。在超声波雾化器中，用高频率电能产生振动机械能量，通常使用压电转换器。此能量直接地或通过耦合流体被传输到该蛋白质支架组合物制剂，从而产生包含蛋白质支架组合物的气溶胶。有利地，通过雾化器递送的蛋白质支架组合物的颗粒具有小于约10μm的颗粒大小，优选地颗粒大小在约1μm至约5μm的范围内，最优选地为约2μm至约3μm。
适用于雾化器(喷射式雾化器或超声波雾化器)的至少一种蛋白质支架组合物的制剂，通常包含的浓度为约0.1mg至约100mg的至少一种蛋白质支架/ml溶液。该制剂可包含各种物剂，如赋形剂、缓冲剂、等渗剂、防腐剂、表面活性剂，且优选地包含锌。该制剂还可包含用于使该至少一种蛋白质支架组合物稳定的赋形剂或物剂，如缓冲剂、还原剂、填充蛋白或碳水化合物。可用于配制至少一种蛋白质支架组合物的填充蛋白包括白蛋白、鱼精蛋白等。可用于配制至少一种蛋白质支架的代表性碳水化合物包括蔗糖、甘露糖醇、乳糖、海藻糖、葡萄糖等。该至少一种蛋白质支架制剂还可包含表面活性剂，其可减少或防止表面诱导的该至少一种蛋白质支架的聚集现象，该聚集现象由形成气溶胶时溶液的雾化所引起。可以采用多种常规表面活性剂，例如聚氧乙烯脂肪酸酯和醇，以及聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯。数量通常将占该制剂的约0.001至4重量％。对于本发明而言特别优选的表面活性剂为聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯、聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯20等等。另外的本领域已知用于配制蛋白质如蛋白质支架的物剂，也可包含在该制剂中。
通过计量剂量吸入器给予蛋白质支架组合物
在计量剂量吸入器(MDI)中，推进剂、至少一种蛋白质支架和任何赋形剂或其他添加剂装在罐中成为包含液化压缩气体的混合物。开动计量阀会将该混合物作为气溶胶释放出来，该气溶胶优选地含有如下尺寸范围的颗粒：小于约10μm、优选地约1μm至约5μm、最优选地约2μm至约3μm。可通过采用由本领域技术人员知道的各种方法(包括气流粉碎、喷雾干燥、临界点凝聚等)生产的蛋白质支架组合物的制剂，来获得所需的气溶胶颗粒大小。优选的定量吸入器包括由3M或Glaxo生产并采用氢氟烃推进剂的那些吸入器。供用于计量剂量吸入器装置的至少一种蛋白质支架的制剂，通常将在非水介质中包含微细的含至少一种蛋白质支架的粉末而成为混悬剂，例如借助于表面活性剂而悬浮于推进剂中。推进剂可以是用于该目的的任何常规材料，例如氯氟烃、氢氯氟烃、氢氟烃或包括三氯氟甲烷、二氯二氟甲烷、二氯四氟乙醇和1，1，1，2-四氟乙烷、HFA-134a(氢氟烷烃-134a)、HFA-227(氢氟烷烃-227)在内的烃类。优选地，推进剂为氢氟烃。可选择表面活性剂以使该至少一种蛋白质支架在推进剂中稳定成为混悬剂，以保护活性剂免 于化学降解等。适宜的表面活性剂包括脱水山梨糖醇三油酸酯、大豆卵磷脂、油酸等等。在一些情况中，使用诸如乙醇的溶剂的溶液气溶胶是优选的。另外的本领域已知用于配制蛋白质的物剂也可包含在该制剂中。本领域普通技术人员会认识到，可通过用本文没有描述的装置进行至少一种蛋白质支架组合物的肺部给予，来实现本发明的方法。
口服制剂及给予
口服用制剂有赖于共给予辅助剂(例如间苯二酚和非离子型表面活性剂如聚氧乙烯油基醚和正十六烷基聚乙烯醚)以人工提高肠壁的渗透性，以及共给予酶抑制剂(例如胰腺胰蛋白酶抑制剂、二异丙基氟磷酸(DFF)和特斯乐)以抑制酶促降解。在美国专利No.6,309,663中教导了用于递送包括蛋白质和蛋白质支架在内的亲水性物剂的制剂，其包含至少两种表面活性剂的组合，旨在用于口服给予、口腔给予、粘膜给予、经鼻给予、经肺给予、阴道跨膜给予或者直肠给予。可将供口服的固体型剂型的活性组分化合物与至少一种添加剂混合，所述添加剂包括蔗糖、乳糖、纤维素、甘露糖醇、海藻糖、棉子糖、麦芽糖醇、葡聚糖、淀粉、琼脂、藻酸盐、几丁质、壳聚糖、果胶、黄蓍胶、阿拉伯树胶、明胶、胶原、酪蛋白、白蛋白、合成的或半合成的聚合物和甘油酯。这些剂型还可含有其他类型的添加剂，例如无活性稀释剂、润滑剂如硬脂酸镁、对羟基苯甲酸酯、防腐剂如山梨酸、抗坏血酸、α-生育酚、抗氧化剂如半胱氨酸、崩解剂、粘合剂、增稠剂、缓冲剂、甜味剂、矫味剂、香味剂等。
片剂和丸剂可进一步加工成肠溶衣包衣制剂。供口服的液体制剂包括可允许用于医学用途的乳剂、糖浆剂、酏剂、混悬剂和溶液制剂。这些制剂可以含有常用于所述领域的无活性稀释剂，例如水。脂质体作为胰岛素和肝素的药物递送系统已有描述(美国专利No.4,239,754)。最近，混合氨基酸的人工聚合物(类蛋白)的微球体已用于递送药物(美国专利No.4,925,673)。此外，美国专利No.5,879,681和美国专利No.5,5,871,753中所述的、用于口服递送生物活性剂的载体化合物，是本领域知道的。
粘膜用制剂及给予
将供口服给予生物活性剂的制剂包囊在一种或多种生物相容性聚合物或共聚物赋形剂(优选地生物可降解的聚合物或共聚物)中得到微胶囊，由 于所得的微胶囊尺寸适当，该生物活性剂能达到动物的集合淋巴小结(也称为“派氏集合淋巴结”或“GALT”)并被集合淋巴滤泡吸收，而又不会因为该生物活性剂穿过了胃肠道而失去有效性。可以在支气管(BALT)和大肠中发现相似的集合淋巴小结。上述组织通常称作粘膜相关的淋巴网状组织(MALT)。对于通过粘膜表面进行的吸收，用于给予至少一种蛋白质支架的组合物和方法包括乳剂，其包含多个亚微米颗粒、粘膜粘附性大分子、生物活性肽和含水连续相，这通过实现乳剂颗粒的粘膜粘附来促进通过粘膜表面进行的吸收(美国专利No.5,514,670)。适于施用本发明的乳剂的粘膜表面可包括角膜、结膜、口腔、舌下、鼻、阴道、肺、胃、肠和直肠给予途径。供阴道或直肠给予的制剂(例如栓剂)可含有例如聚亚烷基二醇、凡士林、可可脂等作为赋形剂。鼻内给予制剂可以是固体并且含有例如乳糖作为赋形剂，或可以是鼻滴剂的水性或油性溶液。对于口腔给予，赋形剂包括糖类、硬脂酸钙、硬脂酸镁、预胶化淀粉等(美国专利No.5,849,695)。
透皮制剂及给予
对于透皮给予，该至少一种蛋白质支架包囊在递送装置如脂质体或聚合物纳米颗粒、微颗粒、微胶囊或微球体(统称微颗粒，除非另有规定)中。有多种合适的装置是已知的，包括由合成聚合物和天然聚合物制成的微颗粒，所述合成聚合物例如聚羟基酸(如聚乳酸、聚乙醇酸以及它们的共聚物)、聚原酸酯、聚酸酐和聚磷腈，所述天然聚合物例如胶原、聚氨基酸、白蛋白和其他蛋白质、海藻酸盐和其他多糖以及它们的组合(美国专利No.5,814,599)。
长期给予及制剂
可取的是，在长时间里将本发明的化合物递送给受试者，例如单次给予即能递送一个星期到一年的时间。可以利用多种缓释剂型、储库(depot)剂型或植入剂型。例如，剂型可含有所述化合物的、在体液中溶解度低的药用无毒盐，例如(a)：与多元酸所成的酸加成盐，所述多元酸例如磷酸、硫酸、柠檬酸、酒石酸、单宁酸、双羟萘酸、海藻酸、聚谷氨酸、萘单磺酸或萘双磺酸、聚半乳糖醛酸等；(b)：与多价金属阳离子所成的盐，所述金属例如锌、钙、铋、钡、镁、铝、铜、钴、镍、镉等，或者与由例如N，N′-二苄基-乙二胺或乙二胺形成的有机阳离子所成的盐；或者(c)：(a)和(b)的组 合，例如锌单宁酸盐。另外，可本发明的化合物，或者优选地，相对不可溶的盐(如刚刚描述的那些)，与例如适合注射的芝麻油一起在凝胶例如单硬脂酸铝凝胶中进行配制。尤其优选的盐为锌盐、鞣酸锌盐、双羟萘酸盐等等。另一种类型的注射用缓释长效制剂(depot formulation)会含有分散的所述化合物或盐以包囊在缓慢降解的无毒非抗原性聚合物(如聚乙醇酸/聚乙醇酸聚合物)中，例如如美国专利No.3,773,919中所述。所述化合物或者优选地相对不可溶的盐(如以上描述的那些)还可配制在胆固醇基质硅橡胶小丸(pellet)中，特别是供用于动物。另外的缓释制剂、长效制剂或植入制剂(例如气体或液体脂质体)在文献中有描述(美国专利No.5,770,222以及“Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems”，J.R.Robinson(编辑)，Marcel Dekker，Inc.，N.Y.，1978)。
已总体地描述了本发明，通过参考下面的实例将更容易理解本发明，所述实例仅以示例的方式给出并且无意于作为限制。
实例
实例1-Fibcon设计
人纤连蛋白的第10个FN3结构域(SEQ ID NO：10)已被开发为另选的支架，其能够被工程改造成通过在结构上与抗体互补决定区(CDR)相似的表面暴露环结合特异性靶标分子，所述环称为B:C环、D:E环和F:G环(图1)(Koide等人，J Mol Biol 284：1141-51，1998)。该纤连蛋白含有14个其他的独立折叠的FN3结构域，基于序列相似性，它们据预测都采取与第10个FN3结构域相似的折叠(SEQ ID NO：1-9，11-15)。的确，这些结构域中的几个的结构保守性通过纤连蛋白FN3结构域1、7、8、9、10、12、13和14的高分辨率结构得到了证实(Vakonakis等人，Embo J 26：2575-83，2007；Leahy等人，Cell 84：155-64，1996；Shanna等人，Embo J 18：1468-79，1999)。为了证实所有15个结构域都能形成独立折叠的单元，使用标准的PCR方法从通用人cDNA来源(Biochain Institute Inc.(Hayward，CA))通过PCR扩增获得了编码每个结构域的基因序列，并将其亚克隆到经修饰的pET15载体(Novagen)中，转化到BL21Star(DE3)大肠杆菌(E.coli)(Invitrogen)中，然后接种到含有75μg/ml羧苄西林的LB琼脂平板上。在PCR步骤过程中，将编码6X聚组氨酸标签的核苷酸加到每个基因的C末端。FN3结构域 7不能够成功地从这个来源克隆，因此不包括在本文给出的分析中。对于每个构建物，挑取单菌落，在50ml含有2％葡萄糖和100μg/ml羧苄西林的TB培养基中37℃下生长过夜。用此培养物接种2.5L Ultra Yield烧瓶(Thomson Instrument Company)中的500mL自诱导培养基(Overnight Express Instant TB培养基，Novagen)。在ATR Multitron振荡培养箱中，用双程序(37℃、300rpm下3小时，然后30℃、250rpm下16小时)进行生长和表达。
收获培养物，在JL8.1转子中7000rpm下离心15分钟以沉淀细胞。将细胞重悬在含有20mM磷酸钠pH 7.5、500mM NaCl、10％甘油、20mM咪唑、0.37mg/ml溶菌酶、1X完全蛋白酶抑制剂(无EDTA；Roche)和benzonase核酸酶(Sigma-Aldrich，最终0.25μl/ml)的30ml缓冲液中，并用Misonix XL2020超声处理器以脉冲模式(开5秒，关30秒)在冰上裂解5分钟。不溶性物质通过在JA-17转子中17,000rpm离心30分钟除去。
在2步骤的层析过程中从可溶性裂解物纯化出FN3蛋白质。首先，通过固定化金属亲和层析捕捉该蛋白质：将2mL Ni-NTA琼脂糖小珠(Qiagen)加到裂解物，并将其放在摇摆平台上4℃下保持1小时。然后将该树脂填充到Poly-Prep柱(Bio-Rad)中，用20mM磷酸钠(pH 7.5)、500mM NaCl、10％甘油和20mM咪唑洗涤，以除去未结合的物质。用20mM磷酸钠(pH 7.5)、500mM NaCl、10％甘油和500mM咪唑将蛋白质从树脂洗脱下来。各流份通过SDS-PAGE进行分析，是同时通过考马斯染色和通过使用HRP缀合的抗His抗体(Immunology Consultants Laboratory)的蛋白质印迹来进行。将所需的流份集中并向PBS pH 7.4中透析。作为第二纯化步骤，将该蛋白质荷载到在PBS中平衡的Superdex-75 HiLoad 16/60柱(GE Healthcare)上。通过SDS-PAGE分析各流份，将含有FN3蛋白的流份集中，用Centriprep UltraCelYM-3浓缩器(Amicon)进行浓缩。
用BioTek读板机测定蛋白质浓度，以测量样品在280nm处的吸光度。最终制品通过考马斯染色进行分析，用抗His抗体进行蛋白质印迹分析，并用在PBS中平衡的G3000SW-XL柱(TOSOH Biosciences)进行HPLC-SEC分析。SDS-PAGE分析表明FN3结构域在6至14kDa之间迁移，这符合单聚蛋白质的预测质量。
通过差示扫描量热法(DSC)表征每个FN3结构域的折叠和热稳定性。通过在N-DSCII热量计(Applied Thermodynamics)中将每个FN3结构域于PBS中的1.0mg/mL溶液以1℃/分钟的速率从35℃加热至95℃，获取DSC数据。扣除单独缓冲剂的曲线，得到图2A-N中所示的曲线。用CpCalc(Microcal)软件从这个数据计算出每个结构域的解链温度，如表1中所示。这个数据表明每个结构域都独立折叠，且这些结构域显示出很宽的热稳定性。
产生出所有15个纤连蛋白FN3结构域的多重序列比对，以设计共有蛋白质序列。图3中的多重序列比对的分析表明，虽然这15个结构域都折叠成类似的结构，但它们仅具有不太高的序列同一性，在27至48％的范围内。通过在图3中所示的比对的每个位置处掺入最保守的氨基酸，设计出了第一个共有序列。该第一个共有序列与纤连蛋白的15FN3结构域具有42至62％的序列同一性，平均同一性为45％。将该第一个共有序列的氨基酸序列进行反翻译，通过重叠PCR合成出编码这个蛋白质的合成基因序列，并亚克隆到经修饰的pET15载体中以进行表达。为进行表达，将此载体转化到大肠杆菌宿主BL21-Gold(DE3)(Stratagene)中，挑取单菌落到0.5mL含有氨苄青霉素的2YT培养基中。当培养物的O.D.600达到约0.6时，通过加入IPTG至1mM的终浓度诱导表达。诱导后于30℃下表达5小时后，通过SDS-PAGE监测表达情况。SDS-PAGE分析表明此蛋白质在大肠杆菌中没有表达迹象。
由于图3中给出的序列比对表明存在着许多不可能界定真实的共有序列的位置，因此设计出另一个共有序列，以试图产生出能在大肠杆菌中表达的蛋白质。该第二个共有序列在89个位置中有79个与该第一个共有序列相同，这导致其与纤连蛋白的15个FN3结构域有37至63％的序列同一性(平均同一性51％)。如对该第一个共有序列所述，将该第二个共有序列的氨基酸序列进行反翻译，并用此基因序列产生表达载体。与第一个共有序列一样，第二个共有序列也不能在大肠杆菌中以可检测的水平表达。
由于所设计的这两个共有序列都不能在大肠杆菌中表达，因此采取了第三个方案。在这个方案中，仅对最稳定的FN3结构域进行序列比对，以使产生稳定的共有蛋白质的可能性最大。表1显示结构域1、2、5、8、 10、12、14和15都具有大于70℃的解链温度。产生出结构域1、5、8、10、12、14和15的多重序列比对，以设计共有序列(图4)。结构域2被排除出这个比对，因为结构分析表明了在这个结构域中N末端“A”链是无序的(Vakonakis等人，Embo J 26：2575-83，2007)。通过选择图4中所示的比对的每个位置处最常用的残基，产生出Fibcon(SEQ ID NO：16)。Fibcon与图4中各个进行比对的结构域有40至64％的同一性。
将Fibcon的氨基酸序列反翻译以产生SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列，并通过不依赖于连接酶的克隆方法亚克隆到经修饰的pET27载体(Novagen)中。将此载体转化到BL21-GOLD(DE3)细胞中，接种中补加有50μg/mL卡那霉素的LB琼脂培养基上。用1个来自此平板的菌落接种10mL 2YT/Kan培养物，并在37℃下生长过夜。用此过夜培养物接种500mL补加有50μg/mL卡那霉素的2YT培养物，在37℃下生长至达到O.D.600～0.6，此时加入IPTG至1mM，将温度降低到30℃。在诱导后，4000×g下离心5小时收获细胞。通过加入5mL的BugBuster(Novagen)和1μLbenzonase核酸酶(Novagen)/g湿沉淀并在室温下摇动30分钟，将所得的细胞沉淀进行裂解，然后通过在15,000×g下离心30分钟使裂解物澄清。将澄清的裂解物上样到1mL Hitrap HP Ni-NTA柱(GE Healthcare)上，用10柱体积的PBS pH 7.4，12.5mM咪唑进行洗涤。通过在20柱体积的范围施加12.5mM至250mM的咪唑梯度，将Fibcon从柱中洗脱下来。各流份通过SDS-PAGE进行分析(图5A和5B)，集中在一起并浓缩，然后注射到处于PBS中的superdex 75 16/60凝胶过滤柱(GE Healthcare)上。由图5A和5B证明，Fibcon完全表达在大肠杆菌的可溶性流份中，得到有效纯化，且以单一的单聚物质形式存在。
通过差示扫描量热法(DSC)和内在色氨酸荧光评估了Fibcon的折叠和热稳定性。通过在N-DSCII热量计(Applied Thermodynamics)中将fibcon于PBS中的1.0mg/mL溶液以1℃/分钟的速率从30℃加热至115℃，获取DSC数据。扣除单独缓冲剂的曲线，以得到图6中所示的曲线。解链曲线符合折叠的结构域，且表明fibcon是高度稳定的蛋白质，热转变温度在82℃和105℃。在105℃下的转变很可能是由于fibcon在高温下聚集，因此此转变是依赖于浓度的。
Fibcon仅含有单一的色氨酸残基，其据预测被埋在该蛋白质的疏水核心中(通过对其他FN3结构域的结构分析预测)。在96孔板中，通过将fibcon的溶液(10μM)平衡于50mM磷酸钠(pH 7.0)，150mM NaCl和盐酸胍(Gu-HCl)的缓冲溶液，用此色氨酸残基的荧光监测fibcon的折叠。对于板的每个孔，Gu-HCl的浓度以0.25M的增量从0变化到6.5M的浓度。色氨酸荧光是用装备有单色器(Molecular Devices)的SpectraMax M5读板机通过280nm激发和360nm发射进行监测。图7显示fibcon在低于4M的Gu-HCl浓度下折叠。此色氨酸残基在胍滴定时的荧光证实了fibcon的折叠和结构。
优点
Fibcon蛋白质具有82℃的高热稳定性。基于这个高稳定性，这个支架分子可能易于在环或链中进行氨基酸置换，且容易制造，这使得它成为有价值的另选支架分子。降低蛋白质稳定性的突变在更为稳定的支架的情形中很可能得到更好的容忍，因此具有高稳定性的支架很可能从支架变体的文库中产生出更具功能性、折叠更好的结合物。由于这个新蛋白质不是人基因组所编码的蛋白质，因此它与基于天然纤连蛋白结构域(如第10个FN3结构域)的序列的支架分子相比，当给予人以用作治疗分子或诊断工具时，产生针对天然人纤连蛋白结构域的免疫反应的风险还可能较低。
实例2-Fibcon文库的产生 
Fibcon变体文库可通过许多不同的方法制备，这取决于突变所需的复杂性和在分子中的相对位置。优选DNA合成方法以产生遍布Fibcon基因的突变。也可用限制酶克隆来将含有该基因不同区域中的突变的各DNA片段重组在一起。在小的限定区域(如单一fibcon环)中的饱和诱变可通过使用简并寡核苷酸及寡核苷酸指导的诱变来引入(Kunkel等人，1987)。
构建了被设计来使用寡核苷酸指导的诱变用7-12个随机氨基酸取代FG环的fibcon文库。合成了寡核苷酸以在编码FG环的位置处掺入简并核苷酸NNS以及两个与fibcon基因序列互补的侧翼20-27bp核苷酸序列。在这个设计中，所有二十种氨基酸都能够在FG环中得到体现。
寡核苷酸指导的诱变的模板通过用含有AscI限制位点的茎环序列取代fibcon F:G环编码序列来构建。这个系统使得可以在诱变后转化前用AscI消化所得的DNA来除去背景模板DNA。为纯化单链DNA模板以供诱变，挑 取携带该载体的大肠杆菌CJ236单菌落，并加到5mL含有羧苄西林(50ug/ml终浓度)和氯霉素(10ug/ml)的2YT生长培养基中。6小时后，加入VCSM13辅助噬菌体至1010pfu/ml的终浓度，并在不振摇的情况下温育10分钟，然后转移到150mL含有羧苄西林(10ug/ml)和尿苷(0.25ug/ml)的2YT中，在振摇下200rpm、37℃温育过夜。离心使细胞沉淀，收集上清液，用PEG NaCl使噬菌体沉淀。用QIAprep Spin M13试剂盒(Qiagen)按照生产商说明从这个沉淀纯化出单链DNA。
为使简并寡核苷酸与模板退火，将5μg的模板DNA与寡核苷酸以10∶1的摩尔比在Tris-HCl(50mM，pH7.5)和MgCl2(10mM)中组合，并在90℃下温育2分钟，在60℃下温育3分钟和在20℃下温育5分钟。退火反应后，向反应混合物中加入ATP(10mM)、dNTP(各25mM)、DTT(100mM)、T4连接酶(7单位)和T7DNA聚合物(10单位)，并在14℃下温育6小时，然后在20℃下温育12小时。所得的DNA用PCR纯化试剂盒(Qiagen)进行纯化，并回收在100μL水中。将文库DNA用10单位的AscI消化4小时，然后再次用Qiagen PCR纯化试剂盒进行纯化。最终的文库DNA回收在50μL的水中。然后将所得的双链DNA产物通过电传孔转化到大肠杆菌MC1061F’中。
将转化子收集在20mL SOC培养基中，让其在37℃下恢复1小时。在恢复结束时，将转化液的等分试样进行系列稀释并接种在含有1％葡萄糖的羧苄西林(100ug/ml)平板上，以评估总转化子数目。然后用剩余的SOC培养物接种1L的含有羧苄西林和1％葡萄糖的2xYT培养基，并生长至OD600达到0.6。将100mL的此培养物用M13辅助噬菌体接种至1010/mL，并在37℃下温育后进行离心。将所得的细胞沉淀重悬于500mL新鲜的含有羧苄西林(100ug/mL)和卡那霉素(35ug/mL)的2xYT培养基中，并在30℃下生长过夜后进行离心。加入PEG/NaCl以沉淀出噬菌体颗粒，并在-80℃下保藏。
设计出第二文库以同时在fibcon的B:C环和F:G环内引入多样性。为此，合成了两个寡核苷酸。正向寡核苷酸是磷酸化的，在编码B:C环的每个位置处含有兼并密码子NNS，而反向寡核苷酸在5’末端是生物素酰化的，在编码F:G环的每个位置处含有21个碱基的NNS密码子。这两个寡核 苷酸都侧接有两个与要诱变的区域之前和之后的区域相同的18bp核苷酸序列。
为构建文库，用t寡核苷酸进行十六个100μL PCR反应以扩增fibconDNA模板，从而在此过程中将NNS密码子同时引入到B:C环和F:G环中。将双链PCR产物与磁性链霉亲和素小珠(Dynal)在B&W缓冲液(10mM Tris-HCl，pH7.5，1mM EDTA，2M NaCl，0.1％Tween-20)中混合并温育20分钟，然后用磁铁吸下来，用B&W缓冲液洗涤两次。正向链用300μL的150mMNaOH从小珠洗脱下来。这个“大引物”是理论多样性大于8×1016的长引物的混合物，用其与单链文库模板退火。文库的构建按以上对第一文库所述来进行。
实例3-靶标蛋白的结合物的选择
为了对能结合靶标蛋白的fibcon文库成员进行选择，用磺基-NHS-LC-生物素(Pierce)对靶标蛋白进行生物素酰化，然后透析到PBS中。为进行选择，将200μL的噬菌体展示文库用200μL的化学封闭剂进行封闭，然后加入生物素酰化的靶标蛋白，浓度为500nM(第1轮)或100nM(第2和第3轮)。结合的噬菌体在第1轮中通过中和亲和素磁性小珠(Seradyne)进行回收，或者在第2和第3轮中通过链霉亲和素磁性小珠(Promega)进行回收未结合的噬菌体用1mL含tween的Tris缓冲盐水(TBST)洗涤5-10次，接着用1mL Tris缓冲盐水(TBS)洗涤2次，从小珠上洗涤下来。通过加入对数中期大肠杆菌MC1061F’，将结合的噬菌体从小珠洗脱下来。将受感染的细胞接种在补加有羧苄西林和葡萄糖的LB琼脂平板上。第二天，从平板刮下细胞，使其生长至对数中期，然后用VCSM13辅助噬菌体拯救并生长过夜。将通过PEG/NaCl沉淀分离到的噬菌体颗粒用于下一轮选择。
经过3轮或更多轮的针对靶标蛋白进行的淘选之后，将所得物通过由PCR扩增fibcon基因而亚克隆到pET27载体中，该载体被修饰成包括不依赖于连接酶的克隆位点。使此PCR产物与该载体退火，并转化到BL21-GOLD(DE3)细胞(Stratagene)中。将各个菌落挑取到96深孔板(Corning)中的1mL培养物中，在37℃下过夜生长至饱和。第二天，用50μL的过夜培养物接种新鲜的1mL培养物。使培养物在37℃下生长2小时，然后加入IPTG至1mM，将温度降低至30℃。在诱导后16小时，离心收获细胞，用100μL 的BugBuster(Novagen)裂解。离心澄清所得的裂解物，用其通过ELISA测试与IgG的结合。
将Maxisorp板(Nunc)用0.1μg的抗HIS抗体(Qiagen)包被过夜，用TBST洗涤，并用Starting Block T20(Thermo Scientific)封闭。将澄清的裂解物在Starting Block中1∶4稀释液加到板中，让其结合1小时，然后用TBST洗涤。将生物素酰化的IgG或生物素酰化的HAS以1μg/ml的浓度加入，温育1小时后用TBST洗涤。通过加入链霉亲和素HRP(Jackon Immunoresearch)并用POD化学发光底物检测，完成对结合的IgG或HSA的检测。
出于本发明的目的，用本领域知道的合适计算机算法确定出70-100％氨基酸或核苷酸序列同一性(即90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或者其中的任何范围或数值)。
显而易见的是，本发明可以与前面的说明和实例中具体描述的方式不同的方式来实施。根据上面的教导，可以作出本发明的多种修改形式和变型形式，并且这些修改形式和变型形式落入所附权利要求的范围内。
表1DSC测出的FN3结构域的解链温度。
 FN3结构域   解链温度(℃)
 1   81.2
 2   70.7
 3   66.1
 4   52.3
 5   72.3
 6   68.3
 7   未测定
 8   72.6
 9   47.0
 10   82.5
 11   53.9
 12   76.1
 13   65.8
 14   70.3
 15   86.5
表2-序列：
SEQ ID NO：1
MSGPVEVFITETPSQPNSHPIQWNAPQPSHISKYILRWRPKNSVGRWKEATIPGHLNS
YTIKGLKPGVVYEGQLISIQQYGHQEVTRFDFTTTSTSGGHHHHHH
SEQ ID NO：2
MSGPVEVFITETPSQPNSHPIQWNAPQPSHISKYILRWRPKNSVGRWKEATIPGHLNS
YTIKGLKPGVVYEGQLISIQQYGHQEVTRFDFTTTSTSGGHHHHHH
SEQ ID NO：3
MGAPDAPPDPTVDQVDDTSIVVRWSRPQAPITGYRIVYSPSVEGSSTELNLPETANSV
TLSDLQPGVQYNITIYAVEENQESTPVVIQQETTGGHHHHHH
SEQ ID NO：4
MTVPSPRDLQFVEVTDVKVTIMWTPPESAVTGYRVDVIPVNLPGEHGQRLPISRNTF
AEVTGLSPGVTYYFKVFAVSHGRESKPLTAQQTTGGHHHHHH
SEQ ID NO：5
MKLDAPTNLQFVNETDSTVLVRWTPPRAQITGYRLTVGLTRRGQPRQYNVGPSVSK
YPLRNLQPASEYTVSLVAIKGNQESPKATGVFTTLGGHHHHHH
SEQ ID NO：6
MQPGSSIPPYNTEVTETTIVITWTPAPRIGFKLGVRPSQGGEAPREVTSDSGSIVVSGL
TPGVEYVYTIQVLRDGQERDAPIVNKVVTGGHHHHHH
SEQ ID NO：7
MGLSPPTNLHLEANPDTGVLTVSWERSTTPDITGYRITTTPTNGQQGNSLEEVVHAD
QSSCTFDNLSPGLEYNVSVYTVKDDKESVPISDTIIPAGGHHHHHH
SEQ ID NO：8
MGVPPPTDLRFTNIGPDTMRVTWAPPPSIDLTNFLVRYSPVKNEEDVAELSISPSDNA
VVLTNLLPGTEYVVSVSSVYEQHESTPLRGRQKTGGHHHHHH
SEQ ID NO：9
MLDSPTGIDFSDITANSFTVHWIAPRATITGYRIRHHPEHFSGRPREDRVPHSRNSITL
TNLTPGTEYVVSIVALNGREESPLLIGQQSTGGHHHHHH
SEQ ID NO：10
MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKS
TATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRTGGHHHHHH
SEQ ID NO：11
MGEIDKPSQMQVTDVQDNSISVKWLPSSSPVTGYRVTTTPKNGPGPTKTKTAGPDQ
TEMTIEGLQPTVEYVVSVYAQNPSGESQPLVQTAVTGGHHHHHH
SEQ ID NO：12
MTIPAPTDLKFTQVTPTSLSAQWTPPNVQLTGYRVRVTPKEKTGPMKEINLAPDSSS
VVVSGLMVATKYEVSVYALKDTLTSRPAQGVVTTLGGHHHHHH
SEQ ID NO：13
MENVSPPRRARVTDATETTITISWRTKTETITGFQVDAVPANGQTPIQRTIKPDVRSY
TITGLQPGTDYKIYLYTLNDNARSSPVVIDASTGGHHHHHH
SEQ ID NO：14
MAIDAPSNLRFLATTPNSLLVSWQPPRARITGYIIKYEKPGSPPREVVPRPRPGVTEAT
ITGLEPGTEYTIYVIALKNNQKSEPLIGRKKTGGHHHHHH
SEQ ID NO：15
MGHRPRPYPPNVGQEALSQTTISWAPFQDTSEYIISCHPVGTDEEPLQFRVPGTSTSA
TLTGLTRGATYNIIVEALKDQQRHKVREEVVTVGNSGGHHHHHH
SEQ ID NO：16
MPAPTDLRFTNETPSSLLISWTPPRVQITGYIIRYGPVGSDGRVKEFTVPPSVSSATITG
LKPGTEYTISVIALKDNQESEPLRGRVTTGGHHHHHH
SEQ ID NO：17
atgccggcgccgaccgatctgcgctttaccaacgaaaccccgagcagcctgctgattagctggaccccgccgcgcgtgcagattac 
cggctatattattcgctatggcccggtgggcagcgatggccgcgtgaaagaatttaccgtgccgccgagcgtgagcagcgcgacc 
attaccggcctgaaaccgggcaccgaatataccattagcgtgattgcgctgaaagataaccaggaaa 
表3-fibcon
  的环环  SEQ ID NO：16的残基   氨基酸序列
  A-B  13-16   TPSS
  B-C  22-28   TPPRVQI
  C-D  38-43   VGSDGR
  D-E  51-54   PSVS
  E-F  60-64   GLKPG
  F-G  75-81   KDNQESEP

Claims (21)

1.一种基于III型纤连蛋白(FN3)结构域的分离的蛋白质支架，所述分离的蛋白质支架由
i) 衍自纤连蛋白FN3结构域的共有序列的氨基酸序列组成，其中所述氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示。
2.根据权利要求1所述的蛋白质支架，其包含7条链和各链之间的6个环，由下列氨基酸序列组成：SEQ ID NO:16的氨基酸序列，并在SEQ ID NO:16的残基13-16、22-28、38-43、51-54、60-64和75-81处形成能够结合细胞蛋白质和/或核酸分子的环，任选所述环中的一个或多个被改变以结合靶标。
3.根据权利要求1或2所述的蛋白质支架，其中所述支架以选自以下的亲和力结合靶标：至少10-9M，所述亲和力通过表面等离子共振或Kinexa方法测定。
4.权利要求3所述的蛋白质支架，其中所述亲和力至少为10-10M。
5.权利要求3所述的蛋白质支架，其中所述亲和力至少为10-11M。
6.权利要求3所述的蛋白质支架，其中所述亲和力至少为10-12M。
7.权利要求3所述的蛋白质支架，其中所述亲和力至少为10-13M。
8.权利要求3所述的蛋白质支架，其中所述亲和力至少为10-14M。
9.权利要求3所述的蛋白质支架，其中所述亲和力至少为10-15M。
10.根据权利要求1或2所述的蛋白质支架，其中所述环形成用于结合靶标的位点。
11.一种构建基于III型纤连蛋白(FN3)结构域的蛋白质支架的文库的方法，所述方法包括以下步骤：
 提供由SEQ ID NO:16的氨基酸序列组成的多肽；和向所述由SEQ ID NO:16的氨基酸序列组成的多肽的各个拷贝中引入多样性以形成所述蛋白质支架文库，任选其中所述引入多样性步骤包括使至少一个选自SEQ ID NO:16的残基13-16、22-28、38-43、51-54、60-64和75-81的环区域突变。
12.一种文库，所述文库通过根据权利要求11所述的方法产生。
13.一种产生以预定的结合亲和力结合特定靶标的蛋白质支架的方法，所述方法包括使根据权利要求12所述的文库与所述特定靶标进行接触，并分离出以所述预定的亲和力结合所述特定靶标的蛋白质支架。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述分离步骤包括分离结合所述特定靶标的支架分子并测试所述分离的支架分子与所述特定靶标的结合亲和力，任选其中所述亲和力小于或等于10-7M。
15.一种分离的核酸分子，所述分离的核酸分子编码根据权利要求1或2所述的蛋白质支架。
16.根据权利要求15所述的分离的核酸分子，其包含SEQ ID NO:17中所示的核苷酸序列。
17.一种分离的核酸载体，所述分离的核酸载体包含根据权利要求15所述的分离的核酸分子。
18.一种原核生物或真核生物宿主细胞，所述原核生物或真核生物宿主细胞包含根据权利要求15所述的分离的核酸分子，任选其中所述宿主细胞为选自以下的至少一者：大肠杆菌BL21Star(DE3)、其他大肠杆菌细胞、酵母细胞、COS-1细胞、COS-7细胞、HEK293细胞、BHK21细胞、CHO细胞、BSC-1细胞、Hep G2细胞、653细胞、SP2/0细胞、293细胞、HeLa细胞、骨髓瘤细胞或淋巴瘤细胞，或者它们的任何衍生物、无限增殖化细胞或转化细胞。
19.一种组合物，所述组合物包含根据权利要求1或2所述的蛋白质支架和至少一种可药用载体或稀释剂，任选还包含至少一种选自以下的化合物或多肽：可检测标记或报道分子、TNF拮抗剂、抗感染药物、心血管(CV)系统药物、中枢神经系统(CNS)药物、自主神经系统(ANS)药物、呼吸道药物、胃肠(GI)道药物、激素药物、使流体或电解质平衡的药物、血液学药物、抗肿瘤药物、免疫调节药物、眼耳或鼻药物、局部用药物、营养药物、细胞因子和细胞因子拮抗剂。
20.一种医疗器械，所述医疗器械包含根据权利要求1或2所述的蛋白质支架，其中所述器械适合于通过至少一种选自以下的方式接触或给予所述蛋白质支架：胃肠外、皮下、肌肉内、静脉内、关节内、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、腹腔内、小脑内、脑室内、结肠内、子宫颈内、胃内、肝内、心肌内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸内、子宫内、膀胱内、病灶内、推注、阴道、直肠、口腔、舌下、鼻内和透皮。
21.一种供人类药用或诊断用的制品，所述制品包含包装材料和容器，所述容器包含根据权利要求1或2所述的蛋白质支架的溶液或冻干形式，其中所述容器任选是以下递送装置或系统的组件：胃肠外、皮下、肌肉内、静脉内、关节内、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、腹腔内、小脑内、脑室内、结肠内、子宫颈内、胃内、肝内、心肌内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸内、子宫内、膀胱内、病灶内、推注、阴道、直肠、口腔、舌下、鼻内或者透皮装置或系统。
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