JP2009518422A - ミオスタチン・アンタゴニストの使用 - Google Patents
ミオスタチン・アンタゴニストの使用 Download PDFInfo
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Abstract
Description
本出願は、その全開示に依存して参考文献として援用される、2005年12月6日出願の米国仮出願第60/742,731号の利益を請求する。
本発明は、トランスフォーミング増殖因子-β(TGF-β)ファミリーメンバーのミオスタチン、ミオスタチン・アンタゴニスト、および多様な疾患の治療のためのこれらのアンタゴニストの使用に関する。
増殖/分化因子8(GDF-8)としても知られるミオスタチンは、骨格筋量制御に関与することが知られるトランスフォーミング増殖因子-β(TGF-β)ファミリーメンバーである。TGF-β-GDFファミリーのメンバーの大部分は、多くの組織種で非特異的に発現され、そして様々な多面的作用を発揮する。しかし、ミオスタチンは、主に、発生中の細胞および成人骨格筋組織で発現し、そして骨格筋増殖を負に制御するのに必須の役割を果たす(McPherronら, Nature(London)387, 83-90(1997))。最近の研究によって、ミオスタチン発現はまた、心臓、脂肪および前脂肪組織でも測定可能であることが示されている。
本発明は、多様な疾患状態のための治療法を提供する。これらの治療は、こうした治療が必要な被験体に1以上のミオスタチン・アンタゴニストを投与することを含む。ミオスタチン・アンタゴニストを予防的に投与して、こうした状態の発展を防止してもよいし、そして必要に応じて、状態が発展する前または発展した後のいずれかに、ミオスタチン・アンタゴニストを被験体に投与してもよい。本発明はさらに、以下に列挙する状態を治療するための医薬組成物の調製におけるミオスタチン・アンタゴニストの使用を提供する。
c1c2c3c4c5c6 Cc7c8 Wc9 WMCPPc10c11c12c13(配列番号354)、式中:
c1は、存在しないか、またはアミノ酸いずれかであり;
c2は、存在しないか、または中性疎水性アミノ酸、中性極性アミノ酸、もしくは酸性アミノ酸であり;
c3は、存在しないか、または中性疎水性アミノ酸、中性極性アミノ酸、もしくは酸性アミノ酸であり;
c4は、存在しないか、またはアミノ酸いずれかであり;
c5は、存在しないか、または中性疎水性アミノ酸、中性極性アミノ酸、もしくは酸性アミノ酸であり;
c6は、存在しないか、または中性疎水性アミノ酸、中性極性アミノ酸、もしくは塩基性アミノ酸であり;
c7は、中性疎水性アミノ酸、中性極性アミノ酸、または塩基性アミノ酸であり;
c8は、中性疎水性アミノ酸、中性極性アミノ酸、または塩基性アミノ酸であり;
c9は、中性疎水性アミノ酸、中性極性アミノ酸、または塩基性アミノ酸であり;そして
c10〜c13は、アミノ酸いずれかであり;
そして長さが20〜50アミノ酸の間であるペプチド、およびその生理学的に許容されうる塩を含む。
d1d2d3d4d5d6 Cd7d8 Wd9 WMCPPd10d11d12d13(配列番号355)、式中
d1は、存在しないか、またはアミノ酸いずれかであり;
d2は、存在しないか、または中性疎水性アミノ酸、中性極性アミノ酸、もしくは酸性アミノ酸であり;
d3は、存在しないか、または中性疎水性アミノ酸、中性極性アミノ酸、もしくは酸性アミノ酸であり;
d4は、存在しないか、またはアミノ酸いずれかであり;
d5は、存在しないか、または中性疎水性アミノ酸、中性極性アミノ酸、もしくは酸性アミノ酸であり;
d6は、存在しないか、または中性疎水性アミノ酸、中性極性アミノ酸、もしくは塩基性アミノ酸であり;
d7は、アミノ酸T、I、またはRのいずれか1つから選択され;
d8は、R、S、Qのいずれか1つから選択され;
d9は、P、RおよびQのいずれか1つから選択され;そして
d10〜d13は、アミノ酸いずれかから選択され;
そして長さが20〜50アミノ酸の間であるペプチド、およびその生理学的に許容されうる塩を含む。
(1)配列WYe1e2 Ye3 G(配列番号356)
ここでe1は、P、SまたはYであり、
e2は、CまたはQであり、そして
e3は、GまたはHである、
を含み、ペプチドの長さが7〜50アミノ酸の間である、ミオスタチンに結合可能なペプチド、およびその生理学的に許容されうる塩;
(2)配列f1 EMLf2 SLf3f4 LL(配列番号455)、
ここでf1は、MまたはIであり、
f2は、アミノ酸いずれかであり、
f3は、LまたはFであり、
f4は、E、QまたはDである、
を含み;そしてペプチドの長さが7〜50アミノ酸の間である、ミオスタチンに結合可能なペプチド、およびその生理学的に許容されうる塩;
(3)配列Lg1g2 LLg3g4 L(配列番号456)、ここで
g1は、Q、DまたはEであり、
g2は、S、Q、DまたはEであり、
g3は、アミノ酸いずれかであり、
g4は、L、W、F、またはYである、
を含み、そしてペプチドの長さが8〜50アミノ酸の間である、ミオスタチンに結合可能なペプチド、およびその生理学的に許容されうる塩;
(4)配列h1h2h3h4h5h6h7h8h9(配列番号457)、ここで
h1は、RまたはDであり、
h2は、アミノ酸いずれかであり、
h3は、A、T、SまたはQであり、
h4は、LまたはMであり、
h5は、LまたはSであり、
h6は、アミノ酸いずれかであり、
h7は、FまたはEであり、
h8は、W、FまたはCであり、
h9は、L、F、MまたはKである、
を含み、そしてペプチドの長さが9〜50アミノ酸の間である、ミオスタチンに結合可能なペプチド、およびその生理学的に許容されうる塩。
以下の詳細な説明に、より完全に記載される別の態様において、ミオスタチン・アンタゴニストとして有用な結合剤は、ポリマーまたはFcドメインなどの少なくとも1つのビヒクルを含み、そして少なくとも1つのリンカー配列をさらに含むことも可能である。この態様において、本発明の結合剤は、少なくとも1つのミオスタチン結合ペプチドが、少なくとも1つのビヒクルに結合するように構築される。単数または複数のペプチドが直接、またはリンカー配列を介して間接的に、ペプチドのN末端、C末端またはアミノ酸側鎖で、ビヒクルに結合され、それによってペプチボディ(peptibody)を提供する。この態様において、本発明の結合剤は、以下の一般化された構造:
(X1)a-F1-(X2)b、またはそのマルチマー;
[ここでF1はビヒクルであり;そしてX1およびX2は、各々独立に
-(L1)c-P1;
-(L1)c-P1-(L2)d-P2;
-(L1)c-P1-(L2)d-P2-(L3)e-P3;
および-(L1)c-P1-(L2)d-P2-(L3)e-P3-(L4)f-P4;
ここでP1、P2、P3、およびP4は、ミオスタチンに結合可能なペプチドであり;そして
L1、L2、L3、およびL4は、各々リンカーであり;そしてa、b、c、d、eおよびfは、各々独立に0または1である、但しaおよびbの少なくとも1つは1である
から選択される]、
およびその生理学的に許容されうる塩を有する。この一般化された構造を有する結合剤の態様において、ペプチドP1、P2、P3、およびP4は、以下の詳細な説明に記載されるような、本明細書において提供するペプチド配列のいずれか1以上から独立に選択されることが可能である。例えば、典型的な態様において、P1、P2、P3、およびP4は、以下の配列:配列番号633、配列番号352、配列番号353、配列番号354、配列番号355、配列番号356、配列番号455、配列番号456、および配列番号457のいずれかを含む1以上のペプチドから独立に選択される。別の態様において、P、P1、P2、P3、およびP4は、以下の配列:配列番号305〜351、および配列番号357〜454のいずれかを含む1以上のペプチドから独立に選択される。ミオスタチン結合剤のさらなる態様を、以下の発明の詳細な説明に提供する。
本発明は、ミオスタチン結合剤を含むミオスタチン・アンタゴニストを用いて、多様な障害を治療する医薬組成物および方法を提供する。本発明は、性腺機能低下症の影響を治療する必要がある被験体において、こうした影響を治療する方法であって、薬学的に許容されうる担体と混合した少なくとも1つのミオスタチン・アンタゴニストの療法的有効量を該被験体に投与することを含む、前記方法を提供する。1つの態様において、性腺機能低下症はアンドロゲン枯渇療法の結果として生じる。第二の態様において、性腺機能低下症は、性腺機能の加齢に伴う減少から生じる。
ミオスタチン
ミオスタチンは、GDF-8としても知られる増殖因子であり、TGF-βファミリーのメンバーである。ミオスタチンは、骨格筋組織の負の制御因子であることが知られる。ミオスタチンは、不活性プレプロタンパク質として合成され、タンパク質分解的切断によって活性化される(Zimmersら、上記(2002))。前駆体タンパク質が切断されて、NH2末端不活性プロドメイン、および約25kDaのホモ二量体の形をとる成熟活性型のおよそ109アミノ酸のCOOH末端タンパク質が生じる(Zimmersら、上記(2002))。現在、成熟二量体は、プロペプチドに結合した不活性の潜在型複合体として血液中で循環すると考えられている(Zimmersら、上記(2002))。
本明細書において、用語「ミオスタチン・アンタゴニスト」は、「ミオスタチン阻害剤」と交換可能に用いられる。本発明によるミオスタチン・アンタゴニストは、ミオスタチンの少なくとも1つの活性を阻害するかまたは遮断し、あるいはミオスタチンまたはその受容体の発現を遮断する。ミオスタチン活性の阻害または遮断は、例えば、ミオスタチンのその受容体への結合に干渉し、そして/またはミオスタチンのその受容体への結合の結果として生じるシグナル伝達を遮断する、1以上の阻害剤を使用することによって、達成可能である。アンタゴニストには、ミオスタチン自体に結合する物質、またはミオスタチン受容体に結合する物質が含まれる。例えば、ミオスタチン・アンタゴニストには、限定されるわけではないが、フォリスタチン、ミオスタチン・プロドメイン、増殖および分化因子11(GDF-11)プロドメイン、プロドメイン融合タンパク質、ミオスタチンに結合するアンタゴニスト性抗体または抗体断片、アクチビンIIB型受容体に結合するアンタゴニスト性抗体または抗体断片、可溶性アクチビンIIB型受容体、可溶性アクチビンIIB型受容体融合タンパク質、可溶性ミオスタチン類似体(可溶性リガンド)、オリゴヌクレオチド、小分子、ペプチド模倣体、およびミオスタチン結合剤が含まれる。これらを、以下により詳細に記載する。
本明細書において、用語「ミオスタチンに結合可能な」または「ミオスタチンに結合アフィニティーを有する」は、以下の実施例に記載するファージELISAアッセイ、BIAcore(登録商標)またはKinExATMアッセイによって示されるような、ミオスタチンに結合する本明細書記載の結合剤などのミオスタチン・アンタゴニストを指す。
ミオスタチン結合剤
本発明のミオスタチン結合剤は、少なくとも1つのミオスタチン結合ペプチドを含む。1つの態様において、本発明の結合剤は、ポリマーまたはFcドメインなどの少なくとも1つのビヒクルに共有結合した、少なくとも1つのミオスタチン結合ペプチドを含む。ミオスタチン結合ペプチドを少なくとも1つのビヒクルに結合させて、結合剤の生物学的活性を増加させ、そして/またはin vivoでの分解を減少させ、in vivoでの半減期を増加させ、in vivoでの毒性または免疫原性を減少させることによって、療法剤としての結合剤の有効性を増加させることを意図する。結合剤は、ペプチドおよびビヒクルを連結するリンカー配列をさらに含むことも可能である。単数または複数のペプチドが直接、またはリンカー配列を介して間接的に、ペプチドのN末端、C末端またはアミノ酸側鎖で、ビヒクルに結合される。この態様において、本発明の結合剤は、以下の構造:
(X1)a-F1-(X2)b、またはそのマルチマー;
[ここでF1はビヒクルであり;そしてX1およびX2は、各々独立に
-(L1)c-P1;
-(L1)c-P1-(L2)d-P2;
-(L1)c-P1-(L2)d-P2-(L3)e-P3;
および-(L1)c-P1-(L2)d-P2-(L3)e-P3-(L4)f-P4
ここでP1、P2、P3、およびP4は、ミオスタチンに結合可能なペプチドであり;そして
L1、L2、L3、およびL4は、各々リンカーであり;そしてa、b、c、d、eおよびfは、各々独立に0または1である、但しaおよびbの少なくとも1つは1である
から選択される]
を有する。
本明細書において、用語「ペプチド」は、ペプチド結合によって連結される約5〜約90アミノ酸の分子を指す。本発明のペプチドは、好ましくは、長さ約5〜約50アミノ酸の間、より好ましくは、長さ約10〜30アミノ酸の間、そして最も好ましくは、長さ約10〜25アミノ酸の間であり、そしてミオスタチン・タンパク質に結合することが可能である。
本明細書において、用語「ビヒクル」は、本発明の1以上のペプチドに結合することが可能な分子を指す。好ましくは、ビヒクルは、本発明の結合剤に少なくとも1つの望ましい特性を与える。ペプチドは、単独では、腎ろ過、細網内皮系における細胞性クリアランス機構、またはタンパク質分解的分解のいずれかによって、in vivoで除去される可能性がある。ビヒクルへの結合は、結合剤の分解を減少させ、そして/または半減期を増加させ、毒性を減少させ、免疫原性を減少させ、そして/または結合剤の生物学的活性を増加させることによって、結合剤の療法的価値を改善する。
1. ジスルフィド結合形成に関与する部位が除去されている。こうした除去によって、本発明の分子を産生するのに用いる宿主細胞に存在する、他のシステイン含有タンパク質との反応が回避可能である。この目的のため、N末端のシステイン含有セグメントを一部切除してもよいし、あるいはシステイン残基を欠失させるか、または他のアミノ酸(例えばアラニル、セリル)で置換してもよい。システイン残基を除去する場合であっても、一本鎖Fcドメインはなお、非共有的に一緒に保持される二量体Fcドメインを形成することも可能である。
本発明の結合剤は、場合によって、「リンカー」基をさらに含むことも可能である。リンカーは、主に、ペプチドおよびビヒクルの間のスペーサー、または本発明の結合剤の2つのペプチドの間のスペーサーとして働く。1つの態様において、リンカーは、ペプチド結合によってともに連結されたアミノ酸、好ましくはペプチド結合によって連結された1〜20アミノ酸で構成され、アミノ酸は20の天然存在アミノ酸から選択される。これらのアミノ酸の1以上は、当業者に理解されるように、グリコシル化されることも可能である。1つの態様において、1〜20アミノ酸は、グリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミン、およびリジンから選択される。好ましくは、リンカーは、立体的に妨害されない、グリシンおよびアラニンなどのアミノ酸で大部分が構成される。したがって、典型的なリンカーは、ポリグリシン(特に(Gly)5、(Gly)8)、ポリ(Gly-Ala)、およびポリアラニンである。本明細書において、記号表示「g」はグリシン・ホモペプチドリンカーを指す。表IIに示すような「gn」は、N末端の5×glyリンカーを指し、一方、「gc」はC末端の5×glyリンカーを指す。GlyおよびAlaの組み合わせもまた好ましい。本発明の結合剤を構築するのに有用な1つの典型的なリンカー配列は、以下のとおりである:gsgsatggsgstassgsgsatg(配列番号305)。このリンカー配列は、「k」または1k配列と称される。表IIに見られるような記号表示「kc」は、C末端のkリンカーを指し、一方、記号表示「kn」は、N末端のkリンカーを指す。
本明細書記載の結合剤は、ミオスタチンに結合可能な少なくとも1つのペプチドを含む。1つの態様において、ミオスタチン結合ペプチドは、長さ約5〜約50アミノ酸の間であり、別の態様において、長さ約10〜30アミノ酸の間であり、そして別の態様において、長さ約10〜25アミノ酸の間である。1つの態様において、ミオスタチン結合ペプチドは、アミノ酸配列WMCPP(配列番号633)を含む。他の態様において、ミオスタチン結合ペプチドは、アミノ酸配列Ca1a2 Wa3 WMCPP(配列番号352)を含み、ここでa1、a2およびa3は、中性疎水性アミノ酸、中性極性アミノ酸、または塩基性アミノ酸から選択される。別の態様において、ミオスタチン結合ペプチドは、アミノ酸配列Cb1b2 Wb3 WMCPP(配列番号353)、ここでb1は、アミノ酸T、I、またはRのいずれか1つから選択され;b2は、R、S、Qのいずれか1つから選択され;b3は、P、RおよびQのいずれか1つから選択され、そして長さが10〜50アミノ酸の間であるペプチド、およびその生理学的に許容されうる塩を含む。
c1c2c3c4c5c6 Cc7c8 Wc9 WMCPPc10c11c12c13(配列番号354)、式中:
c1は、存在しないか、またはアミノ酸いずれかであり;
c2は、存在しないか、または中性疎水性アミノ酸、中性極性アミノ酸、もしくは酸性アミノ酸であり;
c3は、存在しないか、または中性疎水性アミノ酸、中性極性アミノ酸、もしくは酸性アミノ酸であり;
c4は、存在しないか、またはアミノ酸いずれかであり;
c5は、存在しないか、または中性疎水性アミノ酸、中性極性アミノ酸、もしくは酸性アミノ酸であり;
c6は、存在しないか、または中性疎水性アミノ酸、中性極性アミノ酸、もしくは塩基性アミノ酸であり;
c7は、中性疎水性アミノ酸、中性極性アミノ酸、または塩基性アミノ酸であり;
c8は、中性疎水性アミノ酸、中性極性アミノ酸、または塩基性アミノ酸であり;
c9は、中性疎水性アミノ酸、中性極性アミノ酸、または塩基性アミノ酸であり;そして
c10〜c13は、アミノ酸いずれかであり;
そして長さが20〜50アミノ酸の間であるペプチド、およびその生理学的に許容されうる塩を含む。
d1d2d3d4d5d6 Cd7d8 Wd9 WMCPPd10d11d12d13(配列番号355)、式中
d1は、存在しないか、またはアミノ酸いずれかであり;
d2は、存在しないか、または中性疎水性アミノ酸、中性極性アミノ酸、もしくは酸性アミノ酸であり;
d3は、存在しないか、または中性疎水性アミノ酸、中性極性アミノ酸、もしくは酸性アミノ酸であり;
d4は、存在しないか、またはアミノ酸いずれかであり;
d5は、存在しないか、または中性疎水性アミノ酸、中性極性アミノ酸、もしくは酸性アミノ酸であり;
d6は、存在しないか、または中性疎水性アミノ酸、中性極性アミノ酸、もしくは塩基性アミノ酸であり;
d7は、アミノ酸T、I、またはRのいずれか1つから選択され;
d8は、R、S、Qのいずれか1つから選択され;
d9は、P、RおよびQのいずれか1つから選択され;そして
d10〜d13は、アミノ酸いずれかから選択され;
そして長さが20〜50アミノ酸の間であるペプチド、およびその生理学的に許容されうる塩を含む。
(1)配列WYe1e2 Ye3 G(配列番号356)
ここでe1は、P、SまたはYであり、
e2は、CまたはQであり、そして
e3は、GまたはHである、
を含み、ペプチドの長さが7〜50アミノ酸の間である、ミオスタチンに結合可能なペプチド、およびその生理学的に許容されうる塩;
(2)配列f1 EMLf2 SLf3f4 LL(配列番号455)、
ここでf1は、MまたはIであり、
f2は、アミノ酸いずれかであり、
f3は、LまたはFであり、
f4は、E、QまたはDである、
を含み;そしてペプチドの長さが7〜50アミノ酸の間である、ミオスタチンに結合可能なペプチド、およびその生理学的に許容されうる塩;
(3)配列Lg1g2 LLg3g4 L(配列番号456)、ここで
g1は、Q、DまたはEであり、
g2は、S、Q、DまたはEであり、
g3は、アミノ酸いずれかであり、
g4は、L、W、F、またはYである、
を含み、そしてペプチドの長さが8〜50アミノ酸の間である、ミオスタチンに結合可能なペプチド、およびその生理学的に許容されうる塩;
(4)配列h1h2h3h4h5h6h7h8h9(配列番号457)、ここで
h1は、RまたはDであり、
h2は、アミノ酸いずれかであり、
h3は、A、T、SまたはQであり、
h4は、LまたはMであり、
h5は、LまたはSであり、
h6は、アミノ酸いずれかであり、
h7は、FまたはEであり、
h8は、W、FまたはCであり、
h9は、L、F、MまたはKである、
を含み、そしてペプチドの長さが9〜50アミノ酸の間である、ミオスタチンに結合可能なペプチド、およびその生理学的に許容されうる塩。
1つの態様において、本発明の結合剤は、以下の一般化された構造:
(X1)a-F1-(X2)b、またはそのマルチマー;
[ここでF1はビヒクルであり;そしてX1およびX2は、各々独立に
-(L1)c-P1;
-(L1)c-P1-(L2)d-P2;
-(L1)c-P1-(L2)d-P2-(L3)e-P3;
および-(L1)c-P1-(L2)d-P2-(L3)e-P3-(L4)f-P4;
ここでP1、P2、P3、およびP4は、ミオスタチンに結合可能なペプチドであり;そして
L1、L2、L3、およびL4は、各々リンカーであり;そしてa、b、c、d、eおよびfは、各々独立に0または1である、但しaおよびbの少なくとも1つは1である
から選択される]
を有する。
本明細書記載の結合剤は、本明細書に記載するペプチドおよびペプチボディの変異体および誘導体もまた含む。本発明のペプチドおよびペプチボディはどちらも、アミノ酸配列に関して記載することも可能であるため、用語「変異体」および「誘導体」は、ペプチド単独、またはペプチボディの構成要素としてのペプチドに適用して述べることも可能である。本明細書において、用語「ペプチド変異体」は、元来のアミノ酸配列に1以上のアミノ酸残基が挿入されたか、元来のアミノ酸から1以上のアミノ酸残基が欠失されたか、または元来のアミノ酸に1以上のアミノ酸が置換され、そしてミオスタチンに結合し、そしてその活性を修飾する能力を保持するペプチドまたはペプチボディを指す。本明細書において、「変異体」の定義には、ペプチドまたはペプチボディの断片が含まれる。
1)中性疎水性:Met、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Trp、Met、Phe;
2)中性極性:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln、Tyr、Gly;
3)酸性:Asp、Glu;
4)塩基性:His、Lys、Arg;
5)鎖配向に影響を及ぼす残基:Gly、Pro;および
6)芳香族:Trp、Tyr、Phe。
1. 誘導体またはそのある部分が環状である。例えば、ペプチド部分を修飾して2以上のCys残基(例えばリンカー中)を含有させることも可能であり、これをジスルフィド結合形成によって環状化することも可能である。
リジニル残基およびアミノ末端残基を、リジニル残基の電荷を逆転させるコハク酸または他のカルボン酸無水物と反応させてもよい。アルファ-アミノ含有残基を誘導体化する他の適切な試薬には、メチルピコリンイミデートなどのイミドエステル;ピリドキサール・リン酸;ピリドキサール;クロロボロハイドライド(chloroborohydride);トリニトロベンゼンスルホン酸;O-メチルイソ尿素;2,4-ペンタンジオン;およびグリオキシレートとのトランスアミナーゼ触媒反応が含まれる。
当該技術分野に知られる非常に多様な技術を用いて、本発明のペプチドを生成してもよい。例えば、慣用的技術にしたがって、溶液中または固体支持体上で、こうしたペプチドを合成してもよい。多様な自動化合成装置が商業的に入手可能であり、そして既知のプロトコルにしたがって使用可能である。例えば、各々本明細書に参考文献として援用される、StewartおよびYoung(上記);Tamら, J Am Chem Soc, 105:6442(1983);Merrifield, Science 232:341-347(1986);BaranyおよびMerrifield, The Peptides, GrossおよびMeienhofer監修, Academic Press, New York, 1-284;Baranyら, Int J Pep Protein Res, 30:705-739(1987);および米国特許第5,424,398号を参照されたい。
いくつかの場合、本発明のペプチドおよび/またはペプチボディなどの結合剤は、生物学的に活性になるために、「再フォールディング」され、そして酸化されて適切な三次構造になり、そしてジスルフィド連結が生成される必要がある可能性もある。当該技術分野に周知の多くの方法を用いて、再フォールディングを達成してもよい。こうした方法には、例えば、カオトロピック剤の存在下で、通常7より高いpHに、可溶化したポリペプチド剤を曝露することが含まれる。カオトロープの選択は、封入体可溶化に用いる選択と類似であるが、典型的には、カオトロープは、より低い濃度で用いられる。典型的なカオトロピック剤はグアニジンおよび尿素である。大部分の場合、再フォールディング/酸化溶液はまた、還元剤に加えて特定の比でその酸化型を含有して特定の酸化還元電位を生じ、ジスルフィド・シャフリングを可能にして、システイン架橋の形成を生じる。いくつかの通常用いられるレドックス対には、システイン/シスタミン、グルタチオン/ジチオビスGSH、塩化第二銅、ジチオスレイトールDTT/ジチアンDTT、および2-メルカプトエタノール(bME)/ジチオ-bMEが含まれる。多くの場合、共溶媒(co-solvent)を用いて、再フォールディングの効率を増加させることも可能である。一般的に用いられる共溶媒には、グリセロール、多様な分子量のポリエチレングリコール、およびアルギニンが含まれる。
ミオスタチンに結合し、そしてミオスタチン活性を阻害するかまたは遮断する能力に関して、本明細書記載の結合剤を含むアンタゴニストを試験する。いかなる数のアッセイまたは動物試験を用いて、結合剤がミオスタチン活性を阻害するかまたは遮断する能力を決定してもよい。本発明のペプチドおよびペプチボディを性質決定するのに用いられるいくつかのアッセイを、以下の実施例に記載する。1つのアッセイは、C2C12 pMARE-lucアッセイであり、該アッセイは、ミオスタチン/アクチビン応答要素(MARE)を含有するルシフェラーゼ・レポーターベクターでトランスフェクションした、ミオスタチン応答性細胞株(C2C12筋芽細胞)を利用する。一連のペプチボディ希釈物をミオスタチンとプレインキュベーションし、そして次いで細胞をインキュベーション混合物に曝露することによって、典型的なペプチボディをアッセイする。生じたルシフェラーゼ活性を測定し、そして一連のペプチボディ希釈物から滴定曲線を生成する。次いで、IC50(ルシフェラーゼ活性によって測定されるようなミオスタチン活性の50%阻害を達成するペプチボディの濃度)を決定した。以下に記載する第二のアッセイは、ミオスタチン結合剤およびミオスタチンとその受容体に結合可能な抗体などの他のアンタゴニストの動力学パラメーターka(会合速度定数)、kd(解離速度定数)、およびKD(解離平衡定数)を決定するためのBIAcore(登録商標)アッセイである。解離平衡定数(KD、nMで表される)がより低いことは、ミオスタチンに対するペプチボディのアフィニティーがより高いことを示した。さらなるアッセイには、ペプチボディなどの結合剤が中和性である(受容体へのミオスタチンの結合を妨げる)か、または非中和性である(受容体へのミオスタチンの結合を妨げない)かを決定する、遮断アッセイ;本発明の結合剤が、ミオスタチンに選択的に結合して、そして特定の他のTGF-βファミリーメンバーに結合しないかどうかを決定する、選択性アッセイ;およびやはりKDを決定し、そしていくつかの状況では、より感受性であると見なされる、KinEx ATMアッセイまたは溶液に基づく平衡アッセイが含まれる。これらのアッセイを実施例3に記載する。
本発明は、筋肉関連障害および他の障害の治療が必要な被験体に、単数または複数のミオスタチン・アンタゴニストの療法量を投与することによる、こうした障害のための方法および治療を提供する。また、ミオスタチン・アンタゴニストを予防的に投与して、将来の筋萎縮および関連障害に対する治療などを必要とする被験体において、こうした障害から保護してもよい。本明細書において、用語「被験体」は、ミオスタチン関連障害のための治療が必要な、哺乳動物を含み、そしてヒト被験体を含む、いかなる動物も指す。1つの態様において、ミオスタチン・アンタゴニストは、本明細書記載の結合剤である。
本明細書記載の結合剤を含むミオスタチン・アンタゴニストを用いて、炎症または関節リウマチを含む他の免疫反応による悪液質を治療してもよい。関節リウマチ(RA)は、関節炎症、進行性軟骨/骨糜爛、およびリウマチ性悪液質を導く、一般的な全身性自己免疫疾患である。リウマチ性悪液質は、関節リウマチ患者において起こりうる、体の細胞量、特に筋量の損失として記載される(Rallら, Rheumatology 43, 1219-1223(2004)、Roubenoffら, J Clin Invest 93, 2379-2386(1994))。コラーゲン誘導性関節炎(CIA)は、一般的に用いられるRAのマウス・モデルである。実施例12は、典型的なペプチボディでのCIAマウスの処置を記載し、該ペプチボディは、図7に示すように、対照に見られる悪液質による迅速な体重損失を防止した。この例は、本明細書記載のペプチボディを含むミオスタチン・アンタゴニストが、リウマチ性悪液質を治療するのに有用であることを示す。さらに、ミオスタチン・アンタゴニストはまた、LPS(大腸菌リポ多糖)で処置した動物におけるTNF-α(腫瘍壊死因子-α)のレベルを減少させることも示された。この実験を以下の実施例14に記載する。これは、ミオスタチン・アンタゴニストがまた、RAなどの免疫障害の炎症構成要素を治療するのにも有用であることを示す。
本発明の結合剤を含むミオスタチン・アンタゴニストを、成長ホルモン(GH)、インスリン増殖因子-1、成長ホルモン分泌促進因子、またはアンドロゲンによって現在治療されている障害の代替治療法として、さらに用いてもよい。GHまたは成長ホルモン分泌促進因子での治療は、以下に記載するプラダー・ウィリー病などの成長および筋関連障害の古典的なタンパク質同化性の治療である。しかし、GH治療は、しばしば、負の影響を有する可能性がある。ミオスタチン・アンタゴニストは、この治療の代替療法として有用であり、GH関連療法の危険な副作用を伴わずに、より選択的な筋反応を生じる。ミオスタチン・アンタゴニストはまた、GH抵抗性集団、またはGHに抵抗性になった老齢個体を治療するのにも有用である。
本発明の結合剤を含むミオスタチン・アンタゴニストを用いて、性腺機能低下症の結果を治療する必要がある被験体において、これを治療してもよい。本明細書において、用語「性腺機能低下症」は、生殖器の不全または性腺ホルモン分泌の減少から生じる、男性および女性両方における不十分なまたは減少した性腺機能を指す。本明細書において、性腺機能低下症には、化学的または外科的去勢(精巣摘出術、あるいは一方または両方の精巣の喪失とも称される)の結果、および加齢による腺機能低下症が含まれる。化学的または外科的去勢を通じたアンドロゲン枯渇療法は、前立腺癌、卵巣癌、乳癌、ならびに子宮内膜症などの他の生殖器関連癌、ならびに他の障害を治療するために用いられる。性腺機能低下症は、体重減少、特に、長期に渡る除脂肪体重減少および脂肪量増加によるもの、ならびに筋力減少を生じうる。ミオスタチン・アンタゴニストでの精巣摘出マウスの処置を以下の実施例13に記載する。ミオスタチン・ペプチボディ・アンタゴニストで処置した精巣摘出動物は、Fcビヒクルで処置した動物に比較した際、除脂肪体重損失の減弱または逆転を示す。これは、ミオスタチン・アンタゴニストが、アンドロゲン枯渇療法に供された患者を含めて、性腺機能低下症の影響を治療するのに有用であることを示す。ミオスタチン・アンタゴニストはまた、性腺機能低下症を患う被験体において、脂肪量の増加も防止しうる。
さらに、本発明のミオスタチン結合剤は、多くののアッセイにおいて、ミオスタチンを検出し、そして定量するのに有用である。これらのアッセイを以下により詳細に記載する。
結合アッセイは、捕捉されたミオスタチンの量を直接測定する、非競合型であることも可能である。例えば、1つの好ましい「サンドイッチ」アッセイにおいて、結合剤を直接固体支持体に結合させて、固定することも可能である。次いで、これらの固定された結合剤を、試験試料中に存在するミオスタチンに結合させる。次いで、固定されたミオスタチンを、ミオスタチンに対する標識抗体などの標識剤と結合させ、この標識剤を検出することも可能である。別の好ましい「サンドイッチ」アッセイにおいて、ビオチンなどの検出可能部分を含有する、結合剤に特異的な第二の物質を添加し、これにストレプトアビジンなどの第三の標識分子が特異的に結合することも可能である(本明細書に参考文献として援用される、HarlowおよびLane, Antibodies, A Laboratory Manual, 第14章, Cold Spring Harbor Laboratory, ニューヨーク(1988)を参照されたい)。
結合アッセイは競合型であることも可能である。試料中に存在するミオスタチンにより、結合剤から置換されたかまたは競合して引き離されたミオスタチンの量を測定することによって、試料中に存在するミオスタチンの量を間接的に測定する。1つの好ましい競合的結合アッセイにおいて、通常、標識された既知の量のミオスタチンを試料に添加し、そして次いで試料を結合剤と接触させる。結合剤に結合する標識ミオスタチンの量は、試料に存在するミオスタチンの濃度に反比例する(例えば、HarlowおよびLane, Antibodies, A Laboratory Manual, 第14章, pp.579-583, 上記に見られるプロトコルにしたがう)。
本発明はまた、試料中のミオスタチンの存在を検出するかまたは定量するウェスタンブロット法も提供する。該技術は、一般的に、分子量に基づいて、ゲル電気泳動によって、試料タンパク質を分離し、そして該タンパク質を、ニトロセルロースフィルター、ナイロンフィルター、または誘導体化ナイロンフィルターなどの適切な固体支持体に移すことを含む。ミオスタチンに結合する結合剤またはその断片と試料をインキュベーションし、そして生じた複合体を検出する。これらの結合剤を直接標識することも可能であるし、あるいは結合剤に特異的に結合する標識抗体を用いて続いて検出することも可能である。
本発明の結合剤またはその断片は、ミオスタチン量の増加によって特徴付けられる状態または疾患の診断に有用である可能性もある。高レベルのミオスタチンに関する診断アッセイには、ヒト体液、細胞抽出物または特定の組織抽出物において、ミオスタチンを検出する結合剤および標識を利用した方法が含まれる。例えば、個体において、長期に渡り、ミオスタチンの血清レベルを測定して、例えばYarasheskiら、上記に記載されるような、加齢または不活動と関連する筋萎縮の開始を決定することも可能である。ミオスタチンレベルの増加は、年齢が増加した男性群および女性群において、平均筋量および脂肪不含量の減少と相関することが示された(Yarasheskiら、上記)。本発明の結合剤は、例えば、長期に渡り、所定の個体のミオスタチンレベルの増加または減少を監視するのに有用である可能性もある。こうしたアッセイにおいて、修飾を伴い、または伴わずに、結合剤を用いることも可能である。好ましい診断アッセイにおいて、結合剤は、例えば標識またはレポーター分子を結合させることによって、標識されるであろう。非常に多様な標識およびレポーター分子が知られ、これらのいくつかは、すでに本明細書に記載されている。特に、本発明はヒト疾患の診断に有用である。
本発明はまた、ターゲットとする疾患状態を治療するための、本明細書に記載する1以上のミオスタチン・アンタゴニストの医薬組成物も提供する。こうした組成物は、1以上のミオスタチン・アンタゴニストの療法的または予防的有効量を、薬学的に許容されうる物質と組み合わせて含む。医薬組成物は、薬学的に許容されうる物質と混合された、ミオスタチンを部分的または完全に阻害するアンタゴニストを含む。典型的には、アンタゴニストは、動物に投与するため、十分に精製されているであろう。
実施例1
ミオスタチン結合ペプチドの同定
3つの繊維状ファージライブラリー、TN8-IX(5×109独立形質転換体)、TN12-I(1.4×109独立形質転換体)、および直鎖(2.3×109独立形質転換体)(Dyax Corp.)を用いて、ミオスタチン結合ファージに関して選択した。ミオスタチンでコーティングした表面上で各ライブラリーをインキュベーションし、そして異なるパニング条件に供した:非特異的溶出、および組換えヒト・アクチビン受容体IIB/Fcキメラ(R&D Systems, Inc.、ミネソタ州ミネアポリス)を用いた特異的溶出、または以下に記載するようなミオスタチン・プロペプチド溶出。3つのライブラリーすべてに関して、第一の選択周期では、非特異的方式でファージを溶出させ、一方、第二および第三の選択周期では、受容体およびプロミオスタチンを用いた。以下に記載するように選択法を行った。
以下のように、大腸菌K-12株2596(ATCC#202174)において、ミオスタチン・タンパク質を組換え的に産生した。公開国際特許出願WO 00/24782に記載される方法にしたがって、発現ベクターpCFM1656(ATCC番号69576)および米国特許第4,710,473号に記載される発現ベクター系に由来するpAMG21発現ベクター(ATCC番号98113)に、ヒト・プロミオスタチン分子をコードするポリヌクレオチドをクローニングした。プロミオスタチンをコードするポリヌクレオチドを哺乳動物発現ベクターから得た。標準的PCR法、ならびにNdeIおよびBamHIの制限酵素部位を導入する以下のPCRプライマーを用いて、コード領域を増幅した。
0.1M炭酸ナトリウム緩衝液(pH9.6)1ml中、ミオスタチン・タンパク質8μgの濃度で、5ml ImmunoTM試験管(NUNC)上にミオスタチンを固定した。ミオスタチン・コーティングImmunoTM試験管を、軌道振盪(orbital shaking)を伴って、室温で1時間インキュベーションした。次いで、5mlの2%ミルク-PBSを添加し、そして回転させながら室温で1時間インキュベーションすることによって、ミオスタチン・コーティングImmunoTM試験管をブロッキングした。次いで、生じたミオスタチン・コーティングImmunoTM試験管をPBSで3回洗浄した後、選択法に供した。陰性選択のため、さらなるImmunoTM試験管もまた、調製した(ミオスタチンなし)。ミオスタチン・タンパク質の代わりに、1mlの2% BSA-PBSでImmunoTM試験管をコーティングしたことを除いて、各パニング条件について、5〜10のImmunoTM試験管を上記方法に供した。
各パニング条件について、TN8-IXおよびTN12-Iライブラリー(TN8-IXは5×1011pfu、そしてTN12-Iは1.4×1011pfu)では約100のランダムライブラリー同等物、そして直鎖ライブラリー(2.3×1010pfu)では約10のランダムライブラリー同等物を、ライブラリーストックから一定量を分取し、そしてPBST(0.05%Tween-20を含むPBS)で1mlに希釈した。陰性選択用に調製したImmunoTM試験管に、希釈したライブラリーストック1mlを添加し、そして軌道振盪を伴い、室温で10分間インキュベーションした。ファージ上清を抜き取って、そして別の陰性選択工程のため、第二のImmunoTM試験管に添加した。この方式で、5〜10の陰性選択工程を行った。
上記の最後の陰性選択工程後、調製したミオスタチン・コーティングImmunoTM試験管にファージ上清を添加した。軌道振盪を伴い、ImmunoTM試験管を室温で1時間インキュベーションして、特異的ファージがミオスタチンに結合するのを可能にした。3つのライブラリー(TN8-IX、TN12-I、および直鎖ライブラリー)すべてを用いた、3周期の選択に関して、上清を廃棄した後、2%ミルク-PBSで約15回、PBSTで10回、そしてPBSで2回、ImmunoTM試験管を洗浄したが、TN8-IXおよびTN12-Iライブラリーの二回目の選択周期に関しては、2%ミルク-PBSで約14回、2%BSA-PBSで2回、PBSTで10回、そしてPBSで1回、ImmunoTM試験管を洗浄したことが例外であった。
最後の洗浄工程後、100mMトリエチルアミン溶液(Sigma、ミズーリ州セントルイス)1mlを添加して、軌道振盪を伴い、10分間インキュベーションすることによって、結合したファージをImmunoTM試験管から溶出させた。次いで、0.5mlの1M Tris-HCl(pH7.5)を用いて、ファージ含有溶液のpHを中和した。
第2周期および第3周期で、最後の洗浄工程後、1μMの受容体タンパク質(組換えヒト・アクチビン受容体IIB/Fcキメラ、R&D Systems, Inc.、ミネソタ州ミネアポリス)1mlを添加し、各条件に関して1時間インキュベーションすることによって、結合したファージをImmunoTM試験管から溶出させた。
第2周期および第3周期で、最後の洗浄工程後、1μMのプロペプチド・タンパク質(上述のように作製)1mlを添加し、各条件に関して1時間インキュベーションすることによって、結合したファージをImmunoTM試験管から溶出させた。
12.5μg/mlテトラサイクリンを含有するLB培地中で、新鮮な大腸菌(XL-1 Blue MRF')培養物をOD600=0.5まで増殖させた。各パニング条件について、この培養物20mlを氷上で冷却し、そして遠心分離した。細菌ペレットを、1mlのminA塩溶液に再懸濁した。
第二の周期において、第一の周期由来の増幅したファージ(1011pfu)を投入ファージとして用いて、選択工程および増幅工程を行った。次に、第二の周期由来の増幅したファージ(1011pfu)を投入ファージとして用いて、第三の周期の選択および増幅を行った。第三の周期の溶出工程後、溶出したファージのわずかな割合を上述のプラーク形成アッセイにおけるように蒔いた。個々のプラークを摘み取り、そして各ウェルに100μlのTE緩衝液を含有する96ウェルマイクロタイタープレートに蒔いた。これらのマスタープレートを4℃で一晩インキュベーションして、ファージがTE緩衝液に溶出するのを可能にした。
ファージELISA
ファージクローンをファージELISAに供して、そして次いで配列決定した。以下に論じるように配列をランク付けした。
各ファージクローンに関して、PCR法によって配列決定テンプレートを調製した。以下のオリゴヌクレオチド対を用いて、500ヌクレオチド断片を増幅した:プライマー#1:5'-CGGCGCAACTATCGGTATCAAGCTG-3'(配列番号294)およびプライマー#2:5'-CATGTACCGTAACACTGAGTTTCGTC-3'(配列番号295)。各クローンに関して、以下の混合物を調製した。
ヌクレオチド配列から翻訳したペプチド配列をELISAデータと相関させた。ミオスタチン・コーティングウェル中で高い化学発光単位を、そして2%BSAコーティングウェル中で低い化学発光単位を示したクローンを同定した。複数回生じた配列を同定した。これらの基準に基づいて選択した候補配列を、ペプチボディとしてさらなる分析に供した。およそ1200の個々のクローンを分析した。本発明のペプチボディを生成するため、これらのうち、およそ132のペプチドを選択した。これらを以下の表Iに示す。配列番号1〜129を有するペプチドを用いて、同一名のペプチボディを生成した。表Iに示す配列番号130〜141を有するペプチドは、リンカー配列によって付着された、配列番号1〜132のペプチドの2以上を含む。また、配列番号130〜141を、同一名のペプチボディを生成するのにも用いた。
ペプチボディの生成
ペプチド-Fc融合タンパク質をコードするDNAの構築
ミオスタチンに結合可能なペプチドを、単独でまたは互いに組み合わせて用いて、ペプチドがヒトIgG1のFcドメインに融合した、融合タンパク質を構築した。各ペプチボディのFc部分のアミノ酸配列は以下のとおりである(アミノ末端からカルボキシル末端):
すべて本明細書に参考文献として援用される、公開国際特許出願WO 00/24782に記載される方法にしたがって、pCFM1656(ATCC番号69576)および米国特許第4,710,473号に記載される発現ベクター系から、発現プラスミドpAMG21(ATCC番号98113)を得る。
テンプレートとしてpAMG21 Fc_Gly5_Tpoベクターを用いて、Fc N末端ベクターを構築した。5'PCRプライマー(以下)を設計して、pAMG Tpo Gly5のTpoペプチド配列を除去し、そしてApaLIおよびXhoI部位を含有するポリリンカーと交換した。このベクターをテンプレートとして用い、以下の5'プライマーおよび普遍的3'プライマーを用いて、Expand LongポリメラーゼでPCRを行った。
テンプレートとしてpAMG21 Fc_Gly5_Tpoベクターを用いて、Fc C末端ベクターを構築した。3'PCRプライマーを設計して、Tpoペプチド配列を除去し、そしてApaLIおよびXhoI部位を含有するポリリンカーと交換した。普遍的5'プライマーおよび3'プライマーを用いて、Expand LongポリメラーゼでPCRを行った。
Terrificブロス培地(前述のSambrookらの参考文献に引用される、TartofおよびHobbs, “Improved media for growing plasmid and cosmid clones”, Bethesda Research Labs Focus, 第9巻, 12ページ, 1987を参照されたい)中、37℃で、大腸菌株2596中の各pAMG21-Fc融合構築物の培養物を増殖させた。合成自己誘導剤(autoinducer)、N-(3-オキソヘキサノイル)-DL-ホモセリン・ラクトンを、1ミリリットルあたり20ナノグラム(ng/ml)の最終濃度になるように、培地に添加した後、luxPRプロモーターからの遺伝子産物発現の誘導が達成された。培養物を37℃でさらに6時間インキュベーションした。次いで、封入体の存在に関して、細菌培養物を顕微鏡によって検査し、そして遠心分離によって収集した。誘導した培養物中に、屈折(refractile)封入体が観察されたことから、大腸菌の不溶性分画でFc融合体が産生される可能性が最も高いことが示された。10%β-メルカプトエタノールを含有するLaemmli試料緩衝液に直接再懸濁することによって細胞ペレットを溶解し、そして次いで、SDS-PAGEによって分析した。大部分の場合、SDS-PAGEゲル上に、適切な分子量の強いクマシー染色バンドが観察された。
高圧ホモジナイズ(15,000PSIで3パス)によって、水中(体積あたり1/10体積)で細胞を破壊し、そして遠心分離(J-6B中4000RPMで30分間)によって封入体を採取した。6Mグアニジン、50mM Tris、8mM DTT、pH8.0中、1/10の比で、周囲温度で1時間、封入体を可溶化した。可溶化した混合物を4M尿素、20%グリセロール、50mM Tris、160mMアルギニン、3mMシステイン、1mMシスタミン、pH8.5に25倍に希釈した。混合物を低温中で一晩インキュベーションした。次いで、10mM Tris pH8.5、50mM NaCl、1.5M尿素に対して、混合物を透析した。一晩透析した後、透析物のpHを酢酸でpH5に調整した。遠心分離によって沈殿物を除去し、そして10mM NaAc、50mM NaCl、pH5で平衡化したSP-Sepharose Fast Flowカラムに、上清を4℃で装填した。装填後、カラムを10mM NaAc、50mM NaCl、pH5.2で洗浄してベースラインにした。20カラム体積の、酢酸緩衝液中の50mM〜500mMのNaCl勾配で、カラムを展開した。あるいは、ベースラインまで洗浄した後、5カラム体積の10mMリン酸ナトリウムpH7.0でカラムを洗浄し、そして15カラム体積の、リン酸緩衝液中の0〜400mMのNaCl勾配で、カラムを展開した。カラム分画をSDS-PAGEによって分析した。二量体ペプチボディを含有する分画をプールした。ゲルろ過によってもまた分画を分析し、凝集物が存在するかどうかを決定した。
したがって、表IIの第一のペプチボディの構造は、以下のような、C配置および(gly)5リンカーを持つTN8-Con1である:M-Fc-GGGGG-KDKCKMWHWMCKPP(配列番号303)。このペプチボディをコードする典型的なポリヌクレオチドは:
in vitroアッセイ
C2C12細胞に基づくミオスタチン活性アッセイ
本アッセイは、ミオスタチンの受容体への結合を阻害する度合いを測定することによって試験される、阻害剤のミオスタチン中和能を示す。
センサーチップCM5、およびランニング緩衝液として、0.005パーセントのP20界面活性剤(Biacore, Inc.)を用いて、BIAcore(登録商標)3000(Biacore, Inc.、ニュージャージー州ピスカタウェイ)装置上で、各候補ミオスタチン・ペプチボディのアフィニティー分析を行った。製造者が示唆するプロトコルにしたがって、アミン・カップリングキット(Biacore, Inc.)を用い、一級アミン基を介して、研究用品質のCM5センサーチップ(Biacore, Inc.)に、組換え成熟ミオスタチン・タンパク質を固定した。
固定化ActRIIB/Fc(R&D Systems、ミネソタ州ミネアポリス)およびミオスタチンを用いて、ペプチボディの存在下および非存在下、BIAcore(登録商標)アッセイ系で、遮断アッセイを行った。アッセイを用いて、非中和(ActRIIB/Fcへのミオスタチン結合を妨げないもの)または中和(ActRIIB/Fcへのミオスタチン結合を妨げるもの)として、ペプチボディを分類した。いかなるペプチボディも存在しない、ベースラインのミオスタチン-ActRIIB/Fc結合をまず決定した。
精製ペプチボディをBIAcoreチップ上に固定して、第二のペプチボディを注入する前に、ミオスタチンを捕捉し、そして捕捉されたミオスタチンに結合した二次ペプチボディの量を決定した。別個のエピトープを持つペプチボディのみが、捕捉されたミオスタチンに結合し、したがって類似のまたは別個のエピトープ結合特性を持つペプチボディの結合が可能になる。例えば、ペプチボディTN8-19およびL23が、ミオスタチン上の異なるエピトープに結合することが示された。
BIAcore(登録商標)技術を用いて、これらのアッセイを行って、他のTGFβファミリーメンバーへのペプチボディの結合の選択性を決定した。製造者が示唆するプロトコルにしたがって、ActRIIB/Fc、TGFβRII/FcおよびBMPR-1A/Fc(すべてR&D Systems、ミネソタ州ミネアポリスから得られる)を研究用品質のセンサーチップに共有結合的にカップリングした。BIAcoreアッセイは屈折率の変化を検出するため、いかなるペプチボディも存在しない対照表面上の注入で検出された反応に比較した、固定化受容体表面上での注入で検出された反応の間の相違は、それぞれ、受容体へのアクチビンA、TGFβ1、TGFβ3、およびBMP4の実際の結合に相当する。ペプチボディおよびTGFβ分子をプレインキュベーションすると、結合反応の変化(増加または減少)は、TGFβファミリー分子へのペプチボディ結合を示す。本発明のペプチボディはすべて、ミオスタチンに結合するが、アクチビンA、TGFβ1、TGFβ3、またはBMP4に結合しない。
KinEx ATM技術(Sapidyne Instruments, Inc.)を用いた、溶液に基づく平衡結合アッセイを用いて、ペプチボディ分子へのミオスタチン結合の解離平衡(KD)を測定した。この溶液に基づくアッセイは、いくつかの例で、BIAcoreアッセイよりもより感受性であると見なされる。Reacti-GelTM6Xを約50μg/mlのミオスタチンで一晩プレコーティングし、そして次いで、BSAでブロッキングした。30pMおよび100pMのペプチボディ試料を、試料緩衝液中、多様な濃度(0.5pM〜5nM)のミオスタチンと室温で8時間インキュベーションした後、ミオスタチン・コーティングビーズの間を流動させた。スーパーブロック中の1mg/mlの蛍光(Cy5)標識したヤギ抗ヒトFc抗体によって、ビーズに結合したペプチボディの量を定量した。結合シグナルは、所定のミオスタチン濃度で平衡状態の未結合ペプチボディの濃度に比例する。KinEX ATMソフトウェア(Sapidyne Instruments, Inc.)に提供される、二重曲線一部位均質結合モデル(dual-curve one-site homogeneous binding model)を用いた競合曲線の非線形回帰から、KDを得た。
ミオスタチン阻害剤の比較
3つの典型的な第一周期ペプチボディが結合し(KD)そして阻害する(IC50)能力を、可溶性受容体融合タンパク質actRIIB/Fc(R&D Systems, Inc.、ミネソタ州ミネアポリス)に関して得たKD値およびIC50値と比較した。実施例3に記載するpMARE luc細胞に基づくアッセイを用いて、IC50値を決定し、そして実施例3に記載するBiacore(登録商標)アッセイを用いて、KD値を決定した。
実施例5
ペプチドおよびペプチボディがミオスタチンを阻害する能力の比較
次のペプチド配列:QGHCTRWPWMCPPY(TN8-19)(配列番号33)を用い、上記実施例2に記載する方法にしたがって、対応するペプチボディTN8-19(pb)を構築した。上記実施例3に記載するC2C12に基づくアッセイを用いて、ミオスタチン阻害活性に関して、単独のペプチドおよびペプチボディを両方スクリーニングした。図1から、ペプチボディのIC50(ミオスタチンを50%阻害するのに有効な濃度)が、ペプチドのものより有意に低く、そしてしたがって、ペプチボディの形態を取ることによって、ペプチドがミオスタチン活性を阻害する能力が、実質的に改善されたことがわかる。
アフィニティー成熟ペプチドおよびペプチボディの生成
ペプチボディ生成に用いた第一周期ペプチドのいくつかを、アフィニティー成熟用に選択した。選択したペプチドには、次のものが含まれた:システイン拘束TN8-19、QGHCTRWPWMCPPY(配列番号33)、および直鎖ペプチド、直鎖-2 MEMLDSLFELLKDMVPISKA(配列番号104);直鎖-15 HHGWNYLRKGSAPQWFEAWV(配列番号117);直鎖-17 RATLLKDFWQLVEGYGDN(配列番号119);直鎖-20 YREMSMLEGLLDVLERLQHY(配列番号122)、直鎖-21 HNSSQMLLSELIMLVGSMMQ(配列番号123)、直鎖-24 EFFHWLHNHRSEVNHWLDMN(配列番号126)。コンセンサス配列に基づいて、「コア」アミノ酸(コンセンサス配列から決定する)を一定に維持するかまたはその発生頻度を偏向させた、定方向二次ファージディスプレイ・ライブラリーを生成した。あるいは、個々のペプチド配列を用いて、偏向定方向ファージディスプレイ・ライブラリーを生成することも可能である。よりストリンジェントな条件下での、こうしたライブラリーのパニングによって、ミオスタチンへの結合が増進した、ミオスタチンへの選択的結合が増進した、またはさらなる何らかの望ましい特性を持つ、ペプチドを生じることも可能である。
コア配列が91%「ドーピング」された、すなわち各溶液が、相当する塩基(A、G、C、またはT)91%、および他の3ヌクレオチド各々3%である、DNA合成装置中、オリゴヌクレオチドを合成した。TN8-19ファミリーでは、例えば、二次ファージライブラリーの構築に用いた91%ドーピングオリゴは、以下のとおりであった:
第1周期パニング:
投入ファージ数:1012〜1013cfuのファージミド
選択法:Nunc Immuno試験管選択
陰性選択:2%BSAでコーティングしたNunc Immuno試験管を用いて各10分間2回
パニングコーティング:1mlの0.1M炭酸ナトリウム緩衝液(pH9.6)中の1μgのミオスタチン・タンパク質でコーティング
結合時間:3時間
洗浄条件:6×2%ミルク-PBST;6×PBST;2×PBS
溶出条件:100mM TEA溶出
第2周期パニング:
投入ファージ数:1011cfuのファージミド
選択法:Nunc Immuno試験管選択
陰性選択:2%BSAでコーティングしたNunc Immuno試験管を用いて各30分間2回
パニングコーティング:1mlの0.1M炭酸ナトリウム緩衝液(pH9.6)中の1μgのミオスタチン・タンパク質でコーティング
結合時間:1時間
洗浄条件:15×2%ミルク-PBST、1×2%ミルク-PBSTで1時間、10×2%BSA-PBST、1×2%BSA-PBSTで1時間、10×PBSTおよび3×PBS
溶出条件:100mM TEA溶出
第3周期パニング:
投入ファージ数:1010cfuのファージミド
選択法:Nunc Immuno試験管選択
陰性選択:2%BSAでコーティングしたNunc Immuno試験管を用いて各10分間6回
パニングコーティング:1mlの0.1M炭酸ナトリウム緩衝液(pH9.6)中の0.1μgのミオスタチン・タンパク質でコーティング
結合時間:1時間
洗浄条件:15×2%ミルク-PBST、1×2%ミルク-PBSTで1時間、10×2%BSA-PBST、1×2%BSA-PBSTで1時間、10×PBSTおよび3×PBS
溶出条件:100mM TEA溶出
二次ライブラリーのパニングによって、ミオスタチンへの結合が増進したペプチドを得た。個々の選択クローンを上述のようなファージELISAに供し、そして配列決定した。
c1c2c3c4c5c6 Cc7c8 Wc9 WMCPPc10c11c12c13(配列番号354)、を提供し、式中:
c1は、存在しないか、またはアミノ酸いずれかであり;
c2は、存在しないか、または中性疎水性アミノ酸、中性極性アミノ酸、もしくは酸性アミノ酸であり;
c3は、存在しないか、または中性疎水性アミノ酸、中性極性アミノ酸、もしくは酸性アミノ酸であり;
c4は、存在しないか、またはアミノ酸いずれかであり;
c5は、存在しないか、または中性疎水性アミノ酸、中性極性アミノ酸、もしくは酸性アミノ酸であり;
c6は、存在しないか、または中性疎水性アミノ酸、中性極性アミノ酸、もしくは塩基性アミノ酸であり;
c7は、中性疎水性アミノ酸、中性極性アミノ酸、または塩基性アミノ酸であり;
c8は、中性疎水性アミノ酸、中性極性アミノ酸、または塩基性アミノ酸であり;
c9は、中性疎水性アミノ酸、中性極性アミノ酸、または塩基性アミノ酸であり;そして
c10〜c13は、アミノ酸いずれかである。
d1d2d3d4d5d6 Cd7d8 Wd9 WMCPPd10d11d12d13(配列番号355)を提供し、式中:
d1は、存在しないか、またはアミノ酸いずれかであり;
d2は、存在しないか、または中性疎水性アミノ酸、中性極性アミノ酸、もしくは酸性アミノ酸であり;
d3は、存在しないか、または中性疎水性アミノ酸、中性極性アミノ酸、もしくは酸性アミノ酸であり;
d4は、存在しないか、またはアミノ酸いずれかであり;
d5は、存在しないか、または中性疎水性アミノ酸、中性極性アミノ酸、もしくは酸性アミノ酸であり;
d6は、存在しないか、または中性疎水性アミノ酸、中性極性アミノ酸、もしくは塩基性アミノ酸であり;
d7は、アミノ酸T、I、またはRのいずれか1つから選択され;
d8は、R、S、Qのいずれか1つから選択され;
d9は、P、RおよびQのいずれか1つから選択され;
そしてd10〜d13は、アミノ酸いずれかから選択される。
TN-19アフィニティー成熟ファミリーに加えて、直鎖L-2、L-15、L-17、L-20、L-21、およびL-24の第一周期のペプチドから、さらなるアフィニティー成熟ペプチドを産生した。これらのファミリーを以下の表Vに示す。
アフィニティー成熟L2ペプチドは、f1 EMLf2 SLf3f4 LL(配列番号455)のコンセンサス配列を含み、ここでf1は、MまたはIであり;f2は、アミノ酸いずれかであり;f3は、LまたはFであり;そしてf4は、E、QまたはDである。
アフィニティー成熟ペプチボディのin vitroスクリーニング
上述のプロトコルにしたがって、以下の典型的なペプチボディをスクリーニングして、以下のKD値およびIC50値を得た。表VIIは、KinExATM溶液に基づくアッセイまたはBIAcore(登録商標)アッセイによって決定されるように、親ペプチボディと比較した、選択したアフィニティー成熟ペプチボディのKD値の範囲を示す。これらの値は、親ペプチボディと比較して、ミオスタチンに対するアフィニティー成熟ペプチボディの結合アフィニティーが増加したことを示す。表VIIIは、いくつかのアフィニティー成熟ペプチボディのIC50値を示す。値の範囲をこの表に示す。
典型的なペプチボディのin vivo同化活性
CD1 nu/nuマウスモデル(Charles River Laboratories、マサチューセッツ州)を用いて、ヒトFc領域(huFc)を含む本発明のペプチボディのin vivo有効性を決定した。このモデルは迅速な同化反応で本発明の阻害剤に反応し、これは、乾燥筋量の増加および筋線維タンパク質の増加に関連するが、体内の水含量の集積には関連しなかった。
筋力増加
年齢が一致した正常な雄4ヶ月齢C57Bl/6マウスを、週あたり5mg/kgの2xmTN8-19-33、2xmTN8-19-7、およびhuFcビヒクル対照群(10匹/群)の週2回の皮下注射で、30日間処置した。さらなる注射をせずに動物を回復させた。回復期第18日に、握力を測定した。Columbia Instruments測定装置、モデル1027dsm(オハイオ州コロンバス)を用いて、握力を測定した。ペプチボディ処置は、握力の有意な増加を生じ、2xmTN8-19-33で前処置した動物は、対照処置動物に比較して、握力の14%の増加を示し、一方、2xmTN8-19-7は、対照処置マウスに比較して、握力の15%の増加を示した。
薬物動態学
LE配列を含まない代表的なペプチボディを用いて、in vivo薬物動態学実験を行った。10mg/kgおよび5mg/kgの投薬量をCD1 nu/nuマウスに投与して、そして以下のパラメーターを決定した:Cmax(μg/ml)、曲線下面積(AUC)(μg-時間/ml)および半減期(時間)。アフィニティー成熟ペプチボディの2×型が1×型よりも有意に長い半減期を有することが見出された。例えば、1×アフィニティー成熟mTN8-19-22は、動物において約50.2時間の半減期を有し、一方、2xmTN8-19-22は、約85.2時間の半減期を有する。アフィニティー成熟1xmTN8-7は、約65時間の半減期を有し、一方、2xmTN8-19-7は、約106時間の半減期を有する。
mdxマウスの処置
本発明のペプチボディは、動物において、除脂肪筋量を増加させることが示され、そして筋萎縮を伴う多様な障害の治療に有用である。筋ジストロフィーは、これらの障害の1つである。デュシェンヌ筋ジストロフィーのマウスモデルは、デュシェンヌmdxマウス(Jackson Labratories、メイン州バーハーバー)である。老齢(10ヶ月齢)のmdxマウスに、ペプチボディ1xmTN8-19-33(n=8/群)またはビヒクルhuFcタンパク質(N=6/群)のいずれかを3ヶ月間注射した。投薬スケジュールは、1日おき、10mg/kg、皮下注射によった。ペプチボディ処置は、老齢mdxマウスの体重を増加させそして維持するのに陽性の影響を有した。図6Aに示すように、hu-Fc処置対照群に比較して、ペプチボディ処置群では、体重の有意な増加が観察された。さらに、図6Bに示すように、脂肪量に対する除脂肪体重の比もまた、対照群に比較して、ペプチボディ処置の結果、老齢mdxマウスで有意に増加し、そして体重のうちの脂肪の割合が、対照群に比較して、ペプチボディ処置マウスで減少することが、NMR分析によって明らかになった。
CIA関節炎マウス・モデルの処置
コラーゲン誘導性関節炎マウス・モデルは、関節リウマチのモデルとして広く用いられている。実験第1日および第21日に、8週齢のDBA/1Jマウス(Jackson Labs、メイン州バーハーバー)の尾の付け根に100μgウシ・コラーゲンII(Chorondex、ワシントン州レッドモンド)を投与して免疫し、関節炎を誘導した。関節および足の発赤および/または腫脹によってマウスの関節炎状態をスコア付けし、そしてこれに基づいて動物を選択した。動物3群を確立した:コラーゲンを投与されない正常動物(正常、12匹の動物)、コラーゲンに加えてネズミFcビヒクルを投与した動物(CIA/ビヒクル、6匹の動物)、およびコラーゲンに加えて、ネズミFcに結合したペプチボディ2xmTN8-19-21を投与した動物(2xmTN8-19-21/muFc、2x-21とも称する)(CIA/ペプチボディ、8匹の動物)。これらの実験および以下の実施例に用いたネズミFcは、ネズミIgG由来のFcである。CIA/ビヒクル動物およびCIA/ペプチボディ動物には、第1日および第21日のコラーゲン投与に加えて、第8日から始め、そして第50日まで連続して、週2回、5mg/kgのミオスタチン・ペプチボディ2xmTN8-19-21/muFcまたはネズミFcビヒクルのみを皮下(s.c.)注射した。動物の体重を4日ごとに測定した。結果を図7に示す。図7は、体重を喪失したCIA/ビヒクル動物に比較して、CIA/ペプチボディ(2x21)動物の体重増加を示し、本明細書記載のペプチボディを含むミオスタチン・アンタゴニストが、対照動物に示されるリウマチ性悪液質に対抗可能であることを示す。
精巣摘出マウスの処置
以下の実施例は、典型的なペプチボディでの精巣摘出C57Bl/6マウスの処置を記載する。年齢および体重が一致した6ヶ月齢の外科的に精巣摘出したC57Bl/6マウス(Charles River Laboratories、マサチューセッツ州ウィルミントン)の2群を、ネズミFcまたはペプチボディ2xmTN8-19-21/muFc(群あたり11匹の動物)のいずれかで処置した。マウスの2群に3mg/kgペプチボディまたはネズミFcを、週2回IP注射した。処置は、手術の3週間後に始まり、そして10週間続いた。各生存動物に核磁気共鳴(NMR)画像法を行って、研究開始時、第7週および第10週の除脂肪量を評価した。以下の表でわかるように、ネズミFcで処置した精巣摘出マウスは、第10週までに除脂肪量を喪失し始めた。Fcビヒクルに対して、ペプチボディを投与された精巣摘出群を比較すると、ネズミFcで処置した動物に比較して、ペプチボディは、精巣摘出した動物において、除脂肪体重の獲得を改善したことが示された。この結果を以下の表に示す。
TNF-αレベルの減少
雌BALB/cマウス、8〜10週齢(Charles River Laboratories、マサチューセッツ州ウィルミントン)を、LPS負荷の1日前に、PBS対照または10mg/kgのペプチボディ2xTN8-19-21/muFcで前処置した。各群は5匹の動物であった。第1日、0.5mg/kg(10μg/マウス)のLPS(大腸菌055、B5由来のリポ多糖(Sigma))を静脈投与した。LPS投与30分後に、血清試料を収集した。mTNF-α(腫瘍壊死因子α)レベルを測定した。結果は、ペプチボディで前処置した動物が、減少したレベルの血中mTNF-αを有することを示した。PBS処置動物では、血中のmTNF-αが、平均およそ380pg/mlであった。ペプチボディ処置動物では、血中mTNF-αが、平均およそ120pg/mlしかなかった。これは、ミオスタチン・アンタゴニストが、炎症に寄与する少なくとも1つのサイトカインを減少させて、関節リウマチおよび他の免疫障害を治療する際のアンタゴニストの有効性に寄与しうることを示す。
糖尿病のSTZ誘導モデル
以下の実験の目的は、ストレプトゾトシン(STZ)誘導性糖尿病動物モデルにおけるミオスタチン・アンタゴニストの効果を決定することであった。さらに、ミオスタチン・アンタゴニストが、糖尿病腎症の進行または発展を遅延させるかまたは防止するかどうかを決定する実験を設計した。用いたペプチボディは、ネズミFcに結合した2xmTN8-19-21(2xmTN8-19-21/muFcまたは2x-21)であった。対照ビヒクルはネズミFc単独であった。
多数回の低用量ストレプトゾトシン注射によって、糖尿病動物モデルを生成した。8週齢のC57Bl/6マウスをCharles River Laboratoryから購入した。すべての動物を個々のケージで1週間飼育した。動物体重を測定し、そして次いで無作為に2群(n=20/群)に分けた。20匹のマウスに、40mg/kg(クエン酸緩衝溶液0.1mlに溶解)の低用量ストレプトゾトシン(STZ、Sigma Co.)を連続5日間注射した。20匹のマウスの別の群には、ビヒクル(0.1mlのクエン酸緩衝溶液)を連続5日間注射した。グルコース・オキシダーゼ法を用いて、血中グルコース・レベルを測定した(Glucometer Elite、Bayer Corp.、インディアナ州エルクハート)。血中グルコース・レベルの測定によって、糖尿病の誘導を定義した。11mmol/lまたは200mg/dlを超える血中グルコース・レベルを、高血糖と見なした。次いで、糖尿病および年齢一致正常マウスをさらに4ヶ月間維持した。体重、食物摂取および血中グルコース・レベルを毎月測定した。STZ注射の4ヵ月後、20匹のマウスのうち16匹が糖尿病を発展させ、そしてこれらを後の研究に用いた。体重にしたがって、糖尿病マウスを2つの処置群に分けた。年齢一致正常マウスもまた、2つの処置群に分けた。
第0日に始まって、どちらの糖尿病群にも5mg/kgのビヒクル(mu-Fc)または2xmTN8-19-21を週3回6週間皮下注射した。体重および食物摂取を週3回測定した。STZを注射しなかった非糖尿病マウスを、ビヒクル(muFc)で、そして同じ用量および同じスケジュールで6週間処置した。第0日、第15日、第30日、および研究終了時に、グルコース・オキシダーゼ法を用いて、血中グルコース・レベルを測定した。研究設計を以下の表に提示する。
結果:STZ誘導性糖尿病マウスにおける、体重および血中グルコース変化
C57Bl/6マウスの体重および血中グルコースに対する、多数回の低用量STZ注射の結果、年齢一致正常マウス群よりも有意により高い血中グルコース・レベルを有するSTZ処置マウスが生じ、最初は、20匹の動物に関して、平均約120mg/dl平均血糖の正常レベルであったものが、STZ注射後の第2週には、平均約250〜280mg/dlに増加し、そして注射後の第8〜18週には、最大350mg/dlになった。抗ミオスタチン・ペプチボディ処置を開始するまでの4ヶ月の期間全体で、STZ処置群および対照群の間で、体重変化に関する統計的に有意な相違が見られた。対照群は、着実に体重を獲得し、平均すると、20週間に渡って、最大40%の体重獲得であり(平均25gが、第20週後は、34または35グラムにまで増加した)、一方、STZ群は、20週間の期間に渡って少ししか体重を獲得せず、20週間に渡って、約12〜14%しか増加しなかった(20週後、25g〜約28または29g)。
第0日ベースライン値に比較した2x-21またはビヒクルでの6週間処置後の除脂肪体重純変化として、除脂肪体重を示す。これらの値を以下の表に示す。2x-21での処置は、ビヒクル処置対照マウス(0.94±1.94gおよび1.60±1.28g)に比較した際のSTZ糖尿病マウスおよび年齢一致正常マウス両方(6.16±0.81gおよび8.56±0.75g)の除脂肪体重の純獲得を有意に増加させた(p<0.05)。脂肪量の%変化は、各群におけるベースライン第0日値に比較した、2x-21またはビヒクルでの6週間の処置後の純変化に相当する(以下の第二の表を参照されたい)。STZ糖尿病マウスにおける脂肪量獲得%は、2x-21(-15.60±7.01)およびビヒクル処置群(-21.59±6.84)の間で有意に異ならなかった。2x-21処置は、年齢一致正常マウスにおいて、純脂肪量獲得を減少させた(-1.53±3.42対7.13±3.38)が、統計的に有意な量には到達しなかった。
以下の表は、STZ糖尿病マウスおよび年齢一致正常マウスにおける血中グルコース変化に対する2xmTN8-19-21/muFcの影響を示す。血中グルコース・レベルは、STZ糖尿病マウスまたは年齢一致正常マウスのいずれにおいても、2x-21処置群およびビヒクル処置群の間で有意には異ならなかった。
STZ糖尿病マウスの高血糖は、腎臓肥大と関連しているようである。STZ糖尿病マウスの体重に対する腎臓重量比は、年齢一致正常マウスのものより高かった(0.98±0.04対0.67±0.02)。6週間の2x-21処置は、腎臓重量/体重比を、ビヒクル処置糖尿病動物における0.98±0.04から0.84±0.04の値まで有意に減少させた(p<0.05)。
糖尿病マウスに関しては、非糖尿病正常対照マウスに比較して、クレアチニン・クリアランス速度の増加傾向があった(図9)。糖尿病マウスの平均クレアチニン・クリアランス速度は、年齢一致正常マウスより、2倍以上高かった。図9に示すように、2x-21での処置は、ビヒクル処置糖尿病マウスに比較して、糖尿病マウスにおいて、クレアチニン・クリアランス速度を減少させ、腎機能を示した。
尿アルブミン排出および24時間尿体積は、糖尿病性腎症の初期段階中の腎傷害を決定する際に非常に重要なバイオマーカーである。結果は、尿アルブミン排出(図10A)および24時間尿体積の両方が、年齢一致正常マウスに比較した際、STZ糖尿病マウスで増加することを示した。2x-21処置は、糖尿病マウスにおいて、尿アルブミン・レベルを減少させ、そしてまた、24時間尿体積も減少させた(図10B)。これは、腎機能の正常化を示した。
5-フルオロウラシル化学療法誘導性悪液質のネズミ・モデルにおけるミオスタチン・アンタゴニストの影響
化合物5-フルオロウラシル(5-Fu)は、一般的に、結腸直腸癌、乳癌、胃癌または膵臓癌の患者において、療法剤として用いられる。5-Fu療法の副作用は、体重損失および筋萎縮である。5-Fu誘導性悪液質の治療における抗ミオスタチン・アンタゴニスト療法の潜在的な療法的利点を調べた。用いたペプチボディは、2xmTN8-19-21/muFc(2x-21とも称される)またはネズミFcに結合した2xmTN8-19-21であった。対照ビヒクルはネズミFc単独であった。
Claims (42)
- 性腺機能低下症の影響を治療する必要がある被験体において、こうした影響を治療する方法であって、薬学的に許容されうる担体と混合したミオスタチン・アンタゴニストの療法的有効量を該被験体に投与することを含む、前記方法。
- 性腺機能低下症がアンドロゲン枯渇療法の結果として生じる、請求項1の方法。
- 性腺機能低下症が、性腺機能の加齢に伴う減少から生じる、請求項1の方法。
- ミオスタチン・アンタゴニストが、フォリスタチン、ミオスタチン・プロドメイン、GDF-11プロドメイン、プロドメイン融合タンパク質、ミオスタチンに結合するアンタゴニスト性抗体または抗体断片、アクチビンIIB型受容体に結合するアンタゴニスト性抗体または抗体断片、可溶性アクチビンIIB型受容体、可溶性アクチビンIIB型受容体融合タンパク質、可溶性ミオスタチン類似体、オリゴヌクレオチド、小分子、ペプチド模倣体、およびミオスタチン結合剤からなる群より選択される、請求項1の方法。
- ミオスタチン・アンタゴニストがミオスタチン結合剤であり、そしてその結合剤が、配列Cb1b2 Wb3 WMCPP(配列番号353)、[ここで
b1は、アミノ酸T、I、またはRのいずれか1つから選択され;
b2は、R、S、Qのいずれか1つから選択され;
b3は、P、RおよびQのいずれか1つから選択される]
を含み、そして長さが10〜50アミノ酸の間である、ミオスタチンに結合可能な少なくとも1つのペプチドおよびその生理学的に許容されうる塩を含む、請求項1の方法。 - ミオスタチン・アンタゴニストがミオスタチン結合剤であり、そしてその結合剤が、構造:
(X1)a-F1-(X2)b、またはそのマルチマー;
[ここでF1はビヒクルであり;そしてX1およびX2は、各々独立に
-(L1)c-P1;
-(L1)c-P1-(L2)d-P2;
-(L1)c-P1-(L2)d-P2-(L3)e-P3;
および-(L1)c-P1-(L2)d-P2-(L3)e-P3-(L4)f-P4;
ここでP1、P2、P3、およびP4は、ミオスタチンに結合可能なペプチドであり、そしてL1、L2、L3、およびL4は、各々リンカーであり;そしてa、b、c、d、eおよびfは、各々独立に0または1である、但しaおよびbの少なくとも1つは1である
から選択される]、
およびその生理学的に許容されうる塩を有する、請求項1の方法。 - ミオスタチン・アンタゴニストがミオスタチン結合剤であり、そしてその結合剤が、構造:
(X1)a-F1-(X2)b、またはそのマルチマー;
[ここでF1はビヒクルであり;そしてX1およびX2は、各々独立に
-(L1)c-P1;
-(L1)c-P1-(L2)d-P2;
-(L1)c-P1-(L2)d-P2-(L3)e-P3;
および-(L1)c-P1-(L2)d-P2-(L3)e-P3-(L4)f-P4;
ここでP1、P2、P3、およびP4は、ミオスタチンに結合可能なペプチドであり、そして独立に、配列番号305〜351および配列番号357〜454から選択され;
L1、L2、L3、およびL4は、各々リンカーであり;そしてa、b、c、d、eおよびfは、各々独立に0または1である、但しaおよびbの少なくとも1つは1である
から選択される]、
およびその生理学的に許容されうる塩を有する、請求項1の方法。 - 関節リウマチによる悪液質を治療する必要がある被験体において、こうした悪液質を治療する方法であって、薬学的に許容されうる担体と混合したミオスタチン・アンタゴニストの療法的有効量を該被験体に投与することを含む、前記方法。
- ミオスタチン・アンタゴニストが、フォリスタチン、ミオスタチン・プロドメイン、GDF-11プロドメイン、プロドメイン融合タンパク質、ミオスタチンに結合するアンタゴニスト性抗体または抗体断片、アクチビンIIB型受容体に結合するアンタゴニスト性抗体または抗体断片、可溶性アクチビンIIB型受容体、可溶性アクチビンIIB型受容体融合タンパク質、可溶性ミオスタチン類似体、オリゴヌクレオチド、小分子、ペプチド模倣体、およびミオスタチン結合剤からなる群より選択される、請求項8の方法。
- ミオスタチン・アンタゴニストがミオスタチン結合剤であり、そしてその結合剤が、配列Cb1b2 Wb3 WMCPP(配列番号353)、[ここで
b1は、アミノ酸T、I、またはRのいずれか1つから選択され;
b2は、R、S、Qのいずれか1つから選択され;
b3は、P、RおよびQのいずれか1つから選択される]
を含み、そして長さが10〜50アミノ酸の間である、ミオスタチンに結合可能な少なくとも1つのペプチドおよびその生理学的に許容されうる塩を含む、請求項8の方法。 - ミオスタチン・アンタゴニストがミオスタチン結合剤であり、そしてその結合剤が、構造:
(X1)a-F1-(X2)b、またはそのマルチマー;
[ここでF1はビヒクルであり;そしてX1およびX2は、各々独立に
-(L1)c-P1;
-(L1)c-P1-(L2)d-P2;
-(L1)c-P1-(L2)d-P2-(L3)e-P3;
および-(L1)c-P1-(L2)d-P2-(L3)e-P3-(L4)f-P4;
ここでP1、P2、P3、およびP4は、ミオスタチンに結合可能なペプチドであり、そしてL1、L2、L3、およびL4は、各々リンカーであり;そしてa、b、c、d、eおよびfは、各々独立に0または1である、但しaおよびbの少なくとも1つは1である
から選択される]、
およびその生理学的に許容されうる塩を有する、請求項8の方法。 - ミオスタチン・アンタゴニストがミオスタチン結合剤であり、そしてその結合剤が、構造:
(X1)a-F1-(X2)b、またはそのマルチマー;
[ここでF1はビヒクルであり;そしてX1およびX2は、各々独立に
-(L1)c-P1;
-(L1)c-P1-(L2)d-P2;
-(L1)c-P1-(L2)d-P2-(L3)e-P3;
および-(L1)c-P1-(L2)d-P2-(L3)e-P3-(L4)f-P4;
ここでP1、P2、P3、およびP4は、ミオスタチンに結合可能なペプチドであり、そして独立に、配列番号305〜351および配列番号357〜454から選択され;
L1、L2、L3、およびL4は、各々リンカーであり;
そしてa、b、c、d、eおよびfは、各々独立に0または1である、但しaおよびbの少なくとも1つは1である
から選択される]、
およびその生理学的に許容されうる塩を有する、請求項8の方法。 - プラダー・ウィリー症候群の症状に悩まされている被験体において、その影響を治療する方法であって、薬学的に許容されうる担体と混合したミオスタチン・アンタゴニストの療法的有効量を該被験体に投与することを含む、前記方法。
- ミオスタチン・アンタゴニストが、フォリスタチン、ミオスタチン・プロドメイン、GDF-11プロドメイン、プロドメイン融合タンパク質、ミオスタチンに結合するアンタゴニスト性抗体または抗体断片、アクチビンIIB型受容体に結合するアンタゴニスト性抗体または抗体断片、可溶性アクチビンIIB型受容体、可溶性アクチビンIIB型受容体融合タンパク質、可溶性ミオスタチン類似体、オリゴヌクレオチド、小分子、ペプチド模倣体、およびミオスタチン結合剤からなる群より選択される、請求項13の方法。
- ミオスタチン・アンタゴニストがミオスタチン結合剤であり、そしてその結合剤が、配列Cb1b2 Wb3 WMCPP(配列番号353)、[ここで
b1は、アミノ酸T、I、またはRのいずれか1つから選択され;
b2は、R、S、Qのいずれか1つから選択され;
b3は、P、RおよびQのいずれか1つから選択される]
を含み、そして長さが10〜50アミノ酸の間である、ミオスタチンに結合可能な少なくとも1つのペプチドおよびその生理学的に許容されうる塩を含む、請求項13の方法。 - ミオスタチン・アンタゴニストがミオスタチン結合剤であり、そしてその結合剤が、構造:
(X1)a-F1-(X2)b、またはそのマルチマー;
[ここでF1はビヒクルであり;そしてX1およびX2は、各々独立に
-(L1)c-P1;
-(L1)c-P1-(L2)d-P2;
-(L1)c-P1-(L2)d-P2-(L3)e-P3;
および-(L1)c-P1-(L2)d-P2-(L3)e-P3-(L4)f-P4;
ここでP1、P2、P3、およびP4は、ミオスタチンに結合可能なペプチドであり;
L1、L2、L3、およびL4は、各々リンカーであり;そしてa、b、c、d、eおよびfは、各々独立に0または1である、但しaおよびbの少なくとも1つは1である
から選択される]、
およびその生理学的に許容されうる塩を有する、請求項13の方法。 - ミオスタチン・アンタゴニストがミオスタチン結合剤であり、そしてその結合剤が、構造:
(X1)a-F1-(X2)b、またはそのマルチマー;
[ここでF1はビヒクルであり;そしてX1およびX2は、各々独立に
-(L1)c-P1;
-(L1)c-P1-(L2)d-P2;
-(L1)c-P1-(L2)d-P2-(L3)e-P3;
および-(L1)c-P1-(L2)d-P2-(L3)e-P3-(L4)f-P4;
ここでP1、P2、P3、およびP4は、ミオスタチンに結合可能なペプチドであり、そして独立に、配列番号305〜351および配列番号357〜454から選択され;
L1、L2、L3、およびL4は、各々リンカーであり;
そしてa、b、c、d、eおよびfは、各々独立に0または1である、但しaおよびbの少なくとも1つは1である
から選択される]、
およびその生理学的に許容されうる塩を有する、請求項13の方法。 - 火傷傷害による悪液質を治療する必要がある被験体において、こうした悪液質を治療する方法であって、薬学的に許容されうる担体と混合したミオスタチン・アンタゴニストの療法的有効量を該被験体に投与することを含む、前記方法。
- ミオスタチン・アンタゴニストが、フォリスタチン、ミオスタチン・プロドメイン、GDF-11プロドメイン、プロドメイン融合タンパク質、ミオスタチンに結合するアンタゴニスト性抗体または抗体断片、アクチビンIIB型受容体に結合するアンタゴニスト性抗体または抗体断片、可溶性アクチビンIIB型受容体、可溶性アクチビンIIB型受容体融合タンパク質、可溶性ミオスタチン類似体、オリゴヌクレオチド、小分子、ペプチド模倣体、およびミオスタチン結合剤からなる群より選択される、請求項18の方法。
- ミオスタチン・アンタゴニストがミオスタチン結合剤であり、そしてその結合剤が、配列Cb1b2 Wb3 WMCPP(配列番号353)、[ここで
b1は、アミノ酸T、I、またはRのいずれか1つから選択され;
b2は、R、S、Qのいずれか1つから選択され;
b3は、P、RおよびQのいずれか1つから選択される]
を含み、そして長さが10〜50アミノ酸の間である、ミオスタチンに結合可能な少なくとも1つのペプチドおよびその生理学的に許容されうる塩を含む、請求項18の方法。 - ミオスタチン・アンタゴニストがミオスタチン結合剤であり、そしてその結合剤が、構造:
(X1)a-F1-(X2)b、またはそのマルチマー;
[ここでF1はビヒクルであり;そしてX1およびX2は、各々独立に
-(L1)c-P1;
-(L1)c-P1-(L2)d-P2;
-(L1)c-P1-(L2)d-P2-(L3)e-P3;
および-(L1)c-P1-(L2)d-P2-(L3)e-P3-(L4)f-P4;
ここでP1、P2、P3、およびP4は、ミオスタチンに結合可能なペプチドであり;
L1、L2、L3、およびL4は、各々リンカーであり;そしてa、b、c、d、eおよびfは、各々独立に0または1である、但しaおよびbの少なくとも1つは1である
から選択される]、
およびその生理学的に許容されうる塩を有する、請求項18の方法。 - ミオスタチン・アンタゴニストがミオスタチン結合剤であり、そしてその結合剤が、構造:
(X1)a-F1-(X2)b、またはそのマルチマー;
[ここでF1はビヒクルであり;そしてX1およびX2は、各々独立に
-(L1)c-P1;
-(L1)c-P1-(L2)d-P2;
-(L1)c-P1-(L2)d-P2-(L3)e-P3;
および-(L1)c-P1-(L2)d-P2-(L3)e-P3-(L4)f-P4;
ここでP1、P2、P3、およびP4は、ミオスタチンに結合可能なペプチドであり、そして独立に、配列番号305〜351および配列番号357〜454から選択され;
L1、L2、L3、およびL4は、各々リンカーであり;
そしてa、b、c、d、eおよびfは、各々独立に0または1である、但しaおよびbの少なくとも1つは1である
から選択される]、
およびその生理学的に許容されうる塩を有する、請求項18の方法。 - 糖尿病による悪液質を治療する必要がある被験体において、こうした悪液質を治療する方法であって、薬学的に許容されうる担体と混合したミオスタチン・アンタゴニストの療法的有効量を該被験体に投与することを含む、前記方法。
- ミオスタチン・アンタゴニストが、フォリスタチン、ミオスタチン・プロドメイン、GDF-11プロドメイン、プロドメイン融合タンパク質、ミオスタチンに結合するアンタゴニスト性抗体または抗体断片、アクチビンIIB型受容体に結合するアンタゴニスト性抗体または抗体断片、可溶性アクチビンIIB型受容体、可溶性アクチビンIIB型受容体融合タンパク質、可溶性ミオスタチン類似体、オリゴヌクレオチド、小分子、ペプチド模倣体、およびミオスタチン結合剤からなる群より選択される、請求項23の方法。
- ミオスタチン・アンタゴニストがミオスタチン結合剤であり、そしてその結合剤が、配列Cb1b2 Wb3 WMCPP(配列番号353)、[ここで
b1は、アミノ酸T、I、またはRのいずれか1つから選択され;
b2は、R、S、Qのいずれか1つから選択され;
b3は、P、RおよびQのいずれか1つから選択される]
を含み、そして長さが10〜50アミノ酸の間である、ミオスタチンに結合可能な少なくとも1つのペプチドおよびその生理学的に許容されうる塩を含む、請求項23の方法。 - ミオスタチン・アンタゴニストがミオスタチン結合剤であり、そしてその結合剤が、構造:
(X1)a-F1-(X2)b、またはそのマルチマー;
[ここでF1はビヒクルであり;そしてX1およびX2は、各々独立に
-(L1)c-P1;
-(L1)c-P1-(L2)d-P2;
-(L1)c-P1-(L2)d-P2-(L3)e-P3;
および-(L1)c-P1-(L2)d-P2-(L3)e-P3-(L4)f-P4;
ここでP1、P2、P3、およびP4は、ミオスタチンに結合可能なペプチドであり;
L1、L2、L3、およびL4は、各々リンカーであり;そしてa、b、c、d、eおよびfは、各々独立に0または1である、但しaおよびbの少なくとも1つは1である
から選択される]、
およびその生理学的に許容されうる塩を有する、請求項23の方法。 - ミオスタチン・アンタゴニストがミオスタチン結合剤であり、そしてその結合剤が、構造:
(X1)a-F1-(X2)b、またはそのマルチマー;
[ここでF1はビヒクルであり;そしてX1およびX2は、各々独立に
-(L1)c-P1;
-(L1)c-P1-(L2)d-P2;
-(L1)c-P1-(L2)d-P2-(L3)e-P3;
および-(L1)c-P1-(L2)d-P2-(L3)e-P3-(L4)f-P4;
ここでP1、P2、P3、およびP4は、ミオスタチンに結合可能なペプチドであり、そして独立に、配列番号305〜351および配列番号357〜454から選択され;
L1、L2、L3、およびL4は、各々リンカーであり;
そしてa、b、c、d、eおよびfは、各々独立に0または1である、但しaおよびbの少なくとも1つは1である
から選択される]、
およびその生理学的に許容されうる塩を有する、請求項23の方法。 - 糖尿病性腎症を治療する必要がある被験体において、糖尿病性腎症を治療する方法であって、薬学的に許容されうる担体と混合したミオスタチン・アンタゴニストの療法的有効量を該被験体に投与することを含む、前記方法。
- ミオスタチン・アンタゴニストが、フォリスタチン、ミオスタチン・プロドメイン、GDF-11プロドメイン、プロドメイン融合タンパク質、ミオスタチンに結合するアンタゴニスト性抗体または抗体断片、アクチビンIIB型受容体に結合するアンタゴニスト性抗体または抗体断片、可溶性アクチビンIIB型受容体、可溶性アクチビンIIB型受容体融合タンパク質、可溶性ミオスタチン類似体、オリゴヌクレオチド、小分子、ペプチド模倣体、およびミオスタチン結合剤からなる群より選択される、請求項28の方法。
- ミオスタチン・アンタゴニストがミオスタチン結合剤であり、そしてその結合剤が、配列Cb1b2 Wb3 WMCPP(配列番号353)、[ここで
b1は、アミノ酸T、I、またはRのいずれか1つから選択され;
b2は、R、S、Qのいずれか1つから選択され;
b3は、P、RおよびQのいずれか1つから選択される]
を含み、そして長さが10〜50アミノ酸の間である、ミオスタチンに結合可能な少なくとも1つのペプチドおよびその生理学的に許容されうる塩を含む、請求項28の方法。 - ミオスタチン・アンタゴニストがミオスタチン結合剤であり、そしてその結合剤が、構造:
(X1)a-F1-(X2)b、またはそのマルチマー;
[ここでF1はビヒクルであり;そしてX1およびX2は、各々独立に
-(L1)c-P1;
-(L1)c-P1-(L2)d-P2;
-(L1)c-P1-(L2)d-P2-(L3)e-P3;
および-(L1)c-P1-(L2)d-P2-(L3)e-P3-(L4)f-P4;
ここでP1、P2、P3、およびP4は、ミオスタチンに結合可能なペプチドであり;
L1、L2、L3、およびL4は、各々リンカーであり;そしてa、b、c、d、eおよびfは、各々独立に0または1である、但しaおよびbの少なくとも1つは1である
から選択される]、
およびその生理学的に許容されうる塩を有する、請求項28の方法。 - ミオスタチン・アンタゴニストがミオスタチン結合剤であり、そしてその結合剤が、構造:
(X1)a-F1-(X2)b、またはそのマルチマー;
[ここでF1はビヒクルであり;そしてX1およびX2は、各々独立に
-(L1)c-P1;
-(L1)c-P1-(L2)d-P2;
-(L1)c-P1-(L2)d-P2-(L3)e-P3;
および-(L1)c-P1-(L2)d-P2-(L3)e-P3-(L4)f-P4;
ここでP1、P2、P3、およびP4は、ミオスタチンに結合可能なペプチドであり、そして独立に、配列番号305〜351および配列番号357〜454から選択され;
L1、L2、L3、およびL4は、各々リンカーであり;
そしてa、b、c、d、eおよびfは、各々独立に0または1である、但しaおよびbの少なくとも1つは1である
から選択される]、
およびその生理学的に許容されうる塩を有する、請求項28の方法。 - 化学療法剤での治療による悪液質を治療する必要がある被験体において、こうした悪液質を治療する方法であって、薬学的に許容されうる担体と混合したミオスタチン・アンタゴニストの療法的有効量を該被験体に投与することを含む、前記方法。
- ミオスタチン・アンタゴニストが、フォリスタチン、ミオスタチン・プロドメイン、GDF-11プロドメイン、プロドメイン融合タンパク質、ミオスタチンに結合するアンタゴニスト性抗体または抗体断片、アクチビンIIB型受容体に結合するアンタゴニスト性抗体または抗体断片、可溶性アクチビンIIB型受容体、可溶性アクチビンIIB型受容体融合タンパク質、可溶性ミオスタチン類似体、オリゴヌクレオチド、小分子、ペプチド模倣体、およびミオスタチン結合剤からなる群より選択される、請求項33の方法。
- ミオスタチン・アンタゴニストがミオスタチン結合剤であり、そしてその結合剤が、配列Cb1b2 Wb3 WMCPP(配列番号353)、[ここで
b1は、アミノ酸T、I、またはRのいずれか1つから選択され;
b2は、R、S、Qのいずれか1つから選択され;
b3は、P、RおよびQのいずれか1つから選択される]
を含み、そして長さが10〜50アミノ酸の間である、ミオスタチンに結合可能な少なくとも1つのペプチドおよびその生理学的に許容されうる塩を含む、請求項33の方法。 - ミオスタチン・アンタゴニストがミオスタチン結合剤であり、そしてその結合剤が、構造:
(X1)a-F1-(X2)b、またはそのマルチマー;
[ここでF1はビヒクルであり;そしてX1およびX2は、各々独立に
-(L1)c-P1;
-(L1)c-P1-(L2)d-P2;
-(L1)c-P1-(L2)d-P2-(L3)e-P3;
および-(L1)c-P1-(L2)d-P2-(L3)e-P3-(L4)f-P4;
ここでP1、P2、P3、およびP4は、ミオスタチンに結合可能なペプチドであり;
L1、L2、L3、およびL4は、各々リンカーであり;そしてa、b、c、d、eおよびfは、各々独立に0または1である、但しaおよびbの少なくとも1つは1である
から選択される]、
およびその生理学的に許容されうる塩を有する、請求項33の方法。 - ミオスタチン・アンタゴニストがミオスタチン結合剤であり、そしてその結合剤が、構造:
(X1)a-F1-(X2)b、またはそのマルチマー;
[ここでF1はビヒクルであり;そしてX1およびX2は、各々独立に
-(L1)c-P1;
-(L1)c-P1-(L2)d-P2;
-(L1)c-P1-(L2)d-P2-(L3)e-P3;
および-(L1)c-P1-(L2)d-P2-(L3)e-P3-(L4)f-P4;
ここでP1、P2、P3、およびP4は、ミオスタチンに結合可能なペプチドであり、そして独立に、配列番号305〜351および配列番号357〜454から選択され;
L1、L2、L3、およびL4は、各々リンカーであり;
そしてa、b、c、d、eおよびfは、各々独立に0または1である、但しaおよびbの少なくとも1つは1である
から選択される]、
およびその生理学的に許容されうる塩を有する、請求項33の方法。 - 炎症状態を患う被験体において、過剰なTNF-αを治療する方法であって、薬学的に許容されうる担体と混合したミオスタチン・アンタゴニストの療法的有効量を該被験体に投与することを含む、前記方法。
- ミオスタチン・アンタゴニストが、フォリスタチン、ミオスタチン・プロドメイン、GDF-11プロドメイン、プロドメイン融合タンパク質、ミオスタチンに結合するアンタゴニスト性抗体または抗体断片、アクチビンIIB型受容体に結合するアンタゴニスト性抗体または抗体断片、可溶性アクチビンIIB型受容体、可溶性アクチビンIIB型受容体融合タンパク質、可溶性ミオスタチン類似体、オリゴヌクレオチド、小分子、ペプチド模倣体、およびミオスタチン結合剤からなる群より選択される、請求項38の方法。
- ミオスタチン・アンタゴニストがミオスタチン結合剤であり、そしてその結合剤が、配列Cb1b2 Wb3 WMCPP(配列番号353)、[ここで
b1は、アミノ酸T、I、またはRのいずれか1つから選択され;
b2は、R、S、Qのいずれか1つから選択され;
b3は、P、RおよびQのいずれか1つから選択される]
を含み、そして長さが10〜50アミノ酸の間である、ミオスタチンに結合可能な少なくとも1つのペプチドおよびその生理学的に許容されうる塩を含む、請求項38の方法。 - ミオスタチン・アンタゴニストがミオスタチン結合剤であり、そしてその結合剤が、構造:
(X1)a-F1-(X2)b、またはそのマルチマー;
[ここでF1はビヒクルであり;そしてX1およびX2は、各々独立に
-(L1)c-P1;
-(L1)c-P1-(L2)d-P2;
-(L1)c-P1-(L2)d-P2-(L3)e-P3;
および-(L1)c-P1-(L2)d-P2-(L3)e-P3-(L4)f-P4;
ここでP1、P2、P3、およびP4は、ミオスタチンに結合可能なペプチドであり;
L1、L2、L3、およびL4は、各々リンカーであり;そしてa、b、c、d、eおよびfは、各々独立に0または1である、但しaおよびbの少なくとも1つは1である
から選択される]、
およびその生理学的に許容されうる塩を有する、請求項38の方法。 - ミオスタチン・アンタゴニストがミオスタチン結合剤であり、そしてその結合剤が、構造:
(X1)a-F1-(X2)b、またはそのマルチマー;
[ここでF1はビヒクルであり;そしてX1およびX2は、各々独立に
-(L1)c-P1;
-(L1)c-P1-(L2)d-P2;
-(L1)c-P1-(L2)d-P2-(L3)e-P3;
および-(L1)c-P1-(L2)d-P2-(L3)e-P3-(L4)f-P4;
ここでP1、P2、P3、およびP4は、ミオスタチンに結合可能なペプチドであり、そして独立に、配列番号305〜351および配列番号357〜454から選択され;
L1、L2、L3、およびL4は、各々リンカーであり;
そしてa、b、c、d、eおよびfは、各々独立に0または1である、但しaおよびbの少なくとも1つは1である
から選択される]、
およびその生理学的に許容されうる塩を有する、請求項38の方法。
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