KR20170129233A - 폴리스타틴-관련된 융합 단백질 및 이들의 용도 - Google Patents

폴리스타틴-관련된 융합 단백질 및 이들의 용도 Download PDF

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라빈드라 쿠마르
이스야 그린버그
디아나 에스. 사코
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Abstract

일정한 양상에서, 본 발명은 설치류 및 영장류를 비롯한 척추동물에서 및 특히 인간에서 TGFβ 상과 리간드, 특히 리간드, 예를 들면, GDF8, GDF11, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C 및 액티빈 E의 활성을 저해하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드 및/또는 폴리스타틴 리간드의 비정상적인 활성과 연관되는 질환 또는 장애를 치료하거나 예방하는데 이용될 수 있다.

Description

폴리스타틴-관련된 융합 단백질 및 이들의 용도
관련된 출원
본 출원은 2015년 3월 26일자 제출된 U.S. 가출원 번호 62/138,886 (현재 계류 중)에 우선권을 주장한다. 전술한 출원의 내용 및 개시는 본원에 전체적으로 참조로서 편입된다.
발명의 배경
전환 성장 인자-β (TGFβ) 상과는 통상적인 서열 요소 및 구조적 모티프를 공유하는 다양한 성장 인자를 내포한다. 이들 단백질은 척추동물 및 무척추동물 둘 모두에서 매우 다양한 세포 유형에 대한 생물학적 효과를 발휘하는 것으로 알려져 있다. 이러한 상과의 구성원은 배아 발달 동안 패턴 형성 및 조직 특징화에서 중요한 기능을 수행하고, 그리고 지질생성, 근육발생, 연골형성, 심장발생, 조혈, 신경발생 및 상피 세포 분화를 비롯한 다양한 분화 과정에 영향을 줄 수 있다. 상과 구성원은 다양한, 종종 상보성 효과를 갖는다. TGFβ 패밀리의 구성원의 활성을 조작함으로써, 생물체에서 유의미한 생리학적 변화를 유발하는 것이 종종 가능하다. 근육, 뼈, 연골 및 다른 조직에서 변화는 적절한 TGFβ 상과 구성원에 의해 매개되는 신호전달을 증가시키거나 또는 길항함으로써 달성될 수 있다.
리간드 트랩으로서 종종 지칭되는 자연발생 단백질은 TGFβ 상과 리간드의 세포외 조절인자로서 기능한다. 이런 리간드 트랩은 가용성 형태에서 또는 세포외 기질에 부착되어 작용하고, 그리고 전형적으로, 수용체 활성화에 필요한 에피토프에 결합함으로써 리간드를 격리한다. 리간드 트랩의 한 가지 패밀리는 폴리스타틴 및 폴리스타틴-관련된 단백질을 포함하는데, 이들은 복수 라인의 증거에 근거된 바람직한 기능적 활성을 소유하지만, 치료적 작용제로서 이용하기가 어려운 것으로 입증되었다. 따라서, TGFβ 상과 신호전달의 강력한 조절인자로서 기능하는 이와 같은 작용제가 요구된다.
발명의 요약
부분적으로, 본 발명은 폴리스타틴-관련된 융합 단백질을 포함하는 이형화학 단백질 복합체를 제공한다. 이런 이형화학 단백질 복합체는 리간드, 예를 들면, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 E, GDF8 및 GDF11의 높은 친화성 결합 및 저해를 임의선택적으로 전시하고, 그리고 폴리스타틴-관련된 단백질의 선천적 형태에 비하여 재조합 세포주에서 향상된 생산, 정제에 대한 향상된 성질 및/또는 연장된 혈청 반감기를 임의선택적으로 전시한다.
일정한 양상에서, 본원에서 설명된 단백질 복합체는 두 번째 폴리펩티드와 공유적으로 또는 비공유적으로 연관된 첫 번째 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 첫 번째 폴리펩티드는 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드의 아미노산 서열 및 상호작용 쌍의 첫 번째 구성원의 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 두 번째 폴리펩티드는 상호작용 쌍의 두 번째 구성원의 아미노산 서열을 포함한다. 다른 양상에서, 본원에서 설명된 단백질 복합체는 두 번째 폴리펩티드와 비공유적으로 연관된 첫 번째 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 첫 번째 폴리펩티드는 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드의 아미노산 서열 및 상호작용 쌍의 첫 번째 구성원의 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 두 번째 폴리펩티드는 상호작용 쌍의 두 번째 구성원의 아미노산 서열을 포함한다.
본원에서 설명된 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드는 서열 번호: 1-33 중에서 한 가지에 최소한 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%인 아미노산 서열을 포함하거나, 상기 서열로 본질적으로 구성되거나, 또는 상기 서열로 구성되는 폴리펩티드를 포함한다. 임의선택적으로, 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드는 상호작용 쌍의 첫 번째 구성원에 직접적으로 연결되거나, 또는 개재성 서열, 예를 들면, 링커가 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드의 아미노산 서열 및 상호작용 쌍의 첫 번째 구성원의 아미노산 서열 사이에 배치될 수 있다. 링커의 실례는 서열 TGGG, TGGGG, SGGGG, GGGGS 및 GGG를 포함한다. 임의선택적으로, 첫 번째 폴리펩티드는 상호작용 쌍의 첫 번째 구성원 또는 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드의 C 말단 및/또는 N 말단에 배치된 추가 아미노산 (가령, 1-50, 1-40, 1-30, 1-20, 또는 1-10개 아미노산)을 포함할 수 있다. 상호작용 쌍의 첫 번째 구성원 또는 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드의 C 말단 또는 N 말단에 배치된 이런 추가 아미노산은 생물학적 활성을 부여할 수 있다. 대안으로, 이런 추가 아미노산은 어떤, 또는 실제적으로 어떤 생물학적 활성도 부여할 수 없다. 임의선택적으로, 이런 추가 아미노산은 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드에 이종성이고, 그리고 바람직하게는, 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드가 아니다.
두 번째 폴리펩티드는 상호작용 쌍의 두 번째 구성원으로 본질적으로 구성되거나 또는 이것으로 구성될 수 있다. 임의선택적으로, 두 번째 폴리펩티드는 상호작용 쌍의 두 번째 구성원의 C 말단 및/또는 N 말단에 배치된 추가 아미노산 (가령, 1-50, 1-40, 1-30, 1-20, 또는 1-10개 아미노산)을 포함할 수 있다. 상호작용 쌍의 두 번째 구성원의 C 말단 또는 N 말단에 배치된 이런 추가 아미노산은 생물학적 활성을 부여할 수 있다. 대안으로, 상호작용 쌍의 두 번째 구성원의 C 말단 또는 N 말단에 배치된 이런 추가 아미노산은 어떤, 또는 실제적으로 어떤 생물학적 활성도 부여할 수 없다. 임의선택적으로, 상호작용 쌍의 두 번째 구성원의 C 말단 또는 N 말단에 배치된 이런 추가 아미노산은 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드에 이종성일 것이고, 그리고 바람직하게는, 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드가 아니다.
본원에서 설명된 상호작용 쌍은 이합체화를 증진하거나 또는 고차 다합체를 형성하도록 설계된다. 일부 구체예에서, 상호작용 쌍은 비록 작업 구체예가 동종이합체성 복합체를 형성하는 상호작용 쌍을 또한 이용할 수도 있긴 하지만, 상호작용하여 복합체, 특히 이형이합체성 복합체를 형성하는 임의의 2개 폴리펩티드 서열일 수 있다. 상호작용 쌍의 첫 번째와 두 번째 구성원은 비대칭 쌍일 수 있는데, 이것은 상기 쌍의 구성원들이 자가 연관보다는 서로에 우선적으로 연관된다는 것을 의미한다. 따라서, 비대칭 상호작용 쌍의 첫 번째와 두 번째 구성원은 연관하여 이형이합체성 복합체를 형성할 수 있다. 대안으로, 상호작용 쌍은 비유도될 수 있는데, 이것은 상기 쌍의 구성원들이 실제적인 선호 없이 서로 연관되거나 또는 자가-연관될 수 있고, 그리고 따라서, 동일하거나 상이한 아미노산 서열을 가질 수 있다는 것을 의미한다. 따라서, 비유도된 상호작용 쌍의 첫 번째와 두 번째 구성원은 연관하여 동종이합체성 복합체 또는 이형이합체성 복합체를 형성할 수 있다. 임의선택적으로, 상호작용 작용 쌍 (가령, 비대칭 쌍 또는 비유도된 상호작용 쌍)의 첫 번째 구성원은 상호작용 쌍의 두 번째 구성원과 공유적으로 연관된다. 임의선택적으로, 상호작용 작용 쌍 (가령, 비대칭 쌍 또는 비유도된 상호작용 쌍)의 첫 번째 구성원은 상호작용 쌍의 두 번째 구성원과 비공유적으로 연관된다.
전통적인 Fc 융합 단백질 및 항체는 비유도된 상호작용 쌍의 실례이고, 반면 다양한 가공된 Fc 도메인은 비대칭 상호작용 쌍으로서 설계되었다. 이런 이유로, 본원에서 설명된 상호작용 쌍의 첫 번째 구성원 및/또는 두 번째 구성원은 예로서, 면역글로불린의 Fc 부분을 비롯한, 면역글로불린의 불변 도메인을 포함할 수 있다. 임의선택적으로, 상호작용 쌍의 첫 번째 구성원은 포유동물, 바람직하게는 인간의 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 면역글로불린의 Fc 도메인으로부터 유래되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 가령, 상호작용 쌍의 첫 번째 구성원은 서열 번호: 34-46 중에서 한 가지에 최소한 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%인 아미노산 서열을 포함하거나, 상기 서열로 본질적으로 구성되거나, 또는 상기 서열로 구성될 수 있다. 임의선택적으로, 상호작용 쌍의 두 번째 구성원은 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4의 Fc 도메인으로부터 유래되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 가령, 상호작용 쌍의 두 번째 구성원은 서열 번호: 34-46 중에서 한 가지에 최소한 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%인 아미노산 서열을 포함하거나, 상기 서열로 본질적으로 구성되거나, 또는 상기 서열로 구성될 수 있다. 일부 구체예에서, 상호작용 쌍의 첫 번째 구성원 및 두 번째 구성원은 동일한 면역글로불린 부류 및 아형으로부터 유래된 Fc 도메인을 포함한다. 다른 구체예에서, 상호작용 쌍의 첫 번째 구성원 및 두 번째 구성원은 상이한 면역글로불린 부류 또는 아형으로부터 유래된 Fc 도메인을 포함한다. 임의선택적으로, 상호작용 쌍 (가령, 비대칭 쌍 또는 비유도된 상호작용 쌍)의 첫 번째 구성원 및/또는 두 번째 구성원은 예로서, 면역글로불린의 변형된 Fc 부분을 비롯한, 면역글로불린의 변형된 불변 도메인을 포함한다. 가령, 본 발명의 단백질 복합체는 다음의 군: 서열 번호 34-46에서 선택되는 아미노산 서열과 최소한 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 IgG의 첫 번째 변형된 Fc 부분 및 다음의 군: 서열 번호 34-46에서 선택되는 아미노산 서열과 최소한 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, IgG의 첫 번째 변형된 Fc 부분의 아미노산 서열과 동일하거나 상이할 수 있는 IgG의 두 번째 변형된 Fc 부분을 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 상호작용 쌍의 첫 번째 구성원은 서열 번호: 39의 아미노산 서열과 최소한 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 임의선택적으로, 상호작용 쌍의 두 번째 구성원은 서열 번호: 40의 아미노산 서열과 최소한 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 다른 구체예에서, 상호작용 쌍의 첫 번째 구성원은 서열 번호: 40의 아미노산 서열과 최소한 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 임의선택적으로, 상호작용 쌍의 두 번째 구성원은 서열 번호: 39의 아미노산 서열과 최소한 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 상호작용 쌍의 첫 번째 구성원은 서열 번호: 41의 아미노산 서열과 최소한 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 임의선택적으로, 상호작용 쌍의 두 번째 구성원은 서열 번호: 42의 아미노산 서열과 최소한 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 다른 구체예에서, 상호작용 쌍의 첫 번째 구성원은 서열 번호: 42의 아미노산 서열과 최소한 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 임의선택적으로, 상호작용 쌍의 두 번째 구성원은 서열 번호: 41의 아미노산 서열과 최소한 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 상호작용 쌍의 첫 번째 구성원은 서열 번호: 43의 아미노산 서열과 최소한 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 임의선택적으로, 상호작용 쌍의 두 번째 구성원은 서열 번호: 44의 아미노산 서열과 최소한 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 다른 구체예에서, 상호작용 쌍의 첫 번째 구성원은 서열 번호: 44의 아미노산 서열과 최소한 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 임의선택적으로, 상호작용 쌍의 두 번째 구성원은 서열 번호: 43의 아미노산 서열과 최소한 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 상호작용 쌍의 첫 번째 구성원은 서열 번호: 45의 아미노산 서열과 최소한 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 임의선택적으로, 상호작용 쌍의 두 번째 구성원은 서열 번호: 46의 아미노산 서열과 최소한 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 다른 구체예에서, 상호작용 쌍의 첫 번째 구성원은 서열 번호: 46의 아미노산 서열과 최소한 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 임의선택적으로, 상호작용 쌍의 두 번째 구성원은 서열 번호: 45의 아미노산 서열과 최소한 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명은 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드의 아미노산 서열 및 비대칭 상호작용 쌍의 한 구성원의 아미노산 서열을 포함하는 융합 폴리펩티드를 제공한다. 이런 융합 단백질은 서열 번호: 1-33 중에서 한 가지의 아미노산 서열과 최소한 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 임의선택적으로, 융합 폴리펩티드는 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드의 아미노산 서열 및 비대칭 상호작용 쌍의 구성원의 아미노산 서열 사이에 배치된 링커 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 일정한 구체예에서, 비대칭 상호작용 쌍의 구성원은 면역글로불린의 불변 도메인, 예를 들면, 면역글로불린의 Fc 도메인을 포함한다. 가령, 본 발명의 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드 융합 단백질은 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 Fc 도메인으로부터 유래되는 아미노산 서열을 포함하는 비대칭 상호작용 쌍을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 융합 단백질의 비대칭 상호작용 쌍은 서열 번호: 34-46 중에서 한 가지와 최소한 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 상기 서열로 본질적으로 구성되거나, 또는 상기 서열로 구성된다. 일부 구체예에서, 융합 단백질의 비대칭 상호작용 쌍의 구성원은 서열 번호: 39-46 중에서 한 가지와 최소한 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 상기 서열로 본질적으로 구성되거나, 또는 상기 서열로 구성된다.
바람직하게는, 본 발명의 단백질 복합체는 GDF8, GDF-11, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 또는 액티빈 E로 구성된 군에서 선택되는 하나 또는 그 이상의 리간드에 결합한다. 임의선택적으로, 본 발명의 단백질 복합체는 이들 리간드 중에서 하나 또는 그 이상에 10-8, 10-9, 10-10, 10-11, 또는 10-12보다 크거나 또는 이와 동등한 KD로 결합한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 단백질 복합체는 GDF8, GDF-11, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 또는 액티빈 E로 구성된 군에서 선택되는 하나 또는 그 이상의 리간드에 의한 신호전달 (가령, SMADs 1, 2, 3, 5, 및/또는 8에 의한 신호전달)을 저해할 수 있다. 임의선택적으로, 본 발명의 단백질 복합체는 세포-기초된 검정에서 계측될 때, 이들 리간드 중에서 하나 또는 그 이상에 의한 신호전달 (가령, SMADs 1, 2, 3, 5, 및/또는 8에 의한 신호전달)을 저해할 수 있다.
임의선택적으로, 본 발명의 단백질 복합체는 선천적, 단위체성 폴리스타틴-관련된 펩티드와 비교하여 향상된 정제를 전시한다. 임의선택적으로, 본 발명의 단백질 복합체는 포유동물 (가령, 생쥐 또는 인간)에서 최소한 4, 6, 12, 24, 36, 48, 또는 72 시간의 혈청 반감기를 전시한다. 임의선택적으로, 본 발명의 단백질 복합체는 포유동물 (가령, 생쥐 또는 인간)에서 최소한 6, 8, 10, 12, 14, 20, 25, 또는 30 일의 혈청 반감기를 전시할 수 있다.
일정한 양상에서, 본 발명은 본원에서 개시된 첫 번째 및/또는 두 번째 폴리펩티드 중에서 한 가지를 인코딩하는 핵산을 제공한다. 본원에서 개시된 핵산은 발현을 위해 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있고, 그리고 본 발명은 이런 재조합 폴리뉴클레오티드로 형질전환된 세포를 더욱 제공한다. 바람직하게는, 세포는 포유류 세포, 예를 들면, COS 세포 또는 CHO 세포이다.
일정한 양상에서, 본 발명은 본원에서 개시된 첫 번째와 두 번째 폴리펩티드 중에서 한 가지뿐만 아니라 본 발명의 이런 첫 번째와 두 번째 폴리펩티드를 포함하는 단백질 복합체를 만들기 위한 방법을 제공한다. 이런 방법은 본원에서 개시된 핵산 중에서 한 가지를 적합한 세포 (가령, CHO 세포 또는 COS 세포)에서 발현하는 것을 포함할 수 있다. 이런 방법은 a) 세포를 본 발명의 첫 번째 및/또는 두 번째 폴리펩티드의 발현에 적합한 조건 하에 배양하고, 여기서 상기 세포는 첫 번째 및/또는 두 번째 폴리펩티드 발현 구조체로 형질전환되고; 그리고 b) 이렇게 발현된 첫 번째 및/또는 두 번째 폴리펩티드를 회수하는 것을 포함할 수 있다. 유사하게, 상기 방법은 a) 세포를 본 발명의 첫 번째와 두 번째 폴리펩티드의 발현에 적합한 조건 하에 배양하고, 여기서 상기 세포는 첫 번째와 두 번째 폴리펩티드 발현 구조체로 형질전환되고; 그리고 b) 이렇게 발현된 본 발명의 단백질 복합체를 회수하는 것을 포함할 수 있다. 본원에서 설명된 첫 번째 및/또는 두 번째 폴리펩티드뿐만 아니라 본 발명의 첫 번째와 두 번째 폴리펩티드를 포함하는 단백질 복합체는 세포 배양액으로부터 단백질을 획득하기 위한 널리 공지된 기술 중에서 한 가지를 이용하여, 미가공, 부분적으로 정제된, 또는 고도로 정제된 분획물로서 회수될 수 있다.
본원에서 설명된 단백질 복합체 중에서 한 가지가 제약학적 제조물 내로 통합될 수 있다. 임의선택적으로, 이런 제약학적 제조물은 다른 폴리펩티드 성분에 대하여 최소한 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 순수하다. 일부 구체예에서, 본원에서 설명된 제약학적 제조물은 첫 번째 또는 두 번째 폴리펩티드의 자가 결합에 의해 형성된 20%, 15%, 10%, 5%, 3%, 2%, 또는 1%보다 적은 동종이합체를 포함한다. 임의선택적으로, 본원에서 개시된 제약학적 제조물은 하나 또는 그 이상의 추가 활성제를 포함할 수 있다.
일정한 양상에서, 예로서 본원에서 개시된 폴리스타틴-관련된 융합 폴리펩티드를 포함하는 다양한 단백질 복합체를 비롯한 본 발명의 조성물은 폴리스타틴-관련된 융합 폴리펩티드 및/또는 폴리스타틴 리간드 (가령, 미오스타틴, 액티빈, GDF11)의 비정상적인 활성과 연관되는 질환 또는 장애를 치료하거나 예방하는데 이용될 수 있다. 이들 질환, 장애 또는 상태는 일반적으로 본원에서 "폴리스타틴-연관된 질환"으로서 지칭된다. 일정한 구체예에서, 본 발명은 본원에서 설명된 단백질 복합체의 치료 효과량을 개체에 투여하는 것을 통해 치료가 필요한 개체를 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다. 이들 방법은 특히, 동물, 더욱 구체적으로, 인간의 치료적 및 예방적 처치를 목표로 한다.
도면의 간단한 설명
도면 1은 Clustal 2.1을 이용하여 인간 IgG 아이소타입으로부터 Fc 도메인의 복수 서열 정렬을 보여준다. 힌지 영역은 점선 밑줄에 의해 표시된다. 이중 밑줄은 비대칭 사슬 짝짓기를 증진하기 위해 IgG1 Fc (서열 번호: 34)에서 가공될 수 있는 위치 및 다른 아이소타입 (서열 번호: 35, 36, 38)에 대하여 상응하는 위치의 실례를 지시한다.
도면 2는 치료적 용도를 위한 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드를 포함하는 이형화학 단백질 복합체의 계통적 실례를 보여준다. "폴리스타틴-관련된 폴리펩티드" (A)는 "상호작용 쌍의 첫 번째 구성원" (B)의 C 말단, 또는 N 말단에 배치될 수 있다. 링커뿐만 아니라 다른 아미노산 서열이 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드 및 상호작용 쌍의 첫 번째 구성원 사이에 배치될 수 있다. 상호작용 쌍의 첫 번째와 두 번째 구성원 (B, C)은 비대칭 쌍일 수 있는데, 이것은 상기 쌍의 구성원들이 자가 연관보다는 서로에 우선적으로 연관된다는 것을 의미하고, 또는 상호작용 쌍은 비유도될 수 있는데, 이것은 상기 쌍의 구성원들이 실제적인 선호 없이 서로 연관되거나 또는 자가-연관될 수 있고 동일하거나 상이한 아미노산 서열을 가질 수 있다는 것을 의미한다. 전통적인 Fc 융합 단백질 및 항체는 비유도된 상호작용 쌍의 실례이고, 반면 다양한 가공된 Fc 도메인은 비대칭 상호작용 쌍으로서 설계되었다. 두 번째 폴리펩티드에서, 추가 아미노산이 상호작용 쌍의 두 번째 구성원의 C 말단 또는 N 말단에 배치될 수 있고, 그리고 이런 아미노산은 생물학적 활성을 부여하거나 또는 부여하지 않을 수 있지만, 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드에 이종성일 것이고, 그리고 바람직하게는, 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드가 아니다.
발명의 상세한 설명
1. 개요
A. TGFβ 상과 리간드에 의한 조직 항상성의 조절
TGFβ 상과 신호전달 경로는 근육, 뼈, 지방 조직, 췌장 기능, 조혈 세포 등을 비롯한 다양한 세포 유형 및 조직의 출생전 및 출생후 조절에 대해 결정적이다. 본원에서 설명된 단백질 복합체는 예로서, 액티빈 군, 성장 및 분화 인자 (GDF) 군, 뼈 형성 단백질 (BMP) 군의 구성원 또는 상과의 하나 또는 그 이상의 다른 구성원을 비롯한, TGFβ 상과의 하나 또는 그 이상의 리간드에 결합할 수 있다. MSTN 유전자에 의해 인코딩되고 성장 분화 인자-8 (GDF8)로서 또한 알려져 있는 상과 리간드 미오스타틴은 골격근량의 내인성 저해제로서 폭넓게 인식된다. Mstn의 결실에 동형접합성인 생쥐는 증가된 섬유 숫자 및 근섬유 비대의 조합으로 인해 골격근량에서 견실한 증가를 전시한다 [McPherron et al. (1997) Nature 387:83-90]. 미오스타틴 신호전달의 선택적 출생후 상실은 유의미한 근섬유 비대를 유발하고, 따라서 미오스타틴이 성체에서 근육 항상성의 중요한 조절인자이라는 것을 지시한다 [Lee et al. (2010) Mol Endocrinol 24:1998-2008]. 미오스타틴의 자연발생 돌연변이는 인간, 소, 양 및 개에서 증가된 골격근량과 연관된다. 가령, 피에몬테 및 벨기안 블루 소 종족은 근육량에서 현저한 증가를 유발하는 MSTN에서 기능 상실 돌연변이를 보유한다 [Grobet et al. (1997) Nat Genet 17:71-74]. 인간에서, MSTN의 비활성 대립형질은 증가된 근육량 및 보고된 바에 따르면, 이례적인 강도와 연관된다 [Schuelke et al (2004) N Engl J Med 2004, 350:2682-8]. 반대로, 인간 면역결핍 바이러스에 의한 감염과 연관된 인간에서 근육 쇠약은 증가된 MSTN 발현을 동반한다 [Gonzalez-Cadavid et al. (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95:14938-14943].
미오스타틴 활성의 저해는 심신쇠약성 근육 상실과 연관된 유전된 및 획득된 임상적 상태를 갖는 환자에서 근육량 및 강도를 증가시키기 위한 효과적인 전략일 수 있다 [Lee (2004) Annu Rev Cell Dev Biol 20:61-86; Tsuchida (2008) Curr Opin Drug Discov Dev 11:487-494; Rodino-Klapac et al. (2009) Muscle Nerve 39:283-296]. 근육병의 생쥐 모형을 이용한 연구는 미오스타틴 신호전달의 상실이 근이영양증, 척수 근위축증, 악액질, 스테로이드-유도된 근병증 및 연령-관련된 근육감소증을 비롯한 넓은 범위의 질환 세팅에서 유익한 효과를 갖는다는 것을 제안하였다. 게다가, 미오스타틴 신호전달의 상실은 대사성 질환의 모형에서 지방 축적을 감소시키고 글루코오스 물질대사를 향상시켜, 표적화 미오스타틴이 질환, 예를 들면, 비만 및 2형 당뇨병에도 적용될 수 있는 가능성을 올리는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 생체내에서 미오스타틴 신호전달의 치료적 저해를 위한 방법을 확인하는데 상당한 관심이 존재한다.
다른 상과 리간드와 마찬가지로, 미오스타틴은 신호 펩티드, N 말단 프로도메인 및 C 말단 성숙 도메인으로 구성되는 전구체로서 합성된다. 합성 동안, 미오스타틴 프로도메인은 성숙 미오스타틴을 이합체화를 용이하게 하는 입체형태에서 유지하기 위해 이들 분자와 비공유적으로 상호작용한다 [Harrison et al (2011) Growth Factors 29:174-186]. 이합체성 전구체의 개열 후, 쌍둥이 프로도메인은 초기에 성숙 단백질에 부착된 상태로 남아있고, 잠복성 복합체를 형성한다 [(Miyazono et al (1988) J Biol Chem 263:6407-6415; Wakefield et al (1988) J Biol Chem 263:7646-7654; Brown et al (1990) Growth Factors 3:35-43]. 대부분의 TGFβ 리간드보다 더욱 큰 정도까지, 분비된 미오스타틴은 잠복성 또는 반잠복성 형태에서 초기에 존재하고, 이의 활성은 다른 인자에 의해 이후에 드러날 수 있다 [Wolfman et al (2003) Proc Natl Acad Sci USA 100:15842-15846; Szlama et al (2013) FEBS J 280:3822-3839]. 잠복성 미오스타틴은 세포외 공간에 있는데, 여기서 프로도메인은 기질 단백질과 상호작용하여 미오스타틴 생체이용률을 조절하고 [Anderson et al (2008) J Biol Chem 283:7027-7035; Sengle et al (2011) J Biol Chem 286:5087-5099], 또는 순환에 들어가는데, 여기서 대다수의 미오스타틴은 이러한 잠복성 형태에서 존재한다 [Hill et al (2002) J Biol Chem 277:40735-40741]. 세포외 구획에서, 미오스타틴 프로도메인 및 프로테오글리칸 퍼레칸의 상호작용은 표적 세포에 근접한 잠복성 복합체의 농도를 증가시킨다. 잠복성 미오스타틴은 세포외 기질에서 위치된 금속단백분해효소에 의해 연관된 프로도메인 중에서 어느 하나 또는 둘 모두의 부위 특이적 개열에 의해 활성 형태로 전환된다 [Wolfman et al (2003) Proc Natl Acad Sci USA 100:15842-15846].
일단 프로도메인으로부터 방출되면, 미오스타틴은 액티빈 유형 II 수용체 (ActRIIA 또는 ActRIIB) 및 액티빈 유형 I 수용체 (일반적으로 ALK4 또는 ALK7)를 통합하는 삼원 복합체의 형성을 유도함으로써 이의 세포 효과를 발휘한다. 이들 활성화된 수용체 복합체는 차례로, Smad 단백질 (Smad2 및 Smad3, Smad2/3)을 인산화하는데, 이것은 Smad 단백질이 특정한 표적 유전자의 발현을 조절하는 Smad4와의 전사 복합체를 형성할 수 있게 한다 [가령, Mathews and Vale (1991) Cell 65:973-982; Attisano et al. (1992) Cell 68: 97-108; Massague (2000) Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1:169-178을 참조한다]. 유형 I 및 유형 II 수용체는 시스테인-풍부한 영역을 갖는 리간드-결합 세포외 도메인, 막경유 도메인, 그리고 예측된 세린/트레오닌 특이성을 갖는 세포질 도메인으로 구성된 막경유 단백질이다. 유형 II 수용체는 리간드에 결합하는데 필요하고, 반면 유형 I 수용체는 신호전달에 필수적이다.
비록 미오스타틴이 최고의 확립된 사례이긴 하지만, ActRIIA 및/또는 ActRIIB를 통해 신호하는 하나 또는 그 이상의 추가 리간드 역시 근육 비대의 내인성 저해제로서 연루되었다 [Lee et al (2005) Proc Natl Acad Sci USA 102:18117-18122]. 액티빈은 TGFβ 상과 및 내에 이합체성 리간드의 패밀리이고 인히빈-β 아단위로 구성된다. 구체적으로, 액티빈은 동종이합체성 형태 액티빈 A (βAβA), 액티빈 B (βBβB), 액티빈 C (βCβC) 및 액티빈 E (βEβE)뿐만 아니라 액티빈 AB (βAβB) 및 βC 또는 βE를 내포하는 이형이합체를 비롯한 이형이합체성 형태를 포함한다. 이에 더하여, 구조적으로 관련된 이형이합체 인히빈은 다양한 조직에서 액티빈 신호전달의 중요한 저해성 조절인자이다.
액티빈은 다양한 생리학적 및 병리학적 역할을 수행한다. 복수 라인의 증거는 액티빈이 근육량을 제한하는데 미오스타틴과 협력하여 기능하고, 그리고 액티빈 길항제가 생체내에서 근육 성장을 증진하거나 또는 근육 상실을 상쇄시킬 수 있다는 것을 암시한다. [Link et al (1997) Exp Cell Res 233:350-362; He et al (2005) Anat Embryol (Berl) 209:401-407; Souza et al (2008) Mol Endocrinol 22:2689-2702; Gilson et al (2009) Am J Physiol Endocrinol Metab 297:E157-E164; Lee et al (2010) Mol Endocrinol 24:1998-2008; Zhou et al. (2010) Cell 142:531-43]. 액티빈은 뼈 항상성에서 주요한 역할을 수행하고 적혈구생성의 조절인자로서 연루된다 [Maguer-Satta et al (2003) Exp Cell Res 282:110-120; Fields et al (2013) Expert Opin Investig Drugs 22:87-101]. 최근 연구는 상처 치유, 혈관형성, 염증, 면역성, 섬유증 및 암에서 액티빈의 역할을 암시하였다 [Antsiferova et al (2012) J Cell Sci 125:3929-3937]. 액티빈/인히빈 신호전달 경로는 난소, 고환 및 부신의 암과 연관된다. 이에 더하여, 액티빈 A는 간세포 증식의 주요 저해성 조절인자이고, 그리고 조절장애된 액티빈 신호전달은 염증, 섬유증, 간부전 및 암을 비롯한 간 질환에 연루되었다 [Kreidl et al (2009) World J Hepatol 1:17-27]. 액티빈의 다른 기능은 중배엽 분화의 유도, 세포 주기의 조정, 뉴런 세포 생존의 지원, 그리고 내분비 세포 활성의 조화를 포함한다 [DePaolo et al. (1991) Proc Soc Exp Biol Med 198:500-512; Dyson et al (1997) Curr Biol 7:81-84; Woodruff (1998) Biochem Pharmacol 55:953-963].
본원에서 설명된 바와 같이, "액티빈 A"에 결합하는 작용제는 단리된 βA 아단위의 맥락에서 또는 이합체성 복합체 (가령, βAβA 동종이합체 또는 a βAβB 이형이합체)로서 인지에 상관없이, βA 아단위에 특이적으로 결합하는 작용제이다. 이형이합체 복합체 (가령, βAβB 이형이합체)의 경우에, "액티빈 A"에 결합하는 작용제는 βA 아단위 내에 존재하는 에피토프에 특이적이지만, 복합체의 비-βA 아단위 (가령, 복합체의 βB 아단위) 내에 존재하는 에피토프에 결합하지 않는다. 유사하게, "액티빈 A"에 길항작용하는 (저해하는) 본원에서 개시된 작용제는 단리된 βA 아단위의 맥락에서 또는 이합체성 복합체 (가령, βAβA 동종이합체 또는 βAβB 이형이합체)로서 인지에 상관없이, βA 아단위에 의해 매개되는 하나 또는 그 이상의 활성을 저해하는 작용제이다. βAβB 이형이합체의 경우에, "액티빈 A"를 저해하는 작용제는 βA 아단위의 하나 또는 그 이상의 활성을 특이적으로 저해하지만, 복합체의 비-βA 아단위 (가령, 복합체의 βB 아단위)의 활성을 저해하지 않는 작용제이다. 이러한 원리는 "액티빈 B", "액티빈 C" 및 "액티빈 E"에 결합하고 및/또는 이를 저해하는 작용제에도 적용된다. "액티빈 AB"에 길항작용하는 본원에서 개시된 작용제는 βA 아단위에 의해 매개된 하나 또는 그 이상의 활성 및 βB 아단위에 의해 매개된 하나 또는 그 이상의 활성을 저해하는 작용제이다.
뼈 형성 단백질-11 (BMP11)로서 또한 알려져 있는 성장 분화 인자-11 (GDF11)은 생쥐 발달 동안 미아, 지아, 상악골 및 하악궁, 그리고 배근 신경절에서 발현된다 [가령, Nakashima et al. (1999) Mech. Dev. 80: 185-189를 참조한다]. GDF11은 중배엽 및 신경 조직 둘 모두를 패턴화하는데 있어서 독특한 역할을 수행하고 [가령, Gamer et al. (1999) Dev Biol., 208:222-32를 참조한다], 그리고 발달 중인 병아리 사지에서 연골형성 및 근육발생의 음성 조절인자이다 [가령, Gamer et al. (2001) Dev Biol. 229:407-20을 참조한다]. 뇌에서 GDF11의 발현은 GDF11이 신경 활성을 또한 조절할 수 있고, 그리고 GDF11이 후각 상피에서 신경발생을 저해한다는 것을 암시한다 [가령, Wu et al. (2003) Neuron. 37:197-207을 참조한다]. 최근 연구는 GDF11을 적혈구생성에서, 특히 후기 단계 적혈구 분화 동안 중요한 조절 신호로서 암시한다 [Suragani et al (2014) Nat Med 20:408-414]. 이에 더하여, GDF11은 미오스타틴에 구조적 유사성, 공유된 신호전달 성분, 그리고 골격근에서 GDF11 발현에 근거하여 근육 비대의 잠재적 저해제로서 조사되었다 [McPherron et al. (1999) Nat. Genet. 22: 260-264]. 비록 GDF11이 미오스타틴과 마찬가지로, 프로도메인을 갖는 잠복성 복합체로 전신 순환에서 검출가능하고 근육 세포 분화를 탈체에서 저해하지만 [Souza et al (2008) Mol Endocrinol 22:2689-2702], 유전자 연구는 심지어 미오스타틴 결함의 조건 아래에서도, 근육 크기, 섬유 숫자, 또는 섬유 유형을 조절하는데 있어서 GDF11의 역할을 드러내지 않았다 [McPherron et al (2009) BMC Devel Biol 9:24]. 따라서, GDF11이 근육량의 조절에 기여하는 지의 여부가 확고히 결정될 필요가 있다.
B. TGFβ 상과 리간드의 세포외 저해제
상기 논의된 리간드-연관된 프로도메인에 더하여, 여러 다른 선천적 단백질은 세포외에서 TGFβ 상과 리간드를 저해하고, 그리고 따라서, 이들 리간드의 활성을 결정적인 방식으로 조절한다. 인간에서, 미오스타틴, 액티빈 및 GDF11의 가용성 내인성 저해제는 유장 산성 단백질 도메인 (W), 폴리스타틴-Kazal 도메인 (F), 면역글로불린 도메인 (I), 쿠니츠-유형 단백질분해효소 저해제 모듈에 관련된 2개의 탠덤 도메인 (KK) 및 네트린 도메인 (N)을 포함하는 그들의 공유된 도메인 구조에 근거하여, 복수 폴리스타틴 동종형, FLRG로서 알려져 있는 폴리스타틴-유사 유전자 (FSTL3)의 산물, 그리고 WFIKKN1 및 WFIKKN2로 명명된 한 쌍의 밀접하게 관련된 단백질을 포함한다. 폴리스타틴, FLRG, WFIKKN1 및 WFIKKN2 폴리펩티드는 각각, TGFβ 상과 리간드에 대한 선별적인 결합에 중요한 일반적으로 "폴리스타틴 도메인"으로서 지칭되는 하나 또는 그 이상의 구조적 모티프를 내포한다. 이런 이유로, 본원에서 개시된 바와 같이, 용어 "폴리스타틴-관련된 폴리펩티드"는 예로서, 선천적 폴리스타틴, FLRG, WFIKKN1 및 WFIKKN2 서열뿐만 아니라 이들의 변이체 및 절두를 포함한다.
미오스타틴, 액티빈 및/또는 GDF11의 세포외 저해제 중에서 최고로 연구된 것은 폴리스타틴인데, 이의 단일 유전자 (FST)로부터 복수 동종형이 산출된다. 폴리스타틴은 고등 동물의 거의 모든 조직에서 발현되는 자가분비 당단백질이다. 이것은 초기에, 여포성 유체로부터 단리되었고, 그리고 앞쪽 뇌하수체로부터 난포-자극 호르몬 (FSH) 분비를 저해하는 단백질 분획물로서 확인되었다 [Esch et al. (1987) Mol Endocrinol 1:849-855]. TGFβ 상과 신호전달에서 폴리스타틴의 중요성은 폴리스타틴-결함성 생쥐에서 관찰된 복수 결함 및 출생전후 사망에 의해 예시된다 [Matzuk et al (1995) Nature 374:360-363]. 출생후에, 폴리스타틴은 미오스타틴 및 액티빈 [Lee et al (2010) Mol Endocrinol 24:1998-2008], 그리고 잠재적으로 GDF11을 저해함으로써 근육 성장을 증진한다. 폴리스타틴의 생물학적 활성은 이들 리간드에 높은 친화성으로 결합하고, 그리고 따라서, 리간드 및 이의 세포 표면 수용체 - ActRIIA 또는 ActRIIB의 상호작용을 예방하는 이의 능력에 기인하다 [Nakamura et al (1990) Science 247:836-838; Kogawa et al (1991) Endocrinology 128:1434-1440; Schneyer et al (1994) Endocrinology 135:667-674; de Winter et al (1996) Mol Cell Endocrinol 116:105-114; Thompson et al (2005) Dev Cell 9:535-543]. 이에 더하여, 폴리스타틴은 일부 동종형에서 세포 표면에서 프로테오글리칸과의 폴리스타틴 상호작용을 용이하게 하고 [Inouye et al (1992) Mol Cell Endocrinol 90:1-6], 따라서 리간드 작용의 부위 인근에서 폴리스타틴의 더욱 높은 농도를 유지시키는 헤파린-결합 도메인을 내포한다. 게다가, 미오스타틴에 폴리스타틴 (FST288)의 결합은 헤파린에 대한 폴리스타틴의 친화성을 실제적으로 증가시키고 [Cash et al (2009) EMBO J 28:2662-2676], 따라서 리간드 결합이 폴리스타틴-미오스타틴 복합체의 세포 표면 국부화를 증진한다는 것을 암시한다.
폴리스타틴은 "폴리스타틴 도메인"으로서 알려져 있는 특유한 구조적 모티프의 3개 반복부를 내포하는데, 상기 도메인은 10개 시스테인의 보존된 선형 패턴을 포괄하고 분자내 이황화 결합의 특징적인 배열을 형성한다 [Esch et al. (1987) Mol Endocrinol 1:849-855]. 본원에서 폴리스타틴 도메인은 시스테인-풍부한 반복부에 의해 특징화되는 아미노산 도메인, 또는 이러한 아미노산 도메인을 인코딩하는 핵산 서열로서 규정된다. 폴리스타틴 도메인은 65-90개 아미노산의 스팬을 전형적으로 포괄하고, 그리고 10개의 보존된 시스테인 잔기 및 Kazal 세린 단백질분해효소 저해제 도메인과 유사한 영역을 내포한다. 따라서, 폴리스타틴 도메인은 때때로, "폴리스타틴/Kazal 도메인" 또는 "폴리스타틴/Kazal-유사 도메인"으로서 지칭된다. 일반적으로, 이들 시스테인 잔기 사이에 루프 영역은 서열 가변성을 전시하지만, 일부 보존이 존재한다. 네 번째 및 다섯 번째 시스테인 사이에 루프는 통상적으로 짧고, 단지 1개 또는 2개의 아미노산만을 내포한다. 일곱 번째 및 여덟 번째 시스테인 사이의 루프 내에 아미노산은 일반적으로 가장 고도로 보존되고, (G,A)-(S,N)-(S,N,T)-(D,N)-(G,N) 그 이후에 (T,S)-Y 모티프의 공통 서열을 내포한다. 아홉 번째 및 열 번째 시스테인 사이의 영역은 일반적으로, 다른 아미노산에 의해 분리된 2개의 소수성 잔기 (구체적으로 V, I, 또는 L)를 통합하는 모티프를 내포한다.
용어 "폴리스타틴 폴리펩티드"는 폴리스타틴 패밀리의 임의의 자연발생 폴리펩티드뿐만 아니라 예로서, 리간드 결합 (가령, 미오스타틴, GDF11, 액티빈 A, 액티빈 B)을 비롯한 유용한 활성을 유지하는 이들의 임의의 변이체 (돌연변이체, 단편, 융합 및 펩티드모방체 형태 포함)를 포함하는 폴리펩티드를 지칭하는데 이용된다. 가령, 폴리스타틴 폴리펩티드는 폴리스타틴 폴리펩티드의 서열 (서열 번호: 1-17)과 최소한 약 80% 동일한, 그리고 바람직하게는 서열 번호: 1-17 중에서 한 가지에 최소한 85%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 그 이상 동일한 서열을 갖는 임의의 공지된 폴리스타틴의 서열로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 용어 "폴리스타틴 융합 폴리펩티드"는 이종성 (비-폴리스타틴) 부분과 함께 전술한 폴리펩티드 중에서 한 가지를 포함하는 융합 단백질을 지칭할 수 있다. 아미노산 서열은 이것이 서열 번호:3에 의해 대표된, 인간 폴리스타틴의 긴 (315개 아미노산) 형태에서 독특하게 발견되지 않으면, 폴리스타틴에 이종성인 것으로 이해된다. 이종성 부분의 많은 실례가 본원에서 제공되고, 그리고 이런 이종성 부분은 아미노산 서열에 의해 융합 단백질의 폴리스타틴 폴리펩티드 부분에 바로 인접하거나, 또는 개재성 아미노산 서열, 예를 들면, 링커 또는 다른 서열에 의해 분리될 수 있다. 이에 더하여, 폴리펩티드의 라이브러리를 만들고 시험하기 위한 방법이 본원에서 설명되고, 그리고 이런 방법은 또한, 폴리스타틴의 변이체를 만들고 시험하는 것과 관련된다.
폴리스타틴은 상기 단백질의 대안적 mRNA 스플라이싱 및 가변적 당화에 근거하여, 31 내지 49 kDa의 다양한 분자량을 갖는 단일 사슬 폴리펩티드이다. 폴리스타틴 유전자로부터 대안으로 스플라이싱된 mRNAs는 288개 아미노산 (다시 말하면, FST288) 및 315개 아미노산 (다시 말하면, FST315)의 동종형을 인코딩하고, 그리고 후자는 단백질분해적으로 처리되어 또 다른 동종형, 폴리스타틴 303 (FST303)을 산출할 수 있다. 선천적 인간 폴리스타틴 폴리펩티드의 아미노산 서열의 분석은 이것이 5개 도메인: 신호 서열 (서열 번호:1의 아미노산 1-29), N 말단 도메인 (FSTND) (서열 번호:1의 아미노산 30-94), 폴리스타틴 도메인-1 (FSTFD1) (서열 번호:1의 아미노산 95-164), 폴리스타틴 도메인-2 (FSTFD2) (아미노산 (서열 번호:1의 168-239), 그리고 폴리스타틴 도메인-3 (FSTFD3) (서열 번호:1의 아미노산 245-316)을 포함한다는 것을 드러냈다. Shimanski et al (1988) Proc Natl Acad Sci USA 85:4218-4222를 참조한다.
인간 폴리스타틴-288 (FST288) 전구체는 다음의 아미노산 서열 (서열 번호: 1) (NCBI 참조 서열 NP_006341; Uniprot P19883-2)을 갖는데, 신호 펩티드는 점선 밑줄에 의해 지시되고, N 말단 도메인 (FSTND)은 파선 밑줄에 의해 지시되고, 그리고 폴리스타틴 도메인 1-3 (FSTFD1, FSTFD2, FSTFD3)은 실선 밑줄에 의해 지시된다.
Figure pct00001
성숙 (처리된) 인간 폴리스타틴 변이체 FST288은 다음의 아미노산 서열 (서열 번호: 2)을 갖는데, N 말단 도메인은 파선 밑줄에 의해 지시되고 폴리스타틴 도메인 1-3은 실선 밑줄에 의해 지시된다. 게다가, 첫 번째 시스테인에 앞서, 초기 아미노산 G 또는 N 중에서 하나가 처리에 의해 제거되거나 또는 임의의 결과 없이 의도적으로 제거될 수 있고, 그리고 이런 약간 더 작은 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드가 더욱 포함되는 것으로 인지될 것이다.
Figure pct00002
인간 폴리스타틴-315 (FST315) 전구체는 다음의 아미노산 서열 (서열 번호: 3) (NCBI 참조 서열 NP_037541.1; Uniprot P19883)을 갖는데, 신호 펩티드는 점선 밑줄에 의해 지시되고, N 말단 도메인 (FSTND)은 파선 밑줄에 의해 지시되고, 그리고 폴리스타틴 도메인 1-3 (FSTFD1, FSTFD2, FSTFD3)은 실선 밑줄에 의해 지시된다.
Figure pct00003
(서열 번호:3)
성숙 (처리된) 인간 FST315은 다음의 아미노산 서열 (서열 번호: 4)을 갖는데, N 말단 도메인은 파선 밑줄에 의해 지시되고 폴리스타틴 도메인 1-3은 실선 밑줄에 의해 지시된다. 게다가, 첫 번째 시스테인에 앞서, 초기 아미노산 G 또는 N 중에서 하나가 처리에 의해 제거되거나 또는 임의의 결과 없이 의도적으로 제거될 수 있고, 그리고 이런 약간 더 짧은 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드가 더욱 포함되는 것으로 인지될 것이다.
Figure pct00004
본 발명의 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드는 폴리스타틴 단백질의 임의의 자연발생 도메인뿐만 아니라 유용한 활성을 유지하는 이들의 변이체 (가령, 돌연변이체, 단편 및 펩티드모방체 형태)를 포함할 수 있다. 가령, FST315 및 FST288은 미오스타틴, 액티빈 (액티빈 A 및 액티빈 B) 및 GDF11에 대한 높은 친화성을 갖는 것으로 널리 알려져 있고, 그리고 폴리스타틴 도메인 (가령, FSTND, FSTFD1, FSTFD2 및 FSTFD3)은 이런 TGFβ 리간드의 결합에 관련된 것으로 생각된다. 하지만, 이들 4개의 도메인 각각이 이들 TGF-β 리간드에 대한 상이한 친화성을 갖는다는 증거가 있다. 가령, 최근 연구는 N 말단 도메인 및 2개의 FSTFD1 도메인만을 나란히 포함하는 폴리펩티드 구조체가 미오스타틴에 대한 높은 친화성을 유지하고, 액티빈에 대한 친화성을 거의 또는 전혀 나타내지 않고, 그리고 생쥐 내로 도입될 때 유전자 발현에 의해 전신 근육 성장을 증진한다는 것을 증명하였다 [Nakatani et al (2008) FASEB 22:478-487]. 따라서, 본 발명은 부분적으로, 자연발생 FST 단백질에 비하여 소정의 TGFβ 리간드의 선별적인 결합 및/또는 저해를 보여주는 (가령, 액티빈에 대한 유의미하게 감소된 친화성을 가지면서, 미오스타틴에 대한 높은 친화성을 유지하는) 변이체 폴리스타틴 단백질을 포괄한다.
일정한 양상에서, 본 발명은 아래에 진술된 바와 같은, FSTND 도메인 (서열 번호: 5) 및 예로서, 하나 또는 그 이상의 이종성 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드를 포함하고, 그리고 게다가, 첫 번째 시스테인에 앞서, 초기 아미노산 G 또는 N 중에서 하나가 아래에 도시된 실례 (서열 번호: 6)에서처럼 결실될 수 있는 것으로 인지될 것이다.
1 GNCWLRQAKN GRCQVLYKTE LSKEECCSTG RLSTSWTEED VNDNTLFKWM
51 IFNGGAPNCI PCKET (서얼 번호: 5)
1 CWLRQAKNGR CQVLYKTELS KEECCSTGRL STSWTEEDVN DNTLFKWMIF
51 NGGAPNCIPC KET (서얼 번호: 6)
일정한 양상에서, 본 발명은 아래에 진술된 바와 같은 헤파린 결합과 함께 미오스타틴 (및/또는 GDF11) 결합의 최소 코어 활성을 내포하는 FSTFD1 도메인 (서열 번호: 7) 및 예로서, 하나 또는 그 이상의 이종성 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드를 포함한다.
1 CENVDCGPGK KCRMNKKNKP RCVCAPDCSN ITWKGPVCGL DGKTYRNECA
51 LLKARCKEQP ELEVQYQGRC (서얼 번호: 7)
일정한 양상에서, 본 발명은 아래에 진술된 바와 같은 FSTFD2 도메인 (서열 번호: 8) 및/또는 FSTFD3 도메인 (서열 번호: 9) 및 예로서, 하나 또는 그 이상의 이종성 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드를 포함한다.
1 CRDVFCPGSS TCVVDQTNNA YCVTCNRICP EPASSEQYLC GNDGVTYSSA
51 CHLRKATCLL GRSIGLAYEG KC (서얼 번호: 8)
1 CEDIQCTGGK KCLWDFKVGR GRCSLCDELC PDSKSDEPVC ASDNATYASE
51 CAMKEAACSS GVLLEVKHSG SC (서얼 번호: 9)
FSTFD1 서열은 FSTND 도메인을 더욱 포함하는 폴리펩티드로서 발현에 의해 구조적 맥락에서 유리하게 유지될 수 있다. 따라서, 본 발명은 아래에 진술된 바와 같은 FSTND-FSTFD1 서열 (서열 번호:10) 및 예로서, 하나 또는 그 이상의 이종성 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드를 포함하고, 그리고 게다가, 첫 번째 시스테인에 앞서, 초기 아미노산 G 또는 N 중에서 하나가 처리에 의해 제거되거나 또는 임의의 결과 없이 의도적으로 제거될 수 있고, 그리고 이런 약간 더 짧은 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드가 더욱 포함되는 것으로 인지될 것이다.
1 CWLRQAKNGR CQVLYKTELS KEECCSTGRL STSWTEEDVN DNTLFKWMIF
51 NGGAPNCIPC KETCENVDCG PGKKCRMNKK NKPRCVCAPD CSNITWKGPV
101 CGLDGKTYRN ECALLKARCK EQPELEVQYQ GRC (서얼 번호: 10)
Nakatani 등에 의해 증명된 바와 같이, FSTND-FSTFD1-FSTFD1 구조체는 생쥐에서 유전적으로 발현될 때 전신 근육 성장을 부여하는데 충분하고, 그리고 따라서, 본 발명은 아래의 아미노산 서열 (서열 번호: 11) 및 예로서, 하나 또는 그 이상의 이종성 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드를 포함한다.
1 CWLRQAKNGR CQVLYKTELS KEECCSTGRL STSWTEEDVN DNTLFKWMIF
51 NGGAPNCIPC KETCENVDCG PGKKCRMNKK NKPRCVCAPD CSNITWKGPV
101 CGLDGKTYRN ECALLKARCK EQPELEVQYQ GRCCENVDCG PGKKCRMNKK
151 NKPRCVCAPD CSNITWKGPV CGLDGKTYRN ECALLKARCK EQPELEVQYQ
201 GRC (서열 번호: 11)
FSTFD1 서열이 미오스타틴 및 GDF11 결합을 부여하긴 하지만, 액티빈, 특히 액티빈 A뿐만 아니라 액티빈 B 또한 근육의 음성 조절인자이고, 그리고 이런 이유로, 미오스타틴/GDF11 리간드 군 및 액티빈 A/액티빈 B 리간드 군 둘 모두를 저해하는 폴리스타틴 폴리펩티드는 더욱 강력한 근육 효과를 제공할 수 있는 것으로 증명되었다. FSTFD2가 액티빈 A 및 B 결합을 부여한다는 점을 고려하면, 본 발명은 FSTFD1-FSTFD2 (서열 번호: 12) 및 FSTFD1-FSTFD2-FSTFD3 (서열 번호: 13)을 포함하는 폴리펩티드뿐만 아니라 FSTND-FSTFD1-FSTFD2 (서열 번호: 14) 및 예로서, 하나 또는 그 이상의 이종성 폴리펩티드를 포함하는 구조체를 제공한다.
1 CENVDCGPGK KCRMNKKNKP RCVCAPDCSN ITWKGPVCGL DGKTYRNECA
51 LLKARCKEQP ELEVQYQGRC CRDVFCPGSS TCVVDQTNNA YCVTCNRICP
101 EPASSEQYLC GNDGVTYSSA CHLRKATCLL GRSIGLAYEG KC
(서열 번호: 12)
1 CENVDCGPGK KCRMNKKNKP RCVCAPDCSN ITWKGPVCGL DGKTYRNECA
51 LLKARCKEQP ELEVQYQGRC CRDVFCPGSS TCVVDQTNNA YCVTCNRICP
101 EPASSEQYLC GNDGVTYSSA CHLRKATCLL GRSIGLAYEG KCCEDIQCTG
151 GKKCLWDFKV GRGRCSLCDE LCPDSKSDEP VCASDNATYA SECAMKEAAC
201 SSGVLLEVKH SGSC (서열 번호: 13)
1 CWLRQAKNGR CQVLYKTELS KEECCSTGRL STSWTEEDVN DNTLFKWMIF
51 NGGAPNCIPC KETCENVDCG PGKKCRMNKK NKPRCVCAPD CSNITWKGPV
101 CGLDGKTYRN ECALLKARCK EQPELEVQYQ GRCCRDVFCP GSSTCVVDQT
151 NNAYCVTCNR ICPEPASSEQ YLCGNDGVTY SSACHLRKAT CLLGRSIGLA
201 YEGKC (서열 번호: 14)
291개 아미노산의 폴리스타틴 폴리펩티드 (자연발생 FST315의 절두를 나타냄)는 일정한 구체예에서 유리한 성질을 가질 수 있다. 따라서, 처리되지 않은 (서열 번호: 15) 및 성숙 FST291 (서열 번호: 16) 폴리펩티드는 본 발명 내에 포함되고 이종성 단백질과 합동될 수 있다. 게다가, 첫 번째 시스테인에 앞서, 초기 아미노산 G 또는 N 중에서 하나가 처리에 의해 제거되거나 또는 임의의 결과 없이 의도적으로 제거될 수 있고, 그리고 이런 약간 더 짧은 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드, 예를 들면, 아래에 도시된 실례 (서열 번호: 17)가 더욱 포함되는 것으로 인지될 것이다.
1 MVRARHQPGG LCLLLLLLCQ FMEDRSAQAG NCWLRQAKNG RCQVLYKTEL
51 SKEECCSTGR LSTSWTEEDV NDNTLFKWMI FNGGAPNCIP CKETCENVDC
101 GPGKKCRMNK KNKPRCVCAP DCSNITWKGP VCGLDGKTYR NECALLKARC
151 KEQPELEVQY QGRCKKTCRD VFCPGSSTCV VDQTNNAYCV TCNRICPEPA
201 SSEQYLCGND GVTYSSACHL RKATCLLGRS IGLAYEGKCI KAKSCEDIQC
251 TGGKKCLWDF KVGRGRCSLC DELCPDSKSD EPVCASDNAT YASECAMKEA
301 ACSSGVLLEV KHSGSCNSIS (서열 번호: 15)
1 GNCWLRQAKN GRCQVLYKTE LSKEECCSTG RLSTSWTEED VNDNTLFKWM
51 IFNGGAPNCI PCKETCENVD CGPGKKCRMN KKNKPRCVCA PDCSNITWKG
101 PVCGLDGKTY RNECALLKAR CKEQPELEVQ YQGRCKKTCR DVFCPGSSTC
151 VVDQTNNAYC VTCNRICPEP ASSEQYLCGN DGVTYSSACH LRKATCLLGR
201 SIGLAYEGKC IKAKSCEDIQ CTGGKKCLWD FKVGRGRCSL CDELCPDSKS
251 DEPVCASDNA TYASECAMKE AACSSGVLLE VKHSGSCNSI S
(서열 번호: 16)
1 CWLRQAKNGR CQVLYKTELS KEECCSTGRL STSWTEEDVN DNTLFKWMIF
51 NGGAPNCIPC KETCENVDCG PGKKCRMNKK NKPRCVCAPD CSNITWKGPV
101 CGLDGKTYRN ECALLKARCK EQPELEVQYQ GRCKKTCRDV FCPGSSTCVV
151 DQTNNAYCVT CNRICPEPAS SEQYLCGNDG VTYSSACHLR KATCLLGRSI
201 GLAYEGKCIK AKSCEDIQCT GGKKCLWDFK VGRGRCSLCD ELCPDSKSDE
251 PVCASDNATY ASECAMKEAA CSSGVLLEVK HSGSCNSIS
(서열 번호: 17)
본원에서 폴리스타틴 단백질은 FST로서 지칭될 수 있다. FST288에서와 같이 숫자가 뒤따르면, 이것은 단백질이 폴리스타틴의 288-아미노산 동종형이라는 것을 지시한다. FST288-Fc로서 제시되면, 이것은 Fc 도메인이 개재성 링커를 포함하거나 포함하지 않을 수 있는 FST288의 C 말단에 융합된다는 것을 지시한다. 이러한 사례에서 Fc는 본원에서 규정된 바와 같은 임의의 면역글로불린 Fc 부분일 수 있다. FST288-G1Fc로서 제시되면, 이것은 인간 IgG1의 Fc 부분이 FST288의 C 말단에서 융합된다는 것을 지시한다. 반대로 지시되지 않으면, 이러한 명명법으로 설명된 단백질은 인간 폴리스타틴 단백질을 나타낼 것이다.
FSTL3 유전자에 의해 인코딩되고 폴리스타틴-관련된 유전자 (FLRG), 폴리스타틴-유사 3 (FSTL3), 또는 폴리스타틴-관련된 단백질 (FSRP)로서 대안적으로 공지된 자연발생 단백질은 FSTN에 의해 인코딩된 선천적 폴리스타틴 동종형에 밀접하게 관련된다 [Schneyer et al (2001) Mol Cell Endocrinol 180:33-38]. 폴리스타틴과 마찬가지로, FLRG는 미오스타틴, 액티빈 및 GDF11에 높은 친화성으로 결합하고, 그리고 따라서, 생체내에서 이들의 생물활성을 저해한다 [Sidis et al (2006) Endocrinology 147:3586-3597]. 폴리스타틴과 달리, FLRG는 헤파린-결합 서열을 소유하지 않고, 세포 표면 프로테오글리칸에 결합할 수 없고, 그리고 이런 이유로, 세포 표면의 바로 인근에서 FST288보다 액티빈의 덜 강력한 저해제이다. 폴리스타틴과 대조적으로, FLRG는 또한, 혈액 내에서 성숙 미오스타틴에 결합된 상태에서 순환하고, 그리고 따라서, 이점에 관하여 미오스타틴 프로펩티드와 유사하다 [Hill et al (2002) J Biol Chem 277:40735-40741. 폴리스타틴과 달리, 생쥐에서 FLRG 결함은 비록 이것이 다양한 물질대사 표현형을 유발하긴 하지만 치명적이진 않다 [Mukherjee et al (2007) Proc Natl Acad Sci USA 104:1348-1353].
FLRG의 전반적인 구조는 폴리스타틴의 것과 매우 유사하다. 선천적 인간 FLRG 전구체는 4개의 도메인을 포함하는 단일 사슬 폴리펩티드이다: 신호 서열 (서열 번호: 18의 아미노산 1-26), N 말단 도메인 (FLRGND) (서열 번호: 18의 아미노산 38-96), 그리고 본원에서 FLRGFD1 (서열 번호: 18의 아미노산 99-167) 및 FLRGFD2 (서열 번호: 18의 아미노산 171-243)로서 지칭된 2개의 폴리스타틴 도메인.
용어 "FLRG 폴리펩티드"는 FLRG의 임의의 자연발생 폴리펩티드뿐만 아니라 유용한 활성을 유지하는 이들의 임의의 변이체 (돌연변이체, 단편, 융합 및 펩티드모방체 형태 포함)를 포함하는 폴리펩티드를 지칭하는데 이용된다. 일정한 바람직한 구체예에서, 본 발명의 FLRG 폴리펩티드는 미오스타틴, GDF11 또는 액티빈, 특히 액티빈 A에 결합하고 및/또는 이의 활성 (가령, ActRIIA 및/또는 ActRIIB Smad2/3 신호전달의 리간드-매개된 활성화)을 저해한다. 리간드 결합 성질을 유지하는 FLRG 폴리펩티드의 변이체는 FLRG 및 리간드 사이의 상호작용을 검정하는 일과적인 방법을 이용하여 확인될 수 있다 (가령, US 6,537,966을 참조한다). 이에 더하여, 폴리펩티드의 라이브러리를 만들고 시험하기 위한 방법이 본원에서 설명되고, 그리고 이런 방법은 또한, FLRG의 변이체를 만들고 시험하는 것과 관련된다.
가령, FLRG 폴리펩티드는 FLRG 폴리펩티드의 서열 (가령, 서열 번호: 18-25)에 최소한 약 80% 동일한, 그리고 임의선택적으로, 서열 번호: 18-25 중에서 한 가지에 최소한 85%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 그 이상 동일한 서열을 갖는 임의의 공지된 FLRG의 서열로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 용어 "FLRG 융합 폴리펩티드"는 이종성 (비-FLRG) 부분과 함께 전술한 폴리펩티드 중에서 한 가지를 포함하는 융합 단백질을 지칭할 수 있다. 아미노산 서열은 이것이 서열 번호: 18에 의해 대표된 인간 FLRG에서 독특하게 발견되지 않으면, FLRG에 이종성인 것으로 이해된다. 이종성 부분의 많은 실례가 본원에서 제공되고, 그리고 이런 이종성 부분은 아미노산 서열에 의해 융합 단백질의 FLRG 폴리펩티드 부분에 바로 인접하거나, 또는 개재성 아미노산 서열, 예를 들면, 링커 또는 다른 서열에 의해 분리될 수 있다.
인간 FLRG 전구체는 다음의 아미노산 서열 (서열 번호: 18) (NCBI 참조 서열 NP_005851.1의 아미노산 1-263)을 갖는데, 신호 펩티드는 점선 밑줄에 의해 지시되고, N 말단 도메인 (FLRGND)은 파선 밑줄에 의해 지시되고, 그리고 2개의 폴리스타틴 도메인 (FSTFD1, FSTFD2)은 실선 밑줄에 의해 지시된다.
Figure pct00005
성숙 (처리된) 인간 FLRG는 다음의 아미노산 서열 (서열 번호: 19) (NCBI 참조 서열 NP_005851.1의 아미노산 38-263)을 포함하는데, N 말단 도메인은 파선 밑줄에 의해 지시되고, 그리고 2개의 폴리스타틴 도메인은 실선 밑줄에 의해 지시된다. 게다가, 첫 번째 시스테인 (서열 번호: 18에서 위치 38)에 앞서 아미노산 중에서 한 가지 (서열 번호: 18의 위치 27-37)가 실제적인 결과 없이 포함될 수 있고, 그리고 이런 약간 더 긴 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드가 포함되는 것으로 인지될 것이다.
Figure pct00006
(서열 번호: 19)
일정한 양상에서, 본 발명은 아래에 진술된 바와 같은 FLRGND 도메인 (서열 번호: 20) (이것은 액티빈 A와 비교하여 미오스타틴과 상이하게 상호작용한다) [Cash et al (2012) J Biol Chem 287:1043-1053] 및 예로서, 하나 또는 그 이상의 이종성 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 게다가, 첫 번째 시스테인에 앞서 초기 아미노산 G 또는 N 중에서 하나는 아래에 도시된 실례 (서열 번호: 21)에서처럼 결실될 수 있는 것으로 인지될 것이다.
1 GVCWLQQGQE ATCSLVLQTD VTRAECCASG NIDTAWSNLT HPGNKINLLG
51 FLGLVHCLPC (서얼 번호: 20)
1 CWLQQGQEAT CSLVLQTDVT RAECCASGNI DTAWSNLTHP GNKINLLGFL
51 GLVHCLPC (서얼 번호: 21)
일정한 양상에서, 본 발명은 아래에 진술된 바와 같은 FLRGFD1 도메인 (서열 번호: 22) 및 예로서, 하나 또는 그 이상의 이종성 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드를 포함한다.
1 CDGVECGPGK ACRMLGGRPR CECAPDCSGL PARLQVCGSD GATYRDECEL
51 RAARCRGHPD LSVMYRGRC (서얼 번호: 22)
일정한 양상에서, 본 발명은 아래에 진술된 바와 같은 FSTFD2 도메인 (서열 번호: 23) 및 예로서, 하나 또는 그 이상의 이종성 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드를 포함한다.
1 CEHVVCPRPQ SCVVDQTGSA HCVVCRAAPC PVPSSPGQEL CGNNNVTYIS
51 SCHMRQATCF LGRSIGVRHA GSC (서얼 번호: 23)
FLRGFD 서열은 FLRGND 도메인을 더욱 포함하는 폴리펩티드로서 발현에 의해 구조적 맥락에서 유리하게 유지될 수 있다. 따라서, 본 발명은 아래에 진술된 바와 같은 FLRGND-FLRGFD1 서열 (서열 번호: 24) 및 FLRGND-FLRGFD1-FLRGFD2 서열 (서열 번호: 25), 그리고 예로서, 하나 또는 그 이상의 이종성 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 게다가, 첫 번째 시스테인에 앞서, 초기 아미노산 G 또는 N 중에서 하나가 처리에 의해 제거되거나 또는 임의의 결과 없이 의도적으로 제거될 수 있고, 그리고 이런 약간 더 짧은 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드가 더욱 포함되는 것으로 인지될 것이다.
1 GVCWLQQGQE ATCSLVLQTD VTRAECCASG NIDTAWSNLT HPGNKINLLG
51 FLGLVHCLPC KCDGVECGPG KACRMLGGRP RCECAPDCSG LPARLQVCGS
101 DGATYRDECE LRAARCRGHP DLSVMYRGRC (서얼 번호: 24)
1 GVCWLQQGQE ATCSLVLQTD VTRAECCASG NIDTAWSNLT HPGNKINLLG
51 FLGLVHCLPC KCDGVECGPG KACRMLGGRP RCECAPDCSG LPARLQVCGS
101 DGATYRDECE LRAARCRGHP DLSVMYRGRC CEHVVCPRPQ SCVVDQTGSA
151 HCVVCRAAPC PVPSSPGQEL CGNNNVTYIS SCHMRQATCF LGRSIGVRHA
201 GSC (서열 번호: 25)
FLRG-Fc로서 제시되면, 이것은 Fc 도메인이 개재성 링커를 포함하거나 포함하지 않을 수 있는 FLRG의 C 말단에 융합된다는 것을 지시한다. 이러한 사례에서 Fc는 본원에서 규정된 바와 같은 임의의 면역글로불린 Fc 부분일 수 있다. FLRG-G1Fc로서 제시되면, 이것은 IgG1의 Fc 부분이 FLRG의 C 말단에서 융합된다는 것을 지시한다. 반대로 지시되지 않으면, 이러한 명명법으로 설명된 단백질은 인간 FLRG 단백질을 나타낼 것이다.
FSTN 및 FSTL3에 더하여, 2개의 다른 유전자가 확인되었는데, 이들의 단백질 산물은 폴리스타틴 도메인 모티프를 내포하고 미오스타틴 및 GDF11의 세포외 저해제로서 기능한다. 인간에서, 이들 밀접하게 관련된 유전자는 유장 산성 단백질 도메인, 폴리스타틴-Kazal 도메인, 면역글로불린 도메인, 쿠니츠-유형 단백질분해효소 저해제 모듈에 관련된 2개의 탠덤 도메인, 그리고 네트린 도메인을 포함하는 그들의 공유된 도메인 구조에 근거하여 WFIKKN1 및 WFIKKN2로 명명된다 [Trexler et al (2001) Proc Natl Acad Sci USA 98:3705-3709; Trexler et al (2002) Biol Chem 383:223-228]. WFIKKN2는 WFIKKN-관련된 단백질 (WFIKKNRP)로서 또한 알려져 있고, 그리고 이들 단백질의 뮤린 대응물은 그들의 리간드-결합 능력에 근거하여, 각각 GDF-연관된 혈청 단백질-2 (Gasp2) 및 Gasp1로 명명된다 [Hill et al (2003) Mol Endocrinol 17:1144-1154].
선천적 WFIKKN1 (GASP2) 및 WFIKKN2 (GASP1) 단백질은 그럼에도 불구하고, 서로로부터 및 폴리스타틴 또는 FLRG로부터 상이한 중복 활성 프로필을 소유한다. WFIKKNs는 미오스타틴, GDF11 및 일부 경우에, 미오스타틴 프로펩티드에 높은 친화성으로 결합하는데, 성숙 리간드에 결합은 폴리스타틴 도메인 (WFIKKN1FD, WFIKKN2FD)에 의해 일차적으로 매개되고, 그리고 프로펩티드 결합은 네트린 도메인에 의해 일차적으로 매개된다 [Hill et al (2003) Mol Endocrinol 17:1144-1154; Kondas et al (2008) J Biol Chem 283:23677-23684]. 폴리스타틴 및 FLRG와 대조적으로, WFIKKN1 및 WFIKKN2 중에서 어느 것도 액티빈에 결합하지 않는다 [Szlama et al (2010) FEBS J 277:5040-5050]. WFIKKN 단백질은 액티빈 유형 II 수용체에 대한 접근을 차단함으로써 미오스타틴 및 GDF11 신호전달을 저해한다 [Lee et al (2013) Proc Natl Acad Sci USA 110:E3713-E3722]. 양쪽 WFIKKNs에서 여러 단백질분해효소 저해제 모듈의 존재로 인해, 이들은 또한, 복수 유형의 프로테아제의 작용을 조절할 가능성이 있다. WFIKKN1의 조직 발현 패턴은 출생전에 및 출생후에 WFIKKN2의 것과 상이하고, 따라서 이들 두 단백질이 상이한 역할을 제공한다는 견해를 뒷받침한다 [Trexler et al (2002) Biol Chem 383:223-228].
증거의 추가 라인은 WFIKKNs를 골격근량의 조절에 연루시킨다. WFIKKN1 또는 WFIKKN2의 동형접합성 결실을 갖는 생쥐는 근육 중량에서 감소, 섬유 유형에서 빠른 당분해 유형 IIb 섬유로부터 빠른 산화 유형 IIa 섬유로의 이동, 그리고 손상된 근육 재생을 비롯하여, 미오스타틴 및 GDF11의 과다활동과 일치하는 표현형을 전시한다 (Lee et al (2013) Proc Natl Acad Sci USA 110:E3713-E3722]. 반대로, 생쥐에서 WFIKKN2의 광범위한 과다발현은 주로 근육과다 표현형을 야기한다 [Monestier et al (2012) BMC Genomics 13:541-551. 비록 양쪽 WFIKKN 단백질이 미오스타틴에 결합하긴 하지만, WFIKKIN1 및 WFIKKN2는 미오스타틴 프로펩티드와 상이하게 상호작용할 수 있고, 그리고 따라서, 미오스타틴 및 단일 미오스타틴 프로펩티드 사슬 사이의 선천적 복합체인 반잠복성 미오스타틴에 의한 ActRIIA 또는 ActRIIB의 활성화를 상이하게 차단할 수 있다 [Szlama et al (2013) FEBS J 280:3822-3839]. 종합하면, 본원에서 개시된 바와 같은 WFIKKN1 또는 WFIKKN2 폴리펩티드를 포함하는 폴리스타틴-관련된 융합 단백질은 내인성 액티빈과 연관된 저해의 잠재적으로 바람직하지 않은 효과를 유발하지 않으면서 생체내에서 골격근량을 증가시키는 것으로 예측될 것이다.
용어 "WFIKKN1 폴리펩티드"는 WFIKKN1의 임의의 자연발생 폴리펩티드뿐만 아니라 유용한 활성을 유지하는 이들의 임의의 변이체 (돌연변이체, 단편, 융합 및 펩티드모방체 형태 포함)를 포함하는 폴리펩티드를 지칭하는데 이용된다. 일정한 바람직한 구체예에서, 본 발명의 WFIKKN1 폴리펩티드는 미오스타틴, 미오스타틴 프로펩티드, 미오스타틴 및 이의 프로펩티드 사이의 복합체, GDF11 및 잠재적으로 액티빈에 결합하고 및/또는 이의 활성 (가령, ActRIIA 및/또는 ActRIIB Smad2/3 신호전달의 리간드-매개된 활성화)을 저해한다. 리간드 결합 성질을 유지하는 WFIKKN1 폴리펩티드의 변이체는 WFIKKN1 및 리간드 사이의 상호작용을 검정하는 일과적인 방법을 이용하여 확인될 수 있다 [가령, Kondas et al (2008) J Biol Chem 283:23677-23684; Szlama et al (2013) FEBS J 280:3822-3839를 참조한다]. 이에 더하여, 폴리펩티드의 라이브러리를 만들고 시험하기 위한 방법이 본원에서 설명되고, 그리고 이런 방법은 또한, WFIKKN1의 변이체를 만들고 시험하는 것과 관련된다.
가령, WFIKKN1 폴리펩티드는 WFIKKN1 폴리펩티드의 서열 (가령, 서열 번호: 26-28)과 최소한 약 80% 동일한, 그리고 임의선택적으로, 서열 번호: 26-28 중에서 한 가지에 최소한 85%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 그 이상 동일한 서열을 갖는 임의의 공지된 WFIKKN1 폴리펩티드의 서열로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 용어 "WFIKKN1 융합 폴리펩티드"는 이종성 (비-WFIKKN1) 부분과 함께 전술한 폴리펩티드 중에서 한 가지를 포함하는 융합 단백질을 지칭할 수 있다. 아미노산 서열은 이것이 서열 번호: 26에 의해 대표된 인간 WFIKKN1에서 독특하게 발견되지 않으면, WFIKKN1에 이종성인 것으로 이해된다. 이종성 부분의 많은 실례가 본원에서 제공되고, 및 이런 이종성 부분은 아미노산 서열에 의해 융합 단백질의 WFIKKN1 폴리펩티드 부분에 바로 인접하거나, 또는 개재성 아미노산 서열, 예를 들면, 링커 또는 다른 서열에 의해 분리될 수 있다.
인간 WFIKKN1 전구체는 다음의 아미노산 서열 (서열 번호: 26) (NCBI Ref Seq NP_444514.1)을 갖는데, 신호 펩티드는 점선 밑줄에 의해 지시되고 폴리스타틴 도메인 (WFIKKN1FD)은 실선 밑줄에 의해 지시된다.
1 MPALRPLLPL LLLLRLTSGA GLLPGLGSHP GVCPNQLSPN LWVDAQSTCE
51 RECSRDQDCA AAEKCCINVC GLHSCVAARF PGSPAAPTTA ASCEGFVCPQ
101 QGSDCDIWDG QPVCRCRDRC EKEPSFTCAS DGLTYYNRCY MDAEACLRGL
151 HLHIVPCKHV LSWPPSSPGP PETTARPTPG AAPVPPALYS SPSPQAVQVG
201 GTASLHCDVS GRPPPAVTWE KQSHQRENLI MRPDQMYGNV VVTSIGQLVL
251 YNARPEDAGL YTCTARNAAG LLRADFPLSV VQREPARDAA PSIPAPAECL
301 PDVQACTGPT SPHLVLWHYD PQRGGCMTFP ARGCDGAARG FETYEACQQA
351 CARGPGDACV LPAVQGPCRG WEPRWAYSPL LQQCHPFVYG GCEGNGNNFH
401 SRESCEDACP VPRTPPCRAC RLRSKLALSL CRSDFAIVGR LTEVLEEPEA
451 AGGIARVALE DVLKDDKMGL KFLGTKYLEV TLSGMDWACP CPNMTAGDGP
501 LVIMGEVRDG VAVLDAGSYV RAASEKRVKK ILELLEKQAC ELLNRFQD
(서열 번호: 26)
성숙 (처리된) 인간 WFIKKN1은 다음의 아미노산 서열 (서열 번호: 27)을 갖는데, 폴리스타틴 도메인은 실선 밑줄에 의해 지시된다. 게다가, 첫 번째 시스테인에 앞서, 13개 아미노산 중에서 하나가 처리에 의해 제거되거나 또는 실제적인 결과 없이 의도적으로 제거될 수 있고, 그리고 이런 약간 더 작은 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드가 더욱 포함되는 것으로 인지될 것이다.
1 AGLLPGLGSH PGVCPNQLSP NLWVDAQSTC ERECSRDQDC AAAEKCCINV
51 CGLHSCVAAR FPGSPAAPTT AASCEGFVCP QQGSDCDIWD GQPVCRCRDR
101 CEKEPSFTCA SDGLTYYNRC YMDAEACLRG LHLHIVPCKH VLSWPPSSPG
151 PPETTARPTP GAAPVPPALY SSPSPQAVQV GGTASLHCDV SGRPPPAVTW
201 EKQSHQRENL IMRPDQMYGN VVVTSIGQLV LYNARPEDAG LYTCTARNAA
251 GLLRADFPLS VVQREPARDA APSIPAPAEC LPDVQACTGP TSPHLVLWHY
301 DPQRGGCMTF PARGCDGAAR GFETYEACQQ ACARGPGDAC VLPAVQGPCR
351 GWEPRWAYSP LLQQCHPFVY GGCEGNGNNF HSRESCEDAC PVPRTPPCRA
401 CRLRSKLALS LCRSDFAIVG RLTEVLEEPE AAGGIARVAL EDVLKDDKMG
451 LKFLGTKYLE VTLSGMDWAC PCPNMTAGDG PLVIMGEVRD GVAVLDAGSY
501 VRAASEKRVK KILELLEKQA CELLNRFQD (서열 번호: 27)
일정한 양상에서, 본 발명은 아래에 진술된 바와 같은 WFIKKN1FD 도메인 (서열 번호: 28) 및 예로서, 하나 또는 그 이상의 이종성 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드를 포함한다.
1 CEGFVCPQQG SDCDIWDGQP VCRCRDRCEK EPSFTCASDG LTYYNRCYMD
51 AEACLRGLHL HIVPC (서얼 번호: 28)
WFIKKN1-Fc로서 제시되면, 이것은 Fc 부분이 개재성 링커를 포함하거나 포함하지 않을 수 있는 WFIKKN1의 C 말단에 융합된다는 것을 지시한다. 이러한 사례에서 Fc는 본원에서 규정된 바와 같은 임의의 면역글로불린 Fc 부분일 수 있다. WFIKKN1-G1Fc로서 제시되면, 이것은 IgG1의 Fc 부분이 WFIKKN1의 C 말단에서 융합된다는 것을 지시한다. 반대로 지시되지 않으면, 이러한 명명법으로 설명된 단백질은 인간 WFIKKN1 단백질을 나타낼 것이다.
용어 "WFIKKN2 폴리펩티드"는 WFIKKN2의 임의의 자연발생 폴리펩티드뿐만 아니라 유용한 활성을 유지하는 이들의 임의의 변이체 (돌연변이체, 단편, 융합 및 펩티드모방체 형태 포함)를 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 일정한 바람직한 구체예에서, 본 발명의 WFIKKN2 폴리펩티드는 미오스타틴, 미오스타틴 프로펩티드, 미오스타틴 및 이의 프로펩티드 사이의 복합체, GDF11 및 잠재적으로 액티빈에 결합하고 및/또는 이의 활성 (가령, ActRIIA 및/또는 ActRIIB Smad2/3 신호전달의 리간드-매개된 활성화)을 저해한다. 리간드 결합 성질을 유지하는 WFIKKN2 폴리펩티드의 변이체는 WFIKKN2 및 리간드 사이의 상호작용을 검정하는 일과적인 방법을 이용하여 확인될 수 있다 [가령, Kondas et al (2008) J Biol Chem 283:23677-23684; Szlama et al (2013) FEBS J 280:3822-3839를 참조한다]. 이에 더하여, 폴리펩티드의 라이브러리를 만들고 시험하기 위한 방법이 본원에서 설명되고, 그리고 이런 방법은 또한, WFIKKN2의 변이체를 만들고 시험하는 것과 관련된다.
가령, WFIKKN2 폴리펩티드는 WFIKKN2 폴리펩티드의 서열 (가령, 서열 번호: 29-33)과 최소한 약 80% 동일한, 그리고 임의선택적으로, 서열 번호: 29-33 중에서 한 가지에 최소한 85%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 그 이상 동일한 서열을 갖는 임의의 공지된 WFIKKN2 폴리펩티드의 서열로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 용어 "WFIKKN2 융합 폴리펩티드"는 이종성 (비-WFIKKN2) 부분과 함께 전술한 폴리펩티드 중에서 한 가지를 포함하는 융합 단백질을 지칭할 수 있다. 아미노산 서열은 이것이 서열 번호: 29에 의해 대표된 인간 WFIKKN2에서 독특하게 발견되지 않으면, WFIKKN2에 이종성인 것으로 이해된다. 이종성 부분의 많은 실례가 본원에서 제공되고, 그리고 이런 이종성 부분은 아미노산 서열에 의해 융합 단백질의 WFIKKN2 폴리펩티드 부분에 바로 인접하거나, 또는 개재성 아미노산 서열, 예를 들면, 링커 또는 다른 서열에 의해 분리될 수 있다.
인간 WFIKKN2 전구체는 다음의 아미노산 서열 (서열 번호: 29) (NCBI Ref Seq NP_783165.1)을 갖는데, 신호 펩티드는 점선 밑줄에 의해 지시되고, 그리고 폴리스타틴 도메인 (WFIKKN2FD)은 실선 밑줄에 의해 지시된다.
1 MWAPRCRRFW SRWEQVAALL LLLLLLGVPP RSLALPPIRY SHAGICPNDM
51 NPNLWVDAQS TCRRECETDQ ECETYEKCCP NVCGTKSCVA ARYMDVKGKK
101 GPVGMPKEAT CDHFMCLQQG SECDIWDGQP VCKCKDRCEK EPSFTCASDG
151 LTYYNRCYMD AEACSKGITL AVVTCRYHFT WPNTSPPPPE TTMHPTTASP
201 ETPELDMAAP ALLNNPVHQS VTMGETVSFL CDVVGRPRPE ITWEKQLEDR
251 ENVVMRPNHV RGNVVVTNIA QLVIYNAQLQ DAGIYTCTAR NVAGVLRADF
301 PLSVVRGHQA AATSESSPNG TAFPAAECLK PPDSEDCGEE QTRWHFDAQA
351 NNCLTFTFGH CHRNLNHFET YEACMLACMS GPLAACSLPA LQGPCKAYAP
401 RWAYNSQTGQ CQSFVYGGCE GNGNNFESRE ACEESCPFPR GNQRCRACKP
451 RQKLVTSFCR SDFVILGRVS ELTEEPDSGR ALVTVDEVLK DEKMGLKFLG
501 QEPLEVTLLH VDWACPCPNV TVSEMPLIIM GEVDGGMAML RPDSFVGASS
551 ARRVRKLREV MHKKTCDVLK EFLGLH (서열 번호: 29)
성숙 (처리된) 인간 WFIKKN2는 다음의 아미노산 서열 (서열 번호: 30)을 갖는데, 폴리스타틴 도메인은 단일 밑줄에 의해 지시된다. 게다가, 첫 번째 시스테인에 앞서, 11개 아미노산 중에서 하나가 처리에 의해 제거되거나 또는 실제적인 결과 없이 의도적으로 제거될 수 있고, 그리고 이런 약간 더 작은 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드가 더욱 포함되는 것으로 인지될 것이다.
1 LPPIRYSHAG ICPNDMNPNL WVDAQSTCRR ECETDQECET YEKCCPNVCG
51 TKSCVAARYM DVKGKKGPVG MPKEATCDHF MCLQQGSECD IWDGQPVCKC
101 KDRCEKEPSF TCASDGLTYY NRCYMDAEAC SKGITLAVVT CRYHFTWPNT
151 SPPPPETTMH PTTASPETPE LDMAAPALLN NPVHQSVTMG ETVSFLCDVV
201 GRPRPEITWE KQLEDRENVV MRPNHVRGNV VVTNIAQLVI YNAQLQDAGI
251 YTCTARNVAG VLRADFPLSV VRGHQAAATS ESSPNGTAFP AAECLKPPDS
301 EDCGEEQTRW HFDAQANNCL TFTFGHCHRN LNHFETYEAC MLACMSGPLA
351 ACSLPALQGP CKAYAPRWAY NSQTGQCQSF VYGGCEGNGN NFESREACEE
401 SCPFPRGNQR CRACKPRQKL VTSFCRSDFV ILGRVSELTE EPDSGRALVT
451 VDEVLKDEKM GLKFLGQEPL EVTLLHVDWA CPCPNVTVSE MPLIIMGEVD
501 GGMAMLRPDS FVGASSARRV RKLREVMHKK TCDVLKEFLG LH
(서열 번호: 30)
일정한 양상에서, 본 발명은 아래에 진술된 바와 같은 WFIKKN2FD 도메인 (서열 번호: 31) 및 예로서, 하나 또는 그 이상의 이종성 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드를 포함한다.
1 CDHFMCLQQG SECDIWDGQP VCKCKDRCEK EPSFTCASDG LTYYNRCYMD
51 AEACSKGITL AVVTC (서얼 번호: 31)
뮤린 WFIKKN2 (GASP1) 전구체는 다음의 아미노산 서열 (서열 번호: 32) (NCBI Ref Seq NP_861540.2)을 갖는데, 신호 펩티드는 점선 밑줄에 의해 지시되고, 그리고 폴리스타틴 도메인 (WFIKKN2FD)은 실선 밑줄에 의해 지시된다.
1 MCAPGYHRFW FHWGLLLLLL LEAPLRGLAL PPIRYSHAGI CPNDMNPNLW
51 VDAQSTCKRE CETDQECETY EKCCPNVCGT KSCVAARYMD VKGKKGPVGM
101 PKEATCDHFM CLQQGSECDI WDGQPVCKCK DRCEKEPSFT CASDGLTYYN
151 RCFMDAEACS KGITLSVVTC RYHFTWPNTS PPPPETTVHP TTASPETLGL
201 DMAAPALLNH PVHQSVTVGE TVSFLCDVVG RPRPELTWEK QLEDRENVVM
251 RPNHVRGNVV VTNIAQLVIY NVQPQDAGIY TCTARNVAGV LRADFPLSVV
301 RGGQARATSE SSLNGTAFPA TECLKPPDSE DCGEEQTRWH FDAQANNCLT
351 FTFGHCHHNL NHFETYEACM LACMSGPLAI CSLPALQGPC KAYVPRWAYN
401 SQTGLCQSFV YGGCEGNGNN FESREACEES CPFPRGNQHC RACKPRQKLV
451 TSFCRSDFVI LGRVSELTEE QDSGRALVTV DEVLKDEKMG LKFLGREPLE
501 VTLLHVDWTC PCPNVTVGET PLIIMGEVDG GMAMLRPDSF VGASSTRRVR
551 KLREVMYKKT CDVLKDFLGL Q (서열 번호: 32)
성숙 (처리된) 뮤린 WFIKKN2는 다음의 아미노산 서열 (서열 번호: 33)을 갖는데, 폴리스타틴 도메인은 단일 밑줄에 의해 지시된다. 게다가, 첫 번째 시스테인에 앞서, 11개 아미노산 중에서 하나가 처리에 의해 제거되거나 또는 실제적인 결과 없이 의도적으로 제거될 수 있고, 그리고 이런 약간 더 작은 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드가 더욱 포함되는 것으로 인지될 것이다.
1 LPPIRYSHAG ICPNDMNPNL WVDAQSTCKR ECETDQECET YEKCCPNVCG
51 TKSCVAARYM DVKGKKGPVG MPKEATCDHF MCLQQGSECD IWDGQPVCKC
101 KDRCEKEPSF TCASDGLTYY NRCFMDAEAC SKGITLSVVT CRYHFTWPNT
151 SPPPPETTVH PTTASPETLG LDMAAPALLN HPVHQSVTVG ETVSFLCDVV
201 GRPRPELTWE KQLEDRENVV MRPNHVRGNV VVTNIAQLVI YNVQPQDAGI
251 YTCTARNVAG VLRADFPLSV VRGGQARATS ESSLNGTAFP ATECLKPPDS
301 EDCGEEQTRW HFDAQANNCL TFTFGHCHHN LNHFETYEAC MLACMSGPLA
351 ICSLPALQGP CKAYVPRWAY NSQTGLCQSF VYGGCEGNGN NFESREACEE
401 SCPFPRGNQH CRACKPRQKL VTSFCRSDFV ILGRVSELTE EQDSGRALVT
451 VDEVLKDEKM GLKFLGREPL EVTLLHVDWT CPCPNVTVGE TPLIIMGEVD
501 GGMAMLRPDS FVGASSTRRV RKLREVMYKK TCDVLKDFLG LQ
(서열 번호: 33)
WFIKKN2-Fc로서 제시되면, 이것은 Fc 부분이 개재성 링커를 포함하거나 포함하지 않을 수 있는 WFIKKN2의 C 말단에 융합된다는 것을 지시한다. 이러한 사례에서 Fc는 본원에서 규정된 바와 같은 임의의 면역글로불린 Fc 부분일 수 있다. WFIKKN2-G1Fc로서 제시되면, 이것은 IgG1의 Fc 부분이 WFIKKN2의 C 말단에서 융합된다는 것을 지시한다. 반대로 지시되지 않으면, 이러한 명명법으로 설명된 단백질은 인간 WFIKKN2 단백질을 나타낼 것이다.
일정한 양상에서, 본 발명은 리간드 미오스타틴, 액티빈 A, 액티빈 B 및/또는 GDF11을 저해할 수 있는 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드 및 폴리스타틴-관련된 융합 단백질을 제공한다. 용어 "폴리스타틴-관련된 폴리펩티드"는 최소한 하나의 폴리스타틴 도메인의 아미노산 서열 (가령, FSTFD1, FSTFD2, FSTFD3, FLRGFD1, FLRGFD2, WFIKKN1FD, 또는 WFIKKN2FD)과 최소한 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 995 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 단일 폴리펩티드 사슬을 지칭하기 위해 본원에서 이용된다. 용어 "폴리스타틴-관련된 폴리펩티드"는 폴리스타틴 유전자, FLRG (FSTL3, FSRP) 유전자, WFIKKN1 (GASP2) 유전자, 또는 WFIKKN2 (GASP1) 유전자의 임의의 자연발생 폴리펩티드 산물뿐만 아니라 예로서, 리간드 결합 (가령, 미오스타틴, GDF11, 액티빈 A, 액티빈 B)을 비롯한 유용한 활성을 유지하는 이들의 임의의 변이체 (돌연변이체, 단편, 융합 및 펩티드모방체 형태 포함)를 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. 가령, 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드는 서열 번호: 1-33에 최소한 약 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 그 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다.
용어 "폴리스타틴-관련된 융합 폴리펩티드"는 단일 아미노산 서열에서 이종성 부분과 함께 전술한 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드를 포함하는 단일 사슬 융합 단백질을 지칭한다. 아미노산 서열은 이것이 인간 FST315 (서열 번호: 3에 의해 대표됨), 인간 FLRG (서열 번호: 18에 의해 대표됨), 인간 WFIKKN1 (서열 번호: 25에 의해 대표됨), 또는 인간 WFIKKN2 (서열 번호: 28에 의해 대표됨)에서 독특하게 발견되지 않으면, 폴리스타틴, FLRG, WFIKKN1, 또는 WFIKKN2에 이종성인 것으로 이해된다. 이종성 부분의 많은 실례가 본원에서 제공되고, 그리고 이런 이종성 부분은 아미노산 서열에 의해 융합 단백질의 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드 부분에 바로 인접하거나, 또는 개재성 아미노산 서열, 예를 들면, 링커 또는 다른 서열에 의해 분리될 수 있고, 그리고 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드인 부분의 아미노 말단 또는 카르복시 말단에 배치될 수 있다.
일정한 구체예에서, 본원에서 설명된 폴리스타틴-관련된 융합 단백질은 자연발생 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드로부터 유래된 폴리펩티드 사슬을 포함하는 비대칭 이형이합체성 융합 단백질을 지칭한다. 따라서, 일정한 구체예에서, 본 발명의 방법은 다양한 적용가능한 장애, 특히 이런 폴리스타틴-관련된 융합 단백질이 결합하는 리간드의 저해에 의해 다뤄질 수 있는 장애를 치료하기 위해, 하나 또는 그 이상의 지지 요법과 임의선택적으로 합동으로, 최소한 하나의 폴리스타틴 도메인을 내포하는 단일-팔 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질을 비롯한 하나 또는 그 이상의 폴리스타틴-관련된 융합 단백질의 용도에 관계한다. 가령, 미오스타틴 및 임의선택적으로, 다른 리간드, 예를 들면, GDF11, 액티빈 A 및/또는 액티빈 B에 결합하고 이를 저해하는 폴리스타틴-관련된 융합 단백질은 치료가 필요한 개체에서 골격근량을 증가시키고 및/또는 치료가 필요한 개체에서 골격근 상실 또는 골격근 장애를 치료하거나 예방하는데 이용될 수 있다.
본원에서 나타나 있는 바와 같이, 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드는 단위체성 형태에서 발현될 때 활성 단백질로서 발현에 더욱 순응할 수 있지만, 이런 단백질은 정제하기가 어려운 경향이 있고, 그리고 또한, 짧은 혈청 체류 시간 (반감기)을 갖는 경향이 있는데, 이들 둘 모두 치료적 세팅에서 바람직하지 않다. 정제 문제는 정제를 용이하게 하는 내재성 특징, 예를 들면, 당분야에서 이미 공지된 방법에 의한 부착된 단백질의 정제를 할 수 있게 하는 IgG의 불변 도메인 부분 (가령, Fc 부분)과 연관된 성질을 갖는 상호작용 쌍의 통합에 의해 해결될 수 있다. 혈청 반감기를 향상시키기 위한 통상적인 기전은 폴리펩티드를 IgG의 불변 도메인 부분을 갖는 동종이합체성 융합 단백질로서 발현하는 것이다. 하지만, 동종이합체성 단백질 (가령, Fc 융합 구조체에서)로서 표시된 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드는 활성이 아니거나 또는 단위체성 형태로서 잘 생산될 수 없다. 본원에서 증명된 바와 같이, 상기 문제는 단위체성 형태를 반감기 연장 모이어티에 융합함으로써 해결될 수 있고, 그리고 놀랍게도, 이것은 이런 단백질을 비대칭 이형이합체성 융합 단백질로서 발현함으로써 신속하게 달성될 수 있는데, 상기 융합 단백질에서 결합 쌍의 한 구성원은 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드에 융합되고, 그리고 결합 쌍의 다른 구성원은 다른 모이어티 또는 이종성 모이어티에 융합되어, 상기 결합 쌍에 의해 부여된 혈청 반감기에서 향상과 연계된 고도로 활성 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드가 유발된다.
폴리스타틴-관련된 폴리펩티드에서 아미노산의 넘버링은 선천적 리더 서열이 이용되는 지에 상관없이, 서열 번호: 1, 3, 15, 18, 26, 29, 또는 32의 서열에 근거된다.
본 명세서에서 이용된 용어는 일반적으로, 본 발명의 맥락 내에서 및 각 용어가 이용되는 특정한 맥락에서 당분야에서 그들의 일상적인 의미를 갖는다. 본 발명의 조성물 및 방법, 그리고 이들을 만들고 이용하는 방법을 설명함에 있어서 의사에게 추가 보도를 제공하기 위해, 일정한 용어가 아래에 또는 본 명세서의 다른 곳에서 논의된다. 용어의 임의의 이용의 범위 또는 의미는 상기 용어가 이용되는 특정한 맥락으로부터 명백할 것이다.
모든 문법적 형태 및 스펠링 변이에서 "상동성"은 생물체의 동일한 종에서 상과로부터 단백질뿐만 아니라 생물체의 상이한 종으로부터 동종 단백질을 비롯하여, "공통의 진화적 기원"을 소유하는 두 단백질 사이의 관계를 지칭한다. 이런 단백질 (및 이들의 인코딩 핵산)은 퍼센트 동일성의 면에서 또는 특정한 잔기 또는 모티프 및 보존된 위치의 존재에 의해서 인지에 상관없이, 그들의 서열 유사성에 의해 반영된 바와 같은 서열 상동성을 갖는다.
모든 문법적 형태에서 용어 "서열 유사성"은 공통의 진화적 기원을 공유하거나 또는 공유하지 않을 수 있는 핵산 또는 아미노산 서열 사이에 동일성 또는 상응의 정도를 지칭한다.
하지만, 통상적인 용법에서 및 본 출원에서, 용어 "상동성"은 부사, 예를 들면, "고도로"로 수식될 때, 서열 유사성을 지칭할 수 있고, 그리고 공통의 진화적 기원에 관계하거나 또는 관계하지 않을 수 있다.
참고 폴리펩티드 (또는 뉴클레오티드) 서열에 대하여 "퍼센트 (%) 서열 동일성"은 최고 퍼센트 서열 동일성을 달성하기 위해 서열을 정렬하고 필요하면, 갭을 도입한 후에, 그리고 임의의 보존성 치환을 서열 동일성의 일부로서 고려하지 않고, 참고 폴리펩티드 (또는 뉴클레오티드) 서열 내에 아미노산 잔기 (또는 핵산)와 동일한, 후보 서열 내에 아미노산 잔기 (또는 핵산)의 백분율로서 규정된다. 퍼센트 아미노산 서열 동일성을 결정하는 목적을 위한 정렬은 당분야의 기술 범위 안에 있는 다양한 방식으로, 예를 들면, 공개적으로 가용한 컴퓨터 소프트웨어, 예를 들면, BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어를 이용하여 달성될 수 있다. 당업자는 비교되는 서열의 전장에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 비롯하여, 서열을 정렬하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 하지만, 본원에서 목적을 위해, % 아미노산 (핵산) 서열 동일성 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 이용하여 산출된다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 Genentech, Inc.에 의해 저술되었고, 그리고 공급원 코드가 사용자 문서로 U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559에 제출되었는데, 여기서 이것은 U.S. Copyright 등록 번호 TXU510087 하에 등록된다. ALIGN-2 프로그램은 Genentech, Inc., South San Francisco, Calif.로부터 공개적으로 가용하거나, 또는 소스 코드로부터 편집될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 디지털 UNIX V4.0D를 비롯한 UNIX 운영 체계에서 이용을 위해 편집되어야 한다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램에 의해 세팅되고 변하지 않는다.
본원에서 이용된 바와 같이, "X에 실질적으로 결합하지 않는다"는 "X"에 대한 약 10-7, 10-6, 10-5, 10-4 또는 그 이상보다 큰 KD (가령, KD를 결정하는데 이용된 검정에 의한 검출가능한 결합 없음)를 갖는 작용제를 의미하는 것으로 의도된다.
2. 폴리스타틴-관련된 융합 폴리펩티드
일정한 양상에서, 본 발명은 하나 또는 그 이상의 폴리스타틴 도메인 (가령, FST-Fc 폴리펩티드, FLRG-Fc 폴리펩티드, WFIKKN1-Fc 폴리펩티드 및 WFIKKN2-Fc 폴리펩티드)를 포함하는 폴리스타틴-관련된 융합 폴리펩티드에 관계한다. 일정한 구체예에서, 본원에서 개시된 폴리펩티드는 두 번째 폴리펩티드와 공유적으로 또는 비공유적으로 연관된 첫 번째 폴리펩티드를 포함하는 단백질 복합체를 형성할 수 있고, 여기서 첫 번째 폴리펩티드는 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드의 아미노산 서열 및 상호작용 쌍의 첫 번째 구성원의 아미노산 서열을 포함하고; 그리고 두 번째 폴리펩티드는 상호작용 쌍의 두 번째 구성원의 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 여기서 두 번째 폴리펩티드는 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드를 포함하지 않는다. 상호작용 쌍은 비록 작업 구체예가 동종이합체성 서열을 형성하는 상호작용 쌍을 또한 이용할 수도 있긴 하지만, 상호작용하여 복합체, 특히 이형이합체성 복합체를 형성하는 임의의 2개 폴리펩티드 서열일 수 있다. 본원에서 설명된 바와 같이, 상호작용 쌍의 한 구성원은 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드, 예를 들면, 서열 번호: 1-33 중에서 한 가지의 서열과 최소한 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에 융합될 수 있다. 바람직하게는, 상호작용 쌍은 단백질 정제의 향상된 수단 또는 향상된 혈청 반감기를 부여하거나, 또는 다른 모이어티, 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜 모이어티가 부착되어 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드의 단위체성 형태에 비하여 향상된 혈청 반감기를 제공하는 어댑터로서 행동하도록 선별된다.
앞서 설명된 바와 같이, 폴리스타틴은 폴리스타틴 리간드 결합을 매개하는 것으로 생각되는 4개의 시스테인-풍부한 영역 (다시 말하면, FSTND, FSTFD1, FSTFD2 및 FSTFD3)에 의해 특징화된다. 유사하게, FLRG는 3개의 시스테인-풍부한 영역 (다시 말하면, FLRGND, FLRGFD1, 및 FLRGFD2)에 의해 특징화되고, 그리고 WFIKKN1 또는 WFIKKN2는 각각, 미오스타틴, 액티빈, 또는 GDF11에 결합을 매개하는 것으로 생각되는 시스테인-풍부한 영역 (WFIKKN1FD 또는 WFIKKN2FD)에 의해 특징화된다. 게다가, 연구자들은 FST 내에 3개의 폴리스타틴 도메인 중에서 단지 한 가지 (가령, FSTFD1)만 포함하는 폴리펩티드 구조체가 일정한 폴리스타틴 리간드 (가령, 미오스타틴)를 향한 강한 친화성을 유지하고 생체내에서 생물학적으로 활성이라는 것을 증명하였다. Nakatani et al. (2008) FASEB J 22:477-487을 참조한다. 이런 이유로, 본 발명의 변이체 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드는 폴리스타틴 단백질의 하나 또는 그 이상의 활성 부분을 포함할 수 있다. 가령, 본 발명의 구조체는 서열 번호: 1의 아미노산 30-95에 상응하는 잔기에서 시작하고 서열 번호: 1의 아미노산 316-344에 상응하는 위치에서 끝날 수 있다. 다른 실례는 서열 번호: 1의 30-95로부터 위치에서 시작하고 아미노산 164-167 또는 238-244에 상응하는 위치에서 끝나는 구조체를 포함한다.
본원에서 설명된 폴리스타틴, FLRG, WFIKKN1 및 WFIKKN2 폴리펩티드 변이체는 서로 또는 이종성 아미노산 서열과 다양한 방식으로 합동될 수 있다. 가령, 본 발명의 변이체 폴리스타틴-관련된 융합 단백질은 FSTFD1 (서열 번호: 1의 아미노산 95-164; 다시 말하면, 서열 번호: 7), FSTFD2 (서열 번호:1의 아미노산 168-239; 다시 말하면, 서열 번호: 8), 또는 FSTFD3 (서열 번호:1의 아미노산 245-316; 서열 번호: 9)에서 선택되는 하나 또는 그 이상의 폴리스타틴 도메인을 포함하는 폴리펩티드뿐만 아니라 FSTFD1 (서열 번호: 7), FSTFD2 (서열 번호: 8), 또는 FSTFD3 (서열 번호: 9)과 최소한 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 서열에서 선택되는 하나 또는 그 이상의 폴리스타틴 도메인을 포함하는 단백질을 포함한다. 유사하게, 본 발명의 변이체 폴리스타틴-관련된 융합 단백질은 FLRGFD1 (서열 번호: 18의 아미노산 99-167; 다시 말하면, 서열 번호: 22), FLRGFD2 (서열 번호: 18의 아미노산 171-243; 다시 말하면, 서열 번호: 23), WFIKKN1FD (서열 번호: 26의 아미노산 93-157; 다시 말하면, 서열 번호: 28), 또는 WFIKKN2FD (서열 번호: 29의 아미노산 111-175; 다시 말하면, 서열 번호: 31)에서 선택되는 하나 또는 그 이상의 폴리스타틴 도메인을 포함하는 폴리펩티드뿐만 아니라 FSTFD1 (서열 번호: 7), FSTFD2 (서열 번호: 8), FSTFD3 (서열 번호: 9), FLRGFD1 (서열 번호: 22), FLRGFD2 (서열 번호: 23), WFIKKN1FD (서열 번호: 28), 또는 WFIKKN2FD (서열 번호: 31)와 최소한 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 서열에서 선택되는 하나 또는 그 이상의 폴리스타틴 도메인을 포함하는 단백질을 포함한다.
이들 폴리스타틴 도메인은 이런 재조합 단백질이 예로서, 폴리스타틴 리간드-결합 활성 (가령, 미오스타틴) 및 생물학적 활성 (가령, 근육 질량 및/또는 근력을 유도)을 비롯한 원하는 활성을 유지한다면, 본 발명의 변이체 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드 내에서 임의의 순서로 합동될 수 있다. 이런 변이체 폴리스타틴 폴리펩티드의 실례는 예로서, FSTFD1-FSTFD2-FSTFD3, FSTFD1-FSTFD3, FSTFD1-FSTFD1-FSTFD3, FSTFD1-FSTFD2, FSTFD1-FSTFD1, FSTND-FSTFD1-FSTFD2-FSTFD3, FSTND-FSTFD1-FSTFD2, FSTND-FSTFD1-FSTFD1, FSTND-FSTFD1-FSTFD3, FSTND-FSTFD1-FSTFD1-FSTFD3와 같은 도메인 구조를 갖는 폴리펩티드, 그리고 이들 폴리펩티드의 N 말단 또는 C 말단에 다른 이종성 폴리펩티드를 융합함으로써 획득된 폴리펩티드를 포함한다. 변이체 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드의 실례는 예로서, FLRGFD1-FLRGFD1, FLRGFD1-FLRGFD2, FLRGFD1-FLRGFD1-FLRGFD2, FLRGND-FLRGFD1-FLRGFD1, FLRGND-FSTFD1-FSTFD2와 같은 도메인 구조를 갖는 폴리펩티드, 그리고 이들 폴리펩티드의 N 말단 또는 C-말단에 다른 이종성 폴리펩티드를 융합함으로써 획득된 폴리펩티드를 포함한다. 이들 도메인은 직접적으로 융합되거나 또는 링커 폴리펩티드를 거쳐 연결될 수 있다. 임의선택적으로, 폴리펩티드 링커는 임의의 서열일 수 있고, 그리고 1-100, 1-50, 바람직하게는 1-10, 더욱 바람직하게는 1-5개 아미노산을 포함할 수 있다. 일정한 양상에서, 바람직한 링커는 어떤 시스테인 아미노산 또는 프로테아제 개열 부위도 내포하지 않는다.
일부 구체예에서, 본 발명의 폴리스타틴 변이체는 하나 또는 그 이상의 폴리스타틴 리간드에 대한 감소되거나 또는 전폐된 결합 친화성을 갖는다. 일정한 양상에서, 본 발명은 액티빈에 대한 감소된 또는 전폐된 결합 친화성을 갖는 폴리스타틴 변이체를 제공한다. 일정한 양상에서, 본 발명은 액티빈에 대한 감소되거나 또는 전폐된 결합 친화성을 갖지만, 미오스타틴에 대한 높은 친화성을 유지하는 폴리스타틴 변이체를 제공한다. 일정한 양상에서, 본 발명은 GDF11에 대한 감소되거나 또는 전폐된 결합 친화성을 갖지만, 미오스타틴에 대한 높은 친화성을 유지하는 폴리스타틴 변이체를 제공한다.
일정한 구체예에서, 본 발명은 폴리스타틴 또는 다른 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드의 리간드, 예를 들면, 액티빈, GDF8 또는 GDF11을 주제 폴리스타틴-관련된 융합 폴리펩티드로 길항하는 것에 관계한다. 따라서, 본 발명의 조성물 및 방법은 하나 또는 그 이상의 이런 리간드의 비정상적인 또는 바람직하지 않게 높은 활성과 연관된 장애를 치료하는데 유용하다.
본 발명의 폴리스타틴 관련된 폴리펩티드는 신호 서열을 포함할 수 있다. 신호 서열은 폴리스타틴 전구체 (가령, 서열 번호:1의 아미노산 1-29), FLRG 전구체 (가령, 서열 번호: 18의 아미노산 1-26), WFIKKN1 전구체 (가령, 서열 번호: 26의 아미노산 1-19), WFIKKN2 전구체 (가령, 서열 번호: 29의 아미노산 1-34)의 선천적 신호 서열, 또는 다른 단백질로부터 신호 서열, 예를 들면, 조직 플라스미노겐 활성인자 (TPA) 신호 서열 또는 꿀벌 멜라틴 (HBM) 신호 서열일 수 있다.
추가 N-연결된 당화 부위 (N-X-S/T)가 폴리스타틴 관련된 폴리펩티드에 부가될 수 있고, 그리고 폴리스타틴-관련된 융합 단백질의 혈청 반감기를 증가시킬 수 있다. N-X-S/T 서열은 일반적으로, 리간드-결합 주머니의 외부 위치에서 도입될 수 있다. N-X-S/T 서열은 폴리스타틴 서열 및 Fc 또는 다른 융합 성분 사이에 링커 내로 도입될 수 있다. 이런 부위는 기존 S 또는 T에 대하여 정확한 위치에서 N을 도입함으로써, 또는 기존 N에 상응하는 위치에서 S 또는 T를 도입함으로써 최소 노력으로 도입될 수 있다. 당화될 것으로 예측되는 임의의 S는 당화에 의해 제공된 보호 때문에, 면역원성 부위를 창출하지 않으면서 T로 변경될 수 있다. 유사하게, 당화될 것으로 예측되는 임의의 T는 S로 변경될 수 있다. 따라서, 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드 변이체는 하나 또는 그 이상의 추가, 비-내인성 N-연결된 당화 공통 서열을 포함할 수 있다.
일정한 구체예에서, 본 발명은 치료 효력, 또는 안정성 (가령, 탈체 저장 수명 및 생체내에서 단백질분해 분해에 대한 내성)을 증강하는 것과 같은 목적을 위해 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드의 구조를 변형함으로써 기능적 변이체를만드는 것을 예기한다. 변형된 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드는 또한, 예로서 아미노산 치환, 결실, 또는 부가에 의해 생산될 수 있다. 가령, 이소류신 또는 발린으로 류신의 단리된 대체, 글루타민산염으로 아스파르트산염의 단리된 대체, 세린으로 트레오닌의 단리된 대체, 또는 구조적으로 관련된 아미노산으로 아미노산의 유사한 대체 (가령, 보존성 돌연변이)가 결과의 분자의 생물학적 활성에 대한 주요 효과를 갖지 않을 것이라고 예상하는 것은 합리적이다. 보존성 대체는 측쇄에서 관련되는 아미노산의 패밀리 내에서 발생하는 것들이다. 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드의 아미노산 서열에서 변화가 기능적 동족체를 유발하는 지의 여부는 야생형 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드와 유사한 방식으로 세포에서 반응을 발생시키거나, 또는 야생형 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드와 유사한 방식으로 하나 또는 그 이상의 리간드, 예를 들면, 미오스타틴 또는 액티빈에 결합하는 변이체 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드의 능력을 사정함으로써 쉽게 결정될 수 있다.
일정한 구체예에서, 본 발명은 폴리펩티드의 당화를 변경하기 위해 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드의 특정한 돌연변이를 예기한다. 이런 돌연변이는 하나 또는 그 이상의 당화 부위, 예를 들면, O-연결된 또는 N-연결된 당화 부위를 도입하거나 또는 제거하기 위해 선별될 수 있다. 아스파라긴-연결된 당화 인식 부위는 일반적으로, 적절한 세포 당화 효소에 의해 특이적으로 인식되는 트리펩티드 서열, 아스파라긴-X-트레오닌 (여기서 "X"는 임의의 아미노산)을 포함한다. 변경은 또한, 야생형 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드의 서열에 하나 또는 그 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기의 부가, 또는 치환에 의해 만들어질 수 있다 (O-연결된 당화 부위의 경우). 당화 인식 부위의 첫 번째 또는 세 번째 아미노산 위치 중에서 어느 하나 또는 둘 모두에서 다양한 아미노산 치환 또는 결실 (및/또는 두 번째 위치에서 아미노산 결실)은 변형된 트리펩티드 서열에서 비-당화를 유발한다. 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드 상에서 탄수화물 모이어티의 숫자를 증가시키는 다른 수단은 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드에 글리코시드의 화학적 또는 효소적 연계이다. 이용된 연계 방식에 따라, 당(들)은 (a) 아르기닌 및 히스티딘, (b) 유리 카르복실 기, (c) 유리 술피드릴 기, 예를 들면, 시스테인의 것들, (d) 유리 히드록실 기, 예를 들면, 세린, 트레오닌, 또는 히드록시프롤린의 것들, (e) 방향족 잔기, 예를 들면, 페닐알라닌, 티로신, 또는 트립토판의 것들, 또는 (f) 글루타민의 아미드 기에 부착될 수 있다. 이들 방법은 1987년 9월 11일자 공개된 WO 87/05330에서, 그리고 본원에서 참조로서 편입된 Aplin and Wriston (1981) CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306에서 설명된다. 하나 또는 그 이상의 탄수화물 모이어티의 제거는 화학적으로 및/또는 효소적으로 달성될 수 있다. 화학적 탈당화는 예로서, 화합물 트리플루오로메탄술폰산, 또는 동등한 화합물에 대한 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드의 노출을 수반할 수 있다. 이러한 처리는 아미노산 서열을 무손상 상태로 남겨두면서, 연결 당 (N-아세틸글루코사민 또는 N-아세틸갈락토사민)을 제외하고 대부분의 또는 모든 당의 개열을 유발한다. 화학적 탈당화는 Hakimuddin et al. (1987) Arch. Biochem. Biophys. 259:52 및 Edge et al. (1981) Anal. Biochem. 118:131에 의해 더욱 설명된다. 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드 상에서 탄수화물 모이어티의 효소적 개열은 Thotakura et al. (1987) Meth. Enzymol. 138:350에 의해 설명된 바와 같이 다양한 엔도- 및 엑소-글리코시다아제의 이용에 의해 달성될 수 있다. 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드의 서열은 타당하면, 이용된 발현 시스템의 유형에 따라 조정될 수 있는데, 그 이유는 포유류, 효모, 곤충 및 식물 세포 모두 펩티드의 아미노산 서열에 의해 영향을 받을 수 있는 다른 당화 패턴을 도입할 수 있다. 일반적으로, 인간에서 이용을 위한 폴리스타틴-관련된 융합 단백질은 비록 다른 포유류 발현 세포주 역시 유용할 것으로 예상되긴 하지만, 적절한 당화를 제공하는 포유류 세포주, 예를 들면, HEK293, COS, 또는 CHO 세포주에서 발현될 것이다.
본 발명은 임의선택적으로, 절두 변이체를 비롯하여, 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드의 변이체, 특히 조합 변이체의 세트를 산출하는 방법을 더욱 예기한다; 조합 돌연변이체의 풀은 기능적 변이체 서열을 확인하는데 특히 유용하다. 이런 조합 라이브러리의 선별검사의 목적은 예로서, 변경된 성질, 예를 들면, 변경된 약물동력학, 또는 변경된 리간드 결합을 갖는 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드 변이체를 산출하는 것일 수 있다. 다양한 선별검사 검정이 아래에 제공되고, 그리고 이런 검정은 변이체를 평가하는데 이용될 수 있다. 가령, 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드 변이체는 리간드, 예를 들면, 액티빈 A, B, C 또는 E, GDF8 또는 GDF11에 결합하는 능력, 또는 리간드 수용체, 예를 들면, ActRIIA 또는 ActRIIB에 대한 리간드의 결합을 예방하는 능력에 대해 선별검사될 수 있다.
폴리스타틴-관련된 폴리펩티드 또는 이의 변이체의 활성은 또한, 세포-기초된 또는 생체내 검정에서 시험될 수 있다. 가령, 근육 생산에 관련된 유전자의 발현에 대한 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드 변이체의 효과가 사정될 수 있다. 이것은 필요에 따라, 하나 또는 그 이상의 재조합 리간드 단백질 (가령, 미오스타틴 또는 액티빈 A)의 존재에서 수행될 수 있고, 그리고 세포는 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드 및/또는 이들의 변이체 및 임의선택적으로, 리간드를 생산하기 위해 형질감염될 수 있다. 유사하게, 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드는 생쥐 또는 다른 동물에 투여될 수 있고, 그리고 하나 또는 그 이상의 근육 성질, 예를 들면, 근육 질량 또는 강도가 사정될 수 있다. 이런 검정은 당분야에서 널리 알려져 있고 일과적이다. 반응성 리포터 유전자가 하류 신호전달에 대한 효과를 모니터링하기 위해 이런 세포주에서 이용될 수 있다.
자연발생 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드에 비하여 선택적 효능을 갖는 조합적으로-유래된 변이체가 산출될 수 있다. 이런 변이체 단백질은 재조합 DNA 구조체로부터 발현될 때, 유전자 요법 프로토콜에서 이용될 수 있다. 유사하게, 돌연변이유발은 상응하는 야생형 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드와 극적으로 상이한 세포내 반감기를 갖는 변이체를 발생시킬 수 있다. 가령, 변경된 단백질은 단백질분해 분해, 또는 선천적 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드의 파괴 또는 만약 그렇지 않으면 비활성화를 유발하는 다른 과정에 더욱 안정되거나 또는 덜 안정되도록 만들어질 수 있다. 이런 변이체 및 이들을 인코딩하는 유전자는 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드의 반감기를 조정함으로써 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드 수준을 변경하는데 활용될 수 있다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드는 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드 내에 자연적으로 존재하는 것에 더하여 번역후 변형을 더욱 포함할 수 있다. 이런 변형은 아세틸화, 카르복실화, 당화, 인산화, 지질화 및 아실화를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 결과적으로, 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드는 비-아미노산 요소, 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜, 지질, 폴리- 또는 모노-사카라이드 및 인산염을 내포할 수 있다. 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드의 기능성에 대한 이런 비-아미노산 요소의 효과는 다른 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드 변이체에 대해 본원에서 설명된 바와 같이 시험될 수 있다. 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드가 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드의 미성숙 형태를 개열함으로써 세포에서 생산될 때, 번역후 처리 또한, 단백질의 정확한 접힘 및/또는 기능에 중요할 수 있다. 상이한 세포 (가령, CHO, COS, HeLa, MDCK, 293, WI38, NIH-3T3 또는 HEK293)는 이런 번역후 활성을 위한 특정한 세포 기구 및 특징적인 기전을 갖고, 그리고 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드의 정확한 변형 및 처리를 담보하도록 선택될 수 있다.
일정한 양상에서, 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드의 기능적 변이체 또는 변형된 형태는 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드의 최소한 일부 및 하나 또는 그 이상의 융합 도메인을 갖는 융합 단백질을 포함한다. 이런 융합 도메인의 널리 공지된 실례는 폴리히스티딘, Glu-Glu, 글루타티온 S 전달효소 (GST), 티오레독신, 단백질 A, 단백질 G, 면역글로불린 중쇄 불변 영역 (가령, Fc), 말토오스 결합 단백질 (MBP), 또는 인간 혈청 알부민을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 융합 도메인은 원하는 성질을 부여하기 위해 선별될 수 있다. 가령, 일부 융합 도메인은 친화성 크로마토그래피에 의한 융합 단백질의 단리에 특히 유용하다. 친화성 정제의 목적으로, 친화성 크로마토그래피를 위한 유관한 매트릭스, 예를 들면, 글루타티온-, 아밀라아제-, 및 니켈- 또는 코발트- 접합된 수지가 이용된다. 이런 매트릭스 중에서 다수는 "키트" 형태, 예를 들면, (HIS6) 융합 상대와 함께 이용하기 유용한 Pharmacia GST 정제 시스템 및 QIAexpressTM 시스템 (Qiagen)에서 가용하다. 다른 실례로서, 융합 도메인은 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드의 검출을 용이하게 하기 위해 선별될 수 있다. 이런 검출 도메인의 실례는 다양한 형광 단백질 (가령, GFP)뿐만 아니라 "에피토프 태그"를 포함하는데, 이들은 통상적으로, 특이적 항체가 가용한 짧은 펩티드 서열이다. 특정한 단일클론 항체가 쉽게 가용한 널리 공지된 에피토프 태그는 FLAG, 인플루엔자 바이러스 적혈구응집소 (HA) 및 c-myc 태그를 포함한다. 일부 경우에, 융합 도메인은 예로서, 인자 Xa 또는 트롬빈에 대한 프로테아제 개열 부위를 갖는데, 이들은 유관한 프로테아제가 융합 단백질을 부분적으로 소화하고, 그리고 따라서, 그것으로부터 재조합 단백질을 해방시키는 것을 허용한다. 자유로운 단백질은 이후, 차후 크로마토그래피 분리에 의해 융합 도메인으로부터 단리될 수 있다. 일정한 바람직한 구체예에서, 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드는 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드를 생체내에서 안정시키는 도메인 ("안정제" 도메인)과 융합된다. "안정시키는"은 이것이 감소된 분해, 신장에 의한 감소된 소실, 또는 다른 약동학적 효과 때문인지에 상관없이, 혈청 반감기를 증가시키는 것으로 의미된다. 면역글로불린의 Fc 부분과의 융합은 넓은 범위의 단백질에 대한 바람직한 약동학적 성질을 부여하는 것으로 알려져 있다. 유사하게, 인간 혈청 알부민에 융합은 바람직한 성질을 부여할 수 있다. 선별될 수 있는 융합 도메인의 다른 유형은 다합체화 (가령, 이합체화, 사합체화) 도메인 및 기능적 도메인 (추가 생물학적 기능, 예를 들면, 근육 성장의 추가 자극을 부여한다)을 포함한다.
특정한 실례로서, 본 발명은 면역글로불린의 불변 도메인, 예를 들면, 면역글로불린의 CH1, CH2 또는 CH3 도메인 또는 Fc를 포함하는 폴리펩티드에 융합된 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 인간 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로부터 유래된 Fc 도메인은 아래에 제공된다. CDC 또는 ADCC 활성을 감소시키는 다른 돌연변이가 알려져 있고, 그리고 집합적으로, 임의의 이들 변이체는 본 발명 내에 포함되고 폴리스타틴 융합 단백질의 유리한 성분으로서 이용될 수 있다. 임의선택적으로, 서열 번호: 34의 IgG1 Fc 도메인은 잔기, 예를 들면, Asp-265, Lys-322 및 Asn-434 (상응하는 전장 IgG1에 따라서 넘버링됨)에서 하나 또는 그 이상의 돌연변이를 갖는다. 일정한 경우에, 이들 돌연변이 중에서 하나 또는 그 이상 (가령, Asp-265 돌연변이)을 갖는 돌연변이체 Fc 도메인은 야생형 Fc 도메인에 비하여 Fcγ 수용체에 대한 감소된 결합 능력을 갖는다. 다른 경우에, 이들 돌연변이 중에서 하나 또는 그 이상 (가령, Asn-434 돌연변이)을 갖는 돌연변이체 Fc 도메인은 야생형 Fc 도메인에 비하여 MHC 클래스 I-관련된 Fc-수용체 (FcRN)에 대한 증가된 결합 능력을 갖는다.
인간 IgG1의 Fc 부분 (G1Fc)에 이용될 수 있는 선천적 아미노산 서열의 실례는 아래에 도시된다 (서열 번호: 34). 점선 밑줄은 힌지 영역을 지시하고, 그리고 실선 밑줄은 자연발생 변이체를 갖는 위치를 지시한다. 부분적으로, 본 발명은 서열 번호: 34에 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. G1Fc에서 자연발생 변이체는 서열 번호: 34에서 이용된 넘버링 시스템에 따라 D134 및 L136을 포함할 것이다 (Uniprot P01857을 참조한다).
1 THTCPPCPAP ELLGGPSVFL FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV VVDVSHEDPE
51 VKFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQYNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK
101 VSNKALPAPI EKTISKAKGQ PREPQVYTLP PSREEMTKNQ VSLTCLVKGF
151 YPSDIAVEWE SNGQPENNYK TTPPVLDSDG SFFLYSKLTV DKSRWQQGNV
201 FSCSVMHEAL HNHYTQKSLS LSPGK (서얼 번호: 34)
인간 IgG2의 Fc 부분 (G2Fc)에 이용될 수 있는 선천적 아미노산 서열의 실례는 아래에 도시된다 (서열 번호: 35). 점선 밑줄은 힌지 영역을 지시하고, 실선 밑줄은 자연발생 변이체를 갖는 위치를 지시하고, 그리고 이중 밑줄은 서열에서 데이터 베이스 충돌이 있는 위치를 지시한다 (UniProt P01859에 따라). 부분적으로, 본 발명은 서열 번호: 35에 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다.
1 VECPPCPAPP VAGPSVFLFP PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSHEDPEVQ
51 FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QFNSTFRVVS VLTVVHQDWL NGKEYKCKVS
101 NKGLPAPIEK TISKTKGQPR EPQVYTLPPS REEMTKNQVS LTCLVKGFYP
151 SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPMLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS
201 CSVMHEALHN HYTQKSLSLS PGK (서얼 번호: 35)
인간 IgG3의 Fc 부분 (G3Fc)에 이용될 수 있는 아미노산 서열의 2가지 실례는 아래에 도시된다. G3Fc에서 힌지 영역은 다른 Fc 사슬에서보다 최대 4배 길 수 있고, 그리고 유사한 17-잔기 분절에 의해 선행된 3개의 동일한 15-잔기 분절을 내포한다. 아래에 도시된 첫 번째 G3Fc 서열 (서열 번호: 36)은 단일 15-잔기 분절로 구성되는 짧은 힌지 영역을 내포하고, 반면 두 번째 G3Fc 서열 (서열 번호: 37)은 전장 힌지 영역을 내포한다. 각 경우에, 점선 밑줄은 힌지 영역을 지시하고, 그리고 실선 밑줄은 자연발생 변이체를 갖는 위치를 지시한다 (UniProt P01859에 따라). 부분적으로, 본 발명은 서열 번호: 36, 37에 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다.
1 EPKSCDTPPP CPRCPAPELL GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVVVD
51 VSHEDPEVQF KWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTFRVVSV LTVLHQDWLN
101 GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKTKGQPRE PQVYTLPPSR EEMTKNQVSL
151 TCLVKGFYPS DIAVEWESSG QPENNYNTTP PMLDSDGSFF LYSKLTVDKS
201 RWQQGNIFSC SVMHEALHNR FTQKSLSLSP GK (서얼 번호: 36)
1 ELKTPLGDTT HTCPRCPEPK SCDTPPPCPR CPEPKSCDTP PPCPRCPEPK
51 SCDTPPPCPR CPAPELLGGP SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVVVDVSH
101 EDPEVQFKWY VDGVEVHNAK TKPREEQYNS TFRVVSVLTV LHQDWLNGKE
151 YKCKVSNKAL PAPIEKTISK TKGQPREPQV YTLPPSREEM TKNQVSLTCL
201 VKGFYPSDIA VEWESSGQPE NNYNTTPPML DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ
251 QGNIFSCSVM HEALHNRFTQ KSLSLSPGK (서얼 번호: 37)
G3Fc에서 자연발생 변이체 (예로서, Uniprot P01859를 참조한다)는 서열 번호: 36에서 이용된 넘버링 시스템으로 전환될 때 E68Q, V69, P76L, E79Q, Y81F, D97N, N100D, T124A, S169N, S169del, F221Y를 포함하고, 그리고 본 발명은 이들 변이 중에서 하나 또는 그 이상을 내포하는 G3Fc 도메인을 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 이에 더하여, 인간 면역글로불린 IgG3 유전자 (IGHG3)는 상이한 힌지 길이에 의해 특징화되는 구조적 다형성을 보여준다 [Uniprot P01859를 참조한다]. 구체적으로, 변이체 WIS는 V 영역의 대부분 및 모든 CH1 영역을 결여한다. 이것은 힌지 영역 내에 정상적으로 존재하는 위치 11에 더하여 위치 7에서 추가의 사슬간 이황화 결합을 갖는다. 변이체 ZUC는 V 영역의 대부분, 모든 CH1 영역, 그리고 힌지의 일부를 결여한다. 변이체 OMM은 대립형질 형태 또는 다른 감마 사슬 하위부류를 나타낼 수 있다. 본 발명은 이들 변이체 중에서 하나 또는 그 이상을 내포하는 G3Fc 도메인을 포함하는 추가 융합 단백질을 제공한다.
인간 IgG4의 Fc 부분 (G4Fc)에 이용될 수 있는 선천적 아미노산 서열의 실례는 아래에 도시된다 (서열 번호: 38). 점선 밑줄은 힌지 영역을 지시한다. 부분적으로, 본 발명은 서열 번호: 38에 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다.
1 ESKYGPPCPS CPAPEFLGGP SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVVVDVSQ
51 EDPEVQFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQFNS TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE
101 YKCKVSNKGL PSSIEKTISK AKGQPREPQV YTLPPSQEEM TKNQVSLTCL
151 VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL DSDGSFFLYS RLTVDKSRWQ
201 EGNVFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSLGK (서얼 번호: 38)
Fc 도메인에서 다양한 가공된 돌연변이는 G1Fc 서열 (서열 번호: 34)에 대하여 본원에서 제공되고, 그리고 G2Fc, G3Fc 및 G4Fc에서 유사한 돌연변이는 도면 1의 G1Fc에서 그들의 정렬로부터 유래될 수 있다. 부등한 힌지 길이로 인해, 아이소타입 정렬 (도면 1)에 근거된 유사한 Fc 위치는 서열 번호: 34, 35, 36 및 38에서 상이한 아미노산 번호를 소유한다.
단일 세포주로부터 비대칭 면역글로불린-기초된 단백질의 대규모 생산에서 발생하는 문제는 "사슬 연관 문제"로서 알려져 있다. 이중특이적 항체의 생산에서 두드러지게 직면하는 바와 같이, 사슬 연관 문제는 상이한 중쇄 및/또는 경쇄가 단일 세포주에서 생산될 때 내재적으로 비롯되는 복수 조합 가운데서 원하는 다중사슬 단백질을 효율적으로 생산하는 과제에 관계한다 [가령, Klein et al (2012) mAbs 4:653-663을 참조한다]. 이러한 문제는 2개의 상이한 중쇄 및 2개의 상이한 경쇄가 동일한 세포에서 생산될 때 가장 급성인데, 이러한 사례에서 단지 하나만 전형적으로 요망될 때 총 16가지의 가능한 사슬 조합이 있다 (비록 이들 중에서 일부는 동일하긴 하지만). 그럼에도 불구하고, 동일한 원리가 단지 2개의 상이한 (비대칭) 중쇄만을 통합하는 원하는 다중사슬 융합 단백질의 축소된 수율을 설명한다.
허용되는 수율에서 바람직한 비대칭 융합 단백질을 생산하기 위해 단일 세포주에서 Fc-내포 융합 폴리펩티드 사슬의 원하는 대합을 증가시키는 다양한 방법이 당분야에서 공지된다 [가령, Klein et al (2012) mAbs 4:653-663을 참조한다]. Fc-내포 사슬의 원하는 대합을 획득하는 방법은 전하-기초된 대합 (정전 스티어링), "노브-인투-홀" 입체 대합, 그리고 SEEDbody 대합을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 가령, Ridgway et al (1996) Protein Eng 9:617-621; Merchant et al (1998) Nat Biotech 16:677-681; Davis et al (2010) Protein Eng Des Sel 23:195-202를 참조한다. 본원에서 증명된 바와 같이, 단일 WFIKKN2 폴리펩티드 팔을 포함하는 비대칭 Fc 융합 단백질 (여기서 전하-기초된 대합은 비대칭 폴리펩티드 사슬의 정확한 정합을 증진한다)은 이중 WFIKKN2 폴리펩티드 팔을 포함하는 대칭적 Fc 융합 단백질보다 훨씬 큰 효능 (더욱 낮은 IC50)으로 세포-기초된 리포터 유전자 검정에서 미오스타틴 활성을 저해한다.
일정한 구체예에서, 본 발명은 전하 대합 (정전 스티어링)의 기초에서 상보성이도록 가공된 Fc 서열을 이용하여 비대칭 Fc-내포 폴리펩티드 사슬의 원하는 대합을 제공한다. 정전 상보성을 갖는 한 쌍의 Fc 서열 중에서 하나는 임의선택적 링커가 있거나 또는 없이, 구조체의 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드 (가령, 폴리스타틴 폴리펩티드, FLRG 폴리펩티드, WFIKKN1 폴리펩티드, 또는 WFIKKN2 폴리펩티드)에 임의적으로 융합되어 폴리스타틴-관련된 융합 폴리펩티드를 산출할 수 있다. 이러한 단일 사슬은 원하는 다중사슬 구조체 (폴리스타틴-관련된 융합 단백질)의 산출에 우호적이도록 첫 번째 Fc에 상보적인 Fc 서열과 함께, 선택되는 세포에서 공동발현될 수 있다. 정전 스티어링에 근거된 이러한 실례에서, 서열 번호: 39 [인간 G1Fc(E134K/D177K)] 및 서열 번호: 40 [인간 G1Fc(K170D/K187D)]은 상보성 Fc 서열의 실례인데, 여기서 가공된 아미노산 치환은 이중 밑줄 표시되고, 그리고 구조체의 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드는 서열 번호: 39 또는 서열 번호: 40에 융합될 수 있지만 둘 모두에 융합되지는 않는다. 선천적 hG1Fc, 선천적 hG2Fc, 선천적 hG3Fc 및 선천적 hG4Fc 사이에 고도의 아미노산 서열 동일성을 고려할 때, hG2Fc, hG3Fc 또는 hG4Fc (도면 1을 참조한다)에서 상응하는 위치에서 아미노산 치환은 아래의 상보성 hG1Fc 쌍 (서열 번호: 39, 40) 대신에 이용될 수 있는 상보성 Fc 쌍을 산출할 것으로 인지될 수 있다.
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51 VKFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQYNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK
101 VSNKALPAPI EKTISKAKGQ PREPQVYTLP PSRKEMTKNQ VSLTCLVKGF
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201 FSCSVMHEAL HNHYTQKSLS LSPGK (서얼 번호: 39)
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201 FSCSVMHEAL HNHYTQKSLS LSPGK (서얼 번호: 40)
부분적으로, 본 발명은 입체 상보성을 위해 가공된 Fc 서열을 이용하여 비대칭 Fc-내포 폴리펩티드 사슬의 원하는 대합을 제공한다. 부분적으로, 본 발명은 입체 상보성의 실례로서 노브-인투-홀 대합을 제공한다. 입체 상보성을 갖는 한 쌍의 Fc 서열 중에서 하나는 임의선택적 링커가 있거나 또는 없이, 구조체의 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드 (가령, 폴리스타틴 폴리펩티드, FLRG 폴리펩티드, WFIKKN1 폴리펩티드, 또는 WFIKKN2 폴리펩티드)에 임의적으로 융합되어 폴리스타틴-관련된 융합 폴리펩티드를 산출할 수 있다. 이러한 단일 사슬은 원하는 다중사슬 구조체의 산출에 우호적이도록 첫 번째 Fc에 상보적인 Fc 서열과 함께, 선택되는 세포에서 공동발현될 수 있다. 노브-인투-홀 대합에 근거된 이러한 실례에서, 서열 번호: 41 [인간 G1Fc(T144Y)] 및 서열 번호: 42 [인간 G1Fc(Y185T)]는 상보성 Fc 서열의 실례인데, 여기서 가공된 아미노산 치환은 이중 밑줄 표시되고, 그리고 구조체의 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드는 서열 번호: 41 또는 서열 번호: 42에 융합될 수 있지만 둘 모두에 융합되지는 않는다. 선천적 hG1Fc, 선천적 hG2Fc, 선천적 hG3Fc 및 선천적 hG4Fc 사이에 고도의 아미노산 서열 동일성을 고려하면, hG2Fc, hG3Fc 또는 hG4Fc (도면 1을 참조한다)에서 상응하는 위치에서 아미노산 치환은 아래의 상보성 hG1Fc 쌍 (서열 번호: 41, 42) 대신에 이용될 수 있는 상보성 Fc 쌍을 산출할 것으로 인지될 수 있다.
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151 YPSDIAVEWE SNGQPENNYK TTPPVLDSDG SFFLYSKLTV DKSRWQQGNV
201 FSCSVMHEAL HNHYTQKSLS LSPGK (서얼 번호: 41)
1 THTCPPCPAP ELLGGPSVFL FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV VVDVSHEDPE
51 VKFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQYNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK
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151 YPSDIAVEWE SNGQPENNYK TTPPVLDSDG SFFLTSKLTV DKSRWQQGNV
201 FSCSVMHEAL HNHYTQKSLS LSPGK (서얼 번호: 42)
가공된 이황화 결합과 합동된 노브-인투-홀 대합에 근거된 Fc 상보성의 실례는 서열 번호: 43 [hG1Fc(S132C/T144W)] 및 서열 번호: 44 [hG1Fc(Y127C/T144S/L146A/Y185V)]에서 개시된다. 이들 서열에서 가공된 아미노산 치환은 이중 밑줄 표시되고, 그리고 구조체의 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드는 서열 번호: 43 또는 서열 번호: 44에 융합될 수 있지만 둘 모두에 융합되지는 않는다. 선천적 hG1Fc, 선천적 hG2Fc, 선천적 hG3Fc 및 선천적 hG4Fc 사이에 고도의 아미노산 서열 동일성을 고려하면, hG2Fc, hG3Fc 또는 hG4Fc (도면 1을 참조한다)에서 상응하는 위치에서 아미노산 치환은 아래의 상보성 hG1Fc 쌍 (서열 번호: 43, 44) 대신에 이용될 수 있는 상보성 Fc 쌍을 산출할 것으로 인지될 수 있다.
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51 VKFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQYNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK
101 VSNKALPAPI EKTISKAKGQ PREPQVYTLP PCREEMTKNQ VSLWCLVKGF
151 YPSDIAVEWE SNGQPENNYK TTPPVLDSDG SFFLYSKLTV DKSRWQQGNV
201 FSCSVMHEAL HNHYTQKSLS LSPGK (서얼 번호: 43)
1 THTCPPCPAP ELLGGPSVFL FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV VVDVSHEDPE
51 VKFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQYNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK
101 VSNKALPAPI EKTISKAKGQ PREPQVCTLP PSREEMTKNQ VSLSCAVKGF
151 YPSDIAVEWE SNGQPENNYK TTPPVLDSDG SFFLVSKLTV DKSRWQQGNV
201 FSCSVMHEAL HNHYTQKSLS LSPGK (서얼 번호: 44)
부분적으로, 본 발명은 인간 IgG 및 IgA CH3 도메인의 수지양 β-가닥 분절을 산출하도록 가공된 Fc 서열을 이용하여 비대칭 Fc-내포 폴리펩티드 사슬의 원하는 대합을 제공한다. 이런 방법은 SEEDbody 융합 단백질의 형성을 허용하는 가닥-교환 가공된 도메인 (SEED) CH3 이형이합체의 이용을 포함한다 [가령, Davis et al (2010) Protein Eng Design Sel 23:195-202를 참조한다]. SEEDbody 상보성을 갖는 한 쌍의 Fc 서열 중에서 하나는 임의선택적 링커가 있거나 또는 없이, 구조체의 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드 (가령, 폴리스타틴 폴리펩티드, FLRG 폴리펩티드, WFIKKN1 폴리펩티드, 또는 WFIKKN2 폴리펩티드)에 임의적으로 융합되어 폴리스타틴-관련된 융합 폴리펩티드를 산출할 수 있다. 이러한 단일 사슬은 원하는 다중사슬 구조체의 산출에 우호적이도록 첫 번째 Fc에 상보적인 Fc 서열과 함께, 선택되는 세포에서 공동발현될 수 있다. SEEDbody (Sb) 대합에 근거된 이러한 실례에서, 서열 번호: 45 [hG1Fc(SbAG)] 및 서열 번호: 46 [hG1Fc(SbGA)]은 상보성 IgG Fc 서열의 실례인데, 여기서 IgA Fc로부터 가공된 아미노산 치환은 이중 밑줄 표시되고, 그리고 구조체의 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드는 서열 번호: 45 또는 서열 번호: 46에 융합될 수 있지만 둘 모두에 융합되지는 않는다. 선천적 hG1Fc, 선천적 hG2Fc, 선천적 hG3Fc 및 선천적 hG4Fc 사이에 고도의 아미노산 서열 동일성을 고려하면, hG1Fc, hG2Fc, hG3Fc 또는 hG4Fc (도면 1을 참조한다)에서 상응하는 위치에서 아미노산 치환은 아래의 상보성 IgG-IgA 쌍 (서열 번호: 45, 46)에서 이용될 수 있는 Fc 단위체를 산출할 것으로 인지될 수 있다.
1 THTCPPCPAP ELLGGPSVFL FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV VVDVSHEDPE
51 VKFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQYNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK
101 VSNKALPAPI EKTISKAKGQ PFRPEVHLLP PSREEMTKNQ VSLTCLARGF
151 YPKDIAVEWE SNGQPENNYK TTPSRQEPSQ GTTTFAVTSK LTVDKSRWQQ
201 GNVFSCSVMH EALHNHYTQK TISLSPGK (서얼 번호: 45)
1 THTCPPCPAP ELLGGPSVFL FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV VVDVSHEDPE
51 VKFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQYNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK
101 VSNKALPAPI EKTISKAKGQ PREPQVYTLP PPSEELALNE LVTLTCLVKG
151 FYPSDIAVEW ESNGQELPRE KYLTWAPVLD SDGSFFLYSI LRVAAEDWKK
201 GDTFSCSVMH EALHNHYTQK SLDRSPGK (서얼 번호: 46)
융합 단백질의 상이한 요소는 원하는 기능성과 일치하는 임의의 방식으로 배열될 수 있는 것으로 이해된다. 가령, 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드가 이종성 도메인의 C 말단에 배치될 수 있거나, 또는 대안으로, 이종성 도메인이 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드의 C 말단에 배치될 수 있다. 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드 도메인 및 이종성 도메인은 융합 단백질 내에서 인접할 필요가 없고, 그리고 추가 도메인 또는 아미노산 서열이 어느 한쪽 도메인의 C- 또는 N 말단에 또는 이들 도메인 사이에 포함될 수 있다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "면역글로불린 Fc 도메인" 또는 단순히 "Fc"는 면역글로불린 사슬 불변 영역, 바람직하게는 면역글로불린 중쇄 불변 영역, 또는 이의 부분의 카르복실 말단 부분을 의미하는 것으로 이해된다. 가령, 면역글로불린 Fc 영역은 1) CH1 도메인, CH2 도메인 및 CH3 도메인, 2) CH1 도메인 및 CH2 도메인, 3) CH1 도메인 및 CH3 도메인, 4) CH2 도메인 및 CH3 도메인, 또는 5) 2개 또는 그 이상의 도메인 및 면역글로불린 힌지 영역의 조합을 포함할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 면역글로불린 Fc 영역은 최소한 면역글로불린 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하고, 그리고 바람직하게는, CH1 도메인을 결여한다. 폴리스타틴 폴리펩티드는 단지 면역글로불린의 도메인, 예를 들면, CH1 도메인, CH2 도메인 또는 CH3 도메인만을 포함할 수 있는 것으로 또한 이해된다. 이들 도메인 중에서 다수는 바람직한 약동학적 성질뿐만 아니라 이합체화 또는 더욱 높은 차수 다합체화를 부여한다.
한 구체예에서, 중쇄 불변 영역이 유래되는 면역글로불린의 부류는 IgG (Igγ) (γ 하위부류 1, 2, 3 또는 4)이다. 면역글로불린의 다른 부류, IgA (Igα), IgD (Igδ), IgE (Igε) 및 IgM (Igμ)가 이용될 수 있다. 적절한 면역글로불린 중쇄 불변 영역의 선택은 U.S. 특허 번호 5,541,087 및 5,726,044에서 상세하게 논의된다. 특정 결과를 달성하기 위해 일정한 면역글로불린 부류 및 하위부류로부터 특정 면역글로불린 중쇄 불변 영역 서열의 선택은 당분야의 기술 수준 내에 있는 것으로 고려된다. 면역글로불린 Fc 영역을 인코딩하는 DNA 구조체의 부분은 바람직하게는, 힌지 도메인의 최소한 일부, 그리고 바람직하게는, Fc 감마의 CH3 도메인, 또는 IgA, IgD, IgE 또는 IgM 중에서 한 가지에서 상동성 도메인의 최소한 일부를 포함한다.
게다가, 면역글로불린 중쇄 불변 영역 내에 아미노산의 치환 또는 결실은 본원에서 개시된 방법 및 조성물의 실시에서 유용할 수 있는 것으로 예기된다. 한 가지 실례는 아미노산 치환을 위쪽 CH2 영역에 도입하여 Fc 수용체에 대한 감소된 친화성을 갖는 Fc 변이체를 창출하는 것일 것이다 (Cole et al. (1997) J. Immunol. 159:3613). 추가적으로, 많은 사례에서, C 말단 리신, 또는 K는 제거될 것이고, 그리고 따라서, 본원에서 설명된 임의의 폴리펩티드는 Fc 도메인에서 발견되는 C 말단 K, 예를 들면, 서열 번호: 34-46에서 도시된 것들을 생략할 수 있다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드는 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드를 안정시킬 수 있는 하나 또는 그 이상의 변형을 내포한다. 가령, 이런 변형은 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드의 시험관내 반감기를 증강하거나, 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드의 순환 반감기를 증강하거나 또는 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드의 단백질분해 분해를 감소시킨다. 이런 안정화 변형은 융합 단백질 (예로서, 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드 및 안정제 도메인을 포함하는 융합 단백질 포함), 당화 부위의 변형 (예로서, 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드에 당화 부위의 부가 포함), 그리고 탄수화물 모이어티의 변형 (예로서, 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드로부터 탄수화물 모이어티의 제거 포함)을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 융합 단백질의 경우에, 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드는 안정제 도메인, 예를 들면, IgG 분자 (가령, Fc 도메인)에 융합된다. 본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "안정제 도메인"은 융합 단백질의 경우에서처럼 융합 도메인 (가령, Fc)을 지칭할 뿐만 아니라 비단백질성 변형, 예를 들면, 탄수화물 모이어티, 또는 비단백질성 중합체, 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다.
일정한 구체예에서, 본 발명은 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드의 가용한 단리되고 및/또는 정제된 형태를 만드는데, 이들은 다른 단백질로부터 단리되거나, 또는 만약 그렇지 않으면 다른 단백질이 실제적으로 없다. 일정한 구체예에서, 본 발명은 정제에 유리한 성질을 소유하는 상호작용 쌍 (예로서, Fc 도메인)의 부착에 의해 치료적으로 활성 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드의 정제를 용이하게 한다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드 (변형되지 않은 또는 변형된)는 다양한 공지된 기술에 의해 생산될 수 있다. 가령, 이런 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드는 표준 단백질 화학 기술, 예를 들면, Bodansky, M. Principles of Peptide Synthesis, Springer Verlag, Berlin (1993) 및 Grant G. A. (ed.), Synthetic Peptides: A User's Guide, W. H. Freeman and Company, New York (1992)에서 설명된 것들을 이용하여 합성될 수 있다. 이에 더하여, 자동화된 펩티드 합성장치는 상업적으로 가용하다 (가령, Advanced ChemTech Model 396; Milligen/Biosearch 9600). 대안으로, 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드, 이들의 단편 또는 변이체는 당분야에서 널리 공지된 바와 같은 다양한 발현 시스템 (가령, 대장균 (E. coli), 중국 햄스터 난소 세포, COS 세포, 배큘로바이러스)을이용하여 재조합적으로 생산될 수 있다 (또한 하기를 참조한다). 추가 구체예에서, 변형된 또는 변형되지 않은 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드는 예로서, 프로테아제, 예를 들면, 트립신, 서몰리신, 키모트립신, 펩신, 또는 대합된 염기성 아미노산 전환 효소 (PACE)를 이용함으로써 자연발생 또는 재조합적으로 생산된 전장 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드의 소화에 의해 생산될 수 있다. 컴퓨터 분석 (상업적으로 가용한 소프트웨어, 예를 들면, MacVector, Omega, PCGene, Molecular Simulation, Inc.를 이용하여)이 단백질분해 개열 부위를 확인하는데 이용될 수 있다. 대안으로, 이런 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드는 예로서, 당분야에서 공지된 표준 기술에 의해, 예를 들면, 화학적 개열 (가령, 브롬화시안, 히드록실아민)에 의해 자연발생 또는 재조합적으로 생산된 전장 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드로부터 생산될 수 있다.
본원에서 개시된 임의의 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드는 원하는 효과, 예를 들면, 폴리스타틴-관련된 장애의 치료 (가령, 치료가 필요한 개체에서 근육 질량 및/또는 강도의 증가, 치료가 필요한 개체에서 근육 상실의 치료 또는 예방, 치료가 필요한 개체에서 근육 상실의 하나 또는 그 이상의 합병증의 치료 또는 예방; 치료가 필요한 개체에서 헤모글로빈 농도 또는 적혈구 수치의 증가, 치료가 필요한 개체에서 부적당한 헤모글로빈 농도 또는 적혈구 수치의 치료 또는 예방, 치료가 필요한 개체에서 부적당한 헤모글로빈 농도 또는 적혈구 수치의 하나 또는 그 이상의 합병증의 치료 또는 예방; 치료가 필요한 개체에서 뼈 질량 및/또는 강도의 증가, 치료가 필요한 개체에서 뼈 상실 또는 취약성의 치료 또는 예방, 치료가 필요한 개체에서 뼈 상실 또는 취약성의 하나 또는 그 이상의 합병증의 치료 또는 예방; 또는 치료가 필요한 개체에서 암의 치료)를 달성하기 위해 본 발명의 하나 또는 그 이상의 추가 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드와 합동될 수 있다. 가령, 본원에서 개시된 폴리스타틴 폴리펩티드는 i) 본원에서 개시된 하나 또는 그 이상의 추가 FLRG 폴리펩티드, ii) 본원에서 개시된 하나 또는 그 이상의 WFIKKN1 폴리펩티드 및/또는 iii) 본원에서 개시된 하나 또는 그 이상의 WFIKKN2 폴리펩티드와 합동으로 이용될 수 있다.
3. 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산
일정한 양상에서, 본 발명은 본원에서 개시된 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드 중에서 한 가지를 인코딩하는 단리된 및/또는 재조합 핵산을 제공한다. 주제 핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 이런 핵산은 DNA 또는 RNA 분자일 수 있다. 이들 핵산은 예로서, 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드를 만들기 위한 방법에서 이용될 수 있다.
가령, 다음의 서열은 자연발생 인간 폴리스타틴 전구체 폴리펩티드 (서열 번호: 47) (NCBI 참조 서열: NM_013409.2의 뉴클레오티드 359-1390)를 인코딩한다:
agagtgg (서얼 번호: 47)
다음의 서열은 성숙 FST315 폴리펩티드 (서열 번호: 48)를 인코딩한다.
Gggaactgctggctccgtcaagcgaagaacggccgctgccaggtcctgtacaagaccgaactgagcaaggaggagtgctgcagcaccggccggctgagcacctcgtggaccgaggaggacgtgaatgacaacacactcttcaagtggatgattttcaacgggggcgcccccaactgcatcccctgtaaagaaacgtgtgagaacgtggactgtggacctgggaaaaaatgccgaatgaacaagaagaacaaaccccgctgcgtctgcgccccggattgttccaacatcacctggaagggtccagtctgcgggctggatgggaaaacctaccgcaatgaatgtgcactcctaaaggcaagatgtaaagagcagccagaactggaagtccagtaccaaggcagatgtaaaaagacttgtcgggatgttttctgtccaggcagctccacatgtgtggtggaccagaccaataatgcctactgtgtgacctgtaatcggatttgcccagagcctgcttcctctgagcaatatctctgtgggaatgatggagtcacctactccagtgcctgccacctgagaaaggctacctgcctgctgggcagatctattggattagcctatgagggaaagtgtatcaaagcaaagtcctgtgaagatatccagtgcactggtgggaaaaaatgtttatgggatttcaaggttgggagaggccggtgttccctctgtgatgagctgtgccctgacagtaagtcggatgagcctgtctgtgccagtgacaatgccacttatgccagcgagtgtgccatgaaggaagctgcctgctcctcaggtgtgctactggaagtaaagcactccggatcttgcaactccatttcggaagacaccgaggaagaggaggaagatgaagaccaggactacagctttcctatatcttctattctagagtgg (서얼 번호: 48)
다음의 서열은 FST288 폴리펩티드 (서열 번호: 49)를 인코딩한다.
gggaactgctggctccgtcaagcgaagaacggccgctgccaggtcctgtacaagaccgaactgagcaaggaggagtgctgcagcaccggccggctgagcacctcgtggaccgaggaggacgtgaatgacaacacactcttcaagtggatgattttcaacgggggcgcccccaactgcatcccctgtaaagaaacgtgtgagaacgtggactgtggacctgggaaaaaatgccgaatgaacaagaagaacaaaccccgctgcgtctgcgccccggattgttccaacatcacctggaagggtccagtctgcgggctggatgggaaaacctaccgcaatgaatgtgcactcctaaaggcaagatgtaaagagcagccagaactggaagtccagtaccaaggcagatgtaaaaagacttgtcgggatgttttctgtccaggcagctccacatgtgtggtggaccagaccaataatgcctactgtgtgacctgtaatcggatttgcccagagcctgcttcctctgagcaatatctctgtgggaatgatggagtcacctactccagtgcctgccacctgagaaaggctacctgcctgctgggcagatctattggattagcctatgagggaaagtgtatcaaagcaaagtcctgtgaagatatccagtgcactggtgggaaaaaatgtttatgggatttcaaggttgggagaggccggtgttccctctgtgatgagctgtgccctgacagtaagtcggatgagcctgtctgtgccagtgacaatgccacttatgccagcgagtgtgccatgaaggaagctgcctgctcctcaggtgtgctactggaagtaaagcactccggatcttgcaac
(서열 번호: 49)
다음의 서열은 성숙 FST291 폴리펩티드 (서열 번호: 50)를 인코딩한다.
Gggaactgctggctccgtcaagcgaagaacggccgctgccaggtcctgtacaagaccgaactgagcaaggaggagtgctgcagcaccggccggctgagcacctcgtggaccgaggaggacgtgaatgacaacacactcttcaagtggatgattttcaacgggggcgcccccaactgcatcccctgtaaagaaacgtgtgagaacgtggactgtggacctgggaaaaaatgccgaatgaacaagaagaacaaaccccgctgcgtctgcgccccggattgttccaacatcacctggaagggtccagtctgcgggctggatgggaaaacctaccgcaatgaatgtgcactcctaaaggcaagatgtaaagagcagccagaactggaagtccagtaccaaggcagatgtaaaaagacttgtcgggatgttttctgtccaggcagctccacatgtgtggtggaccagaccaataatgcctactgtgtgacctgtaatcggatttgcccagagcctgcttcctctgagcaatatctctgtgggaatgatggagtcacctactccagtgcctgccacctgagaaaggctacctgcctgctgggcagatctattggattagcctatgagggaaagtgtatcaaagcaaagtcctgtgaagatatccagtgcactggtgggaaaaaatgtttatgggatttcaaggttgggagaggccggtgttccctctgtgatgagctgtgccctgacagtaagtcggatgagcctgtctgtgccagtgacaatgccacttatgccagcgagtgtgccatgaaggaagctgcctgctcctcaggtgtgctactggaagtaaagcactccggatcttgcaactccatttcgtgg (서얼 번호: 50)
가령, 다음의 서열 (서열 번호: 51)은 자연발생 인간 FLRG 전구체 폴리펩티드 (NCBI 참조 서열 NM_005860.2의 뉴클레오티드 36-824)를 인코딩한다. 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드는 밑줄 표시된다.
1 atgcgtcccg gggcgccagg gccactctgg cctctgccct ggggggccct
51 ggcttgggcc gtgggcttcg tgagctccat gggctcgggg aaccccgcgc
101 ccggtggtgt ttgctggctc cagcagggcc aggaggccac ctgcagcctg
151 gtgctccaga ctgatgtcac ccgggccgag tgctgtgcct ccggcaacat
201 tgacaccgcc tggtccaacc tcacccaccc ggggaacaag atcaacctcc
251 tcggcttctt gggccttgtc cactgccttc cctgcaaaga ttcgtgcgac
301 ggcgtggagt gcggcccggg caaggcgtgc cgcatgctgg ggggccgccc
351 gcgctgcgag tgcgcgcccg actgctcggg gctcccggcg cggctgcagg
401 tctgcggctc agacggcgcc acctaccgcg acgagtgcga gctgcgcgcc
451 gcgcgctgcc gcggccaccc ggacctgagc gtcatgtacc ggggccgctg
501 ccgcaagtcc tgtgagcacg tggtgtgccc gcggccacag tcgtgcgtcg
551 tggaccagac gggcagcgcc cactgcgtgg tgtgtcgagc ggcgccctgc
601 cctgtgccct ccagccccgg ccaggagctt tgcggcaaca acaacgtcac
651 ctacatctcc tcgtgccaca tgcgccaggc cacctgcttc ctgggccgct
701 ccatcggcgt gcgccacgcg ggcagctgcg caggcacccc tgaggagccg
751 ccaggtggtg agtctgcaga agaggaagag aacttcgtg
(서열 번호: 51)
다음의 서열 (서열 번호: 52)은 성숙 인간 FLRG 폴리펩티드 (NCBI 참조 서열 NM_005860.2의 뉴클레오티드 114-824)를 인코딩한다.
1 atgggctcgg ggaaccccgc gcccggtggt gtttgctggc tccagcaggg
51 ccaggaggcc acctgcagcc tggtgctcca gactgatgtc acccgggccg
101 agtgctgtgc ctccggcaac attgacaccg cctggtccaa cctcacccac
151 ccggggaaca agatcaacct cctcggcttc ttgggccttg tccactgcct
201 tccctgcaaa gattcgtgcg acggcgtgga gtgcggcccg ggcaaggcgt
251 gccgcatgct ggggggccgc ccgcgctgcg agtgcgcgcc cgactgctcg
301 gggctcccgg cgcggctgca ggtctgcggc tcagacggcg ccacctaccg
351 cgacgagtgc gagctgcgcg ccgcgcgctg ccgcggccac ccggacctga
401 gcgtcatgta ccggggccgc tgccgcaagt cctgtgagca cgtggtgtgc
451 ccgcggccac agtcgtgcgt cgtggaccag acgggcagcg cccactgcgt
501 ggtgtgtcga gcggcgccct gccctgtgcc ctccagcccc ggccaggagc
551 tttgcggcaa caacaacgtc acctacatct cctcgtgcca catgcgccag
601 gccacctgct tcctgggccg ctccatcggc gtgcgccacg cgggcagctg
651 cgcaggcacc cctgaggagc cgccaggtgg tgagtctgca gaagaggaag
701 agaacttcgt g (서얼 번호: 52)
가령, 다음의 서열 (서열 번호: 53)은 자연발생 인간 WFIKKN1 전구체 폴리펩티드 (NCBI 참조 서열 NM_053284.2의 뉴클레오티드 243-1886)를 인코딩한다. 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드는 밑줄 표시된다.
1 atgcccgccc tacgtccact cctgccgctc ctgctcctcc tccggctgac
51 ctcgggggct ggcttgctgc cagggctggg gagccacccg ggcgtgtgcc
101 ccaaccagct cagccccaac ctgtgggtgg acgcccagag cacctgtgag
151 cgcgagtgta gcagggacca ggactgtgcg gctgctgaga agtgctgcat
201 caacgtgtgt ggactgcaca gctgcgtggc agcacgcttc cccggcagcc
251 cagctgcgcc gacgacagcg gcctcctgcg agggctttgt gtgcccacag
301 cagggctcgg actgcgacat ctgggacggg cagcccgtgt gccgctgccg
351 cgaccgctgt gagaaggagc ccagcttcac ctgcgcctcg gacggcctca
401 cctactacaa ccgctgctat atggacgccg aggcctgcct gcggggcctg
451 cacctccaca tcgtgccctg caagcacgtg ctcagctggc cgcccagcag
501 cccggggccg ccggagacca ctgcccgccc cacacctggg gccgcgcccg
551 tgcctcctgc cctgtacagc agcccctccc cacaggcggt gcaggttggg
601 ggtacggcca gcctccactg cgacgtcagc ggccgcccgc cgcctgctgt
651 gacctgggag aagcagagtc accagcgaga gaacctgatc atgcgccctg
701 atcagatgta tggcaacgtg gtggtcacca gcatcgggca gctggtgctc
751 tacaacgcgc ggcccgaaga cgccggcctg tacacctgca ccgcgcgcaa
801 cgctgctggg ctgctgcggg ctgacttccc actctctgtg gtccagcgag
851 agccggccag ggacgcagcc cccagcatcc cagccccggc cgagtgcctg
901 ccggatgtgc aggcctgcac gggccccact tccccacacc ttgtcctctg
951 gcactacgac ccgcagcggg gcggctgcat gaccttcccg gcccgtggct
1001 gtgatggggc ggcccgcggc tttgagacct acgaggcatg ccagcaggcc
1051 tgtgcccgcg gccccggcga cgcctgcgtg ctgcctgccg tgcagggccc
1101 ctgccggggc tgggagccgc gctgggccta cagcccgctg ctgcagcagt
1151 gccatccctt cgtgtacggt ggctgcgagg gcaacggcaa caacttccac
1201 agccgcgaga gctgcgagga tgcctgcccc gtgccgcgca caccgccctg
1251 ccgcgcctgc cgcctccgga gcaagctggc gctgagcctg tgccgcagcg
1301 acttcgccat cgtggggcgg ctcacggagg tgctggagga gcccgaggcc
1351 gccggcggca tcgcccgcgt ggcgctcgag gacgtgctca aggatgacaa
1401 gatgggcctc aagttcttgg gcaccaagta cctggaggtg acgctgagtg
1451 gcatggactg ggcctgcccc tgccccaaca tgacggcggg cgacgggccg
1501 ctggtcatca tgggtgaggt gcgcgatggc gtggccgtgc tggacgccgg
1551 cagctacgtc cgcgccgcca gcgagaagcg cgtcaagaag atcttggagc
1601 tgctggagaa gcaggcctgc gagctgctca accgcttcca ggac
(서열 번호: 53)
다음의 서열 (서열 번호: 54)은 성숙 인간 WFIKKN1 폴리펩티드 (NCBI Ref Seq NM_053284.2의 뉴클레오티드 300-1886)를 인코딩한다.
1 gctggcttgc tgccagggct ggggagccac ccgggcgtgt gccccaacca
51 gctcagcccc aacctgtggg tggacgccca gagcacctgt gagcgcgagt
101 gtagcaggga ccaggactgt gcggctgctg agaagtgctg catcaacgtg
151 tgtggactgc acagctgcgt ggcagcacgc ttccccggca gcccagctgc
201 gccgacgaca gcggcctcct gcgagggctt tgtgtgccca cagcagggct
251 cggactgcga catctgggac gggcagcccg tgtgccgctg ccgcgaccgc
301 tgtgagaagg agcccagctt cacctgcgcc tcggacggcc tcacctacta
351 caaccgctgc tatatggacg ccgaggcctg cctgcggggc ctgcacctcc
401 acatcgtgcc ctgcaagcac gtgctcagct ggccgcccag cagcccgggg
451 ccgccggaga ccactgcccg ccccacacct ggggccgcgc ccgtgcctcc
501 tgccctgtac agcagcccct ccccacaggc ggtgcaggtt gggggtacgg
551 ccagcctcca ctgcgacgtc agcggccgcc cgccgcctgc tgtgacctgg
601 gagaagcaga gtcaccagcg agagaacctg atcatgcgcc ctgatcagat
651 gtatggcaac gtggtggtca ccagcatcgg gcagctggtg ctctacaacg
701 cgcggcccga agacgccggc ctgtacacct gcaccgcgcg caacgctgct
751 gggctgctgc gggctgactt cccactctct gtggtccagc gagagccggc
801 cagggacgca gcccccagca tcccagcccc ggccgagtgc ctgccggatg
851 tgcaggcctg cacgggcccc acttccccac accttgtcct ctggcactac
901 gacccgcagc ggggcggctg catgaccttc ccggcccgtg gctgtgatgg
951 ggcggcccgc ggctttgaga cctacgaggc atgccagcag gcctgtgccc
1001 gcggccccgg cgacgcctgc gtgctgcctg ccgtgcaggg cccctgccgg
1051 ggctgggagc cgcgctgggc ctacagcccg ctgctgcagc agtgccatcc
1101 cttcgtgtac ggtggctgcg agggcaacgg caacaacttc cacagccgcg
1151 agagctgcga ggatgcctgc cccgtgccgc gcacaccgcc ctgccgcgcc
1201 tgccgcctcc ggagcaagct ggcgctgagc ctgtgccgca gcgacttcgc
1251 catcgtgggg cggctcacgg aggtgctgga ggagcccgag gccgccggcg
1301 gcatcgcccg cgtggcgctc gaggacgtgc tcaaggatga caagatgggc
1351 ctcaagttct tgggcaccaa gtacctggag gtgacgctga gtggcatgga
1401 ctgggcctgc ccctgcccca acatgacggc gggcgacggg ccgctggtca
1451 tcatgggtga ggtgcgcgat ggcgtggccg tgctggacgc cggcagctac
1501 gtccgcgccg ccagcgagaa gcgcgtcaag aagatcttgg agctgctgga
1551 gaagcaggcc tgcgagctgc tcaaccgctt ccaggac (서얼 번호: 54)
가령, 다음의 서열 (서열 번호: 55)은 자연발생 인간 WFIKKN2 전구체 폴리펩티드 (NCBI 참조 서열 NM_175575.5의 뉴클레오티드 695-2422)를 인코딩한다. 신호 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드는 밑줄 표시된다.
1 atgtgggccc caaggtgtcg ccggttctgg tctcgctggg agcaggtggc
51 agcgctgctg ctgctgctgc tactgctcgg ggtgcccccg cgaagcctgg
101 cgctgccgcc catccgctat tcccacgccg gcatctgccc caacgacatg
151 aatcccaacc tctgggtgga cgcacagagc acctgcaggc gggagtgtga
201 gacggaccag gagtgtgaga cctatgagaa gtgctgcccc aacgtatgtg
251 ggaccaagag ctgcgtggcg gcccgctaca tggacgtgaa agggaagaag
301 ggcccagtgg gcatgcccaa ggaggccaca tgtgaccact tcatgtgtct
351 gcagcagggc tctgagtgtg acatctggga tggccagccc gtgtgtaagt
401 gcaaagaccg ctgtgagaag gagcccagct ttacctgcgc ctcggacggc
451 ctcacctact ataaccgctg ctacatggat gccgaggcct gctccaaagg
501 catcacactg gccgttgtaa cctgccgcta tcacttcacc tggcccaaca
551 ccagcccccc accacctgag accaccatgc accccaccac agcctcccca
601 gagacccctg agctggacat ggcggcccct gcgctgctca acaaccctgt
651 gcaccagtcg gtcaccatgg gtgagacagt gagcttcctc tgtgatgtgg
701 tgggccggcc ccggcctgag atcacctggg agaagcagtt ggaggatcgg
751 gagaatgtgg tcatgcggcc caaccatgtg cgtggcaacg tggtggtcac
801 caacattgcc cagctggtca tctataacgc ccagctgcag gatgctggga
851 tctacacctg cacggcccgg aacgtggctg gggtcctgag ggctgatttc
901 ccgctgtcgg tggtcagggg tcatcaggct gcagccacct cagagagcag
951 ccccaatggc acggctttcc cggcggccga gtgcctgaag cccccagaca
1001 gtgaggactg tggcgaagag cagacccgct ggcacttcga tgcccaggcc
1051 aacaactgcc tgaccttcac cttcggccac tgccaccgta acctcaacca
1101 ctttgagacc tatgaggcct gcatgctggc ctgcatgagc gggccgctgg
1151 ccgcgtgcag cctgcccgcc ctgcaggggc cctgcaaagc ctacgcgcct
1201 cgctgggctt acaacagcca gacgggccag tgccagtcct ttgtctatgg
1251 tggctgcgag ggcaatggca acaactttga gagccgtgag gcctgtgagg
1301 agtcgtgccc cttccccagg gggaaccagc gctgtcgggc ctgcaagcct
1351 cggcagaagc tcgttaccag cttctgtcgc agcgactttg tcatcctggg
1401 ccgagtctct gagctgaccg aggagcctga ctcgggccgc gccctggtga
1451 ctgtggatga ggtcctaaag gatgagaaaa tgggcctcaa gttcctgggc
1501 caggagccat tggaggtcac tctgcttcac gtggactggg catgcccctg
1551 ccccaacgtg accgtgagcg agatgccgct catcatcatg ggggaggtgg
1601 acggcggcat ggccatgctg cgccccgata gctttgtggg cgcatcgagt
1651 gcccgccggg tcaggaagct tcgtgaggtc atgcacaaga agacctgtga
1701 cgtcctcaag gagtttcttg gcttgcac (서얼 번호: 55)
다음의 서열 (서열 번호: 56)은 성숙 인간 WFIKKN2 폴리펩티드 (NCBI Ref Seq NM_175575.5의 뉴클레오티드 797-2422)를 인코딩한다.
1 ctgccgccca tccgctattc ccacgccggc atctgcccca acgacatgaa
51 tcccaacctc tgggtggacg cacagagcac ctgcaggcgg gagtgtgaga
101 cggaccagga gtgtgagacc tatgagaagt gctgccccaa cgtatgtggg
151 accaagagct gcgtggcggc ccgctacatg gacgtgaaag ggaagaaggg
201 cccagtgggc atgcccaagg aggccacatg tgaccacttc atgtgtctgc
251 agcagggctc tgagtgtgac atctgggatg gccagcccgt gtgtaagtgc
301 aaagaccgct gtgagaagga gcccagcttt acctgcgcct cggacggcct
351 cacctactat aaccgctgct acatggatgc cgaggcctgc tccaaaggca
401 tcacactggc cgttgtaacc tgccgctatc acttcacctg gcccaacacc
451 agccccccac cacctgagac caccatgcac cccaccacag cctccccaga
501 gacccctgag ctggacatgg cggcccctgc gctgctcaac aaccctgtgc
551 accagtcggt caccatgggt gagacagtga gcttcctctg tgatgtggtg
601 ggccggcccc ggcctgagat cacctgggag aagcagttgg aggatcggga
651 gaatgtggtc atgcggccca accatgtgcg tggcaacgtg gtggtcacca
701 acattgccca gctggtcatc tataacgccc agctgcagga tgctgggatc
751 tacacctgca cggcccggaa cgtggctggg gtcctgaggg ctgatttccc
801 gctgtcggtg gtcaggggtc atcaggctgc agccacctca gagagcagcc
851 ccaatggcac ggctttcccg gcggccgagt gcctgaagcc cccagacagt
901 gaggactgtg gcgaagagca gacccgctgg cacttcgatg cccaggccaa
951 caactgcctg accttcacct tcggccactg ccaccgtaac ctcaaccact
1001 ttgagaccta tgaggcctgc atgctggcct gcatgagcgg gccgctggcc
1051 gcgtgcagcc tgcccgccct gcaggggccc tgcaaagcct acgcgcctcg
1101 ctgggcttac aacagccaga cgggccagtg ccagtccttt gtctatggtg
1151 gctgcgaggg caatggcaac aactttgaga gccgtgaggc ctgtgaggag
1201 tcgtgcccct tccccagggg gaaccagcgc tgtcgggcct gcaagcctcg
1251 gcagaagctc gttaccagct tctgtcgcag cgactttgtc atcctgggcc
1301 gagtctctga gctgaccgag gagcctgact cgggccgcgc cctggtgact
1351 gtggatgagg tcctaaagga tgagaaaatg ggcctcaagt tcctgggcca
1401 ggagccattg gaggtcactc tgcttcacgt ggactgggca tgcccctgcc
1451 ccaacgtgac cgtgagcgag atgccgctca tcatcatggg ggaggtggac
1501 ggcggcatgg ccatgctgcg ccccgatagc tttgtgggcg catcgagtgc
1551 ccgccgggtc aggaagcttc gtgaggtcat gcacaagaag acctgtgacg
1601 tcctcaagga gtttcttggc ttgcac (서얼 번호: 56)
일정한 양상에서, 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드를 인코딩하는 주제 핵산은 서열 번호: 47-56의 변이체인 핵산을 포함하는 것으로 더욱 이해된다. 변이체 뉴클레오티드 서열은 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드 치환, 부가 또는 결실에 의해 다른 서열, 예를 들면, 대립형질 변이체를 포함하고; 그리고, 이런 이유로, 서열 번호: 47-56에서 지정된 코딩 서열의 뉴클레오티드 서열과 상이한 코딩 서열을 포함할 것이다.
일정한 구체예에서, 본 발명은 서열 번호: 47-56과 최소한 80%, 85%, 90%, 95%, 96% 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 단리된 또는 재조합 핵산 서열을 제공한다. 당업자는 서열 번호: 47-56에 상보적인 핵산 서열, 그리고 서열 번호: 47-56의 변이체 역시 본 발명의 범위 내에 있다는 것을 인지할 것이다. 추가 구체예에서, 본 발명의 핵산 서열은 단리되고, 재조합이고 및/또는 이종성 뉴클레오티드 서열과 융합되거나, 또는 DNA 라이브러리 내에 있을 수 있다.
다른 구체예에서, 본 발명의 핵산은 또한, 고도로 엄격한 조건 하에, 서열 번호: 47-56에서 지정된 뉴클레오티드 서열, 서열 번호: 47-56의 보체 서열, 또는 이들의 단편에 혼성화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
당업자는 DNA 혼성화를 증진하는 적절한 엄격함 조건이 변할 수 있다는 것을 쉽게 이해할 것이다. 가령, 약 45 ℃에서 6.0 x 염화나트륨/구연산나트륨 (SSC)에서 혼성화, 그 이후에 50 ℃에서 2.0 x SSC의 세척이 수행될 수 있었다. 가령, 세척 단계에서 염 농도는 50 ℃에서 약 2.0 x SSC의 낮은 엄격함에서부터 50 ℃에서 약 0.2 x SSC의 높은 엄격함까지에서 선택될 수 있다. 이에 더하여, 세척 단계에서 온도는 실온, 약 22 ℃에서 낮은 엄격함 조건으로부터 약 65 ℃에서 높은 엄격함 조건으로 증가될 수 있다. 온도 및 염 둘 모두 변할 수 있거나, 또는 온도 또는 염 농도가 일정하게 유지될 수 있고, 반면 다른 변수가 변화된다. 한 구체예에서, 본 발명은 실온에서 6 x SSC의 낮은 엄격함 조건 하에 혼성화되고, 그 이후에 실온에서 2 x SSC에서 세척되는 핵산을 제공한다.
유전자 코드에서 축중성으로 인해 서열 번호: 47-56에서 진술된 바와 같은 핵산과 상이한 단리된 핵산 역시 본 발명의 범위 내에 있다. 가령, 다수의 아미노산은 하나 이상의 삼중항에 의해 지정된다. 동일한 아미노산을 명시하는 코돈, 또는 동의어 (가령, CAU 및 CAC는 히스티딘에 대한 동의어이다)는 단백질의 아미노산 서열에 영향을 주지 않는 "침묵" 돌연변이를 유발할 수 있다. 하지만, 본 단백질의 아미노산 서열에서 변화를 야기하는 DNA 서열 다형성이 포유류 세포 사이에서 존재할 것으로 예상된다. 당업자는 특정 단백질을 인코딩하는 핵산의 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드에서 이들 변이 (뉴클레오티드의 최대 약 3-5%)가 자연 대립형질 변이로 인해 소정의 종의 개체 사이에서 존재할 수 있다는 것을 인지할 것이다. 임의의 모든 이런 뉴클레오티드 변이 및 결과의 아미노산 다형성은 본 발명의 범위 안에 있다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 재조합 핵산은 발현 구조체 내에서 하나 또는 그 이상의 조절 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 조절 뉴클레오티드 서열은 일반적으로, 발현에 이용된 숙주 세포에 적합할 것이다. 적절한 발현 벡터 및 적합한 조절 서열의 다양한 유형이 다양한 숙주 세포에 대해 당분야에서 공지된다. 전형적으로, 상기 하나 또는 그 이상의 조절 뉴클레오티드 서열은 프로모터 서열, 리더 또는 신호 서열, 리보솜 결합 부위, 전사 시작 및 종결 서열, 번역 시작 및 종결 서열, 그리고 인핸서 또는 활성인자 서열을 포함할 수 있지만 이들에 한정되지 않는다. 당분야에서 공지된 바와 같은 구조성 또는 유도성 프로모터가 본 발명에 의해 예기된다. 프로모터는 자연발생 프로모터이거나, 또는 하나 이상의 프로모터의 요소를 합동하는 하이브리드 프로모터일 수 있다. 발현 구조체는 세포 내에 에피솜, 예를 들면, 플라스미드 상에 존재할 수 있거나, 또는 발현 구조체는 염색체 내에 삽입될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 발현 벡터는 형질전환된 숙주 세포의 선별을 허용하는 선별가능 마커 유전자를 내포한다. 선별가능 마커 유전자는 당분야에서 널리 공지되고, 그리고 이용된 숙주 세포에 따라 변할 것이다.
일정한 양상에서, 주제 핵산은 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드를 인코딩하고 최소한 하나의 조절 서열에 작동가능하게 연결된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터에서 제공된다. 조절 서열은 당분야에서 인식되고, 그리고 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드의 발현을 주도하도록 선별된다. 따라서, 용어 조절 서열은 프로모터, 인핸서 및 다른 발현 제어 요소를 포함한다. 예시적인 조절 서열은 Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego, CA (1990)에서 설명된다. 가령, 자신에게 작동가능하게 연결될 때 DNA 서열의 발현을 제어하는 임의의 매우 다양한 발현 제어 서열이 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드를 인코딩하는 DNA 서열을 발현하기 위해 이들 벡터에서 이용될 수 있다. 이런 유용한 발현 제어 서열은 예로서, SV40의 초기 및 후기 프로모터, tet 프로모터, 아데노바이러스 또는 시토메갈로바이러스 극초기 프로모터, RSV 프로모터, lac 시스템, trp 시스템, TAC 또는 TRC 시스템, 발현이 T7 RNA 중합효소에 의해 주도되는 T7 프로모터, 파지 람다의 주요 오퍼레이터 및 프로모터 영역, fd 외피 단백질에 대한 제어 영역, 3-포스포글리세린산 키나아제 또는 다른 해당효소에 대한 프로모터, 산성 인산분해효소, 예를 들면, Pho5의 프로모터, 효모 α-교배 인자의 프로모터, 배큘로바이러스 시스템의 다면체 프로모터 및 원핵 또는 진핵 세포 또는 이들의 바이러스의 유전자의 발현을 제어하는 것으로 공지된 다른 서열, 그리고 다양한 이들의 조합을 포함한다. 발현 벡터의 설계는 형질전환되는 숙주 세포의 선택 및/또는 발현되는 원하는 단백질의 유형과 같은 인자에 의존할 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 게다가, 벡터의 사본수, 벡터에 의해 인코딩된 임의의 다른 단백질, 예를 들면, 항균성 마커의 사본수 및 발현을 제어하는 능력 또한 고려되어야 한다.
본 발명의 재조합 핵산은 클로닝된 유전자, 또는 이의 부분을 원핵 세포, 진핵 세포 (효모, 조류, 곤충 또는 포유류), 또는 둘 모두에서 발현에 적합한 벡터 내로 결찰함으로써 생산될 수 있다. 재조합 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드의 생산을 위한 발현 수송체는 플라스미드 및 다른 벡터를 포함한다. 가령, 적합한 벡터는 원핵 세포, 예를 들면, 대장균 (E. coli)에서 발현을 위한 다음 유형의 플라스미드: pBR322-유래된 플라스미드, pEMBL-유래된 플라스미드, pEX-유래된 플라스미드, pBTac-유래된 플라스미드 및 pUC-유래된 플라스미드를 포함한다.
일부 포유류 발현 벡터는 세균에서 벡터의 증식을 용이하게 하는 원핵 서열, 그리고 진핵 세포에서 발현되는 하나 또는 그 이상의 진핵 전사 단위 둘 모두를 내포한다. pcDNAI/amp, pcDNAI/neo, pRc/CMV, pSV2gpt, pSV2neo, pSV2-dhfr, pTk2, pRSVneo, pMSG, pSVT7, pko-neo 및 pHyg 유래된 벡터는 진핵 세포의 형질감염에 적합한 포유류 발현 벡터의 실례이다. 이들 벡터 중에서 일부는 원핵 및 진핵 세포 둘 모두에서 복제 및 약제 내성 선별을 용이하게 하기 위해, 세균 플라스미드, 예를 들면, pBR322로부터 서열로 변형된다. 대안으로, 바이러스, 예를 들면, 소 유두종 바이러스 (BPV-1), 또는 엡스타인 바르 바이러스 (pHEBo, pREP-유래된 및 p205)의 유도체가 진핵 세포에서 단백질의 일시적인 발현에 이용될 수 있다. 다른 바이러스 (레트로바이러스 포함) 발현 시스템의 실례는 유전자 요법 전달 시스템에 관한 아래 설명에서 발견될 수 있다. 플라스미드의 제조에서 및 숙주 생명체의 형질전환에서 이용된 다양한 방법은 당분야에서 널리 공지된다. 원핵 및 진핵 세포 둘 모두에 대한 다른 적합한 발현 시스템뿐만 아니라 일반적인 재조합 절차에 대해, Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed., ed. by Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) Chapters 16 및 17을 참조한다. 일부 경우에, 배큘로바이러스 발현 시스템의 이용에 의해 재조합 폴리펩티드를 발현하는 것이 바람직할 수 있다. 이런 배큘로바이러스 발현 시스템의 실례는 pVL-유래된 벡터 (가령, pVL1392, pVL1393 및 pVL941), pAcUW-유래된 벡터 (가령, pAcUW1), 그리고 pBlueBac-유래된 벡터 (가령, β-gal 내포 pBlueBac III)를 포함한다.
일정한 구체예에서, 벡터, 예를 들면, Pcmv-스크립트 벡터 (Stratagene, La Jolla, Calif.), pcDNA4 벡터 (Invitrogen, Carlsbad, Calif.) 및 pCI-neo 벡터 (Promega, Madison, Wisc.)는 CHO 세포에서 주제 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드를 생산하도록 설계될 것이다. 명백한 바와 같이, 주제 유전자 구조체는 예로서, 정제를 위한 융합 단백질 또는 변이체 단백질을 비롯한 단백질을 생산하기 위해, 배양액에서 증식된 세포에서 주제 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드의 발현을 유발하는데 이용될 수 있다.
본 발명은 또한, 주제 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드 중에서 하나 또는 그 이상에 대한 코딩 서열 (가령, 서열 번호: 19-22)을 포함하는 재조합 유전자로 형질감염된 숙주 세포와 관련된다. 숙주 세포는 임의의 원핵 또는 진핵 세포일 수 있다. 가령, 본 발명의 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드는 세균 세포, 예를 들면, 대장균 (E. coli), 곤충 세포 (가령, 배큘로바이러스 발현 시스템을 이용하여), 효모, 또는 포유류 세포에서 발현될 수 있다. 다른 적합한 숙주 세포는 당업자에게 공지되어 있다.
따라서, 본 발명은 주제 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드를 생산하는 방법과 더욱 관련된다. 가령, 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드를 인코딩하는 발현 벡터로 형질감염된 숙주 세포는 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드의 발현이 발생하도록 허용하는 적절한 조건 하에 배양될 수 있다. 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드는 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드를 내포하는 세포 및 배지의 혼합물로부터 분비되고 단리될 수 있다. 대안으로, 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드는 세포질에 또는 막 분획물 내에 유지되고, 그리고 세포가 수확되고 용해되고, 그리고 상기 단백질이 단리될 수 있다. 세포 배양액은 숙주 세포, 배지 및 다른 부산물을 포함한다. 세포 배양에 적합한 배지는 당분야에서 널리 공지된다. 주제 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드는 이온 교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 한외여과, 전기이동, 그리고 폴리스타틴 폴리펩티드의 특정 에피토프에 특이적인 항체로 면역친화성 정제를 비롯하여, 단백질을 정제하기 위한 당분야에서 공지된 기술을 이용하여, 세포 배양 배지, 숙주 세포, 또는 둘 모두로부터 단리될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드는 이의 정제를 용이하게 하는 도메인을 내포하는 융합 단백질이다.
다른 구체예에서, 재조합 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드의 원하는 부분의 N 말단에서 정제 리더 서열, 예를 들면, 폴리-(His)/엔테로키나아제 개열 부위 서열을 코딩하는 융합 유전자는 Ni2+ 금속 수지를 이용한 친화성 크로마토그래피에 의한 발현된 융합 단백질의 정제를 허용할 수 있다. 이후, 정제 리더 서열은 정제된 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드를 제공하기 위해, 엔테로키나아제로 처리에 의해 차후 제거될 수 있다 (가령, Hochuli et al., (1987) J. Chromatography 411:177; 및 Janknecht et al., PNAS USA 88:8972를 참조한다).
융합 유전자를 만들기 위한 기술은 널리 알려져 있다. 본질적으로, 상이한 폴리펩티드 서열을 코딩하는 다양한 DNA 단편의 연결은 결찰을 위한 평활 말단 또는 스태거 말단, 적절한 말단을 제공하기 위한 제한 효소 소화, 타당하면 점착 말단의 채워 넣기, 바람직하지 않은 연결을 방지하기 위한 알칼리 인산분해효소 처리, 그리고 효소적 결찰을 이용하여, 전통적인 기술에 따라서 수행된다. 다른 구체예에서, 융합 유전자는 자동화된 DNA 합성장치를 포함하는 전통적인 기술에 의해 합성될 수 있다. 대안으로, 유전자 단편의 PCR 증폭이 2개의 연속성 유전자 단편 사이에 상보성 오버행을 발생시키는 앵커 프라이머를 이용하여 실행될 수 있고, 이들 단편은 차후 어닐링되어 키메라 유전자 서열이 산출될 수 있다 (가령, Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons: 1992를 참조한다).
4. 예시적인 치료적 용도
일정한 구체예에서, 예로서 본원에서 개시된 폴리스타틴-관련된 융합 폴리펩티드를 포함하는 다양한 단백질 복합체를 포함하는 본 발명의 조성물은 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드 및/또는 폴리스타틴 리간드 (가령, 미오스타틴, 액티빈, GDF11)의 비정상적인 활성과 연관되는 질환 또는 장애를 비롯하여, 본 섹션에서 설명되는 질환 또는 장애를 치료하거나 예방하는데 이용될 수 있다. 이들 질환, 장애 또는 상태는 일반적으로 본원에서 "폴리스타틴-연관된 질환"으로서 지칭된다. 일정한 구체예에서, 본 발명은 앞서 설명된 바와 같은 폴리스타틴-관련된 융합 폴리펩티드의 치료 효과량을 개체에 투여하는 것을 통해 치료가 필요한 개체를 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다. 이들 방법은 특히, 동물 및 더욱 구체적으로, 인간의 치료적 및 예방적 처치를 목표로 한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 장애 또는 상태를 "예방"하는 치료제는 통계학적 표본에서, 처리되지 않은 대조 표본에 비하여 처리된 표본에서 장애 또는 상태의 발생을 감소시키거나, 또는 처리되지 않은 대조 표본에 비하여 장애 또는 상태의 하나 또는 그 이상의 증상의 개시를 지연시거나 또는 이들의 심각도를 감소시키는 화합물을 지칭한다. 본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "치료하는"은 일단 질환이 확립되면, 상기 질환의 개선 또는 제거를 포함한다. 어떠한 경우에도, 예방 또는 치료는 의사 또는 다른 건강 관리 제공자에 의해 제공된 진단 및 치료적 작용제의 투여의 의도된 결과에서 식별될 수 있다.
일반적으로, 본 발명에서 설명된 바와 같은 질환 또는 장애의 치료 또는 예방은 본 발명의 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드, 또는 이런 폴리펩티드를 포함하는 조성물, 복합체 또는 조합을 "효과량으로" 투여함으로써 달성된다. 작용제의 효과량은 원하는 치료적 또는 예방적 결과를 달성하기 위해, 필요한 용량에서 및 기간 동안, 효과적인 양을 지칭한다. 본 발명의 작용제의 "치료 효과량"은 인자, 예를 들면, 개체의 질환 상태, 연령, 성별 및 체중, 그리고 개체에서 원하는 반응을 이끌어내는 작용제의 능력에 따라 변할 수 있다. "예방적 효과량"은 원하는 예방적 결과를 달성하는데 필요한 용량에서 및 기간 동안 효과적인 양을 지칭한다.
폴리스타틴-리간드 복합체는 조직 성장뿐만 아니라 초기 발달 과정, 예를 들면, 다양한 구조의 정확한 형성에서, 또는 성기능 발달, 뇌하수체 호르몬 생산 및 근육의 창출을 비롯한 하나 또는 그 이상의 발육기 후 능력에서 필수적인 역할을 수행한다. 따라서, 폴리스타틴-연관된 질환은 비정상적인 조직 성장과 발육 결함을 포함한다.
치료를 위한 예시적인 질환은 신경근 장애 (가령, 근이영양증 및 근위축), 울혈성 폐쇄성 폐질환 (및 COPD와 연관된 근육 쇠약), 근육 소모 증후군, 근육감소증, 그리고 악액질, 지방 조직 장애 (가령, 비만), 2형 당뇨병 (NIDDM, 성인-발병 당뇨병), 그리고 뼈 퇴행성 질환 (가령, 골다공증)을 포함한다. 다른 예시적인 질환은 근변성 및 신경근 장애, 조직 수복 (가령, 상처 치유), 그리고 신경변성 질환 (가령, 근위축성 측삭 경화증)을 포함한다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물 (가령, 폴리스타틴-관련된 융합 단백질)은 근이영양증의 치료의 일부로서 이용된다. 용어 "근이영양증"은 골격근 및 때때로 심장 및 호흡성 근육의 점진적인 약화 및 악화에 의해 특징화되는 일군의 변성 근육병을 지칭한다. 근이영양증은 근육에서 현미경적 변화로 시작되는 진행성 근육 쇠약 및 허약에 의해 특징화되는 유전 질환이다. 시간의 추이에서 근육이 변성함에 따라서, 개체의 근력이 감퇴한다. 주제 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드를 포함하는 섭생으로 치료될 수 있는 예시적인 근이영양증은 다음을 포함한다: 듀시엔형 근이영양증 (DMD), 베커 근이영양증 (BMD), 에머리 드라이푸스 근이영양증 (EDMD), 지대형 근이영양증 (LGMD), 얼굴어깨위팔 근이영양증 (FSH 또는 FSHD) (란도르 디제린형으로 또한 알려져 있음), 근긴장성 이영양증 (MMD) (스타이너트 병으로서 또한 알려져 있음), 눈인두근 이영양증 (OPMD), 원위 근이영양증 (DD), 선천성 근이영양증 (CMD).
듀시엔형 근이영양증 (DMD)은 1860년대에 프랑스 신경과의사 Guillaume Benjamin Amand Duchenne에 의해 최초 기술되었다. 베커 근이영양증 (BMD)은 독일 의사 Peter Emil Becker의 이름을 따라서 명명되는데, 이는 1950년대에 DMD의 이러한 변이체를 최초 기술하였다. DMD는 남성에서 가장 빈번한 유전성 질환 중에서 한 가지인데, 3,500명당 1명꼴로 영향을 준다. DMD는 X 염색체의 짧은 팔 상에 위치된 디스트로핀 유전자가 파괴될 때 발생한다. 남성이 X 염색체의 하나의 사본만을 보유하기 때문에, 이들은 디스트로핀 유전자의 하나의 사본만을 갖는다. 디스트로핀 단백질이 없으면, 근육은 수축 및 이완의 주기 동안 쉽게 손상된다. 질환의 초기에는 근육이 재생에 의해 보완되지만, 추후에는 근육 선조체 세포가 진행 중인 손상을 따라잡을 수 없게 되고, 그리고 건강한 근육이 비기능적 섬유지방 조직에 의해 대체된다.
BMD는 디스트로핀 유전자에서 상이한 돌연변이로부터 발생한다. BMD 환자는 일부 디스트로핀을 갖지만, 이것은 양에서 불충분하거나 또는 품질에서 불량하다. 일부 디스트로핀을 갖는 것은 BMD를 앓는 사람들의 근육이 DMD를 앓는 사람들의 근육만큼 나쁘게 또는 빠르게 퇴화하는 것으로부터 보호한다.
가령, 최근 연구는 생체내에서 미오스타틴 (폴리스타틴 리간드)의 기능을 차단하거나 또는 제거하는 것이 DMD 및 BMD 환자에서 최소한 일정한 증상을 효과적으로 치료할 수 있다는 것을 증명한다. 따라서, 주제 폴리스타틴-관련된 융합 폴리펩티드는 미오스타틴 저해제 (길항제)로서 행동할 수 있고, 그리고 DMD 및 BMD 환자에서 생체내에서 미오스타틴의 기능을 차단하는 대안적 수단을 구성한다.
유사하게, 주제 폴리스타틴-관련된 융합 폴리펩티드는 근육 성장이 필요한 다른 질환 상태에서 근육 질량을 증가시키는 효과적인 수단을 제공한다. 가령, 근위축성 측삭 경화증 (ALS, 루게릭병 또는 운동 신경세포병으로 또한 불림)은 뇌를 골격근에 연결하는 CNS의 성분인 운동 신경세포를 공격하는 막을 수 없는 만성적인 불치의 CNS 장애이다. ALS에서, 운동 신경세포는 쇠약해지고 궁극적으로 죽고, 그리고 비록 개체의 뇌가 정상적으로 완전히 기능하고 기민한 상태로 남아있지만, 움직이라는 명령이 근육에 결코 도달하지 않는다. ALS에 걸리는 대부분의 사람은 40 및 70 세 사이이다. 약화되는 첫 번째 운동 신경세포는 팔 또는 다리에 이르는 것들이다. ALS을 앓는 사람들은 보행에 문제가 있을 수 있고, 이들은 물건을 떨어뜨리고, 쓰러지고, 그들의 언어 능력이 불분명해지고, 그리고 통제할 수 없을 정도로 웃거나 울 수 있다. 궁극적으로, 사지의 근육이 불용으로 인해 위축되기 시작한다. 이러한 근육 허약은 심신쇠약성이 될 것이고, 그리고 개체는 휠체어를 필요로 하거나 또는 병상을 벗어나 움직일 수 없게 될 것이다. 대부분의 ALS 환자는 질환 개시로부터 3-5 년 내에 호흡 부전으로 또는 폐렴과 같은 인공호흡기 보조로부터 합병증으로 사망한다.
폴리스타틴-관련된 융합 폴리펩티드에 의해 유도된 증가된 근육 질량은 또한, 근육 소모병으로 고통받는 개체에 유익할지도 모른다. 미오스타틴 발현은 인간에서 제지방체중과 역으로 상관하고, 그리고 MSTN 유전자의 증가된 발현은 AIDS 소모 증후군을 앓는 환자에서 체중 감소와 연관된다. AIDS 환자에서 미오스타틴의 기능을 저해함으로써, AIDS가 완전하게 제거되지는 않지만, AIDS의 최소한 일정한 증상이 경감될 수 있고, 따라서 AIDS 환자에서 삶의 질이 유의미하게 향상된다.
암 식욕부진-악액질 증후군은 암의 가장 심신쇠약성이고 치명적인 양상 중에서 한 가지이다. 이러한 증후군은 많은 유형의 암의 공통 특질이고 - 사망 시에 암 환자의 대략 80% 내에 존재하고 - 그리고 불량한 삶의 질 및 화학요법에 대한 불량한 반응뿐만 아니라 필적하는 종양을 갖지만 체중 감소가 없는 환자에서 발견되는 더욱 짧은 생존 기간의 원인이 된다. 악액질은 전형적으로, 발병전 체중의 5 퍼센트보다 큰 비자발적 체중 감소가 6-개월 기간 이내에 발생하면, 암을 앓는 환자에서 의심된다. 식욕부진, 지방 및 근육 조직의 쇠약, 그리고 심리학적 곤란과 연관하여, 악액질은 암 및 숙주 사이의 복합적 상호작용으로부터 발생한다. 암 악액질은 사이토킨 생산, 지질-동원 및 단백질분해-유도 인자의 방출 및 중간 물질대사에서 변경에 영향을 준다. 비록 식욕부진이 통상적이긴 하지만, 감소된 식품 섭취 단독으로는 암 환자에서 목격된 신체 조성에서 변화를 설명할 수 없고, 그리고 영양소 섭취를 증가시키는 것은 소모 증후군을 반전시킬 수 없다. 현재, 악액질 과정을 제어하거나 또는 반전시키는 치료는 없다. 성체 생쥐에서 GDF8의 전신 과다발현이 인간 악액질 증후군에서 목격된 것과 유사한 심대한 근육 및 지방 상실을 유도하는 것으로 밝혀졌기 때문에 (Zimmers et al., 위와 같음), 주제 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드는 근육 성장이 요망되는 악액질 증후군의 증상을 예방하거나, 치료하거나, 또는 경감하는데 유익하게 이용될 수 있다.
다른 구체예에서, 폴리스타틴-관련된 융합 폴리펩티드, 또는 이런 폴리펩티드의 조합은 동물에서 체지방 함량을 조절하는데 이용될 수 있고, 그리고 거기에 관련된 질환 및 특히, 거기에 관련된 건강-훼손 질환을 치료하거나 예방하는데 이용될 수 있다. 본 발명에 따라서, 체중을 조절 (제어)하는 것은 체중을 감소시키거나 또는 증가시키고, 체중 증가의 속도를 감소시키거나 또는 증가시키고, 또는 체중 감소의 속도를 증가시키거나 또는 감소시키는 것을 지칭할 수 있고, 그리고 또한, 체중을 능동적으로 유지하거나, 또는 체중을 유의미하게 변화시키지는 않는 (가령, 만약 그렇지 않으면 체중을 증가 또는 감소시킬 수 있는 외부 또는 내부 영향에 대항하여) 것을 포함한다. 본 발명의 한 구체예는 본 발명의 폴리스타틴-관련된 융합 폴리펩티드, 또는 이런 폴리펩티드의 조합을 치료가 필요한 동물 (가령, 인간)에 투여함으로써 체중을 조절하는 것에 관계한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 폴리스타틴-관련된 융합 폴리펩티드, 또는 이런 폴리펩티드의 조합은 동물에서 체중을 감소시키고 및/또는 체중 증가를 감소시키고 그리고, 더욱 구체적으로 비만의 위험에 처해있거나 또는 비만으로 고통받는 환자에서 비만을 치료하거나 또는 개선하는데 이용될 수 있다. 다른 특정한 구체예에서, 본 발명은 체중을 증가시키거나 또는 유지할 수 없는 동물 (가령, 소모 증후군을 앓는 동물)을 치료하기 위한 방법 및 화합물에 관계한다. 이런 방법은 체중 및/또는 질량을 증가시키거나, 또는 체중 및/또는 질량 상실을 감소시키거나, 또는 바람직하지 않게 낮은 (가령, 해로운) 체중 및/또는 질량과 연관되거나 또는 이에 의해 유발된 질환을 향상시키는데 효과적이다. 이에 더하여, 높은 콜레스테롤의 장애 (가령, 고콜레스테롤혈증 또는 이상지질혈증)가 본 발명의 폴리스타틴-관련된 융합 폴리펩티드, 또는 이런 폴리펩티드의 조합으로 치료될 수 있다.
일부 구체예에서, 본 발명의 폴리스타틴-관련된 융합 폴리펩티드, 또는 이런 폴리펩티드의 조합은 대사 장애, 예를 들면, II형 당뇨병, 대사 증후군, 고아디포넥틴증, 과혈당증 또는 고인슐린혈증을 치료하는데 이용될 수 있다.
섬유증은 일반적으로, 장기 또는 조직에서 세포 수의 상대적 감소와 합동된 콜라겐 섬유 및 세포외 기질 둘 모두의 과도한 침착을 지칭한다. 이러한 과정이 손상 이후에 자연 상처 치유의 중요한 특질이긴 하지만, 섬유증은 예로서, 폐, 신장, 간, 뼈, 근육 및 피부를 비롯한 다양한 조직 및 장기에서 병리학적 피해를 야기할 수 있다. 섬유증에서 TGF-베타 상과의 역할은 광범위하게 연구되었다. 예로서, 액티빈 (가령, 액티빈 A 및 액티빈 B) 및 GDF8을 비롯한 TGF-베타 상과 리간드가 섬유증에 연루되었다 [Hedger et al (2013) Cytokine and Growth Factor Reviews 24:285-295; Hardy et al. (2015) 93: 567-574; 그리고 Cantini et al. (2008) J Sex Med 5:1607-1622]. 이런 이유로, 일부 구체예에서, 본 발명의 폴리스타틴-관련된 융합 폴리펩티드, 또는 이런 폴리펩티드의 조합은 섬유증, 특히 섬유증-연관된 장애 및 상태를 치료하는데 이용될 수 있다. 가령, 폴리스타틴-관련된 융합 폴리펩티드, 또는 이런 폴리펩티드의 조합은 다음 중에서 하나 또는 그 이상을 치료하거나 예방하는데 이용될 수 있다: 폐섬유증, 과민성 폐렴, 특발성 섬유증, 결핵, 폐렴, 낭포성 섬유증, 천식, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 기종, 신장 (신장) 섬유증, 신장 (신장) 부전, 만성 신장 (신장) 질환, 뼈 섬유증, 골수섬유증, 류마티스성 관절염, 전신성 홍반성 루푸스, 경피증, 사르코이드증, 다발혈관염을 동반한 육아종증, 페이로니병, 간 섬유증, 윌슨병, 글리코겐 축적병 (특히 유형 III, IV, IX 및 X), 철-과부하, 고셔병, 젤웨거 증후군, 비알코올성 및 알코올성 지방간염, 담관 간경변증, 경화 담관염, 버드 키아리 증후군, 수술-연관된 섬유증, 크론병, 듀피트렌 구축, 종격 섬유증, 신장기원 섬유증, 복막후 섬유증, 심방 섬유증, 심내막심근 섬유증, 췌장 섬유증.
일부 구체예에서, 본 발명의 폴리스타틴-관련된 융합 폴리펩티드, 또는 이런 폴리펩티드의 조합은 임의선택적으로, 만성 신장병을 치료하기 위한 하나 또는 그 이상의 지지 요법과 합동으로, 만성 신장병을 치료하거나 예방하는데 이용될 수 있다. 일부 구체예에서, 본 발명의 폴리스타틴-관련된 융합 폴리펩티드, 또는 이런 폴리펩티드의 조합은 임의선택적으로, 만성 신장병을 치료하기 위한 하나 또는 그 이상의 지지 요법과 합동으로, 만성 신장병의 하나 또는 그 이상의 합병증 (증상 또는 현성)을 치료하거나 예방하는데 이용될 수 있다. 일부 구체예에서, 본 발명의 폴리스타틴-관련된 융합 폴리펩티드, 또는 이런 폴리펩티드의 조합은 임의선택적으로, 말기 신장병을 치료하기 위한 하나 또는 그 이상의 지지 요법과 합동으로, 말기 신부전을 치료하거나 예방하는데 이용될 수 있다. 만성 신장병으로서 또한 알려져 있는 만성 신장병 (CKD)은 수개월 또는 수년의 기간에 걸쳐 신장 기능에서 진행성 상실이다. 악화되는 신장 기능의 증상은 전반적으로 몸이 불편한 느낌 및 감소된 식욕의 경험을 포함할 수 있다. 종종, 만성 신장병은 신장 문제의 위험에 처해있는 것으로 알려져 있는 사람들, 예를 들면, 높은 혈압 또는 당뇨병을 앓는 사람들 및 CKD와 관련된 혈액을 갖는 사람들의 선별검사의 결과로서 진단된다. 이러한 질환은 또한, 이것이 이의 인식된 합병증 중에서 한 가지, 예를 들면, 심혈관 질환, 빈혈, 또는 심낭염을 야기할 때 확인될 수 있다. 최근 전문적인 지침은 CKD의 심각도를 5가지 시기로 분류하는데, 시기 1은 경미하고 통상적으로 극소의 증상을 유발하고, 그리고 시기 5는 치료되지 않으면 불량한 기대 수명을 갖는 심각한 질병이다. 시기 5 CKD는 종종, 말기 신장병, 말기 신장병, 또는 말기 신부전으로 불리고, 그리고 주로, 최근 갱신된 용어 만성 신부전 또는 만성 신부전과 동의어이고; 그리고 환자가 투석의 형태를 수반할 수 있지만, 이상적으로는 신장 이식을 구성하는 신장 보상 요법을 필요로 한다는 것을 통상적으로 의미한다. CKD는 초기에 특별한 증상이 없고, 그리고 일반적으로, 소변 내에 혈청 크레아티닌 또는 단백질의 증가로서만 검출된다. 신장 기능이 감소함에 따라서, 다양한 증상이 아래에 설명된 바와 같이 현성할 수 있다. 혈압이 유체 과부하 및 레닌-안지오텐신 시스템을 통해 신장에 의해 창출된 혈관작용 호르몬의 생산으로 인해 증가될 수 있고, 개체에서 고혈압이 발생하고 및/또는 울혈성 심부전으로 고통받을 위험이 증가한다. 요소가 축적되어, 질소혈증 및 궁극적으로, 요독증 (기면에서부터 심낭염 및 뇌병증까지의 범위에서 변하는 증상)을 야기할 수 있다. 높은 전신 순환으로 인해, 요소는 외분비 땀에서 높은 농도로 배설되고, 그리고 땀이 증발함에 따라서 피부 상에서 결정화한다 ("요독 서리"). 칼륨은 혈액 내에 축적될 수 있다 (권태 및 잠재적으로 치명적인 심장 부정맥을 비롯한 다양한 증상을 갖는 고칼륨혈증). 고칼륨혈증은 통상적으로, 사구체 여과율이 20-25 ml/분/1.73 m2 이하로 떨어질 때까지 발생하지 않는데, 이 포인트에서 신장은 칼륨을 배출하는 감소된 능력을 갖는다. CKD에서 고칼륨혈증은 산혈증 (이것은 칼륨의 세포외 이동을 야기한다)에 의해 및 인슐린의 결여로부터 악화될 수 있다. 에리트로포이에틴 합성이 감소되어 빈혈을 유발할 수 있다. 유체 용적 과부하 증상은 변하는 경미한 부종 내지 치명적인 폐부종의 범위에서 일어날 수 있다. 감소된 인산염 배출로 인한 고인산혈증은 일반적으로, 시구체 여과에서 감소 이후에 일어날 수 있다. 고인산혈증은 증가된 심혈관 위험과 연관되고 혈관 석회화에 대한 직접적인 자극이다. 저칼슘혈증이 현성할 수 있는데, 이것은 일반적으로, 섬유모세포 성장 인자-23의 자극에 의해 유발된다. 골세포는 FGF23의 증가된 생산에 책임을 지는데, 이것은 효소 1-알파-수산화효소 (25-히드록시콜레칼시페롤의 1,25 디히드록시비타민 D3으로의 전환을 책임짐)의 강력한 저해제이다. 추후, 이차성 부갑상선 기능항진증, 신장성 골형성장애 및 혈관 석회화로의 이러한 진행은 심장 기능을 더욱 손상시킨다. 대사성 산증 (황산염, 인산염, 요산 등의 축적으로 인해)이 일어나고, 그리고 효소에 작용하는 과잉 산에 의한 변경된 효소 활성; 및 또한, 과잉 산으로 인한 고칼륨혈증 (산혈증)의 증진에 의한 심장 및 뉴런 막의 증가된 흥분성을 유발할 수 있다. 산증 역시 근위 세뇨관의 세포로부터 필요한 만큼의 암모니아를 산출하는 감소된 능력에 기인한다. 신장 기능이 감소함에 따라서 유병률이 증가하는 철결핍성 빈혈은 혈액투석을 필요로 하는 사람들에서 특히 만연한다. 이것은 원인에서 다인자이지만, 증가된 염증, 에리트로포이에틴에서 감소, 그리고 골수 억제를 야기하는 고요산혈증을 포함한다. CKD를 앓는 사람들은 가속된 죽상경화증을 경험하고, 그리고 일반 개체군보다 심혈관 질환이 발생할 가능성이 더욱 높다. CKD 및 심혈관 질환으로 고통받는 환자는 단지 후자만을 앓는 사람들보다 훨씬 나쁜 예후를 갖는 경향이 있다.
본원에서 이용된 바와 같이, "합동으로", "조합", 또는 "공동 투여"는 추가 요법 (가령, 두 번째, 세 번째, 네 번째 등)이 체내에서 여전히 효과적이도록 (가령, 복수 화합물이 환자에서 이들 화합물의 상승 효과를 비롯한 동시 효과를 나타내도록) 하는 임의의 투여 형태를 지칭한다. 유용성은 혈액, 혈청, 또는 혈장 내에 작용제의 계측가능한 농도와 상관하지 않을 수도 있다. 가령, 상이한 치료 화합물은 동일한 제제 또는 별개의 제제에서, 부수적으로 또는 순차적으로, 그리고 상이한 일정에서 투여될 수 있다. 따라서, 이런 치료를 제공받는 개체는 상이한 요법의 병용 효과로부터 이익을 얻을 수 있다. 본 발명의 하나 또는 그 이상의 폴리스타틴-관련된 융합 폴리펩티드, 또는 이런 폴리펩티드의 조합은 하나 또는 그 이상의 다른 추가 작용제 또는 지지 요법과 동시에, 이들에 앞서, 또는 이들 다음에 투여될 수 있다. 일반적으로, 각 치료적 작용제는 특정 작용제에 대해 결정된 용량에서 및/또는 시간 일정에서 투여될 것이다. 섭생에서 이용되는 특정 조합은 본 발명의 길항제 및 요법 및/또는 원하는 효과의 양립성을 고려할 것이다.
5. 제약학적 조성물
일정한 구체예에서, 본 발명의 화합물 (가령, 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드)은 제약학적으로 허용되는 담체로 조제된다. 가령, 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드는 단독으로 또는 제약학적 제제 (다시 말하면, 치료 조성물)의 성분으로서 투여될 수 있다. 주제 화합물은 인간 또는 수의학에서 이용을 위해 임의의 편의한 방식에서 투여용으로 조제될 수 있다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 치료 방법은 조성물을 국소, 전신, 국부, 또는 이식물 또는 장치로서 국부 투여하는 것을 포함한다. 투여될 때, 본 발명에서 이용을 위한 치료 조성물은 당연히, 발열원 없는, 생리학적으로 허용되는 형태이다. 게다가, 조성물은 바람직하게는, 표적 조직 부위 (가령, 뼈, 연골, 근육, 지방 또는 뉴런), 예를 들면, 조직 손상을 갖는 부위에 전달을 위한 점성 형태에서 피포되거나 또는 주사될 수 있다. 국소 투여는 상처 치유 및 조직 수복에 적합할 수 있다. 앞서 설명된 바와 같은 조성물 내에 임의선택적으로 또한 포함될 수 있는, 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드 이외의 치료적으로 유용한 작용제는 대안적으로 또는 부가적으로, 본 발명의 방법에서 주제 화합물 (가령, 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드)과 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 하나 또는 그 이상의 치료 화합물 (가령, 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드)을 표적 조직 부위에 전달할 수 있고, 발달하는 조직에 대한 구조를 제공하고, 그리고 최적으로는 신체 내로 재흡수될 수 있는 매트릭스를 포함할 수 있다. 가령, 매트릭스는 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드의 느린 방출을 제공할 수 있다. 이런 매트릭스는 다른 이식된 의학적 적용을 위해 현재 이용되고 있는 물질로 형성될 수 있다.
매트릭스 물질의 선택은 생체적합성, 생물분해성, 기계적 성질, 미용적 외관 및 인터페이스 성질에 근거된다. 본 조성물의 특정 적용은 적절한 제제를 규정할 것이다. 조성물에 대한 잠재적 매트릭스는 생물분해성이고 화학적으로 규정된 황산칼슘, 인산삼칼슘, 수산화인회석, 폴리유산 및 폴리무수물일 수 있다. 다른 잠재적 물질은 생물분해성이고 생물학적으로 충분히 규정된, 예를 들면, 뼈 또는 진피 콜라겐이다. 추가 매트릭스는 순수한 단백질 또는 세포외 기질 성분으로 구성된다. 다른 잠재적 매트릭스는 비생물분해성이고 화학적으로 규정된, 예를 들면, 소결된 수산화인회석, 생체유리, 알루민산염, 또는 다른 세라믹스이다. 매트릭스는 임의의 전술한 유형의 물질의 조합, 예를 들면, 폴리유산 및 수산화인회석 또는 콜라겐 및 인산삼칼슘으로 구성될 수 있다. 바이오세라믹스는 구멍 크기, 입자 크기, 입자 모양 및 생물분해성을 변경하기 위해 예로서, 칼슘-알루민산염-인산염 처리에서처럼 조성물 내에서 변경될 수 있다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 방법은 예로서, 활성 성분으로서 작용제의 미리 결정된 양을 각각 내포하는 캡슐, 교갑, 알약, 정제, 로젠지 (향미 가미된 기부, 통상적으로 수크로오스 및 아카시아 또는 트래거캔스를 이용하여), 분말, 과립의 형태에서, 또는 수성 또는 비수성 액체에서 용액 또는 현탁액으로서, 또는 수중유 또는 유중수 액체 유제로서, 또는 엘릭시르 또는 시럽으로서, 또는 사탕형 알약 (비활성 기부, 예를 들면, 젤라틴 및 글리세린, 또는 수크로오스 및 아카시아를 이용하여)으로서 및/또는 구강 청결제로서 경구 투여될 수 있다. 작용제는 또한, 일시 주사, 연질약 또는 페이스트로서 투여될 수 있다.
경구 투여를 위한 고체 약형 (캡슐, 정제, 알약, 당의정, 분말, 과립 등)에서, 본 발명의 하나 또는 그 이상의 치료 화합물은 하나 또는 그 이상의 제약학적으로 허용되는 담체, 예를 들면, 구연산나트륨 또는 인산이칼슘 및/또는 다음 중에서 한 가지와 혼합될 수 있다: (1) 충전제 또는 증량제, 예를 들면, 전분, 락토오스, 수크로오스, 글루코오스, 만니톨 및/또는 규산; (2) 결합제, 예를 들면, 예로서, 카르복시메틸셀룰로오스, 알긴산염, 젤라틴, 폴리비닐 피롤리돈, 수크로오스 및/또는 아카시아; (3) 보습제, 예를 들면, 글리세롤; (4) 붕해제, 예를 들면, 한천-한천, 탄산칼슘, 감자 또는 타피오카 전분, 알긴산, 일정한 규산염 및 탄산나트륨; (5) 용해 지연제, 예를 들면, 파라핀; (6) 흡수 촉진제, 예를 들면, 사차 암모늄 화합물; (7) 적심제, 예를 들면, 세틸 알코올 및 글리세롤 모노스테아레이트; (8) 흡수제, 예를 들면, 카올린 및 벤토나이트 점토; (9) 윤활제, 예를 들면, 활석, 스테아르산칼슘, 스테아르산마그네슘, 고체 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 라우릴 황산염, 그리고 이들의 혼합물; 그리고 (10) 착색제. 캡슐, 정제 및 알약의 경우에, 제약학적 조성물은 또한, 완충제를 포함할 수 있다. 유사한 유형의 고체 조성물은 또한, 락토오스 또는 유당과 같은 부형제뿐만 아니라 고분자량 폴리에틸렌 글리콜을 이용한 연성과 경성-충전된 젤라틴 캡슐에서 충전제로서 이용될 수 있다.
경구 투여를 위한 액체 약형은 제약학적으로 허용되는 유제, 마이크로유제, 용액, 현탁액, 시럽 및 엘릭시르를 포함한다. 활성 성분에 더하여, 액체 약형은 당분야에서 통상적으로 이용되는 비활성 희석제, 예를 들면, 물 또는 다른 용매, 가용화제 및 유화제, 예를 들면, 에틸 알코올, 이소프로필 알코올, 에틸 탄산염, 에틸 아세트산염, 벤질 알코올, 벤질 벤조산염, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸렌 글리콜, 오일 (특히, 목화씨, 땅콩, 옥수수, 배아, 올리브, 피마자 및 참깨 오일), 글리세롤, 테트라히드로푸릴 알코올, 폴리에틸렌 글리콜 및 소르비탄의 지방산 에스테르, 그리고 이들의 혼합물을 내포할 수 있다. 비활성 희석제 이외에, 경구 조성물은 또한, 어쥬번트, 예를 들면, 적심제, 유화 및 현탁제, 감미제, 풍미제, 착색제, 방향제 및 보존제를 포함할 수 있다.
현탁액은 활성 화합물에 더하여, 현탁제, 예를 들면, 에톡실화된 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨, 그리고 소르비탄 에스테르, 미정질 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 한천-한천 및 트래거캔스, 그리고 이들의 혼합물을 내포할 수 있다.
본원에서 개시된 일정한 조성물은 피부에 또는 점막에 국소 투여될 수 있다. 국소 제제는 피부 또는 각질층 침투 증강제로서 효과적인 것으로 공지된 매우 다양한 작용제 중에서 하나 또는 그 이상을 더욱 포함할 수 있다. 이들의 실례는 2-피롤리돈, N-메틸-2-피롤리돈, 디메틸아세트아미드, 디메틸포름아미드, 프로필렌 글리콜, 메틸 또는 이소프로필 알코올, 디메틸술폭시드 및 아존이다. 제제를 미용적으로 허용되도록 만들기 위해 추가 작용제가 더욱 포함될 수 있다. 이들의 실례는 지방, 왁스, 오일, 염료, 향기, 보존제, 안정제 및 표면 활성제이다. 각질용해 작용제, 예를 들면, 당분야에서 공지된 것들 또한 포함될 수 있다. 실례는 살리실산 및 황이다.
국소 또는 경피 투여을 위한 약형은 분말, 스프레이, 연고, 페이스트, 크림, 로션, 겔, 용액, 패치 및 흡입제를 포함한다. 활성 화합물은 무균 조건 하에 제약학적으로 허용되는 담체, 그리고 필요할 수도 있는 임의의 보존제, 완충액 또는 추진제와 혼합될 수 있다. 연고, 페이스트, 크림 및 겔은 본 발명의 주제 화합물 (가령, 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드)에 더하여, 부형제, 예를 들면, 동물 및 식물성 지방, 오일, 왁스, 파라핀, 전분, 트래거캔스, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 규산, 활석 및 아연 산화물, 또는 이들의 혼합물을 내포할 수 있다.
분말 및 스프레이는 주제 화합물에 더하여, 부형제, 예를 들면, 락토오스, 활석, 규산, 수산화알루미늄, 규산칼슘, 그리고 폴리아미드 분말, 또는 이들 물질의 혼합물을 내포할 수 있다. 스프레이는 관례적인 추진제, 예를 들면, 클로로플루오로탄화수소 및 휘발성 치환되지 않은 탄화수소, 예를 들면, 부탄 및 프로판을 부가적으로 내포할 수 있다.
일정한 구체예에서, 비경구 투여에 적합한 제약학적 조성물은 하나 또는 그 이상의 제약학적으로 허용되는 무균 등장성 수성 또는 비수성 용액, 분산액, 현탁액 또는 유제, 또는 이용 직전에 무균 주사가능 용액 또는 분산액으로 재구성될 수 있는 무균 분말과 합동으로, 하나 또는 그 이상의 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드를 포함할 수 있는데, 이것은 항산화제, 완충액, 세균발육저지제, 제제를 의도된 수용자의 혈액과 등장성이 되게 만드는 용질 또는 현탁제 또는 농후제를 내포할 수 있다. 본 발명의 제약학적 조성물에서 이용될 수 있는 적합한 수성 및 비수성 담체의 실례는 물, 에탄올, 폴리올 (가령, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이들의 적합한 혼합물, 식물성 오일, 예를 들면, 올리브유, 그리고 주사가능 유기 에스테르, 예를 들면, 에틸 올레산염을 포함한다. 적절한 유동성은 예로서, 코팅 물질, 예를 들면, 레시틴의 이용에 의해, 분산액의 경우에 필요한 입자 크기의 유지에 의해, 그리고 계면활성제의 이용에 의해 유지될 수 있다.
본 발명의 조성물은 또한, 어쥬번트, 예를 들면, 보존제, 적심제, 유화제 및 분산제를 내포할 수 있다. 미생물의 작용의 예방은 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들면, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀 소르브산 등의 포함에 의해 담보될 수 있다. 등장성 작용제, 예를 들면, 당, 염화나트륨 등을 조성물 내로 포함하는 것이 또한 바람직할 수 있다. 이에 더하여, 주사가능 제약학적 형태의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들면, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴의 포함에 의해 달성될 수 있다.
투약 섭생은 본 발명의 주제 화합물 (가령, 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드)의 작용을 변경하는 다양한 인자를 고려하여, 주치의에 의해 결정될 것으로 이해된다. 다양한 인자는 치료되는 질환에 의존할 것이다.
일정한 구체예에서, 본 발명은 또한, 본원에서 개시된 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드 또는 다른 화합물의 생체내 생산을 위한 유전자 요법을 제공한다. 이런 요법은 앞서 열거된 바와 같은 장애를 갖는 세포 또는 조직 내로 폴리스타틴-관련된 폴리뉴클레오티드 서열의 도입에 의해 치료 효과를 달성할 것이다. 폴리스타틴-관련된 폴리뉴클레오티드 서열의 전달은 재조합 발현 벡터, 예를 들면, 키메라 바이러스 또는 콜로이드 분산 시스템을 이용하여 달성될 수 있다. 폴리스타틴-관련된 폴리뉴클레오티드 서열의 치료적 전달을 위해 표적화된 리포솜의 이용이 바람직하다.
본원에서 교시된 바와 같은 유전자 요법을 위해 활용될 수 있는 다양한 바이러스 벡터는 아데노바이러스, 헤르페스 바이러스, 우두, 또는 바람직하게는, RNA 바이러스, 예를 들면, 레트로바이러스를 포함한다. 바람직하게는, 레트로바이러스 벡터는 뮤린 또는 조류 레트로바이러스의 유도체이다. 단일 외래 유전자가 삽입될 수 있는 레트로바이러스 벡터의 실례는 다음을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다: 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스 (MoMuLV), 하비 뮤린 육종 바이러스 (HaMuSV), 뮤린 유방 종양 바이러스 (MuMTV), 그리고 라우스 육종 바이러스 (RSV). 다수의 추가 레트로바이러스 벡터는 복수 유전자를 통합할 수 있다. 이들 모든 벡터는 형질도입된 세포가 확인되고 산출될 수 있도록, 선별가능 마커에 대한 유전자를 전달하거나 또는 통합할 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 예로서, 당, 당지질, 또는 단백질을 부착함으로써 표적-특이적으로 만들어질 수 있다. 바람직한 표적화는 항체를 이용함으로써 달성된다. 당업자는 폴리스타틴-관련된 폴리뉴클레오티드를 내포하는 레트로바이러스 벡터의 표적 특정한 전달을 허용하기 위해, 특정한 폴리뉴클레오티드 서열이 레트로바이러스 유전체 내로 삽입되거나 또는 바이러스 외피에 부착될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 바람직한 구체예에서, 벡터는 뼈, 연골, 근육 또는 뉴런 세포/조직에 표적화된다.
대안으로, 조직 배양 세포는 전통적인 인산칼슘 형질감염에 의해 레트로바이러스 구조 유전자 gag, pol 및 env를 인코딩하는 플라스미드로 직접적으로 형질감염될 수 있다. 이들 세포는 이후, 관심되는 유전자를 내포하는 벡터 플라스미드로 형질감염된다. 결과의 세포는 레트로바이러스 벡터를 배양 배지 내로 방출한다.
폴리스타틴-관련된 폴리뉴클레오티드를 위한 다른 표적화된 전달 시스템은 콜로이드 분산 시스템이다. 콜로이드 분산 시스템은 거대분자 복합체, 나노캡슐, 마이크로스피어, 비드, 그리고 수중유 유제, 미셀, 혼합된 미셀 및 리포솜을 비롯한 지질-기초된 시스템을 포함한다. 본 발명의 바람직한 콜로이드성 시스템은 리포솜이다. 리포솜은 시험관내 및 생체내에서 전달 수송체로서 유용한 인공 막 소포이다. RNA, DNA 및 무손상 비리온은 수성 내부에 피포되고 생물학적으로 활성 형태에서 세포로 전달될 수 있다 (가령, Fraley, et al., Trends Biochem. Sci., 6:77, 1981을 참조한다). 리포솜 운반제를 이용하여 효율적인 유전자 전달을 위한 방법은 당분야에서 공지된다, 가령, Mannino, et al., Biotechniques, 6:682, 1988을 참조한다. 리포솜의 조성은 통상적으로, 스테로이드, 특히 콜레스테롤과 합동으로, 인지질의 조합이다. 다른 인지질 또는 다른 지질 역시 이용될 수 있다. 리포솜의 물리적 특징은 pH, 이온 강도 및 이가 양이온의 존재에 의존한다.
리포솜 생산에서 유용한 지질의 실례는 포스파티딜 화합물, 예를 들면, 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜콜린, 포스파티딜세린, 포스파티딜에탄올아민, 스핑고지질, 세레브로시드 및 강글리오시드를 포함한다. 예시적인 인지질은 난 포스파티딜콜린, 디팔미토일포스파티딜콜린 및 디스테아로일포스파티딜콜린을 포함한다. 리포솜의 표적화는 또한, 예로서 장기 특이성, 세포 특이성 및 소기관 특이성에 근거하여 가능하고 당분야에서 공지된다.
실시예
본 발명은 지금까지 일반적으로 설명되었기 때문에, 다음 실시예를 참조하면 더욱 쉽게 이해될 것인데, 이들 실시예는 본 발명의 일정한 구체예 및 구체예들의 예시의 목적으로만 포함되고 본 발명을 한정하는 것으로 의도되지 않는다.
실시예 1. 단일-팔 WFIKKN2 폴리펩티드 융합 단백질의 산출
출원인은 가용성 비대칭 Fc 융합 단백질을 산출하였는데, 여기서 선천적 전장 인간 WFIKKN2 폴리펩티드가 2가지 인간 G1Fc 사슬 중에서 한 가지에 링커를 통해 부착되었다.
WFIKKN2-Fc 이형화학 복합체의 형성을 증진하기 위한 방법은 WFIKKN2-Fc 동종이합체성 복합체와는 대조적으로, 비대칭 이형화학 복합체의 형성을 유도하기 위해 Fc 도메인의 아미노산 서열에서 변경을 도입하는 것이다. Fc 도메인을 이용하여 비대칭 상호작용 쌍을 만들기 위한 많은 상이한 접근법이 본 발명에서 설명된다.
서열 번호: 57 및 58의 폴리펩티드 서열에서 도해된 한 가지 접근법에서, 한쪽 Fc 도메인은 상호작용 대면에서 양이온성 아미노산이 도입되도록 변경되고, 반면, 다른 Fc 도메인은 상호작용 대면에서 음이온성 아미노산이 도입되도록 변경된다. 본 실시예에서, 이들 두 폴리펩티드 사슬의 정확한 대합은 WFIKKN2-G1Fc 내에 두 위치 (밑줄 표시됨)에서 리신 잔기 (E134K/D177K) (서열 번호: 57) 및 G1Fc 내에 두 위치 (밑줄 표시됨)에서 아스파르트산염 잔기 (K170D/K187D) (서열 번호: 58)를 대체함으로써 전하-기초된 기전을 통해 증진된다. 13개 아미노산의 임의선택적 N 말단 연장 (밑줄 표시됨)은 위치 4에서 시스테인에 의한 이황화 결합 형성을 용이하게 하기 위해 짧은 사슬 (서열 번호: 58) 상에 포함된다.
1 LPPIRYSHAG ICPNDMNPNL WVDAQSTCRR ECETDQECET YEKCCPNVCG
51 TKSCVAARYM DVKGKKGPVG MPKEATCDHF MCLQQGSECD IWDGQPVCKC
101 KDRCEKEPSF TCASDGLTYY NRCYMDAEAC SKGITLAVVT CRYHFTWPNT
151 SPPPPETTMH PTTASPETPE LDMAAPALLN NPVHQSVTMG ETVSFLCDVV
201 GRPRPEITWE KQLEDRENVV MRPNHVRGNV VVTNIAQLVI YNAQLQDAGI
251 YTCTARNVAG VLRADFPLSV VRGHQAAATS ESSPNGTAFP AAECLKPPDS
301 EDCGEEQTRW HFDAQANNCL TFTFGHCHRN LNHFETYEAC MLACMSGPLA
351 ACSLPALQGP CKAYAPRWAY NSQTGQCQSF VYGGCEGNGN NFESREACEE
401 SCPFPRGNQR CRACKPRQKL VTSFCRSDFV ILGRVSELTE EPDSGRALVT
451 VDEVLKDEKM GLKFLGQEPL EVTLLHVDWA CPCPNVTVSE MPLIIMGEVD
501 GGMAMLRPDS FVGASSARRV RKLREVMHKK TCDVLKEFLG LHTGGGGSGG
551 GGSGGGGSGG GGSTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV
601 TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVL
651 HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSRKEMT
701 KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLK SDGSFFLYSK
751 LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK
(서열 번호: 57)
-13 SNTKVDKRVT GGG
1 THTCPPCPAP ELLGGPSVFL FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV VVDVSHEDPE
51 VKFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQYNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK
101 VSNKALPAPI EKTISKAKGQ PREPQVYTLP PSREEMTKNQ VSLTCLVKGF
151 YPSDIAVEWE SNGQPENNYD TTPPVLDSDG SFFLYSDLTV DKSRWQQGNV
201 FSCSVMHEAL HNHYTQKSLS LSPGK (서얼 번호: 58)
이들 변이체의 성숙 (처리된) 형태에 대한 상응하는 핵산 서열은 서열 번호: 59, 60이다.
1 CTGCCGCCCA TCCGCTATTC CCACGCCGGC ATCTGCCCCA ACGACATGAA
51 TCCCAACCTC TGGGTGGACG CACAGAGCAC CTGCAGGCGG GAGTGTGAGA
101 CGGACCAGGA GTGTGAGACC TATGAGAAGT GCTGCCCCAA CGTATGTGGG
151 ACCAAGAGCT GCGTGGCGGC CCGCTACATG GACGTGAAAG GGAAGAAGGG
201 CCCAGTGGGC ATGCCCAAGG AGGCCACATG TGACCACTTC ATGTGTCTGC
251 AGCAGGGCTC TGAGTGTGAC ATCTGGGATG GCCAGCCCGT GTGTAAGTGC
301 AAAGACCGCT GTGAGAAGGA GCCCAGCTTT ACCTGCGCCT CGGACGGCCT
351 CACCTACTAT AACCGCTGCT ACATGGATGC CGAGGCCTGC TCCAAAGGCA
401 TCACACTGGC CGTTGTAACC TGCCGCTATC ACTTCACCTG GCCCAACACC
451 AGCCCCCCAC CACCTGAGAC CACCATGCAC CCCACCACAG CCTCCCCAGA
501 GACCCCTGAG CTGGACATGG CGGCCCCTGC GCTGCTCAAC AACCCTGTGC
551 ACCAGTCGGT CACCATGGGT GAGACAGTGA GCTTCCTCTG TGATGTGGTG
601 GGCCGGCCCC GGCCTGAGAT CACCTGGGAG AAGCAGTTGG AGGATCGGGA
651 GAATGTGGTC ATGCGGCCCA ACCATGTGCG TGGCAACGTG GTGGTCACCA
701 ACATTGCCCA GCTGGTCATC TATAACGCCC AGCTGCAGGA TGCTGGGATC
751 TACACCTGCA CGGCCCGGAA CGTGGCTGGG GTCCTGAGGG CTGATTTCCC
801 GCTGTCGGTG GTCAGGGGTC ATCAGGCTGC AGCCACCTCA GAGAGCAGCC
851 CCAATGGCAC GGCTTTCCCG GCGGCCGAGT GCCTGAAGCC CCCCGACAGT
901 GAGGACTGTG GCGAAGAGCA GACCCGCTGG CACTTCGATG CCCAGGCCAA
951 CAACTGCCTG ACCTTCACCT TCGGCCACTG CCACCGTAAC CTCAACCACT
1001 TTGAGACCTA TGAGGCCTGC ATGCTGGCCT GCATGAGCGG GCCGCTGGCC
1051 GCGTGCAGCC TGCCCGCCCT GCAGGGGCCC TGCAAAGCCT ACGCGCCTCG
1101 CTGGGCTTAC AACAGCCAGA CGGGCCAGTG CCAGTCCTTT GTCTATGGTG
1151 GCTGCGAGGG CAATGGCAAC AACTTTGAGA GCCGTGAGGC CTGTGAGGAG
1201 TCGTGCCCCT TCCCCAGGGG GAACCAGCGC TGTCGGGCCT GCAAGCCTCG
1251 GCAGAAGCTC GTTACCAGCT TCTGTCGCAG CGACTTTGTC ATCCTGGGCC
1301 GAGTCTCTGA GCTGACCGAG GAGCCTGACT CGGGCCGCGC CCTGGTGACT
1351 GTGGATGAGG TCCTAAAGGA TGAGAAAATG GGCCTCAAGT TCCTGGGCCA
1401 GGAGCCATTG GAGGTCACTC TGCTTCACGT GGACTGGGCA TGCCCCTGCC
1451 CCAACGTGAC CGTGAGCGAG ATGCCGCTCA TCATCATGGG GGAGGTGGAC
1501 GGCGGCATGG CCATGCTGCG CCCCGATAGC TTTGTGGGCG CATCGAGTGC
1551 CCGCCGGGTC AGGAAGCTTC GTGAGGTCAT GCACAAGAAG ACCTGTGACG
1601 TCCTCAAGGA GTTTCTTGGC TTGCACACCG GTGGTGGAGG TTCTGGAGGT
1651 GGAGGAAGTG GTGGAGGTGG TTCTGGAGGT GGTGGAAGTA CTCACACATG
1701 CCCACCGTGC CCAGCACCTG AACTCCTGGG GGGACCGTCA GTCTTCCTCT
1751 TCCCCCCAAA ACCCAAGGAC ACCCTCATGA TCTCCCGGAC CCCTGAGGTC
1801 ACATGCGTGG TGGTGGACGT GAGCCACGAA GACCCTGAGG TCAAGTTCAA
1851 CTGGTACGTG GACGGCGTGG AGGTGCATAA TGCCAAGACA AAGCCGCGGG
1901 AGGAGCAGTA CAACAGCACG TACCGTGTGG TCAGCGTCCT CACCGTCCTG
1951 CACCAGGACT GGCTGAATGG CAAGGAGTAC AAGTGCAAGG TCTCCAACAA
2001 AGCCCTCCCA GCCCCCATCG AGAAAACCAT CTCCAAAGCC AAAGGGCAGC
2051 CCCGAGAACC ACAGGTGTAC ACCCTGCCCC CATCCCGGAA GGAGATGACC
2101 AAGAACCAGG TCAGCCTGAC CTGCCTGGTC AAAGGCTTCT ATCCCAGCGA
2151 CATCGCCGTG GAGTGGGAGA GCAATGGGCA GCCGGAGAAC AACTACAAGA
2201 CCACGCCTCC CGTGCTGAAG TCCGACGGCT CCTTCTTCCT CTATAGCAAG
2251 CTCACCGTGG ACAAGAGCAG GTGGCAGCAG GGGAACGTCT TCTCATGCTC
2301 CGTGATGCAT GAGGCTCTGC ACAACCACTA CACGCAGAAG AGCCTCTCCC
2351 TGTCTCCGGG TAAA (서얼 번호: 59)
1 AGCAACACCA AGGTGGACAA GAGAGTTACC GGTGGTGGAA CTCACACATG
51 CCCACCGTGC CCAGCACCTG AACTCCTGGG GGGACCGTCA GTCTTCCTCT
101 TCCCCCCAAA ACCCAAGGAC ACCCTCATGA TCTCCCGGAC CCCTGAGGTC
151 ACATGCGTGG TGGTGGACGT GAGCCACGAA GACCCTGAGG TCAAGTTCAA
201 CTGGTACGTG GACGGCGTGG AGGTGCATAA TGCCAAGACA AAGCCGCGGG
251 AGGAGCAGTA CAACAGCACG TACCGTGTGG TCAGCGTCCT CACCGTCCTG
301 CACCAGGACT GGCTGAATGG CAAGGAGTAC AAGTGCAAGG TCTCCAACAA
351 AGCCCTCCCA GCCCCCATCG AGAAAACCAT CTCCAAAGCC AAAGGGCAGC
401 CCCGAGAACC ACAGGTGTAC ACCCTGCCCC CATCCCGGGA GGAGATGACC
451 AAGAACCAGG TCAGCCTGAC CTGCCTGGTC AAAGGCTTCT ATCCCAGCGA
501 CATCGCCGTG GAGTGGGAGA GCAATGGGCA GCCGGAGAAC AACTACGACA
551 CCACGCCTCC CGTGCTGGAC TCCGACGGCT CCTTCTTCCT CTATAGCGAC
601 CTCACCGTGG ACAAGAGCAG GTGGCAGCAG GGGAACGTCT TCTCATGCTC
651 CGTGATGCAT GAGGCTCTGC ACAACCACTA CACGCAGAAG AGCCTCTCCC
701 TGTCTCCGGG TAAA (서얼 번호: 60)
서열 번호: 57 및 서열 번호: 58의 단백질은 CHO 세포주로부터 공동발현되고 정제되어, WFIKKN2-Fc를 포함하는 이형화학 복합체가 산출될 수 있다.
비대칭 Fc 융합 단백질을 이용하여 이형다합체 복합체의 형성을 증진하는 다른 접근법에서, Fc 도메인은 서열 번호: 71 및 72의 폴리펩티드 서열에서 예시된 바와 같이 상보성 소수성 상호작용 및 추가 분자간 이황화 결합이 도입되도록 변경된다.
1 LPPIRYSHAG ICPNDMNPNL WVDAQSTCRR ECETDQECET YEKCCPNVCG
51 TKSCVAARYM DVKGKKGPVG MPKEATCDHF MCLQQGSECD IWDGQPVCKC
101 KDRCEKEPSF TCASDGLTYY NRCYMDAEAC SKGITLAVVT CRYHFTWPNT
151 SPPPPETTMH PTTASPETPE LDMAAPALLN NPVHQSVTMG ETVSFLCDVV
201 GRPRPEITWE KQLEDRENVV MRPNHVRGNV VVTNIAQLVI YNAQLQDAGI
251 YTCTARNVAG VLRADFPLSV VRGHQAAATS ESSPNGTAFP AAECLKPPDS
301 EDCGEEQTRW HFDAQANNCL TFTFGHCHRN LNHFETYEAC MLACMSGPLA
351 ACSLPALQGP CKAYAPRWAY NSQTGQCQSF VYGGCEGNGN NFESREACEE
401 SCPFPRGNQR CRACKPRQKL VTSFCRSDFV ILGRVSELTE EPDSGRALVT
451 VDEVLKDEKM GLKFLGQEPL EVTLLHVDWA CPCPNVTVSE MPLIIMGEVD
501 GGMAMLRPDS FVGASSARRV RKLREVMHKK TCDVLKEFLG LHTGGGTHTC
601 PPCPAPELLG GPSVFLFPPK PKDTLMISRT PEVTCVVVDV SHEDPEVKFNW
701 YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKAL
801 PAPIEKTISK AKGQPREPQV YTLPPCREEM TKNQVSLWCL VKGFYPSDIAV
901 EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMHE
1001 ALHNHYTQKS LSLSPGK (서얼 번호: 71)
가능한 동종이합체성 복합체 중에서 어느 하나보다는 이형이합체의 형성을 증진하기 위해, 2개의 아미노산 치환 (세린을 시스테인으로 대체 및 트레오닌을 트립토판으로 대체)이 상기 이중 밑줄에 의해 지시된 바와 같이 융합 단백질의 Fc 도메인 내로 도입될 수 있다. 서열 번호: 71의 아미노산 서열은 임의선택적으로, 리신 (K)이 C 말단으로부터 제거된 상태로 제공될 수 있다.
Fc 융합 폴리펩티드의 상보성 형태 (서열 번호: 72)는 다음과 같고, 그리고 임의선택적으로, 리신 (K)이 C 말단으로부터 제거된 상태로 제공될 수 있다.
-13 SNTKVDKRVT GGG
1 THTCPPCPAP ELLGGPSVFL FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV VVDVSHEDPE
51 VKFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQYNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK
101 VSNKALPAPI EKTISKAKGQ PREPQVCTLP PSREEMTKNQ VSLSCAVKGF
151 YPSDIAVEWE SNGQPENNYK TTPPVLDSDG SFFLVSKLTV DKSRWQQGNV
201 FSCSVMHEAL HNHYTQKSLS LSPGK (서얼 번호: 72)
상기 서열 번호: 71의 폴리펩티드와의 이형이합체 형성을 유도하기 위해, 4개의 아미노산 치환이 상기 이중 밑줄에 의해 지시된 바와 같이 Fc 폴리펩티드 내로 도입될 수 있다. 서열 번호: 72의 아미노산 서열은 임의선택적으로, 리신 (K)이 C 말단으로부터 제거된 상태로 제공될 수 있다.
서열 번호: 71 및 서열 번호: 72의 단백질은 CHO 세포주로부터 공동발현되고 정제되어, WFIKKN2-Fc를 포함하는 이형화학 복합체가 산출될 수 있다.
본 발명은 예로서, 다음의 리더 서열 중에서 한 가지로 세포에서 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드의 발현을 제공한다:
선천적 인간 폴리스타틴 리더: MVRARHQPGGLCLLLLLLCQFMEDRSAQA
(서열 번호: 61)
선천적 인간 FLRG 리더: MRPGAPGPLWPLPWGALAWAVGFVSS
(서열 번호: 62)
선천적 인간 WFIKKN1 리더: MPALRPLLPLLLLLRLTSG
(서열 번호: 63)
선천적 인간 WFIKKN2 리더: MWAPRCRRFWSRWEQVAALLLLLLLLGVPPRSLA
(서열 번호: 64)
조직 플라스미노겐 활성인자 (TPA): MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSP
(서열 번호: 65)
벌꿀 멜리틴 (HBML): MKFLVNVALVFMVVYISYIYA
(서열 번호: 66)
선별된 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드 변이체는 TPA 리더를 통합하고, 그리고 긴 사슬을 형성하기 위해 임의선택적 링커와 함께 또는 이것 없이 G1Fc 도메인 (서열 번호: 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 또는 46)에 융합된다. 긴 사슬과의 대합을 증진하는 상보성 G1Fc 도메인 (서열 번호: 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 또는 46)을 포함하는 짧은 사슬 역시 TPA 리더를 통합한다. 구조체는 COS 또는 CHO 세포에서 공동발현되고 여과 및 단백질 A 크로마토그래피에 의해 조건부 배지로부터 정제되었다. 리포터 유전자 검정을 위한 표본의 순도는 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 분석에 의해 평가되었다.
선천적 전장 인간 WFIKKN2 폴리펩티드를 통합하는 2개의 변이체가 공동발현에 의해 생산된 단일-팔 WFIKKN2-hG1Fc 융합 단백질과의 직접적인 비교를 위해 산출되었다. 첫 번째 변이체는 이중-팔 WFIKKN2-hG1Fc 융합 단백질이고, 그리고 두 번째 변이체는 C 말단에서 His6 태그에 부착된 단일 사슬 WFIKKN2 폴리펩티드이었다.
출원인은 COS 세포를 단일-팔 WFIKKN2-hG1Fc 및 이중-팔 WFIKKN2-hG1Fc를 인코딩하는 구조체로 일시적으로 형질감염시켰다. CHO 세포가 WFIKKN2-His6을 안정되게 발현하는데 이용되었다. WFIKKN2-His6을 인코딩하는 UCOE™-기초된 구조체가 CHO 세포주 내로 안정되게 형질감염되었고, 클론이 메토트렉사트로 선별되었고, 그리고 집락을 형성하는 임의의 클론이 이후 모아졌다. 어떤 유전자 증폭도 수행되지 않았는데, 그 이유는 발현의 안정성을 유지하면서 UCOE™ 풀을 증폭하는 것이 어렵기 때문이다. 희석 클로닝 대신에, 높은-발현 풀이 확인되고 WFIKKN2-His6을 산출하는데 이용되었다.
Fc-내포 구조체의 정제는 예로서, 조건부 배지의 여과, 그 이후에 단백질 A 크로마토그래피, 글리신 완충액 (pH 3.0)으로 용리, 표본 중화, 그리고 크기-배제 크로마토그래피를 비롯한 다양한 기술로 달성되었다. Fc-내포 구조체의 순도는 분석적 크기-배제 크로마토그래피 및 SDS-PAGE에 의해 평가되었다.
WFIKKN2-His6의 정제는 예로서, 조건부 배지의 정용여과, 그 이후에 니켈-니트릴로트리아세트산 (Qiagen) 아가로오스 친화성 크로마토그래피, 이미다졸 완충액으로 용리, 그리고 PBS에 대한 투석을 비롯한 다양한 기술을 이용하여 달성되었다. 표본의 순도는 모든 구조체에 대해 분석적 크기-배제 크로마토그래피 및 SDS-PAGE에 의해 평가되었다. 성숙 단백질의 분석은 WFIKKN2-His6에 대한 예상된 N 말단 서열을 확증하였다.
실시예 2. 단일-팔 WFIKKN2 폴리펩티드 융합 단백질의 효능
A204 횡문근육종 세포에서 리포터 유전자 검정이 미오스타틴 신호전달을 저해하는 전장 인간 WFIKKN2 폴리펩티드 변이체의 능력을 평가하는데 이용되었다. 이러한 검정은 형질감염 효율에 대해 정규화하기 위해, pGL3(CAGA)12 리포터 플라스미드 [Dennler et al (1998) EMBO 17:3091-3100]뿐만 아니라 대조 레닐라 리포터 플라스미드 (pRL-CMV)로 형질감염된 인간 횡문근육종 세포주에 근거된다. CAGA12 모티프가 TGFβ-반응성 유전자, 예를 들면, 플라스미노겐 활성인자 저해제 유형 1 내에 존재하고, 따라서 이러한 벡터는 Smad2 및 Smad3을 통해 신호전달하는 인자에 일반적으로 이용된다.
검정의 첫 번째 일자에, A204 세포 (ATCCㄾ HTB-82)가 웰마다 105 세포에서 48-웰 평판에서 분포되고, 그리고 10% FBS로 보충된 McCoy의 5A 성장 배지 (Life Technologies)에서 하룻밤 동안 배양되었다. 모든 배양은 달리 언급되지 않으면 37 ℃ 및 5% CO2에서 이루어졌다. 두 번째 일자에, 10 μg pGL3(CAGA)12, 0.1 μg pRL-CMV, 30 μl X-tremeGENE 9 (Roche Diagnostics) 및 970 μl OptiMEM (Life Technologies)을 내포하는 용액이 검정 완충액 (McCoy의 5A 배지 + 0.1% 소 혈청 알부민)에 첨가하고 하룻밤 배양을 위해 도말된 세포 (500 μl/웰)에 적용하기에 앞서, 실온에서 30 분 동안 배양되었다. 세 번째 일자에, 배지가 제거되고, 그리고 세포가 아래에 설명된 바와 같이 제조된 리간드 및 저해제의 혼합물과 함께 6 시간 동안 배양되었다.
미오스타틴 신호전달을 저해하는 WFIKKN2 구조체의 능력을 평가하기 위해, 각 시험 물품 (각각 2개의 복제물)의 계열 희석이 48-웰 평판 내에 검정 완충액에서 200 μl의 최종 부피까지 이루어졌다. 이후, 검정 완충액에서 동등한 용적의 미오스타틴 (R&D systems, 32 ng/mL의 최종 농도)이 첨가되었다. 시험 용액은 형질감염된 A204 세포의 48-웰 평판의 각 웰에 250 μl의 이러한 혼합물을 첨가하기에 앞서 30 분 동안 배양되었다. 6 시간 동안 시험 용액과 함께 배양 후, 세포는 인산염 완충된 식염수로 헹굼되고, 이후 수동 용해 완충액 (Promega E1941)으로 용해되고 -70℃에서 하룻밤 동안 보관되었다. 네 번째 및 최종 일자에, 평판은 온건한 진탕 하에 실온으로 가온되었다. 세포 용해물은 96-웰 화학발광 평판으로 이전되고, 그리고 이중-루시페라아제 리포터 검정 시스템 (Promega E1980)으로부터 시약으로 광도계에서 분석되었다. 실험적 리포터의 루시페라아제 활성은 레닐라 대조 리포터로 획득된 루시페라아제 활성에 대해 정규화되었다.
WFIKKN2 폴리펩티드 구조체는 미오스타틴에 의한 신호전달을 저해하는 능력에서 현저하게 달랐다. 아래의 표에서 보여지는 바와 같이, 단일 사슬 WFIKKN2-His6 및 단일-팔 WFIKKN2-G1Fc는 낮은 나노몰 범위에서 IC50 값으로, 미오스타틴 신호전달을 강력하게 저해하였다. 대조적으로, 이중-팔 WFIKKN2-G1Fc는 시험된 농도 범위에 걸쳐 미오스타틴 신호전달에서 어떤 감소도 보여주지 않았는데, 이것은 이러한 구조체에 대한 IC50 값이 최소한 100 nM일 것이라는 것을 암시한다. 따라서, 단일-팔 WFIKKN2-G1Fc로 미오스타틴 저해의 효능은 이중 WFIKKN2 팔을 포함하는 G1Fc 융합 단백질의 것보다 훨씬 높았다.
구조체 IC50 (nM) 생쥐에서 반감기 (h)
단일-사슬 WFIKKN2-His6 1.4 ~ 2.5
단일-팔 WFIKKN2-G1Fc 2.9 ~ 110
이중-팔 WFIKKN2-G1Fc > 100 ND
ND, 결정되지 않음
단일 사슬 WFIKKN2-His6 및 단일-팔 WFIKKN2-G1Fc의 제거 약물동력학은 생쥐에서 수행된 별개의 실험에서 연구되었다. 단일 용량의 피하 투여 후 생쥐 혈청 표본에서 단일 사슬 WFIKKN2-His6의 농도는 상업적인 항-His6 항체 (abcamㄾ ab18184)를 이용한 ELISA에 의해 계측되었다. 단일 용량의 피하 투여 후 단일-팔 WFIKKN2-G1Fc의 농도는 상업적인 항인간 IgG1 항체 (Binding Site Immunologicals AP006)를 이용한 ELISA에 의해 계측되었다. 상기 표에서 지시된 바와 같이, 생쥐에서 단일 사슬 WFIKKN2-His6 단백질의 반감기는 대략 2.5 시간 이고 (데이터 제시되지 않음), 반면 생쥐 (n = 3)에서 단일-팔 WFIKKN2-G1Fc 융합 단백질의 반감기는 100 시간보다 많았는데 (데이터 제시되지 않음), 이로부터 이러한 분자는 인간에서 10-20 일의 약리학적으로 유용한 혈청 반감기를 가질 것으로 예측될 것이다. 따라서, 단일-팔 WFIKKN2 구조체를 산출하는 이형이합체성 또는 비대칭 접근법을 활용함으로써, 출원인은 단일 사슬 (선천적) 단백질의 바람직한 리간드 결합 활성을 전통적인 동종이합체성 Fc 융합 단백질의 바람직한 혈청 반감기와 합동할 수 있었다.
종합하면, 이들 결과는 단일-팔 WFIKKN2-G1Fc가 유용한 치료적 작용제일 수 있다는 것을 지시한다. 이러한 실례를 뛰어넘어, 출원인은 단일-팔 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드를 포함하는 다른 비대칭 융합 단백질 역시 정제의 용이함 및 동종이합체성 Fc 융합 단백질 구조체에 전형적인 혈청 반감기를 부여하면서, 그들의 이중-팔 대응물보다 리간드 신호전달의 더욱 강력한 저해를 전시할 것으로 예측한다.
참조로서 편입
본원에서 언급된 모든 간행물 및 특허는 마치 각 개별 간행물 또는 특허가 참조로서 편입되는 것으로 특정적으로 및 개별적으로 지시되는 것처럼 전체적으로 본원에 참조로서 편입된다.
요부의 특정한 구체예가 논의되긴 했지만, 상기 명세서는 예시이고 제한하지 않는다. 본 명세서 및 아래 특허청구범위의 검토 시에 많은 변형이 당업자에게 명백해질 것이다. 본 발명의 전체 범위는 등가물의 전체 범위와 함께 특허청구범위, 그리고 이런 변형과 함께 본 명세서를 참조하여 결정되어야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> ACCELERON PHARMA INC. <120> FOLLISTATIN-RELATED FUSION PROTEINS AND USES THEREOF <130> PHPH-086-101 <140> 15/081,629 <141> 2016-03-25 <150> 62/138,886 <151> 2015-03-26 <160> 77 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 317 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Val Arg Ala Arg His Gln Pro Gly Gly Leu Cys Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Leu Leu Cys Gln Phe Met Glu Asp Arg Ser Ala Gln Ala Gly Asn Cys 20 25 30 Trp Leu Arg Gln Ala Lys Asn Gly Arg Cys Gln Val Leu Tyr Lys Thr 35 40 45 Glu Leu Ser Lys Glu Glu Cys Cys Ser Thr Gly Arg Leu Ser Thr Ser 50 55 60 Trp Thr Glu Glu Asp Val Asn Asp Asn Thr Leu Phe Lys Trp Met Ile 65 70 75 80 Phe Asn Gly Gly Ala Pro Asn Cys Ile Pro Cys Lys Glu Thr Cys Glu 85 90 95 Asn Val Asp Cys Gly Pro Gly Lys Lys Cys Arg Met Asn Lys Lys Asn 100 105 110 Lys Pro Arg Cys Val Cys Ala Pro Asp Cys Ser Asn Ile Thr Trp Lys 115 120 125 Gly Pro Val Cys Gly Leu Asp Gly Lys Thr Tyr Arg Asn Glu Cys Ala 130 135 140 Leu Leu Lys Ala Arg Cys Lys Glu Gln Pro Glu Leu 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Lys Lys Cys Leu Trp Asp Phe Lys Val Gly Arg Gly Arg Cys Ser Leu 225 230 235 240 Cys Asp Glu Leu Cys Pro Asp Ser Lys Ser Asp Glu Pro Val Cys Ala 245 250 255 Ser Asp Asn Ala Thr Tyr Ala Ser Glu Cys Ala Met Lys Glu Ala Ala 260 265 270 Cys Ser Ser Gly Val Leu Leu Glu Val Lys His Ser Gly Ser Cys Asn 275 280 285 Ser Ile Ser Glu Asp Thr Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Asp Gln Asp 290 295 300 Tyr Ser Phe Pro Ile Ser Ser Ile Leu Glu Trp 305 310 315 <210> 5 <211> 65 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Gly Asn Cys Trp Leu Arg Gln Ala Lys Asn Gly Arg Cys Gln Val Leu 1 5 10 15 Tyr Lys Thr Glu Leu Ser Lys Glu Glu Cys Cys Ser Thr Gly Arg Leu 20 25 30 Ser Thr Ser Trp Thr Glu Glu Asp Val Asn Asp Asn Thr Leu Phe Lys 35 40 45 Trp Met Ile Phe Asn Gly Gly Ala Pro Asn Cys Ile Pro Cys Lys Glu 50 55 60 Thr 65 <210> 6 <211> 63 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Cys Trp Leu Arg Gln Ala Lys Asn Gly Arg Cys Gln Val Leu Tyr Lys 1 5 10 15 Thr Glu Leu Ser Lys Glu Glu Cys Cys Ser Thr Gly Arg Leu Ser Thr 20 25 30 Ser 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Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 13 Cys Glu Asn Val Asp Cys Gly Pro Gly Lys Lys Cys Arg Met Asn Lys 1 5 10 15 Lys Asn Lys Pro Arg Cys Val Cys Ala Pro Asp Cys Ser Asn Ile Thr 20 25 30 Trp Lys Gly Pro Val Cys Gly Leu Asp Gly Lys Thr Tyr Arg Asn Glu 35 40 45 Cys Ala Leu Leu Lys Ala Arg Cys Lys Glu Gln Pro Glu Leu Glu Val 50 55 60 Gln Tyr Gln Gly Arg Cys Cys Arg Asp Val Phe Cys Pro Gly Ser Ser 65 70 75 80 Thr Cys Val Val Asp Gln Thr Asn Asn Ala Tyr Cys Val Thr Cys Asn 85 90 95 Arg Ile Cys Pro Glu Pro Ala Ser Ser Glu Gln Tyr Leu Cys Gly Asn 100 105 110 Asp Gly Val Thr Tyr Ser Ser Ala Cys His Leu Arg Lys Ala Thr Cys 115 120 125 Leu Leu Gly Arg Ser Ile Gly Leu Ala Tyr Glu Gly Lys Cys Cys Glu 130 135 140 Asp Ile Gln Cys Thr Gly Gly Lys Lys Cys Leu Trp Asp Phe Lys Val 145 150 155 160 Gly Arg Gly Arg Cys Ser Leu Cys Asp Glu Leu Cys Pro Asp Ser Lys 165 170 175 Ser Asp Glu Pro Val Cys Ala Ser Asp Asn Ala Thr Tyr Ala Ser Glu 180 185 190 Cys Ala Met Lys Glu Ala Ala Cys 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ctactgtgtg acctgtaatc ggatttgccc agagcctgct 600 tcctctgagc aatatctctg tgggaatgat ggagtcacct actccagtgc ctgccacctg 660 agaaaggcta cctgcctgct gggcagatct attggattag cctatgaggg aaagtgtatc 720 aaagcaaagt cctgtgaaga tatccagtgc actggtggga aaaaatgttt atgggatttc 780 aaggttggga gaggccggtg ttccctctgt gatgagctgt gccctgacag taagtcggat 840 gagcctgtct gtgccagtga caatgccact tatgccagcg agtgtgccat gaaggaagct 900 gcctgctcct caggtgtgct actggaagta aagcactccg gatcttgcaa ctccatttcg 960 gaagacaccg aggaagagga ggaagatgaa gaccaggact acagctttcc tatatcttct 1020 attctagagt gg 1032 <210> 48 <211> 945 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 48 gggaactgct ggctccgtca agcgaagaac ggccgctgcc aggtcctgta caagaccgaa 60 ctgagcaagg aggagtgctg cagcaccggc cggctgagca cctcgtggac cgaggaggac 120 gtgaatgaca acacactctt caagtggatg attttcaacg ggggcgcccc caactgcatc 180 ccctgtaaag aaacgtgtga gaacgtggac tgtggacctg ggaaaaaatg ccgaatgaac 240 aagaagaaca aaccccgctg cgtctgcgcc ccggattgtt ccaacatcac ctggaagggt 300 ccagtctgcg ggctggatgg gaaaacctac 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Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 59 ctgccgccca tccgctattc ccacgccggc atctgcccca acgacatgaa tcccaacctc 60 tgggtggacg cacagagcac ctgcaggcgg gagtgtgaga cggaccagga gtgtgagacc 120 tatgagaagt gctgccccaa cgtatgtggg accaagagct gcgtggcggc ccgctacatg 180 gacgtgaaag ggaagaaggg cccagtgggc atgcccaagg aggccacatg tgaccacttc 240 atgtgtctgc agcagggctc tgagtgtgac atctgggatg gccagcccgt gtgtaagtgc 300 aaagaccgct gtgagaagga gcccagcttt acctgcgcct cggacggcct cacctactat 360 aaccgctgct acatggatgc cgaggcctgc tccaaaggca tcacactggc cgttgtaacc 420 tgccgctatc acttcacctg gcccaacacc agccccccac cacctgagac caccatgcac 480 cccaccacag cctccccaga gacccctgag ctggacatgg cggcccctgc gctgctcaac 540 aaccctgtgc accagtcggt caccatgggt gagacagtga gcttcctctg tgatgtggtg 600 ggccggcccc ggcctgagat cacctgggag aagcagttgg aggatcggga gaatgtggtc 660 atgcggccca accatgtgcg tggcaacgtg gtggtcacca acattgccca gctggtcatc 720 tataacgccc agctgcagga tgctgggatc tacacctgca cggcccggaa cgtggctggg 780 gtcctgaggg ctgatttccc gctgtcggtg gtcaggggtc atcaggctgc agccacctca 840 gagagcagcc ccaatggcac ggctttcccg gcggccgagt gcctgaagcc ccccgacagt 900 gaggactgtg gcgaagagca gacccgctgg cacttcgatg cccaggccaa caactgcctg 960 accttcacct tcggccactg ccaccgtaac ctcaaccact ttgagaccta tgaggcctgc 1020 atgctggcct gcatgagcgg gccgctggcc gcgtgcagcc tgcccgccct gcaggggccc 1080 tgcaaagcct acgcgcctcg ctgggcttac aacagccaga cgggccagtg ccagtccttt 1140 gtctatggtg gctgcgaggg caatggcaac aactttgaga gccgtgaggc ctgtgaggag 1200 tcgtgcccct tccccagggg gaaccagcgc tgtcgggcct gcaagcctcg gcagaagctc 1260 gttaccagct tctgtcgcag cgactttgtc atcctgggcc gagtctctga gctgaccgag 1320 gagcctgact cgggccgcgc cctggtgact gtggatgagg tcctaaagga tgagaaaatg 1380 ggcctcaagt tcctgggcca ggagccattg gaggtcactc tgcttcacgt ggactgggca 1440 tgcccctgcc ccaacgtgac cgtgagcgag atgccgctca tcatcatggg ggaggtggac 1500 ggcggcatgg ccatgctgcg ccccgatagc tttgtgggcg catcgagtgc ccgccgggtc 1560 aggaagcttc gtgaggtcat gcacaagaag acctgtgacg tcctcaagga gtttcttggc 1620 ttgcacaccg gtggtggagg ttctggaggt ggaggaagtg gtggaggtgg ttctggaggt 1680 ggtggaagta ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca 1740 gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 1800 acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 1860 gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 1920 taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 1980 aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 2040 aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggaa ggagatgacc 2100 aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 2160 gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctgaag 2220 tccgacggct ccttcttcct ctatagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 2280 gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 2340 agcctctccc tgtctccggg taaa 2364 <210> 60 <211> 714 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 60 agcaacacca aggtggacaa gagagttacc ggtggtggaa ctcacacatg cccaccgtgc 60 ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac 120 accctcatga tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa 180 gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca 240 aagccgcggg aggagcagta caacagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg 300 caccaggact ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca 360 gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac 420 accctgcccc catcccggga ggagatgacc aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc 480 aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac 540 aactacgaca ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ctatagcgac 600 ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat 660 gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg taaa 714 <210> 61 <211> 29 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 61 Met Val Arg Ala Arg His Gln Pro Gly Gly Leu Cys Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Leu Leu Cys Gln Phe Met Glu Asp Arg 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Claims (55)

  1. 두 번째 폴리펩티드와 공유적으로 또는 비공유적으로 연관된 첫 번째 폴리펩티드를 포함하는 단백질 복합체, 여기서:
    a. 첫 번째 폴리펩티드는 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드의 아미노산 서열 및 상호작용 쌍의 첫 번째 구성원의 아미노산 서열을 포함하고; 그리고
    b. 두 번째 폴리펩티드는 상호작용 쌍의 두 번째 구성원의 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 두 번째 폴리펩티드는 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드를 포함하지 않는다.
  2. 청구항 1에 있어서, 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드의 아미노산 서열은 서열 번호: 1-33 중에서 한 가지의 아미노산 서열과 최소한 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 복합체.
  3. 청구항 1 또는 2에 있어서, 첫 번째 폴리펩티드는 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드의 아미노산 서열 및 상호작용 쌍의 첫 번째 구성원의 아미노산 서열 사이에 배치된 링커 폴리펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 복합체.
  4. 청구항 1 내지 3 중에서 어느 한 항에 있어서, 상호작용 쌍의 첫 번째 구성원은 면역글로불린의 불변 도메인을 포함하고, 그리고 상호작용 쌍의 두 번째 구성원은 면역글로불린의 불변 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 복합체.
  5. 청구항 1 내지 4 중에서 어느 한 항에 있어서, 상호작용 쌍의 첫 번째 구성원은 면역글로불린의 Fc 도메인을 포함하고, 그리고 상호작용 쌍의 두 번째 구성원은 면역글로불린의 불변 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 복합체.
  6. 청구항 1 내지 5 중에서 어느 한 항에 있어서, 상호작용 쌍의 첫 번째 구성원은 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 Fc 도메인인 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 복합체.
  7. 청구항 5에 있어서, 상호작용 쌍의 첫 번째 구성원은 서열 번호: 34-46 중에서 한 가지와 최소한 80%, 85%, 90%, 95%,96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 복합체.
  8. 청구항 1 내지 7 중에서 어느 한 항에 있어서, 상호작용 쌍의 두 번째 구성원은 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 Fc 도메인인 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 복합체.
  9. 청구항 1 내지 8 중에서 어느 한 항에 있어서, 상호작용 쌍의 두 번째 구성원은 서열 번호: 34-46 중에서 한 가지와 최소한 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 복합체.
  10. 청구항 1 내지 9 중에서 어느 한 항에 있어서, 상호작용 쌍의 첫 번째 구성원은 상호작용 쌍의 두 번째 구성원과 공유적으로 또는 비공유적으로 연관하여 이합체성 단백질 복합체를 형성하는 것을 특징으로 하는 단백질 복합체.
  11. 청구항 1 내지 10 중에서 어느 한 항에 있어서, 상호작용 쌍은 비대칭 상호작용 쌍인 것을 특징으로 하는 단백질 복합체.
  12. 청구항 11에 있어서, 비대칭 상호작용 쌍의 첫 번째 구성원은 IgG의 첫 번째 변형된 불변 도메인을 포함하고, 그리고 비대칭 상호작용 쌍의 두 번째 구성원은 IgG의 두 번째 변형된 불변 도메인을 포함하고, 그리고 비대칭 상호작용 쌍의 첫 번째와 두 번째 구성원은 연관하여 이형이합체성 복합체를 형성하는 것을 특징으로 하는 단백질 복합체.
  13. 청구항 11에 있어서, 비대칭 상호작용 쌍의 첫 번째 구성원은 IgG의 첫 번째 변형된 Fc 부분을 포함하고, 그리고 비대칭 상호작용 쌍의 두 번째 구성원은 IgG의 두 번째 변형된 Fc 부분을 포함하고, 그리고 비대칭 상호작용 쌍의 첫 번째와 두 번째 구성원은 연관하여 이형이합체성 복합체를 형성하는 것을 특징으로 하는 단백질 복합체.
  14. 청구항 13에 있어서, IgG의 첫 번째 Fc 부분은 서열 번호 34-46에서 선택되는 아미노산 서열과 최소한 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 IgG의 두 번째 Fc 부분은 IgG의 첫 번째 Fc 부분의 아미노산 서열과 상이하고 서열 번호 34-46에서 선택되는 아미노산 서열과 최소한 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 복합체.
  15. 청구항 13 또는 14에 있어서, 비대칭 상호작용 쌍의 첫 번째 구성원은 서열 번호: 39의 아미노산 서열과 최소한 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 복합체.
  16. 청구항 13 내지 15 중에서 어느 한 항에 있어서, 비대칭 상호작용 쌍의 두 번째 구성원은 서열 번호: 40의 아미노산 서열과 최소한 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 복합체.
  17. 청구항 13 또는 14에 있어서, 비대칭 상호작용 쌍의 첫 번째 구성원은 서열 번호: 40의 아미노산 서열과 최소한 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 복합체.
  18. 청구항 13, 14, 또는 17 중에서 어느 한 항에 있어서, 비대칭 상호작용 쌍의 두 번째 구성원은 서열 번호: 39의 아미노산 서열과 최소한 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 복합체.
  19. 청구항 13 또는 14에 있어서, 비대칭 상호작용 쌍의 첫 번째 구성원은 서열 번호: 41의 아미노산 서열과 최소한 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 복합체.
  20. 청구항 13, 14, 또는 19 중에서 어느 한 항에 있어서, 비대칭 상호작용 쌍의 두 번째 구성원은 서열 번호: 42의 아미노산 서열과 최소한 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 복합체.
  21. 청구항 13 또는 14에 있어서, 비대칭 상호작용 쌍의 첫 번째 구성원은 서열 번호: 42의 아미노산 서열과 최소한 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 복합체.
  22. 청구항 13, 14, 또는 21 중에서 어느 한 항에 있어서, 비대칭 상호작용 쌍의 두 번째 구성원은 서열 번호: 41의 아미노산 서열과 최소한 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 복합체.
  23. 청구항 13 또는 14에 있어서, 비대칭 상호작용 쌍의 첫 번째 구성원은 서열 번호: 43의 아미노산 서열과 최소한 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 복합체.
  24. 청구항 13, 14, 또는 23 중에서 어느 한 항에 있어서, 비대칭 상호작용 쌍의 두 번째 구성원은 서열 번호: 44의 아미노산 서열과 최소한 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 복합체.
  25. 청구항 13 또는 14에 있어서, 비대칭 상호작용 쌍의 첫 번째 구성원은 서열 번호: 44의 아미노산 서열과 최소한 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 복합체.
  26. 청구항 13, 14, 또는 25 중에서 어느 한 항에 있어서, 비대칭 상호작용 쌍의 두 번째 구성원은 서열 번호: 43의 아미노산 서열과 최소한 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 복합체.
  27. 청구항 13 또는 14에 있어서, 비대칭 상호작용 쌍의 첫 번째 구성원은 서열 번호: 45의 아미노산 서열과 최소한 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 복합체.
  28. 청구항 13, 14, 또는 27 중에서 어느 한 항에 있어서, 비대칭 상호작용 쌍의 두 번째 구성원은 서열 번호: 46의 아미노산 서열과 최소한 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 복합체.
  29. 청구항 13 또는 14에 있어서, 비대칭 상호작용 쌍의 첫 번째 구성원은 서열 번호: 46의 아미노산 서열과 최소한 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 복합체.
  30. 청구항 13, 14, 또는 29 중에서 어느 한 항에 있어서, 비대칭 상호작용 쌍의 두 번째 구성원은 서열 번호: 45의 아미노산 서열과 최소한 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 복합체.
  31. 청구항 1 내지 11 중에서 어느 한 항에 있어서, 상호작용 쌍은 비유도된 상호작용 쌍인 것을 특징으로 하는 단백질 복합체.
  32. 청구항 31에 있어서, 비유도된 상호작용 쌍의 첫 번째 구성원은 상호작용 쌍의 두 번째 구성원과 공유적으로 또는 비공유적으로 연관하여 이합체성 복합체를 형성하는 것을 특징으로 하는 단백질 복합체.
  33. 청구항 31 또는 32에 있어서, 비유도된 상호작용 쌍의 첫 번째 구성원은 비유도된 상호작용 쌍의 두 번째 구성원과 동일한 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 단백질 복합체.
  34. 청구항 1 내지 33 중에서 어느 한 항에 있어서, 두 번째 폴리펩티드는 상호작용 쌍의 두 번째 구성원의 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 두 번째 폴리펩티드는 실제적인 생물학적 활성을 부여하는 임의의 다른 아미노산 서열을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 단백질 복합체.
  35. 청구항 1 내지 34 중에서 어느 한 항에 있어서, 두 번째 폴리펩티드는 상호작용 쌍의 두 번째 구성원의 아미노산 서열로 구성되고, 단서로서 두 번째 폴리펩티드는 상호작용 쌍의 두 번째 구성원의 아미노산 서열의 C 말단, N 말단 또는 C와 N 말단 둘 모두에 융합된 추가 1-50, 1-40, 1-30, 1-20 또는 1-10개 아미노산을 포함할 수 있는 것을 특징으로 하는 단백질 복합체.
  36. 청구항 35에 있어서, 추가 아미노산은 실제적인 생물학적 활성을 부여하지 않는 것을 특징으로 하는 단백질 복합체.
  37. 청구항 1 내지 36 중에서 어느 한 항에 있어서, 단백질 복합체는 GDF8, GDF11, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C 또는 액티빈 E에서 선택되는 하나 또는 그 이상의 리간드에 10-9, 10-10, 10-11, 또는 10-12보다 크거나 또는 이와 동등한 KD로 결합하는 것을 특징으로 하는 단백질 복합체.
  38. 청구항 1 내지 36 중에서 어느 한 항에 있어서, 단백질 복합체는 세포-기초된 검정에서, GDF8, GDF11, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C 또는 액티빈 E에서 선택되는 하나 또는 그 이상의 리간드에 의한 신호전달을 저해하는 것을 특징으로 하는 단백질 복합체.
  39. 청구항 1 내지 38 중에서 어느 한 항에 있어서, 단백질 복합체는 생쥐에서 최소한 6, 12, 24, 36, 48 또는 72 시간의 혈청 반감기를 전시하는 것을 특징으로 하는 단백질 복합체.
  40. 청구항 1 내지 38 중에서 어느 한 항에 있어서, 단백질 복합체는 인간에서 최소한 6, 8, 10, 또는 12 일의 혈청 반감기를 전시하는 것을 특징으로 하는 단백질 복합체.
  41. 청구항 1 내지 40 중에서 어느 한 항에 있어서, 단백질 복합체는 이형이합체인 것을 특징으로 하는 단백질 복합체.
  42. 청구항 1 내지 41 중에서 어느 한 항의 단백질 복합체를 포함하는 제약학적 제조물.
  43. 청구항 42에 있어서, 청구항 1 내지 40 중에서 어느 한 항의 단백질 복합체는 다른 폴리펩티드 성분에 대하여 최소한 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 순수한 것을 특징으로 하는 제약학적 제조물.
  44. 청구항 42 또는 43에 있어서, 제약학적 제조물은 첫 번째 또는 두 번째 폴리펩티드의 자가 결합에 의해 형성된 20%, 15%, 10%, 5%, 3%, 2% 또는 1%보다 적은 동종이합체를 포함하는 것을 특징으로 하는 제약학적 제조물.
  45. 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드의 아미노산 서열 및 비대칭 상호작용 쌍의 구성원의 아미노산 서열을 포함하는 융합 폴리펩티드.
  46. 청구항 45에 있어서, 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드의 아미노산 서열은 서열 번호: 1-33 중에서 한 가지의 아미노산 서열과 최소한 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 융합 폴리펩티드.
  47. 청구항 45 또는 46에 있어서, 융합 폴리펩티드는 폴리스타틴-관련된 폴리펩티드의 아미노산 서열 및 비대칭 상호작용 쌍의 구성원의 아미노산 서열 사이에 배치된 링커 폴리펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 융합 폴리펩티드.
  48. 청구항 45, 46 또는 47 중에서 어느 한 항에 있어서, 비대칭 상호작용 쌍의 구성원은 면역글로불린의 불변 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 융합 폴리펩티드.
  49. 청구항 45, 46 또는 47 중에서 어느 한 항에 있어서, 비대칭 상호작용 쌍의 구성원은 면역글로불린의 Fc 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 융합 폴리펩티드.
  50. 청구항 45, 46 또는 47 중에서 어느 한 항에 있어서, 비대칭 상호작용 쌍의 구성원은 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 Fc 도메인인 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 융합 폴리펩티드.
  51. 청구항 45, 46 또는 47 중에서 어느 한 항에 있어서, 비대칭 상호작용 쌍의 구성원은 서열 번호: 34-46 중에서 한 가지와 최소한 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 융합 폴리펩티드.
  52. 청구항 45, 46 또는 47 중에서 어느 한 항에 있어서, 비대칭 상호작용 쌍의 구성원은 서열 번호: 39-46 중에서 한 가지와 최소한 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 융합 폴리펩티드.
  53. 청구항 1에 있어서,
    a. 첫 번째 폴리펩티드는 서열 번호: 57의 아미노산 서열에 최소한 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100%인 아미노산 서열을 포함하고; 그리고
    b. 두 번째 폴리펩티드는 서열 번호: 58의 아미노산 서열에 최소한 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100%인 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 복합체.
  54. 청구항 1에 있어서,
    a. 첫 번째 폴리펩티드는 서열 번호: 71의 아미노산 서열에 최소한 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100%인 아미노산 서열을 포함하고; 그리고
    b. 두 번째 폴리펩티드는 서열 번호: 72의 아미노산 서열에 최소한 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100%인 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 복합체.
  55. 청구항 45 내지 52 중에서 어느 한 항의 융합 단백질에 대한 코딩 서열을 포함하는 핵산.
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