MX2015002894A - Proteinas de dominio de soporte basadas en fibronectina que se fijan a miostatina. - Google Patents

Proteinas de dominio de soporte basadas en fibronectina que se fijan a miostatina.

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Abstract

La presente invención se refiere a proteínas del dominio de soporte basadas en fibronectina que se fijan a miostatina. También, el uso de estas proteínas en aplicaciones terapéuticas para tratar distrofia muscular, caquexia, sarcopenia, osteoartritis, osteoporosis, diabetes, obesidad, EPOC, nefropatía crónica, insuficiencia cardíaca, infarto de miocardio y fibrosis. También, células que comprenden esas proteínas, polinucleótidos que codifican esas proteínas o fragmentos de estas, y vectores que comprenden los polinucleótidos que codifican las proteínas.

Description

PROTEÍNAS DEL DOMINIO DE SOPORTE BASADAS EN FIBRONECTINA QUE SE FIJAN A MIOSTATINA Campo de la Invención La presente invención se refiere a proteínas del dominio de soporte basadas en fibronectina que se fijan a miostatina. La invención también se refiere al uso de proteínas innovadoras en aplicaciones terapéuticas para tratar enfermedades de atrofia muscular progresiva y trastornos metabólicos. La invención también se refiere a células que comprenden esas proteínas, polinucleótidos que codifican esas proteínas o fragmentos de estas, y a vectores que comprenden los polinucleótidos que codifican las proteínas de la invención.
Antecedentes de la Invención La miostatina, también conocida como factor de crecimiento y diferenciación 8 (GDF-8, por sus siglas en inglés), es un miembro de la superfamilia del factor de crecimiento transformante b (TGF-b) de factores de crecimiento segregados. La miostatina tiene todas las características estructurales comunes a las proteínas de la familia TGF-b: un amino terminal hidrófobo que actúa como una señal secretora, nueve residuos de cisteína invariables y un sitio de procesamiento proteolítico tipo furina "RXXR". La escisión proteolítica de la proteína produce el dominio del REF.: 254728 C-terminal que forma un homodímero que es la forma biológicamente activa de la miostatina (Thies et al., Growth Factors 2001; 18(4):251-9). Las alineaciones del fragmento del C-terminal de las secuencias de aminoácidos de miostatina de múltiples especies de vertebrados revelan que la proteína es altamente conservada (100 % de identidad) en seres humanos, monos, vacas, perros, ratones, ratas, pavos y gallinas (McPherron, et al. PNAS, 94:12457-61, 1997).
La expresión de la miostatina se limita principalmente al tejido músculo esqueleto y adiposo, donde se demostró que es un regulador negativo del desarrollo del músculo esqueleto (Lee LS, Immunol Endocr Metab Agente Med Chem. 2010; 10:183-194). En los mamíferos, el músculo esqueleto pareciera ser el tejido objetivo principal de la miostatina, donde se fija a los receptores de la superficie celular y produce pérdida muscular. Los ratones y el ganado con deficiencias genéticas de miostatina exhiben drásticos aumentos de la masa muscular esquelética, es decir, el fenotipo "doble músculo", lo cual respalda la función de la miostatina en la supresión del desarrollo muscular (McPherron y Lee, Proc Nati Acad Sci USA. 23 de diciembre de 2003; 100(26):15842-6). La hipertrofia muscular en las razas de ganado azul belga y piemontese se debe a la mutación sin sentido dentro del tercer exón del gen de miostatina bovino (Bass et. al., Domes t Anim Endocrinol . 1999; 17(2-3):191-7).
La sobreexpresión transgénica de los inhibidores de miostatina también da como resultado la hipermusculación. La mejora del desarrollo muscular en estos animales se debe a un aumento de la proliferación celular o del desarrollo hiperplásico, y al crecimiento celular o desarrollo hipertrófico, lo cual genera miofibras más grandes y pesadas. También se reportó un aumento de la masa muscular esquelética debido a una mutación de miostatina en seres humanos. La inhibición de miostatina aumenta eficazmente la fuerza y la masa muscular esquelética, tanto en el periodo posnatal como en adultos.
El aumento de la fuerza y la masa muscular esquelética también está asociado a las adaptaciones metabólicas que afectan de manera positiva la composición corporal, el gasto energético, la homeostasis de la glucosa y los requerimientos de insulina. Los descubrimientos genéticos y farmacológicos indican que la miostatina regula el metabolismo energético y que su inhibición puede atenuar considerablemente la progresión de enfermedades metabólicas, que incluyen obesidad y diabetes. Por ejemplo, los ratones con inactivación de miostatina exhiben una menor acumulación de grasa corporal (McPherron & Lee, J. JCI 109: 595, 2002) en comparación con los ratones de tipo silvestre de la misma edad. Esta reducción de la grasa corporal es una manifestación de la reducción de la cantidad y del tamaño de adipocitos, lo cual implica que la miostatina cumple una función importante en la adipogénesis y en la miogénesis.
En consecuencia, la miostatina es un objetivo deseable para la intervención terapéutica o profiláctica para el tratamiento de trastornos o afecciones que se beneficiarían de un aumento de la masa muscular, la fuerza muscular y/o el metabolismo (por ejemplo, distrofia muscular, fragilidad, atrofia por inactividad y caquexia), trastornos asociados a la atrofia muscular progresiva (por ejemplo, enfermedades renales o insuficiencia cardíaca, y enfermedades hepáticas) y trastornos metabólicos (por ejemplo, diabetes tipo II, síndrome metabólico, obesidad y osteoartritis).
En consecuencia, sería ventajoso obtener mejores proteínas de soporte del dominio de fibronectina que se fijan a miostatina para el tratamiento terapéutico, por ejemplo, de trastornos metabólicos, atrofia muscular progresiva y pérdida muscular por inactividad.
Breve Descripción de la Invención La presente invención se basa, al menos en parte, en el descubrimiento de adnectinas que se fijan a miostatina y la antagonizan. Específicamente, las adnectinas antimiostatina de la presente invención inhiben la actividad de miostatina, lo cual afecta la señalización de SMAD corriente abajo. Un mecanismo que justifica la señalización alterada de SMAD de algunas de las adnectinas antimiostatina de la invención consiste en la inhibición del reclutamiento de Alk4 en el complejo de miostatina-ActRIIb, cuyas consecuencias fisiológicas son aumento del volumen muscular y del peso corporal.
En un aspecto, la invención proporciona un polipéptido que comprende un dominio de fibronectina tipo III a la décima (10Fn3), en donde 10Fn3 tiene al menos un bucle seleccionado de los bucles BC, DE y FG con una secuencia de aminoácidos alterada con respecto a la secuencia del bucle correspondiente del dominio 10Fn3 humano, y en donde el polipéptido se fija a miostatina. En ciertas modalidades, el polipéptido se fija a miostatina con una KD menor de 500 nM.
En algunas modalidades, el bucle BC del polipéptido de la invención comprende una secuencia de aminoácidos de conformidad con la Fórmula X1-L-P-X2-X3-X4-X5-X6-X7, en donde (a) Xi se selecciona del grupo que consiste en S, T e Y; (b) X2 se selecciona del grupo que consiste en H, Y, N, R, F, G, S y T; (c) X3se selecciona del grupo que consiste en A, P, Q, S, F, H, N y R; (d) X4 se selecciona del grupo que consiste en G y A; (e) X5 se selecciona del grupo que consiste en H, L, R, V, N, D, F, I y K; (f) & se selecciona del grupo que consiste en A, L, G, M, F, I y V; y (g) X7 se selecciona del grupo que consiste en H y N. En ciertas modalidades, Xi es S, y/o X2 es H o Y, y/o X3 es A o P, y/o X4 es G, y/o X5 es H, L o R, y/o X6 es A o L, y/o Xi es H.
En otras modalidades, el bucle BC comprende una secuencia de aminoácidos de conformidad con la Fórmula Xi9-X20-P-X21-G-X22-A, en donde (a) X19 se selecciona del grupo que consiste en D, E, V y W; (b) X20 se selecciona del grupo que consiste en A, S y V; (c) X21 se selecciona del grupo que consiste en R, A, G, K y L; y (d) X22 se selecciona del grupo que consiste en L y R. En ciertas modalidades, X19 es D, y/o X20 es A, S o V, y/o X22 es L.
En algunas modalidades, el bucle DE comprende una secuencia de aminoácidos de conformidad con la Fórmula G-R-G-Xs, en donde Xs es V o L.
En algunas modalidades, el bucle DE comprende una secuencia de aminoácidos de conformidad con la Fórmula X23-G-R-G-X24, en donde (a) X23 se selecciona del grupo que consiste en V, P, F, I y L; y (b) X24 se selecciona del grupo que consiste en S, N y T.
En algunas modalidades, el bucle FG del polipéptido de la invención comprende una secuencia de aminoácidos de conformidad con la Fórmula X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18, en donde (a) Xg se selecciona del grupo que consiste en L, V e I; (b) X10 se selecciona del grupo que consiste en T y S; (c) Xn se selecciona del grupo que consiste en K, R, A, G, S, D, H, N, T y P; (d) X12 se selecciona del grupo que consiste en S, T, A, E, H, K y N; (e) X13 se selecciona del grupo que consiste en K, G, Q, D, E, N, T y S; (f) Xi4 se selecciona del grupo que consiste en V, I, F, L, M, P, T e Y; (g) X15 se selecciona del grupo que consiste en I, L e Y; (h) Xi6 se selecciona del grupo que consiste en H, I, V, K, L, R, F, G, S y T; (i) X17 se selecciona del grupo que consiste en Y y H; y (j) Xi8 se selecciona del grupo que consiste en K, M, L, R y V.
En ciertas modalidades, X9 es L o V, y/o X10 es T, X11 es K o R, y/o X12 es S o T, y/o X13 es K, G o Q, y/o X14 es V o I, y/o X15 es I, y/o Xi6 es H, l o V, y/o X17 es Y y/o Xis es K o M.
En otras modalidades, el bucle FG comprende una secuencia de aminoácidos de conformidad con la Fórmula X25-X26-R-X27-G-X28-X29-X30-X31-X32, en donde (a) X25 se selecciona del grupo que consiste en I y V; (b) X26 se selecciona del grupo que consiste en F, D e Y; (c) X27 se selecciona del grupo que consiste en D y T; (d) X28 se selecciona del grupo que consiste en P, M, V y T; (e) X29 se selecciona del grupo que consiste en V, L, N, R y S; (f) X30 se selecciona del grupo que consiste en H, T, L, N, Q y S; (g) X31 se selecciona del grupo que consiste en F, W, Y, H y L; y (h) X32 se selecciona del grupo que consiste en D, A y G.
En ciertas modalidades, X25 es I, y/o X26 es F, y/o X27 es D, y/o X2s es P, y/o X29 es V, y/o X30 es H o T, y/o X31 es F o W, y/o X32 es D.
En algunas modalidades, el polipéptido comprende un bucle BC y un bucle DE, o un bucle BC y un bucle FG, o un bucle DE y un bucle FG, o un bucle BC, un bucle DE y un bucle FG.
En algunas modalidades, el bucle BC del polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 7-38. En otras modalidades, el bucle DE comprende un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO: 39-45. Aún en otras modalidades, el bucle FG comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 46-79. En algunas modalidades, la secuencia de aminoácidos de los bucles BC, DE o FG es al menos 80 % idéntica a cualquiera de SEQ ID NO: 7- 38, 39-45 y 46-79, respectivamente. En otras modalidades, el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% idéntica a cualquiera de SEQ ID NO: 80-123, 228-239 y 252-273. Aun en otras modalidades, el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 80-123, 228-239 y 252-273.
En algunas modalidades, los polipéptidos comprenden las combinaciones de bucles BC, DE y FG, que se indican en la Tabla 1. En una modalidad, el polipéptido tiene los bucles BC, DE y FG que se indican en SEQ ID NO: 34, 39 y 75, respectivamente.
En algunas modalidades, el polipéptido comprende los bucles BC, DE y FG que se indican en SEQ ID NO: 34, 39 y 75, respectivamente, en donde el bucle BC tiene 1, 2, 3, 4, 5 o 6 sustituciones de aminoácidos, tales como sustituciones conservadoras de aminoácidos. En algunas modalidades, el bucle BC tiene una secuencia de aminoácidos de conformidad con la Fórmula X33-L-P-X34-X35-X36-X37-X38-X39, en donde X33 es T o Y; X34 es Y, N, R, F, G, S o T; X35es A, P, S, F, H, N o R; X36 es A; X37 es H, L, R, V, N, D, F o I; X38 es L, G, M, F, I o V; y X39 es H.
En algunas modalidades, el polipéptido comprende los bucles BC, DE y FG que se indican en SEQ ID NO: 34, 39 y 75, respectivamente, en donde el bucle DE tiene una sustitución de aminoácidos, tal como una sustitución conservadora de aminoácidos. En algunas modalidades, el bucle DE tiene una secuencia de aminoácidos de conformidad con la Fórmula G-R-G-X40, en donde X40 es L.
En algunas modalidades, el polipéptido comprende los bucles BC, DE y FG que se indican en SEQ ID NO: 34, 39 y 75, respectivamente, en donde el bucle FG tiene 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 sustituciones de aminoácidos, tales como sustituciones conservadoras de aminoácidos. En algunas modalidades, el bucle FG tiene una secuencia de aminoácidos de conformidad con la Fórmula X41-X42-X43-X44-X45-X46-X47-X48-X49-X50, en donde X41 es L o I; X42 es S; X43 es K, R, A, G, S, H, N, T o P; X44 es S, A, E, H, K o N; X45 es R, Q, D, E, N, T o S ; X46 es V, I , F , L, M, P o T; X47 es I o Y; X48 es H, I , V, L, R, F, G, S o T ; X49 es H; y X50 es M, L, R o V.
En algunas modalidades, el polipéptido comprende los bucles BC, DE y FG que se indican en SEQ ID NO: 34, 39 y 75, respectivamente, en donde el bucle BC tiene 1, 2, 3, 4, 5 o 6 sustituciones de aminoácidos, tales como sustituciones conservadoras de aminoácidos, y el bucle DE tiene 1 sustitución de aminoácidos, tal como una sustitución conservadora de aminoácidos. En algunas modalidades, el bucle BC tiene una secuencia de aminoácidos de conformidad con la Fórmula X33-L-P-X34-X35-X36-X37-X38-X39, en donde X33 es T o Y; X34 es Y, N, R, F, G, S o T; X35es A, P, S, F, H, N o R; X36 es A; X37 es H, L, R, V, N, D, F o I; X38 es L, G, M, F, I o V; y X39 es H y el bucle DE tiene una secuencia de aminoácidos de conformidad con la Fórmula G-R-G-X40, en donde X40 es L.
En algunas modalidades, el polipéptido comprende los bucles BC, DE y FG que se indican en SEQ ID NO: 34, 39 y 75, respectivamente, en donde el bucle BC tiene 1, 2, 3, 4, 5 o 6 sustituciones de aminoácidos, tales como sustituciones conservadoras de aminoácidos, y el bucle FG tiene 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 sustituciones de aminoácidos, tales como sustituciones conservadoras de aminoácidos. En algunas modalidades, el bucle BC tiene una secuencia de aminoácidos de conformidad con la Fórmula X33-L-P-X34-X35-X36-X37-X38-X39, en donde X33 es T o Y; X34 es Y, N, R, F, G, S o T; X35es A, P, S, F, H, N o R; X36 es A; X37 es H, L, R, V, N, D, F o I; X38 es L, G, M, F, I o V; y X39 es H, y el bucle FG tiene una secuencia de aminoácidos de conformidad con la Fórmula X41-X42-X43—X44—X45-X46—X47—X48-X49—X5o, en donde X41 es L o I; X42 es S; X43 es K, R, A, G, S, H, N, T o P; X44 es S, A, E, H, K o N; X45 es K, Q, D, E, N, T o S; X46 es V, I, F, L, M, P O T; X47 es I o Y; X48 es H, I, V, L, R, F, G, S o T; X49 es H; y X50 es M, L, R o V.
En algunas modalidades, el polipéptido comprende los bucles BC, DE y FG que se indican en SEQ ID NO: 34, 39 y 75, respectivamente, en donde el bucle DE tiene 1 sustitución de aminoácidos, tal como una sustitución conservadora de aminoácidos, y el bucle FG tiene 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 sustituciones de aminoácidos, tales como sustituciones conservadoras de aminoácidos. En algunas modalidades, el bucle DE tiene una secuencia de aminoácidos de conformidad con la Fórmula G-R-G-X40, en donde X4o es L, y el bucle FG tiene una secuencia de aminoácidos de conformidad con la Fórmula X4i-X42-X43-X44-X45-X4s-X47-X48-X49-X5o, en donde X4i es L o I; X42 es S; X43 es K, R, A, G, S, H, N, T o P; X44 es S, A, E, H, K o N; X45 es K, Q, D, E, N, T o S; X46 es V, I, F, L, M, P O T; X47 es I O Y; X48 es H, I, V, L, R, F, G, S O T; X49 es H; y X50 es M, L, R o V.
En algunas modalidades, el polipéptido comprende los bucles BC, DE y FG que se indican en SEQ ID NO: 34, 39 y 75, respectivamente, en donde el bucle BC tiene 1, 2, 3, 4, 5 o 6 sustituciones de aminoácidos, tales como sustituciones conservadoras de aminoácidos, y el bucle DE tiene 1 sustitución de aminoácidos, tal como una sustitución conservadora de aminoácidos, y el bucle FG tiene 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 sustituciones de aminoácidos, tales como sustituciones conservadoras de aminoácidos . En algunas modalidades, el bucle BC tiene una secuencia de aminoácidos de conformidad con la Fórmula X33-L-P-X34-X35-X36-X37-X38-X39, en donde X33 es T o Y; X34 es Y, N, R, F, G, S o T; X35 es A, P, S, F, H, N o R; X36 es A; X37 es H, L, R, V, N, D, F o I; X38 es L, G, M, F, l o V; y X39 es H; el bucle DE tiene una secuencia de aminoácidos de conformidad con la Fórmula G-R-G-X40, en donde X4o es L; y el bucle FG tiene una secuencia de aminoácidos de conformidad con la Fórmula X41-X42-X43-X44-X45-X46-X47-X48-X49-X50, en donde X41 es L o I; X42 es S; X43 es K, R, A, G, S, H, N, T o P; X44 es S, A, E, H, K o N; X45 es K, Q, D, E, N, T o S; X46 es V, I, F, L, M, P o T; X47 es I o Y; X48 es H, I, V, L, R, F, G, S o T; X49 es H; y X50 es M, L, R o V.
En algunas modalidades, el polipéptido comprende los bucles BC, DE y FG que se indican en SEQ ID NO: 34, 39 y 75, respectivamente y tiene sustituciones de aminoácidos en los bucles BC, DE y FG que permiten que el polipéptido mantenga una fijación a miostatina. Estas sustituciones de aminoácidos se pueden determinar, por ejemplo, mediante barrido de mutación profunda, como se describe en el Ejemplo 8. En consecuencia, en algunas modalidades, el polipéptido tiene un bucle BC que comprende una secuencia de aminoácidos de conformidad con la Fórmula X51-X52-X53-X54-X55-X56-X57-X58-X59, en donde: X51 se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, F, H, I, K, L, N, Q, R, S, T, V, W e Y; X52 se selecciona del grupo que consiste en L, M y V; X53 se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, E, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V e Y; X54 se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W e Y; X55 se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y; X56 se selecciona del grupo que consiste en G y S; X57 se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, X, T, V, W e Y; X58 se selecciona del grupo que consiste en A, C, G, L, M, S y T; y X59 se selecciona del grupo que consiste en A, C, F, H, N, P, Q, R, S e Y. En una modalidad preferida, Xsi se selecciona del grupo que consiste en C, F, I, S, V, W e Y; X52 se selecciona del grupo que consiste en L; X53se selecciona del grupo que consiste en P; X54 se selecciona del grupo que consiste en C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W e Y; X55 se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y; X56 se selecciona del grupo que consiste en G; X57 se selecciona del grupo que consiste en A, C, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, V, W e Y; X58 se selecciona del grupo que consiste en A, G, L, M y S; y X59 se selecciona del grupo que consiste en C, H, N, Q, S e Y. En una modalidad más preferida, X51 se selecciona del grupo que consiste en F, S y W; X52 se selecciona del grupo que consiste en L; X53 se selecciona del grupo que consiste en P; X54 se selecciona del grupo que consiste en C, F, G, I, K, L, M, N, R, S, T, V, W e Y; X55 se selecciona del grupo que consiste en A, C, E, F, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V e Y; X56 se selecciona del grupo que consiste en G; X57 se selecciona del grupo que consiste en A, C, H, K, L, M, N, R, V, W e Y; X58 se selecciona del grupo que consiste en A, G y L; y X59 se selecciona del grupo que consiste en H, N y Q. En una modalidad específica, X51 S; X52 es L; X53 es P; X54 es H; X55 es Q; X56 es G; X57 es K; X58 es A; X59 es N.
En algunas modalidades, el polipéptido comprende un bucle DE que comprende una secuencia de aminoácidos de conformidad con la Fórmula G-R-G-Cbo, en donde Ceo es A, C, D, E, F, I, K, L, M, N, Q, S, T y V. En una modalidad preferida, Xso es C, E, I, L, M, Q, T y V. En una modalidad más preferida, X6o es C, E, I, L, M y V. En una modalidad específica, Ceo es V.
En algunas modalidades, el polipéptido comprende un bucle FG que comprende una secuencia de aminoácidos de conformidad con la Fórmula X61-X62-X63-X64-X65-X66-X67-68-X69-X70, en donde X6i se selecciona del grupo que consiste en A, C, F, I, L, M, Q, T, V, W e Y; Cb2 se selecciona del grupo que consiste en A, C, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W e Y; X63 se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y; X64 se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y; X65 se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R; S, T, V, W e Y; X66 se selecciona del grupo que consiste en A, C, F, H, I, L, M, N, P, S, T, V, W e Y; Xei se selecciona del grupo que consiste en A, C, E, F, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W e Y; Cbb se selecciona del grupo que consiste en A, C D, E F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S T, V, W e Y; X69 se selecciona del grupo que consiste en F, W e Y; y X70 se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y. En una modalidad preferida, Cbi se selecciona del grupo que consiste en A, C, I, L, M y V; X&2 se selecciona del grupo que consiste en C, F, H, I, L, M, Q, R, S, T, V, W e Y; Cb2 se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, S, T, V, W e Y; X64 se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W e Y; X65 se selecciona del grupo que consiste en A, D, E, F, G, H, I, L, M, N, Q, S, T, V, W e Y; Xee se selecciona del grupo que consiste en C, F, I, L, M, P, T, V, e Y; Xei se selecciona del grupo que consiste en C, F, H, I, K, L, M, N, Q, R, T, V, W e Y; Cb8 se selecciona del grupo que consiste en A, C, E, F, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y; b9 se selecciona del grupo que consiste en W e Y; y X70 se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, E, G, H, K, L, M, N, P, Q, R, S, T y V. En una modalidad más preferida, CI se selecciona del grupo que consiste en I y V; X62 se selecciona del grupo que consiste en C, F, I, L, M, T, V, W e Y; Cb3 se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, Q, S, T y V; Cq4 se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, F, G, I, L, M, N, Q, S, T, V, W e Y; Xes se selecciona del grupo que consiste en A, G, S, T y W; Xee se selecciona del grupo que consiste en F, I, V, W e Y; Cbi se selecciona del grupo que consiste en F, H, I, L, M, V, W e Y; Cb8 se selecciona del grupo que consiste en A, C, F, G, I, K, L, M, T, V y W; Xs9 se selecciona del grupo que consiste en W e Y; y X7o se selecciona del grupo que consiste en A, G, K, L, M, P, Q y R. En una modalidad específica, Xsi es V; Cb2 es T; Cb3 es D; X& es T; Cb5 es G; Cbb es Y; Xei es L; Ceb es K; Cb9 es Y; y X7o es K.
En algunas modalidades, el polipéptido de la invención comprende bucles BC, DE y FG, en donde el bucle BC comprende una secuencia de aminoácidos de conformidad con la Fórmula X5i-X52-X53-X54_X55-X56-X57-X58-X59, en donde, X51 se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, F, H, I, K, L, N, Q, R, S, T, V, W e Y; X52 se selecciona del grupo que consiste en L, M y V; X53se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, E, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V e Y; X54 es A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W e Y; X55 se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y; X56 se selecciona del grupo que consiste en G y S; X57 es A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W e Y; X58 es A, C, G, L, M, S y T; y X59 es A, C, F, H, N, P, Q, R, S e Y; el bucle DE comprende una secuencia de aminoácidos de conformidad con la Fórmula G-R-G-X60, en donde Xeo se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, E, F, I, K, L, M, N, Q, S, T y V; y el bucle FG comprende una secuencia de aminoácidos de conformidad con la Fórmula X6i-X62-X63-X64_X65-X66-X67-X68-X69-X70 en donde Cbi se selecciona del grupo que consiste en A, C, F, I, L, M, Q, T, V, W e Y; x62 es A, C, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W e Y; Cb3 se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y; X64 se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y; X65 se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W e Y; X66 se selecciona del grupo que consiste en A, C, F, H, I, L, M, N, P, S, T, V, W e Y; e se selecciona del grupo que consiste en A, C, E, F, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, e Y; X6s se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y; X69 se selecciona del grupo que consiste en F, W e Y; y X70 se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y.
En una modalidad preferida, el polipéptido de la invención comprende bucles BC, DE y FG, en donde el bucle BC comprende una secuencia de aminoácidos de conformidad con la Formula X5i-X52- 53-X54-X55-X56_X57-X58_X59, en donde, X51 se selecciona del grupo que consiste en C, F, I, S, V, W e Y; X52 es L; X53es P; X54 se selecciona del grupo que consiste en C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W e Y; X55 se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y; X5e es G; X57 se selecciona del grupo que consiste en A, C, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, V, W e Y; X5s se selecciona del grupo que consiste en A, G, L, M y S; y X59 se selecciona del grupo que consiste en C, H, N, Q, S e Y; el bucle DE comprende una secuencia de aminoácidos de conformidad con la Fórmula G-R-G-X60, en donde Cbo se selecciona del grupo que consiste en C, E, I, L, M, Q, T y V; y el bucle FG comprende una secuencia de aminoácidos de conformidad con la Fórmula X61-62-X63-X64-65-X66-X67-68-X69-X7o, en donde Cbi se selecciona del grupo que consiste en A, C, I, L, M y V; X62 es C, F, H, I, L, M, Q, R, S, T, V, W e Y; X63 se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, S, T, V, W e Y; Xe4 se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W e Y; Cd5 se selecciona del grupo que consiste en A, D, E, F, G, H, I, L, M, N, Q, S, T, V, W e Y; XS6 se selecciona del grupo que consiste en C, F, I, L, M, P, T, V, W e Y; Cb7 se selecciona del grupo que consiste en C, F, H, I, K, L, M, N, Q, R, T, V, W e Y; Cbb se selecciona del grupo que consiste en A, C, E, F, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y; Cd9 se selecciona del grupo que consiste en W e Y; y X70 se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y.
En una modalidad más preferida, el polipéptido de la invención comprende bucles BC, DE y FG, en donde el bucle BC comprende una secuencia de aminoácidos de conformidad con la Fórmula X5i-X52-X53-X54-X55-X56-X57-X58-X59 en donde, X51 se selecciona del grupo que consiste en F, S y W; X52 es L; X53es P; X54 se selecciona del grupo que consiste en C, F, G, I, K, L, M, N, R, S, T, V, W e Y; X55 se selecciona del grupo que consiste en A, C, E, F, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V e Y; X56 es G; X57 se selecciona del grupo que consiste en A, C, H, K, L, M, N, R, V, W e Y; X5s se selecciona del grupo que consiste en A, G y L; y X59 se selecciona del grupo que consiste en H, N y Q; el bucle DE comprende una secuencia de aminoácidos de conformidad con la Fórmula G-R-G-X60, en donde Xeo se selecciona del grupo que consiste en C, E, I, L, M y V; y el bucle FG comprende una secuencia de aminoácidos de conformidad con la Fórmula X61-X62-X63-X64-X65-X66-X67-X68-X69-X70, en donde Cbi se selecciona del grupo que consiste en I y V; X62 es C, F, I, L, M, T, V, W e Y; Xei se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, Q, S, T y V; X64 se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, F, G, I, L, M, N, Q, S, T, V, W e Y; Cb5 se selecciona del grupo que consiste en A, G, S, T y W; Xee se selecciona del grupo que consiste en F, I, V, W e Y; Cb7 se selecciona del grupo que consiste en F, H, I, L, M, V, W e Y; Cbb se selecciona del grupo que consiste en A, C, F, G, I, K, L, M, T, V y W; Cb9 se selecciona del grupo que consiste en W e Y; y X70 se selecciona del grupo que consiste en A, G, K, L, M, P, Q y R.
En una modalidad específica, el polipéptido de la invención comprende bucles BC, DE y FG, en donde el bucle BC comprende una secuencia de aminoácidos de conformidad con la Fórmula X5i-X52-X53-X54-X55-X56_X57-X58-X59, en donde, X51 es S; X52 es L; X53es P; X54 es H; X55 es Q; X56 es G; X57 es K; X58 es A; X59 es N; el bucle DE comprende una secuencia de aminoácidos de conformidad con la Fórmula G-R-G-X60, en donde Ceo es V; y el bucle FG comprende una secuencia de aminoácidos de conformidad con la Fórmula X61-X62-X63-X64-X65-X66-X67-X68-X69-X70, en donde Cei es V; Cb2 es T; Cb3 es D; Ce4 es T; Cb5 es G; Cbb es Y; X67 es L; Cbb es K; X69 es Y; y X70 es K.
En otra modalidad, el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 273 [PRD-1474], SEQ ID NO: 118 [3116_A06], SEQ ID NO: 281 [secuencia de adnectina del núcleo de PRD-1474 y 3116_A06, precedida por una secuencia de extensión del N-terminal (GVSDVPRDL) y seguida por una cola del C-terminal (El)] o SEQ ID NO: 331 [secuencia de adnectina del núcleo de PRD-1474 y 3116_A06 sin una secuencia líder del N-terminal o una cola del C-terminal]. Aun en otra modalidad, el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100% idéntica a las regiones de bucles que no son BC, DE ni FG de SEQ ID NO: 118, 273, 281 o 331.
En otro aspecto, la invención proporciona polipéptidos que se fijan a un sitio de fijación de adnectina discontinuo en la miostatina. En algunas modalidades, los polipéptidos se fijan a una región en los aminoácidos 55-66 de la miostatina (SEQ ID NO: 3). En algunas modalidades, los polipéptidos se fijan a una región en los aminoácidos 85-101 de la miostatina (SEQ ID NO: 3). Aún en otras modalidades, los polipéptidos se fijan en dos regiones, aminoácidos 85-101 y 55-66, de la miostatina (SEQ ID NO: 3).
En algunas modalidades, los polipéptidos de la invención no compiten por la fijación a miostatina con ActRIIB. En algunas modalidades, los polipéptidos de la invención compiten por la fijación a miostatina con ALK4 y/o ALK5 .
En algunas modalidades, los polipéptidos antes descritos pueden comprender una o más porciones farmacocinéticas (PK), tales como polietilenglicol, ácido siálico, Fe, fragmento Fe, transferrina, albúmina de suero, una proteína de fijación a la albúmina de suero y una proteína de fijación a la inmunoglobulina de suero. En una modalidad, la porción PK es una proteína de fijación a la albúmina de suero que comprende un dominio 10Fn3 que se fija, por ejemplo, a HSA. En otra modalidad, la porción PK es Fe y puede estar en el N- o C-terminal del polipéptido y, opcionalmente, formar un dímero. Aún en otras modalidades, la porción PK es polietilenglicol. En algunas modalidades, la porción PK y el polipéptido se enlazan mediante al menos un puente de disulfuro, un enlace peptídico, un polipéptido, un azúcar polimérico o una porción de polietilenglicol.
En otro aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un polipéptido descrito con anterioridad, que es opcionalmente libre de endotoxinas.
En otro aspecto, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un polipéptido descrito con anterioridad, un vector de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos y una célula que comprende el ácido nucleico que codifica el polipéptido. En otro aspecto, la invención proporciona un método para producir el polipéptido antimiostatina mediante el cultivo de la célula.
En otro aspecto, la invención proporciona un método para atenuar o inhibir una enfermedad o trastorno relacionados con miostatina en un sujeto mediante la administración de una cantidad eficaz del polipéptido o composición que comprende un polipéptido descrito con anterioridad. En algunas modalidades, la enfermedad que se desea tratar es distrofia muscular, esclerosis lateral amiotrófica, miositis por cuerpos de inclusión (IBM, por sus siglas en inglés), enfermedad pulmonar obstructiva congestiva, insuficiencia cardíaca crónica, cáncer, SIDA, insuficiencia renal, nefropatía crónica, uremia, artritis reumatoide, sarcopenia, atrofia muscular progresiva por reposo prolongado, lesión de la médula espinal, apoplejía, fractura ósea, envejecimiento, diabetes, obesidad, hiperglucemia, caquexia, osteoartritis, osteoporosis, infarto de miocardio o fibrosis.
En otro aspecto, la invención proporciona un método para atenuar o inhibir un trastorno asociado a la degeneración o a la atrofia muscular progresiva en un sujeto.
En otro aspecto, la invención proporciona un método para administrar el polipéptido para aumentar la masa muscular, la cantidad de células musculares, el tamaño de las células musculares, la fuerza muscular, el rendimiento físico y/o la resistencia en el sujeto.
En otro aspecto, la invención proporciona un método para atenuar o inhibir un trastorno metabólico en un sujeto.
En algunas modalidades, el trastorno metabólico es diabetes (por ejemplo, diabetes tipo II), hiperglucemia, hiperinsulinemia, hiperlipidemia, resistencia a la insulina, intolerancia a la glucosa, lipodistrofia, obesidad o síndrome metabólico. En algunas modalidades, se puede administrar una segunda composición terapéutica. En otras modalidades, la administración del polipéptido da como resultado una mayor sensibilidad a la insulina, mayor absorción celular de la glucosa, niveles más bajos de glucosa en sangre y/o menor grasa corporal.
En otro aspecto, la invención proporciona un método para mejorar la masa muscular magra en un sujeto, que comprende administrar una cantidad eficaz de un polipéptido o una composición descritos anteriormente.
En otro aspecto, la invención proporciona un método para aumentar la relación entre la masa muscular magra y la grasa en un sujeto, que comprende administrar una cantidad eficaz de un polipéptido o una composición descritos anteriormente.
En otro aspecto, la invención proporciona kits que comprenden un polipéptido o una composición descritos anteriormente e instrucciones de uso.
En otro aspecto, la invención proporciona métodos para detectar o medir la miostatina en una muestra, que comprenden poner en contacto la muestra con un polipéptido descrito anteriormente y detectar o medir la fijación del polipéptido a la miostatina.
En otro aspecto, la invención se refiere a adnectinas de fijación a antimiostatina para atenuar o inhibir una enfermedad o un trastorno relacionados con miostatina, atenuar o inhibir un trastorno asociado a la degeneración o a la atrofia muscular progresiva, aumentar la masa muscular, aumentar la cantidad de células musculares, aumentar el tamaño de las células musculares, aumentar la fuerza muscular, el rendimiento y/o la resistencia física, atenuar o inhibir un trastorno metabólico, aumentar la masa muscular magra y/o aumentar la relación entre la masa muscular magra y la grasa en un sujeto.En algunas modalidades, las adnectinas antimiostatina son las que se describen en la presente, por ejemplo, las adnectinas antimiostatina indicadas en SEQ ID NO: 80-123, 228-239 y 252-273.
En otro aspecto, la invención se refiere al uso de adnectinas de fijación a antimiostatina para preparar un medicamento para atenuar o inhibir una enfermedad o un trastorno relacionados con miostatina, atenuar o inhibir un trastorno asociado a la degeneración o a la atrofia muscular progresiva, aumentar la masa muscular, aumentar la cantidad de células musculares, aumentar el tamaño de las células musculares, aumentar la fuerza muscular, el rendimiento y/o la resistencia física, atenuar o inhibir un trastorno metabólico, aumentar la masa muscular magra y/o aumentar la relación entre la masa muscular magra y la grasa en un sujeto. En algunas modalidades, las adnectinas antimiostatina son las que se describen en la presente, por ejemplo, las adnectinas antimiostatina indicadas en SEQ ID NO: 80-123, 228-239 y 252-273.
Breve Descripción de las Figuras La Figura 1 muestra una alineación de secuencias de aminoácidos de adnectina antimiostatina de ejemplo. Las secuencias de aminoácidos de los bucles BC, DE y FG se identifican con subrayado, cursiva/subrayado o negrita/subrayado, respectivamente.
La Figura 2 representa un análisis basado en WebLogo de los diversos residuos del bucle BC de la familia 1979_B06 de adnectinas antimiostatina. Se indica la frecuencia de aminoácidos en cada posición del bucle BC que variaron durante la PROfusión. La imagen se creó con WebLogo (Crooks GE, Hon G, Chandonia JM, Brenner SE. WebLogo: A sequence logo generator. Genome Research 2004; 14:1188-1190).
La Figura 3 representa un análisis basado en WebLogo de los diversos residuos del bucle DE de la familia 1979_B06 de adnectinas antimiostatina. Se indica la frecuencia de aminoácidos en cada posición del bucle DE que variaron durante la PROfusión.
La Figura 4 representa un análisis basado en WebLogo de los diversos residuos del bucle FG de la familia 1979_B06 de adnectinas antimiostatina. Se indica la frecuencia de aminoácidos en cada posición del bucle FG que variaron durante la PROfusión.
La Figura 5 representa un análisis basado en WebLogo de los diversos residuos del bucle BC de la familia 2062_G02 de adnectinas antimiostatina. Se indica la frecuencia de aminoácidos en cada posición del bucle BC que variaron durante la PROfusión.
La Figura 6 representa un análisis basado en WebLogo de los diversos residuos del bucle DE de la familia 2062_G02 de adnectinas antimiostatina. Se indica la frecuencia de aminoácidos en cada posición del bucle DE que variaron durante la PROfusión.
La Figura 7 representa un análisis basado en WebLogo de los diversos residuos del bucle FG de la familia 2062_G02 de adnectinas antimiostatina. Se indica la frecuencia de aminoácidos en cada posición del bucle FG que variaron durante la PROfusión.
La Figura 8 representa un gráfico que muestra la correlación entre los datos bioquímicos y celulares de proteínas mutantes de alanina de adnectina 3116_A06 diferenciadas, y su adaptación relativa en un barrido de mutación profunda de conformidad con la posición de la secuencia.
La Figura 9 representa un gráfico que muestra la correlación entre ERnorma del barrido de mutación profunda de NGS de mutaciones de alanina de adnectina 3116_A06 y el IC5o medido mediante HTRF. Se indican intervalos para mutaciones de sitio únicas preferidas, muy preferidas y de máxima preferencia para la fijación a miostatina.
La Figura 10 representa un gráfico de un ensayo de fijación competitiva (ELISA competitivo) que muestra que las adnectinas PRD-1285, PRD-1286 y PRD-1288 no bloquean la fijación de miostatina a ActRIIb-Fc. Se indica el % de competencia de la fijación de ActRIIb-Fc a miostatina. Como se previo, el constructo ActRIIb-Fc de control positivo compitió por la fijación de ActRIIb-Fc a miostatina.
La Figura 11 representa un gráfico que muestra los efectos de varias concentraciones de adnectinas PRD-1285, PRD-1286 y PRD-1288 en la actividad de miostatina en un ensayo de ARE-luciferasa. Las condiciones experimentales son las que se describen en el Ejemplo 3. Cada uno de PRD-1285, PRD-1286 y PRD-1288 inhibió el 100 % de la actividad de ARE-luciferasa inducida por miostatina.
Las Figuras 12A-12B son esquemas que representan el mecanismo de acción mediante el cual las adnectinas de la presente invención inhiben la actividad de miostatina. El complejo de señalización natural se muestra en la Figura 12A. Específicamente, después de la fijación de miostatina a ActRIIb se produce el reclutamiento de la cinasa tipo receptor de activina 4 (ALK4) o ALK5, y ActRIIb y ALK4/5 se fijan a diferentes regiones de miostatina. Las adnectinas de la presente invención evitan la fijación de ALK4/5, pero no de ActRIIb, a la miostatina (Figura 12B).
Las Figuras 13A-13B muestran modelos computacionales que representan el complejo de 3116_A06 y miostatina. La Figura 13A muestra la estructura de miostatina sola (gris), y se indican los sitios de fijación de ALK4 y los sitios de fijación de ActRIIB. Las regiones donde 3116_A06 se fija a miostatina (es decir, las regiones 1 y 2) se indican en negro, según se determinó mediante los experimentos descritos en el Ejemplo 11. La Figura 13B muestra un complejo preferido de 3116_A06 (negro) y miostatina (gris) derivado de un protocolo de acoplamiento como se describe en el Ejemplo 12. Las regiones de miostatina 1 y 2 identificadas mediante HDX-MS (Ejemplo 11) se representan en un modelo de esferas espaciales en un solo lado de la molécula, y los bucles BC, DE y FG de 3116_A06 se representan en un modelo de varillas. Si bien la figura muestra una adnectina fijada a uno de los dos sitios de fijación, debe tenerse en cuenta que pueden estar ocupados uno o ambos sitios de fijación de adnectina.
La Figura 14 representa un gráfico de barras que muestra el porcentaje de aumento del peso corporal el día 15 en ratones tratados con las adnectinas antimiostatina indicadas en comparación con los ratones de control. Los ratones B6 SCID se trataron una vez o dos veces por semana con inyecciones subcutáneas de adnectinas antimiostatina durante 14 días, como se describe en el Ejemplo 13. Los pesos corporales se mmiiddiieerroonn dduurraannttee ttooddoo el periodo de tratamiento; se representa el porcentaje de los valores de cambio calculados el día 15. (*= indica diferencias estadísticas del grupo de control respectivo; p £ 0.01 prueba t).
La Figura 15 representa un gráfico de barras que muestra el aumento del volumen muscular de las patas (en cm3) el día 15 en ratones tratados con las adnectinas antimiostatina indicadas en comparación con los ratones de control. Los ratones B6 SCID se trataron una vez o dos veces por semana con inyecciones subcutáneas de adnectinas antimiostatina durante 14 días, como se describe en el Ejemplo 13. (*= indica diferencias estadísticas del grupo de control respectivo; p £ 0.05 prueba t).
La Figura 16 representa un gráfico de barras que muestra el aumento del volumen muscular de las patas (en cm3) el día 28 en ratones tratados con las diversas dosis indicadas de PRD-1474. Los ratones B6 SCID se trataron una vez o dos veces por semana con inyecciones subcutáneas de PRD-1474 durante 28 días, como se describe en el Ejemplo 14. (*p< 0.0001; # no considerable entre los grupos).
Descripción Detallada de la Invención Definiciones A menos que se definan de otro modo, todos los términos téenicos y científicos que se usan en la presente tienen el mismo significado que le otorga habitualmente una persona experta en la téenica. Si bien se puede usar cualquier método y composición similares o equivalentes a las descritas en la presente para poner en práctica o probar la presente invención, los métodos y las composiciones preferidas se describen en la presente.
Como se usa en la presente, "miostatina de longitud completa" se refiere a la secuencia de polipéptidos de longitud completa descrita en McPherron et al. (1997), supra, así como a polipéptidos de longitud completa relacionados, que incluyen variantes alélicas y homólogos de interespecies. Los términos "miostatina" o "miostatina madura" se refieren a fragmentos de la miostatina madura biológicamente activa, así como a polipéptidos relacionados, que incluyen variantes alélicas, variantes de empalme, y péptidos y polipéptidos de fusión. Según se reporta, la proteína madura del C-terminal tiene 100 % de identidad de secuencia entre varias especies, que incluyen seres humanos, ratones, gallinas, cerdos, pavos y ratas (Lee et al., PNAS 2001; 98:9306). La secuencia de prepromiostatina humana es: MQKLQLCVYIYLFMLIVAGPVDLNENSEQKENVEKEGLCNACTWRQNTKSS RIEAIKIQILSKLRLETAPNISKDVIRQLLPKAPPLRELIDQYDVQRDDSSDGSLEDDDYH ATTETIITMPTESDFLMQVDGKPKCCFFKFSSKIQYNKW KAQLWIYLRPVETPTTVFVQI LRLIKPMKDGTRYTGIRSLKLDMNPGTGIWQSIDVKTVLQNWLKQPESNLGIEIKALDENG HDLAVTFPGPGEDGLNPFLEVKVTDTPKRSRRDFGLDCDEHSTESRCCRYPLTVDFEAFGW DWIIAPKRYKANYCSGECEFVFLQKYPHTHLVHQANPRGSAGPCCTPTKMSPINMLYFNGK EQIIYGKIPAMW DRCGCS (SEQ ID NO: 1) La secuencia de promiostatina humana es: NENSEQKENVEKEGLCNACTWRQNTKSSRIEAIKIQILSKLRLETAPNISK DVIRQLLPKAPPLRELIDQYDVQRDDSSDGSLEDDDYHATTETIITMPTESDFLMQVDGKP KCCFFKFSSKIQYNKW KAQLWIYLRPVETPTTVFVQILRLIKPMKDGTRYTGIRSLKLDM NPGTGIWQSIDVKTVLQNWLKQPESNLGIEIKALDENGHDLAVTFPGPGEDGLNPFLEVKV TDTPKRSRRDFGLDCDEHSTESRCCRYPLTVDFEAFGWDWIIAPKRYKANYCSGECEFVFL QKYPHTHLVHQANPRGSAGPCCTPTKMSPINMLYFNGKEQIIYGKIPAMW DRCGCS (SEQ ID NO: 2) La secuencia de miostatina madura (conservada en seres humanos, murinos, ratas, gallinas, pavos, perros, caballos y cerdos) es: DFGLDCDEHSTESRCCRYPLTVDFEAFGWDWIIAPKRYKANYCSGECEFVF LQKYPHTHLVHQANPRGSAGPCCTPTKMSPINMLYFNGKEQIIYGKIPAMW DRCGCS (SEQ ID NO: 3).
Como se usa en la presente, "polipéptido" se refiere a cualquier secuencia de dos o más aminoácidos, independientemente de la longitud, la modificación posterior a la traducción o la función. "Polipéptido", "péptido" y "proteína" se usan de manera indistinta en la presente. Los polipéptidos pueden incluir aminoácidos naturales y aminoácidos no naturales, como los que se describen en la patente estadounidense N.° 6.559,126, que se incorpora en la presente por referencia. Los polipéptidos también se pueden modificar de varias maneras químicas estándares (por ejemplo, un aminoácido se puede modificar con un grupo protector; el aminoácido del carboxi-terminal se puede convertir en un grupo amida terminal; el residuo amino terminal se puede modificar con grupos para, por ejemplo, mejorar la lipofilicidad; o el polipéptido se puede glucosilar químicamente o modificar de otro modo para aumentar la estabilidad o la semivida in vivo). Las modificaciones de los polipéptidos pueden incluir la fijación de otra estructura, tal como un compuesto cíclico u otra molécula al polipéptido y también pueden incluir polipéptidos que contienen uno o más aminoácidos en una configuración alterada (es decir, R o S; o L o D). Los péptidos de la invención son proteínas que derivan del dominio de fibronectina tipo III a la décima que fueron modificadas para que se fijen a la miostatina y, en la presente, se denominan "adnectina antimiostatina" o "adnectina miostatina".
Como se usa en la presente, una "cadena de polipéptidos" se refiere a un polipéptido en donde cada uno de los dominios se une a otros dominios mediante enlaces peptídicos, a diferencia de las interacciones no covalentes o los puentes de disulfuro.
Un polipéptido "aislado" es aquel que se identificó y separó y/o se recuperó de un componente de un componente de su entorno natural. Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que interferirían en usos terapéuticos o de diagnóstico para el polipéptido, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteináceos o no proteináceos. En modalidades preferidas, el polipéptido se purificará (1) hasta obtener más de 95 % en peso de polipéptido según se determina mediante el método de Lowry y, con máxima preferencia, más de 99 % en peso, (2) en la medida suficiente para obtener al menos residuos de la secuencia de aminoácidos interna o del N-terminal mediante el uso de un secuenciador de taza giratoria, o (3) hasta alcanzar homogeneidad mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras o no reductoras usando azul de Coomassie o, preferentemente, tinción de plata. El polipéptido aislado incluye el polipéptido in situ dentro de las células recombinantes, ya que al menos un componente del entorno natural del polipéptido no estará presente. Sin embargo, en general, el polipéptido aislado se puede preparar mediante al menos una etapa de purificación.
En la presente, "porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoácidos" se define como el porcentaje de residuos de aminoácidos en una secuencia candidata, que son idénticos a los residuos de aminoácidos en una secuencia seleccionada, luego de alinear las secuencias e introducir espacios, de ser necesario, para lograr el máximo porcentaje de identidad de secuencia, sin tener en cuenta ninguna sustitución conservadora como parte de la identidad de secuencia. La alineación para determinar el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos se puede lograr de varias maneras conocidas por las personas del oficio de nivel medio, por ejemplo, usando software informático disponible para el público, tal como el software BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 o Megalign (DNASTAR™). Las personas del oficio de nivel medio pueden determinar con facilidad los parámetros adecuados para medir la alineación, que incluyen cualquier algoritmo necesario para lograr la alineación máxima sobre la longitud total de las secuencias que se comparan. Por ejemplo, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos A determinada para, con o contra una secuencia de aminoácidos B determinada (que, alternativamente, se puede parafrasear como una secuencia de aminoácidos A determinada que tiene o comprende un cierto % de identidad de secuencia de aminoácidos para, con o contra una secuencia de aminoácidos B determinada) se calcula de la siguiente manera: 100 veces la fracción X/Y, en donde X es la cantidad de residuos de aminoácidos clasificados como coincidencias idénticas por el programa de alineación de secuencias ALIGN-2 en la alineación de A y B de ese programa, y en donde Y es la cantidad total de residuos de aminoácidos en B. Se tendrá en cuenta que cuando la longitud de la secuencia de aminoácidos A no sea igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos B, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de A con respecto a B no será igual al % de identidad de secuencia de aminoácidos de B con respecto a A.
Como se usa en la presente, "sustitución conservadora" indica el reemplazo de un residuo de aminoácido por otro sin alterar la conformación y función generales del péptido, lo que incluye, por ejemplo, el reemplazo de un aminoácido por uno con propiedades similares (por ejemplo, polaridad, potencial de fijación al hidrógeno, acidez, alcalinidad, forma, hidrofobicidad, aromaticidad y similares). Los aminoácidos con propiedades similares son conocidos en el estado de la téenica. Por ejemplo, la arginina, histidina y lisina son aminoácidos hidrófilos básicos y pueden ser intercambiables. De manera similar, la isoleucina, un aminoácido hidrófobo, puede ser reemplazada por leucina, metionina o valina. Los aminoácidos hidrófilos neutros, que se pueden sustituir entre sí, incluyen asparagina, glutamina, serina y treonina. En la presente invención, "sustituido"' o "modificado" significan que se incluyen los aminoácidos que se alteraron o modificaron de aminoácidos naturales. Cabe destacar que, en el contexto de la presente invención, una sustitución conservadora es reconocida en el estado de la técnica como una sustitución de un aminoácido con otro aminoácido que tiene propiedades similares.
Como se usa en la presente, la frase "sitio de fijación de adnectina" se refiere al sitio o a la porción de una proteína (por ejemplo, miostatina) que interactúa o se fija a una adnectina particular (por ejemplo, como un epítopo es reconocido por un anticuerpo). Los sitios de fijación de adnectina se pueden formar de aminoácidos contiguos o no contiguos yuxtapuestos por el plegamiento terciario de una proteína. En general, los sitios de fijación de adnectina formados por aminoácidos contiguos quedan retenidos luego de la exposición a solventes desnaturalizantes, mientras que los sitios de fijación de adnectina formados por el plegamiento terciario se pierden luego del tratamiento de solventes desnaturalizantes.
Un sitio de fijación de adnectina para una adnectina antimiostatina de la invención se puede determinar mediante la aplicación de téenicas estándares que se usan generalmente para el mapeo de epítopos de anticuerpos que incluyen, entre otros, mapeo de proteasa y análisis mutacional. De manera alternativa, un sitio de fijación de adnectina se puede determinar mediante un ensayo de competencia usando un anticuerpo o una adnectina de referencia que se fija al mismo polipéptido, por ejemplo, miostatina (como también se describe más adelante en la sección "Adnectinas que compiten de manera cruzada y/o adnectinas que se fijan al mismo sitio de fijación de adnectina"). Si la adnectina de prueba y la molécula de referencia (por ejemplo, otra adnectina o anticuerpo) compiten, entonces se fijan al mismo sitio de fijación de adnectina o a sitios de fijación de adnectina que están lo suficientemente cercanos de manera que la fijación de una molécula interfiera con la otra.
Las frases "se fija específicamente a", "fijación específica", "fijación selectiva" y "se fija de manera selectiva", que se usan de manera indistinta en la presente, se refieren a una adnectina que exhibe afinidad por una miostatina, pero no se fija considerablemente (por ejemplo, menos de alrededor de 10 % de fijación) a un polipéptido diferente, según se mide mediante una téenica disponible en el estado de la técnica, tal como análisis de Scatchard y/o ensayo de fijación competitiva (por ejemplo, ELISA de competencia, ensayo BIACORE). El término también se aplica cuando, por ejemplo, un dominio de fijación de una adnectina de la invención es específico de miostatina.
Como se usa en la presente, la frase "se fija preferentemente a" se refiere a que la fijación de una adnectina de la invención a miostatina es al menos alrededor de 20 % mayor que la fijación a un polipéptido diferente, según se mide mediante una técnica disponible en el estado de la técnica, tal como análisis de Scatchard y/o ensayos de fijación competitiva (por ejemplo, ELISA de competencia, ensayo BIACORE).
Como se usa en la presente, la frase "reactividad cruzada" se refiere a una adnectina que se fija a más de una proteína diferente que tiene sitios de fijación de adnectina idénticos o muy similares.
Como se usa en la presente, el término "KD" se refiere a la constante de equilibrio de disociación de una interacción particular de adnectina-proteína (por ejemplo, miostatina) o a la afinidad de una adnectina con una proteína (por ejemplo, miostatina), según se mide usando un ensayo de resonancia de plasmones superficiales o un ensayo de fijación celular. Como se usa en la presente, una "KD deseada" se refiere a una KD de una adnectina que es suficiente para la finalidad contemplada. Por ejemplo, una KD deseada se puede referir a la KD de una adnectina necesaria para provocar un efecto funcional en un ensayo in vitro, por ejemplo, un ensayo celular de luciferasa.
Como se usa en la presente, el término "kass" se refiere a la constante de asociación de la asociación de una adnectina al complejo de adnectina/proteína.
Como se usa en la presente, el término "kdiss" se refiere a la constante de disociación de la disociación de una adnectina del complejo de adnectina/proteína.
Como se usa en la presente, el término "IC5o" se refiere a la concentración de una adnectina que inhibe una respuesta, ya sea en un ensayo in vitro o in vivo, hasta un nivel que es 50 % de la respuesta inhibidora máxima, es decir, un valor intermedio entre la respuesta inhibidora máxima y la respuesta sin tratamiento.
Como se usa en la presente, la frase "actividad de miostatina" se refiere a una o más actividades morfogenéticas o reguladoras del crecimiento asociadas a la fijación de la proteína de miostatina activa a ActRIIb y el posterior reclutamiento de Alk4 o Alk5. Por ejemplo, la miostatina activa es un regulador negativo de la masa muscular esquelética. La miostatina activa también puede modular la producción de enzimas específicas del músculo (por ejemplo, creatina cinasa), estimular la proliferación de mioblastos y modular la diferenciación de preadipocitos en adipocitos. La actividad de la miostatina se puede determinar usando métodos conocidos en el estado de la téenica, tales como los que se describen en la presente.
Las frases "inhibir la actividad de miostatina", "antagonizar la actividad de miostatina" o "antagonizar la miostatina" se usan de manera indistinta para referirse a la capacidad de las adnectinas antimiostatina de la presente invención de neutralizar o antagonizar una actividad de la miostatina in vivo o in vitro. Como se usan en la presente, los términos "inhibir" o "neutralizar", con respecto a una actividad de una adnectina de la invención, se refieren a la capacidad de antagonizar, prohibir, prevenir, impedir, hacer más lenta, alterar, eliminar, detener, reducir o revertir considerablemente, por ejemplo, la progresión o la gravedad del aspecto que se desea inhibir, que incluye, por ejemplo, una actividad o propiedad biológica, una enfermedad o una afección. La inhibición o neutralización es, preferentemente, al menos alrededor de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o más.
Por ejemplo, una adnectina antimiostatina de la invención puede reducir los niveles en circulación de miostatina biológicamente activa que se encuentran con frecuencia en un sujeto vertebrado o puede reducir los niveles en circulación de miostatina biológicamente activa en sujetos con trastornos que dan como resultado niveles elevados de miostatina en circulación. Una reducción de la actividad de miostatina se puede determinar usando ensayos in vitro, por ejemplo, ensayos de fijación, como se describe en la presente. De manera alternativa, una reducción de la actividad de miostatina puede provocar un aumento del peso corporal, de la masa muscular y de la fuerza muscular, una alteración de la relación entre músculo y grasa, un aumento de la masa muscular libre de grasa, un aumento del tamaño y/o de la cantidad de células musculares y/o una reducción del contenido de grasa corporal.
El término "PK" es un acrónimo en inglés de "farmacocinética" y abarca propiedades de un compuesto, que incluyen, por ejemplo, absorción, distribución, metabolismo y eliminación por parte de un sujeto. Como se usan en la presente, "proteína de modulación PK" o "porción PK" se refieren a cualquier proteína, péptido o porción que afecta las propiedades farmacocinéticas de una molécula biológicamente activa cuando se fusiona a la molécula biológicamente activa o se administra junto con ella. Los ejemplos de una proteína de modulación PK o una porción PK incluyen PEG, aglutinantes de albúmina de suero humano (HSA, por sus siglas en inglés) (descritos en las publicaciones estadounidenses Nos. 2005/0287153 y 2007/0003549, las publicaciones PCT Nos. WO 2009/083804 y WO 2009/133208), albúmina de suero humano, Fe, fragmentos de Fe y variantes de estos y azúcares (por ejemplo, ácido siálico).
La "semivida" de un compuesto o secuencia de aminoácidos se puede definir, en general, como el tiempo que demora la concentración sérica del polipéptido en reducirse en un 50 % in vivo debido, por ejemplo, a la degradación de la secuencia o del compuesto y/o a la depuración o el secuestro de la secuencia o el compuesto mediante mecanismos naturales. La semivida se puede determinar de cualquier manera conocida per se, tal como mediante análisis farmacocinético. Las téenicas adecuadas serán evidentes para las personas del oficio de nivel medio y pueden incluir, por ejemplo, las etapas de administrar de manera adecuada a un sujeto una dosis adecuada de la secuencia de aminoácidos o el compuesto de la invención; tomar muestras de sangre u otras muestras del sujeto en intervalos regulares; determinar el nivel o la concentración de la secuencia de aminoácidos o el compuesto de la invención en la muestra de sangre; y calcular, de (un gráfico de) los datos así obtenidos, el tiempo transcurrido hasta que el nivel o la concentración de la secuencia de aminoácidos o el compuesto de la invención se redujeron en un 50 % en comparación con el nivel inicial luego de la administración de la dosis. Se hace referencia, por ejemplo, a los manuales estándares, tales como Kenneth, A. et al., Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists y en Peters et al., Pharmacokinete Analysis: A Practical Approach (1996). También se hace referencia a Gibaldi, M. et al., Pharmacokinetíes, 2.a edición rev., Marcel Dekker (1982).
La se ivida se puede expresar mediante parámetros, tales como ti/2-alfa, ti/2-beta, HL_lambda_z y el área debajo de la curva (AUC, por sus siglas en inglés). En la presente descripción, un "aumento de la semivida" se refiere a un aumento de cualquiera de estos parámetros, dos de estos parámetros, tres parámetros de estos parámetros o los cuatro parámetros. Un "aumento de la semivida" se refiere, en particular, a un aumento de ti/2-beta y/o HL_Lambda_z, ya sea con o sin un aumento de ti/2-alfa y/o AUC o ambos.
Las notaciones "mpk", "mg/kg" o "mg por kg" se refieren a miligramos por kilogramo. Todas las notaciones se usan de manera indistinta a lo largo de la presente descripción.
Los términos "individuo", "sujeto" y "paciente", que se usan de manera indistinta en la presente, se refieren a un animal, preferentemente un mamífero (que incluye no primate y un primate) o especies aviares, e incluyen, entre otros, murinos, simios, seres humanos, animales mamíferos de granja (por ejemplo, bovinos, porcinos, ovinos), animales mamíferos de deportes (por ejemplo, equinos) y mascotas mamíferas (por ejemplo, caninos y felinos); preferentemente, el término se refiere a seres humanos. El término también se refiere a especies aviares, que incluyen, entre otras, gallinas y pavos. En una modalidad determinada, el sujeto, preferentemente un mamífero, preferentemente un ser humano, también se caracteriza por tener una enfermedad, un trastorno o una afección que se beneficiarían de un menor nivel o una menor bioactividad de miostatina. En otra modalidad, el sujeto, preferentemente un mamífero, preferentemente un ser humano, también se caracteriza por estar en riesgo de desarrollar una enfermedad, un trastorno o una afección que se beneficiarían de un menor nivel o una menor bioactividad de miostatina.
La frase "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere al menos a la dosis mínima, pero menor a una dosis tóxica, de un agente que es necesario para provocar un beneficio terapéutico en un sujeto. Por ejemplo, una cantidad terapéuticamente eficaz de una adnectina antimiostatina de la invención es una cantidad que provoca, en mamíferos, preferentemente en seres humanos, uno o más de los siguientes: un aumento del volumen muscular y/o fuerza muscular, una disminución de la grasa corporal, un aumento de la sensibilidad a la insulina o el tratamiento de afecciones en las cuales la presencia de miostatina causa o contribuye a un efecto patológico no deseado, o la disminución de los niveles de miostatina genera un efecto terapéutico beneficioso.
Como se usan en la presente, los términos "frágil" o "fragilidad" se refieren a una afección que se puede caracterizar por dos o más síntomas de debilidad, pérdida de peso, movilidad lenta, fatiga, bajos niveles de actividad, poca resistencia y respuesta conductual deficiente a estímulos sensoriales. Una característica de la fragilidad es "sarcopenia" o la pérdida de masa muscular relacionada con la edad.
Como se usa en la presente, el término "caquexia" se refiere a atrofia muscular acelerada y pérdida de masa corporal magra que puede ser el resultado de varias enfermedades.
Descripción general La presente invención proporciona polipéptidos novedosos que se fijan a miostatina y la antagonizan (en adelante denominados "adnectinas antimiostatina"). A fin de identificar antagonistas de miostatina, la miostatina se presentó en grandes colecciones sintéticas de adnectinas. Las adnectinas que se fijan a miostatina se analizaron para determinar la fijación a miostatina, las propiedades biofísicas y la actividad inhibidora de miostatina. Las adnectinas antimiostatina se mutaron y se sometieron a presión selectiva adicional disminuyendo la concentración objetivo y seleccionando las adnectinas antimiostatina con constantes de disociación lentas. A partir de este proceso de optimización, se identificó una familia de adnectinas como inhibidores específicos de miostatina con actividad bioquímica y biofísica favorable. Las adnectinas antimiostatina descritas en la presente solicitud son útiles para los tratamientos de trastornos, enfermedades y afecciones para las cuales se sabe que la inhibición de la actividad de miostatina es beneficiosa; estos incluyen, entre otros, el tratamiento de la atrofia muscular progresiva, de trastornos metabólicos y de atrofia muscular por inactividad.
Como se describe en Rebbapragada et al . ( MCB 2003;23:7230-42), la vía de señalización de miostatina implica la fijación de miostatina a ActRIIb y el posterior reclutamiento de cinasa tipo receptor de activina 4 (ALK4) o ALK5. La fijación a los ALK induce la fosforilación de Smad2/Smad3 y la posterior activación de la vía de señalización tipo TGF (véase, por ejemplo, Rebbapragada et al., MCB 2003;23:7230-42).
I. Soportes basados en fibronectina Un aspecto de la solicitud proporciona adnectinas antimiostatina que comprenden un dominio Fn3, en donde se aleatorizaron o mutaron uno o más de los bucles accesibles de solvente. En algunas modalidades, el dominio Fn3 es un dominio Fn3 derivado del décimo módulo de tipo silvestre del dominio de fibronectina humana tipo III (10Fn3): VSDVPRDLEW AATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVP GSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRT (SEQ ID NO: 4) (los bucles BC, DE y FG están subrayados).
En otras modalidades, las secuencias de fijación de no ligandos de 10Fn3, es decir, el "soporte de 10Fn3", se pueden alterar siempre que 10Fn3 retenga la función de fijación al ligando y/o la estabilidad estructural. Se informó una variante de los soportes de 10Fn3 mutantes. En un aspecto, se reemplazan uno o más de Asp 7, Glu 9 y Asp 23 por otro aminoácido, por ejemplo, un residuo de aminoácido de carga no negativa (por ejemplo, Asn, Lys, etc.). Se informó que estas mutaciones tienen el efecto de promover una mayor estabilidad del mutante 10Fn3 a pH neutro en comparación con la forma de tipo silvestre (véase, por ejemplo, la publicación de PCT N.° WO 02/04523). Se describieron varias alteraciones adicionales en el soporte de 10Fn3 que son beneficiosas o neutras. Véase, por ejemplo, Batori et al., Protein Eng., 15(12):1015-1020 (diciembre de 2002); Koide et al., Biochemistry, 40(34):10326-10333 (28 de agosto de 2001).
Las proteínas 10Fn3 variantes y de tipo silvestre se caracterizan por la misma estructura, a saber, 7 secuencias de dominio de la cadena beta denominadas de A a G y 6 regiones de bucle (bucle AB, bucle BC, bucle CD, bucle DE, bucle EF y bucle FG) que conectan las 7 secuencias de dominio de la cadena beta. Las cadenas beta ubicadas más cerca de los terminales N y C pueden adoptar una conformación tipo beta en solución. En SEQ ID NO:4, el bucle AB corresponde a los residuos 15-16, el bucle BC corresponde a los residuos 21-30, el bucle CD corresponde a los residuos 39-45, el bucle DE corresponde a los residuos 51-56, el bucle EF corresponde a los residuos 60-66, y el bucle FG corresponde a los residuos 76-87 (Xu et al., Chemistry & Biology, 9:933-942, 2002).
En consecuencia, en algunas modalidades, la adnectina antimiostatina es un polipéptido 10Fn3 que es al menos 40%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% o 90% idéntico al dominio 10Fn3 humano, como se muestra en SEQ ID NO:4. En general, la mayor parte de la variabilidad ocurrirá en uno o más de los bucles. Cada una de las cadenas beta o tipo beta de un polipéptido 10Fn3 puede consistir esencialmente en una secuencia de aminoácidos que es al menos 80%, 85%, 90%, 95% o 100% idéntica a la secuencia de una cadena beta o tipo beta correspondiente de SEQ ID N0:4, siempre que esa variación no altere la estabilidad del polipéptido en condiciones fisiológicas.
En algunas modalidades, la invención proporciona una adnectina antimiostatina que comprende un dominio de fibronectina tipo III a la décima (10Fn3), en donde el dominio 10Fn3 comprende un bucle AB; un bucle BC; un bucle CD; un bucle DE; un bucle EF; y un bucle FG; y tiene al menos un bucle seleccionado de los bucles BC, DE y FG con una secuencia de aminoácidos alterada con respecto a la secuencia del bucle correspondiente del dominio 10Fn3 humano. En algunas modalidades, la adnectinas antimiostatina de la presente invención comprenden un dominio 10Fn3 que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100% idéntica a las regiones no bucle de SEQ ID NO:4, en donde se altera al menos un bucle seleccionado de BC, DE y FG. En algunas modalidades, se alteran los bucles BC y FG, y en algunas modalidades, se alteran los bucles BC, DE y FG, es decir, los dominios 10Fn3 comprenden bucles no naturales. En algunas modalidades, se alteran los bucles AB, CD y/o EF. "Alterar" se refiere a una o más alteraciones de secuencias de aminoácidos con respecto a una secuencia molde (dominio de fibronectina humano correspondiente) e incluye adiciones, eliminaciones y sustituciones de aminoácidos, o una combinación de estas. La alteración de una secuencia de aminoácidos se puede lograr mediante la variación intencional, a ciegas o espontánea, en general, de una secuencia que codifica ácidos nucleicos, y se puede realizar mediante cualquier téenica, por ejemplo, PCR, PCR propensa a error o síntesis química de ADN.
En algunas modalidades, se puede extender o acortar la longitud de uno o más bucles seleccionados de BC, DE y FG con respecto al bucle de fibronectina humana correspondiente. En algunas modalidades, la longitud del bucle se puede extender 2-25 aminoácidos. En algunas modalidades, la longitud del bucle se puede disminuir 1-11 aminoácidos. Por lo tanto, para optimizar la fijación del antígeno se puede alterar la longitud de un bucle de 10Fn3, así como la secuencia para obtener la mayor flexibilidad y afinidad posibles en la fijación del antígeno.
En algunas modalidades, el polipéptido comprende un dominio Fn3 que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 80, 85, 90, 95, 98, 99 o 100% idéntica a las regiones no bucle de SEQ ID NO: 4, en donde se altera al menos un bucle seleccionado de BC, DE y FG. En algunas modalidades, el bucle BC alterado tiene hasta 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 sustituciones de aminoácidos, hasta 1, 2, 3 o 4 eliminaciones de aminoácidos, hasta 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 inserciones de aminoácidos o una combinación de estas. En algunas modalidades, el bucle DE alterado tiene hasta 1, 2, 3, 4, 5 o 6 sustituciones de aminoácidos, hasta 1, 2, 3 o 4 eliminaciones de aminoácidos, hasta 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, o 13 inserciones de aminoácidos o combinaciones de estas. En algunas modalidades, el bucle FG alterado tiene hasta 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 sustituciones de aminoácidos, hasta 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 u 11 eliminaciones de aminoácidos, hasta 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 ,17 ,18 ,19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 inserciones de aminoácidos o combinaciones de estas.
Las adnectinas antimiostatina de la invención se basan en un soporte de 10Fn3 y se definen, en términos generales, mediante la siguiente secuencia: EW AAT(Z)aSLLI(Z)xYYRITYGE(Z)bQEFTV(Z)yATI(Z)CDYTITVY AV(Z)zISINYRT (SEQ ID NO: 5), en donde el bucle AB es representado por (Z)a, el bucle CD es representado por (Z)b, el bucle EF es representado por (Z)e, el bucle BC es representado por (Z)x, el bucle DE es representado por (Z)y y el bucle FG es representado por (Z)z. Z representa cualquier aminoácido, y el subíndice después de Z representa un entero de la cantidad de aminoácidos. En particular, a puede estar en cualquier lugar de 1-15, 2-15, 1-10, 2-10, 1-8, 2-8, 1-5, 2-5, 1-4, 2-4, 1-3, 2-3 o 1-2 aminoácidos; y b, c, x, y y z pueden estar, cada uno, independientemente, en cualquier lugar de 2-20, 2-15, 2-10, 2-8, 5-20, 5-15, 5-10, 5-8, 6-20, 6-15, 6-10, 6-8, 2-7, 5-7 o 6-7 aminoácidos. En modalidades preferidas, a es 2 aminoácidos, b es 7 aminoácidos, c es 7 aminoácidos, x es 11 aminoácidos, y es 6 aminoácidos y z es 12 aminoácidos. Las secuencias de las cadenas beta pueden tener, en cualquier lugar, de 0 a 10, de 0 a 8, de 0 a 6, de 0 a 5, de 0 a 4, de 0 a 3, de 0 a 2, o de O a l sustituciones, eliminaciones o adiciones en las 7 regiones de soporte con respecto a los aminoácidos correspondientes que se indican en SEQ ID NO: 4. En ciertas modalidades, las secuencias de las cadenas beta pueden tener, en cualquier lugar, de 0 a 10, de 0 a 8, de 0 a 6, de 0 a 5, de 0 a 4, de 0 a 3, de 0 a 2, o de O a l sustituciones conservadoras en las 7 regiones de soporte con respecto a los aminoácidos correspondientes que se indican en SEQ ID NO: 4. En ciertas modalidades, se fijan los residuos de aminoácidos del núcleo, y se produce cualquier sustitución, sustitución conservadora, eliminación o adición en los residuos que no son los residuos de aminoácidos del núcleo.
De manera alternativa, las adnectinas antimiostatina de la invención se basan en un soporte de 10Fn3 y se definen, en términos generales, mediante la siguiente secuencia: EW AATPTSLLI(Z)XYYRITYGETGGNSPVQEFTV (Z)yATISGLKPGVDY TITVYAV(Z)ZISINYRT (SEQ ID NO: 6) en donde el bucle BC es representado por (Z)x, el bucle DE es representado por (Z)y y el bucle FG es representado por (Z)z. Z representa cualquier aminoácido, y el subíndice después de Z representa un entero de la cantidad de aminoácidos. En particular, x, y y z pueden estar cada uno, independientemente, en cualquier lugar de 2-20, 2-15, 2-10, 2-8, 5-20, 5-15, 5-10, 5-8, 6-20, 6-15, 6-10, 6-8, 2-7, 5-7 o 6-7 aminoácidos. En modalidades preferidas, x es 11 aminoácidos, y es 6 aminoácidos y z es 12 aminoácidos. Las secuencias de las cadenas beta pueden tener, en cualquier lugar, de O a lO, de 0 a 8, de 0 a 6, de 0 a 5, de 0 a 4, de 0 a 3, de 0 a 2, o de O a l sustituciones, eliminaciones o adiciones en las 7 regiones de soporte con respecto a los aminoácidos correspondientes que se indican en SEQ ID NO: 1. En ciertas modalidades, las secuencias de las cadenas beta pueden tener, en cualquier lugar, de O a lO, de 0 a 8, de O a 6, de 0 a 5, de 0 a 4, de 0 a 3, de 0 a 2, o de O a l sustituciones conservadoras en las 7 regiones de soporte con respecto a los aminoácidos correspondientes que se indican en SEQ ID NO: 4. En ciertas modalidades, se fijan los residuos de aminoácidos del núcleo, y se produce cualquier sustitución, sustitución conservadora, eliminación o adición en los residuos que no son los residuos de aminoácidos del núcleo.
En ciertas modalidades, una adnectina antimiostatina descrita en la presente puede comprender la secuencia que se indica en SEQ ID NO: 5 o 6, en donde se altera al menos uno de los bucles BC, DE y FG representados por (Z)x, (Z)y y (Z)z, respectivamente. Como se describió anteriormente, los residuos de aminoácidos que corresponden a los residuos 21-30, 51-56 y 76-87 de SEQ ID NO: 4 definen los bucles BC, DE y FG, respectivamente. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que no es necesario modificar todos los residuos en la región del bucle para lograr un fijador 10Fn3 que tenga una fuerte afinidad a un objetivo deseado (por ejemplo, miostatina).
Por ejemplo, no es necesario modificar los residuos 21 (S) y 22 (W) del bucle BC que se indican en SEQ ID NO: 1 para la fijación a miostatina. Esto significa que se pueden obtener dominios 10Fn3 con una alta afinidad de fijación a miostatina modificando solo los residuos 23-30 del bucle BC como se indica en SEQ ID NO: 4. Esto se muestra en los bucles BC ejemplificados en la Tabla 1, lo cual indica que solo se modifican las posiciones subrayadas.
De modo similar, tampoco es necesario modificar las posiciones 51 (P) y 56 (T) del bucle DE que se indican en SEQ ID NO: 4 para la fijación a miostatina. Esto significa que se pueden obtener dominios 10Fn3 con una alta afinidad de fijación a miostatina modificando solo los residuos 52-55 del bucle DE como se indica en SEQ ID NO: 4. Esto se muestra en los bucles DE ejemplificados en la Tabla 1, lo cual indica que solo se alteran los residuos que abarcan las posiciones subrayadas.
De modo similar, tampoco es necesario modificar las posiciones 76 (T) y 87 (P) del bucle FG que se indican en SEQ ID NO: 1 para la fijación a miostatina. Esto significa que se pueden obtener dominios 10Fn3 con una alta afinidad de fijación a miostatina modificando solo los residuos 77-86 del bucle FG como se indica en SEQ ID NO: 4. Esto se muestra en los bucles FG ejemplificados en la Tabla 1, lo cual indica que solo se alteran los residuos que abarcan las posiciones subrayadas.
En consecuencia, en algunas modalidades, se pueden describir las regiones de los bucles BC, DE y FG de las adnectinas antimiostatina de la invención de conformidad con las secuencias de consenso. Estas secuencias de consenso se ejemplifican mediante los bucles BC, DE y FG que se muestran en la Tabla 1, según se determina mediante el análisis de WebLogo (Figuras 2-7) (Crooks GE, Hon G, Chandonia JM, Brenner SE. WebLogo: A sequence logo generator. Genome Research 2004;14:1188-1190, que se incorpora en la presente por referencia en su totalidad). El análisis mediante WebLogo genera un aminoácido distintivo que refleja la frecuencia de los aminoácidos en cada posición alterada de los bucles BC, DE o FG.
Por ejemplo, en algunas modalidades, el bucle BC, (Z)x, se define mediante la secuencia de consenso X1-L-P-X2-X3-X4-X5-X6-X7 , en donde, Xi es S, T o Y; X2 es H, Y, N, R, F, G, S O T; X3es A, P, Q, S, F, H, N o R; X4 es G O A; X5 H, L, R, V, N, D, F, I o K; Cb es A, L, G, M, F, I o V; y X7 es H o N.
En ciertas modalidades preferidas, el bucle BC comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 7, 11-21, 23-31, 34 y 36-38. En una modalidad, el bucle BC comprende el aminoácido indicado en SEQ ID NO.34.
En algunas modalidades, el bucle DE, (Z)y, se define mediante la secuencia de consenso G-R-G-Cb, en donde Xs es V o L. En ciertas modalidades preferidas, el bucle DE comprende un aminoácido seleccionado de SEQ ID NO: 39 y 42.
En una modalidad, el bucle DE comprende el aminoácido indicado en SEQ ID NO.39.
En algunas modalidades, el bucle FG, (Z)z, se define mediante la secuencia de consenso X9-X10-X11-X12-X13-X14- X15-X16-X17-X18, en donde X9 es L, V o I; X10 es T o S; Xn es K, R, A, G, S, D, H, N, T o P; X12 es S, T, A, E, H, K o N; Xi3 es K, G, Q, D, E, N, T o S; Xi4 es V, I, F, L, M, P, T o Y; X15 es I, L o Y; Xie es H, I, V, K, L, R, F, G, S o T; C7 es Y o H; y Xis es K, M, L, R o V. En ciertas modalidades preferidas, el bucle FG comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 46, 50-62, 64-72, 75- 77 y 79. En una modalidad, el bucle FG comprende el aminoácido indicado en SEQ ID NO.75.
En otras modalidades, el bucle BC, (Z)x, se define mediante la secuencia de consenso X19-X20-P-X21-G-X22-A, en donde X19 es D, E, V o W; X20 es A, S o V; X21 es R, A, G, K o L; y X22 es L o R. En ciertas modalidades preferidas, el bucle BC comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 8-10, 22, 32, 33 y 35.
En otras modalidades, el bucle DE, (Z)y, se define mediante la secuencia de consenso X23-G-R-G-X24, en donde X23 es V, P, F, I o L; y X24 es S, N o T. En ciertas modalidades preferidas, el bucle DE comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 40, 41 y 43-45.
En otras modalidades, el bucle FG, (Z)z, se define mediante la secuencia de consenso X25-X26-R-X27-G-X28-X29-X30-X31-X32, en donde X25 es I o V; X26 es F, D o Y; X27 es D o T; X2e es P, M, V O T; X29 es V, L, N, R O S; X30 es H, T, L, N, Q O S; X31 es F, W, Y, H o L; y X32 es D, A o G. En ciertas modalidades preferidas, el bucle FG comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 47-49, 63, 73, 74 y 78.
En consecuencia, en ciertas modalidades, la invención proporciona una adnectina antimiostatina que comprende un bucle BC, (Z)x, que tiene la secuencia X1-L-P-X2-X3-X4-X5-X6-X7, y un bucle DE, (Z)y, que tiene la secuencia G-R-G-Xs, como se definió anteriormente. En ciertas modalidades, el bucle BC comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 7, 11-21, 23-31, 34 y 36-38, y el bucle DE comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 39 y 42. En una modalidad, los bucles BC y DE comprenden las secuencias de aminoácidos indicadas en SEQ ID NO: 34 y 39, respectivamente.
En ciertas modalidades, la adnectina antimiostatina comprende un bucle BC, (Z)x, que tiene la secuencia X1-L-P-X2-X3-X4-X5-X6-X7, y un bucle FG, (Z)z, que tiene la secuencia X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18, como se definió anteriormente. En ciertas modalidades, el bucle BC comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 7, 11-21, 23-31, 34 y 36-38, y el bucle FG comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 46, 50-62, 64-72, 75-77 y 79. En una modalidad, los bucles BC y PG comprenden las secuencias de aminoácidos indicadas en SEQ ID NO: 34 y 75, respectivamente.
En ciertas modalidades, la adnectina antimiostatina comprende un bucle DE, (Z)y, que tiene la secuencia G-R-G-Xs, y un bucle FG, (Z)z, que tiene la secuencia X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18, como se definió anteriormente. En ciertas modalidades, el bucle DE comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 39 y 42, y el bucle FG comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 46, 50-62, 64-72, 75-77 y 79. En una modalidad, los bucles DE y FG comprenden las secuencias de aminoácidos indicadas en SEQ ID NO: 39 y 75, respectivamente.
En ciertas modalidades, la adnectina antimiostatina comprende un bucle BC, (Z)x, que tiene la secuencia X1-L-P-X2-X3-X4-X5-X6-X7, un bucle DE, (Z)y, que tiene la secuencia G-R-G-Xs, y un bucle FG, (Z)z, que tiene la secuencia X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18, como se definió anteriormente. En ciertas modalidades, el bucle BC comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 7, 11-21, 23-31, 34 y 36-38, el bucle DE comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 39 y 42, y el bucle FG comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 46, 50-62, 64-72, 75-77 y 79. En una modalidad, los bucles BC, DE y FG comprenden las secuencias de aminoácidos indicadas en SEQ ID NO: 34, 39 y 75, respectivamente.
En otras modalidades, la invención proporciona una adnectina antimiostatina que comprende un bucle BC, (Z)x, que tiene la secuencia X19-X20-P-X21-G-X22-A, y un bucle DE, (Z)y, que tiene la secuencia X23-G-R-G-X24, como se definió anteriormente. En ciertas modalidades, el bucle BC comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 8-10, 22, 32, 33 y 35, y el bucle DE comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 40, 41 y 43-45.
En otras modalidades, la adnectina antimiostatina comprende un bucle BC, (Z)x, que tiene la secuencia X19-X20-P-X21-G-X22-A, y un bucle FG, (Z)z, que tiene la secuencia X25-X26-R-X27-G-X28-X29-X30-X30-X32, como se definió anteriormente. En ciertas modalidades, el bucle BC comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 8-10, 22, 32, 33 y 35, y el bucle FG comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 47-49, 63, 73, 74 y 78.
En otras modalidades, la adnectina antimiostatina comprende un bucle DE, (Z)y, que tiene la secuencia X23-G-R-G-X24, y un bucle FG, (Z)z, que tiene la secuencia X25-X26-R-X27-G-X28-X29-X30-X30-X32, como se definió anteriormente. En ciertas modalidades, el bucle DE comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 40, 41 y 43-45, y el bucle FG comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 47-49, 63, 73, 74 y 78.
En otras modalidades, la adnectina antimiostatina comprende un bucle BC, (Z)x, que tiene la secuencia X19-X20-P-X21-G-X22-A, un bucle DE, (Z)y, que tiene la secuencia X23-G-R-G-X24, y un bucle FG, (Z)z, que tiene la secuencia X25-X26-R-X27-G-X28-X29-X30-X30-X32, como se definió anteriormente. En ciertas modalidades, el bucle BC comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 8-10, 22, 32, 33 y 35, el bucle DE comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 40, 41 y 43-45, y el bucle FG comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 47-49, 63, 73, 74 y 78.
En ciertas modalidades preferidas, una adnectina antimiostatina de la invención comprende la secuencia indicada en SEQ ID NO: 5 o 6, en donde los bucles BC, DE y FG representados por (Z)x, (Z)y y (Z)z, respectivamente, son reemplazados por un conjunto respectivo de bucles BC, DE y FG que tienen las secuencias de consenso de SEQ ID NO: 7-38, 39-45 y 46-79, respectivamente.
En otras modalidades preferidas, una adnectina antimiostatina de la invención comprende la secuencia indicada en SEQ ID NO: 5 o 6, en donde los bucles BC, DE y FG representados por (Z)x, (Z)y y (Z)z, respectivamente, son reemplazados por un conjunto respectivo de bucles BC, DE y FG que tienen secuencias que son al menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% o 99% idénticas a las secuencias de los bucles BC, DE o FG de los clones enumerados en la Tabla 1.
En modalidades de ejemplo, una adnectina antimiostatina descrita en la presente se define mediante SEQ ID NO: 5 y tiene un conjunto respectivo de secuencias de los bucles BC, DE y FG de cualquiera de los clones enumerados en la Tabla 1. Por ejemplo, el clon 1979_B06 de la Tabla 1 comprende los bucles BC, DE y FG como se indica en SEQ ID NO: 7, 39 y 46, respectivamente. Por lo tanto, una adnectina antimiostatina basada en estos bucles puede comprender SEQ ID NO: 5 o 6, en donde (Z)x comprende SEQ ID NO: 7, (Z)y comprende SEQ ID NO: 39 y (Z)z comprende SEQ ID NO: 46. Se contemplan constructos similares usando el conjunto de bucles BC, DE y FG de los otros clones en la Tabla 1 o las secuencias de consenso de SEQ ID NO: 7-38, 39-45 y 46-79, respectivamente. Las regiones de soporte de las adnectinas antimiostatina pueden comprender, en cualquier lugar, de 0 a 20, de 0 a 15, de O a lO, de 0 a 8, de 0 a 6, de 0 a 5, de O a 4, de 0 a 3, de 0 a 2 o de 0 a l sustituciones, sustituciones conservadoras, eliminaciones o adiciones con respecto a los residuos de aminoácidos de soporte de SEQ ID NO: 4. Estas modificaciones del soporte se pueden realizar, siempre que la adnectina antimiostatina sea capaz de fijar miostatina con una KD deseada.
En modalidades preferidas, el bucle BC de la adnectina antimiostatina de la invención comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: SWSLPHAGHVN (SEO ID NO: 7), SWVSPRGRAR (SEQ ID NO: 8), SWEVPRGLAR (SEQ ID NO: 9), SWWAPLGLAR SEQ ID NO: 10), SWTLPHAGLAH (SEQ ID NO: 11), SWYLPYPAHMN (SEQ ID NO: 12), SWSLPFAGHLN (SEQ ID NO: 13), SWSLPYSGLAN (SEQ ID NO: 14), SWSLPHAGHAH (SEQ ID NO: 15), SWTLPNFGLIN (SEQ ID NO: 16), SWTLPHAGRAH (SEQ ID NO: 17), SWSLPYAGHLN (SEQ ID NO: 18), SWSLPYAAHMN (SEQ ID NO: 19), SWSLPYPGHLN (SEQ ID NO: 20), SWSLPYAGHAH (SEQ ID NO: 21), SWDAPGGLAR (SEQ ID NO: 22), SWSLPTPGLAH (SEQ ID NO: 23), SWSLPHRGVAN (SEQ ID NO: 24), SWSLPSSGVAH (SEQ ID NO: 25), SWSLPHHGFGH (SEQ ID NO: 26), SWSLPHAGDAH (SEQ ID NO: 27 SWSLPHNGVAH (SEQ ID NO: 28), SWSLPRQGLAN (SEQ ID NO: 29 SWSLPGPGHFH (SEQ ID NO: 30), SWSLPHPGLGH (SEQ ID NO: 31), SWDAPRGLAR (SEQ ID NO: 32), SWDAPAGLAR (SEQ ID NO: 33), SWSLPHQGKAN (SEQ ID NO: 34), SWDAPKGLAR (SEQ ID NO: 35), SWSLPNPGIAH (SEQ ID NO: 36), SWSLPRPGNAH (SEQ ID NO: 37) y SWSLPNPGNAH (SEQ ID NO: 38).
En algunas modalidades, el bucle BC de la adnectina antimiostatina de la invención comprende la porción subrayada de cualquiera de SEQ ID NO: 7-38, como se indica en la Tabla 1. En una modalidad, el bucle BC comprende la porción subrayada de SEQ ID NO: 34.
En algunas modalidades, el bucle DE de la adnectina antimiostatina de la invención comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: PGRGVT (SEQ ID NO: 39), PGRGST (SEQ ID NO: 40), LGRGST (SEQ ID NO: 41), PGRGLT (SEQ ID NO: 42), IGRGST (SEQ ID NO: 43), FGRGTT (SEQ ID NO: 44) y VGRGNT (SEQ ID NO: 45). En algunas modalidades, el bucle DE de la adnectina antimiostatina de la invención comprende la porción subrayada de cualquiera de SEQ ID NO: 39-45, como se indica en la Tabla 1. En una modalidad, el bucle DE comprende la porción subrayada de SEQ ID NO: 39.
En algunas modalidades, el bucle FG de la adnectina antimiostatina de la invención comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: TLTKSQM1HYMP (SEQ ID NO: 46] TIYRDGMSHHDP (SEQ ID NO: 47), TVYRDGPLLLAP (SEQ ID NO: 48] TIFRTGMVQYDP (SEQ ID NO: 49), TLTNSE11LYKP (SEQ ID NO: 50] TLTKSQILHHRP (SEQ ID NO: 51), TLTRSKI1HYMP (SEQ ID NO: 52] TLTHSNIIRYVP (SEQ ID NO: 53), TVSSTKVIVYLP (SEQ ID NO: 54), TITKSTIIIYKP (SEQ ID NO: 55), TVTTTSVILYKP (SEQ ID NO: 56), TLTKSQLIHYMP (SEQ ID NO: 57), TLTRSQVIHYMP (SEQ ID NO: 58), TLTKSKIIHYMP (SEQ ID NO: 59), TVSSTKVIHYKP (SEQ ID NO: 60), TLTKSKVIHYMP (SEQ ID NO: 61), TVTTTKVIHYKP (SEQ ID NO: 62), TIDRDGVNHFAP (SEQ ID NO: 63), TVTHHGVIGYKP (SEQ ID NO: 64), TLTGANVIIYKP (SEQ ID NO: 35), TVTNTGVIIYKP (SEQ ID NO: 66), TVTATGI11YKP (SEQ ID NO: 67), TVTRAGFYRYKP (SEQ ID NO: 68), TVTREEVISYKP (SEQ ID NO: 69), TVTAAGVIIYKP (SEQ ID NO: 70), TVTANQPIIYKP (SEQ ID NO: 71), TITPETIIVYKP (SEQ ID NO: 72), TIDRDGTRSFDP (SEQ ID NO: 73), TIFRDGPVTWDP (SEQ ID NO: 74), TVTDTGYLKYKP (SEQ ID NO: 75), TLTGSDTIFYKP (SEQ ID NO: 76), TVTGKDVIKYKP (SEQ ID NO: 77), TIFRDGW NYGP (SEQ ID NO: 78) y TVTDTGFITYKP (SEQ ID NO: 79).
En algunas modalidades, el bucle FG de la adnectina antimiostatina de la invención comprende la porción subrayada de cualquiera de SEQ ID NO: 46-79, como se indica en la Tabla 1. En una modalidad, el bucle FG comprende la porción subrayada de SEQ ID NO: 75.
En algunas modalidades, la adnectina antimiostatina de la invención comprende una secuencia del bucle BC seleccionada de las secuencias del bucle BC que tienen SEQ ID NO: 7-38 o la porción subrayada de cualquiera de SEQ ID NO: 7-38, como se indica en la Tabla 1; una secuencia del bucle DE seleccionada de las secuencias del bucle DE que tienen SEQ ID NO: 39-45 o la porción subrayada de cualquiera de SEQ ID NO: 39-45, como se indica en la Tabla 1; y una secuencia del bucle FG seleccionada de las secuencias del bucle FG que tienen SEQ ID NO: 46-79 o la porción subrayada de cualquiera de SEQ ID NO: 46-79 como se indica en la Tabla 1. En algunas modalidades, la adnectina antimiostatina de la invención comprende una secuencia de aminoácidos de los bucles BC, DE y FG que es al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100% idéntica a cualquiera de SEQ ID NO: 7-38, 39-45 y 46-79, respectivamente. En otras modalidades, la adnectina antimiostatina de la invención comprende una secuencia de aminoácidos de los bucles BC, DE y FG que es al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100% idéntica a la porción subrayada de cualquiera de SEQ ID NO: 7-38, 39-45 y 46-79, respectivamente, como se indica en la Tabla 1.
En algunas modalidades, la adnectina antimiostatina comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NO: 80-123, 228-239 y 252-273 (secuencias de longitud completa de las Tablas 2, 5 y 6). En una modalidad, la adnectina antimiostatina comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 273.
En algunas modalidades, la adnectina antimiostatina comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100% idéntica a cualquiera de SEQ ID NO: 80-123, 228-239 y 252-273. En otras modalidades, la adnectina antimiostatina comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100% idéntica a las regiones que no son bucles BC, DE ni FG de SEQ ID NO: 80-123, 228-239 y 252-273.
En una modalidad, la adnectina antimiostatina de la invención comprende los bucles BC, DE y FG como se indica en SEQ ID NO: 34, 39 y 75, respectivamente. En otra modalidad, la adnectina antimiostatina comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 273 [PRD-1474], SEQ ID NO: 118 [3116_A06], SEQ ID NO: 281 [secuencia de adnectina del núcleo compartida por PRD-1474 y 3116_A06, precedida por una secuencia de extensión del N-terminal (GVSDVPRDL) y seguida por una cola del C-terminal (El)] o SEQ ID NO: 331 [secuencia de adnectina del núcleo de PRD-1474 y 3116_A06 sin una secuencia líder del N- o C-terminal del C-terminal]. La secuencia de adnectina del núcleo de PRD-1474 y 3116_A06 se indica a continuación: EW AATPTSLLISWSLPHQGKANYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGRGVTAT ISGLKPGVDYTITVYAVTVTDTGYLKYKPISINYRT (SEQ ID NO: 331).
Aún en otra modalidad, la adnectina antimiostatina de la presente invención comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100% idéntica a las regiones que no son bucles BC, DE ni FG de SEQ ID NO: 118, 273, 281 O 331.
En una modalidad, la adnectina antimiostatina de la invención descrita en la presente se puede describir con respecto a la adnectina antimiostatina que comprende los bucles BC, DE y FG, como se indica en SEQ ID NO: 34, 39 y 75.
En consecuencia, en algunas modalidades, la adnectina antimiostatina de la invención comprende los bucles BC, DE y FG, como se indica en SEQ ID NO: 34, 39 y 75, respectivamente, en donde el bucle BC comprende 1, 2, 3, 4, 5 o 6 sustituciones de aminoácidos, tales como sustituciones conservadoras de aminoácidos. En consecuencia, en algunas modalidades, el bucle BC se define mediante la secuencia de consenso X33-L-P-X34-X35-X36-X37-X38-X39, en donde X33 es T o Y; X34 es Y, N, R, F, G, S o T; X35 es A, P, S, F, H, N o R; X36 es A; X37 es H, L, R, V, N, D, F o I; X38 es L, G, M, F, I o V; y X39 es H.
En algunas modalidades, la adnectina antimiostatina de la invención comprende los bucles BC, DE y FG, como se indica en SEQ ID NO: 34, 39 y 75, respectivamente, en donde el bucle DE comprende 1 sustitución de aminoácidos, tal como una sustitución conservadora de aminoácidos. En consecuencia, en algunas modalidades, el bucle DE se define mediante la secuencia de consenso G-R-G-X40, en donde X4o es L.
En algunas modalidades, la adnectina antimiostatina de la invención comprende los bucles BC, DE y FG, como se indica en SEQ ID NO: 34, 39 y 75, respectivamente en donde el bucle FG comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 sustituciones de aminoácidos, tales como sustituciones conservadoras de V aminoácidos. En consecuencia, en algunas modalidades, el bucle FG se define mediante la secuencia de consenso X41-X42-X43-X44-X45-X46-X47-X48-X49-X50, en donde X41 es L o I; X42 es S; X43 es K, R, A, G, S, H, N, T o P; X44 es S, A, E, H, K o N; X45 es K, Q, D, E, N, T o S; X46 es V, I, F, L, M, P o T; X47 es I o Y; X48 es H, I, V, L, R, F, G, S o T; X49 es H; y X50 es M, L, R o V.
En algunas modalidades, la adnectina antimiostatina de la invención comprende los bucles BC, DE y FG, como se indica en SEQ ID NO: 34, 39 y 75, respectivamente, en donde el bucle BC tiene 1, 2, 3, 4, 5 o 6 sustituciones de aminoácidos, tales como sustituciones conservadoras de aminoácidos, y el bucle DE tiene 1 sustitución de aminoácidos, tal como una sustitución conservadora de aminoácidos. En algunas modalidades, el bucle BC tiene una secuencia de aminoácidos de conformidad con la Fórmula X33-L- P-X34-X35-X36-X37-X38-X39, en donde X33 es T o Y; X34 es Y, N, R, F, G, S o T; X35 es A, P, S, F, H, N o R; X36 es A; X37 es H, L, R, V, N, D, F o I; X38 es L, G, M, F, I o V; y X39 es H y el bucle DE tiene una secuencia de aminoácidos de conformidad con la Fórmula G-R-G-X40, en donde X4o es L.
En algunas modalidades, la adnectina antimiostatina de la invención comprende los bucles BC, DE y FG, como se indica en SEQ ID NO: 34, 39 y 75, respectivamente, en donde el bucle BC tiene 1, 2, 3, 4, 5 o 6 sustituciones de aminoácidos, tales como sustituciones conservadoras de aminoácidos, y el bucle FG tiene 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 sustituciones de aminoácidos, tales como sustituciones conservadoras de aminoácidos. En algunas modalidades, el bucle BC comprende una secuencia de aminoácidos de conformidad con la Fórmula X33-L-P-X34-X35-X36-X37-X38-X39, en donde X33 es T o Y; X34 es Y, N, R, F, G, S o T; X35 es A, P, S, F, H, N o R; X3e es A; X37 es H, L, R, V, N, D, F o I; X38 es L, G, M, F, I o V; y X39 es H, y el bucle FG comprende una secuencia de aminoácidos de conformidad con la Fórmula X4i-X42-X43-X44-C45-X46~X47-X48-X49-Cdo, en donde X4i es L o I; X42 es S; X43 es K, R, A, G, S, H, N, T o P; X44 es S, A, E, H, K o N; X45 es K, Q, D, E, N, T O S; X46 es V, I, F, L, M, P O T; X47 es I o Y; X4s es H, I, V, L, R, F, G, S o T; X49 es H; y X50 es M, L, R o V.
En algunas modalidades, la adnectina antimiostatina de la invención comprende los bucles BC, DE y FG, como se indica en SEQ ID NO: 34, 39 y 75, respectivamente, en donde el bucle DE tiene 1 sustitución de aminoácidos, tal como una sustitución conservadora de aminoácidos, y el bucle FG tiene 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 sustituciones de aminoácidos, tales como sustituciones conservadoras de aminoácidos. En algunas modalidades, el bucle DE comprende una secuencia de aminoácidos de conformidad con la Fórmula G-R-G-X40, en donde X40 es L, y el bucle FG tiene una secuencia de aminoácidos de conformidad con la Fórmula X41-X42-X43-X44-X45-X46-X47-X48-X49-X50, en donde X41 es L o I; X42 es S; X43 es K, R, A, G, S, H, N, T o P; X44 es S, A, E, H, K o N; X45 es K, Q, D, E, N, T o S; X46 es V, I, F, L, M, P o T; X47 es I o Y; X4e es H, I, V, L, R, F, G, S o T; X49 es H; y X50 es M, L, R o V.
En algunas modalidades, la adnectina antimiostatina de la invención comprende los bucles BC, DE y FG, como se indica en SEQ ID NO: 34, 39 y 75, respectivamente, en donde el bucle BC tiene 1, 2, 3, 4, 5 o 6 sustituciones de aminoácidos, tales como sustituciones conservadoras de aminoácidos, y el bucle DE tiene 1 sustitución de aminoácidos, tal como una sustitución conservadora de aminoácidos, y el bucle FG tiene 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 sustituciones de aminoácidos, tales como sustituciones conservadoras de aminoácidos. En algunas modalidades, el bucle BC comprende una secuencia de aminoácidos de conformidad con la Fórmula X33-L-P-X34-X35-X36-X37-X38-X39, en donde X es T o Y; X es Y, N, R, F, G, S o T; X es A, P, S, F, H, N o R; X36 es A; X37 es H, L, R, V, N, D, F o I; X38 es L, G, M, F, I o V; y X3g es H; el bucle DE comprende una secuencia de aminoácidos de conformidad con la Fórmula G-R-G-X40, en donde X40 es L; y el bucle FG tiene una secuencia de aminoácidos de conformidad con la Fórmula X41-X42-X43-X44-X45-X46-X47-X48-X49-X50, en donde X4i es L o I; X42 es S; X43 es K, R, A, G, S, H, N, T o P; X44 es S, A, E, H, K o N; X45 es K, Q, D, E, N, T o S; X46 es V, I, F, L, M, P o T; X47 es I o Y; X48 es H, I, V, L, R, F, G, S o T; X49 es H; y X50 es M, L, R o V.
En una modalidad, la adnectina antimiostatina de la invención comprende los bucles BC, DE y FG como se indica en SEQ ID NO: 34, 39 y 75, respectivamente, y tiene sustituciones de aminoácidos en los bucles BC, DE y FG que permiten que la adnectina antimiostatina mantenga una fijación a miostatina. Estas sustituciones de aminoácidos se pueden determinar, por ejemplo, mediante barrido de mutación profunda, como se describe en el Ejemplo 8.
En consecuencia, en algunas modalidades, la adnectina antimiostatina de la invención comprende un bucle BC que comprende una secuencia de aminoácidos de conformidad con la Fórmula X5i-X52-X53-X54-X55-X56-X57-X58-X59, en donde: X51 se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, F, H, I, K, L, N, Q, R, S, T, V, W e Y; X52 se selecciona del grupo que consiste en L, M y V; X53 se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, E, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V e Y; X54 se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W e Y; X55 se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y; X56 se selecciona del grupo que consiste en G y S; X57 se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W e Y; X58 se selecciona del grupo que consiste en A, C, G, L, M, S y T; y X59 se selecciona del grupo que consiste en A, C, F, H, N, P, Q, R, S e Y. En una modalidad preferida, X51 se selecciona del grupo que consiste en C, F, I, S, V, W e Y; X52 se selecciona del grupo que consiste en L; X53 se selecciona del grupo que consiste en P; X54 se selecciona del grupo que consiste en C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W e Y; X55 se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y; X56 se selecciona del grupo que consiste en G; X57 se selecciona del grupo que consiste en A, C, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, V, W e Y; X5s se selecciona del grupo que consiste en A, G, L, M y S; y X59 se selecciona del grupo que consiste en C, H, N, Q, S e Y. En una modalidad más preferida, X51 se selecciona del grupo que consiste en F, S y W; X52 se selecciona del grupo que consiste en L; X53 se selecciona del grupo que consiste en P; X54 se selecciona del grupo que consiste en C, F, G, I, K, L, M, N, R, S, T, V, W e Y; X55 se selecciona del grupo que consiste en A, C, E, F, H, I, K, L, , P, Q, R, S, T, V e Y; X56 se selecciona del grupo que consiste en G; X57 se selecciona del grupo que consiste en A, C, H, K, L, M, N, R, V, W e Y; X58 se selecciona del grupo que consiste en A, G y L; y X59 se selecciona del grupo que consiste en H, N y Q.
En algunas modalidades, la adnectina antimiostatina de la invención comprende un bucle DE que comprende una secuencia de aminoácidos de conformidad con la Fórmula G-R-G-X6o, en donde Cbo es A, C, D, E, F, I, K, L, M, N, Q, S, T y V. En una modalidad preferida, Ceo es C, E, I, L, M, Q, T y V. En una modalidad más preferida, Ceo es C, E, I, L, M y V.
En algunas modalidades, la adnectina antimiostatina de la invención comprende un bucle FG que comprende una secuencia de aminoácidos de conformidad con la Fórmula Cei-X62-X63-X64-X65-X6S-X67-X68-X69-X70, en donde Cei se selecciona del grupo que consiste en A, C, F, I, L, M, Q, T, V, W e Y; X62 se selecciona del grupo que consiste en A, C, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W e Y; X63 se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y; X54 se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y; X65 se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W e Y; X6e se selecciona del grupo que consiste en A, C, F, H, I, L, M, N, P, S, T, V, W e Y; X67 se selecciona del grupo que consiste en A, C, E, F, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W e Y; Xes se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y; X9 se selecciona del grupo que consiste en F, W e Y; y Xvo se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y. En una modalidad preferida, Cei se selecciona del grupo que consiste en A, C, I, L, M y V; Cb2 se selecciona del grupo que consiste en C, F, H, I, L, M, Q, R, S, T, V, W e Y; Cb3 se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, S, T, V, W e Y; X64 se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W e Y; X65 se selecciona del grupo que consiste en A, D, E, F, G, H, I, L, M, N, Q, S, T, V, W e Y; C se selecciona del grupo que consiste en C, F, I, L, M, P, T, V, W e Y; Cb7 se selecciona del grupo que consiste en C, F, H, I, K, L, M, N, Q, R, T, V, W e Y; X68 se selecciona del grupo que consiste en A, C, E, F, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y; Cb9 se selecciona del grupo que consiste en W e Y; y X70 se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, E, G, H, K, L, M, N, P, Q, R, S, T y V. En una modalidad más preferida, Cbi se selecciona del grupo que consiste en I y V; X62 se selecciona del grupo que consiste en C, F, I, L, M, T, V, W e Y; X63 se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, Q, S, T y V; Cb4 se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, F, G, I, L, M, N, Q, S, T, V, W e Y; &s se selecciona del grupo que consiste en A, G, S, T y W; X6e se selecciona del grupo que consiste en F, I, V, W e Y; X67 se selecciona del grupo que consiste en F, Hf I, L, M, V, W e Y; X68 se selecciona del grupo que consiste en A, C, F, G, I, K, L, M, T, V y W; X69 se selecciona del grupo que consiste en W e Y; y X70 se selecciona del grupo que consiste en A, G, K, L, M, P, Q y R.
En algunas modalidades, la adnectina antimiostatina de la invención comprende bucles BC, DE y FG, en donde el bucle BC comprende una secuencia de aminoácidos de conformidad con la Fórmula X51-X52-X53-X54-X55-X56-X57-X58-X59, en donde X51 se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, F, H, I, K, L, N, Q, R, S, T, V, W e Y; X52 se selecciona del grupo que consiste en L, M y V; X53 se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, E, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V e Y; X54 es A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, e Y; X55 se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y; X5e se selecciona del grupo que consiste en G y S; X57 es A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W e Y; X58 es A, C, G, L, M, S y T; y X59 es A, C, F, H, N, P, Q, R, S e Y; el bucle DE comprende una secuencia de aminoácidos de conformidad con la Fórmula G-R-G-Xeo, en donde Xeo se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, E, F, I, K, L, M, N, Q, S, T y V; y el bucle FG comprende una secuencia de aminoácidos de conformidad con la Fórmula C6?-C62-C63-C64-Cd5-C66-C67-C68-C69-C7o, en donde Xei se selecciona del grupo que consiste en A, C, F, I, L, M, Q, T, V, W e Y; X62 es A, C, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W e Y; Ce3 se selecciona del grupo que consiste en A, C D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y; Cb4 se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y; X65 se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W e Y; && se selecciona del grupo que consiste en A, C, F, H, I, L, M, N, P, S, T, V, W e Y; Cbi se selecciona del grupo que consiste en A, C, E, F, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W e Y; Ceb se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y; Xes se selecciona del grupo que consiste en F, W e Y; y X70 se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y.
En una modalidad preferida, la adnectina antimiostatina de la invención comprende bucles BC, DE y FG, en donde el bucle BC comprende una secuencia de aminoácidos de conformidad con la Fórmula X51-X52-X53-X54-X55-X56-X57-X58-X59, en donde X51 se selecciona del grupo que consiste en C, F, I, S, V, W e Y; X52 es L; X53 es P; X54 se selecciona del grupo que consiste en C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W e Y; X55 se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y; X56 es G; X57 se selecciona del grupo que consiste en A, C, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, V, W e Y; X58 se selecciona del grupo que consiste en A, G, L, M y S; y X59 se selecciona del grupo que consiste en C, H, N, Q, S e Y; el bucle DE comprende una secuencia de aminoácidos de conformidad con la Fórmula G-R-G-X6o, en donde Ceo se selecciona del grupo que consiste en C, E, I, L, M, Q, T y V; y el bucle FG comprende una secuencia de aminoácidos de conformidad con la Fórmula X61-X62-X63-X64-X65—X66—X67-X68—Xes—X70, en donde X6i se selecciona del grupo que consiste en A, C, I, L, M y V; X62 es C, F, H, I, L, M, Q, R, S, T, V, W e Y; Cb3 se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, S, T, V, W e Y; X64 se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W e Y; Cq5 se selecciona del grupo que consiste en A, D, E, F, G, H, I, L, M, N, Q, S, T, V, W e Y; Xee se selecciona del grupo que consiste en C, F, I, L, M, P, T, V, W e Y; X67 se selecciona del grupo que consiste en C, F, H, I, K, L, M, N, Q, R, T, V, W e Y; se selecciona del grupo que consiste en A, C, E, F, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y; X69 se selecciona del grupo que consiste en W e Y; y X70 se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y.
En una modalidad de mayor preferencia, la adnectina antimiostatina de la invención comprende bucles BC, DE y FG, en donde el bucle BC comprende una secuencia de aminoácidos de conformidad con la Fórmula X51-X52-X53-X54-X55-X56-X57-X58-X59, en donde X51 se selecciona del grupo que consiste en F, S y W; X52 es L; X53es P; X54 se selecciona del grupo que consiste en C, F, G, I, K, L, M N, R, S, T, V, W e Y; X55 se selecciona del grupo que consiste en A, C, E, F, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V e Y; X56 es G; X57 se selecciona del grupo que consiste en A, C, H, K, L, M, N, R, V, W e Y; X58 se selecciona del grupo que consiste en A, G y L; y X59 se selecciona del grupo que consiste en H, N y Q; el bucle DE comprende una secuencia de aminoácidos de conformidad con la Fórmula G-R-G-X60, en donde Ceo se selecciona del grupo que consiste en C, E, I, L, M y V; y el bucle FG comprende una secuencia de aminoácidos de conformidad con la Fórmula Cei-X62-X63-X64-X65-X66-X67—X68-X69-X70, en donde X6i se selecciona del grupo que consiste en I y V; Cb2 es C, F, I, L, M, T, V, W e Y; Xs3 se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, Q, S, T y V; Ce4 se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, F, G, I, L, M, N, Q, S, T, V, W e Y; Xes se selecciona del grupo que consiste en A, G, S, T y W; X6e se selecciona del grupo que consiste en F, I, V, W e Y; X67 se selecciona del grupo que consiste en F, H, I, L, M, V, W e Y; Cb8 se selecciona del grupo que consiste en A, C, F, G, I, K, L, M, T, V y W; Cb9 se selecciona del grupo que consiste en W e Y; y X70 se selecciona del grupo que consiste en A, G, K, L, M, P, Q y R.
En algunas modalidades, la adnectina antimiostatina es codificada por una secuencia de ácidos nucleicos como se indica en cualquiera de SEQ ID NO: 124-167, 240-251 y 284-305 (secuencias de longitud completa de las Tablas 2, 5 y 6). En algunas modalidades, la adnectina antimiostatina es codificada por una secuencia de ácidos nucleicos que es al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a cualquiera de SEQ ID NO: 124-167, 240-251 y 284-305.
La fibronectina se fija naturalmente a ciertos tipos de integrinas mediante una porción de fijación a integrina, "arginina-glicina-ácido aspártico" (RGD, por sus siglas en inglés). En algunas modalidades, el polipéptido comprende un dominio 10Fn3 que carece de la porción de fijación a integrina (RGD). El dominio de fijación a integrina se puede retirar alterando la secuencia RGD mediante sustitución, eliminación o inserción de aminoácidos.
En algunas modalidades, las secuencias de aminoácidos de los bucles BC, DE y/o FG idénticas a la porción subrayada de cualquiera de SEQ ID NO: 7-38, 39-45 y 46-79, respectivamente, como se muestra en la Tabla 1, se injertan en soportes de proteínas que no son del dominio 10Fn3. Por ejemplo, una o más secuencias de aminoácidos del bucle se intercambian por uno o más bucles CDR de la cadena pesada o liviana de un anticuerpo o un fragmento de este, o se insertan en uno o más de aquellos. En otras modalidades, el dominio proteico en el que se intercambian o insertan una o más secuencias de aminoácidos del bucle incluye, entre otros, dominios Fn3 de consenso (Centocor, EE. UU.), proteínas de repetición de ancirina (Molecular Partners AG, Zúrich, Suiza), anticuerpos de dominio (Domantis, Ltd, Cambridge, MA), nanocuerpos de camélidos de dominio simple (Ablynx, Bélgica), lipocalinas (por ejemplo, anticalinas; Pieris Proteolab AG, Freising, Alemania), avímeros (A gen, CA), aficuerpos (Affibody AG, Suecia), ubiquitina (por ejemplo, afilinas; Scil Proteins GmbH, Halle, Alemania), miméticos de epítopos de proteína (Polyphor Ltd, Allschwil, Suiza), soportes de conjunto helicoidal (por ejemplo, alfacuerpos, Complix, Bélgica), dominios Fyn SH3 (Covagen AG, Suiza) o atrímeros (Anaphor, Inc., CA).
Las SEQ ID NO de los bucles BC, DE y FG de las adnectinas antimiostatina de ejemplo de la invención se indican en la Tabla 1.
Tabla 1 Las SEQ ID NO de las monoadnectinas antimiostatina de ejemplo de la invención se indican en la Tabla 2.
Tabla 2 2062_G02, también MGVSDVPRDLEWAATPT ATGGGAGTTTCTGATGTGCCGCGCG denominado en la SLLISWVSPRGRARYYRI ACCTGGAAGTGGTTGCTGCCACCCC presente ATI-1134 TYGETGGNSPVQEFTVPG CACCAGCCTGCTGATCAGCTGGGTT RGSTATISGLKPGVDYTI TCTCCGCGTGGTCGTGCTCGATATT TVYAVTIYRDGMSHHDPI ACCGCATCACTTACGGCGAAACAGG núcleo 2 de SINYRTEIDKPSQHHHHH AGGCAATAGCCCTGTCCAGGAGTTC His6) AC (SEQ ID NO: 125) núcleo 5 de GRGVTATISGLKPGVDYT CTGCCGCATGCTGGTCTTGCGCACT adnectina que ITVYAVTITKSTIIIYKP ATTACCGCATCACTTACGGCGAAAC núcleo 11 de GRGVTATISGLKPGVDYT TTGCCGCATGCTGGTCGTGCGCACT adnectina que ITVYAVTVTTTSVILYKP ATTACCGCATCACTTACGGCGAAAC .
AdCTl (cursiva) TATGCAGTTACCCTGACCCGCAGCA con etiqueta AAATTATTCATTATATGCCGATTAG adnectina que ITVYAVTVSSTKV1HYKP ATTATCGTATTACCTATGGTGAAAC tiene la ISINYRTETDJÍPSQHHHH CGGTGGTAATAGTCCGGTTCAGGAA adnectina que ITVYAVTVTTTKV1HYKP ATTATCGTATTACCTATGGTGAAAC tiene la ISINYRTEIDKPSQHHHH CGGTGGTAATAGTCCGGTTCAGGAA secuencia del HH (SEQ ID NO: TTCACCGTTCCGGGTCGTGGTGTTA terminal AdNTl 105) CCGCAACCATTAGCGGTCTGAAACC (subrayada) y GGGTGTTGATTACACCATTACCGTT AdCTl (cursiva) TATGCAGTTACCGTTACCACCACCA con etiqueta AAGTGATTCATTATAAACCGATTAG núcleo 27 de RGSTATISGLKPGVDYTI GCTCCGGGTGGTCTGGCTCGATATT adnectina que TVYAVTIDRDGVNHFAPI ACCGCATCACTTACGGCGAAACAGG tiene la SINYRTEIDiCPSQHHHHH AGGCAATAGCCCTGTCCAGGAGTTC secuencia del H (SEQ ID NO: 106 ACTGTGATCGGTCGTGGTAGCACAG terminal AdNTl CTACCATCAGCGGCCTTAAACCTGG (subrayada) y CGTTGATTATACCATCACTGTGTAT AdCTl (cursiva) GCTGTCACTATCGACCGTGACGGTG núcleo 28 de GRGVTATISGLKPGVDYT CTGCCGACTCCAGGTCTCGCCCATT adnectina que ITVYAVTVTHHGVIGYKP ATTACCGCATCACTTACGGCGAAAC tiene la ISINYRT E I DKPSQHHHH AGGAGGCAATAGCCCTGTCCAGGAG secuencia del HH (SEQ ID NO: TTCACTGTGCCTGGTCGTGGTGTTA terminal AdNTl 107) CAGCTACCATCAGCGGCCTTAAACC (subrayada) y TGGCGTTGATTATACCATCACTGTG AdCTl (cursiva) TATGCTGTCACTGTCACTCATCACG adnectina que ITVYAVTVTRAGFYRYKP ATTACCGCATCACTTACGGCGAAAC núcleo 33 de GRGVTATISGLKPGVDYT CTGCCGCATAATGGTGTCGCCCATT adnectina que ITVYAVTVTREEVISYKP ATTACCGCATCACTTACGGCGAAAC tiene la ISINYRTEIDKPSQHHHH AGGAGGCAATAGCCCTGTCCAGGAG adnectina que ITVYAVTITPETIIVYKP ATTACCGCATCACTTACGGCGAAAC tiene la ISINYRTEIDPSQHHHH AGGAGGCAATAGCCCTGTCCAGGAG secuencia del HH (SEQ ID NO: TTCACTGTGCCTGGTCGTGGTGTTA terminal AdNTl 115) CAGCTACCATCAGCGGCCTTAAACC (subrayada) y TGGCGTTGATTATACCATCACTGTG AdCTl (cursiva) TATGCTGTCACTATCACTCCGGAAA con etiqueta CGATCATCGTCTACAAACCAATTTC núcleo 44 de GRGVTATISGLKPGVDYT CTGCCGAATCCGGGTAACGCCCATT Adnectinas que compiten de manera cruzada y/o adnectinas que se fijan al mismo sitio de fijación de adnectina En una modalidad, las adnectinas de la invención compiten (por ejemplo, compiten de manera cruzada) por la fijación a miostatina con las adnectinas antimiostatina particulares descritas en la presente. Las adnectinas que compiten se pueden identificar en función de su capacidad de inhibir competitivamente la fijación a miostatina de las adnectinas descritas en la presente en ensayos de fijación a miostatina estándares. Por ejemplo, se pueden usar ensayos ELISA estándares, en donde se inmoviliza una proteína miostatina recombinante en la placa, una de las adnectinas se etiqueta en forma fluorescente y se evalúa la capacidad de las adnectinas no etiquetadas de competir por la fijación de la adnectina etiquetada.
En una modalidad, se puede llevar a cabo un formato de ELISA competitivo para determinar si dos adnectinas antimiostatina se fijan a sitios de fijación de adnectina superpuestos en la miostatina. En un formato, la adnectina # 1 se recubre en una placa, que luego se bloquea y se lava. A esta placa, se agrega una miostatina sola, o miostatina preincubada con una concentración saturada de adnectina # 2. Después de un periodo de incubación adecuado, la placa se lava y se sondea con un anticuerpo antimiostatina policlonal, tal como un anticuerpo policlonal antimiostatina de cabra biotinilado (R&D Systems), y luego se produce la detección con un conjugado de estreptavidina-HRP y procedimientos de desarrollo de tetrametilbencidina estándares. Si la señal de OD es la misma con o sin preincubación con adnectina # 2, las dos adnectinas se fijan independientemente entre sí, y sus sitios de fijación de adnectina no se superponen. Sin embargo, si la señal de OD para las cavidades que recibieron las mezclas de miostatina/adnectina # 2 es inferior a las que recibieron miostatina sola, se confirma que la fijación de adnectina # 2 bloquea la fijación de adnectina # 1 a miostatina.
De manera alternativa, se lleva a cabo un experimento similar mediante resonancia de plasmones superficiales (SPR, por ejemplo, BIAcore). Se inmoviliza adnectina # 1 en una superficie del chip de SPR, y luego se aplican inyecciones de miostatina sola o miostatina preincubada con una concentración saturada de adnectina # 2. Si la señal de fijación de mezclas de miostatina/adnectina # 2 es igual o superior a la de miostatina sola, las dos adnectinas se fijan independientemente entre sí, y sus sitios de fijación de adnectina no se superponen. Sin embargo, si la señal de fijación de mezclas de miostatina/adnectina # 2 es inferior a la de miostatina sola, se confirma que la fijación de adnectina # 2 bloquea la fijación de adnectina # 1 a miostatina. Una característica de estos experimentos es el uso de concentraciones saturadas de adnectina # 2. Si la miostatina no se satura con adnectina # 2, las conclusiones anteriores no tienen sustento. Se pueden usar experimentos similares para determinar si dos proteínas de fijación a miostatina se fijan a sitios de fijación de adnectina superpuestos.
Ambos ensayos ejemplificados anteriormente también se pueden llevar a cabo en el orden inverso, en donde se inmoviliza adnectina # 2, y se agregan a la placa miostatina- adnectina # 1. De manera alternativa, se puede reemplazar adnectina # 1 y/o # 2 por un anticuerpo monoclonal y/o una proteína soluble de fusión al receptor Fe.
En otra modalidad, la competencia se puede determinar usando un ensayo sándwich HTRF, como se describe en el Ejemplo 4.
En otras modalidades, la adnectina que compite es una adnectina que se fija al mismo sitio de fijación de adnectina en miostatina como una adnectina antimiostatina particular descrita en la presente. Se pueden usar téenicas de mapeo estándares, tales como mapeo de proteasa, análisis mutacional, cristalografía de rayos X y resonancia magnética nuclear bidimensional, para determinar si una adnectina se fija al mismo sitio de fijación de adnectina como una adnectina de referencia (véase, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol.66, G. E. Morris, Ed. (1996)).
Las adnectinas antimiostatina candidatas que compiten pueden inhibir la fijación de adnectinas antimiostatina de la invención a miostatina en al menos 50 %, al menos 55 %, al menos 60 %, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 %. El % de competencia se puede determinar usando los métodos antes descritos.
En algunas modalidades, no es necesario que las moléculas que compiten con las adnectinas antimiostatina de la invención sean una adnectina, sino que pueden ser cualquier tipo de molécula que se fija a miostatina, tal como un anticuerpo, una molécula pequeña, un péptido y similares.
En algunas modalidades, las adnectinas de la invención se fijan a un sitio de fijación de adnectina discontinuo en miostatina. En algunas modalidades, los polipéptidos se fijan a una región en los aminoácidos 55-66 de la miostatina (SEQ ID NO: 3). En algunas modalidades, los polipéptidos se fijan a una región en los aminoácidos 85-101 de la miostatina (SEQ ID NO: 3). Aún en otras modalidades, los polipéptidos se fijan en dos regiones, aminoácidos 85-101 y 55-66, de la miostatina (SEQ ID NO: 3).
En algunas modalidades, los polipéptidos de la invención no compiten por la fijación a miostatina con ActRIIB. En algunas modalidades, los polipéptidos de la invención compiten por la fijación a miostatina con ALK4 y/o ALK5.
II. Secuencias de extensión En ciertas modalidades, las moléculas de adnectina antimiostatina de la presente invención se pueden modificar para comprender una secuencia de extensión del N-terminal y/o una extensión del C-terminal. Por ejemplo, una secuencia MG se puede ubicar en el N-terminal del 10Fn3 definido en SEQ ID NO: 4. Con frecuencia, M se escinde, lo que deja a G en el N-terminal. De manera alternativa, los 10 primeros aminoácidos de las adnectinas antimiostatina que se muestran en Tabla 2 se pueden reemplazar por una secuencia del N-terminal alternativa, que en la presente se denomina extensiones del N-terminal, como se muestra en la Tabla 7. Además, M, G o MG también se pueden ubicar en el N-C-terminal respecto a cualquiera de las extensiones del N-terminal que se muestran en la Tabla 7. Las adnectinas antimiostatina descritas en la presente también pueden comprender secuencias cola del C-terminal alternativas, que en la presente se denominan secuencias de extensión del C-terminal. Por ejemplo, las secuencias de adnectina antimiostatina que se muestran en la Tabla 2 se pueden truncar en la treonina correspondiente a T94 de SEQ ID NO: 4 (es decir, truncadas después de la porción INYRT (SEQ ID NO: 168) de la secuencia). La versión truncada se puede usar como moléculas truncadas en la forma truncada, o de manera alternativa, se pueden agregar extensiones del C-terminal después del residuo de treonina. Las secuencias de extensión del C-terminal de ejemplo se muestran en la Tabla 7. Las adnectinas antimiostatina de ejemplo que comprenden secuencias de extensión del C-terminal se muestran en la Tabla 2 como SEQ ID NO: 80-123. Por ejemplo, SEQ ID NO: 80 (clon 1979_B06) comprende la extensión del C-terminal natural EIDKPSQ (SEQ ID NO: 211) seguida de la etiqueta His6 (SEQ ID NO: 328). Sin embargo, cabe destacar que la etiqueta His6 es completamente opcional.
En ciertas modalidades, las secuencias de extensión del C-terminal (también denominadas "colas") comprenden residuos E y D, y pueden tener de 8 a 50, de 10 a 30, de lO a 20, de 5 a 10 y de 2 a 4 aminoácidos de longitud. En algunas modalidades, las secuencias cola incluyen enlazadores a base de ED en donde la secuencia comprende las repeticiones en tándem de ED. En modalidades de ejemplo, la secuencia cola comprende 2-10, 2-7, 2-5, 3-10, 3-7, 3-5, 3, 4 o 5 repeticiones de ED. En ciertas modalidades, las secuencias cola a base de ED también pueden incluir residuos de aminoácidos adicionales, tales como: El, EID, ES, EC, EGS y EGC. Estas secuencias se basan, en parte, en secuencias cola de adnectina conocidas, tales como EIDKPSQ (SEQ ID NO: 211), en donde se retiraron los residuos D y K. En modalidades de ejemplo, la cola a base de ED comprende residuos E, I o El antes de las repeticiones ED.
En otras modalidades, las secuencias del N- o C-terminal se pueden combinar con secuencias enlazadoras conocidas (por ejemplo, SEQ ID NO: 181-227 en la Tabla 4) según sea necesario cuando se diseña una molécula de fusión de adnectina antimiostatina. En algunas modalidades, las secuencias se pueden ubicar en el C-terminal del dominio 10Fn3 para facilitar la fijación de una porción farmacocinética.
Por ejemplo, se puede agregar un enlazador que contiene cisteína, tal como GSGC (SEQ ID NO: 189) al C-terminal para facilitar la PEGilación dirigida al sitio en el residuo de cisteína. Las adnectinas antimiostatina de ejemplo que comprenden un enlazador que contiene cisteína se muestran en la Tabla 5 como SEQ ID NO: 228-239.
III. Porciones farmacocinéticas En un aspecto, la solicitud proporciona adnectinas antimiostatina que también comprenden una porción farmacocinética (PK). Se puede evaluar la farmacocinética mejorada de conformidad con la necesidad terapéutica percibida. Con frecuencia, se desea aumentar la biodisponibilidad y/o el tiempo entre las dosis, posiblemente aumentando el tiempo que una proteína permanece disponible en el suero después de la administración de la dosis. En algunos casos, se desea mejorar la continuidad de la concentración sérica de la proteína en el tiempo (por ejemplo, disminuyendo la diferencia en la concentración sérica de la proteína poco después de la administración y poco antes de la siguiente administración). La adnectina antimiostatina se puede unir a una porción que reduce la tasa de depuración del polipéptido en un mamífero (por ejemplo, ratón, rata o ser humano) en más del doble, más del triple, más del cuádruple o más del quíntuple, en relación con la adnectina antimiostatina no modificada. Otras medidas para mejorar la farmacocinética pueden incluir la semivida sérica, que con frecuencia se divide en una fase alfa y una fase beta. Una o ambas fases se pueden mejorar considerablemente mediante la adición de una porción adecuada. Por ejemplo, la porción PK puede aumentar la semivida sérica del polipéptido en más del 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 150, 200, 400, 600, 800, 1000 % o más con respecto al dominio Fn3 solo.
Las porciones que hacen más lenta la depuración de una proteína de la sangre, en la presente denominadas "porciones PK", incluyen porciones de polioxialquileno (por ejemplo, polietilenglicol), azúcares (por ejemplo, ácido siálico) y porciones proteicas bien toleradas (por ejemplo, Fe, fragmentos y variantes de estos, transferrina o albúmina del suero). La adnectina antimiostatina también se puede fusionar a la albúmina o a un fragmento (porción) o variante de la albúmina, como se describe en la publicación estadounidense No.2007/0048282, o se puede fusionar a una o más adnectinas de fijación a la albúmina del suero, como se describe en la presente.
Otras porciones PK que se pueden usar en la invención incluyen las descritas en kencendidotermann et al., ( Current Opini n in Biotechnology 2011; 22:868-76), que se incorpora en la presente como referencia. Las porciones PK incluyen, entre otras, fusiones de albúmina de suero humano, conjugados de albúmina de suero humano, aglutinantes de albúmina de suero humano (por ejemplo, adnectina PKE, AlbudAb, ABD), fusiones de XTEN, fusiones de PAS (es decir, iméticos de PEG recombinantes a base de los tres aminoácidos prolina, alanina y serina), conjugados de hidratos de carbono (por ejemplo, almidón de hidroxietilo (HES)), glucosilación, conjugados de ácido polisiálico y conjugados de ácidos grasos.
En consecuencia, en algunas modalidades, la invención proporciona una adnectina antimiostatina fusionada a una porción PK que es un azúcar polimérico. En algunas modalidades, la porción PK es una porción de polietilenglicol o una región Fe. En algunas modalidades, la porción PK es una proteína de fijación a la albúmina del suero, tal como la que se describen en las publicaciones estadounidenses N.os 2007/0178082 y 2007/0269422. En algunas modalidades, la porción PK es una albúmina de suero humano. En algunas modalidades, la porción PK es transíerrina.
Polietilenglicol En algunas modalidades, la adnectina antimiostatina comprende polietilenglicol (PEG). PEG es un polímero soluble en agua conocido que se encuentra disponible en el comercio o se puede preparar mediante polimerización por apertura del anillo de etilenglicol de conformidad con los métodos conocidos en el estado de la téenica (Sandler and Karo, Polymer Synthesis, Academic Press, Nueva York, vol. 3, páginas 138-161). El término "PEG" se usa ampliamente para referirse a cualquier molécula de polietilenglicol, independientemente del tamaño o la modificación en un extremo del PEG, y se puede representar mediante la fórmula: X— O(CH2CH2O)n-iCH2CH20H, en donde n es de 20 a 2300, y X es H o una modificación del terminal, por ejemplo, alquilo C1-4. PEG puede contener otros grupos químicos que son necesarios para las reacciones de fijación, que son el resultado de la síntesis química de la molécula; o que actúan como espaciadores para la distancia óptima de las partes de la molécula. Además, un PEG puede consistir en una o más cadenas laterales PEG enlazadas entre sí. Los PEG con más de una cadena PEG se denominan PEG ramificados o de múltiples ramificaciones. Los PEG ramificados se describen, por ejemplo, en la solicitud europea publicada No. 473084A y en la patente estadounidense No.5,932,462.
Se pueden unir una o más moléculas PEG en diferentes posiciones en la proteína, y esta unión se puede obtener mediante la reacción con aminas, tioles u otros grupos reactivos adecuados. La porción amina puede ser, por ejemplo, una amina primaria que se encuentra en el N-terminal de un polipéptido o un grupo amina presente en un aminoácido, tal como lisina o arginina. En algunas modalidades, la porción PEG está unida en una posición del polipéptido seleccionada del grupo que consiste en: a) el N-terminal; b) entre el N-terminal y la cadena beta o tipo beta más cercana al N-terminal; c) un bucle ubicado en una cara del polipéptido opuesto al sitio de fijación objetivo; d) entre el C-terminal y la cadena beta o tipo beta más cercana al C-terminal; y e) en el C-terminal.
La PEGilación se puede lograr mediante la PEGilación dirigida al sitio, en donde se introduce un grupo reactivo adecuado en la proteína para crear un sitio en donde, preferentemente, se produce la PEGilación. En algunas modalidades, la proteína se modifica para introducir un residuo de cisteína en la posición deseada, lo que permite la PEGilación dirigida al sitio en la cisteína. Las mutaciones se pueden introducir en una secuencia codificadora de proteínas, a fin de generar residuos de cisteína. Esto puede lograrse, por ejemplo, mediante la mutación de uno o más residuos de aminoácidos a cisteína. Los aminoácidos preferidos para que muten a un residuo de cisteína incluyen serina, treonina, alanina y otros residuos hidrófilos. Preferentemente, el residuo que se mutará a cisteína es un residuo expuesto en la superficie. Los algoritmos son conocidos en el estado de la téenica porque predicen la accesibilidad a la superficie de los residuos en función de la secuencia primaria o una proteína. De manera alternativa, los residuos de superficie se pueden predecir comparando las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos de fijación, dado que se solucionó la estructura de cristal del marco, en función de qué polipéptido de fijación se diseña y evoluciona (véase Himanen et al., Nature 2001; 414:933-8) y, por ende, se identifican los residuos expuestos en la superficie. La PEGilación de los residuos de cisterna se puede llevar a cabo usando, por ejemplo, PEG-maleimida, PEG-vinilsulfona, PEG-iodoacetamida o PEG-disulfuro de ortopiridilo.
En general, PEG se activa con un grupo de activación adecuado para acoplarse a un sitio deseado en el polipéptido. Los métodos de PEGilación son conocidos en el estado de la téenica y también se describen en Zalipsky, S., et al., "Use of Functionalized Poly(Ethylene Glycols) for Modification of Polypeptides" in Polyethylene Glycol Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applications, J. M. Harris, Plenus Press, Nueva York (1992) y en Zalipsky (1995) Advanced Drug Reviews 16: 157-182.
PEG puede presentar una amplia variación en cuanto al peso molecular y puede ser ramificado o lineal. En general, el peso molecular promedio de PEG es de alrededor de 100 Dalton a alrededor de 150.000 Dalton. Los pesos moleculares promedio de ejemplo de PEG incluyen alrededor de 20.000 Dalton, alrededor de 40.000 Dalton, alrededor de 60.000 Dalton y alrededor de 80.000 Dalton. En ciertas modalidades, el peso molecular de PEG es de 40.000 Dalton. También se pueden usar versiones ramificadas de PEG que tienen un peso molecular total de cualquiera de los anteriores. En algunas modalidades, PEG tiene dos ramificaciones. En otras modalidades, PEG tiene cuatro ramificaciones. En otra modalidad, PEG es un bis-PEG (NOF Corporation, DE-200MA), en donde se conjugan dos adnectinas (véase, por ejemplo, el Ejemplo 1 y ATI-1341 de la Tabla 5).
Se pueden usar téenicas de separación y purificación convencionales conocidas en el estado de la técnica para purificar adnectinas antimiostatina PEGiladas, tales como exclusión por tamaño (por ejemplo, filtración en gel) y cromatografía de intercambio iónico. Los productos también se pueden separar usando SDS-PAGE. Los productos que se pueden separar incluyen adnectinas mono-PEGiladas, di-PEGiladas, tri-PEGiladas, poli-PEGiladas y no PEGiladas, y libres de PEG. El porcentaje de conjugados mono-PEG se puede controlar agrupando fracciones más amplias alrededor del pico de elución para aumentar el porcentaje de mono-PEG en la composición. Alrededor del 90 % de los conjugados mono-PEG representan un buen equilibrio entre rendimiento y actividad.
En algunas modalidades, las adnectinas antimiostatina PEGiladas preferentemente retienen al menos alrededor del 25 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 % de la actividad biológica asociada a la adnectina antimiostatina no modificada. En algunas modalidades, "actividad biológica" se refiere a la capacidad de fijarse a miostatína, como se evalúa mediante KD, kencendido o apagado- En algunas modalidades, la adnectina antimiostatina PEGilada muestra un aumento de la fijación a miostatína con respecto a una adnectina antimiostatina no PEGilada.
Las adnectinas antimiostatina modificadas por PEG de ejemplo se muestran en la Tabla 5.
Dominio Fe de inmunoglobulina (y fragmentos) En algunas modalidades, la adnectina antimiostatina se fusiona a un dominio Fe de inmunoglobulina, o a un fragmento o variante de aquel. Como se usa en la presente, una "región Fe funcional" es un dominio Fe o un fragmento de este que retiene la capacidad de fijarse a FcRn. En algunas modalidades, una región Fe funcional se fija a FcRn, pero no tiene función efectora. La capacidad de la región Fe o un fragmento de esta de fijarse a FcRn se puede determinar mediante ensayos de fijación estándares conocidos en el estado de la téenica. En otras modalidades, la región Fe o un fragmento de esta se fija a FcRn y tiene al menos una "función efectora" de una región Fe nativa. Los ejemplos de "funciones efectoras" incluyen fijación de Clq; citotoxicidad dependiente del complemento (CDC, por sus siglas en inglés); fijación al receptor Fe; citotoxicidad mediada por células dependientes del anticuerpo (ADCC, por sus siglas en inglés); fagocitosis; regulación descendente de los receptores de la superficie celular (por ejemplo, receptor de linfocitos B; BCR), etc. En general, las funciones efectoras requieren que la región Fe se combine con un dominio de fijación (por ejemplo, una adnectina antimiostatina), y se pueden analizar mediante varios ensayos conocidos en el estado de la téenica para evaluar las funciones efectoras del anticuerpo.
Una "región Fe de la secuencia nativa" comprende una secuencia de aminoácidos idéntica a la secuencia de aminoácidos de una región Fe natural. Una "variante de la región Fe" comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de la de una región Fe de la secuencia nativa en al menos una modificación de aminoácidos. Preferentemente, la variante de la región Fe tiene al menos una sustitución de aminoácidos en comparación con una región Fe de la secuencia nativa o con la región Fe de un polipéptido de origen, por ejemplo, de alrededor de 1 a alrededor de 10 sustituciones de aminoácidos y, preferentemente, de alrededor de 1 a alrededor de 5 sustituciones de aminoácidos en una región Fe de la secuencia nativa o en la región Fe del polipéptido de origen. La variante de la región Fe en la presente tiene, preferentemente, al menos alrededor de 80 % de identidad de secuencia con una región Fe de la secuencia nativa y/o con una región Fe de un polipéptido de origen y, con máxima preferencia, al menos alrededor de 90 % de identidad de secuencia con aquella, con mayor preferencia, al menos alrededor de 95 % de identidad de secuencia con aquella.
En una modalidad de ejemplo, el dominio Fe deriva de una subclase IgGl; sin embargo, también se pueden usar otras subclases (por ejemplo, IgG2, IgG3 e IgG4). A continuación, se muestra la secuencia de un dominio Fe de inmunoglobulina IgGl humana: DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVW DVSHEDP EVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRW SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPI EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKT TPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 169) La secuencia de articulación del núcleo está subrayada, y las regiones CH2 y CH3 están en formato regular. Cabe destacar que la U sina del C-terminal es opcional.
La fusión se puede formar uniendo una adnectina antimiostatina a un extremo de la molécula Fe, es decir, en las disposiciones de Fc-adnectina antimiostatina o adnectina antimiostatina-Fc. En ciertas modalidades, se fusionan Fe y la adnectina antimiostatina a mediante un enlazador. Las secuencias enlazadoras de ejemplo incluyen GAGGGGSG (SEQ ID NO: 181), EPKSSD (SEQ ID NO: 182), D, ESPKAQASSVPTAQPQAEGLA (SEQ ID NO: 183), ELQLEESAAEAQDGELD (SEQ ID NO: 184), GQPDEPGGS (SEQ ID NO: 185), GGSGSGSGSGSGS (SEQ ID NO: 186), ELQLEESAAEAQEGELE (SEQ ID NO: 187), GSGSG (SEQ ID NO: 188), GSGC (SEQ ID NO: 189), AGGGGSG (SEQ ID NO: 190), GSGS (SEQ ID NO: 191), QPDEPGGS (SEQ ID NO: 192), GSGSGS (SEQ ID NO: 193), TVAAPS (SEQ ID NO: 194), KAGGGGSG (SEQ ID NO: 195), KGSGSGSGSGSGS (SEQ ID NO: 196), KQPDEPGGS (SEQ ID NO: 197), KELQLEESAAEAQDGELD (SEQ ID NO: 198), KTVAAPS (SEQ ID NO: 199), KAGGGGSGG (SEQ ID NO: 200), KGSGSGSGSGSGSG (SEQ ID NO: 201), KQPDEPGGSG (SEQ ID NO: 202), KELQLEESAAEAQDGELDG (SEQ ID NO: 203), KTVAAPSG (SEQ ID NO: 204) AGGGGSGG (SEQ ID NO: 205), AGGGGSG (SEQ ID NO: 206), GSGSGSGSGSGSG (SEQ ID NO: 207), QPDEPGGSG (SEQ ID NO: 208) y TVAAPSG (SEQ ID NO: 209).
En algunas modalidades, la región Fe usada en la fusión de adnectina antimiostatina comprende la región de articulación de una molécula Fe. Como se usa en la presente, la región de "articulación" comprende los residuos de articulación del núcleo que abarcan las posiciones 1-16 de SEQ ID NO: 169 (DKTHTCPPCPAPELLG; SEQ ID NO: 170) de la región Fe de IgGl. En ciertas modalidades, la fusión de adnectina antimiostatina-Fc adopta una estructura multimérica (por ejemplo, dímero) que se debe, en parte, a los residuos de cisteína en las posiciones 6 y 9 de SEQ ID NO: 169 en la región de articulación. En otras modalidades, la región de articulación, como se usa en la presente, también puede incluir residuos derivados de las regiones CH1 y CH2 que flanquean la secuencia de articulación del núcleo, como se muestra en SEQ ID NO: 169. Incluso en otras modalidades, la secuencia de articulación es GSTHTCPPCPAPELLG (es decir, la secuencia de articulación de PRD-932; SEQ ID NO: 180).
En algunas modalidades, la secuencia de articulación puede incluir sustituciones que confieren propiedades farmacocinéticas, biofísicas y/o biológicas deseables. Algunas secuencias de articulación de ejemplo incluyen EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPS (SEQ ID NO: 171; se subraya la región de articulación del núcleo), EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGSS (SEQ ID NO 172; se subraya la región de articulación), EPKSSGSTHTCPPCPAPELLGGSS (SEQ ID NO: 173; se subraya la región de articulación del núcleo), DKTHTCPPCPAPELLGGPS (SEQ ID NO: 174; se subraya la región de articulación del núcleo) y DKTHTCPPCPAPELLGGSS (SEQ ID NO: 175; se subraya la región de articulación del núcleo). En una modalidad, el residuo P en la posición 18 de SEQ ID NO: 169 se reemplazó por S para retirar la función efectora Fe; este reemplazo se ejemplifica en las articulaciones que tienen cualquiera de las SEQ ID NO: 172, 173 y 175. En otra modalidad, los residuos DK en las posiciones 1-2 de SEQ ID NO: 169 se reemplazaron por GS para retirar un posible sitio clip; este reemplazo se ejemplifica en SEQ ID NO: 173. En otra modalidad, C en la posición 103 de SEQ ID NO: 176, que corresponde a la región constante de la cadena pesada de IgGl humano (es decir, los dominios CH1-CH3), se reemplazó por S para prevenir la formación del enlace de cisteína inadecuado en ausencia de una cadena liviana, este reemplazo se ejemplifica en SEQ ID NO: 171-173.
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVH TFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPC PAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTL PPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO : 176 ) En ciertas modalidades, una fusión adnectina antimiostatina-Fc puede tener las siguientes configuraciones: 1) adnectina antimiostatina-articulación-Fc o 2) articulación-Fc-adnectina antimiostatina. Por lo tanto, cualquier adnectina antimiostatina de la presente invención se puede fusionar a una región Fe que comprende una secuencia de articulación de conformidad con estas configuraciones. En algunas modalidades, se puede usar un enlazador para unir la adnectina antimiostatina a la porción de articulación-Fc, por ejemplo, una proteína de fusión de ejemplo puede tener la configuración adnectina antimiostatina-enlazador-articulación-Fc o articulación-Fc-enlazador-adnectina antimiostatina. Además, según el sistema donde se produce el polipéptido de fusión, se puede ubicar una secuencia líder en el N-terminal del polipéptido de fusión. Por ejemplo, si la fusión se produce en un sistema de mamífero, se puede agregar una secuencia líder, tal como METDTLLLWVLLLWVPGSTG (SEQ ID NO: 177) al N-terminal de la molécula de fusión. Si se produce la fusión en E. coli , la secuencia de fusión estará precedida por una metionina.
La siguiente secuencia ejemplifica un constructo de adnectina antimiostatina-articulación-Fc: GVSOVPRDLEWAATPTSLLISWTLPHAGRAHYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGRGVTATI SGLKPGVD YTI TVYAVTVTTTKVIHYKPISINYR TEIEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVW DVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTY RW SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKN QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNV FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (PRD-1171; SEQ ID NO: 253). La secuencia líder se indica en negrita, la secuencia de adnectina antimiostatina se indica en cursiva y la región de articulación está subrayada. Cabe destacar que la U sina del C-terminal es opcional.
Aquí, el dominio Fe comprende las regiones CH2 y CH3 de IgGl humano de la siguiente manera: VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCW VDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQYNSTYRW SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTL PPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 178) y la secuencia de articulación DKTHTCPPCPAPELLG (SEQ ID NO: 170).
La siguiente secuencia ejemplifica un constructo de Fc-adnectina antimiostatina: DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVW DVSHEDP EVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRW SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPI EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKT TPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPELQLEESAA EAQEGELEGVSOVPKDLEWAATPTSLLISWSLPHQGKANYYRITYGETGGNSPVQEFTVP GRGVTA TISGLKPGVD YTI TVYA VTVTD TGYLKYKPI S INYR TEI (PRD-1474; SEQ ID NO: 273). La región de articulación está subrayada, la secuencia líder se indica en negrita y la secuencia de adnectina antimiostatina se indica en cursiva.
Aquí, el dominio Fe comprende las regiones CH2 y CH3 de IgGl humano de la siguiente manera: VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVW DVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQYNSTYRW SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTL PPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP (SEQ ID NO: 179) y la secuencia de articulación DKTHTCPPCPAPELLG (SEQ ID NO: 170).
Las fusiones de adnectina antimiostatina-Fc y las fusiones de Fc-adnectina antimiostatina ejemplares se muestran en la Tabla 6 (SEQ ID NO: 252-273). Todas las secuencias pueden empezar con una metionina o una secuencia líder de mamífero (por ejemplo, SEQ ID NO: 177).
Adnectinas En algunas modalidades, la porción PK es otra adnectina específica, por ejemplo, de una proteína sérica (por ejemplo, albúmina de suero humano), como se describe en US 2012/0094909, que se incorpora en la presente como referencia en su totalidad. Otras porciones PK que se pueden usar con las adnectinas de la invención se describen en kencendidotermann et al. ( Current Opini n in Biotechnology 2011;22:868-76), como se analizó con anterioridad. Por ejemplo, las porciones PK basada en adnectina se pueden enlazar directa o indirectamente a una adnectina antimiostatina mediante un enlazador de polipeptido. Los enlazadores adecuados para unir dominios Fn3 son aquellos que permiten que los dominios separados se plieguen independientemente entre sí y formen una estructura tridimensional que permite una alta afinidad de fijación a una molécula objetivo. Los enlazadores de polipéptidos de ejemplo incluyen PSTSTST (SEQ ID NO: 210) , EIDKPSQ (SEQ ID NO: 211) y enlazadores GS, tales como GSGSGSGSGS (SEQ ID NO: 213) y multímeros de estos. En algunas modalidades, el enlazador es un enlazador a base de glicina- serina. Estos enlazadores comprenden residuos de glicina y serina, y pueden tener de 8 a 50, de 10 a 30 y de 10 a 20 aminoácidos de longitud. Los ejemplos incluyen enlazadores que tienen una secuencia de aminoácidos (GS) (SEQ ID NO: 215) , G(GS)6 (SEQ ID NO: 216) y G(GS)7G (SEQ ID NO: 217) . Otros enlazadores contienen ácido glutámico e incluyen, por ejemplo, (GSE) 5 (SEQ ID NO: 218) y GGSEGGSE (SEQ ID NO: 219) . Otros enlazadores de glicina-serina de ejemplo incluyen (GS)4 (SEQ ID NO: 212) , ( GGGGS ) 7 (SEQ ID NO: 220) , (GGGGS) 5 (SEQ ID NO: 221) y (GGGGS) 3G (SEQ ID NO: 222) . En algunas modalidades, el enlazador es un enlazador a base de glicina-prolina . Estos enlazadores comprenden residuos de glicina y prolina, y pueden tener de 3 a 30 , de 10 a 30 y de 3 a 20 aminoácidos de longitud. Los ej emplos incluyen enlazadores que tienen una secuencia de aminoácidos (GP) 3G (SEQ ID NO : 223 ) , (GP) 5G (SEQ ID NO : 224 ) y GPG. En otras modalidades , el enlazador puede ser un enlazador a base de prolina-alanina que tiene de 3 a 30 , de 10 a 30 y de 3 a 20 aminoácidos de longitud. Los ej emplos de enlazadores a base de prolina-alanina incluyen (PA) 3 (SEQ ID NO : 225 ) , (RA) b (SEQ ID NO : 226) y (PA) 9 (SEQ ID NO : 227 ) . La longitud óptima del enlazador y la composición de aminoácidos se pueden determinar mediante experimentos de rutina teniendo en cuenta las explicaciones provistas en la presente. En algunas modalidades, una adnectina antimiost atina se enlaza, por ejemplo, a una adnectina anti-HSA mediante un enlazador de polipéptido que tiene un sitio de proteasa que se puede escindir mediante una proteasa en la sangre o en el tej ido obj etivo . Estas modalidades se pueden usar para liberar una adnectina ant imiostat ina a fin de lograr una mejor administración, mejores propiedades terapéuticas o una producción más ef icaz .
Se pueden introducir enlazadores o espaciadores adicionales en el N-terminal o en el C-terminal de un dominio Fn3 entre el dominio Fn3 y el enlazador de polipéptido .
En algunas modalidades , una adnectina ant imiostatina se puede enlazar directa o indirectamente , por ej emplo, a una adnectina anti-HSA mediante un enlazador polimérico. Se pueden usar enlazadores poliméricos para variar de manera óptima la distancia entre cada componente de la fusión, a fin de crear una proteína de fusión con una o más de las siguientes características: 1) menor o mayor impedimento estérico de fijación de uno o más dominios proteicos cuando se fijan a una proteína de interés; 2) mayor estabilidad o solubilidad proteica; 3) menor agregación proteica; y 4) mayor avidez o afinidad total de la proteína.
En algunas modalidades, una adnectina antimiostatina se enlaza, por ejemplo, a una adnectina anti- HSA mediante un polímero biocompatible, tal como un azúcar polimérico. El azúcar polimérico puede incluir un sitio de escisión enzimática que puede escindirse mediante una enzima en la sangre o en el tejido objetivo. Estas modalidades se pueden usar para liberar una adnectina antimiostatina a fin de lograr una mejor administración, mejores propiedades terapéuticas o una producción más eficaz.
En la Tabla 3, se proporciona un resumen de monoadnectinas y las formas modificadas de la porción PK correspondientes (por ejemplo, fusiones PEGiladas y Fe).
Tabla 3 - - - - - - - _ _ _ _ a Las monoadnectinas no modificadas tienen una secuencia de adnectina del núcleo precedida por una secuencia de extensión del N-terminal (MGVSDVPRDL; SEQ ID NO: 306) y seguida por una cola del C-terminal (EIDKPSQHHHHHH; SEQ ID NO: 325), como se muestra en la Tabla 2. La secuencia de adnectina del núcleo corresponde a una secuencia de monoadnectina que carece de la secuencia de extensión del N-terminal y de la secuencia de cola del C-terminal. b Las adnectinas con mutantes de cisteína tienen la secuencia de adnectina del núcleo de la monoadnectina en la primera columna y están precedidas por una secuencia de extensión del N-terminal (MGVSDVPRDL; SEQ ID NO: 306) y seguidas por una cola del C-terminal (GSGC[Modificación]HHHHHH; SEQ ID NO: 326 O EGSGC[Modificación]HHHHHH; SEQ ID NO: 327), como se muestra en la Tabla 5. c Las adnectinas con una porción Fe en el C-terminal tienen la secuencia de adnectina del núcleo de la monoadnectina en la primera columna, que está precedida por una secuencia de extensión del N-terminal (GVSDVPRDL; SEQ ID NO: 307) y seguida por una cola del C-terminal (El), que está seguida por una secuencia enlazadora (Tabla 4) y la secuencia de la región Fe, como se describe en la Tabla 6. d Las adnectinas con una porción Fe en el N-terminal tienen una secuencia de la región Fe que está precedida por una secuencia de articulación del N-terminal y seguida por un enlazador (Tabla 4), y la secuencia de adnectina del núcleo de la monoadnectina en la primera columna, que está precedida por una secuencia de extensión del N-terminal (GVSDVPRDL; SEQ ID NO: 307) y seguida por una cola del C-terminal (El), como se muestra en la Tabla 6.
Las SEQ ID NO de los enlazadores de ejemplo de la invención se indican en la Tabla 4.
Tabla 4 Las SEQ ID NO de las adnectinas antimiostatina PEGiladas de ejemplo de la invención se indican en la Tabla Tabla 5 Las SEQ ID NO de las adnectinas antimiostatina fusionadas a Fe de ejemplo de la invención se indican en la Tabla 6.
Tabla 6 Las SEQ ID NO de la secuencia líder (extensión del N-terminal) y de la secuencia cola del C-terminal de ejemplo de la invención se indican en la Tabla 7.
Tabla 7 IV. Teenología de fusión de ácido nucleico-proteína En un aspecto, la invención provee una adnectina que comprende dominios de fibronectina tipo III, que se fija a miostatina. Una forma de obtener y evaluar rápidamente dominios Fn3 con propiedades de fijación específicas es la tecnología de fusión de ácido nucleico-proteína de Adnexus, una empresa de Bristol-Myers Squibb R&D. En la presente se utiliza la tecnología de expresión y etiquetado in vitro, denominada "PROfusión", que explota las fusiones de ácido nucleico-proteína (fusiones de ARN- y ADN-proteína) para identificar porciones de polipéptidos y aminoácidos novedosos que son importantes para la fijación a proteínas. La tecnología de fusión de ácido nucleico-proteína es una tecnología que acopla en forma covalente una proteína a su información genética codificante. Para obtener una descripción detallada de la tecnología de fusión de ARN- proteína y los métodos de cribado de la colección de proteínas de soporte a base de fibronectina, consulte Szostak et al., las patentes estadounidenses N.os 6,258,558, 6,261,804, 6,214,553, 6,281,344, 6,207,446, 6,518,018 y 6,818,418; Roberts et al., Proc. Nati . Acad. Sci . , 1997;94:12297-12302; y Kurz et al., Molecules, 2000; 5:1259-64, que se incorporan en la presente como referencia.
V. Vectores y polinucleótidos Los ácidos nucleicos que codifican una de las diversas proteínas o polipéptidos descritos en la presente se pueden sintetizar químicamente. El uso del codón se puede seleccionar a fin de mejorar la expresión en una célula. El uso del codón dependerá del tipo de célula seleccionado. Se desarrollaron patrones de uso de codones especializados para E. coli y otras bacterias, así como células de mamíferos, células vegetales, células de levadura y células de insectos. Véase, por ejemplo: Mayfield et al., Proc. Nati . Acad. Sci . EE. UU., 100(2):438-442 (21 de enero de 2003); Sinclair et al., Protein Expr. Purif., 26(I):96-105 (octubre de 2002); Connell, N.D., Curr. Opin. Biotechnol ., 12(5):446-449 (octubre de 2001); Makrides et al., Microbiol . Rev. , 60(3):512-538 (septiembre de 1996); y Sharp et al., Yeast, 7 (7):657-678 (octubre de 1991).
Las téenicas generales para la manipulación de ácidos nucleicos se describen, por ejemplo, en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2.a edición, Vol. 1-3, Coid Spring Harbor Laboratory Press (1989), o Ausubel, F. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing and Wilcy-Interscience, Nueva York (1987) y sus actualizaciones periódicas, que se incorporan en la presente por referencia. En general, el ADN que codifica el polipéptido se enlaza operativamente a elementos adecuados reguladores de la transcripción o traducción derivados de genes de mamíferos, virus o insectos. Estos elementos reguladores incluyen un promotor de la transcripción, una secuencia operativa opcional para controlar la transcripción, una secuencia que codifica sitios de fijación a mARN ribosómico y secuencias que controlan la terminación de la transcripción y traducción. También se incorpora la capacidad de replicarse en un hospedero, en general conferida por un origen de replicación, y un gen de selección para facilitar el reconocimiento de los transformantes.
Las proteínas descritas en la presente se pueden producir en forma recombinante no solo directamente, sino también como un polipéptido de fusión con un polipéptido heterólogo, que es, preferentemente, una secuencia de señales u otro polipéptido que tiene un sitio de escisión específico en el N-terminal de la proteína o del polipéptido maduros. Preferentemente, la secuencia de señales heteróloga seleccionada es una que es reconocida y procesada (es decir, escindida por una peptidasa de señal) por la célula hospedera. Una secuencia líder del N-terminal de ejemplo para la producción de polipéptidos en un sistema de mamíferos es: METDTLLLWVLLLWVPGSTG (SEQ ID NO: 177), que se retira mediante la célula hospedera después de la expresión.
Para las células hospederas procarióticas que no reconocen ni procesan una secuencia de señales nativa, la secuencia de señales es sustituida por una secuencia de señales procariótica seleccionada, por ejemplo, del grupo de fosfatasa alcalina, penicilinasa, 1 pp o líderes de enterotoxina termoestable II.
Para la secreción de levadura, la secuencia de señales nativa se puede sustituir, por ejemplo, con el líder de invertasa de levadura, un líder de factor (que incluye líderes de factores alfa de Saccharomyces y Kluyveromyces) o líder de fosfatasa ácida, el líder de glucoamilasa de C. albicans o la secuencia de señales descrita en la patente estadounidense No. 5,631,144. En la expresión de célula de mamíferos, se encuentran disponibles secuencias de señales de mamíferos, así como líderes secretores virales, por ejemplo, la señal gD del herpes simple. El ADN de esas regiones precursoras se puede enlazar en el marco de lectura al ADN que codifica la proteína.
Los vectores de expresión y los vectores de clonación contienen una secuencia de ácidos nucleicos que permite que el vector se replique en una o más células hospederas seleccionadas. En general, en los vectores de clonación, esta secuencia es una que permite que el vector se replique independientemente del ADN cromosómico hospedero, e incluye orígenes de replicación o secuencias de replicación autónoma. Estas secuencias son conocidas para diversas bacterias, levaduras y virus. El origen de replicación del plásmido pBR322 es adecuado para la mayoría de las bacterias Gramnegativas, el origen del plásmido de 2 dos micrómetrosD es adecuado para la levadura, y varios orígenes virales (SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) son útiles para vectores de clonación en células de mamíferos. En general, el origen del componente de replicación no es necesario para vectores de expresión de mamíferos (el origen de SV40 puede usarse generalmente solo porque contiene el promotor temprano).
Los vectores de expresión y de clonación pueden contener un gen de selección, también denominado marcador seleccionable. Los genes seleccionables habituales codifican proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato o tracielina, (b) complementan deficiencias auxotróficas, o (c) proporcionan nutrientes importantes que no están disponibles en medios complejos, por ejemplo, el gen que codifica D-alanina racemasa para Bacilli.
En general, los vectores de expresión y de clonación contienen un promotor que es reconocido por el organismo hospedero, y está enlazado operativamente al ácido nucleico que codifica la proteína de la invención, por ejemplo, una proteína soporte a base de fibronectina. Los promotores adecuados para usar con hospederos procarióticos incluyen el promotor phoA, los sistemas promotores de beta-lactamasa y lactosa, fosfatasa alcalina, el sistema promotor de triptófano (trp) y promotores híbridos, tales como el promotor Tan. Sin embargo, también son adecuados otros promotores bacterianos conocidos. Los promotores para usar en sistemas bacterianos también contendrán una secuencia Shine-Dalgarno (S.D.) enlazada operativamente al ADN que codifica la proteína de la invención. Las secuencias promotoras son conocidas por eucariotas. Prácticamente, todos los genes eucarióticos tienen una región rica en AT ubicada aproximadamente de 25 a 30 bases corriente arriba del sitio donde se inicia la transcripción. Otra secuencia encontrada 70 a 80 bases corriente arriba del inicio de la transcripción de muchos genes es una región CNCAAT en donde N puede ser cualquier nucleótido. En el extremo 3' de la mayoría de los genes eucarióticos, se encuentra una secuencia AATAAA que puede ser la señal para la adición de la cola poli A al extremo 3' de la secuencia codificante. Todas aquellas secuencias se insertan de manera adecuada en los vectores de expresión eucarióticos.
Los ejemplos de secuencias promotoras adecuadas para usar con hospederos de la levadura incluyen los promotores de 3-fosfoglicerato cinasa u otras enzimas glucolíticas, tales como enolasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, hexocinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructocinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato cinasa, triosefosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucocinasa.
Se puede controlar la transcripción de vectores en células hospederas de mamíferos, por ejemplo, mediante promotores obtenidos de los genomas de virus, tales como virus de polioma, virus de difteria aviar, adenovirus (tal como adenovirus 2), virus del papiloma bovino, virus del sarcoma aviar, citomegalovirus, un retrovirus, virus de la hepatitis B y, con máxima preferencia, virus del simio 40 (SV40), de promotores mamíferos heterólogos, por ejemplo, el promotor de actina o un promotor de inmunoglobulina, de promotores de choque término, siempre que tales promotores sean compatibles con los sistemas de célula hospedera.
En general, la transcripción del ADN que codifica una proteína de la invención mediante eucariotas superiores aumenta insertando una secuencia potenciadora en el vector. Se conocen muchas secuencias potenciadoras de genes de mamíferos (globina, elastasa, albúmina, a-fetoproteína e insulina). En general, sin embargo, se usará un potenciador de un virus de célula eucariótica. Los ejemplos incluyen el potenciador SV40 en el último sitio del origen de replicación (bp 100-270), el potenciador del promotor temprano de citomegalovirus, el potenciador de polioma en el último sitio del origen de replicación y potenciadores de adenovirus. Véase también Yaniv, Nature, 297:17-18 (1982) sobre elementos potenciadores para la activación de promotores eucarióticos. El potenciador se puede empalmar con el vector en una posición 5' o 3' con respecto a la secuencia codificadora de péptidos, pero se ubica preferentemente en el sitio 5' del promotor.
Los vectores de expresión que se usan en las células hospederas eucarióticas (por ejemplo, levadura, hongos, insectos, plantas, animales, seres humanos o células nucleadas de otros organismos multicelulares) también contendrán secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y para la estabilización del mARN. En general, estas secuencias se encuentran disponibles en las regiones no traducidas 5' y, ocasionalmente, 3' de ADN o cADN eucarióticos o virales. Estas regiones contienen segmentos de nucleótidos transcriptos como fragmentos poliadenilados en la porción no traducida del mARN que codifica la proteína de la invención. Un componente de terminación de la transcripción útil es la región de poliadenilación de la hormona del crecimiento bovina. Véanse WO 94/11026 y el vector de expresión allí descrito.
El ADN recombinante también puede incluir cualquier tipo de secuencia de etiqueta de proteína que pueda ser útil para purificar la proteína. Los ejemplos de etiquetas de proteínas incluyen, entre otras, una etiqueta de histidina, una etiqueta FLAG, una etiqueta myc, una etiqueta HA o una etiqueta GST. Los vectores de expresión y clonación adecuados para usar con hospederos celulares de bacterias, hongos, levadura y mamíferos se pueden encontrar en Cloning Vectors: A Laboratory Manual, (Elsevier, Nueva York (1985)), cuya descripción relevante se incorpora en la presente por referencia.
El constructo de expresión se introduce en la célula hospedera mediante un método adecuado para la célula hospedera, como será evidente para las personas del oficio de nivel medio. En el arte se conocen varios métodos para introducir ácidos nucleicos en células hospederases, que incluyen, entre otros, electroporación; transfección con cloruro de calcio, cloruro de rubidio, fosfato de calcio, DEAE-dextrano u otras sustancias; bombardeo con microproyectiles; lipofección; e infección (en donde el vector es un agente infeccioso).
Las células hospederas adecuadas incluyen células de procariotas, levadura, mamíferos o bacterias. Las bacterias adecuadas incluyen organismos gramnegativos o grampositivos, por ejemplo, E. coli o Bacillus spp. También se puede usar levadura, preferentemente, de la especie Saccharomyces, tal como S. cerevisiae , para la producción de polipéptidos. También se pueden usar varios sistemas de cultivo celular de mamíferos o insectos para expresar proteínas recombinantes. Los sistemas de baculovirus para la producción de proteínas heterólogas en células de insectos se describen en Luckow et al. (Bio/Technology, 6:47 (1988)). Los ejemplos de líneas de células hospederas de mamífero adecuadas incluyen células endoteliales, células renales de mono COS-7, CV-1, células L, C127, 3T3, ovario de hámster chino (CHO), células renales de embrión humano, y líneas celulares HeLa, 293, 293T y BHK. Los polipéptidos purificados se preparan cultivando sistemas de hospedero/vector adecuados para expresar las proteínas recombinantes. En muchas aplicaciones, debido al pequeño tamaño de los polipéptidos descritos en la presente, la expresión en E. coli sería el método de expresión preferido. Luego la proteína se purifica del medio de cultivo o de los extractos celulares.
VI. Producción de proteínas La presente invención también se refiere a líneas celulares que expresan una adnectina antimiostatina o el polipéptido de fusión de esta. La creación y el aislamiento de líneas celulares que producen una adnectina antimiostatina se pueden lograr usando téenicas estándares conocidas en el estado de la técnica, tales como las descritas en la presente.
Las células hospederas se transforman con los vectores de expresión o clonación descritos en la presente para la producción de proteínas, y se cultivan en un medio de nutrientes convencional modificado según sea adecuado para inducir promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas. En los ejemplos que se muestran en la presente, las células hospederas que se usan para la producción de proteínas de alto rendimiento (HTPP) y la producción a mediana escala fueron los de la cepa bacteriana HMS174.
Las adnectinas de la presente invención también se pueden obtener en forma aglucosilada mediante la producción de las adnectinas, por ejemplo, en células procarióticas (por ejemplo, E. coli) . Cabe destacar que las formas aglucosiladas de las adnectinas de la invención muestran una afinidad, una potencia y un mecanismo de acción iguales a los de las adnectinas glucosiladas cuando se las evalúa in vitro.
Las células hospederas que se usan para obtener las proteínas de la presente invención se pueden cultivar en varios medios. Los medios disponibles en el comercio, tales como, Ham's FIO (Sigma), medio esencial mínimo ((MEM), Sigma), RPMI-1640 (Sigma) y medio Eagle modificado por Dulbecco ((DMEM), Sigma) son adecuados para cultivar células hospederases. Además, varios de los medios descritos en Ham et al., Meth Enzymol., 58:44 (1979), Barites et al., Anal.
Biochem., 102:255 (1980), las patentes estadounidenses Nos. 4,767,704, 4,657,866, 4,927,762, 4,560,655, 5,122,469, 6,048,728, 5,672,502 o la patente estadounidense No. RE 30,985 se pueden usar como medio de cultivo para las células hospederases. Cualquiera de estos medios se puede enriquecer, según sea necesario, con hormonas y/u otros factores de crecimiento (tales como insulina, transferrina o factor de crecimiento epidérmico), sales (tales como cloruro de sodio, calcio, magnesio y fosfato), amortiguadores (tales como HEPES), nucleótidos (tales como, adenosina y timidina), antibióticos (tales como el fármaco gentamicina), oligoelementos (definidos como compuestos inorgánicos usualmente presentes en concentraciones finales en el intervalo micromolar) y glucosa o una fuente de energía equivalente. También se pueden incluir otros complementos necesarios en concentraciones adecuadas conocidas por las personas del oficio de nivel medio. Las condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH y similares, son las que se usaron previamente con la célula hospedera seleccionada para la expresión y serán evidentes para las personas del oficio de nivel medio.
Las proteínas descritas en la presente también se pueden obtener con sistemas de traducción celular. Para ello, los ácidos nucleicos que codifican el polipéptido se deben modificar para permitir la transcripción in vitro, a fin de producir mARN y permitir la traducción libre de células de mARN en el sistema libre de células particular que se usa (eucariótico, tal como un sistema de traducción libre de células de levadura o mamífero, o procariótico, tal como un sistema de traducción libre de células bacterianas).
Las proteínas de la invención también se pueden obtener mediante síntesis química (por ejemplo, mediante los métodos descritos en Solid Phase Peptide Synthesis, 2.a edición, The Pierce Chemical Co., Rockford, 111. (1984)). Las modificaciones de la proteína también se pueden realizar mediante síntesis química.
Las proteínas de la presente invención se pueden purificar mediante métodos de aislamiento/purificación de proteínas generalmente conocidos en el campo de la química de las proteínas. Los ejemplos incluyen extracción, recristalización, salado (por ejemplo, con sulfato de amonio o sulfato de sodio), centrifugación, diálisis, ultrafiltración, cromatografía por adsorción, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía hidrófoba, cromatografía de fase normal, cromatografía de fase inversa, filtración en gel, cromatografía de permeación en gel, cromatografía por afinidad, electroforesis, distribución a contracorriente o cualquier combinación de estos. Después de la purificación, los polipéptidos se pueden intercambiar en diferentes amortiguadores y/o se pueden concentrar mediante diversos métodos conocidos en el estado de la téenica, que incluyen, por ejemplo, filtración y diálisis.
El polipéptido purificado es, preferentemente, al menos 85 % puro, con mayor preferencia, al menos 95 % puro y, con máxima preferencia, al menos 98 % puro. Independientemente del valor numérico exacto de la pureza, el polipéptido es suficientemente puro para usar como producto farmacéutico.
VII. Caracterización biofísica y bioquímica La fijación de una adnectina antimiostatina de la invención a una molécula objetivo (por ejemplo, miostatina) se puede evaluar en términos de constantes de equilibrio (por ejemplo, disociación, KD) y en términos de constantes cinéticas (por ejemplo, constante de asociación, kencendido, Y constante de disociación, kapagado)· En general, la adnectina se fija a una molécula objetivo con una KD de menos de 500 nM, 100 nM, 10 nM, 1 nM, 500 pM, 200 pM o 100 pM, aunque se pueden tolerar valores de KD más elevados cuando kpagado es suficientemente baja o kencendido es suficientemente alta.
Ensayos in vitro de afinidad de fijación Las adnectinas antimiostatina que se fijan a miostatina y la antagonizan se pueden identificar usando varios ensayos in vitro. Preferentemente, los ensayos son ensayos de alto rendimiento que permiten la evaluación de varias adnectinas candidatas simultáneamente. En algunas modalidades, BMP-11, que comparte el 90 % de identidad de aminoácidos con miostatina, se puede usar como reemplazo de miostatina en ensayos in vitro cuando el ensayo se realiza en condiciones de saturación. Cabe destacar que las adnectinas antimiostatina fusionadas a los dominios Fe se pueden fijar a miostatina y a BMP-11, mientras que las monoadnectinas se fijan preferentemente a miostatina. Sin limitarse a la teoría, esto puede reflejar el aumento de la avidez de adnectinas fusionadas a Fe bivalentes en comparación con las adnectinas monovalentes. Se observa una mejora de fijación a BMP11 similar con adnectinas PEGiladas bivalentes, tales como ATI-1341, que comprenden adnectinas fusionadas a dos extremos de una porción PEG de 20kDa.
Se describen ensayos ilustrativos para determinar la afinidad de fijación de adnectinas antimiostatina en los Ejemplos que se indican más adelante e incluyen, entre otros, métodos de fase de solución, tal como el ensayo de exclusión cinético (KinExA) (Blake et al., JBC 1996;271:27677-85; Drake et al., Anal Biochem 2004;328:35-43), la resonancia de plasmones superficiales (SPR) con el sistema Biacore (Uppsala, Suecia) (Welford et al., Opt. Quant. Elect 1991;23:1; Morton and Myszka, Methods in Enzymology 1998;295:268) y ensayos de fluorescencia homogénea de resolución temporal (HTRF) (Newton et al., J Biomol Screen 2008;13:674-82; Patel et al., Assay Drug Dev Technol 2008;6:55-68).
En algunas modalidades, las interacciones biomoleculares se pueden controlar en tiempo real con el sistema Biacore, que utiliza SPR para detectar cambios en el ángulo de resonancia de la luz en la superficie de una película dorada delgada en un soporte de vidrio debido a los cambios en el índice refractario de la superficie hasta 300 nm de distancia. El análisis Biacore genera constantes de velocidad de asociación, constantes de velocidad de disociación, constantes de disociación de equilibrio y constantes de afinidad. La afinidad de fijación se obtiene evaluando las constantes de velocidad de asociación y disociación con un sistema de resonancia de plasmones superficiales Biacore (Biacore, Inc.). Se activa un chip biosensor para el acoplamiento covalente del objetivo. Luego, el objetivo se diluye y se inyecta en el chip para obtener una señal en unidades de respuesta de material inmovilizado. Dado que la señal en unidades de resonancia (RU) es proporcional a la masa de material inmovilizado, esto representa un intervalo de densidades objetivo inmovilizadas en la matriz. Los datos de asociación y disociación se ajustan simultáneamente en un análisis global para resolver la expresión de velocidad neta para una interacción biomolecular 1:1, lo que da como resultado mejores valores de ajuste para kencendido, kapagado y Rma (respuesta maxima en saturación). Las constantes de disociación de equilibrio para la fij ación, KD, se calculan de mediciones SPR como kapagado/k encendido · En algunas modalidades, las adnectinas antimiostatina de la invención muestran una KD en el ensayo de afinidad SPR descrito en el Ejemplo 6 de 500 nM o menos, 400 nM o menos, 300 nM o menos, 200 nM o menos, 150 nM o menos, 100 nM o menos, 90 nM o menos, 80 nM o menos, 70 nM o menos, 60 nM o menos, 50 nM o menos, 40 nM o menos, 30 nM o menos, 20 nM o menos, 15 nM o menos, 10 nM o menos, 5 nM o menos, o 1 nM o menos. Preferentemente, KD es de 15 nM o menos. Con mayor preferencia, KD es de 2.0 nM o menos.
En algunas modalidades, las adnectinas antimiostatina de la invención muestran un IC50 en el ensayo HTRF descrito en el Ejemplo 4 de 5 nM o menos, 4 nM o menos, 3 nM o menos, 2.5 nM o menos, 2 nM o menos, 1.5 nM o menos, 1 nM o menos, 0.5 nM o menos, 0.2 nM o menos, o 0.1 nM o menos. Preferentemente, IC50 es de 1.5 nM o menos. Con mayor preferencia, IC50 es de 0.5 nM o menos.
En algunas modalidades, las adnectinas antimiostatina de la invención muestran una KD en el ensayo de exclusión cinético descrito en el Ejemplo 7 de 2 nM o menos, 1.5 nM o menos, 1 nM o menos, 900 pM o menos, 850 pM o menos, 800 pM o menos, 750 pM o menos, 700 pM o menos, 650 pM o menos, 600 pM o menos, 550 pM o menos, 500 pM o menos, 450 pM o menos, 400 pM o menos, 350 pM o menos, 340 pM o menos, 330 pM o menos, 300 pM o menos, 250 pM o menos, 200 pM o menos, 150 pM o menos, o 100 pM o menos. Preferentemente, KD es de 850 pM o menos.
Cabe destacar que los ensayos descritos anteriormente son ejemplificativos y que se puede utilizar cualquier método conocido en el estado de la téenica para determinar la afinidad de fijación entre proteínas (por ejemplo, transferencia a base de fluorescencia (FRET), ensayo inmunoabsorbente enlazado a enzimas y ensayos de fijación competitiva (por ejemplo, radioinmunoensayos)), a fin de evaluar las afinidades de fijación de las adnectinas antimiostatina de la invención.
Ensayos in vitro de actividad antagonista La capacidad de las adnectinas antimiostatina de antagonizar la actividad de miostatina se puede determinar fácilmente usando diversos ensayos in vítro. Preferentemente, los ensayos son ensayos de alto rendimiento que permiten la evaluación de varias adnectinas candidatas simultáneamente. En algunas modalidades, los efectos antagonistas de las adnectinas antimiostatina en la actividad de la miostatina se puede determinar mediante ensayos celulares de elementos sensibles a activina (ARE)-indicadores de luciferasa, como se describe en el Ejemplo 3. En ciertas modalidades, las adnectinas antimiostatina de la invención disminuyen la actividad de ARE-luciferasa inducida por miostatina en al menos 10 %, al menos 20 %, al menos 30 %, al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 % o más con respecto a un control al momento de la coincubación de iostatina con una adnectina antimiostatina antes de la estimulación de las células con la mezcla. Un ejemplo de reacción de control implica tratar las células con miostatina sola o con miostatina preincubada con un exceso de un inhibidor de miostatina de referencia, tal como Quimera Fe RIIB de activina humana (R&D Systems) o ActRIIb-Fc, como se describe en Morrison et al. ( Experimental Neurology 2009; 217:258-68). En otras modalidades, las adnectinas antimiostatina de la invención inhiben la actividad de ARE-indicador de luciferasa con un IC50 de 500 nM o menos, 400 nM o menos, 300 nM o menos, 200 nM o menos, 100 nM o menos, 50 nM o menos, 10 nM o menos, 5 nM o menos, 1 nM, 0.5 nM o menos, 0.4 nM o menos, 0.3 nM o menos, 0.2 nM o menos, o 0.10 nM o menos, como se describe en el Ejemplo 3.
En otras modalidades, los efectos antagonistas de las adnectinas antimiostatina en la actividad de miostatina se pueden determinar midiendo el alcance de la fosforilación SMAD en células tratadas con miostatina, como se describe en el Ejemplo 5. En ciertas modalidades, las adnectinas antimiostatina de la invención disminuyen la fosforilación SMAD inducida por miostatina en al menos 10 %, al menos 20 %, al menos 30 %, al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 95 o al menos 97 % o más con respecto a un control al momento de la coincubación de miostatina con una adnectina antimiostatina antes de la estimulación de las células con la mezcla. Un ejemplo de reacción de control implica tratar las células con miostatina sola o con miostatina preincubada con un exceso de un inhibidor de miostatina de referencia, tal como Quimera Fe RIIB de activina humana (R&D Systems) o ActRIIb-Fc, como se describe en Morrison et al. ( Experimental Neurology 2009; 217:258-68). En algunas modalidades, las adnectinas antimiostatina de la invención inhiben la fosforilación SMAD con una IC50 de 1 nM o menos, 0.8 nM o menos, 0.6 nM o menos, 0.4 nM o menos, 0.3 nM o menos, 0.2 nM o menos, o 0.1 nM o menos en una respuesta inhibidora de 12 puntos o 4 puntos, como se describe en el Ejemplo 5. En otras modalidades, las adnectinas antimiostatina de la invención a 10 nM inhiben la fosforilación SMAD mediante miostatina en al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, o al menos 98 % o más, como se describe en el Ejemplo 5.
Además, se conocen varios sistemas de modelos in vitro que utilizan células, cultivo tisular y métodos histológicos para estudiar la enfermedad de las motoneuronas. Por ejemplo, un cultivo organotípico de médula espinal de rata sometido a excitotoxicidad de glutamato es útil como sistema de modelo para evaluar la eficacia de adnectinas antimiostatina para la prevención de la degeneración de las motoneuronas . Corsé et al . , Neurobiol . Dis . (1999) 6 : 335 346. Para el análisis de sistemas in vitro para su uso en el estudio de ALS , consulte , por ejemplo, Bar, P. R. , Eur. J. Phantiacol . (2000) 405 :285 295; Silani et al . , J. Neurol. (2000) 247 Suppl 1 : 128 36; Martin et al . , Int. J. Mol. Med. (2000) 5 :3 13.
Cabe destacar que los ensayos descritos en la presente son ejemplificativos y que cualquier método conocido en el estado de la téenica que pueda ser útil como una lectura de la actividad de miostatina es adecuado para la evaluación de los efectos antagonizantes de miostatina de las adnectinas antimiostatina de la invención (por ej emplo, RT-PCR en tiempo real de mARN de los genes obj etivo de SMAD (por ejemplo, Smad 7 ; Ciármela et al . , Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism 2011 ; 96 ; 755-65 ) o mARN de genes que contienen ARE) .
Modelos in vivo Existen varios modelos animales conocidos en el estado de la técnica que recapitulan los síntomas de enfermedades, trastornos y afecciones asociados a atrofia muscular progresiva relacionados, por ejemplo, a trastornos musculares, neuro usculares, neurológicos y metabólicos. Estos modelos se pueden usar para evaluar la eficacia de las adnectinas antimiostatina de la invención.
Los ejemplos de estos modelos animales incluyen, por ejemplo, el modelo de ratón de distrofia muscular enlazada al cromosoma X (mdx) (US2011/0008375, Gehrig et al., Nature 2012;484:394-8), que incluye 4 cepas adicionales de ratón mdx — ratón mdx2cv, mdx3cv, mdx4cv o mdx5cv (Phelps et al . , Human Molecular Genetics. 1996/5(8):1149-1153), ratón mdx con ablación adicional de la utrofina homologa a distrofina (mdx/utr-/~) (Deconinck et al . , Cell . 1997;90 (4):717-727), el ratón C57BL/6 con inactivación de alfa-SG (Duelos et al . i (1998) J. Cell Biol.142, 1461-1471), y los analizados recientemente en Nakamura et al., (J Biomed Biotechnol . 2011; # de artículo: 184393), por ejemplo, el ratón mdx52, en donde se elimina el exón 52 del gen DMD murino, el modelo de distrofia muscular de golden retriever (GRMD), el modelo de distrofia muscular ligado al cromosoma X canino (CXMD) y el modelo de distrofia hipertrófica muscular felino (HFMD) (por ejemplo, Shelton et al . , Neuromuscular Disorders . 2005;15(2):127-138).
Los modelos animales para el estudio de trastornos motoneuronales, tales como ALS, son ratones transgenicos con un gen de superóxido dismutasa (S0D1) Cu/Zn mutante ligado a ALS (mSODlG93A y/o mSODlG37R). Estos ratones desarrollan un trastorno paralítico de aparición en la adultez predominantemente hereditario con varias de las características clínicas y patológicas de ALS familiar, (por ejemplo, Gurncy et al., Science (1994) 264:17721775; Nagano et al., Life Sci (2002) 72:541 548). Otros modelos animales incluyen dos modelos murinos naturales de neuropatía motora progresiva (pmn) y síndrome de Wobbler (Haegggeli and Kato, Neurosci. Lett. (2002) 335:3943). Para una reseña de varios modelos animales para usar en el estudio de enfermedades motoneuronales, tales como ALS, véase, por ejemplo, Jankowsky et al., Curr Neurol Neurosci. Rep. (2002) 2:457464; Elliott, J. L., Neurobiol. Dis. (1999) 6:310 20; y Borchelt et al., Brain Pathol. (1998) 8:735757.
Los modelos animales de otras enfermedades neurodegenerativas o neuropatológicas, además de ALS, incluyen un modelo de ratón transgénico para evaluar la atrofia muscular espino-bulbar (SBMA) (Katsuno et al., Neuron (2002) 35:843 854), modelos animales de poliomielitis paralítica humana (Ford et al., Microb. Pathog. (2002) 33:97 107), modelos animales de atrofia muscular de la médula espinal (Schmid et al., J. Child Neurol. 22, 1004-1012, 2007), modelos animales de miopatía distal y miopatía hereditaria por cuerpos de inclusión (Malicdan et al ., Acta Myol. diciembre de 2007; 26(3): 171-175), modelo murino de enfermedad desmielinizante genética (Suzuki et al., Microsc. Res. Tech. 1995; 32:204-214), y los descritos por Meyer ZuHórste et al. (Curr. Opin. Neurol.2006; 19:464-473).
Los modelos animales para evaluar la eficacia de las adnectinas antimiostatina de la invención contra la pérdida de volumen muscular debido a atrofia y/o inactividad incluyen, entre otros, modelos de ratón de inmovilización unilateral (Madaro et al., Basic Applied Myology 2008;18:149-153), desgarro del tendón de Aquiles (tenotomía) (Bialek et al., Physiol Genomics 2011; 43:1075-86) y los descritos en Powers et al. (Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 2005; 288:R337-44), tal como suspensión trasera de animales, inmovilización de las extremidades y ventilación mecánica controlada.
Los modelos animales pertinentes para evaluar la eficacia de las adnectinas antimiostatina de la invención en el tratamiento de trastornos metabólicos incluyen, entre otros, los descritos en Ramaro et al. (Indian J Med Res 2007; 125:451-472) y Kennedy et al. (Disease Models & Mechanisms 2010; 3:156-166); ambos se incorporan en la presente como referencia en su totalidad). Los ejemplos de estos modelos animales incluyen ratones Lepob/ob, ratones Lepr^, ratones Kuo kencendidodo, ratones KK/Ay, ratones obesos de Nueva Zelanda (NZO), ratones NONcNZOlO, ratones obesos diabéticos Tsumara Suzuki (TSOD) y ratones no obesos Tsumara Suzuki (TSNO), ratones M16, ratas obesas Zucker, ratas obesas diabéticas Zucker, ratas SHR/N- cp, ratas JCR/LA -cp, ratas obesas Otsuka Long Evans Tokushima, monos obesos Macaca mulatta, ratas diabéticas Cohén, ratas Goto-Kakizaki y ratones C57 BL/6 mutantes no obesos (Akita). La diabetes tipo 2 también se puede inducir por alimentación, por ejemplo, alimentando ratones C57BL6 sin obesidad ni diabetes con una dieta con alto contenido graso (Surwit et al., Diabetes 1988;37:1163-7). La diabetes tipo 2 también se puede inducir químicamente, por ejemplo, con tioglucosa de oro (Le Marchand Brustel et al., Am J Physiol 1978,-234:E348-58) o estreptozotocina, o se puede inducir quirúrgicamente (por ejemplo, animales diabéticos con pancreatectomía parcial) (McNeil JH., Experimental models of diabetes. Florida, US: CRC Press LLc; 1999; Sasaki et al., In Vivo 2000; 14:535-41). También se sabe que varios modelos animales genéticos recapitulan los síntomas y fenotipos de trastornos metablólicos, tales como los descritos en Kennedy et al., 2010 {supra) .
En algunas modalidades, se puede evaluar la eficacia de las adnectinas antimiostatina de la invención para aumentar el volumen o la masa muscular mediante la inyección subcutánea a ratones, como se describe en el Ejemplo 9. Dado que la inhibición de la miostatina aumenta la masa muscular, se prevé que las adnectinas antimiostatina de la invención aumentan el peso corporal y la masa muscular, cuyo alcance se puede usar para determinar la potencia de las adnectinas.
En algunas modalidades, en particular cuando las adnectinas antimiostatina son inmunogénicas en ratones (por ejemplo, debido al uso del dominio de fibronectina humana tipo III) y cuando los tratamientos crónicos resultan convenientes, las adnectinas antimiostatina de la invención se pueden administrar a ratones SCID, que no pueden aumentar las respuestas inmunitarias humorales o celulares. En algunas modalidades, los ratones SCID se pueden cruzar con otros modelos genéticos, tales como los descritos en la presente (por ejemplo, ratones diabéticos), para desarrollar un modelo de ratón inmunodeprimido al que se le puede administrar un tratamiento crónico con las adnectinas antimiostatina de la invención.
VIII. Aplicaciones terapéuticas En un aspecto, la presente invención proporciona adnectinas antimiostatina útiles para el tratamiento de enfermedades o trastornos relacionados con miostatina, por ejemplo, trastornos de atrofia muscular progresiva, atrofia muscular, trastornos metabólicos y trastornos degenerativos óseos. En consecuencia, en ciertas modalidades, la invención proporciona métodos para atenuar o inhibir una enfermedad o un trastorno relacionados con la miostatina en un sujeto, que comprende administrar una cantidad eficaz de un polipéptido de fijación a miostatina, es decir, una adnectina antimiostatina, a un sujeto. En algunas modalidades, el sujeto es un ser humano. En algunas modalidades, las adnectinas antimiostatina son aceptables desde el punto de vista farmacéutico para un mamífero, en particular, un ser humano. Un polipéptido "aceptable desde el punto de vista farmacéutico" se refiere a un polipéptido que se administra a un animal sin consecuencias médicas adversas considerables, tales como esencialmente libre de endotoxina o con niveles de endotoxina muy bajos.
En algunas modalidades, las adnectinas antimiostatina de la presente invención se administran a un sujeto en combinación (en forma concurrente o separada) con un agente conocido en el estado de la téenica que es útil para el trastorno o la enfermedad particulares que se tratan.
En algunas modalidades, la población objetivo de pacientes para la terapia con adnectina antimiostatina es una que no puede recibir una terapia estándar para la enfermedad, el trastorno o la afección que se tratan, por ejemplo, debido a factores como la edad, las afecciones preexistentes, la información genética y/o las comorbilidades. Las adnectinas antimiostatina de la invención pueden funcionar como alternativa a las terapias existentes asociadas a efectos secundarios considerables (por ejemplo, rendimiento reproductivo) o problemas con respecto a la seguridad.
Los ejemplos de enfermedades, trastornos y afecciones para los cuales las adnectinas antimiostatina de la presente invención serán útiles se describen en más detalle a continuación.
Enfermedades y trastornos musculares, neurológicos y metabólicos Las adnectinas antimiostatina de la presente invención se pueden usar para tratar trastornos musculares, neurológicos y metabólicos asociados a la atrofia muscular progresiva y/o atrofia muscular. Por ejemplo, la sobreexpresión de miostatina in vivo induce signos y síntomas característicos de la caquexia, y los agentes de fijación a miostatina pueden resolver parcialmente el efecto de atrofia muscular progresiva de la miostatina (Zimmers et al., Science 2002; 296:1486-8). Los pacientes con SIDA también muestran un aumento de los niveles séricos de material inmunorreactivo a miostatina en comparación con pacientes sin SIDA o con pacientes con SIDA que no muestran pérdida de peso (Gonzalez-Cadavid et al., PNAS 1998; 95:14938-43). También se ha observado que la eliminación específica cardíaca de miostatina reduce la atrofia muscular esquelética en ratones con insuficiencia cardíaca, y en cambio, la sobreexpresión de miostatina específica en el corazón es suficiente para inducir la atrofia muscular progresiva (Breitbart et al., AJP-Heart ; 2011; 300:H1973-82). Por el contrario, los ratones con inactivación de miostatina muestran mayor masa muscular y menor la acumulación de grasa dependencia de la edad en comparación con sus contrapartes de tipo silvestre (McPherron et al., J. Clin. Invest . 2002; 109:595-601).
Los ejemplos de trastornos que se pueden tratar de conformidad con los métodos de la invención incluyen miopatías y neuropatías que incluyen, a su vez, por ejemplo, enfermedad de las motoneuronas, y trastornos neuromusculares y neurológicos.
Por ejemplo, las adnectinas anti iostatina se pueden usar para tratar miopatías hereditarias y trastornos neuromusculares (por ejemplo, distrofia muscular (Gonzalez-Kadavid et al., PNAS, 1998;95:14938-43), trastornos motoneuronales, miopatías congénitas, miopatías inflamatorias y miopatías metabólicas), y también miopatías adquiridas (por ejemplo, miopatía inducida por fármacos, miopatía inducida por toxinas, miopatía inducida por infecciones, miopatía paraneoplásica y otras miopatías asociadas a enfermedades graves).
Tales trastornos incluyen, entre otros, distrofia muscular de Duchenne, distrofia muscular progresiva, distrofia muscular de Becker, distrofia muscular de Dejerine-Landouzy, distrofia muscular de Erb, distrofia muscular de Emery Dreifuss, distrofia muscular de la cintura y las extremidades, distrofia muscular oculofaríngea (OPMD, por sus siglas en inglés), distrofia muscular facioescapulohumeral, distrofia muscular congénita, distrofia muscular neuroaxonal infantil, distrofia miotónica (enfermedad de Steinert), distrofia muscular distal, miopatía nemalínica, parálisis periódica familiar, miotonia no distrófica, parálisis periódica, atrofia muscular de la médula espinal, atrofia muscular de la médula espinal (SMA, por sus siglas en inglés), esclerosis lateral amiotrófica (ALS, por sus siglas en inglés), esclerosis lateral primaria (PLS, por sus siglas en inglés), atrofia muscular progresiva (PMA, por sus siglas en inglés), miopatía distal, miopatía iotubular/centronuclear, miopatía nemalínica, miopatía de minicuerpos centrales, miopatía de cuerpos centrales, desminopatía, miositis por cuerpos de inclusión, dermatomiositis, polimiositis, miopatía mitocóndrica, síndrome miasténico congénito, miastenia grave, disfunción muscular pospoliomielítica, miopatía por esteroides, miopatía por alcohol, atrofia muscular perioperatoria y neuromiopatía de la unidad de cuidados intensivos.
Las radiculopatías y neuropatías hereditarias y adquiridas que se pueden tratar con adnectinas antimiostatina incluyen, entre otras, síndrome de la columna vertebral rígida, enfermedad de músculo, ojo y cerebro, neuropatía hereditaria motora y sensorial, enfermedad de Carcot-Marie-Tooth, neuropatía inflamatoria crónica, neuropatía hipertrófica progresiva, neuropatía tomaculosa, lupus, síndrome de Guillain-Barré, polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, esclerosis múltiple, sarcoidosis, neuropatía diabética, neuropatía por alcohol, neuropatías relacionadas con enfermedades (por ejemplo, V1H/SIDA, enfermedad de Lyme), neuropatías relacionadas con toxinas (por ejemplo, metales pesados, quimioterapia), neuropatías por compresión (por ejemplo, tumores, neuropatía compresiva) y neuropatías asociadas a lesiones o traumatismos (por ejemplo, síndrome de la cauda equma, paraplejia, cuadriplejia).
En algunas modalidades, las adnectinas antimiostatina de la invención se pueden usar para tratar distrofias musculares (por ejemplo, distrofia muscular de Duchenne, distrofia muscular de Becker), ALS y sarcopenia.
Otros trastornos asociados a la atrofia muscular progresiva que se pueden tratar con las adnectinas antimiostatina de la invención incluyen caquexia, síndrome consuntivo, sarcopenia, enfermedad pulmonar obstructiva congestiva, fibrosis quística (caquexia pulmonar), enfermedades cardíacas o insuficiencia cardíaca (caquexia cardíaca), cáncer, consunción producida por SIDA, consunción producida por insuficiencia renal, nefropatías, claudicación, caquexia asociada a diálisis, uremia, artritis reumatoide, lesión muscular, cirugía, reparación del músculo dañado, fragilidad, atrofia por inactividad, osteoporosis, osteoartritis, crecimiento y reparación de ligamentos.
Los métodos de la invención también se pueden usar para aumentar el volumen muscular en sujetos que sufren de atrofia muscular por inactividad. La atrofia por inactividad puede producirse por diferentes causas que incluyen cualquier trastorno o estado que provoque inmovilidad o inactividad prolongada, por ejemplo, reposo prolongado, uso de silla de ruedas, inmovilidad de las extremidades, descarga del diafragma mediante ventilación mecánica, trasplante de órganos sólidos, reemplazo de articulaciones, apoplejía, debilidad relacionada con daño del SNC, lesión de la médula espinal, recuperación de una quemadura grave, hemodiálisis crónica sedentaria, recuperación postraumática, recuperación de la septicemia y exposición a la microgravedad (Powers et al., Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 2005;288:R337-44).
Además, el aumento de la relación entre la grasa y el músculo relacionado con la edad, y la atrofia muscular relacionada con la edad parecieran estar relacionados con la miostatina. Por ejemplo, el promedio de proteína miostatina inmunorreactiva sérica aumentó con la edad en grupo de jóvenes (19-35 años), adultos (36-75 años) y adultos mayores (76-92 años) hombres y mujeres, mientras que el promedio de masa muscular y masa libre de grasa disminuyeron con la edad en estos grupos (Yarasheski et al. J Nutr Aging 6(5):343-8 (2002)). En consecuencia, los sujetos con atrofia muscular debido al envejecimiento y/o los sujetos que presentan debilidad, por ejemplo, por sarcopenia, también se beneficiarían del tratamiento con las adnectinas antimiostatina de la invención.
También se contemplan métodos para aumentar la masa muscular en animales para consumo administrando una dosis eficaz de las adnectinas antimiostatina a estos animales. Dado que el polipéptido de miostatina maduro del C-terminal es idéntico en todas las especies, se podría prever que las adnectinas antimiostatina aumentan de manera eficaz la masa muscular y reducen la grasa en todas las especies importantes desde el punto de vista agrícola, por ejemplo, ganado, gallinas, pavos y cerdos.
La eficacia de la adnectina antimiostatina para el tratamiento de trastornos de atrofia muscular progresiva o atrofia muscular se pueden determinar, por ejemplo, mediante uno o más métodos para medir el aumento del volumen o de la masa muscular, el aumento de la cantidad de células musculares (hiperplasia), el aumento del tamaño de las células musculares (hipertrofia) y/o el aumento de la fuerza muscular. Por ejemplo, efectos sobre el aumento del volumen muscular de las adnectinas antimiostatina de la presente invención se indican en los Ejemplos descritos más adelante. Los métodos para determinar el "aumento de la masa muscular" son conocidos en el estado de la téenica. Por ejemplo, el contenido muscular se puede medir antes y después de la administración de una adnectina antimiostatina de la invención usando técnicas estándares, tales como el peso bajo el agua (véase, por ejemplo, Bhasin et al. New Eng. J. Med. (1996) 335:1-7) y absorciometría de rayos X de energía dual (véase, por ejemplo, Bhasin et al. Mol. Endocrinol. (1998) 83:3155-3162). El incremento del tamaño muscular se puede demostrar mediante el aumento de peso de al menos alrededor de 5-10 %, preferentemente, al menos alrededor de 10-20 % o más.
Trastornos me tabélleos Las adnectinas antimiostatina de la presente invención, que reducen la actividad de miostatina y/o la señalización, son útiles para el tratamiento de trastornos metabólicos, tales como obesidad, diabetes mellitus tipo II, trastornos relacionados con la diabetes, síndrome metabólico e hiperglucemia.
La miostatina está involucrada en la patogénesis de la diabetes mellitus tipo II. La miostatina se expresa en el tejido adiposo, y los ratones con deficiencia de miostatina presentan una reducción en la acumulación de grasa a medida que envejecen. Además, los ratones obesos (Lepob/ob) amarillos con el gen agouti mortal que carecen de miostatina presentan una reducción de la concentración de glucosa, la acumulación de grasa y el peso corporal total (Yen et al., FASEB J. 8:479, 1994; McPherron et al., 2002). Como se describe en US2011/0008375, los antagonistas de miostatina pueden disminuir la relación entre grasa y músculo en un modelo de ratón de edad avanzada, conservar la masa muscular esquelética y la masa corporal magra, y atenuar la hipertrofia renal en ratones diabéticos inducidos por STZ.
Como se usa en la presente, el término "obesidad" se refiere a una afección en donde el exceso de grasa corporal se acumuló de tal manera que la salud puede verse afectada en forma negativa. Con frecuencia, se define como un índice de masa corporal (IMC) de 30 kg/m2 o más, que se diferencia del sobrepeso definido como un IMC de 25 kg/m2 o más (véase, por ejemplo, Organización Mundial de la Salud (2000) (PDF). Technical report series 894: Obesity: Preventing and managing the global epidemic. Ginebra: Organización Mundial de la Salud). Un peso corporal excesivo está asociado a varias enfermedades, en particular, enfermedades cardiovasculares, diabetes mellitus tipo II, apnea obstructiva del sueño, ciertos tipos de cáncer y osteoartritis.
Se puede identificar un sujeto con obesidad, por ejemplo, mediante la determinación del IMC (el IMC se calcula dividiendo la masa por la altura del sujeto al cuadrado), de la circunferencia de la cintura y el índice cintura-cadera (la circunferencia de cintura total (>102 cm en hombres y >88 cm en mujeres) y el índice de cintura-cadera (la circunferencia de la cintura dividida por la de la cadera de >0.9 en hombres y >0.85 en mujeres) (véase, por ejemplo, Yusuf S, et al., (2004). Lancet 364: 937-52), y/o el porcentaje de grasa corporal (grasa corporal total expresada como un porcentaje del peso corporal total: los hombres con más de 25 % de grasa corporal y las mujeres con más de 33 % de grasa corporal son obesos; el porcentaje de grasa corporal se puede calcular del IMC de la persona mediante la siguiente fórmula: % de grasa corporal = (1.2 * BMI) + (0.23 * edad) -5.4 - (10.8 * sexo); el sexo es 0 en el caso de las mujeres y 1 en el caso de los hombres). Las téenicas de medición del porcentaje de grasa corporal incluyen, por ejemplo, tomografía computarizada (TC), imagen por resonancia magnética (MIZI, por sus siglas en inglés) y absorciometría de rayos X de energía dual (DEXA, por sus siglas en inglés).
La expresión "diabetes tipo II" se refiere a una enfermedad crónica de por vida que se produce cuando la insulina del cuerpo no funciona de manera eficaz. Un componente principal de la diabetes tipo II es la "resistencia a la insulina", en donde la insulina producida por el páncreas no se puede conectar con las células de la grasa y de los músculos para permitir el ingreso de la glucosa para producir energía, lo cual produce hiperglucemia (alto nivel de glucosa en sangre). Para compensar, el páncreas produce más insulina, y las células, que dan cuenta de este aumento de insulina, se vuelven aún más resistentes, lo que da como resultado un círculo vicioso de altos niveles de glucosa y, con frecuencia, altos niveles de insulina.
La frase "trastornos asociados a la diabetes" o "trastornos relacionados con la diabetes", como se usan en la presente, se refieren a afecciones y otras enfermedades que están habitualmente relacionadas con la diabetes. Los ejemplos de trastornos asociados a la diabetes incluyen, por ejemplo, hiperglucemia, hiperinsulinemia, hiperlipidemia, resistencia a la insulina, intolerancia a la glucosa, obesidad, retinopatía diabética, degeneración macular, cataratas, nefropatía diabética, glomeruloesclerosis, neuropatía diabética, disfunción eréctil, síndrome premenstrual, reestenosis vascular, colitis ulcerosa, cardiopatía coronaria, hipertensión, angina de pecho, infarto de miocardio, apoplejía, trastornos cutáneos y del tejido conectivo, úlceras en el pie, acidosis metabólica, artritis y osteoporosis.
La eficacia de las adnectinas antimiostatina para el tratamiento de trastornos metabólicos se puede determinar, por ejemplo, mediante uno o más métodos para medir un aumento de la sensibilidad a la insulina, un aumento de la absorción celular de glucosa en el sujeto, una disminución de los niveles de glucosa en sangre y una disminución de la grasa corporal.
Por ejemplo, en sujetos con diabetes tipo II o que presentan riesgo de desarrollar diabetes, se pueden controlar los niveles de HbAlc. Como se usan en la presente, las expresiones "hemoglobina 1AC" o "HbAlc" se refieren al producto de una glucación no enzimática de la cadena de hemoglobina B. El intervalo deseado de niveles de HbAlc para personas con diabetes se puede determinar de las pautas de la American Diabetes Association (ADA), es decir, the Standards of Medical Care in Diabetes ( Diabetes Care 2012;35(Suppl 1):S511-563). Los niveles objetivo de HbAlc actuales, en general, son de <7.0 % para personas con diabetes; las personas que no tienen diabetes, en general, presentan valores de HbAlc inferiores a 6 %. En consecuencia, la eficacia de las adnectinas antimiostatina de la presente invención se puede determinar mediante un marcado aumento del nivel de HBAlc en un sujeto.
Los métodos de la invención también incluyen la administración de una adnectina antimiostatina sola o en combinación con otros agentes conocidos en el estado de la téenica para el control glucémico (por ejemplo, insulina, GLP1) o para tratar complicaciones relacionadas con la diabetes reconocidas en el estado de la técnica.
Otros trastornos Los ratones con inactivación de miostatina presentan un aumento de la masa muscular, aumento del contenido de minerales y de la densidad del húmero del ratón; también presentan un aumento del contenido de minerales del hueso trabecular y cortical en las regiones donde se unen los músculos (Hamrick et al . Calcif Tissue Intl 2002 ; 71 : 63 -8 ) . Esto sugiere que el aumento de la masa muscular puede ayudar a mejorar la resistencia ósea y a reducir la osteoporosis y otras enfermedades óseas degenerativas .
Otras enfermedades o trastornos para los cuales las adnectinas antimiostatina de la presente invención son útiles incluyen cicatrización, enfermedad antif ibrótica, síndrome de Lambert -Eaton y enfermedad de Parkinson .
Terapias de combinación Las adnectinas antimiostatinas provistas en la presente se pueden usar en combinación con agentes contra la diabetes , agentes antihiperglicemicos , agentes antihiperinsulinémicos, agentes antirretinopáticos, agentes antineuropáticos, agentes antineurodegenerativos, agentes antinefropáticos, agentes antiateroescleréticos, agentes antiisquémicos, agentes antihipertensores, agentes contra la obesidad, agentes antidislipidémicos, agentes antihiperlipidémicos, agentes antihipertrigliceridémicos, agentes antihipercolesterolémicos, agentes contra la restenosis, agentes antipancreáticos, hipolipemiantes, anorexígenos , agentes que mejoran la memoria, agentes contra la demencia o agentes promotores del desarrollo cognitivo, supresores del apetito, tratamientos curativos neurológicos o musculares , tratamientos para la insuficiencia cardíaca, tratamientos para la arteriopatía periférica y agentes antiinflamatorios.
Los agentes contra la diabetes que se usan en combinación con las adnectinas antimiostatina incluyen, entre otros, secretagogos de insulina o sensibilizadores de insulina, moduladores del receptor de GPR40 u otros agentes contra la diabetes. Estos agentes incluyen, entre otros, inhibidores de dipeptidil peptidasa IV (DP4) (por ejemplo, sitagliptina, saxagliptina, alogliptina, vildagliptina y similares), biguanidas (por ejemplo, metformina, fenformina y similares), sulfonilureas (por ejemplo, gliburida, glimepirida, glipizida y similares), inhibidores de glucosidasa (por ejemplo, acarbosa, miglitol y similares), agonistas de PPARy, tales como tiazolidindionas (por ejemplo, rosiglitazona, pioglitazona y similares), agonistas duales de PPAR a/g (por ejemplo, muraglitazar, tesaglitazar, aleglitazar y similares), activadores de glucocinasa (como se describen en Fyfe et al., Drugs of t he Future, 34(8):641-653 (2009) y se incorporan en la presente por referencia), moduladores del receptor de GPR119 (MBX-2952, PSN821, APD597 y similares), inhibidores de SGLT2 (dapagliflozina, canagliflozina, remagliflozina y similares), análogos de amilina, tales como pramlintida y/o insulina. Las reseñas de terapias actuales y emergentes para el tratamiento de la diabetes se pueden encontrar en: Mohler et al., Medicinal Research Reviews, 29(1):125-195 (2009) y Mizuno et al., Current Medicinal Chemistry, 15:61-74 (2008).
Las adnectinas antimiostatina de la presente invención también se pueden usar opcionalmente en combinación con uno o más agentes hipofágicos, tales como detilpropiona, fendimetrazina, fentermina, orlistat, sibutramina, lorcaserina, pramlintida, topiramato, antagonistas del receptor de MCHR1, oxintomodulina, naltrexona, péptido amilina, moduladores del receptor de NPY Y5, moduladores del receptor de NPY Y2, moduladores del receptor de NPY Y4, cetilistat, moduladores del receptor de 5HT2c y similares. Las adnectinas antimiostatina de la presente invención también se pueden usar en combinación con un agonista del receptor de péptido 1 tipo glucagón (GLP-1 R), tal como exenatida, liraglutida, amida GPR-1(1-36), amida GLP-1(7-36), GLP-1(7-37) (como se describe en la patente estadounidense No. 5,614,492 de Habener, cuya descripción se incorpora en la presente por referencia), que se puede administrar mediante inyección, por vía intranasal o mediante dispositivos transdérmicos o bucales. Las reseñas de terapias actuales y emergentes para el tratamiento de la obesidad se pueden encontrar en: Melnikova et al., Nature Reviews Drug Discovery, 5:369-370 (2006); Jones, Nature Reviews : Drug Discovery, 8:833-834 (2009); Obici, Endocrinology, 150(6):2512-2517 (2009); y Elangbam, Vet .
Pathol . , 46(1):10-24 (2009).
Las adnectinas antimiostatina de la presente invención también se pueden administrar con uno o más agentes terapéuticos adicionales, según sea adecuado para la enfermedad o el trastorno particulares que se tratan. Los ejemplos de agentes adicionales incluyen aquellos que son útiles para tratar trastornos metabólicos, tales como diabetes tipo II y sarcopenia, e incluyen, entre otros, GLP-1, tipo GLP-1, amilina y FGF21; aquellos que son útiles para tratar enfermedades antifibróticas, enfermedades neuromusculares, enfermedades de las motoneuronas y sarcopenia e incluyen, entre otros, ghrelina, SARM, Riluzol, testosterona, andrógenos, hormona del crecimiento, terapia de reemplazo hormonal, inhibidores de COX-2, activadores de troponina, agonistas b2, CTLA4-Ig (por ejemplo, abetacept, belatacept) y anticuerpos anti-TGF ; aquellos que son útiles para tratar caquexia y otros síndromes consuntivos, e incluyen, entre otros, inhibidores de cinasa del receptor TGF , anti-IL-6 e inhibidores de ubiquitina-proteasoma; aquellos que son útiles para tratar calambres musculares asociados a miotonia y PLS e incluyen, entre otros fitoina, quinina, Baclofeno y tizanidina; aquellos que son útiles para tratar neuropatías e incluyen antidepresivos (por ejemplo, tricíclicos e inhibidores de la reabsorción de serotonina-norepinefriña selectivos (SNRI)), anticonvulsivos, cannabinoides, toxina botulínica tipo A, antagonistas de NMDA (por ejemplo, cetamina), suplementos dietarios (por ejemplo, ácido alfa lipoico y benfotiamina); aquellos que son útiles para tratar neuropatías inflamatorias crónicas e incluyen, entre otros, corticoesteroides, inmunoglobulina intravenosa y fármacos inmunosupresores (por ejemplo, ciclofosfamida, ciclosporina, azatiprina, micofenolato mofetil, globulina antitimocilo, rituximab); y aquellos que son útiles para tratar el síndrome de Guillain Barré, sarcopenia, fracturas y pérdida ósea, e incluyen, entre otros, Boniva (ibandronato) y PTH.
Las adnectinas antimiostatina de la presente invención se pueden administrar con uno o más agentes adicionales usados en la terapia sintomática. Los ejemplos de tales agentes para tratar los síntomas de ALS incluyen activadores de poros de la transición de la permeabilidad itocóndrica (MPT, por sus siglas en inglés), activadores rápidos de troponina esqueléticos, reguladores de macrófagos (por ejemplo, NP001), agentes para el tratamiento de la enfermedad lisosómica (por ejemplo, NP003) y antagonistas del receptor nicotínico de acetilcolina (nAchR). Un ejemplo de otro agente para usar en el tratamiento de los síntomas de DMD/BMD es un agente que aumenta los niveles de ATP.
Las adnectinas antimiostatina de la presente invención también se pueden administrar con uno o más agentes adicionales que se usan en la terapia de modificación de enfermedades. Los ejemplos de tales agentes para tratar ALS incluyen secuestrantes de radicales libres (por ejemplo, edaravona (norfenazona), CV-3611), agonistas de VEGF (por ejemplo, SSNNNN00002299)),, pprrootteeíínnaa Nogo-A I (por ejemplo, GSK122324), inhibidores de S0D1 (por ejemplo, ISIS-SODIRx) e inhibidores de PGE sintasa 1 (por ejemplo, AAD-2004). Los ejemplos de agentes para tratar DMD/BMD incluyen aquellos que promueven la omisión de exones ( exon skipping) (por ejemplo, moléculas antisentido, tales como drisapersen (PRO051/GSK2402968), PRO044, Eteplirsen, AVI-4658, AVI-5038, Ataluren (PTC124)), agentes para la terapia génica, agentes antiinflamatorios (por ejemplo, CRD007) y agentes antifibróticos (por ejemplo, HT-100).
Como se analizó previamente, los agentes que promueven la omisión de exones se pueden usar en combinación con las adnectinas antimiostatina de la presente invención para tratar la distrofia muscular de Duchenne y la distrofia muscular de Becker. Los ejemplos de exones específicos que se pueden dirigir para restaurar la distrofina funcional incluyen exones 7, 8, 17, 43, 44, 45, 46, 50, 51, 52, 53 y 55 (véase, por ejemplo, Lu et al., Molecular Therapy 2011;19:9-15). En algunas modalidades, se puede usar más de un agente, por ejemplo, oligonucleótidos antisentido, para inducir la omisión de múltiples exones.
IX. Composiciones farmacéuticas La presente invención también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden una adnectina antimiostatina o proteínas de fusión de aquellas descritas en la presente, en donde la composición es esencialmente libre de endotoxinas, o al menos contiene solo los niveles aceptables de endotoxinas, según lo determina el organismo regulador correspondiente (por ejemplo, FDA).
Las composiciones de la presente invención pueden ser en forma de píldora, comprimido, cápsula, líquido o comprimido de liberación sostenida para la administración oral; un líquido para la administración intravenosa, subcutánea o parenteral; o gel, loción, ungüento, crema, polímero u otro vehículo de liberación sostenida para la administración local.
Los métodos conocidos en el estado de la téenica para obtener composiciones se encuentran, por ejemplo, en "Remington: The Science and Practice of Pharmacy" (20.a ed., ed. A. R. Gennaro AR., 2000, Lippincott Williams & Wilkins, Filadelfia, Pa.). Las composiciones para la administración parenteral pueden contener, por ejemplo, excipientes, agua estéril, solución salina, polialquilenglicoles, tales como polietilenglicol, aceites de origen vegetal o naftálenos hidrogenados. Se pueden usar polímeros de láctido biodegradable biocompatible, copolímeros de láctido/glicólido o copolímeros de polioxietileno-polioxipropileno para controlar la liberación de los compuestos. Se pueden usar composiciones nanoparticuladas (por ejemplo, nanopartículas biodegradables, nanopartículas de lípidos sólidos, liposomas) para controlar la biodistribución de los compuestos. Otros sistemas de administración parenteral potencialmente útiles incluyen partículas de copolímero de etileno-acetato de vinilo, bombas osmóticas, sistemas de infusión implantables y liposomas. La concentración del compuesto en la composición varía según varios factores, que incluyen la dosis del fármaco que se desea administrar y la vía de administración.
Los portadores, excipientes o estabilizantes adecuados no son tóxicos para los receptores en las dosis y concentraciones empleadas, e incluyen amortiguadores, tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes, que incluyen ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; alcohol de fenol, butilo o bencilo; parabenos de alquilo, tales como parabeno de metilo o propilo; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de alrededor de 10 residuos); proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos, tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros hidratos de carbono, que incluyen glucosa, mañosa o dextranos; agentes quelantes, tales como EDTA; azúcares, tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones tomadores de sales, tales como sodio; complejos de metal (por ejemplo, complejos de proteína Zn); y/o tensioactivos no iónicos, tales como TWEEN, PLURONIC™ o polietilenglicol (PEG).
Los polipéptidos de la presente invención se pueden administrar opcionalmente como una sal aceptable desde el punto de vista farmacéutico, tales como sales de adición ácida no tóxica o complejos de metal que se usan habitualmente en la industria farmacéutica. Los ejemplos de sales de adición ácida incluyen ácidos orgánicos, tales como ácido acético, láctico, parmoico, maleico, cítrico, málico, ascórbico, succínico, benzoico, palmítico, subérico, salicílico, tartárico, metansulf ónico, toluensulfónico o trifluoroacético, o similares; ácidos poliméricos, tales como ácido tánico, carboximetilcelulosa o similares; y ácidos inorgánicos, tales como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico y similares. Los complejos de metal incluyen zinc, hierro y similares. En un ejemplo, el polipéptido se formula en presencia de acetato de sodio para aumentar la estabilidad térmica.
Los ingredientes activos también pueden estar comprimidos en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante téenicas de coacervación o mediante polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsulas de gelatina o hidroximetilcelulosa y microcápsulas de poli-(metilmetacrilato), respectivamente, en sistemas de suministro de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Tales téenicas se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences 16.a edición, Osol, A. Ed. (1980).
Se pueden realizar preparaciones de liberación sostenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen las proteínas de la invención; las matrices tienen aspecto de artículos con forma, por ejemplo, películas o microcápsulas. Los ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato) o poli (vinilalcohol)), poliláctidos (patente estadounidense No. 3,773,919), copolímeros de ácido L-glutámico y etil-L-glutamato, acetato de etilen-vinilo no degradable, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradables, tales como LUPRON DEPOT ™ (microesferas inyectables compuestas por copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprólido) y ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. Si bien los polímeros, tales como de etileno-acetato de vinilo y ácido láctico-ácido glucólico, permiten la liberación de moléculas durante más de 100 días, determinados hidrogeles liberan proteínas durante periodos más cortos. Cuando las proteínas encapsuladas de la invención permanecen en el cuerpo durante un largo tiempo, se pueden desnaturalizar o agregar como resultado de la exposición a la humedad a 37 °C, lo que da como resultado una pérdida de la actividad biológica y posibles cambios en la inmunogenicidad. Se pueden elaborar estrategias razonables para la estabilización según el mecanismo involucrado. Por ejemplo, si se descubre que el mecanismo de agregabilidad es la formación del enlace S-S intermolecular mediante el intercambio de tio-disulfuro, la estabilización se puede lograr mediante la modificación de los residuos de sulhidrilo, la liofilización de soluciones ácidas, el control del contenido de humedad, el uso de aditivos adecuados y el desarrollo de composiciones de la matriz polimérica específica.
Las composiciones de la presente invención para uso oral incluyen comprimidos que contienen ingredientes activos en una mezcla con excipientes no tóxicos aceptables desde el punto de vista farmacéutico. Estos excipientes pueden ser, por ejemplo, diluyentes o agentes de relleno inertes (por ejemplo, sacarosa y sorbítol), agentes lubricantes, agentes deslizantes y antiadhesivos (por ejemplo, estearato de magnesio, estearato de zinc, ácido esteárico, sílice, aceites vegetales hidrogenados o talco). Las composiciones para uso oral también se pueden proveer como comprimidos masticables o como cápsulas de gelatina dura, en donde el ingrediente activo se mezcla con un diluyente sólido inerte o como cápsulas de gelatina blanda, en donde el ingrediente activo se mezcla con agua o con un medio oleoso.
Con frecuencia, la composición farmacéutica que se usa para la administración in vivo debe ser estéril. Esto se puede lograr mediante la filtración a través de membranas de filtración estériles. Cuando la composición se liofiliza, la esterilización mediante este método se puede llevar a cabo antes o después de la liofilización y reconstitución. La composición para la administración parenteral se puede almacenar liofilizada o en solución. Además, las composiciones parenterales generalmente se colocan en un recipiente que tiene un puerto de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa o vial de solución intravenosa que tiene un tapón que se puede perforar con una aguja de inyección hipodérmica.
Una vez que la composición farmacéutica se formula, se puede almacenar en viales estériles como solución, suspensión, gel, emulsión, sólido o polvo deshidratado o liofilizado. Estas formulaciones se pueden almacenar en forma lista para usar o en una forma (por ejemplo, liofilizada) que requiere de la reconstitución antes de la administración.
Las composiciones de la presente también pueden contener más de un compuesto activo, según sea necesario, para la afección particular que se trate, preferentemente, aquellos que tienen actividades complementarias que no se perjudican entre sí. Estas moléculas están presentes de manera combinada en cantidades que son eficaces para la finalidad prevista.
X. Administración Una composición farmacéutica que comprende una adnectina antimiostatina de la presente invención se puede administrar a un sujeto en riesgo de presentar o que presenta las patologías descritas en la presente usando téenicas de administración estándares que incluyen la administración oral, parenteral, pulmonar, transdérmica, intramuscular, intranasal, bucal, sublingual o con supositorios. Preferentemente, la administración de las adnectinas antimiostatina de la invención es por vía parenteral. Como se usa en la presente, el término "parenteral" incluye la administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, rectal, vaginal o intraperitoneal. Se prefiere la administración sistémica periférica mediante inyección intravenosa, intraperitoneal o subcutánea.
Una dosis terapéuticamente eficaz se refiere a una dosis que produce los efectos terapéuticos para los cuales se la administra. Una cantidad eficaz de una composición farmacéutica que se usará terapéuticamente depende, por ejemplo, de los objetivos y del contexto terapéutico. Una persona experta en la téenica comprenderá que los niveles de dosis adecuados para el tratamiento variarán, en parte, según la molécula que se administra, la indicación para la cual se usa la molécula del agente de fijación, la vía de administración, el tamaño (peso corporal, superficie corporal o tamaño de los órganos) y la afección (edad y salud general) del paciente.
Por ejemplo, la dosis terapéuticamente eficaz se puede calcular inicialmente en ensayos de cultivo celular o en modelos animales, tales como ratones, ratas, conejos, perros, cerdos o monos. También se puede usar un modelo animal para determinar el intervalo de concentración y la vía de administración adecuados. Luego, se puede usar esa información para determinar las dosis y las vías de administración útiles en seres humanos.
La dosis exacta se determinará en función de los factores relacionados con el sujeto que necesita tratamiento y se puede establecer mediante técnicas estándares. La dosis y la administración se ajustan para brindar niveles suficientes del compuesto activo o para mantener el efecto deseado. Los factores que se pueden tener en cuenta incluyen la gravedad de la enfermedad, la salud del paciente, la edad, el peso y el sexo del sujeto, el tiempo y la frecuencia de administración, la combinación farmacológica, la sensibilidad a la reacción y la respuesta a la terapia. En general, las adnectinas antimiostatina de la presente invención se administran de alrededor de 0.01 mg/kg a alrededor de 50 mg/kg por día, preferentemente, de 0.01 mg/kg a alrededor de 30 mg/kg por día, con máxima preferencia, de 0.01 mg/kg a alrededor de 20 mg/kg por día. En algunas modalidades, las adnectinas antimiostatina de la presente invención se administran en dosis semanales de alrededor de 1 a 50 mg, con mayor preferencia, alrededor de 10-50 mg. En otras modalidades, las adnectinas antimiostatina de la presente invención se administran en dosis mensuales de 30-200 mg, preferentemente, 50-150 mg y, con mayor preferencia, 60-120 mg.
La frecuencia de administración de la dosis depende de los parámetros farmacocinéticos de la molécula del agente de fijación en la formulación usada. En general, una composición se administra hasta que se obtiene una dosis que permite obtener el efecto deseado. Por lo tanto, la composición se puede administrar como una dosis única o como dosis múltiples (con la misma concentración/dosificación o con concentraciones/dosificaciones diferentes) en el tiempo, o como una infusión continua. Con frecuencia, se realiza un refinamiento de la dosis adecuada. Las dosis adecuadas se pueden determinar mediante el uso de datos adecuados de respuesta a la dosis. Por ejemplo, la adnectina antimiostatina se puede administrar diariamente (por ejemplo, 1, 2, 3 o 4 veces al día) o con menor frecuencia (por ejemplo, una vez cada dos días, una o dos veces por semana o mensualmente). Además, como se sabe en el estado de la téenica, puede ser necesario realizar ajustes en función de la edad, el peso corporal, la salud, el sexo, la alimentación, el tiempo de administración, las interacciones farmacológicas y la gravedad de la enfermedad, y los pueden determinar las personas del oficio de nivel medio mediante experimentos de rutina. La adnectina antimiostatina se administra de manera adecuada al paciente una sola vez o durante una serie de tratamientos.
La administración de una adnectina antimiostatina o una fusión de esta, y uno o más agentes terapéuticos adicionales, ya sea coadministrados o administrados secuencialmente, se puede llevar a cabo como se describió anteriormente para las aplicaciones terapéuticas. Una persona experta en la técnica comprenderá que los portadores, diluyentes y excipientes adecuados y aceptables desde el punto de vista farmacéutico para la coadministración dependerán de las características del agente terapéutico particular que se administra.
XI. Métodos de detección y diagnóstico Las adnectinas antimiostatina de la invención también son útiles en diversas aplicaciones de diagnóstico. Por ejemplo, se puede usar una adnectina antimiostatina de la invención para diagnosticar un trastorno o una enfermedad asociados al aumento de los niveles de miostatina. De manera similar, se puede usar una adnectina antimiostatina en un ensayo para controlar los niveles de miostatina en un sujeto tratado por una afección asociada a la miostatina. Las adnectinas antimiostatina se pueden usar con o sin modificación, y están etiquetadas mediante unión covalente o no covalente de una porción detectable. La porción detectable puede ser una capaz de producir, directa o indirectamente, una señal detectable. Por ejemplo, la porción detectable puede ser un radioisótopo, tal como H3, C14 o 13, P32, S35 o 1131; un compuesto fluorescente o quimioluminiscente, tal como isotiocianato de fluoresceína, rodamina o luciferina; o una enzima, tal como fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa o peroxidasa de rábano.
Se puede usar cualquier método conocido en el estado de la téenica para conjugar una proteína con la porción detectable, incluidos aquellos métodos descritos por Hunter, et al., Nature 144:945 (1962); David, et al., Bioche istry 13:1014 (1974); Pain, et al., J. Immunol . Meth. 40:219 (1981); y Nygren, J. Histochem. and Cytochem. 30:407 (1982). Los métodos in vitro incluyen la química de conjugación conocida en el estado de la técnica, que comprende química compatible con proteínas, tal como química para aminoácidos específicos, por ejemplo, Cys y Lys. A fin de ligar una porción (tal como PEG) a una proteína de la invención, se usa un grupo de enlace o un grupo reactivo. Los grupos de enlace adecuados son conocidos en el estado de la téenica e incluyen grupos de disulfuro, grupos de tioéter, grupos lábiles ácidos, grupos fotolábiles, grupos lábiles de peptidasa y grupos lábiles de esterasa. Los grupos de enlace preferidos son grupos de disulfuo y grupos de tioéter, según la aplicación. En el caso de los polipéptidos sin un aminoácido Cys, un Cys se puede modificar por ingeniería genética en una ubicación para permitir la actividad de la proteína mientras se crea una ubicación para la conjugación.
Las adnectinas antimiostatina ligadas a una porción detectable también son útiles para la formación de imágenes in vivo. El polipéptido se puede ligar a un agente radiopaco o radioisótopo y administrar a un sujeto, preferentemente, en el torrente circulatorio; luego se evalúa la presencia y ubicación de la proteína etiquetada en el sujeto. Esta técnica de formación de imágenes es útil para la estadificación y el tratamiento de tumores malignos. La proteína se puede etiquetar con cualquier porción detectable en un sujeto, ya sea mediante resonancia magnética nuclear, radiología u otro medio de detección conocido en el estado de la técnica.
Las adnectinas antimiostatina también son útiles como agentes de purificación por afinidad. En este proceso, los polipéptidos se inmovilizan en un soporte adecuado, tal como una resina Sephadex o un papel de filtro, mediante los métodos conocidos en el estado de la téenica.
Las adnectinas antimiostatina se pueden usar en cualquier método de ensayo conocido, tal como ensayos de fijación competitiva, ensayos tipo sándwich directos e indirectos, y ensayos de inmunoprecipitación (Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, p. 147-158 (CRC Press, Inc., 1987)).
En ciertos aspectos, la descripción proporciona métodos para detectar una molécula objetivo en una muestra. Un método puede comprender poner en contacto una muestra con una adnectina antimiostatina descrita en la presente, en donde el contacto se lleva a cabo en condiciones que permiten la formación del complejo adnectina antimiostatina-objetivo; y detectar este complejo, lo que también implica detectar el objetivo en la muestra. La detección se puede realizar usando cualquier técnica conocida en el estado de la técnica, por ejemplo, radiografía, ensayo inmunológico, detección can fluorescencia, espectroscopia de masa o resonancia de plasmones superficiales. La muestra puede ser de un ser humano u otro mamífero. Las adnectinas antimiostatina se pueden etiquetar con una porción de etiquetado, tal como una porción radiactiva, una porción fluorescente, una porción cromogénica, una porción quimioluminiscente o una porción hapteno. Las adnectinas antimiostatina se puede inmovilizar en un soporte sólido.
XII. Kits y artículos de fabricación La adnectina antimiostatina de la invención se puede proporcionar en un kit, una combinación envasada de reactivos en cantidades predeterminadas con instrucciones de uso para métodos terapéuticos o de diagnóstico de la invención.
Por ejemplo, en una modalidad de la invención, se proporciona un artículo de fabricación que contiene materiales útiles para el tratamiento o la prevención de trastornos o afecciones descritas anteriormente. El artículo de fabricación comprende un recipiente y una etiqueta. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, viales, jeringas y tubos de ensayo. Los recipientes se pueden formar con diversos materiales, tales como vidrio o plástico. El recipiente contiene una composición de la invención que es eficaz para la prevención o el tratamiento del trastorno o de la afección y puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial con un tapón que se puede perforar con una aguja de inyección hipodérmica). El agente activo en la composición es una adnectina antimiostatina de la invención. La etiqueta que se encuentra en el recipiente, o que está asociada a este, indica que la composición es útil para tratar la afección determinada. El artículo de fabricación también puede comprender un segundo recipiente que comprende un amortiguador aceptable desde el punto de vista farmacéutico, tal como solución salina amortiguada con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. También puede incluir otros materiales deseados desde el punto de vista comercial y del usuario, que incluyen otros amortiguadores, diluyentes, filtros, agujas, jeringas y prospectos con instrucciones de uso.
Incorporación por referencia Todos los documentos y las referencias, incluidos los documentos de patentes y sitios web, descritos en la presente se incorporan en forma individual en este documento con el mismo alcance que si se hubieran escrito en este documento total o parcialmente.
EJEMPLOS La invención se describe por referencia a los siguientes ejemplos, que son solo ilustrativos y no pretenden limitar la presente invención. Si bien la invención se describió en detalle y con referencia a modalidades específicas, será evidente para la persona experta en la téenica que se pueden realizar diversos cambios y modificaciones sin apartarse de su espíritu ni de su alcance.
Ejemplo 1 - Producción de proteínas Producción de proteínas de alto rendimiento (HTPP) Los aglutinantes seleccionados en el vector PET9d corriente arriba de una etiqueta HISs y transformados en células BL21 DE3 plysS de E. coli se inocularon en 5 ral de medio LB que contenía 50 mg/ml de canamicina en un formato de 24 cavidades, y se cultivaron a 37°C durante la noche. Se prepararon nuevos cultivos de medio LB de 5 mi (50 pg/ml canamicina) para la expresión inducible mediante la aspiración de 200 ml del cultivo durante la noche y se dispensaron en la cavidad adecuada. Los cultivos se cultivaron a 37°C hasta Aboo 0.6-0.9. Después de la inducción con 1 mM de isopropil-3-tiogalactósido (IPTG), el cultivo se expresó durante 6 horas a 30°C y se recolectó mediante centrifugación durante 10 minutos a 2750 g a 4°C.
Las pelotillas celulares (en formato de 24 cavidades) se lisaron mediante resuspensión en 450 ml de amortiguador de lisis (50 mM de NaH2PC>4, NaCl 0.5 M, lx de cóctel de inhibidores de proteasa Complete™ sin EDTA (Roche), 1 mM de PMSF, 10 mM de CHAPS, 40 mM de imidazol, 1 mg/ml de lisozima, 30 pg/ml de DNAsa, 2 pg/ml de aprotonina, pH 8.0) y se agitó a temperatura ambiente durante 1-3 horas. Los U sados se aclararon y se colocaron nuevamente en la rejilla en un formato de 96 cavidades mediante transferencia a 96 cavidades Whatman GF/D Unifilter equipada con 96 cavidades, una placa de recolección de 1.2 mi, y se filtraron a presión positiva. Los lisados aclarados se transfirieron a una placa quelante de níquel o de cobalto de 96 cavidades equilibrada con un amortiguador de equilibrio (50 mM de NaH2PÜ4, NaCl 0.5 M, 40 mM de itnidazol, pH 8.0) y se incubaron durante 5 min. El material no fijado se retiró a presión positiva. La resina se lavó dos veces con 0.3 ml/cavidad con un amortiguador de lavado #1 (50 mM de NaH2P04, NaCl 0.5 M, 5 mM de CHAPS, 40 mM de imidazol, pH 8.0). Cada lavado se retiró a presión positiva. Antes de la elución, se lavó cada cavidad con 50 ml de amortiguador de elución (PBS + 20 mM de EDTA), se incubó durante 5 minutos, y este lavado se desechó a presión positiva. La proteína se eluyó aplicando 100 ml más de amortiguador de elución a cada cavidad. Después de la incubación durante 30 minutos a temperatura ambiente, las placas se centrifugaron durante 5 minutos a 200 g, y la proteína eluida se recolectó en placas de recolección de 96 cavidades que contenían 5 m? de MgCl20.5 M agregado al fondo de cada placa de recolección de elución antes de la elución. La proteína eluida se cuantificó mediante un ensayo de proteína total con dominio 10Fn3 de tipo silvestre como la proteína estándar.
Expresión y purificación de aglutinantes de proteínas de soporte basadas en fibronectina insolubles Para la expresión, se clonaron los clones seleccionados, seguidos de la etiqueta HIS6, en un vector pET9d y se expresaron en células BL21 DE3 plysS de E. coli . Se usaron 20 mi de un cultivo de inoculo (generado de una colonia de una sola placa) para inocular 1 litro de medio LB o medio de expresión TB durante la noche (inducción automática) que contenía 50 mg/ml de canamicina y 34 pg/ml de cloramfenicol. Los cultivos en el medio LB se incubaron a 37 °C hasta Aboo 0.6-1.0, en cuyo momento se indujeron con 1 mM de isopropil-p-tiogalactósido (IPTG) y se cultivaron durante 4 horas a 30 °C. Los cultivos se cultivaron en medio de expresión TB durante la noche a 37 °C durante 5 horas, en cuyo momento la temperatura se redujo a 18 °C, y los cultivos se cultivaron durante 19 horas. Los cultivos se recolectaron mediante centrifugación durante 30 minutos a >10.000 g a 4 °C. Las pelotillas celulares se congelaron a -80 °C. Después de descongelarlos, las pelotillas celulares se volvieron a suspender en 25 mi de amortiguador de lisis (20 mM de NaH2P04, NaCl 0.5 M, lx de cóctel de inhibidor de proteasa Complete™, sin EDTA (Roche), pH 7.4) usando un homogeneizador Ultraturrax (IKA works) sobre hielo. La lisis celular se logró mediante homogeneización a alta presión (^18.000 psi) con un microfluidizador modelo M-110S (Microfluidics). La fracción insoluble se separó mediante centrifugación durante 30 minutos a j>23.300 g a 4°C. La pelotilla insoluble recuperado de la centrifugación del lisato se lavó con 20 mM de fosfato de sodio/500 mM de NaCl, pH 7.4. La pelotilla se volvió a solubilizar en clorhidrato de guanidina 6 M en 20 mM de fosfato de sodio/500 mM de NaCl pH 7.4 con ultrasonido, seguido de la incubación a 37 grados durante 1-2 horas. La pelotilla que se volvió a solubilizar se filtró con un filtro de 0.45 mm y se cargó en una columna Histrap equilibrada con amortiguador de 20 mM de fosfato de sodio/500 mM de NaCl/guanidina 6 M, pH 7.4. Después de la carga, la columna se lavó para otros 25 volúmenes de columna con el mismo amortiguador. La proteína ligada se eluyó con 50 mM de imidazol en 20 mM de fosfato de sodio/500 mM de NaCl/guanidina-HCl 6 M, pH 7.4. La proteína purificada se volvió a plegar mediante diálisis en 50 mM de acetato de sodio/150 mM de NaCl, pH 4.5 o PBS, pH 7.2.
Expresión y purificación de aglutinantes de proteínas de soporte basadas en fibronectina solubles Como alternativa a la purificación de aglutinantes insolubles, también se puede usar la purificación de aglutinantes solubles. Para la expresión, se clonaron los clones seleccionados, seguidos de la etiqueta HIS6, en un vector pET9d y se expresaron en células BL21 DE3 plysS de E. coli . Se usaron 20 mi de un cultivo de inoculo (generado de una colonia de una sola placa) para inocular 1 litro de medio LB o medio de expresión TB durante la noche (inducción automática) que contenía 50 mg/ml de canamicina y 34 pg/ml de cloramfenicol. Los cultivos en el medio LB se incubaron a 37°C hasta Aeoo 0.6-1.0, luego se sometieron a inducción con 1 mM de isopropil-p-tiogalactósido (IPTG) y se cultivaron durante 4 horas a 30 °C. Los cultivos cultivados en medio de expresión TB durante la noche se incubaron a 37 °C durante 5 horas, después de lo cual la temperatura se redujo a 18 °C, y los cultivos se cultivaron durante 19 horas. Los cultivos se recolectaron mediante centrifugación durante 30 minutos a ^>10.000 g a 4 °C. Las pelotillas celulares se congelaron a -80 °C. Las pelotillas celulares descongeladas se volvieron a suspender en 25 mi de amortiguador de lisis (20 mM de NaHsPCU, NaCl 0.5 M, lx de cóctel de inhibidor de proteasa Complete™ sin EDTA (Roche), pH 7.4) usando un homogeneizador Ultra-turrax (IKA works) sobre hielo. La lisis celular se logró mediante homogeneización a alta presión (>18.000 psi) con un microfluidizador modelo M-110S (Microfluidics). La fracción soluble se separó mediante centrifugación durante 30 minutos a >23.300 g a 4°C. El sobrenadante se clarificó usando un filtro de 0.45 pm. El lisato clarificado se colocó en una columna Histrap (GE) previamente equilibrada con 20 mM de fosfato de sodio/500 mM de NaCl, pH 7.4. La columna se lavó con 25 volúmenes de columna del mismo amortiguador, luego con 20 volúmenes de columna de 20 mM de fosfato de sodio/500 mM de NaCl/25 mM de imidazol, pH 7.4 y posteriormente con 35 volúmenes de columna de 20 mM de fosfato de sodio/500 mM de NaCl/40 mM de imidazol, pH 7.4. La proteína se eluyó con 15 volúmenes de columna de 20 mM de fosfato de sodio/500 mM de NaCl/500 mM de imidazol, pH 7.4, las fracciones se agruparon sobre la base de absorbancia a A2bo y se dializaron en 1 x PBS o 50 mM de Tris, 150 mM de NaCl, pH 8.5 o 50 mM de NaOAc, 150 mM de NaCl, pH 4.5. Los precipitados se retiraron mediante filtración con un filtro de 0.22 mm.
PEGilación específica de sitio de adnectinas con polietilenglicol (PEG) Las adnectinas que contenían un residuo de cisteína modificado por ingeniería genética se conjugaron con PEG o reactivo de bloqueo de cisteína mediante la química de adición de Michael entre el grupo tiol en la cisteína y el grupo funcional maleimida de PEG o n-etilmaleimida (NEM). Para la PEGilación con PEG de 40 kDa de dos ramificaciones (NOF Corporation, P/N GL2-400MA), se agregó PEG en exceso molar a la solución de proteínas en condiciones levemente ácidas a neutras. La reacción continuó a temperatura ambiente durante 2 horas durante la noche. Luego la reacción se aplicó a una columna de intercambio iónico para separar la adnectina PEGilada de la PEG-maleimida sin reaccionar y la adnectina no PEGilada. Para la PEGilación con PEG de 40 kDa de 4 ramificaciones (NOF, P/N GL4-400MA) o bis-PEG de 20 kDa (NOF Corporation, P/N DE-200MA), la adnectina se purificó de SP FF en amortiguador de citrato, pH 6.5. Después de la reducción con DTT, la muestra se desaló en una columna G25 en el mismo amortiguador para retirar la DTT y se hizo reaccionar con bis-PEG de 20 kDa o PEG de 40 K de 4 ramificaciones en una relación 2:1 (PEG:adnectina) durante 2 horas a temperatura ambiente, y la reacción se detuvo agregando BME en exceso. La muestra se purificó mediante una columna Resource 15S (GE #17-0944-10) para retirar selectivamente especies no PEGiladas (y especies mono-PEGiladas en el caso de la reacción con bis-PEG de 20 kDa). Se usó una columna SEC preparativa final (GE #17-1071-01, Superdex200, 26/60) (en caso de que fuera necesaria) para eliminar especies altamente moleculares y adnectina no reactiva. Para preparar una adnectina bloqueada por CYS, se agregó NEM en un exceso molar de 10 veces (Pierce Chemical) inmediatamente después de la etapa de desalado G25 antes mencionada en amortiguador de citrato (pH 6.5). Se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente, y la reacción se detuvo mediante la adición de BME en exceso. La muestra dializó exhaustivamente en PBS. Las adnectinas conjugadas purificadas se analizaron mediante SDS-PAGE y cromatografía de exclusión por tamaño.
Purificación y PEGilación de aglutinantes de proteínas de soporte basadas en fibronectina no etiquetados Se clonaron aglutinantes seleccionados en un vector pET9d sin etiqueta HIS6 y se expresaron en células BL21 DE3 plysS de E. coli . Se cultivaron 25 mi de un cultivo de inoculo previamente aislado de una colonia de una sola placa en un matraz de 125 mi hasta que la OD 600 nm alcanzó 1-2, usando un medio a pH 6.85 + 50 ug/ml de canamicina (cloruro de amonio, ácido cítrico, citrato de amonio férrico, sulfato de magnesio, fosfato de sodio monobásico monohidrato, dextrosa anhidra, glicerol, fitona peptona, extracto de levadura granulado, sulfato de canamicina y sulfato de amonio para el ajuste del pH). Se inocularon 101 de agente de fermentación (7.5 1 de volumen inicial del medio del lote) en una OD 600 nm final de 0.003. El cultivo se cultivó durante la noche a 25 °C mezclando constantemente a 650 rpm y niveles de O2 disuelto >30 %, mientras se mantenía el pH. Al día siguiente, la temperatura se modificó a 37 °C, y el cultivo se cultivó hasta que la OD 600 nm alcanzó 20-25. Cuando se alcanzó la OD deseada, la temperatura se modificó a 30 °C, y el cultivo se indujo con IPTG (concentración final: 1 mM). Se agregó un medio de alimentación (glicerol, fitona peptona, extracto de levadura granulado, sulfato de canamicina y ácido fosfórico para el ajuste del pH) a una velocidad de 40 mi de medio/1 de volumen de formación/h. Las células se recolectaron mediante centrifugación a 10.000 g durante 30 min a 4 °C. Las pelotillas celulares se congelaron a -80 °C.
La pasta celular se descongeló en 1 x PBS en una relación de 10 mi de amortiguador/g de pasta celular. Una vez que se descongeló, la muestra se alteró con un homogeneizador UltraTurrax (IKA works) hasta que se volvió homogénea. Luego la solución se pasó dos veces a través de un microfluidizador a 18.000 psi. La fracción soluble se separó mediante centrifugación durante 30 minutos a ³ 10.000 g a 4°C. El sobrenadante se diluyó 1:1 con acetato de sodio (pH 4.5) y se clarificó con un filtro de 0.2 mm. El lisado clarificado se colocó en una columna SP FF (SP1; GE) previamente equilibrada con 50 mM de acetato de sodio (pH 4.5). La columna se lavó con 2 volúmenes de columna del mismo amortiguador y luego con 8 volúmenes de columna de 50 mM de acetato de sodio/350 mM de NaCl, pH 4.5. La proteína se eluyó con 50 mM de acetato de sodio/700 mM de NaCl, pH 4.5. Las eluciones se agruparon en función de la absorbancia a A28o.
La elución de SP1 se diluyó 1:5 con 20 mM de fosfato de sodio (pH 6.7) y se colocó en una columna SP FF (SP2) previamente equilibrada con 20 mM de fosfato de sodio/100 mM de NaCl, pH 6.7. Luego la columna se lavó con 2 volúmenes de columna del mismo amortiguador. La proteína se eluyó de la columna con 20 mM de fosfato de sodio/NaCl 0.5 M, pH 6.7. Las eluciones se agruparon en función de la absorbancia a A28o· La elución de SP2 se diluyó a 100 mM de NaCl con 20 mM de fosfato de sodio (pH 6.7) y se colocó en una columna Q FF (GE) previamente equilibrada con 20 mM de fosfato de sodio/100 mM de NaCl, pH 6.7. Se recolectó el pico de FT (que contenía el producto). La columna se lavó con amortiguador de equilibrio hasta que el pico de FT regresó al valor inicial.
Las adnectinas que contenían un residuo de cisterna modificado por ingeniería genética se conjugaron con PEG mediante la química de adición de Michael entre el grupo tiol en la cisterna y el grupo funcional maleimida del reactivo PEG. La fracción Q de FT se PEGiló con PEG ramificado de 40 kDa en una relación molar de 2:1 entre PEG y proteína. La muestra se incubó durante la noche a temperatura ambiente. La reacción de PEGilación se diluyó con 2 partes de 50 mM de acetato de sodio (pH 4.5) y se colocó en una columna SP FF (GE) previamente equilibrada con 50 mM de acetato de sodio (pH 4.5). La columna se lavó con 2 volúmenes de columna del mismo amortiguador. La proteína PEGilada se eluyó de la columna con 50 mM de acetato de sodio/200 mM de NaCl, pH 4.5). Las eluciones se agruparon en función de la absorbancia a A280. La proteína PEGilada se concentró usando una membrana Millipore Biomax de 30 kDa. La muestra se filtró en un filtro de 0.22 ym y se almacenó, por ejemplo, 4 °C, -20 °C o -80 |C.
Expresión y purificación transitorias de aglutinantes de proteínas de soporte basadas en fibronectina formateadas con Fe Para la generación de ADN, se clonaron los candidatos seleccionados en un plásmido pDV-16 del cual se transformaron células ToplO de E. coli . pDV-16 es una versión modificada de pTT5 (Yves Durocher, NRC Canadá), en donde se introdujo la secuencia codificante de IgGl-Fc humana, precedida por una secuencia de señales, y se incluyeron sitios de restricción para permitir la inserción de secuencias codificantes de adnectina en cualquier terminal de Fe. Las células transformadas se expandieron inoculando 1 1 de cultivo de Luria que contenía 100 yg/ml de ampicilina e incubándolo en una incubadora giratoria a 225 rpm durante 18 horas a 37°C. Las pelotillas bacterianas se recolectaron mediante centrifugación a >10000 g durante 30 minutos a 4°C. El ADN plas ídico purificado se aisló usando un kit QIAGEN Plasmid Plus Mega (QIAGEN), como se describe en el protocolo del fabricante. El ADN purificado se cuantificó usando absorbancia a 260 nm y se congeló a -80°C antes de usarlo.
Las células HEK 293-EBNA1 (clon 6E) (Yves Durocher, NRC Canadá) se expandieron hasta 2 x 106 células/ml en 21 de medio F17 en una bolsa GE Healthcare Wave de 101 a 37°C, 5 % de CO2, y se mezclaron agitándolas en un ángulo de 8o a 18 rpm.
El ADN se preparó para la transfección de la siguiente manera: El medio F17 se calentó a 37°C. Se descongelaron ADN y un reactivo de transfección de PEI en una campana de bioseguridad estéril. Se agregó ADN (2.25 mg) a 100 mi de medio F17 caliente en un matraz de cultivo de polipropileno estéril y se mezcló suavemente mediante agitación. En un matraz diferente, se combinaron 6.75 mg de PEI (1 mg/ml) con 100 mi de medio F17 precalentado y se mezclaron suavemente mediante agitación. Los matraces se dejaron reposar durante 5 minutos antes de combinar el contenido agregando la solución de PEI al matraz que contenía el ADN y mezclando suavemente mediante agitación.
El contenido del matraz que contenía la mezcla de ADN:PEI se agregó a la bolsa Wave que contenía las células HEK 293-6E después de la incubación a temperatura ambiente durante 15 minutos en la campana de bioseguridad. La bolsa que contenía las células HEK 293-6E transfectadas se incubaron durante 24 h a 37°C, 5 % de CO2, y se mezclaron agitándolas en un ángulo de 8o a 18 rpm. Después de 24 horas, se agregaron al cultivo de manera aséptica 100 mi de Tryptone NI al 20 % filtrado estéril (Organotechnie, Canadá) disuelto en un medio F17. Las células y el medio se recolectaron después de otras 72 horas de incubación, como se describió anteriormente. De manera alternativa, la expresión transitoria de HEK en matraces de agitación (0.5 1 de medio en un matraz de 21) se puede llevar a cabo en una relación 1:2 de ADN:PEI. Las células se separaron del medio condicionado mediante centrifugación a 6000 g durante 30 minutos a 4°C. El medio condicionado se retuvo, se filtró a través de un filtro de 0.2 mM y se almacenó a 4°C.
El medio condicionado se aplicó a una columna de cromatografía de 10 mi que contenía resina GE MabSelect Sure previamente equilibrada en PBS a una velocidad de 5 ml/minuto. Después de cargar el medio condicionado filtrado, la columna se lavó con al menos 100 mi de PBS a temperatura ambiente. El producto purificado se eluyó de la columna con la aplicación de 100 mM de glicina/100 mM de NaCl, pH 3.0. Las fracciones se neutralizaron en pH recolectándolas en tubos que contenían 1/6 del volumen de Tris 1 M pH 8, o agrupándolas de conformidad con la absorbancia a A280 seguida de la adición de Tris 1 M pH 8 a 100 mM. Si el contenido de especies de alto peso molecular es mayor a 5 % después de la elución de la proteína A, luego la muestra se vuelve a purificar mediante una columna Superdex 200 (26/60) (GE Healthcare) en PBS. Las fracciones SEC que contenían monómeros se agruparon y se concentraron. El agrupamiento de SEC o la proteína A resultante se dializó de manera exhaustiva en PBS a 4°C y se filtró de manera estéril usando un filtro de corte de 0.22 pm antes del congelamiento a -80°C.
Fabricación a granel : Expresión en mamíferos y recuperación primaria: Sistema UCOE CHO Se creó un banco de células de investigación en mamíferos (RCB) mediante la transfección de fusiones de adnectina antimiostatina-Fc clonadas en el vector pUCOE que contenía el elemento de apertura de cromatina ubicua (UCOE) [Vector UCOE modificado de Millipore] en células CHO-S. Se estableció un RCB expandiendo las células en un medio de selección (0.04 % (v/v) L-Glutamina (Invitrogen) y 0.01 % (v/v) de complemento HT (Invitrogen) en un medio CD CHO (Invitrogen)) que contenía 12.5 mg/ml de puromicina. Las células con un número de pase bajo se aislaron de manera aséptica mediante centrifugación, se volvieron a suspender en un medio de banco (0.04% (v/v) L-Glutamina (Invitrogen), 0.01 % (v/v) de complemento HT (Invitrogen) y 7.5 % (v/v) de DMSO en medio CD CHO (Invitrogen)) hasta obtener una concentración final de 1 x 107 células/ml. Inicialmente, estas células se congelaron en un baño de alcohol de isopropilo al 70 % a -80 ’C durante la noche y al día siguiente se transfirieron a nitrógeno líquido para su almacenamiento a largo plazo.
El cultivo celular se inició descongelando un solo vial de RCB en 25 mi del medio de selección que contenía 12.5 pg/ml de puromicina y expandiendo el cultivo en el mismo medio. Las células alcanzaron una concentración de 1-2 x 106 células/ml antes de volver a dividirse en 0.2 x 106 células/ml. Generalmente, las células se mantuvieron entre 2-4 semanas antes de sembrar un biorreactor. El cultivo de expansión se sometió a un último pase y se cultivó hasta que se pudo sembrar un biorreactor de 15 1 que contenía 81 de medio de producción (medio CD CHO de Invitrogen que contenía 0.01 % (v/v) de complemento HT (Invitrogen), 0.04 % (v/v) de Glutamax (Gibco) y 0.005 % (v/v) de Pluronic F-68 (Gibco)) a una densidad final de 0.2 x 106 células/ml. El cultivo del biorreactor se controló a diario para determinar la VCD (densidad celular viable), el porcentaje de viabilidad, el pH y la concentración de glucosa. El cultivo del biorreactor se alimentó los días 3 y 6 con una adición de bolo del volumen total al 10 % de medio de alimentación. El cultivo se recolectó entre el día 7 y el día 9 con un porcentaje de viabilidad de > 70 %. Durante el cultivo, el cultivo del biorreactor se controló a un pH de 7.1, temperatura de 37 ’C, 40 % de D02 y rpm constante de 100.
El día de la cosecha, los cultivos del biorreactor se pasaron directamente a través de un filtro de 6.0/3.0 mm de profundidad y luego se filtraron en una bolsa estéril de 0.8/0.2 ym. El cultivo estéril clarificado se almacenó durante la noche a 2-8 °C. El cultivo clarificado se concentró a través de TFF de lámina enderezada usando una membrana de 30.000 kDa. La concentración aproximada fue de 6x, en función del título de la cosecha. Luego, el sobrenadante concentrado se filtró de manera estéril en botellas PETG y se procesó directamente o se almacenó a -80 ‘C.
Purificación de la fusión de adnectina antimi os ta tina - Fe El sobrenadante del cultivo recolectado (puro o concentrado) se colocó en una columna de. proteína A MabSelect previamente equilibrada con PBS. La columna se lavó con 5 CV de 50 tt?M de Tris, pH 8.0, urea 1 M, 10 % de PG. La fusión de adnectina-Fc se eluyó con 100 mM de glicina pH 3.3, y el pico se recolectó en un recipiente previamente cargado con 1 CV de 200 nM de acetato de sodio pH 4.5. La elución pico se basó en la absorbencia a A280.
La elución de la proteína A se diluyó hasta alcanzar pH de 3.0 con la adición de ácido cítrico 2 M y se mantuvo a temperatura ambiente durante 1 hora para la inactivación viral. Luego se diluyó la muestra con 200 M de fosfato de sodio tribásico hasta alcanzar pH 4.5. De ser necesario, la solución se volvió a diluir con agua para disminuir la conductividad por debajo de 10 ms/cm.
La elución de la proteína A diluida se pasó por un Tosoh Q 600C AR (Tosoh Bioscience), previamente condicionado con 50 mM de acetato de sodio pH 4.5, en un modo de captura negativo. El pico de flujo continuo se recolectó en función de la absorbancia a A280. La columna se lavó con 50 mM de acetato de sodio y se despojó con NaOH 0.2 N.
El flujo continuo Q 600C AR se formuló usando filtración de flujo tangencial con una membrana de fibra hueca de 30 K NMWCO (GE) mezclando muy suavemente el retentato. La fusión de adnectina-Fc se diafiltró en 25 mM de fosfato de sodio, 150 mM de trehalosa pH 7.0 para 6 diavolúmenes y luego se concentró hasta obtener una concentración proteica deseada.
Ejemplo 2 - Evaluación biofísica de proteínas antimiostatina Cromatografía por exclusión de tamaño: La cromatografía por exclusión de tamaño (SEC) estándar se realizó en adnectinas candidatas que surgieron del proceso de mediana escala. La SEC del material de mediana escala se realizó usando una columna Superdex 200 10/30 o Superdex 75 10/30 (GE Healthcare) en un sistema Agilent 1100 o 1200 HPLC con detección UV a A214 nm y A280 nm y detección de fluorescencia (excitación 280 nm, emisión 350 nm). Se usó un amortiguador de 100 mM de sulfato de sodio/100 mM de fosfato de sodio/150 mM de cloruro de sodio, pH 6.8 a la velocidad de flujo adecuada de la columna SEC usada. Se usaron estándares de filtración en gel (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) para la calibración del peso molecular. Los resultados de la SEC en adnectinas purificadas a mediana escala mostraron adnectina principalmente monomérica y elución en el intervalo aproximado de 10 kDa contra estándares de filtración en gel globular (BioRad), como se muestra en las Tablas 9 y 10.
Termoestabilidad: Se realizó el análisis de fluorescencia por barrido térmico (TSF) de adnectinas de HTPP para cribarlas mediante estabilidad térmica relativa. Las muestras se normalizaron a 0.2 mg/ml en PBS. Se agregó 1 ml de tintura naranja Sypro diluida 1:40 con PBS a 25 ml de cada muestra, y la placa se selló con un sello adhesivo para microplacas de 96 cavidades transparentes. Las muestras se sometieron a barrido usando una máquina de RT-PCR BioRad con un aumento de temperatura de 25 °C-95 °C, a una velocidad de 2 grados por minuto. Los datos se analizaron usando el software BioRad CFX manager 2.0. Se demostró que los valores obtenidos mediante TSF se correspondían bien con los valores Tm obtenidos mediante DSC en un intervalo de fusión de 40 °C a 70 °C. Este se considera el intervalo de trabajo aceptable para esta téenica. Se obtiene un resultado de ND ("ningún dato") cuando la pendiente de la curva de transición es demasiado pequeña como para permitir que su pico derivado (la velocidad de cambio de fluorescencia con el tiempo) se distinga del ruido. Un resultado "ND" no se puede interpretar como un indicio de termoestabilidad. Los análisis de calorimetría de barrido diferencial (DSC) de adnectinas dializadas, sometidas a HTPP y de mediana escala se realizaron para determinar sus respectivas Tm. Una solución de 0.5 mg/ml se sometió a barrido en un calorímetro de barrido diferencial VP-capilar (GE Microcal) con un aumento de temperatura de 15 °C a 110 °C, a una velocidad de 1 grado por minuto a una presión de 70 p.s.i. Los datos se analizaron con respecto a una corrida de control del amortiguador adecuado usando el mejor ajuste (bes t fit) con Origin Software (OriginLab Corp). Los resultados de los análisis de TSF y DSC se resumen en las Tablas 8-10. Como se muestra en las Tablas 8-10, muchos de los clones mostraron temperaturas de desplegamiento mayores de 60 °C, lo que indicó una estructura altamente estable desde el punto de vista biofísico adecuada para la formulación de medicamentos. Generalmente, las adnectinas fueron tolerantes a la PEGilación o al formateo con Fe, sin pérdida aparente de estabilidad. En algunos casos, estos formatos produjeron una mejor estabilidad. Por ejemplo, 3116_A07 como adnectina no modificada tiene una Tm, de conformidad con TSF, de 60 °C, pero cuando se PEGiló (ATI-1377), la Tm, de conformidad con DSC, fue de 68 °C, y en un formato Fc-X (PRD-1286), la Tm de conformidad con DSC fue de 66 °C.
Ejemplo 3 - Ensayo celular de luciferasa Se generó un plásmido indicador de luciferasa, elemento sensible a activina (ARE)-luc, ligando nueve repeticiones de ARE en tándem al indicador de luciferasa de luciérnaga. El plásmido se transfectó de manera transitoria a las células HepG2 . El plásmido pGL4.74 [hRluc/TK] se cotransfectó para normalizar la eficacia de la transfección. Se colocaron en placas 10.000 células por cavidad en una placa de 96 cavidades. Cuando una proteína, como una miostatina, activina o BMP-11, se agrega a las células y se fija a su receptor cognado, se desencadena la señalización de SMAD corriente abajo, lo cual provoca que un complejo de SMAD fosforilado se fije al ARE. La cantidad de, por ejemplo, miostatina, expuesta a las células es directamente proporcional a la cantidad de proteína luciferasa producida y, en consecuencia, a la actividad de luciferasa medida. Cuando un antagonista de miostatina (por ejemplo, una adnectina antimiostatina) se agrega en forma concurrente con miostatina a las células, la activación del ARE disminuye, lo cual provoca una menor producción y actividad de luciferasa.
En este experimento, se incubaron previamente (1) adnectina antimiostatina y miostatina, (2) adnectina antimiostatina y activina A, o (3) adnectina antimiostatina y BMP-11 antes de la adición a las células. Se usó miostatina (R&D Systems) a 10-500 pM, activina A (R&D Systems) a 10-500 pM y BMP-11 (R&D Systems) a 10-500 pM. Después de la incubación durante la noche con estas distintas combinaciones, las células se U saron, y se midió la actividad de luciferasa (luminiscencia) mediante el sistema de ensayo de luciferasa Dual-Glo® (EnVision). IC50 se define como la concentración de adnectina necesaria para alcanzar 50 % de inhibición de la actividad de ARE-luciferasa inducida por miostatina.
Como se muestra en las Tablas 8-10, las adnectinas antimiostatinas inhibieron el aumento mediado por miostatina de la actividad de ARE-indicador de luc.
Ejemplo 4 - Ensayo de fijación HTRF Se usó un ensayo HTRF para medir las afinidades de fijación de las adnectinas antimiostatinas a la miostatina. El ensayo fue un ensayo HTRF competitivo, donde se utilizó la etiqueta Eu-W1024 como fluoróforo donante y Alexa Fluor® 647 como fluoróforo aceptor. La adnectina biotinilada 1889E01 y rhActRIIb-Fc etiquetada como Alexa Fluor® 647 se pueden fijar simultáneamente a la iostatina en dos sitios de fijación diferentes. La estreptavidina etiquetada con Eu-W1024 se usa para fijarse a 1889E01 biotinilada. Los dos fluoróforos, Eu- W1024 y Alexa Fluor® 647, se unen mediante la formación de un complejo de 1889E0l/miostatina/ActRIIb-Fc, y la señal HTRF se puede leer en un lector de placas EnVision (Perkin Elmer) usando un protocolo de HTRF. En presencia de una adnectina competitiva, la señal de HTRF disminuye. Los IC5o se indican en las Tablas 8-10.
Tabla 8: Resultados de la caracterización biofísica, del ensayo indicador de ARE-luciferasa y del ensayo de fijación HTRF para monoadnectinas antimiostatina.
Tabla 9: Resultados de la caracterización biofísica, del ensayo indicador de ARE-luciferasa y del ensayo de fijación HTRF para adnectinas antimiostatina PEGiladas.
Tabla 10 : Resultados de la caracterización >iofísica, del ensayo indicador de ARE-luciferasa del :nsayo de fijación HTRF para adnectinas antimiostatina .
Ejemplo 5 - Inhibición mediada por adnectina antimiostatina de la fosforilación de SMAD2 inducida por miostatina Las células de rabdomiosarcoma humano RH41 (DSMZ, Braunschweig, Alemania) se usaron para el análisis de respuesta a la inhibición de 12, 2 y 4 puntos que se describe a continuación. Las células se retiraron del medio de cultivo, se lavaron para eliminar el suero y se inactivaron en un medio de ensayo que contenía BSA durante 4 horas. Las células se levantaron del matraz usando verseno y se transfirieron a placas de polipropileno de 96 cavidades con fondo en V a razón de 5 x 105 células/cavidad. Para la respuesta de inhibición de 12 puntos, se agregaron a las células 100 pM de miostatina recombinante (R&D Systems), preincubada durante 1 hora con un intervalo de concentración de 5 veces de dilución de adnectinas comenzando con 1000 nM (es decir, 1000 nM, 200 nM, 40 nM, 8 nM, 1.6 nM, 0.32 nM, 0.064 nM, 0.0128 nM, 0.00256 nM, 0.000512 nM, 0.000102 nM, 0.0000204 nM). Para la respuesta de inhibición de 4 puntos, se agregaron a las células 100 pM de miostatina, preincubada durante 1 hora con un intervalo de concentración de adnectinas (30 nM, 3 nM, 0.1 nM o 0.001 nM). Para la respuesta de inhibición de 2 puntos, se agregaron a las células 100 pM de miostatina, preincubada durante 1 hora con un intervalo de concentración de adnectinas (10 nM o 0.5 nM).
Las células se trataron con la mezcla de miostatina-adnectina durante 1 hora a 37°C para inducir la fosforilación de SMAD2 (pSmad2) . La estimulación se detuvo colocando las células sobre hielo y agregando PBS helado. Las células se convirtieron en pelotillas y se U saron de conformidad con protocolos estándares, y la fosforilación de SMAD2 se detectó mediante el uso de un ensayo ELISA (Cell Signaling Technologies) . La inhibición obtenida mediante el intervalo de concentración de adnectinas se representó gráficamente con el software GraphPad Prism y se normalizaron los puntos de datos para controles que produjeron una inhibición de 100 % y 0 %. IC50 se define como la concentración de adnectina necesaria para alcanzar 50 % de inhibición de la inhibición de la fosforilación de SMAD2 inducida por miostatina. Los datos presentados en la Tabla 11 indican que las adnectinas derivadas de optimización por afinidad de los clones progenitores 1979_B06 y 2062_G02 inhibieron de manera potente y completa la fosforilación de pSMAD inducida por miostatina y mostraron valores IC50 que variaban de 0.78 nM a 0.06 nM. Esto representa una mejora de más de 16-75 veces de los valores IC50 con respecto a los clones progenitores 1979_B06 (IC50 = 12.8 nM) y 2062_G02 (IC50 = 59.1 nM).
Tabla 11. Inhibición de la fosforilación de SMAD2 (pSMAD2) mediante adnectinas antimiostatina Ejemplo 6 - Mediciones de afinidad mediante SPR a las adnectinas antimiostatina Cinetica de fijación de adnectina mediante el uso del formato A de SPR El anticuerpo Fe antihumano (Biacore/GE) se inmovilizó en un chip Biacore CM5 mediante el acoplamiento de NHS/EDC de conformidad con las instrucciones del fabricante.
Se capturó ActRIIb-Fc (R&D Systems) en células de referencia * y de flujo activo, luego se capturó miostatina humana (R&D Systems) , BMP-11 humana (GDF-11 ; R&D Systems) o activina A humana (R&D Systems) en las células de flujo activo únicamente (cada una solubilizada de conformidad con el protocolo sugerido por el fabricante y diluida en un amortiguador de corrida HBSP) . Se aplicó un intervalo de concentración de adnectina antimiostatina en todas las células de flujo en un amortiguador de corrida HBSP . La regeneración de la superficie del chip entre ciclos se llevó a cabo con dos impulsos de 30 segundos de MgCl 3 M. Los rastros de cinética de los sensogramas menos la referencia se ajustaron a un modelo de fijación 1:1 usando el software Biaevaluation. En la Tabla 12 se muestra un resumen de los datos cinéticos de Biacore.
Los datos que se muestran en la Tabla 12 indican que las adnectinas de la progenie optimizada se fijaron firmemente a la miostatina, en donde KD estaba en el intervalo de 0.06-1.47 nM, en comparación con las adnectinas progenitoras 1979_B06 y 2062_G02 , que mostraron KD de 29 y 49 nM, respectivamente .
Después de la PEGilación, se produjo una pérdida de afinidad a miostatina, en donde las KD variaron de 0.76 a 14.4 nM, aunque la PEGilación no produjo efecto alguno en la potencia del ensayo de ARE-luciferasa (véanse las Tablas 8 y 9).
La selectividad de adnectina en BMP-11 varía desde completamente no selectiva hasta de 17 veces, mientras que la fijación a activina es extremadamente débil o inexistente, lo cual sugiere una alta selectividad sobre la activina.
Cinética de fijación de adnectina mediante el uso del formato B de SPR (útil para adnectinas formateadas con Fe) Se solubilizaron miostatina humana (R&D Systems), BMP-11 humana (GDF-ll; R&D Systems) o activina A humana (R&D Systems) de conformidad con el protocolo sugerido por el fabricante y se inmovilizaron en un chip Biacore CM5 a 1-10 mg/ml en amortiguador de acetato (pH 4.0 o 4.5) usando acoplamiento de NHS/EDC estándar. Se aplicó un intervalo de concentración de adnectinas antimiostatina en el amortiguador de corrida HBSP. La regeneración de la superficie del chip entre ciclos se llevó a cabo con 60 segundos de 10-50 mM de NaOH. Los rastros de cinética de los sensogramas menos la referencia se ajustaron a un modelo de fijación 1:1 usando el software Biaevaluation. Para las adnectinas formateadas con Fe, la cinética de interacción fue impulsada por la avidez del Fe bivalente y la miostatina dimérica incluso con baja densidad de inmovilización. En la Tabla 12 se muestra un resumen de los datos cinéticos de Biacore. Los datos que se presentan en la Tabla 12 indican que algunas de las adnectinas que se hacen correr en este formato SPR se fijan a miostatina y BMP-11, y también a la activina con afinidades similares. Sin embargo, la selectividad sustancial sobre la activina en el ensayo ARE-luciferasa sugiere que la afinidad a la activina se puede acentuar artificialmente en este formato de ensayo SPR.
Tabla 12. Resumen de datos cinéticos SPR de adnectinas antimiostatina. Los formatos A y B se describen en el Ejemplo 6.
Ejemplo 7- Afinidad en fase de solución a las adnectinas antimiostatina La afinidad de solución de PRD-1474, una adnectina antimiostatina fusionada con Fe, a la miostatina se midió usando un ensayo de exclusión cinetica (KinExA) . Las titulaciones por cuadruplicado de PRD-1474 se llevaron a cabo con miostatina en una concentración monomérica de 2 nM (n=2) , 1 nM (n=l) y 0.7 nM (n=l) . La concentración de miostatina no fijada relativa se midió mediante la captura en una matriz sólida ATI-1310 (acoplada a microesferas de po 1 i ac r i 1 ami da mediante una cisteína libre modificada por ingeniería genética) y luego mediante la detección con un constructo etiquetado con fluorescencia del correceptor de miostatina, ActRIIB-Ig, que se puede fijar a la miostatina simultáneamente con la adnectina. ATI-1310 es una adnectina relacionada que compite con PRD-1474 por la fijación a la miostatina y permite la captura de miostatina no fijada. El análisis de Kd global que se muestra en la Tabla 13 indica una Kd de 170 pM con un intervalo de confianza de 95 % de 330-60 pM. Las afinidades de PRD-1177 y ATI-1338 también se midieron usando el mismo formato de ensayo. Las titulaciones por triplicado de PRD-1177 se llevaron a cabo con miostatina en una concentración monomerica de 1 nM (n=2) y 0.8 nM (n=l) . Las titulaciones por triplicado de ATI-1338 se llevaron a cabo con miostatina a una concentración monomérica de 5 nM (n=l) , 1.6 nM (n=l) y 1.4 nM (n=l) . Estos análisis indican que PRD-1177 se fija a la miostatina con un valor Kd global de 250 pM y un intervalo de confianza de 95 % de 340-130 pM (Tabla 13) . ATI-1338 se fija a la miostatina con un valor Kd global de 850 pM y un intervalo de confianza de 95 % de 1400-330 pM.
Tabla 13. Mediciones de afinidad en fase de solución de KinExA de la fijación a miostatina.
Ejemplo 8 - Análisis mutacional de 3116_A06 A fin de entender la tolerancia relativa de las posiciones de bucle a la mutación, se llevaron a cabo por separado dos estudios similares. El primero fue un barrido de alanina tradicional, en donde la fijación y la eficacia de mutaciones de alanina diferentes en los bucles de adnectina 3116_A06 (SEQ ID NO: 118) se evaluaron en ensayos bioquímicos y celulares. El segundo estudio consistió en un barrido mutacional profundo, en el cual se creó una genoteca de mutaciones de sitio único en las mismas posiciones de 3116_A06 (SEQ ID 118), pero cada posición se sustituyó con 20 de los posibles aminoácidos. Estos componentes de la genoteca se expresaron luego como fusiones de proteína-mARN y se sometieron a una única ronda de exposición a mARN (como se describe en la Sección IV) , separando los componentes de la genoteca asociados a la miostatina biotinilada de aquellos no fijados usando microesferas magnéticas de estreptavidina . En esta modalidad, la secuenciación de última generación de poblaciones de entrada y ligadas permitió la determinación del enriquecimiento//reducción relativos de cada secuencia, lo cual refleja su afinidad intrínseca a la miostatina.
Barrido de alanina; Se usó mutagénesis dirigida al sitio de PCR para crear mutaciones de alanina de sitio único en 3116_A06 (SEQ ID NO: 118) en el bucle BC (residuos 25-33) , el bucle DE (residuos 55-58) y el bucle FG (residuos 80-89). Los clones se expresaron en E . col i y se purificaron mediante HTPP como se describe en el Ejemplo 1. La cromatografía de exclusión por tamaño (SEC, como se describe en el Ejemplo 2) confirmó que todas las proteínas sustituidas con alanina eran predominantemente monoméricas (Tabla 14). Se realizaron ensayos de ARE-lucíferasa (Ejemplo 3) y HTRF (Ejemplo 4). En el ensayo de competencia de fijación HTRF, las potencias variaron de IC50 = 1.5 nM a >100 nM (Tabla 14). La mayoría de las posiciones toleraron la sustitución de alanina en el ensayo HTRF en cierto grado, con la excepción de Gly55, Arg56 y Gly57 del bucle DE, para el cual la fijación se redujo drásticamente (IC50 >100 nM). Se produjo un efecto más leve en las posiciones Gly30 del blucle BC, y Val80, Thr81 y Tyr88 del bucle FG, que aún mostraban fijación, pero con un aumento >10 veces en IC50 con respecto a la secuencia parental ( "WT"). En el ensayo celular de ARE-luciferasa, la potencia de los mutantes varió de IC50 = 0.6 nM a >100 nM (Tabla 14). El impacto de las mutaciones de alanina fue generalmente mayor en el ensayo celular que en el ensayo HTRF. Gly55, Arg56 y Gly57 del bucle DE, y Val80 y Tyr88 del bucle FG mostraron una potencia drásticamente menor en este ensayo, con IC50 >100 nM. Se observó un efecto más moderado para las posiciones de BC Leu26, Pro27, His28, Gly30 y Asn33, y las posiciones de FG positions Thr81, Tyr85 y Leu86, que tuvieron IC50 >10 veces la de la secuencia parental.
Tabla 14: Caracterización bioquímica y potencias celulares de mutantes de alanina de 3116 A06 *SEC 1: Altamente monomérico; SEC 2: Principalmente monomérico Barrido mutacional profundo: Se combinó una secuenciación de alto rendimiento con una expresión de proteínas para permitir la medición simultánea de la adaptación relativa de cada mutante de bucle de sitio único posible, en una escala que sería pesada para una modalidad tradicional, como la que se describió anteriormente (para una revisión de los enfoques de "Barrido mutacional profundo", véase Araya et al., Trends in Biotechnology 29: 435-442, 2011; también se ejemplifica una modalidad similar en Forsyth et al., mAbs 5 : 523-532, 2013).
Construcción y selección de la genoteca: Se crearon tres genotecas separadas que contenían todas las mutaciones de sitio único posibles en cada uno de los tres bucles de 3116_A06 (SEQ ID NO: 118): bucle BC (posiciones 25-33), bucle DE (posiciones 55-58) y bucle FG (posiciones 80-89). Para cada bucle, se designaron varios oligonucleótidos que incorporaban individualmente un codón NNK en cada posición, en donde N=A, C, G, T y K=G, T. El uso de estos codones degenerados permite la codificación de los 20 aminoácidos (más un codón de detención) en la posición donde se incorpora NNK. Los oligonucleótidos se agruparon mediante PCR de extensión superpuesta para generar genotecas de adnectinas de longitud completa, en donde Lib-BC contenía cada mutación del bucle BC de aminoácido simple de 3116_A06, Lib-DE contenía cada mutación del bucle DE de aminoácido simple de 3116_A06, y Lib-FG contenía cada mutación del bucle FG de aminoácido simple de 3116_A06. Las tres genotecas se expresaron como moléculas de fusión de mARN -proteína usando PROfusión de conformidad con Xu et al., Chemistry & Biology 9: 933-942, 2002. Las moléculas PROfusión Lib-BC, Lib-DE y Lib-FG se seleccionaron por separado contra 3 nM de miostatina biotinilada, y las moléculas de fijación se capturaron posteriormente en microesferas magnéticas de estreptavidina. Los aglutinantes se eluyeron de las microesferas usando 100 mM de KOH. Las moléculas eluidas de las microesferas representan variantes de 3116_A06 que aún se pueden fijar a la miostatina, mientras que aquellas presentes en la genoteca inicial, pero que no se encuentran en la elución, representan variantes de 3116_A06 que no se fijan tan adecuadamente a la miostatina.
Mezcla y códigos de barra de NGS: Dos poblaciones, la de entrada (antes de la fijación a la miostatina) y aglutinantes (eluidos de microesferas después de la selección), derivadas de cada una de las tres genotecas (Lib-BC, Lib-DE y Lib-FG) se recolectaron y se ampliaron por separado. Se agregó a cada población un adaptador universal TruSeq 5', un adaptador Truseq 3' II y un código de barras único de 6 nucleótidos según PCR. Se cuantificó y se mezcló individualmente un total de seis poblaciones con código de barras (Líb-BC: Lib-DE: Lib-FG = 9:4:10) en función de la cantidad de residuos aleatorizados en cada bucle, a fin de obtener cantidades similares de secuencias por posición aleatorizada estadísticamente. La muestra agrupada se secuenció mediante la secuenciación de última generación MiSeq 150 bp con terminales apareados (Illumina).
Análisis de datos de NGS: Las secuencias leídas hacia adelante de la secuenciación de última generación se agruparon de conformidad con la población, la posición de la mutación y la identidad del aminoácido mutado. Todas las secuencias de mala calidad y aquellas que contienen varios sitios de mutación fueron eliminadas del análisis. A continuación, la frecuencia de cada secuencia en la población posterior a la selección se dividió por su frecuencia en la población de entrada para derivar una relación de enriquecimiento (ER). La comparación de ER de las secuencias parentales (WT, que funciona como control positivo) y las secuencias que contenían un codón de detención (que funcionan como control negativo, representando el ruido de fondo de la supervivencia por casualidad) mostraron que la relación entre la señal y el fondo (S/B) variaba entre los tres bucles, probablemente debido a que cada genoteca de bucle se sometió a selecciones individuales. Por esta razón, cada secuencia se normalizó hasta alcanzar las ER de detención promedio y de peso promedio para su propio bucle específico, a fin de obtener ERnorma.
El barrido mutacional profundo se validó comparando el ajuste relativo de los mutantes de alanina de sitio único a los datos bioquímicos del barrido de alanina tradicional.
En general, la correlación fue bastante significativa (Figura 8). Las ER de NGS definen un perfil de enriquecimiento y reducción de mutantes de alanina en los bucles que tiene una correlación considerable con el impacto observado en los ensayos HTRF y de ARE-lucíferasa.
La IC5o de HTRF bioquímico también se representó directamente en comparación con ERnorma de NGS para cada mutante de alanina, como se mostró en la Figura 9.
En función de las correlaciones de alanina, se establecieron tres categorías en las cuales podrían agruparse todas las mutaciones de aminoácidos de sitio único mediante sus relaciones de enriquecimiento de NGS: Las mutaciones de máxima preferencia (ERnorma > 0.8), las mutaciones de mayor preferencia (ERnorma > 0.5) y las mutaciones preferidas (ERnorma > 3 desviaciones estándares de la ERet promedio del bucle). Los límites más bajos de ERnorma que definieron esta última categoría fueron diferentes para los tres bucles: BC = 0.25; DE = 0.15; FG = 0.35. Todos los mutantes de sitio único en los bucles de 3116_A06 se agruparon de conformidad con sus relaciones de enriquecimiento normalizadas para determinar la tolerancia relativa de cada posición a la mutación (Tabla 15).
Tabla 15: Mutaciones de sitio único en las secuencias de bucle de 3116_A06 que mantienen la fijación a la miostatina Usando los datos de barrido mutacional profundo completos, las posiciones del bucle BC 25, 26, 27, 30, 32 y 33, las posiciones del bucle DE 55, 56 y 57, y las posiciones del bucle FG 80 y 88 parecen ser las más conservadas, en donde solo algunos tipos de aminoácidos en estas posiciones mantienen su fijación a la miostatina. Por otro lado, otras posiciones son altamente tolerantes a la mutación, lo que incluye las posiciones del bucle BC 28, 29 y 31, y las posiciones del bucle FG 82, 83 y 87.
Ejemplo 9 - Evaluación de la farmacocinética de la adnectina antimiostatina Para investigar el perfil farmacocinético de las adnectinas con diferentes formatos PEGilados, se formateó la adnectina antimiostatina 2987_H07 con PEG de 40 KD de 2 ramificaciones (ATI-1338), PEG de 40 KD de 4 ramificaciones (ATI-1339) y Bis PEG de 20 KD (ATI-1341). Se llevaron a cabo estudios de dosis únicas de administración subcutánea con estas tres adnectinas PEGiladas en ratones C57BL6. Las concentraciones farmacológicas totales se determinaron mediante el ensayo ELISA. El inmunoensayo de PK bioanalítico para la cuantificación de ATI-1338 utilizó un ensayo ELISA con formato sándwich estándar, en donde el 1338 se capturó con un anticuerpo monoclonal a la proteína de etiqueta HIS, luego se detectó con un anticuerpo anti-PEG policlonal. Como se muestra en la Tabla 16, los dos formatos PEGilados de 40 KD, ATI-1338 y ATI-1339, produjeron una mejora farmacocinética más prominente (es decir, una semivida más prolongada (ti/2) y una exposición más alta normalizada con dosis) que el formato PEGilado Bis-20 KD, ATI-1341.
Tabla 16. Comparación farmacocinética de tres formatos PEGilados para adnectina 2987_H07 Se llevaron a cabo estudios de dosis únicas después de la administración intravenosa y subcutánea de adnectinas antimiostatina fusionadas con Fe (PRD-1177, PRD-1286 y PRD-1474) en ratones C57BL6 para evaluar los efectos de la fusión con Fe en parámetros farmacocinéticos. Las concentraciones farmacológicas totales se determinaron mediante ensayos ELISA. El inmunoensayo PK bioanalítico para la cuantificación de los conjugados de Fe para PRD1177, 1474 y 1286 usó un ensayo ELISA con formato sándwich estándar mediante teenología ECL, en donde el 1177 se capturó con un anticuerpo policlonal a la adnectina de soporte, luego se detectó con un anticuerpo IgG antihumano. Como se muestra en la Tabla 17, las tres adnectinas fusionadas con Fe tuvieron una semivida más prolongada (58 -172 h) que la adnectina PEGilada ATI-1338 (25 h). Una biodisponibilidad de SC inferior probablemente refleja la proteólisis durante el tránsito intersticial y linfático de la molécula biológica. La biodisponibilidad de SC de las adnectinas fusionadas con Fe se encuentra dentro de un intervalo razonable en función de la literatura publicada (por ejemplo, Richter et al., AAPS J. 2012;14:559-70).
Tabla 17. Comparación farmacocinética de tres adnectinas antimiostatina fusionadas con Fe Ejemplo 10 - Mecanismo de inhibición de adnectina antimiostatina ELISA competitivo: Los ensayos de fijación competitiva para evaluar la capacidad de las adnectinas antimiostatina para competir con el receptor de ActRIIB en la fijación a la miostatina se llevaron a cabo mediante ELISA competitivo. Se recubrieron placas Nunc Maxisorp con 2 mg/ml de ActRIIb-Fc (R&D Systems) en amortiguador de carbonato de sodio 0.2 M pH 9.6 durante la noche a 4 °C. Después de lavar con PBS-T (PBS que contenía 0.05 % de Tween-20), las cavidades se bloquearon con amortiguador OptEIA (BD Biosciences) durante 1 h a 25 °C con agitación. La miostatina (10 nM; R&D Systems) se incubó previamente con un intervalo de concentración de adnectina o competidor de ActRIIb-Fc (0.2 pM a 1 mM) en amortiguador OptEIA durante 1 h a 25 °C con agitación. La placa de ensayo recubierta y bloqueada se lavó con PBS-T, y luego se agregaron las mezclas de miostatina/competidor y se incubaron durante 30 min a 25 °C con agitación. Las placas de ensayo se lavaron con PBS-T, después de lo cual se detectó miostatina con 1:1000 de anticuerpo policlonal antimiostatina de cabra biotinilado (R&D Systems) diluido en OptEIA, durante 1 h a 25 °C con agitación. Después de lavar con PBS-T, se agregó 1:5000 estreptavidina-HRP (Thermo/Pierce) diluida en OptEIA, y luego se incubó durante 30 min a 25 °C con agitación. La placa de ensayo se desarrolló con TMB (BD Biosciences), se inactivó con ácido sulfúrico 2N, y la absorbancia se lcyó a A450. Como se muestra en la Figura 10, ActRIIb-Fc en solución bloquea totalmente la fijación de la miostatina a ActRIIb-Fc recubierta en la placa, como se previo. Por el contrario, sin embargo, PRD-1288 (difiere de PRD-1474 únicamente en la secuencia enlazadora), PRD-1285 y PRD-1286 en concentraciones de hasta 1 mM no evitan que la miostatina se una a ActRIIb.
SPR de competencia: Los ensayos de fijación competitiva para evaluar la capacidad de las adnectinas antimiostatina para competir con receptores Tipo I y Tipo II por la fijación a la miostatina o BMP11, como reemplazo de la miostatina, también se llevaron a cabo mediante SPR en un instrumento Biacore T100, en dos formatos experimentales diferentes. En el "formato A de SPR", las superficies del chip sensor se prepararon inmovilizando 100 ug/ml de proteína A (Pierce) en 10 mM de acetato pH 4.5 a 4500 RU en un chip sensor CM5 (Biacore/GE Healthcare) usando la química estándar de etil(dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) / N-hidroxisuccinimida (NHS), con bloqueo de etanolamina. ALK4-Fc (R&D Systems), ALK5-Fc (R&D Systems), ActRIIB-Fc (elaboración interna), un anticuerpo monoclonal antimiostatina/ BMP11 (mAb-A) que compite para fijarse a la miostatina con ActRIIB, no compite con 3116A06 para fijarse a la miostatina (elaboración interna) o adnectina-Fc PRD-1474 en concentraciones de 7-13 mg/ml se capturaron a través de la cola de Fe a densidades de superficie de 1600 - 4300 RU usando inyecciones 60 s a 10 ml/min. Los experimentos de competencia se realizaron haciendo fluir 100 nM de miostatina (R&D Systems) o BMP11 (R&D Systems) sobre estas superficies en ausencia o presencia de 200 nM de adnectina ATI-1523 a una velocidad de flujo de 30 ml/min con tiempos de asociación y disociación de 180 s. El amortiguador de corrida para los experimentos de competencia e inmovilización fue 10 mM de HEPES, 150 mM de NaCl, 3 mM de EDTA y 0.05 % v/v de tensioactivo P20, pH 7.4, y se regeneraron superficies entre ciclos usando 2 inyecciones de 10 mM de glicina pH 1.5 durante 30 s a 30 ml/min.
En el formato A de SPR, BMP11 se fijó específicamente a las superficies de ALK4-Fc, ALK5-FC, ActRIIB-Fc, mAb-A y PRD-1474, mientras que la miostatina se fijó específicamente a ActRIIB-Fc, mAb-A y PRD-1474, pero no a ALK4-Fc o ALK5-Fc. Para evaluar el efecto de ATI-1523 en la miostatina o la fijación de BMP11, todas las respuestas de fijación de cada proteína al final de la fase de asociación de 180 s se normalizaron hasta 100 % y se compararon con las respuestas de fijación de la miostatina o BMP11 en presencia de ATI-1523 (Tabla 18). ATI-1523 bloqueó completamente la fijación de la miostatina o BMP11 a la superficie de PRD-1474 de control, como se previo. En los ensayos para evaluar la capacidad de ATI-1523 para bloquear la interacción de miostatina con ALK4-Fc o ALK5-Fc, BMP-11, que también se fija a ALK4-Fc y ALK5-Fc, se usó como reemplazo de la miostatina, debido a que la miostatina sola no se fija de manera considerable a ALK4-FC y ALK5-Fc en este formato experimental. ATI-1523 redujo considerablemente la señal de fijación de BMP11 hacia ALK4-Fc (reducción de 98 %) y ALK5-Fc (reducción del 69 %), lo que sugiere que la adnectina compite para fijarse a la miostatina con los receptores tipo I. Por el contrario, se observó una mayor respuesta de fijación para los complejos de miostatina/ATI-1523 o BMPll/ATI-1523 en las superficies de ActRIIB-Fc o mAb-A, lo que sugiere que los complejos de miostatina/ATI-1523 o BMPll/ATI-1523 pueden unirse a estas superficies, es decir, la adnectina no es competitiva con ActRIIB-Fc o mAb-A. El gran aumento en la respuesta de fijación (aumento >1000 %) para el complejo de miostatina/ATI-1523 en las superficies de ActRIIB-Fc y mAb-A es coherente con la adnectina que tiene un efecto solubilizante en la miostatina.
Tabla 18: La respuesta de fijación de SPR para 100 nM de miostatina o 100 nM de BMP11 en ausencia o presencia de 200 nM de ATI-1523 en las superficies de ALK4-Fc, ALK5-Fc, ActRIIB-Fc, mAb-A o PRD-1474.
Competencia de adnectina mediante el uso del "formato B de SPR": El mecanismo de acción de las adnectinas antimiostatina también se evaluó en el "formato B de SPR", en donde la miostatina o BMP11 (10 mg/ml en 10 mM de acetato pH 4.5) se inmovilizaron directamente en la superficie del chip sensor CM5 usando la química de acoplamiento de EDC/NHS en una densidad de 985 RU (miostatina) o 530 RU (BMP11). En este caso, la respuesta de fijación para los receptores ALK4-Fc (R&D Systems), ALK5-Fc (R&D Systems) o ActRIIB-monómero (elaboración interna) inyectados solos (2 mM durante 180 s a 30 ml/min) se comparó con las respuestas de fijación para estos receptores después de la prefijación de la fusión de adnectina-Fc PRD-1474 a la superficie (1 mM para 480 s a 30 ml/min). El amortiguador de corrida para los experimentos de competencia e inmovilización fue 10 mM de HEPES, 150 mM de NaCl, 3 mM de EDTA y 0.05 % v/v de tensioactivo P20, pH 7.4, y se regeneraron superficies entre ciclos usando 4 inyecciones de 50 mM de NaOH durante 15 s a 30 m?/min.
En ausencia de PRD-1474, cada receptor se fijó específicamente a BMP11 inmovilizado, mientras que solo ALK5-Fc y ActRIIB-monómero, pero no ALK4-FC, se fijaron a la miostatina inmovilizada. La prefijación de PRD-1474 redujo considerablemente la señal de fijación de ALK4-Fc hacia BMP11 (reducción de 70 %) y también redujo la fijación de ALK5-Fe hacia la miostatina o BMP11 (reducción de 35-41 %), pero tuvo un impacto mínimo en la fijación de ActRIIB-monómero a las superficies de miostatina o BMP11, Tabla 19. Estos datos, tomados junto con los datos de la competencia de SPR del "formato A de SPR" (Tabla 18), los datos de ELISA competitivo (Figura 10), y la inhibición completa de la señalización de miostatina observada en el ensayo de ARE-luciferasa (Figura 11), demuestran que el mecanismo de acción de la adnectina es el bloqueo del reclutamiento de receptores de señalización tipo I (ALK4/5) y que las adnectinas no compiten con la fijación al receptor tipo II (ActRIIB).
Tabla 19: Respuesta de fijación de SPR para 1 mM ALK4-Fc, ALK5-Fc o ActRIIB-monómero en las superficies inmovilizadas de miostatina o BMP11 con prefijación de PRD-1474 o sin ella.
Debido a que estas adnectinas representan los ejemplos de familias de secuencias en la presente invención, y los clones individuales dentro de una familia de secuencias bien definidas mantienen el mismo sitio de fijación, las secuencias abarcadas por la presente invención actúan bloqueando el reclutamiento de ALK4/5 al complejo miostatina-ActRIIb.
Los datos farmacocinéticos también indican que los niveles del complejo de miostatina-adnectina se acumulan con el tiempo y que estos complejos se fijan a ActRIIb, y así actúan como un inhibidor negativo dominante de la señalización independiente del fármaco libre. Este mecanismo particular distingue las adnectinas antimiostatina de la presente invención de los anticuerpos de antimiostatina descritos en la literatura (por ejemplo, US 7632499) e indican que las adnectinas antimiostatina de la invención tienen una mayor actividad.
Ejemplo 11: Mapeo del sitio de fijación de la adnectina en la miostatina mediante HDX-MS: El sitio de fijación de la adnectina en la miostatina se evaluó usando la espectrometría de masa de intercambio de hidrógeno-deuterio (HDX-MS).
El método de espectrometría de masa de intercambio de hidrógeno/deuterio (HDX-MS) demuestra la conformación proteica y la dinámica conformacional en solución mediante el control de la velocidad y el alcance del intercambio de deuterio en los hidrógenos de amida de la estructura principal. El nivel de HDX depende de la accesibilidad del solvente de los hidrógenos de la amida de la estructura principal y la conformación proteica. El aumento másico de la proteína en HDX se puede medir con precisión mediante MS. Cuando esta téenica se usa junto con la digestión enzimática, se pueden obtener las características estructurales en el nivel de péptidos, lo cual permite la diferenciación de péptidos expuestos a la superficie de aquellos plegados hacia adentro, o de aquellos secuestrados en la interfaz de un complejo proteína-proteína. Con frecuencia, se realiza el etiquetado con deuterio y los experimentos de inactivación posteriores, y luego la digestión de pepsina en línea, la separación de los péptidos y el análisis MS.
Debido a que se demostró que la miostatina sola tiene una solubilidad baja poco adecuada para HDX-MS en condiciones de pH fisiológicamente relevante (< 10 ug/ml), se usó una estrategia alternativa para aumentar la solubilidad de la miostatina formando un complejo con la proteína y el fragmento de Fab de mAb-A (Fab-A), que demostró ser no competitivo con la adnectina usando los experimentos de SPR descritos en el Ejemplo 10. El estado oligomérico de las muestras de HDX-MS se caracterizó mediante la cromatografía por exclusión de tamaño acoplada al detector de dispersión de luz láser multiángulo (SEC-MALS), en donde la masa del complejo de miostatina/Fab-A determinada por MALS (-120 kDa) fue coherente con la estoiquiometría prevista de un homodímero de miostatina fijado a dos moléculas de Fab-A, y la masa del complejo miostatina/Fab-A/3116_A06 determinada por MALS (142 kDa) fue coherente con la estoiquiometría prevista de un homodímero de miostatina fijado a dos moléculas Fab-A más dos moléculas 3116_A06.
Antes de mapear el sitio de fijación de adnectina en la miostatina reconocida por la adnectina 3116_A06 mediante HDX-MS, se realizaron experimentos no deuterados para generar una lista de péptidos pépticos comunes para la miostatina de las muestras de miostatina/Fab-A (relación molar 1:1 a 30 mM cada uno) y miostatina/Fab-A/3116_A06 (relación molar de 1:1:1 a 30 mM cada una), con lo cual se logró una cobertura de secuencia de 83.5 % para la miostatina. En este experimento, se usaron 10 mM de amortiguador de fosfato (pH 7.0) durante la etapa de etiquetado, y luego se agregó un amortiguador de inactivación (200 mM de amortiguador de fosfato con GdnCl 4 M y TCEP 0.5 M, pH 2.5, 1:1, v/v). Para los experimentos de mapeo de sitios de fijación de adnectina, se mezclaron 5 ml de cada muestra (miostatina/Fab-A o miostatina/Fab-A/3116_A06) con 65 ml de amortiguador de etiquetado HDX (10 mM de amortiguador de fosfato en D20, pD 7.0) para comenzar las reacciones de etiquetado a temperatura ambiente (-25 °C). Las reacciones se llevaron a cabo durante diferentes periodos: 20 s, 1 min, 10 min, 60 min y 240 min. Al final de cada periodo de reacción de etiquetado, la reacción se inactivó mediante la adición de amortiguador de inactivación (1:1, v/v), y la muestra inactivada se inyectó en el sistema Waters HDX-MS para su análisis. Los péptidos pépticos comunes observados se controlaron para determinar sus niveles de absorción de deuterio en ausencia/presencia de 3116_A06.
Los datos experimentales obtenidos de las mediciones mediante HDX-MS indican que la adnectina 3116_A06 reconoce un sitio de fijación de adnectina discontinuo comprendido por las dos regiones de péptidos en la miostatina: Región 1: LYFNGKEQIIYGKIPAM (85-101); SEQ ID NO: 329 Región 2: PHTHLVHQANP (56-66); SEQ ID NO: 330 En función de los niveles relativos de absorción de deuterio, las dos regiones de péptidos se pueden clasificar como las regiones 1 > 2, de las cuales la región 1 tiene los cambios más significativos en la absorción de deuterio.
Ejemplo 12’- Acoplamiento in silico de adnectina 3116_A06 en la miostatina Se usó un enfoque computacional para generar un modelo estructural del complejo 3116_A06-miostatina que fue consistente con los datos de HDX-MS (Figuras 13A-13B). El acoplamiento proteico de 3116_A06 en la estructura de la miostatina humana (PDB 3HH2 tomada del banco de datos proteicos, www.rcsb.org; Cash et al., EMBO J. 2& -.2662-2616 , 2009) se llevó a cabo usando ZDOCK (Chen and Wang, Proteins 47:281-294, 2002) como se implemento en Accelrys software Discovery Studio v3.5 (Accelrys). El protocolo ZDOCK utiliza el acoplamiento de cuerpos rígidos de dos estructuras proteicas (ligando = 3116_A06 y receptor = miostatina). Las pruebas de acoplamiento se filtraron para los complejos que contenían conformaciones de los bucles FG (residuos Thr79 a Tyr88) y BC (residuos Ser25 a N33) de 3116_A06. Se seleccionó un complejo preferido en función de la complementariedad de los residuos de interfaz acoplados con correlación de las sustituciones favorables del bucle identificadas por la mutagénesis de adnectina. La Figura 13A muestra el sitio de fijación de ALK4 y el sitio de fijación de ActRIIB mapeados en la estructura de miostatina (gris). La Región 1 y la Región 2, que fueron identificadas por los experimentos de HDX-MS como se describieron en el Ejemplo 11, están indicadas en negro. La Figura 13B muestra un complejo preferido del acoplamiento, con el bucle BC, DE y FG de 3116_A06 (negro) representado en un modelo de varillas, y las regiones 1 y 2 de miostatina (gris) representadas en un modelo de esferas espaciales. Varios residuos que fueron identificados como mutaciones favorables del bucle muestran contribuciones clave. Por ejemplo, en el bucle BC de 3116_A06, los residuos Ser25, Leu26 y Pro27 son importantes como ligaduras estructurales para mantener la conformación general del bucle. Por el contrario, Ala32 encaja en una pequeña hendidura hidrófoba formada en la interfaz del complejo, y la estructura principal del residuo forma puentes de hidrógeno con la miostatina. Las sustituciones de máxima preferencia en la posición 32 son Gly o Leu, y se prevé que encajan adecuadamente en lugar de la alanina. De manera similar, Asn33 está involucrado con los puentes de hidrógeno en residuos de triptófano de miostatina cercanos. Las sustituciones de máxima preferencia en posición 33 son His y Gln, que también contienen cadenas laterales que contribuyen como donantes de puentes de hidrógeno. Los residuos del bucle DE son esenciales: las sustituciones más favorables se limitan a Gly55, Arg56 y Gly 57, y solo se prefieren sustituciones conservadoras para Val58. En la estructura del modelo, Arg56 es un residuo esencial que colabora con las interacciones de cationes pi con Y86 de miostatina en la Región 1 y puentes de hidrógeno adicionales con la estructura principal y la cadena lateral de otros residuos de la Región 1. Para muchos residuos del bucle FG, las sustituciones de máxima preferencia son reemplazos conservadores. Una posición fundamental identificada fue Tyr88, que tiene interacciones de cationes pi e interacciones pi-pi con Y55 y otros residuos de la Región 2 de miostatina. El bucle FG también participa en varias interacciones hidrófobas con las regiones 1 y 2 identificadas de experimentos de mutagénesis. Estos cálculos muestran gran concordancia con los datos de los experimentos HDX-MS y SPR.
Ejemplo 13 - Modelo de ratón in vivo de eficacia musculoesquelética Se albergaron ratones B6.SCID macho (9-13 semanas de edad, Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine) en una habitación con temperatura controlada con un ciclo opuesto de 12 horas de luz/oscuridad. El agua y el alimento estuvieron disponibles a demanda. Los ratones se aleatorizaron y se distribuyeron entre grupos de tratamiento para recibir el control o los compuestos de prueba de la presente invención en función del peso corporal (alrededor de 20-22 g). A fin de demostrar la eficacia in vivo de los compuestos de la presente invención, los compuestos se administraron semanalmente (adnectinas antimiostatina fusionadas con Fe) o dos veces por semana (adnectinas antimiostatina PEGiladas) mediante inyección subcutánea. Los compuestos de prueba se administraron a los animales en solución salina amortiguada con fosfato (PBS). Los controles se trataron solo con amortiguador de reconstitución. A los animales de prueba (n=8-10 ratones/grupo) se les aplicaron por vía subcutánea, durante un periodo de 14 días, dosis de, por ejemplo, 5, 6 o 10 mg/kg/semana de un compuesto de la invención. Se registraron las mediciones del peso corporal antes de la aleatorización, el día de la aleatorización, y 2 a 3 veces por semana durante los periodos de tratamiento y al final del estudio. La masa muscular de la pata inferior se registró de carcasas corporales al final del estudio mediante análisis cuantitativo de imágenes por resonancia magnética (MRI, Echo Medical Systems, Tex). Los grupos de prueba se compararon con el grupo de control. Los resultados muestran que las adnectinas antimiostatina de la invención aumentaron el porcentaje de peso corporal desde el inicio (Figura 14) y tuvieron efectos anabólicos considerables en el volumen muscular esquelético (Figura 15), en comparación con los ratones de control (por ejemplo, un aumento aproximado de 7-10 % en el volumen muscular, en comparación con el control.
Imagen por resonancia magnética (IRM) La IRM para las mediciones del volumen muscular de las patas se realizó con Bruker PharmaScan 4.7 Tesla con un diámetro de 16 cm (Bruker Biospin, Billerica, Ma. EE. UU.). Se utilizó una bobina de 62 mm de volumen para el transmisor y el receptor. Después de recolectar las imágenes del localizador de la pata inferior, se obtuvieron imágenes ponderadas T2 usando un plano de corte axial. La secuencia de eco de espín rápida (RARE) consistió en un pulso de 90° Hermite seguido por un pulso de 180° Hermite con TR/TE = 2000/23ms. Se recolectaron 11 cortes axiales desde la parte superior de la rodilla hasta el tobillo con una dimensión de matriz de 256 x 128 de funciones de datos. El campo de visión fue de 5 cm x 2.5 cm, con un espesor de corte de 1.25 mm y un factor RARE de 4 y 8 promedios de señal. Los volúmenes musculares de las patas se calcularon sumando todas las áreas de corte axial multiplicado por el espesor de corte de 1.25 mm para el volumen muscular total en cada pata. Las imágenes se analizaron como un área promedio de la región de intereses (ROI) mediante análisis de secuencia de imágenes (ISA, Bruker Biospin, Billerica, Ma.). Se dibujaron ROI manuales alrededor del músculo de las patas, excluyendo la piel y el área de grasa subcutánea. El volumen muscular promedio total de ambas patas se muestra en la Figura 15.
La IRM para los volúmenes cardíacos como criterio de valoración de seguridad también se realizó con el mismo escáner de IRM. Después de obtener las imágenes iniciales de localizador del área torácica, se recolectaron 9 imágenes axiales desde los grandes vasos sanguíneos hasta la punta del corazón. De modo similar al análisis de los músculos de las patas, se agregaron las áreas axiales y se multiplicaron por el espesor de corte de 1.25 mm para obtener el volumen cardíaco total de cada animal. Según IRM, no se observaron cambios importantes en el volumen cardíaco.
Estadística Las diferencias entre los grupos se evaluaron mediante la prueba t de Student apareada con dos colas.
Ejemplo 14 - Eficacia de PRD-1474 en el crecimiento muscular in vivo Los ratones macho B6.SCID (n=10/grupo) se mantuvieron y se trataron como se describió en el Ejemplo 10, excepto porque se administró PRD-1474 en varias dosis como se indica en la Figura 16 y la duración del tratamiento fue de 28 días. PRD-1474 a 1 mg/kg mostró un aumento considerable del 11.1 % en volumen muscular de la pata inferior en comparación con el grupo de control PBS (p<0.0001). También se observaron aumentos considerables en el volumen muscular de la pata inferior de 27.7%, 29.7% y 32.8% con PRD-1474 a 10 mg/kg, 30 mg/kg y 100 mg/kg, respectivamente. No se observaron cambios en el volumen cardíaco en ninguno de los grupos de tratamiento en comparación con los grupos de control. Los datos se presentan como desviación estándar de la media +. Los diversos grupos a los que se les administraron dosis se compararon mediante ANOVA. (*p< 0.0001; *no importante entre grupos).
Los datos demuestran que las adnectinas antimiostatina de la invención son eficaces con dosis considerablemente más bajas que los inhibidores de miostatina descritos con anterioridad (por ejemplo, US 7632499, J. Clin. Onclo. 30 (supl):Abstr.2516, 2012). Por ello, las adnectinas antimiostatina de la invención proporcionan una mayor eficacia con dosis más bajas y menos efectos secundarios no deseados, cuando se administran solas o en combinación con otros inhibidores de miostatina u otros fármacos, para el tratamiento de la atrofia muscular progresiva y de las enfermedades metabólicas descritas en la presente.
Modalidades 1. Un polipéptido que comprende un dominio de fibronectina tipo III a la décima (10Fn3), en donde 10Fn3 tiene al menos un bucle seleccionado de los bucles BC, DE y FG con una secuencia de aminoácidos alterada con respecto a la secuencia del bucle correspondiente del dominio 10Fn3 humano, en donde el polipéptido se fija a miostatina. 2. El polipéptido de conformidad con la modalidad 1, en donde el polipéptido se fija a miostatina con una KD menor de 500 nM. 3. El polipéptido de conformidad con las modalidades 1 o 2, en donde el bucle BC comprende una secuencia de aminoácidos de conformidad con la Fórmula Xi-L-P-X2-X3-X4-X5-X6-X7, en donde (a) Xi se selecciona del grupo que consiste en S, T e Y; (b) X2 se selecciona del grupo que consiste en H, Y, N, R, F, G, S y T; (c) X3se selecciona del grupo que consiste en A, P, Q, S, F, H, N y R; (d) X4 se selecciona del grupo que consiste en G y A; (e) X5 se selecciona del grupo que consiste en H, L, R, V, N, D, F, I y K; (f) X6 se selecciona del grupo que consiste en A, L, G, M, F, I y V; y (g) X7 se selecciona del grupo que consiste en H y N. 4. El polipéptido de conformidad con la modalidad 3, en donde Xi es S. 5. El polipéptido de conformidad con las modalidades 3 o 4, en donde Xå es H o Y. 6. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las modalidades 3-5, en donde X3 es A o P. 7. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las modalidades 3-6, en donde X4 es G. 8. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las modalidades 3-7, en donde X5 es H, L o R. 9. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las modalidades 3-8, en donde X6 es A o L. 10. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las modalidades 3-9, en donde X7 es H. 11. El polipéptido de conformidad con la modalidad 3, en donde el bucle BC comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 7, 11-21, 23-31, 34 y 36-38. 12. El polipéptido de conformidad con la modalidad 11, en donde el bucle BC comprende la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO.34. 13. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el bucle DE comprende una secuencia de aminoácidos de conformidad con la Fórmula G- R-G-Xs, en donde Xs es V o L. 14. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el bucle DE comprende un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO: 39 y 42. 15. El polipéptido de conformidad con la modalidad 14, en donde el bucle DE comprende la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO.39. 16. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el bucle FG comprende una secuencia de aminoácidos de conformidad con la Fórmula Xg-Xio-Xii-Xi2-Xi3-Xi4-Xi5-Xi6-Xi7-Xi8, sn donde (a) Xg se selecciona del grupo que consiste en L, V e I; (b) Xio se selecciona del grupo que consiste en T y S; (c) Xn se selecciona del grupo que consiste en K, R, A, G, S, D, H, , T y P; (d) X12 se selecciona del grupo que consiste en S, T, A, E, H, K y N; (e) X13 se selecciona del grupo que consiste en K, G, Q, D, E, N, T y S; (f) X14 se selecciona del grupo que consiste en V, I, F, L, M, P, T e Y; (g) X15 se selecciona del grupo que consiste en I, L e Y; (h) Xi6 se selecciona del grupo que consiste en H, I, V, K, L, R, F, G, S y T; (i) X17 se selecciona del grupo que consiste en Y y H; y (j) Xi8 se selecciona del grupo que consiste en K, M, L, R y V. 17. El polipéptido de conformidad con la modalidad 16, en donde Xg es L o V. 18. El polipéptido de conformidad con las modalidades 16 o 17, en donde Xio es T. 19. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las modalidades 16-18, en donde Xn es K o R. 20. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las modalidades 16-19, en donde X12 es S o T. 21. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las modalidades 16-20, en donde X13 es K, G o Q. 22. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las modalidades 16-21, en donde X14 es V o I. 23. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las modalidades 16-22, en donde X15 es I. 24. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las modalidades 16-23, en donde X16 es H, I o V. 25. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las modalidades 16-24, en donde X17 es Y. 26. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las modalidades 16-25, en donde Xis es K o M. 27. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el bucle FG comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 46, 50-62, 64-72, 75-77 y 79. 28. El polipéptido de conformidad con la modalidad 27, en donde el bucle FG comprende la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO.75. 29. El polipéptido de conformidad con las modalidades 1 o 2, en donde el bucle BC comprende una secuencia de aminoácidos de conformidad con la Fórmula X19-X20-P-X21-G-X22-A, en donde (a) X19 se selecciona del grupo que consiste en D, E, V y W; (b) X20 se selecciona del grupo que consiste en A, S Y V; (c) X21 se selecciona del grupo que consiste en R, A, G, K y L; y (d) X22 se selecciona del grupo que consiste en L y R. 30. El polipéptido de conformidad con la modalidad 29, en donde X19 es D. 31. El polipéptido de conformidad con las modalidades 29 o 30, en donde X20 es A. 32. El polipéptido de conformidad con cualquiera « de las modalidades 29-31, en donde X21 es R o A. 33. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las modalidades 29-32, en donde X22 es L. 34. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las modalidades 29-33, en donde el bucle BC comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 8-10, 22, 32, 33 y 35. 35. El polipéptido de conformidad con las modalidades 1, 2 y 27-34, en donde el bucle DE comprende una secuencia de aminoácidos de conformidad con la Fórmula X23-G-R-G-X24, en donde (a) X23 se selecciona del grupo que consiste en V, P, F, I y L; y (b) X24 se selecciona del grupo que consiste en S, N y T. 36. El polipéptido de conformidad con la modalidad 35, en donde el bucle DE comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 40, 41 y 43-45. 37. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las modalidades 1, 2 y 29-36, en donde el bucle FG comprende una secuencia de aminoácidos de conformidad con la Formula X25-X26-R-X27-G-X28-X29-X30-X31-X32, en donde (a) X25 se selecciona del grupo que consiste en I y V; (b) C26 se selecciona del grupo que consiste en F, D e Y; (c) X27 se selecciona del grupo que consiste en D y T; (d) X28 se selecciona del grupo que consiste en P, M, V y T; (e) X29 se selecciona del grupo que consiste en V, L, N, R y S; (f) X30 se selecciona del grupo que consiste en H, T, L, N, Q y S; (g) X31 se selecciona del grupo que consiste en F, W, Y, H y L; y (h) X32 se selecciona del grupo que consiste en D, A y G. 38. El polipéptido de conformidad con la modalidad 37, en donde X2s es I. 39. El polipéptido de conformidad con las modalidades 37 o 38, en donde X26 es F. 40. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las modalidades 37-39, en donde X27 es D. 41. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las modalidades 37-40, en donde X28 es P. 42. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las modalidades 37-41, en donde X29 es V. 43. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las modalidades 37-42, en donde X30 es H o T. 44. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las modalidades 37-43, en donde X31 es F o W. 45. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las modalidades 37-44, en donde X32 es D. 46. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las modalidades 37-45, en donde el bucle FG comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 47-49, 63, 73, 74 y 78. 47. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el polipéptido comprende un bucle BC y un bucle DE. 48. El polipéptido de conformidad con la modalidad 47, en donde el bucle BC comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 7-38, y el bucle DE comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 39-45. 49. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las modalidades 1-46, en donde el polipéptido comprende un bucle BC y un bucle FG. 50. El polipéptido de conformidad con la modalidad 49, en donde el bucle BC comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 7-38, y el bucle FG comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 46-79. 51. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las modalidades 1-46, en donde el polipéptido comprende un bucle DE y un bucle FG. 52. El polipéptido de conformidad con la modalidad 51, en donde el bucle DE comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 39-45, y el bucle FG comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 46-79. 53. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el polipéptido comprende un bucle BC, un bucle DE y un bucle FG. 54. El polipéptido de conformidad con la modalidad 53, en donde el bucle BC comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 7-38, el bucle DE comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 39-45, y el bucle FG comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 46-79. 55. El polipéptido de conformidad con la modalidad 54, en donde el bucle BC comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 34, el bucle DE comprende SEQ ID NO: 39 y el bucle FG comprende SEQ ID NO: 75. 56. El polipéptido de conformidad con la modalidad 55, en donde las secuencias del bucle BC tienen 1, 2, 3, 4, 5 o 6 sustituciones de aminoácidos; el bucle DE tiene 1 sustitución de aminoácidos, y el bucle FG tiene 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 sustituciones de aminoácidos. 57. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 56, en donde (a) el bucle BC comprende una secuencia de aminoácidos de conformidad con la Fórmula X33-L-P-X34-X35-X36-X37-X38-X39, en donde (i) X33 se selecciona del grupo que consiste en T e Y; (ii) X34 se selecciona del grupo que consiste en Y, N, R, F, G, S y T; (iii) X35 se selecciona del grupo que consiste en A, P, S, F, H, N y R; (iv) X36 es A; (v) X37 se selecciona del grupo que consiste en H, L, R, V, N, D, F e I; (vi) X38 se selecciona del grupo que consiste en L, G, M, F, I y V; y (vii) X39 es H; (b) el bucle DE comprende una secuencia de aminoácidos de conformidad con la Fórmula G-R-G-X40, en donde X40 es L; y (c) el bucle FG comprende una secuencia de aminoácidos de conformidad con la Fórmula X41-X42-X43-X44-X45- X46-X47-X48-X49-X50, en donde (i) X41 se selecciona del grupo que consiste en L e (ii) X42 es S; (iii) X43 se selecciona del grupo que consiste en K, S, H, N, T y P; (iv) X44 se selecciona del grupo que consiste en S, K y N; (v) X45 se selecciona del grupo que consiste en K, N, T y S; (vi) X46 se selecciona del grupo que consiste en V, M, P y T; (vii) X47 se selecciona del grupo que consiste en I e Y; (viii) X48 se selecciona del grupo que consiste en H, I, V, L, R, F, G, S y T; (ix) X49 es H; y (x) X50 se selecciona del grupo que consiste en M, L, R y V. 58. El polipéptido de conformidad con las modalidades 1 o 2, en donde el bucle BC comprende una secuencia de aminoácidos de conformidad con la Fórmula X51-X52~X53_X54_X55_X56-X57-X58-X59 6n donde (a) X51 se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, F, H, I, K, L, N, Q, R, S, T, V, W e Y; (b) X52 se selecciona del grupo que consiste en L, M y V; (c) X53 se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, E, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V e Y; (d) X54 se selecciona del grupo que consiste en A, c, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, e Y; (e) X55 se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y; (f) X56 se selecciona del grupo que consiste en G y S; (g) X57 se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W e Y; (h) X58 se selecciona del grupo que consiste en A, C, G, L, M, S y T; y (i) X59 se selecciona del grupo que consiste en A, C, F, H, N, P, Q, R, S e Y. 59. El polipéptido de conformidad con la modalidad 58, en donde (a) X51 se selecciona del grupo que consiste en C, F, I, S, V, W e Y; (b) X52 se selecciona del grupo que consiste en L; (c) X53se selecciona del grupo que consiste en P; (d) X54 se selecciona del grupo que consiste en C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W e Y; (e) X55 se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, E, F, G, H, I, K L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y; (f) X56 se selecciona del grupo que consiste en G; (g) X57 se selecciona del grupo que consiste en A, C, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, V, e Y; (h) X58 se selecciona del grupo que consiste en A, G, L, M y S; y (i) X59 se selecciona del grupo que consiste en C, H, N, Q, S e Y. 60. El polipéptido de conformidad con la modalidad 59, en donde (a) X5i se selecciona del grupo que consiste en F, S y W; (b) X52 se selecciona del grupo que consiste en L; (c) X53se selecciona del grupo que consiste en P; (d) X54 se selecciona del grupo que consiste en C, F, G, I, K, L, M, N, R, S, T, V, W e Y; (e) X55 se selecciona del grupo que consiste en A, C, E, F, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V e Y; (f) X56 se selecciona del grupo que consiste en G; (g) X57 se selecciona del grupo que consiste en A, C, H, K, L, M, N, R, V, W e Y; (h) X58 se selecciona del grupo que consiste en A, G Y L; y (i) X59 se selecciona del grupo que consiste en H, N y Q- 61. El polipéptido de conformidad con la modalidad 58-60, en donde X51 es S. 62. El polipéptido de conformidad con la modalidad 58, en donde X52 es L. 63. El polipéptido de conformidad con la modalidad 58, en donde X53 es P. 64. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las modalidades 58, 59 y 61-63, en donde X54 es H. 65. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las modalidades 58-64, en donde X55 es Q. 66. El polipéptido de conformidad con la modalidad 58, en donde X56 es G. 67. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las modalidades 58-66, en donde X57 es K. 68. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las modalidades 58-67, en donde X5ees A. 69. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las modalidades 58-68, en donde X59 es N. 70. El polipéptido de conformidad con la modalidad 58, en donde el bucle BC comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 7, 11-21, 23-31, 34 y 36-38. 71. El polipéptido de conformidad con la modalidad 70, en donde el bucle BC comprende la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO.34. 72. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las modalidades 58-71, en donde el bucle DE comprende una secuencia de aminoácidos de conformidad con la Fórmula G-R-G-X6o, en donde X60 es A, C, D, E, F, I, K, L, M, N, Q, S, T y V. 73. El polipéptido de conformidad con la modalidad 72, en donde Ceo es C, E, I, L, M, Q, T y V. 74. El polipéptido de conformidad con la modalidad 73, en donde X6o es C, E, I, L, M y V. 75. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las modalidades 72-74, en donde Ceo es V. 76. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las modalidades 58-75, en donde el bucle DE comprende un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO: 39 y 42. 77. El polipéptido de conformidad con la modalidad 76, en donde el bucle DE comprende la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO.39. 78. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las modalidades 58-77, en donde el bucle FG comprende una secuencia de aminoácidos de conformidad con la Fórmula Cei-X62-X63-X64—X65-X66-X67-X68-X69-X7o, en donde (a) X6i se selecciona del grupo que consiste en A, C, F, I, L, M, Q, T, V, W e Y; (b) X62 se selecciona del grupo que consiste en A, C, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W e Y; ( c ) X63 se selecciona del grupo que consiste en A, C , D, E , F , G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y; (d) X64 se selecciona del grupo que consiste en A, C , D , E , F , G, H , I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, e Y; (e ) X65 se selecciona del grupo que consiste en A, C , D , E , F , G, H , I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W e Y; ( f ) Xse se selecciona del grupo que consiste en A, C , F , H, I , L , M, N, P S, T, V, W e Y; (g) Xe 7 se selecciona del grupo que consiste en A, C , E , F , H, I , K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W e Y; (h) X68 se selecciona del grupo que consiste en A, C , D , E , F , G, H , I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y; ( i ) X69 se selecciona del grupo que consiste en F, W e Y ; y (j) X70 se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y. 79. El polipéptido de conformidad con la modalidad 78, en donde: (a) X6i se selecciona del grupo que consiste en A, C, I, L, M y V; (b) X62 se selecciona del grupo que consiste en C, F, H, I, L, M, Q, R, S, T, V, W e Y; (C) X63 se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, S, T, V, W e Y; (d) X64 se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, E, F, G, H , I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W e Y; (e) Cd5 se selecciona del grupo que consiste en A, D , E, F, G, H, i , L, M, N, Q, S, T, V, W e Y; (f) Cd6 se selecciona del grupo que consiste en C, F , I, L, M, P, T , V, W e Y; (g) Cd7 se selecciona del grupo que consiste en C, F , H, I, K, L, M, N, Q, R, T, V, W e Y; (h) Cd8 se selecciona del grupo que consiste en A, C, E, F, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y; (i) Cd9 se selecciona del grupo que consiste en W e Y ; y (j) Cto se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, E, G, H, K, L, M, N, P, Q, R, S, T y V. 80. El polipéptido de conformidad con la modalidad 79 en donde: (a) Cbi se selecciona del grupo que consiste en I y V; (b) C62 se selecciona del grupo que consiste en C, F , I, L, M, T, V, W e Y; (c) X63 se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, Q, S, T y V; (d) Cb4 se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, F, G, I, L, M, N, Q, S, T, V, W e Y; (e) Cb5 se selecciona del grupo que consiste en A, G, S, T y W; (f) Cb6 se selecciona del grupo que consiste en F, I, V, W e Y; (g) Xsi se selecciona del grupo que consiste en F, H, I, L, M, V, W e Y; (h) X68 se selecciona del grupo que consiste en A, C, F, G, I, K, L, M, T, V y W; (i) Xg9 se selecciona del grupo que consiste en W e Y; y (j) X70 se selecciona del grupo que consiste en A, G, K, L, M, P, Q y R. 81. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las modalidades 78-80, en donde X6i es V. 82. El polipéptido de conformidad con las modalidades 78-81, en donde X&2 es T. 83. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las modalidades 78-82, en donde Cb3 es D. 84. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las modalidades 78-83, en donde Cb4 es T. 85. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las modalidades 78-84, en donde X65 es G. 86. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las modalidades 78-85, en donde Cb6 es Y. 87. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las modalidades 78-86, en donde X67 es L. 88. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las modalidades 78-87, en donde X6e es K. 89. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las modalidades 78-88, en donde X69 es Y. 90. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las modalidades 78-89, en donde X70 es K. 91. El polipéptido de conformidad con las modalidades 1 o 2, en donde (a) el bucle BC comprende una secuencia de aminoácidos de conformidad con la Fórmula X51-X52-X53-X54-X55-X56-X57-X58X59, en donde (i) X51 se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, F, H, I, K, L, N, Q, R, S, T, V, W e Y; (ii) X52 se selecciona del grupo que consiste en L, M y V; (iii) X53se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, E, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V e Y; (iv) X54 es A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W e Y; (v) X55 se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y; (vi) X56 se selecciona del grupo que consiste en G y S; (vii) X57 es A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S T V, W e Y; (viii) X58 es A, C, G, L, M, S y T; y (ix) X59 es A, C, F, H, N, P, Q, R, S e Y; (b) el bucle DE comprende una secuencia de aminoácidos de conformidad con la Fórmula G-R-G-X30, en donde Cdo se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, E, F, I, K, L, M, N, Q, S, T y V; y (c) el bucle FG comprende una secuencia de aminoácidos de conformidad con la Fórmula 61-X62-X63-X64-X65-X66-X67-X68-X69-X7o, en donde (i) Cd? se selecciona del grupo que consiste en A, C, F, I, L, M, Q, T, V, W e Y; (ii) X62 es A, C, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W e Y; (iii) X63 se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y; (iv) X64 se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y; (v) X65 se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W e Y; (vi) X66 se selecciona del grupo que consiste en A, C, F, H, I, L, M, N, P, S, T, V, W e Y; (vii) X67 se selecciona del grupo que consiste en A, C E F, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W e Y; (viii) X68 se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y; (ix) X69 se selecciona del grupo que consiste en F, W e Y; y (x) X70 se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y. 92. El polipéptido de conformidad con la modalidad 91, en donde (a) (i) X51 se selecciona del grupo que consiste en C, F, I, S, V, W e Y; (ii) X52 es L; (iii) X53es P; (iv) X54 se selecciona del grupo que consiste en C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W e Y; (v) X55 se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y; (vi) X56 es G; (vii) X57 se selecciona del grupo que consiste en A, C, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, V, W e Y; (viii) X58 se selecciona del grupo que consiste en A, G, L, M y S; y (ix) X59 se selecciona del grupo que consiste en C, H, N, Q, S e Y; (b) Ceo se selecciona del grupo que consiste en C, E, I, L, M, Q, T y V; y (c) (i) X6i se selecciona del grupo que consiste en A, C, I, L, M y V; (ii) X62 es C, F, H, I, L, M, Q, R, S, T, V, W e Y; ( iii) X se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, E, F, G, H, I , L, M, N, P, Q, S , T, V, W e Y; ( iv) X se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W e Y; (v) XÉ5 se selecciona del grupo que consiste en A, D, E, F, G, H, I, L,M,N, Q, S, T,V,W e Y; (vi) Xg6 se selecciona del grupo que consiste en C, F, I, L, M, P, T, V,W e Y; (vii) X67 se selecciona del grupo que consiste en C, F, H, I, K, L, M,N, Q,R, T,V,W e Y; (viii) Cb8 se selecciona del grupo que consiste en A, C, E, F, G, I, K, L,M,N, P, Q, R, S, T, V, W e Y; (ix) X69se selecciona del grupo que consiste en W e Y;y (x) X70 se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, E, F, G, H, I, K, L,M, N, P, Q, R, S, T,V, W e Y. 93. El polipéptido de conformidad con la modalidad 92, en donde: (a) (i) X51 se selecciona del grupo que consiste en F, S y W; (ii) X52es L; (iii) X53es P; (iv) X54 se selecciona del grupo que consiste en C, F, G, I, K, L, M, N, R, S, T,V,W e Y; (v) X55 se selecciona del grupo que consiste en A, C, E, F, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V e Y; (vi) X56es G; (vii) X57 se selecciona del grupo que consiste en A, C, H, K, L, M, N, R,V,W e Y; (viii) X58se selecciona del grupo que consiste en A, G y L; (ix) X59 se selecciona del grupo que consiste en H,N y Q; (b) Xgo se selecciona del grupo que consiste en C, E, I, L, M y V;y (c) (i) Cd?se selecciona del grupo que consiste en I y V; (ii) X62es C, F, I, L, M, T, V, W e Y; (iii) X63 se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, E, F, G, H, I, L,M, N, Q, S, T y V; (iv) Cb4 se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, F, G, I, L, M, N, Q, S, T, V, W e Y; (v) ¾ se selecciona del grupo que consiste en A, G, S, T y W; (vi ) X6 se selecciona del grupo que consiste en F, I, V, W e Y; (vii) X67 se selecciona del grupo que consiste en F, H, I, L, M, V, W e Y; (viii) X68 se selecciona del grupo que consiste en A, C, F, G, I, K, L, M, T, V y W; (ix) Xes se selecciona del grupo que consiste en e Y; Y (x) X70 se selecciona del grupo que consiste en A, G, K, L, M, P, Q y R. 94. El polipéptido de conformidad con la modalidad 92, en donde: (a) (i) X5i es S; (ii) X52 es L; (iii) X53es P; (iv) X54 es H; (v) X55 es Q; (vi) Xss es G; y (vii) X57 es K; (viii) X58 es A; y (ix) X59 es N; (b) Xso es V; y (c) (i) X6i es V; (ii) X62 es T; (iii) X63 es D; (iv) X64 es T; (v) X65 es G; (vi) X6e es Y; (vii) X57 es L; (viii) X68 es K; (ix) XS9 es Y; y (x) X70 es K. 95. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las modalidades 1 o 2, en donde el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100% identica a las regiones que no son bucles BC, DE ni FG de SEQ ID NO: 118, 273, 281 o 331. 96. El polipéptido de conformidad con las modalidades 1 o 2, en donde las secuencias de aminoácidos de los bucles BC, DE o FG son al menos 80% idénticas a cualquiera de SEQ ID NO: 7-38, 39-45 y 46-79, respectivamente . 97. El polipéptido de conformidad con la modalidad 1, en donde el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% idéntica a cualquiera de SEQ ID NO: 80-123, 228-239, 252-273, 281 y 331. 98. El polipéptido de conformidad con la modalidad 97, en donde el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% idéntica a SEQ ID NO: 331. 99. El polipéptido de conformidad con la modalidad 97, en donde el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 80%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% idéntica a SEQ ID NO: 273. 100. El polipéptido de conformidad con la modalidad 1, en donde el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 80-123, 228-239, 252-273, 281 y 331. 101. El polipéptido de conformidad con la modalidad 100, en donde el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO. 331. 102. El polipéptido de conformidad con la modalidad 101, en donde el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO.273. 103. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el sitio de fijación de adnectina en la miostatina es discontinuo. 104. El polipéptido de conformidad con la modalidad 103, en donde el polipéptido se fija a una región en los aminoácidos 56-66. 105. El polipéptido de conformidad con la modalidad 103, en donde el polipéptido se fija a una región en los aminoácidos 85-101. 106. El polipéptido de conformidad con la modalidad 103, en donde el polipéptido se fija a una región en los aminoácidos 85-101 y 56-66 de SEQ ID NO: 3. 107. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el polipéptido no compite con ActRIIB por la fijación a miostatina. 108. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las modalidades anteriores, en donde el polipéptido compite con ALK4 y/o ALK5 por la fijación a miostatina. 109. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las modalidades anteriores, que también comprende una o más porciones farmacocinéticas (PK) seleccionadas del grupo que consiste en polietilenglicol, ácido siálico, Fe, fragmento Fe, transíerrina, albúmina del suero, una proteína de fijación a la albúmina del suero y una proteína de fijación a la inmunoglobulina del suero. 110. El polipéptido de conformidad con la modalidad 109, en donde la porción PK y el polipéptido se unen mediante al menos un puente de disulfuro, un enlace peptídico, un polipéptido, un azúcar polimérico o una porción de polietilenglicol. 111. El polipéptido de conformidad con la modalidad 109, en donde la porción PK y el polipéptido se unen mediante un enlazador con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 181-227. 112. El polipéptido de conformidad con la modalidad 109, en donde la proteína de fijación a la albúmina del suero comprende un dominio de fibronectina tipo III a la décima (10Fn3). 113. El polipéptido de conformidad con la modalidad 109, en donde el dominio 10Fn3 se fija a HSA. 114. El polipéptido de conformidad con la modalidad 109, en donde la porción PK es Fe. 115. El polipéptido de conformidad con la modalidad 114, en donde Fe se encuentra en el N-terminal del polipéptido. 116. El polipéptido de conformidad con la modalidad 115, en donde Fe se encuentra en el C-terminal del polipéptido. 117. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las modalidades 114-116, en donde el polipéptido forma un dímero. 118. El polipéptido de conformidad con la modalidad 109, en donde la porción PK es polietilenglicol. 119. Una composición farmaceutica que comprende un polipéptido de conformidad con cualquiera de las modalidades anteriores y un portador aceptable desde el punto de vista farmacéutico. 120. La composición de conformidad con la modalidad 118, en donde la composición es esencialmente libre de endotoxinas. 121. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica el polipéptido de conformidad con cualquiera de las modalidades 1-116. 122 . La molécula de ácido nucleico aislada de conformidad con la modalidad 121 , en donde la molécula de ácido nucleico tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO : 124 - 167 , 240 - 251 y 284 - 305 . 123 . Un vector de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que codif ica el polipéptido de conformidad con cualquiera de las modalidades 1 -116 . 124 . Una célula que comprende un ácido nucleico que codif ica el polipéptido de conformidad con cualquiera de las modalidades 1-115. 125 . Un método para producir un polipéptido de f ij ación a miostatina, que comprende cultivar la célula de conformidad con la modalidad 124 en condiciones adecuadas para expresar el polipéptido y purificarlo . 126 . Un método para atenuar o inhibir una enfermedad o un trastorno relacionados con miostatina en un sujeto, que comprende administrar una cantidad eficaz del polipéptido o de la composición de conformidad con cualquiera de las modalidades 1- 120 . 127 . El metodo de conformidad con la modalidad 126 , en donde la enfermedad o el trastorno se seleccionan del grupo que consiste en distrofia muscular, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad pulmonar obstructiva congestiva, insuficiencia cardíaca crónica, cáncer, SIDA, insuficiencia renal , nefropatía crónica, uremia, artritis reumatoide , sarcopenia, atrofia muscular progresiva por inactividad prolongada, lesión medular, apoplej ía, fractura ósea, envej ecimiento, diabetes , obesidad, hiperglucemia, caquexia, osteoartritis , osteoporosis , infarto de miocardio y fibrosis . 128 . Un método para atenuar o inhibir un trastorno asociado a la degeneración o a la atrofia muscular progresiva en un sujeto, que comprende administrar una cantidad eficaz del polipéptido o de la composición de conformidad con las modalidades 1-120. 129. El método de conformidad con la modalidad 128, en donde el trastorno se selecciona del grupo que consiste en distrofia muscular, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad pulmonar obstructiva congestiva, insuficiencia cardíaca crónica, cáncer, SIDA, caquexia, insuficiencia renal, nefropatía crónica, uremia, artritis reumatoide, sarcopenia, atrofia muscular progresiva por inactividad prolongada, lesión medular, lesión traumática, apoplej ía , fractura ósea y envej ecimiento . 130 . El método de conformidad con la modalidad 129 , en donde la enfermedad es distrofia muscular . 131. El método de conformidad con la modalidad 128 , en donde la administración del polipeptido al suj eto provoca al menos uno de los siguientes efectos biológicos : (a) aumento de la masa muscular; (b) aumento de la cantidad de células musculares ; (c) aumento del tamaño de las células musculares ; y (d) aumento de la fuerza muscular . 132 . Un método para atenuar o inhibir un trastorno metabólico en un suj eto, que comprende administrar una cantidad ef icaz del polipéptido o de la composición de conformidad con las modalidades 1- 120 . 133 . El método de conformidad con la modalidad 132 , en donde el sujeto tiene una enfermedad o un trastorno seleccionados del grupo que consiste en diabetes, hiperglucemia, hiperinsulinemia, hiperlipidemia, resistencia a la insulina, intolerancia a la glucosa, obesidad y síndrome metabólico. 134. El método de conformidad con la modalidad 132, en donde la enfermedad o el trastorno es diabetes tipo II. 135. El método de conformidad con la modalidad 134, que también comprende la administración de una segunda composición terapéutica para tratar la diabetes. 136 . El método de conformidad con cualquiera de las modalidades 131- 135 , en donde la administración del polipéptido al suj eto provoca al menos uno de los siguientes efectos biológicos : (a) aumento de la sensibilidad a la insulina ; (b) aumento de la absorción celular de la glucosa en el suj eto; (c) disminución de los niveles de glucosa en sangre; y (d) disminución de la grasa corporal. 137. Un metodo para aumentar la masa muscular magra en un sujeto, que comprende administrar una cantidad eficaz del polipéptido o de la composición de conformidad con cualquiera de las modalidades 1-120. 138. Un método para aumentar la relación entre la masa muscular magra y la grasa en un sujeto, que comprende administrar una cantidad eficaz del polipéptido o de la composición de conformidad con cualquiera de las modalidades 1-120. 139 . Un kit que comprende el polipéptido o la composición de conformidad con cualquiera de las modalidades 1-120 e instrucciones de uso . 140 . Un método para detectar o medir la miostatina en una muestra, que comprende poner en contacto la muestra con el polipéptido de conformidad con cualquiera de las modalidades 1-117, y detectar o medir la fijación del polipéptido a la miostatina.
Se hace constar que con relación a esta fecha, el mej or método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención .

Claims (23)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:
1. Un polipéptido caracterizado porque comprende un dominio de fibronectina tipo III a la décima (10Fn3), en donde 10Fn3 tiene al menos un bucle seleccionado de los bucles BC, DE y FG con una secuencia de aminoácidos alterada con respecto a la secuencia del bucle correspondiente del dominio 10Fn3 humano, y en donde el polipéptido se fija a miostatina con una KD menor de 500 nM.
2. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque (a) el bucle BC comprende una secuencia de aminoácidos de conformidad con la Fórmula X51-X52-X53-X54-X55-X5S-X57-X58-X59, como se muestra en la Tabla 15, en donde (i) X5i se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, F, H, I, K, L, N, Q, R, S, T, V, W e Y; (ii) X52 se selecciona del grupo que consiste en L, M y V; (iii) X53se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, (iv) X54 es A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W e Y; (v) X55 se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, E F, G, H, I, K, L,M, N, P, Q, R, S, T,V, W e Y; (vi) Xse se selecciona del grupo que consiste en G y S; (vii) X57es A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q R, S, T, V, W e Y; (viii) X58 es A, C, G, L, M, S y T; y (ix) X59 es A, C, F, H, N, P, Q, R S e Y; y/o (b) el bucle DE comprende una secuencia de aminoácidos de conformidad con la Fórmula G-R-G-X30, como se muestra en la Tabla 15, en donde Ceo se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, E, F, I, K, L, M, N, Q, S, T y V; y/o (c) el bucle FG comprende una secuencia de aminoácidos de conformidad con la Fórmula X61-X62-X63-X64-X65-Xse-Xs7-Xss-X69-X7o, como se muestra en la Tabla 15, en donde (i) X6i se selecciona del grupo que consiste en A, C, F, I, L, M, Q, T, V, W e Y; (ii) X62 es A, C, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W e Y; (iii) Xs3 se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y; (iv) b4 se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y; (v) X65 se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W e Y; (vi) X6e se selecciona del grupo que consiste en A, C, F, H I, L, M, N, P, S, T, V, W e Y; (vii) X67 se selecciona del grupo que consiste en A, C, E, F, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W e Y; (viii) X68 se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y; (ix) X69 se selecciona del grupo que consiste en F, W e Y; y (x) X?o se selecciona del grupo que consiste en A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W e Y.
3. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el bucle BC comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 34, 7, 11-21, 23-31 y 36-38, el bucle DE comprende un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO: 39 y 42, y el bucle FG comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 75, 46, 50-62, 64-72, 76, 77 y 79.
4. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque los bucles BC, DE y FG comprenden: (a) la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 7, 39 y 46, respectivamente; (b) la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 8, 40 y 47, respectivamente; (c) la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 12, 42 y 51, respectivamente; (d) la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 17, 39 y 56, respectivamente; (e) la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 18, 39 y 57, respectivamente; (f) la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 17, 39 y 62, respectivamente; (g) la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 32, 44 y 73, respectivamente; (h) la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 35, 45 y 74, respectivamente; (i) la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 34, 39 y 75, respectivamente; (j) la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 35, 39 y 75, respectivamente; o (k) la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 38, 39 y 79.
5. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el bucle BC comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 34, el bucle DE comprende SEQ ID NO: 39 y el bucle FG comprende SEQ ID NO: 75.
6. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100% identica a las regiones que no son bucles BC, DE ni FG de SEQ ID NOs : 331, 273, 281 o 118.
7. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% idéntica a cualquiera de SEQ ID NOs : 331, 273, 80-123, 228-239, 252-272 o 281.
8. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque se fija a una región en los aminoácidos 56-66 de SEQ ID NO: 3.
9. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque se fija a una región en los aminoácidos 85-101 y 56-66 de SEQ ID NO: 3.
10. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque no compite con ActRIIB por la fijación a miostatina y/o el polipéptido compite con ALK4 y/o ALK5 por la fijación a miostatina.
11. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque también comprende una o más porciones farmacocinéticas (PK) seleccionadas del grupo que consiste en polietilenglicol , ácido siálico, Fe, fragmento Fe, transferrina, albúmina del suero, una proteina de fijación a la albúmina del suero y una proteína de fijación a la inmunoglobulina del suero .
12. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende un polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, y un portador.
13. Una molécula de ácido nucleico aislada caracterizada porque codifica el polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-11.
14. Una célula caracterizada porque comprende un ácido nucleico que codifica el polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-11.
15. Uso del polipéptido o de la composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-12, para la manufactura de un medicamento para atenuar o inhibir una enfermedad o un trastorno relacionado con miostatina en un sujeto.
16. El uso de conformidad con la reivindicación 15, en donde la administración del polipéptido al sujeto provoca al menos uno de los siguientes efectos biológicos: (a) aumento de la masa muscular; (b) aumento de la cantidad de células musculares; (c) aumento del tamaño de las células musculares; y (d) aumento de la fuerza muscular.
17. El uso de conformidad con la reivindicación 15, en donde la administración del polipéptido al sujeto provoca al menos uno de los siguientes efectos biológicos: (a) aumento de la sensibilidad a la insulina; (b) aumento de la absorción celular de la glucosa en el sujeto; (c) disminución de los niveles de glucosa en sangre; y (d) disminución de la grasa corporal .
18 . Un metodo para detectar o medir la miostatina en una muestra, caracterizado porque comprende poner en contacto la muestra con el polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-11 , y detectar o medir la fij ación del polipéptido a la miostatina .
19. Uso de una cantidad suficiente del polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-11, o de la composición de conformidad con la reivindicación 12, en la manufactura de un medicamento para incrementar la masa muscular de un sujeto.
20. El uso de conformidad con la reivindicación 19, en donde el sujeto tiene un trastorno neuromotor, un trastorno neuromuscular o un trastorno neurológico.
21. El uso de conformidad con la reivindicación 20, en donde el sujeto tiene distrofia muscular de Duchenne.
22. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18-21, en donde el polipéptido comprende bucles BC, DE y PG que comprenden las secuencias de aminoácido de SEQ ID Nos: 34 , 39 y 75 , respectivamente .
23. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18-22 , en donde el polipéptido comprende la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 273.
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