MX2011008566A - Composiciones supercontigo basadas en el dominio de fibronectina tipo iii, metodos y usos. - Google Patents

Abstract

Un supercóntigo de proteínas basado en una secuencia consenso de la décima repetición de la fibronectina tipo III (FN3) de fibronectina humana, que incluye ácidos nucleicos aislados que codifican un supercóntigo de proteínas, vectores, células huésped, y métodos de preparación y uso de estos que tienen aplicaciones en las composiciones diagnósticas y/o terapéuticas, métodos y dispositivos. En particular, las moléculas supercóntigo de proteínas que se unen a lgG basado en la secuencia consenso se identificaron como útiles para aplicaciones de diagnóstico y/o terapéutico.

Description

COMPOSICIONES SUPERCÓNTIGO BASADAS EN EL DOMINIO DE FIBRONECTINA TIPO III, MÉTODOS Y USOS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a supercóntigos de proteínas con propiedades nuevas, que incluyen la capacidad de unirse a los objetivos celulares. Más particularmente, la presente invención se dirige a un supercóntigo de proteína basado en una secuencia consenso de una fibronectina tipo III (FN3) repetitiva.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los anticuerpos monoclonales son la clase de proteínas terapéuticas que se usa más ampliamente cuando se desea una afinidad y especificidad alta por una molécula objetivo. Sin embargo, las proteínas no anticuerpo que pueden modificarse para unirse a esos objetivos son también de mucho interés en la industria biofarmacéutica. Estas proteínas "supercóntigo alternativos" pueden tener ventajas sobre los anticuerpos tradicionales debido a su tamaño pequeño, falta de enlaces disulfuro, alta estabilidad, y capacidad para expresarse en huéspedes procariotas. Los nuevos métodos de purificación se aplican fácilmente; se conjugan fácilmente con los fármacos/toxinas, penetran eficientemente en los tejidos y se formatean fácilmente en aglutinantes multiespecíf¡cos(Skerra 2000; Binz y Pluckthun 2005).

Uno de esos supercóntigos alternativos es el pliegue de la inmunoglobulina (Ig). Este pliegue se encuentra en las regiones variables de los anticuerpos, así como en millones de proteínas no anticuerpo. Se demostró que una de esas proteínas Ig, la décima repetición de la fibronectina tipo III (FN3) de la fibronectina humana, puede tolerar un número de mutaciones en los lazos expuestos a la superficie mientras mantiene la estructura de pliegue Ig general. Así, se han construido genotecas de variantes de aminoácidos en estos lazos y se han seleccionado aglutinantes específicos para un número de objetivos diferentes (Koide y otros, 1998; Karatan y otros, 2004). Se encontró que esos dominios FN3 modificados se unen a los objetivos con alta afinidad, mientras que mantienen propiedades biofísicas importantes (Parker y otros, 2005).

Las propiedades físicas deseables de las moléculas de supercóntigos alternativos potenciales incluyen alta estabilidad térmica y reversibilidad del plegamiento y desplegamiento térmico. Se han aplicado muchos métodos para aumentar la estabilidad térmica aparente de las proteínas y enzimas, que incluyen el diseño racional basado en la comparación con secuencias termoestables muy similares, el diseño de puentes de disulfuro estabilizantes, mutaciones para aumentar la tendencia a la a-hélice, modificación de los puentes de sal, alteración de la carga de superficie de la proteína, evolución dirigida, y composición de secuencias consenso (Lehmann y Wyss 2001). La estabilidad térmica alta es una propiedad deseable de esos supercóntigos ya que pueden aumentar el rendimiento de la proteína recombinante obtenida, mejorar la solubilidad de la molécula purificada, mejorar la actividad de los supercóntigos intracelulares, disminuir la inmunogenicidad, y minimizar la necesidad de una cadena fría en la fabricación.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona un supercóntigo de proteina basada en una proteína de repetición de la fibronectina tipo III (FN3), ácidos nucleicos codificantes o complementarios, vectores, células huésped, composiciones, combinaciones, formulaciones, dispositivos, y métodos para prepararlos y usarlos. En una modalidad preferida, el supercóntigo de proteína está formado por una secuencia consenso de dominios FN3 múltiples de fibronectina humana. En otra modalidad preferida el supercóntigo de proteína de la presente invención es una secuencia consenso de 7 dominios FN3. Los supercóntigos de proteínas de la invención pueden diseñarse para unir varias moléculas, por ejemplo, una proteína objetivo celular.

Los supercóntigos de proteínas de la invención pueden incluir moléculas o porciones adicionales, por ejemplo, la región Fe de un anticuerpo, dominio de unión a la albúmina, u otra porción que influencia el período de semidesintegración. En otras modalidades los supercóntigos de proteínas de la invención pueden unirse a una molécula de ácido nucleico que puede codificar el supercóntigo de proteina.

La presente invención proporciona, además, al menos un método para expresar al menos un supercóntigo de proteína basado en una secuencia consenso de dominios FN3 múltiples, en una célula huésped, el método comprende cultivar una célula huésped como es descrito en la presente descripción bajo condiciones en donde al menos un supercóntigo de proteína se expresa en cantidades detectables y/o recuperables.

La presente invención proporciona, además, al menos una composición que comprende (a) un supercóntigo de proteína basado en una secuencia consenso de dominios FN3 múltiples y/o ácido nucleico codificante como es descrito en la presente descripción; y (b) un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable y/o adecuado.

La presente invención comprende, además, un método de generación de genotecas de un supercóntigo de proteína basado en una proteína de repetición de fibronectina tipo III (FN3), preferentemente, una secuencia consenso de dominios FN3 múltiples y, con mayor preferencia, una secuencia consenso de dominios FN3 múltiples de fibronectina humana. La genoteca se forma al realizar generaciones sucesivas de supercóntigos por alteración (por mutación) de los aminoácidos o el número de aminoácidos en las moléculas en posiciones particulares en porciones del supercóntigo, por ejemplo, las regiones lazo. Las genotecas pueden generarse por la alteración de la composición de los aminoácidos de un solo lazo o la alteración simultánea de múltiples lazos. Los lazos que se alteran pueden alargarse o recortarse en correspondencia. Tales genotecas pueden generarse para incluir todos los aminoácidos posibles en cada posición, o un subconjunto diseñado de aminoácidos. Los miembros de la genoteca pueden usarse para ensayos por exhibición, tal como exhibición in vitro (exhibición de ADN, ARN, ribosoma) y exhibición de fagos.

Los supercóntigos de proteínas de la presente invención proporcionan propiedades biofísicas mejoradas, tales como estabilidad bajo condiciones reductoras y solubilidad a altas concentraciones; pueden expresarse y plegarse en sistemas procariotas, tal como E. coli, en sistemas eucariotas, tal como levadura, y en sistemas de transcripción/traducción in vitro, tales como el sistema de lisado de reticulocitos de conejo En un aspecto adicional la presente invención proporciona un método para generar una molécula supercóntigo que se une a un objetivo particular por cribado de la genoteca de supercóntigos de la invención con los aglutinantes objetivos y de detección. En otros aspectos relacionados la invención comprende métodos de ensayo que pueden usarse para generar o madurar la afinidad de los supercóntigos de proteínas con la actividad deseada, por ejemplo, capaz de unirse a las proteínas objetivo con una cierta afinidad. La maduración de la afinidad puede realizarse por rondas iterativas de mutagénesis y selección por medio del uso de sistemas tales como exhibición de fagos o exhibición in vitro. La mutagénesis durante este proceso puede ser el resultado de la mutagénesis dirigida al sitio para residuos de supercóntigos específicos, mutagénesis aleatoria debido a PCR propenso a error, barajado de ADN, y/o una combinación de estas técnicas. La presente invención proporciona, además, cualquier invención descrita en la presente descripción.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS FIGURAS Figura 1. Estructura del dominio FN3. Estructura cristalina del 10.° dominio de FN3 de la fibronectina humana (PDB 1TTF) (Main, y otros, Cell 71 : 671-8, 1992). Los lazos B:C, D:E, y F:G que se sometieron a diversificación se etiquetaron.

Figuras 2A-2N. Perfiles de fusión de los dominios FN3 purificados (excepto para el 7." dominio) de fibronectina humana según se determinó por DSC (por sus siglas en inglés) en PBS pH 7.4.

Figura 3. Alineamiento múltiple de secuencias de los 15 dominios FN3 de fibronectina humana. El alineamiento se produjo por medio del uso del software VectorNTI.

Figura 4. Alineamiento múltiple de secuencias de los dominios FN3 1 , 5, 8, 10, 12, 14, y 15 de fibronectina humana. El alineamiento se produjo por medio del uso del software VectorNTI.

Figuras 5A y 5B. Expresión y purificación de fibcon. Figura 5A: El análisis SDS-PAGE 4-12 % mostró el lisado de célula total, fracción soluble, flujo continuo de Ni-NTA, y fracciones eluidas de la columna de Ni-NTA. Figura 5B Purificación con Superdex 75 de fibcon en PBS. Las flechas muestran el volumen de elución y la masa de los estándar de peso molecular.

Figura 6. Calorimetría de barrido diferencial de fibcon en PBS pH 7.4.

Figura 7. El Gu-HCI indujo el desplegamiento de fibcon monitoreado por fluorescencia intrínseca del triptófano. La excitación fue a una longitud de onda de 280 nm y emisión a 365 nm.

Figura 8. Secuencia de aminoácidos de fibcon que muestra la ubicación de los lazos A-B, B-C, C-D, D-E, E-F, F-G.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona un supercóntigo de proteína recombinante y/o sintético, aislado, basado en una proteína de repetición de fibronectina tipo III (FN3) de fibronectina humana, que incluye, sin limitación, supercóntigo derivado de mamífero, así como las composiciones y moléculas de ácido nucleico codificantes que comprende al menos un polinucleótido que codifica un supercóntigo de proteína basado en el décimo dominio de FN3. La presente invención incluye, además, pero no se limita a, los métodos para preparar y usar tales ácidos nucleicos y supercóntigos de proteínas, que incluyen las composiciones diagnósticas y terapéuticas, los métodos y los dispositivos.

Los supercóntigos de proteínas de la presente invención ofrecen ventajas sobre las terapéuticas convencionales, tales como la capacidad de administrarse localmente, oralmente, o atravesar la barrera hematoencefálica, la capacidad de expresarse en E. coli, lo que permite la expresión aumentada de la proteina como una función de recursos contra capacidad de expresión de las células de mamíferos para modificarse en moléculas biespecíficas que se unen a objetivos múltiples o epítopos múltiples del mismo objetivo, la capacidad de conjugarse con fármacos, polímeros, y sondas, la capacidad de formularse a altas concentraciones, y la capacidad de esas moléculas de penetrar eficazmente los tejidos enfermos y tumores.

Además, los supercóntigos de proteínas tienen muchas de las propiedades de los anticuerpos en relación con su pliegue que imita la región variable de un anticuerpo. Esta orientación permite que los lazos de FN3 se expongan de manera similar a las regiones determinantes de la complementariedad del anticuerpo (CDR). Estas deben ser capaces de unirse a los objetivos celulares y los lazos pueden alterarse, por ejemplo, afinidad madura, para mejorar ciertas propiedades de unión o relacionadas.

Tres de los seis lazos del supercóntigo de proteína de la invención corresponden topológícamente a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR 1-3), es decir, regiones de unión al antígeno, de un anticuerpo, mientras que los tres lazos restantes se exponen a la superficie de manera similar a las CDR del anticuerpo. Estos residuos de los tramos de los lazos 13-16, 22-28, 38-43, 51-54, 60-64, y 75-81 de la SEQ ID NO: 16 como se muestra en la Tabla 3 a continuación y la Figura 8. Preferentemente, las regiones lazo en los residuos 22-28, 51-54, y 75-81 se alteran por afinidad y especificidad de unión. Estas regiones lazo se aleatorizan para poblar una genoteca y pueden seleccionarse aglutinantes potentes a partir de la genoteca con alta afinidad por un objetivo de proteina particular. Una o más de las regiones lazo pueden interactuar con una proteína objetivo similar a una interacción CDR del anticuerpo con la proteina.

Los supercóntigos de la presente invención pueden incorporar otras subunidades, por ejemplo, a través de la interacción covalente. Todo o una porción de una región constante del anticuerpo puede unirse al supercóntigo para impartir propiedades similares al anticuerpo, por ejemplo, actividad del complemento (ADCC), período de semidesintegración, etc. Por ejemplo, la función efectora puede proporcionarse y/o controlarse, por ejemplo, al modificar la unión de C1q y/o la unión FcyR y así modificar la actividad CDC y/o la actividad ADCC. Las "funciones efectoras" son responsables de la activación o diminución de la actividad biológica (por ejemplo, en un sujeto). Los ejemplos de funciones efectoras incluyen, pero no se limitan a: unión de C1 q; citotoxicidad dependiente del complemento (CDC); unión al receptor Fe; citotoxicidad medida por la célula dependiente del complemento (ADCC); fagocitosis; regulación descendente de los receptores de superficie celular (por ejemplo, receptor de células B; BCR), etc. Tales funciones efectoras pueden requerir que la región Fe se combine con un dominio de unión (por ejemplo, lazos del supercóntigo de proteína) y pueden evaluarse por medio del uso de varios ensayos (por ejemplo, ensayos de unión Fe, ensayos ADCC, ensayos CDC, etc.).

Además, un conjugado de toxina, albúmina o aglutinantes de albúmina, moléculas de polietilenglicol (PEG) se pueden unir a la molécula del supercóntigo para las propiedades deseadas. Cualquiera de estas fusiones puede generarse por técnicas estándares, por ejemplo, por expresión de la proteína de fusión a partir de un gen de fusión recombinante construido por medio del uso de secuencias de genes públicamente disponibles.

Los supercóntigos de la presente invención pueden usarse como monoespecíficos en forma monomérica o como bi- o multi-específicos (para diferentes epítopos u objetivos de proteínas en el mismo objetivo de proteína) en forma multímera. Los enlaces pueden ser covalentes o no covalentes. Por ejemplo, un supercóntigo biespecífico dimérico tiene una subunidad con especificidad por un primer epítopo o proteína objetivo y una segunda subunidad con especificidad por un segundo epítopo o proteína objetivo. Las subunidades de supercóntigos se unen en una variedad de conformaciones que pueden aumentar la valencia y así la avidez de la unión al antígeno.

Como se usa en la presente descripción, un "anticuerpo" incluye cualquier proteína o péptido que contiene una molécula que comprende al menos una porción de una molécula de inmunoglobulina, tal como, pero no se limitan a, al menos una región determinante de complementaridad (CDR) de una cadena ligera o pesada o una porción de unión al ligando de esta, una región variable de cadena pesada o de cadena ligera, una región constante de cadena pesada o de cadena ligera, una región marco, o cualquier porción de esta. Tal anticuerpo afecta además, opcionalmente, un ligando específico tal como, pero no se limitan a, en donde tal anticuerpo modula, disminuye, aumenta, antagoniza, agoniza, mitiga, alivia, bloquea, inhibe, deroga y/o interfiere con al menos una actividad o unión, o con actividad o unión del receptor, in vitro, in situ y/o in vivo.

El término "anticuerpo" pretende abarcar, además, los anticuerpos, fragmentos de digestión, porciones específicas y variantes de estas, que incluye, sin limitación, miméticos del anticuerpo o que comprenden porciones de anticuerpos que imitan la estructura y/o función de un anticuerpo o fragmento especificado o porción de estos, que incluye, sin limitación, anticuerpos de cadena sencilla, anticuerpos de dominio sencillo, y fragmentos de estos. Los fragmentos funcionales incluyen fragmentos de unión al antígeno que se unen a un objetivo particular. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpo capaces de unirse a un objetivo particular o porciones de este, que incluyen, pero no se limitan a, fragmentos Fab (por ejemplo, por digestión de papaina), Fab' (por ejemplo, por digestión y reducción parcial de pepsina) y F(ab')2 (por ejemplo, por digestión de pepsina), facb (por ejemplo, por digestión de plasmina), pFc' (por ejemplo, por digestión de pepsina o plasmina), Fd (por ejemplo, por digestión de pepsina, reducción parcial y reagrupación), Fv o scFv (por ejemplo, por técnicas de biología molecular), son abarcados por la invención (ver, por ejemplo, Colligan, Immunology, supra).

Tales fragmentos pueden producirse por clivaje enzimático, técnicas recombinantes o sintéticas, como se conoce en la materia y/o como es descrito en la presente descripción. Los anticuerpos pueden producirse, además, en una variedad de formas truncadas por medio del uso de genes de anticuerpos en los que se introdujo uno o más codones de terminación corriente arriba del sitio de terminación natural. Por ejemplo, un gen de combinación que codifica una porción de cadena pesada F(ab')2 pueden diseñarse para incluir secuencias de ADN que codifican el dominio Ch^ y/o región bisagra de la cadena pesada. Las diferentes porciones de los anticuerpos pueden unirse químicamente por técnicas convencionales, o pueden prepararse como una proteína contigua por medio del uso de técnicas de ingeniería genética.

Una proteína supercóntigo de la presente invención puede usarse para medir o efectuar en una célula, tejido, órgano o animal (que incluyen los mamíferos y humanos), para diagnosticar, monitorear, modular, tratar, aliviar, ayudar a prevenir la incidencia de, o reducir los síntomas de, al menos una enfermedad o afección, seleccionada de, pero sin limitarse a, al menos una de un trastorno o enfermedad inmune, un trastorno o enfermedad cardiovascular, un trastorno o enfermedad infecciosa, maligna, y/o neurológica, u otra afección relacionada conocida o especificada.

Un método de este tipo puede comprender administrar una cantidad efectiva de una composición o una composición farmacéutica que comprende al menos una proteína supercóntigo a una célula, tejido, órgano, animal o paciente con necesidad de tal modulación, tratamiento, alivio, prevención, o reducción de los síntomas, efectos o mecanismos. La cantidad efectiva puede comprender una cantidad de aproximadamente 0.001 a 500 mg/kg por administración única (por ejemplo, bolo), múltiple o continua, o para alcanzar una concentración en suero de 0.01-5000 pg/ml concentración en suero por administración única, múltiple, o continua, o cualquier intervalo efectivo o valor en ella, como se hace y determina por medio del uso de métodos conocidos, como es descrito en la presente descripción o conocidos en la materia relevante.

Proteína supercóntigo de la presente invención - Producción y generación Al menos una proteína supercóntigo de la presente invención puede producirse, opcionalmente, por una línea celular, una línea celular mixta, una célula inmortalizada o población clonal de células inmortalizadas, como se conoce bien en la materia. Ver, por ejemplo, Ausubel, y otros, ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, NY (1987-2001), Sambrook, y otros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2.° edición, Cold Spring Harbor, NY (1989); Harlow and Lañe, Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1989); Colligan, y otros, eds., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., NY (1994-2001); Colligan y otros, Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, NY, (1997-2001).

Los aminoácidos de una proteína supercóntigo pueden alterarse, añadirse y/o eliminarse para reducir la inmunogenicidad o reducir, mejorar o modificar la unión, afinidad, constante de asociación, constante de disociación, avidez, especificidad, período de semidesintegración, estabilidad, solubilidad o cualquier otra característica adecuada, como se conoce en la materia.

Opcionalmente, las proteínas supercóntigo pueden modificarse con retención de alta afinidad por el antígeno y otras propiedades biológicas favorables. Para alcanzar este objetivo las proteínas supercóntigo pueden prepararse, opcionalmente, por un proceso de análisis de las secuencias parentales y varios productos modificados conceptuales por medio del uso de modelos tridimensionales de las secuencias parentales y modificadas. Los modelos tridimensionales se encuentran comúnmente disponibles y son del conocimiento de aquellos con experiencia en la materia. Se encuentran disponibles programas de computadora que ilustran y exhiben estructuras conformacionales tridimensionales probables de secuencias candidatas seleccionadas y pueden medir la posible inmunogenicidad (por ejemplo, el programa Immunofilter de Xencor, Inc. de Monrovia, CA). La inspección de estas exhibiciones permite el análisis del rol probable de los residuos en el funcionamiento de la secuencia candidata, es decir, el análisis de residuos que influencia la capacidad de la proteína supercóntigo candidata para unirse a su antígeno. De esta forma, los residuos pueden seleccionarse y combinarse a partir de las secuencias genitoras y de referencia de manera que las características deseadas, tales como la afinidad por el(los) antigeno(s) objetivo(s), se alcanzan. Alternativamente, o adicionalmente a, los procedimientos anteriores, pueden usarse otros métodos adecuados de modificación.

Ensayo El ensayo de supercóntigos de proteínas para la unión específica a proteínas o fragmentos similares se puede alcanzar convenientemente por medio del uso de genotecas de nucleótidos (exhibición de ADN o ARN) o exhibición de péptido, por ejemplo, exhibición in vitro. Este método involucra el ensayo de colecciones grandes de péptidos para los miembros individuales que tienen la función o estructura deseada. Las secuencias de nucleótidos o péptidos exhibidas pueden ser de una longitud de 3 a 5000 o más nucleótidos o aminoácidos, frecuentemente, de 5-100 aminoácidos y, frecuentemente, de aproximadamente 8 a 25 aminoácidos. Adicionalmente a los métodos de síntesis químicos directos para generar genotecas de péptidos, se han descrito varios métodos de ADN recombinante. Un tipo involucra la exhibición de una secuencia peptídica en la superficie de un bacteriófago o célula. Cada bacteriófago o célula contiene la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia peptídica exhibida particular. Esos métodos se describen en las publicaciones de patente PCT núms. 91/17271 , 91/18980, 91/19818, y 93/08278.

Otros sistemas para generar genotecas de péptidos tienen aspectos de los métodos recombinante y de síntesis química in vitro. Ver, las publicaciones de patente PCT núms. 92/05258, 92/14843, y 96/19256. Ver además, las patentes de los Estados Unidos núms. 5,658,754; y 5,643,768. Las genotecas de exhibición de péptidos, vector, y kits de ensayo se encuentran comercialmente disponibles de proveedores como Invitrogen (Carisbad, CA), y Cambridge Antibody Technologies (Cambridgeshire, Reino Unido). Ver, por ejemplo, patentes de los Estados Unidos núms. 4704692, 4939666, 4946778, 5260203, 5455030, 5518889, 5534621 , 5656730, 5763733, 5767260, 5856456, cedida a Enzon; 5223409, 5403484, 5571698, 5837500, cedida a Dyax, 5427908, 5580717, cedida a Affymax; 5885793, cedida a Cambridge Antibody Technologies; 5750373, cedida a Genentech, 5618920, 5595898, 5576195, 5698435, 5693493, 5698417, cedida a Xoma, Colligan, supra; Ausubel, supra; o Sambrook, supra.

Los supercóntigos de proteínas de la invención pueden unirse a las proteínas humanas u otros de mamíferos con un amplia intervalo de afinidades (KD). En una modalidad preferida, al menos un supercóntigo de proteína de la presente invención puede unirse, opcionalmente, a una proteína objetivo con alta afinidad, por ejemplo, con una KD igual a o menor de aproximadamente 0"7 M, tal como, pero sin limitarse a, 0.1-9.9 (o cualquier intervalo o valor dentro de este) X 10-8, 10·9, 10 10, 10'11, 10-12, 10"13, 1fJ14, 10'15 o cualquier intervalo o valor dentro de este, determinado por resonancia de plasmón de superficie o el método Kinexa, como es practicado por aquellos con experiencia en la materia.

La afinidad o avidez de un supercóntigo de proteína por un antígeno puede determinarse experimentalmente por medio del uso de cualquier método adecuado (Ver, por ejemplo, Berzofsky, y otros, "Antibody-Antigen Interactions", En Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press: Nueva York, NY (1984); Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman and Company: Nueva York, NY (1992); y los métodos descritos en la presente descripción). La afinidad medida de una interacción supercóntigo de proteína-antígeno particular pueden variar si se mide bajo diferentes condiciones (por ejemplo, concentración de la sal, pH). Así, las mediciones de afinidad y otros parámetros de unión al antígeno (por ejemplo, KD, Ka, Kd) se realizan, preferentemente, con soluciones estandardizadas de supercóntigo de proteína y antígeno, y un amortiguador estandardizado, tal como el amortiguador descrito en la presente descripción.

Los ensayos competitivos pueden realizarse con el supercóntigo de proteína de la presente invención para determinar qué proteínas, anticuerpos, y otros antagonistas compiten por la unión a una proteína objetivo con el supercóntigo de proteína de la presente invención y/o comparten la región del epítopo. Estos ensayos como se conoce fácilmente por aquellos con experiencia en la materia evalúan la competencia entre los antagonistas o ligandos para un número limitado de sitios de unión en una proteína. La proteína y/o anticuerpo se inmoviliza o insolubiliza antes o después de la competencia y la muestra unida a la proteína objetivo se separa de la muestra no unida, por ejemplo, por decantación (en donde la proteína/anticuerpo se preinsolubilizó) o por centrifugación (en donde la proteina/anticuerpo precipitó después de la reacción competitiva). Además, la unión competitiva puede determinarse, si la función se altera, por la unión o falta de unión del supercóntigo de proteína a la proteína objetivo, por ejemplo, si la molécula de supercóntigo de proteína inhibe o potencia la actividad enzimátíca de, por ejemplo, una etiqueta. ELISA y otros ensayos funcionales pueden usarse, como se conoce bien en la materia.

Moléculas de ácido nucleico.

Las moléculas de ácido nucleico de la presente invención que codifican supercóntigos de proteínas pueden estar en forma deARN, tal como ARNm, ARNnh, ARNt o cualquier otra forma, o en forma de ADN, que incluye, pero no se limitan a, ADNc y ADN genómico obtenido por clonación o producido sintéticamente, o cualquier combinación de estos. El ADN puede ser de cadena triple, de cadena doble, o de cadena sencilla, o cualquier combinación de estos. Cualquier porción de al menos una cadena de ADN o ARN puede ser la cadena codificante, conocida, además, como el secuenciador, o puede ser una cadena no codificante, referida, además, como la cadena anticodificante.

Las moléculas de ácido nucleico aisladas de la presente invención pueden incluir moléculas de ácido nucleico que comprenden un marco de lectura abierto (ORF), opcionalmente, con uno o más intrones, por ejemplo, pero no se limitan a, al menos una porción especificada de al menos un supercóntigo de proteína; moléculas de ácido nucleico que comprenden la secuencia codificante para un supercóntigo de proteína o región lazo que se une a la proteína objetivo; y moléculas de ácido nucleico que comprenden una secuencia de nucleótidos sustancialmente diferente de la descrita anteriormente pero la cual, debido a la degeneración del código genético, todavía codifican el supercóntigo de proteina como se describe en la presente descripción y/o como se conoce en la materia. Por supuesto, el código genético es bien conocido en la materia. Así, sería rutina para una persona con experiencia en la materia generar tales variantes de ácido nucleico redundantes que codifican para supercóntigos de proteína específicos de la presente invención. Ver, por ejemplo, Ausubel, y otros, supra, y esas variantes de ácido nucleico se incluyen en la presente invención.

Como se indicó en la presente descripción, las moléculas de ácido nucleico de la presente invención que comprenden un ácido nucleico que codifica un supercóntigo de proteína pueden incluir, pero no se limitan a, las que codifican la secuencia de aminoácidos de un fragmento de supercóntigo de proteína, por sí mismas; la secuencia codificante para el supercóntigo de proteína entero o una porción de este; la secuencia codificante para un supercóntigo de proteína, fragmento o porción, así como secuencias adicionales, tales como la secuencia codificante de al menos un péptido de fusión o líder de señal, con o sin las secuencias codificantes adicionales antes mencionadas, tal como al menos un intrón, junto con secuencias no codificantes, adicionales, que incluyen pero no se limitan a, secuencias 5' y 3' no codificantes, tales como las secuencias transcritas, no traducidas que desempeñan un rol en la transcripción, procesamiento del ARNm, que incluye corte y empalme y señales de poliadenilación (por ejemplo, unión al ribosoma y estabilidad del ARNm); una secuencia codificante adicional que codifica para aminoácidos adicionales, tales como los que proporcionan funcionalidades adicionales. Así, la secuencia que codifica un supercóntigo de proteína puede fusionarse con una secuencia marcadora, tal como una secuencia que codifica un péptido que facilita la purificación del supercóntigo de proteína fusionado que comprende un fragmento o porción del supercóntigo de proteína.

Los polinucleótidos hibridan selectivamente un polinucleótido como de describe en la presente descripción La presente invención proporciona ácidos nucleicos aislados que hibridan bajo condiciones de hibridación selectivas a un polinucleótido descrito en la presente descripción. Así, los polinucleótidos de esta modalidad se pueden usar para aislar, detectar, y/o cuantificar los ácidos nucleicos que comprenden esos polinucleótidos. Por ejemplo, los polinucleótidos de la presente invención se pueden usar para identificar, aislar, o amplificar los clones de longitud parcial o completa en una genoteca depositada. En algunas modalidades los polinucleótidos son secuencias de ADNc o genómicas aisladas, o de cualquier otra forma complementarias a, un ADNc de una genoteca de ácido nucleico humano o mamífero.

Preferentemente, la genoteca de ADNc comprende al menos 80 % de secuencias de longitud completa, preferentemente, al menos 85 % o 90 % de secuencias de longitud completa y, con mayor preferencia, al menos 95 % de secuencias de longitud completa. Las genotecas de ADNc pueden normalizarse para aumentar la representación de secuencias raras. Las condiciones de hibridación de estringencia baja a moderada típicamente, pero no exclusivamente, se emplean con secuencias que tienen una identidad de secuencia reducida en relación con las secuencias complementarias. Las condiciones de estringencia moderada y alta pueden emplearse, opcionalmente, para secuencias de mayor identidad. Las condiciones de estringencia baja permiten la hibridación selectiva de secuencias que tienen aproximadamente 70 % de identidad de secuencia y pueden emplearse para identificar secuencias ortólogas o parálogas.

Opcionalmente, los polinucleótidos de esta invención codificarán al menos una porción de un supercóntigo de proteína codificado por los polinucleótidos descritos en la presente descripción. Los polinucleótidos de esta invención abarcan las secuencias de ácido nucleico que pueden emplearse para la hibridación selectiva a un polinucleótido que codifica a supercóntigo de proteína de la presente invención. Ver, por ejemplo, Ausubel, supra; Colligan, supra, cada uno incorporado completamente en la presente descripción como referencia.

Construcción de ácidos nucleicos Los ácidos nucleicos aislados de la presente invención pueden prepararse por medio del uso de (a) métodos recombinantes, (b) técnicas sintéticas, (c) técnicas de purificación, y/o (d) combinaciones de estas, como se conoce bien en la materia.

Los ácidos nucleicos pueden comprender, convenientemente, secuencias adicionalmente a un polinucleótido de la presente invención. Por ejemplo, un sitio de clonación múltiple que comprende uno o más sitios de restricción de la endonucleasa pueden insertarse en el ácido nucleico para ayudar en el aislamiento del polinucleótido. Además, las secuencias traducibles pueden insertarse para ayudar en el aislamiento del polinucleótido traducido de la presente invención. Por ejemplo, una secuencia marcadora de hexa-histidina proporciona un medio conveniente para purificar las proteínas de la presente invención. El ácido nucleico de la presente invención, sin incluir la secuencia codificante es, opcionalmente, un vector, adaptador, o enlazador para la clonación y/o expresión de un polinucleótido de la presente invención.

Las secuencias adicionales pueden añadirse a tales secuencias de clonación y/o expresión para optimizar su función en la clonación y/o expresión, para ayudar en el aislamiento del polinucleótido, o para mejorar la introducción del polinucleótido en una célula. El uso de los vectores de clonación, vectores de expresión, adaptadores, y enlazadores es bien conocido en la materia. (Ver, por ejemplo, Ausubel, supra; o Sambrook, supra) Métodos recombinantes para la construcción de ácidos nucleicos Las composiciones de ácido nucleico aislado de esta invención, tales como A N, ADNc, ADN genómico, o cualquier combinación de estos, pueden obtenerse a partir de fuentes biológicas por medio del uso de cualquier número de metodologías de clonación conocidas por aquellos con experiencia en la materia. En algunas modalidades las sondas de oligonucleótidos que hibridan selectivamente, bajo condiciones de estringencia, a los polinucleótidos de la presente invención, se usan para identificar la secuencia deseada en una genoteca de ADN genómico o ADNc. El aislamiento del ARN y construcción de genotecas genómicas y ADNc son bien conocidas por aquellos con experiencia en la materia. (Ver, por ejemplo, Ausubel, supra; o Sambrook, supra) Métodos de ensayo y aislamiento de ácido nucleico Una genoteca genómica o ADNc puede ensayarse por medio del uso de una sonda basada en la secuencia de un polinucleótido de la presente invención, tal como las descritas en la presente descripción. Las sondas pueden usarse para hibridar con las secuencias de ADNc o ADN genómico para aislar los genes homólogos en el mismo o diferentes organismos. Aquellos con experiencia en la materia apreciarán que varios grados de estringencia de hibridación pueden emplearse en el ensayo; y tanto el medio de hibridación como de lavado puede ser astringente. Ya que las condiciones para la hibridación se hacen más rigurosas debe haber un grado mayor de complementariedad entre la sonda y el objetivo para que ocurra la formación del dúplex. El grado de estringencia puede controlarse por uno o más de temperatura, resistencia iónica, pH y la presencia de un solvente parcialmente desnaturalizado, tal como la formamida. Por ejemplo, la estringencia de hibridación varía convenientemente al cambiar la polaridad de la solución reactante a través de, por ejemplo, la manipulación de la concentración de formamida dentro del intervalo de 0 % a 50 %. El grado de complementariedad (identidad de secuencia) requerida para la unión detectable variará de acuerdo con la estringencia del medio de hibridación y/o el medio de lavado. El grado de complementariedad será, óptimamente, 100 %, o 70-100 %, o cualquier intervalo o valor dentro de este. Sin embargo, se entenderá que variaciones menores de secuencia en las sondas e iniciadores pueden compensarse mediante la reducción de la estringencia de la hibridación y/o del medio de lavado.

Los métodos de amplificación de ARN o ADN son bien conocidos en la materia y se pueden usar de acuerdo con la presente invención sin demasiada experimentación, basado en las enseñanzas y guía que se presentan en la presente descripción.

Los métodos conocidos de la amplificación del ADN o ARN incluyen, pero no se limitan a, reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y procesos de amplificación relacionados (ver, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos núms. 4,683, 195, 4,683,202, 4,800, 159, 4,965, 188, de Mullís, y otros; 4,795,699 and 4,921 ,794 de Tabor, y otros; 5,142,033 de Innis; 5,122,464 de Wilson, y otros; 5,091 ,310 de Innis; 5,066,584 de Gyllensten, y otros; 4,889,818 de Gelfand, y otros; 4,994,370 de Silver, y otros; 4,766,067 de Bíswas; 4,656,134 de Ringold) y la amplificación mediada por ARN que usa ARN no codificante para la secuencia objetivo como un patrón para la síntesis del ADN de doble cadena (patente de los Estados Unidos núm. 5,130,238 de Malek, y otros, con el nombre comercial NASBA), el contenido completo de dichas referencias se incorporan en la presente descripción como referencia. (Ver, por ejemplo, Ausubel, supra; o Sambrook, supra.) Por ejemplo, la tecnología de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se puede usar para amplificar las secuencias de polinucleótidos de la presente invención y genes relacionados directamente a partir de genotecas de ADNc o ADN genómico. La PCR y otros métodos de amplificación in vitro pueden usarse, además, por ejemplo, para clonar secuencias de ácido nucleico que codifican para las proteínas a expresarse, para preparar los ácidos nucleicos a ser usados como sondas para detectar la presencia del ARNm deseado en muestras, para la secuenciación del ácido nucleico, o para otros propósitos. Los ejemplos de técnicas suficientes para dirigir a las personas expertas a través de métodos de amplificación in vitro se encuentran en Berger, supra, Sambrook, supra, y Ausubel, supra, así como Mullís, y otros, patente de los Estados Unidos núm. 4,683,202 (1987); e Innis, y otros, PCR Protocols A Guide to Methods and Applications, Eds. , Academic Press Inc., San Diego, CA (1990). Los kits comercialmente disponibles para amplificación PCR genómica son conocidos en la materia.

Ver, por ejemplo, el kit para PCR genómico Advantage-GC (Clontech). Además, por ejemplo, se puede usar proteína 32 del gen T4 (Boehringer Mannheim) para mejorar el rendimiento de productos de PCR larga.

Métodos sintético para la construcción de ácidos nucleicos Los ácidos nucleicos aislados de la presente invención se pueden preparar, además, por síntesis química directa por métodos conocidos (ver, por ejemplo, Ausubel, y otros, supra). La síntesis química produce, generalmente, un oligonucleótido de cadena sencilla, que se puede convertir en ADN de doble cadena por hibridación con una secuencia complementaria, o por polimerización con un ADN polimerasa por medio del uso de la cadena sencilla como un patrón. Una persona experta en la materia reconocerá que mientras que la síntesis química de ADN puede limitarse a secuencias de aproximadamente 100 o más bases, se pueden obtener secuencias más largas por ligadura de secuencias más cortas.

Casetes de expresión recombinantes La presente invención proporciona, además, casetes de expresión recombinantes que comprenden un ácido nucleico de la presente invención. Una secuencia de ácido nucleico de la presente invención, por ejemplo, una ADNc o una secuencia genómica que codifica un supercóntigo de proteína de la presente invención, se puede usar para construir un cásete de expresión recombinante que se puede introducir en al menos una célula huésped deseada. Un cásete de expresión recombinante comprenderá, típicamente, un polinucleótido de la presente invención operablemente unido a secuencias reguladoras de iniciación transcripcional que dirigirán la transcripción del polinucleótido en la célula huésped deseada. Ambos promotores heterólogo y no heterólogo (es decir, endógeno) pueden emplearse para dirigir la expresión de los ácidos nucleicos de la presente invención.

En algunas modalidades los ácidos nucleicos aislados que sirven como promotor, potenciador, u otros elementos se pueden introducir en la posición adecuada (corriente arriba, corriente abajo o en el intrón) de una forma no heteróloga de un polinucleótido de la presente invención para regular ascendente o descendentemente la expresión de un polinucleótido de la presente invención. Por ejemplo, los promotores endógenos pueden alterarse in vivo o in vitro por mutación, deleción y/o sustitución.

Vectores y células huésped La presente invención se relaciona, además, con vectores que incluyen moléculas aisladas de ácido nucleico de la presente invención, células huésped que se modifican genéticamente con los vectores recombinantes, y la producción de al menos un supercóntigo de proteina por técnicas recombinantes, como se conoce bien en la materia. Ver, por ejemplo, Sambrook, y otros, supra; Ausubel, y otros, supra, cada uno incorporado completamente en la presente descripción como referencia.

Los polinucleótidos pueden unirse, opcionalmente, a un vector que contiene un marcador seleccionable para la propagación en un huésped. Generalmente, un vector plasmídico se introduce en un precipitado, tal como un precipitado de fosfato cálcico, o en un complejo con un lipido cargado. Si el vector es un virus, se puede empacar in vitro por medio del uso de una línea celular de empaque adecuada y después se transduce en la células huésped.

El inserto de ADN debe unirse operablemente a un promotor adecuado. Los constructos de expresión contendrán, además, sitios para la iniciación de la transcripción, terminación y, en la región transcrita, un sitio de unión al ribosoma para la traducción. La porción codificante de los transcritos maduros expresados por los constructos incluirán, preferentemente, una iniciación de la traducción al principio y un codón de terminación (por ejemplo, UAA, UGA o UAG) ubicado adecuadamente al final del ARNm para ser traducido, con UAA y UAG preferido para la expresión en células de mamífero o eucariota.

Los vectores de expresión sólo incluirán, preferentemente, opcionalmente, al menos un marcador seleccionare. Tales marcadores incluyen, por ejemplo, pero sin limitarse a, metotrexato (MTX), dihidrofolato reductasa (DHFR, patentes de los Estados Unidos núms. 4,399,216; 4,634,665; 4,656,134; 4,956,288; 5,149,636; 5,179,017, ampicilina,. neomicina (G418), ácido micofenólico, o glutamina sintetasa (GS, patentes de los Estados Unidos núms. 5,122,464; 5,770,359; 5,827,739) resistencia al cultivo de células eucariotas, y genes de resistencia a la tetracíclina o ampicilina para cultivar en E. coli y otras bacterias o procariotas (las patentes anteriores se incorporan completamente por este medio como referencia). Los medios de cultivo y condiciones adecuadas para las células huésped anteriormente descritas son conocidos en la materia. Los vectores adecuados resultarán fácilmente evidentes para el técnico con experiencia. La introducción de un constructo vector en una célula huésped puede afectarse por la transfección de fosfato calcico, transfección medida por DEAE-dextrano, transfección medida por lípidos catiónicos, electroporación, transducción, infección u otros métodos conocidos. Tales métodos se describen en la materia, tal como en Sambrook, supra, Capítulos 1-4 y 16-18; Ausubel, supra, Capítulos 1 , 9, 13, 15, 16.

Al menos un supercóntigo de proteína de la presente invención se puede expresar en una forma modificada, tal como una proteína de fusión, y puede incluir no solamente las señales de secreción, sino también regiones funcionales heterólogas adicionales. Por ejemplo, una región de aminoácidos adicionales, particularmente cargada de aminoácidos, puede añadirse al terminal N de un supercóntigo de proteína para mejorar la estabilidad y persistencia en la célula huésped, durante la purificación, o durante el manejo y almacenamiento posterior. Además, las porciones de péptidos pueden añadirse a un supercóntigo de proteina de la presente invención para facilitar la purificación. Tales regiones pueden eliminarse antes de la preparación final de un supercóntigo de proteína o al menos un fragmento de este. Tales métodos se describen en muchos manuales de laboratorio estándar, tales como Sambrook, supra, Capítulos 17.29-17.42 y 18.1-18.74; Ausubel, supra, Capítulos 16, 17 y 18.

Aquellos con experiencia en la materia conocen los numerosos sistemas de expresión disponibles para la expresión de un ácido nucleico que codifica una proteína de la presente invención. Alternativamente, los ácidos nucleicos de la presente invención se pueden expresar en una célula huésped al convertirse (por manipulación) en una célula huésped que contiene ADN endógeno que codifica un supercóntigo de proteína de la presente invención. Tales métodos son bien conocidos en la materia, por ejemplo, como se describe en las patentes de los Estados Unidos núms. 5,580,734, 5,641 ,670, 5,733,746, y 5,733,761 , incorporadas completamente en la presente descripción como referencia.

Ilustrativo de cultivos de células útiles para la producción de los supercóntigos de proteínas, porciones específicas o variantes de estos, son las células bacterianas, de levadura, y de mamíferos como se conoce en la materia. Los sistemas de células de mamíferos estarán, frecuentemente, en forma de monocapas de células aunque pueden usarse, además, las suspensiones de células de mamíferos o biorreactores. Un número de líneas de células huésped adecuadas capaces de expresar las proteínas glicosiladas intactas se han desarrollado en la materia, e incluyen las línea celulares COS-1 (por ejemplo, ATCC CRL 1650), COS-7 (por ejemplo, ATCC CRL-1651), HEK293, BHK21 (por ejemplo, ATCC CRL-10), CHO (por ejemplo, ATCC CRL 1610) y BSC-1 (por ejemplo, ATCC CRL-26), células Cos-7, células CHO, células hep G2, células P3X63Ag8.653, células SP2/0-Ag14, 293, células HeLa y similares, las que se encuentran fácilmente disponibles de, por ejemplo, American Type Culture Collection, Manassas, Va (www.atcc.org). Las células huésped preferidas incluyen las células de origen linfoide, tal como las células de mieloma y linfoma. Las células huésped particularmente preferidas son las células P3X63Ag8.653 (número de acceso de la ATCC CRL-1580) y células SP2/0-Ag14 (número de acceso de la ATCC CRL-1851). En una modalidad particularmente preferida, la célula recombinante es una célula P3X63Ab8.653 o una célula SP2/0-Ag14.

Los vectores de expresión para estas células pueden incluir una o más de las siguientes secuencias de control de expresión, tales como, pero sin limitarse a, un origen de replicación; un promotor (por ejemplo, promotores SV40 tardío o temprano, el promotor CMV (patentes de los Estados Unidos núms. 5,168,062; 5,385,839), un promotor HSV tk, un promotor pgk (fosfoglicerato quinasa), un promotor alfa EF-1 (patente de Estados Unidos núm. 5,266,491), al menos un promotor humano; un potenciador, y/o sitios de información de procesamiento, tales como sitios de unión al ribosoma, sitios de corte y empalme de ARN, sitios de poliadenilación (por ejemplo, un sitio de adición poli A de SV40 grande T Ag), y secuencias terminadoras transcripcionales. Ver, por ejemplo, Ausubel y otros, supra; Sambrook, y otros, supra. Otras células útiles para la producción de ácidos nucleicos o proteínas de la presente invención se conocen y/o están disponibles, por ejemplo, a partir del catálogo de la American Type Culture Collection Catalogue of Cell Lines and Hybridomas (www.atcc.org) u otras fuentes conocidas o comerciales.

Cuando las células huésped eucariotas se emplean, las secuencias terminadoras de transcripción o poliadenilación se incorporan, típicamente, en el vector. Un ejemplo de una secuencia terminadora es la secuencia de poliadenilación del gen de la hormona de crecimiento bovino. Las secuencias para corte y empalme preciso del transcrito pueden, además, incluirse. Un ejemplo de una secuencia de corte y empalme es el intrón VP1 de SV40 (Sprague, y otros, J. Virol. 45:773-781 (1983)). Además, las secuencias génicas para el control de la replicación en la célula huésped se pueden incorporar en el vector, como se conoce en la materia.

Purificación de un supercóntigo de proteína Un supercóntigo de proteína puede recuperarse y purificarse a partir de cultivos de células recombinantes por métodos bien conocidos que incluyen, pero no se limitan a, purificación de la proteína A, precipitación (f) de sulfato amónico o etanol, extracción ácida, cromatografía de intercambio aniónico o catíónico, cromatografía de la fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrofóbica, cromatografía de afinidad, cromatografía de hidroxilapatita y cromatografía de lectina. La cromatografía en líquido de alto rendimiento ("HPLC") puede emplearse, además, para la purificación. Ver, por ejemplo, Colligan, Current Protocols in Immunology, o Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, NY, (1997-2001 ), por ejemplo, Capítulos 1 , 4, 6, 8, 9, 10, cada uno incorporado completamente en la presente descripción como referencia.

Los supercóntigos de proteína de la presente invención incluyen productos purificados de manera natural, productos de procedimientos de síntesis química, y productos producidos por técnicas recombinantes a partir de un huésped procariota o eucariota, que incluyen, por ejemplo, células de E. coli, levadura, plantas superiores, insectos y mamíferos. Dependiendo del huésped que se emplee en un procedimiento de producción recombinante, el supercóntigo de proteína de la presente invención puede ser glicosilado o puede ser no glicosilado. Tales métodos se describen en muchos manuales de laboratorio estándar, tales como Sambrook, supra, Secciones 17.37-17.42; Ausubel, supra, Capítulos 10, 12, 13, 16, 18 y 20, Colligan, Protein Science, supra, Capítulos 12-14, todos incorporados completamente en la presente descripción como referencia. Códigos de los aminoácidos Los aminoácidos que componen los supercóntigos de proteína de la presente invención se abrevian frecuentemente. Las designaciones del aminoácido pueden indicarse al designar el aminoácido por su único código de letra, sus tres códigos de letra, nombre, o tres codones de nucleótidos como se comprende bien en la técnica (ver Alberts, B., y otros, Molecular Biology of The Cell, tercera ed., Garland Publishing, Inc., Nueva York, 1994). Un supercóntigo de proteína de la presente invención puede incluir uno o más sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácido, a partir de mutaciones naturales o manipulación humana, como se especifica en la presente descripción. Los aminoácidos en un supercóntigo de proteína de la presente invención que son esenciales para la función se pueden identificar por métodos conocidos en la materia, tales como mutagénesis dirigida al sitio o mutagénesis de barrido con alanina (por ejemplo, Ausubel, supra, Capítulos 8, 15; Cunníngham and Wells, Science 244:1081-1085 (1989)). El último procedimiento introduce mutaciones de alanina sencillas en cada residuo en la molécula. Las moléculas mutantes resultantes se prueban después para la actividad biológica, tal como, pero sin limitarse a, al menos una actividad de neutralización. Los sitios que son críticos para la unión del supercóntigo de proteína se pueden identificar, además, por análisis estructural, tal como cristalización, resonancia magnética nuclear o etiquetado por fotoafinidad (Smith, y otros, J. Mol. Biol. 224:899-904 (1992) y de Vos, y otros, Science 255:306-312 (1992)).

Como apreciarán los expertos, la presente invención incluye al menos un supercóntigo de proteína biológicamente activo de la presente invención. Los supercóntigos de proteína biológicamente activos tienen una actividad específica al menos 20 %, 30 %, o 40 %, y, preferentemente, al menos 50 %, 60 %, o 70 %, y, con la máxima preferencia, al menos 80 %, 90 %, o 95 %-1000 % o más de la del supercóntigo de proteína nativo (no sintético), endógeno o relacionado y conocido. Los métodos para ensayar y cuantificar las mediciones de la actividad enzimática y especificidad del sustrato son bien conocidas por aquellos con experiencia en la materia.

En otro aspecto la invención se refiere a supercóntigos de proteínas y fragmentos, como se describe en la presente descripción , los cuales se modifican por la unión covalente de una porción orgánica. Tal modificación puede producir un fragmento de supercóntigo de proteína con propiedades farmacocinéticas mejoradas (por ejemplo, aumento del período de semidesintegración en suero ¡n vivo). La porción orgánica puede ser un grupo polimérico hidrófilo lineal o ramificado, grupo ácido graso, o grupo éster de ácido graso. En modalidades particulares, el grupo polimérico hidrófilo puede tener un peso molecular de aproximadamente 800 a aproximadamente 120,000 dalton y puede ser un glicol de polialcano (por ejemplo, polietilenglicol (PEG), polipropilenglicol (PPG)), polimero de carbohidrato, polímero de aminoácido o polivinil pirrolidona, y el grupo ácido graso o éster de ácido graso puede comprender de aproximadamente ocho a aproximadamente cuarenta átomos de carbono.

Los supercóntigos de proteínas modificados y fragmentos de la invención pueden comprender una o más porciones orgánicas que se unen covalentemente, directamente o indirectamente, al anticuerpo. Cada porción orgánica que se une a un supercóntigo de proteína o fragmento de la invención puede ser independientemente un grupo polimérico hidrófilo, un grupo ácido graso o un grupo éster de ácido graso. Como se usa en la presente descripción, el término "ácido graso" abarca los ácidos mono-carboxílicos y los ácidos di-carboxílicos. Un "grupo polimérico hidrófilo", como se usa en la presente descripción, se refiere a un polímero orgánico que es más soluble en agua que en octano. Por ejemplo, la polilisina es más soluble en agua que en octano. Así, la invención abarca un supercóntigo de proteína modificado por la unión covalente de polilisina. Los polímeros hidrófilos adecuados para modificar los supercóntigos de proteínas de la invención pueden ser lineales o ramificados e incluyen, por ejemplo, glicol de polialcanos (por ejemplo, PEG, monometoxi-polietilenglicol (mPEG), PPG y similares), hidratos de carbono (por ejemplo, dextrano, celulosa, oligosacáridos, polisacáridos y similares), polímeros de aminoácidos hidrófilos (por ejemplo, polilisina, poliarginina, poliaspartato y similares), óxidos de polialcano (por ejemplo, óxido de polietileno, óxido de polipropileno y similares) y polivinil pirrolidona. Preferentemente, el polímero hidrófilo que modifica el supercóntigo de proteína de la invención tiene un peso molecular de aproximadamente 800 a aproximadamente 150,000 dalton como una entidad molecular separada. Por ejemplo, se puede usar PEG5000 y PEG2o,ooo> en donde el subíndice es el peso molecular promedio del polímero en daltons. El grupo polimérico hidrófilo se puede sustituir con uno a aproximadamente seis grupos alquilo, ácido graso o éster de ácido graso. Los polímeros hidrófilos que se sustituyen con un grupo ácido graso o éster de ácido graso se pueden preparar mediante el empleo de métodos adecuados. Por ejemplo, un polímero que comprende un grupo amina se puede acoplar a un carboxilato del ácido graso o éster de ácido graso, y un carboxilato activado (por ejemplo, activado con N, N-carbonil diimidazol) en un ácido graso o éster de ácido graso se puede acoplar a un grupo hidroxilo en un polímero.

Los ácidos grasos y esteres de ácido graso adecuados para modificar los supercóntigos de proteínas de la Invención se pueden saturar o pueden contener una o más unidades de insaturación. Los ácidos grasos que son adecuados para modificar los supercóntigos de proteínas de la invención incluyen, por ejemplo, n-dodecanoato (C12, laurato), n-tetradecanoato (C14, mlristato), n-octadecanoato (Ci8, estearato), n-eicosanoato (C2o, araquidato), n-docosanoato (C22, behenato), n-triacontanoato (C30), n-tetracontanoato (C40) , c/s-A9-octadecanoato (C18, oleato), todo c/'s-A5,8,1 1 ,14-eicosatetraenoato (C20, araquidonato), ácido octanodioico, ácido tetradecanodioico, ácido octadecanodioico, ácido docosanedioico, y similares. Los ésteres de ácido graso adecuados incluyen mono-ésteres de ácidos dicarboxílicos que comprenden un grupo alquilo inferior lineal o ramificado. El grupo alquilo inferior puede comprender de uno a aproximadamente doce, preferentemente, uno a aproximadamente seis, átomos de carbono.

Los supercóntigos de proteínas y fragmentos modificados se pueden preparar por medio del uso de métodos adecuados, tales como por reacción con uno o más agentes modificadores. Un "agente modificador", como se usa en la presente descripción, se refiere a un grupo orgánico adecuado (por ejemplo, polímero hidrófilo, un ácido graso, un éster de ácido graso) que comprende un grupo de activación. Un "grupo de activación" es una porción química o grupo funcional que puede, bajo condiciones adecuadas, reaccionar con un segundo grupo químico y formar así un enlace covalente entre el agente modificador y el segundo grupo químico. Por ejemplo, los grupos de activación de amina-reactiva incluyen grupo electrofílicos, tales como tosilato, mesilato, halo (cloro, bromo, fluoro, yodo), ésteres de N-hidroxisuccinimidil (NHS), y similares. Los grupos de activación que pueden reaccionar con tioles incluyen, por ejemplo, maleimida, yodoacetilo, acri illo, disulfuro de piridilo, ácido 5-tiol-2-nitrobenzoico tiol (TNB-tiol), y similares. Un grupo funcional aldehido se puede acoplar a moléculas que contienen amina- o hidrazida-, y un grupo azida puede reaccionar con un grupo fósforo trivalente para formar enlaces de fosforamidato o fosforimida. Los métodos adecuados para introducir grupos de activación en las moléculas son conocidos en la materia (ver por ejemplo, Hermanson, G. T., Bioconjugate Techniques, Academic Press: San Diego, CA (1996)). Un grupo de activación puede unirse directamente a un grupo orgánico (por ejemplo, polímero hidrófilo, ácido graso, éster de ácido graso), o a través de una porción enlazadora, por ejemplo, un grupo C1-C12 divalente, en donde uno o más átomos de carbono se pueden reemplazar por un heteroátomo, tal como oxígeno, nitrógeno o azufre. Las porciones enlazadoras adecuadas incluyen, por ejemplo, tetraetilenglicol, -(CH2)3-, -NH-(CH2)6-NH-, -(CH2)2-NH- y -CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH-NH-. Los agentes modificadores que comprenden una porción enlazadora se pueden producir, por ejemplo, al reaccionar una mono-Boc-alquildiamina (por ejemplo, mono-Boc-etilendiamína, mono-Boc-diaminohexano) con un ácido graso en presencia de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropilo) carbodiimida (EDC) para formar una unión amida entre la amina libre y el carboxilato de ácido graso. El grupo protector Boc se puede eliminar del producto por tratamiento con ácido trifluoacético (TFA) para exponer una amina primaria que se puede acoplar a otro carboxilato, como se describe, o se puede reaccionar con anhídrido maleico y ciclar el producto resultante para producir un derivado maleimido activado del ácido graso. (Ver, por ejemplo, Thompson, y orros, patente núm. WO 92/16221 , cuyas enseñanzas completas se incorporan en la presente descripción como referencia.) Los supercóntigos de proteínas modificados de la invención se pueden producir al reaccionar un supercóntigo de proteína o fragmento con un agente modificador. Por ejemplo, las porciones orgánicas pueden unirse al supercóntigo de proteína en una manera de sitio no especifico mediante el empleo de un agente modificador de amina-reactiva, por ejemplo, un éster NHS de PEG. Los supercóntigos de proteínas y fragmentos modificados que comprenden una porción orgánica que se une a sitios específicos de un supercóntigo de proteína de la presente invención se pueden preparar por medio del uso de métodos adecuados, tales como proteolisis inversa (Fisch y otros., Bioconjugate Chem., 3:147-153 (1992); Werlen y otros, Bioconjugate Chem., 5:411-417 (1994); Kumaran y otros, P tein Sci. 6(10)2233-2241 (1997); Itoh y otros, Bioorg. Chem., 24(1): 59-68 (1996); Capellas y otros, Biotechnol. Bioeng., 56(4):456-463 (1997)), y los métodos descritos en Hermanson, G. T., Bioconjugate Techniques, Academic Press: San Diego, CA (1996).

Composiciones de supercóntigo de proteína que comprenden otros ingredientes terapéuticamente activos Las composiciones de supercóntigo de proteína de la invención pueden comprender, además, opcionalmente, una cantidad efectiva de al menos un compuesto o proteína (molécula pequeña o grande) seleccionado de al menos uno de un fármaco antiinfeccioso, un fármaco del sistema cardiovascular (CV), un fármaco del sistema nervioso central (CNS), un fármaco del sistema nervioso autónomo (ANS), un fármaco del tracto respiratorio, un fármaco del tracto gastrointestinal (Gl), un fármaco hormonal, un fármaco para el equilibrio de fluido o electrolito, un fármaco hematológico, un antineoplásico, un fármaco de ¡nmunomodulación, un fármaco oftálmico, ótico o nasal, un fármaco tópico, un fármaco nutricional o similares. Tales fármacos son bien conocidos en la materia, e incluyen las formulaciones, indicaciones, dosificación y administración para cada uno de los presentados en la presente descripción (ver, por ejemplo, Nursing 2001 Handbook of Drugs, 21.° edición, Springhouse Corp., Springhouse, PA, 2001 ; Health Professional's Drug Guide 2001 , ed., Shannon, Wilson, Stang, Prentice-Hall, Inc, Upper Saddie River, NJ; Pharmcotherapy Handbook, Wells y otros, ed., Appleton & Lange, Stamford, CT, cada uno incorporado completamente en la presente descripción como referencia).

El fármaco a nti infeccioso puede ser al menos uno seleccionado de amebicidas o al menos uno de antiprotozoarios, antihelmínticos, antimicóticos, antipalúdicos, antituberculosos o al menos un de antileprosos, aminoglucósidos, penicilinas, cefalosporinas, tetracíclinas, sulfonamidas, fluoroquinolonas, antivirales, antiinfecciosos macrólidos, y antiinfecciosos variados. El fármaco CV puede ser al menos uno seleccionado de inotrópicos, antiarrítmicos, antianginales, antihipertensivos, antilipémicos, y fármacos cardiovasculares variados. El fármaco CNS puede ser al menos uno seleccionado de analgésicos no narcóticos o al menos uno seleccionado de antipiréticos, fármacos antünflamatorios no esferoides, narcótico o al menos un analgésico opiode, hipnóticos sedantes, anticonvulsivos, antidepresivos, fármacos antiansiedad, antisicóticos, estimulantes del sistema nervioso central, antiparkinsonianos, y fármacos para el sistema nervioso central variados. El fármaco ANS puede ser al menos uno seleccionado de colinérgicos (parasimpatomiméticos), anticolinérgicos, adrenérgicos (simpatomiméticos), bloqueadores adrenérgicos (simpatolíticos), relajantes músculo esqueléticos, y bloqueadores neuromusculares. El fármaco del tracto respiratorio puede ser al menos uno seleccionado de antihistaminas, broncodilatadores, expectorantes o al menos un antitusígeno, y fármacos respiratorios variados. El fármaco del tracto Gl puede ser al menos uno seleccionado de antiácidos o al menos un adsorbente o al menos un antiflatulento, enzima digestiva o al menos un solubilizador del cálculo biliar, antidiarreicos, laxantes, antieméticos, y fármacos antiulcerosos. El fármaco hormonal puede ser al menos uno seleccionado de corticosteroides, andrógenos o al menos un esteroide anabólico, estrógeno o al menos una progestina, gonadotropina, fármaco antidiabético o al menos un glucagon, hormona tiroidea, antagonista de la hormona tiroidea, hormona pituitaria, y fármaco similar al paratiroideo. El fármaco para equilibrio fluido y de electrolito puede ser al menos uno seleccionado de diuréticos, electrólitos o al menos una solución de reemplazo, acidificante o al menos un alcalinizante. El fármaco hematológico puede ser al menos uno seleccionado de hematinicos, anticoagulantes, derivados de la sangre, y enzimas trombolíticas. Los antineoplásicos pueden ser al menos uno seleccionado de fármacos alquilantes, antimetabolitos, antineoplásicos antibióticos, antineoplásicos que alteran el equilibrio hormonal, y antineoplásicos variados. El fármaco de inmunomodulación puede ser al menos uno seleccionado de inmunosupresores, vacunas o al menos un toxoide, antitoxina o al menos un antiveneno, suero inmune, y modificador de la respuesta biológica. Los fármacos oftálmicos, óticos, y nasales pueden ser al menos uno seleccionado de los fármacos antiinfecciosos oftálmicos, antiinflamatorios oftálmicos, mióticos, midriáticos, vasoconstrictores oftálmicos, oftálmicos, óticos, y nasales variados. El fármaco tópico puede ser al menos uno seleccionado de antünfecciosos locales, escabicidas o al menos un pediculicida o corticosteroide tópico. El fármaco nutricional puede ser al menos uno seleccionado de vitaminas, minerales, o calóricos. Ver, por ejemplo, el contenido de Nursing 2001 Drug Handboo , supra.

El al menos un amebicida o antiprotozoario puede ser al menos uno seleccionado de atovaquona, clorhidrato de cloroquina, fosfato de cloroquina, metronidazol, clorhidrato de metronidazol, y isetionato de pentamidina. El al menos un antihelmíntico puede ser al menos uno seleccionado de mebendazol, pirantel pamoato, y tiabendazol. El al menos un antimicótico puede ser al menos uno seleccionado de anfotericina B, complejo de sulfato de colesterilo con anfotericina B, complejo lipido de anfotericina B, anfotericina B liposomal, fluconazol, flucitosina, griseofulvina micronizada, griseofulvina ultramicronizada, itraconazol, ketoconazol, nistatina, y clorhidrato de terbinafine. El al menos un antipalúdico puede ser al menos uno seleccionado de clorhidrato de cloroquina, fosfato de cloroquina, doxiciclina, sulfato de hidroxicloroquina, clorhidrato de mefloquina, fosfato de primaquina, pirimetamina, y pirimetamina con sulfadoxina. El al menos un antituberculoso o antileproso puede ser al menos uno seleccionado de clofazimina, cicloserina, dapsona, clorhidrato de etambutol, isoniazid, pirazinamida, rifabutin, rifampin, rifapentina, y sulfato de estreptomicina. El al menos un aminoglucósido puede ser al menos uno seleccionado de sulfato de amikacina, sulfato de gentamicina, sulfato de neomicina, sulfato de estreptomicina, y sulfato de tobramicina. La al menos una penicilina puede ser al menos una seleccionada de amoxicilina/clavulanato potásico, trihidrato de amoxicilina, ampicilina, ampicilina sódica, trihidrato de ampicilina, ampicilina sódica/sulbactam sódico, cloxacilina sódica, dicloxacilina sódica, mezlocilina sódica, nafcilina sódica, oxacilina sódica, penicilina G benzatina, penicilina G potásica, penicilina G procaina, penicilina G sódica, penicilina V potásica, piperacilina sódica, piperacilina sódica/tazobactam sódico, ticarcilina disódica, y ticarcilina disódica/clavulanato potásico. La al menos una cefalosporina puede ser al menos una seleccionada de cefaclor, cefadroxil, cefazolin sódico, cefdinir, clorhidrato de cefepime, cefixima, cefmetazol sódico, cefonicid sódico, cefoperazona sódica, cefotaxima sódica, cefotetan disódico, cefoxitin sódico, cefpodoxima proxetil, cefprozil, ceftazidima, ceftibuten, ceftizoxima sódica, ceftriaxona sódica, cefuroxima axetil, cefuroxima sódica, clorhidrato de cefalexina, monohidrato de cefalexina, cefradina, y loracarbef. La al menos una tetraciclina puede ser al menos una seleccionada de clorhidrato de demeclociclina, doxiciclina cálcica, hiclato de doxiciclina, clorhidrato de doxiciclina, monohidrato de doxiciclina, clorhidrato de minociclina, y clorhidrato de tetraciclina. La al menos una sulfonamida puede ser al menos una seleccionada de cotrimoxazol, sulfadiazina, sulfametoxazol, sulfisoxazol, y sulfisoxazol acetilo. La al menos una fluoroquinolona puede ser al menos una seleccionada de mesilato de alatrofloxacina, ciprofloxacina, enoxacina, levofloxacina, clorhidrato de lomefloxacina, ácido nalidíxíco, norfloxacina, ofloxacina, esparfloxacina, y mesilato de trovafloxacina. La al menos una fluoroquinolona puede ser al menos una seleccionada de mesilato de alatrofloxacina, ciprofloxacina, enoxacina, levofloxacina, clorhidrato de lomefloxacina, ácido nalidíxíco, norfloxacina, ofloxacina, esparfloxacina, y mesilato de trovafloxacina. El al menos un antiviral puede ser al menos uno seleccionado de sulfato de abacavir, aciclovir sódico, clorhidrato de amantadina, amprenavír, cidofovir, mesilato de delavirdina, didanosina, efavirenz, famciclovír, fomivirsen sódico, foscarnet sódico, ganciclovir, sulfato de ¡ndinavir, lamivudína, lamivudina/zidovudina, mesilato de nelfinavir, nevírapina, fosfato de oseltamivir, ribavirina, clorhidrato de rimantadina, ritonavir, saquinavir, mesilato de saquinavir, estavudina, clorhidrato de valaciclovir, zalcitabina, zanamivir, y zidovudina. El al menos un antiinfeccioso macrolina puede ser al menos uno seleccionado de azitromicina, claritromicina, diritromicina, eritromicina base, estolato de- eritromicina, etil succínato de eritromicina, lactobionato de eritromicina, y estearato de eritromicina. El al menos un antiinfeccioso variado puede ser al menos uno seleccionado de aztreonam, bacitracina, succinato de cloranlenicol sódico, clorhidrato de clindamícina, clorhidrato de clindamicina palmitato, fosfato de clindamicina, imipenem y cilastatina sódica, meropenem, macrocristales de nitrofurantoína, microcristales de nitrofurantoína, quinupristin/dalfopristin, clorhidrato de espectinomicina, trimetoprim, y clorhidrato de vancomicina. (Ver, por ejemplo, págs. 24-214 de Nursing 2001 Drug Handbook).

El al menos un inotrópico puede ser al menos uno seleccionado de lactato de amrinona, digoxina, y lactato de milrinona. El al menos un antiarrítmico puede ser al menos uno seleccionado de adenosina, clorhidrato de amiodarona, sulfato de atropina, tosilato de bretilio, clorhidrato de diltiazem, disopiramida, fosfato de disopiramida, clorhidrato de esmolol, acetato de flecainida, fumarato de ibutilida, clorhidrato de lidocaína, clorhidrato de mexiletina, clorhidrato de moricizina, fenitoína, fenitoína sódica, clorhidrato de procainamida, clorhidrato de propafenona, clorhidrato de propranolol, bisulfato de quinidina, gluconato de quinidina, poligalacturonatode quinidina, sulfato de quinidina, sotalol, clorhidrato de tocainida, y clorhidrato de verapamilo. El al menos un antianginal puede ser al menos uno seleccionado de besilato de amlodipidina, nitrito de amilo, clorhidrato de bepridilo, clorhidrato de diltiazem, dinitrato de isosorbide, mononitrato de isosorbide, nadolol, clorhidrato de nicardipina, nifedipina, nitroglicerina, clorhidrato de propranolol, verapamilo, y clorhidrato de verapamilo. El al menos un antihipertensivo puede ser al menos uno seleccionado de clorhidrato de acebutolol, besilato de amlodipina, atenolol, clorhidrato de benazepril, clorhidrato de betaxolol, fumarato de bisoprolol, candesartan cilexetil, captopril, clorhidrato de carteolol, carvedilol, clonidina, clorhidrato de clonidina, diazóxido, clorhidrato de diltiazem, mesilato de doxazosina, enalaprilat, maleato de enalapril, mesilato de eprosartan, felodipina, mesilato de fenoldopam, fosinopril sódico, acetato de guanabenz, sulfato de guanadrel, clorhidrato de guanfacina, clorhidrato de hidralazina, irbesartán, isradipina, clorhidrato de labetalol, lisinopril, losartán potásico, metildopa, clorhidrato de metildopato, succinato de metoprolol, tartrato de metoprolol, minoxidil, clorhidrato de moexipril, nadolol, clorhidrato de nicardipina, nifedipina, nisoldipina, nitroprusiato sódico, sulfato de penbutolol, perindopril erbumina, mesilato de fentolamina, pindolol, clorhidrato de prazosina, clorhidrato de propranolol, clorhidrato de quinapril, ramipril, telmisartan, clorhidrato de terazosina, maleato de timolol, trandolapril, vaisartan, y clorhidrato de verapamilo. El al menos un antilipémico puede ser al menos uno seleccionado de atorvastatina cálcica, cerivastatina sódica, colestiramina, clorhidrato de colestipol, fenofibrato (micronizado), fluvastatina sódica, gemfibrozil, lovastatina, niacina, pravastatina sódica, y simvastatina. El al menos un CV fármaco CV variado puede ser al menos uno seleccionado de abciximab, alprostadil, clorhidrato de arbutamina, cilostazol, bisulfato de clopidogrel, dipiridamol, eptifibatida, clorhidrato de midodrina, pentoxifilina, clorhidrato de ticlopidina, y clorhidrato de tirofiban. (Ver, por ejemplo, págs. 215-336 de Nursing 2001 Drug Handbook).

El al menos un analgésico no narcótico o antipirético puede ser al menos uno seleccionado de acetaminofeno, aspirina, trisalicilato de colina y magnesio, diflunisal, y salicilato magnésico. El al menos un fármaco antiinflamatorio no esteroide puede ser al menos uno seleccionado de celecoxib, diclofenaco potásico, diclofenaco sódico, etodolac, fenoprofen calcico, flurbiprofeno, ibuprofeno, ¡ndometacina, trihidrato de ¡ndometacina sódica, cetoprofeno, ketorolaco trometamina, nabumetone, naproxeno, naproxen sódico, oxaprozin, piroxicam, rofecoxib, y sulindaco. El al menos un analgésico opiode o narcótico puede ser al menos uno seleccionado de clorhidrato de alfentanilo, clorhidrato de buprenorfina, tartrato de butorfanol, fosfato de codeína, sulfato de codeina, citrato de fentanilo, sistema transdérmico de fentanilo, fentanilo transmucoso, clorhidrato dehidromorfona, clorhidrato de meperidina, clorhidrato de metadona, clorhidrato de morfina, sulfato de morfina, tartrato de morfina, clorhidrato de nalbufina, clorhidrato de oxicodona, pectinato de oxicodona, clorhidrato de oximorfona, clorhidrato de pentazocina, clorhidrato de pentazocina y clorhidrato de naloxona, lactato de pentazocina, clorhidrato de propoxifeno, napsilato de propoxifeno, clorhidrato de remifentanilo, citrato de sufentanilo, y clorhidrato de tramadol. El al menos un hipnótico sedante puede ser al menos uno seleccionado de hidrato de doral, estazolam, clorhidrato de flurazepam, pentobarbital, pentobarbital sódico, fenobarbital, sódico, secobarbital sódico, temazepam, triazolam, zaleplon, y tartrato de zolpidem El al menos un anticonvulsivo puede ser al menos uno seleccionado de acetazolamida sódica, carbamazepina, clonazepam, clorazepato dipotásico, diazepam, divalproex sódico, etosuximida, fosfenitoína sódica, gabapentina, lamotriginq, sulfato magnésico, fenobarbital, fenobarbital sódico, fenitoína, fenitoína sódica, fenitoina sódico (extendido), primidona, clorhidrato de tiagabina, topiramato, valproato sódico, y ácido valproico. El al menos un antidepresivo puede ser al menos uno seleccionado de clorhidrato de amitriptilina, pamoato de amitriptilina, amoxapina, clorhidrato de bupropion, bromhidrato de citalopram, clorhidrato de clomipramina, clorhidrato de desipramina, clorhidrato de doxepina, clorhidrato de fluoxetína, clorhidrato de imipramina, pamoato de imipramina, mirtazapina, clorhidrato de nefazodona, clorhidrato de nortriptilina, clorhidrato de paroxetina, sulfato de fenelzina, clorhidrato de sertralina, sulfato de tranilcipromina, maleato de trimipramina, y clorhidrato de venlafaxina. El al menos un fármaco antiansiedad puede ser al menos uno seleccionado de alprazolam, clorhidrato de buspirona, clorodiazepóxido, clorhidrato de clorodiazepóxido, clorazepato dipotásico, diazepam, clorhidrato de doxepina, embonato de hidroxizina, clorhidrato de hidroxizina, pamoato de hidroxizina, lorazepam, meprobamato, clorhidrato de midazolam, y oxazepam. El al menos un fármaco antisicótico puede ser al menos uno seleccionado de clorhidrato de clorpromazina, clozapina, decanoato de flufenazina, enantato de fluefenazina, clorhidrato de fluefenazina, haloperidol, decanoato de haloperidol, lactato de haloperidol, clorhidrato de loxapina, succinato de loxapina, besilato de mesoridazina, clorhidrato de molindona, olanzapina, perfenazina, pimozida, proclorperazina, fumarato de quetiapina, risperidona, clorhidrato de tioridazina, tiotixeno, clorhidrato de tiotixeno, y clorhidrato de trifluoperazina. El al menos un estimulante del sistema nervioso central puede ser al menos uno seleccionado de sulfato de anfetamina, cafeína, sulfato de dextroanfetamina, clorhidrato de doxapram, clorhidrato de metanfetamina, clorhidrato de metilfenidato, modafinil, pemolina, y clorhidrato de fentermina. El al menos un antiparkinsoniano puede ser al menos uno seleccionado de clorhidrato de amantadina, mesilato de benztropina, clorhidrato de biperideno, lactato de biperideno, mesilato de bromocriptina, carbidopa-levodopa, entacapona, levodopa, mesilato de pergolida, diclorhidrato de pramipexol, clorhidrato de ropinirol, clorhidrato de selegilina, tolcapona, y clorhidrato de trihexifenidilo. El al menos un fármaco del sistema nervioso central variado puede ser al menos uno seleccionado de clorhidrato de bupropiona, clorhidrato de donepezil, droperidol, maleato de fluvoxamina, carbonato de litio, citrato de litio, clorhidrato de naratriptán, nicotina polacrilex, sistema transdérmico de nicotina, propofol, benzoato de rizatriptán, clorhidrato monohidrato de sibutramina, succinato de sumatriptán, clorhidrato de tacrina, y zolmitriptán. (Ver, por ejemplo, págs. 337-530 de Nursing 2001 Drug Handbook).

El al menos un colinérgico (por ejemplo, parasimatomimético) puede ser al menos uno seleccionado de cloruro de betanecol, cloruro de edrofonio, bromuro de neostigmina, sulfato de metilo de neostigmina, salicilato de fisostigmina, y bromuro de piridostigmina. El al menos un anticolinérgico puede ser al menos uno seleccionado de sulfato de atropina, clorhidrato de diciclomina, glicopirrolato, hiosciamina, sulfato de hiosciamina, bromuro de propantelina, escopolamina, butilbromuro de escopolamina, y bromhidrato de escopolamina. El al menos un adrenérgico (simpatomiméticos) puede ser al menos uno seleccionado de clorhidrato de dobutamina, clorhidrato de dopamina, bitartrato de metaraminol, bitartrato de norepinefrina, clorhidrato de fenilefrina, clorhidrato de pseudoefedrina, y sulfato de pseudoefedrina. El al menos un bloqueador adrenérgico (simpatolítico) puede ser al menos uno seleccionado de mesilato de dihidroergotamina, tartrato de ergotamina, maleato de metisergida, y clorhidrato de propranolol. El al menos un relajante músculo esquelético puede ser al menos uno seleccionado de baclofen, carisoprodol, clorzoxazona, clorhidrato de ciclobenzaprina, dantroleno sódico, metocarbamol, y clorhidrato de tizanidina. El al menos un bloqueador neuromuscular puede ser al menos uno seleccionado de besilato de atracurio, besilato de cisatracurio, cloruro de doxacurio, cloruro de mivacurio, bromuro de pancuronio, bromuro de pipecuronio, bromuro de rapacuronio, bromuro de rocuronio, cloruro de succinilcolina, cloruro de tubocurarina, y bromuro de vecuronio. (Ver, por ejemplo, págs. 531-84 de Nursing 2001 Drug Handbook).

La al menos una antihistamina puede ser al menos una seleccionada de maleato de bronfeniramina, clorhidrato de cetirizina, maleato de clorfeniramina, fumarato de clemastina, clorhidrato de ciproheptadina, clorhidrato de difenhidramina, clorhidrato de fexofenadina, loratadina, clorhidrato de prometazina, teoclato de prometazina, y clorhidrato de triprolidina. El al menos un broncodilatador puede ser al menos uno seleccionado de albuterol, sulfato de albuterol, aminofilina, sulfato de atropina, sulfato de efedrina, epinefrina, bitartrato de epinefrina, clorhidrato de epinefrina, bromuro de ipratropio, isoproterenol, clorhidrato de isoproterenol, sulfato de isoproterenol, clorhidrato de levalbuterol, sulfato de metaproterenol, oxtrifilina, acetato de pirbuterol, xinafoato de salmeterol, sulfato de terbutalina, y teofilina. El al menos un expectorante o antitusígeno puede ser al menos uno seleccionado de benzonatato, fosfato de codeína, sulfato de codeína, bromhidrato de dextrametorfano, clorhidrato de difenhidramina, guaifenesina, y clorhidrato de hidromorfona. El al menos un fármaco respiratorio variado puede ser al menos uno seleccionado de acetilcisteína, dipropionato de beclometasona, beractant, budesonida, calfactant, cromolín sódico, dornasa alfa, epoprostenol sódico, flunisolida, propionato de fluticasona, montelukast sódico, nedocromil sódico, palivizumab, acetonida de triamcinolona, zafirlukast, y zileuton. (ver, por ejemplo, págs. 585-642 de Nursing 2001 Drug Handbook).

El al menos un antiácido, adsorbente, o antiflatulento puede ser al menos uno seleccionado de carbonato alumínico, hidróxido alumínico, carbonato cálcico, magaldrato, hidróxido magnésico, óxido magnésico, simeticona, y bicarbonato sódico. La al menos un enzima digestiva o solubilizador del cálculo biliar puede ser al menos uno seleccionado de pancreatina, pancrelipasa, y ursodiol. El al menos un antidiarreico puede ser al menos uno seleccionado de attapulguita, subsalicilato de bismuto, policarbofilo cálcico, clorhidrato de dfenoxilato y sulfato de atropina, loperamida, acetato de octreotida, tintura de opio, y tintura de opio (camforada). El al menos un laxante puede ser al menos uno seleccionado de bisocodilo, policarbofilo cálcico, cáscara sagrada, extracto fluido aromático de cáscara sagrada, extracto fluido de cáscara sagrada, aceite de ricino, docusato cálcico, docusato sódico, glicerina, lactulosa, citrato magnésico, hidróxido magnésico, sulfato magnésico, metilcelulosa, aceite mineral, polietilenglicol o solución de electrólito, plantago afra, senna, y fosfatos sódicos. El al menos un antiemético puede ser al menos uno seleccionado de clorhidrato de clorpromazina, dimenhidrinato, mesilato de dolasetron, dronabinol, clorhidrato de granisetron, clorhidrato de meclizina, clorhidrato de metocloproamida, clorhidrato de ondansetron, perfenazina, proclorperazina, edisilato de proclorperazina, maleato de proclorperazina, clorhidrato de prometazina, escopolamina, maleato de tietilperazina, y clorhidrato de trimetobenzamida. El al menos un fármaco antiulceroso puede ser al menos uno seleccionado de cimetidina, clorhidrato de cimetidina, famotidina, lansoprazol, misoprostol, nizatidina, omeprazol, rabeprozol sódico, citrato de bismuto rantidina, clorhidrato de ranitidina, y sucralfato. (Ver, por ejemplo, págs. 643-95 de Nursing 2001 Drug Handbook).

El al menos un corticosteroide puede ser al menos uno seleccionado de betametasona, acetato de betametasona o fosfato sódico de betametasona, fosfato sódico de betametasona, acetato de cortisona, dexametasona, acetato de dexametasona, fosfato sódico de dexametasona, acetato de fludrocortisona, hidrocortisona, acetato de hidrocortisona, cipionato de hidrocortisona, fosfato sódico de hidrocortisona, succinato sódico de hidrocortisona, metilprednisolona, acetato de metilprednisolona, succinato sódico de metilprednisolona, prednisolona, acetato de prednisolona, fosfato sódico de prednisolona, tebutato de prednisolona, prednisona, triamcinolona, acetonida de triamcinolona, y diacetato de triamcinolona. El al menos un andrógeno o esferoide anabólico puede ser al menos uno seleccionado de danazol, fluoximesterona, metiltestosterona, decanoato de nandrolona, fenpropionato de nandrolona, testosterona, cipionato de testosterona, enantato de testosterona, propionato de testosterona, y sistema transdérmico de testosterona. El al menos un estrógeno o progestina puede ser al menos uno seleccionado de estrógenos esterificados, estradiol, cipionato de estradiol, sistema transdérmico de acetato de estradiol/noretindrona, valerato de estradiol, estrógenos (conjugados), estropipato, etinil estradiol, etinil estradiol y desogestrel, etinil estradiol y diacetato de etinodiol, etinil estradiol y desogestrel, etinil estradiol y diacetato de etinodiol, etinil estradiol y levonorgestrel, etinil estradiol y noretindrona, etinil estradiol y acetato de noretindrona, etinil estradiol y norgestimato, etinil estradiol y norgestrel, etinil estradiol y noretindrona y acetato y fumarato ferroso, levonorgestrel, acetato de medroxiprogesterona, mestranol y noretindron, noretindrona, acetato de noretindrona, norgestrel, y progesterona. La al menos una gonadroptropina puede ser al menos una seleccionada de acetato de ganirelix, acetato de gonadorelina, acetato de histrelina, y menotropinas. El al menos un antidiabético o glucagon puede ser al menos uno seleccionado de acarbosa, clorpropamida, glimepirida, glipizida, glucagon, gliburida, insulina, clorhidrato de metformina, miglitol, clorhidrato de pioglitazona, repaglinida, maleato de rosiglitazona, y troglitazona. La al menos una hormona tiroidea puede ser al menos una seleccionada de levotiroxina sódica, liotironina sódica, liotrix, y tiroides. El al menos un antagonista de la hormona tiroidea puede ser al menos uno seleccionado de metimazol, yoduro potásico, yoduro potásico (solución saturada), propiltiouracilo, yodo radioactivo (yoduro sódico 1311), y solución de yodo fuerte. La al menos una hormona pituitaria puede ser al menos una seleccionada de corticotropina, cosintropina, acetato de desmopresina, acetato de leuprolida, corticotropina de reposición, somatrem, somatropina, y vasopresina. El al menos un fármaco similar al paratiroideo puede ser al menos uno seleccionado de calcifediol, calcitonina (humana), calcitonina (salmón), calcitriol, dihidrotaquisterol, y etidronato disódico. (Ver, por ejemplo, págs. 696-796 de Nursing 2001 Drug Handbook).

El al menos un diurético puede ser al menos uno seleccionado de acetazolamida, acetazolamida sódica, clorhidrato de amilorida, bumetanida, clortalidona, etacrinato sódico, ácido etacrínico, furosemida, hidroclorotiazida, indapamida, manitol, metolazona, espironolactona, torsemida, triamtereno, y urea. El al menos un electrólito o solución de reemplazo puede ser al menos uno seleccionado de acetato cálcico, carbonato cálcico, cloruro cálcico, citrato cálcico, glubionato cálcico, gluceptato cálcico, gluconato cálcico, lactato cálcico, fosfato cálcico (dibásico), fosfato cálcico (tribásico), dextrano (alto peso molecular), dextrano (bajo peso molecular), hetaalmidón, cloruro magnésico, sulfato magnésico, acetato potásico, bicarbonato potásico, cloruro potásico, gluconato potásico, inyección de Ringer, inyección de Ringer (lactato), y cloruro sódico. El al menos un acidificante o alcalinizante puede ser al menos uno seleccionado de bicarbonato sódico, lactato sódico, y trometamina. (Ver, por ejemplo, págs. 797-833 de Nursing 2001 Drug Handbook).

El al menos un hematínico puede ser al menos uno seleccionado de fumarato ferroso, gluconato ferroso, sulfato ferroso, sulfato ferroso (seco), hierro dextrano, hierro sorbitol, complejo de polisacárido-hierro, y complejo de sodio gluconato férrico. El al menos un anticoagulante puede ser al menos uno seleccionado de ardeparina sódica, dalteparina sódica, danaparoide sódico, enoxaparina sódica, heparina cálcica, heparina sódica, y warfarina sódica. El al menos un derivado de la sangre puede ser al menos uno seleccionado de albúmina 5 %, albúmina 25 %, factor antihemofílico, complejo coagulante antiinhibidor, antitrombina III (humana), factor IX (humano), complejo del factor IX, y fracciones de proteína plasmática. La al menos una enzima trombolítica puede ser al menos una seleccionada de alteplasa, anistreplasa, reteplasa (recombinante), estreptoquinasa, y uroquinasa. (Ver, por ejemplo, págs. 834-66 de Nursing 2001 Drug Handbook).

El al menos un fármaco alquilante puede ser al menos uno seleccionado de busulfán, carboplatino, carmustina, clorambucil, cisplatino, ciclofosfamida, ifosfamida, lomustina, clorhidrato de mecloretamina, melfalano, clorhidrato de melfalano, estreptozocina, temozolomida, y tiotepa. El al menos un antimetabolito puede ser al menos uno seleccionado de capecitabina, cladribina, citarabina, floxuridina, fosfato de fludarabina, fluorouracilo, hidroxiurea, mercaptopurina, metotrexatpo, metotrexato sódico, y tioguanina. El al . menos un antineoplásico antibiótico puede ser al menos uno seleccionado de sulfato de bleomicina, dactinomicina, citrato de daunorubicina liposomal, clorhidrato de daunorubicina, clorhidrato de doxorrubicina, clorhidrato de doxorrubicina liposomal, clorhidrato de epirubicina, clorhidrato de idarubicina, mitomicina, pentostatina, plicamicina, y valrubicina. El al menos un antineoplásico que altera el equilibrio hormonal puede ser al menos uno seleccionado de anastrozol, bicalutamida, fosfato sódico de estramustina, exemestano, flutamida, acetato de goserelina, letrozol, acetato de leuprolida, acetato de megestrol, nilutamida, citrato de tamoxifeno, testolactona, y citrato de toremifeno. El al menos un antineoplásico variado puede ser al menos uno seleccionado de asparaginasa, bacilo Calmette-Guerin (BCG) (vivo intravesical), dacarbazina, docetaxel, etopósido, fosfato de etopósido, clorhidrato de gemcitabina, clorhidrato de irinotecan, mitotano, clorhidrato de mitoxantrona, paclitaxel, pegaspargasa, porfimer sódico, clorhidrato de procarbazina, rituximab, tenipósido, clorhidrato de topotecan, trastuzumab, tretinoin, sulfato de vinblastina, sulfato de vincristina, y tartrato de vinorelbina. (Ver, por ejemplo, págs. 867-963 de Nursing 2001 Drug Handbook).

El al menos un inmunosupresor puede ser al menos uno seleccionado de azatioprina, basiliximab, ciclosporina, daclizumab, linfocitos inmuno globulina, muromonab-CD3, mofetil micofenolato, clorhidrato de mofetil micofenolato, sirolimos, y tacrolimos. La al menos un vacuna o toxoide puede ser al menos uno seleccionado de la vacuna BCG, vacuna del cólera, toxoides (adsorbido) diftérico y tetánico, vacuna de toxoides diftérico y tetánico y pertussis acelular adsorbida, vacuna de toxoides diftérico y tetánico y pertussis de célula completa, vacunas del conjugado Haemophilius b, vacuna de la hepatitis A (inactivada), vacuna de la hepatitis B (recombinante), vacuna del virus de la influenza 1999-2000 trivalente tipos A & B (antígeno de superficie purificado), vacuna del virus de la influenza 1999-2000 trivalente tipos A & B (subvirión o subvirión purificado), vacuna del virus de la influenza 1999-2000 trivalente tipos A & B (virión completo), vacuna del virus de la encefalitis japonesa (inactivado), vacuna de la enfermedad de Lyme (OspA recombinante), vacuna del virus del sarampión y paperas y rubéola (vivo), vacuna del virus del sarampión y paperas y rubéola (vivo atenuado), vacuna del virus del sarampión (vivo atenuado), vacuna meningocócica de polisacáridos, vacuna del virus de las paperas (vivo), vacuna contra plagas, vacuna neumocócíca (polivalente), vacuna del virus de la polio (inactivada), vacuna del virus de la polio (vivo, oral, trivalente), vacuna contra la rabia (adsorbida), vacuna contra la rabia (célula diploide humana), vacuna del virus de la rubéola y paperas (vivo), vacuna del virus de la rubéola (vivo, atenuado), toxoide tetánico (adsorbido), toxoide tetánico (fluido), vacuna contra el tifus (oral), vacuna contra el tifus (parenteral), vacuna contra el tifus Vi de polisacáridos, vacuna del virus de la varicela, y vacuna de la fiebre amarilla. La al menos un antitoxina o antiveneno puede ser al menos uno seleccionado de antiveneno de la araña viuda negra, antiveneno crotalidae (polivalente), antitoxina de la difteria (equina), y antiveneno de Micrurus fulvius. El al menos un suero inmune puede ser al menos uno seleccionado de globulina inmune de citomegalovirus (intravenoso), globulina inmune de hepatitis B (humana), globulina inmune intramuscular, globulina inmune intravenosa, globulina inmune de la rabia (humana), globulina inmune del virus sincicial respiratorio intravenoso (humana), globulina inmune RhO(D) (humana), globulina inmune RhO(D) intravenosa (humana), globulina inmune de tétano (humana), y globulina inmune contra varicela-zoster. El al menos un modificador de la respuesta biológica puede ser al menos uno seleccionado de aldesleukina, epoetina alfa, filgrastim, acetato de glatiramer para inyección, interferón alfacon-1 , interferón alfa-2a (recombinante), interferón alfa-2b (recombinante), ¡nterferón beta-la, interferón beta-1b (recombinante), interferón gamma-1b, clorhidrato de levamisol, oprelvekin, y sargramostim. (Ver, por ejemplo, págs. 964-1040 de Nursing 2001 Drug Handbook).

El al menos un antiinfeccioso oftálmico puede seleccionarse de bacitracina, cloranlenicol, clorhidrato de ciprofloxacina, eritromicina, sulfato de gentamicina, ofloxacina 0.3 %, sulfato de polimixina B, sulfacetamida sódica 10 %, sulfacetamida sódica 15 %, sulfacetamida sódica 30 %, tobramicina, y vidarabina. El al menos un antiinflamatorio oftálmico puede ser al menos uno seleccionado de dexametasona, fosfato sódico de dexametasona, diclofenaco sódico 0.1 %, fluorometolona, flurbiprofén sódico, ketorolaco trometamina, acetato de prednisolona (suspensión) y fosfato sódico de prednisolona (solución). El al menos un miótico puede ser al menos uno seleccionado de cloruro de acetilcolina, carbacol (intraocular), carbacol (tópico), yoduro de ecotiofato, pilocarpina, clorhidrato de pilocarpina, y nitrato de pilocarpina. El al menos un midriático puede ser al menos uno seleccionado de sulfato de atropina, clorhidrato de ciclopentolato, clorhidrato de epinefrina, borato de epinefil, bromhidrato de homatropina, clorhidrato de fenilefrina, bromhidrato de escopolamina, y tropicamida. El al menos un vasoconstrictor oftálmico puede ser al menos uno seleccionado de clorhidrato de nafazolina, clorhidrato de oximetazolina, y clorhidrato de tetrahidrozolina. El al menos un oftálmico vanado puede ser al menos uno seleccionado de clorhidrato de apraclonidina, clorhidrato de betaxolol, tartrato de brimonidina, clorhidrato de carteolol, clorhidrato de dipivefrina, clorhidrato de dorzolamida, difumarato de emedastina, fluoresceína sódica, fumarato de ketotifeno, latanoprost, clorhidrato de levobunolol, clorhidrato de metipranolol, cloruro sódico (hipertónico), y maleato de timolol. El al menos un ótico puede ser al menos uno seleccionado de ácido bórico, peróxido de carbamida, cloranlenicol, y condensado de polipéptido-oleato de trietanolamina El al menos un fármaco nasal puede ser al menos uno seleccionado de dipropionato de beclometasona, budesonida, sulfato de efedrina, clorhidrato de epinefrina, flunisolida, propionato de fluticasona, clorhidrato de nafazolina, clorhidrato oximetazolina, clorhidrato de fenilefrina, clorhidrato de tetrahidrozolina, acetonida de triamcinolona, y clorhidrato de xilometazolina. (Ver, por ejemplo, págs. 1041-97 de Nursing 2001 Drug Handbook).

El al menos un antiinfeccioso local puede ser al menos uno seleccionado de aciclovir, anfotericina B, ácido acelaico en crema, bacitracina, nitrato de butoconazol, fosfato de clindamicina, clotrimazol, nitrato de econazol, eritromicina, sulfato de gentamicina, ketoconazol, acetato de mafenida, metronidazol (tópico), nitrato de miconazol, mupirocina, clorhidrato de naftifina, sulfato de neomicina, nitrofurazona, nistatina, sulfadiazina de plata, clorhidrato de terbinafina, terconazol, clorhidrato de tetraciclina, tioconazol, y tolnaftato. El al menos un escabicida o pediculicida puede ser al menos uno seleccionado de crotamiton, lindano, permetrina, y piretrinas. El al menos un corticosteroide tópico puede ser al menos uno seleccionado de dipropionato de betametasona, valerato de betametasona, propionato de clobetasol, desonida, desoximetasona, dexametasona, fosfato sódico de dexametasona, diacetato de diflorasona, acetonida de fluocinolona, fluocinonida, flurandrenolida, propionato de fluticasona, halcionida, hidrocortisona, acetato de hidrocortisona, butirato de hidrocortisona, valerato de hidrocortisona, de mometasona, y acetonida de triamcinolona. (Ver, por ejemplo, págs. 1098-1 36 de Nursing 2001 Drug Handbook).

La al menos una vitamina o mineral puede ser al menos una seleccionada de vitamina A, vitaminas del complejo B, cianocobalamina, ácido fólico, hidroxocobalamina, leucovorina cálcica, niacina, niacinamida, clorhidrato de piridoxina, riboflavina, clorhidrato de tiamina, vitamina C, vitamina D, colecaliferol, ergocalcifero, análogo de la vitamina D, doxercalciferol, paricalcitol, vitamina E, análogo de la vitamina K, fitonadiona, fluoruro sódico, fluoruro sódico (tópico), oligoelementos, cromo-cobre, yodo, manganeso, selenio, y cinc. El al menos un calórico puede ser al menos uno seleccionado de infusiones de aminoácidos (cristalino), infusiones de aminoácidos en dextrosa, infusiones de aminoácidos con electrólitos, infusiones de aminoácidos con electrólito en dextrosa, infusiones de aminoácidos para el fallo hepático, infusiones de aminoácidos para el estrés metabólico alto, infusiones de aminoácidos para el fallo renal, dextrosa, emulsiones grasas, y triglicéridos de cadena media. (Ver, por ejemplo, págs. 1137-63 de Nursing 2001 Drug Handbook).

Las composiciones de supercóntigo de proteínas de la presente invención pueden comprender, además, al menos uno de cualquier cantidad adecuada y efectiva de una composición o composición farmacéutica que comprende un supercóntigo de proteínas contactado o administrado a una célula, tejido, órgano, animal o paciente con necesidad de tal modulación, tratamiento o terapia, que comprende, opcionalmente, además, al menos uno seleccionado de al menos un antagonista TNF (por ejemplo, pero sin limitarse a, un antagonista de proteína o químico de TNF, anticuerpo monoclonal o policlonal de TNF o fragmento, una receptor de TNF soluble (por ejemplo, p55, p70 o p85) o fragmento, polipéptidos de fusión de estos, o un antagonista de TNF de molécula pequeña, por ejemplo, proteína de unión al TNF I o II (TBP-1 o TBP-II), nerelimonmab, infliximab, etanercept, CDP-571 , CDP-870, afelimomab, lenercept, y similares), un antireumático (por ejemplo, metotrexato, auranofin, aurotioglucosa, azatioprina, etanercept, tiomalato sódico de oro, sulfato de hidroxicloroquina, leflunomida, sulfasalzina), un relajante muscular, un narcótico, un fármaco antiinflamatorio no esteroide (NSAID), un analgésico, un anestésico, un sedante, un anestésico local, un bloqueador neuromuscular, un antimicrobiano (por ejemplo, aminoglucósido, un antimicótico, un antiparasitario, un antiviral, un carbapenem, cefalosporina, una flurorquinolona, un macrólido, una penicilina, una sulfonamida, una tetraciclina, otro antimicrobiano), un antisoriásico, un corticosteriode, un esteroide anabólico, un agente relacionado con la diabetes, un mineral, un nutritivo, un agente tiroideo, una vitamina, una hormona relacionada con el calcio, un antidiarreico, un antitusígeno, un antiemético, un antiulceroso, un laxante, un anticoagulante, una eritropoyetina (por ejemplo, epoetina alfa), un filgrastim (por ejemplo, G-CSF, Neupogen), un sargramostim (GM-CSF, Leukina), una inmunización, una inmunoglobulina, un inmunosupresor (por ejemplo, basiliximab, ciclosporina, daclizumab), una hormona de crecimiento, un fármaco de reemplazo hormonal, un modulador del receptor de estrógeno, un midriático, un cicloplégico, un agente alquilante, un antimetabolito, un inhibidor mitótico, un radiofarmacéutico, un antidepresivo, agente antimaniaco, un antipsicótico, un anxiolítico, un hipnótico, un simpatomimético, un estimulante, donepezil, tacrina, un medicamento para el asma, un agonista beta, un esteroide inhalado, un inhibidor del leucotrieno, una metilxantina, una cromolina, una epinefrina o análogo, dornasa alfa (Pulmozyme), una citocina o un antagonista de citocina. Los ejemplos no limitantes de esas citocinas incluyen, pero no se limitan a, cualquiera de IL-1 a IL-32 (por ejemplo, IL-1 , IL-2, etc). Las dosis adecuadas se conocen bien en la materia. Ver, por ejemplo, Wells y otros, eds., Pharmacotherapy Handbook, 2.° edición, Appleton and Lange, Stamford, CT (2000); PDR Pharmacopoeia, Tarascón Pocket Pharmacopoeia 2000, edición de lujo, Tarascón Publishing, Loma Linda, CA (2000), cada una de esas referencias se incorporan completamente en la presente como referencia.

Tales anticancerígenos o antiinfecciosos pueden incluir, además, moléculas de toxina que se asocian, unen, co-formulan o coadministran con al menos un supercóntigo de proteínas de la presente invención. La toxina puede actuar, opcionalmente, para matar selectivamente la célula o tejido patológico. La célula patológica puede ser una célula cancerosa u otra. Tales toxinas pueden ser, pero no se limitan a, una toxina purificada o recombinante o fragmento de toxina que comprende al menos un dominio citotóxico funcional de la toxina, por ejemplo, seleccionado de al menos uno de ricina, toxina de la difteria, una toxina venenosa, o una toxina bacteriana. El término toxina incluye, además, ambas endotoxinas y exotoxinas producidas por cualquier bacteria o virus de origen natural, mutante o recombinante que pueden causar cualquier afección patológica en seres humanos y otros mamíferos, que incluyen el choque tóxico que puede provocar la muerte. Tales toxinas pueden incluir, pero no se limitan a, enterotoxina termo-lábil (LT) de E. coli enterotoxigénica, enterotoxina termoestable (ST), citotoxina Shigella, enterotoxinas Aeromonas, toxina-1 del síndrome de choque tóxico (TSST-1), enterotoxina A estafilocóccica (SEA), B (SEB), o C (SEC), enterotoxinas de estreptococos y similares. Tales bacterias incluyen, pero no se limitan a, cepas de una especie de E. coli enterotoxigénica (ETEC), E. coli enterohemorrágica (por ejemplo, cepas del serotipo 0157:H7), especies de Staphylococcus (por ejemplo, Staphylococcus aureus, Staphylococcus pyogenes), especies de Shigella (por ejemplo, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella boydii, y Shigella sonnei), especies de Salmonella (por ejemplo, Salmonella typhi, Salmonella cholera-suis, Salmonella enteritidis), especies de Clostridium (por ejemplo, Clostridium perfringens, Clostridium dificile, Clostridium botulinum), especies de Camphlobacter (por ejemplo, Camphlobacter jejuni, Camphlobacter fetus), especies de Heliobacter, (por ejemplo, Heliobacter pylori), especies de Aeromonas (por ejemplo, Aeromonas sobria, Aeromonas hidrophila, Aeromonas caviae), Pleisomonas shigelloides, Yersina enterocolitica, especies de Vibrios (por ejemplo, Vibrios cholerae, Vibrios parahemolyticus), especies de Klebsiella, Pseudomonas aeruginosa, y Streptococci. Ver, por ejemplo, Stein, ed., INTERNAL MEDICINE, 3.° ed., págs. 1 -13, Little, Brown and Co., Boston, (1990); Evans y otros, eds. , Bacterial Infections of Humans: Epidemiology and Control, 2.° Ed., págs. 239-254, Plenum Medical Book Co., Nueva York (1991); Mandell y otros, Principies and Practice of Infectious Diseases, 3.° Ed., Churchill Livingstone, Nueva York (1990); Berkow y otros, eds., The Merck Manual, 16.° edición, Merck and Co., Rahway, N.J., 1992; Wood y otros, FEMS Microbiology Immunotogy, 76:121-134 (1991 ); Marrack y otros, Science, 248:705-71 1 (1990), el contenido de estas referencias se incorpora completamente en la presente descripción como referencia.

Los compuestos, composiciones o combinaciones de supercóntigo de proteínas de la presente invención pueden comprender, además, al menos uno de cualquiera de auxiliares adecuados, tales como, pero sin limitarse a, diluyente, aglutinante, estabilizante, tampón, sales, solventes lipofílicos, conservantes, adyuvantes o similares. Se prefieren los auxiliares farmacéuticamente aceptables. Los ejemplos no limitantes de, y los método para preparar tales soluciones estériles se conocen bien en la materia, tales como, pero limitados a, Gennaro, Ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18.° edición, Mack Publishing Co. (Easton, PA) 1990. Los portadores farmacéuticamente aceptables pueden seleccionarse rutinariamente que sean adecuados para el modo de administración, solubilidad y/o estabilidad de la composición del supercóntigo de proteínas, fragmento o variante como se conoce bien en la materia o como se describe en la presente descripción.

Los excipientes farmacéuticos y aditivos útiles en la presente composición incluyen, pero no se limitan a, proteínas, péptidos, aminoácidos, lípidos, y carbohidratos (por ejemplo, azúcares que incluyen monosacáridos, di-, tri-, tetra-, y oligosacárídos; azúcares derivatizadas tales como alditol, ácidos aldónicos, azúcares esterificadas y similares; y polisacáridos o polímeros de azúcar), que pueden estar presentes singularmente o en conjunto, que comprenden solos o en conjunto 1-99.99 % en peso o volumen. Los excipientes de proteína ilustrativos incluyen albúmina sérica, tal como albúmina sérica humana (HSA), albúmina humana recombinante (rHA), gelatina, caseína, y similares. Los componentes de aminoácidos/proteínas representativos que pueden funcionar, además, en la capacidad de amortiguador incluyen alanina, glicina, arginina, betaína, histidina, ácido glutámico, ácido aspártico, cisteína, lisina, leucina, isoleucina, valina, metionina, fenilalanina, aspartame, y similares. Un aminoácido preferido es glicina.

Los excipientes de carbohidrato adecuados para usar en la invención incluyen, por ejemplo, monosacárido, tales como fructosa, maltosa, galactosa, glucosa, d(+)-manosa, sorbosa, y similares; disacáridos, tales como lactosa, sucrosa, trehalosa, celobiosa, y similares; polisacáridos, tales como rafinosa, melezitosa, maltodextrinas, dextranos, almidones, y similares; y alditoles, tales como manitol, xilitol, maltitol, lactitol, xilitol sorbitol (glucitol), mioinositol y similares. Los excipientes de carbohidrato preferidos para usar en la presente invención son manitol, trehalosa, y rafinosa.

Las composiciones de supercóntigo de proteínas pueden incluir, además, un amortiguador o un agente de ajuste de pH; típicamente, el amortiguador es una sal preparada a partir de un ácido o base orgánica. Los amortiguadores representativos incluyen sales de ácido orgánico, tales como las sales de ácido cítrico, ácido ascórbico, ácido glucónico, ácido carbónico, ácido tartárico, ácido succínico, ácido acético, o ácido itálico; Tris, clorhidrato de trometamina, o amortiguadores de fosfato. Los amortiguadores preferidos para usar en las presentes composiciones son sales de ácido orgánico, tal como citrato.

Además, las composiciones de supercóntigo de proteínas de la invención pueden incluir excipiente/aditivos poliméricos, tales como polivinilpirrolidonas, ficol (un azúcar polimérico), dextratos (por ejemplo, ciclodextrinas, tales como 2-hidroxipropil- -ciclodextrina), polietilenglicoles, agentes aromatizantes, agentes antimicrobianos, edulcorantes, antioxidantes, agentes antiestáticos, surfactantes (por ejemplo, polisorbatos, tales como "TWEEN 20" y "TWEEN 80"), lípidos {por ejemplo, fosfolípidos, ácidos grasos), esteroides (por ejemplo, colesterol), y agentes quelantes (por ejemplo, EDTA).

Estos y excipientes farmacéuticos conocidos adicionales y/o aditivos adecuados para usar en las composiciones de supercóntigo de proteínas, porción o variante de acuerdo con la invención son conocidos en la materia, por ejemplo, como se enumera en "Remington: The Science & Practice of Pharmacy", 19.° ed., Williams & Williams, (1995), y en el "Physician's Desk Reference", 52.° ed., Medical Economics, Montvale, NJ (1998), la descripción de estas se incorpora completamente en la presente descripción como referencia. Los materiales excipientes o portadores preferidos son los carbohidratos (por ejemplo, sacáridos y alditoles) y amortiguadores (por ejemplo, citrato) o agentes poliméricos. Una molécula portadora ilustrativa es el mucopolisacárido, ácido hialurónico, que pueden ser útiles para el suministro intraarticular.

Formulaciones Como se mencionó anteriormente, la invención proporciona formulaciones estables que comprenden, preferentemente, un amortiguador de fosfato con solución salina o una sal escogida, así como soluciones y formulaciones conservadas que contienen un conservante así como formulaciones conservadas multiuso adecuadas para uso farmacéutico o veterinario, que comprenden al menos un supercóntigo de proteína en una formulación farmacéuticamente aceptable. Las formulaciones conservadas contienen al menos un conservante conocido u opcionalmente seleccionado del grupo que consiste de al menos un fenol, m-cresol, p-cresol, o-cresol, clorocresol, alcohol bencílico, nitrito fenilmercúrico, fenoxietanol, formaldehído, clorobutanol, cloruro magnésico (por ejemplo, hexahidrato), alquilparabeno (metilo, etil, propilo, butilo y similares), cloruro de benzalconio, cloruro de benzetonio, dehidroacetato sódico y timerosal, polímeros, o mezclas de estos en un diluyente acuoso. Cualquier concentración o mezcla adecuada se puede usar como se conoce en la materia, tal como aproximadamente 0.0015 %, o cualquier intervalo, valor, o fracción de estos. Los ejemplos no limitantes incluyen, sin conservante, aproximadamente 0.1-2 % m-cresol (por ejemplo, 0.2, 0.3. 0.4, 0.5, 0.9, 1.0 %), aproximadamente 0.1-3 % alcohol bencílico (por ejemplo, 0.5, 0.9, 1.1 , 1.5, 1.9, 2.0, 2.5 %), aproximadamente 0.001-0.5 % timerosal (por ejemplo, 0.005, 0.01), aproximadamente 0.001-2.0 % fenol (por ejemplo, 0.05, 0.25, 0.28, 0.5, 0.9, 1.0 %), 0.0005-1.0 % alquilparabeno(s) (por ejemplo, 0.00075, 0.0009, 0.001 , 0.002, 0.005, 0.0075, 0.009, 0.01 , 0.02, O.05, 0.075, 0.09, 0.1 , 0.2, 0.3, 0.5, 0.75, 0.9, 1.0 %), y similares.

Como se mencionó anteriormente, la invención proporciona un articulo de fabricación que comprende material de empaque y al menos un frasco que comprende una solución de al menos un supercóntigo de proteínas con los amortiguadores prescritos y/o conservantes, opcíonalmente en un diluyente acuoso, en donde dicho material de empaque comprende una etiqueta que indica que esa solución puede mantenerse durante un período de 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 9, 12, 18, 20, 24, 30, 36, 40, 48, 54, 60, 66, 72 horas o mayor. La invención comprende, además, un artículo de fabricación que comprende material de empaque, un primer frasco que comprende, liofilizado, al menos un supercóntigo de proteínas, y un segundo frasco que comprende un diluyente acuoso del amortiguador prescrito o conservante, en donde dicho material de empaque comprende una etiqueta que instruye al paciente para reconstituir el al menos un supercóntigo de proteínas en el diluyente acuoso para formar una solución que se puede mantener durante un período de veinte a veinticuatro horas o mayor.

El al menos un supercóntigo de proteínas usado de acuerdo con la presente invención se puede producir por medio recombinante, que incluye a partir de una célula de mamífero o preparaciones transgénicas, o pueden purificarse a partir de otras fuentes biológicas, como es descrito en la presente o como se conoce en la materia.

El intervalo de al menos un supercóntigo de proteínas en el producto de la presente invención incluye cantidades que producen después de la reconstitución, en el sistema húmedo/seco, concentraciones de aproximadamente 1.0 g/ml a aproximadamente 1000 mg/ml, aunque concentraciones inferiores y superiores son operables y dependen del vehículo de suministro deseado, por ejemplo, las formulaciones en solución diferirán del parche transdérmico, pulmonar, transmucosa, u osmótico o método de micro bomba.

Preferentemente, el diluyente acuoso comprende, opcionalmente, además, un conservante farmacéuticamente aceptable. Los conservantes preferidos incluyen los seleccionados del grupo que consiste de fenol, m-cresol, p-cresol, o-cresol, clorocresol, alcohol bencílico, alquilparabeno (metilo, etil, propilo, butilo y similares), cloruro de benzalconio, cloruro de benzetonio, dehidroacetato sódico y timerosal, o mezclas de estos. La concentración del conservante usado en la formulación es una concentración suficiente para producir un efecto antimicrobiano. Tales concentraciones dependen del conservante seleccionado y se determinan fácilmente por el técnico con experiencia.

Otros excipientes, por ejemplo, los agentes de isotonicidad, amortiguadores, antioxidantes, y potenciadores conservantes, pueden añadirse opcionalmente y preferentemente al diluyente. Un agente de isotonicidad, tal como glicerina, se usa comúnmente a concentraciones conocidas. Un amortiguador fisiológicamente tolerado se añade, preferentemente, para proporcionar un control mejorado del pH. Las formulaciones pueden cubrir un amplio intervalo de pH, tal como de aproximadamente pH 4 a aproximadamente pH 10, y los intervalos preferidos de aproximadamente pH 5 a aproximadamente pH 9, y un intervalo más preferido de aproximadamente 6.0 a aproximadamente 8.0. Preferentemente, las formulaciones de la presente invención tienen un pH entre aproximadamente 6.8 y aproximadamente 7.8. Los amortiguadores preferidos incluyen amortiguadores de fosfato, con la máxima preferencia, fosfato sódico, particularmente, solución salina regulada con fosfato (PBS).

Otros aditivos, tales como un solubilizador farmacéuticamente aceptable como Tween 20 (polioxietileno (20) monolaurato de sorbitán), Tween 40 (polioxietileno (20) monopalmitato de sorbitán), Tween 80 (polioxietileno (20) monooleato de sorbitán), Pluronic F68 (copolímero de bloque polioxietileno polioxipropileno), y PEG (polietilenglicol) o surfactantes no iónicos, tales como polisorbato 20 o 80 o poloxámero 184 o 188, polioles Pluronic®, otros co-polimeros de bloque, y quelantes, tales como EDTA y EGTA, pueden añadirse, opcionalmente, a las formulaciones o composiciones para reducir la agregación. Estos aditivos son particularmente útiles si se usa una bomba o contenedor plástico para administrar la formulación. La presencia de surfactante farmacéuticamente aceptable mitiga la tendencia de agregación de la proteína.

Las formulaciones de la presente invención se pueden preparar por un proceso que comprende mezclar al menos un supercóntigo de proteínas y un conservante seleccionado del grupo que consiste de fenol, m-cresol, p-cresol, o-cresol, clorocresol, alcohol bencílico, alquilparabeno, (metilo, etil, propilo, butilo y similares), cloruro de benzalconio, cloruro de benzetonio, dehidroacetato sódico y timerosal o mezclas de estos en un diluyente acuoso. La mezcla del al menos un supercóntigo de proteínas y el conservante en un diluyente acuoso se lleva a cabo mediante el uso de una disolución convencional y procedimientos de mezclado. Para preparar una formulación adecuada, por ejemplo, una cantidad medida de al menos un supercóntigo de proteínas en solución amortiguadora se combina con el conservante deseado en una solución amortiguadora en cantidades suficientes para proporcionar la proteína y el conservante a las concentraciones deseadas. Las variaciones de este proceso serían reconocidas por el experto en la materia. Por ejemplo, el orden en que se añaden los componentes, si se usan aditivos adicionales, la temperatura y pH a la cual se prepara la formulación, son todos factores que se pueden optimizar por la concentración y medios de administración usados.

Las formulaciones reivindicadas pueden proporcionarse a los pacientes como soluciones claras o como frascos dobles que comprenden un frasco de liofilizado de al menos un supercóntigo de proteínas que se reconstituye con un segundo frasco que contiene agua, un conservante y/o excipientes, preferentemente, un amortiguador de fosfato y/o solución salina y una sal escogida, en un diluyente acuoso. Tanto una solo frasco de solución o frasco doble que requieren reconstitución pueden reutilizarse varias veces y pueden bastar para un solo ciclo o múltiples ciclos de tratamiento del paciente y así pueden proporcionar un régimen de tratamiento más conveniente que los disponibles actualmente.

La presente reivindica artículo de fabricación son útiles para la administración durante un periodo en el intervalo de inmediato a veinticuatro horas o mayor. En correspondencia, los artículos de fabricación actualmente reivindicados ofrecen ventajas significativas al paciente. Las formulaciones de la invención pueden ser almacenadas, opcionalmente, con seguridad a temperaturas de aproximadamente 2 °C a aproximadamente 40 °C y mantienen la actividad biológica de la proteína por períodos extendidos de tiempo, lo que permite así una etiqueta de empaque que indica que la solución se puede mantener y/o usar durante un período de 6, 12, 18, 24, 36, 48, 72, o 96 horas o mayor. Si se usa el diluyente conservado, esa etiqueta puede incluir el uso hasta 1 -12 meses, medio, uno y medio, y/o dos años.

Las soluciones de al menos un supercóntigo de proteínas de la invención se pueden preparar por un proceso que comprende mezclar al menos un supercóntigo de proteínas en un diluyente acuoso. El mezclado se lleva a cabo por medio de uso de procedimientos de mezclado y una disolución convencional. Para preparar un diluyente adecuado, por ejemplo, una cantidad medida de al menos un supercóntigo de proteínas en agua o amortiguador se combina en cantidades suficientes para proporcionar la proteína y, opcionalmente, un conservante o amortiguador a concentraciones deseadas. Las variaciones de este proceso serían reconocidas por el experto en la materia. Por ejemplo, el orden en que se añaden los componentes, si se usan aditivos adicionales, la temperatura y pH a la cual se prepara la formulación, son todos factores que se pueden optimizar por la concentración y medios de administración usados.

Los productos reivindicados se pueden proporcionar a los pacientes como soluciones claras o como frascos dobles que comprenden un frasco de al menos un supercóntigo de proteínas liofilizado que se reconstituye con un segundo frasco que contiene él diluyente acuoso. Tanto un solo frasco de solución o frasco doble que requieren reconstitución pueden reusarse varias veces y pueden bastar para un solo ciclo o múltiples ciclos de tratamiento del paciente y, así, pueden proporcionar un régimen de tratamiento más conveniente que los disponibles actualmente.

Los productos reivindicados se pueden proporcionar indirectamente a los pacientes al proporcionar a las farmacias, clínicas, u otras instituciones e instalaciones de este tipo, soluciones claras o frascos dobles que comprenden un frasco de liofilizado al menos un supercóntigo de proteínas que se reconstituye con un segundo frasco que contiene el diluyente acuoso. La solución clara en este caso puede ser hasta un litro o aun mayor en tamaño, al proporcionar un reservorio grande a partir del cual porciones más pequeñas de la al menos una solución de supercóntigo de proteínas puede recuperarse una o varias veces para transferir en frascos más pequeños y proporcionados por la farmacia o la clínica a sus usuarios y/o pacientes.

Los dispositivos reconocidos que comprenden sistemas de un solo frasco incluyen dispositivos de inyector tipo pluma para la entrega de una solución, tales como, BD Pens, BD Autojector®, Humaject®, NovoPen®, B-D®Pen, AutoPen®, y OptiPen®, GenotropinPen®, Genotronorm Pen®, Humatro Pen®, Reco-Pen®, Roferon Pen®, Biojector®, Iject®, J-tip Needle-Free Injector®, Intraject®, Medi-Ject®, por ejemplo, como los fabricados o desarrollados por Becton Dickensen (Franklin Lakes, NJ, www.bectondickenson.com), Disetronic (Burgdorf, Suiza, www.disetronic.com; Bioject, Portland, Oregon (www.bioject.com); National Medical Products, Weston Medical (Peterborough, Reino Unido, www.weston-medical.com), Medi-Ject Corp (Minneapolis, MN, www.mediiect.com), y dispositivos similarmente adecuados. Los dispositivos reconocidos que comprenden un sistema de frasco doble incluyen los sistemas de inyector tipo pluma para reconstituir un fármaco liofilizado en un cartucho para la entrega de la solución reconstituida, tales como el HumatroPen®. Los ejemplos de otros dispositivos adecuados incluyen jeringas pre-rellenas, auto-inyectores, inyectores sin aguja y juegos de infusión IV sin aguja.

Los productos reivindicados en la presente descripción incluyen el material de empaque. El material de empaque proporciona, además de la información requerida por las agencias regulatorias, las condiciones bajos las cuales el producto se puede usar. El material de empaque de la presente invención proporciona instrucciones al paciente para reconstituir, al menos, un supercóntigo de proteínas en el diluyente acuoso para formar una solución y usar la solución durante un período de 2-24 horas o mayor para los dos productos del frasco, húmedo/seco. Para el frasco único, el producto en solución, la etiqueta indica que tal solución se puede usar durante un periodo de 2-24 horas o mayor. Los productos reivindicados en la presente invención son útiles para el uso de productos farmacéuticos humanos.

Las formulaciones de la presente invención se pueden preparar por un proceso que comprende mezclar al menos un supercóntigo de proteínas y un amortiguador seleccionado, preferentemente, un amortiguador de fosfato que contiene solución salina o una sal escogida. Mezclar al menos un supercóntigo de proteínas y el amortiguador en un diluyente acuoso se lleva a cabo por medio del uso de procedimientos de mezclado y disolución convencionales. Para preparar una formulación adecuada, por ejemplo, una cantidad medida de al menos un supercóntigo de proteínas en agua o amortiguador se combina con el agente amortiguador en agua en cantidades suficientes para proporcionar la proteina y el amortiguador en las concentraciones deseadas. Las variaciones de este proceso serían reconocidas por el experto en la materia. Por ejemplo, el orden en que se añaden los componentes, si se usan aditivos adicionales, la temperatura y pH a la cual se prepara la formulación, son todos factores que se pueden optimizar por la concentración y medios de administración usados.

Las formulaciones estables o conservadas reivindicadas se pueden proporcionar a los pacientes como soluciones claras o como frascos dobles que comprenden un frasco de supercóntigo de proteínas liofilizado que se reconstituye con un segundo frasco que contiene un conservante o amortiguador y excipientes en un diluyente acuoso. Tanto un solo frasco de solución o frasco doble que requieren reconstitución pueden reusarse varias veces y pueden bastar para un solo ciclo o múltiples ciclos de tratamiento del paciente y, así, pueden proporcionar un régimen de tratamiento más conveniente que los disponibles actualmente.

Otras formulaciones o métodos para estabilizar el supercóntigo de proteínas puede resultar en uno distinto a una solución clara de polvo liofilizado que comprende el supercóntigo de proteínas. Entre las soluciones no claras se encuentran las formulaciones que comprenden suspensiones particuladas, dichos particulados son una composición que contiene el supercóntigo de proteínas en una estructura de dimensión variable y conocida de formas muy diversas como una microesfera, micropartícula, nanopartícula, nanosfera, o liposoma. Tales formulaciones particuladas relativamente homogéneas, prácticamente esféricas, que contienen un agente activo se pueden formar al contactar una fase acuosa que contiene el agente activo y un polímero y una fase no acuosa seguido por la evaporación de la fase no acuosa para provocar la coalescencia de las partículas de la fase acuosa como se enseña en la patente de los Estados Unidos núm. 4,589,330. Las micropartículas porosas se pueden preparar por medio del uso de una primera fase que contiene el agente activo y un polímero dispersos en un solvente continuo y al eliminar dicho solvente de la suspensión por liofilización o dilución-extracción-precipitación como se enseña en la patente de los Estados Unidos núm. 4,818,542. Los polímeros preferidos para tales preparaciones son polímeros o copolímeros naturales o sintéticos seleccionados del grupo que consiste de agar de gelatina, almidón, arabínogalactana, albúmina, colágeno, ácido poliglicólico, ácido poliláctico, glicólido-L(-) láctido poli(episilon-caprolactona, ácido poli(epsilon-caprolactona-CO-láctico), ácido poli(epsilon-caprolactona-CO-glicólico), ácido pol¡(p-hidroxi butírico), óxido de polietileno, polietileno, poli(alquil-2-cianoacrilato), poli(hidroxietil metacrilato), poliamidas, poli(aminoácidos), poli(2-hidroxietil DL-aspartamida), poli(éster urea), polí(L-fenilalanina/etilenglicol/1 ,6-diisocianatohexano) y poli(metil metacrilato). Particularmente, los polímeros preferidos son poliésteres, tales como ácido poliglicólico, ácido poliláctico, glicólido-L(-) láctido poli(episilon-caprolactona, ácido poli(epsilon-caprolactona-CO-láctico), y ácido poli(epsilon-caprolactona-CO-glicólico. Los solventes útiles para disolver el polímero y/o el ingrediente activo incluyen: agua, hexafluoroisopropanol, cloruro de metileno, tetra hidrofurano, hexano, benceno, o sesquihidrato de hexafluoroacetona. Los procesos para dispersar la fase que contiene el ingrediente activo con una segunda fase pueden incluir forzar por presión dicha primera fase a través de un orificio en una tobera para afectar la formación de gotas.

Las formulaciones de polvo seco pueden resultar de procesos distintos a la liofilización, tales como por secado por aspersión o extracción por disolvente por evaporación o por precipitación de una composición cristalina seguido por una o más etapas para eliminar el solvente acuoso o no acuoso. La preparación de una preparación de supercóntigo de proteínas secada por aspersión se enseña en la patente de los Estados Unidos núm. 6,019,968. Las composiciones en polvo seco basadas en el supercóntigo de proteínas pueden producirse por secado por aspersión de las soluciones o suspensiones de supercóntigo de proteínas y, opcionalmente, excipientes, en un solvente bajo condiciones para proporcionar un polvo seco respirable. Los solventes pueden incluir compuestos polares, tales como agua y etanol, los que pueden secarse fácilmente La estabilidad del supercóntigo de proteínas puede mejorarse al realizar los procedimientos de secado por aspersión en ausencia de oxígeno, tal como bajo un manto de nitrógeno o por medio del uso de nitrógeno como un gas de secado. Otra formulación relativamente seca es una dispersión de una pluralidad de microestructuras perforadas dispersas en un medio de suspensión que comprende, típicamente, un propulsor de hidrofluoroalcano como se enseña en la patente núm. 9916419. Las dispersiones estabilizadas pueden administrarse al pulmón de un paciente por medio del uso de un inhaladores de dosis medida. La instalación útil en la fabricación comercial de medicamentos secados por aspersión se fabrican por Buchi Ltd. o Niro Corp.

Al menos un supercóntigo de proteínas en las formulaciones o soluciones estables o conservadas descritas en la presente descripción pueden administrarse a un paciente de acuerdo con la presente invención por una variedad de métodos de entrega que incluyen inyección SC o IM; transdérmico, pulmonar, transmucosa, implante, bomba osmótica, cartucho, micro bomba, u otros medios apreciados por el técnico con experiencia, como se conoce bien en la materia.

Aplicaciones terapéuticas La presente invención proporciona, además, un método para modular o tratar una enfermedad, en una célula, tejido, órgano, animal, o paciente, como se conoce en la materia o como se describe en la presente descripción, por medio del uso de al menos un supercóntigo de proteínas de la presente invención, por ejemplo, al administrar o contactar la célula, tejido, órgano, animal, o paciente con una cantidad terapéutica efectiva del supercóntigo de proteínas. La presente invención proporciona, además, un método para modular o tratar una enfermedad en una célula, tejido, órgano, animal, o paciente, la enfermedad incluye, pero no se limita a, al menos uno de obesidad, una enfermedad inmune relacionada, una enfermedad cardiovascular, una enfermedad infecciosa, una enfermedad maligna o una enfermedad neurológica.

La presente invención proporciona, además, un método para . - -. , modular o tratar al menos una enfermedad inmune relacionada, en una célula, tejido, órgano, animal, o paciente que incluye, pero no se limita a, al menos una de artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, artritis reumatoide juvenil con aparición sistémica, artritis psoriásica, espondilitis anquilosante, úlcera gástrica, artropatías seronegativas, osteoartritis, osteolisis, aflojamiento aséptico de prótesis ortopédicas, enfermedad inflamatoria del intestino, colitis ulcerativa, lupus eritematoso sistémico, síndrome antifosfolipídico, iridociclitis/uveitis/neuritis óptica, fibrosis pulmonar idiopática, vasculitis sistémica/granulomatosis de wegener, sarcoidosis, procedimientos inversos de orquitis/vasectomía, enfermedades alérgicas/atópicas, asma, rinitis alérgica, eczema, dermatitis alérgica por contacto, conjuntivitis alérgica, pneumonitis por hipersensibilidad, transplantes, rechazo al transplante de órganos, enfermedad del injerto contra el huésped, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica, síndrome de sepsis, sepsis por gram positivos, sepsis por gram negativos, sepsis con cultivo negativo, sepsis fúngica, fiebre neutropénica, urosepsis, meningococcemia, trauma/hemorragia, quemaduras, exposición a radiaciones ionizantes, pancreatitis aguda, síndrome de diestrés respiratorio del adulto, artritis reumatoide, hepatitis inducida por alcohol, patologías inflamatorias crónicas, sarcoidosis, patología de Crohn, anemia de células falciformes, diabetes, nefrosis, enfermedades atópicas, reacciones de hipersensibilidad, rinitis alérgica, fiebre del heno, rinitis perenne, conjuntivitis, endometriosis, asma, urticaria, anafalaxis sistémica, dermatitis, anemia perniciosa, enfermedad hemolítica, trombocitopenia, rechazo al injerto de cualquier órgano o tejido, rechazo al trasplante de riñon, rechazo al trasplante de corazón, rechazo al trasplante de hígado, rechazo al trasplante de páncreas rechazo al trasplante de pulmón, rechazo al trasplante de médula ósea (BMT), rechazo al aloinjerto de piel, rechazo al trasplante cartílago, rechazo al injerto de hueso, rechazo al trasplante del intestino delgado, rechazo al trasplante del timo fetal, rechazo al trasplante paratiroideo, rechazo al xenoinjerto de cualquier órgano o tejido, rechazo al aloinjerto, reacciones de hipersensibilidad contra el receptor, enfermedad de Graves, enfermedad Raynaud, diabetes resistente a la insulina tipo B, asma, miastenia gravis, citotoxicidad mediada por el anticuerpo, reacciones de hipersensibilidad tipo III, síndrome de POEMS (polineuropatía, organomegalia, endocrinopatía, gammopatía monoclonal, y síndrome de cambios en la piel), polineuropatía, organomegalia, endocrinopatía, gammopatía monoclonal, y síndrome de cambios en la piel, síndrome antifosfolipidico, pénfigo, escleroderma, enfermedad mixta del tejido conectivo, enfermedad idiopática de Addison, diabetes mellitus, hepatitis crónica activa, cirrosis biliar primaria, vitíligo, vasculitis, síndrome cardiotomía post-MI, hipersensibilidad tipo IV, dermatitis por contacto, pneumonitis por hipersensibilidad, rechazo al aloinjerto, granulomas debidos a organismos intracelulares, sensibilidad a los fármacos, metabólica/idiopática, enfermedad de Wilson, hemacromatosis, deficiencia de alfa-1 -antitripsina, retinopatía diabética, tiroiditis de hashimoto, osteoporosis, evaluación del eje hipotálamico-pituitario-adrenal, cirrosis biliar crónica, tiroiditis, encefalomielitis, caquexia, fibrosis quística, enfermedad pulmonar neonatal crónica, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD), linfohistiocitosi hematofagocítica familiar, afecciones dermatológicas, psoriasis, alopecia, síndrome nefrótico, nefritis, nefritis glomerular, fallo renal agudo, hemodiálisis, uremia, toxicidad, preclampsia, terapia con okt3, terapia anti-cd3, terapia con citocina, quimioterapia, terapia con radiación (por ejemplo, que incluye pero no se limitan a, astenia, anemia, caquexia, y similares), intoxicación crónica con salicilato, y similares. Ver, por ejemplo, el Merck Manual, 12.°-17.c ediciones, Merck & Company, Rahway, NJ (1972, 1977, 1982, 1987, 1992, 1999), Pharmacotherapy Handbook, Wells y otros, eds., segunda edición, Appleton and Lange, Stamford, Conn. (1998, 2000), cada una incorporada completamente como referencia.

La presente invención proporciona, además, un método para modular o tratar al menos una enfermedad cardiovascular en una célula, tejido, órgano, animal, o paciente, que incluye, pero no se limita a, al menos uno de síndrome de miocardio atontado, infarto del miocardio, insuficiencia cardiaca congestiva, apoplejía, apoplejía isquémica, hemorragia, síndrome coronario agudo, arteriesclerosis, aterosclerosis, restenosis, enfermedad ateriosclerótica diabética, hipertensión, hipertensión arterial, hipertensión renovascular, síncope, choque, sífilis del sistema cardiovascular, fallo cardíaco, cor pulmonale, hipertensión pulmonar primaria, arritmia cardiaca, latidos ectópicos auriculares, aleteo auricular, fibrilación auricular, (sostenida o paroxismal), síndrome post perfusión, respuesta inflamatoria a la derivación coronaria cardiopulmonar, taquicardia auricular caótica o multifocal, taquicardia QRS estrecha regular, arritmias específicas, fibrilación ventricular, arritmias del haz de His, bloqueo atrioventricular, bloqueo de la rama del haz, trastorno isquémico del miocardio, enfermedad de la arteria coronaria, angina de pecho, infarto del miocardio, cardiomiopatía cardiomiopatía congestiva dilatada, cardiomiopatía restrictiva, enfermedades valvulares del corazón, endocarditis, enfermedad pericardial, tumores cardiacos, aneurismas aóticos y periféricos, disección aórtica, inflamación de la aorta, oclusión de la aorta abdominal y sus ramificaciones, trastornos vasculares periféricos, trastornos arteriales oclusivos, enfermedad aterlosclerótica periférica, tromboangeitis obliterante, trastornos funcionales de las arterias periféricas, enfermedad y fenómeno de Raynaud, acrocianosis, eritromelalgia, enfermedades venosas, trombosis venosa, venas varicosas, fístula arteriovenosa, linfederma, lipedema, angina inestable, lesión por reperfusión, síndrome post bomba, lesión por isquemia-reperfusión, y similares. Tal método puede comprender, opcionalmente, administrar una cantidad efectiva de una composición o composición farmacéutica que comprende al menos un supercóntigo de proteínas a una célula, tejido, órgano, animal o paciente que necesita de tal modulación, tratamiento o terapia.

La presente invención proporciona, además, un método para modular o tratar al menos una enfermedad infecciosa en una célula, tejido, órgano, animal o paciente, que incluye, pero no se limita a, al menos una de: infección bacteriana aguda o crónica, procesos parasíticos o infecciosos agudos y crónicos, que incluyen infecciones bacterianas, virales y fúngicas, infección por HlV/neuropatía por HIV, meningitis, hepatitis (por ejemplo, A, B o C, o similares), artritis séptica, peritonitis, pneumonía, epiglotitis, e. coli 0157:h7, síndrome urémico hemolítico/púrpura trombótica trombocitopénica, malaria, fiebre por dengue hemorrágico, leishmaniasis, lepra, síndrome de choque tóxico, miositis estreptococica, gangrena gaseosa, tuberculosis por mycobacterium, mycobacterium aviar intracelular, neumonía por pneumocystis carinii, enfermedad inflamatoria pélvica, orquitis/epididimitis, legionela, enfermedad de Lyme, influenza a, virus epstein-barr, síndrome hemafagocítico viral asociado, encefalitis viral/meningitis aséptica, y similares.

La presente invención proporciona, además, un método para modular o tratar al menos una enfermedad maligna en una célula, tejido, órgano, animal o paciente, que incluye, pero no se limita a, al menos una de: leucemia, leucemia aguda, leucemia línfoblástica aguda (ALL), leucemia linfocítica aguda, célula-B, célula-T o FAB ALL, leucemia mieloide aguda (AML), leucemia mielógena aguda, leucemia mielocítica crónica (CML), leucemia linfocítica crónica (CLL), leucemia de células pilosas, síndrome mielodisplásico (MDS), un linfoma, enfermedad de Hodgkin, un linfoma maligno, linfoma de no hodgkin, linfoma de Burkitt, mieloma múltiple, sarcoma de Kaposi, carcinoma colorectal, carcinoma pancreático, carcinoma nasofaríngeo, histiocitosis maligna, síndrome paraneoplásíco/hipercalcemia de malignidad, tumores sólidos, cáncer de vejiga, cáncer de mamas, cáncer colorectal, cáncer del endometrio, cáncer de cabeza, cáncer de cuello, cáncer sin poliposis hereditario, linfoma de Hodgkin, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de ovario, cáncer pancreático, cáncer de próstata, carcinoma de células renales, cáncer testicular, adenocarcinomas, sarcomas, melanoma maligno, hemangioma, enfermedad metastásica, resorción ósea relacionada con el cáncer, dolor óseo relacionado con el cáncer, y similares.

La presente invención proporciona, además, un método para modular o tratar al menos una enfermedad neurológica en una célula, tejido, órgano, animal o paciente, que incluye, pero no se limita a, al menos una de: enfermedades neurodegenerativas, esclerosis múltiple, cefaleas migrañosas, complejo demencia SIDA, enfermedades desmielinazantes, tales como esclerosis múltiple y mielitis transversa aguda; trastornos extrapiramidales y cerebelares, tales como lesiones del sistema corticoespinal; trastornos de los ganglios básales; trastornos de movimiento hipercinético, tales como Corea de Huntington y corea senil; trastornos de movimiento inducido por fármacos, tales como los inducidos por fármacos que bloquean los receptores de dopamina del CNS; trastornos de movimiento hipocinéticos, tales como enfermedad de Parkinson; parálisis supranuclear progresiva; lesiones estructurales del cerebelo; degeneraciones espinocerebelares, tales como ataxia espinal, ataxia de Friedreich, degeneraciones cortical cerebelosas, degeneraciones de sistemas múltiples (Mencel, Dejerine-Thomas, Shi-Drager, y Machado-Joseph); trastornos sistémicos (enfermedad de Refsum, abetalipoprotemia, ataxia, telangiectasia, y trastorno del multi-sistema mitocondrial); trastornos del núcleo desmielinizantes, tales como esclerosis múltiple, mielitis transversa aguda; y trastornos de la unidad motora, tales como atrofias musculares neurogénicas (degeneración de las células del asta anterior, tales como esclerosis lateral amiotrófica, atrofia muscular espinal infantil y atrofia muscular espinal juvenil); enfermedad de Alzheimer; síndrome de Down en la mediana edad; enfermedad con cuerpos de Lewy difusos; demencia senil del tipo de cuerpo de Lewy; síndrome de Wemicke-Korsakoff; alcoholismo crónico; enfermedad de Creutzfeldt-Jakob; panencefalitis esclerosante subaguda, enfermedad de Hallerrorden-Spatz; demencia pugilística; lesión neurotraumática (por ejemplo, lesión de la médula espinal, lesión cerebral, conmoción, conmoción repetitiva); dolor; dolor inflamatorio; autismo; depresión; apoplejía; trastornos cognitivos; epilepsia; y similares. Tal método puede comprender, opcionalmente, administrar una cantidad efectiva de una composición o composición farmacéutica que comprende al menos un anticuerpo TNF o variante o porción específica a una célula, tejido, órgano, animal o paciente que necesita de tal modulación, tratamiento o terapia. Ver, por ejemplo, el Merck Manual, 16.° edición, Merck & Company, Rahway, NJ (1992).

La presente invención proporciona, además, un método para modular o tratar al menos una herida, trauma o lesión del tejido o afección crónica relacionada, en una célula, tejido, órgano, animal o paciente, que incluye, pero no se limita a, al menos uno de: lesión corporal o un trauma asociado con cirugía oral que incluye cirugía periodontal, extracción de dientes, tratamiento de endodoncia, inserción de implantes dentales, aplicación y uso de prótesis dentales; o en donde la herida se selecciona del grupo que consiste de heridas asépticas, heridas contusionadas, herida incisas, heridas laceradas, heridas no penetrantes, heridas abiertas, heridas penetrantes, heridas perforantes, heridas punzantes, heridas sépticas, heridas subcutáneas y de infartos; o en donde la herida se selecciona del grupo que consiste de úlceras isquémicas, úlceras por presión, fístulas, mordeduras severas, quemaduras térmicas y heridas del sitio donador; o en donde la herida es una herida aftosa, una herida traumática o una herida asociada al herpes.

Las heridas y/o úlceras se encuentran normalmente sobresalientes de la piel en una superficie de la mucosa o como un resultado de un infarto en un órgano ("apoplejía"). Una herida puede ser un resultado de un defecto o una lesión del tejido blando o de una afección subyacente. En el presente contexto, el término "piel" se refiere a la superficie más externa del cuerpo de un animal, que incluye un humano, y abarca la piel intacta o casi intacta así como una superficie de la piel herida. El término "mucosa" se refiere a la mucosa no dañada o dañada de un animal, tal como un humano, y puede ser la mucosa oral, bucal, aural, nasal, pulmonar, de los ojos, gastrointestinal, vaginal, rectal.

En el presente contexto el término "herida" denota una lesión corporal con interrupción de la integridad normal de las estructuras tisulares. El término abarca, además, los términos "llaga", "lesión", "necrosis", y "úlcera". Normalmente, el término "llaga" es u término popular de casi cualquier lesión de la piel o membranas mucosas y el término "úlcera" es un defecto local, o excavación, de la superficie de un órgano o tejido, que se produce por desprendimiento del tejido necrótico. La lesión generalmente se refiere a cualquier defecto del tejido. La necrosis se relaciona con el tejido muerto resultante de la infección, lesión, inflamación o infartos.

El término "herida" usado en el presente contexto denota cualquier herida (ver a continuación para una clasificación de las heridas) y a cualquier etapa particular en el proceso curativo, que incluye la etapa antes de que se inicie cualquier curación o aun antes de que se realice una herida específica del tipo de incisión quirúrgica (tratamiento profiláctico). Los ejemplos de heridas que pueden prevenirse y/o tratarse de acuerdos con la presente invención son, por ejemplo, heridas asépticas, heridas contusionadas, herida incisas, heridas laceradas, heridas no penetrantes (es decir, heridas en las cuales no hay disrupcion de la piel pero si hay lesión de las estructuras subyacentes), heridas abiertas, heridas penetrantes, heridas perforantes, heridas punzantes, heridas sépticas, heridas subcutáneas, etc. Los ejemplos de llagas son llagas de la cama, llagas bucales, úlceras por cromo, úlceras del herpes simple, úlceras por presión, etc. Los ejemplos de úlceras son, por ejemplo, una úlcera péptica, úlcera duodenal, úlcera gástrica, úlcera gotosa, úlcera diabética, úlcera isquémica hipertensiva, úlcera por estasis, ulcus cruris (úlcera venosa), úlcera sublingual, úlcera submucosa, úlcera sintomática, úlcera trófica, úlcera tropical, y úlcera venérea, por ejemplo, causada por gonorrea (que incluye uretritis, endocervicitis y proctitis). Las afecciones relacionadas con las heridas o llagas que pueden ser tratadas con éxito de acuerdo con la invención son quemaduras, ántrax, tétano, gangrena gaseosa, escarlatina, erisipelas, sicosis de la barba, folliculitis, impétigo contagioso, o impétigo bulloso, etc. Frecuentemente, existe un cierto traslapamiento entre el uso de los términos "herida" y "úlcera" y "herida" y "llaga" y, además, los términos se usan frecuentemente de manera aleatoria. Por lo tanto, como se mencionó anteriormente, en el presente contexto el término "herida" abarca los términos "úlcera", "lesión", "llaga" e "infarto", y los términos se usan indistintamente a menos que se indique de cualquier otra forma.

Los tipos de heridas a tratarse de acuerdo con la invención incluyen, además: (i) heridas generales, tales como, por ejemplo, heridas quirúrgicas, traumáticas, infecciosas, isquémicas, térmicas, químicas y bulosas; (ii) heridas específicas de la cavidad oral, tales como, por ejemplo, heridas post-extracción, heridas de endodoncia especialmente en relación con el tratamiento de quistes y abscesos, úlceras y lesiones de origen bacteriano, viral o autoinmunológico, heridas mecánicas, químicas, térmicas, infecciosas y liquenoide; úlceras herpéticas, estomatitis aftosa, gingivitis ulcerativa necrosante aguda y síndrome de boca ardiente son ejemplos específicos; y (iii) heridas en la piel, tales como, por ejemplo, neoplasia, quemaduras (por ejemplo, química, térmica), lesiones (bacterianas, viral, autoinmunológicas), mordeduras y incisiones quirúrgicas. Otra forma de clasificar las heridas es como (i) pequeña pérdida de tejido debido a incisiones quirúrgicas, abrasiones menores y mordeduras menores, o como (¡i) pérdida de tejido significativa. El último grupo incluye las úlceras isquémicas, úlceras por presión, fístulas, laceraciones, mordeduras severas, quemaduras térmicas y heridas del sitio donador (en tejidos blandos y duros) e infartos.

Otras heridas que son de importancia en relación con la presente invención son las heridas de tipo úlceras isquémicas, úlceras por presión, fístulas, mordeduras severas, quemaduras térmicas y heridas del sitio donador. Las úlceras isquémicas y úlceras por presión son heridas que normalmente sólo se curan muy lentamente y, especialmente en esos casos, un proceso curativo mejorado y más rápido es por supuesto de gran importancia para el paciente. Además, los costos involucrados en el tratamiento de pacientes que padecen de tales heridas son marcadamente reducidos cuando la curación se mejora y tiene lugar más rápidamente.

Las heridas del sitio donador son heridas que, por ejemplo, ocurren en relación con la eliminación de tejido duro de una parte del cuerpo a otra parte del cuerpo, por ejemplo, en relación con el transplante. Las heridas que resultan de esas operaciones son muy dolorosas y una curación mejorada es por lo tanto muy valorada. El término "piel" se usa en un sentido muy amplio y abarca la capa epidérmica de la piel y, en los casos en donde la capa de la piel está más o menos lesionada, además, la capa dérmica de la piel. Aparte del estrato córneo, la capa epidérmica de la piel es la capa exterior (epitelial) y la capa de tejido conectivo más profunda de la piel se llama dermis.

Cualquier método de la presente invención puede comprender administrar una cantidad efectiva de una composición o composición farmacéutica que comprende al menos un supercóntigo de proteínas a una célula, tejido, órgano, animal o paciente que necesita de tal modulación, tratamiento o terapia. Un método de este tipo puede comprender además, opcionalmente, la administración conjunta o terapia de combinación para tratar tales enfermedades o trastornos, en donde la administración de dicho al menos un supercóntigo de proteínas, porción o variante específica de este comprende, además, administrar, antes, concurrentemente, y/o después, al menos uno seleccionado de al menos un antagonista TNF (por ejemplo, pero sin limitarse a, un antagonista de proteína o químico de TNF, anticuerpo o fragmento monoclonal o policlonal de TNF, un receptor de TNF soluble (por ejemplo, p55, p70 o p85) o fragmento, polipéptidos de fusión de estos, o un antagonista de TNF de molécula pequeña, por ejemplo, proteína de unión al TNF I o II (TBP-1 o TBP-II), nerelimonmab, infliximab, etanercept (Enbrel™), adalimulab (Humira™), CDP-571 , CDP-870, afelimomab, lenercept, y similares), un antireumático (por ejemplo, metotrexato, auranofin, aurotioglucosa, azatioprina, tiomalato sódico de oro, sulfato de hidroxicloroquina, leflunomida, sulfasalzina), un relajante muscular, un narcótico, un fármaco antiinflammatorio no esteroide (NSAID), un analgésico, un anestésico, un sedante, un anestésico local, un bloqueador neuromuscular, un antimicrobiano (por ejemplo, aminoglucósido, un antimicótico, un antiparasitario, un antiviral, un carbapenem, cefalosporina, una flurorquinolona, un macrólido, una penicilina, una sulfonamida, una tetracíclina, otro antimicrobiano), un antisoriásico, un corticosteriode, un esteroide anabólico, un agente relacionado con la diabetes, un mineral, un nutritivo, un agente tiroideo, una vitamina, una hormona relacionada con el calcio, un antidiarreico, un antitusígeno, un antiemético, un antiulcerante, un laxante, un anticoagulante, una eritropoyetina (por ejemplo, epoetina alfa), un filgrastim (por ejemplo, G-CSF, Neupogen), un sargramostim (GM-CSF, Leukina), una inmunización, una inmunoglobulina, un inmunosupresor (por ejemplo, basiliximab, ciclosporina, daclizumab), una hormona de crecimiento, un fármaco de reemplazo hormonal, un modulador del receptor de estrógeno, un midriático, un cicloplégico, un agente alquilante, un antimetabolito, un inhibidor mitótico, un radiofarmacéutico, un antidepresivo, agente antimaníaco, un antipsicótico, un anxiolítico, un hipnótico, un simpatomimético, un estimulante, donepezil, tacrina, un medicamento para el asma, un agonista beta, un esteroide inhalado, un inhibidor del leucotrieno, una metilxantina, una cromolina, una epinefrina o análogo, dornasa alfa (Pulmozyme), una citocina o un antagonista de citocina. Las dosis adecuadas se conocen bien en la materia. Ver, por ejemplo, Wells y otros, eds., Pharmacotherapy Handbook, 2.° edición, Appleton and Lange, Stamford, CT (2000); PDR Pharmacopoeia, Tarascón Pocket Pharmacopoeia 2000, edición de lujo, Tarascón Publishing, Loma Linda, CA (2000); Nursing 2001 Handbook of Drugs, 21.° edición, Springhouse Corp., Springhouse, PA, 2001 ; Health Professional's Drug Guide 2001 , ed., Shannon, Wilson, Stang, Prentice-Hall, Inc, Upper Saddle River, NJ.cada una de estas referencias se incorpora completamente en la presente descripción como referencia.

Las citocinas incluyen cualquier citocina conocida. Ver, por ejemplo, CopewithCytokines.com. Los antagonistas de citocina incluyen, pero no se limitan a, cualquier supercóntigo de proteínas, anticuerpo, fragmento o mimético, cualquier receptor soluble, fragmento o mimético, cualquier antagonista de molécula pequeña, o cualquier combinación de estos.

Típicamente, el tratamiento de las afecciones patológicas se efectúa por administración de una cantidad efectiva o dosificación de al menos una composición de supercóntigo de proteínas en total, en promedio, en un intervalo de al menos aproximadamente 0.01 a 500 miligramos de al menos un supercóntigo de proteínas por kilogramo del paciente por dosis y, preferentemente, de al menos aproximadamente 0.1 a100 miligramos del supercóntigo de proteínas/kilogramo del paciente por administración única o múltiple, dependiendo de la actividad específica del agente activo contenido en la composición. Alternativamente, la concentración efectiva en suero puede comprender una concentración en suero de 0.1-5000 íg/ml por administración única o múltiple. Las dosifiacciones adecuadas son conocidas por los profesionales médicos y dependerá, por supuesto, del estado particular de la enfermedad, la actividad específica de la composición a administrar, y el tratamiento particular a que se somete al paciente. En algunos casos, para alcanzar la cantidad terapéutica deseada, puede ser necesario proporcionar la administración repetida, es decir, administraciones individuales repetidas de una dosis medida o monitoreada particular, en donde las administraciones individuales se repiten hasta que se alcanza la dosis diaria o el efecto deseado.

Las dosis preferidas pueden incluir, opcionalmente, aproximadamente 0.1-99 y/o 100-500 mg/kg/administración, o cualquier intervalo, valor o fracción de este, o alcanzar una concentración en suero de aproximadamente 0.1-5000 íg/ml concentración en suero por administración única o múltiple, o cualquier intervalo, valor o fracción de este. Un intervalo de dosificación preferido para el supercóntigo de proteínas de la presente invención es de aproximadamente 1 mg/kg, hasta aproximadamente 3, aproximadamente 6 o aproximadamente 12 mg/kg de peso corporal del paciente.

Alternativamente, la dosificación administrada puede variar dependiendo de factores conocidos, tales como las características farmacodinámicas del agente particular, y su modo y ruta de administración; edad, salud, y peso del receptor; naturaleza y extensión de los síntomas, tipo de tratamiento concurrente, frecuencia de tratamiento, y el efecto deseado. Usualmente una dosificación del ingrediente activo puede ser aproximadamente 0.1 a 100 miligramos por kilogramo de peso corporal. Normalmente, 0.1 a 50 y, preferentemente, 0.1 a 10 miligramos por kilogramo por administración o en forma de liberación sostenida es efectiva para obtener resultados deseados.

Como un ejemplo no limitante, el tratamiento de humanos o animales puede proporcionarse como una dosificación una vez o periódica de al menos un supercóntigo de proteínas de la presente invención aproximadamente 0.1 a 100 mg/kg o cualquier intervalo, valor o fracción de este por día, en al menos uno de 1-40 días o, alternativamente o además, al menos uno de 1-52 semanas o, alternativamente o además, al menos uno de 1-20 años, o cualquier combinación de estos, por medio del uso de dosis por infusión o repetidas, únicas.

Las formas de dosificación (composición) adecuadas para administración interna contienen, generalmente, de aproximadamente 0.001 miligramo a aproximadamente 500 miligramos de ingrediente activo por unidad o contenedor. En estas composiciones farmacéuticas el ingrediente activo estará presente, normalmente, en una cantidad de aproximadamente 0.5-99.999 % en peso basado en el peso total de la composición.

Para la administración parenteral, el supercóntigo de proteínas puede formularse como una solución, suspensión, emulsión, partícula, polvo, o polvo liofilizado en una asociación, o proporcionado separadamente, con un vehículo parenteral farmacéuticamente aceptable. Los ejemplos de esos vehículos son agua, solución salina, solución de Ringer, solución de dextrosa, y aproximadamente 1 -10 % albúmina sérica humana. Pueden usarse los liposomas y vehículos no acuosos, tales como los aceites fijos. El vehículo o polvo liofilizado puede contener aditivos que mantiene la isotonicidad (por ejemplo, cloruro sódico, manitol) y la estabilidad química (por ejemplo, amortiguadores y conservantes). La formulación se esteriliza por técnicas conocidas o adecuadas.

Los portadores farmacéuticos adecuados se describen en la edición más reciente de Remington's Pharmaceutical Sciences, A. Osol, un texto de referencia estándar en este campo.

Administración alternativa Se pueden usar muchos modos desarrollados y conocidos de acuerdo con la presente invención para administrar cantidades farmacéuticamente efectivas de al menos un supercóntigo de proteínas de acuerdo con la presente invención. Aunque en la siguiente descripción se usa la administración pulmonar, otros modos de administración se pueden usar de acuerdo con la presente invención con resultados adecuados. Los supercóntigos de proteínas de la presente invención pueden entregarse en un portador, como una solución, emulsión, coloide, o suspensión, o como un polvo seco, mediante el uso de cualquiera de una variedad de dispositivos y métodos adecuados para la administración por inhalación u otros modos descritos aquí o conocidos en la materia.

Formulaciones parenterales y administración Las formulaciones para la administración parenteral pueden contener como excipientes comunes agua estéril o solución salina, glicol de polialquileno, tales como polietilenglicol, aceites de origen vegetal, naftalenos hidrogenados y similares. Las suspensiones acuosas u oleosas para inyección se pueden preparar por medio del uso de un emulsionante adecuado o humidificador y un agente de suspensión, de acuerdo con los métodos conocidos. Los agentes para inyección pueden ser un agente de dilución no tóxico, que no se administra oralmente, tal como solución acuosa, una solución inyectable estéril o suspensión en un solvente. Como el vehículo o solvente usable, se permite el agua, solución de Ringer, solución salina isotónica, etc.; como un solvente normal o solvente de suspensión, se puede usar el aceite no volátil estéril. Para estos propósitos, cualquier tipo de aceite no volátil y ácido graso se puede usar, e incluyen, aceite graso o ácido graso natural o sintético o semisintético; mono- o di- o tri-glicéridos naturales o sintéticos o semisintéticos. La administración parental se conoce en la materia e incluye, pero no se limitan a, medios convencionales de inyección, un dispositivo de inyección sin aguja presurizado con gas como se describe en la patente de los Estados Unidos núm. 5,851 ,198, y un dispositivo perforador láser como se describe en la patente de los Estados Unidos núm. 5,839,446 incorporados completamente en la presente como referencia.

Entrega alternativa La invención se refiere, además, a la administración de al menos un supercóntigo de proteínas por medio parenteral, subcutáneo, intramuscular, intravenoso, intraarticular, intrabronquial, intraabdominal, intracapsular, intracartilaginoso, intracavidad, intracelial, intracerebral, intracerebroventricular, intracólico, intracervical, intragástrico, intrahepático, intramiocárdico, intraosteal, intrapélvico, intrapericardiaco, intraperitoneal, ¡ntrapleural, intraprostático, intrapulmonar, intrarrectal, intrarrenal, intrarretinal, intraespinal, intrasinovial, intratorácico, intrauterino, intravesical, intralesional, bolo, vaginal, rectal, bucal, sublingual, intranasal, o transdérmico. Al menos una composición de supercóntigo de proteínas se puede preparar para su uso para la administración parenteral (subcutánea, intramuscular o intravenosa) o cualquier otra administración, particularmente en forma de soluciones o suspensiones líquidas; para su uso en administración vaginal o rectal, particularmente en formas semísólidas tal como, pero sin limitarse a, cremas y supositorios; para administración oral o sublingual tal como, pero sin limitarse a, en forma de tabletas o cápsulas; o por vía intranasal tal como, pero sin limitarse a, la forma de polvo, gotas nasales o aerosoles o ciertos agentes; o por vía transdérmica tal como, pero sin limitarse a, un gel, pomada, loción, suspensión o sistema de entrega de parche potenciadores químicos tal como sulfóxido de dimetilo para modificar la estructura de la piel o para aumentar la concentración del fármaco en el parche transdérmico (Junginger, y otros. En "Drug Permeation Enhancement;" Hsieh, D. S., Eds., págs. 59-90 (Marcel Dekker, Inc. Nueva York 1994, incorporado completamente en la presente descripción como referencia), o con agentes oxidantes que permiten la aplicación de formulaciones que contienen proteínas y péptidos sobre la piel (patente núm. WO 98/53847), o aplicaciones de campos eléctricos para crear rutas de transporte transitorias, tales como electroporación, o para aumentar la movilidad de los fármacos cargados a través de la piel, tales como iontoforesis, o aplicación de ultrasonido, tal como sonoforesis (patentes de los Estados Unidos núms. 4,309,989 y 4,767,402) (las patentes y publicaciones anteriores se incorporan totalmente en la presente descripción como referencia).

Administración pulmonar/nasal Para la administración pulmonar, preferentemente, al menos una composición de supercóntigo de proteínas se entrega en un tamaño de partículas efectivo para alcanzar las vías respiratorias inferiores del pulmón o los senos. De acuerdo con la invención al menos un supercóntigo de proteínas puede entregarse por cualquiera de una variedad de dispositivos de inhalación o nasales conocidos en la materia para la administración de un agente terapéutico por inhalación. Estos dispositivos capaces de depositar las formulaciones en aerosol en la cavidad sinusal o alveolos de un paciente incluyen inhaladores de dosis medida, nebulizadores, generadores de polvo seco, rociadores, y similares. Otros dispositivos adecuados para dirigir la administración pulmonar o nasal del supercóntigo de proteínas se conocen, además, en la materia. Todos esos dispositivos pueden usar formulaciones adecuadas para la administración para suministrar el supercóntigo de proteínas en un aerosol. Tales aerosoles pueden estar compuestos de soluciones (acuosas y no acuosas) o partículas sólidas.

Los inhaladores de dosis medida como el inhalador de dosis medida Ventolín® usan, típicamente, un gas propelente y requieren de la activación durante la inspiración (Ver, por ejemplo, patentes núms. WO 94/16970, WO 98/35888). Los inhaladores de polvo seco como el Turbuhaler™ (Astra), Rotahaler® (Glaxo), Diskus® (Glaxo), inhalador Spiros™ (Dura), dispositivos comercializados por Inhale Therapeutics, y el inhalador de polvo Spinhaler® (Fisons) usan la activación de la respiración de un polvo mezclado (patente de los Estados Unidos núm. 4668218 Astra, núm. patente EP 237507 Astra, patente núm. WO 97/25086 Glaxo, patente núm. WO 94/08552 Dura, patente de los Estados Unidos núm. 5458135 Inhale, patente núm. WO 94/06498 Fisons, incorporados completamente en la presente descripción como referencia). Los nebulizadores como AERx™ Aradigm, el nebulizador Ultravent® (Mallinckrodt), y el nebulizador Acorn II® (Marquest Medical Products) (patente de los Estados Unidos núm. 5404871 Aradigm, patente núm. WO 97/22376), las referencias anteriores se incorporan completamente en la presente descripción como referencia, producen aerosoles de soluciones, mientras que los inhaladores de dosis medida, inhaladores de polvo seco, etc. generan aerosoles de partículas pequeñas. Estos ejemplos específicos de dispositivos de inhalación comercialmente disponibles pretender ser representativos de los dispositivos específicos adecuados para la práctica de esta invención, y no pretenden limitar el alcance de la invención.

Preferentemente, una composición que comprende al menos un supercóntigo de proteínas se entrega por un inhalador de polvo seco o un rociador. Estos son varias características deseables de un dispositivo de inhalación para la administración de al menos un supercóntigo de proteínas de la presente invención. Por ejemplo, el suministro por medio de un dispositivo de inhalación es ventajosamente fiable, reproducible, y preciso. El dispositivo de inhalación puede suministrar, opcionalmente, partículas secas pequeñas, por ejemplo, menores que aproximadamente 10 µ?t?, preferentemente, aproximadamente 1-5 µ?t?, para una buena respiración. Administración de composiciones de supercóntigo de proteínas como un aerosol Un rocío que incluye la composición del supercóntigo de proteínas se puede producir al forzar una suspensión o solución de al menos un supercóntigo de proteínas a través de una tobera bajo presión. El tamaño y configuración de la tobera, la presión aplicada, y la velocidad de alimentación del líquido se pueden escoger para alcanzar el salida y el tamaño de partícula. Un electro-rociado se puede producir, por ejemplo, por un campo eléctrico en relación con una alimentación capilar o por tobera. Ventajosamente, las partículas de al menos una composición de supercóntigo de proteínas que se suministra por medio de un rociador tiene un tamaño de partículas menor que aproximadamente 10 pm, preferentemente, en el intervalo de aproximadamente 1 µ?t? a aproximadamente 5 pm y, con la máxima preferencia, aproximadamente 2 pm a aproximadamente 3 pm.

Las formulaciones de al menos una composición de supercóntigo de proteínas adecuada para su uso con un rociador incluye, típicamente, la composición de supercóntigo de proteínas en una solución acuosa a una concentración de aproximadamente 0.1 mg a aproximadamente 100 mg de al menos una composición de supercóntigo de proteínas por mi de solución o mg/gm, o cualquier intervalo, valor o fracción de estos. La formulación puede incluir agentes, tales como, un excipiente, un amortiguador, un agente de isotonicidad, un conservante, un surfactante y, preferentemente, cinc. La formulación puede incluir, además, un excipiente o agente para la estabilización de la composición de supercóntigo de proteínas, tal como, un amortiguador, un agente reductor, una proteína en volumen, o un carbohidrato. Las proteínas en volumen útiles para la formulación de composiciones de supercóntigo de proteínas incluyen albúmina, protaminas, o similares. Los carbohidratos útiles para la formulación dé las composiciones de supercóntigo de proteínas incluyen sacarosa, manitol, lactosa, trehalosa, glucosa, o similares. La formulación de la composición del supercóntigo de proteínas puede incluir, además, un surfactante, que puede reducir o prevenir la agregación inducida por la superficie de la composición de supercóntigo de proteínas causada por la atomización de la solución en la formación de un aerosol. Varios surfactantes convencionales pueden emplearse, tales como ésteres de ácido graso de polioxietileno y alcoholes, y ésteres de ácido graso de polioxietileno sorbitol. Las cantidades se encontrarán generalmente en el intervalo entre 0.001 y 14 % en peso de la formulación. Los surfactantes especialmente preferidos para los propósitos de esta invención son monooleato de polioxietileno sorbitán, polisorbato 80, polisorbato 20, o similares. Los agentes adicionales conocidos en la materia para la formulación de una proteina, tal como supercóntigos de proteínas, o porciones o variantes específicas, pueden incluirse, además, en la formulación.

Administración de las composiciones de supercóntiqo de proteínas por medio de un nebulizador Las composiciones de supercóntigo de proteínas de la invención pueden administrarse por medio de un nebulizador, tal como nebulizador de chorro o un nebulizador ultrasónico. Típicamente, en un nebulizador de chorro se usa una fuente de aire comprimido para crear un chorro de aire a alta velocidad a través de un orificio. Como el gas se expande más allá de la tobera, se crea una región de baja presión, la cual tira la solución de la composición de supercóntigo de proteínas a través de un tubo capilar conectado a un reservorio líquido. La corriente líquida del tubo capilar se divide en filamentos inestables y gotitas cuando sale del tubo, y crea el aerosol. Un intervalo de configuraciones, régimen de flujo, y tipos tabique pueden emplearse para alcanzar las características de rendimiento deseadas de un nebulizador de chorro dado. En un nebulizador ultrasónico la energía eléctrica de alta frecuencia se usa para crear energía mecánica, vibratoria, típicamente al emplear un transductor piezoeléctrico. Esta energía se transmite a la formulación de la composición de supercóntigo de proteínas directamente o a través de un fluido de acoplamiento, y crea un aerosol que incluye la composición de supercóntigo de proteínas. Ventajosamente, las partículas de la composición de supercóntigo de proteínas que se entrega por un nebulizador tiene un tamaño de partículas menor que aproximadamente 10 µ?t?, preferentemente, en el intervalo de aproximadamente 1 pm a aproximadamente 5 pm y, con la máxima preferencia, aproximadamente 2 pm a aproximadamente 3 pm.

Las formulaciones de al menos un supercóntigo de proteínas adecuadas para su uso con un nebulizador, en chorro o ultrasónico incluye, típicamente, una concentración de aproximadamente 0.1 mg a aproximadamente 100 mg de al menos un supercóntigo de proteínas por mi de solución. La formulación puede incluir agentes tales como un excipiente, un amortiguador, un agente de isotonicidad, un conservante, un surfactante y, preferentemente, cinc. La formulación puede incluir, además, un excipiente o agente para la estabilización de la al menos una composición de supercóntigo de proteínas, tal como un amortiguador, un agente reductor, una proteína en volumen, o un carbohidrato. Las proteínas en volumen útiles para la formulación de al menos una de las composiciones de supercóntigo de proteínas incluyen albúmina, protaminas, o similares. Los carbohidratos típicos útiles para la formulación de al menos un supercóntigo de proteínas incluyen sacarosa, manitol, lactosa, trehalosa, glucosa, o similares. La al menos una formulación de supercóntigo de proteínas puede incluir, además, un surfactante, que puede reducir o prevenir la agregación inducida por la superficie de al menos un supercóntigo de proteínas causada por la atomización de la solución en la formación de un aerosol. Varios surfactantes convencionales pueden emplearse, tales como ésteres de ácido graso de polioxietileno y alcoholes, y ésteres de ácido graso de polioxietileno sorbitol. Las cantidades se encontrarán, generalmente, en el intervalo entre aproximadamente 0.001 y 4 % en peso de la formulación. Los surfactantes especialmente preferidos para los propósitos de esta invención son monooleato de polioxietileno sorbitán, polisorbato 80, polisorbato 20, o similares. Los agentes adicionales conocidos en la materia para la formulación de una proteína, tal como supercóntigo de proteínas pueden incluirse, además, en la formulación.

Administración de composiciones de supercóntigo de proteínas por medio de un inhalador de dosis medida En un inhalador de dosis medida (MDI), un propulsor, al menos un supercóntigo de proteínas, y cualquier excipiente u otros aditivos están contenidos en un bote como una mezcla que incluye un gas comprimido licuado. La activación de la válvula dosificadora libera la mezcla como un aerosol, preferentemente, que contiene partículas en el intervalo de tamaño de menor que aproximadamente 10 pm, preferentemente, aproximadamente 1 pm a aproximadamente 5 pm y, con la máxima preferencia, aproximadamente 2 µ?t? a aproximadamente 3 pm. El tamaño de partículas de aerosol deseado puede obtenerse al emplear una formulación de la composición de supercóntigo de proteínas que se produce por varios métodos conocidos por aquellos experimentados en la materia, que incluyen, molienda por chorro, secado por aspersión, condensación en el punto crítico, o similares. Los inhaladores de dosis medida preferidos incluyen los fabricados por 3 o Glaxo y emplean un propulsor de hidrofluorocarbono. Las formulaciones de al menos un supercóntigo de proteínas para ser usadas con un dispositivo inhalador de dosis medida incluirán, generalmente, un polvo finamente dividido que contiene al menos un supercóntigo de proteínas como una suspensión en un medio no acuoso, por ejemplo, suspendido en un propulsor con la ayuda de un surfactante. El propulsor puede ser cualquier material convencional empleado para este propósito, tal como clorofluocarbono, un hidroclorofluorocarbono, un hidrofluorocarbono, o un hidrocarburo, que incluye triclorofluometano, diclorodifluometano, diclorotetrafluoroetanol y 1 ,1 ,1 ,2-tetrafluoroetano, HFA-134a (hidrofluroalcano-134a), HFA-227 (hidrofluroalcano-227), o similares. Preferentemente, el propulsor es un hidrofluorocarbono. El surfactante puede seleccionarse para estabilizar el al menos un supercóntigo de proteínas como una suspensión en el propulsor, para proteger el agente activo contra la degradación química, y similares. Los surfactantes adecuados incluyen trioleato de sorbitán, lecitina de soya, ácido oléico, o similares. En algunos casos se prefieren los aerosoles en solución que usan solventes, tal como etanol. Los agentes adicionales conocidos en la materia para la formulación de una proteína pueden incluise, además, en la formulación. El experto en la materia reconocerá que los métodos de la actual invención pueden alcanzarse por administración pulmonar de al menos una composición de supercóntigo de proteínas a través de dispositivos no descritos en la presente descripción.

Formulaciones orales y administración Las formulaciones para la administración oral dependen de los adyuvantes de administración conjunta (por ejemplo, resorcinoles y surfactantes no iónicos, tales como éter de polioxietileno oleílo y éter de n-hexadecilpolietileno) para aumentar artificialmente la permeabilidad de las paredes intestinales, así como la administración conjunta de inhibidores enzimáticos (por ejemplo, inhibidores tripsina pancreática, diisopropilfluorofosfato (DFF) y trasilol) para inhibir la degradación enzimática. Las formulaciones para la entrega de agentes hidrófilos que incluyen proteínas y supercóntigo de proteínas y una combinación de al menos dos surfactantes que se usan para la administración oral, bucal, mucosa, nasal, pulmonar, vaginal transmembrana, o rectal se enseñan en la patente de los Estados Unidos núm. 6,309,663. El compuesto constituyente activo de la forma de dosificación tipo sólida para la administración oral pueden mezclarse con al menos un aditivo, que incluye sacarosa, lactosa, celulosa, manitol, trehalosa, rafinosa, maltitol, dextrano, almidones, agar, arginatos, quitinas, quitosanas, pectinas, goma de tragacanto, goma arábiga, gelatina, colágeno, caseína, albúmina, polímero sintético o semisintético, y glicérido. Esas formas de dosificación pueden contener, además, otros tipos de aditivos, por ejemplo, agente de dilución inactivo, lubricante, tal como estearato magnésico, parabén, agente conservante, tales como ácido sórbico, ácido ascórbico,.alfa.-tocoferol, antioxídante tal como cisteína, desintegrador, aglutinante, espesador, agente amortiguador, agente edulcorante, agente aromatizante, agente perfumante, etc.

Las tabletas y pildoras pueden procesarse, además, en preparaciones de recubrimiento entérico. Las preparaciones líquidas para la administración oral incluyen preparaciones en emulsión, jarabe, elixires, suspensión y solución permitidas para uso médico. Estas preparaciones pueden contener agentes de dilución inactivos normalmente usados en dicho campo, por ejemplo, agua. Los liposomas se han descrito como sistemas de entrega defármacos para la insulina y heparina (patente de Estados Unidos núm. 4,239,754). Más recientemente, las microesferas de polímeros artificiales de aminoácidos mixtos (proteínaoides) se han usado para entregar los productos farmacéuticos (patente de Estados Unidos núm. 4,925,673). Además, los compuestos portadores descritos en la patente de los Estados Unidos núm. 5,879,681 y la patente de los Estados Unidos núm. 5,5,871 ,753 y que se usan para suministrar agentes biológicamente activos oralmente son conocidos en la materia.

Formulaciones mucosas y administración Una formulación para la administración oral de un agente bioactivo encapsulado en uno o más excipientes de polímero o copolímero biocompatible, preferentemente, un polímero o copolimero biodegradable, que proporciona microcápsulas las cuales debido al tamaño adecuado de las microcápsulas resultantes resulta en el agente que llega y es absorbido por los folículos linfáticos agregados, de otra forma conocidos como el "parche de Peyer", o "GALT" del animal sin pérdidas de efectividad debido a que el agente pasa a través del tracto gastrointestinal. Folículos linfáticos agregados similares pueden encontrarse en los tubo bronquiales (BALT) y el intestino grueso. Los tejidos anteriormente-descritos se conocen, generalmente, como tejidos linforeticulares asociados a la mucosa (MALT). Por la absorción a través de las superficies de la mucosa, las composiciones y métodos para administrar al menos un supercóntigo de proteínas incluyen una emulsión que comprende una pluralidad de partículas submicrónicas, una macromolécula mucoadhesiva, un péptido bioactivo, y una fase acuosa continua, la que promueve la absorción través de las superficies de la mucosa al lograr la mucoadhesión de las partículas de la emulsión (patente de Estados Unidos núm. 5,514,670). Las superficies mucosas adecuadas para la aplicación de las emulsiones de la presente invención pueden incluir rutas de administración cornea, conjuntiva, bucal, sublingual, nasal, vaginal, pulmonar, estomacal, intestinal, y rectal. Las formulaciones para la administración vaginal o rectal, por ejemplo, supositorios, pueden contener como excipientes, por ejemplo, polialquilenglicoles, vaselina, manteca de cacao, y similares. Las formulaciones para la administración intranasal pueden ser sólidas y contienen como excipientes, por ejemplo, lactosa o pueden ser soluciones acuosas u oleosas de gotas nasales. Para la administración bucal, los excipientes incluyen azúcares, estearato calcico, estearato magnésico, almidón pregelinatinizado, y similares (patente de Estados Unidos núm. 5,849,695).

Formulaciones transdérmicas y administración Para la administración transdérmica, el al menos un supercóntigo de proteínas se encapsula en un dispositivo de entrega, tal como un liposoma o nanoparticulas poliméricas, micropartículas, microcápsula, o microesferas (mencionadas colectivamente como micropartículas a menos que se declare de cualquier otra forma). Se conoce un número de dispositivos adecuados que incluyen micropartículas preparadas de polímeros sintéticos, tales como ácidos polihidroxi, tales como ácido poliláctico, ácido poliglicólico y copolimero de estos, poliortoésteres, polianhídridos, y polifosfacenos, y polímeros naturales, tales como colágeno, ácido poliamino, albúmina y otras proteínas, alginato y otros polisacáridos, y combinaciones de estos (patente de Estados Unidos núm. 5,814,599).

Administración prolongada y formulaciones Puede desearse suministrar los compuestos de la presente invención al sujeto durante períodos prolongados de tiempo, por ejemplo, por períodos de una semana a un año a partir de una administración única. Pueden usarse varias formas de dosificación de liberación lenta, depósito o implante. Por ejemplo, una forma de dosificación puede contener una sal no tóxica farmacéuticamente aceptable de los compuestos que tiene un grado de solubilidad inferior en fluidos corporales, por ejemplo, (a) una sal acida de adición con un ácido polibásico, tal como ácido fosfórico, ácido sulfúrico, ácido cítrico, ácido tartárico, ácido tánico, ácido pamoico, ácido algínico, ácido poliglutámico, ácidos naftaleno mono- o di-sulfónico, ácido poligalacturónico, y similares; (b) una sal con un catión metálico polivalente, tal como cinc, calcio, bismuto, bario, magnesio, aluminio, cobre, cobalto, níquel, cadmio y similares, o con un catión orgánico formado a partir de, por ejemplo, ?,?'-dibencilo-etilendíamina o etilendiamina; o (c) combinaciones de (a) y (b), por ejemplo, una sal de tanato de cinc. Además, los compuestos de la presente invención o, preferentemente, una sal relativamente insoluble, tal como las que se acaban de describir, pueden formularse en un gel, por ejemplo, un gel de monoestearato alumínico con, por ejemplo, aceite de sésamo, adecuado para inyección. Las sales particularmente preferidas son las sales de cinc, sales de tanato de cinc, sales de pamoato, y similares. Otro tipo de formulación de depósito de liberación lenta para inyección podría contener el compuesto o sal dispersa para encapsulación en un polímero de degradación lenta, no tóxico, no antigénico, tal como un ácido poliláctico/ácido poliglicólico, por ejemplo, como se describe en la patente de los Estados Unidos núm. 3,773,919. Los compuestos o, preferentemente, las sales relativamente insolubles, tales como las descritas anteriormente, pueden formularse, además, en comprimidos silásticos con matriz de colesterol, particularmente para su uso en animales. Las formulaciones de liberación lenta, depósito o implante adicionales, por ejemplo, liposomas gaseosos o líquidos, se conocen en la literatura (patente de Estados Unidos núm. 5,770,222 y "Sustained and Controlled Reléase Drug Delivery Systems", J. R. Robínson ed., Marcel Dekker, Inc., N.Y., 1978).

Habiendo descrito la invención generalmente, la misma será comprendida más fácilmente con referencia a los siguientes ejemplos, los que se proporcionan a modo de ilustración y no se consideran limitantes.

Ejemplos Ejemplo 1. Diseño de Fibcon El 10.° dominio FN3 de fibronectina humana (SEQ ID NO: 10) ha sido explotado como un supercóntigo alternativo capaz de modificarse para unirse a moléculas objetivo específicas a través de los lazos expuestos a la superficie estructuralmente análogos a las regiones determinantes de complementaridad del anticuerpo (CDR), mencionados como los lazos B:C, D:E, y F:G (Figura 1) (Koide, y otros, J Mol Biol 284: 1141-51 , 1998). La proteína fibronectina contiene otros 14 dominios FN3 independientemente plegados, todos los que se predijeron para adoptar un pliegue similar al 10.° dominio FN3 basado en la similitud de secuencia (SEQ ID NO: 1-9, 1 1-15). Claramente, la conservación estructural para vario de estos dominios se confirmó por las estructuras de alta resolución de los dominios FN3 de fibronectina 1 , 7, 8, 9, 10, 12, 13, y 14 (Vakonakis, y otros, Embo J 26: 2575-83, 2007; Leahy, y otros, Cell 84: 155-64, 1996; Sharma, y otros, Embo J 18; 1468-79, 1999). Para confirmar que los 15 dominios pueden formar unidades independientemente plegadas, las secuencias génicas que codifican cada dominio se obtuvieron por amplificación PCR a partir de una fuente de ADNc humano universal (Biochain Institute Inc. (Hayward, CA)) por medio del uso de métodos PCR estándar, subclonado en un vector pET15 modificado (Novagen), transformado en BL21Star(DE3) E. coli (Invitrogen) y colocado en placas de agar LB que contienen 75 íg/ml de carbenicilina. Los nucleótidos que codifican para una etiqueta de polihistidina 6X se añadieron al extremo del terminal C de cada gen durante la etapa PCR. El dominio 7 de FN3 no fue capaz de clonarse exitosamente a partir de esta fuente y, por lo tanto, no se incluyó en el análisis presentado aquí. Para cada constructo se tomó una sola colonia y se cultivó toda la noche a 37 °C en 50 mi del medio TB media que contiene 2 % glucosa y 100 íg/ml de carbenicilina. Este cultivo se usó para sembrar 500 mi del medio de autoinducción (medio TB Overnight Express Instant, Novagen) en un matraz de 2.5 I Ultra Yield (Thomson Instrument Company). El crecimiento y expresión se realizó por medio del uso de un programa doble (3 horas a 37 °C, 300 rpm, seguido por 16 horas a 30 °C, 250 rpm) en un incubador con agitación ATR Multitron.

El cultivo se cosechó y centrifugó a 7000 rpm por 15 minutos en un rotor JL8.1 para comprimir las células. Las células se resuspendieron en 30 mi de amortiguador que contiene 20 mM fosfato sódico, pH 7.5, 500 mM NaCI, 10 % glicerina, 20 mM imidazol, 0.37 mg/ml lisozima, 1X inhibidor de proteasa completo (EDTA-libre; Roche) y Benzonase (Sigma-Aldrich, 0.25 íl/ml final) y se lisó con un sonicador Misonix XL2020 por 5 minutos en hielo en modo de pulso (5 segundos encendido, 30 segundos apagado). El material insoluble se eliminó por centrifugación a 17,000 rpm por 30 min en un rotor JA-17.

Las proteínas FN3 se purificaron a partir del lisado soluble en un proceso cromatográfico en 2 etapas. Primero, la proteína se capturó por cromatografía de afinidad en metal inmovilizado, se añadió 2 mi de bolillas de Ni-NTA agarosa (Qiagen) al lisado y se colocó en una plataforma de balanceo por 1 hora a 4 °C. La resina se empacó después en una columna poli-Prep (Bio-Rad) y se lavó con 20 mM de fosfato sódico, pH 7.5, 500 mM NaCI, 10 % glicerina y 20 mM imidazol para eliminar el material no unido. Las proteínas se eluyeron a partir de la resina con 20 mM fosfato sódico, pH 7.5, 500 mM NaCI, 10 % glicerina y 500 mM imidazol. Las fracciones se analizaron por SDS-PAGE, por tinción con Coomassie y por Membrana de Western por medio del uso un anticuerpo anti-His conjugado HRP (Immunology Consultants Laboratory). Las fracciones deseadas se mezclaron y dializaron en PBS pH 7.4. Como una segunda etapa de purificación, la proteína se cargó en una columna Superdex-75 HiLoad 16/60 (GE Healthcare) equilibrada en PBS. Las fracciones se analizaron por SDS-PAGE, y las fracciones que contienen la proteína FN3 se mezclaron y concentraron por medio del uso un concentrador Centriprep UltraCel YM-3 (Amicon).

La concentración de proteínas se determinó por medio del uso de un lector de placas BioTek para medir la absorbancia de la muestra a 280 nm. La preparación final se analizó por tinción Coomassie, Membrana de Western con anticuerpo anti-His, y por HPLC-SEC por medio del uso una columna G3000SW-XL (TOSOH Biosciences) equilibrada en PBS. El análisis SDS-PAGE muestra que los dominios FN3 migran entre 6 y 14 kDa, de acuerdo con las masas predichas para las proteínas monoméricas.

El plegamiento y estabilidad térmica de cada dominio FN3 se caracterizó por calorimetría de barrido diferencial. Los datos DSC se obtuvieron por calentamiento de 1.0 mg/ml de soluciones de cada dominio FN3 en PBS de 35 °C a 95 °C a un velocidad de 1 0C/minuto en un calorímetro N-DSCII (Applied Thermodynamics). Se sustrajo solamente una curva de amortiguador para producir los perfiles que se muestran en las Figuras 2A-2N. A partir de estos datos, las temperaturas de fusión se calcularon para cada dominio por medio del uso del sofware CpCalc (Microcal) como se muestra en la Tabla 1. Este dato demuestra que cada dominio se pliega independientemente y que esos dominios exhiben un amplio intervalo de estabilidades térmicas.

Un alineamiento de secuencia múltiple de los 15 dominios FN3 de fibronectina se produjo para diseñar una secuencia consenso de proteína. El análisis del alineamiento de secuencia múltiple de la Figura 3 muestra que aunque esos 15 dominios se pliegan en estructuras similares, estos tienen solamente identidades de secuencia modestas, en el intervalo de 27 a 48 %. Una primera secuencia consenso se diseño al incorporar el aminoácido más conservado en cada posición a partir del alineamiento que se muestra en la Figura 3. La primera secuencia consenso tiene un intervalo de identidad de secuencia de 42 a 62 % con los 15 dominios FN3 de fibronectina con un promedio de identidad de 45 %. La secuencia de aminoácidos de la primera secuencia consenso se tradujo otra vez y una secuencia génica sintética que codifica esta proteína se sintetizó mediante el solapamiento PCR y se subclonó en un vector pET15 modificado para la expresión. Para la expresión, este vector se transformó en el huésped de E. coli BL21 -Gold(DE3) (Stratagene) y se tomó una sola colonia en 0.5 mi de medio 2YT que contiene ampicilina. La expresión se indujo por la adición de IPTG para una concentración final de 1 mM cuando el cultivo alcanzó un O.D.600 de -0.6. La expresión se monitoreó por SDS-PAGE seguido de 5 horas de expresión a 30 °C después de la inducción. El análisis SDS-PAGE no mostró evidencia de expresión de esta proteína en E. coli.

Como el alineamiento de secuencia presentado en la Figura 3 muestra que hay numerosas posiciones para las cuales no es posible definir una secuencia consenso válida, se diseño una secuencia consenso alterna en un intento por producir una proteína que pudiera expresarse en E. coli. La segunda secuencia consenso fue idéntica a la primera en las 79 de 89 posiciones, lo que resulta en identidades de secuencia en el intervalo de 37 a 63 % (identidad promedio de 51 %) para los 15 dominios FN3 de fibronectina. La secuencia de aminoácidos de la segunda secuencia consenso se tradujo otra vez y esta secuencia génica se usó para producir un vector de expresión como se describe para la secuencia consenso. Como con la primera, la segunda secuencia consenso falló en expresarse a niveles detectables en E. coli.

Como las dos primeras secuencias consenso que se diseñaron fallaron para expresarse en E. coli, se usó un tercer método. En este método, un alineamiento de secuencia de solamente los dominios FN3 más estables se produjo para maximizar el potencial de producir una proteína consenso estable. La Tabla 1 muestra que los dominios 1 , 2, 5, 8, 10, 12, 14, y 15 tienen temperaturas de fusión mayores que 70 °C. Un alineamiento de secuencia múltiple de los dominios 1 , 5, 8, 10, 12, 14, y 15 se generó para diseñar una secuencia consenso (Figura 4). El dominio 2 se excluyó de este alineamiento ya que el análisis estructural mostró que la cadena "A" del terminal N se desordena en este dominio (Vakonakis, y otros, Embo J 26: 2575-83, 2007). Se generó Fibcon (SEQ ID NO: 16) por medio de seleccionar el residuo usado más frecuentemente en cada posición del alineamiento que se muestra en la Figura 4. Fibcon se encuentra en el intervalos de 40 a 64 % idénticos al alineamiento de los dominios individuales en la Figura 4.

La secuencia de aminoácidos de Fibcon se tradujo otra vez para producir la secuencia génica que se muestra en la SEQ ID NO: 17 y se subclonó en un vector pET27 modificado (Novagen) por métodos de clonación independientes de ligasa. Este vector se transformó en las células BL21-GOLD (DE3) y se colocó en placas LB de agar suplementado con 50 pg/ml de canamicina. Un cultivo 2YT/Kan de 10 mi se inoculó con 1 colonia a partir de esta placa y se cultivó toda la noche a 37 °C. Este cultivo se usó para sembrar un cultivo 2YT de 500 mi suplementado con 50 pg/ml de canamicina que se cultivó a 37 °C hasta alcanzar un O.D.600 ~ 0.6, en cuyo punto se añadió IPTG a 1 mM y la temperatura se redujo a 30 °C. Las células se cosecharon por centrifugación a 4000 x g 5 horas después de la inducción. El comprimido de células resultante se lisó al añadir 5 mi de BugBuster (Novagen) y 1 pl de Benzonase (Novagen) por gramo de comprimido húmedo y con balanceo a temperatura ambiente por 30 minutos, en cuyo punto el lisado se aclaró por centrifugación a 15,000 x g por 30 minutos. El lisado claro se cargó en una columna Hitrap HP Ni-NTA de 1 mi (GE Healthcare) y se lavó con 10 volúmenes de columna de PBS pH 7.4, 12.5 mM ¡midazol. Fibcon se eluyó a partir de la columna por aplicación de un gradiente de imidazol de 12.5 mM a 250 mM sobre 20 volúmenes de columna. Las fracciones se analizaron por SDS-PAGE (Figuras 5A y 5B), se mezclaron, y concentraron antes de la inyección en una columna con filtración de gel superdex 75 16/60 (GE Healthcare) en PBS. A partir de las Figuras 5A y 5B se muestra que Fibcon se expresa completamente en la fracción soluble de E. coli, se purifica eficientemente, y está presente en una sola especie monomérica.

El plegamiento y estabilidad térmica de fibcon se evaluó por calorimetría de barrido diferencial y fluorescencia triptófano intrínseca. Los datos DSC se obtuvieron por calentamiento de 1.0 mg/ml de solución de fibcon en PBS de 30 °C a 115 °C a una velocidad de 1 °C/minuto en un calorímetro N-DSCII (Applied Thermodynamics). Se sustrajo solamente una curva del amortiguador para producir el perfil que se muestra en la Figura 6. El perfil de fusión es consistente con un dominio plegado y muestra que fibcon es una proteína muy estable con transiciones térmicas, a 82 °C y 105 °C. La transición a 105 °C se debe, probablemente, a la agregación de fibcon a altas temperaturas ya que esta transición depende de la concentración.

Fibcon contiene solamente un único residuo de triptófano que se predice que se entierra en el núcleo hirdrofóbico de la proteína por análisis estructural de otros dominios FN3. La fluorescencia de este residuo de triptófano se usó para monitorear el plegamiento de fibcon al equilibrar una solución de fibcon (10 µ?) en soluciones amortiguadas de 50 mM fosfato sódico pH 7.0, 150 mM NaCI y clorhidrato de guanidina (Gu-HCI) en una placa de 96 pocilios. La concentración de Gu-HCI varió para cada pocilio de la placa de concentraciones de 0 a 6.5 M en incrementos de 0.25 M. La fluorescencia del triptófano se monitoreó por excitación a 280 nm y emisión a 360 nm por medio del uso de un lector de placas SpectraMax M5 equipado con un monocromatógrafo (Molecular Devices). La Figura 7 muestra que fibcon se pliega a concentraciones Gu-HCI por debajo de 4 M. La fluorescencia de este residuo de triptófano después de la valoración con guanidina confirma el plegamiento y estructura de fibcon.

Ventajas La proteína fibcon tiene una alta estabilidad térmica de 82 °C.

Basado en esta alta estabilidad, esta molécula supercóntigo es probablemente susceptible de sustitución de aminoácidos en los lazos o cadenas y es fácil de fabricar, lo que la hace una molécula supercóntigo alternativa valiosa. Las mutaciones que disminuyen la estabilidad de la proteína son probablemente mejor toleradas en el contexto de un supercóntigo más estable y, así, un supercóntigo con alta estabilidad produce, probablemente, aglutinantes más funcionales, mejor plegados a partir de una genoteca de variantes de supercóntigos. Como esta nueva proteína no es una proteína codificada por el genoma humano, puede proporcionar, además, menos riesgo hacia la generación de una respuesta inmune contra los dominios de fibronectina humana nativa cuando se administra a los seres humanos para su uso como una molécula terapéutica o herramienta de diagnóstico en comparación con las moléculas supercóntigo basadas en la secuencia de dominios de fibronectina nativa, tal como el 10.° dominio FN3.

Ejemplo 2. Generación de genotecas Fibcon Las genotecas variante de Fibcon pueden prepararse por muchos métodos diferentes, dependiendo de la complejidad deseada y la ubicación relativa de las mutaciones en la molécula. Los métodos de síntesis de ADN se prefieren para crear mutaciones aisladas a través del gen Fibcon. La clonación de enzima de restricción se puede usar para recombinar fragmentos de ADN que contienen mutaciones en diferentes regiones del gen. La mutagénesis saturante en una región pequeña definida, tal como un solo lazo fibcon, se pueden introducir por medio del uso de una mutagénesis dirigida al oligonucleótido y oligo-nucleótido redundante. (Kunkel y otros, 1987).

Se construyó una genoteca fibcon diseñada para reemplazar el lazo FG con 7-12 aminoácidos aleatorios por medio del uso de mutagénesis dirigida al oligonucleótido. Se sintetizó un oligonucleótido para incorporar los nucleótidos redundantes NNS en las posiciones que codifican el lazo FG y dos secuencias de nucleótidos de flanqueo de 20-27 bp de complementariedad a la secuencia génica fibcon. En este diseño los veinte aminoácidos son capaces de representarse en el lazo FG.

El patrón para la mutagénesis dirigida al oligonucleótido se construyó al reemplazar el lazo fibcon F:G que codifica la secuencia con una secuencia de lazos tallo que contiene un sitio de restricción Ascl. Este sistema permite la eliminación del patrón de ADN de fondo después de la mutagénesis por digestión del ADN resultante con AscI antes de la transformación. Para purificar un patrón de ADN de cadena sencilla para mutagénesis, una sola colonia de E. coli CJ236 que alberga el vector se toma y añade en 5 mi del medio de crecimiento 2YT con carbenicilina (50 ug/ml concentración final) y cloranlenicol (10 ug/ml). Después de 6 horas, el fago de ayuda VCSM1 3 se añadió a una concentración final de 1010 pfu/ml y se incubó sin agitar por 10 minutos antes de transferirlo a 150 mi de 2YT con carbenicilina (10 ug/ml) y uridina (0.25 ug/ml) y se incubó a 37 °C con agitación a 200 rpm toda la noche. Las células se comprimieron por centrifugación y el sobrenadante se recogió y el fago se comprimió con PEG NaCI. El ADN de cadena sencilla se purifica a partir de este comprimido por medio del uso de un kit QIAprep Spin M13 (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Para hibridar el oligonucleótido redundante para el patrón, 5 de ADN patrón se combinan con un oligo a una relación molar de 10:1 en Tris-HCI (50 mM, pH7.5) y MgCI2 (10 mM) y se incuban a 90 °C por 2 minutos, 60 °C por 3 minutos, y 20 °C por 5 minutos. Después de la reacción de hibridación, se añade ATP (10 mM), dNTP (25 mM cada uno), DTT (100 mM), T4 ligasa (7 unidades), y T7 ADN polimerasa (10 unidades) a la mezcla de reacción y se incuba a 14 °C por 6 horas seguido por 20 °C por 12 horas. El ADN resultante se purifica por medio del uso un kit de purificación PCR (Qiagen) y se recupera en 100 µ? de agua. El ADN de la genoteca se digiere con 10 unidades de AscI por 4 horas y después se purifica otra vez con el kit de purificación PCR de Qiagen. El ADN de la genoteca final se recupera en 50 µ? de agua. El producto de ADN de cadena doble resultante se transforma después en E. coli MC 061 F' por electroporación.

Los transformantes se recogen en 20 mi de medio SOC y se dejan recuperar por 1 hora a 37 °C. Al final de la recuperación, una alícuota de la transformación se diluye en serie y se coloca en placas de carbenicilina (100 ug/ml) que contienen 1 % glucosa para evaluar el número transformante total. El cultivo SOC restante se usa después para inocular 1 I del medio 2xYT con carbinicilina y 1 % glucosa y se cultiva hasta que alcanza un OD60o de 0.6. 100 mi de este cultivo se inocula con el fago M13 para 1010/ml y se incuba a 37 °C antes de la centrifugación. El comprimido de células resultante se resuspende en 500 mi de medio 2xYT fresco que contiene carbenicilina (100 ug/ml) y canamicina (35 ug/ml) y se cultiva a 30 °C toda la noche antes de la centrifugación. Las partículas del fago se precipitan con la adición de PEG/NaCI y se almacenan a -80 °C.

Una segunda genoteca se diseño para introducir diversidad dentro de los lazos B:C y F:G de fibcon simultáneamente. Para hacerlo se sintetizaron dos oligonucleótidos. El oligo iniciador es fosforilado y contiene el codón NNS redundante en cada una de las posiciones que codifican el lazo B:C, mientras que el oligo inverso es biotinilado en el extremo 5' y contiene 21 bases del codón NNS en cada una de las posiciones que codifican el lazo F:G. Ambos oligonucleótidos están flanqueados por dos secuencias de nucleótidos de 18 bp idénticas a la región precedente y que sigue a la región a mutar.

Para construir la genoteca se realizan dieciséis reacciones PCR 100 µ? por medio del uso de oligos para amplificar el patrón de ADN fibcon, al introducir los codones NNS en los lazos B:C y F:G simultáneamente en el proceso. El producto PCR de cadena doble se mezcla con bolillas de estreptavidina magnéticas (Dynal) en amortiguador B&W (10 mM Tris-HCI, pH7.5, 1 mM EDTA, 2 M NaCI, 0.1 % Tween-20) y se incuba por 20 minutos, se reduce con un imán y se lava con el amortiguado B&Wr dos veces. Esta cadena iniciadora se eluye a partir de las bolillas con 300 µ? de 150 mM NaOH. Este "megainiciador", una mezcla de un iniciador grande con más de 8x1016 en diversidad teórica, se usa para hibridar un patrón de la genoteca de cadena sencilla. La construcción de la genoteca se lleva a cabo como se describió anteriormente para la primera genoteca.

Ejemplo 3. Selección de los aglutinantes para la proteina objetivo Para realizar las selecciones de los miembros de la genoteca fibcon que se unen a la proteína objetivo, la proteiña objetivo se biotinaliza por medio del uso de sulfo-NHS-LC-Biotin (Pierce) antes de su diálisis en PBS. Para las selecciones, 200 µ? de las genotecas de exhibición del fago se bloquean con 200 µ? del quimiobloqueador antes de la adición de la proteína objetivo biotinalizada a concentraciones de 500 nM (ronda 1) o 100 nM (rondas 2 y 3). Los fagos unidos se recuperan por las bolillas magnéticas de Neutravidin (Seradyne) en la ronda 1 0 bolillas magnéticas de estreptavidina (Promega) en la rondas 2 y 3. Los fagos no unidos se lavan a partir de las bolillas por medio del uso de 5- 0 lavados con 1 mi de amortiguador salino Tris con tween (TBST) seguido por 2 lavados con 1 mi de amortiguador salino Tris (TBS). Los fagos unidos se eluyen a partir de las bolillas por la adición de una fase semi-logarítmica de E. coli MC1061 F'. Las células infectadas se colocan en placas de agar LB suplementadas con carbenicilina y glucosa. Al día siguiente, las células se raspan de la placa y se cultivan en fase semi-logarítmica antes de rescatarlas con el fago de ayuda VCSM13 y se cultivan toda la noche. Las partículas del fago aisladas por precipitación PEG/NaCI se usan para la próxima ronda de selecciones.

Después de 3 o más rondas de cribado contra la proteína objetivo, la salida se subclona en un vector pET27 modificado para incluir un sitio de clonación dependiente de ligasa por amplificación del gen fibcon por PCR. Este producto PCR se híbrida al vector y se transforma en células BL21-GOLD(DE3) (Stratagene). Las colonias individuales se recogen en cultivos de 1 mi en placas de 96 pocilios profundas (Corning) y se cultivan para la saturación toda la noche a 37 °C. Al día siguiente, 50 µ? del cultivo de toda la noche se usa para inocular a 1 mi de cultivo fresco. Los cultivos crecen a 37 °C por 2 horas antes de añadir IPTG a 1 mM y reducir la temperatura a 30 °C. Las células se cosechan por centrifugación 16 horas después de la inducción y se lisan con 100 µ? de BugBuster (Novagen). Los lisados resultantes se aclararon por centrifugación y se usaron para probar la unión a IgG por ELISA.

Las placas Maxisorp (Nunc) se recubren con 0.1 pg del anticuerpo anti-HIS (Qiagen) toda la noche, se lavan con TBST, y se bloquean con Starting Block T20 (Thermo Scientific). Los lisados claros diluidos 1 :4 en Starting Block se añaden a las placas y se dejan unir por 1 hora antes de lavar con TBST. IgG biotinilado o HSA biotinilado se añaden a una concentración de 1 pg/ml y se lavan con TBST después de 1 hora de incubación. La detección de IgG o HSA unidos se lleva a cabo al añadir estreptavidina-HRP (Jackon Immunoresearch) y detectar con el sustrato de quimiluminiscencia POD.

Para los propósitos de esta invención, 70-100% de identidad de secuencia de aminoácidos o nucleótidos (es decir, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 o cualquier intervalo o valor de estos) se determina por medio del uso de un algoritmo de computadora adecuado, como se conoce en la materia.

Resultará evidente que la invención puede practicarse de cualquier otra forma que las particularmente descritas en la descripción anterior y los ejemplos. Numerosas modificaciones y variaciones de la presente invención son posibles a la luz de las enseñanzas anteriores y, por lo tanto, están dentro del alcance de las reivindicaciones anexas.

Tabla 1 Temperaturas de fusión de los dominios FN3 determinadas por DSC.

Dominio FN3 Temperatura de fusión fC) 1 81.2 2 70.7 3 66.1 4 52.3 5 72.3 6 68.3 7 N.D. 8 72.6 9 47.0 10 82.5 11 53.9 12 76.1 13 65.8 14 70.3 15 86.5 Tabla 2. Secuencias: SEQ ID NO: 1 MSGPVEVFITETPSQPNSHPIQWNAPQPSHISKYILRWRPKNSVGRWKEATIPGHLNSYT IKGLKPGWYEGQLISIQQYGHQEVTRFDFTTTSTSGGHHHHHH SEQ ID NO: 2 MSGPVEVFITETPSQPNSHPIQWNAPQPSHISKYILRWRPKNSVGRWKEATIPGHLNSYT IKGLKPGWYEGQLISIQQYGHQEVTRFDFTTTSTSGGHHHHHH SEQ ID NO: 3 MGAPDAPPDPTVDQVDDTSIWRWSRPQAPITGYRIVYSPSVEGSSTELNLPETANSVTL SDLQPGVQYNITIYAVEENQESTPWIQQETTGGHHHHHH SEQ ID NO: 4 MTVPSPRDLQFVEVTDVKVTIMWTPPESAVTGYRVDVIPVNLPGEHGQRLPISRNTFAEV TGLSPGVTYYFKVFAVSHGRESKPLTAQQTTGGHHHHHH SEQ ID NO: 5 MKLDAPTNLQFVNETDSTVLVRWTPPRAQITGYRLTVGLTRRGQPRQYNVGPSVSKYPL RNLQPASEYTVSLVAIKGNQESPKATGVFTTLGGHHHHHH SEQ ID NO: 6 MQPGSSIPPYNTEVTETTIVITWTPAPRIGFKLGVRPSQGGEAPREVTSDSGSIWSGLTP GVEYVYTIQVLRDGQERDAPIVNKWTGGHHHHHH SEQ ID NO: 7 MGLSPPTNLHLEANPDTGVLTVSWERSTTPDITGYRITTTPTNGQQGNSLEEWHADQS SCTFDNLSPGLEYNVSVYTVKDDKESVPISDTIIPAGGHHHHHH SEQ ID NO: 8 MGVPPPTDLRFTNIGPDTMRVTWAPPPSIDLTNFLVRYSPVKNEEDVAELSISPSDNAW LTNLLPGTEYWSVSSVYEQHESTPLRGRQKTGGHHHHHH SEQ ID NO: 9 MLDSPTGIDFSDITANSFTVHWIAPRATITGYRIRHHPEHFSGRPREDRVPHSRNSITLTN LTPGTEYWSIVALNGREESPLLIGQQSTGGHHHHHH SEQ ID NO: 10 MGVSDVPRDLEWAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTA TISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASS PISINYRTGGHHHHHH SEQ ID NO: 1 1 MGEIDKPSQMQVTDVQDNSISVKWLPSSSPVTGYRVTTTPKNGPGPTKTKTAGPDQTE MTIEGLQPTVEYWSVYAQNPSGESQPLVQTAVTGGHHHHHH SEQ ID NO: 12 MTIPAPTDLKFTQVTPTSLSAQWTPPNVQLTGYRVRVTPKEKTGP KEINLAPDSSSVW SGLMVATKYEVSVYALKDTLTSRPAQGWTTLGGHHHHHH SEQ ID NO: 13 MENVSPPRRARVTDATETTITISWRTKTETITGFQVDAVPANGQTPIQRTIKPDVRSYTIT GLQPGTDYKIYLYTLNDNARSSPWIDASTGGHHHHHH SEQ ID NO: 14 MAIDAPSNLRFLATTPNSLLVSWQPPRARITGYIIKYEKPGSPPREWPRPRPGVTEATITGL EPGTEYTIYVIALKNNQKSEPLIGRKKTGGHHHHHH SEQ ID NO: 15 MGHRPRPYPPNVGQEALSQTTISWAPFQDTSEYIISCHPVGTDEEPLQFRVPGTSTSATLT GLTRGATYNIIVEALKDQQRHKVREEWTVGNSGGHHHHHH SEQ ID NO: 16 MPAPTDLRFTNETPSSLLISWTPPRVQITGYIIRYGPVGSDGRVKEFTVPPSVSSATITGLKP GTEYTISVIALKDNQESEPLRGRVTTGGHHHHHH SEQ ID NO: 17 atgccggcgccgaccgatctgcgctttaccaacgaaaccccgagcagcctgctgattágctggaccccgccgcgcgtgcaga ttaccggctatattattcgctatggcccggtgggcagcgatggccgcgtgaaagaatttaccgtgccgccgagcgtgagcagcg cgaccattaccggcctgaaaccgggcaccgaatataccattagcgtgattgcgctgaaagataaccaggaaa Tabla 3. Lazos de fibcon Lazo Residuos de la SEQ ID NO:16 Secuencia de aminoácidos A-B 13-16 TPSS B-C 22-28 TPPRVQI C-D 38-43 VGSDGR D-E 51-54 PSVS E-F 60-64 GLKPG F-G 75-81 KDNQESEP

Claims (23)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1. Un supercóntigo de proteínas aislado basado en un dominio de la fibronectina tipo III (FN3) que comprende una secuencia de aminoácidos derivada de una secuencia consenso de un dominio FN3, en donde la secuencia de aminoácidos tiene al menos 75 % de identidad con la secuencia consenso del dominio FN3.

2. Un supercóntigo de proteínas aislado basado en un dominio de la fibronectina tipo III (FN3) que comprende una secuencia de aminoácidos derivada de una secuencia consenso de los dominios FN3 de fibronectina, en donde la secuencia de aminoácidos tiene al menos 75 % de identidad con la SEQ ID NO:16.

3. El supercóntigo de proteínas de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque comprende 7 cadenas y 6 lazos entre las cadenas.

4. El supercóntigo de proteínas de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:16 y que forma lazos en los residuos 13-16, 22-28, 38-43, 51 -54, 60-64, y 75-81 de la SEQ ID NO: 16 capaces de unirse a las proteínas celulares y/o moléculas de ácido nucleico.

5. El supercóntigo de proteínas de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:16 y que forma lazos en los residuos 13-16, 22-28, 38-43, 51-54, 60-64, y 75-81 de la SEQ ID NO: 16 capaces de unirse a las proteínas celulares y/o moléculas de ácido nucleico, en donde uno o más de los lazos se altera para unirse a un objetivo.

6. El supercóntigo de proteínas de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizado además porque dicho supercóntigo se une a un objetivo con al menos una afinidad seleccionada de al menos 10"9 M, al menos 10'10 M, al menos 10"11 M, y al menos 10 2 M, al menos 10"13 M, al menos 10"14 M, y al menos 10"15 M, determinado por resonancia de plasmón de superficie u otro método Kinexa.

7. El supercóntigo de proteínas de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 -5, caracterizado además porque los lazos forman sitios para la unión a los objetivos.

8. Un método para construir una genoteca de un supercóntigo de proteínas basado en un dominio de fibronectina tipo III (FN3), el método comprende las etapas de: proporcionar un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16; e introducir diversidad en las copias del polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 16 para formar la genoteca de supercóntigo de proteínas.

9. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque la etapa de introducir diversidad comprende mutar al menos una región lazo seleccionada del grupo que consiste de los residuos 13-16, 22-28, 38-43, 51-54, 60-64, y 75-81 de la SEQ ID NO:16.

10. Una genoteca producida por el método de la reivindicación 9.

11. Un método para generar un supercóntigo de proteínas que se une a un objetivo específico con una afinidad de unión predefinida, el método comprende contactar la genoteca de la reivindicación 10 con el objetivo específico y aislar un supercóntigo de proteínas que se une al objetivo específico con la afinidad predefinida.

12. El método de conformidad con la reivindicación 1 1 , caracterizado además porque la etapa de aislamiento comprende aislar las moléculas supercóntigo que se unen al objetivo específico y probar las moléculas supercóntigo aisladas para la afinidad de unión al objetivo específico.

13. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque la afinidad es menor o igual que aproximadamente 10-7 M.

14. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un supercóntigo de proteínas de cualquiera de las reivindicaciones 1-5.

15. La molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 14, caracterizada además porque comprende la secuencia de nuecleótidos que se expone en la SEQ ID NO: 17.

16. Un vector de ácido nucleico aislado que comprende la molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 14.

17. Una célula huésped procariota o eucariota que comprende la molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 14.

18. La célula huésped de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada además porque la célula huésped es al menos una célula seleccionada de E. coli BL21Star(DE3), otra célula de E. coli, levadura, COS-1 , COS-7, HEK293, BHK21 , CHO, BSC-1 , Hep G2, 653, SP2/0, 293, células HeLa, mieloma, o linfoma, o cualquier célula derivada, inmortalizada o transformada de éstas.

19. Una composición que comprende un supercóntigo de proteínas de cualquiera de las reivindicaciones 1-5 y al menos un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.

20. La composición de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada además porque comprende adicionalmente al menos un compuesto o polipéptido seleccionado de un reportero o etiqueta detectable, un antagonista de TNF, un fármaco antiinfeccioso, un fármaco del sistema cardiovascular (CV), un fármaco del sistema nervioso central (CNS), un fármaco del sistema nervioso autónomo (ANS), un fármaco del tracto respiratorio, un fármaco del tracto gastrointestinal (Gl), un fármaco hormonal, un fármaco para el equilibrio fluido o de electrolitos, un fármaco hematológico, un antineoplásico, un fármaco inmunomodulador, un fármaco oftálmico, ótico o nasal, un fármaco tópico, un fármaco nutricional, una citocina, y un antagonista de citocina.

21. Un dispositivo médico que comprende un supercóntigo de proteinas de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde el dispositivo es adecuado para contactar o administrar el supercóntigo de proteínas por al menos un modo seleccionado de parenteral, subcutáneo, intramuscular, intravenoso intrarticular, intrabronquial, intraabdominal, intracapsular, intracartilaginoso, intracavidad, intracelial, ¡ntracerebral, intracerebroventricular, intracólico, intracervical, intragástrico, intrahepático, ¡ntramiocardio, intraosteal, intrapélvico, intrapericardiaco, intraperitoneal, intrapleural, intraprostático, intrapulmonar, intrarrectal, intrarrenal, intrarretinal, intraespinal, intrasinovial, intratorácico, intrauterino, intravesical, intralesional, bolo, vaginal, rectal, bucal sublingual, intranasal, y transdérmico.

22. Un artículo de fabricación para uso farmacéutico o de diagnóstico humano, que comprende material de empaque y un contenedor que comprende una solución o una forma liofilizada de a supercóntigo de proteínas de cualquiera de las reivindicaciones 1-5.

23. El artículo de fabricación de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado además porque el contenedor es un componente de un dispositivo o sistema de suministro parenteral, subcutáneo, intramuscular, intravenoso, intrarticular, intrabronquial, intraabdominal, intracapsular, intracartilaginoso, intracavidad, intracelial, ¡ntracerebral, intracerebroventricular, intracólico, intracervical, intragástrica, intrahepática, intramiocárdica, intraosteal, intrapélvica, intrapericardiaca, intraperitoneal, intrapleural, intraprostática, intrapulmonar, intrarrectal, intrarrenal, intrarretinal, intraespinal, intrasinovial, intratorácica, intrauterina, intravesical, intralesional, bolos, vaginal, rectal, bucal, sublingual, ¡ntranasal, o transdérmica.