ES2879387T3 - Proteínas de dominio de armazón a base de fibronectina que se unen a miostatina - Google Patents

Proteínas de dominio de armazón a base de fibronectina que se unen a miostatina Download PDF

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Malavi Madireddi
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Joanna F Swain
Wenjun Zhao
Hui Wei
Aaron Yamniuk
Alexander Kozhich
Vidhyashankar Ramamurthy
Martin Corbett
Stanley Krystek
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Abstract

Un polipéptido que comprende un décimo dominio de fibronectina de tipo III (10Fn3), en donde el polipéptido se une a miostatina con una KD inferior a 500 nM y uno de los bucles BC, DE y FG del dominio 10Fn3 tiene una sustitución de aminoácido con respecto a las secuencias de aminoácidos respectivas de las SEQ ID NO: 34, 39 y 75, respectivamente, y en donde (a) la sustitución de un aminoácido está en el bucle BC, en donde (i) la serina en la posición 3 del bucle BC (SEQ ID NO: 34) está sustituida con un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en C, F, I, V, W e Y; (ii) la histidina en la posición 6 del bucle BC (SEQ ID NO: 34) está sustituida con un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en C, D, E, F, G, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W e Y; (iii) la glutamina en la posición 7 del bucle BC (SEQ ID NO: 34) está sustituida con un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, R, S, T, V, W e Y; (iv) la lisina en la posición 9 del bucle BC (SEQ ID NO: 34) está sustituida con un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, C, G, H, I, L, M, N, Q, R, S, V, W e Y; (v) la alanina en la posición 10 del bucle BC (SEQ ID NO: 34) está sustituida con un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en G, L, M y S; o (vi) la asparagina en la posición 11 del bucle BC (SEQ ID NO: 34) está sustituida con un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en C, H, Q, S e Y; (b) la sustitución de un aminoácido está en el bucle DE, en donde la valina en la posición 5 del bucle DE (SEQ ID NO: 39) está sustituida con un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en C, E, I, L, M, Q y T; o (c) la sustitución de un aminoácido está en el bucle FG, en donde (i) la valina en la posición 2 del bucle FG (SEQ ID NO: 75) está sustituida con un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, C, I, L y M; (ii) la treonina en la posición 3 del bucle FG (SEQ ID NO: 75) está sustituida con un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en C, F, H, I, L, M, Q, R, S, V, W e Y; (iii) el ácido aspártico en la posición 4 del bucle FG (SEQ ID NO: 75) está sustituido con un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, S, T, V, W e Y; (iv) la treonina en la posición 5 del bucle FG (SEQ ID NO: 75) está sustituida con un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, C, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, V, W e Y; (v) la glicina en la posición 6 del bucle FG (SEQ ID NO: 75) está sustituida con un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, D, E, F, H, I, L, M, N, Q, S, T, V, W e Y; (vi) la tirosina en la posición 7 del bucle FG (SEQ ID NO: 75) está sustituida con un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en C, F, I, L, M, P, T, V y W; (xii) la leucina en la posición 8 del bucle FG (SEQ ID NO: 75) está sustituida con un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en C, F, H, I, L, M, N, Q, R, T, V, W e Y; (xiii) la lisina en la posición 9 del bucle FG (SEQ ID NO: 75) está sustituida con un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, C, E, F, G, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y; (ix) la tirosina en la posición 10 del bucle FG (SEQ ID NO: 75) está sustituida con W; o (x) la lisina en la posición 11 del bucle FG (SEQ ID NO: 75) está sustituida con un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, C, D, E, G, H, L, M, N, P, Q, R, S, T y V.

Description

DESCRIPCIÓN
Proteínas de dominio de armazón a base de fibronectina que se unen a miostatina
Referencia a solicitudes relacionadas
La presente solcitud reivindica prioridad a la Solicitud Provisional de Estados Unidos N.° 61/700.697 con el título "Proteínas de dominio de armazón a base de fibronectina que se unen a miostatina" presentada el 13 de septiembre de 2012, y la Solicitud Provisional de Estados Unidos N.° 61/780,005 con el título "Proteínas de dominio de armazón a base de las que se unen a miostatina" presentada el 13 de marzo de 2013.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a proteínas de dominio de armazón a base de fibronectina que se unen a miostatina. La invención también se refiere al uso de proteínas innovadoras en aplicaciones terapéuticas para tratar enfermedades de pérdida muscular y trastornos metabólicos. La invención se refiere adicionalmente a células que comprenden proteínas de ese tipo, polinucleótidos que codifican proteínas de este tipo o fragmentos de los mismos, y a vectores que comprenden los polinucleótidos que codifican las proteínas innovadoras.
Antecedentes de la invención
La miostatina, también conocida como factor 8 de crecimiento y diferenciación (GDF-8), es un miembro de la superfamilia del factor p de crecimiento transformante (TGF-p) de factores de crecimiento secretados. La miostatina tiene todas las características estructurales comunes a las proteínas de la familia TGF-p: un extremo amino terminal hidrófobo que actúa como una señal secretora, nueve restos de cisteína invariables y un sitio de procesamiento proteolítico de tipo furina "RXXR". La escisión proteolítica de la proteína da lugar a un dominio C-terminal que forma un homodímero que es la forma biológicamente activa de la miostatina (Thies et al., Growth Factors 2001; 18 (4): 251 -9). Los alineamientos del fragmento C-terminal de las secuencias de aminoácidos de miostatina de múltiples especies de vertebrados revelan que la proteína está altamente conservada (identidad de un 100 %) entre ser humano, mono, vaca, perro, rata, pavo y pollo (McPherron, et al., PNAS, 94: 12457-61, 1997).
La expresión de la miostatina se limita principalmente al músculo esquelético y al tejido adiposo, donde se ha demostrado que es un regulador negativo del desarrollo del músculo esquelético (Lee LS, Immunol Endocr Metab Agents Med Chem. 2010; 10: 183-194). En mamíferos, el músculo esquelético parece ser el principal tejido diana de la miostatina, donde se une a los receptores de la superficie celular, lo que lleva a la pérdida muscular. Los ratones y el ganado con deficiencias genéticas en la miostatina presentan aumentos drásticos en la masa del músculo esquelético, es decir, el fenotipo de "doble musculación", por lo tanto, apoyan el papel de la miostatina en la supresión del crecimiento muscular (McPherron y Lee, Proc Natl Acad Sci USA. 23 de diciembre de 2003; 100 (26): 15842-6). La hipertrofia muscular en las razas de ganado belga azul y piamontesa se debe a una mutación de sentido erróneo dentro del tercer exón del gen de la miostatina bovina (Bass et al., Domest Anim Endocrinol. 1999; 17 (2-3): 191-7). La sobreexpresión transgénica de los inhibidores de miostatina también da como resultado hipermusculatura. El aumento del crecimiento muscular en estos animales se debe a un aumento tanto en el número de células, o crecimiento hiperplásico, como en el tamaño de las células, o crecimiento hipertrófico, que da como resultado miofibras más grandes y más pesadas. El aumento de la masa muscular esquelética debido a una mutación de miostatina también se ha informado en seres humanos. La inhibición de la miostatina aumenta de manera eficaz la masa y la fuerza del músculo esquelético, tanto en el periodo postnatal como en adultos.
Los aumentos de la masa muscular y la resistencia del esqueleto también están asociados con adaptaciones metabólicas que influyen de forma positiva en la composición corporal, el gasto de energía, la homeostasis de la glucosa y los requisitos de insulina. Los hallazgos tanto genéticos como farmacológicos indican que la miostatina regula el metabolismo energético y que su inhibición puede atenuar de forma significativa la progresión de las enfermedades metabólicas, incluyendo la obesidad y la diabetes. Por ejemplo, los ratones nulos para miostatina presentan una disminución de la acumulación de grasa corporal (McPherron y Lee, J. JCI 109: 595, 2002) cuando se compara con ratones de tipo silvestre de la misma edad. Esta reducción en la grasa corporal es una manifestación de la reducción en el número y tamaño de adipocitos, lo que implica un papel importante de la miostatina en la adipogénesis, así como en la miogénesis.
Por consiguiente, la miostatina es una diana deseable para la intervención terapéutica o profiláctica para el tratamiento de trastornos o afecciones que se podrían beneficiar de un aumento de la masa muscular, fuerza muscular y/o metabolismo (p. ej., distrofia muscular, fragilidad, atrofia por falta de uso y caquexia), trastornos asociado con el desgaste muscular (p. ej., enfermedad renal, insuficiencia o enfermedad cardiaca y enfermedad hepática) y trastornos metabólicos (p. ej., diabetes de tipo II, síndrome metabólico, obesidad y osteoartritis).
Por consiguiente, podría ser ventajoso obtener proteínas de armazón de dominio de fibronectina mejoradas que se una a miostatina para el tratamiento terapéutico de, p. ej., trastornos metabólicos, trastornos de desgaste muscular y pérdida muscular debido a inactividad.
Compendio de la invención
La presente invención se basa, al menos en parte, en el descubrimiento de Adnectinas que se unen a y antagonizan la miostatina. De forma específica, las Adnectinas anti-miostatina de la presente invención inhiben la actividad de la miostatina, infiriendo de ese modo en la señalización de SMAD cadena abajo. Un mecanismo que explica la alteración de la señalización de SMAD de algunas de las Adnectinas anti-miostatina de la invención implica la inhibición del reclutamiento de Alk4 al complejo miostatina-ActRIIb, cuyas consecuencias fisiológicas son aumentó el volumen muscular y del peso corporal.
En un aspecto, la invención proporciona un polipéptido que comprende un décimo dominio de tipo III de fibronectina (10Fn3) en donde el 10Fn3 tiene al menos un bucle seleccionado del bucle BC, DE y FG con una secuencia de aminoácidos alterada con respecto a la secuencia del bucle correspondiente del dominio 10Fn3 humano y en donde el polipéptido se une a miostatina. En determinadas realizaciones, el polipéptido se une a la miostatina con una Kd inferior a 500 nM.
En algunas realizaciones, el bucle BC del polipéptido de la invención comprende una secuencia de aminoácidos según la fórmula X1-L-P-X2-X3-X4-X5-X6-X7, en donde (a) X1 se selecciona del grupo que consiste en S, T e Y; (b) X2 se selecciona del grupo que consiste en H, Y, N, R, F, G, S y T; (c) X3 se selecciona del grupo que consiste en A, P, Q, S, F, H, N y R; (d) X4 se selecciona del grupo que consiste en G y A; (e) X5 se selecciona del grupo que consiste en H, L, R, V, N, D, F, I y K; (f) X6 se selecciona del grupo que consiste en A, L, G, M, F, I y V; y (g) X7 se selecciona del grupo que consiste en H y N. En determinadas realizaciones, X1 es S, y/o X2 es H o Y, y/o X3 es A o P, y/o X4 es G, y/o X5 es H, L o R, y/o X6 es A o L y/o X7 es H.
En otras realizaciones, el bucle BC comprende una secuencia de aminoácidos según la fórmula X19-X20-P-X21-G-X22-A, en donde (a) X19 se selecciona del grupo que consiste en D, E, V y W; (b) X20 se selecciona del grupo que consiste en A, S y V; (c) X21 se selecciona del grupo que consiste en R, A, G, K y L; y (d) X22 se selecciona del grupo que consiste en L y R. En determinadas realizaciones, X19 es D, y/o X20 es A, S o V, y/o X22 es L.
En algunas realizaciones, el bucle DE comprende una secuencia de aminoácidos según la fórmula G-R-G-X8 , en donde X8 es V o L.
En algunas realizaciones, el bucle DE comprende una secuencia de aminoácidos según la fórmula X23-G-R-G-X24, en donde (a) X23 se selecciona del grupo que consiste en V, P, F, I y L; y (b) X24 se selecciona del grupo que consiste en S, N y T.
En algunas realizaciones, el bucle FG del polipéptido de la invención comprende una secuencia de aminoácidos según la fórmula X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18, en donde (a) X9 se selecciona del grupo que consiste en L, V e I; (b) X10 se selecciona del grupo que consiste en T y S; (c) X11 se selecciona del grupo que consiste en K, R, A, G, S, D, H, N, T y P; (d) X12 se selecciona del grupo que consiste en S, T, A, E, H, K y N; (e) X13 se selecciona del grupo que consiste en K, G, Q, D, E, N, T y S; (f) X14 se selecciona del grupo que consiste en V, I, F, L, M, P, T e Y; (g) X15 se selecciona del grupo que consiste en I, L e Y; (h) X16 se selecciona del grupo que consiste en H, I, V, K, L, R, F, G, S y T; (i) X17 se selecciona del grupo que consiste en Y y H; y (J) X18 se selecciona del grupo que consiste en K, M, L, R y V.
En determinadas realizaciones, X9 es L o V, y/o X10 es T, X11 es K o R, y/o X12 es S o T, y/o X13 es K, G o Q, y/o X14 es V o I, y/o X15 es I, y/o X16 es H, I o V, y/o X17 es Y y/o X18 es K o M.
En algunas realizaciones, el bucle FG comprende una secuencia de aminoácidos según la fórmula X25-X26-R-X27-G-X28-X29-X30-X31-X32, en donde (a) X25 se selecciona del grupo que consiste en I y V; (b) X26 se selecciona del grupo que consiste en F, D e Y; (c) X27 se selecciona del grupo que consiste en D y T; (d) X28 se selecciona del grupo que consiste en P, M, V y T; (e) X29 se selecciona del grupo que consiste en V, L, N, R y S; (f) X30 se selecciona del grupo que consiste en H, T, L, N, Q y S; (g) X31 se selecciona del grupo que consiste en F, W, Y, H y L; y (h) X32 se selecciona del grupo que consiste en D, A y G.
En determinadas realizaciones, X25 es I, y/o X26 es F, y/o X27 es D, y/o X28 es P, y/o X29 es V, y/o X30 es H o T, y/o X31 es F o W y/o X32 es D.
En algunas realizaciones, el polipéptido comprende un bucle BC y un bucle DE, o un bucle BC y bucle FG, o un bucle DE y un bucle FG o un bucle BC, un bucle DE y un bucle FG.
En algunas realizaciones, el bucle BC del polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 7-38. En otras realizaciones, el bucle DE comprende un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 39-45. En otras realizaciones más, el bucle FG comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 46-79. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos de bucle BC, DE o FG es al menos 80 % idéntica a una cualquiera de las SEQ ID NO: 7-38, 39-45 y 46-79, respectivamente. En otras realizaciones, el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 % idéntica a una cualquiera de las SEQ ID NO: 80-123, 228-239 y 252-273. En otras realizaciones más, el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 80-123, 228-239 y 252-273.
En algunas realizaciones, los polipéptidos comprenden las combinaciones de bucles BC, DE y FG como se muestra en la tabla 1. En una realizaciones, el polipéptido tiene los bucles BC, DE y FG como se expone en las SEQ ID NO: 34, 39 y 75, respectivamente.
En algunas realizaciones, el polipéptido comprende los bucles BC, DE y FG como se presenta en las SEQ ID NOs: 34, 39,y 75, respectivamente, en donde el bucle BC tiene 1, 2, 3, 4, 5 o 6 sustituciones de aminoácidos, tales como sustituciones de aminoácidos conservativas. En algunas realizaciones, el bucle BC tiene una secuencia de aminoácidos según la fórmula X33-L-P-X34-X35-X36-X37-X38- X39, en donde X33 es T o Y; X34 es Y, N, R, F, G, S o T; X35 es A, P, S, F, H, N o R; X36 es A; X37 es H, L, R, V, N, D, F o I; X38 es L, G, M, F, I o V; y X39 es H.
En algunas realizaciones, el polipéptido comprende los bucles BC, DE y FG como se presenta en las SEQ ID NOs: 34, 39 y 75, respectivamente, en donde el bucle DE tiene 1 sustitución de aminoácido, tal como una sustitución de aminoácido conservativa. En algunas realizaciones, el bucle DE tiene una secuencia de aminoácidos según la fórmula G-R-G-X40, en donde X40 es L.
En algunas realizaciones, el polipéptido comprende los bucles BC, DE y FG como se presenta en las SEQ ID NOs: 34, 39 y 75, respectivamente, en donde el bucle FG tiene 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 sustituciones de aminoácidos, tales como sustituciones de aminoácidos conservativas. En algunas realizaciones, el bucle FG tiene una secuencia de aminoácidos según la fórmula X41-X42-X43-X44-X45-X46- X47-X47-X48- X49 X50, en donde X41 es L o I; X42 es S; X43 es K, R, A, G, S, H, N, T o P; X44 es S, A, E, H, K o N; X45 es K, Q, D, E, N, T o S; X46 es V, I, F, L, M, P o T; X47 es I o Y; X48 es H, I, V, L, R, F, G, S o T; X49 es H; y X50 es M, L, R o V.
En algunas realizaciones, el polipéptido comprende los bucles BC, DE y FG como se presenta en las SEQ ID NOs: 34, 39 y 75, respectivamente, en donde el bucle BC tiene 1, 2, 3, 4, 5 o 6 sustituciones de aminoácidos, tales como sustituciones de aminoácidos conservativas, y el bucle DE tiene 1 sustitución de aminoácido, tal como una sustitución de aminoácido conservativa. En algunas realizaciones, el bucle BC tiene una secuencia de aminoácidos según la fórmula X33-L-P- X34-X35-X36-X37-X38-X39, en donde X33 es T o Y; X34 es Y, N, R, F, G, S o T; X35 es A, P, S, F, H, N o R; X36 es A; X37 es H, L, R, V, N, D, F, o I; X38 es L, G, M, F, I o V; y X39 es H, y el bucle DE tiene una secuencia de aminoácidos según la fórmula G-R-G-X40, en donde X40 es L.
En algunas realizaciones, el polipéptido comprende los bucles BC, DE y FG como se presenta en las SEQ ID NOs: 34, 39 y 75, respectivamente, en donde el bucle BC tiene 1, 2, 3, 4, 5 o 6 sustituciones de aminoácidos, tales como sustituciones de aminoácidos conservativas, y el bucle FG tiene 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 sustituciones de aminoácidos, tales como sustituciones de aminoácidos conservativas. En algunas realizaciones, el bucle BC tiene una secuencia de aminoácidos según la fórmula X33-L-P- X34-X35-X36-X37-X38-X39, en donde X33 es T o Y; X34 es Y, N, R, F, G, S o T; X35 es A, P, S, F, H, N o R; X36 es A; X37 es H, L, R, V, N, D, F, o I; X38 es L, G, M, F, I o V; y X39 es H, y el bucle FG tiene una secuencia de aminoácidos según la fórmula X41-X42-X43- X44-X45-X46-X47-X48-X49-X50, en donde X41 es L o I; X42 es S; X43 es K, R, A, G, S, H, N, T o P; X44 es S, A, E, H, K o N; X45 es K, Q, D, E, N, T o S; X46 es V, I, F, L, M, P o T; X47 es I o Y; X48 es H, I, V, L, R, F, G, S o T; X49 es H; y X50 es M, L, R, o V.
En algunas realizaciones, el polipéptido comprende los bucles BC, DE y FG como se presenta en las SEQ ID NOs: 34, 39 y 75, respectivamente, en donde el bucle DE tiene 1 sustitución de aminoácido, tal como una sustitución de aminoácido conservativa, y el bucle FG tiene 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 sustituciones de aminoácidos, tales como sustituciones de aminoácidos conservativas. En algunas realizaciones, el bucle DE tiene una secuencia de aminoácidos según la fórmula G-R-G-X40, donde X40 es L, y el bucle FG tiene una secuencia de aminoácidos según la fórmula X41- X42-X43-X44-X45-X46-X47-X48-X49-X50, en donde X41 es L o I; X42 es S; X43 es K, R, A, G, S, H, N, T o P; X44 es S, A, E, H, K o N; X45 es K, Q, D, E, N, T o S; X46 es V, I, F, L, M, P o T; X47 es I o Y; X48 es H, I, V, L, R, F, G, S o T; X49 es H; y X50 es M, L, R o V.
En algunas realizaciones, el polipéptido comprende los bucles BC, DE y FG como se presenta en las SEQ ID NOs: 34, 39 y 75, respectivamente, en donde el bucle BC tiene 1, 2, 3, 4, 5 o 6 sustituciones de aminoácidos, tales como sustituciones de aminoácidos conservativas, y el bucle FG tiene 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 sustituciones de aminoácidos, tales como sustituciones de aminoácidos conservativas. En algunas realizaciones, el bucle BC tiene una secuencia de aminoácidos según la fórmula X33-L-P-X34-X35-X36-X37-X38-X39, en donde X33 es T o Y; X34 es Y, N, R, F, G, S o T; X35 es A, P, S, F, H, N o R; X36 es A; X37 es H, L, R, V, N, D, F o I; X38 es L, G, M, F, I o V; y X39 es H; el bucle DE tiene una secuencia de aminoácidos según la fórmula G-R-G-X40, en donde X40 es L; y el bucle FG tiene una secuencia de aminoácidos según la fórmula X41-X42-X43-X44-X45-X46-X47-X48-X49-X50, en donde X41 es L o I, X42 es S; X43 es K, R, A, G, S, H, N, T o P; X44 es S, A, E, H, K o N; X45 es K, Q, D, E, N, T o S; X46 es V, I, F, L, M, P o T; X47 es I o Y; X48 es H, I, V, L, R, F, G, S o T; X49 es H; y X50 es M, L, R o V.
En algunas realizaciones, el polipéptido comprende los bucles BC, DE y FG como se presenta en las SEQ ID NOs: 34, 39 y 75, y tiene sustituciones de aminoácidos en los bucles BC, DE y FG que permiten que el polipéptido mantenga la unión a miostatina. Dichas sustituciones de aminoácidos pueden determinarse, por ejemplo, mediante exploración mutacional profunda como se describe en el ejemplo 8. En consecuencia, en algunas realizaciones, el polipéptido tiene un bucle BC que comprende una secuencia de aminoácidos según la fórmula X51-X52-X53-X54-X55X56-X57-X58-X59, en donde: X51 se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, F, H, I, K, L, N, Q, R, S, T, V, W e Y;
X52 se selecciona del grupo que consiste en L, M y V; X53 se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, E, I, K, L,
M, N, P, Q, R, S, T, V e Y; X54 se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T,
V, W e Y; X55 se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y; X56 se selecciona del grupo que consiste en G y S; X57 se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, E, F, G, H, I, K,
L, M, N, Q, R, S, T, V, W e Y; X58 se selecciona del grupo que consiste en A, C, G, L, M, S y T; y X59 se selecciona del grupo que consiste en A, C, F, H, N, P, Q, R, S e Y. En una realización preferida, X51 se selecciona del grupo que consiste en C, F, I, S, V, W e Y; X52 se selecciona del grupo que consiste en L; X53 se selecciona del grupo que consiste en P; X54 se selecciona del grupo que consiste en C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W e Y; X55 se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y; X56 se selecciona del grupo que consiste en G; X57 se selecciona del grupo que consiste en A, C, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, V, W e Y; X58 se selecciona del grupo que consiste en A, G, L, M y S; y X59 se selecciona del grupo que consiste en C, H, N, Q, S e Y. En una realización más preferida, X51 se selecciona del grupo que consiste en F, S y W; X52 se selecciona del grupo que consiste en E; X53 se selecciona del grupo que consiste en P; X54 se selecciona del grupo que consiste en
C, F, G, I, K, E, M, N, R, S, T, V, W e Y; X55 se selecciona del grupo que consiste en A, C, E, F, H, I, K, L, M, P, Q, R,
S, T, V e Y; X56 se selecciona del grupo que consiste en G; X57 se selecciona del grupo que consiste en A, C, H, K,
L, M, N, R, V, W e Y; X58 se selecciona del grupo que consiste en A, G y L; y X59 se selecciona del grupo que consiste en H, N y Q. En una realización específica, X51 S; X52 es L; X53 es P; X54 es H; X55 es Q X58 es A; X59 es N.
En algunas realizaciones, el polipéptido comprende un bucle DE que comprende una secuencia de aminoácidos según la fórmula G-R-G-X60, en donde X60 es A, C, D, E, F, I, K, L, M, N, Q, S, T y V. En una realización preferida,
X60 es C, E, I, L, M, Q, T y V. En una realización más preferida, X60 es C, E, I, L, M y V. En una realización específica, X60 es V.
En algunas realizaciones, el polipéptido comprende un bucle FG que comprende una secuencia de aminoácidos según la fórmula X61-X62-X63-X64-X65-X66-X67-X68-X69-X70, en donde X61 se selecciona del grupo que consiste en A, C,
F, I, L, M, Q, T, V, W e Y; X62 se selecciona del grupo que consiste en A, C, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W e
Y; X63 se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y; X64 se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y; X65 se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W e Y; X66 se selecciona del grupo que consiste en A, C, F, H, I, L, M, N, P, S, T, V, W e Y; X67 se selecciona del grupo que consiste en A, C, E, F, H, I, K, L,
M, N, Q, R, S, T, V, W e Y; X68 se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S,
T, V, W e Y; X69 se selecciona del grupo que consiste en F, W e Y; y X70 se selecciona del grupo que consiste en A,
C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y. En una realización preferida, X61 se selecciona del grupo que consiste en A, C, I, E, M y V; X62 se selecciona del grupo que consiste en C, F, H, I, L, M, Q, R, S, T, V, W e Y; X63 se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, S, T, V, W e Y; X64 se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W e Y; X65 se selecciona del grupo que consiste en A, D, E, F, G, H, I, L, M, N, Q, S, T, V, W e Y; X66 se selecciona del grupo que consiste en C, F, I, L, M,
P, T, V, W e Y; X67 se selecciona del grupo que consiste en C, F, H, I, K, E, M, N, Q, R, T, V, W e Y; X68 se selecciona del grupo que consiste en A, C, E, F, G, I, K, E, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y; X69 se selecciona del grupo que consiste en W e Y; y X70 se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, E, G, H, K, L, M, N, P, Q, R, S, T y V.
En una realización más preferida, X61 se selecciona del grupo que consiste en I y V; X62 se selecciona del grupo que consiste en C, F, I, L, M, T, V, W e Y; X63 se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, Q,
S, T y V; X64 se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, F, G, I, L, M, N, Q, S, T, V, W e Y; X65 se selecciona del grupo que consiste en A, G, S, T y W; X66 se selecciona del grupo que consiste en F, I, V, W e Y; X67 se selecciona del grupo que consiste en F, H, I, L, M, V, W e Y; X68 se selecciona del grupo que consiste en A, C, F, G,
I, K, L, M, T, V y W; X69 se selecciona del grupo que consiste en W e Y; y X70 se selecciona del grupo que consiste en A, G, K, L, M, P, Q y R. En una realización específica, X61 es V; X62 es T; X63 es D; X64 es T; X65 es G; X66 es Y;
X67 es L; X68 es K; X69 es Y; y X70 es K.
En algunas realizaciones, el polipéptido comprende bucles BC, DE y FG, en donde el bucle BC comprende una secuencia de aminoácidos según la fórmula X51-X52- X53-X54-X55-X56-X57-X58-X59, en donde, X51 se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, F, H, I, K, F, N, Q, R, S, T, V, W e Y; X52 se selecciona del grupo que consiste en F,
M y V; X53 se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, E, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V e Y; X54 es A, C, D, E, F,
G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W e Y; X55 se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, E, F, G, H, I, K, E, M,
N, P, Q, R, S, T, V, W e Y; X56 se selecciona del grupo que consiste en G y S; X57 es A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M,
N, Q, R, S, T, V, W e Y; X58 es A, C, G, L, M, S y T; y X59 es A, C, F, H, N, P, Q, R, S e Y; el bucle DE comprende una secuencia de aminoácidos según la fórmula G-R-G- X60, en donde X60 se selecciona del grupo que consiste en
A, C, D, E, F, I, K, L, M, N, Q, S, T y V; y el bucle FG comprende una secuencia de aminoácidos según la fórmula
X61-X62-X63-X64-X65-X66-X67-X68-X69-X70, en donde X61 se selecciona del grupo que consiste en A, C, F, I, L, M, Q, T,
V, W e Y; X62 es A, C, F, G, H, I, K, E, M, N, Q, R, S, T, V, W e Y; X63 se selecciona del grupo que consiste en A, C,
D, E, F, G, H, I, K, E, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y; X64 se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, E, F, G, H,
I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y; X65 se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q,
R, S, T, V, W e Y; X66 se selecciona del grupo que consiste en A, C, F, H, I, E, M, N, P, S, T, V, W e Y; X67 se selecciona del grupo que consiste en A, C, E, F, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W e Y; X68 se selecciona del grupo
que consiste en A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y; X69 se selecciona del grupo que consiste en F, W e Y; y X70 se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, E, F, G, H, I, K, E, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y.
En una realización, el polipéptido de la invención comprende bucles BC, DE y FG, en donde el bucle BC comprende una secuencia de aminoácidos según la fórmula X51-X52-X53-X54-X55-X56-X57-X58-X59, en donde, X51 se selecciona del grupo que consiste en C, F, I, S, V, W e Y; X52 es E; X53 es P; X54 se selecciona del grupo que consiste en C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W e Y; X55 se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y; X56 es G; X57 se selecciona del grupo que consiste en A, C, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, V, W e Y; X58 se selecciona del grupo que consiste en A, G, L, M y S; y X59 se selecciona del grupo que consiste en C, H, N, Q, S e Y; el bucle DE comprende una secuencia de aminoácidos según la fórmula G-R-G-X60, en donde X60 se selecciona del grupo que consiste en C, E, I, L, M, Q, T y V; y el bucle FG comprende una secuencia de aminoácidos según la fórmula X61-X62-X63-X64-X65-X66-X67-X68-X69-X70, en donde X61 se selecciona del grupo que consiste en A, C, I, L, M y V; X62 es C, F, H, I, L, M, Q, R, S, T, V, W e Y; X63 se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, S, T, V, W e Y; X64 se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W e Y; X65 se selecciona del grupo que consiste en A, D, E, F, G, H, I, L, M, N, Q, S, T, V, W e Y; X66 se selecciona del grupo que consiste en C, F, I, L, M, P, T, V, W e Y; X67 se selecciona del grupo que consiste en C, F, H, I, K, E, M, N, Q, R, T, V, W e Y; X68 se selecciona del grupo que consiste en A, C, E, F, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y; X69 se selecciona del grupo que consiste en W e Y; y X70 se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, E, F, G, H, I, K, E, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y.
En una realización más preferida, el polipéptido de la invención comprende bucles BC, DE y FG, en donde el bucle BC comprende una secuencia de aminoácidos según la fórmula X51-X52-X53-X54-X55-X56-X57-X58-X59. en donde X51 se selecciona del grupo que consiste en F, S y W; X52 es L; X53 es P; X54 se selecciona del grupo que consiste en C, F, G, I, K, L, M, N, R, S, T, V, W e Y; X55 se selecciona del grupo que consiste en A, C, E, F, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V e Y; X56 es G; X57 se selecciona del grupo que consiste en A, C, H, K, L, M, N, R, V, W e Y; X58 se selecciona del grupo que consiste en A, G y L; y X59 se selecciona del grupo que consiste en H, N y Q; el bucle DE comprende una secuencia de aminoácidos según la fórmula G-R-G-X60, en donde X60 se selecciona del grupo que consiste en C, E, I, L, M y V; y el bucle FG comprende una secuencia de aminoácidos según la fórmula X61-X62-X63-X64-X65-X66-X67-X68-X69-X70, en donde X61 se selecciona del grupo que consiste en I y V; X62 es C, F, I, L, M, T, V, W e Y; X63 se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, Q, S, T y V; X64 se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, F, G, I, E, M, N, Q, S, T, V, W e Y; X65 se selecciona del grupo que consiste en A, G, S, T y W; X66 se selecciona del grupo que consiste en F, I, V, W e Y; X67 se selecciona del grupo que consiste en F, H, I, E, M, V, W e Y; X68 se selecciona del grupo que consiste en A, C, F, G, I, K, E, M, T, V y W; X69 se selecciona del grupo que consiste en W e Y; y X70 se selecciona del grupo que consiste en A, G, K, E, M, P, Q y R.
En una realización específica, el polipéptido de la invención comprende bucles BC, DE y FG, en donde el bucle BC comprende una secuencia de aminoácidos según la fórmula X51-X52- X53-X54-X55-X56-X57-X58-X59, en donde, X51 es S; X52 es L; X53 es P; X54 es H; X55 es Q; X56 es G; X57 es K; X58 es A; X59 es N; el bucle DE comprende una secuencia de aminoácidos según la fórmula G-R-G- X60, en donde X60 es V; y el bucle FG comprende una secuencia de aminoácidos según la fórmula X61-X62-X63-X64-X65-X66-X67-X68-X69-X70, en donde X61 es V; X62 es T; X63 es D; X64 es T; X65 es G; X66 es Y; X67 es L; X68 es K; X69 es Y; y X70 es K.
En otra realización, el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos un 80 %, un 85 %, un 90 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 %, un 99 % o un 100 % a la secuencia de aminoácidos expuesta en las SEQ ID NO: 273 [PRD-1474], SEQ ID NO: 118 [3116_A06], SEQ ID NO: 281 [secuencia de Adnectina núcleo de PRD-1474 y 3116_A06 precedida por la secuencia de extensión N-terminal (GVSDVPRDL) y seguido por una cola C-terminal (EI)], o SEQ ID NO: 331 [secuencia de Adnectina núcleo de Pr D-1474 y 3116_A06 sin una secuencia líder N-terminal o cola C-terminal]. En otra realización más, el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos un 80 %, un 85 %, un 90 %, un 95 %, un 98 %, un 99 % o un 100 % a las regiones del bucle que no son BC, DE, y FG de SEQ ID NO: 118, 273, 281 o 331.
En otro aspecto, la invención proporciona polipéptidos que se unen a un sitio de unión a Adnectina discontinuo en miostatina. En algunas realizaciones, los polipéptidos se unen a una región dentro de los aminoácidos 55-66 de la miostatina (SEQ ID NO: 3). En algunas realizaciones, los polipéptidos se unen a una región dentro de los aminoácidos 85-101 de la miostatina (SEQ ID NO: 3). Además en otras realizaciones, los polipéptidos se unen dentro de dos regiones, los aminoácidos 85-101 y 55-66, de la miostatina (SEQ ID NO: 3).
En algunas realizaciones, los polipéptidos de la invención no compiten por la unión a miostatina con ActRIIB. En algunas realizaciones, los polipéptidos de la invención compiten por la unión a miostatina con ALK4 y/o ALK5.
En algunas realizaciones, los polipéptidos y se han descrito anteriormente pueden comprender uno o más restos farmacocinéticos (PK) tales como polietilenglicol, ácido siálico, Fc, fragmento de Fc, transferrina, albúmina de suero, una proteína de unión a albúmina de suero, y una proteína de unión a inmunoglobulina en suero. En una realización, el resto PK es una proteína de unión a albúmina de suero que comprende un dominio 10Fn3 que se une a, por ejemplo, HSA. En otra realización, el resto PK es Fc y puede estar sobre cualquiera del extremo N- o C-terminal del polipéptido, y opcionalmente puede formar un dímero. Además en otras realizaciones, el resto PK es polietilenglicol. En algunas realizaciones, el resto PK y el polipéptido se unen mediante al menos un enlace disulfuro, un enlace peptídico, un polipéptido, un azúcar polimérico o un resto de polietilenglicol.
En otro aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un polipéptido que se ha descrito anteriormente, que opcionalmente está libre de endotoxina.
En otro aspecto, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un polipéptido que se ha descrito anteriormente, un vector de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos, y una célula que comprende el ácido nucleico que codifica el polipéptido. En otro aspecto, la invención proporciona un método para producir el polipéptido anti-miostatina mediante cultivo de la célula.
En otro aspecto, la invención proporciona un método para atenuar o inhibir una enfermedad o trastorno relacionados con la miostatina en un sujeto mediante la administración de una cantidad eficaz del polipéptido o composición que comprende un polipéptido que se ha descrito anteriormente. En algunas realizaciones, la enfermedad que se va a tratar es distrofia muscular, esclerosis lateral amiotrófica, miositis por cuerpos de inclusión (IBM), enfermedad pulmonar obstructiva crónica, insuficiencia cardiaca crónica, cáncer, SIDA, insuficiencia renal, enfermedad renal crónica, uremia, artritis reumatoide, sarcopenia, desgaste muscular debido al reposo en cama prolongado, lesión de la médula espinal, apoplejía, fractura ósea, envejecimiento, diabetes, obesidad, hiperglucemia, caquexia, osteoartritis, osteoporosis, infarto de miocardio, o fibrosis.
En otro aspecto, la invención proporciona un método para atenuar o inhibir un trastorno asociado con degeneración o desgaste muscular en un sujeto.
En otro aspecto, la invención proporciona un método para administrar el polipéptido para aumentar la masa muscular, aumentar el número de células musculares, aumentar el tamaño de las células musculares, aumentar la resistencia muscular, rendimiento físico y/o resistencia en el sujeto.
En otro aspecto, la invención proporciona un método para atenuar o inhibir un trastorno metabólico en un sujeto. En algunas realizaciones, el trastorno metabólico es diabetes (p. ej., diabetes de tipo II), hiperglucemia, hiperinsulinemia, hiperlipidemia, resistencia a la insulina, alteración del metabolismo de la glucosa, lipodistrofia, obesidad o síndrome metabólico. En algunas realizaciones, se puede administrar una segunda composición terapéutica. En algunas realizaciones, la administración del polipéptido da como resultado un aumento de la sensibilidad a la insulina, aumento de la absorción de glucosa por células, disminución de los niveles de glucosa en sangre, y/o disminución de la grasa corporal.
En otro aspecto, la invención proporciona un método para aumentar la masa muscular magra en un sujeto que comprende la administración de una cantidad eficaz de un polipéptido o composición que se han descrito anteriormente.
En otro aspecto, la invención proporciona un método para aumentar la proporción de masa muscular magra con respecto a grasa en un sujeto que comprende la administración de una cantidad eficaz de un polipéptido o composición que se han descrito anteriormente.
En otro aspecto, la invención proporciona kits que comprenden un polipéptido o composición que se han descrito anteriormente, e instrucciones para su uso.
En otro aspecto, la invención proporciona métodos para detectar o medir miostatina en una muestra que comprenden poner en contacto la muestra con un polipéptido que se ha descrito anteriormente, y detectar o medir la unión del polipéptido a la miostatina.
En otro aspecto, la invención se refiere a Adnectinas que se unen a anti-miostatina para su uso para atenuar o inhibir una enfermedad o trastorno relacionados con la miostatina, para atenuar o inhibir un trastorno asociado con degeneración o desgaste muscular, aumentar la masa muscular, aumentar el número de células musculares, aumentar el tamaño de las células musculares, aumentar la resistencia muscular, rendimiento físico y/o resistencia, para atenuar o inhibir un trastorno metabólico, aumentar la masa muscular magra, y/o aumentar la proporción de masa muscular magra con respecto a grasa, en un sujeto. En algunas realizaciones, las Adnectinas anti-miostatina son las que se describen en la presente memoria, p. ej., las Adnectinas anti-miostatina que se presentan en las SEQ ID NOs: 80-123, 228-239, y 252-273.
En otro aspecto, la invención se refiere al uso de las Adnectinas que se unen a anti-miostatina para preparar un medicamento para atenuar o inhibir una enfermedad o trastorno relacionados con la miostatina, para atenuar o inhibir un trastorno asociado con degeneración o desgaste muscular, aumentar la masa muscular, aumentar el número de células musculares, aumentar el tamaño de las células musculares, aumentar la resistencia muscular, rendimiento físico y/o resistencia, para atenuar o inhibir un trastorno metabólico, aumentar la masa muscular magra, y/o aumentar la proporción de masa muscular magra con respecto a grasa, en un sujeto. En algunas realizaciones, las Adnectinas anti-miostatina son las que se describen en la presente memoria, p. ej., las Adnectinas anti-miostatina que se presentan en las SEQ ID NOs: 80-123, 228-239, y 252-273.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 muestra un alineamiento de secuencias de aminoácidos de Adnectina anti-miostatina a modo de ejemplo. Las secuencias de aminoácidos de los bucles BC, DE, y FG se identifican con letra subrayada, cursiva/subrayada o en negrita/subrayada, respectivamente.
La Figura 2 representa un análisis basado en WebLogo de los restos variados del bucle BC de la familia 1979_B06 de Adnectinas anti-miostatina. Se indica la frecuencia de aminoácidos en cada posición del bucle BC que se variaron durante la PROfusión. La imagen se creó usando WebLogo (Crooks GE, Hon G, Chandonia JM, Brenner SE. WebLogo: A sequence logo generator. Genome Research 2004; 14: 1188-1190).
La Figura 3 representa un análisis basado en WebLogo de los restos variados del bucle DE de la familia 1979_B06 de Adnectinas anti-miostatina. Se indica la frecuencia de aminoácidos en cada posición del bucle DE que se variaron durante la PROfusión.
La Figura 4 representa un análisis basado en WebLogo de los restos variados del bucle FG de la familia 1979_B06 de Adnectinas anti-miostatina. Se indica la frecuencia de aminoácidos en cada posición del bucle FG que se variaron durante la PROfusión.
La Figura 5 representa un análisis basado en WebLogo de los restos variados del bucle BC de la familia 2062_G02 de Adnectinas anti-miostatina. Se indica la frecuencia de aminoácidos en cada posición del bucle BC que se variaron durante la PROfusión.
La Figura 6 representa un análisis basado en WebLogo de los restos variados del bucle DE de la familia 2062_G02 de Adnectinas anti-miostatina. Se indica la frecuencia de aminoácidos en cada posición del bucle DE que se variaron durante la PROfusión.
La Figura 7 representa un análisis basado en WebLogo de los restos variados del bucle FG de la familia 2062_G02 de Adnectinas anti-miostatina. Se indica la frecuencia de aminoácidos en cada posición del bucle FG que se variaron durante la PROfusión.
La Figura 8 representa un gráfico que muestra la correlación de datos bioquímicos y basados en células para proteínas mutantes de alanina discretas de Adnectina 3116_A06, con su capacidad relativa en rastreo mutacional profundo según la posición de la secuencia.
La Figura 9 representa un gráfico que muestra la correlación de ERnorm a partir de rastreo mutacional profundo de NGS de mutaciones de alanina de Adnectina 3116_A06 con la CI50 medida por HTRF. Se indican los compartimentos para mutaciones de un solo sitio preferibles, más preferibles, y las más preferibles para unión a miostatina.
La Figura 10 representa un gráfico de un ensayo de unión competitiva (ELISA competitivo) que muestra que las Adnectinas PRD-1285, PRD-1286, y PRD-1288 no bloquean la unión de miostatina a ActRIIb-Fc. Se indica el % de competición de unión de ActRIIb-Fc a miostatina. Como se esperaba, la construcción de ActRIIb-Fc de control positivo competía con la unión de ActRIIb-Fc a miostatina.
La Figura 11 representa un gráfico que muestra los efectos de diversas concentraciones de las Adnectinas PRD-1285, PRD-1286, y PRD-1288 en la actividad de miostatina en un Ensayo de ARE-luciferasa. Las condiciones experimentales son como se describe en el Ejemplo 3. Cada una de PRD-1285, PRD-1286, y PRD-1288 inhibió un 100 % de la actividad de ARE-luciferasa inducida por miostatina.
La Figura 12 es un esquema que representa el mecanismo de acción mediante el cual las Adnectinas de la presente invención inhiben la actividad de la miostatina. El complejo de señalización nativo se muestra en la Fig. 12A. de forma específica, la unión de la miostatina a ActRIIb va seguido por el reclutamiento de quinasa 4 similar al receptor de activina (ALK4) o ALK5, y ActRIIb y ALK4/5 se unen a distintas regiones de la miostatina. Las Adnectinas de la presente invención previenen la unión de ALK4/5, pero no de ActRIIb, a la miostatina (Fig. 12B).
La Figura 13 nuestro modelo informático que representa el complejo de 3116_A06 y miostatina. La Fig. 13A nuestra estructura de la miostatina sola (color gris), con los sitios de unión de ALK4 y de ActRIIB indicados. Las regiones en las que 3116_A06 se une a la miostatina (es decir, las Regiones 1 y 2) se indican en color negro, tal como se determina a partir de experimentos que se describen en el Ejemplo 11. La Fig. 13B muestra un complejo preferible de 3116_A06 (color negro) y miostatina (color gris) obtenido a partir de un protocolo de replicación como se describe en el Ejemplo 12. Las regiones 1 y 2 de la miostatina, tal como se identifican con HDX-MS (Ejemplo 11), se representan en el espacio relleno solo en un lado de la molécula, y los bucles BC, DE, y FG de 3116_A06 se representan en la representación de barras. Aunque esta figura muestra una Adnectina unida a uno de los dos sitios de unión a Adnectina, se debe tener en cuenta que se podría ocupar un sitio de unión a Adnectina individual, o ambos sitios de unión a Adnectina podrían estar ocupados.
La Figura 14 representa un gráfico de barras que muestra los aumentos porcentuales en el peso corporal en el día 15 en ratones tratados con las Adnectinas anti-miostatina indicadas en comparación con los ratones de control. Los ratones B6 SCID se trataron cada dos semanas o semanalmente con inyecciones subcutáneas de Adnectinas anti miostatina durante 14 días, como se describe en el Ejemplo 13. Los pesos corporales se midieron durante todo el periodo de tratamiento; se representan los valores calculados de cambio porcentual para el día 15. (* = indica diferencias estadísticas con respecto al grupo de control respectivo; p < 0,01 ensayo T).
La Figura 15 representa un gráfico de barras que muestra los aumentos en el volumen muscular de la pierna (en cm3) en el día 15 en ratones tratados con las Adnectinas anti-miostatina indicadas en comparación con ratones de control. Los ratones B6 SCID se trataron cada dos semanas o semanalmente con inyecciones subcutáneas de Adnectinas anti-miostatina durante 14 días como se describe en el Ejemplo 13. (* = indica diferencias estadísticas con respecto al grupo de control respectivo; p < 0,05 ensayo T).
La Figura 16 representa un gráfico de barras que muestra los aumentos en el volumen muscular de la pierna (en cm3) en el día 28 en ratones tratados con las diversas dosis indicadas de PRD-1474. Los ratones B6 SCID se trataron cada dos semanas o semanalmente con inyecciones subcutáneas de PRD-1474 durante 28 días como se describe en el Ejemplo 14. (*p < 0,0001; # no significativo entre grupos).
Descripción detallada de la invención
Definiciones
A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente memoria tienen el mismo significado que normalmente entiende alguien con experiencia en la técnica. Aunque cualquier método y composición similar o equivalente a las que se describen en la presente memoria se puede usar en la práctica o ensayo de la presente invención, los métodos y composiciones preferibles se describen en la presente memoria.
"Miostatina de longitud completa" como se usa en la presente memoria se refiere a la secuencia de polipéptidos de longitud completa que se describe en McPherron et al., (1997), mencionado anteriormente, así como a polipéptidos de longitud completa relacionados incluyendo variantes alélicas y homólogos interespecies. El término "miostatina" o "miostatina madura" se refiere a fragmentos de la miostatina madura biológicamente activa, así como a péptidos relacionados incluyendo variantes alélicas, variantes de corte y empalme, y péptidos y polipéptidos de fusión. Se ha informado que la proteína C-terminal madura tiene una identidad de secuencia de un 100 % entre muchas especies incluyendo ser humano, ratón, pollo, porcino, pavo, y rata (Lee et al., PNAS 2001; 98: 9306). La secuencia para la prepromiostatina humana es:
MQKLQLCVYIYLFMLIVAGPYDLNENSEQKENVEKEGLCNACTWRQNTKSSRIEAIK
IQILSKLRLET APNIS KD VIRQLLPKAPPLRELIDQYD V QRDDS SDGSLEDDD YH ATTE
TIITMPTESDFLMQVDGKPKCCFFKFSSKIQYNKVVKAQLWIYLRPVETPTTVFVQIL
n T t t / t u / r T 7 ' r \ ^ r r n ' \ 7 r m T n o t t ^ t r \ i t y r \ T r » n rm m r r v f ' T r N T rT 7'r n t t r v x m r T T / T v n r ir \ T T n T F T T / a t f \ f i N m v r i v u v u o i i s . i i o i ín o i^ j v l l j ivi in r u i u i v v v k i v vv i ^ J v v ^ r n o i N i a t i e ^ a l u e
NGHDLAVTFPGPGEDGLNPFLEVKVTDTPKRSRRDFGLDCDEHSTESRCCRYPLTVD
FEAFGWDWIIAPKRYKANYCSGECEFYFLQKYPHTHLVHQANPRGSAGPCCTPTKM
SPINMLYFNGKEQIIYGKIPAMVVDRCGCS (SEQ ID NO: 1)
La secuencia para la pro-miostatina humana es:
NENSEQKENVEKEGLCNACTWRQNTKSSRIEAIKIQILSKLRLETAPNISKDVIRQLLP
KAPPLRELIDQYDVQRDDSSDGSLEDDDYHATTETIITMPTESDFLMQVDGKPKCCFF
KFSSKIQYNKVVKAQLWIYLRPVETPTTVFVQILRLIKPMKDGTRYTGIRSLKLDMNP
GTGIWQSIDVKTVLQNWLKQPESNLGIEIKALDENGHDLAVTFPGPGEDGLNPFLEV
KVTDTPKRSRRDFGLDCDEHSTESRCCRYPLTVDFEAFGWDWIIAPKRYKANYCSGE
CEFVFLQKYPHTHLVHQANPRGSAGPCCTPTKMSPINMLYFNGKEQIIYGKIPAMVV
DRCGCS (SEQ ID NO: 2)
La secuencia para la miostatina madura (conservada en ser humano, murino, rata, pollo, pavo, perro, caballo, y cerdo) es:
DFGLDCDEHSTESRCCRYPLTVDFEAFGWDWIIAPKRYKANYCSGECEFVFLQKYPH
THLVHQANPRGSAGPCCTPTKMSPINMLYFNGKEQIIYGKIPAMVVDRCGCS (SEQ
ID NO: 3).
"Polipéptido" como se usa en la presente memoria se refiere a cualquier secuencia de dos o más aminoácidos, independientemente de la longitud, modificación posterior a la traducción, o función. "Polipéptido", "péptido" y "proteína" se usan indistintamente en la presente memoria. Los polipéptidos pueden incluir aminoácidos naturales y aminoácidos no naturales, tales como los descritos en el documento de Patente de Estados Unidos N.° 6.559.126. Los polipéptidos también se pueden modificar en cualquiera de una diversidad de formas químicas convencionales (p. ej., un aminoácido se puede modificar con un grupo protector; el aminoácido carboxi terminal se puede convertir en un grupo amido terminal; el resto amino terminal se califica con grupos para, p. ej., aumentar la lipofilia; o el polipéptido se puede glicosilar por vía química o modificar de otro modo para aumentar la estabilidad o semivida in vivo). Las modificaciones en los polipéptidos pueden incluir la unión de otra estructura tal como un compuesto cíclico u otra molécula al polipéptido y también pueden incluir polipéptidos que contienen uno o más aminoácidos en una configuración alterada (es decir, R o S; o, L o D). Los péptidos de la invención son proteínas obtenidas a partir del décimo dominio de tipo III de fibronectina que se han modificado para unirse a la miostatina y en la presente memoria se denominan, "Adnectina anti-miostatina" o "Adnectina de miostatina".
Una "cadena polipeptídica", como se usa en la presente memoria, se refiere a un polipéptido en donde cada uno de los dominios del mismo está unido a otro(s) dominio(s) mediante enlace(s) peptídico(s), a diferencia de las interacciones no covalentes o enlaces disulfuro.
Un polipéptido "aislado" es uno que ha sido identificado y separado y/o recuperado a partir de un componente de su entorno natural. Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que podrían interferir con los usos diagnósticos o terapéuticos del polipéptido, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteicos o no proteicos. En realizaciones preferidas, el polipéptido se purificará (1) hasta más de un 95 % en peso de polipéptido tal como se determina mediante el método de Lowry, y lo más preferiblemente más de un 99 % en eso, (2) hasta un grado suficiente como para obtener al menos restos de la secuencia de aminoácidos N-terminal o interna mediante el uso de un agente secuestrador de copa giratoria, o (3) hasta homogeneidad por SDS-PAGE en condiciones reductoras o no reductoras usando azul de Coomassie o, preferiblemente, tinción con plata. El polipéptido aislado incluye el polipéptido in situ dentro de las células recombinantes, ya que al menos un componente del entorno natural del polipéptido no estará presente. Normalmente, sin embargo, el polipéptido aislado se preparará mediante al menos una etapa de purificación.
"Porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoácidos" en la presente memoria se define como el porcentaje de restos de aminoácido en una secuencia candidata que son idénticos a los restos de aminoácidos en una secuencia seleccionada, después de alinear las secuencias e introducir espacios, si fuera necesario, para conseguir el porcentaje máximo de identidad de secuencia, y no considerando ninguna sustitución conservativa como parte de la identidad de secuencia. El alineamiento para fines de determinar el porcentaje de identidad de la secuencia de aminoácidos se puede conseguir de diversas maneras que están dentro de la habilidad en la técnica, por ejemplo, usando un software informático disponible al público tal como BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 o Megalign (DNASTAR™). Los expertos en la técnica pueden determinar fácilmente los parámetros apropiados para medir el alineamiento, incluyendo los algoritmos necesarios para lograr un alineamiento máximo con respecto a toda la longitud de las secuencias que se comparan. Por ejemplo, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos dada A, con, o en contra de una secuencia de aminoácidos B dada (que como alternativa se puede expresar como una secuencia de aminoácidos A dada que tiene o que comprende un cierto % de identidad de secuencia de aminoácidos para, con o contra una secuencia de aminoácidos B) determinada se calcula de la siguiente manera: 100 veces la fracción X/Y, donde X es el número de restos de aminoácidos puntúa los como coincidencias idénticas por el programa de alineamiento de secuencias ALIGN-2 en ese alineamiento del programa de A y B, y donde Y es el número total de restos de aminoácido en B. Se observará que cuando la longitud de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos B, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de A a B no será igual al % de identidad de secuencia de aminoácidos de B a A.
Como se usa en la presente memoria, "sustitución conservativa" se refiere al reemplazo de un resto de aminoácido por otro, sin alterar la conformación y función general del péptido, que incluye, pero no se limita a, reemplazo de un aminoácido por uno que tiene propiedades similares (tales como, por ejemplo, polaridad, potencial de formación de enlaces de hidrógeno, ácido, básico, forma, hidrófobo, aromático y similares). Los aminoácidos con propiedades similares son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, arginina, histidina y lisina son aminoácidos hidrófilos básicos y pueden ser intercambiables. Del mismo modo, isoleucina, un aminoácido hidrófobo, se puede reemplazar con leucina, metionina o valina. Los aminoácidos hidrófilos neutros, que se pueden sustituir por otro, incluyen asparagina, glutamina, serina y treonina. Por "sustituido"' o "modificado" la presente invención incluye los aminoácidos que se han alterado o modificado a partir de aminoácidos de origen natural. Como tal, se debería entender que en el contexto de la presente invención una sustitución conservativa se reconoce en la técnica como una sustitución de un aminoácido por otro aminoácido que tiene propiedades similares.
Como se usa en la presente memoria, la expresión "sitio de unión a Adnectina" se refiere al sitio o parte de una proteína (p. ej., miostatina) interactúa o se une a una Adnectina en particular (p. ej., al igual que un epítopo es reconocido por un anticuerpo). Los sitios de unión a Adnectina se pueden formar a partir de aminoácidos contiguos o aminoácidos no contiguos yuxtapuestos mediante el plegamiento terciario de una proteína. Los sitios de unión a Adnectina formados por aminoácidos contiguos generalmente son retenidos al exponerse a disolventes desnaturalizantes, mientras que los sitios de unión a Adnectina formados por el plegamiento terciario generalmente se pierden en el tratamiento de disolventes desnaturalizantes.
Un sitio de unión a Adnectina para una Adnectina anti-miostatina de la invención se puede terminar mediante la aplicación de técnicas convencionales usadas generalmente para formación de mapas de epítopos de anticuerpos que incluyen, pero no se limitan a, formación de mapas de proteasa y análisis mutacional. Como alternativa, un sitio de unión a Adnectina se puede determinar mediante ensayo de competición usando una Adnectina o anticuerpo de referencia que se une al mismo polipéptido, p. ej., miostatina (como se describe adicionalmente a continuación en la sección "Adnectinas de Competición Cruzada y/o Adnectinas que se Unen al Mismo Sitio de Unión a Adnectina". Si la Adnectina de ensayo y la molécula de referencia (p. ej., otra Adnectina o anticuerpo) compiten, entonces se unen al mismo sitio de unión a Adnectina o a sitios de unión a Adnectina suficientemente próximos de modo que la unión de una molécula interfiere con la otra.
Las expresiones "se une de forma específica", "unión específica", "unión selectiva", y "se une de forma selectiva" tal como se usan indistintamente en la presente memoria se refieren a una Adnectina que presenta afinidad hacia una miostatina, pero que no se une de forma significativa (p. ej., una unión de menos de aproximadamente un 10 %) a un polipéptido diferente tal como se mide con una técnica disponible en la técnica tal como, pero que no se limita a, análisis de Scatchard y/o ensayos de unión competitiva (p. ej., ELISA de competición, ensayo de BIACORE). La expresión también se puede aplicar cuando, p. ej., un dominio de unión de una Adnectina de la invención es específico para la miostatina.
La expresión "se une preferentemente" como se usa en la presente memoria se refiere a la situación en la que una Adnectina de la invención se une a la miostatina en más de al menos aproximadamente un 20 % de lo que se une un polipéptido diferente tal como se mide con una técnica disponible en la técnica tal como, pero que no se limita a, análisis de Scatchard y/o ensayos de unión competitiva (p. ej., ELISA de competición, ensayo de BIACORE).
Como se usa en la presente memoria, la expresión "reactividad cruzada" se refiere a una Adnectina que se une a más de una proteína distinta que tiene sitios de unión a Adnectina idénticos o muy similares.
El término "Kd", como se usa en la presente memoria, pretende hacer referencia a la constante de equilibrio de disociación de una interacción de Adnectina-proteína en particular (p. ej., miostatina) o la afinidad de una Adnectina hacia una proteína (p. ej., miostatina), tal como se mide usando un ensayo de resonancia de plasmón superficial o un ensayo de unión celular. Una "Kd deseada", como se usa en la presente memoria, se refiere a una Kd de una Adnectina que es suficiente para los fines que se contemplan. Por ejemplo, una Kd deseada puede hacer referencia a la Kd de una Adnectina requerida para provocar un efecto funcional en un ensayo in vitro, p. ej., un ensayo de luciferasa a base de células.
El término "kasoc", como se usa en la presente memoria, pretende hacer referencia a la constante de tasa de asociación para la asociación de una Adnectina en el complejo de Adnectina/proteína.
El término "kdisoc", como se usa en la presente memoria, pretende hacer referencia a la constante de tasa de disociación para la disociación de una Adnectina del complejo de Adnectina/proteína.
El término "CI50", como se usa en la presente memoria, se refiera la concentración de una Adnectina inhibir la respuesta, ya sea en un ensayo in vitro o un ensayo in vivo, hasta un nivel que es un 50 % de la respuesta inhibitoria máxima, es decir, a medio camino entre la respuesta inhibitoria máxima y la respuesta sin tratar.
La expresión "actividad de miostatina" como se usa en la presente memoria se refiere a una o más de actividades reguladoras del crecimiento o morfogenéticas asociadas con la unión de proteína miostatina activa a ActRIIb y el posterior reclutamiento de Alk4 o Alk5. Por ejemplo, la miostatina activa es un regulador negativo de la masa del músculo esquelético. La miostatina activa también puede modular la producción de enzimas específicas del músculo (p. ej., creatina quinasa), estimular la proliferación de mioblastos, y modular la diferenciación a preadipocitos. La actividad de la miostatina se puede determinar usando métodos reconocidos en la técnica, tales como los que se describen en la presente memoria.
Las expresiones "inhibir la actividad de miostatina" o "antagonizar la actividad de miostatina" o "antagonizar la miostatina" se usan indistintamente para hacer referencia a la capacidad de las Adnectinas anti-miostatina de la presente invención para neutralizar o antagonizar una actividad de miostatina in vivo o in vitro. Los términos "inhibir" o "neutralizar" como se usan en la presente memoria con respecto a una actividad de una Adnectina de la invención se refieren a la capacidad para antagonizar, prohibir, prevenir, limitar, disminuir, interrumpir, eliminar, parar, reducir o revertir básicamente, p. ej., la progresión a la gravedad de lo que se está inhibiendo que incluye, pero no se limita a, Una actividad por propiedad biológica, una enfermedad o una afección. La inhibición o neutralización es preferiblemente al menos aproximadamente un 10 %, un 20 %, un 30 %, un 40 %, un 50 %, un 60 %, un 70 %, un 80 %, un 90 %, un 95 % o más elevada.
Por ejemplo, una Adnectina anti-miostatina de la invención puede reducir los niveles circulantes de miostatina biológicamente activa que se encuentra normalmente en un sujeto vertebrado, o una reducción de los niveles circulantes de la miostatina biológicamente activa en sujetos con trastornos que dan como resultado niveles circulantes de miostatina elevados. Una reducción de la actividad de la miostatina se puede determinar usando ensayos in vitro, p. ej., ensayos de unión, como se describe en la presente memoria. Como alternativa, una reducción en la actividad de la miostatina puede dar como resultado un aumento del peso corporal, un aumento de la masa muscular, un aumento de la resistencia muscular, una alteración de la proporción de músculo con respecto a grasa, un aumento de la masa muscular sin grasa, un aumento del tamaño y/o número de células musculares, y/o una reducción del contenido de grasa corporal.
El término "PK" es un acrónimo para "farmacocinético" incluye propiedades de un compuesto que incluyen, a modo de ejemplo, absorción, distribución, metabolismo, y eliminación por un sujeto. Una "proteína de modulación PK" o "resto PK" como se usa en la presente memoria se refiere a cualquier proteína, péptido, por esto que influye en las propiedades farmacocinéticas de una molécula biológicamente activa cuando se fusiona a o se administra en conjunto con la molécula biológicamente activa. Los ejemplos de una proteína de modulación PK o resto PK incluyen PEG, aglutinantes de albúmina de suero humano (HSA) (como se describe en las Publicaciones de Estados Unidos N.os 2005/0287153 y 2007/0003549, Publicaciones de PCT N.os WO 2009/083804 y WO 2009/133208), albúmina de suero humano, Fc o fragmentos de Fc y variantes de los mismos, y azúcares (p. ej., ácido siálico).
La "semivida" de una secuencia de aminoácidos o compuesto generalmente se puede definir como el tiempo necesario para que la concentración en suero del polipéptido se reduzca en un 50 %, in vivo, por ejemplo debido a la degradación de la secuencia o compuesto y/o eliminación o secuestro de la secuencia o compuesto mediante mecanismos naturales. La semivida se puede determinar de una manera conocida per se, tal como mediante análisis farmacocinético. Las técnicas adecuadas serán evidentes para la persona con experiencia en la técnica, y generalmente pueden implicar, por ejemplo, las etapas de administración de forma adecuada a un sujeto de una dosis adecuada de la secuencia de aminoácidos o compuesto de la invención; extraer muestras de sangre u otras muestras del sujeto a intervalos regulares; determinan el nivel o concentración de la secuencia de aminoácidos o compuesto de la invención en dicha muestra de sangre; y calcular, a partir de (una representación de) los datos obtenidos de ese modo, el tiempo hasta que el nivel o concentración de la secuencia de aminoácidos o compuesto de la invención se ha reducido en un 50 % en comparación con el nivel inicial después de la dosificación. Se hace referencia, por ejemplo, a los manuales convencionales, tales como Kenneth, A. et al., Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists y en Peters et al., Pharmacokinete Analysis: A Practical Approach (1996). También se hace referencia a Gibaldi, M. et al., Pharmacokinetics, 2a Rev. Edición, Marcel Dekker (1982). La semivida se puede expresar usando parámetros tales como la t1/2-alfa, t1/2-beta, HL_Lambda_z, y el área bajo la curva (AUC). En la presente memoria descriptiva, un "aumento de la semivida" se refiere a un aumento en uno cualquiera de estos parámetros, cualesquiera dos de estos parámetros, cualesquiera tres de estos parámetros o los cuatro de estos parámetros. Un "aumento de la semivida" en particular se refiere a un aumento en la t1/2-beta, y/o HL_Lambda_z, ya sea con o sin un aumento en la t1/2-alfa y/o el AUC o ambos.
Las notaciones "mpk", "mg/kg", o "mg por kg" se refieren a miligramos por kilogramo. Todas las notaciones se usan de forma intercambiable a través de la presente descripción.
Los términos "individuo", "sujeto", y "paciente", se usan indistintamente en la presente memoria, se refieren a un animal, preferiblemente un mamífero (incluyendo un no primate y un primate) o especie aviar, que incluye, pero no se limita a, murinos, simios, seres humanos, animales de granja mamíferos (p. ej., bovino, porcino, ovino), animales del deporte en mamíferos (p. ej., equino), y mascotas coniferas (p. ej., canino y felino); preferiblemente el término se refiere a seres humanos. El término también se refiere a especies aviares, que incluyen, pero no se limitan, pollos y pavos. En una realización determinada, el sujeto, preferiblemente un mamífero, preferiblemente un ser humano, se caracteriza adicionalmente con una enfermedad o trastorno o afección que se podría beneficiar de una disminución del nivel o una disminución de la bioactividad de la miostatina. En otra realización el sujeto, preferiblemente un mamífero, preferiblemente un ser humano, se caracteriza adicionalmente por estar en riesgo de desarrollo de un trastorno, enfermedad o afección que se podría beneficiar de una disminución del nivel de la miostatina o una disminución de la bioactividad de la miostatina.
La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a al menos la dosis mínima, pero menos que una dosis tóxica, de un agente que es necesario para transmitir un beneficio terapéutico a un sujeto. Por ejemplo, una cantidad terapéuticamente eficaz de una Adnectina anti-miostatina de la invención es una cantidad que, en mamíferos, preferiblemente seres humanos, da como resultado uno o más de los siguientes: un aumento en el volumen muscular y/o resistencia muscular, una disminución de la grasa corporal, un aumento de la sensibilidad a insulina, o el tratamiento de afecciones en donde la presencia de la miostatina causa o contribuye a un efecto patológico no deseable o una disminución de los niveles de miostatina da como resultado un efecto terapéutico beneficioso.
El término "débil" o "debilidad" como se usa en la presente memoria se refiere a una afección que se puede caracterizar por dos o más síntomas de debilidad, pérdida de peso, disminución de la movilidad, fatiga, niveles bajos de actividad, resistencia escasa, y alteración de la respuesta de comportamiento a pistas sensoriales. Un elemento distintivo de la debilidad es la "sarcopenia", o la pérdida de masa muscular relacionada con la edad.
El término "caquexia" como se usa en la presente memoria se refiere a la condición de debilitamiento muscular acelerado y pérdida de masa muscular magra que puede resultar de diversas enfermedades.
Visión de conjunto
La invención proporciona nuevos polipéptidos que se unen a y antagonizan la miostatina (en la presente memoria denominadas "Adnectinas anti-miostatina"). Con el fin de identificar antagonistas de miostatina, la miostatina se presentó a grandes bibliotecas sintéticas de Adnectinas. Las adnectinas que se unen a la miostatina se identificaron sistemáticamente para unión a miostatina, para propiedades biofísicas, y para actividad inhibitoria de miostatina. Las Adnectinas anti-miostatina se mutaron y se sometieron a presión selectiva adicional mediante la disminución de la concentración diana y a la selección de Adnectinas anti-miostatina con tasas de disociación lentas. A partir de este proceso de optimización, una familia de Adnectinas se identificó como inhibidores específicos de miostatina con actividad bioquímica y biofísica favorable. Las Adnectinas anti-miostatina que se describen en la presente solicitud son útiles para el tratamiento de trastornos, enfermedades, y afecciones para las cuales se sabe que la inhibición de la miostatina es beneficiosa, incluyendo, pero no limitándose a, el tratamiento de trastornos de debilitamiento muscular, trastornos metabólicos, y atrofia muscular debido a inactividad.
Como se describe en Rebbapragada et al., (MCB 2003; 23: 7230-42), la ruta de señalización de miostatina implica la unión de miostatina a ActRIIb, seguido por el reclutamiento de la quinasa 4 similar al receptor de activina (ALK4) o ALK5. La unión a las ALK induce la fosforilación de Smad2/Smad3, seguido por la activación de la ruta de señalización similar a TGFp (véase, p. ej., Rebbapragada et al., MCB 2003; 23: 7230-42).
I. Armazones a Base de Fibronectina
Un aspecto de la solicitud proporciona Adnectinas anti-miostatina que comprenden un dominio Fn3 en el que uno o más de los bucles accesibles al disolvente se ha aleatorizado o mutado. En algunas realizaciones, el dominio Fn3 es un dominio Fn3 obtenido a partir del décimo módulo de tipo silvestre del dominio de fibronectina de tipo III humana (10Fn3):
VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVOEFTVPGSKSTAT
ISGLKPGYDYTITYYAYTGRGDSPASSKPISINYRT (SEQ ID NO: 4)
(los bucles BC, DE, y FG están subrayados).
En otras realizaciones, las secuencias de unión al ligando de 10Fn3, es decir, el "armazón de 10Fn3", se pueden alterar con la condición de que el 10Fn3 retenga la función de unión al ligando y/o estabilidad estructural. Se ha informado de una diversidad de armazones de 10Fn3 mutantes. En un aspecto, una o más de Asp 7, Glu 9, y Asp 23 se reemplaza con otro aminoácido, tal como, por ejemplo, un resto de aminoácido con carga negativa (p. ej., Asn, Lys, etc.). Se ha informado que estas mutaciones tienen el efecto de estimular una estabilidad mayor del 10Fn3 mutante a pH neutro en comparación con la forma de tipo silvestre (véase, p. ej., Publicación de PCT N.° WO 02/04523). Se ha descrito una diversidad de alteraciones adicionales en el armazón de 10Fn3 que son beneficiosas o neutras. Véase, por ejemplo, Batori et al., Protein Eng., 15 (12): 1015-1020 (diciembre de 2002); Koide et al., Biochemistry, 40 (34): 10326-10333 (28 de agosto de 2001).
Las proteínas de 10Fn3 tanto variantes como de tipo silvestre se caracterizan por la misma estructura, en particular siete secuencias de dominio de hebra beta designadas de A a G y seis regiones de bucle (bucle AB, bucle BC, bucle CD, bucle DE, bucle EF, y bucle FG) que conectan con las siete secuencias de dominio de la beta. Las hebras beta colocadas más cerca de los extremos N- y C-terminales pueden adoptar una conformación similar a la estructura beta en solución. En la SEQ ID NO: 4, el bucle AB corresponde a los restos 15-16, el bucle BC corresponde a los restos 21-30, el bucle CD corresponde a los restos 39-45, el bucle DE corresponde a los restos 51-56, el bucle EF corresponde a los restos 60-66, y el bucle FG corresponde a los restos 76-87 (Xu et al., Chemistry & Biology, 9: 933­ 942, 2002).
Por consiguiente, en algunas realizaciones, la Adnectina anti-miostatina es un polipéptido de 10Fn3 que es idéntico en al menos un 40 %, un 50 %, un 60 %, un 65 %, un 70 %, un 75 %, un 80 %, un 85 %, o un 90 % al 10Fn3 de dominio humano, que se muestran en la SEQ ID NO: 4. Una gran parte de la variabilidad generalmente se producirá en uno o más de los bucles. Cada una de las hebras beta o similares a hebras beta de un polipéptido 10Fn3 pueden consistir básicamente en una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos un 80 %, un 85 %, un 90 %, un 95 % o un 100 % a la secuencia de una hebra beta o hebra similar a beta de SEQ ID NO: 4, con la condición de que una variación de ese tipo no altere la estabilidad del polipéptido en condiciones fisiológicas.
En algunas realizaciones, la invención proporciona una Adnectina anti-miostatina que comprende un décimo dominio de fibronectina de tipo III (10Fn3), en donde el dominio 10Fn3 comprende un bucle, AB; un bucle, BC; un bucle, CD; un bucle, DE; un bucle EF; y un bucle FG; y tiene al menos un bucle seleccionado del bucle BC, DE y FG con una secuencia de aminoácidos alterada con respecto a la secuencia del bucle correspondiente del dominio 10Fn3 humano. En algunas realizaciones, las Adnectinas anti-miostatina de la presente invención comprenden un dominio 10Fn3 que comprende una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos un 80 %, un 85 %, un 90 %, un 95 %, un 98 %, un 99 % o un 100 % a las regiones que no son bucle de SEQ ID NO: 4, en donde al menos un bucle seleccionado de BC, DE y FG se altera. En algunas realizaciones, los bucles BC y FG están alterados y, en algunas realizaciones, los bucles BC, DE y FG están alterados, es decir, los dominios 10Fn3 comprenden bucles de origen no natural. En algunas realizaciones, los bucles AB, CD y/o EF están alterados. Por "alterado" se hace referencia a una o más alteraciones en la secuencia de aminoácidos con respecto a la secuencia molde (que corresponde al dominio de fibronectina humana) incluye adiciones, deleciones, sustituciones de aminoácidos o una combinación de las mismas. La alteración de una secuencia de aminoácidos de conseguir a través de variación de secuencia intencionada, con ocultación, o espontáneo, generalmente de una secuencia codificante de ácido nucleico, y se puede producir mediante cualquier técnica, por ejemplo, PCR, PCR propensa a error, o síntesis química de ADN.
En algunas realizaciones, la longitud de uno o más bucles seleccionados entre BC, DE y FG se puede ampliar o acortar con respecto al bucle de fibronectina humana correspondiente. En algunas realizaciones, la longitud del bucle se puede ampliar en 2-25 aminoácidos. En algunas realizaciones, la longitud del bucle puede disminuirse en 1­ 11 aminoácidos. Para optimizar la unión al antígeno, por lo tanto, la longitud de un bucle de 10Fn3 se puede alterar en su longitud así como en su secuencia para obtener la flexibilidad y afinidad más elevadas posibles en la unión al antígeno.
En algunas realizaciones, el polipéptido comprende un dominio Fn3 que comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos un 80, un 85, un 90, un 95, un 98, un 99, o un 100 % a las regiones que no son bucle de SEQ ID NO: 4, en donde al menos un bucle seleccionado de BC, DE y FG está alterado. En algunas realizaciones, el bucle BC alterado tiene hasta 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 sustituciones de aminoácidos, hasta 1, 2, 3 o 4 supresiones de aminoácidos, hasta 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 inserciones de aminoácidos o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, el bucle DE alterado tiene hasta 1,2, 3, 4, 5 o 6 sustituciones de aminoácidos, hasta 1, 2, 3 o 4 supresiones de aminoácidos, hasta 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o 13 inserciones de aminoácidos o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, el bucle FG tiene hasta 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 sustituciones de aminoácidos, hasta 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o 11 supresiones de aminoácidos, hasta 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 ,17 ,18 ,19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 inserciones de aminoácidos, o una combinación de los mismos.
Las Adnectinas Anti-miostatina de la invención se basan en un armazón de 10Fn3 y se definen generalmente mediante la siguiente secuencia:
EVVAAT (Z)aSLLI(Z)xYYRITY GE(Z)bQEFT V (Z)yATI(Z)cD YTITVY AV (Z)zISIN YRT
(SEQ ID NO: 5),
en donde el bucle AB se representa con (Z)a, el bucle CD se representa con (Z)b, el bucle EF se representa con (Z)e, el bucle BC se representa con (Z)x, el bucle DE se representa con (Z)y, y el bucle FG se representa con (Z)z. Z representa cualquier aminoácido y el subíndice que sigue a la Z representa un número entero de número de aminoácidos. En particular, a puede ser cualquiera entre 1-15, 2-15, 1-10, 2-10, 1-8, 2-8, 1-5, 2-5, 1-4, 2-4, 1-3, 2-3, o 1-2 aminoácidos; y cada uno de b, c, x y z pueden ser independientemente cualquiera de 2-20, 2-15, 2-10, 2-8, 5­ 20, 5-15, 5-10, 5-8, 6-20, 6-15, 6-10, 6-8, 2-7, 5-7, o 6-7 aminoácidos. En realizaciones preferidas, a son 2 aminoácidos, b son 7 aminoácidos, c son 7 aminoácidos, x son 11 aminoácidos, y son 6 aminoácidos, y z son 12 aminoácidos. Las secuencias de las hebras beta puede ser cualquiera de 0 a 10, de 0 a 8, de 0 a 6, de 0 a 5, de 0 a 4, de 0 a 3, de 0 a 2, o de 0 a 1 sustituciones, deleciones o adiciones a través de las 7 regiones de armazón con respecto a los aminoácidos correspondientes que se muestran en la SEQ ID NO: 4. En ciertas realizaciones, las secuencias de las hebras beta pueden ser cualquiera de 0 a 10, de 0 a 8, de 0 a 6, de 0 a 5, de 0 a 4, de 0 a 3, de 0 a 2, o de 0 a 1 sustituciones conservativas a través de las 7 regiones de armazón con respecto a los aminoácidos correspondientes que se muestran en la SEQ ID NO: 4. En ciertas realizaciones, los restos de aminoácido núcleos se fijan y se produce cualquier sustitución, sustitución conservativa, deleción o adición en los restos distintos a los restos de aminoácido núcleos.
Como alternativa, las Adnectinas anti-miostatina de la invención se basan en un armazón de 10Fn3 y se definen generalmente con la secuencia:
EVVAATPTSLLI(Z)xYYRITYGETGGNSPVQEFTV(Z)yATISGLKPGVD YTITVY AV(Z)z
I SIN YRT (SEQ ID NO: 6)
en donde el bucle BC se representa con (Z)x, el bucle DE se representa con (Z)y, y el bucle FG se representa con (Z)z. Z representa cualquier aminoácido y el subíndice que sigue a la Z representa un número entero del número de aminoácidos. En particular, cada uno de x, y y z pueden ser cualquiera de 2-20, 2-15, 2-10, 2-8, 5-20, 5-15, 5-10, 58, 6-20, 6-15, 6- 10, 6-8, 2-7, 5-7 o 6-7 aminoácidos. En realizaciones preferidas, x son 11 aminoácidos, y son 6 aminoácidos, y z son 12 aminoácidos. Las secuencias de las hebras de cada pueden tener cualquiera de 0 a 10, de 0 a 8, de 0 a 6, de 0 a 5, de 0 a 4, de 0 a 3, de 0 a 2, o de 0 a 1 sustituciones, deleciones o adiciones a través de las 7 regiones de armazón con respecto a los aminoácidos correspondientes que se muestran en la SEQ ID NO: 1. En ciertas realizaciones, las secuencias de las hebras beta pueden tener cualquiera de 0 a 10, de 0 a 8, de 0 a 6, de 0 a 5, de 0 a 4, de 0 a 3, de 0 a 2, o de 0 a 1 sustituciones conservativas a través de las 7 regiones de armazón con respecto a los aminoácidos correspondientes que se muestran en la SEQ ID NO: 4. En ciertas realizaciones, los restos de aminoácido núcleos se fijan y cualquier sustitución, sustitución conservativa, deleción o adición en los restos distintos a los restos de aminoácido núcleos.
En ciertas realizaciones, una Adnectina anti-miostatina que se describe en la presente memoria puede comprender la secuencia tal como se presenta en la SEQ ID NO: 5 o 6, en donde al menos uno de los bucles BC, DE y FG representados mediante (Z)x , (Z)y , y (Z)z , respectivamente, está alterado. Como se ha descrito anteriormente, los restos de aminoácido que corresponden a los restos 21-30, 51-56, y 76-87 de SEQ ID NO: 4 definen los bucles BC, DE, y FG, respectivamente. Sin embargo, se debería entender que no es necesario modificar cada residuo dentro de la región de bucle un aglutinante de 10Fn3 que tenga una fuerte afinidad hacia una villana deseada (p. ej., miostatina).
Por ejemplo, no es necesario modificarlos restos 21 (S) y 22 (W) del bucle BC como se muestra en la SEQ ID NO: 1 para su unión a la miostatina. Es decir, los dominios 10Fn3 con una afinidad de unión elevada a la miostatina se pueden obtener mediante modificación solamente de los restos 23-30 del bucle BC como se muestra en la SEQ ID NO: 4. Esto se demuestra en los bucles BC que se ponen a modo de ejemplo en la Tabla 1, que indica que solamente se modifican las posiciones subrayadas.
Del mismo modo, no es necesario modificar las posiciones 51 (P) y 56 (T) del bucle DE como se muestra en la SEQ ID NO: 4 para su unión a la miostatina. Es decir, los dominios 10Fn3 con una afinidad de unión elevada a la miostatina se pueden obtener por modificación solamente de los restos 52-55 del bucle DE como se muestra en la SEQ ID NO: 4. esto se demuestra en los bucles DE que se ponen a modo de ejemplo en la Tabla 1, que indica que solamente se alteraron los restos que se extienden a las posiciones subrayadas.
Del mismo modo, no es necesario modificar las posiciones 76 (T) y 87 (P) del bucle FG como se muestra en la SEQ ID NO: 1 para su unión a la miostatina. Es decir, los dominios 10Fn3 con una afinidad de unión elevada a la miostatina se pueden obtener por modificación solamente de los restos 77-86 del bucle FG como se muestra en la SEQ ID NO: 4. Esto se demuestra en los bucles FG que se ponen a modo de ejemplo en la Tabla 1, que indica que Solamente se alteraron los restos que se extienden a las posiciones subrayadas.
Por consiguiente, en algunas realizaciones, las regiones de los bucles BC, DE, y FG de las Adnectinas antimiostatina de la invención se pueden describir según secuencias consenso. Estas secuencias consenso se ponen a modo de ejemplo con los bucles BC, DE, y FG que se muestran en la Tabla 1, y tal como se determina mediante análisis WebLogo (Figs. 2-7) (Crooks GE, Hon G, Chandonia JM, Brenner SE. WebLogo: A sequence logo generator. Genome Research 2004; 14: 1188-1190). El análisis WebLogo genera una firma de aminoácido que refleja la frecuencia de los aminoácidos en cada posición alterada del bucle BC, DE, o FG.
Por ejemplo, en algunas realizaciones, el bucle BC, (Z)x , se define por la secuencia consenso X1-L-P-X2-X3-X4-X5-X6-X7 , en donde, X1 es S, T o Y; X2 es H, Y, N, R, F, G, S o T; X3 es A, P, Q, S, F, H, N o R; X4 es G o A; X5 H, L, R, V, N, D, F, I o K; X6 es A, L, G, M, F, I o V; y X7 es H o N. En ciertas realizaciones preferidas, el bucle BC comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre las SEQ ID NOs: 7, 11-21,23-31,34, y 36-38. En una realización, el bucle BC comprende el aminoácido que se presenta en la SEQ ID NO: 34.
En algunas realizaciones, el bucle DE, (Z)y , se define por la secuencia consenso G-R-G-Xs , en donde Xs es V o L. En ciertas realizaciones preferidas, el bucle DE comprende un aminoácido seleccionado entre las SEQ ID NOs: 39 y 42. En una realización, el bucle DE comprende el aminoácido que se presenta en la SEQ ID NO: 39.
En algunas realizaciones, el bucle FG, (Z)z , se define con la secuencia consenso X9 -X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18, en donde X9 es L, V o I; X10 es T o S; X11 es K, R, A, G, S, D, H, N, T o P; X12 es S, T, A, E, H, K o N; X13 es K, G, Q, D, E, N, T o S; X14 es V, I, F, L, M, P, T o Y; X15 es I, L o Y; X16 es H, I, V, K, L, R, F, G, S o T; X17 es Y o H; y X18 es K, M, L, R o V. En ciertas realizaciones preferidas, el bucle FG comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre las SEQ ID NOs: 46, 50-62, 64-72, 75-77, y 79. En una realización, el bucle FG comprende el aminoácido que se presenta en la SEQ ID NO: 75.
En otras realizaciones, el bucle BC, (Z)x , se define por la secuencia consenso X19-X20-P-X21-G-X22-A, en donde X19 es D, E, V o W; X20 es A, S o V; X21 es R, A, G, K o L; y X22 es L o R. En ciertas realizaciones preferidas, el bucle BC comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre las SEQ ID NOs: 8-10, 22, 32, 33, y 35.
En otras realizaciones, el bucle DE, (Z)y , se define por la secuencia consenso X23-G-R-G-X24, en donde X23 es V, P, F, I o L; y X24 es S, N o T. En ciertas realizaciones preferidas, el bucle DE comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre las SEQ ID NOs: 40, 41, y 43-45.
En otras realizaciones, el bucle FG, (Z)z, se define por la secuencia consenso X25-X26-R-X27-G-X28-X29-X30-X31-X32, en donde X25 es I o V; X26 es F, D o Y; X27 es D o T; X28 es P, M, V o T; X29 es V, L, N, R o S; X30 es H, T, L, N, Q o S; X31 es F, W, Y, H o L; y X32 es D, A o G. En ciertas realizaciones preferidas, el bucle FG comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre las SEQ ID NOs: 47-49, 63, 73, 74, y 78.
Por consiguiente, en determinadas realizaciones, la invención proporciona una Adnectina anti-miostatina que comprende un bucle BC, (Z)x , que tiene la secuencia X1-L-P-X2-X3-X4-X5-X6-X7 y un bucle DE, (Z)y , que tiene la secuencia G-R-G-X8, como se ha definido anteriormente. En ciertas realizaciones, el bucle BC comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre las SEQ ID NOs: 7, 11-21, 23-31, 34, y 36-38, y el bucle DE comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre las SEQ ID NOs: 39 y 42. En una realización, los bucles BC y DE comprenden las secuencias de aminoácidos que se presentan en las SEQ ID NOs: 34 y 39, respectivamente.
En ciertas realizaciones, la Adnectina anti-miostatina comprende un bucle BC, (Z)x , que tiene la secuencia X1-L-P-X2-X3-X4-X5-X6-X7 y un bucle FG, (Z)z , que tiene la secuencia X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18, como se ha definido anteriormente. En ciertas realizaciones, el bucle BC comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre las SEQ ID NOs: 7, 11-21, 23-31, 34, y 36-38, y el bucle FG comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre las SEQ ID NOs: 46, 50-62, 64-72, 75-77, y 79. En una realización, los bucles BC y FG comprenden las secuencias de aminoácidos que se presentan en las SEQ ID NOs: 34 y 75, respectivamente.
En ciertas realizaciones, la Adnectina anti-miostatina comprende un bucle DE, (Z)y , que tiene la secuencia G-R-G-X8 y un bucle FG, (Z)z, que tiene la secuencia X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18, como se ha definido anteriormente. En ciertas realizaciones, el bucle DE comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre las SEQ ID NOs: 39 y 42, y el bucle FG comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre las SEQ ID NOs: 46, 50-62, 64-72, 75-77, y 79. En una realización, los bucles DE y FG comprenden las secuencias de aminoácidos que se presentan en las SEQ ID NOs: 39 y 75, respectivamente.
En ciertas realizaciones, la Adnectina anti-miostatina comprende un bucle BC, (Z)x , que tiene la secuencia X1-L-P-X2-X3-X4-X5-X6-X7 , un bucle DE, (Z)y , que tiene la secuencia G-R-G-X8 y un bucle FG, (Z)z, que tiene la secuencia X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18, como se ha definido anteriormente. En ciertas realizaciones, el bucle BC comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre las SEQ ID NOs: 7, 11-21, 23-31, 34, y 36-38, el bucle DE comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre las SEQ ID NOs: 39 y 42, y el bucle FG comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre las SEQ ID NOs: 46, 50-62, 64-72, 75-77, y 79. En una realización, los bucles BC, DE, y FG comprenden las secuencias de aminoácidos que se presentan en las SEQ ID NOs: 34, 39, y 75, respectivamente.
En otras realizaciones, la invención proporciona una Adnectina anti-miostatina que comprende un bucle BC, (Z)x , que tiene la secuencia X19-X20-P-X21-G-X22-A y un bucle DE, (Z)y , que tiene la secuencia X23-G-R-G-X24, como se ha definido anteriormente. En ciertas realizaciones, el bucle BC comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre las SEQ ID NOs: 8-10, 22, 32, 33, y 35 y el bucle DE comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre las SEQ ID NOs: 40, 41, y 43-45.
En otras realizaciones, la Adnectina anti-miostatina comprende un bucle BC, (Z)x , que tiene la secuencia X19-X20-P-X21-G-X22-A y un bucle FG, (Z)z , que tiene la secuencia X25-X26-R-X27-G-X28-X29-X30-X30-X32, como se ha definido anteriormente. En ciertas realizaciones, el bucle BC comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre las SEQ ID NOs: 8-10, 22, 32, 33, y 35 y el bucle FG comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre las SEQ ID NOs: 47-49, 63, 73, 74, y 78.
En otras realizaciones, la Adnectina anti-miostatina comprende un bucle DE, (Z)y , que tiene la secuencia X23-G-R-G-X24 y un bucle FG, (Z)z , que tiene la secuencia X25-X26-R-X27-G-X28-X29-X30-X30-X32, como se ha definido anteriormente. En ciertas realizaciones, el bucle DE comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre las SEQ ID NOs: 40, 41, y 43-45 y el bucle FG comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre las SEQ ID NOs: 47-49, 63, 73, 74, y 78.
En otras realizaciones, la Adnectina anti-miostatina comprende un bucle BC, (Z)x , que tiene la secuencia X19-X20-P-X21-G-X22-A, comprende un bucle DE, (Z)y , que tiene la secuencia X23-G-R-G-X24 y un bucle FG, (Z)z , que tiene la secuencia X25-X26-R-X27-G-X28-X29-X30-X30-X32, como se ha definido anteriormente. En realizaciones, el bucle BC comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre las SEQ ID NOs: 8-10, 22, 32, 33, y 35, el bucle DE comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre las SEQ ID NOs: 40, 41, y 43-45, y el bucle FG comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre las SEQ ID NOs: 47-49, 63, 73, 74, y 78.
En ciertas realizaciones preferidas, una Adnectina anti-miostatina de la invención comprende la secuencia se presenta en la SEQ ID NO: 5 o 6, en donde los bucles BC, DE y FG tal como se representan con (Z)x , (Z)y , y (Z)z, respectivamente, se reemplazan con un conjunto respectivo de bucles BC, DE, y FG que tienen las secuencias consenso de SEQ ID NOs: 7-38, 39-45, y 46-79, respectivamente.
En otras realizaciones preferidas, una Adnectina anti-miostatina de la invención comprende la secuencia se presenta en la SEQ ID NO: 5 o 6, en donde los bucles BC, DE y FG tal como se representan con (Z)x , (Z)y , y (Z)z, respectivamente, se reemplazan con un conjunto respectivo de bucles BC, DE, y FG que tienen secuencias idénticas en al menos un 75 %, un 80 %, un 85 %, un 90 %, un 95 %, un 97 %, un 98 %, o un 99 % a las secuencias de los bucles BC, DE o FG de los clones que se enumeran en la Tabla 1.
En realizaciones ilustrativas, una Adnectina anti-miostatina como se describe en la presente memoria se define por la SEQ ID NO: 5 y puede tener un respectivo conjunto de secuencias de los bucles BC, DE y FG de cualquiera de los clones que se enumeran en la Tabla 1. Por ejemplo, el clon 1979_B06 en la Tabla 1 comprende los bucles BC, DE, y FG como se presenta en las SEQ ID NOs: 7, 39, y 46, respectivamente. Por lo tanto, una Adnectina antimiostatina que se basa en estos bucles puede comprender la SEQ ID NO: 5 o 6, en donde (Z)x comprende SEQ ID NO: 7, (Z)y comprende SEQ ID NO: 39, y (Z)z comprende SEQ ID NO: 46. Se contemplan construcciones similares que usa en el conjunto de bucles BC, DE y FG de los otros clones en la Tabla 1, o las secuencias consenso de SEQ ID NOs: 7-38, 39-45, y 46-79, respectivamente. Las regiones del armazón de las Adnectinas anti-miostatina de ese tipo pueden comprender cualquiera de 0 a 20, de 0 a 15, de 0 a 10, de 0 a 8, de 0 a 6, de 0 a 5, de 0 a 4, de 0 a 3, de 0 a 2, o de 0 a 1 sustituciones, sustituciones conservativas, deleciones o adiciones con respecto a los restos de aminoácidos del armazón de SEQ ID NO: 4. Se pueden realizar modificaciones del armazón de ese tipo, siempre y cuando la Adnectina anti-miostatina sea capaz de unirse a la miostatina con una Kd deseada.
En ciertas realizaciones preferidas, el bucle BC de la Adnectina anti-miostatina de la invención comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: SWSLPHAGHVN (SEQ ID NO: 7), SWVSPRGRAR (SEQ ID NO: 8), SWEVPRGLAR (SEQ ID NO: 9), SWWAPLGLAR (SEQ ID NO: 10), SWTLPHAGLAH (SEQ ID NO: 11), SWYLPYPAHMN (SEQ ID NO: 12), SWSLPFAGHLN (SEQ ID NO: 13), SWSLPYSGLAN (SEQ ID NO: 14), SWSLPHAGHAH (SEQ ID NO: 15), SWTLPNFGLIN (SEQ ID NO: 16), SWTLPHAGRAH (SEQ ID NO: 17), SWSLPYAGHLN (SEQ ID NO: 18), SWSLPYAAHMN (SEQ ID NO: 19), SWSLPYPGHLN (SEQ ID NO: 20), SWSLPYAGHAH (SEQ ID NO: 21), SWDAPGGLAR (SEQ ID NO: 22), SWSLPTPGLAH (SEQ ID NO: 23), SWSLPHRGVAN (SEQ ID NO: 24), SWSLPSSGVAH (SEQ ID NO: 25), SWSLPHHGFGH (SEQ ID NO: 26), SWSLPHAGDAH (SEQ ID NO: 27), SWSLPHNGVAH (SEQ ID NO: 28), SWSLPRQGLAN (SEQ ID NO: 29), SWSLPGPGHFH (SEQ ID NO: 30), SWSLPHPGLGH (SEQ ID NO: 31), SWDAPRGLAR (SEQ ID NO: 32), SWDAPAGLAR (SEQ ID NO: 33), SWSLPHQGKAN (SEQ ID NO: 34), SWDAPKGLAR (SEQ ID NO: 35), SWSLPNPGIAH (SEQ ID NO: 36), SWSLPRPGNAH (SEQ ID NO: 37), y SWSLPNPGNAH (SEQ ID NO: 38).
En algunas realizaciones, el bucle BC de la Adnectina anti-miostatina de la invención comprende la parte subrayada de una cualquiera de las SEQ ID NOs: 7-38, como se muestra en la Tabla 1. En una realización, el bucle BC comprende la parte subrayada de la SEQ ID NO: 34.
En algunas realizaciones, el bucle DE de la Adnectina anti-miostatina de la invención comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: PGRGVT (SEQ ID NO: 39), PGRGST (SEQ ID NO: 40), LGRGST (SEQ ID NO: 41), PGRGLT (SEQ ID NO: 42), IGRGST (SEQ ID NO: 43), FGRGTT (SEQ ID NO: 44), y VGRGNT (SEQ ID NO: 45). En algunas realizaciones, el bucle DE de la Adnectina anti-miostatina de la invención comprende la parte subrayada de una cualquiera de las SEQ ID NOs: 39-45, como se muestra en la Tabla 1. En una realización, el bucle DE comprende la parte subrayada de la SEQ ID NO: 39.
En algunas realizaciones, el bucle FG de la Adnectina anti-miostatina de la invención comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: TLTKSQMIHYMP (SEQ ID NO: 46), TIYRDGMSHHDP (SEQ ID NO: 47), TVYRDGPLLLAP (SEQ ID NO: 48), TIFRTGMVQYDP (SEQ ID NO: 49), TLTNSEIILYKP (SEQ ID NO: 50), TLTKSQILHHRP (SEQ ID NO: 51), TLTRSKIIHYMP (SEQ ID NO: 52), TLTHSNIIRYVP (SEQ ID NO: 53), TVSSTKVIVYLP (SEQ ID NO: 54), TITKSTIIIYKP (SEQ ID NO: 55), TVTTTSVILYKP (SEQ ID NO: 56), TLTKSQLIHYMP (SEQ ID NO: 57), TLTRSQVIHYMP (SEQ ID NO: 58), TLTKSKIIHYMP (SEQ ID NO: 59), TVSSTKVIHYKP (SEQ ID NO: 60), TLTKSKVIHYMP (SEQ ID NO: 61), TVTTTKVIHYKP (SEQ ID NO: 62), TIDRDGVNHFAP (SEQ ID NO: 63), TVTHHGVIGYKP (SEQ ID NO: 64), TLTGANVIIYKP (SEQ ID NO: 35), TVTNTGVIIYKP (SEQ ID NO: 66), TVTATGIIIYKP (SEQ ID NO: 67), TVTRAGFYRYKP (SEQ ID NO: 68), TVTREEVISYKP (SEQ ID NO: 69), TVTAAGVIIYKP (SEQ ID NO: 70), TVTANQPIIYKP (SEQ ID NO: 71), TITPETIIVYKP (SEQ ID NO: 72), TIDRDGTRSFDP (SEQ ID NO: 73), TIFRDGPVTWDP (SEQ ID NO: 74), TVTDTGYLKYKP (SEQ ID NO: 75), TLTGSDTIFYKP (SEQ ID NO: 76), TVTGKDVIKYKP (SEQ ID NO: 77), TIFRDGVVNYGP (SEQ ID NO: 78), y TVTDTGFITYKP (SEQ ID NO: 79).
En algunas realizaciones, el bucle FG de la Adnectina anti-miostatina de la invención comprende la parte subrayada de una cualquiera de las SEQ ID NOs: 46-79, como se muestra en la Tabla 1. En una realización, el bucle FG comprende la parte subrayada de la SEQ ID NO: 75.
En algunas realizaciones, la Adnectina anti-miostatina de la invención comprende una secuencia de bucle BC seleccionada entre las secuencias de bucle BC que tienen las SEQ ID NOs: 7-38, o la parte subrayada de una cualquiera de las SEQ ID NOs: 7-38, como se muestra en la Tabla 1; una secuencia de bucle DE seleccionada entre las secuencias de bucle DE que tienen las SEQ ID NOs: 39-45, o la parte subrayada de una cualquiera de las SEQ ID NOs: 39-45 como se muestra en la Tabla 1; y una secuencia de bucle FG seleccionada entre las secuencias de bucle FG que tienen las SEQ ID NOS: 46-79, o la parte subrayada de una cualquiera de las SEQ ID NOS: 46-79 como se muestra en la Tabla 1. En algunas realizaciones, la Adnectina anti-miostatina de la invención comprende una secuencia de aminoácidos de bucle BC, DE y FG que es idéntica en al menos un 70 %, un 75 %, un 80 %, un 85 %, un 90 %, un 95 %, un 98 %, un 99 % o un 100 % a la de una cualquiera de las SEQ ID NOs: 7-38, 39-45, y 46­ 79, respectivamente. En otras realizaciones, la Adnectina anti-miostatina de la invención comprende una secuencia de aminoácidos de bucle BC, DE y FG que es idéntica en al menos un 70 %, un 75 %, un 80 %, un 85 %, un 90 %, un 95 %, un 98 %, un 99 % o un 100 % a la parte subrayada de una cualquiera de las SEQ ID NOS: 7-38, 39-45, y 46-79, respectivamente, como se muestra en la Tabla 1.
En algunas realizaciones, la Adnectina anti-miostatina comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NOs: 80-123, 228-239, y 252-273 (secuencias de longitud completa de las Tablas 2, 5, y 6). En una realización, la Adnectina anti-miostatina comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 273.
En algunas realizaciones, la Adnectina anti-miostatina comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos un 70 %, un 75 %, un 80 %, un 85 %, un 90 %, un 95 %, un 98 %, un 99 % o un 100 % a una cualquiera de las SEQ ID NOS: 80-123, 228-239, y 252-273. En otras realizaciones, la Adnectina anti-miostatina comprende una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos un 80 %, un 85 %, un 90 %, un 95 %, un 98 %, un 99 % o un 100 % a las regiones del bucle que no son BC, DE, y FG de SEQ ID NOs: 80-123, 228-239, y 252-273.
En una realización, la Adnectina anti-miostatina de la invención comprende los bucles BC, DE, y FG como se presenta en las SEQ ID NOs: 34, 39, y 75, respectivamente. En otra realización, la Adnectina anti-miostatina comprende una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos un 80 %, un 85 %, un 90 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 %, un 99 % o un 100 % a la secuencia de aminoácidos que se presenta en la SEQ ID NO: 273 [PRD-1474], SEQ ID NO: 118 [3116_A06], SEQ ID NO: 281 [secuencia de Adnectina núcleo compartida por PRD-1474 y 3116_A06, precedida por una secuencia de extensión N-terminal (GVSDVPRDL) y seguida por una cola C-terminal (EI)] o SeQ ID NO: 331 [secuencia de Adnectina núcleo de PRD-1474 y 3116_A06 sin una secuencia líder N-terminal o cola C-terminal]. La secuencia de Adnectina núcleo de PRD-1474 y 3116_A06 se presenta a continuación:
EVVAATPTSLLISWSLPHQGKANYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGRGVTATISGLKPG
VDYTITVYAVTVTDTGYLKYKPISINYRT (SEQ ID NO: 331)
Además en otra realización, la Adnectina anti-miostatina de la presente invención comprende una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos un 80 %, un 85 %, un 90 %, un 95 %, un 98 %, un 99 % o un 100 % a las regiones del bucle que no son BC, DE, y FG de SEQ ID NO: 118, 273, 281, o 331.
En una realización, la Adnectina anti-miostatina de la invención y que se describe en la presente memoria se puede describir en relación a la Adnectina anti-miostatina que comprende los bucles BC, DE, y FG como se presenta en las SEQ ID NOs: 34, 39, y 75.
Por consiguiente, en algunas realizaciones, la Adnectina anti-miostatina de la invención comprende los bucles BC, DE, y FG como se presenta en las SEQ ID NOs: 34, 39, y 75, respectivamente, en donde el bucle BC comprende 1, 2, 3, 4, 5, o 6 sustituciones de aminoácido, tal como sustituciones de aminoácido conservativas. Por consiguiente, en algunas realizaciones, el bucle BC se define por la secuencia consenso X33-L-P-X34-X35-X36-X37-X38-X39, en donde X33 es T o Y; X34 es Y, N, R, F, G, S, o T; X35 es A, P, S, F, H, N, o R; X36 es A; X37 es H, L, R, V, N, D, F, o I; X38 es L, G, M, F, I, o V; y X39 es H.
En algunas realizaciones, la Adnectina anti-miostatina de la invención comprende los bucles BC, DE, y FG como se presenta en las SEQ ID NOs: 34, 39, y 75, respectivamente, en donde el bucle DE comprende 1 sustitución de aminoácido, tal como una sustitución de aminoácido conservativa. En consecuencia, en algunas realizaciones, el bucle DE se define por la secuencia consenso G-R-G-X40, en donde X40 es L.
En algunas realizaciones, la Adnectina anti-miostatina de la invención comprende los bucles BC, DE, y FG como se presenta en las SEQ ID NOs: 34, 39, y 75, respectivamente en donde el bucle FG comprende 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, u 8 sustituciones de aminoácido, tal como sustituciones de aminoácido conservativas. Por consiguiente, en algunas realizaciones, el bucle FG se define por la secuencia consenso X41-X42-X43-X44-X45-X46-X47-X48-X49-X50, en donde X41 es L o I; X42 es S; X43 es K, R, A, G, S, H, N, T, o P; X44 es S, A, E, H, K, o N; X45 es K, Q, D, E, N, T, o S; X46 es V, I, F, L, M, P, o T; X47 es I o Y; X48 es H, I, V, L, R, F, G, S, o T; X49 es H; y X50 es M, L, R, o V.
En algunas realizaciones, la Adnectina anti-miostatina de la invención comprende los bucles BC, DE, y FG como se presenta en las SEQ ID NOs: 34, 39, y 75, respectivamente, en donde el bucle BC tiene 1, 2, 3, 4, 5, o 6 sustituciones de aminoácido, tal como sustituciones de aminoácido conservativas, y el bucle DE tiene 1 sustitución de aminoácido, tal como una sustitución de aminoácido conservativa. En algunas realizaciones, el bucle BC tiene una secuencia de aminoácidos según la fórmula X33-L-P-X34-X35-X36-X37-X38-X39, en donde X33 es T o Y; X34 es Y, N, R, F, G, S, o T; X35 es A, P, S, F, H, N, o R; X36 es A; X37 es H, L, R, V, N, D, F, o I; X38 es L, G, M, F, I, o V; y X39 es H, y el bucle DE tiene una secuencia de aminoácidos según la fórmula G-R-G-X40, en donde X40 es L.
En algunas realizaciones, la Adnectina anti-miostatina de la invención comprende los bucles BC, DE, y FG como se presenta en las SEQ ID NOs: 34, 39, y 75, respectivamente, en donde el bucle BC tiene 1, 2, 3, 4, 5, o 6 sustituciones de aminoácido, tal como sustituciones de aminoácido conservativas, y el bucle FG tiene 1,2, 3, 4, 5, 6,
7, u 8 sustituciones de aminoácido, tal como sustituciones de aminoácido conservativas. En algunas realizaciones, el bucle BC comprende una secuencia de aminoácidos según la fórmula X33-L-P-X34-X35-X36-X37-X38-X39, en donde X33 es T o Y; X34 es Y, N, R, F, G, S, o T; X35 es A, P, S, F, H, N, o R; X36 es A; X37 es H, L, R, V, N, D, F, o I; X38 es L,
G, M, F, I, o V; y X39 es H, y el bucle FG comprende una secuencia de aminoácidos según la fórmula X41-X42-X43-X44-X45-X46-X47-X48-X49-X50, en donde X41 es L o I; X42 es S; X43 es K, R, A, G, S, H, N, T, o P; X44 es S, A, E, H, K, o N;
X45 es K, Q, D, E, N, T, o S; X46 es V, I, F, L, M, P, o T; X47 es I o Y; X48 es H, I, V, L, R, F, G, S, o T; X49 es H; y X50 es M, L, R, o V.
En algunas realizaciones, la Adnectina anti-miostatina de la invención comprende los bucles BC, DE, y FG como se presenta en las SEQ ID NOs: 34, 39, y 75, respectivamente, en donde y el bucle DE tiene 1 sustitución de aminoácido, tal como una sustitución de aminoácido conservativa, y el bucle FG tiene 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, u 8 sustituciones de aminoácido, tal como sustituciones de aminoácido conservativas. En algunas realizaciones, el bucle
DE comprende una secuencia de aminoácidos según la fórmula G-R-G-X40, en donde X40 es L, y el bucle FG tiene una secuencia de aminoácidos según la fórmula X41-X42-X43-X44-X45-X46-X47-X48-X49-X50, en donde X41 es L o I; X42 es S; X43 es K, R, A, G, S, H, N, T, o P; X44 es S, A, E, H, K, o N; X45 es K, Q, D, E, N, T, o S; o T; X47 es I o Y; X48 es H, I, V, L, R, F, G, S, o T; X49 es H; y X50 es M, L, R, o V.
En algunas realizaciones, la Adnectina anti-miostatina de la invención comprende los bucles BC, DE, y FG como se presenta en las SEQ ID NOs: 34, 39, y 75, respectivamente, en donde el bucle BC tiene 1, 2, 3, 4, 5, o 6 sustituciones de aminoácido, tal como sustituciones de aminoácido conservativas, y el bucle DE tiene 1 sustitución de aminoácido, tal como una sustitución de aminoácido conservativa, y el bucle FG tiene 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, u 8 sustituciones de aminoácido, tal como sustituciones de aminoácido conservativas. En algunas realizaciones, el bucle
BC comprende una secuencia de aminoácidos según la fórmula X33-L-P-X34-X35-X36-X37-X38-X39, en donde X33 es T o
Y; X34 es Y, N, R, F, G, S, o T; X35 es A, P, S, F, H, N, o R; X36 es A; X37 es H, L, R, V, N, D, F, o I; X38 es L, G, M, F,
I, o V; y X39 es H; el bucle DE comprende una secuencia de aminoácidos según la fórmula G-R-G-X40, en donde X40 es L; y el bucle FG tiene una secuencia de aminoácidos según la fórmula X41-X42-X43-X44-X45-X46-X47-X48-X49-X50, en donde X41 es L o I; X42 es S; X43 es K, R, A, G, S, H, N, T, o P; X44 es S, A, E, H, K, o N; X45 es K, Q, D, E, N, T, o S;
X46 es V, I, F, L, M, P, o T; X47 es I o Y; X48 es H, I, V, L, R, F, G, S, o T; X49 es H; y X50 es M, L, R, o V.
En algunas realizaciones, la Adnectina anti-miostatina de la invención comprende los bucles BC, DE, y FG como se presenta en las SEQ ID NOs: 34, 39, y 75, respectivamente, y tiene sustituciones de aminoácido en los bucles BC,
DE, y FG que permiten que la Adnectina anti-miostatina mantenga la unión a la miostatina. Las sustituciones de aminoácido de ese tipo se pueden determinar, p. ej., mediante rastreo mutacional profundo, como se describe en el Ejemplo 8.
Por consiguiente, en algunas realizaciones, la Adnectina anti-miostatina de la invención comprende un bucle BC que comprende una secuencia de aminoácidos según la fórmula X51-X52-X53-X54-X55-X56-X57-X58-X59, en donde: X51 se selecciona entre el grupo que consiste en A, C, D, F, H, I, K, L, N, Q, R, S, T, V, W e Y; X52 se selecciona entre el grupo que consiste en L, M, y V; X53 se selecciona entre el grupo que consiste en A, C, D, E, I, K, L, M, N, P, Q, R,
S, T, V e Y; X54 se selecciona entre el grupo que consiste en A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W e Y;
X55 se selecciona entre el grupo que consiste en A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y; X56 se selecciona entre el grupo que consiste en G y S; X57 se selecciona entre el grupo que consiste en A, C, D, E, F, G,
H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W e Y; X58 se selecciona entre el grupo que consiste en A, C, G, L, M, S, y T; y X59 se selecciona entre el grupo que consiste en A, C, F, H, N, P, Q, R, S e Y. En una realización preferida, X51 se selecciona entre el grupo que consiste en C, F, I, S, V, W e Y; X52 se selecciona entre el grupo que consiste en L;
X53 se selecciona entre el grupo que consiste en P; X54 se selecciona entre el grupo que consiste en C, D, E, F, G,
H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W e Y; X55 se selecciona entre el grupo que consiste en A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M,
N, P, Q, R, S, T, V, W e Y; X56 se selecciona entre el grupo que consiste en G; X57 se selecciona entre el grupo que consiste en A, C, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, V, W e Y; X58 se selecciona entre el grupo que consiste en A, G, L, M, y
S; y X59 se selecciona entre el grupo que consiste en C, H, N, Q, S e Y. En una realización más preferida, X51 se selecciona entre el grupo que consiste en F, S, y W; X52 se selecciona entre el grupo que consiste en L; X53 se selecciona entre el grupo que consiste en P; X54 se selecciona entre el grupo que consiste en C, F, G, I, K, L, M, N,
R, S, T, V, W e Y; X55 se selecciona entre el grupo que consiste en A, C, E, F, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V e Y; X56 se selecciona entre el grupo que consiste en G; X57 se selecciona entre el grupo que consiste en A, C, H, K, L, M, N,
R, V, W e Y; X58 se selecciona entre el grupo que consiste en A, G, y L; y X59 se selecciona entre el grupo que consiste en H, N, y Q.
En algunas realizaciones, la Adnectina anti-miostatina de la invención comprende un bucle DE que comprende una secuencia de aminoácidos según la fórmula G-R-G-X60, en donde X60 es A, C, D, E, F, I, K, L, M, N, Q, S, T, y V. En una realización preferida, X60 es C, E, I, L, M, Q, T, y V. En una realización más preferida, X60 es C, E, I, L, M, y V.
En algunas realizaciones, la Adnectina anti-miostatina de la invención comprende un bucle FG que comprende una secuencia de aminoácidos según la fórmula X61-X62-X63-X64-X65-X66-X67-X68-X69-X70, en donde X61 se selecciona entre el grupo que consiste en A, C, F, I, L, M, Q, T, V, W e Y; X62 se selecciona entre el grupo que consiste en A, C,
F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W e Y; X63 se selecciona entre el grupo que consiste en A, C, D, E, F, G, H, I, K,
L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y; X64 se selecciona entre el grupo que consiste en A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P,
Q, R, S, T, V, W e Y; X65 se selecciona entre el grupo que consiste en A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W e Y; X66 se selecciona entre el grupo que consiste en A, C, F, H, I, L, M, N, P, S, T, V, W e Y; X67 se selecciona entre el grupo que consiste en A, C, E, F, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W e Y; X68 se selecciona entre el grupo que consiste en A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y; X69 se selecciona entre el grupo que consiste en F, W e Y; y X70 se selecciona entre el grupo que consiste en A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y. En una realización preferida, X61 se selecciona entre el grupo que consiste en A, C, I, L, M, y V; X62 se selecciona entre el grupo que consiste en C, F, H, I, L, M, Q, R, S, T, V, W e Y; X63 se selecciona entre el grupo que consiste en A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, S, T, V, W e Y; X64 se selecciona entre el grupo que consiste en A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W e Y; X65 se selecciona entre el grupo que consiste en A, D, E, F, G, H, I, L, M, N, Q, S, T, V, W e Y; X66 se selecciona entre el grupo que consiste en C, F, I, L, M, P, T, V, W e Y; X67 se selecciona entre el grupo que consiste en C, F, H, I, K, L, M, N, Q, R, T, V, W e Y; X68 se selecciona entre el grupo que consiste en A, C, E, F, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y; X69 se selecciona entre el grupo que consiste en W e Y; y X70 se selecciona entre el grupo que consiste en A, C, D, E, G, H, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, y V. En una realización más preferida, X61 se selecciona entre el grupo que consiste en I y V; X62 se selecciona entre el grupo que consiste en C, F, I, L, M, T, V, W e Y; X63 se selecciona entre el grupo que consiste en A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, Q, S, T, y V; X64 se selecciona entre el grupo que consiste en A, C, D, F, G, I, L, M, N, Q, S, T, V, W e Y; X65 se selecciona entre el grupo que consiste en A, G, S, T, y W; X66 se selecciona entre el grupo que consiste en F, I, V, W e Y; X67 se selecciona entre el grupo que consiste en F, H, I, L, M, V, W e Y; X68 se selecciona entre el grupo que consiste en A, C, F, G, I, K, L, M, T, V, y W; X69 se selecciona entre el grupo que consiste en W e Y; y X70 se selecciona entre el grupo que consiste en A, G, K, L, M, P, Q, y R.
En algunas realizaciones, la Adnectina anti-miostatina de la invención comprende los bucles BC, DE, y FG, en donde el bucle BC comprende una secuencia de aminoácidos según la fórmula X51-X52-X53-X54-X55-X56-X57-X58-X59, en donde, X51 se selecciona entre el grupo que consiste en A, C, D, F, H, I, K, L, N, Q, R, S, T, V, W e Y; X52 se selecciona entre el grupo que consiste en L, M, y V; X53 se selecciona entre el grupo que consiste en A, C, D, E, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V e Y; X54 es A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W e Y; X55 se selecciona entre el grupo que consiste en A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y; X56 se selecciona entre el grupo que consiste en G y S; X57 es A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W e Y; X58 es A, C, G, L, M, S, y T; y X59 es A, C, F, H, N, P, Q, R, S e Y; el bucle DE comprende una secuencia de aminoácidos según la fórmula G-R-G-X60, en donde X60 se selecciona entre el grupo que consiste en A, C, D, E, F, I, K, L, M, N, Q, S, T, y V; y el bucle FG comprende una secuencia de aminoácidos según la fórmula X61-X62-X63-X64-X65-X66-X67-X68-X69-X70, en donde X61 se selecciona entre el grupo que consiste en A, C, F, I, L, M, Q, T, V, W e Y; X62 es A, C, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W e Y; X63 se selecciona entre el grupo que consiste en A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y; X64 se selecciona entre el grupo que consiste en A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y; X65 se selecciona entre el grupo que consiste en A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W e Y; X66 se selecciona entre el grupo que consiste en A, C, F, H, I, L, M, N, P, S, T, V, W e Y; X67 se selecciona entre el grupo que consiste en A, C, E, F, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W e Y; X68 se selecciona entre el grupo que consiste en A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y; X69 se selecciona entre el grupo que consiste en F, W e Y; y X70 se selecciona entre el grupo que consiste en A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y.
En una realización preferida, la Adnectina anti-miostatina de la invención comprende los bucles BC, DE, y FG, en donde el bucle BC comprende una secuencia de aminoácidos según la fórmula X51-X52-X53-X54-X55-X56-X57-X58-X59, en donde, X51 se selecciona entre el grupo que consiste en C, F, I, S, V, W e Y; X52 es L; X53 es P; X54 se selecciona entre el grupo que consiste en C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W e Y; X55 se selecciona entre el grupo que consiste en A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y; X56 es G; X57 se selecciona entre el grupo que consiste en A, C, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, V, W e Y; X58 se selecciona entre el grupo que consiste en A, G, L, M, y S; y X59 se selecciona entre el grupo que consiste en C, H, N, Q, S e Y; el bucle DE comprende una secuencia de aminoácidos según la fórmula G-R-G-X60, en donde X60 se selecciona entre el grupo que consiste en C, E, I, L, M, Q, T, y V; y el bucle FG comprende una secuencia de aminoácidos según la fórmula X61-X62-X63-X64-X65-X66-X67-X68-X69-X70, en donde X61 se selecciona entre el grupo que consiste en A, C, I, L, M, y V; X62 es C, F, H, I, L, M, Q, R, S, T, V, W e Y; X63 se selecciona entre el grupo que consiste en A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, S, T, V, W e Y; X64 se selecciona entre el grupo que consiste en A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W e Y; X65 se selecciona entre el grupo que consiste en A, D, E, F, G, H, I, L, M, N, Q, S, T, V, W e Y; X66 se selecciona entre el grupo que consiste en C, F, I, L, M, P, T, V, W e Y; X67 se selecciona entre el grupo que consiste en C, F, H, I, K, L, M, N, Q, R, T, V, W e Y; X68 se selecciona entre el grupo que consiste en A, C, E, F, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y; X69 se selecciona entre el grupo que consiste en W e Y; y X70 se selecciona entre el grupo que consiste en A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y.
En una realización más preferida, la Adnectina anti-miostatina de la invención comprende los bucles BC, DE, y FG, en donde el bucle BC comprende una secuencia de aminoácidos según la fórmula X51-X52-X53-X54-X55-X56-X57-X58-X59, en donde, X51 se selecciona entre el grupo que consiste en F, S, y W; X52 es L; X53 es P; X54 se selecciona entre el grupo que consiste en C, F, G, I, K, L, M, N, R, S, T, V, W e Y; X55 se selecciona entre el grupo que consiste en A, C, E, F, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V e Y; X56 es G; X57 se selecciona entre el grupo que consiste en A, C, H, K, L, M, N, R, V, W e Y; X58 se selecciona entre el grupo que consiste en A, G, y F; y X59 se selecciona entre el grupo que consiste en H, N, y Q; el bucle DE comprende una secuencia de aminoácidos según la fórmula G-R-G-X60, en donde X60 se selecciona entre el grupo que consiste en C, E, I, L, M, y V; y el bucle FG comprende una secuencia de aminoácidos según la fórmula X61-X62-X63-X64-X65-X66-X67-X68-X69-X70, en donde X61 se selecciona entre el grupo que consiste en I y V; X62 es C, F, I, L, M, T, V, W e Y; X63 se selecciona entre el grupo que consiste en A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, Q, S, T, y V; X64 se selecciona entre el grupo que consiste en A, C, D, F, G, I, L, M, N, Q, S, T, V, W e Y; X65 se selecciona entre el grupo que consiste en A, G, S, T, y W; X66 se selecciona entre el grupo que consiste en F, I, V, W e Y; X67 se selecciona entre el grupo que consiste en F, H, I, L, M, V, W e Y; X68 se selecciona entre el grupo que consiste en A, C, F, G, I, K, L, M, T, V, y W; X69 se selecciona entre el grupo que consiste en W e Y; y X70 se selecciona entre el grupo que consiste en A, G, K, L, M, P, Q, y R.
En algunas realizaciones, la Adnectina anti-miostatina está codificada por una secuencia de ácidos nucleicos como se presenta en una cualquiera de las SEQ ID NOs: 124-167, 240-251, y 284-305 (secuencias de longitud completa de las Tablas 2, 5, y 6). En algunas realizaciones, la Adnectina anti-miostatina está codificada por una secuencia de ácidos nucleicos que es idéntica en al menos un 70 %, un 75 %, un 80 %, un 85 %, un 90 %, un 95 %, un 98 %, un 99 % o un 100 % a una cualquiera de las SEQ ID NOS: 124-167, 240-251, y 284-305.
La fibronectina se une de forma natural a ciertos tipos de integrinas a través de su motivo de unión a integrina, "ácido arginina-glicina-aspártico" (RGD). En algunas realizaciones, el polipéptido comprende un dominio 10Fn3 que carece del motivo de unión a integrina (RGD). El dominio de unión a se puede retirar mediante la alteración de la secuencia de RGD mediante sustitución, de elección o inserción de aminoácido.
En algunas realizaciones, las secuencias de aminoácidos del bucle BC, DE y/o FG idénticas a la parte subrayada de una cualquiera de las SEQ ID NOS: 7-38, 39-45, y 46-79, respectivamente, como se muestra en la Tabla 1, se injertan en armazones de proteínas de dominio que no es 10Fn3. Por ejemplo, una o más secuencias de aminoácidos del bucle se intercambia por o se inserta en uno o más bucles de CDR de una cadena pesada o ligera de anticuerpo un fragmento de la misma. En otras realizaciones, el dominio de proteína en el que se intercambian o insertan una o más secuencias de bucle de aminoácido incluye, pero no se limita a, dominios Fn3 consenso (Centocor ,US), proteínas de repetición de anquirina (Molecular Partners AG, Zúrich Suiza), anticuerpos de dominio (Domantis, Ltd, Cambridge, MA), nanocuerpos camélidos de un solo dominio (Ablynx, Bélgica), Lipocalinas (p. ej., anticalinas; Pieris Proteolab AG, Freising, Alemania), Avímeros (Amgen, CA), aficuerpos (Affibody AG, Suecia), ubiquitina (p. ej., afilinas; Scil Proteins GmbH, Halle, Alemania), miméticos de epítopo de proteína (Polyphor Ftd, Allschwil, Suiza), armazones de haz helicoidal (p. ej. alfacuerpos, Complix, Bélgica), dominios SH3 de Fyn (Covagen AG, Suiza), o atrímeros (Anaphor, Inc., CA).
Las SEQ ID NOs de los bucles BC, DE y FG de Adnectinas anti-miostatina ilustrativas de la invención se presentan en la Tabla 1.
Tabla 1
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Las SEQ ID NOs de monoAdnectinas anti-miostatina ilustrativas de la invención se presentan en la Tabla 2. Tabla 2
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Adnectinas de Competición Cruzada y/o Adnectinas que se Unen al Mismo Sitio de Unión a Adnectina
En una realización, las Adnectinas de la invención compiten (p. ej., competencia cruzada) por su unión a miostatina con las Adnectinas anti-miostatina particulares que se describen en la presente memoria. Las Adnectinas de competición de ese tipo se pueden identificar basándose en su capacidad para inhibir de forma competitiva la unión a miostatina de Adnectinas que se describen en la presente memoria en ensayos de unión a miostatina convencionales. Por ejemplo, se pueden usar ensayos de ELISA convencionales en los que una proteína miostatina recombinante se inmoviliza sobre la placa, una de las Adnectinas se etiqueta con fluorescencia y se evalúa la capacidad de las Adnectinas no etiquetadas para competir por la unión de la Adnectina etiquetada.
En una realización, se puede realizar un ensayo de ELISA competitivo para determinar si los Adnectinas antimiostatina se unen a sitios de unión a Adnectina solapados sobre la miostatina. En un formato, la Adnectina N.° 1 se reviste sobre una placa, que a continuación se bloquea y se lava. A esta placa se le añade miostatina sola, o miostatina incubada previamente con una concentración de saturación de Adnectina N.° 2. Después de un periodo de incubación adecuado, la placa se lava y se rastrea con un anticuerpo anti-miostatina policlonal, tal como un anticuerpo policlonal de cabra anti-miostatina biotinilado (R&D Systems), seguido por detección con conjugado de estreptavidina-HRP y procedimientos convencionales de desarrollo de tetrametilbencidina. Si la señal de DO es la misma con o sin incubación previa con Adnectina N.° 2, entonces las dos Adnectinas se unen independientemente la una de la otra, y sus sitios de unión a Adnectina no se solapan. Sin embargo, si la señal de DO para los pocillos que recibieron mezclas de miostatina/Adnectina N.° 2 es menor que para los que recibieron solo miostatina, entonces la unión de la Adnectina N.° 2 se confirma para bloquear la unión de la Adnectina N.° 1 a la miostatina.
Como alternativa, se lleva a cabo un experimento similar mediante resonancia de plasmón superficial (SPR, p. ej., BIAcore). La Adnectina N.° 1 se inmoviliza sobre una superficie de chip de SPR, seguido por inyecciones de cualquiera de miostatina sola o miostatina incubada previamente con una concentración de saturación de Adnectina N.° 2. Si la señal de unión para mezclas de miostatina/Adnectina N.° 2 es la misma o más elevada que para la miostatina sola, entonces las dos Adnectinas se unen independientemente la una de la otra, y sus sitios de unión a Adnectina no se solapan. Sin embargo, si la señal de unión para mezclas de miostatina/Adnectina N.° 2 es menor que la señal de unión para la miostatina sola, entonces la unión de la Adnectina N.° 2 se confirma para bloquear la unión de la Adnectina N.° 1 a la miostatina. Una característica de estos experimentos es el uso de concentraciones de saturación de la Adnectina N.° 2. Si la miostatina no se satura con la Adnectina N.° 2, entonces las conclusiones que se han mencionado anteriormente no se mantiene. Se pueden usar experimentos similares para determinar si cualesquiera dos proteínas de unión a miostatina se unen a sitios de unión a Adnectina solapantes.
Ambos ensayos ejemplificados anteriormente también se pueden realizar en el orden inverso en el que la Adnectina N.° 2 se inmoviliza y la miostatina-Adnectina N.° 1 se añaden a la placa. Como alternativa, la Adnectina N.° 1 y/o N.° 2 se pueden reemplazar con un anticuerpo monoclonal y/o proteína de fusión de receptor soluble-Fc.
En otra realización, la competición también se puede determinar usando un ensayo de sándwich HTRF, como se describe en el Ejemplo 4.
En otras realizaciones, la Adnectina de competición es una Adnectina que se une al mismo sitio de unión a Adnectina en la miostatina como una Adnectina anti-miostatina particular que se describe en la presente memoria. Las técnicas de formación de mapas convencionales, tales como formación de mapas de proteasa, análisis mutacional, cristalografía de rayos x y resonancia magnética nuclear en 2 dimensiones, se pueden usar para determinar si una Adnectina se une al mismo sitio de unión a Adnectina como una Adnectina de referencia (véase, p. ej., Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996)).
Las Adnectinas anti-miostatina de competición candidatas pueden inhibir la unión de las Adnectinas anti-miostatina de la invención a la miostatina en al menos un 50 %, al menos un 55 %, al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, o al menos un 99 %. El % de competición se puede determinar usando los métodos que se han descrito anteriormente.
En algunas realizaciones, no es necesario que las moléculas que compiten con las Adnectinas anti-miostatina de la invención sean una Adnectina, pero puede ser cualquier tipo de molécula que se una a la miostatina, tal como, pero no limitado a, un anticuerpo, una molécula pequeña, un péptido, y similares.
En algunas realizaciones, las Adnectinas de la invención se unen a un sitio de unión a Adnectina discontinuo sobre la miostatina. En algunas realizaciones, los polipéptidos se unen a una región dentro de los aminoácidos 55-66 de la miostatina (SEQ ID NO: 3). En algunas realizaciones, los polipéptidos se unen a una región dentro de los aminoácidos 85-101 de la miostatina (SEQ ID NO: 3). Además en otras realizaciones, los polipéptidos se unen dentro de dos regiones, aminoácidos 85-101 y 55-66, de la miostatina (SEQ ID NO: 3).
En algunas realizaciones, los polipéptidos de la invención no compiten por la unión a la miostatina con ActRIIB. En algunas realizaciones, los polipéptidos de la invención compiten por la unión a la miostatina con ALK4 y/o ALK5. II. Secuencias de Extensión
En ciertas realizaciones, las moléculas de Adnectina anti-miostatina de la presente invención se pueden modificar para que comprendan comprenden una secuencia de extensión N-terminal y/o una extensión C-terminal.
Por ejemplo, una secuencia MG se puede colocar en el extremo N-terminal del 10Fn3 definido por la SEQ ID NO: 4. La M normalmente se escindirá, dejando una G en el extremo N-terminal. Como alternativa, los primeros 10 aminoácidos de las Adnectinas anti-miostatina que se muestran en la Tabla 2 se pueden reemplazar con una secuencia N-terminal alternativa, denominada en la presente memoria extensiones N-terminales, como se muestra en la Tabla 7. Además, una M, G o MG también se puede colocar de forma N-terminal a cualquiera de las extensiones N-terminales que se muestran en la Tabla 7. Las Adnectinas anti-miostatina que se describen en la presente memoria también pueden comprender secuencias de cola C-terminal alternativas, denominadas en la presente memoria secuencias de extensión C-terminal. Por ejemplo, las secuencias de Adnectina anti-miostatina que se muestran en la Tabla 2 se pueden truncar en la treonina que corresponde a T94 de SEQ ID NO: 4 (es decir, se pueden truncar después de la parte INYRT (SEQ ID NO: 168) de la secuencia). La versión truncada de ese tipo se puede usar como moléculas terapéuticas en la forma truncada, o extensiones C- terminales alternativas se pueden añadir después del resto de treonina. Las secuencias de extensión C-terminal a modo de ejemplo se muestran en la Tabla 7. Las Adnectinas anti-miostatina que comprenden secuencias de extensión C-terminal se muestran en la Tabla 2 como las SEQ ID NOs: 80-123. Por ejemplo, SEQ ID NO: 80 (clon 1979_B06) comprende la extensión EIDKPSQ C-terminal de origen natural (SEQ ID NO: 211) seguida por una etiqueta de His6 (SEQ ID NO: 328). Sin embargo, se debería entender que la etiqueta de His6 es completamente opcional.
En ciertas realizaciones, las secuencias de extensión C-terminal (también denominadas "colas"), comprenden restos E y D, y pueden tener una longitud entre 8 y 50, 10 y 30, 10 y 20, 5 y 10, y 2 y 4 aminoácidos. En algunas realizaciones, las secuencias de cola incluyen conectores a base de ED en los que la secuencia comprende repeticiones en tándem de ED. En realizaciones a modo de ejemplo, la secuencia de cola comprende 2-10, 2-7, 2-5, 3-10, 3-7, 3-5, 3, 4 o 5 repeticiones de ED. En ciertas realizaciones, las secuencias de cola a base de ED también pueden incluir restos de aminoácido adicionales, tales como, por ejemplo: El, EID, ES, EC, EGS, y EGC. Las secuencias de ese tipo se basan, en parte, en secuencias de cola de Adnectina conocidas, tales como EIDKPSQ (SEQ ID NO: 211), en las que los restos D y K se han retirado. En realizaciones a modo de ejemplo, la cola a base de ED comprende un resto de E, I o restos de El antes de las repeticiones de ED.
En otras realizaciones, las secuencias N- o C-terminales se deben combinar con secuencias colectoras conocidas (p. ej., SEQ ID NO: 181-227 en la Tabla 4) si fuera necesario cuando se diseña una molécula de fusión de Adnectina anti-miostatina. En algunas realizaciones, la secuencia se puede situar en el extremo C-terminal del dominio 10Fn3 para facilitar la unión de un resto farmacocinético. Por ejemplo, un conector que contiene cisteína tal como GSGC (SEQ ID NO: 189) se puede añadir al extremo C-terminal para facilitar la PEGilación dirigida al sitio en el resto de cisteína. Las Adnectinas anti-miostatina a modo de ejemplo que comprenden un conector que contiene cisteína se muestran en la Tabla 5 como las SEQ ID NOs: 228-239.
III. Restos Farmacocinéticos
En un aspecto, la solicitud proporciona Adnectinas anti-miostatina que comprenden adicionalmente un farmacocinético (PK). La farmacocinética mejorara se puede evaluar según la necesidad terapéutica percibida. A menudo es deseable aumentar la biodisponibilidad y/o aumento del tiempo entre dosis, posiblemente aumentando el tiempo en el que una proteína permanece disponible en el suelo después de su dosificación. En algunos casos, es deseable mejorar la continuidad de la concentración en suero de la proteína a lo largo del tiempo (p. ej., disminuir la diferencia en la concentración en suero de la proteína poco después de la administración y poco antes de la siguiente administración). La Adnectina anti-miostatina se puede unir a un resto que reduce la tasa de eliminación del polipéptido en un mamífero (p. ej., ratón, rata, o ser humano) en más de dos veces, más de tres veces, más de cuatro veces o más de cinco veces con respecto a la Adnectina anti-miostatina no modificada. Otras mediciones para mejorar la farmacocinética pueden incluir semivida en suero, que a menudo se divide en una fase alfa y una fase beta. Cualquiera o ambas fases se pueden mejorar de forma significativa mediante la adición de un resto apropiado. Por ejemplo, el resto PK puede aumentar la semivida en suelo del polipéptido en más de un 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 150, 200, 400, 600, 800, 1000 % o más con respecto al dominio Fn3 solo.
Los restos que muestran eliminación de una proteína de la sangre, en la presente memoria denominados "restos PK", incluyen restos de polioxialquileno (p. ej., polietilenglicol), azúcares (p. ej., ácido siálico), y restos de proteína bien tolerados (p. ej., Fc y fragmentos y variantes del mismo, transferrina, o albúmina de suero). La Adnectina antimiostatina también se puede fusionar a albúmina o a un fragmento (parte) o variante de albúmina como se describe en la Publicación de Estados Unidos N.° 2007/0048282, o se puede fusionar a una o más Adnectinas de unión a albúmina en suero, como se describe en la presente memoria.
Otros restos PK que se pueden usar en la invención incluyen los que se describen en Kontermann et al., (Current Opinión in Biotechnology 2011; 22: 868-76). Los restos PK de ese tipo incluyen, pero no se limitan a, fusiones de albúmina de suero humano, conjugados de albúmina de suero humano, aglutinantes de albúmina de suero humano (p. ej., Adnectina PKE, AlbudAb, ABD), fusiones de XTEN, fusiones de PAS (es decir, miméticos de PEG de combinados basados en los tres aminoácidos prolina, alanina, y serina), conjugados de carbohidratos (p. ej., hidroxietil almidón (HES)), glicosilación, conjugados de ácido polisiálico, y conjugados de ácido graso.
Por consiguiente, en algunas realizaciones la invención proporciona una Adnectina anti-miostatina fusionada a un resto PK que es un azúcar polimérico. En algunas realizaciones, el resto PK es un resto de polietilenglicol o una región de Fc. En algunas realizaciones el resto PK es una proteína de unión a albúmina de suero tal como las que se describen en las Publicaciones de Estados Unidos N.os 2007/0178082 y 2007/0269422. En algunas realizaciones el resto PK es albúmina de suero humano. En algunas realizaciones, el resto PK es transferrina.
Polietilenglicol
En algunas realizaciones, la Adnectina anti-miostatina comprende polietilenglicol (PEG). El PEG es un polímero soluble en agua, bien conocido, que está disponible en el mercado o que se puede preparar mediante polimerización por apertura del anillo de etilenglicol según métodos bien conocidos en la técnica (Sandler y Karo, Polymer Synthesis, Academic Press, New York, Vol. 3, páginas 138-161). El término "PEG" se usa ampliamente para incluir cualquier molécula de polietilenglicol, sin hacer referencia al tamaño o la modificación en un extremo del PEG, y se puede representar con la fórmula: X-O(CH2CH2O)n-1CH2CH2OH, en la que n es de 20 a 2300 y X es H o una modificación terminal, p. ej., un alquilo C1-4. El PEG puede contener grupos químicos adicionales que son necesarios para reacciones de unión, que resultan de la síntesis química de la molécula; o que actúan como un espaciador para distancia óptima de las partes de la molécula. Además, un PEG de ese tipo puede consistir en una o más cadenas laterales de PEG que se unen en conjunto. Los PEG con más de una cadena de PEG se denominan PEG de múltiples ramas o ramificados. Los PEG ramificados se describen, por ejemplo, en la Solicitud Publicada Europea N.° 473084A y en el documento de Patente de Estados Unidos N.° 5.932.462.
Una o más moléculas de PEG se pueden unir en diferentes posiciones en la proteína, y una unión de ese tipo supone conseguir mediante reacción con aminas, tioles u otros grupos reactivos adecuados. El resto amino puede ser, por ejemplo, una lámina primaria encontrará en el extremo N-terminal de un polipéptido o un grupo amino presente en un aminoácido, tal como lisina o arginina. En algunas realizaciones, el resto de PEG se une en una posición en el polipéptido seleccionada del grupo que consiste en: a) el extremo N-terminal; b) entre el extremo N- y la hebra beta o hebra similar a beta la más N-terminal; c) un bucle colocado en una cara del polipéptido opuesta al sitio de unión a diana; d) entre el extremo C-terminal y la hebra beta o hebra similar a beta la más C-terminal; y e) en el extremo C-terminal.
La PEGilación se puede conseguir mediante PEGilación dirigida al sitio, en donde un grupo reactivo adecuado se introduce en la proteína para crear un sitio en el que la PEGilación se produce preferentemente. En algunas realizaciones, la proteína se modifica para introducir un resto de cisteína en una posición deseada, lo que permite la PEGilación dirigida al sitio de unión a cisteína. Las mutaciones se pueden introducir en una secuencia codificante de proteína para generar restos de cisteína. Esto se puede conseguir, por ejemplo, mediante mutación de uno o más restos de aminoácido para cisteína. Los aminoácidos preferidos para mutar a un resto de cisteína incluyen serina, treonina, alanina y otros restos hidrófilos. Preferiblemente, el resto que se va a mutar a cisteína es un resto con superficie expuesta. En la técnica se conocen bien algoritmos para permitir la accesibilidad de superficie de restos basándose en la secuencia primaria de una proteína. Como alternativa, los restos de superficie se pueden predecir comparando las secuencias de aminoácidos de polipéptidos de unión, dado que se ha resuelto la estructura cristalina del marco, basándose en el que se diseñan y evolucionan los polipéptidos de unión (véase Himanen et al., Nature 2001; 414: 933-8) y de ese modo los restos de superficie expuesta se identifican. La PEGilación de restos de cisteína se puede llevar a cabo usando, por ejemplo, PEG-maleimida, PEG-vinilsulfona, PEG-yodoacetamida, o PEG-disulfuro de ortopiridilo.
El PEG generalmente se activa con un grupo de activación adecuado apropiado para el acoplamiento a un sitio deseado sobre el polipéptido. Los métodos de PEGilación se conocen bien en la técnica y se describen adicionalmente en Zalipsky, S., et al., "Use of Functionalized Poly(Ethylene Glycols) for Modification of Polypeptides" en Polyethylene Glycol Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applications, J. M. Harris, Plenus Press, New York (1992), y en Zalipsky (1995J Advanced Drug Reviews 16: 157-182.
El PEG puede variar ampliamente en su peso molecular y puede ser ramificado o lineal. Por lo general, el peso molecular promedio en peso del PEG es de aproximadamente 100 Daltons a aproximadamente 150.000 Daltons. Los pesos moleculares promedio en peso a modo de ejemplo para el PEG incluyen aproximadamente 20.000 Daltons, aproximadamente 40.000 Daltons, aproximadamente 60.000 Daltons y aproximadamente 80.000 Daltons. En ciertas realizaciones, el peso molecular del PEG es de 40.000 Daltons. También se pueden usar versiones ramificadas del PEG que tienen un peso molecular total de cualquiera de los que se han mencionado anteriormente. En algunas realizaciones, el PEG tiene dos ramificaciones. En otras realizaciones, el PEG tiene cuatro ramificaciones. En otra realización, el PEG es un bis-PEG (NOF Corporation, DE-200MA), en el que dos Adnectinas están conjugadas (véase, p. ej., Ejemplo 1 y ATI-1341 de la Tabla 5).
Para purificar Adnectinas anti-miostatina PEGiladas se pueden usar técnicas convencionales de separación purificación conocidas en la técnica, tales como cromatografía de exclusión por tamaño (p. ej., filtración en gel) y cromatografía de intercambio iónico. Los productos también se pueden separar usando SDS-PAGE. Los productos que se pueden separar incluyen Adnectinas mono-, di-, tri-, poli- y no PEGiladas, así como PEG libre. El porcentaje de conjugados de mono-PEG se pueden controlar mediante combinación de fracciones más amplias alrededor del pico de elución para aumentar el porcentaje de mono-PEG en la composición. Aproximadamente un 90 % de conjugados de mono-PEG representa un buen equilibrio de rendimiento y actividad.
En algunas realizaciones, las Adnectinas anti-miostatina PEGiladas mantendrán preferiblemente al menos aproximadamente un 25 %, un 50 %, un 60 %, un 70 %, un 80 %, un 85 %, un 90 %, un 95 % o un 100 % de la actividad biológica asociada con la Adnectina anti-miostatina no modificada. En algunas realizaciones, la actividad biológica se refiere a su capacidad para unirse a la miostatina, tal como se evalúa por KD, kasoc, o kdisoc. En algunas realizaciones, la Adnectina anti-miostatina PEGilada muestra un aumento en la unión a la miostatina con respecto a la Adnectina anti-miostatina no PEGilada.
En la Tabla 5 se muestran Adnectinas anti-miostatina modificadas con PEG a modo de ejemplo.
Dominio Fc de inmunoglobulina (y fragmentos)
En algunas realizaciones, la Adnectina anti-miostatina se fusiona a un dominio Fc de inmunoglobulina, o fragmento o variante del mismo. Como se usa en la presente memoria, una "región de Fc funcional" es un dominio Fc o fragmento del mismo que mantiene la capacidad para unirse a FcRn. En algunas realizaciones, una región de Fc funcional se une a FcRn, pero no posee función efecto de la. La capacidad de la región de Fc o fragmento de la misma para unirse a FcRn se puede determinar mediante ensayos de unión convencionales conocidos en la técnica. En otras realizaciones, la región de Fc o fragmento de la misma se une a FcRn y tiene al menos una "función efectora" de una región de Fc nativa. Las "funciones efectoras" a modo de ejemplo incluyen unión a C1q; citotoxicidad dependiente de complemento (CDC); unión a receptor de Fc; citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpo (ADCC); fagocitosis; regulación negativa de receptores de superficie celular (p. ej., receptor de linfocitos B; BCR), etc. Las funciones receptoras de ese tipo generalmente requieren que la región de Fc se combine con un dominio de unión (p. ej., una Adnectina anti-miostatina) y se puede evaluar usando diversos ensayos conocidos en la técnica para evaluar funciones efectoras de anticuerpo de ese tipo.
Una "región de Fc de secuencia nativa" comprende una secuencia de aminoácidos idéntica a la secuencia de aminoácidos de una región de Fc encontrada en la naturaleza. Una "región de Fc variante" comprende una secuencia de aminoácidos que se diferencia de la de una región de Fc de secuencia en virtud de al menos una modificación de aminoácido. Preferiblemente, la región de Fc variante tiene al menos una sustitución de aminoácido en comparación con una región de Fc de secuencia nativa o con respecto a la región de Fc de un polipéptido precursor, p. ej., de aproximadamente una a aproximadamente diez sustituciones de aminoácido, y preferiblemente de aproximadamente una a aproximadamente cinco sustituciones de aminoácido en una región de Fc de secuencia nativa o en la región de Fc del polipéptido precursor. La región de Fc variante en la presente memoria tendrá preferiblemente una identidad de secuencia de al menos aproximadamente un 80 % con una región de Fc de secuencia nativa y/o con una región de Fc de un polipéptido precursor, y lo más preferiblemente una identidad de secuencia de al menos aproximadamente un 90 % con la misma, más preferiblemente una identidad de secuencia de al menos aproximadamente un 95 % con la misma.
En una realización a modo de ejemplo, el dominio Fc se obtiene a partir de una subclase de IgG1, sin embargo, también se pueden usar otras subclases (p. ej., IgG2, IgG3 e IgG4). A continuación se muestra la secuencia de un dominio Fc de inmunoglobulina IgG1 humana:
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY
VDGYEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIE
KTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENN
YKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
K (SEQ ID NO: 169)
La secuencia de bisagra núcleo está subrayada, y las regiones CH2 y CH3 están en un texto regular. Se debería entender que la lisina C-terminal es opcional.
La fusión se puede formar mediante la unión de una Adnectina anti-miostatina a cualquier extremo de la molécula de Fc, es decir, disposiciones de Fc-Adnectina anti-miostatina o de Adnectina anti-miostatina-Fc. En ciertas realizaciones, el dominio Fc y la Adnectina anti-miostatina se fusionan a través de un conector. Las secuencias de conectores a modo de ejemplo incluyen GAGGGGSG (SEQ ID NO: 181), EPKSSD (SEQ ID NO: 182), D, ESPKAQASSVPTAQPQAEGLA (SEQ ID NO: 183), ELQLEESAAEAQDGELD (SEQ ID NO: 184), GQPDEPGGS (SEQ ID NO: 185), GGSGSGSGSGSGS (SEQ ID NO: 186), ELQLEESAAEAQEGELE (SEQ ID NO: 187), GSGSG (SEQ ID NO: 188), GSGC (SEQ ID NO: 189), AGGGGSG (SEQ ID NO: 190), GSGS (SEQ ID NO: 191), QPDEPGGS (SEQ ID NO: 192), GSGSGS (SEQ ID NO: 193), TVAAPS (SEQ ID NO: 194), KAGGGGSG (SEQ ID NO: 195), KGSGSGSGSGSGS (SEQ ID NO: 196), KQPDEPGGS (SEQ ID NO: 197), KELQLEESAAEAQDGELD (SEQ ID NO: 198), KTVAAPS (SEQ ID NO: 199), KAGGGGSGG (SEQ ID NO: 200), KGSGSGSGSGSGSG (SEQ ID NO: 201), KQPDEPGGSG (SEQ ID NO: 202), KELQLEESAAEAQDGELDG (SEQ ID NO: 203), KTVAAPSG (SEQ ID NO: 204) AGGGGSGG (SEQ ID NO: 205), AGGGGSG (SEQ ID NO: 206), GSGSGSGSGSGSG (SEQ ID NO: 207), QPDEPGGSG (SEQ ID NO: 208), y TVAAPSG (SEQ ID NO: 209).
En algunas realizaciones, la región de Fc usada en la fusión de Adnectina anti-miostatina comprende la región bisagra de una molécula de Fc. Como se usa en la presente memoria, la región "bisagra" comprende los restos de bisagra núcleo que se extienden a las posiciones 1-16 de SEQ ID NO: 169 (DKTHTCPPCPAPELLG; SEQ ID NO: 170) de la región de Fc de IgG1. En ciertas realizaciones, la fusión de Adnectina anti-miostatina-Fc adopta una estructura multimérica (p. ej., dímero) debido, en parte, a los restos de cisteína en las posiciones 6 y 9 de la SEQ ID NO: 169 dentro de la región bisagra. En otras realizaciones, la región bisagra como se usa en la presente memoria, puede incluir adicionalmente restos obtenidos a partir de las regiones CH1 y CH2 que flanquean la secuencia de bisagra núcleo, como se muestra en la SEQ ID NO: 169. Además en otras realizaciones, la secuencia bisagra es GSTHTCPPCPAPELLG (es decir, la secuencia bisagra para PRD-932; SEQ ID NO: 180).
En algunas realizaciones, la secuencia bisagra, puede incluir sustituciones que confieren propiedades farmacocinéticas, biofísicas, y/o biológicas deseables. Algunas secuencias bisagra a modo de ejemplo incluye EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPS (SEQ ID NO: 171; región bisagra de núcleo subrayada), EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGSS (SEQ ID NO 172; región bisagra de núcleo subrayada), EPKSSGSTHTCPPCPAPELLGGSS (SEQ ID NO: 173; región bisagra de núcleo subrayada), DKTHTCPPCPAPELLGGPS (SEQ ID NO: 174; región bisagra de núcleo subrayada), y DKTHTCPPCPAPELLGGSS (SEQ ID NO: 175; región bisagra de núcleo subrayada). En una realización, el resto P en la posición 18 de la SEQ ID NO: 169 se ha reemplazado con S a eliminar la función efectora de Fc; este reemplazo se observa a modo de ejemplo en bisagras que tienen una cualquiera de las SEQ ID NOs: 172, 173, y 175. En otra realización, los restos DK en las posiciones 1-2 de la SEQ ID NO: 169 se han reemplazado con GS para eliminar un sitio de clip potencial; este reemplazo se observa a modo de ejemplo en la SEQ ID NO: 173. En otra realización, la C en la posición 103 de la SEQ ID NO: 176, que corresponde a la región constante de cadena pesada de IgG1 humana (es decir, los dominios CH1-CH3), se ha reemplazado con S para evitar la formación de enlace cisteína inapropiado en ausencia de una cadena ligera; este reemplazo se observa a modo de ejemplo en las SEQ ID NOs: 171-173.
ASTKGPSYFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVL
QSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTOTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAP
ELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVYDYSHEDPEYKFNWYVDGVEVHNAKT
KPREEQYNSTYRVVSVFTVFHQDWFNGKEYKCKVSNKAFPAPIEKTISKAKGQPREP
QVYTFPPSRDEFTKNQVSFTCFVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVFDSDGS
FFFYSKFTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEAFHNHYTQKSFSFSPGK (SEQ ID NO: 176)
En ciertas realizaciones, una fusión de Adnectina anti-miostatina-Fc puede tener las siguientes configuraciones: 1) Adnectina anti-miostatina-bisagra-Fc o 2) bisagra-Fc-Adnectina anti-miostatina. Por lo tanto, cualquier Adnectina anti-miostatina de la presente invención se puede fusionar a una región Fc que comprende una secuencia bisagra según estas configuraciones. En algunas realizaciones, se puede usar un conector para unir la Adnectina antimiostatina al resto de bisagra-Fc, por ejemplo, una proteína de fusión a modo de ejemplo puede tener la configuración Adnectina anti-miostatina-conector-bisagra-Fc o bisagra-Fc-conector-Adnectina anti-miostatina. Además, dependiendo del sistema en el que se produce el polipéptido de fusión, una secuencia líder se puede colocar en el extremo N-terminal del polipéptido de fusión. Por ejemplo, si la fusión se produce en un sistema mamífero, una secuencia líder tal como METDTLLLWVLLLWVpGs Tg (SEQ ID NO: 177) se puede añadir al extremo N-terminal de la molécula de fusión. Si la fusión se produce en E. coli, la secuencia de fusión irá precedida por una metionina.
La siguiente secuencia ejemplifica una construcción de Adnectina anti-miostatina-bisagra-Fc:
G Y S W P R D L E V V A A T P T S L L IS W T L P H A G R A H Y Y R IT Y G E T G G N S P V Q E F T V P G R G V T A T I
SG L K P G V D Y T IT V Y A V T V T T T K V IE ÍY K P ISIN Y R T E T E P K SSD K T Y IT C P P C P A P E L L G G P S Y F
LFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVD VSHEDPEVKFNWYVDGVEVHN AKTKPREEQYN
STYRVVS VLTVLHQD WLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTIS KAKGQPREPQVYTLPPS
RDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLT
VDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (PRD-1171; SEQ ID NO: 253).
La secuencia líder está en letra negrita, la secuencia de Adnectina anti-miostatina está en letra cursiva, y la región bisagra está subrayada. Se debería entender que la lisina C-terminal es opcional.
En la presente memoria, el dominio Fc comprende las regiones CH2 y CH3 de IgG1 humana como sigue a continuación:
VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ
YNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLP
PSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKL
TVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 178)
y la secuencia bisagra DKTHTCPPCPAPELLG (SEQ ID NO: 170).
La siguiente secuencia ejemplifica una construcción de Fc-Adnectina anti-miostatina:
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY
VDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIE
KTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENN
YKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPEL
Q L E E S A A E A Q E G E L E G V S W F K D L E V V A A T P T S L L IS W S L P H Q G K A N Y Y R IT Y G E T G G N S
P V Q E F T V P G R G V T A T IS G L K P G V D Y T IT V Y A V T V T D T G Y L K Y K P IS IN Y R T E l (PRD-1474;
SEQ ID NO: 273).
La región bisagra está subrayada, la secuencia líder está en letra negrita, y la secuencia de Adnectina antimiostatina está en letra cursiva.
En la presente memoria, el dominio Fc comprende las regiones CH2 y CH3 de IgG1 humana como sigue a continuación:
YFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ
y n s t y r v v s v l t v l h q d w l n g k e y k c k v s n k a l p a p ie k t is k a k g q p r e p q v y t l p
FSRDELTKNQV S LTCL VKGFYPSDIA VE WESNGQFEN N YKTTPP VLDS DG S FFLY S KL
TVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP (SEQ ÍD NO: 179)
y la secuencia bisagra DKTHTCPPCPAPELLG (SEQ ID NO: 170).
Las fusiones de Adnectina anti-miostatina-Fc y las fusiones de Fc-Adnectina anti-miostatina ilustrativas se muestran en la Tabla 6 (SEQ ID NOs: 252-273). Todas las secuencias pueden comenzar con una metionina o una secuencia líder de mamífero (p. ej., SEQ ID NO: 177).
Adnectinas
En algunas realizaciones el resto PK es otra Adnectina específica, por ejemplo, para una proteína de suero (p. ej., albúmina de suero humano), como se describe en el documento de patente US 2012/0094909. Otros restos de PK que se pueden usar con las Adnectinas de la invención se describen en Kontermann et al. (Current Opinión in Biotechnology 2011; 22: 868-76), como se ha discutido anteriormente. A modo de ejemplo, los restos PK a base de Adnectina se pueden unir de forma directa o indirecta a una Adnectina anti-miostatina mediante un conector polipeptídico. Los conectores adecuados para unir los dominios Fn3 son aquellos que permiten que los dominios separados se plieguen independientemente entre sí y formen una estructura tridimensional que permita una unión de alta afinidad a una molécula diana. Los conectores polipeptídicos a modo de ejemplo incluyen PSTSTST (SEQ ID NO: 210), EIDKPSQ (SEQ ID NO: 211), y conectores de GS, tal como GSGSGSGSGS (SEQ ID NO: 213) y multímeros de los mismos. En algunas realizaciones, el conector es un conector a base de glicina-serina conector. Estos conectores comprenden restos de glicina y serina y pueden tener una longitud entre 8 y 50, 10 y 30, y 10 y 20 aminoácidos. Los ejemplos incluyen conectores que tienen una secuencia de aminoácidos (GS)7 (SEQ ID NO: 215), G(GS)6 (SEQ ID nO: 216), y G(GS)7G (SEQ ID NO: 217). Otros conectores contienen ácido glutámico, e incluyen, por ejemplo, (GSE)5 (SEQ iD nO: 218) y GGSEGGSE (s Eq ID NO: 219). Otros conectores de glicina-serina a modo de ejemplo incluyen (GS)4 (SEQ ID NO: 212), (GGGGS)7 (SEQ ID NO: 220), (GGGGS)5 (SEQ ID NO: 221), y (GGGGS)3G (SEQ ID NO: 222). En algunas realizaciones, el conector es un conector a base de glicina-prolina. Estos conectores comprenden restos de glicina y prolina y pueden tener una longitud entre 3 y 30, 10 y 30, y 3 y 20 aminoácidos. Los ejemplos incluyen conectores que tienen una secuencia de aminoácidos (GP)3G (SEQ ID NO: 223), (GP)5G (SEQ ID NO: 224), y GPG. En otras realizaciones, el conector puede ser un conector a base de prolina-alanina que tiene una longitud entre 3 y 30, 10 y 30, y 3 y 20 aminoácidos. Los ejemplos de conectores a base de prolina y alanina incluyen, por ejemplo, (PA)3 (SeQ iD nO: 225), (PA)6 (SEQ ID NO: 226) y (PA)9 (SEQ ID NO: 227). La longitud del conector y la composición del aminoácido óptimas se puede determinar mediante extirpación de rutina en vista de las enseñanzas que se proporcionan en la presente memoria. En algunas realizaciones, una Adnectina anti-miostatina se une, por ejemplo, a una Adnectina anti-HSA mediante un conector polipeptídico que tiene un sitio de proteasa que se puede escindir con una proteasa en la sangre o tejidos diana. Las realizaciones de este tipo se pueden usar para liberar una Adnectina anti-miostatina para una administración o propiedades terapéuticas mejores o una producción más eficaz.
En el extremo N-terminal por el extremo C-terminal de un dominio Fn3 entre el dominio Fn3 y el conector polipeptídico se pueden introducir conectores o espaciadores adicionales.
En algunas realizaciones, una Adnectina anti-miostatina se puede unir de forma directa o indirecta por ejemplo, a una Adnectina anti-HSA mediante un conector polimérico. Los conectores poliméricos se pueden usar para variar de forma óptima la distancia entre cada componente de la fusión para crear una fusión de proteína con una o más de las siguientes características: 1) reducción o aumento del impedimento estérico de la unión de uno o más dominios de proteína cuando se une a una proteína de interés, 2) aumento de la estabilidad subida de la proteína, 3) disminución de la agregación de la proteína, y 4) aumento de la avidez o afinidad generales de la proteína.
En algunas realizaciones, una Adnectina anti-miostatina se une, por ejemplo, a una Adnectina anti-HSA, mediante un polímero biocompatible tal como un azúcar polimérico. El azúcar polimérico puede incluir un sitio de escisión enzimática que se puede escindir con una enzima en la sangre o tejidos diana. Las realizaciones de ese tipo se pueden usar para liberar una Adnectina anti-miostatina para una administración o propiedades terapéuticas mejores o una producción más eficaz.
En la Tabla 3 se presenta un sumario de monoAdnectinas y sus formas modificadas de resto PK correspondientes (p. ej., PEGilada y fusiones de Fc).
Tabla 3
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a Las monoAdnectinas sin modificar tienen una secuencia de Adnectina núcleo precedida por una secuencia de extensión N-terminal (MGVSDVPRDL; SEQ ID NO: 306) y seguida por una cola C-terminal
(EIDKPSQHHHHHH; SEQ ID NO: 325), como se muestra en la Tabla 2. La secuencia de Adnectina núcleo corresponde a la secuencia de monoAdnectina que carece de las secuencias de extensión N-terminal y de cola C-terminal.
b Las Adnectinas con mutantes de cisteína tienen la secuencia de Adnectina núcleo de la monoAdnectina en la primera columna, y van precedidas por una secuencia de extensión N-terminal (MGVSDVPRDL; SEQ ID NO: 306) y van seguidas por una cola C-terminal (GSGC[Modificación]HHHHHH; SEQ ID NO: 326 o EGSGC[Modificación]HHHHHH; SEQ ID NO: 327), como se muestra en la Tabla 5.
c Las Adnectinas con un resto Fc en el extremo C-terminal tienen la secuencia de Adnectina núcleo de la monoAdnectina en la primera columna, que va precedida por una secuencia de extensión N-terminal (GVSDVPRDL; SEQ ID NO: 307) y van seguidas por una cola C-terminal(El), que va seguida por una secuencia de conector (Tabla 4) y la secuencia de la región Fc, como se describe en la Tabla 6.
d Las Adnectinas con un resto Fc en el extremo N-terminal tienen una secuencia de región Fc que va precedida por una secuencia bisagra N-terminal y que va seguida por un conector (Tabla 4) y la secuencia de Adnectina núcleo de la monoAdnectina en la primera columna, que por sí misma precedida por una secuencia de extensión N-terminal (GVSDVPRDL; SEQ ID NO: 307) y va seguidas por una cola C-terminal (EI), como se muestra en la Tabla 6.
Las SEQ ID NOs de conectores a modo de ejemplo de la invención se presentan en la Tabla 4.
Tabla 4
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Las SEQ ID NOs de Adnectinas anti-miostatina PEGiladas ilustrativas de la invención se presentan en la Tabla 5. Tabla 5
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Las SEQ ID NOs de Adnectinas anti-miostatina fusionadas con Fc ilustrativas de la invención se presentan en la Tabla 6.
Tabla 6
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Las SEQ ID NOs de las secuencias líder (extensión N-terminal) y cola C-terminal de la invención a modo de ejemplo se presentan en la Tabla 7.
Tabla 7
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IV. Tecnología de Fusión de Ácido Nucleico-Proteína
En un aspecto, la invención proporciona una Adnectina que comprende dominios de fibronectina tipo III que se une a la miostatina. Una forma de hacer y someter a ensayo rápidamente los dominios Fn3 con propiedades de unión específicas es la tecnología de fusión de ácido nucleico-proteína de Adnexus, una compañía de R&D de Bristol-Myers Squibb. La presente descripción usa la tecnología de expresión y etiquetado in vitro, denominada ‘PROfusión’ que aprovecha las fusiones de ácido nucleico-proteína (fusiones de ARN- y ADN-proteína) para identificar nuevos polipéptidos y motivos de aminoácidos que son importantes para la unión a proteínas. La tecnología de fusión de ácido nucleico-proteína es una tecnología que acopla covalentemente una proteína a su información genética codificante. Para una descripción detallada de la tecnología de fusión de ARN-proteína y métodos de identificación sistemática de biblioteca de proteína de armazón a base de fibronectina véase Szostak et al., documentos de Patente de Estados Unidos N os 6.258.558, 6.261.804, 6.214.553, 6.281.344, 6.207.446, 6.518.018 y 6.818.418; Roberts et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 1997; 94: 12297-12302; y Kurz et al., Molecules, 2000; 5: 1259-64.
V. Vectores y Polinucleótidos
Los ácidos nucleicos que codifican cualquiera de las diversas proteínas o polipéptidos que se describen en la presente memoria se pueden sintetizar por vía química. El uso del codón se puede seleccionar para mejorar la expresión en una célula. El uso de codón de ese tipo dependerá del tipo de célula seleccionada. Se han desarrollado patrones de uso de codones especializados para E. coli y otras bacterias, así como células de mamíferos, células vegetales, células de levadura y células de insectos. Véase por ejemplo: Mayfield et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1 0 0 (2 ): 438-442 (21 de enero de 2003); Sinclair et al., Protein Expr. Purif., 2 6 (I): 96-105 (octubre de 2 0 0 2 ); Connell, N.D., Curr. Opin. Biotechnol., 1 2 (5): 446-449 (octubre de 2 0 0 1 ); Makrides et al., Microbiol. Rev, 60 (3): 512-538 (septiembre de 1996); y Sharp et al., Yeast, 7 (7): 657-678 (octubre de 1991).
Las técnicas generales para la manipulación de ácidos nucleicos se describen en, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Edición, Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), o Ausubel, F. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing and Wiley-Interscience, New York (1987) y actualizaciones periódicas. En general, el ADN que codifica el polipéptido está unido de forma operativa a elementos reguladores de transcripción o traducción adecuados obtenidos a partir de genes de mamíferos, virus o insectos. Los elementos reguladores de ese tipo incluyen un promotor de la transcripción, una secuencia de operador opcional para controlar la transcripción, una secuencia que codifica el sitio de unión ribosómico del ARNm adecuado y secuencias que controlan la terminación de la transcripción y la traducción. Además se incorpora la capacidad de replicarse en un hospedador, normalmente conferida por un origen de replicación, y un gen de selección para facilitar el reconocimiento de transformantes.
Las proteínas que se describen en la presente memoria se pueden producir de forma recombinante no solo directamente, sino también como un polipéptido de fusión con un polipéptido heterólogo, que es preferiblemente una secuencia señal u otro polipéptido que tiene un sitio de escisión específico en el extremo N-terminal de la proteína madura o polipéptido. La secuencia señal heteróloga seleccionada preferiblemente es una que es reconocida y procesada (es decir, escindida por una peptidasa señal) por la célula hospedadora. Una secuencia líder N-terminal a modo de ejemplo para producción de polipéptidos en un sistema de mamíferos es: METDTLLLWVLLLWVPGSTG (SEQ ID NO: 177), que es eliminada por la célula hospedadora después de la expresión.
Para las células hospedadoras procariotas que no reconocen y procesan una secuencia señal nativa, la secuencia señal se sustituye por una secuencia señal procariota seleccionada, por ejemplo, entre el grupo de los líderes de fosfatasa alcalina, penicilinasa, 1 pp o enterotoxina II estable al calor.
Para la secreción de levadura, la secuencia señal nativa puede ser sustituida por, p. ej., un líder de invertasa de levadura, un líder de factor (incluyendo los líderes de factor alfa de Saccharomyces y Kluyveromyces), o el líder de fosfatasa ácida, el líder de glucoamilasa de C. albicans, o la secuencia señal que se describe en el documento de Patente de Estados Unidos N.° 5.631.144. En la expresión de células de mamífero, se encuentran disponibles secuencias señal de mamífero así como líderes secretores virales, por ejemplo, la señal gD del herpes simple. El ADN para las regiones precursoras de ese tipo se puede y ligar en el marco de lectura abierto al ADN que codifica la proteína.
Los vectores de expresión y clonación contienen una secuencia de ácidos nucleicos que permite que el vector se replique en una o más células hospedadoras seleccionadas. Generalmente, en los vectores de clonación, esta secuencia es una que permite que el vector se replique independientemente del ADN cromosómico del hospedador, e incluye orígenes de replicación o secuencias de replicación autónoma. Las secuencias de ese tipo son bien conocidas para una diversidad de bacterias, levaduras y virus. El origen de replicación del plásmido pBR322 es adecuado para la mayoría de las bacterias Gram-negativas, el origen del plásmido de 2 micrómetros es adecuado para levaduras, y diversos orígenes virales (SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) son útiles para la clonación de vectores en células de mamífero. En general, el origen del componente de replicación no es necesario para los vectores de expresión de mamífero (el origen de SV40 se puede usar habitualmente solo porque contiene el promotor temprano).
Los vectores de expresión y clonación pueden contener un gen de selección, también denominado marcador seleccionable. Los genes de selección habituales codifican proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, p. ej., ampicilina, neomicina, metotrexato o traciclina, (b) complementan las deficiencias auxotróficas, o (c) suministran nutrientes críticos que no están disponibles a partir de medios complejos, p. ej., el gen que codifica la D-alanina racemasa para Bacilli.
Los vectores de expresión y clonación normalmente contienen un promotor que es reconocido por el organismo hospedador y está unido de forma operativa al ácido nucleico que codifica la proteína de la invención, p. ej., una proteína de armazón a base de fibronectina. Los promotores adecuados para su uso con los hospedadores procariotas incluyen el promotor phoA, sistemas promotores de beta-lactamasa y lactosa, fosfatasa alcalina, un sistema promotor de triptófano (trp) y promotores híbridos tales como el promotor tan. Sin embargo, son adecuados otros promotores bacterianos conocidos. Los promotores para uso en sistemas bacterianos también contendrán una secuencia de Shine-Dalgarno (S.D.) unida de forma operativa al ADN que codifica la proteína de la invención. Las secuencias promotoras son conocidas para eucariotas. Prácticamente todos los genes eucariotas tienen una región rica en AT situada de aproximadamente 25 a 30 bases cadena arriba desde el sitio donde se inicia la transcripción. Otra secuencia encontrada de 70 a 80 bases cadena arriba desde el inicio de la transcripción de muchos genes es una región CNCAAT donde N puede ser cualquier nucleótido. En el extremo en la posición 3' de la mayoría de los genes eucariotas hay una secuencia AATAAA que puede ser la señal para la adición de la cola poli A al extremo en la posición 3' de la secuencia de codificación. Todas estas secuencias se insertan de forma adecuada en vectores de expresión eucariotas.
Los ejemplos de secuencias promotoras adecuadas para su uso con hospedadores de levadura incluyen los promotores de la 3-fosfoglicerato quinasa u otras enzimas glicolíticas, tales como enolasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructoquinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato quinasa, triosfosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucoquinasa.
La transcripción de vectores en células hospedadoras de mamífero se puede controlar, por ejemplo, mediante promotores obtenidos a partir de genomas de virus tales como el virus del polioma, el virus de la viruela aviar, el adenovirus (tal como el Adenovirus 2), el virus del papiloma bovino, el virus del sarcoma aviar, el citomegalovirus, un retrovirus, virus de la hepatitis B y lo más preferiblemente el Virus de Simio 40 (SV40), de promotores heterólogos de mamíferos, p. ej., el promotor de actina o un promotor de inmunoglobulina, a partir de promotores de choque térmico, con la condición de que tales promotores sean compatibles con los sistemas de la célula hospedadora.
La transcripción de un ADN que codifica la proteína de la invención por los eucariotas superiores a menudo se incrementa al insertar una secuencia potenciadora en el vector. Ahora se conocen muchas secuencias potenciadoras de genes de mamíferos (globina, elastasa, albúmina, a-fetoproteína e insulina). Por lo general, sin embargo, se usará un potenciador de un virus de células eucariotas. Los ejemplos incluyen el potenciador de SV40 en el lado tardío del origen de replicación (pb 100-270), el potenciador del promotor temprano de citomegalovirus, el potenciador de polioma en el lado tardío del origen de replicación y los potenciadores de adenovirus. Véase también Yaniv, Nature, 297: 17-18 (1982) sobre elementos mejoradores para la activación de promotores eucariotas. El potenciador se puede empalmar en el vector en una posición 5' o 3' con respecto a la secuencia codificante del péptido, pero se sitúa preferiblemente en un sitio en la posición 5' del promotor.
Los vectores de expresión usados en células hospedadoras eucariotas (p. ej., células de levadura, hongos, insectos, plantas, animales, ser humano o células nucleadas de otros organismos pluricelulares) también contendrán secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y para estabilizar el ARNm. Las secuencias de ese tipo comúnmente están disponibles en las regiones en la posición 5' y, en ocasiones en la posición 3', no traducidas de los ADN o ADNc eucariotas o virales. Estas regiones contienen segmentos de nucleótidos transcritos como fragmentos poliadenilados en la parte no traducida de ARNm que codifica la proteína de la invención. Un componente útil de terminación de la transcripción es la región de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina. Véase el documento WO 94/11026 y el vector de expresión que se describe en el mismo.
El ADN recombinante también puede incluir cualquier tipo de secuencia de etiqueta proteica que pueda ser útil para purificar la proteína. Los ejemplos de etiquetas proteicas incluyen, pero no se limitan a, una etiqueta de histidina, una etiqueta FLAG, una etiqueta myc, una etiqueta HA o una etiqueta GST. Los vectores de clonación y de expresión apropiados para su uso con hospedadores celulares bacterianos, bacterianos, fúngicos, de levadura y de mamíferos se pueden encontrar en Cloning Vectors: A Laboratory Manual, (Elsevier, New York (1985)).
La construcción de expresión se introduce en la célula hospedadora usando un método apropiado para la célula hospedadora, como será evidente para una persona con experiencia en la técnica. Una diversidad de métodos para introducir ácidos nucleicos en células hospedadoras son conocidos en la técnica, que incluyen, pero no se limitan a, electroporación; transfección usando cloruro de calcio, cloruro de rubidio, fosfato de calcio, DEAE-dextrano u otras sustancias; bombardeo de microproyectiles; lipofección; e infección (cuando el vector es un agente infeccioso). Las células hospedadoras adecuadas incluyen células de procariotas, levaduras, mamíferos o bacterianas. Las bacterias adecuadas incluyen organismos gram negativos o gram positivos, por ejemplo, Levadura de E. coli o Bacillus spp., preferiblemente de la especie Saccharomyces, tal como S. cerevisiae, que también se pueden usar para la producción de polipéptidos. También se pueden usar diversos sistemas de cultivo de células de mamíferos o insectos para expresar proteínas recombinantes. Los sistemas de baculovirus para la producción de proteínas heterólogas en células de insectos son revisados por Luckow et al., (Bio/Technology, 6: 47 (1988)). Los ejemplos de líneas de células hospedadoras de mamíferos adecuadas incluyen líneas de células endoteliales, células de riñón de mono COS-7, CV-1, células L, C127, 3T3, ovario de hámster chino (CHO), células de riñón embrionario humano, HeLa, 293, 293T y células BHK. Los polipéptidos purificados se preparan cultivando sistemas de hospedador/vector adecuados para expresar las proteínas recombinantes. Para muchas aplicaciones, el pequeño tamaño de muchos de los polipéptidos que se describen en la presente memoria podría hacer que la expresión en E. coli sea el método preferible para la expresión. A continuación la proteína se purifica a partir de medios de cultivo o extractos celulares. VI. Producción de Proteínas
La presente invención también se refiere a líneas celulares que expresan una Adnectina anti-miostatina o un polipéptido de fusión de la misma. La creación y el aislamiento de líneas celulares que producen una Adnectina antimiostatina se pueden conseguir usando técnicas convencionales conocidas en la técnica, tales como las que se describen en la presente memoria.
Las células hospedadoras se transforman con los vectores de expresión o clonación que se describen en la presente memoria para la producción de proteínas y se cultivan en medios nutrientes convencionales modificados según sea apropiado para inducir promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas. En los ejemplos que se muestran en la presente memoria, las células hospedadoras usadas para la producción de proteínas de alto rendimiento (HTPP) y la producción a mediana escala fueron las de la cepa bacteriana HMS174.
Las adnectinas de la presente invención también se pueden obtener en forma aglicosilada mediante la producción de las adnectinas en, p. ej., células procariotas (p. ej., E. coli). En particular, las formas aglicosiladas de las Adnectinas de la invención presentan la misma afinidad, potencia y mecanismo de acción que las Adnectinas glicosiladas cuando se someten a ensayo in vitro.
Las células hospedadoras usadas para producir las proteínas de la presente invención se pueden cultivar en una diversidad de medios. Los medios disponibles en el mercado tales como F10 de Ham (Sigma), Medio Esencial Mínimo ((MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma), y Medio de Eagle Modificado por Dulbecco ((DMEM), Sigma)) son adecuados para cultivar las células hospedadoras. Además, muchos de los medios que se describen en Ham et al., Meth. Enzymol., 58: 44 (1979), Barites et al., Anal. Biochem., 102: 255 (1980), documentos de Patente de Estados Unidos N.os 4.767.704, 4.657.866, 4.927.762, 4.560.655, 5.122.469, 6.048.728, 5.672.502, o documento de Patente de Estados Unidos N.° RE 30.985 se pueden usar como medio de cultivo para las células hospedadoras. Cualquiera de estos medios se puede complementar si fuera necesario con hormonas y/u otros factores de crecimiento (tal como insulina, transferrina o factor de crecimiento epidérmico), sales (tal como cloruro de sodio, calcio, magnesio y fosfato), tampones (tal como HEPES), nucleótidos (tal como adenosina y timidina), antibióticos (tal como el fármaco Gentamicina), elementos traza (definidos como compuestos inorgánicos normalmente presentes en concentraciones finales en el intervalo micromolar) y glucosa o una fuente de energía equivalente. Cualquier otro suplemento necesario también se puede incluir en concentraciones apropiadas que podrían ser conocidas por los expertos en la técnica. Las condiciones de cultivo, tales como temperatura, el pH y similares, son aquellas usadas previamente con la célula hospedadora seleccionada para la expresión, y serán evidentes para la persona con experiencia en la materia.
Las proteínas que se describen en la presente memoria también se pueden producir usando sistemas de traducción celular. Para tales fines, los ácidos nucleicos que codifican el polipéptido se deben modificar para permitir la transcripción in vitro para producir ARNm y para permitir la traducción libre de células del ARNm en el sistema particular libre de células que se está usando (eucariotas tal como un sistema de traducción libre de células de mamífero o levadura, o procariota tal como un sistema de traducción libre de células bacterianas.
Las proteínas de la invención también se pueden producir por síntesis química (p. ej., con los métodos que se describen en Solid Phase Peptide Synthesis, 2a Edición, The Pierce Chemical Co., Rockford, I11. (1984)). Las modificaciones a la proteína también se pueden producir mediante síntesis química.
Las proteínas de la presente invención se pueden purificar mediante métodos de aislamiento/purificación para proteínas generalmente conocidos en el campo de la química de proteínas. Los ejemplos no limitantes incluyen extracción, recristalización, precipitación de proteínas por adición de sal (p. ej., con sulfato de amonio o sulfato de sodio), centrifugación, diálisis, ultrafiltración, cromatografía de adsorción, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía hidrofóbica, cromatografía de fase normal, cromatografía de fase inversa, filtración para obtención, cromatografía de permeación de gel, cromatografía de afinidad, electroforesis, distribución en contracorriente o cualquier combinación de éstas. Después de la purificación, los polipéptidos se pueden intercambiar en diferentes tampones y/o se pueden concentrar mediante cualquiera de una diversidad de métodos conocidos en la técnica, que incluyen, pero no se limitan a, filtración y diálisis.
El polipéptido purificado es preferiblemente puro en al menos un 85 %, o preferiblemente puro en al menos un 95 %, y lo más preferiblemente puro en al menos un 98 %. Independientemente del valor numérico exacto de la pureza, el polipéptido es lo suficientemente puro como para usarlo como un producto farmacéutico.
VII. Caracterización Biofísica y Bioquímica
La unión de una Adnectina anti-miostatina de la invención a una molécula diana (p. ej., miostatina) se puede evaluar en términos de constantes de equilibrio (p. ej., disociación, Kd) y en términos de constantes cinéticas (p. ej., constante de asociación, kasoc y constante de disociación, kdisoc). Una Adnectina generalmente se unirá a una molécula diana con una Kd inferior a 500 nM, 100 nM, 10 nM, 1 nM, 500 pM, 200 pM, o 100 pM, aunque se pueden tolerar valores de Kd más elevados en los que la kdisoc es lo suficientemente baja o la kasoc, es lo suficientemente elevada.
Ensayos In vitro para Afinidad de Unión
Las Adnectinas anti-miostatina que se unen a y antagonizan la miostatina se pueden identificar usando diversos ensayos in vitro. Preferiblemente, los ensayos son ensayos de alto rendimiento que permiten la identificación sistemática de múltiples Adnectinas candidatas de forma simultánea. En algunas realizaciones, BMP-11, que comparte un 90 % de identidad de aminoácido con la miostatina, se puede usar como un sustituto para la miostatina en ensayos in vitro cuando el ensayo se realiza en condiciones de saturación.
En particular, las Adnectinas anti-miostatina fusionadas a dominios Fc se pueden unir tanto a miostatina como a BMP-11, mientras que las mono Adnectinas se unen preferentemente a la miostatina. Sin quedar ligado a la teoría, esto puede reflejar el aumento de la avidez de las Adnectinas fusionadas a Fc divalentes en comparación con las Adnectinas monovalentes. Un aumento de la unión a BMP11 similar se observa con las Adnectinas PEGiladas divalentes, tal como ATI-1341, que comprenden Adnectinas fusionadas a los extremos de un resto de PEG de 20 kDa.
Los ensayos a modo de ejemplo para determinar la afinidad de unión de Adnectinas anti-miostatina se describen en los Ejemplos que se mencionan a continuación, incluyen, pero no se limitan, métodos en fase de solución tal como el ensayo de exclusión cinética (KinExA) (Blake et al., JBC 1996; 271: 27677-85; Drake et al., Anal Biochem 2004; 328: 35-43), resonancia de plasmón superficial (SPR) con el sistema Biacore (Uppsala, Suecia) (Welford et al., Opt. Quant. Elect 1991; 23:1; Morton y Myszka, Methods in Enzymology 1998; 295: 268) y ensayos de fluorescencia resuelta en el tiempo homogénea (HTRF) (Newton et al., J Biomol Screen 2008; 13: 674-82; Patel et al., Assay Drug Dev Technol2008; 6: 55-68).
En algunas realizaciones, las interacciones biomoleculares se monitorizar en tiempo real con el sistema Biacore, que usa SPR para detectar cambios en el ángulo de resonancia de la luz en la superficie de una película fina de oro sobre un soporte de vidrio debido a cambios en el índice de refracción de la superficie ha dejado hasta 300 nm. El análisis de Biacore Genera constantes de tasa de asociación, constantes de tasa de disociación, constantes de disociación en equilibrio, y constantes de afinidad. La afinidad de unión se obtiene evaluando las constantes de tasa de asociación y de disociación usando un sistema de resonancia de plasmón superficial de Biacore (Biacore, Inc.). Un chip biosensor se activa para acoplamiento covalente de la diana. La diana a continuación se diluye y se inyecta sobre el chip para obtener una señal como unidades de respuesta de material inmovilizado. Dado que la señal en unidades de resonancia (RU) es proporcional a la masa de material inmovilizado, esto representa un intervalo de densidades de diana inmovilizada sobre la matriz. Los datos de asociación y disociación se ajustan de forma simultánea en un análisis global para resolver la expresión de la tasa neta para una interacción bimolecular a 1:1, proporcionando los mejores valores de ajuste para kasoc, kdisoc y Rmáx (respuesta máxima en saturación). Las constantes de disociación en equilibrio para la unión, las KD, se calculan a partir de mediciones de SPR Como kdisoc/kasoc.
En algunas realizaciones, las Adnectinas anti-miostatina de la invención presentan una Kd en el ensayo de afinidad de SPR que se describe en el Ejemplo 6 de 500 nM o inferior, 400 nM o inferior, 300 nM o inferior, 200 nM o inferior, 150 nM o inferior, 100 nM o inferior, 90 nM o inferior, 80 nM o inferior, 70 nM o inferior, 60 nM o inferior, 50 nM o inferior, 40 nM o inferior, 30 nM o inferior, 20 nM o inferior, 15 nM o inferior, 10 nM o inferior, 5 nM o inferior, o 1 nM o inferior. Preferiblemente, la Kd es 15 nM o inferior. Más preferiblemente, la Kd es 2,0 nM o inferior.
En algunas realizaciones, las Adnectinas anti-miostatina de la invención presentan una CI50 en el ensayo de HTRF que se describe en el Ejemplo 4 de 5 nM o inferior, 4 nM o inferior, 3 nM o inferior, 2.5 nM o inferior, 2 nM o inferior, 1.5 nM o inferior, 1 nM o inferior, 0,5 nM o inferior, 0,2 nM o inferior, o 0,1 nM o inferior. Preferiblemente, la CI50 es 1.5 nM o inferior. Más preferiblemente, la CI50 es 0,5 nM o inferior.
En algunas realizaciones, las Adnectinas anti-miostatina de la invención presentan una Kd en el ensayo de exclusión cinética que se describe en el Ejemplo 7 de 2 nM o inferior, 1,5 nM o inferior, 1 nM o inferior, 900 pM o inferior, 850 pM o inferior, 800 pM o inferior, 750 pM o inferior, 700 pM o inferior, 650 pM o inferior, 600 pM o inferior, 550 pM 0 inferior, 500 pM o inferior, 450 pM o inferior, 400 pM o inferior, 350 pM o inferior, 340 pM o inferior, 330 pM o inferior, 300 pM o inferior, 250 pM o inferior, 200 pM o inferior, 150 pM o inferior, o 100 pM o inferior. Preferiblemente, la Kd es 850 pM o inferior.
Se debería entender que los ensayos que se describen en la presente memoria que se ha mencionado anteriormente son a modo de ejemplo, y que cualquier método conocido en la técnica para determinar la afinidad de unión entre proteínas (p. ej., transferencia basada en fluorescencia (FRET), ensayo de inmunoabsorción unida a enzimas, y ensayos de unión competitiva (p. ej., radioinmunoensayos)) se puede usar para evaluar las afinidades de unión de las Adnectinas anti-miostatina de la invención.
Ensayos In vitro para Actividad Antagonista
La capacidad de las Adnectinas anti-miostatina para antagonizar la actividad de miostatina se puede determinar fácilmente usando diversos ensayos in vitro. Preferiblemente, los ensayos son ensayos de alto rendimiento que permiten la identificación sistemática de múltiples Adnectinas candidatas de forma simultánea. En algunas realizaciones, los efectos antagonistas de las Adnectinas anti-miostatina en la actividad de miostatina se pueden determinar en ensayos de indicador de elemento sensible a activina (ARE)-luciferasa basados en células, como se describe en el Ejemplo 3. En ciertas realizaciones, las Adnectinas anti-miostatina de la invención disminuyen la actividad de ARE-luciferasa inducida por miostatina en al menos un 10 %, al menos un 20 %, al menos un 30 %, al menos un 40 %, al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 % o más con respecto a un control después de co-incubación de miostatina con una Adnectina anti-miostatina antes de estimular las células con la mezcla. Una reacción de control a modo de ejemplo implica el tratamiento de las células con miostatina sola o con miostatina incubada previamente con un exceso de un inhibidor de miostatina de referencia tal como la Quimera de Fc de Activina RIIB Humana (R&D Systems) o ActRIIb-Fc como se describe en Morrison et al., (Experimental Neurology 2009; 217: 258-68). En otras realizaciones, las Adnectinas anti-miostatina de la invención inhiben la actividad de indicador de ARE-luciferasa con una CI50 de 500 nM o inferior, 400 nM o inferior, 300 nM o inferior, 200 nM o inferior, 100 nM o inferior, 50 nM o inferior, 10 nM o inferior, 5 nM o inferior, 1 nM, 0,5 nM o inferior, 0,4 nM o inferior, 0,3 nM o inferior, 0,2 nM o inferior, o 0,10 nM o inferior, como se describe en el Ejemplo 3.
En otras realizaciones, los efectos antagonistas de las Adnectinas anti-miostatina en la actividad de miostatina se pueden determinar midiendo al alcance de la fosforilación de SMAD en células tratadas con miostatina, como se describe en el Ejemplo 5. En ciertas realizaciones, las Adnectinas anti-miostatina de la invención disminuyen la fosforilación de SMAD inducida por miostatina en al menos un 10 %, al menos un 20 %, al menos un 30 %, al menos un 40 %, al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, o al menos un 97 % o más con respecto a un control después de co-incubación de miostatina con una Adnectina anti-miostatina antes de estimular las células con la mezcla. Una reacción de control a modo de ejemplo implica el tratamiento de las células con miostatina sola o miostatina incubada previamente con un exceso de un inhibidor de miostatina de referencia tal como la Quimera de Fc de Activina RIIB Humana (R&D Systems) o ActRIIb-Fc como se describe en Morrison et al. .Experimental Neurology 2009; 217: 258-68). En algunas realizaciones, las Adnectinas anti-miostatina de la invención inhiben la fosforilación de SMAD con una CI50 de 1 nM o inferior, 0,8 nM o inferior, 0,6 nM o inferior, 0,4 nM o inferior, 0,3 nM o inferior, 0,2 nM o inferior, o 0,1 nM o inferior en una respuesta de inhibición de 12 puntos o 4 puntos, como se describe en el Ejemplo 5. En otras realizaciones, las Adnectinas antimiostatina de la invención a 10 nM inhiben la fosforilación de SMAD por miostatina en al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, o al menos un 98 % o más, como se describe en el Ejemplo 5.
Además, son conocidos varios sistemas modelo in vitro que usan células, cultivo tisular y métodos histológicos para estudiar enfermedades de las neuronas motoras. Por ejemplo, un corte organotípico de médula espinal de rata sometido a excitotoxicidad por glutamato es útil como un sistema modelo para someter a ensayo la eficacia de las Adnectinas anti-miostatina para prevenir la regeneración de las neuronas motoras. Corse et al., Neurobiol. Dis. (1999) 6: 335346. Para una discusión de sistemas in vitro para su uso en el estudio de ELA, véase, p. ej., Bar, P. R., Eur. J. Pharmacol. (2000) 405: 285 295; Silani et al., J. Neurol. (2000) 247 Supl 1: 12836; Martin et al., Int. J. Mol. Med. (2000) 5: 313.
Se debería entender que los ensayos que se describen en la presente memoria son a modo de ejemplo, y cualquier método conocido en la técnica que pueda servir como una lectura para la actividad de miostatina es adecuado para su uso para someter a ensayo los efectos antagonizantes de la miostatina de las Adnectinas anti-miostatina de la invención (p. ej., RT-PCR en tiempo real de los ARNm de genes diana de SMAD (p. ej., Smad 7; Ciarmela et al., Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism 2011; 96; 755-65) o los ARNm de genes que contienen ARE).
Modelos In vivo
Existen varios modelos animales reconocidos por la técnica que recapitulan los síntomas de enfermedades, trastornos y condiciones asociadas con el desgaste muscular asociado, por ejemplo, con músculos, neuromusculares, neurológicos y trastorno metabólico. Estos modelos se pueden utilizar para probar la eficacia de las Adnectinas anti-miostatina de la invención.
Por ejemplo, los ejemplos no limitantes de los modelos animales de ese tipo incluyen, p. ej., el modelo de ratón con muscular distrofia (mdx) relacionado con el cromosoma X (documento US2011/0008375, Gehrig et al., Nature 2012; 484: 394-8), que incluye 4 cepas adicionales de mdx ratón-mdx2cv, mdx3cv, mdx4cv, o ratón mdx5cv (Phelps et al., Human Molecular Genetics. 1996; 5 (8): 1149-1153), el ratón mdx con ablación adicional del homólogo de distrofina, utrofina (mdx/u--) (Deconinck et al., Cell. 1997; 90 (4): 717-727), el ratón alfa-SG-nulo C57BL/6 (Duclos et al., (1998) J. Cell Biol. 142, 1461-1471), y los que se han revisado recientemente en Nakamura et al., (J. Biomed Biotechnol.
2011; N.° de ID del Artículo: 184393), p. ej., el ratón mdx52, en el que se produce una deleción del exón 52 del gen DMD murino, el modelo de distrofia muscular en Golden Retriever (GRMD), el modelo de Distrofia Muscular Canina relacionada con el Cromosoma X (CXMDj ), y el modelo de Distrofia e Hipertrofia Muscular Felina (HFMD) (p. ej., Shelton et al., Neuromuscular Disorders. 2005; 15 (2): 127-138).
Los modelos animales para el estudio de trastornos de neuronas motoras, tales como ELA, son ratones transgénicos con un gen de la superóxido dismutasa de Cu/Zn (SOD1) mutantes relacionados con ELA (mSOD1G93A y/o mSOD1G37R). Estos ratones desarrollan un trastorno paralítico de aparición adulta hereditario dominante con muchas de las características clínicas y patológicas de la ELA familiar (p. ej., Gurney et al., Science (1994) 264: 1772 1775; Nagano et al., Life Sci (2002) 72: 541 548). Otros modelos animales incluyen dos modelos murinos de origen natural para la neuronopatía motora progresiva (pmn) y síndrome de Wobbler (Haegggeli y Kato, Neurosci. Lett. (2002) 335: 3943). Para una revisión de varios modelos animales para su uso en el estudio de enfermedades relacionadas con las neuronas motoras tales como ELA, véase, p. ej., Jankowsky et al., Curr Neurol Neurosci. Rep. (2002) 2: 457464; Elliott, J. L., Neurobiol. Dis. (1999) 6: 31020; y Borchelt et al., Brain Pathol. (1998) 8: 735757.
Los modelos animales de otras enfermedades neurodegenerativas o neuropatológicas, además de la ELA, incluyen un modelo de ratón transgénico para evaluar la atrofia muscular espinal y bulbar (SBMA) (Katsuno et al., Neuron (2002) 35: 843 854), modelos animales para la poliomielitis paralítica humana (Ford et al., Microb. Pathog. (2002) 33:97 107), modelos animales de atrofia muscular espinal (Schmid et al., J. Child Neurol. 22, 1004-1012, 2007), modelos animales para miopatía distal y miopatía por cuerpos de inclusión hereditaria (Malicdan et al., Acta Myol. Diciembre de 2007; 26 (3): 171-175), el modelo murino de enfermedad desmielinizante genética (Suzuki et al., Microsc. Res. Tech. 1995;32:204-214), y los que se describen en Meyer ZuHorste et al., (Curr. Opin. Neurol. 2006; 19: 464-473).
Los modelos animales para someter a ensayo la eficacia de las Adnectinas anti- miostatina de la invención contra la pérdida de volumen muscular debido a atrofia y/o inactividad incluyen, pero no se limitan a, modelos de ratón de inmovilización unilateral (Madaro et al., Basic Applied Myology 2008; 18: 149-153), laceración del tendón de Aquiles (tenotomía) (Bialek et al., Physiol Genomics 2011; 43: 1075-86), y los que se describen en Powers et al., (Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 2005; 288: R337-44), tales como, suspensión de animales de las extremidades posteriores, inmovilización de extremidades y ventilación mecánica controlada.
Los modelos animales relevantes para someter a ensayo la eficacia de las Adnectinas anti-miostatina de la invención en el tratamiento de trastornos metabólicos incluyen, pero no se limitan a, los que se describen en Ramaro et al., (Indian J Med Res 2007; 125: 451-472) y Kennedy et al., (Disease Models & Mechanisms 2010; 3: 156-166). Los ejemplos no limitantes de los modelos animales de ese tipo incluyen ratones Lepob/ob, ratones Lepr^, ratones Kuo Kondo, ratones KK/Ay, ratones Obesos de Nueva Zelanda (NZO), ratones NONcNZO10, ratones con Diabetes Obesos Tsumara Suzuki (TSOD) y ratones No Obesos Tsumara Suzuki (TSNO), ratones M16, ratas con grasa Zucker, ratas con grasa diabéticas Zucker, ratas SHR/N-cp, ratas JCR/lA-cp, ratas con Grasa Otsuka Long Evans Tokushima, monos rhesus Obesos, ratas diabéticas Cohen, ratas Goto-Kakizaki, y ratones C57 BL/6 (Akita) no obesos mutantes. La diabetes de tipo 2 también se puede inducir con la dieta, p. ej., mediante la alimentación con un alimento con alto contenido de grasa a ratones C57BL6 no diabéticos, no obesos (Surwit et al., Diabetes 1988; 37: 1163-7). La diabetes tipo 2 también se puede inducir por vía química con, p. ej., goldtioglucosa (Le Marchand Brustel et al., Am J Physiol 1978; 234: E348-58) o estreptozotocina, o se puede inducir por vía quirúrgica, (p. ej., animales diabéticos con pancreatomía parcial) (McNeil JH., Experimental models of diabetes. Florida, US: CRC Press LLc; 1999; Sasaki et al., In Vivo 2000; 14: 535-41). También se sabe que muchos modelos genéticos de animales sintetizan los síntomas y fenotipos de trastorno metabólico, tales como los revisados en Kennedy et al., 2010 (mencionado anteriormente).
En algunas realizaciones, la eficacia de las Adnectinas anti-miostatina de la invención para aumentar la masa o volumen muscular se puede someter a ensayo mediante inyección subcutánea de ratones, como se describe en el Ejemplo 9. Dado que la inhibición de la miostatina aumenta la masa muscular, se espera que las Adnectinas antimiostatina de la invención aumenten el peso corporal y la masa muscular, cuyo alcance se puede usar para determinar la potencia de las adnectinas.
En algunas realizaciones, en particular, cuando las Adnectinas anti-miostatina son inmunogénicas en ratones (p. ej., debido al uso del dominio de fibronectina humana tipo III) y se desean tratamientos crónicos, las Adnectinas antimiostatina de la invención se pueden administrar a ratones SCID, que son incapaces de remontar las respuestas inmunológicas celulares o humorales. En algunas realizaciones, los ratones SCID se pueden cruzar con otros modelos genéticos, tales como los que se describen en la presente memoria (p. ej., ratones diabéticos), para desarrollar un modelo de ratón inmunocomprometido susceptible de tratamiento crónico con las Adnectinas antimiostatina de la invención.
VIII. Aplicaciones Terapéuticas
En un aspecto, la presente invención proporciona Adnectinas anti-miostatina útiles para el tratamiento de enfermedades o trastornos relacionados con la miostatina, p. ej., trastornos de debilitamiento muscular, atrofia muscular, trastornos metabólicos, y trastornos degenerativos óseos. Por consiguiente, en ciertas realizaciones la invención proporciona los métodos para atenuar o inhibir una enfermedad o trastorno relacionados con la miostatina en un sujeto que comprenden la administración de una cantidad épica de polipéptido de unión a miostatina, es decir, una Adnectina anti-miostatina, a un sujeto. En algunas realizaciones el sujeto es un ser humano. En algunas realizaciones, las Adnectinas anti-miostatina son farmacéuticamente aceptables para un mamífero, en particular un ser humano. Un polipéptido "farmacéuticamente aceptable" se refiere a un polipéptido que se administra a un animal sin consecuencias médicas adversas significativas, tales como básicamente sin endotoxina, o niveles muy bajos de endotoxina.
En algunas realizaciones, las Adnectinas anti-miostatina de la presente invención se administrarán a un sujeto en combinación (de forma simultánea o por separado) con un agente que en la técnica se sabe que es útil para el trastorno o enfermedad en particular que se están tratando.
En algunas realizaciones, la población de pacientes diana para terapia con Adnectina anti-miostatina es una que no está dispuesta a terapia convencional para la enfermedad, trastorno, o afección que se está tratando debido a, p. ej., edad, afecciones existentes previamente, cargamento genético, y/o morbideces conjuntas. Las Adnectinas antimiostatina de la invención pueden servir como alternativas a las terapias existentes que están asociadas con efectos secundarios sustanciales (p. ej., rendimiento reproductivo) o preocupaciones de seguridad.
Las enfermedades, trastornos y afecciones para los cuales serán útiles las Adnectinas anti-miostatina de la presente invención se describen con más detalle a continuación.
Enfermedades y Trastornos Musculares, Neurológicos, y Metabólicos
Las Adnectinas anti-miostatina de la presente invención se pueden usar para tratar trastornos musculares, neurológicos y metabólicos asociados con debilitamiento muscular y/o atrofia muscular. Por ejemplo, la sobreexpresión de la miostatina in vivo induce signos y síntomas característicos de caquexia, y los agentes de unión a la miostatina pueden resolver parcialmente el efecto de debilitamiento muscular de la miostatina (Zimmers et al., Science 2002; 296: 1486-8). Los pacientes con SIDA también presentan un aumento de los niveles en suero de material inmunorreactivo hacia la miostatina en comparación con pacientes sin SIDA o para pacientes con SIDA que no presentan pérdida de peso (Gonzalez-Cadavid et al., PNAS 1998; 95: 14938-43). También se ha observado que la eliminación de la miostatina específica del corazón reduce la atrofia del músculo esquelético en ratones con insuficiencia cardiaca, y por el contrario, de forma específica la sobreexpresión de la miostatina en el corazón es suficiente como para inducir debilitamiento muscular (Breitbart et al., AJP-Heart; 2011; 300: H1973-82). Por el contrario, los ratones con supresión genética de miostatina muestran un aumento de masa muscular, y una disminución de la acumulación de grasa dependiente de la edad en comparación con sus homólogos de tipo silvestre (McPherron et al., J. Clin. Invest. 2002; 109: 595-601).
Los trastornos a modo de ejemplo que se pueden tratar según los métodos de la invención incluyen miopatías y neuropatías, incluyendo, por ejemplo, enfermedad de las neuronas motoras, trastornos neuromusculares y neurológicos.
Por ejemplo, las Adnectinas anti-miostatina se pueden usar para tratar miopatías y trastornos neuromusculares heredados (p. ej., distrofia muscular (Gonzalez-Kadavid et al., PNAS, 1998; 95: 14938-43), enfermedades de las neuronas motoras, miopatías congénitas, miopatías inflamatorias y miopatías metabólicas), así como miopatías adquiridas (p. ej., miopatía inducida por fármaco, miopatía inducida por toxina, miopatía inducida por infección, miopatía paraneoplásica y otras miopatías asociadas con enfermedades críticas).
Los trastornos de ese tipo incluyen, pero no se limitan a, distrofia muscular de Duchenne, distrofia muscular progresiva, distrofia muscular de tipo Becker, distrofia muscular de Dejerine-Landouzy, distrofia muscular de Erb, distrofia muscular de Emery Dreifuss, distrofia muscular de la cintura y extremidades, distrofia muscular oculofaríngea (OPMD), distrofia muscular facioscapulohumeral, distrofia muscular congénita, distrofia muscular neuroaxonal infantil, distrofia miotónica (enfermedad de Steinert), distrofia muscular distal, miopatía nemalínica, parálisis periódica familiar, miotonía no distrófica, parálisis periódicas, atrofia muscular espinal, atrofia muscular espinal (SMA), esclerosis lateral amiotrófica (ELA), esclerosis lateral primaria (PLS), atrofia muscular progresiva (PMA), miopatía distal, miopatía miotubular/centronuclear, miopatía nemalínica, enfermedad de mini core, enfermedad del núcleo central, desminopatía, miositis por cuerpos de inclusión, dermatomiositis, polimiositis, miopatía mitocondrial, síndrome miasténico congénito, miastenia gravis, disfunción muscular posterior a la polio, miopatía esteroidea, miopatía alcohólica, atrofia muscular perioperatoria e neuromiopatía adquirida en la UCI.
Las neuropatías y radiculopatías heredadas y adquiridas que se pueden tratar con Adnectinas anti-miostatina incluyen, pero no se limitan a, síndrome de la columna vertebral rígida, enfermedad de músculo-ojo-cerebro, neuropatía motora y sensorial hereditaria, enfermedad de Charcot-Marie-Tooth, neuropatía inflamatoria crónica, neuropatía hipertrófica progresiva, neuropatía tomaculosa, lupus, síndrome de Guillain-Barré, polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, esclerosis múltiple sarcoidosis, neuropatía diabética, neuropatía alcohólica, neuropatías relacionadas con enfermedades (p. ej., VIH/SIDA, enfermedad de Lyme), neuropatías relacionadas con toxinas (p. ej., metales pesados, quimioterapia), neuropatías por compresión (p. ej., tumores, neuropatía por atrapamiento), y neuropatías asociadas con lesión o traumatismo (p. ej., síndrome de la cauda equina, paraplejia, cuadriplejia).
En algunas realizaciones, las Adnectinas anti-miostatina de la invención se pueden usar para tratar distrofias musculares (p. ej., distrofia muscular de Duchenne, distrofia muscular de tipo Becker), ELA, y sarcopenia.
Los trastornos adicionales asociados con debilitamiento muscular que se pueden tratar con las Adnectinas antimiostatina de la invención incluyen caquexia, síndrome de debilitamiento, sarcopenia, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, fibrosis quística (caquexia pulmonar), enfermedad o insuficiencia cardiaca (caquexia cardiaca), cáncer, debilitamiento debido a SIDA, debilitamiento debido a insuficiencia renal, enfermedad renal, claudicación, caquexia asociada con la diálisis, uremia, artritis reumatoide, lesión muscular, cirugía, reparación de músculo dañado, fragilidad, atrofia por desuso, osteoporosis, osteoartritis, crecimiento y reparación del ligamento.
Los métodos de la invención también se pueden usar para aumentar el volumen muscular en sujetos que padecen atrofia muscular debida al desuso. La atrofia por desuso puede resultar de numerosas causas incluyen cualquier trastorno o estado que conduce a una inmovilidad o desuso prolongados, que incluyen, pero no se limitan a, reposo en cama prolongado, estar unido a una silla de ruedas, inmovilización de las extremidades, descarga del diafragma mediante ventilación mecánica, trasplante de órganos sólidos, reemplazo articular, apoplejía, de vida relacionada con daño en el SNC, lesión de la médula espinal, recuperación de quemaduras graves, hemodiálisis crónica sedentaria, recuperación después de traumatismos, recuperación después de sepsis y exposición a microgravedad (Powers et al., Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 2005; 288: R337-44).
Además, parece que los aumentos relacionados con la edad de las proporciones de grasa con respecto a músculo, y la atrofia muscular relacionada con la edad están relacionados con la miostatina. Por ejemplo, el promedio de proteína inmunorreactiva hacia miostatina en suero aumentó con la edad en grupos de hombres y mujeres jóvenes (19-35 años de edad), edad media (36-75 años de edad), y de edad avanzada (76-92 años de edad), mientras que el promedio de masa muscular y masa sin grasa disminuía con la edad en estos grupos (Yarasheski et al., J Nutr Aging 6 (5): 343-8 (2002)). Por consiguiente, los sujetos con atrofia muscular debida al envejecimiento, y/o los sujetos que son débiles debido a, por ejemplo, sarcopenia, también se podrían beneficiar el tratamiento con las Adnectinas antimiostatina de la invención.
También se contemplan métodos para aumentar la masa muscular en animales para alimento mediante la administración de una dosificación eficaz de las Adnectinas anti-miostatina a estos animales. Dado que el polipéptido de miostatina C-terminal maduro es idéntico en todas las especies, se podría esperar que las Adnectinas antimiostatina aumentaron de forma eficaz la masa muscular y redujeran la grasa en cualquier especie importante en agricultura, por ejemplo, pero no limitándose a, ganado vacuno, pollos, pavos, y cerdos.
La eficacia de la Adnectina anti-miostatina en el tratamiento de trastornos de debilitamiento muscular o atrofia muscular se puede determinar, por ejemplo, mediante uno o más métodos para medir un aumento de la masa o volumen muscular, un aumento del número de células musculares (hiperplasia), un aumento del tamaño de las células musculares (hipertrofia) y/o un aumento de la fuerza muscular. Por ejemplo, los efectos de aumento del volumen muscular de las Adnectinas anti-miostatina de la presente invención se demuestran en los Ejemplos que se describen a continuación. Los métodos para determinar el "aumento de masa muscular" se conocen bien en la técnica. Por ejemplo, el contenido de músculo se puede medir antes y después de la administración de una Adnectina anti-miostatina de la invención usando técnicas convencionales, tales como pesada bajo el agua (véase, p. ej., Bhasin et al., New Eng. J. Med. (1996) 335: 1-7) y absorciometría de rayos X de energía doble (véase, p. ej., Bhasin et al., Mol. Endocrinol. (1998) 83: 3155-3162). Un aumento del tamaño muscular se puede poner en evidencia mediante el aumento de peso de al menos un aproximadamente un 5-10 %, preferiblemente al menos aproximadamente un 10-20 % o superior.
Trastornos Metabólicos
Las Adnectinas anti-miostatina de la presente invención, que reducen la actividad y/o señalización de la miostatina, son útiles para tratar trastornos metabólicos, tales como obesidad, diabetes mellitus de tipo II, trastornos asociados a la diabetes, síndrome metabólico, e hiperglucemia.
La miostatina está implicada en la patogénesis de la diabetes mellitus de tipo II. La miostatina se expresa en tejido adiposo y los ratones con deficiencia de miostatina presentan una reducción de la acumulación de la grasa a medida que envejecen. Además, la carga de glucosa, la acumulación de grasa, y el peso corporal total se reducen en Ratones agouti De color amarillo y obesos (Lepob/ob) letales que carecen de miostatina (Yen et al., FASEB J. 8: 479, 1994; McPherron et al., 2002). Como se describe en el documento US2011/0008375, los antagonistas de la miostatina pueden disminuir la proporción de grasa con respecto al músculo en un modelo de ratón envejecido, pueden conservar la masa del músculo esquelético y la masa corporal magra, y pueden atenuar la hipertrofia renal en ratones diabéticos inducidos por STZ.
Como se usa en la presente memoria, la "obesidad" es una afección en la cual el exceso de grasa corporal se ha acumulado de un modo tal que la salud se puede ver afectada de forma negativa. Normalmente se define como un índice de masa corporal (BMI) de 30 kg/m2 o superior que se distingue de tener un sobrepeso tal como se define mediante un BMI de 25 kg/m2 un superior (véase, p. ej., Organización Mundial de la Salud (2000) (PDF). Serie 894 de informes técnicos: Obesidad: prevención y gestión de la epidemia global. Ginebra: Organización Mundial de la Salud). El peso corporal excesivo está asociado con diversas enfermedades, en particular enfermedades cardiovasculares, diabetes mellitus de tipo II, apnea del sueño obstructiva, determinados tipos de cáncer, y osteoartritis.
Un sujeto con obesidad se puede identificar, por ejemplo, determinando el BMI (el BMI se calcula dividiendo la masa del sujeto entre el cuadrado de su altura), circunferencia de la cintura y proporción de cintura-cadera (la circunferencia absoluta de la cintura (> 102 cm en hombres y > 88 cm en mujeres) y la proporción de cintura-cadera (la circunferencia de la cintura dividida entre la de las caderas de > 0,9 para hombres y > 0,85 para mujeres) (véase, p. ej., Yusuf S, et al., (2004). Lancet 364: 937-52), y/o porcentaje de grasa corporal (grasa corporal total expresada como porcentaje del peso corporal total: hombres con más de un 25 % de grasa corporal y mujeres con más de un 33 % de grasa corporal son obesos; el porcentaje de grasa corporal se puede calcular a partir del BMI de una persona mediante la siguiente fórmula: % de grasa corporal = (1,2 * BMI) (0,23 * edad) - 5,4 - (10,8 * género), donde el género es 0 si es hembra y 1 si es macho). Las técnicas de medición del porcentaje de grasa corporal incluyendo, por ejemplo, tomografía computarizada (rastreo de CT), formación de imágenes por resonancia magnética (MRI), y absorciometría de rayos X de energía doble (DEXA).
La expresión "diabetes de tipo II" se refiere a una enfermedad que dura toda la vida, crónica que resulta cuando la insulina del cuerpo no funciona de manera eficaz. Un componente principal de la diabetes de tipo II es la "resistencia a la insulina", en donde la insulina producida por el páncreas no se puede conectar con la grasa y las células musculares a permitir que la glucosa en su interior produzca energía, causando hiperglucemia (alto contenido de glucosa en sangre). Para compensar con el páncreas produce más insulina, y las células, que detectan este flujo de insulina, quieran a ser incluso más resistentes, dando como resultado un ciclo vicioso de niveles de glucosa elevados y a menudo niveles de insulina elevados.
La expresión "trastornos asociados a la diabetes" o "trastornos asociados a la diabetes" o "trastornos relacionados con la diabetes", como se usa en la presente memoria, se refiere a afecciones y otras enfermedades que comúnmente se asocian o están relacionadas con la diabetes. Los ejemplos de trastornos asociados a la diabetes incluyen, por ejemplo, hiperglucemia, hiperinsulinemia, hiperlipidemia, resistencia a la insulina, alteración del metabolismo de la glucosa, obesidad, retinopatía diabética, degeneración macular, cataratas, nefropatía diabética, glomerulosclerosis, neuropatía diabética, disfunción eréctil, síndrome premenstrual, reestenosis vascular, colitis ulcerosa, cardiopatía coronaria, hipertensión, angina de pecho, infarto de miocardio, apoplejía, trastornos de la piel y del tejido conectivo, ulceraciones del pie, acidosis metabólica, artritis y osteoporosis.
La eficacia de las Adnectinas anti-miostatina en el tratamiento de trastornos metabólicos se puede determinar, por ejemplo, mediante uno o más métodos de medición de un aumento de la sensibilidad a insulina, un aumento de la absorción de glucosa por las células del sujeto, una disminución de los niveles de glucosa en sangre, y una disminución de la grasa corporal.
Por ejemplo, en sujetos que tienen diabetes de tipo II o que están en riesgo de desarrollar diabetes, los niveles de HbA1c se pueden monitorizar. El término "hemoglobina 1AC" o "HbA1c" como se usa en la presente memoria se refiere al producto de una glucosilación no enzimática de la cadena B de hemoglobina. El intervalo diana deseado de niveles de HbA1c para personas con diabetes se puede determinar a partir de las directrices de la Asociación Americana de Diabetes (ADA), es decir, los Estándares de Atención Médica en Diabetes (Diabetes Care 2012; 35 (Supl 1): S511-563). En la actualidad los niveles diana actuales de HbA1c son generalmente < 7,0 % para las personas con diabetes, y las personas que no tienen diabetes generalmente tienen valores de HbA1c inferiores a un 6 %. Por consiguiente, la eficacia de las Adnectinas anti-miostatina de la presente invención se puede determinar mediante una disminución observada en el nivel de HBA1c en un sujeto.
Los métodos de la invención incluyen además la administración de una Adnectina anti-miostatina sola, o en combinación con otros agentes que son conocidos en la técnica para el control glucémico (p. ej., insulina, GLP1) o para tratar las complicaciones relacionadas con la diabetes reconocidas en la técnica.
Otros trastornos
Los ratones con supresión genética para miostatina presentan un aumento de la masa muscular, así como un aumento del contenido de minerales y densidad del húmero del ratón, y un aumento del contenido de minerales tanto del hueso trabecular como del cortical en las regiones donde se unen los músculos (Hamrick et al., Calcif Tissue Intl2002; 71: 63-8). Esto sugiere que el aumento de la masa muscular puede ayudar a mejorar la resistencia ósea y reducir la osteoporosis y otras enfermedades óseas degenerativas.
Las enfermedades o trastornos adicionales para los cuales son útiles las Adnectinas anti-miostatina de la presente invención incluyen curación de heridas, enfermedad antifibrótica, Síndrome de Lambert-Eaton y Enfermedad de Parkinson.
Terapias de combinación
Las Adnectinas anti-miostatina que se proporcionan en la presente memoria se pueden usar en combinación con agentes antidiabéticos, agentes anti-hiperglucémicos, agentes anti-hiperinsulinémicos, agentes anti-retinopáticos, agentes anti-neuropáticos, agentes anti-neurodegenerativos, agentes anti-nefropáticos, agentes antiateroscleróticos, agentes anti-isquémicos, agentes anti-hipertensivos, agentes anti-obesidad, agentes antidislipidémicos, agentes anti-dislipidémicos, agentes anti-hiperlipidémicos, agentes anti-hipertrigliceridémicos, agentes anti-hipercolesterolémicos, agentes anti-reestenóticos, agentes anti-pancreáticos, agentes hipolipemiantes, agentes anoréxicos, agentes potenciadores de la memoria, agentes antidemencia o agentes estimulantes de la cognición, supresores del apetito, tratamientos restauradores neurológicos o musculares, tratamientos para la insuficiencia cardiaca, tratamientos para la enfermedad arterial periférica y agentes anti-inflamatorios.
Los agentes antidiabéticos usados en combinación con las Adnectinas anti-miostatina incluyen, pero no se limitan a, secretagogos de insulina o sensibilizadores de insulina, moduladores del receptor GPR40 u otros agentes antidiabéticos. Estos agentes incluyen, pero no se limitan a, inhibidores de la dipeptidil peptidasa IV (DP4) (por ejemplo, sitagliptina, saxagliptina, alogliptina, vildagliptina y similares), biguanidas (por ejemplo, metformina, fenformina y similares), sulfonil ureas (por ejemplo, gliburida, glimepirida, glipicida y similares), inhibidores de glucosidasa (por ejemplo, acarbosa, miglitol y similares), agonistas de PPARy tales como tiazolidindionas (por ejemplo, rosiglitazona, pioglitazona y similares), agonistas dobles de PPAR a/Y (por ejemplo, muraglitazar, tesaglitazar, aleglitazar y similares), activadores de glucoquinasa (como se describe en Fyfe et al., Drugs of the Future, 34 (8): 641-653 (2009)), moduladores del receptor GPR119 (MBX-2952, PSN821, APD597 y similares), inhibidores de SGLT2 (dapagliflozina, canagliflozina, remagliflozina y similares), análogos de amilina tales como pramlintida y/o insulina. Las revisiones de las terapias actuales y emergentes para el tratamiento de la diabetes se pueden encontrar en: Mohler et al., Medicinal Research Reviews, 29 (1): 125-195 (2009), y en Mizuno et al., Current Medicinal Chemistry, 15: 61-74 (2008).
Las Adnectinas anti-miostatina de la presente invención también se pueden usar opcionalmente en combinación con uno o más agentes hipofágicos como dietilpropión, fendimetrazina, fentermina, orlistat, sibutramina, lorcaserina, pramlintida, topiramato, antagonistas del receptor MCHR1, oxinadomodulina, moduladores del receptor NPY Y5, moduladores del receptor NPY Y2, moduladores del receptor NPY Y4, cetilistat, moduladores del receptor 5HT2c, y similares. Las Adnectinas anti-miostatina de la presente invención también se pueden usar en combinación con un agonista del receptor peptídico 1 similar al glucagón (GLP-1 R), tales como exenatida, liraglutida, GPR-1 (1-36) amida, GLP-1 (7-36) amida, GLP-1 (7-37) (como se describe en el documento de Patente de Estados Unidos N.° 5.614.492 de Habener), que se pueden administrar mediante inyección, por vía intranasal o mediante dispositivos transdérmicos o bucales. Las revisiones de las terapias actuales y emergentes para el tratamiento de la obesidad se pueden encontrar en: Melnikova et al., Nature Reviews Drug Discovery, 5: 369-370 (2006); Jones, Nature Reviews: Drug Discovery, 8: 833-834 (2009); Obici, Endocrinology, 150 (6): 2512-2517 (2009); y en Elangbam, Vet. Pathol., 46 (1): 10-24 (2009).
Las Adnectinas anti-miostatina de la presente invención también se pueden administrar con uno o más agentes terapéuticos adicionales, si fuera apropiado, para la enfermedad o trastorno en particular que se está tratando. Los ejemplos no limitantes de agentes adicionales incluyen aquellos que son útiles para tratar trastornos metabólicos tales como diabetes de tipo II y sarcopenia e incluyen, pero no se limitan a, GLP-1, similar a GLP-1, amilina, y FGF21; aquellos que son útiles para tratar enfermedad antifibrótica, enfermedad neuromuscular, enfermedad de las neuronas motoras y sarcopenia e incluyen, pero no se limitan a, grelina, SARM, Riluzol, testosterona, andrógenos, hormona del crecimiento, terapia de reemplazo hormonal, inhibidores de la COX-2, activadores de troponina, agonistas p2, CTLA4-Ig (p. ej., abetacept, belatacept) y anticuerpos anti-TGFp; aquellos que son útiles para tratar la caquexia y otros síndromes de debilitamiento e incluyen, pero no se limitan a, inhibidores de la quinasa del receptor de TGFp, inhibidores anti-IL-6 e inhibidores de la ubiquitina-proteasoma; aquellos que son útiles para tratar los calambres musculares asociados con miotonía y PLS e incluyen, pero no se limitan a, fitoína, quinina, Baclofeno y tizanidina; aquellos que son útiles para las neuropatías e incluyen antidepresivos (p. ej., inhibidores tricíclicos e inhibidores selectivos de la reabsorción de serotonina-norepinefrina (SNRI)), anticonvulsivos, cannabinoides, toxina botulínica de Tipo A, antagonistas de NMDA (p. ej., ketamina), suplementos dietéticos (p. ej., ácido alfa lipoico y benfotiamina); aquellos que son útiles para el tratamiento de neuropatías inflamatorias crónicas incluyen, pero no se limitan a, corticosteroides, inmunoglobulina intravenosa y fármacos inmunosupresores (p. ej., ciclofosfamida, ciclosporina, azatiprina, micofenolato mofetilo, globulina anti-timocítica, rituximab); y aquellos que son útiles para tratar el síndrome de Guillain Barre, sarcopenia, fractura y pérdida ósea e incluyen, entre otros, Boniva (ibandronato) y PTH.
Las Adnectinas anti-miostatina de la presente invención se pueden administrar con uno o más agentes adicionales usados en terapia sintomática. Los ejemplos no limitantes de agentes de ese tipo para tratar los síntomas de la ELA incluyen activadores de poros de transición de permeabilidad mitocondrial (MPT), activadores rápidos de troponina esquelética, reguladores de macrófagos (p. ej., NP001), agentes de tratamiento de la enfermedad de almacenamiento lisosomal (p. ej., NP003), y antagonistas del receptor nicotínico de acetilcolina (nAchR). Un ejemplo no limitante de un agente adicional para su uso en el tratamiento de los síntomas de DMD/BMD es un agente que aumenta los niveles de ATP.
Las Adnectinas anti-miostatina de la presente invención también se pueden administrar con uno o más agentes adicionales usados en terapia de modificación de la enfermedad. Los ejemplos no limitantes de los agentes de este tipo para tratar la ELA incluyen neutralizadores de radicales libres (p. ej., edaravona (norfenazona), CV-3611), agonistas de VEGF (p. ej., sNN0029), proteína Nogo-A I (p. ej., GSK122324), inhibidores de SOD1 (p. ej., ISIS-SOD1Rx), e inhibidores de la PGE sintasa 1 (p. ej., AAD-2004). Los ejemplos no limitantes de los agentes de ese tipo para tratar DMD/BMD incluyen aquellos que estimulan la omisión de exones (p. ej., moléculas antisentido tales como drisapersén (PRO051/GSK2402968), PRO044, Eteplirsén, AVI-4658, AVI-5038, Ataluren (PTC124)), agentes de terapia génica, agentes antiinflamatorios (p. ej., CRD007), y agentes anti-fibróticos (p. ej., HT-100).
Como se ha discutido anteriormente, los agentes que estimulan la omisión de exones se pueden usar en combinación con las Adnectinas anti-miostatina de la presente invención para tratar la distrofia muscular de Duchenne y la distrofia muscular de tipo Becker. Los ejemplos de exones específicos que pueden se pueden dirigir para restablecer la distrofina funcional incluyen los exones 7, 8, 17, 43, 44, 45, 46, 50, 51,52, 53, y 55 (véase, p. ej., Lu et al., Molecular Therapy 2011; 19: 9-15). En algunas realizaciones, para inducir la omisión de múltiples exones se puede usar más de un agente, p. ej., oligonucleótidos antisentido.
IX. Composiciones Farmacéuticas
La presente invención proporciona adicionalmente composiciones farmacéuticas que comprenden una Adnectina anti-miostatina o proteínas de fusión de las mismas que se describen en la presente memoria, en donde la composición está básicamente libre de endotoxinas, o al menos no contiene niveles más que aceptables de endotoxinas según lo determine la agencia reguladora apropiada (p. ej., FDA).
Las composiciones de la presente invención pueden estar en forma de píldora, comprimido, cápsula, líquido o comprimido de liberación sostenida para administración oral; un líquido para administración intravenosa, subcutánea o parenteral; o un gel, loción, pomada, crema, o un polímero u otro vehículo de liberación sostenida para administración local.
Los métodos bien conocidos en la técnica para preparar composiciones se encuentran, por ejemplo, en "Remington: The Science and Practice of Pharmacy" (20a ed., ed. A. R. Gennaro AR., 2000, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, Pa.). Las composiciones para administración parenteral pueden contener, por ejemplo, excipientes, agua estéril, solución salina, polialquilenglicoles tales como polietilenglicol, aceites de origen vegetal o naftalenos hidrogenados. Se pueden usar polímeros de lactida biocompatibles y biodegradables, copolímeros de lactida/glicólido o copolímeros de polioxietileno-polioxipropileno para controlar la liberación de los compuestos. Las composiciones de nanopartículas (p. ej., nanopartículas biodegradables, nanopartículas de lípidos sólidos, liposomas) se pueden usar para controlar la biodistribución de los compuestos. Otros sistemas de administración parenteral potencialmente útiles incluyen partículas de copolímero de etileno-acetato de vinilo, bombas osmóticas, sistemas de infusión implantables y liposomas. La concentración del compuesto en la composición varía dependiendo de una serie de factores, incluyendo la dosificación del fármaco que se va a administrar y la vía de administración.
Los vehículos, excipientes o estabilizantes aceptables no son tóxicos para los receptores en las dosificaciones y concentraciones usadas, e incluyen tampones tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes incluyendo ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencil amonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquil parabenos tales como metil o propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 restos); proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos que incluyen glucosa, manosa o dextranos; agentes quelantes tales como EDTA; azúcares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sales, tales como sodio; complejos metálicos (p. ej., complejos de Zn-proteína); y/o tensioactivos no iónicos tales como Tween, PLURONIC™ o polietilenglicol (PEG).
Los polipéptidos de la presente invención se pueden administrar opcionalmente como una sal farmacéuticamente aceptable, tales como sales de adición de ácidos no tóxicos o complejos metálicos que se usan comúnmente en la industria farmacéutica. Los ejemplos de sales de adición de ácido incluyen ácidos orgánicos tales como ácido acético, láctico, pamoico, maleico, cítrico, málico, ascórbico, succínico, benzoico, palmítico, subérico, salicílico, tartárico, metanosulfónico, toluenosulfónico o difluoroacético o similares; ácidos poliméricos tales como ácido tánico, carboximetilcelulosa o similares; y ácido inorgánico tales como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, o similares. Los complejos metálicos incluyen cinc, hierro y similares. En un ejemplo, el polipéptido se formula en presencia de acetato de sodio para aumentar la estabilidad térmica.
Los principios activos también pueden estar atrapados en una microcápsula preparada, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsula de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcápsula de poli(metacrilato de metilo), respectivamente, en sistemas de administración de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Las técnicas de ese tipo se describen en la 16a edición de Remington's Pharmaceutical Sciences, Osol, A. Ed. (1980).
Se pueden preparar preparaciones de liberación sostenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen las proteínas de la invención, cuyas matrices están en forma de artículos conformados, p. ej., películas, o microcápsulas. Los ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(metacrilato de 2-hidroxietilo) o poli(alcohol vinílico)), polilactidas (documento de Patente de Estados Unidos N.° 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutámico y L-glutamato de etilo, acetato de etileno-vinil o no degradable, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradables tales como LUPRON DEPOT™ (microesferas inyectables formadas por copolímero de ácido lácticoácido glicólico y acetato de leuprolida) y ácido poli-D-(-)-3-hidroxibuitírico. Aunque los polímeros tales como el acetato de etileno-vinilo y el ácido láctico-ácido glicólico permiten la liberación de moléculas durante más de 100 días, determinados hidrogeles liberan proteínas durante periodos de tiempo más cortos. Cuando las proteínas de la invención encapsuladas pueden permanecer en el cuerpo durante mucho tiempo, se pueden desnaturalizar o agregar como resultado de la exposición a la humedad a 37 °C, dando como resultado una pérdida de actividad biológica y posibles cambios en la inmunogenicidad. Se pueden idear estrategias racionales para la estabilización dependiendo del mecanismo implicado. Por ejemplo, si se descubre que el mecanismo de agregación es una formación de enlace S-S intermolecular a través del intercambio tio-disulfuro, la estabilización se puede conseguir modificando los restos de sulfhidrilo, liofilizando a partir de soluciones ácidas, controlando el contenido de humedad, usando aditivos apropiados y desarrollando una matriz de polímero específica.
Las composiciones de la presente invención para uso oral incluyen comprimidos que contienen el principio o principios activo(s) en una mezcla con excipientes farmacéuticamente aceptables no tóxicos. Estos excipientes pueden ser, por ejemplo, diluyentes o cargas inertes (p. ej., sacarosa y sorbitol), agentes lubricantes, sustancias de deslizamiento y anti-adhesivos (p. ej., estearato de magnesio, estearato de cinc, ácido esteárico, sílices, aceites vegetales hidrogenados, o talco). Las composiciones para uso oral también se pueden proporcionar como comprimidos masticables, o como cápsulas de gelatina dura en donde el principio activo se mezcla con un diluyente sólido inerte, o en forma de cápsulas de gelatina blanda en donde el principio activo se mezcla con agua o un medio oleoso.
La composición farmacéutica que se va a usar para administración in vivo generalmente debe ser estéril. Esto se puede conseguir mediante filtración a través de membranas de filtración estériles. Cuando la composición está liofilizada, la esterilización que usa este método se puede realizar antes o después de la liofilización y la reconstitución. La composición para administración parenteral se puede almacenar en forma liofilizada o en solución.
Además, las composiciones parenterales generalmente se colocan en un recipiente que tiene un puerto de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa de solución intravenosa o un vial que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica.
Una vez que se ha formulado la composición farmacéutica, se puede almacenar en viales estériles como una solución, suspensión, gel, emulsión, sólido o un polvo deshidratado o liofilizado. Las formulaciones de ese tipo se pueden almacenar en una forma lista para usar o en una forma (p. ej., liofilizada) que requiere reconstitución antes de su administración.
Las composiciones en la presente memoria también pueden contener más de un compuesto activo, si fuera necesario, para la indicación particular que se está tratando, preferiblemente aquellas con actividades complementarias que no se afecten entre sí de forma adversa. Las moléculas de ese tipo están presentes de forma adecuada en combinación en cantidades que son eficaces para la finalidad prevista.
Ejemplos
La invención se describe a continuación con referencia a los siguientes ejemplos, que son solo ilustrativos, y no pretenden limitar la presente invención.
Ejemplo 1 - Producción de proteínas
Producción de Proteínas de Alto Rendimiento (HTPP)
Los aglutinantes seleccionados clonados en el vector PET9d cadena arriba de una etiqueta de HIS6 y transformados en células BL21 DE3 plysS de E.coli se inocularon en 5 ml de medio LB que contenía 50 pg/ml de kanamicina en un formato de 24 pocillos y se cultivaron a 37 °C durante la noche. Se prepararon nuevos cultivos de 5 ml de medio LB (50 pg/ml de kanamicina) para la expresión inducible por aspiración de 200 pl del cultivo durante la noche y se dispensaron en el pocillo apropiado. Los cultivos se cultivaron a 37 °C hasta A600 0,6-0,9. Después de la inducción con isopropil-p-tiogalactósido 1 mM (IPTG), el cultivo se expresó durante 6 horas a 30 °C y se recogió por centrifugación durante 10 minutos a 2750 g a 4 °C.
Los sedimentos celulares (en formato de 24 pocillos) se lisaron mediante resuspensión en 450 pl de Tampón de Lisis (NaH2PÜ450 mM, NaCl 0,5 M, Cóctel Inhibidor de Proteasa Complete™ 1x sin EDTA (Roche), PMSF 1 mM, CHAPS 10 mM, imidazol 40 mM, 1 mg/ml de lisozima, 30 pg/ml de ADNasa, 2 pg/ml de aprotonina, pH 8,0) y se agitó a temperatura ambiente durante 1 -3 horas. Los lisados se eliminaron y se volvieron a colocar en un formato de 96 pocillos mediante transferencia a un GF/D Unifilter de Whatman de 96 pocillos equipado con una placa de captura de 1,2 ml, de 96 pocillos y se filtró por presión positiva. Los lisados eliminados se transfirieron a una Placa de Quelación de Níquel o Cobalto de 96 pocillos que se había equilibrado con un tampón de equilibrio (NaH2PÜ4 50 mM, NaCl 0,5 M, imidazol 40 mM, pH 8,0) y se incubaron durante 5 min. El material no unido se eliminó por presión positiva.
La resina se lavó dos veces con 0,3 ml/pocillo con Tampón de lavado n.° 1 (NaH2 PÜ450 mM, NaCl 0,5 M, CHAPS 5 mM, imidazol 40 mM, pH 8,0). Cada lavado se eliminó mediante presión positiva. Antes de la elución, cada pocillo se lavó con 50 pl de tampón de elución (PBS EDTA 20 mM), se incubó durante 5 min, y este lavado se descartó mediante presión positiva. La proteína se eluyó aplicando 100 pl adicionales de tampón de elución a cada pocillo. Después de una incubación de 30 minutos a temperatura ambiente, la placa o placas se centrifugaron durante 5 minutos a 200 g y la proteína eluida se recogió en placas de captura de 96 pocillos que contenían 5 pl de MgCl2 0,5 M añadido a la parte inferior de la placa de captura de elución antes de la elución. La proteína eluida se cuantificó usando un ensayo de proteína total con el dominio 10Fn3 de tipo silvestre como el patrón de proteína. Expresión y purificación de aglutinantes de proteína de armazón a base de fibronectina insoluble
Para la expresión, el clon o clones seleccionados, seguido por la etiqueta de HIS6, se clonaron en un vector pET9d y se expresaron en células BL21 DE3 plysS de E.coli. Se usaron veinte ml de un cultivo de inóculo (generado a partir de una sola colonia sembrada en placa) para inocular 1 litro de medio LB o TB-Medios de Expresión Durante la Noche (auto inducción) que contenía 50 pg/ml de Kanamicina y 34 pg/ml de cloranfenicol. Los cultivos en medio LB se incubaron a 37 °C hasta A6000,6-1,0, momento en el cual se indujeron con isopropil-p-tiogalactósido 1 mM (IPTG) y se cultivaron durante 4 horas a 30 °C. Los cultivos se cultivaron en TB-Medios de Expresión Durante la Noche a 37 °C durante 5 horas, momento en el cual la temperatura se redujo a 18 °C y se cultivaron durante 19 horas. Los cultivos se recogieron por centrifugación durante 30 minutos a > 10.000 g a 4 °C. Los sedimentos celulares se congelaron a -80 °C. después de la descongelación, sedimento celular se volvió a suspender en 25 ml de tampón de lisis (NaH2PÜ420 mM, NaCl 0,5 M, Cóctel Inhibidor de Proteasa Complete™ 1x sin EDTA (Roche), pH 7,4) usando un homogeneizador Ultra-turrax (IKA works) en hielo. La lisis celular se consiguió mediante homogenización a alta presión (> 0,12 MPa (> 18.000 psi)) usando el Modelo M-110S de Microfluidizador (Microfluidics). La fracción insoluble se separó por centrifugación durante 30 minutos a > 23.300 g a 4 °C. El sedimento insoluble recuperado de la centrifugación del lisado se lavó con fosfato sódico 20 mM/NaCl 500 mM, pH 7,4. El sedimento se volvió a solubilizar en hidrocloruro de guanidina 6 M en fosfato sódico 20 mM/NaCl 500 mM pH 7,4 con sonicación, seguido por incubación a 37 grados durante 1-2 horas. El sedimento resolubilizado se filtró con un filtro de 0,45 pm y se cargó sobre una columna Histrap equilibrada con el tampón de fosfato sódico 20 mM/NaCI 500 mM/guanidina 6 M a pH 7,4. Después de la carga, la columna se lavó con una cantidad adicional de 25 volúmenes de columna con el mismo tampón. La proteína unida se eluyó con imidazol 50 mM en fosfato sódico 20 mM/NaCl 500 mM/HCl de guanidina 6 M a, pH 7,4. La proteína purificada se volvió a plegar mediante diálisis contra acetato de sodio 50 mM/150 mM NaCl, pH 4,5 o PBS, pH 7,2.
Expresión y purificación de aglutinantes de proteína de armazón a base de fibronectina soluble
Como una alternativa a la purificación de los aglutinantes insolubles, también se puede usar la purificación de los aglutinantes solubles. Para expresión, el clon o clones seleccionados, seguido por la etiqueta de HIS6, se clonaron en un vector pET9d y se expresaron en células BL21 DE3 plysS de E.coli. Se usaron veinte ml de un cultivo de inóculo (generado a partir de una sola colonia sembrada en placa) para inocular 1 litro de medio LB o TB-Medios de Expresión Durante la Noche (auto inducción) que contenía 50 pg/ml de Kanamicina y 34 pg/ml de cloranfenicol. Los cultivos en medio LB se incubaron a 37 °C hasta A600 0,6-1,0, seguido por inducción con isopropil-p-tiogalactósido 1 mM (IPTG) y se cultivó durante 4 horas a 30 °C. Los cultivos se cultivaron en TB-Medios de Expresión Durante la Noche y se incubó a 37 °C durante 5 horas, tras lo cual la temperatura se redujo a 18 °C y se cultivaron durante 19 horas. Los cultivos se recogieron por centrifugación durante 30 minutos a > 10.000 g a 4 °C. Los sedimentos celulares se congelaron a -80 °C. El sedimento celular descongelado se volvió a suspender en 25 ml de tampón de lisis (NaH2 PÜ420 mM, NaCl 0,5 M, Cóctel Inhibidor de Proteasa Complete™ 1x sin EdTA (Roche), pH 7,4) usando un homogeneizador Ultra-turrax (IKA works) en hielo. La lisis celular se consiguió mediante homogenización a alta presión (> 0,12 MPa (> 18.000 psi) usando un Modelo M-110S de Microfluidizador (Microfluidics). La fracción soluble se separó por centrifugación durante 30 minutos a > 23.300 g a 4 °C. El sobrenadante se aclaró usando un filtro de 0,45 pm. La fracción de lisado aclarado se cargó en una columna Histrap (GE) equilibrada previamente con fosfato sódico 20 mM/NaCl 500 mM, pH 7,4. A continuación la columna se lavó con 25 volúmenes de columna del mismo tampón, seguido por 20 volúmenes de columna de fosfato sódico 20 mM/NaCl 500 mM/imidazol 25 mM, pH 7,4 y a continuación 35 volúmenes de columna de fosfato sódico 20 mM/NaCl 500 mM/imidazol 40 mM, pH 7,4. La proteína se eluyó con 15 volúmenes de columna de fosfato sódico 20 mM/NaCl 500 mM/imidazol 500 mM, pH 7,4, las fracciones se combinaron basándose en la absorbancia a A280, y se sometieron a diálisis contra 1x PBS o Tris 50 mM, NaCl 150 mM, pH 8,5 o NaOAc 50 mM, NaCl 150 mM, pH 4,5. Las fracciones precipitadas se eliminaron por filtración con un filtro de 0,22 pm.
PEGilación específica de Sitio de Adnectinas con polietilenglicol (PEG)
Las adnectinas que contenían un resto de cisteína modificado por ingeniería se conjugaron con PEG o reactivo de bloqueo de cisteína a través de la química de adición de Michael entre el grupo tiol en la cisteína y el grupo funcional maleimido del PEG o n-etilmaleimida (NEM). Para la PEGilación con PEG de 40 kDa de 2 ramificaciones (NOF Corporation, P/N GL2-400MA), se añadió PEG en exceso molar a la solución de proteína en condiciones ligeramente ácidas a neutras. Se dejó que la reacción avanzara a temperatura ambiente durante 2 horas hasta la noche. La reacción se aplicó a continuación a una columna de intercambio iónico para separar la Adnectina PEGilada de la PEG-maleimida sin reaccionar y la Adnectina no PEGilada. Para la PEGilación con PEG de 40 kDa de 4 ramificaciones (NOF, P/N GL4-400MA) o bis-PEG de 20 kDa (NOF corporation, P/N DE-200MA), la Adnectina se purificó a partir de SPFF en tampón citrato, pH 6,5. Después de la reducción con DTT, la muestra se desalificó en una columna G25 en el mismo tampón para eliminar DTT y se hizo reaccionar con bis-PEG de 20 kDa o PEG de 40 K de 4 ramificaciones a una proporción de 2:1 (PEG:adnectina) durante 2 horas a temperatura ambiente, y la reacción se detuvo con la adición de exceso de BME. La muestra se purificó mediante una columna Resource 15S (GE N.° 17-0944-10) para eliminar de forma selectiva las especies no PEGiladas (y las especies mono-PEGiladas en el caso de una reacción de bis-PEG de 20 kDa). Se usó una columna final preparatoria de SEC (GE N.° 17-1071-01, Superdex200, 26/60) (si fuera necesario) para eliminar las especies de alto peso molecular y la Adnectina no reactiva. Para preparar una Adnectina bloqueada por CYS, se añadió un exceso molar de 10 veces de NEM (Pierce Chemical) inmediatamente después de la etapa de desalación de G25 mencionada anteriormente en tampón de citrato (pH 6,5). Esto se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente y la reacción se detuvo mediante la adición de BME en exceso. La muestra a continuación se sometió a diálisis de forma extensa contra PBS. Las adnectinas conjugadas purificadas se analizaron mediante SDS-PAGE y cromatografía de exclusión por tamaño.
Purificación y PEGilación de aglutinantes de proteína de armazón a base de fibronectina sin etiquetar
Los aglutinantes seleccionados se clonaron en un vector pET9d sin etiqueta de HIS6 y se expresaron en células BL21 DE3 plysS de E.coli. 25 ml de un cultivo de inóculo previamente aislado de una sola colonia sembrada en placa se hicieron crecer en un matraz de 125 ml hasta que la DO 600 nm alcanzó 1-2, usando medios a pH 6,85 50 ug/ml de kanamicina (cloruro de amonio, ácido cítrico, citrato de amonio férrico, sulfato de magnesio, monohidrato monobásico de fosfato de sodio, dextrosa anhidra, glicerol, peptona de fitona, extracto de levadura granulada, sulfato de kanamicina, sulfato de amonio para ajustar el pH). Un fermentador de 10 l (7,5 l de volumen de inicio de medios discontinuos) se inoculó a una DO final a 600 nm de 0,003. El cultivo se hizo crecer durante la noche a 25 °C con una mezcla constante a 650 rpm y niveles de O2 disuelto de > 30 %, a la vez que se mantenía el pH. Al día siguiente, la temperatura se cambió a 37 °C y el cultivo se hizo crecer hasta que la DO a 600 nm alcanzó 20-25. Una vez que se consiguió la DO diana, la temperatura se cambió a 30 °C y el cultivo se indujo con IPTG (concentración final: 1 mM). Se añadió un medio de alimentación (glicerol, peptona de fitona, extracto de levadura granulada, sulfato de kanamicina y ácido fosfórico para ajustar el pH) a una tasa de 40 ml de medios/l de volumen de formación/h. Las células se recogieron mediante centrifugación a 10.000 g durante 30 min a 4 °C. Los sedimentos celulares se congelaron a -80 °C.
La pasta celular se descongeló en PBS 1x en una proporción de 10 ml de tampón/g de pasta celular. Una vez descongelada, la muestra se interrumpió con un homogeneizador UltraTurrax (IKA works) hasta homogeneidad. A continuación, la solución se pasó dos veces a través de un microfluidizador a 0,12 MPa (18.000 psi). La fracción soluble se separó por centrifugación durante 30 minutos a > 10.000 g a 4 °C. El sobrenadante se diluyó a 1:1 con acetato de sodio (pH 4,5) y se aclaró con un filtro de 0,2 gm. El lisado aclarado se cargó en una columna SP FF (SP1; GE) equilibrada previamente con acetato de sodio 50 mM (pH 4,5). A continuación la columna se lavó con 2 volúmenes de columna del mismo tampón, seguido por 8 volúmenes de columna de acetato de sodio 50 mM/NaCl 350 mM, pH 4,5. La proteína se eluyó con acetato de sodio 50 mM/NaCl 700 mM, pH 4,5. Las eluciones se combinaron basándose en la absorbancia a A280.
La elución de SP1 se diluyó a 1:5 con fosfato sódico 20 mM (pH 6,7) y se cargó en una columna SP FF (SP2) equilibrada previamente con fosfato sódico 20 mM/NaCl 100 mM, pH 6,7. A continuación la columna se lavó con 2 volúmenes de columna del mismo tampón. La proteína se eluyó de la columna con fosfato sódico 20 mM/NaCl 0,5 M, pH 6,7. Las eluciones se combinaron basándose en la absorbancia a A280.
La elución de SP2 se diluyó a NaCl 100 mM con fosfato sódico 20 mM (pH 6,7) y se cargó en una columna Q FF (GE) equilibrada previamente con fosfato sódico 20 mM/NaCl 100 mM, pH 6,7. El pico de FT (que contiene el producto) fue recogido. La columna se lavó con tampón de equilibrio hasta que el pico de FT volvió a la medida inicial.
Las adnectinas que contienen un resto de cisteína manipulada se conjugaron con PEG a través de la química de adición de Michael entre el grupo tiol en la cisteína y el grupo funcional maleimida del reactivo PEG. La fracción Q FT se PEGiló con PEG ramificado de 40 kDa en una relación molar de PEG con respecto a proteína de 2:1. La muestra se incubó durante la noche a temperatura ambiente. La reacción de PEGilación se diluyó con 2 partes de acetato de sodio 50 mM (pH 4,5) y se cargó en una columna SP FF column (GE) equilibrada previamente con acetato de sodio 50 mM (pH 4,5). La columna se lavó con 2 volúmenes de columna del mismo tampón. La proteína PEGilada se eluyó de la columna con acetato de sodio 50 mM/NaCl 200 mM, pH 4,5). Las eluciones se agruparon basándose en la absorbancia a A280. La proteína PEGilada se concentró usando una membrana Millipore Biomax de 30 kDa. La muestra se filtró sobre un filtro de 0,22 gm y se almacenó a, por ejemplo, 4 °C, -20 °C, o - 8 0 °C.
Expresión transitoria y purificación de aglutinantes de proteína de armazón a base de fibronectina con Fc formateado
Para la generación de ADN, los candidatos seleccionados se clonaron en un plásmido pDV-16 a partir del cual se transformaron las células Top 10 de E. coli. PDV-16 es una versión modificada de pTT5 (Yves Durocher, NRC Canadá), en donde se introdujo la secuencia de codificación de IgG1-Fc humana, precedida por la secuencia señal, y se incluyeron sitios de restricción para permitir la inserción de secuencias de codificación de Adnectina en cualquier extremo del Fc. Las células transformadas se expandieron inoculando 1 l de caldo de cultivo Luria que contenía 1 0 0 gg/ml de Ampicilina e incubando en una incubadora giratoria a 225 rpm durante 18 horas a 37 °C. Los sedimentos bacterianos se recogieron mediante centrifugación a > 10000 g durante 30 minutos a 4 °C. El ADN plasmídico purificado se aisló usando un Kit Plasmid Plus Mega de QIAGEN (QIAGEN) como se describe en el protocolo del fabricante. El ADN purificado se cuantificó utilizando la absorbancia a 260 nm y se congeló a -80 °C antes de su uso.
Las células HEK 293-EBNA1 (clon 6 E) (Yves Durocher, NRC Canadá) se expandieron a 2x106 células/ml en 2 l de medio F17 en una bolsa GE Healthcare Wave DE 10 l a 37 °C, CO2 al 5 %, y se mezclaron mediante balanceó con un ángulo de 8 grados a 18 rpm.
El ADN se preparó para la transfección como sigue a continuación: el medio F17 se calentó a 37 °C. El ADN y un reactivo de transfección PEI se descongelaron en una campana de bioseguridad estéril. Se añadió ADN (2,25 mg) a 100 ml de medio F17 calentado en un matraz de cultivo de polipropileno estéril y se mezcló suavemente mediante agitación. En un matraz separado, se combinaron 6,75 mg de PEI (1 mg/ml) con 100 ml de medio F17 calentado previamente y se mezclaron suavemente mediante agitación. Los matraces se dejaron reposar durante 5 minutos antes de combinar los contenidos añadiendo la solución de PEI al matraz que contenía el ADN y mezclando suavemente mediante agitación.
Los contenidos del matraz que contiene la mezcla de ADN:PEI se añadieron a la bolsa ondulada que contiene las células HEK 293-6E después de incubar una temperatura ambiente durante 15 minutos en la campana de bioseguridad. La bolsa que contiene las células HEK 293-6E transfectadas se incubó durante veinticuatro horas a 37 °C, CO2 al 5 %, y se mezclaron mediante balanceó con un ángulo de 8 grados a 18 RPM. Después de 24 horas, se añadieron asépticamente al cultivo 100 ml de Triptona N1 al 20 % filtrada de manera estéril (Organotechnie, Canadá) disuelta en medio F17. Las células y los medios se recolectaron después de 72 horas adicionales de incubación como se ha descrito anteriormente. como alternativa, la expresión transitoria de HEK en matraces de agitación (0,5 l de medios en un matraz de 2 l) se puede realizar con una relación ADN:PEI de 1:2. Las células se separaron del medio acondicionado mediante centrifugación a 6000 g durante 30 minutos a 4 °C. Los medios acondicionados se retuvieron, se filtraron a través de un filtro de 0,2 pM y se almacenaron a 4 °C.
El medio acondicionado se aplicó a una columna de cromatografía de 10 ml que contenía resina MabSelect Sure de GE equilibrada previamente en PBS a una tasa de 5 ml/minuto. Después de la carga del medio acondicionado filtrado, la columna se lavó con al menos 100 ml de PBS a temperatura ambiente. El producto purificado se eluyó de la columna con la aplicación de glicina 100 mM/NaCl 100 mM, pH 3,0. Las fracciones se neutralizaron en pH, ya sea mediante su recogida en tubos que contenían 1/6 de volumen de Tris 1 M a pH 8, o mediante combinación según la absorbancia a A280 seguido por la adición de Tris 1 M a pH 8 a 100 mM. Si el contenido de especies de alto peso molecular es superior a un 5 % después de la elución de la Proteína A, entonces la muestra se purifica adicionalmente en una columna Superdex 200 (26/60) (GE Healthcare) en PBS. Las fracciones de SEC que contienen monómeros se combinan y se concentran. La combinación resultante de proteína A o SEC se dializó de forma exhaustiva contra PBS a 4 °C, y se filtró de forma estéril usando un filtro de corte de 0,22 pm antes de su congelación a -80 °C.
Fabricación a granel: Expresión en Mamíferos y Recuperación Primaria: Sistema UCOE CHO
Se creó un Banco de Células de Investigación (RCB) de mamíferos mediante la transfección de fusiones de Adnectina anti-miostatina-Fc clonadas en el vector pUCOE que contiene el Elemento de Apertura de Cromatina Ubicua (UCOE) [vector UCOE modificado de Millipore] en células CHO-S. Se estableció un RCB expandiendo las células en medios de selección (L-Glutamina al 0,04 % (v/v) (Invitrogen) y Suplemento de HT al 0,01 % (v/v) (Invitrogen) en medio CD CHO (Invitrogen)) que contenía 12,5 pg/ml de puromicina. Las células de bajo número de pases se aislaron de forma aséptica mediante centrifugación, se volvieron a suspender en medios de almacenamiento (L-Glutamina al 0,04 % (v/v) (Invitrogen), Suplemento de HT al 0,01 % (v/v) (Invitrogen) y DMSO al 7,5 % (v/v) en medio CD CHO (Invitrogen)) a una concentración final de 1 x 107 células/ml. Estas células se congelaron inicialmente en un baño de alcohol isopropílico al 70 % a -80 °C durante la noche y a continuación se transfirieron a nitrógeno líquido para su almacenamiento a largo plazo al día siguiente.
El cultivo celular se inició descongelando un solo vial de RCB en 25 ml de medio de selección que contenía 12,5 pg/ml de puromicina y expandiendo el cultivo en el mismo medio. Se permitió que las células alcanzaran una concentración entre 1-2 x 106 células/ml antes de dividirse nuevamente a 0,2 x 106 células/ml. Las células generalmente se mantuvieron entre 2 y 4 semanas antes de su siembra en un biorreactor. El cultivo de expansión se pasó por última vez y se dejó crecer hasta el punto en que un biorreactor de 15 l contenía 8 l de medio de producción (medio CD CHO de Invitrogen que contenía Suplemento de HT al 0,01 % (v/v) (Invitrogen), Glutamax al 0,04 % (v/v) (Gibco), y Pluronic F-68 al 0,005 % (v/v) (Gibco)) se podría haber sembrado hasta una densidad final de 0,2 x 106 células/ml. El cultivo del biorreactor se controló diariamente para VCD (densidad celular viable), porcentaje de viabilidad, pH y concentración de glucosa. El cultivo del biorreactor se alimentó los días 3 y 6 con una adición de un bolo de volumen total de un 10 % de medio de alimentación. El cultivo se recolectó entre el día 7 y el día 9 con un porcentaje de viabilidad > 70 %. Durante el cultivo, el cultivo del biorreactor se controló a un pH de 7,1, temperatura de 37 °C, % de D02 de un 40 %, y unas RPM constantes de 100.
El día de la cosecha, los cultivos del biorreactor se pasaron directamente a través de un filtro de profundidad de 6,0/3,0 pm seguido por una filtración de 0,8/0,2 pm estéril en una bolsa estéril. El cultivo estéril aclarado se almacenó durante la noche a 2-8 °C. A continuación el cultivo aclarado se concentró a través de la lámina plana de TFF usando una membrana de 30.000 kDa. La concentración aproximada fue 6x, dependiendo de la titulación de la cosecha. El sobrenadante concentrado se filtró a continuación de forma estéril en frascos de PETG y se procesó directamente o se almacenó a -80 °C.
Purificación de Fusión de Adnectina-Anti-miostatina-Fc
El sobrenadante de cultivo recolectado (puro o concentrado) se carga en una columna MabSelect de Proteína A previamente equilibrada con PBS. La columna se lava con 5 VC de Tris 50 mM a pH 8,0, Urea 1 M, PG al 10 %. La fusión de Adnectina-Fc se eluye con glicina 100 mM a pH 3,3, recogiendo el pico en un recipiente que se carga previamente con 1 CV de acetato de sodio 200 mM a pH 4,5. La elución máxima se basa en la absorbancia a A280. La elución de la proteína A se diluye a pH 3,0 con la adición de ácido cítrico 2 M y se deja a temperatura ambiente durante 1 hora, para la inactivación viral. A continuación la muestra luego se diluye con fosfato sódico tribásico 200 mM hasta que se alcanza un pH 4,5. Si es necesario, la solución se diluye más con agua para disminuir la conductividad por debajo de 10 ms/cm.
La elución de la proteína A diluida se pasa a través de un Tosoh Q 600C AR (Tosoh Bioscience), previamente acondicionado con acetato de sodio 50 mM a pH 4,5, en un modo de captura negativo. El pico de flujo continuo se recoge, basándose en la absorbancia a A280. La columna se lava con acetato de sodio 50 mM y se separa con NaOH 0,2 N.
El flujo continuo Q 600C AR se formula mediante filtración por flujo tangencial usando una membrana de fibra hueca (GE) 30K NMWCO, con una mezcla muy suave de la fracción retenida. La fusión de adnectina-Fc se sometió a d ia filtra c ió n en fo s fa to de sod io 25 m M , tre h a lo s a 150 m M a pH 7,0 p a ra 6 d ia v o lú m e n e s y a c o n tin u a c ió n se co n c e n tró ha s ta u n a c o n c e n tra c ió n de p ro te ín a d iana .
Ejemplo 2 - Evaluación Biofísica de Proteínas Anti-miostatina
Cromatografía de exclusión por tamaño. La c ro m a to g ra fía de e xc lu s ió n p o r ta m a ñ o (S E C ) co n v e n c io n a l se rea lizó so b re A d n e c tin a s c a n d id a ta s q u e re su lta ro n de l p ro c e s o de p ro c e s o de m e d ia n a e sca la . La S E C de l m a te ria l a m e d ia n a e s c a la se llevó a ca b o u sa n d o un a c o lu m n a S u p e rd e x 200 10 /30 o u n a c o lu m n a S u p e rd e x 75 10 /30 (G E H e a lth ca re ) en un s is te m a de H P L C A g ile n t 1100 o 1200 con d e te cc ió n de U V a A 214 nm y A 280 nm y con d e te cc ió n de flu o re s c e n c ia (exc ita c ió n 280 nm, em is ió n 350 nm ). Se usó un ta m p ó n de su lfa to de sod io 100 m M /fo s fa to de so d io 100 m M /c lo ru ro de so d io 150 m M , pH 6 ,8 al c a u d a l a p ro p ia d o p a ra la c o lu m n a de S E C e m p le a d a . S e u sa ron p a tro n e s de filtra c ió n en ge l (B io -R ad L a b o ra to rie s , H e rcu le s , C A ) p a ra la c a lib ra c ió n de l peso m o le cu la r. Los re su lta d o s de la S E C en A d n e c tin a s p u rific a d a s a m e d ia n a e s c a la m o stra ro n p re d o m in a n te m e n te a d n e c tin a m o n o m é rica y e luc ió n en el rango a p ro x im a d o de 10 kD a con re sp e c to a p a tro n e s de F iltrac ión en G el g lo b u la re s (B io R a d ) co m o se m u e s tra en las T a b la s 9 y 10.
Termoestabilidad: S e rea lizó un an á lis is de F lu o re s c e n c ia de R a s tre o T é rm ico (T S F) de A d n e c tin a s H T P P pa ra id e n tifica rla s de fo rm a s is te m á tic a m ed ia n te e s ta b ilid a d té rm ic a re la tiva . Las m u e s tra s se n o rm a liza ro n a 0 ,2 m g/m l en PBS. S e añ ad ió 1 pl de c o lo ra n te n a ra n ja S yp ro d ilu id o a 1 :40 con PBS a 25 pl de c a d a m u e s tra y la p la ca se c e rró h e rm é tic a m e n te con un c e rra d o h e rm é tico a d h e s iv o de m ic ro p la ca tra n s p a re n te de 96 po c illo s . El ra s tre o de las m u e s tra s se re a lizó u sa n d o u n a m á q u in a de R T -P C R de B io R ad a u m e n ta n d o la te m p e ra tu ra de 25 °C -95 °C, a u n a ta s a de 2 g ra d o s p o r m in u to . Los d a to s se a n a liza ro n u sa n d o el s o ftw a re C F X m a n a g e r 2.0 de B ioR ad . Se ha m o s tra d o q u e los va lo re s o b te n id o s p o r T S F se c o rre la c io n a n b ien con los va lo re s de Tm o b te n id o s p o r D SC en un in te rva lo de fu s ió n de 40 °C a 70 °C. Esto se c o n s id e ra el in te rva lo de tra b a jo a ce p ta b le p a ra e s ta té cn ica . Se o b tie n e un re su lta d o de N D ("S in d a to s ") c u a n d o la p e n d ie n te de la c u rv a de tra n s ic ió n es d e m a s ia d o p e q u e ñ a pa ra p e rm itir q u e su p ico d e riv a d o (la ta s a de c a m b io en la flu o re s c e n c ia con el t ie m p o ) se d is tin g a de l ru ido. Un resu ltad o "N D " no se pu e d e in te rp re ta r co m o u n a in d ica c ión de te rm o e s ta b ilid a d . Se rea liza ro n an á lis is de C a lo r im e tr ía de B a rrid o D ife renc ia l (D S C ) de A d n e c tin a de H T P P ’d s o m e tid o a d iá lis is y m e d ia n a e s c a la p a ra d e te rm in a r sus re sp e c tiva s T m. S e h izo de l ra s tre o de un a so lu c ió n de 0 ,5 m g /m l en un c a lo r ím e tro de B arrido D ife renc ia l p o r C a p ila rid a d de V P (G E M ic ro ca l) a u m e n ta n d o la te m p e ra tu ra de 15 °C a 110 °C, a u n a ta s a de 1 g ra d o p o r m in u to a u n a p re s ión de 0 ,48 M P a (70 p .s .i). Los da to s se a n a liza ro n con resp ec to a un d e s a rro llo de c o n tro l de l ta m p ó n a p ro p ia d o u sa n d o el m e jo r a jus te u sa n d o el S o ftw a re O rig in (O rig in L a b C o rp ). Los re su lta d o s de los an á lis is T S F y D SC se resu m en en las T a b la s 8-10. C o m o se m u e s tra en las T a b la s 8-10, m u ch o s de los c lo n e s p re se n ta ro n te m p e ra tu ra s de d e s p le g a m ie n to de m ás de 60 °C, lo q u e in d ica u n a e s tru c tu ra b io fís ic a m e n te e s ta b le a lta m e n te a d e c u a d a p a ra la fo rm u la c ió n m ed ic in a l. Las a d n e c tin a s e ra n g e n e ra lm e n te to le ra n te s a la P E G ila c ión o al fo rm a te o de Fc sin p é rd id a a p a re n te de e s ta b ilid a d . En a lg u n o s caso s , e s to s fo rm a to s p e rm itie ro n m e jo ra r la e s ta b ilid a d . P or e je m p lo , 3116 _ A 07 co m o u n a A d n e c tin a no m o d ifica d a tie n e u n a Tm p o r T S F de 60 °C, p e ro c u a n d o se P E G ila ba (A T I-1377) la Tm p o r D S C e ra de 68 °C, y en un fo rm a to de F c-X (P R D -1286) la Tm p o r DSC e ra de 66 °C.
Ejemplo 3 - Ensayo de Luciferasa a base de Células
S e g e n e ró un p lá sm id o in d ic a d o r de lu c ife rasa , A c tiv in -R e s p o n s iv e E le m en t (A R E )-lu c , m ed ia n te lig a m ie n to de nu e ve re p e tic io n e s de l A R E en tá n d e m al in d ica d o r de lu c ife ra sa de lu c ié rn aga . El p lá sm id o se tra n s fe c tó de fo rm a tra n s ito r ia en cé lu la s H e pG 2. El p lá sm id o p G L 4.74 [h R lu c /T K ] se tra n s fe c tó de m a n e ra c o n ju n ta p a ra n o rm a liz a r la e fic a c ia de la tra n s fe c c ió n . Se s e m b ra ro n 10.000 cé lu la s p o r po c illo en u n a p la ca de 96 po c illo s . C u a n d o un a p ro te ín a ta l co m o m io s ta tina , ac tiv ina , o B M P -11 , se a ñ ad e a las cé lu la s y se un e a su re c e p to r ho m ó lo g o re la c io n a d o , la se ñ a liza c ió n c a d e n a ab a jo de S M A D se d e s e n c a d e n a , co n d u c ie n d o a la un ión de un c o m p le jo de S M A D fo s fo r ila d o al A R E . La c a n tid a d de, p. ej., m io s ta tina , e x p u e s ta a las cé lu la s es d ire c ta m e n te p ro p o rc io n a l a la c a n tid a d de p ro te ín a de lu c ife ra s a p ro d u c id a y, en co n s e c u e n c ia , se m id e la ac tiv id a d de lu c ife rasa . C u a n d o un a n ta g o n is ta de m io s ta tin a (p. e j., u n a A d n e c tin a a n ti-m io s ta tin a ) se a ñ ad e de fo rm a s im u ltá n e a con la m io s ta tin a a las cé lu la s , la ac tiva c ió n de l A R E d ism in u ye , c o n d u c ie n d o u n a d ism in u c ió n de la p ro d u cc ió n y ac tiv id a d de lu c ife rasa .
En e s te e xp e rim e n to , (1) A d n e c tin a A n ti-m io s ta tin a y m io s ta tin a , (2) A d n e c tin a a n ti-m io s ta tin a y a c tiv in a A, o (3) A d n e c tin a a n ti-m io s ta tin a y BM P-11 se in cu b a ro n p re v ia m e n te an te s de a d ic ió n a las cé lu la s . La m io s ta tin a (R & D S y s te m s ) se usó a 10 -500 pM , a c tiv in a A (R & D S ys te m s) a 10 -500 pM , y BM P-11 (R & D S ys te m s) a 10 -500 pM . D e sp u é s de l p e rio d o de in cuba c ió n d u ra n te la no ch e con e s ta s d iv e rs a s co m b in a c io n e s , las cé lu la s se so m e tie ro n a lis is y la ac tiv id a d de lu c ife ra sa (lu m in isce n c ia ) se m id ió u sa n d o el D u a l-G lo L u c ife ra se A s s a y S y s te m ® (E nV is ion ). La C I50 se d e fin e co m o la c o n c e n tra c ió n de A d n e c tin a re q u e rid a p a ra a lc a n z a r u n a in h ib ic ió n de un 50 % de la ac tiv id a d de A R E -lu c ife ra s a in d u c id a p o r m io s ta tina .
C o m o se m u e s tra en las T a b la s 8-10, las A d n e c tin a s a n ti-m io s ta tin a in h ib ie ro n los a u m e n to s m ed ia d o s po r m io s ta tin a en la ac tiv id a d de l in d ic a d o r de A R E -lu c .
Ejemplo 4 - Ensayo de Unión a HTRF
Un e n s a y o de H T R F se usó p a ra m e d ir las a fin id a d e s de un ión de las A d n e c tin a s a n ti-m io s ta tin a a la m io s ta tina . El ensayo era un ensayo de HTRF competitivo usando la etiqueta Eu-W 1024 como un fluoróforo dador y Alexa Fluor® 647 como un fluoróforo aceptor. La Adnectina 1889E01 biotinilada y rhActRIIb-Fc etiquetado con Alexa Fluor® 647 se unen a miostatina de forma simultánea en dos sitios de unión distintos. La Estreptavidina etiquetada con Eu-W 1024 se usa para unirse a 1889E01 biotinilado. Los dos fluoróforos, Eu-W1024 y Alexa Fluor® 647, se ponen juntos mediante la formación de un complejo de 1889E01/miostatina/ActRIIb-Fc, y la señal de HTRF se puede leer sobre un lector de placas EnVision (Perkin Elmer) usando un protocolo de HTRF. en presencia de una Adnectina competitiva, la señal de HTRF disminuye. Las CI50 se presentan en las Tablas 8-10.
Tabla 8: Resultados de caracterización biofísica, ensayo de indicador de ARE-luciferasa, y ensayos de unión a HTRF para mono-Adnectinas anti-miostatina.
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Tabla 9: Resultados de caracterización biofísica, ensayo de indicador de ARE-luciferasa, y ensayos de unión a HTRF para Adnectinas anti-miostatina PEGiladas.
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Tabla 10: Resultados de caracterización biofísica, ensayo de indicador de ARE-luciferasa, y ensayos de unión a HTRF para Adnectinas anti-miostatina fusionadas a Fc.
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Ejemplo 5- Inhibición mediada por Adnectina Anti-miostatina de la Fosforilación de SMAD2 inducida por Miostatina
Se usaron células de rabdomiosarcoma RH41 humano (DSMZ, Braunschweig, Alemania) para el análisis de respuesta a la inhibición de 12, 2, y 4 puntos que se describe a continuación. Las células se retiraron del medio de cultivo y se lavaron para eliminar el suero y se inmovilizaron en medios de ensayo que contenían BSA durante 4 horas. Las células se retiraron del matraz usando verseno y se transfirieron a placas de polipropileno de fondo en V de 96 pocillos a 5x105 células/pocillo. Para la respuesta a la inhibición de 12 puntos, se añadió a las células miostatina recombinante 100 pM (R&D Systems), incubada previamente durante 1 hora con un intervalo de concentración de dilución de 5 veces de Adnectinas comenzando en 1000 nM (es decir, 1000 nM, 200 nM, 40 nM, 8 nM, 1,6 nM, 0,32 nM, 0,064 nM, 0,0128 nM, 0,00256 nM, 0,000512 nM, 0,000102 nM, .0000204 nM),. Para la respuesta de inhibición de 4 puntos, se añadió 100 pM de miostatina, incubada previamente durante 1 hora con un intervalo de concentraciones de Adnectinas (30 nM, 3 nM, 0,1 nM o 0,001 nM), a las células. Para la respuesta a la inhibición de 2 puntos, se añadieron a las células 100 pM de miostatina, incubada previamente durante 1 hora con un intervalo de concentración de Adnectinas (10 nM o 0,5 nM). Las células se trataron con la mezcla de miostatina-Adnectina durante 1 hora a 37 °C para inducir la fosforilación de SMAD2 (pSmad2). La estimulación se detuvo colocando las células en hielo y añadiendo PBS enfriado en hielo. Las células se sedimentaron y se lisaron siguiendo protocolos convencionales y la fosforilación de SMAD2 se detectó usando un ensayo ELISA (Cell Signaling Technologies). La inhibición conseguida por el intervalo de concentraciones de Adnectinas se representó gráficamente usando el Software GraphPad Prism y normalizando los puntos de datos con respecto a controles que proporcionaron una inhibición de un 100 % y de un 0 %. La CI50 se define como la concentración de Adnectina requerida para alcanzar una inhibición de un 50 % de la fosforilación de SMAD2 inducida por miostatina. Los datos que se presentan en la Tabla 11 indican que las Adnectinas obtenidas a partir de la optimización de la afinidad de ambos clones precursores 1979_B06 y 2062_G02 inhibían potente y completamente la fosforilación de pSMAD inducida por miostatina y demostró valores de CI50 que variaban de 0,78 nM a 0,06 nM. Esto representa una mejora de más de 16-75 veces en los valores de CI50 con respecto a los clones precursores 1979_B06 (CI50 = 12,8 nM) y 2062_G02 (CI50 = 59,1 nM).
Tabla 11. Inhibición de fosforilación de SMAD2 (pSMAD2) por Adnectinas anti-miostatina
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Ejemplo 6 - Mediciones de Afinidad de SPR para Adnectinas Anti-miostatina
Cinética de unión a Adnectina usando el formato A de SPR
El anticuerpo Fc anti-humano (Biacore/GE) se inmovilizó en un chip CM5 de Biacore mediante un acoplamiento de NHS/EDC según las instrucciones del fabricante. ActRIIb-Fc (R&D Systems) se capturó en células de flujo tanto de referencia como activo, seguido de la captura de miostatina humana (R&D Systems), BMP-11 humana (GDF-11; R&D Systems) o activina A humana (R&D Systems) solo en células de flujo activo (cada una solubilizada según el protocolo sugerido por el fabricante y diluido en tampón de desarrollo HBSP). Se aplicó un intervalo de concentraciones de Adnectina anti-miostatina en todas las células de flujo en el tampón de desarrollo HBSP. La regeneración de la superficie del chip entre ciclos se consiguió con dos pulsos de 30 segundos de MgCb 3 M. Los rastros cinéticos de los sensogramas con la referencia arrestada se ajustaron a un modelo de unión a 1:1 usando el software Biaevaluation. Un resumen de los datos cinéticos de Biacore se muestra en la Tabla 12.
Los datos que se muestran en la Tabla 12 indican que las Adnectinas de progenie optimizada se unen fuertemente a la miostatina, con las Kd en el intervalo de 0,06-1.47 nM, en comparación con las Adnectinas precursoras 1979_B06 y 2062_G02, que presentaron Kd de 29 y 49 nM, respectivamente.
Después de la PEGilación, hay cierta pérdida en la afinidad de la miostatina, con Kd que varían de 0,76 a 14,4 nM, aunque no hay efecto de la PEGilación en la potencia en el Ensayo de ARE-luciferasa (véanse las Tablas 8 y 9). La selectividad de la Adnectina con respecto intervalos de BMP-11 varía desde totalmente no selectiva hasta 17 veces, mientras que la unión a activina es extremadamente débil o inexistente, lo que sugiere una alta selectividad con respecto a la activina.
Cinética de unión a Adnectina usando el formato B de SPR (útil para las adnectinas con Fc formateado) La miostatina humana (R&D Systems), BMP-11 humana (GDF-11; R&D Systems) o Activina A humana (R&D Systems) se solubilizó según el protocolo sugerido por el fabricante y se inmovilizó en un chip CM5 de Biacore a 1­ 10 pg/ml en tampón acetato (pH 4,0 o 4,5) usando acoplamiento de NHS/EDC convencional. Un intervalo de concentraciones de Adnectinas anti-miostatina se aplicó en el tampón de desarrollo de HBSP. La regeneración de la superficie del chip entre ciclos se realizó con 60 segundos de NaOH 10-50 mM. Los rastros cinéticos de los sensogramas con la referencia arrestada se ajustaron a un modelo de unión a 1:1 usando el Software Biaevaluation. Para las Adnectinas con Fc formateado, las cinéticas de interacción son dirigidas por la avidez del Fc bivalente y la miostatina dimérica incluso a baja densidad de inmovilización. Un resumen de los datos cinéticos de Biacore se muestra en la Tabla 12. Los datos que se muestran en la Tabla 12 indican que algunas de las Adnectinas se desarrollan en la miostatina que se une al formato SPR de y BMP-11 y también activina con afinidades similares. La selectividad sustancial sobre la activina en el Ensayo de ARE-luciferasa, sin embargo, sugiere que la afinidad hacia la activina se puede acentuar artificialmente en este formato de ensayo de SPR.
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Ejemplo 7- Afinidad en Fase de Solución para Adnectinas Anti-miostatina
La afinidad en solución de de PRD-1474, una Adnectina anti-miostatina fusionada a Fc, para la miostatina se midió usando un Ensayo de Exclusión Cinética (KinExA). Se realizaron titulaciones de PRD-1474 por cuadruplicado con miostatina una concentración de monómero de 2 nM (n = 2), 1 nM (n = 1), y 0,7 nM (n = 1). La concentración de miostatina sin unión relativa se midió mediante captura en una matriz sólida de ATI-1310 (acoplada a perlas de poliacrilamida mediante una cisteína libre modificada por ingeniería) seguido por detección con una construcción etiquetada con fluorescencia del co-receptor de miostatina, ActRIIB-Ig que se puede unir a la miostatina de forma simultánea con la Adnectina. ATI-1310 es una Adnectina relación a la que compite con PRD-1474 para su unión a la miostatina y permite la captura de miostatina sin unir. El análisis de Kd global que se muestra en la Tabla 13 proporciona una Kd de 170 pM con un intervalo de confianza de un 95 % de 330-60 pM. Las afinidades de PRD-1177 y ATI-1338 también se midieron usando el mismo formato de ensayo. Se realizaron titulaciones de PRD-1177 por triplicado con miostatina a una concentración de monómeros de 1 nM (n = 2) y 0,8 nM (n = 1). Se realizaron titulaciones de ATI-1338 por triplicado con miostatina a una concentración de monómero de 5 nM (n = 1), 1,6 nM (n = 1), y 1,4 nM (n = 1). Estos análisis indican que PRD-1177 se unía la miostatina con un valor de Kd global de 250 pM y un intervalo de confianza de un 95 % de 340-130 pM (Tabla 13). ATI-1338 se une a la miostatina con un valor de Kd global de 850 pM y un intervalo de confianza de un 95 % de 1400-330 pM.
Tabla 13. Mediciones de afinidad de fase en solución de KinExA para unión a miostatina.
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Ejemplo 8 - Análisis Mutational de 3116_A06
Para comprender la tolerancia relativa de las posiciones del bucle con respecto a la mutación, se llevaron a cabo dos estudios similares pero separados. El primero fue un rastreo con alanina tradicional, donde se evaluaron la unión y la eficacia de mutaciones discretas de alanina en los bucles de Adnectina 3116_A06 (SEQ ID NO: 118) en ensayos bioquímicos y basados en células. El segundo estudio consistió en un rastreo mutacional profundo de NGS en el que los investigadores crearon una biblioteca de mutaciones de un solo sitio en las mismas posiciones de 3116_A06 (SEQ ID 118), pero sustituyendo cada posición con 20 de los aminoácidos posibles. Estos componentes de la biblioteca a continuación se expresaron como fusiones de proteína-ARNm y se sometieron a una sola ronda de presentación de ARNm (como se describe en la Sección IV), separando los componentes de la biblioteca asociados a la miostatina biotinilada de los que permanecen sin unir usando perlas magnéticas de estreptavidina. En este enfoque, la secuenciación de próxima generación de poblaciones de entrada y unidas permitió la determinación del enriquecimiento/agotamiento relativo de cada secuencia, lo que refleja su afinidad intrínseca hacia la miostatina.
Rastreo de alanina: la mutagénesis dirigida de sitio de PCR se usó para crear mutaciones de alanina de un solo sitio en 3116_A06 (SEQ ID NO: 118) en el bucle BC (restos 25-33), bucle DE (restos 55-58), y bucle FG (restos 80­ 89). Los clones se expresaron en E. coli y se purificaron por HTPP como se describe en el Ejemplo 1. La cromatografía de exclusión por tamaño (SEC, como se describe en el Ejemplo 2) confirmó que todas las proteínas sustituidas con alanina eran predominantemente monoméricas (Tabla 14). Se realizaron ensayos tanto de ARE-luciferasa (Ejemplo 3) como de HTRF (Ejemplo 4). En el ensayo de unión de competición de HTRF, las potencias variaron de CI50 = 1,5 nM a > 100 nM (Tabla 14). La mayoría de las posiciones toleraron la sustitución de alanina en el ensayo de HTRF en algún grado, con la excepción de Gly55, Arg56, y Gly57 del bucle DE, para el cual la unión se redujo drásticamente (las CI50 > 100 nM). Un efecto menor se produjo a las posiciones Gly30 del bucle BC, y Val80, Thr81, y Tyr88 del bucle FG, que todavía mostraban unión pero con un aumento > 10 veces en la CI50 con respecto a la secuencia precursora ("WT"). En el ensayo o a base de células de ARE-luciferasa, la potencia de los mutantes varió de CI50 = 0,6 nM a > 100 nM (Tabla 14). El impacto de las mutaciones de alanina generalmente era mayor en el ensayo a base de células con respecto al ensayo de HTRF. Gly55, Arg56, y Gly57 del bucle DE y Val80 y Tyr88 del bucle FG todas presentaban una potencia reducida drásticamente en este ensayo, con las CI50 > 100 nM. Un efecto más moderado se observó para las posiciones Leu26, Pro27, His28, Gly30, y Asn33 del bucle BC, y las posiciones Thr81, Tyr85, y Leu86 del bucle FG, todas las cuales teniendo las CI50 > 10 veces con respecto a la de la secuencia precursora.
Tabla 14: Caracterización bioquímica y potencia a base de células para mutantes de alanina de 3116_A06
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*SEC 1: Altamente monomérico; SEC 2: En su mayoría monomérico
Rastreo Mutacional Profundo: Rastreo Mutacional Profundo: La secuenciación de alto rendimiento se combinó con visualización de proteínas para permitir la medición simultánea de la aptitud relativa de cada posible mutante de bucle de un solo sitio, en una escala podría ser onerosa para un enfoque tradicional como el que se ha descrito anteriormente (para una revisión de enfoques de "Exploración Mutacional Profunda", véase Araya et al., Trends in Biotechnology 29: 435-442, 2011; un enfoque similar se ejemplifica en Forsyth et al., mAbs 5: 523-532, 2013).
Construcción y selección de bibliotecas: Se crearon tres bibliotecas separadas que contenían cada posible mutación en un solo sitio en cada uno de los tres bucles de 3116_A06 (SEQ ID NO: 118): bucle BC (posiciones 25-33), bucle DE (posiciones 55-58), y bucle FG (posiciones 80-89). Para cada bucle, se diseñaron múltiples oligonucleótidos que incorporaban individualmente un codón NNK en cada posición, donde N = A, C, G, T y K = G, T. El uso de estos codones degenerados permite la codificación de los 20 aminoácidos (más un codón de parada) en la posición donde se incorpora NNK. Los oligonucleótidos se ensamblaron mediante PCR de extensión por solapamiento para generar las bibliotecas de Adnectina de longitud completa, donde Lib-BC contenía cada mutación de bucle BC de aminoácidos de 3116_A06, Lib-DE contenía cada mutación de bucle DE de aminoácidos de 3116_A06, y Lib-FG contenía cada mutación de bucle FG de aminoácidos de 3116_A06. Las tres bibliotecas se expresaron como moléculas de fusión de ARNm-proteína usando PROfusión según Xu et al., Chemistry & Biology 9: 933-942, 2002. Las moléculas de PROfusión Lib-BC, Lib-DE, y Lib-FG se seleccionaron por separado contra miostatina biotinilada 3 nM, y las moléculas de unión se capturaron posteriormente sobre perlas magnéticas de estreptavidina. Los aglutinantes se eluyeron de las perlas usando KOH 100 mM. Las moléculas eluidas de las perlas representan variantes de 3116_A06 que aún pueden unirse a la miostatina, mientras que las presentes en la biblioteca inicial pero no encontradas en la elución representan variantes de 3116_A06 que no se unen del mismo modo a la miostatina.
Codificación de barras y mezcla de NGS: Dos poblaciones, entrada (antes de la unión a la miostatina) y aglutinantes (eluidos de las cuentas posteriores a la selección), obtenidas a partir de cada una de las tres bibliotecas (Lib-BC, Lib-DE y Lib-FG) se recogieron y amplificaron por separado. Cada población se adjuntó con un Adaptador Universal 5'-TruSeq, un Adaptor II 3'-Truseq y un código de barras único de 6 nucleótidos mediante PCR. Un total de seis poblaciones con código de barras se cuantificaron de forma individual y se mezclaron (Lib-BC: Lib-DE: Lib-FG = 9:4:10) en función del número de restos aleatorios en cada bucle, con el fin de obtener números de secuencias similares por posición aleatoria estadísticamente. La muestra agrupada se secuenció mediante secuenciación de próxima generación de extremos emparejados de 150 pb MiSeq (Illumina).
Análisis de datos de NGS: Las secuencias de lectura directa de la secuenciación de la próxima generación se agruparon según población, posición de mutación e identidad del aminoácido mutado. Todas las secuencias de mala calidad y las que contenían múltiples sitios de mutación se eliminaron del análisis. A continuación, la frecuencia de cada secuencia en la población posterior a la selección se dividió entre su frecuencia en la población de entrada para obtener una proporción de enriquecimiento (ER). La comparación de las ER de las secuencias precursoras (WT, que funciona como un control positivo) y las secuencias que contienen un codón de parada (que funciona como un control negativo, que representa el ruido de fondo de la supervivencia al azar) mostró que la relación de señal con respecto a fondo (S/B) varió entre los tres bucles, supuestamente porque cada biblioteca de bucles se puso a través de selecciones de forma individual. Por esta razón, cada secuencia se normalizó con respecto a las ER de parada promedio y de wt promedio para su propio bucle específico, para obtener ERnorm.
g l^norm _ ER — ER .
ER,,.- — ER parada
El rastreo mutacional profundo se validó comparando la aptitud relativa de los mutantes de alanina de un solo sitio con los datos bioquímicos del rastreo de alanina tradicional. En general, la correlación fue bastante fuerte (Figura 8). Las ER de NGS definen un perfil de enriquecimiento y agotamiento de mutantes de alanina en todos los bucles que se correlaciona bien con el impacto observado en los ensayos de HTRF y de ARE-luciferasa.
La CI50 de HTRF bioquímica también se representó directamente frente a la ERnorm de NGS para cada mutante de alanina, como se muestra en la Figura 9.
Basándose en las correlaciones de la alanina, se establecieron tres categorías en las que todas las mutaciones de aminoácidos de un solo sitio se podrían agrupar a través de sus proporciones de enriquecimiento de NGS: Las mutaciones más preferidas (ERnorm > 0,8), mutaciones más preferidas (ERnorm > 0,5), y mutaciones preferidas (ERnorm > 3 desviaciones estándar a partir de la ERparada promedio de bucle). Los límites inferiores de ERnorm que definen la última categoría diferían para los tres bucles: BC = 0,25; DE = 0,15; FG = 0,35. Todos los mutantes de un solo sitio en los bucles de 3116_A06 se agruparon según sus proporciones de enriquecimiento normalizadas para determinar la tolerancia relativa de cada posición con respecto a la mutación (Tabla 15).
Tabla 15: Mutaciones de un solo sitio en las secuencias de bucle de 3116_A06 que mantienen la unión a miostatina
Figure imgf000095_0001
Usando todos los datos del rastreo mutacional profundo de NGS, parece que las posiciones 25, 26, 27, 30, 32, y 33 del bucle BC, y las posiciones 55, 56, y 57 del bucle DE, y las posiciones 80 y 88 del bucle FG son las más conservadas, en las que solamente uno o unos pocos tipos de aminoácidos en estas posiciones mantienen la unión a la miostatina. Por otro lado, otras posiciones son altamente tolerantes a la mutación, incluyendo las posiciones 28, 29, y 31 del bucle BC, y las posiciones 82,83, y 87 del bucle FG.
Ejemplo 9 - Evaluación de la Farmacocinética de Adnectina Anti-miostatina
Para investigar el perfil farmacocinético de las Adnectinas con diferentes formatos PEGilados, la Adnectina antimiostatina 2987_H07 se formateó con PEG de 40 Kd de 2 ramificaciones (ATI-1338), PEG de 40 Kd de 4 ramificaciones (ATI-1339), y PEG 20 Kd Bis (ATI-1341). Se realizaron estudios de una sola dosis de administración subcutánea con estas tres Adnectinas PEGiladas en ratones C57BL6. Las concentraciones totales de fármaco se determinaron mediante un ensayo ELISA. El inmunoensayo PK bioanalítico para la cuantificación de ATI-1338 usó un ensayo ELISA de formato sándwich convencional, donde el 1338 se capturó con un anticuerpo monoclonal contra la proteína HIS-TAG y a continuación se detectó con un anticuerpo policlonal anti-PEG. Como se muestra en la Tabla 16, los dos formatos PEGilados de 40 Kd , ATI-1338 y ATI-1339, proporcionaron una mejora farmacocinética más prominente (es decir, una semivida más larga (t1/2) y una mayor exposición a dosis normalizadas) que el formato PEGilado de Bis-20 Kd , ATI-1341.
T a b l a 1 6 . Comparación Farmacocinética de Tres Formatos PEGilados para Adnectina
2987 H07
Figure imgf000096_0002
Se realizaron estudios de una sola dosis después de la administración intravenosa y subcutánea de Adnectinas antimiostatina fusionadas con Fc (PRD-1177, PRD-1286 y PRD-1474) en ratones C57BL6 para evaluar los efectos de la fusión de Fc sobre los parámetros farmacocinéticos. Las concentraciones totales de fármaco se determinaron mediante ensayos ELISA. El inmunoensayo PK bioanalítico para la cuantificación de los conjugados de Fc para PRD 1177, 1474 y 1286 usó un ensayo ELISA de formato de tipo sándwich con tecnología ECL, donde el 1177 se capturó con un anticuerpo policlonal con respecto al armazón de Adnectina, a continuación se detectó con un anticuerpo IgG anti-humano. Como se muestra en la Tabla 17, las tres Adnectinas fusionadas con Fc tenían una semivida más larga (58 - 172 h) que la Adnectina PEGilada ATI-1338 (25 h). Una menor biodisponibilidad de SC probablemente refleja la proteólisis durante el tránsito intersticial y linfático de la molécula biológica. La biodisponibilidad de SC de las Adnectinas fusionadas con Fc está dentro de un rango razonable basándose en la literatura publicada (p. ej., Richter et al., AAPS J. 2012; 14: 559-70).
T a b l a 1 7 . Comparación Farmacocinética de Tres Adnectinas anti-miostatina fusionadas a Fc
Figure imgf000096_0001
E j e m p l o 1 0 - M e c a n i s m o d e I n h i b i c i ó n d e A d n e c t i n a A n t i - m i o s t a t i n a
ELISA competitivo: los ensayos de unión competitiva para evaluar la capacidad de Adnectinas anti-miostatina para competir con el receptor ActRIIB que se une a la miostatina se llevaron a cabo usando ELISA competitivo. Las placas Nunc Maxisorp se revistieron con 2 pg/ml de ActRIIb-Fc (R&D Systems) en tampón de carbonato de sodio 0,2 M a pH 9,6 durante la noche a 4 °C. Después de lavar con PBS-T (PBS que contenía Tween-20 al 0,05 %), los pocillos se bloquearon con tampón OptEIA (BD Biosciences) durante 1 h a 25 °C con agitación. La miostatina (10 nM; R&D Systems) se incubó previamente con un intervalo de concentraciones de Adnectina o competidor de ActRIIb-Fc (de 0,2 pM a 1 pM) en tampón OptEIA durante 1 h a 25 °C con agitación. La placa de ensayo bloqueada y revestida se lavó con PBS-T, y a continuación se añadieron mezclas de miostatina/competidor y se incubaron durante 30 min a 25 °C con agitación. La placa de ensayo se lavó con PBS-T, tras lo cual se detectó miostatina unida con anticuerpo policlonal de cabra anti-miostatina biotinilado a 1:1000 (R&D Systems) diluido en OptEIA, durante 1 h a 25 °C con agitación. Después de lavar con PBS-T, se añadió Estreptavidina-HRP (Thermo/Pierce) a 1:5000 diluida en OptEIA, seguido de incubación durante 30 minutos a 25 °C con agitación. La placa de ensayo se desarrolló con TMB (BD Biosciences), se interrumpió con ácido sulfúrico 2 N y se leyó la absorbancia a A450. Como se muestra en la F i g . 1 0 , ActRIIb-Fc en solución bloquea completamente la unión de miostatina a ActRIIb-Fc revestido sobre la placa, tal como se esperaba. Sin embargo, por el contrario, PRD-1288 (se diferencia de PRD-1474 solo en la secuencia del conector), PRD-1285 y PRD-1286 en concentraciones de hasta 1 pM no bloquean la unión de miostatina a ActRIIb.
SPR de competición: los ensayos de unión competitiva para evaluar la capacidad de Adnectinas anti-miostatina para competir con los receptores de Tipo I y de tipo II para su unión a miostatina o BMP11, como un sustituto de miostatina, también se realizaron usando SPR en un instrumento Biacore T100, en dos formatos experimentales diferentes. En el "Formato A de SPR", las superficies del chip sensor se prepararon mediante la inmovilización de 100 ug/ml de proteína A (Pierce) en acetato 10 mM a pH 4,5 a 4500 Ru en un chip sensor CM5 (Biacore/GE Healthcare) usando química convencional de etil(dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) / N-hidroxisuccinimida (NHS), con bloqueo con etanolamina. ALK4-Fc (R&D Systems), AlK5-Fc (R&D Systems), ActRIIB-Fc (producido en las instalaciones), un anticuerpo monoclonal anti-miostatina/BMP11 (mAb-A) que compite por la unión a miostatina con ActRIIB pero que no compite con 3116_A06 por la unión a la miostatina (producido en las instalaciones), o Adnectina-Fc PRD-1474 a concentraciones de 7-13 pg/ml se capturaron a través de la cola de Fc a densidades de superficie de 1600 - 4300 RU usando inyecciones durante 60 s a 10 pl/min. Los experimentos de competición se realizaron haciendo fluir miostatina 100 nM miostatina (R&D Systems) o BMP11 (R&D Systems) sobre estas superficies en ausencia o presencia de Adnectina ATI-1523200 nM Adnectina a un caudal de 30 pl/min con tiempos de asociación y disociación de 180 s. El tampón de desarrollo para los experimentos de inmovilización y competición fue HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, y Tensioactivo P20 al 0,05 % en v/v, pH 7,4, y las superficies se regeneraron entre ciclos usando dos inyecciones de glicina 10 mM a pH 1,5 durante 30 s a 30 pl/min.
En el Formato A de SPR, BMP11 se unió de forma específica a las superficies ALK4-Fc, ALK5-Fc, ActRIIB-Fc, mAb-A, and PRD-1474, mientras que la miostatina se unió de forma específica a ActRIIB-Fc, mAb-A, y PRD-1474, pero no a ALK4-Fc o ALK5-Fc. Para evaluar el efecto de ATI-1523 sobre la unión a miostatina o BMP11, las respuestas de unión para cada proteína al final de la fase de asociación de 180 s se normalizaron cada una a un 100 %, y se compararon con las respuestas de unión para miostatina o BMP11 en presencia de ATI-1523 (Tabla 18). ATI-1523 bloqueó completamente la unión de miostatina o BMP11 a la superficie de control PRD-1474, tal como se esperaba. En los ensayos para evaluar la capacidad de ATI-1523 para bloquear la interacción de miostatina con ALK4-Fc o ALK5-Fc, BMP-11, que también se une a ALK4-Fc y ALK5-Fc, se usó como un sustituto de miostatina, ya que la miostatina sola no se une de forma significativa a ALK4-Fc y ALK5-Fc en este formato experimental. ATI-1523 redujo significativamente la señal de unión para BMP11 hacia ALK4-Fc (reducción de un 98 %) y ALK5-Fc (reducción de un 69 %), lo que sugiere que la Adnectina compite por la unión a la miostatina con los receptores de Tipo I. Por el contrario, se observó un aumento de la respuesta de unión para los complejos de miostatina/ATI-1523 o BMP 11/ATI-1523 sobre superficies de ActRIIB-Fc o mAb-A surfaces, lo que sugiere que los complejos de miostatina/ATI-1523 or BMP 11/ATI-1523 son capaces de unirse a estas superficies, es decir, la Adnectina no es competitiva con ActRIIB-Fc o mAb-A. El gran aumento en la respuesta de unión (> 1000 % de aumento) para el complejo de miostatina/ATI-1523 sobre superficies de ActRIIB-Fc y mAb-A es coherente con la Adnectina que tiene un efecto de solubilización sobre la miostatina.
Tabla 18: Respuesta de unión a SPR para miostatina 100 nM o BMP11 100 nM en ausencia o presencia de ATI-1523200 nM sobre superficies de ALK4-Fc, ALK5-Fc, ActRIIB-Fc, mAb-A, o PRD-1474.
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Competición de Adnectina usando el "Formato B de SPR": el mecanismo de acción para Adnectinas anti-miostatina se evaluó adicionalmente en el "Formato B de SPR", donde la miostatina o BMP11 (10 pg/ml en acetato 10 mM A pH 4,5) se inmovilizaron directamente en una superficie de chip sensor CM5 usando química de acoplamiento de EDC/NHS a una densidad de 985 RU (miostatina) o 530 RU (BMP11). En la presente memoria, la respuesta de unión para los receptores ALK4-Fc (R&D Systems), ALK5-Fc (R&D Systems), o ActRIIB-monómero (producidos en las instalaciones) inyectados solos (2 pM durante 180 s a 30 pl/min), se compararon con las respuestas de unión para estos receptores después de la unión previa de PRD-1474 de fusión de Adnectina-Fc a la superficie (1 pM durante 480 s a 30 pl/min). El tampón de desarrollo para los experimentos de inmovilización y competición fue HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, y Tensioactivo P20 al 0,05 % en v/v, pH 7,4, y las superficies se regeneraron entre ciclos usando 4 inyecciones de NaOH 50 mM durante 15 s a 30 pl/min.
En ausencia de PRD-1474, cada receptor se unió específicamente a BMP11 inmovilizado, mientras que solo ALK5-Fc y ActRIIB-monómero, pero no ALK4-Fc, se unieron a la miostatina inmovilizada. La unión previa de PRD-1474 redujo de forma significativa la señal de unión de ALK4-Fc hacia BMP 11 (reducción de un 70 %) y también redujo la unión de ALK5-Fc hacia la miostatina o BMP11 (reducción de un 35-41 %), pero tuvo un impacto mínimo en la unión del ActRIIB-monómero a superficies de cualquiera de miostatina o BMP11, Tabla 19. estos datos, tomados en conjunto con los datos de competición de SPR a partir del "Formato A de SPR" (Tabla 18), los datos de ELISA competitivo (Fig. 10), y la inhibición completa de la señalización de miostatina observada en el Ensayo de ARE-luciferasa (Fig. 11), demuestran que el mecanismo de acción de la Adnectina es el bloqueo del reclutamiento de receptores de señalización de Tipo I (ALK4/5), y que las Adnectins no compiten con la unión al receptor de Tipo II (ActRIIB).
Tabla 19: Respuesta de unión a SPR para monómero de ALK4-Fc, ALK5-Fc, o ActRIIB 1pM sobre miostatina in m o v iliz a d a o su p e rfic ie s de B M P 11 con o sin P R D -1474 un id o p re v ia m e n te .
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D a do q u e e s ta s A d n e c tin a s re p re se n ta n las fa m ilia s de s e c u e n c ia s q u e se usan a m od o de e je m p lo en la p re se n te in venc ión , y los c lo n e s in d iv id u a le s d e n tro de u n a fa m ilia de s e c u e n c ia s b ien d e fin id a m a n tie n e n el m ism o s itio de un ión , las se cu e n c ia s cu b ie rta s p o r la p re se n te in ve n c ió n a c tú an b lo q u e a n d o el re c lu ta m ie n to de A L K 4 /5 en el c o m p le jo de m io s ta tin a -A c tR IIb .
Los da to s fa rm a c o c in é tic o s ind ican a d e m á s q u e los n ive le s de l c o m p le jo de m io s ta tin a -A d n e c tin a se acu m u la n con el t ie m p o y q u e e s to s c o m p le jo s se un en a A c tR IIb , a c tu a n d o de e se m od o co m o un in h ib id o r ne g a tivo d o m in a n te de la se ñ a liza c ió n in d e p e n d ie n te de l fá rm a c o lib re. E ste m e c a n is m o ú n ico d is tin g u e a las A d n e c tin a s a n ti-m io s ta tin a de la p re se n te in ve n c ió n de los a n tic u e rp o s a n ti-m io s ta tin a qu e se d e sc rib e n en la b ib lio g ra fía (p. e j., d o c u m e n to US 7 632499 ), e in d ica q u e las A d n e c tin a s a n ti-m io s ta tin a de la in ve n c ió n p re se n ta n un a u m e n to de la ac tiv idad .
Ejemplo 11: Formación de mapas de sitio de unión a Adnectina sobre miostatina usando HDX-MS:
El s itio de un ión a A d n e c tin a so b re la m io s ta tin a se e va lu ó a d ic io n a lm e n te u sa n d o e s p e c tro m e tr ía de m a sa s p o r in te rca m b io de h id ró g e n o -d e u te rio (H D X -M S ).
El m é to d o de e s p e c tro m e tr ía de m a sa s p o r in te rca m b io de h id ró g e n o /d e u te rio (H D X -M S ) s o n d e a la co n fo rm a c ió n y la d in á m ic a c o n fo rm a c io n a l de la p ro te ín a en so luc ió n m ed ia n te la m o n ito riza c ió n de la ta s a de in te rca m b io de d e u te rio y su a lca n ce en los h id ro g e n o d e sd e la a m id a de la e s tru c tu ra p rinc ip a l. El n ive l de H D X d e p e n d e de la a cce s ib ilid a d de l d is o lv e n te a los h id ro g e n a d o s de la a m id a de la e s tru c tu ra p rin c ip a l y la c o n fo rm a c ió n de la p ro te ín a . El a u m e n to de m a sa de la p ro te ín a so b re H D X se p u e d e m e d ir de fo rm a p re c isa p o r M S. C u a n d o e s ta té c n ic a se e m p a re ja con d ig e s tió n e n z im á tica , se p u ed en en te n e r e le m e n to s e s tru c tu ra le s a n ive l p e p tíd ico , p e rm itie n d o la d ife re n c ia c ió n de los p é p tid o s de su p e rfic ie e x p u e s ta de los p le g a d o s d e n tro , o a p a rtir de los s e c u e s tra d o s en la su p e rfic ie de c o n ta c to de un co m p le jo de p ro te ín a -p ro te ín a . p o r lo g e n e ra l, se rea lizan e tiq u e ta d o con d e u te rio y p o s te rio re s e x p e rim e n to s de in te rru p c ió n , se g u id o p o r d ig e s tió n de p e p s in a en línea , se p a ra c ió n de pé p tid o s , y an á lis is de MS.
D ado q u e se e n c o n tró qu e la m io s ta tin a s o la tie n e u n a s o lu b ilid a d in a d e c u a d a m e n te ba ja p a ra H D X -M S en c o n d ic io n e s de pH fis io ló g ic a m e n te re le va n te (< 10 pg /m l), los in ve s tig a d o re s usa ro n un a e s tra te g ia a lte rn a tiv a de a u m e n to de la s o lu b ilid a d de la m io s ta tin a m e d ia n te fo rm a c ió n de co m p le jo de la p ro te ín a con el fra g m e n to Fab de m A b -A (F ab-A ), qu ie n se m o stró qu e no e ra co m p e titiv o con la A d n e c tin a u sa n d o los e x p e rim e n to s de S P R q u e se d e sc rib e n en el E je m plo 10. El e s ta d o o lig o m é ric o de las m u e s tra s de H D X -M S se c a ra c te r iz ó m ed ia n te c ro m a to g ra fía de e xc lu s ió n p o r ta m a ñ o a c o p la d a a un d e te c to r de d isp e rs ió n lá s e r de m ú ltip le s á n g u lo s (S E C -M A LS ), d o n d e la m a sa d e te rm in a d a p o r M A LS de l c o m p le jo de m io s ta tin a /F a b -A (~ 120 kD a) e ra co h e re n te con la e s te q u io m e tr ía e s p e ra d a de un h o m o d ím e ro de m io s ta tin a un id o a d o s m o lé cu la s de Fab-A , y la m a sa d e te rm in a d a p o r M A L S de l co m p le jo de m io s ta tin a /F a b -A /3116 _ A 06 (142 kD a ) e ra co h e re n te con la e s te q u io m e tr ía e s p e ra d a de un h o m o d ím e ro de m io s ta tin a un id o a dos m o lé cu la s de F ab-A m ás do s m o lé cu la s de 3116 _ A 06.
A n te s de la fo rm a c ió n de m ap as de l s itio de un ión a A d n e c tin a so b re la m io s ta tin a re co n o c id o p o r la A d n e c tin a 3 116 _ A 06 p o r H D X -M S , se rea liza ro n e x p e rim e n to s no d e u te ra d o s p a ra g e n e ra r un lis tado de m u e s tra s de p é p tid o s p é p tico s c o m u n e s p a ra m io s ta tin a a p a rtir de m io s ta tin a /F a b -A ( p ro p o rc ió n m o la r de 1:1 a 30 pM c a d a u n o ) y m io s ta tin a /F a b -A /3116 _ A 06 (p ro p o rc ió n m o la r de 1:1:1 a 30 pM c a d a uno), co n s ig u ie n d o un a c o b e rtu ra de s e c u e n c ia s de un 83 ,5 % p a ra la m io s ta tina . En e s te e x p e rim e n to , e l ta m p ó n fo s fa to 10 m M (pH 7,0 ) se usó d u ra n te la e ta p a de e tiq u e ta d o , se g u id o p o r la a d ic ió n de ta m p ó n de in te rru p c ió n (tam pó n fo s fa to 200 m M con G dn C l 4 M Y T C E P 0,5 M, pH 2,5, 1 :1, v /v ). P ara e x p e rim e n to s de fo rm a c ió n de m ap as de s itio de un ión a A d n e c tin a , 5 pl de c a d a m u e s tra (m io s ta tin a /F a b -A o m io s ta tin a /F a b -A /3116 _ A 06 ) se m e zc la ro n con 65 pl de ta m p ó n de e tiq u e ta d o de H D X (tam pó n fo s fa to 10 m M en D20, pD 7.0 ) p a ra c o m e n z a r las re a cc io n e s de e tiq u e ta d o a te m p e ra tu ra am b ie n te (~ 25 °C). Las re a cc io n e s lle va ro n a c a b o d u ra n te d ife re n te s p e rio d o s de t ie m p o : 20 s, 1 m in, 10 m in, 60 m in, y 24 0 m in. A l f in a l de c a d a p e rio d o de re a cc ión de e tiq u e ta d o , la rea cc ión se in te rru m p ió m e d ia n te la a d ic ió n de ta m p ó n de in te rru p c ió n (1:1, v /v ) y la m u e s tra in te rru m p id a se in yec tó en el s is te m a H D X -M S de W a te rs p a ra su a n á lis is . Los p é p tid o s pé p tico s co m u n e s o b s e rv a d o s se m o n ito riza ro n p a ra sus n ive le s de a b so rc ió n de d e u te rio En p re s e n c ia /a u s e n c ia de 3116_A 06.
Los d a to s e x p e rim e n ta le s o b te n id o s a p a rtir de m e d ic io n e s de H D X -M S ind ican qu e la A d n e c tin a 3116 _ A 06 re co n o ce un s itio de un ión a A d n e c tin a d is c o n tin u o fo rm a d o p o r d o s re g io n e s e s p e c ífic a s en la m io s ta tina :
R e g ió n 1: L Y F N G K E Q IIY G K IP A M (85 -101 ); S E Q ID N O : 329
R egión 2: P H T H L V H Q A N P (56 -66 ); S E Q ID N O : 330
B a sá n d o se en los n ive le s re la tivo s de a b so rc ió n de d e u te rio , las d o s re g io n e s p e p tíd ic a s se c la s ifica n co m o reg ión 1 > 2, con la reg ión 1 te n ie n d o los c a m b io s m ás s ig n ific a tiv o s en la a b so rc ió n de l im perio .
E je m p lo 12 - A c o p la m ie n to in silico d e A d n e c t in a 3116 _ A 06 s o b re M io s ta t in a
Un e n fo q u e in fo rm á tico se usó p a ra g e n e ra r un m o d e lo e s tru c tu ra l de l c o m p le jo de 3116 _ A 06 -m io s ta tin a q u e e ra co h e re n te con los d a to s de H D X -M S (F ig . 13). El a c o p la m ie n to de p ro te ín a de 3116 _ A 06 en la e s tru c tu ra de la m io s ta tin a h u m a n a (P D B 3H H 2 to m a d a a p a rtir de l B an co de D a tos de P ro te ín a s , w w w .rc s b .o rg ; C a sh et al., EMBO J. 28 : 2662 -2676 , 2009 ) se llevó a ca b o u sa n d o Z D O C K (C hen y W ang , Proteins 47 : 281 -294 , 2002 ) ta l co m o se im p le m e n ta en el s o ftw a re D isco ve ry S tud io v3.5 de A c c e lry s (A cce lrys ). El p ro to co lo de Z D O C K u sa a co p la m ie n to de c u e rp o s ríg id o s de d o s e s tru c tu ra s p ro te ín ic a s (lig a n d o = 3116 _ A 06 y re c e p to r = m io s ta tin a ). Los p la n te a m ie n to s a co p la d o s se f iltra ro n p a ra c o m p le jo s q u e c o n te n ía n c o n fo rm a c io n e s de 3116 _ A 06 de los b u c le s FG (res tos T h r79 a T y r88 ) y BC (re s to s S e r25 a N 33). Un c o m p le jo p re fe re n te s e le c c io n a b a s á n d o s e en la co m p le m e n ta rie d a d de los res tos de la su p e rfic ie de c o n ta c to a co p la d o s con co rre la c ió n de su s titu c io n e s fa v o ra b le s p a ra el b u c le id e n tifica d a s p o r m u ta g é n e s is de A d n e c tin a . La F ig . 13 A m u e s tra el s itio de un ión a A L K 4 y el s itio de un ió n a A c tR IIB de q u e se fo rm a n m a p a s so b re la e s tru c tu ra de m io s ta tin a (co lo r g ris ). La R eg ión 1 y la R eg ión 2, qu e se id e n tifica ro n con los e x p e rim e n to s de H D X -M S co m o se d e s c rib e en el E je m plo 11, se ind ican en c o lo r negro . La F ig . 13 B m u e s tra un c o m p le jo p re fe re n te a p a rtir de b lo q u e o , con los b u c le s BC, DE y FG de 3116 _ A 06 (co lo r ne gro ) re p re se n ta d o s en stick, y las R e g io ne s 1 y 2 de la m io s ta tin a (c o lo r g ris ) re p re s e n ta d a s en re llen o de e sp a c io . V a rio s res tos qu e se id e n tifica ro n co m o m u ta c io n e s fa v o ra b le s de l bu c le m o stra ro n co n trib u c io n e s fu n d a m e n ta le s . P o r e je m p lo , en el bu c le BC de 3116 _ A 06 , los res tos S er25 , Le u26, y P ro27 son im p o rta n te s co m o lim ita c io n e s e s tru c tu ra le s p a ra m a n te n e r la c o n fo rm a c ió n g e n e ra l de l bu c le . P o r el c o n tra rio , la A la 32 se a ju s ta en u n a p e q u e ñ a fis u ra h id ró fo b a fo rm a d a en la su p e rfic ie de c o n ta c to de l c o m p le jo y la e s tru c tu ra p rinc ip a l de l resto fo rm a e n la c e s de h id ró g e n o con la m io s ta tina . Las m ás su s titu c io n e s p re fe rib le s en la po s ic ió n 32 son G ly o Leu, y se p re d ice q u e se a jus tan b ien en el lu g a r de la a lan ina . Del m ism o m odo, la A sn 33 e s tá im p lica d a con e n la c e s de h id ró g e n o p a ra re s to s de tr ip tó fa n o c e rc a n o s de m io s ta tina . Las su s titu c io n e s en la po s ic ió n 33 m ás p re fe rib le s son H is y G ln, q u e ta m b ié n c o n tie n e n c a d e n a s la te ra le s qu e p u ed en c o n trib u ir co m o d a d o re s de e n la c e s de h id ró g e n o . Los res tos en el bu c le DE son c rít ic o s : las s u s titu c io n e s m ás fa v o ra b le s se lim itan a G ly55 , A rg 56 , y G ly 57, y so la m e n te son p re fe rib le s las s u s titu c io n e s c o n s e rv a tiv a s p a ra V a l58. En la e s tru c tu ra de l m od e lo , la A rg 56 es un resto c r ít ic o q u e c o n trib u y e a in te ra cc io n e s de c a tio n e s pi con Y 86 de la m io s ta tin a en la R e g ió n 1 a s í co m o e n la c e s de h id ró g e n o ad ic io n a le s con Los res tos de la e s tru c tu ra p rin c ip a l y la ca d e n a la te ra l de o tra R eg ión 1. P ara m uch os res tos de l bu c le FG, las s u s titu c io n e s M ás p re fe rib le s e ra n su s titu c io n e s c o n se rva tiva s . U n a po s ic ió n c r ít ic a id e n tif ic a d a fu e T yr88 , q u e tien e in te ra cc io n e s de ca tió n pi e in te ra c c io n e s p i-p i con Y 55 y con o tro s res tos de la R eg ión 2 de la m io s ta tina . El bu c le FG ta m b ié n e s tá im p licad o con v a ria s in te ra cc io n e s h id ró fo b a s con las R e g io ne s 1 y 2 id e n tifica d a s a p a rtir de los e x p e rim e n to s de m u ta g é n e s is . E stos c á lcu lo s m ue stra n q u e es tá n m uy de a cu e rd o con los da to s e xp e rim e n ta le s de H D X -M S y S PR .
E je m p lo 13 - M o d e lo d e ra tó n in vivo d e e f ic a c ia m u s c u lo e s q u e lé t ic a
Los ra ton es B 6.S C ID m ach o (9 -13 s e m a n a s de ed ad , J a ckso n L a b o ra to rie s , B a r H arbo r, M a ine) se a lo ja ro n en un a ha b ita c ió n de te m p e ra tu ra c o n tro la d a con un c ic lo in ve rtido de 12 ho ras de lu z /o scu rid a d . El a g u a y el p ienso co n v e n c io n a l se a d m in is tra ro n la vo lu n ta d . Los ra ton es se c la s ifica ro n de fo rm a a le a to ria y se d is tr ib u y e ro n en tres g ru p o s de tra ta m ie n to p a ra re c ib ir c u a lq u ie ra de los c o m p u e s to s de co n tro l o de e n s a y o de la p re se n te in venc ión b a s á n d o s e en el pe so co rp o ra l (a p ro x im a d a m e n te 20 -22 g). C on el fin de d e m o s tra r la e fic a c ia in vivo de los c o m p u e s to s de la p re se n te in venc ión , los c o m p u e s to s se a d m in is tra ro n y a s e a s e m a n a lm e n te (a d n e c tin a s an tim io s ta tin a de fu s ió n de Fc) o d o s v e c e s a la se m a n a (a d n e c tin a s a n ti-m io s ta tin a P E G ila d a s ) m ed ia n te in yecc ió n s u b cu tá n e a . Los c o m p u e s to s de e n s a y o s se a d m in is tra ro n a los a n im a le s en S o lu c ió n S a lin a T a m p o n a d a con F osfa to (P B S ). Los c o n tro le s se tra ta ro n s o la m e n te con ta m p ó n de re co n s titu c ió n . Los a n im a le s de e n s a y o (n = 8 -10 ra to n e s /g ru p o ) se d o s ifica ro n d u ra n te un m arco te m p o ra l de 14 d ía s p o r v ía s u b cu tá n e a , con , p. e j., 5, 6 o 10 m g /k g /s e m a n a de un c o m p u e s to de la in venc ión . Las m e d ic io n e s de l p e so co rp o ra l se re g is tra ro n an te s de la c la s ifica c ió n de fo rm a a lea to ria , en el d ía de la c la s ifica c ió n de fo rm a a lea to ria , y de d o s a tre s v e c e s a la se m a n a d u ra n te los p e rio d o s de tra ta m ie n to , y al fina l de l es tu d io . La m a sa de l m ú scu lo de la p ie rn a m e n o r se reg is tró a p a rtir de los e s q u e le to s c o rp o ra le s al fina l de l e s tu d io m ed ia n te an á lis is de fo rm a c ió n de im á g e n e s p o r re so n a n c ia m a g n é tica c u a n tita tiv a (M R I, E cho M ed ica l S ys te m s , T ex). Los g ru p o s de e n s a y o se co m p a ra ro n con re sp e c to al g ru p o de con tro l. Los re su lta d o s m u e s tra n q u e las A d n e c tin a s a n ti-m io s ta tin a de la in ve n c ió n a u m e n ta ro n el p o rce n ta je de l pe so co rp o ra l a p a rtir de l v a lo r in ic ia l (F ig . 14) y te n ía n e fe c to s a n a b ó lico s s ig n ific a tiv o s en el vo lu m e n de l m ú scu lo e s q u e lé tic o (F ig . 15), en c o m p a ra c ió n con ra to n e s de c o n tro l (p. e j., un a u m e n to de a p ro x im a d a m e n te un 7 -10 % en el v o lu m e n m u s c u la r en c o m p a ra c ió n con el con tro l.
Formación de imágenes por resonancia magnética (MRI)
La M RI p a ra m e d ic io n e s de l v o lu m e n de l m ú scu lo de la p ie rn a se llevaron a ca b o en un P h a rm a S ca n 4.7 T e s la de B ru k e r con un ca lib re de 16 cm (B ru k e r B iosp in , B ille rica , M a. U S A ). U n a b o b in a con un v o lu m e n de 62 m m se usó p a ra el tra n s m is o r y el rece p to r. D e spu és de re c o g e r las im á g e n e s de l lo c a liz a d o r de la pa rte in fe rio r de la p ie rna , las im á g e n e s p o n d e ra d a s p o r T 2 se o b tu v ie ro n u sa n d o un p lano de c o rte ax ia l. La s e c u e n c ia de g iro rá p id o -e co (R A R E ) c o n s is tió en un pu lso de H e rm ite de 90° p u lse se g u id o p o r un p u lso de H e rm ite de 180° con un T R /T E = 2000 /23 ms. S e reco g ie ro n o n c e co rte s a x ia le s d e sd e la p a rte s u p e rio r de la ro d illa ha s ta el to b illo con u n a d ire cc ió n de m a triz de 25 6 x 128 pu n to s de da tos . El c a m p o de v is ió n e ra de 5 cm p o r 2 ,5 cm , con un g ro s o r de co rte de 1,25 m m y un fa c to r de R A R E de 4 y 8 p ro m e d io s de señ a l. Los v o lú m e n e s de l m uslo de la p ie rn a se ca lcu la ro n su m a n d o to d a s las á re a s de co rte ax ia l m u ltip lica d o p o r el g ro s o r de c o rte de 1,25 m m p a ra un v o lu m e n de m úscu lo to ta l en c a d a p ie rna . Las im á g e n e s se a n a liza ro n con un p ro m e d io de l á re a de la reg ión de in te rés (R O I) m e d ia n te A n á lis is de S e c u e n c ia de Im age n (ISA , B ru k e r B iosp in , B ille rica , M a.). Las ROI m a n u a le s se d ib u ja ro n a lre d e d o r de l m ú scu lo de la p ie rn a e x c lu y e n d o la p ie l y la z o n a de g ra s a s u b cu tá n e a . El v o lu m e n m u s c u la r p ro m e d io to ta l p a ra a m b a s p ie rna s se m u e s tra en la F ig . 15.
La M R I p a ra v o lú m e n e s c a rd ia c o s co m o un pu n to fin a l de se g u rid a d ta m b ié n se llevó a ca b o con el m ism o e s c á n e r de M R I. D e spu és de o b te n e r im á g e n e s de lo c a liz a d o r in ic ia l de l á re a to rá c ica , se reco g ie ro n 9 im á g e n e s a x ia le s de los v a s o s g ra n d e s de l á p e x de l co ra zó n . Al igua l q u e el a n á lis is de los m ú scu lo s de la p ie rna , las á re a s a x ia le s se a ñ a d ie ro n y se m u ltip lica ro n p o r el g ro s o r de co rte de 1,25 m m p a ra o b te n e r el v o lu m e n c a rd ia c o to ta l p a ra c a d a an im a l. No se o b se rvó c a m b io s ig n ifica tivo en el v o lu m e n c a rd ia c o p o r M R I.
Estadísticas
Las d ife re n c ia s e n tre g ru p o s se e va lu a ro n u sa n d o el an á lis is e m p a re ja d o de 2 co la s con el e n s a y o T de S tud en t.
E je m p lo 14 - E f ic a c ia d e P R D -1474 en e l c re c im ie n to m u s c u la r in vivo
Los ra ton es B 6.S C ID m ach o (n = 10 /g rup o) se m a n tu v ie ro n y tra ta ro n co m o se d e sc rib e en el E je m p lo 10, con la e xce p c ió n de qu e P R D -1474 se a d m in is tró a las d iv e rs a s do s is ta l co m o se in d ica en la F ig . 16, y la d u ra c ió n del tra ta m ie n to fu e de 28 d ía s . P R D -1474 a 1 m g/kg m ostró un a u m e n to s ig n ifica tivo de un 11,1 % en el v o lu m e n de l m uslo de la p ie rn a in fe rio r en c o m p a ra c ió n con el g ru p o de c o n tro l de PBS (p < 0 ,0001 ). T a m b ié n se o b se rva ro n a u m e n to s s ig n ifica tivo s en el v o lu m e n de l m ú scu lo de la p ie rn a in fe rio r de un 27 ,7 % , un 29 ,7 % , y un 32 ,8 % con P R D -1474 a 10 m g /kg , 30 m g/kg , y 100 m g /kg , re sp e c tiva m e n te . No se o b s e rv ó c a m b io en el v o lu m e n c a rd ia c o en to d o s los g ru p o s de d o s is de tra ta m ie n to con re sp e c to al con tro l. Los d a to s se p re se n ta n co m o m e d ia ± d e sv ia c ió n e s tá n d a r. Los d iv e rs o s g ru p o s de d o s ifica c ió n se c o m p a ra ro n u sa n d o A N O V A . (*p < 0 ,0001 ; #no s ig n ific a tiv a en tre g ru po s).
Los d a to s d e m u e s tra n q u e las A d n e c tin a s a n ti-m io s ta tin a de la in ve n c ió n son e fic a c e s a d o s ific a c io n e s s ig n ific a tiv a m e n te m e n o re s qu e los in h ib id o re s de m io s ta tin a q u e se han d e sc rito a n te rio rm e n te (p. e j., d o c u m e n to s U S 7632499 , J. Clin. Onclo. 30 (S up l): A bstr. 2516 , 2012). P o r lo tan to , las A d n e c tin a s a n ti-m io s ta tin a de la in venc ión p ro p o rc io n a n un a u m e n to de la e fic a c ia a d o s ific a c io n e s m ás ba ja s c o m b in a d a s con la d ism in u c ió n de e fe c to s se c u n d a rio s no d e se a d o s , c u a n d o se a d m in is tra n so las o en c o m b in a c ió n con o tro s in h ib id o re s de m io s ta tin a o tros fá rm a co s , p a ra tra ta r e l d e b ilita m ie n to m u s c u la r y e n fe rm e d a d e s m e ta b ó lica s q u e se d e sc rib e n en la p re se n te m em o ria .

Claims (15)

R E IV IN D IC A C IO N E S
1. Un polipéptido que comprende un décimo dominio de fibronectina de tipo III (10Fn3), en donde el polipéptido se une a miostatina con una Kd inferior a 500 nM y uno de los bucles BC, DE y FG del dominio 10Fn3 tiene una sustitución de aminoácido con respecto a las secuencias de aminoácidos respectivas de las SEQ ID NO: 34, 39 y 75, respectivamente, y en donde
(a) la sustitución de un aminoácido está en el bucle BC, en donde
(i) la serina en la posición 3 del bucle BC (SEQ ID NO: 34) está sustituida con un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en C, F, I, V, W e Y;
(ii) la histidina en la posición 6 del bucle BC (SEQ ID NO: 34) está sustituida con un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en C, D, E, F, G, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W e Y;
(iii) la glutamina en la posición 7 del bucle BC (SEQ ID NO: 34) está sustituida con un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, R, S, T, V, W e Y;
(iv) la lisina en la posición 9 del bucle BC (SEQ ID NO: 34) está sustituida con un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, C, G, H, I, L, M, N, Q, R, S, V, W e Y;
(v) la alanina en la posición 10 del bucle BC (SEQ ID NO: 34) está sustituida con un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en G, L, M y S; o
(vi) la asparagina en la posición 11 del bucle BC (SEQ ID NO: 34) está sustituida con un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en C, H, Q, S e Y;
(b) la sustitución de un aminoácido está en el bucle DE, en donde
la valina en la posición 5 del bucle DE (SEQ ID NO: 39) está sustituida con un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en C, E, I, L, M, Q y T; o
(c) la sustitución de un aminoácido está en el bucle FG, en donde
(i) la valina en la posición 2 del bucle FG (SEQ ID NO: 75) está sustituida con un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, C, I, L y M;
(ii) la treonina en la posición 3 del bucle FG (SEQ ID NO: 75) está sustituida con un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en C, F, H, I, L, M, Q, R, S, V, W e Y;
(iii) el ácido aspártico en la posición 4 del bucle FG (SEQ ID NO: 75) está sustituido con un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, S, T, V, W e Y;
(iv) la treonina en la posición 5 del bucle FG (SEQ ID NO: 75) está sustituida con un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, C, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, V, W e Y;
(v) la glicina en la posición 6 del bucle FG (SEQ ID NO: 75) está sustituida con un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, D, E, F, H, I, L, M, N, Q, S, T, V, W e Y;
(vi) la tirosina en la posición 7 del bucle FG (SEQ ID NO: 75) está sustituida con un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en C, F, I, L, M, P, T, V y W;
(xii) la leucina en la posición 8 del bucle FG (SEQ ID NO: 75) está sustituida con un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en C, F, H, I, L, M, N, Q, R, T, V, W e Y;
(xiii) la lisina en la posición 9 del bucle FG (SEQ ID NO: 75) está sustituida con un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, C, E, F, G, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y;
(ix) la tirosina en la posición 10 del bucle FG (SEQ ID NO: 75) está sustituida con W; o
(x) la lisina en la posición 11 del bucle FG (SEQ ID NO: 75) está sustituida con un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, C, D, E, G, H, L, M, N, P, Q, R, S, T y V.
2. El polipéptido de la reivindicación 1, en donde
(a) la sustitución de un aminoácido está en el bucle BC y en donde
(i) la serina en la posición 3 del bucle BC (SEQ ID NO: 34) está sustituida con un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en F y W;
(ii) la histidina en la posición 6 del bucle BC (SEQ ID NO: 34) está sustituida con un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en C, F, G, I, K, L, M, N, R, S, T, V, W e Y;
(iii) la glutamina en la posición 7 del bucle BC (SEQ ID NO: 34) está sustituida con un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, C, E, F, H, I, K, L, M, P, R, S, T, V e Y;
(iv) la lisina en la posición 9 del bucle BC (SEQ ID NO: 34) está sustituida con un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, C, H, L, M, N, R, V, W e Y;
(v) la alanina en la posición 10 del bucle BC (SEQ ID NO: 34) está sustituida con un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en G y L;
(vi) la asparagina en la posición 11 del bucle BC (SEQ ID NO: 34) está sustituida con un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en H y Q;
(b) la sustitución de un aminoácido está en el bucle DE, en donde
(vii) la valina en la posición 5 del bucle DE (SEQ ID NO: 39) está sustituida con un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en C, E, I, L y M; o
(c) la sustitución de un aminoácido está en el bucle FG, en donde
(i) la valina en la posición 2 del bucle FG (SEQ ID NO: 75) está sustituida con I;
(ii) la treonina en la posición 3 del bucle FG (SEQ ID NO: 75) está sustituida con un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en C, F, I, L, M, V, W e Y;
(iii) el ácido aspártico en la posición 4 del bucle FG (SEQ ID NO: 75) está sustituido con un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, C, E, F, G, H, I, L, M, N, Q, S, T y V;
(iv) la treonina en la posición 5 del bucle FG (SEQ ID NO: 75) está sustituida con un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, C, F, G, I, L, M, N, Q, S, T, V, W e Y;
(v) la glicina en la posición 6 del bucle FG (SEQ ID NO: 75) está sustituida con un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, S, T y W;
(vi) la tirosina en la posición 7 del bucle FG (SEQ ID NO: 75) está sustituida con un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en F, I, V y W;
(vii) la leucina en la posición 8 del bucle FG (SEQ ID NO: 75) está sustituida con un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en F, H, I, M, V, W e Y;
(viii) la lisina en la posición 9 del bucle FG (SEQ ID NO: 75) está sustituida con un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, C, F, G, I, L, M, T, V y W;
(ix) la tirosina en la posición 10 del bucle FG (SEQ ID NO: 75) está sustituida con W; o
(x) la lisina en la posición 11 del bucle FG (SEQ ID NO: 75) está sustituida con un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A, G, K, M, P, Q y R.
3. El polipéptido de la reivindicación 1 o 2, en donde el dominio 10Fn3 comprende además una secuencia de extensión N-terminal que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 307.
4. El polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde el dominio 10Fn3 comprende además una secuencia de extensión C-terminal que comprende la secuencia de aminoácidos EI.
5. El polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica al menos en un 90 % a una cualquiera de las SEQ ID NO: 331,273, 281 o 118.
6. El polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, que comprende adicionalmente uno o más restos farmacocinéticos (PK) seleccionados del grupo que consiste en polietilenglicol, ácido siálico, Fc, fragmento de Fc, transferrina, albúmina de suero, una proteína de unión a albúmina de suero y una proteína de unión a inmunoglobulina en suero.
7. El polipéptido de la reivindicación 6, en donde el resto PK y el polipéptido están unidos mediante un conector que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 181-187.
8. El polipéptido de la reivindicación 7, en donde el resto PK es un Fc.
9. Una composición que comprende el polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
10. Una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 y 7.
11. Una célula que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 10.
12. El polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8 o la composición de la reivindicación 9, para su uso en un método de tratamiento de un trastorno muscular, neurológico o metabólico asociado con desgaste muscular y/o atrofia muscular, o un trastorno degenerativo óseo.
13. El polipéptido o composición para su uso según la reivindicación 12, en donde el sujeto tiene una distrofia muscular.
14. El polipéptido o composición para su uso según la reivindicación 13, en donde el sujeto tiene distrofia muscular de Duchenne.
15. El polipéptido o composición para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 12-14, en donde el polipéptido consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 273.
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