CN110678195A - ALK4:ActRIIB异多聚体及其用途 - Google Patents
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Abstract
在某些方面，本公开文本提供了可溶性异聚多肽复合物，其包含ALK4受体的细胞外结构域和ActRIIB的细胞外结构域。在某些方面，此类可溶性ALK4:ActRIIB复合物可以用于调节(促进或抑制)组织或细胞的生长，所述组织或细胞包括例如肌肉、骨、软骨、脂肪、神经组织、肿瘤和/或癌细胞。在某些方面，此类ALK4:ActRIIB复合物可以用于改善肌肉形成、骨形成、代谢参数和与这些组织、细胞网络、肾和内分泌系统相关的障碍。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年10月5日提交的美国临时申请号62/404,727和2017年5月24日提交的美国临时申请号62/510,417的优先权权益。将前述申请的说明书通过引用以其整体并入本文。
背景技术
转化生长因子-β(TGF-β)超家族含有多种生长因子，所述生长因子具有共同的序列元件和结构基序。已知这些蛋白质对脊椎动物和无脊椎动物中的各种各样的细胞类型发挥生物学作用。该超家族的成员在模式形成和组织特化中在胚胎发育过程中执行重要功能，并且可以影响多种分化过程，包括脂肪生成、肌生成、软骨形成、心脏发生、造血作用、神经发生和上皮细胞分化。该家族分为两个一般的系统发生进化枝：该超家族的最近进化的成员，其包括TGF-β、激活素和nodal；以及该超家族的更远相关蛋白质的进化枝，其包括许多BMP和GDF[Hinck(2012)FEBS Letters 586:1860-1870]。TGF-β家族成员具有多种(通常是互补的)生物学作用。通过操纵TGF-β家族成员的活性，通常可以在生物中引起显著的生理变化。例如，皮埃蒙特牛和比利时蓝牛品种在GDF8(也称为肌生成抑制蛋白)基因中携带功能丧失突变，其导致肌肉量显著增加[Grobet等人(1997)Nat Genet 17(1):71-4]。此外，在人类中，GDF8的无活性等位基因与增加的肌肉量相关，并且据报道与异常强度相关[Schuelke等人(2004)N Engl J Med 350:2682-8]。
纤维化、肌肉、骨、脂肪和其他组织的变化可以通过增强或抑制由TGF-β家族的配体介导的细胞内信号传导(例如，SMAD 1、2、3、5和/或8)来实现。因此，需要调节TGF-β超家族的多种配体的活性的药剂。
发明内容
如本文所述，已发现ALK4:ActRIIB异二聚体蛋白质是TGF-β超家族的配体的独特拮抗剂，其与相应的ActRIIB和ALK4同二聚体相比显示出不同的配体结合概况/选择性。具体地，示例性ALK4:ActRIIB异二聚体展示出与任一种同二聚体相比增强的与激活素B的结合，保留如对于ActRIIB同二聚体所观察到的与激活素A、GDF8和GDF11的强结合，并且显示出与BMP9、BMP10和GDF3的明显降低的结合。事实上，ALK4:ActRIIB异二聚体对BMP9展示出很低至观察不到的亲和力，而该配体与ActRIIB同二聚体强烈结合。参见图4。因此，这些结果证明与ActRIIB同二聚体相比，ALK4:ActRIIB异二聚体是TGF-β超家族的某些配体的更具选择性的拮抗剂(抑制剂)。因此，ALK4:ActRIIB异二聚体在这种选择性拮抗作用是有利的某些应用中比ActRIIB同二聚体更有用。例子包括治疗性应用，其中需要拮抗激活素(例如，激活素A、激活素B、激活素AB、激活素AC)、GDF8和GDF11中的一种或多种，同时降低BMP9、BMP10和GDF3中的一种或多种的拮抗作用。
此外，ALK4:ActRIIB异二聚体产生了与ActRIIB同二聚体的生物学作用惊人地相似的某些生物学作用，尽管这两种复合物具有差异的配体选择性。例如，ALK4:ActRIIB异二聚体对骨骼肌和骨发挥有益的合成代谢作用并且对脂肪组织发挥分解代谢作用，这非常类似于ActRIIB-Fc同二聚体的作用。然而，与ActRIIB同二聚体不同，ActRIIB:ALK4异二聚体仅显示出与BMP9和BMP10的低亲和力或短暂结合，因此应该对由这些配体介导的过程(如血管生成)几乎没有并发抑制。这种新颖的选择性可用于例如治疗需要对肌肉和骨的刺激作用和/或对脂肪的抑制作用但不需要改变血管生成的患者。另外，ALK4:ActRIIB异二聚体在小鼠肾病模型中具有多种有益作用，特别是对治疗或预防肾损害、炎症和纤维化具有有益作用。因此，尽管不希望受特定作用机制的束缚，但是预期结合/抑制激活素(例如，激活素A、激活素B、激活素AB和激活素AC)、GDF8和/或GDF11中的至少一种或多种的ALK4:ActRIIB异多聚体及其变体将是用于促进对骨骼肌和骨的有益合成代谢作用、对脂肪组织的分解代谢作用和对肾病的有益作用的有用的药剂。
因此，本公开文本部分地涉及包含至少一种ALK4多肽和至少一种ActRIIB多肽的异多聚体复合物(异多聚体)(ALK4:ActRIIB异多聚体)。优选地，ALK4多肽包含ALK4受体的配体结合结构域，例如ALK4细胞外结构域的一部分。类似地，ActRIIB多肽通常包含ActRIIB受体的配体结合结构域，例如ActRIIB细胞外结构域的一部分。优选地，此类ALK4和ActRIIB多肽以及其所得的异多聚体是可溶的。优选地，此类ALK4和ActRIIB多肽以及其所得的异多聚体是重组蛋白。优选地，此类ALK4和ActRIIB多肽以及其所得的异多聚体是分离的蛋白质。
在某些方面，ALK4:ActRIIB异多聚体包含含有与如下多肽至少70％相同的氨基酸序列的ALK4结构域，所述多肽以SEQ ID NO:9的氨基酸24-34(例如，氨基酸24、25、26、27、28、29、30、31、32、33和34)中的任何一个开始，并以SEQ ID NO:9的氨基酸101-126(例如，氨基酸101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125和126)中的任何一个结束。例如，ALK4:ActRIIB异多聚体可以包含与SEQ ID NO:9的氨基酸34-101至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体可以包含与SEQ ID NO:9的氨基酸24-126至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体可以包含与SEQ ID NO:10至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的ALK4氨基酸序列。
在其他方面，ALK4:ActRIIB异多聚体包含含有与如下多肽至少70％相同的氨基酸序列的ALK4结构域，所述多肽以SEQ ID NO:19的氨基酸24-34(例如，氨基酸24、25、26、27、28、29、30、31、32、33和34)中的任何一个开始，并以SEQ ID NO:19的氨基酸101-126(例如，氨基酸101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125和126)中的任何一个结束。例如，ALK4:ActRIIB异多聚体可以包含与SEQ ID NO:19的氨基酸34-101至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体可以包含与SEQ ID NO:19的氨基酸24-126至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体可以包含与SEQ ID NO:20至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的ALK4氨基酸序列。
在某些方面，ALK4:ActRIIB异多聚体包含含有与如下多肽至少70％相同的氨基酸序列的ActRIIB结构域，所述多肽以SEQ ID NO:1的氨基酸20-29(例如，氨基酸20、21、22、23、24、25、26、27、28和29)中的任何一个开始，并以SEQ ID NO:1的氨基酸109-134(109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133和134)中的任何一个结束。例如，ALK4:ActRIIB异多聚体可以包含与SEQ ID NO:1的氨基酸29-109至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体可以包含与SEQ ID NO:1的氨基酸25-131至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体可以包含与SEQ ID NO:2至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的ActRIIB氨基酸序列。在一些实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体可以包含与SEQ ID NO:3至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的ActRIIB氨基酸序列。在一些实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体不包含含有在对应于SEQID NO:1的L79的位置处的酸性氨基酸(例如，天然存在的氨基酸E或D或人工酸性氨基酸)的ActRIIB多肽。
在其他方面，ALK4:ActRIIB异多聚体包含含有与如下多肽至少70％相同的氨基酸序列的ActRIIB结构域，所述多肽以SEQ ID NO:4的氨基酸20-29(例如，氨基酸20、21、22、23、24、25、26、27、28和29)中的任何一个开始，并以SEQ ID NO:4的氨基酸109-134(109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133和134)中的任何一个结束。例如，ALK4:ActRIIB异多聚体可以包含与SEQ ID NO:4的氨基酸29-109至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体可以包含与SEQ ID NO:4的氨基酸25-131至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体可以包含与SEQ ID NO:5至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的ActRIIB氨基酸序列。在一些实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体可以包含与SEQ ID NO:6至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的ActRIIB氨基酸序列。在一些实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体不包含含有在对应于SEQID NO:1的L79的位置处的酸性氨基酸(例如，天然存在的氨基酸E或D或人工酸性氨基酸)的ActRIIB多肽。
如本文所述，ALK4:ActRIIB异多聚体结构包括例如异二聚体、异三聚体、异四聚体、异五聚体和更高阶异多聚体复合物。参见例如图6。在某些优选的实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体是异二聚体。
在某些方面，ALK4和/或ActRIIB多肽可以是融合蛋白。例如，在一些实施方案中，ALK4多肽可以是包含ALK4多肽结构域和一个或多个异源(非ALK4)多肽结构域的融合蛋白(例如，ALK4-Fc融合蛋白)。类似地，在一些实施方案中，ActRIIB多肽可以是包含ActRIIB多肽结构域和一个或多个异源(非ActRIIB)多肽结构域的融合蛋白(ActRIIB-Fc融合蛋白)。
在一些实施方案中，ALK4多肽是包含免疫球蛋白的Fc结构域的融合蛋白。类似地，在一些实施方案中，ActRIIB多肽是包含免疫球蛋白的Fc结构域的融合蛋白。传统的Fc融合蛋白和抗体是非引导相互作用对的例子，而多种工程化Fc结构域已被设计为不对称的相互作用对[Spiess等人(2015)Molecular Immunology 67(2A):95-106]。因此，本文所述的相互作用对的第一成员和/或第二成员可以包含免疫球蛋白的恒定结构域，包括例如免疫球蛋白的Fc部分。例如，相互作用对的第一成员可以包含来源于IgG(IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)、IgA(IgA1或IgA2)、IgE或IgM免疫球蛋白的Fc结构域的氨基酸序列。此类免疫球蛋白结构域可以包含促进ALK4:ActRIIB异多聚体形成的一个或多个氨基酸修饰(例如，缺失、添加和/或取代)。类似地，相互作用对的第二成员可以包含来源于IgG(IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)、IgA(IgA1或IgA2)、IgE或IgM的Fc结构域的氨基酸序列。此类免疫球蛋白结构域可以包含促进ALK4:ActRIIB异多聚体形成的一个或多个氨基酸修饰(例如，缺失、添加和/或取代)。例如，相互作用对的该第二成员可以包含与SEQ ID NO:23-37中的任何一个70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，基本上由所述氨基酸序列组成，或由所述氨基酸序列组成。在一些实施方案中，相互作用对的第一成员和第二成员包含来源于相同免疫球蛋白类别和亚型的Fc结构域。在其他实施方案中，相互作用对的第一成员和第二成员包含来源于不同免疫球蛋白类别或亚型的Fc结构域。
在某些方面，本公开文本涉及包含至少一种ALK4-Fc融合蛋白和至少一种ActRIIB-Fc融合蛋白的ALK4:ActRIIB异多聚体，其中该ALK4-Fc融合蛋白包含改变该ALK4-Fc融合蛋白的等电点(pI)的一个或多个氨基酸修饰(例如，氨基酸取代、阳离子化、脱氨基化、羧基末端氨基酸异质性、磷酸化和糖基化)和/或该ActRIIB-Fc融合蛋白包含改变该ActRIIB-Fc融合蛋白的pI的一个或多个氨基酸修饰。在一些实施方案中，该ALK4-Fc融合蛋白中的该一个或多个氨基酸修饰赋予该ALK4-Fc融合蛋白与该ActRIIB-Fc融合蛋白之间pI的增加的差异。在其他实施方案中，该ActRIIB-Fc融合蛋白中的该一个或多个氨基酸修饰赋予该ActRIIB-Fc融合蛋白与该ALK4-Fc融合蛋白之间pI的增加的差异。在仍其他实施方案中，该ALK4-Fc融合蛋白中的该一个或多个氨基酸修饰赋予该ALK4-Fc融合蛋白与该ActRIIB-Fc融合蛋白之间pI的增加的差异，并且该ActRIIB-Fc融合蛋白中的该一个或多个氨基酸修饰赋予该ActRIIB-Fc融合蛋白与该ALK4-Fc融合蛋白之间pI的增加的差异。在一些实施方案中，该ALK4-Fc融合蛋白包含一个或多个氨基酸修饰，所述一个或多个氨基酸修饰将pI改变至少0.1(例如，改变至少0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.7、0.8、0.9、1.0、1.3、1.5、1.7、2.0、2.3、2.5、2.7、3.0、3.3、3.5、3.7或改变至少4.0)。在一些实施方案中，该ActRIIB-Fc融合蛋白包含一个或多个氨基酸修饰，所述一个或多个氨基酸修饰将pI改变至少0.1(例如，改变至少0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.7、0.8、0.9、1.0、1.3、1.5、1.7、2.0、2.3、2.5、2.7、3.0、3.3、3.5、3.7或改变至少4.0)。在一些实施方案中，该ALK4-Fc融合蛋白包含一个或多个氨基酸修饰，所述一个或多个氨基酸修饰将pI改变至少0.1(例如，改变至少0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.7、0.8、0.9、1.0、1.3、1.5、1.7、2.0、2.3、2.5、2.7、3.0、3.3、3.5、3.7或改变至少4.0)，并且该ActRIIB-Fc融合蛋白包含一个或多个氨基酸修饰，所述一个或多个氨基酸修饰将pI改变至少0.1(例如，改变至少0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.7、0.8、0.9、1.0、1.3、1.5、1.7、2.0、2.3、2.5、2.7、3.0、3.3、3.5、3.7或改变至少4.0)。在一些实施方案中，该ALK4-Fc融合蛋白和该ActRIIB-Fc融合蛋白具有至少0.7的pI差异(例如，至少0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2.、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9或至少4.0或更大的pI差异)。
在某些方面，本公开文本的ALK4:ActRIIB异多聚体包含含有一个或多个氨基酸修饰的ALK4-Fc融合蛋白，所述一个或多个氨基酸修饰提高该ALK4-Fc融合蛋白的pI；以及含有一个或多个氨基酸修饰的ActRIIB-Fc融合蛋白，所述一个或多个氨基酸修饰降低该ActRIIB-Fc融合蛋白的pI。例如，可以通过用一个或多个带正电的氨基酸[例如，精氨酸(R)、赖氨酸(K)或组氨酸(H)]取代一个或多个中性或带负电的氨基酸来修饰ALK4-Fc融合蛋白。类似地，可以通过用一个或多个带负电的氨基酸[例如，天冬氨酸(E)或谷氨酸(D)]取代一个或多个中性或带正电的氨基酸来修饰ActRIIB-Fc融合蛋白。在一些实施方案中，该ALK4-Fc融合蛋白Fc结构域是IgG1 Fc结构域，所述IgG1 Fc结构域包含改变该ALK4-Fc融合蛋白的pI的一个或多个氨基酸修饰。在一些实施方案中，该ALK4-Fc融合蛋白IgG1 Fc结构域包含与SEQ ID NO:31的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，该ALK4-Fc融合蛋白IgG1 Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代选自：a)在对应于SEQ ID NO:31的N162的位置处的氨基酸取代；b)在对应于SEQ ID NO:31的D179的位置处的氨基酸取代；以及c)在对应于SEQ ID NO:31的N162的位置处的氨基酸取代和在对应于SEQ ID NO:31的D179的位置处的氨基酸取代。在一些实施方案中，该ALK4-Fc融合蛋白IgG1Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代选自：a)在对应于SEQID NO:31的N162的位置处的精氨酸、赖氨酸或组氨酸取代(N162R、N162K或N162H)；b)在对应于SEQ ID NO:31的D179的位置处的精氨酸、赖氨酸或组氨酸取代(D179R、D179K或D179H)；以及c)在对应于SEQ ID NO:31的N162的位置处的精氨酸、赖氨酸或组氨酸取代(N162R、N162K或N162H)和在对应于SEQ ID NO:31的D179的位置处的精氨酸、赖氨酸或组氨酸取代(D179R、D179K或D179H)。在一些实施方案中，该ALK4-Fc融合蛋白IgG1 Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代选自：a)在对应于SEQ ID NO:31的N162的位置处的精氨酸取代(N162R)；b)在对应于SEQ ID NO:31的D179的位置处的精氨酸取代(D179R)；以及c)在对应于SEQ ID NO:31的N162的位置处的精氨酸取代(N162R)和在对应于SEQ ID NO:31的D179的位置处的精氨酸取代(D179R)。在一些实施方案中，该ALK4-Fc融合蛋白Fc结构域是IgG2 Fc结构域，所述IgG2 Fc结构域包含改变该ALK4-Fc融合蛋白的pI的一个或多个氨基酸修饰。在一些实施方案中，该ALK4-Fc融合蛋白IgG2 Fc结构域包含与SEQ ID NO:32的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，该ALK4-Fc融合蛋白IgG2 Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代选自：a)在对应于SEQ ID NO:32的N160的位置处的氨基酸取代；b)在对应于SEQ ID NO:32的D177的位置处的氨基酸取代；以及c)在对应于SEQ ID NO:32的N160的位置处的氨基酸取代和在对应于SEQID NO:32的D177的位置处的氨基酸取代。在一些实施方案中，该ALK4-Fc融合蛋白IgG2 Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代选自：a)在对应于SEQ IDNO:32的N160的位置处的精氨酸、赖氨酸或组氨酸取代(N160R、N160K或N160H)；b)在对应于SEQ ID NO:32的D177的位置处的精氨酸、赖氨酸或组氨酸取代(D177R、D177K或D177H)；以及c)在对应于SEQ ID NO:32的N160的位置处的精氨酸、赖氨酸或组氨酸取代(N160R、N160K或N160H)和在对应于SEQ ID NO:32的D177的位置处的精氨酸、赖氨酸或组氨酸取代(D177R、D177K或D177H)。在一些实施方案中，该ALK4-Fc融合蛋白Fc结构域是IgG3 Fc结构域，所述IgG3 Fc结构域包含改变该ALK4-Fc融合蛋白的pI的一个或多个氨基酸修饰。在一些实施方案中，该ALK4-Fc融合蛋白IgG3 Fc结构域包含与SEQ ID NO:33的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，该ALK4-Fc融合蛋白IgG3 Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代选自：a)在对应于SEQ ID NO:33的S169的位置处的氨基酸取代；b)在对应于SEQ ID NO:33的D186的位置处的氨基酸取代；以及c)在对应于SEQ IDNO:33的S169的位置处的氨基酸取代和在对应于SEQ ID NO:33的D186的位置处的氨基酸取代。在一些实施方案中，该ALK4-Fc融合蛋白IgG3Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代选自：a)在对应于SEQ ID NO:33的S169的位置处的精氨酸、赖氨酸或组氨酸取代(S169R、S169K或S169H)；b)在对应于SEQ ID NO:33的D186的位置处的精氨酸、赖氨酸或组氨酸取代(D186R、D186K或D186H)；以及c)在对应于SEQ ID NO:33的S169的位置处的精氨酸、赖氨酸或组氨酸取代(S169R、S169K或S169H)和在对应于SEQ ID NO:33的D186的位置处的精氨酸、赖氨酸或组氨酸取代(D186R、D186K或D186H)。在一些实施方案中，该ALK4-Fc融合蛋白Fc结构域是IgG4 Fc结构域，所述IgG4 Fc结构域包含改变该ALK4-Fc融合蛋白的pI的一个或多个氨基酸修饰。在一些实施方案中，该ALK4-Fc融合蛋白IgG4 Fc结构域包含与SEQ ID NO:35的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，该ALK4-Fc融合蛋白IgG4Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代选自：a)在对应于SEQ ID NO:35的N166的位置处的氨基酸取代；b)在对应于SEQ ID NO:35的D183的位置处的氨基酸取代；以及c)在对应于SEQ ID NO:35的N166的位置处的氨基酸取代和在对应于SEQ ID NO:35的D183的位置处的氨基酸取代。在一些实施方案中，该ALK4-Fc融合蛋白IgG4 Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代选自：a)在对应于SEQ ID NO:35的N166的位置处的精氨酸、赖氨酸或组氨酸取代(N166R、N166K或N166H)；b)在对应于SEQ ID NO:35的D183的位置处的精氨酸、赖氨酸或组氨酸取代(D183R、D183K或D183H)；以及c)在对应于SEQ ID NO:35的N166的位置处的精氨酸、赖氨酸或组氨酸取代(N166R、N166K或N166H)和在对应于SEQ ID NO:32的D183的位置处的精氨酸、赖氨酸或组氨酸取代(D183R、D183K或D183H)。在一些实施方案中，该ActRIIB-Fc融合蛋白Fc结构域是IgG1 Fc结构域，所述IgG1 Fc结构域包含改变该ActRIIB-Fc融合蛋白的pI的一个或多个氨基酸修饰。在一些实施方案中，该ActRIIB-Fc融合蛋白IgG1 Fc结构域包含与SEQ ID NO:31的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，该ActRIIB-Fc融合蛋白IgG1 Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代选自：a)在对应于SEQ ID NO:31的K138的位置处的氨基酸取代；b)在对应于SEQ ID NO:31的K217的位置处的氨基酸取代；以及c)在对应于SEQ ID NO:31的K138的位置处的氨基酸取代和在对应于SEQ ID NO:31的K217的位置处的氨基酸取代。在一些实施方案中，该ActRIIB-Fc融合蛋白IgG1 Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代选自：a)在对应于SEQ ID NO:31的K138的位置处的天冬氨酸或谷氨酸取代(K138E或K138D)；b)在对应于SEQ ID NO:31的K217的位置处的天冬氨酸或谷氨酸取代(K217E或K217D)；以及c)在对应于SEQ ID NO:31的K138的位置处的天冬氨酸或谷氨酸取代(K138E或K138D)和在对应于SEQ ID NO:31的K217的位置处的天冬氨酸或谷氨酸取代(K217E或K217D)。在一些实施方案中，该ALK4-Fc融合蛋白IgG1 Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代选自：a)在对应于SEQ ID NO:31的K138的位置处的谷氨酸取代(K138E)；b)在对应于SEQ ID NO:31的K217的位置处的天冬氨酸取代(K217D)；以及c)在对应于SEQ ID NO:31的K138的位置处的谷氨酸取代(K138E)和在对应于SEQ ID NO:31的K217的位置处的天冬氨酸取代(K217D)。在一些实施方案中，该ActRIIB-Fc融合蛋白Fc结构域是IgG2 Fc结构域，所述IgG2 Fc结构域包含改变该ActRIIB-Fc融合蛋白的pI的一个或多个氨基酸修饰。在一些实施方案中，该ActRIIB-Fc融合蛋白IgG2 Fc结构域包含与SEQ ID NO:32的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，该ActRIIB-Fc融合蛋白IgG2融合Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代选自：a)在对应于SEQ ID NO:32的K136的位置处的氨基酸取代；b)在对应于SEQ ID NO:32的K215的位置处的氨基酸取代；以及c)在对应于SEQ ID NO:32的K136的位置处的氨基酸取代和在对应于SEQ ID NO:32的K215的位置处的氨基酸取代。在一些实施方案中，该ActRIIB-Fc融合蛋白IgG2 Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代选自：a)在对应于SEQ ID NO:32的K136的位置处的天冬氨酸或谷氨酸取代(K136E或K136D)；b)在对应于SEQ ID NO:32的K215的位置处的天冬氨酸或谷氨酸取代(K215E或K215D)；以及c)在对应于SEQ ID NO:32的K136的位置处的天冬氨酸或谷氨酸取代(K136E或K136D)和在对应于SEQ ID NO:32的K215的位置处的天冬氨酸或谷氨酸取代(K215E或K215D)。在一些实施方案中，该ActRIIB-Fc融合蛋白Fc结构域是IgG3 Fc结构域，所述IgG3 Fc结构域包含改变该ActRIIB-Fc融合蛋白的pI的一个或多个氨基酸修饰。在一些实施方案中，该ActRIIB-Fc融合蛋白IgG3 Fc结构域包含与SEQ ID NO:33的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，该ActRIIB-Fc融合蛋白IgG3融合Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代选自：a)在对应于SEQ ID NO:33的K145的位置处的氨基酸取代；b)在对应于SEQ ID NO:33的K224的位置处的氨基酸取代；以及c)在对应于SEQ ID NO:33的K145的位置处的氨基酸取代和在对应于SEQ ID NO:33的K224的位置处的氨基酸取代。在一些实施方案中，该修饰的ActRIIB-Fc融合蛋白IgG3 Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代选自：a)在对应于SEQ ID NO:33的K145的位置处的天冬氨酸或谷氨酸取代(K145E或K145D)；b)在对应于SEQ ID NO:33的K224的位置处的天冬氨酸或谷氨酸取代(K224E或K224D)；以及c)在对应于SEQ ID NO:33的K145的位置处的天冬氨酸或谷氨酸取代(K145E或K145D)和在对应于SEQ ID NO:33的K224的位置处的天冬氨酸或谷氨酸取代(K224E或K224D)。在一些实施方案中，该ActRIIB-Fc融合蛋白Fc结构域是IgG4 Fc结构域，所述IgG4 Fc结构域包含改变该ActRIIB-Fc融合蛋白的pI的一个或多个氨基酸修饰。在一些实施方案中，该ActRIIB-Fc融合蛋白IgG4 Fc结构域包含与SEQID NO:35的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，该ActRIIB-Fc融合蛋白IgG4融合Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代选自：a)在对应于SEQ ID NO:35的K142的位置处的氨基酸取代；b)在对应于SEQ ID NO:35的K221的位置处的氨基酸取代；以及c)在对应于SEQ ID NO:35的K142的位置处的氨基酸取代和在对应于SEQID NO:35的K221的位置处的氨基酸取代。在一些实施方案中，该ActRIIB-Fc融合蛋白IgG4Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代选自：a)在对应于SEQID NO:35的K142的位置处的天冬氨酸或谷氨酸取代(K142E或K142D)；b)在对应于SEQ IDNO:35的K221的位置处的天冬氨酸或谷氨酸取代(K221E或K221D)；以及c)在对应于SEQ IDNO:35的K142的位置处的天冬氨酸或谷氨酸取代(K142E或K142D)和在对应于SEQ ID NO:35的K221的位置处的天冬氨酸或谷氨酸取代(K221E或K221D)。
在某些方面，本公开文本的ALK4:ActRIIB异多聚体包含含有一个或多个氨基酸修饰的ActRIIB-Fc融合蛋白，所述一个或多个氨基酸修饰提高该ActRIIB-Fc融合蛋白的pI；以及含有一个或多个氨基酸修饰的ALK4-Fc融合蛋白，所述一个或多个氨基酸修饰降低该ALK-Fc融合蛋白的pI。例如，可以通过用一个或多个带正电的氨基酸[例如，精氨酸(R)、赖氨酸(K)或组氨酸(H)]取代一个或多个中性或带负电的氨基酸来修饰ActRIIB-Fc融合蛋白。类似地，可以通过用一个或多个带负电的氨基酸[例如，天冬氨酸(E)或谷氨酸(D)]取代一个或多个中性或带正电的氨基酸来修饰ALK4-Fc融合蛋白。在一些实施方案中，该ActRIIB-Fc融合蛋白Fc结构域是IgG1 Fc结构域，所述IgG1 Fc结构域包含改变该ALK4-Fc融合蛋白的pI的一个或多个氨基酸修饰。在一些实施方案中，该ActRIIB-Fc融合蛋白IgG1Fc结构域包含与SEQ ID NO:31的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，该ActRIIB-Fc融合蛋白IgG1 Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代选自：a)在对应于SEQ ID NO:31的N162的位置处的氨基酸取代；b)在对应于SEQ ID NO:31的D179的位置处的氨基酸取代；以及c)在对应于SEQ ID NO:31的N162的位置处的氨基酸取代和在对应于SEQ ID NO:31的D179的位置处的氨基酸取代。在一些实施方案中，该ActRIIB-Fc融合蛋白IgG1 Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代选自：a)在对应于SEQ ID NO:31的N162的位置处的精氨酸、赖氨酸或组氨酸取代(N162R、N162K或N162H)；b)在对应于SEQ ID NO:31的D179的位置处的精氨酸、赖氨酸或组氨酸取代(D179R、D179K或D179H)；以及c)在对应于SEQ ID NO:31的N162的位置处的精氨酸、赖氨酸或组氨酸取代(N162R、N162K或N162H)和在对应于SEQ ID NO:31的D179的位置处的精氨酸、赖氨酸或组氨酸取代(D179R、D179K或D179H)。在一些实施方案中，该ActRIIB-Fc融合蛋白IgG1 Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代选自：a)在对应于SEQ IDNO:31的N162的位置处的精氨酸取代(N162R)；b)在对应于SEQ ID NO:31的D179的位置处的精氨酸取代(D179R)；以及c)在对应于SEQ ID NO:31的N162的位置处的精氨酸取代(N162R)和在对应于SEQ ID NO:31的D179的位置处的精氨酸取代(D179R)。在一些实施方案中，该ActRIIB-Fc融合蛋白Fc结构域是IgG2 Fc结构域，所述IgG2 Fc结构域包含改变该ActRIIB-Fc融合蛋白的pI的一个或多个氨基酸修饰。在一些实施方案中，该ActRIIB-Fc融合蛋白IgG2 Fc结构域包含与SEQ ID NO:32的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，该ActRIIB-Fc融合蛋白IgG2 Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代选自：a)在对应于SEQ ID NO:32的N160的位置处的氨基酸取代；b)在对应于SEQ IDNO:32的D177的位置处的氨基酸取代；以及c)在对应于SEQ ID NO:32的N160的位置处的氨基酸取代和在对应于SEQ ID NO:32的D177的位置处的氨基酸取代。在一些实施方案中，该ActRIIB-Fc融合蛋白IgG2 Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代选自：a)在对应于SEQ ID NO:32的N160的位置处的精氨酸、赖氨酸或组氨酸取代(N160R、N160K或N160H)；b)在对应于SEQ ID NO:32的D177的位置处的精氨酸、赖氨酸或组氨酸取代(D177R、D177K或D177H)；以及c)在对应于SEQ ID NO:32的N160的位置处的精氨酸、赖氨酸或组氨酸取代(N160R、N160K或N160H)和在对应于SEQ ID NO:32的D177的位置处的精氨酸、赖氨酸或组氨酸取代(D177R、D177K或D177H)。在一些实施方案中，该ActRIIB-Fc融合蛋白Fc结构域是IgG3 Fc结构域，所述IgG3 Fc结构域包含改变该ActRIIB-Fc融合蛋白的pI的一个或多个氨基酸修饰。在一些实施方案中，该ActRIIB-Fc融合蛋白IgG3 Fc结构域包含与SEQ ID NO:33的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，该ActRIIB-Fc融合蛋白IgG3 Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代选自：a)在对应于SEQ ID NO:33的S169的位置处的氨基酸取代；b)在对应于SEQ ID NO:33的D186的位置处的氨基酸取代；以及c)在对应于SEQ ID NO:33的S169的位置处的氨基酸取代和在对应于SEQ ID NO:33的D186的位置处的氨基酸取代。在一些实施方案中，该修饰的ActRIIB-Fc融合蛋白IgG3 Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代选自：a)在对应于SEQ ID NO:33的S169的位置处的精氨酸、赖氨酸或组氨酸取代(S169R、S169K或S169H)；b)在对应于SEQ ID NO:33的D186的位置处的精氨酸、赖氨酸或组氨酸取代(D186R、D186K或D186H)；以及c)在对应于SEQ ID NO:33的S169的位置处的精氨酸、赖氨酸或组氨酸取代(S169R、S169K或S169H)和在对应于SEQ ID NO:33的D186的位置处的精氨酸、赖氨酸或组氨酸取代(D186R、D186K或D186H)。在一些实施方案中，该ActRIIB-Fc融合蛋白Fc结构域是IgG4 Fc结构域，所述IgG4 Fc结构域包含改变该ActRIIB-Fc融合蛋白的pI的一个或多个氨基酸修饰。在一些实施方案中，该ActRIIB-Fc融合蛋白IgG4 Fc结构域包含与SEQ ID NO:35的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，该ActRIIB-Fc融合蛋白IgG4 Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代选自：a)在对应于SEQ IDNO:35的N166的位置处的氨基酸取代；b)在对应于SEQ ID NO:35的D183的位置处的氨基酸取代；以及c)在对应于SEQ ID NO:35的N166的位置处的氨基酸取代和在SEQ ID NO:35的D183的位置处的氨基酸取代。在一些实施方案中，该ActRIIB-Fc融合蛋白IgG4 Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代选自：a)在对应于SEQ ID NO:35的N166的位置处的精氨酸、赖氨酸或组氨酸取代(N166R、N166K或N166H)；b)在对应于SEQ IDNO:35的D183的位置处的精氨酸、赖氨酸或组氨酸取代(D183R、D183K或D183H)；以及c)在对应于SEQ ID NO:35的N166的位置处的精氨酸、赖氨酸或组氨酸取代(N166R、N166K或N166H)和在对应于SEQ ID NO:35的D183的位置处的精氨酸、赖氨酸或组氨酸取代(D183R、D183K或D183H)。在一些实施方案中，该ALK4-Fc融合蛋白Fc结构域是IgG1 Fc结构域，所述IgG1 Fc结构域包含改变该ALK4-Fc融合蛋白的pI的一个或多个氨基酸修饰。在一些实施方案中，该ALK4-Fc融合蛋白IgG1 Fc结构域包含与SEQ ID NO:31的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，该ALK4-Fc融合蛋白IgG1融合Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代选自：a)在对应于SEQ ID NO:31的K138的位置处的氨基酸取代；b)在对应于SEQ ID NO:31的K217的位置处的氨基酸取代；以及c)在对应于SEQ ID NO:31的K138的位置处的氨基酸取代和在对应于SEQ ID NO:31的K217的位置处的氨基酸取代。在一些实施方案中，该ALK4-Fc融合蛋白IgG1 Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代选自：a)在对应于SEQ ID NO:31的K138的位置处的天冬氨酸或谷氨酸取代(K138E或K138D)；b)在对应于SEQ ID NO:31的K217的位置处的天冬氨酸或谷氨酸取代(K217E或K217D)；以及c)在对应于SEQ ID NO:31的K138的位置处的天冬氨酸或谷氨酸取代(K138E或K138D)和在对应于SEQ ID NO:31的K217的位置处的天冬氨酸或谷氨酸取代(K217E或K217D)。在一些实施方案中，该ALK4-Fc融合蛋白IgG1 Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代选自：a)在对应于SEQ ID NO:31的K138的位置处的谷氨酸取代(K138E)；b)在对应于SEQ ID NO:31的K217的位置处的天冬氨酸取代(K217D)；以及c)在对应于SEQ ID NO:31的K138的位置处的谷氨酸取代(K138E)和在对应于SEQ ID NO:31的K217的位置处的天冬氨酸取代(K217D)。在一些实施方案中，该ALK4-Fc融合蛋白Fc结构域是IgG2 Fc结构域，所述IgG2 Fc结构域包含改变该ALK4-Fc融合蛋白的pI的一个或多个氨基酸修饰。在一些实施方案中，该ALK4-Fc融合蛋白IgG2 Fc结构域包含与SEQ ID NO:32的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，该ALK4-Fc融合蛋白IgG2融合Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代选自：a)在对应于SEQ ID NO:32的K136的位置处的氨基酸取代；b)在对应于SEQ ID NO:32的K215的位置处的氨基酸取代；以及c)在对应于SEQ ID NO:32的K136的位置处的氨基酸取代和在对应于SEQ ID NO:32的K215的位置处的氨基酸取代。在一些实施方案中，该ALK4-Fc融合蛋白IgG2Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代选自：a)在对应于SEQID NO:32的K136的位置处的天冬氨酸或谷氨酸取代(K136E或K136D)；b)在对应于SEQ IDNO:32的K215的位置处的天冬氨酸或谷氨酸取代(K215E或K215D)；以及c)在对应于SEQ IDNO:32的K136的位置处的天冬氨酸或谷氨酸取代(K136E或K136D)和在对应于SEQ ID NO:32的K215的位置处的天冬氨酸或谷氨酸取代(K215E或K215D)。在一些实施方案中，该ALK4-Fc融合蛋白Fc结构域是IgG3 Fc结构域，所述IgG3 Fc结构域包含改变该ALK4-Fc融合蛋白的pI的一个或多个氨基酸修饰。在一些实施方案中，该ALK4-Fc融合蛋白IgG31 Fc结构域包含与SEQ ID NO:33的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，该ALK4-Fc融合蛋白IgG3融合Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代选自：a)在对应于SEQ ID NO:33的K145的位置处的氨基酸取代；b)在对应于SEQ ID NO:33的K224的位置处的氨基酸取代；以及c)在对应于SEQ ID NO:33的K145的位置处的氨基酸取代和在对应于SEQ ID NO:33的K224的位置处的氨基酸取代。在一些实施方案中，该ALK4-Fc融合蛋白IgG3Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代选自：a)在对应于SEQID NO:33的K145的位置处的天冬氨酸或谷氨酸取代(K145E或K145D)；b)在对应于SEQ IDNO:33的K224的位置处的天冬氨酸或谷氨酸取代(K224E或K224D)；以及c)在对应于SEQ IDNO:33的K145的位置处的天冬氨酸或谷氨酸取代(K145E或K145D)和在对应于SEQ ID NO:33的K224的位置处的天冬氨酸或谷氨酸取代(K224E或K224D)。在一些实施方案中，该ALK4-Fc融合蛋白Fc结构域是IgG4 Fc结构域，所述IgG4Fc结构域包含改变该ALK4-Fc融合蛋白的pI的一个或多个氨基酸修饰。在一些实施方案中，该ALK4-Fc融合蛋白IgG4 Fc结构域包含与SEQ ID NO:35的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，该ALK4-Fc融合蛋白IgG4融合Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代选自：a)在对应于SEQ ID NO:35的K142的位置处的氨基酸取代；b)在对应于SEQ ID NO:35的K221的位置处的氨基酸取代；以及c)在对应于SEQ ID NO:35的K142的位置处的氨基酸取代和在对应于SEQ ID NO:35的K221的位置处的氨基酸取代。在一些实施方案中，该ALK4-Fc融合蛋白IgG4Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代选自：a)在对应于SEQID NO:35的K142的位置处的天冬氨酸或谷氨酸取代(K142E或K142D)；b)在对应于SEQ IDNO:35的K221的位置处的天冬氨酸或谷氨酸取代(K221E或K221D)；以及c)在对应于SEQ IDNO:35的K142的位置处的天冬氨酸或谷氨酸取代(K142E或K142D)和在对应于SEQ ID NO:35的K221的位置处的天冬氨酸或谷氨酸取代(K221E或K221D)。
如本文所述，ALK4-Fc融合蛋白和/或ActRIIB-Fc融合蛋白可以包含促进异多聚体形成(例如，ALK4-Fc:ActRIIB-Fc异二聚化)的一个或多个修饰。类似地，ALK4-Fc融合蛋白和/或ActRIIB-Fc融合蛋白可以包含抑制同多聚体形成(例如，ALK4-Fc:ActRIIB-Fc同二聚化)的一个或多个修饰。在一些实施方案中，ALK4-Fc融合蛋白和/或ActRIIB-Fc融合蛋白可以包含促进异多聚体形成的一个或多个修饰并且包含抑制同多聚体形成的一个或多个修饰。例如，在一些实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体包含：a)具有IgG1 Fc结构域的ALK4-Fc融合蛋白，所述IgG1 Fc结构域包含SEQ ID NO:31的位置S132处的半胱氨酸取代(S132C)和SEQ ID NO:31的位置T144处的色氨酸取代(T144W)；以及b)具有IgG1 Fc结构域的ActRIIB-Fc融合蛋白，所述IgG1 Fc结构域包含SEQ ID NO:31的位置Y127处的半胱氨酸取代(Y127C)、SEQ ID NO:31的位置T144处的丝氨酸取代(T144S)、SEQ ID NO:31的位置L146处的丙氨酸取代(L146A)和SEQ ID NO:31的位置Y185处的缬氨酸取代(Y185V)。在一些实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体包含：a)具有IgG1 Fc结构域的ActRIIB-Fc融合蛋白，所述IgG1 Fc结构域包含SEQ ID NO:31的位置S132处的半胱氨酸取代(S132C)和SEQ ID NO:31的位置T144处的色氨酸取代(T144W)；以及b)具有IgG1 Fc结构域的ALK4-Fc融合蛋白，所述IgG1 Fc结构域包含SEQ ID NO:31的位置Y127处的半胱氨酸取代(Y127C)、SEQ ID NO:31的位置T144处的丝氨酸取代(T144S)、SEQ ID NO:31的位置L146处的丙氨酸取代(L146A)和SEQ ID NO:31的位置Y185处的缬氨酸取代(Y185V)。在一些实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体包含：a)具有IgG2 Fc结构域的ALK4-Fc融合蛋白，所述IgG2 Fc结构域包含SEQ ID NO:32的位置S130处的半胱氨酸取代(S130C)和SEQ ID NO:32的位置T142处的色氨酸取代(T142W)；以及b)具有IgG2 Fc结构域的ActRIIB-Fc融合蛋白，所述IgG2 Fc结构域包含SEQID NO:32的位置Y125处的半胱氨酸取代(Y125C)、SEQ ID NO:32的位置T142处的丝氨酸取代(T142S)、SEQ ID NO:32的位置L144处的丙氨酸取代(L144A)和SEQ ID NO:32的位置Y183处的缬氨酸取代(Y183V)。在一些实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体包含：a)具有IgG2 Fc结构域的ActRIIB-Fc融合蛋白，所述IgG2 Fc结构域包含SEQ ID NO:32的位置S130处的半胱氨酸取代(S130C)和SEQ ID NO:32的位置T142处的色氨酸取代(T142W)；以及b)具有IgG2Fc结构域的ALK4-Fc融合蛋白，所述IgG2 Fc结构域包含SEQ ID NO:32的位置Y125处的半胱氨酸取代(Y125C)、SEQ ID NO:32的位置T142处的丝氨酸取代(T142S)、SEQ ID NO:32的位置L144处的丙氨酸取代(L144A)和SEQ ID NO:32的位置Y183处的缬氨酸取代(Y183V)。在一些实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体包含：a)具有IgG3 Fc结构域的ALK4-Fc融合蛋白，所述IgG3 Fc结构域包含SEQ ID NO:33的位置S139处的半胱氨酸取代(S139C)和SEQ ID NO:33的位置T151处的色氨酸取代(T151W)；以及b)具有IgG3 Fc结构域的ActRIIB-Fc融合蛋白，所述IgG3 Fc结构域包含SEQ ID NO:33的位置Y134处的半胱氨酸取代(Y134C)、SEQ IDNO:33的位置T151处的丝氨酸取代(T151S)、SEQ ID NO:33的位置L153处的丙氨酸取代(L153A)和SEQ ID NO:33的位置Y192处的缬氨酸取代(Y192V)。在一些实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体包含：a)具有IgG3 Fc结构域的ActRIIB-Fc融合蛋白，所述IgG3 Fc结构域包含SEQ ID NO:33的位置S139处的半胱氨酸取代(S139C)和SEQ ID NO:33的位置T151处的色氨酸取代(T151W)；以及b)具有IgG3 Fc结构域的ALK4-Fc融合蛋白，所述IgG3 Fc结构域包含SEQ ID NO:33的位置Y134处的半胱氨酸取代(Y134C)、SEQ ID NO:33的位置T151处的丝氨酸取代(T151S)、SEQ ID NO:33的位置L153处的丙氨酸取代(L153A)和SEQ ID NO:33的位置Y192处的缬氨酸取代(Y192V)。在一些实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体包含：a)具有IgG4 Fc结构域的ALK4-Fc融合蛋白，所述IgG4 Fc结构域包含SEQ ID NO:35的位置S136处的半胱氨酸取代(S136C)和SEQ ID NO:35的位置T148处的色氨酸取代(T148W)；以及b)具有IgG4 Fc结构域的ActRIIB-Fc融合蛋白，所述IgG4 Fc结构域包含SEQ ID NO:35的位置Y131处的半胱氨酸取代(Y131C)、SEQ ID NO:35的位置T148处的丝氨酸取代(T148S)、SEQID NO:35的位置L150处的丙氨酸取代(L150A)和SEQ ID NO:35的位置Y189处的缬氨酸取代(Y189V)。在一些实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体包含：a)具有IgG4 Fc结构域的ActRIIB-Fc融合蛋白，所述IgG4 Fc结构域包含SEQ ID NO:35的位置S136处的半胱氨酸取代(S136C)和SEQ ID NO:35的位置T148处的色氨酸取代(T148W)；以及b)具有IgG4 Fc结构域的ALK4-Fc融合蛋白，所述IgG4 Fc结构域包含SEQ ID NO:35的位置Y131处的半胱氨酸取代(Y131C)、SEQ ID NO:35的位置T148处的丝氨酸取代(T148S)、SEQ ID NO:35的位置L150处的丙氨酸取代(L150A)和SEQ ID NO:35的位置Y189处的缬氨酸取代(Y189V)。
在某些方面，本公开文本的ALK4:ActRIIB异多聚体包含：a)具有与SEQ ID NO:66的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的Fc结构域的ALK4-Fc融合蛋白；以及b)具有与SEQ ID NO:67的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的Fc结构域的ActRIIB-Fc融合蛋白。在一些实施方案中，该ALK4-Fc融合蛋白Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代选自：a)在对应于SEQ ID NO:66的138的位置处的谷氨酸；b)在对应于SEQ ID NO:66的217的位置处的天冬氨酸；以及c)在对应于SEQ ID NO:66的138的位置处的谷氨酸和在对应于SEQ ID NO:66的217的位置处的天冬氨酸。任选地，该ALK4-Fc融合蛋白Fc结构域进一步包含在对应于SEQ ID NO:66的132的位置处的半胱氨酸和在对应于SEQ ID NO:66的144的位置处的色氨酸。在一些实施方案中，该ActRIIB-Fc融合蛋白Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代选自：a)在对应于SEQ ID NO:67的162的位置处的精氨酸；b)在对应于SEQ ID NO:67的179的位置处的精氨酸；以及c)在对应于SEQ ID NO:67的162的位置处的精氨酸和在对应于SEQ ID NO:67的179的位置处的精氨酸。任选地，该ActRIIB-Fc融合蛋白Fc结构域进一步包含在对应于SEQ ID NO:67的127的位置处的半胱氨酸、在对应于SEQ ID NO:67的144的位置处的丝氨酸、在对应于SEQ ID NO:67的146的位置处的丙氨酸和在对应于SEQ ID NO:67的185的位置处的缬氨酸。
在某些方面，本公开文本的ALK4:ActRIIB异多聚体包含：a)具有与SEQ ID NO:66的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的Fc结构域的ActRIIB-Fc融合蛋白；以及b)具有与SEQ ID NO:67的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的Fc结构域的ALK4-Fc融合蛋白。在一些实施方案中，该ActRIIB-Fc融合蛋白Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代选自：a)在对应于SEQ IDNO:66的138的位置处的谷氨酸；b)在对应于SEQ ID NO:66的217的位置处的天冬氨酸；以及c)在对应于SEQ ID NO:66的138的位置处的谷氨酸和在对应于SEQ ID NO:66的217的位置处的天冬氨酸。任选地，该ActRIIB-Fc融合蛋白Fc结构域进一步包含在对应于SEQ ID NO:66的132的位置处的半胱氨酸和在对应于SEQ ID NO:66的144的位置处的色氨酸。在一些实施方案中，该ALK4-Fc融合蛋白Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代选自：a)在对应于SEQ ID NO:67的162的位置处的精氨酸；b)在对应于SEQ ID NO:67的179的位置处的精氨酸；以及c)在对应于SEQ ID NO:67的162的位置处的精氨酸和在对应于SEQ ID NO:67的179的位置处的精氨酸。任选地，该ALK4-Fc融合蛋白Fc结构域进一步包含在对应于SEQ ID NO:67的127的位置处的半胱氨酸、在对应于SEQ ID NO:67的144的位置处的丝氨酸、在对应于SEQ ID NO:67的146的位置处的丙氨酸和在对应于SEQ ID NO:67的185的位置处的缬氨酸。
在某些方面，本公开文本涉及包含至少一种ALK4-Fc融合蛋白和至少一种ActRIIB-Fc融合蛋白的重组ALK4:ActRIIB异多聚体，其中：a)该ALK4-Fc融合蛋白包含IgG1Fc结构域，所述IgG1 Fc结构域包含在对应于SEQ ID NO:31的S132的位置处的半胱氨酸(S132C)、在对应于SEQ ID NO:31的T144的位置处的色氨酸(T144W)和在对应于SEQ ID NO:31的H213的位置处的酸性氨基酸；并且b)该ActRIIB-Fc融合蛋白包含IgG1 Fc结构域，所述IgG1 Fc结构域包含在对应于SEQ ID NO:31的Y127的位置处的半胱氨酸(Y127C)、在对应于SEQ ID NO:31的T144的位置处的丝氨酸(T144S)、在对应于SEQ ID NO:31的L146的位置处的丙氨酸(L146A)和在对应于SEQ ID NO:31的Y185的位置处的缬氨酸(Y185V)。在一些实施方案中，其中在对应于SEQ ID NO:31的H213的位置处的该酸性氨基酸是天冬氨酸。在一些实施方案中，在对应于SEQ ID NO:31的H213的位置处的该酸性氨基酸是谷氨酸。在一些实施方案中，该ALK4-Fc融合蛋白Fc结构域与SEQ ID NO:31的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更相同。在一些实施方案中，该ActRIIB-Fc融合蛋白Fc结构域与SEQ ID NO:31的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更相同。
在某些方面，本公开文本涉及包含至少一种ALK4-Fc融合蛋白和至少一种ActRIIB-Fc融合蛋白的重组ALK4:ActRIIB异多聚体，其中：a)该ActRIIB-Fc融合蛋白包含IgG1 Fc结构域，所述IgG1 Fc结构域包含在对应于SEQ ID NO:31的S132的位置处的半胱氨酸(S132C)、在对应于SEQ ID NO:31的T144的位置处的色氨酸(T144W)和在对应于SEQ IDNO:31的H213的位置处的酸性氨基酸；并且b)该ALK4-Fc融合蛋白包含IgG1 Fc结构域，所述IgG1 Fc结构域包含在对应于SEQ ID NO:31的Y127的位置处的半胱氨酸(Y127C)、在对应于SEQ ID NO:31的T144的位置处的丝氨酸(T144S)、在对应于SEQ ID NO:31的L146的位置处的丙氨酸(L146A)和在对应于SEQ ID NO:31的Y185的位置处的缬氨酸(Y185V)。在一些实施方案中，其中在对应于SEQ ID NO:31的H213的位置处的该酸性氨基酸是天冬氨酸。在一些实施方案中，在对应于SEQ ID NO:31的H213的位置处的该酸性氨基酸是谷氨酸。在一些实施方案中，该ALK4-Fc融合蛋白Fc结构域与SEQ ID NO:31的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更相同。在一些实施方案中，该ActRIIB-Fc融合蛋白Fc结构域与SEQ ID NO:31的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更相同。在某些方面，本公开文本涉及包含至少一种ALK4-Fc融合蛋白和至少一种ActRIIB-Fc融合蛋白的重组ALK4:ActRIIB异多聚体，其中：a)该ALK4-Fc融合蛋白包含IgG1Fc结构域，所述IgG1 Fc结构域包含在对应于SEQ ID NO:31的S132的位置处的半胱氨酸(S132C)和在对应于SEQ ID NO:31的T144的位置处的色氨酸(T144W)；并且b)该ActRIIB-Fc融合蛋白包含IgG1 Fc结构域，所述IgG1 Fc结构域包含在对应于SEQ ID NO:31的Y127的位置处的半胱氨酸(Y127C)、在对应于SEQ ID NO:31的T144的位置处的丝氨酸(T144S)、在对应于SEQ ID NO:31的L146的位置处的丙氨酸(L146A)、在对应于SEQ ID NO:31的Y185的位置处的缬氨酸(Y185V)和在对应于SEQ ID NO:31的H213的位置处的酸性氨基酸。在一些实施方案中，其中在对应于SEQ IDNO:31的H213的位置处的该酸性氨基酸是天冬氨酸。在一些实施方案中，在对应于SEQ IDNO:31的H213的位置处的该酸性氨基酸是谷氨酸。在一些实施方案中，该ALK4-Fc融合蛋白Fc结构域与SEQ ID NO:31的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更相同。在一些实施方案中，该ActRIIB-Fc融合蛋白Fc结构域与SEQ ID NO:31的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更相同。在某些方面，本公开文本涉及包含至少一种ALK4-Fc融合蛋白和至少一种ActRIIB-Fc融合蛋白的重组ALK4:ActRIIB异多聚体，其中：a)该ActRIIB-Fc融合蛋白包含IgG1 Fc结构域，所述IgG1 Fc结构域包含在对应于SEQ ID NO:31的S132的位置处的半胱氨酸(S132C)和在对应于SEQ ID NO:31的T144的位置处的色氨酸(T144W)；并且b)该ALK4-Fc融合蛋白包含IgG1 Fc结构域，所述IgG1 Fc结构域包含在对应于SEQ ID NO:31的Y127的位置处的半胱氨酸(Y127C)、在对应于SEQ ID NO:31的T144的位置处的丝氨酸(T144S)、在对应于SEQ ID NO:31的L146的位置处的丙氨酸(L146A)和在对应于SEQ ID NO:31的Y185的位置处的缬氨酸(Y185V)以及在对应于SEQ ID NO:31的H213的位置处的酸性氨基酸。在一些实施方案中，其中在对应于SEQ ID NO:31的H213的位置处的该酸性氨基酸是天冬氨酸。在一些实施方案中，在对应于SEQ ID NO:31的H213的位置处的该酸性氨基酸是谷氨酸。在一些实施方案中，该ALK4-Fc融合蛋白Fc结构域与SEQ ID NO:31的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更相同。在一些实施方案中，该ActRIIB-Fc融合蛋白Fc结构域与SEQ ID NO:31的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更相同。
在某些方面，本公开文本涉及包含至少一种ALK4-Fc融合蛋白和至少一种ActRIIB-Fc融合蛋白的重组ALK4:ActRIIB异多聚体，其中：a)该ALK4-Fc融合蛋白包含IgG2Fc结构域，所述IgG2 Fc结构域包含在对应于SEQ ID NO:32的S130的位置处的半胱氨酸(S130C)、在对应于SEQ ID NO:32的T142的位置处的色氨酸(T142W)和在对应于SEQ ID NO:32的H211的位置处的酸性氨基酸；并且b)该ActRIIB-Fc融合蛋白包含IgG2 Fc结构域，所述IgG2 Fc结构域包含在对应于SEQ ID NO:32的Y125的位置处的半胱氨酸(Y125C)、在对应于SEQ ID NO:32的T142的位置处的丝氨酸(T142S)、在对应于SEQ ID NO:32的L144的位置处的丙氨酸(L144A)和在对应于SEQ ID NO:32的Y183的位置处的缬氨酸(Y183V)。在一些实施方案中，其中在对应于SEQ ID NO:32的H211的位置处的该酸性氨基酸是天冬氨酸。在一些实施方案中，在对应于SEQ ID NO:32的H211的位置处的该酸性氨基酸是谷氨酸。在一些实施方案中，该ALK4-Fc融合蛋白Fc结构域与SEQ ID NO:32的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更相同。在一些实施方案中，该ActRIIB-Fc融合蛋白Fc结构域与SEQ ID NO:32的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更相同。
在某些方面，本公开文本涉及包含至少一种ALK4-Fc融合蛋白和至少一种ActRIIB-Fc融合蛋白的重组ALK4:ActRIIB异多聚体，其中：a)该ActRIIB-Fc融合蛋白包含IgG2 Fc结构域，所述IgG2 Fc结构域包含在对应于SEQ ID NO:32的S130的位置处的半胱氨酸(S130C)、在对应于SEQ ID NO:32的T142的位置处的色氨酸(T142W)和在对应于SEQ IDNO:32的H211的位置处的酸性氨基酸；并且b)该ALK4-Fc融合蛋白包含IgG2 Fc结构域，所述IgG2 Fc结构域包含在对应于SEQ ID NO:32的Y125的位置处的半胱氨酸(Y125C)、在对应于SEQ ID NO:32的T142的位置处的丝氨酸(T142S)、在对应于SEQ ID NO:32的L144的位置处的丙氨酸(L144A)和在对应于SEQ ID NO:32的Y183的位置处的缬氨酸(Y183V)。在一些实施方案中，其中在对应于SEQ ID NO:32的H211的位置处的该酸性氨基酸是天冬氨酸。在一些实施方案中，在对应于SEQ ID NO:32的H211的位置处的该酸性氨基酸是谷氨酸。在一些实施方案中，该ALK4-Fc融合蛋白Fc结构域与SEQ ID NO:32的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更相同。在一些实施方案中，该ActRIIB-Fc融合蛋白Fc结构域与SEQ ID NO:32的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更相同。
在某些方面，本公开文本涉及包含至少一种ALK4-Fc融合蛋白和至少一种ActRIIB-Fc融合蛋白的重组ALK4:ActRIIB异多聚体，其中：a)该ALK4-Fc融合蛋白包含IgG2Fc结构域，所述IgG2 Fc结构域包含在对应于SEQ ID NO:32的S130的位置处的半胱氨酸(S130C)和在对应于SEQ ID NO:32的T142的位置处的色氨酸(T142W)；并且b)该ActRIIB-Fc融合蛋白包含IgG2 Fc结构域，所述IgG2 Fc结构域包含在对应于SEQ ID NO:32的Y125的位置处的半胱氨酸(Y125C)、在对应于SEQ ID NO:32的T142的位置处的丝氨酸(T142S)、在对应于SEQ ID NO:32的L144的位置处的丙氨酸(L144A)、在对应于SEQ ID NO:32的Y183的位置处的缬氨酸(Y183V)和在对应于SEQ ID NO:32的H211的位置处的酸性氨基酸。在一些实施方案中，其中在对应于SEQ ID NO:32的H211的位置处的该酸性氨基酸是天冬氨酸。在一些实施方案中，在对应于SEQ ID NO:32的H211的位置处的该酸性氨基酸是谷氨酸。在一些实施方案中，该ALK4-Fc融合蛋白Fc结构域与SEQ ID NO:32的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更相同。在一些实施方案中，该ActRIIB-Fc融合蛋白Fc结构域与SEQ ID NO:32的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更相同。
在某些方面，本公开文本涉及包含至少一种ALK4-Fc融合蛋白和至少一种ActRIIB-Fc融合蛋白的重组ALK4:ActRIIB异多聚体，其中：a)该ActRIIB-Fc融合蛋白包含IgG2 Fc结构域，所述IgG2 Fc结构域包含在对应于SEQ ID NO:32的S130的位置处的半胱氨酸(S130C)和在对应于SEQ ID NO:32的T142的位置处的色氨酸(T142W)；并且b)该ALK4-Fc融合蛋白包含IgG2 Fc结构域，所述IgG2 Fc结构域包含在对应于SEQ ID NO:32的Y125的位置处的半胱氨酸(Y125C)、在对应于SEQ ID NO:32的T142的位置处的丝氨酸(T142S)、在对应于SEQ ID NO:32的L144的位置处的丙氨酸(L144A)、在对应于SEQ ID NO:32的Y183的位置处的缬氨酸(Y183V)和在对应于SEQ ID NO:32的H211的位置处的酸性氨基酸。在一些实施方案中，其中在对应于SEQ ID NO:32的H211的位置处的该酸性氨基酸是天冬氨酸。在一些实施方案中，在对应于SEQ ID NO:32的H211的位置处的该酸性氨基酸是谷氨酸。在一些实施方案中，该ALK4-Fc融合蛋白Fc结构域与SEQ ID NO:32的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更相同。在一些实施方案中，该ActRIIB-Fc融合蛋白Fc结构域与SEQ ID NO:32的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更相同。
在某些方面，本公开文本涉及包含至少一种ALK4-Fc融合蛋白和至少一种ActRIIB-Fc融合蛋白的重组ALK4:ActRIIB异多聚体，其中：a)该ALK4-Fc融合蛋白包含IgG4Fc结构域，所述IgG4 Fc结构域包含在对应于SEQ ID NO:35的S136的位置处的半胱氨酸(S136C)、在对应于SEQ ID NO:35的T148的位置处的色氨酸(T148W)和在对应于SEQ ID NO:35的H217的位置处的酸性氨基酸；并且b)该ActRIIB-Fc融合蛋白包含IgG4 Fc结构域，所述IgG4 Fc结构域包含在对应于SEQ ID NO:35的Y131的位置处的半胱氨酸(Y131C)、在对应于SEQ ID NO:35的T148的位置处的丝氨酸(T148S)、在对应于SEQ ID NO:35的L150的位置处的丙氨酸(L150A)和在对应于SEQ ID NO:35的Y189的位置处的缬氨酸(Y189V)。在一些实施方案中，其中在对应于SEQ ID NO:35的H217的位置处的该酸性氨基酸是天冬氨酸。在一些实施方案中，在对应于SEQ ID NO:35的H217的位置处的该酸性氨基酸是谷氨酸。在一些实施方案中，该ALK4-Fc融合蛋白Fc结构域与SEQ ID NO:35的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更相同。在一些实施方案中，该ActRIIB-Fc融合蛋白Fc结构域与SEQ ID NO:35的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更相同。
在某些方面，本公开文本涉及包含至少一种ALK4-Fc融合蛋白和至少一种ActRIIB-Fc融合蛋白的重组ALK4:ActRIIB异多聚体，其中：a)该ActRIIB-Fc融合蛋白包含IgG4 Fc结构域，所述IgG4 Fc结构域包含在对应于SEQ ID NO:35的S136的位置处的半胱氨酸(S136C)、在对应于SEQ ID NO:35的T148的位置处的色氨酸(T148W)和在对应于SEQ IDNO:35的H217的位置处的酸性氨基酸；并且b)该ALK4-Fc融合蛋白包含IgG4 Fc结构域，所述IgG4 Fc结构域包含在对应于SEQ ID NO:35的Y131的位置处的半胱氨酸(Y131C)、在对应于SEQ ID NO:35的T148的位置处的丝氨酸(T148S)、在对应于SEQ ID NO:35的L150的位置处的丙氨酸(L150A)和在对应于SEQ ID NO:35的Y189的位置处的缬氨酸(Y189V)。在一些实施方案中，其中在对应于SEQ ID NO:35的H217的位置处的该酸性氨基酸是天冬氨酸。在一些实施方案中，在对应于SEQ ID NO:35的H217的位置处的该酸性氨基酸是谷氨酸。在一些实施方案中，该ALK4-Fc融合蛋白Fc结构域与SEQ ID NO:35的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更相同。在一些实施方案中，该ActRIIB-Fc融合蛋白Fc结构域与SEQ ID NO:35的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更相同。
在某些方面，本公开文本涉及包含至少一种ALK4-Fc融合蛋白和至少一种ActRIIB-Fc融合蛋白的重组ALK4:ActRIIB异多聚体，其中：a)该ALK4-Fc融合蛋白包含IgG4Fc结构域，所述IgG4 Fc结构域包含在对应于SEQ ID NO:35的S136的位置处的半胱氨酸(S136C)和在对应于SEQ ID NO:35的T148的位置处的色氨酸(T148W)；并且b)该ActRIIB-Fc融合蛋白包含IgG4 Fc结构域，所述IgG4 Fc结构域包含在对应于SEQ ID NO:35的Y131的位置处的半胱氨酸(Y131C)、在对应于SEQ ID NO:35的T148的位置处的丝氨酸(T148S)、在对应于SEQ ID NO:35的L150的位置处的丙氨酸(L150A)、在对应于SEQ ID NO:35的Y189的位置处的缬氨酸(Y189V)和在对应于SEQ ID NO:35的H217的位置处的酸性氨基酸。在一些实施方案中，其中在对应于SEQ ID NO:35的H217的位置处的该酸性氨基酸是天冬氨酸。在一些实施方案中，在对应于SEQ ID NO:35的H217的位置处的该酸性氨基酸是谷氨酸。在一些实施方案中，该ALK4-Fc融合蛋白Fc结构域与SEQ ID NO:35的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更相同。在一些实施方案中，该ActRIIB-Fc融合蛋白Fc结构域与SEQ ID NO:35的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更相同。
在某些方面，本公开文本涉及包含至少一种ALK4-Fc融合蛋白和至少一种ActRIIB-Fc融合蛋白的重组ALK4:ActRIIB异多聚体，其中：a)该ActRIIB-Fc融合蛋白包含IgG4 Fc结构域，所述IgG4 Fc结构域包含在对应于SEQ ID NO:35的S136的位置处的半胱氨酸(S136C)和在对应于SEQ ID NO:35的T148的位置处的色氨酸(T148W)；并且b)该ALK4-Fc融合蛋白包含IgG4 Fc结构域，所述IgG4 Fc结构域包含在对应于SEQ ID NO:35的Y131的位置处的半胱氨酸(Y131C)、在对应于SEQ ID NO:35的T148的位置处的丝氨酸(T148S)、在对应于SEQ ID NO:35的L150的位置处的丙氨酸(L150A)、在对应于SEQ ID NO:35的Y189的位置处的缬氨酸(Y189V)和在对应于SEQ ID NO:35的H217的位置处的酸性氨基酸。在一些实施方案中，其中在对应于SEQ ID NO:35的H217的位置处的该酸性氨基酸是天冬氨酸。在一些实施方案中，在对应于SEQ ID NO:35的H217的位置处的该酸性氨基酸是谷氨酸。在一些实施方案中，该ALK4-Fc融合蛋白Fc结构域与SEQ ID NO:35的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更相同。在一些实施方案中，该ActRIIB-Fc融合蛋白Fc结构域与SEQ ID NO:35的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更相同。
任选地，ALK4多肽与一个或多个异源结构域直接连接(融合)，或者间插序列(如接头)可以位于该ALK4多肽的氨基酸序列与该一个或多个异源结构域(例如，免疫球蛋白的Fc结构域)之间。类似地，该ActRIIB多肽可以与一个或多个异源结构域直接连接(融合)，或者间插序列(如接头)可以位于该ActRIIB多肽的氨基酸序列与该一个或多个异源结构域(例如，免疫球蛋白的Fc结构域)之间。接头可以对应于ActRIIB或ALK4的细胞外结构域的C末端处的约15个氨基酸的非结构化区域(“尾部”)，或者它可以是在5与15、20、30、50、100个或更多个相对不含二级结构的氨基酸之间的人工序列。接头可以富含甘氨酸和脯氨酸残基，并且可以例如含有苏氨酸/丝氨酸和甘氨酸的重复序列。接头的例子包括但不限于序列TGGG(SEQ ID NO:17)、SGGG(SEQ ID NO:18)、TGGGG(SEQ ID NO:15)、SGGGG(SEQ ID NO:16)、GGGGS(SEQ ID NO:58)、GGGG(SEQ ID NO:14)和GGG(SEQ ID NO:13)。
在某些方面，本公开文本涉及包含至少一种ALK4-Fc融合蛋白和至少一种ActRIIB-Fc融合蛋白的重组ALK4:ActRIIB异多聚体，其中该ALK4-Fc融合蛋白包含与SEQID NO:76的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，并且其中该ActRIIB-Fc融合蛋白包含与SEQ ID NO:72的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，该ALK4-Fc融合蛋白包含一个或多个氨基酸，所述一个或多个氨基酸选自：a)在对应于SEQ ID NO:76的234的位置处的半胱氨酸、在对应于SEQ IDNO:76的251的位置处的丝氨酸、在对应于SEQ ID NO:76的253的位置处的丙氨酸和在对应于SEQ ID NO:76的292的位置处的缬氨酸；b)在对应于SEQ ID NO:76的269的位置处的带正电的氨基酸；c)在对应于SEQ ID NO:76的D286的位置处的带正电的氨基酸；d)在对应于SEQID NO:76的269的位置处的带正电的氨基酸和在对应于SEQ ID NO:76的286的位置处的带正电的氨基酸；e)在对应于SEQ ID NO:76的234的位置处的半胱氨酸、在对应于SEQ ID NO:76的251的位置处的丝氨酸、在对应于SEQ ID NO:76的253的位置处的丙氨酸、在对应于SEQID NO:76的292的位置处的缬氨酸(Y292V)和在对应于SEQ ID NO:76的269的位置处的带正电的氨基酸；f)在对应于SEQ ID NO:76的234的位置处的半胱氨酸、在对应于SEQ ID NO:76的251的位置处的丝氨酸、在对应于SEQ ID NO:76的253的位置处的丙氨酸、在SEQ ID NO:76的位置292处的缬氨酸和在对应于SEQ ID NO:76的286的位置处的带正电的氨基酸；以及g)在对应于SEQ ID NO:76的234的位置处的半胱氨酸、在对应于SEQ ID NO:76的251的位置处的丝氨酸、在对应于SEQ ID NO:76的253的位置处的丙氨酸和在对应于SEQ ID NO:76的292的位置处的缬氨酸、在对应于SEQ ID NO:76的269的位置处的带正电的氨基酸和在对应于SEQ ID NO:76的286的位置处的带正电的氨基酸。在一些实施方案中，该ActRIIB-Fc融合蛋白包含一个或多个氨基酸，所述一个或多个氨基酸选自：a)在对应于SEQ ID NO:72的250的位置处的半胱氨酸和在SEQ ID NO:72的位置262处的色氨酸；b)在对应于SEQ ID NO:72的256的位置处的带负电的氨基酸；c)在对应于SEQ ID NO:72的335的位置处的带负电的氨基酸；d)在对应于SEQ ID NO:72的256的位置处的带负电的氨基酸和在对应于SEQ ID NO:72的335的位置处的带负电的氨基酸；e)在对应于SEQ ID NO:72的250的位置处的半胱氨酸、在SEQ ID NO:72的位置262处的色氨酸和在对应于SEQ ID NO:72的256的位置处的带负电的氨基酸；f)在对应于SEQ ID NO:72的250的位置处的半胱氨酸、在SEQ ID NO:72的位置262处的色氨酸和在对应于SEQ ID NO:72的335的位置处的带负电的氨基酸；以及g)在对应于SEQ ID NO:72的250的位置处的半胱氨酸、在SEQ ID NO:72的位置262处的色氨酸、在对应于SEQ ID NO:72的256的位置处的带负电的氨基酸和在对应于SEQ ID NO:72的335的位置处的带负电的氨基酸。在一些实施方案中，该带正电的氨基酸残基是修饰的或天然存在的(例如，R、K或H)氨基酸。在一些实施方案中，该带正电的氨基酸残基是R。在一些实施方案中，该带负电的氨基酸残基是修饰的或天然存在的(例如，D或E)氨基酸。在一些实施方案中，该带负电的氨基酸残基是D。在一些实施方案中，该带负电的氨基酸残基是E。
在某些方面，本公开文本涉及重组ALK4-Fc融合蛋白，其包含与SEQ ID NO:76的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，该ALK4-Fc融合蛋白Fc结构域包含一个或多个氨基酸，所述一个或多个氨基酸选自：a)在对应于SEQ IDNO:76的234的位置处的半胱氨酸、在对应于SEQ ID NO:76的251的位置处的丝氨酸、在对应于SEQ ID NO:76的253的位置处的丙氨酸和在对应于SEQ ID NO:76的292的位置处的缬氨酸；b)在对应于SEQ ID NO:76的269的位置处的带正电的氨基酸；c)在对应于SEQ ID NO:76的286的位置处的带正电的氨基酸；d)在对应于SEQ ID NO:76的269的位置处的带正电的氨基酸和在对应于SEQ ID NO:76的286的位置处的带正电的氨基酸；e)在对应于SEQ ID NO:76的234的位置处的半胱氨酸、在对应于SEQ ID NO:76的251的位置处的丝氨酸、在对应于SEQ ID NO:76的253的位置处的丙氨酸、在SEQ ID NO:76的位置292处的缬氨酸和在对应于SEQ ID NO:76的269的位置处的带正电的氨基酸；f)在对应于SEQ ID NO:76的234的位置处的半胱氨酸、在对应于SEQ ID NO:76的251的位置处的丝氨酸、在对应于SEQ ID NO:76的253的位置处的丙氨酸、在对应于SEQ ID NO:76的292的位置处的缬氨酸和在对应于SEQ IDNO:76的286的位置处的带正电的氨基酸；以及g)在对应于SEQ ID NO:76的234的位置处的半胱氨酸、在对应于SEQ ID NO:76的251的位置处的丝氨酸、在对应于SEQ ID NO:76的253的位置处的丙氨酸和在对应于SEQ ID NO:76的292的位置处的缬氨酸、在对应于SEQ IDNO:76的269的位置处的带正电的氨基酸和在对应于SEQ ID NO:76的286的位置处的带正电的氨基酸。在一些实施方案中，该带正电的氨基酸残基是修饰的或天然存在的(例如，R、K或H)氨基酸。在一些实施方案中，该带正电的氨基酸残基是R。
在某些方面，本公开文本涉及重组ActRIIB-Fc融合蛋白，其包含与SEQ ID NO:72的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，该融合蛋白包含一个或多个氨基酸，所述一个或多个氨基酸选自：a)在对应于SEQ ID NO:72的250的位置处的半胱氨酸和在对应于SEQ ID NO:72的262的位置处的色氨酸；b)在对应于SEQID NO:72的256的位置处的带负电的氨基酸；c)在对应于SEQ ID NO:72的335的位置处的带负电的氨基酸；d)在对应于SEQ ID NO:72的256的位置处的带负电的氨基酸和在对应于SEQID NO:72的335的位置处的带负电的氨基酸；e)在对应于SEQ ID NO:72的250的位置处的半胱氨酸、在SEQ ID NO:72的位置262处的色氨酸和在对应于SEQ ID NO:72的256的位置处的带负电的氨基酸；f)在对应于SEQ ID NO:72的250的位置处的半胱氨酸、在SEQ ID NO:72的位置262处的色氨酸和在对应于SEQ ID NO:72的335的位置处的带负电的氨基酸；以及g)在对应于SEQ ID NO:7的250的位置处的半胱氨酸、在SEQ ID NO:72的位置262处的色氨酸、在对应于SEQ ID NO:72的256的位置处的带负电的氨基酸和在对应于SEQ ID NO:72的335的位置处的带负电的氨基酸。在一些实施方案中，该带负电的氨基酸残基是修饰的或天然存在的(例如，D或E)氨基酸。在一些实施方案中，该带负电的氨基酸残基是D。在一些实施方案中，该带负电的氨基酸残基是E。
在某些方面，本公开文本涉及重组ALK4-Fc融合蛋白，其包含与SEQ ID NO:74的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，该ALK4-Fc融合蛋白Fc结构域包含一个或多个氨基酸，所述一个或多个氨基酸选自：a)在对应于SEQ IDNO:74的258的位置处的半胱氨酸、在对应于SEQ ID NO:74的275的位置处的丝氨酸、在对应于SEQ ID NO:74的277的位置处的丙氨酸和在SEQ ID NO:74的位置316处的缬氨酸；b)在对应于SEQ ID NO:74的293的位置处的带正电的氨基酸；c)在对应于SEQ ID NO:74的310的位置处的带正电的氨基酸；d)在对应于SEQ ID NO:74的293的位置处的带正电的氨基酸和在对应于SEQ ID NO:74的310的位置处的带正电的氨基酸；e)在对应于SEQ ID NO:74的258的位置处的半胱氨酸、在对应于SEQ ID NO:74的275的位置处的丝氨酸、在对应于SEQ ID NO:74的277的位置处的丙氨酸、在SEQ ID NO:74的位置316处的缬氨酸和在对应于SEQ ID NO:74的293的位置处的带正电的氨基酸；f)在对应于SEQ ID NO:74的258的位置处的半胱氨酸、在对应于SEQ ID NO:74的275的位置处的丝氨酸、在对应于SEQ ID NO:74的277的位置处的丙氨酸、在对应于SEQ ID NO:74的316的位置处的缬氨酸和在对应于SEQ ID NO:74的310的位置处的带正电的氨基酸；g)在对应于SEQ ID NO:74的258的位置处的半胱氨酸、在对应于SEQ ID NO:74的275的位置处的丝氨酸、在对应于SEQ ID NO:74的277的位置处的丙氨酸、在对应于SEQ ID NO:74的316的位置处的缬氨酸、在对应于SEQ ID NO:74的293的位置处的带正电的氨基酸和在对应于SEQ ID NO:74的310的位置处的带正电的氨基酸。在一些实施方案中，该带正电的氨基酸残基是修饰的或天然存在的(例如，R、K或H)氨基酸。在一些实施方案中，该带正电的氨基酸残基是R。
在某些方面，本公开文本涉及重组ActRIIB-Fc融合蛋白，其包含与SEQ ID NO:70的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，该ActRIIB-Fc融合蛋白Fc结构域包含一个或多个氨基酸，所述一个或多个氨基酸选自：a)在对应于SEQ ID NO:70的275的位置处的半胱氨酸和在对应于SEQ ID NO:70的287的位置处的色氨酸；b)在对应于SEQ ID NO:70的281的位置处的带负电的氨基酸；c)在对应于SEQ IDNO:70的360的位置处的带负电的氨基酸；d)在对应于SEQ ID NO:70的281的位置处的带负电的氨基酸和在对应于SEQ ID NO:70的360的位置处的带负电的氨基酸；e)在对应于SEQID NO:70的275的位置处的半胱氨酸、在对应于SEQ ID NO:70的287的位置处的色氨酸和在对应于SEQ ID NO:70的281的位置处的带负电的氨基酸；f)在对应于SEQ ID NO:70的275的位置处的半胱氨酸、在对应于SEQ ID NO:70的287的位置处的色氨酸和在对应于SEQ IDNO:70的360的位置处的带负电的氨基酸；以及g)在对应于SEQ ID NO:70的275的位置处的半胱氨酸、在对应于SEQ ID NO:70的287的位置处的色氨酸、在对应于SEQ ID NO:70的281的位置处的带负电的氨基酸和在对应于SEQ ID NO:70的360的位置处的带负电的氨基酸。在一些实施方案中，该带负电的氨基酸残基是修饰的或天然存在的(例如，D或E)氨基酸。在一些实施方案中，该带负电的氨基酸残基是D。在一些实施方案中，该带负电的氨基酸残基是E。
在某些方面，本公开文本涉及包含至少一种ALK4-Fc融合蛋白和至少一种ActRIIB-Fc融合蛋白的重组ALK4:ActRIIB异多聚体，其中该ALK4-Fc融合蛋白包含与SEQID NO:48的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，并且其中该ActRIIB-Fc融合蛋白包含与SEQ ID NO:80的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，该ALK4-Fc融合蛋白Fc结构域包含在对应于SEQ ID NO:48的234的位置处的半胱氨酸、在对应于SEQ ID NO:48的251的位置处的丝氨酸、在对应于SEQID NO:48的253的位置处的丙氨酸和在SEQ ID NO:48的位置292处的缬氨酸。在一些实施方案中，该ActRIIB-Fc融合蛋白Fc结构域包含在对应于SEQ ID NO:80的250的位置处的半胱氨酸、在对应于SEQ ID NO:80的262的位置处的色氨酸和在对应于SEQ ID NO:80的331的位置处的精氨酸。
在某些方面，本公开文本涉及重组ALK4-Fc融合蛋白，其包含与SEQ ID NO:48的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，该ALK4-Fc融合蛋白Fc结构域包含在对应于SEQ ID NO:48的234的位置处的半胱氨酸、在对应于SEQ IDNO:48的251的位置处的丝氨酸、在对应于SEQ ID NO:48的253的位置处的丙氨酸和在SEQID NO:48的位置292处的缬氨酸。
在某些方面，本公开文本涉及重组ActRIIB-Fc融合蛋白，其包含与SEQ ID NO:80的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，该ActRIIB-Fc融合蛋白Fc结构域包含在对应于SEQ ID NO:80的250的位置处的半胱氨酸、在对应于SEQ ID NO:80的262的位置处的色氨酸和在对应于SEQ ID NO:80的331的位置处的精氨酸。
在某些方面，本公开文本涉及重组ALK4-Fc融合蛋白，其包含与SEQ ID NO:47的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，该ALK4-Fc融合蛋白Fc结构域包含在对应于SEQ ID NO:47的258的位置处的半胱氨酸、在对应于SEQ IDNO:47的275的位置处的丝氨酸、在对应于SEQ ID NO:47的277的位置处的丙氨酸和在SEQID NO:47的位置316处的缬氨酸。
在某些方面，本公开文本涉及重组ActRIIB-Fc融合蛋白，其包含与SEQ ID NO:78的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，该ActRIIB-Fc融合蛋白Fc结构域包含在对应于SEQ ID NO:78的275的位置处的半胱氨酸、在对应于SEQ ID NO:78的287的位置处的色氨酸和在对应于SEQ ID NO:78的356的位置处的精氨酸。
在某些方面，本公开文本涉及包含至少一种ALK4-Fc融合蛋白和至少一种ActRIIB-Fc融合蛋白的重组ALK4:ActRIIB异多聚体，其中该ALK4-Fc融合蛋白包含与SEQID NO:76的氨基酸序列至少90％、95％、97％或99％相同的氨基酸序列，并且其中该ActRIIB-Fc融合蛋白包含与SEQ ID NO:72的氨基酸序列至少90％、95％、97％或99％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，该ALK4-Fc融合蛋白包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列，并且该ActRIIB-Fc融合蛋白包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列。在一些实施方案中，该ActRIIB-Fc融合蛋白包含SEQ ID NO:38的前导序列。在一些实施方案中，该ActRIIB-Fc融合蛋白包含与SEQ ID NO:70的氨基酸序列至少90％、95％、97％或99％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，该ActRIIB-Fc融合蛋白包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列。在一些实施方案中，该ALK4-Fc融合蛋白包含SEQ ID NO:38的前导序列。在一些实施方案中，该ALK4-Fc融合蛋白包含与SEQ ID NO:74的氨基酸序列至少90％、95％、97％或99％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，该ALK4-Fc融合蛋白包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列。在一些实施方案中，该ALK4-Fc融合蛋白包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列，并且该ActRIIB-Fc融合蛋白包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列。
任选地，ALK4和/或ActRIIB多肽包含一个或多个修饰的氨基酸残基，所述一个或多个修饰的氨基酸残基选自：糖基化氨基酸、PEG化氨基酸、法尼基化氨基酸、乙酰化氨基酸、生物素化氨基酸、与脂质部分缀合的氨基酸和与有机衍生剂缀合的氨基酸。ALK4和/或ActRIIB多肽可以包含至少一种N-连接糖，并且可以包含两种、三种或更多种N-连接糖。此类多肽也可以包含O-连接糖。ALK4和/或ActRIIB多肽可以在多种细胞系中产生，所述细胞系以适合于患者使用的方式糖基化该蛋白质，所述细胞系包括工程化昆虫或酵母细胞以及哺乳动物细胞如COS细胞、CHO细胞、HEK细胞和NSO细胞。在一些实施方案中，ALK4和/或ActRIIB多肽是糖基化的并且具有可从中国仓鼠卵巢细胞系获得的糖基化模式。优选地，本公开文本的ALK4:ActRIIB异多聚体复合物在哺乳动物(例如，小鼠或人)中显示出至少4、6、12、24、36、48或72小时的血清半衰期。任选地，ALK4:ActRIIB异多聚体可以在哺乳动物(例如，小鼠或人)中显示出至少6、8、10、12、14、20、25或30天的血清半衰期。
在某些方面，本公开文本的ALK4:ActRIIB异多聚体与一种或多种TGF-β超家族配体结合。任选地，ALK4:ActRIIB异多聚体以小于或等于10-8、10-9、10-10、10-11或10-12M的KD与这些配体中的一种或多种结合。例如，在一些实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体与激活素B结合。在一些实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体与激活素A结合。在一些实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体与激活素AB结合。在一些实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体与激活素C结合。在一些实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体与激活素AC结合。在一些实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体与激活素BC结合。在一些实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体与激活素BC结合。在一些实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体与激活素BE结合。在一些实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体与GDF11结合。在一些实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体与GDF8结合。在一些实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体与BMP6结合。在一些实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体与GDF3结合。在一些实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体与BMP10结合。在一些实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体不与BMP9结合或基本上不与BMP9结合(例如，以大于或等于10-8或10-7的KD结合)。在一些实施方案中，与相应的ActRIIB同多聚体相比，ALK4:ActRIIB异多聚体以更强的亲和力结合激活素B。在一些实施方案中，与相应的ActRIIB同多聚体相比，ALK4:ActRIIB异多聚体以更弱的亲和力结合GDF3。在一些实施方案中，与相应的ActRIIB同多聚体相比，ALK4:ActRIIB异多聚体以更弱的亲和力结合BMP10。在一些实施方案中，与相应的ActRIIB同多聚体相比，ALK4:ActRIIB异多聚体以更弱的亲和力结合BMP9。
一般而言，本公开文本的ALK4:ActRIIB异多聚体拮抗(抑制)至少一种TGF-β超家族配体的一种或多种活性，并且此类活性改变可以使用本领域已知的多种测定来测量，包括例如基于细胞的测定如本文所述的那些测定。在某些方面，ALK4:ActRIIB异多聚体可以用于在例如基于细胞的测定中抑制由一种或多种TGFβ超家族配体介导的信号传导(例如，Smad 2/3和/或Smad 1/5/8信号传导)。例如，在一些实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体在基于细胞的测定中抑制激活素信号传导。在一些实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体在基于细胞的测定中抑制激活素信号传导。在一些实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体在基于细胞的测定中抑制激活素A信号传导。在一些实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体在基于细胞的测定中抑制激活素B信号传导。在一些实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体在基于细胞的测定中抑制激活素AB信号传导。在一些实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体在基于细胞的测定中抑制激活素C信号传导。在一些实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体在基于细胞的测定中抑制激活素AC信号传导。在一些实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体在基于细胞的测定中抑制激活素BC信号传导。在一些实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体在基于细胞的测定中抑制激活素E信号传导。在一些实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体在基于细胞的测定中抑制激活素AE信号传导。在一些实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体在基于细胞的测定中抑制激活素CE信号传导。在一些实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体在基于细胞的测定中抑制GDF11信号传导。在一些实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体在基于细胞的测定中抑制GDF8信号传导。在一些实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体在基于细胞的测定中抑制BMP6信号传导。在一些实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体在基于细胞的测定中抑制GDF3信号传导。在一些实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体在基于细胞的测定中抑制BMP10信号传导。在一些实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体在基于细胞的测定中不抑制或基本上不抑制BMP9信号传导。在一些实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体在基于细胞的测定中是激活素B信号传导的较强抑制剂。在一些实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体在基于细胞的测定中是GDF3信号传导的较弱抑制剂。在一些实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体在基于细胞的测定中是BMP10信号传导的较弱抑制剂。在一些实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体在基于细胞的测定中是BMP9信号传导的较弱抑制剂。
本文所述的任何ALK4:ActRIIB异多聚体均可以配制为药物制剂(组合物)。在一些实施方案中，药物制剂包含药学上可接受的载体。在一些实施方案中，药物制剂将是无热原的(意指无热原达到管理用于治疗用途的产品质量的规范所要求的程度)。药物制剂还可以包含一种或多种另外的化合物，如用于治疗本文所述的障碍/病症的化合物。一般而言，ALK4:ActRIIB异多聚体药物制剂基本上不含ALK4和/或ActRIIB同多聚体。例如，在一些实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体药物制剂包含小于约10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或小于约1％的ALK4同多聚体。在一些实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体药物制剂包含小于约10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或小于约1％的ActRIIB同多聚体。在一些实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体药物制剂包含小于约10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或小于约1％的ALK4同多聚体和小于约10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或小于约1％的ActRIIB同多聚体。
在某些方面，本公开文本提供了编码如本文所述的ActRIIB多肽的核酸。例如，ActRIIB核酸可以包含与SEQ ID NO:7的73-396的序列至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核酸，或在严格条件下与SEQ ID NO:7的核苷酸73-396的互补体杂交的核酸。这种核酸可以是包含SEQ ID NO:8的序列的核酸。在一些实施方案中，ActRIIB核酸包含与SEQ ID NO:71至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核苷酸序列。在一些实施方案中，ActRIIB核酸包含与SEQ ID NO:73至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核苷酸序列。在一些实施方案中，ActRIIB核酸包含与SEQ ID NO:79至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核苷酸序列。在一些实施方案中，ActRIIB核酸包含与SEQ ID NO:81至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核苷酸序列。
在某些方面，本公开文本提供了编码如本文所述的ActRIIB多肽的核酸。例如，ALK4核酸可以包含与SEQ ID NO:11的70-378的序列至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核酸或在严格条件下与SEQ ID NO:11的核苷酸70-378的互补体杂交的核酸，基本上由所述核酸组成，或由所述核酸组成。在一些实施方案中，ALK4核酸包含与SEQ ID NO:75至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核苷酸序列。在一些实施方案中，ALK4核酸包含与SEQ IDNO:77至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核苷酸序列。在一些实施方案中，ALK4核酸包含与SEQ ID NO:82至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核苷酸序列。在一些实施方案中，ALK4核酸包含与SEQ ID NO:83至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核苷酸序列。
在某些方面，本公开文本提供了包含ALK4多肽的编码序列和ActRIIB多肽的编码序列的核酸序列。例如，在一些实施方案中，本公开文本的核酸a)包含与SEQ ID NO:71、73、79和77中的任何一个至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核苷酸序列，并且b)包含与SEQ IDNO:75、77、82和83中的任何一个至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核苷酸序列，基本上由所述核苷酸序列组成，或由所述核苷酸序列组成。
优选地，ALK4和/或ActRIIB核酸是分离的和/或重组的核酸。本文公开的核酸可以与启动子可操作地连接以供表达。本公开文本进一步提供了包含此类ALK4和/或ActRIIB多核苷酸的载体以及包含此类ALK4和/或ActRIIB多核苷酸的细胞(例如，CHO细胞)(优选从人或其他脊椎动物物种分离的细胞)以及包含此类ALK4和/或ActRIIB多核苷酸的载体。
在某些方面，ALK4多肽和/或ActRIIB多肽可以在哺乳动物细胞系中表达，任选合适地介导ActRIIB或ALK4蛋白的天然糖基化以减小患者中不利的免疫反应的可能性(包括兽医患者的可能性)的细胞系。已成功使用人和CHO细胞系，并且预期其他常见的哺乳动物表达载体将是有用的。因此，本公开文本提供了包含本文公开的任何核酸的培养的细胞。此类细胞可以是哺乳动物细胞，包括CHO细胞、NSO细胞、HEK细胞和COS细胞。可以根据预期患者的物种选择其他细胞。本文公开了其他细胞。培养的细胞应理解为意指在实验室中或其他人造条件下(例如，冷冻的或在培养基中)维持，而不是活生物的一部分的细胞。
在某些方面，本公开文本提供了用于制备本文所述的任何ALK4和ActRIIB多肽以及包含此类多肽的ALK4:ActRIIB异多聚体复合物的方法。这种方法可以包括在合适的细胞(例如，CHO细胞或COS细胞)中表达本文公开的任何核酸。例如，在一些实施方案中，制备包含ALK4多肽和ActRIIB多肽的异多聚体的方法包括：在适合于表达ALK4多肽和ActRIIB多肽的条件下培养细胞，其中该细胞包含ALK4多核苷酸和ActRIIB多核苷酸；任选地回收如此表达的异多聚体。可替代地，制备包含ALK4多肽和ActRIIB多肽的异多聚体的方法可以包括：a)在适合于表达ALK4多肽的条件下培养第一细胞，其中该第一细胞包含ALK4多核苷酸；b)回收如此表达的ALK4多肽；c)在适合于表达ActRIIB多肽的条件下培养第二细胞，其中该第二细胞包含ActRIIB多核苷酸；d)回收如此表达的ActRIIB多肽；e)在适合于ALK4:ActRIIB异多聚体形成的条件下将该回收的ALK4多肽和该回收的ActRIIB多肽合并；任选地回收该ALK4:ActRIIB异多聚体。在某些实施方案中，使用TPA前导序列(例如，SEQ ID NO:38)表达ALK4和/或ActRIIB多肽。在某些实施方案中，在CHO细胞中表达ALK4和/或ActRIIB多肽。本文所述的ALK4和ActRIIB多肽以及本文所述的ALK4和ActRIIB多肽的蛋白质复合物可以使用任何用于从细胞培养物获得蛋白质的公知技术以粗制、部分纯化或高度纯化的级分的形式回收。一般而言，此类方法导致基本上不含ALK4和/或ActRIIB同多聚体的ALK4:ActRIIB异多聚体。例如，在一些实施方案中，用于产生ALK4:ActRIIB异多聚体的方法导致小于约10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或小于约1％的ALK4同多聚体。在一些实施方案中，用于产生ALK4:ActRIIB异多聚体的方法导致小于约10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或小于约1％的ActRIIB同多聚体。在一些实施方案中，用于产生ALK4:ActRIIB异多聚体的方法导致小于约10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或小于约1％的ALK4同多聚体和小于约10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或小于约1％的ActRIIB同多聚体。
本公开文本进一步提供了方法和ALK4:ActRIIB异多聚体，其用于治疗或预防多种ALK4:ActRIIB相关疾病和与例如肌肉、骨、脂肪、红细胞和其他组织相关的病症。此类疾病和障碍包括但不限于与肌肉减少或肌肉生长不足相关的障碍(例如，肌肉萎缩；肌营养不良，包括杜氏肌营养不良(Duchenne muscular dystrophy)、贝氏肌营养不良(Beckermuscular dystrophy)和面肩肱型肌营养不良；肌萎缩侧索硬化；散发性包涵体肌炎、遗传性包涵体肌炎和恶病质)以及与不良体重增加相关的障碍(例如，肥胖症、2型糖尿病或非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM)、心血管疾病、高血压症、骨关节炎、中风、呼吸问题和胆囊疾病)。在一些实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体可以用于降低有需要的受试者的体脂含量或降低体脂含量的增加速率。在一些实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体可以用于降低患者的胆固醇和/或甘油三酯水平。在一些实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体可以用于治疗或预防纤维化或纤维化相关障碍或病症(例如，肾脏衰竭、慢性肾脏疾病、囊性纤维化和骨髓纤维化)。
本公开文本进一步提供了方法和ALK4:ActRIIB异多聚体，其用于治疗或预防多种ALK4:ActRIIB相关疾病和与例如肾相关的病症。此类疾病或病症包括例如慢性肾病或衰竭、急性肾病或衰竭、患有1期肾病的患者、患有2期肾病的患者、患有3期肾病的患者、患有4期肾病的患者、患有5期肾病的患者、非糖尿病肾病、肾小球肾炎、间质性肾炎、糖尿病肾病(diabetic kidney disease)、糖尿病性肾病(diabetic nephropathy)、肾小球硬化症、快速进行性肾小球肾炎、肾脏纤维化、奥尔波特综合征(Alport syndrome)、IDDM肾炎、系膜增生性肾小球肾炎、膜增生性肾小球肾炎、新月体性肾小球肾炎、肾脏间质纤维化、局灶性节段性肾小球硬化症、膜性肾病、微小病变肾病、微量免疫快速进行性肾小球肾炎、IgA肾病、多囊肾病、登特病(Dent's disease)、肾钙质沉着症(nephrocytinosis)、海曼肾炎(Heymann nephritis)、常染色体显性遗传(成人)多囊肾病、常染色体隐性遗传(儿童)多囊肾病、急性肾损伤、肾病综合征、肾脏缺血、足细胞疾病或障碍、蛋白尿、肾小球疾病、膜性肾小球肾炎、局灶性节段性肾小球肾炎、先兆子痫、子痫、肾病变、胶原血管病、良性直立性(体位性)蛋白尿、IgM肾病、膜性肾病、结节病、糖尿病、药物引起的肾损害、法布里病(Fabry'sdisease)、氨基酸尿症、范可尼综合征(Fanconi syndrome)、高血压性肾硬化、间质性肾炎、镰状细胞病、血红蛋白尿、肌红蛋白尿、韦格纳肉芽肿病(Wegener's Granulomatosis)、糖原贮积病1型、慢性肾病、慢性肾脏衰竭、低肾小球滤过率(GFR)、肾血管硬化(nephroangiosclerosis)、狼疮肾炎、ANCA阳性微量免疫新月体性肾小球肾炎、慢性同种异体移植物肾病、肾毒性、肾脏毒性、肾坏死、肾损害、肾小球和肾小管损伤、肾功能障碍、肾炎综合征、急性肾脏衰竭、慢性肾脏衰竭、近端肾小管功能障碍、急性肾同种异体移植物排斥、慢性肾移植排斥、非IgA系膜增生性肾小球肾炎、感染后肾小球肾炎、伴有任何类型肾脏受累的血管炎、任何遗传性肾脏疾病、任何间质性肾炎、肾脏移植失败、肾癌、与其他病症(例如，高血压症、糖尿病和自身免疫疾病)相关的肾病、登特病、肾钙质沉着症、海曼肾炎、原发性肾病、塌陷性肾小球病(collapsing glomerulopathy)、致密沉积物病、冷球蛋白血症相关肾小球肾炎、亨诺-许兰病(Henoch-Schonlein disease)、感染后肾小球肾炎、细菌性心内膜炎、显微镜下多血管炎、许尔-施特劳斯综合征(Churg-Strauss syndrome)、抗GBM抗体介导的肾小球肾炎、淀粉样变性、单克隆免疫球蛋白沉积病、原纤维性肾小球肾炎、免疫触须样肾小球病、缺血性肾小管损伤、药物诱导的肾小管间质性肾炎、毒性肾小管间质性肾炎、传染性肾小管间质性肾炎、细菌性肾盂肾炎、由多瘤病毒感染或HIV感染引起的病毒感染性肾小管间质性肾炎、代谢诱导的肾小管间质性疾病、混合性结缔组织病(mixedconnective disease)、管型肾病、可能由尿酸盐或草酸盐或药物诱导的晶体沉积引起的晶体肾病、急性细胞性肾小管间质同种异体移植物排斥、由淋巴瘤或移植后淋巴组织增生性疾病引起的肿瘤浸润性疾病、阻塞性肾病、血管疾病、血栓性微血管病、肾血管硬化、粥样硬化栓塞性疾病(atheroembolic disease)、混合性结缔组织病(mixed connective tissuedisease)、结节性多动脉炎、神经钙蛋白抑制剂诱导的血管疾病、急性细胞性血管同种异体移植物排斥、急性体液同种异体移植物排斥、早期肾脏功能衰退(early renal functiondecline，ERFD)、终末期肾脏疾病(ESRD)、肾脏静脉血栓形成、急性肾小管坏死、肾脏闭塞、急性间质性肾炎、确诊的慢性肾病、肾脏动脉狭窄、缺血性肾病、尿毒症、药物和毒素诱导的慢性肾小管间质性肾炎、反流性肾病、肾结石、古德帕斯彻综合征(Goodpasture'ssyndrome)、正常红细胞正常色素性贫血(normocytic normochromic anemia)、肾性贫血、糖尿病慢性肾病、IgG4相关疾病、冯·希佩尔-林道综合征(von Hippel-Lindausyndrome)、结节性硬化症、肾痨(nephronophthisis)、髓质囊性肾病、肾细胞癌、腺癌、肾母细胞瘤、淋巴瘤、白血病、低唾液酸化障碍、慢性环孢素肾病、肾脏再灌注损伤、肾发育不良、氮质血症、双侧动脉闭塞、急性尿酸性肾病、血容量不足、急性双侧梗阻性尿路病、高钙血症肾病、溶血性尿毒症综合征、急性尿潴留、恶性肾硬化、产后肾小球硬化症、硬皮病、非古德帕斯彻抗GBM病、显微镜下结节性多动脉炎、变应性肉芽肿病、急性放射性肾炎、链球菌感染后肾小球肾炎、沃尔登斯特伦巨球蛋白血症(Waldenstrom's macroglobulinemia)、镇痛剂肾病、动静脉瘘、动静脉移植、透析、异位肾、髓质海绵肾、肾性骨营养不良、孤立肾、肾积水、微量白蛋白尿、尿毒症、血尿、高脂血症、低白蛋白血症、脂肪尿、酸中毒和高钾血症。在一些实施方案中，本公开文本进一步提供了方法和ALK4:ActRIIB拮抗剂，其用于延迟或预防从1期到2期肾病、从2期到3期肾病、从3期到4期肾病或从4期到5期肾病的进展。在一些实施方案中，本公开文本进一步提供了方法和ALK4:ActRIIB异多聚体，其用于预防或减少肾炎。在一些实施方案中，本公开文本进一步提供了方法和ALK4:ActRIIB异多聚体，其用于预防或减少肾损害。在一些实施方案中，本公开文本进一步提供了方法和ALK4:ActRIIB异多聚体，其用于预防或减少肾纤维化。
在某些方面，本公开文本涉及治疗肺动脉高压的方法，其包括向有需要的患者给予有效量的ALK4:ActRIIB异多聚体，如本文所述的那些(例如，ALK4:ActRIIB异二聚体)。在一些实施方案中，该ALK4:ActRIIB异多聚体的给予减少该患者的心室肥大。在一些实施方案中，该ALK4:ActRIIB异多聚体的给予使该患者的心室肥大减少至少10％(例如，10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或至少80％)。在一些实施方案中，该ALK4:ActRIIB异多聚体的给予减少该患者的平滑肌肥大。在一些实施方案中，该ALK4:ActRIIB异多聚体的给予使该患者的平滑肌肥大减少至少10％(例如，10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或至少80％)。在一些实施方案中，该ALK4:ActRIIB异多聚体的给予减少该患者的肺小动脉肌化。在一些实施方案中，该ALK4:ActRIIB异多聚体的给予使该患者的肺小动脉肌化减少至少10％(例如，10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或至少80％)。在一些实施方案中，该ALK4:ActRIIB异多聚体的给予减少该患者的肺血管阻力。在一些实施方案中，该ALK4:ActRIIB异多聚体的给予使该患者的肺血管阻力减少至少10％(例如，10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或至少80％)。在一些实施方案中，该ALK4:ActRIIB异多聚体的给予使该患者的肺血管阻力减少至少25％-30％。在一些实施方案中，该患者患有肺动脉高压，并且患有根据世界卫生组织对于肺高压的功能分类系统的功能性II类或III类肺高压。在一些实施方案中，该患者患有肺动脉高压，其被分类为选自以下的一种或多种亚型：特发性或遗传性肺动脉高压、药物和/或毒素诱导的肺高压、与结缔组织病相关的肺高压以及与分流修复后至少1年时的先天性全身到肺分流相关的肺高压。在一些实施方案中，该患者已经用一种或多种血管扩张药治疗。在一些实施方案中，该患者已经用选自以下的一种或多种药剂治疗：5型磷酸二酯酶抑制剂、可溶性鸟苷酸环化酶刺激剂、前列环素受体激动剂和内皮素受体拮抗剂。在一些实施方案中，该一种或多种药剂选自：波生坦、西地那非、贝前列素、马西替坦、舍来昔帕(selexipag)、依前列醇、曲前列环素、伊洛前列素、安立生坦和他达拉非。在一些实施方案中，该方法进一步包括给予一种或多种血管扩张药。在一些实施方案中，该方法进一步包括给予选自以下的一种或多种药剂：5型磷酸二酯酶抑制剂、可溶性鸟苷酸环化酶刺激剂、前列环素受体激动剂和内皮素受体拮抗剂。在一些实施方案中，该一种或多种药剂选自：波生坦、西地那非、贝前列素、马西替坦、舍来昔帕、依前列醇、曲前列环素、伊洛前列素、安立生坦和他达拉非。在一些实施方案中，该患者的6分钟步行距离为150至400米。在一些实施方案中，该方法将该患者的6分钟步行距离增加至少10米(例如，至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、250、300或多于400米)。在一些实施方案中，该患者的血红蛋白水平>8g/dl且<15g/dl。在一些实施方案中，该方法延迟肺动脉高压的临床恶化。在一些实施方案中，该方法延迟根据世界卫生组织对于肺高压的功能分类系统的肺高压的临床恶化。在一些实施方案中，该方法降低与肺动脉高压相关的一种或多种并发症的住院风险。
在一些实施方案中，本公开文本涉及治疗肺高压的方法，其包括向有需要的患者给予有效量的ALK4:ActRIIB异多聚体。在某些方面，本公开文本涉及预防肺高压的方法，其包括向有需要的患者给予有效量的ALK4:ActRIIB异多聚体。在某些方面，本公开文本涉及降低肺高压的进展速度的方法，其包括向有需要的患者给予有效量的ALK4:ActRIIB异多聚体。在一些实施方案中，本公开文本提供了一种治疗间质性肺病的方法，其包括向有需要的患者给予有效量的ALK4:ActRIIB异多聚体。在一些实施方案中，本公开文本提供了一种治疗、预防间质性肺病的一种或多种并发症或降低其进展速度和/或严重程度的方法，其包括向有需要的患者给予有效量的ALK4:ActRIIB异多聚体。在一些实施方案中，该间质性肺病是特发性肺纤维化。在某些方面，本公开文本涉及降低肺高压的严重程度的方法，其包括向有需要的患者给予有效量的ALK4:ActRIIB异多聚体。在某些方面，本公开文本涉及治疗肺高压的一种或多种并发症(例如，肺动脉中的平滑肌和/或内皮细胞增殖、肺动脉中的血管生成、呼吸困难、胸痛、肺血管重构、右心室肥大和肺纤维化)的方法，其包括向有需要的患者给予有效量的ALK4:ActRIIB异多聚体。在某些方面，本公开文本涉及预防肺高压的一种或多种并发症(例如，肺动脉中的平滑肌和/或内皮细胞增殖、肺动脉中的血管生成、呼吸困难、胸痛、肺血管重构、右心室肥大和肺纤维化)的方法，其包括向有需要的患者给予有效量的ALK4:ActRIIB异多聚体。在某些方面，本公开文本涉及降低肺高压的一种或多种并发症(例如，肺动脉中的平滑肌和/或内皮细胞增殖、肺动脉中的血管生成、呼吸困难、胸痛、肺血管重构、右心室肥大和肺纤维化)的进展速度的方法，其包括向有需要的患者给予有效量的ALK4:ActRIIB异多聚体。在某些方面，本公开文本涉及降低肺高压的一种或多种并发症(例如，肺动脉中的平滑肌和/或内皮细胞增殖、肺动脉中的血管生成、呼吸困难、胸痛、肺血管重构、右心室肥大和肺纤维化)的严重程度的方法，其包括向有需要的患者给予有效量的ALK4:ActRIIB异多聚体。在某些优选的实施方案中，本文所述的方法涉及患有肺动脉高压的患者。在一些实施方案中，本文所述的方法涉及具有至少25mmHg(例如，至少25、30、35、40、45或50mmHg)的静息肺动脉压(PAP)的患者。在一些实施方案中，本文所述的方法降低患有肺高压的患者的PAP。例如，该方法可以将患有肺高压的患者的PAP降低至少3mmHg(例如，至少3、5、7、10、12、15、20或25mmHg)。在一些实施方案中，本文所述的方法降低患有肺高压的患者的肺血管阻力。在一些实施方案中，本文所述的方法升高患有肺高压的患者的肺毛细血管楔压。在一些实施方案中，本文所述的方法升高患有肺高压的患者的左心室舒张末压。在一些实施方案中，本文所述的方法提高(改善)患有肺高压的患者的运动耐力(能力、耐量)。例如，该方法可以增加患有肺高压的患者的6分钟步行距离，任选地将6分钟步行距离增加至少10米(例如，至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100或更多米)。另外，该方法可以降低该患者的博格呼吸困难指数(Borg dyspnea index，BDI)，其任选地可以在6分钟步行测试之后评估。在一些实施方案中，该方法将该患者的博格呼吸困难指数(BDI)降低至少0.5个指数点(例如，至少0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10个指数点)。在一些实施方案中，本文所述的方法涉及患有如世界卫生组织所公认的I类、II类、III类或IV类肺高压的患者。在一些实施方案中，本文所述的方法涉及延迟肺高压的临床进展(恶化)(例如，如通过世界卫生组织标准所测量的进展)。在一些实施方案中，该方法预防或延迟肺高压类别进展(例如，预防或延迟如世界卫生组织所公认的从I类到II类、从II类到III类或从III类到IV类肺高压的进展)。在一些实施方案中，该方法促进或增加肺高压类别退化(例如，促进或增加如世界卫生组织所公认的从IV类到III类、从III类到II类或从II类到I类肺高压的退化)。在一些实施方案中，除了该一种或多种GDF BMP拮抗剂之外，还向该患者给予用于治疗肺高压的一种或多种支持疗法或活性剂。例如，还可以向该患者给予选自以下的一种或多种支持疗法或活性剂：前列环素及其衍生物(例如，依前列醇、曲前列环素和伊洛前列素)；前列环素受体激动剂(例如，舍来昔帕)；内皮素受体拮抗剂(例如，西他生坦、安立生坦、马西替坦和波生坦)；钙通道阻断剂(例如，氨氯地平、地尔硫卓和硝苯地平)；抗凝血剂(例如，华法林)；利尿剂；氧疗法；房间隔造口术；肺动脉血栓内膜剥脱术；5型磷酸二酯酶抑制剂(例如，西地那非和他达拉非)；可溶性鸟苷酸环化酶激活剂(例如，辛那西呱(cinaciguat)和利奥西呱)；ASK-1抑制剂(例如，CIIA；SCH79797；GS-4997；MSC2032964A；3H-萘并[1,2,3-de]喹啉-2,7-二酮、NQDI-1；2-硫代-噻唑烷、5-溴-3-(4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亚基)-l,3-二氢-吲哚-2-酮)；NF-κΒ拮抗剂(例如，dh404、CDDO-环氧化物；2.2-二氟丙酰胺；C28咪唑(CDDO-Im)；2-氰基-3,12-二氧代齐墩果-1,9-二烯-28-酸(CDDO)；3-乙酰齐墩果酸；3-三氟乙酰基齐墩果酸；28-甲基-3-乙酰基齐墩果烷；28-甲基-3-三氟乙酰基齐墩果烷；28-甲氧基齐墩果酸；SZC014；SCZ015；SZC017；齐墩果酸的PEG化衍生物；3-O-(β-D-吡喃葡糖基)齐墩果酸；3-O-[β-D-吡喃葡糖基-(1-->3)-β-D-吡喃葡糖基]齐墩果酸；3-O-[β-D-吡喃葡糖基-(1-->2)-β-D-吡喃葡糖基]齐墩果酸；3-O-[β-D-吡喃葡糖基-(1-->3)-β-D-吡喃葡糖基]齐墩果酸28-O-β-D-吡喃葡糖酯；3-O-[β-D-吡喃葡糖基-(1-->2)-β-D-吡喃葡糖基]齐墩果酸28-O-β-D-吡喃葡糖酯；3-O-[a-L-吡喃鼠李糖基-(1-->3)-β-D-吡喃葡糖醛酸基]齐墩果酸；3-O-[α-L-吡喃鼠李糖基-(1-->3)-β-D-吡喃葡糖醛酸基]齐墩果酸28-O-β-D-吡喃葡糖酯；28-O-β-D-吡喃葡糖基-齐墩果酸；3-O-β-D-吡喃葡糖基(1→3)-β-D-吡喃葡糖醛酸(CS1)；齐墩果酸3-O-β-D-吡喃葡糖基(1→3)-β-D-吡喃葡糖醛酸(CS2)；甲基3,11-二氧代齐墩果-12-烯-28-醇化物(DIOXOL)；ZCVI4-2；苄基3-去羟基-1,2,5-噁二唑并[3',4':2,3]齐墩果酸酯)；肺和/或心脏移植。
附图说明
图1示出了人ActRIIA(SEQ ID NO:49)和人ActRIIB(SEQ ID NO:2)的细胞外结构域的比对，其中在本文中基于多个ActRIIB和ActRIIA晶体结构的综合分析被推断为直接接触配体的残基用方框表示。
图2示出了不含其细胞内结构域的多种脊椎动物ActRIIB前体蛋白(分别为SEQ IDNO:50-55)、不含其细胞内结构域的人ActRIIA前体蛋白(SEQ ID NO:56)以及共有的ActRII前体蛋白(SEQ ID NO:57)的多序列比对。
图3示出了使用Clustal 2.1获得的来自人IgG同种型的Fc结构域的多序列比对。铰链区用虚下划线表示。双下划线表示在IgG1 Fc中工程化以促进不对称链配对的位置和关于其他同种型IgG2、IgG3和IgG4的相应位置的例子。
图4示出了与ActRIIB-Fc同二聚体和ALK4-Fc同二聚体相比，ALK4-Fc:ActRIIB-Fc异二聚体蛋白质复合物的比较性配体结合数据。对于每种蛋白质复合物，配体按koff(它是与配体信号传导抑制良好相关的动力学常数)排序，并且以结合亲和力的降序列出(最紧密结合的配体在顶部列出)。在左侧，黄色、红色、绿色和蓝色线表示解离速率常数的量级。黑色实线表示如下配体，所述配体与异二聚体的结合与同二聚体相比增强或不变，而红色划线表示与同二聚体相比显著降低的结合。如所示，该ALK4-Fc:ActRIIB-Fc异二聚体展示出与任一种同二聚体相比增强的与激活素B的结合，保留如对于ActRIIB-Fc同二聚体所观察到的与激活素A、GDF8和GDF11的强结合，并且显示出与BMP9、BMP10和GDF3的明显降低的结合。与ActRIIB-Fc同二聚体一样，该异二聚体保留与BMP6的中等水平结合。
图5示出了来源于多种脊椎动物物种的ALK4细胞外结构域(SEQ ID NO:59-65)的多序列比对。
图6A至图6D示出了包含ALK4多肽和ActRIIB多肽的异聚蛋白质复合物的示意性例子。
在示出的实施方案中，ALK4多肽(从左至右)是包含相互作用对的第一成员(“C1”)的融合多肽的一部分，并且ActRIIB多肽是包含相互作用对的第二成员(“C2”)的融合多肽的一部分。合适的相互作用对包括例如重链和/或轻链免疫球蛋白相互作用对、其截短物及变体，如本文所述的那些相互作用对[例如，Spiess等人(2015)Molecular Immunology 67(2A):95-106]。在每种融合多肽中，接头可以位于ALK4或ActRIIB多肽与该相互作用对的相应成员之间。该相互作用对的第一和第二成员可以是非引导的，这意味着该对的成员可以彼此缔合或自我缔合而没有实质的偏好，并且它们可以具有相同或不同的氨基酸序列。参见图6A。可替代地，该相互作用对可以是引导(不对称)对，这意味着该对的成员优先彼此缔合而不是自我缔合。参见图6B。可以设想更高阶的复合物。参见图6C和图6D。
图7示出了如通过如本文所述的A-204报告基因测定所测定的比较性ALK4-Fc:ActRIIB-Fc异二聚体/ActRIIB-Fc:ActRIIB-Fc同二聚体IC50数据。ALK4-Fc:ActRIIB-Fc异二聚体与ActRIIB-Fc:ActRIIB-Fc异二聚体类似地抑制激活素A、激活素B、GDF8和GDF11信号传导途径。然而，与ActRIIB-Fc:ActRIIB-Fc异二聚体相比，ALK4-Fc:ActRIIB-Fc异二聚体对BMP9和BMP10信号传导途径的抑制显著降低。这些数据证明与相应的ActRIIB:ActRIIB同二聚体相比，ALK4:ActRIIB异二聚体是激活素A、激活素B、GDF8和GDF11的更具选择性的拮抗剂。
图8A至图8C示出了来自经历单侧输尿管梗阻(UUO)的小鼠肾的纤维化基因(Col1a1、纤连蛋白、PAI-1、CTGF和a-SMA)、炎性基因(TNF-α和MCP1)、细胞因子基因(TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3和激活素A)、肾损伤基因(NGAL)、缺氧诱导因子1-α(HIF1a)和激活素A受体(Acvr2A)的基因表达概况。来自对侧非手术肾的样品用作对照(Ctrl)。在手术后第17天获得基因表达概况。在手术后第3天、第7天、第10天和第14天向小鼠给予PBS或ALK4-Fc:ActRIIB-Fc同二聚体。($)表示在仅给予PBS的小鼠中的第17天的UUO肾与给予ALK7-Fc:ActRIIB-Fc同二聚体的小鼠中的第17天的UUO肾之间的统计差异。(@)表示未检测到转录物。
图9A和图9B示出了用运载体(Col4a3-Veh和Col4a5-Veh)或ALK4-Fc:ActRIIB-Fc融合蛋白(Col4a3-IIB/ALK4和Col4a5-IIB/ALK4)处理的Col4a3和Col4a5奥尔波特小鼠中的蛋白尿水平。图9A显示在Col4a3奥尔波特小鼠中与运载体相比，ALK4-Fc:ActRIIB-Fc处理显著地降低蛋白尿水平。图9B显示在Col4a5奥尔波特小鼠中与运载体相比，ALK4-Fc:ActRIIB-Fc处理显著地降低蛋白尿水平。
图10A至图10C示出了来自用运载体(Col4a3-Veh)或ALK4-Fc:ActRIIB-Fc异二聚体(Col4a3-IIB/ALK4)处理的Col4a3-/-奥尔波特小鼠的肾组织的组织学分析。图10A表示如通过胶原-I染色所揭示的组织纤维化的百分比。胶原-I染色表明ALK4-Fc:ActRIIB-Fc处理显著地减少该奥尔波特小鼠模型的肾纤维化。图10B表示如通过三色染色所揭示的组织纤维化的百分比。三色染色表明ALK4-Fc:ActRIIB-Fc处理显著地减少该奥尔波特小鼠模型的肾纤维化。图10C表示如通过组织学分析所揭示的硬化肾小球的百分比。数据表明ALK4-Fc:ActRIIB-Fc处理显著地减少该奥尔波特小鼠模型的硬化肾小球。
具体实施方式
1.综述
部分地，本公开文本涉及包含TGFβ超家族I型受体多肽和TGFβ超家族II型受体多肽的异多聚体、其用途以及制备此类异多聚体的方法。参见例如图6。在某些优选的实施方案中，异多聚体包含TGFβ超家族I型受体多肽的细胞外结构域和TGFβ超家族II型受体多肽的细胞外结构域。具体地，本公开文本提供了包含ALK4多肽和ActRIIB多肽的异多聚体。优选地，此类ALK4多肽包含ALK4受体的配体结合结构域，并且此类ActRIIB多肽包含ActRIIB受体的配体结合结构域。在某些优选的实施方案中，与相应的同多聚体样品相比，本公开文本的ALK4:ActRIIB异多聚体具有改变的TGFβ超家族配体结合概况/特异性(例如，ALK4:ActRIIB异二聚体与ActRIIB:ActRIIB同二聚体或ALK4:ALK4同二聚体相比)。
TGF-β超家族包括超过30种分泌因子，包括TGF-β、激活素、nodal、骨形态发生蛋白(BMP)、生长和分化因子(GDF)以及抗苗勒管激素(AMH)[Weiss等人(2013)DevelopmentalBiology,2(1):47-63]。在脊椎动物和无脊椎动物中均发现的该超家族的成员在各种组织中普遍表达并在动物的一生中的发育的最早阶段过程中起作用。实际上，TGF-β超家族蛋白是干细胞自我更新、原肠胚形成、分化、器官形态发生和成体组织稳态的关键介质。与这种普遍存在的活性一致，异常的TGF-β超家族信号传导与广泛范围的人体病理学相关，所述人体病理学包括例如自身免疫疾病、心血管疾病、纤维化疾病和癌症。
TGF-β超家族的配体共有相同的二聚体结构，其中一个单体的中心3-1/2转螺旋装在由另一个单体的β-链形成的凹面上。大多数TGF-β家族成员通过分子间二硫键进一步稳定。该二硫键穿过由另外两个二硫键形成的环，生成所谓的“半胱氨酸结”基序[Lin等人(2006)Reproduction 132:179-190；和Hinck等人(2012)FEBS Letters 586:1860-1870]。
TGF-β超家族信号传导由I型和II型丝氨酸/苏氨酸激酶受体的异聚复合物介导，所述激酶受体在配体刺激后磷酸化并激活下游SMAD蛋白(例如，SMAD蛋白1、2、3、5和8)[Massagué(2000)Nat.Rev.Mol.Cell Biol.1:169-178]。这些I型和II型受体是跨膜蛋白，其由具有富半胱氨酸区的配体结合细胞外结构域、跨膜结构域和具有预测的丝氨酸/苏氨酸激酶特异性的细胞质结构域构成。一般而言，I型受体介导细胞内信号传导，而II型受体是结合TGF-β超家族配体所需的。I型和II型受体在配体结合后形成稳定的复合物，从而导致II型受体对I型受体的磷酸化。
TGF-β家族可以根据它们结合的I型受体和它们激活的Smad蛋白而分为两个系统发生分支。一个分支是最近进化的分支，其包括例如TGF-β、激活素、GDF8、GDF9、GDF11、BMP3和nodal，它们通过激活Smad 2和3的I型受体发送信号[Hinck(2012)FEBS Letters 586:1860-1870]。另一个分支包含该超家族的更远相关的蛋白质，并且包括例如BMP2、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7、BMP8a、BMP8b、BMP9、BMP10、GDF1、GDF5、GDF6和GDF7，它们通过Smad 1、5和8发送信号。
激活素是TGF-β超家族的成员，并且最初被发现作为促卵泡激素分泌的调节剂，但随后已经表征了多种生殖和非生殖作用。有三种主要的激活素形式(A、B和AB)，它们是两个密切相关的β亚基的同二聚体/异二聚体(分别为βAβA、βBβB和βAβB)。人类基因组还编码主要在肝脏中表达的激活素C和激活素E，并且含有βC或βE的异二聚体形式也是已知的。在TGF-β超家族中，激活素是独特的多功能因子，其可以刺激在卵巢和胎盘细胞中的激素产生，支持神经元细胞存活，根据细胞类型积极或消极地影响细胞周期进程，并且至少在两栖动物胚胎中诱导中胚层分化[DePaolo等人(1991)Proc Soc Ep Biol Med.198:500-512；Dyson等人(1997)Curr Biol.7:81-84；和Woodruff(1998)Biochem Pharmacol.55:953-963]。在几种组织中，激活素信号传导被其相关的异二聚体抑制素拮抗。例如，在促卵泡激素(FSH)从垂体的分泌的调节中，激活素促进FSH合成和分泌，而抑制素减少FSH合成和分泌。可调节激活素生物活性和/或与激活素结合的其他蛋白质包括卵泡抑素(FS)、卵泡抑素相关蛋白(FSRP，也称为FLRG或FSTL3)和α2-巨球蛋白。
如本文所述，结合“激活素A”的药剂是特异性地结合βA亚基的药剂，无论是在分离的βA亚基的背景下还是作为二聚体复合物(例如，βAβA同二聚体或βAβB异二聚体)。在异二聚体复合物(例如，βAβB异二聚体)的情况下，结合“激活素A”的药剂对βA亚基内存在的表位具有特异性，而不结合该复合物的非βA亚基(例如，该复合物的βB亚基)中存在的表位。类似地，本文公开的拮抗(抑制)“激活素A”的药剂是抑制如由βA亚基介导的一种或多种活性的药剂，无论是在分离的βA亚基的背景下还是作为二聚体复合物(例如，βAβA同二聚体或βAβB异二聚体)。在βAβB异二聚体的情况下，抑制“激活素A”的药剂是特异性地抑制βA亚基的一种或多种活性而不抑制该复合物的非βA亚基(例如，该复合物的βB亚基)的活性的药剂。该原理也适用于结合和/或抑制“激活素B”、“激活素C”和“激活素E”的药剂。本文公开的拮抗“激活素AB”的药剂是抑制如由βA亚基介导的一种或多种活性和如由βB亚基介导的一种或多种活性的药剂。相同的原理也适用于结合和/或抑制“激活素AC”、“激活素BC”、“激活素AE”和“激活素BE”的药剂。
BMP和GDF一起形成共有TGF-β超家族的特征性折叠的半胱氨酸结细胞因子的家族[Rider等人(2010)Biochem J.,429(1):1-12]。该家族包括例如BMP2、BMP4、BMP6、BMP7、BMP2a、BMP3、BMP3b(也称为GDF10)、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7、BMP8、BMP8a、BMP8b、BMP9(也称为GDF2)、BMP10、BMP11(也称为GDF11)、BMP12(也称为GDF7)、BMP13(也称为GDF6)、BMP14(也称为GDF5)、BMP15、GDF1、GDF3(也称为VGR2)、GDF8(也称为肌生成抑制蛋白)、GDF9、GDF15和生物皮肤生长因子(decapentaplegic)。除了诱导骨形成的能力(这赋予了BMP的名称)之外，BMP/GDF在广泛范围的组织的发育中展示出形态发生活性。BMP/GDF同二聚体和异二聚体与I型和II型受体二聚体的组合相互作用以产生多种可能的信号传导复合物，从而导致两组竞争的SMAD转录因子之一的激活。BMP/GDF具有高度特异性和局限性的功能。这些功能通过多种方式进行调节，包括BMP/GDF表达的发育限制和通过分泌以高亲和力结合细胞因子的几种特异性BMP拮抗剂蛋白。奇怪的是，许多这些拮抗剂类似于TGF-β超家族配体。
生长和分化因子-8(GDF8)也称为肌生成抑制蛋白。GDF8是骨骼肌量的负调节因子，并且在发育中和成人骨骼肌中高度表达。转基因小鼠中的GDF8无效突变的特征在于骨骼肌的显著的肥大和增生[McPherron等人Nature(1997)387:83-90]。骨骼肌量的类似增加在牛中并且显著地在人类中的GDF8的天然存在的突变中是明显的[Ashmore等人(1974)Growth,38:501-507；Swatland和Kieffer,J.Anim.Sci.(1994)38:752-757；McPherron和Lee,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1997)94:12457-12461；Kambadur等人Genome Res.(1997)7:910-915；和Schuelke等人(2004)N Engl J Med,350:2682-8]。研究还表明，与人类中的HIV感染相关的肌肉消耗伴随着GDF8蛋白表达的增加[Gonzalez-Cadavid等人,PNAS(1998)95:14938-43]。另外，GDF8可以调节肌肉特异性酶(例如，肌酸激酶)的产生并调节成肌细胞增殖[国际专利申请公开号WO 00/43781]。GDF8前肽可以非共价地结合成熟的GDF8结构域二聚体，从而使其生物活性失活[Miyazono等人(1988)J.Biol.Chem.,263:6407-6415；Wakefield等人(1988)J.Biol.Chem.,263；7646-7654；和Brown等人(1990)GrowthFactors,3:35-43]。与GDF8或结构相关的蛋白质结合并抑制其生物活性的其他蛋白质包括卵泡抑素并且可能包括卵泡抑素相关蛋白[Gamer等人(1999)Dev.Biol.,208:222-232]。
GDF11(也称为BMP11)是在小鼠发育过程中在尾芽、肢芽、上颌弓和下颌弓以及背根神经节中表达的分泌蛋白[McPherron等人(1999)Nat.Genet.,22:260-264；和Nakashima等人(1999)Mech.Dev.,80:185-189]。GDF11在模式化中胚层和神经组织中发挥独特的作用[Gamer等人(1999)Dev Biol.,208:222-32]。GDF11被证明是发育中小鸡肢体中软骨形成和肌生成的负调节因子[Gamer等人(2001)Dev Biol.,229:407-20]。GDF11在肌肉中的表达也表明其在以类似于GDF8的方式调节肌肉生长中的作用。另外，GDF11在脑中的表达表明GDF11也可以具有与神经系统功能相关的活性。有趣的是，发现GDF11抑制嗅上皮中的神经发生[Wu等人(2003)Neuron.,37:197-207]。因此，抑制剂GDF11可以在治疗疾病如肌肉疾病和神经退行性疾病(例如，肌萎缩侧索硬化)中具有体外和体内应用。
如本文所述，比较性结合数据证明与任一种相应的ActRIIB或ALK4同二聚体相比，ALK4:ActRIIB异二聚体具有改变的结合概况(配体选择性)。具体地，ALK4:ActRIIB异二聚体展示出与任一种同二聚体相比增强的与激活素B的结合，并且保留如对于ActRIIB同二聚体所观察到的与激活素A、GDF8和GDF11的强结合。然而，与ActRIIB同二聚体相比，ALK4:ActRIIB异二聚体显示出与BMP9、BMP10和GDF3的明显降低的结合。具体地，BMP9对ALK4:ActRIIB异二聚体展示出很低或观察不到的亲和力，而该配体与ActRIIB同二聚体强烈结合。
因此，这些结果证明与ActRIIB同二聚体相比，ALK4:ActRIIB异二聚体是激活素A、激活素B、GDF8和GDF11的更具选择性的拮抗剂。因此，ALK4:ActRIIB异二聚体在这种选择性拮抗作用是有利的某些应用中比ActRIIB同二聚体更有用。例子包括治疗性应用，其中需要保留激活素(例如，激活素A、激活素B、激活素AC、激活素AB)、GDF8和GDF11中的一种或多种的拮抗作用，而最小化BMP9、BMP10和BMP6中的一种或多种的拮抗作用。
此外，如本文所述，ALK4:ActRIIB异二聚体对骨骼肌和骨发挥有益的合成代谢作用并且对脂肪组织发挥分解代谢作用，这非常类似于ActRIIB同二聚体的作用。然而，与ActRIIB同二聚体不同，ActRIIB:ALK4异二聚体仅显示出与BMP9和BMP10的低亲和力或短暂结合，因此将对由这些配体介导的过程(如血管生成)几乎没有并发抑制。这种新颖的选择性将可用于例如治疗需要对例如肌肉和骨的刺激作用和对脂肪的抑制作用但不需要改变血管生成的患者。
本说明书中使用的术语在本公开文本的上下文中以及在使用每个术语的特定上下文中通常具有它们在本领域中的普通含义。某些术语在下文或本说明书的其他地方进行讨论，以向从业者提供关于描述本公开文本的组合物和方法以及如何制备和使用它们的额外指导。术语的任何使用的范围或含义将从使用它的特定上下文中变得清楚。
术语“异聚体”或“异多聚体”是至少包含第一多肽链和第二多肽链的复合物，其中该第二多肽链与该第一多肽链在氨基酸序列上相差至少一个氨基酸残基。该异聚体可以包含由该第一和第二多肽链形成的“异二聚体”，或者可以形成更高阶结构，其中除了该第一和第二多肽链之外还存在一个或多个多肽链。异多聚体的示例性结构包括异二聚体、异三聚体、异四聚体和其他寡聚体结构。异二聚体在本文中命名为X:Y或等同地命名为X-Y，其中X代表第一多肽链，并且Y代表第二多肽链。更高阶异聚体和寡聚体结构在本文中以相应的方式命名。在某些实施方案中，异多聚体是重组的(例如，一种或多种多肽组分可以是重组蛋白)、分离的和/或纯化的。
所有语法形式和拼写变体的“同源的”是指具有“共同进化起源”的两种蛋白质之间的关系，所述蛋白质包括来自相同生物物种中的超家族的蛋白质以及来自不同生物物种的同源蛋白质。此类蛋白质(及其编码核酸)具有如通过其序列相似性所反映的序列同源性，无论是就同一性百分比而言还是根据特定残基或基序和保守位置的存在。然而，在通常的用法中和在本申请中，术语“同源的”在用副词如“高度地”修饰时，可以指序列相似性，并且可以涉及或可以不涉及共同的进化起源。
所有语法形式的术语“序列相似性”是指可以共有或可以不共有共同的进化起源的核酸或氨基酸序列之间的同一性或对应的程度。
将关于参考多肽(或核苷酸)序列的“序列同一性百分比(％)”定义为在用以实现最大百分比序列同一性并且不将任何保守取代视为序列同一性的一部分而比对序列和引入缺口(如果需要)后，候选序列中与参考多肽(核苷酸)序列中的氨基酸残基(或核酸)相同的氨基酸残基(或核酸)的百分比。用于确定氨基酸序列同一性百分比的目的的比对能以本领域技术范围内的多种方式实现，例如使用可公开获得的计算机软件，如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适当参数，包括为了在被比较的序列的全长上实现最大比对所需要的任何算法。然而，为了本文的目的，使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生氨基酸(核酸)序列同一性值％。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech,Inc.编写，并且源代码已经以用户文档提交在美国版权局(U.S.Copyright Office)，华盛顿，20559中，其中它在美国版权登记号TXU510087下注册。ALIGN-2程序可从加利福尼亚州南旧金山的Genentech,Inc.公开获得，或者可以从源代码编译。应编译ALIGN-2程序以在UNIX操作系统(包括数字UNIX V4.0D)上使用。所有序列比较参数均由ALIGN-2程序设置，并且不变。
所有语法形式的“激动”是指激活蛋白质和/或基因(例如，通过激活或扩增该蛋白质的基因表达或通过诱导无活性蛋白质进入活性状态)或提高蛋白质和/或基因的活性的过程。
所有语法形式的“拮抗”是指抑制蛋白质和/或基因(例如，通过抑制或减少该蛋白质的基因表达或通过诱导活性蛋白质进入无活性状态)或降低蛋白质和/或基因的活性的过程。
在整个说明书和权利要求书中结合数值使用的术语“约”和“大约”表示本领域技术人员熟知和可接受的精确度区间。一般而言，这种精确度区间为±10％。可替代地并且特别地，在生物系统中，术语“约”和“大约”可以意指在给定值的数量级内(优选≤5倍且更优选≤2倍)的值。
本文公开的数字范围包含限定该范围的数字。
术语“一个”和“一种”包括复数指代物，除非使用该术语的上下文另有明确规定。术语“一个”(或“一种”)以及术语“一个/一种或多个/多种”在本文中可以互换使用。此外，本文使用的“和/或”被视为两个或更多个指定特征或组分中的每一个与或不与其他特征或组分的特定公开。因此，如在本文中以短语如“A和/或B”使用的术语“和/或”旨在包括“A和B”、“A或B”、“A”(单独)和“B”(单独)。同样地，如以短语如“A、B和/或C”使用的术语“和/或”旨在涵盖以下方面中的每一个：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；以及C(单独)。2.ALK4:ActRIIB异多聚体
在某些方面，本公开文本涉及包含一种或多种ALK4受体多肽(例如，SEQ ID NO:9、10、19、20、42、44、47、48、74和76)和一种或多种ActRIIB受体多肽(例如，SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、39、41、45、46、70、72、78和80)的异多聚体，其在本文中通常称为“ALK4:ActRIIB异多聚体复合物”或“ALK4:ActRIIB异多聚体”。优选地，本公开文本的ALK4:ActRIIB异多聚体是可溶的，例如异多聚体可以包含ALK4受体的可溶部分(结构域)和ActRIIB受体的可溶部分(结构域)。一般而言，ALK4和ActRIIB的细胞外结构域对应于这些受体的可溶部分。因此，在一些实施方案中，本公开文本的异多聚体包含ALK4受体的细胞外结构域和ActRIIB受体的细胞外结构域。本文公开了ALK4和ActRIIB受体的示例性细胞外结构域，并且可以根据本公开文本的发明(例如，ALK4:ActRIIB异多聚体组合物及其用途)使用此类序列以及其片段、功能变体和修饰形式。本公开文本的ALK4:ActRIIB异多聚体包括例如异二聚体、异三聚体、异四聚体和更高阶的寡聚体结构。参见例如图6。在某些优选的实施方案中，本公开文本的异多聚体是ALK4:ActRIIB异二聚体。
优选地，本公开文本的ALK4:ActRIIB异多聚体与一种或多种TGF-β超家族配体结合。在一些实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体可以与激活素(例如，激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、激活素AC、激活素AB、激活素BC、激活素AE和激活素BE)、GDF8、GDF11、BMP6、GDF3和BMP10中的一种或多种结合。在一些实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体与激活素A结合。在一些实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体与激活素B结合。在一些实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体与激活素C结合。在一些实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体与激活素E结合。在一些实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体与激活素AB结合。在一些实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体与激活素AC结合。在一些实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体与激活素AE结合。在一些实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体与激活素BC结合。在一些实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体与激活素BE结合。在一些实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体与GDF11结合。在一些实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体与GDF8结合。在一些实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体与BMP6结合。在一些实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体与GDF3结合。在一些实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体与BMP10结合。在一些实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体不与BMP9结合或基本上不与BMP9结合(例如，由于BMP9与ALK4:ActRIIB异多聚体之间的相互作用的短暂性质而具有不确定的Ka或Kd)。在一些实施方案中，与相应的ActRIIB同多聚体相比，ALK4:ActRIIB异多聚体以更强的亲和力结合激活素B。在一些实施方案中，与相应的ActRIIB同多聚体相比，ALK4:ActRIIB异多聚体以更弱的亲和力结合GDF3。在一些实施方案中，与相应的ActRIIB同多聚体相比，ALK4:ActRIIB异多聚体以更弱的亲和力结合BMP9。在一些实施方案中，与相应的ActRIIB同多聚体相比，ALK4:ActRIIB异多聚体以更弱的亲和力结合BMP10。任选地，ALK4:ActRIIB异多聚体可以进一步与BMP2、BMP2/7、BMP3、BMP4、BMP4/7、BMP5、BMP7、BMP8a、BMP8b、GDF5、GDF6/BMP13、GDF7、GDF9b/BMP15、GDF15/MIC1、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、nodal、胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、神经营养因子(neurturin)、artemin、persephin、MIS和Lefty中的一种或多种结合。
在一些实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体可以用于抑制(拮抗)由一种或多种TGFβ超家族配体介导的信号传导(例如，Smad 2/3和/或Smad 1/5/8信号传导)。具体地，本公开文本的ALK4:ActRIIB异多聚体可以用于在例如基于细胞的测定如本文所述的测定中抑制通过一种或多种TGFβ超家族配体进行的细胞内信号传导。例如，ALK4:ActRIIB异多聚体可以在基于细胞的测定中抑制由激活素(例如，激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、激活素AC、激活素AB、激活素BC、激活素AE和激活素BE)、GDF8、GDF11、BMP6、GDF3和BMP10中的一种或多种介导的信号传导。在一些实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体可以在基于细胞的测定中抑制激活素A信号传导。在一些实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体可以在基于细胞的测定中抑制激活素B信号传导。在一些实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体可以在基于细胞的测定中抑制激活素C信号传导。在一些实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体可以在基于细胞的测定中抑制激活素D信号传导。在一些实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体可以在基于细胞的测定中抑制激活素E信号传导。在一些实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体可以在基于细胞的测定中抑制激活素AB信号传导。在一些实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体可以在基于细胞的测定中抑制激活素AC信号传导。在一些实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体可以在基于细胞的测定中抑制激活素BC信号传导。在一些实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体可以在基于细胞的测定中抑制激活素AE信号传导。在一些实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体可以在基于细胞的测定中抑制激活素BE信号传导。在一些实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体可以在基于细胞的测定中抑制GDF11信号传导。在一些实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体可以在基于细胞的测定中抑制GDF8信号传导。在一些实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体可以在基于细胞的测定中抑制BMP6信号传导。在一些实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体可以在基于细胞的测定中抑制GDF3信号传导。在一些实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体可以在基于细胞的测定中抑制BMP9信号传导。在一些实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体在基于细胞的测定中不抑制或基本上不抑制BMP9信号传导。在一些实施方案中，与相应的ActRIIB同多聚体相比，ALK4:ActRIIB异多聚体在基于细胞的测定中是激活素B信号传导的较强抑制剂。在一些实施方案中，与相应的ActRIIB同多聚体相比，ALK4:ActRIIB异多聚体在基于细胞的测定中是BMP10信号传导的较弱抑制剂。在一些实施方案中，与相应的ActRIIB同多聚体相比，ALK4:ActRIIB异多聚体在基于细胞的测定中是GDF3信号传导的较强抑制剂。在一些实施方案中，与相应的ActRIIB同多聚体相比，ALK4:ActRIIB异多聚体在基于细胞的测定中BMP9信号传导的较强抑制剂。任选地，ALK4:ActRIIB异多聚体可以在基于细胞的测定中进一步抑制通过BMP2、BMP2/7、BMP3、BMP4、BMP4/7、BMP5、BMP7、BMP8a、BMP8b、GDF5、GDF6/BMP13、GDF7、GDF9b/BMP15、GDF15/MIC1、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、nodal、胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、神经营养因子、artemin、persephin、MIS和Lefty中的一种或多种进行的细胞内信号传导。
如本文所用，术语“ActRIIB”是指来自任何物种的激活素受体IIB型(ActRIIB)蛋白质的家族以及通过诱变或其他修饰来源于此类ActRIIB蛋白的变体。本文中对ActRIIB的提及应理解为对任何一种当前鉴定的形式的提及。ActRIIB家族的成员通常是跨膜蛋白，其由包含富半胱氨酸区的配体结合细胞外结构域、跨膜结构域和具有预测的丝氨酸/苏氨酸激酶活性的细胞质结构域构成。
术语“ActRIIB多肽”包括如下多肽，所述多肽包含ActRIIB家族成员的任何天然存在的多肽以及其保留有用活性的任何变体(包括突变体、片段、融合物和肽模拟形式)。此类变体ActRIIB多肽的例子在整个本公开文本以及通过引用以其整体并入本文的国际专利申请公开号WO 2006/012627、WO2008/097541和WO 2010/151426中提供。本文所述的所有ActRIIB相关多肽的氨基酸的编号均基于下文提供的人ActRIIB前体蛋白序列(SEQ ID NO:1)的编号，除非另外特别指出。
人ActRIIB前体蛋白序列如下：
信号肽用单下划线表示；细胞外结构域用粗体字表示；并且潜在的内源性N-连接糖基化位点用
表示。
加工的细胞外ActRIIB多肽序列如下：
GRGEAETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWRNSSGTIELVKKGCWLDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPT(SEQ ID NO:2)
在一些实施方案中，可以产生在N末端具有“SGR……”序列的蛋白质。细胞外结构域的C末端“尾部”用单下划线表示。缺失“尾部”的序列(Δ15序列)如下：
GRGEAETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWRNSSGTIELVKKGCWLDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEA(SEQ ID NO:3)
在文献中还报道了具有在SEQ ID NO:1的位置64处的丙氨酸(A64)的ActRIIB的形式，参见例如Hilden等人(1994)Blood,83(8):2163-2170。申请人已经确定包含具有A64取代的ActRIIB的细胞外结构域的ActRIIB-Fc融合蛋白对激活素和GDF11具有相对较低的亲和力。相比之下，具有在位置64处的精氨酸(R64)的相同ActRIIB-Fc融合蛋白对激活素和GDF11具有在低纳摩尔至高皮摩尔范围内的亲和力。因此，具有R64的序列用作本公开文本中人ActRIIB的“野生型”参考序列。
具有在位置64处的丙氨酸的ActRIIB的形式如下：
信号肽用单下划线表示，并且细胞外结构域用粗体字表示。
替代A64形式的加工的细胞外ActRIIB多肽序列如下：
GRGEAETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWANSSGTIELVKKGCWLDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPT(SEQ ID NO:5)
在一些实施方案中，可以产生在N末端具有“SGR……”序列的蛋白质。细胞外结构域的C末端“尾部”用单下划线表示。缺失“尾部”的序列(Δ15序列)如下：
GRGEAETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWANSSGTIELVKKGCWLDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEA(SEQ ID NO:6)
编码人ActRIIB前体蛋白的核酸序列如下所示(SEQ ID NO:7)，表示Genbank参考序列NM_001106.3的核苷酸25-1560，其编码ActRIIB前体的氨基酸1-513。如所示的序列提供了位置64处的精氨酸，并且可以被修饰为替代地提供丙氨酸。信号序列是加下划线的。
编码加工的细胞外人ActRIIB多肽的核酸序列如下(SEQ ID NO:8)。如所示的序列提供了位置64处的精氨酸，并且可以被修饰为替代地提供丙氨酸。
人ActRIIB细胞外结构域和人ActRIIA细胞外结构域的氨基酸序列的比对示于图1中。该比对显示了被认为直接接触ActRII配体的两种受体内的氨基酸残基。例如，复合ActRII结构显示ActRIIB-配体结合口袋部分地由残基Y31、N33、N35、L38至T41、E47、E50、Q53至K55、L57、H58、Y60、S62、K74、W78至N83、Y85、R87、A92以及E94至F101定义。在这些位置处，预期保守突变将会是耐受的。
另外，ActRIIB在脊椎动物中是良好保守的，其中大段的细胞外结构域完全保守。例如，图2描绘了与多种ActRIIB直系同源物相比的人ActRIIB细胞外结构域的多序列比对。与ActRIIB结合的许多配体也是高度保守的。因此，从这些比对中，可以预测对于正常ActRIIB-配体结合活性而言重要的配体结合结构域内的关键氨基酸位置，并且预测可能耐受取代而不显著地改变正常ActRIIB-配体结合活性的氨基酸位置。因此，根据本发明公开的方法有用的活性人ActRIIB变体多肽可以包含在来自另一种脊椎动物ActRIIB的序列的相应位置处的一个或多个氨基酸，或者可以包含类似于人或其他脊椎动物序列中的残基的残基。不意在是限制性的，以下例子说明了定义活性ActRIIB变体的这种方法。人细胞外结构域(SEQ ID NO:53)中的L46是非洲爪蟾(Xenopus)ActRIIB(SEQ ID NO:55)中的缬氨酸，并且因此该位置可以改变，并且任选地可以改变为另一种疏水性残基(如V、I或F)或非极性残基(如A)。人细胞外结构域中的E52是非洲爪蟾中的K，这表明该位点可以耐受各种变化，包括极性残基(如E、D、K、R、H、S、T、P、G、Y)和可能的A。人细胞外结构域中的T93是非洲爪蟾中的K，这表明广泛的结构变异在该位置处是耐受的，其中倾向极性残基如S、K、R、E、D、H、G、P、G和Y。人细胞外结构域中的F108是非洲爪蟾中的Y，并且因此Y或其他疏水性基团如I、V或L应该是耐受的。人细胞外结构域中的E111是非洲爪蟾中的K，这表明带电残基在该位置处将会是耐受的，所述带电残基包括D、R、K和H以及Q和N。人细胞外结构域中的R112是非洲爪蟾中的K，这表明碱性残基在该位置处是耐受的，所述碱性残基包括R和H。人细胞外结构域中的位置119处的A保守性相对较差，并且在啮齿动物中表现为P而在非洲爪蟾中表现为V，因此基本上任何氨基酸在该位置处应该是耐受的。
此外，ActRII蛋白已在本领域中在结构和功能特征方面进行了表征，特别是关于配体结合[Attisano等人(1992)Cell 68(1):97-108；Greenwald等人(1999)NatureStructural Biology 6(1):18-22；Allendorph等人(2006)PNAS 103(20:7643-7648；Thompson等人(2003)The EMBO Journal 22(7):1555-1566；以及美国专利号：7,709,605、7,612,041和7,842,663]。除了本文的教导之外，这些参考文献充分地提供了关于如何产生保留一种或多种正常活性(例如，配体结合活性)的ActRIIB变体的指导。
例如，称为三指毒素折叠的定义结构基序对于I型和II型受体的配体结合而言是重要的，并且由位于每种单体受体的细胞外结构域内的不同位置处的保守半胱氨酸残基形成[Greenwald等人(1999)Nat Struct Biol 6:18-22；和Hinck(2012)FEBS Lett 586:1860-1870]。因此，如由这些保守半胱氨酸的最外侧划分的人ActRIIB的核心配体结合结构域对应于SEQ ID NO:1(ActRIIB前体)的位置29-109。因此，在这些半胱氨酸划分的核心序列侧翼的结构上不太有序的氨基酸可以在N末端被截短约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28个残基和/或在C末端被截短约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个残基，而不必改变配体结合。用于N末端和/或C末端截短的示例性ActRIIB细胞外结构域包括SEQ ID NO:2、3、5和6。
Attisano等人表明ActRIIB的细胞外结构域的C末端的脯氨酸结的缺失降低了受体对激活素的亲和力。含有本发明SEQ ID NO:1的氨基酸20-119的ActRIIB-Fc融合蛋白“ActRIIB(20-119)-Fc”相对于ActRIIB(20-134)-Fc具有降低的与GDF11和激活素的结合，所述ActRIIB(20-134)-Fc包含脯氨酸结区域和完整的近膜结构域(参见例如美国专利号7,842,663)。然而，ActRIIB(20-129)-Fc蛋白相对于野生型保留类似但略微降低的活性，即使脯氨酸结区域被破坏。
因此，在氨基酸134、133、132、131、130和129(关于SEQ ID NO:1)处停止的ActRIIB细胞外结构域预期全部都具活性，但在134或133处停止的构建体可能是最具活性的。类似地，预期在残基129-134(关于SEQ ID NO:1)中任何一个处的突变不会大幅改变配体结合亲和力。支持这一点的是，本领域已知P129和P130(关于SEQ ID NO:1)的突变基本上不降低配体结合。因此，本公开文本的ActRIIB多肽可以早在氨基酸109(最终的半胱氨酸)处结束，然而，预期以109和119结束或在109与119之间(例如，109、110、111、112、113、114、115、116、117、118或119)结束的形式具有降低的配体结合。氨基酸119(关于本发明SEQ ID NO:1)保守性差，并且因此容易改变或截短。在128(关于SEQ ID NO:1)处或稍后结束的ActRIIB多肽应保留配体结合活性。在关于SEQ ID NO:1的119和127处或在关于SEQ ID NO:1的119与127之间(例如，119、120、121、122、123、124、125、126或127)结束的ActRIIB多肽将具有中等结合能力。根据临床或实验设置，可能需要使用这些形式中的任何一种。
在ActRIIB的N末端，预期以氨基酸29(关于SEQ ID NO:1)或之前开始的蛋白质将保留配体结合活性。氨基酸29表示初始半胱氨酸。在位置24(关于SEQ ID NO:1)处的丙氨酸到天冬酰胺突变引入N-连接糖基化序列而基本上不影响配体结合[美国专利号7,842,663]。这证实了在信号切割肽与半胱氨酸交联区域之间的对应于氨基酸20-29的区域中的突变是良好耐受的。具体地，以位置20、21、22、23和24(关于SEQ ID NO:1)开始的ActRIIB多肽应保留一般的配体结合活性，并且还预期以位置25、26、27、28和29(关于SEQ ID NO:1)开始的ActRIIB多肽保留配体结合活性。例如美国专利号7,842,663已经证明以22、23、24或25开始的ActRIIB构建体惊人地具有最大活性。
总之，ActRIIB的活性部分(例如，配体结合部分)的通式包含SEQ ID NO:1的氨基酸29-109。因此，ActRIIB多肽可以例如包含与ActRIIB的一部分至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，基本上由所述氨基酸序列组成，或由所述氨基酸序列组成，所述ActRIIB的一部分以对应于SEQ ID NO:1的氨基酸20-29中的任何一个的残基开始(例如，以氨基酸20、21、22、23、24、25、26、27、28或29中的任何一个开始)，并且以对应于SEQ ID NO:1的氨基酸109-134中的任何一个的位置结束(例如，以氨基酸109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133或134中的任何一个结束)。其他例子包括如下多肽，所述多肽以来自SEQ ID NO:1的20-29(例如，位置20、21、22、23、24、25、26、27、28或29中的任何一个)或21-29(例如，位置21、22、23、24、25、26、27、28或29中的任何一个)的位置开始，并且以来自SEQ ID NO:1的119-134(例如，位置119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133或134中的任何一个)、119-133(例如，位置119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132或133中的任何一个)、129-134(例如，位置129、130、131、132、133或134中的任何一个)或129-133(例如，位置129、130、131、132或133中的任何一个)的位置结束。其他例子包括如下构建体，所述构建体以来自SEQ ID NO:1的20-24(例如，位置20、21、22、23或24中的任何一个)、21-24(例如，位置21、22、23或24中的任何一个)或22-25(例如，位置22、22、23或25中的任何一个)的位置开始，并且以来自SEQ ID NO:1的109-134(例如，位置109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133或134中的任何一个)、119-134(例如，位置119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133或134中的任何一个)或129-134(例如，位置129、130、131、132、133或134中的任何一个)的位置结束。还考虑了这些范围内的变体，特别是与SEQID NO:1的相应部分具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的变体。
本文描述的变异能以各种方式组合。在一些实施方案中，ActRIIB变体包含在配体结合口袋中的不超过1、2、5、6、7、8、9、10或15个保守氨基酸变化，以及在配体结合口袋中的位置40、53、55、74、79和/或82处的零个、一个或多个非保守改变。结合口袋外部的位点(在此处可变性可以特别地良好耐受)包括细胞外结构域的氨基和羧基末端(如上所述)以及位置42-46和65-73(关于SEQ ID NO:1)。在位置65处的天冬酰胺到丙氨酸改变(N65A)实际上改善了在A64背景中的配体结合，因此预期对R64背景中的配体结合没有不利影响[美国专利号7,842,663]。这种变化可能会消除在A64背景中N65处的糖基化，从而证明该区域中的显著变化可能是耐受的。虽然R64A变化的耐受性差，但R64K是良好耐受的，因此另一种碱性残基如H可以在位置64处耐受[美国专利号7,842,663]。另外，本领域描述的诱变程序的结果表明ActRIIB中存在通常有益于保守的氨基酸位置。关于SEQ ID NO:1，这些位置包括位置80(酸性或疏水性氨基酸)、位置78(疏水性氨基酸，并且特别是色氨酸)、位置37(酸性氨基酸，特别是天冬氨酸或谷氨酸)、位置56(碱性氨基酸)、位置60(疏水性氨基酸，特别是苯丙氨酸或酪氨酸)。因此，本公开文本提供了可在ActRIIB多肽中保守的氨基酸的框架。可能需要保守的其他位置如下：位置52(酸性氨基酸)、位置55(碱性氨基酸)、位置81(酸性氨基酸)、98(极性或带电的氨基酸，特别是E、D、R或K)，所有这些位置都是关于SEQ ID NO:1。
在某些实施方案中，本公开文本涉及包含至少一种ActRIIB多肽的异多聚体，所述ActRIIB多肽包括其片段、功能变体和修饰形式。优选地，根据本公开文本的发明使用的ActRIIB多肽是可溶的(例如，ActRIIB的细胞外结构域)。在其他优选的实施方案中，根据本公开文本使用的ActRIIB多肽与一种或多种TGF-β超家族配体结合。因此，在一些实施方案中，根据本公开文本使用的ActRIIB多肽抑制(拮抗)一种或多种TGF-β超家族配体的活性(例如，抑制Smad信号传导)。在一些实施方案中，本公开文本的异多聚体包含至少一种ActRIIB多肽，所述ActRIIB多肽包含与ActRIIB的一部分至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，基本上由所述氨基酸序列组成，或由所述氨基酸序列组成，所述ActRIIB的一部分以对应于SEQ ID NO:1的氨基酸20-29的残基开始(例如，以氨基酸20、21、22、23、24、25、26、27、28或29中的任何一个开始)，并且以对应于SEQ ID NO:1的氨基酸109-134的位置结束(例如，以氨基酸109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133或134中的任何一个结束)。在某些优选实施方案中，本公开文本的异多聚体包含至少一种ActRIIB多肽，所述ActRIIB多肽包含与SEQ ID NO:1的氨基酸29-109至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，由所述氨基酸序列组成，或基本上由所述氨基酸序列组成。在其他优选实施方案中，本公开文本的异多聚体复合物包含至少一种ActRIIB多肽，所述ActRIIB多肽包含与SEQ ID NO:1的氨基酸25-131至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，由所述氨基酸序列组成，或基本上由所述氨基酸序列组成。在一些实施方案中，本公开文本的异多聚体包含至少一种ActRIIB多肽，所述ActRIIB多肽与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、39、41、45或46中的任何一个的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、97％、98％、99％或100％相同。在某些优选的实施方案中，本公开文本的异多聚体包含、不包含ActRIIB多肽，其中对应于SEQ ID NO:1的L79的位置是酸性氨基酸(即，不是天然存在的D或E氨基酸残基或人工酸性氨基酸)。
在某些方面，本公开文本涉及包含ALK4多肽的蛋白质复合物。如本文所用，术语“ALK4”是指来自任何物种的激活素受体样激酶4蛋白的家族以及通过诱变或其他修饰来源于此类ALK4蛋白的变体。本文中对ALK4的提及应理解为对任何一种当前鉴定的形式的提及。ALK4家族的成员通常是跨膜蛋白，其由具有富半胱氨酸区的配体结合细胞外结构域、跨膜结构域和具有预测的丝氨酸/苏氨酸激酶活性的细胞质结构域构成。
术语“ALK4多肽”包括如下多肽，所述多肽包含ALK4家族成员的任何天然存在的多肽以及其保留有用活性的任何变体(包括突变体、片段、融合物和肽模拟形式)。本文所述的所有ALK4相关多肽的氨基酸的编号均基于下文的人ALK4前体蛋白序列(SEQ ID NO:9)的编号，除非另外特别指出。
人ALK4前体蛋白序列(NCBI Ref Seq NP_004293)如下：
信号肽用单下划线表示，并且细胞外结构域用粗体字表示。
加工的细胞外人ALK4多肽序列如下：
SGPRGVQALLCACTSCLQANYTCETDGACMVSIFNLDGMEHHVRTCIPKVELVPAGKPFYCLSSEDLRNTHCCYTDYCNRIDLRVPSGHLKEPEHPSMWGPVE(SEQ ID NO:10)
编码ALK4前体蛋白的核酸序列如下所示(SEQ ID NO:11)，其对应于Genbank参考序列NM_004302.4的核苷酸78-1592。信号序列是加下划线的，并且细胞外结构域用粗体字表示。
编码细胞外ALK4多肽的核酸序列如下：
TCCGGGCCCCGGGGGGTCCAGGCTCTGCTGTGTGCGTGCACCAGCTGCCTCCAGGCCAACTACACGTGTGAGACAGATGGGGCCTGCATGGTTTCCATTTTCAATCTGGATGGGATGGAGCACCATGTGCGCACCTGCATCCCCAAAGTGGAGCTGGTCCCTGCCGGGAAGCCCTTCTACTGCCTGAGCTCGGAGGACCTGCGCAACACCCACTGCTGCTACACTGACTACTGCAACAGGATCGACTTGAGGGTGCCCAGTGGTCACCTCAAGGAGCCTGAGCACCCGTCCATGTGGGGCCCGGTGGAG(SEQ ID NO:12)
人ALK4前体蛋白序列的替代同种型(即同种型C(NCBI Ref Seq NP_064733.3))如下：
信号肽用单下划线表示，并且细胞外结构域用粗体字表示。
加工的细胞外ALK4多肽序列(同种型C)如下：
SGPRGVQALLCACTSCLQANYTCETDGACMVSIFNLDGMEHHVRTCIPKVELVPAGKPFYCLSSEDLRNTHCCYTDYCNRIDLRVPSGHLKEPEHPSMWGPVE(SEQ ID NO:20)
编码ALK4前体蛋白(同种型C)的核酸序列如下所示(SEQ ID NO:21)，其对应于Genbank参考序列NM_020328.3的核苷酸78-1715。信号序列是加下划线的，并且细胞外结构域用粗体字表示。
编码细胞外ALK4多肽(同种型C)的核酸序列如下：
TCCGGGCCCCGGGGGGTCCAGGCTCTGCTGTGTGCGTGCACCAGCTGCCTCCAGGCCAACTACACGTGTGAGACAGATGGGGCCTGCATGGTTTCCATTTTCAATCTGGATGGGATGGAGCACCATGTGCGCACCTGCATCCCCAAAGTGGAGCTGGTCCCTGCCGGGAAGCCCTTCTACTGCCTGAGCTCGGAGGACCTGCGCAACACCCACTGCTGCTACACTGACTACTGCAACAGGATCGACTTGAGGGTGCCCAGTGGTCACCTCAAGGAGCCTGAGCACCCGTCCATGTGGGGCCCGGTGGAG(SEQ ID NO:22)
在某些实施方案中，本公开文本涉及包含至少一种ALK4多肽的异多聚体，所述ALK4多肽包括其片段、功能变体和修饰形式。优选地，根据本公开文本的发明(例如，包含ALK4多肽的异多聚体及其用途)使用的ALK4多肽是可溶的(例如，ALK4的细胞外结构域)。在其他优选的实施方案中，根据本公开文本的发明使用的ALK4多肽结合和/或抑制(拮抗)一种或多种TGF-β超家族配体的活性(例如，Smad信号传导)。在一些实施方案中，本公开文本的异多聚体包含至少一种ALK4多肽，所述ALK4多肽与SEQ ID NO:9、10、19、20、42、44、47、48、74和76的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、97％、98％或99％相同。在一些实施方案中，本公开文本的异多聚体复合物由至少一种ALK4多肽组成或基本上由其组成，所述ALK4多肽与SEQ ID NO:9、10、19、20、42、44、47、48、74和76的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、97％、98％或99％相同。
ALK4在脊椎动物中是良好保守的，其中大段的细胞外结构域完全保守。例如，图5描绘了与多种ALK4直系同源物相比的人ALK4细胞外结构域的多序列比对。与ALK4结合的许多配体也是高度保守的。因此，从这些比对中，可以预测对于正常ALK4-配体结合活性而言重要的配体结合结构域内的关键氨基酸位置，并且预测可能对取代耐受而不显著地改变正常ALK4-配体结合活性的氨基酸位置。因此，根据本发明公开的方法有用的活性人ALK4变体多肽可以包含在来自另一种脊椎动物ALK4的序列的相应位置处的一个或多个氨基酸，或者可以包含类似于人或其他脊椎动物序列中的残基的残基。不意在是限制性的，以下例子说明了定义活性ALK4变体的这种方法。人ALK4细胞外结构域(SEQ ID NO:59)中的V6是小家鼠(Mus muculus)ALK4(SEQ ID NO:63)中的异亮氨酸，并且因此该位置可以改变，并且任选地可以改变为另一种疏水性残基(如L、I或F)或非极性残基(如A)，如在原鸡(Gallus gallus)ALK4(SEQ ID NO:62)中所观察到的。人细胞外结构域中的E40是原鸡ALK4中的K，这表明该位点可以耐受各种变化，包括极性残基(如E、D、K、R、H、S、T、P、G、Y)以及可能的非极性残基(如A)。人细胞外结构域中的S15是原鸡ALK4中的D，这表明广泛的结构变异在该位置处是耐受的，其中倾向极性残基如S、T、R、E、K、H、G、P、G和Y。人细胞外结构域中的E40是原鸡ALK4中的K，这表明带电残基在该位置处将会是耐受的，所述带电残基包括D、R、K、H以及Q和N。人细胞外结构域中的R80是星鼻鼹(Condylura cristata)ALK4(SEQ ID NO:60)中的K，这表明碱性残基在该位置处是耐受的，所述碱性残基包括R、K和H。人细胞外结构域中的Y77是野猪(Sus scrofa)ALK4(SEQ ID NO:64)中的F，这表明芳香族残基在该位置处是耐受的，所述芳香族残基包括F、W和Y。人细胞外结构域中的P93保守性相对较差，其在刺猬(Erinaceuseuropaeus)ALK4(SEQ ID NO:61)中表现为S而在原鸡ALK4中表现为N，因此基本上任何氨基酸在该位置处应该是耐受的。
此外，ALK4蛋白已在本领域中在结构和功能特征方面进行了表征，特别是关于配体结合[例如，Harrison等人(2003)J Biol Chem 278(23):21129-21135；Romano等人(2012)J Mol Model 18(8):3617-3625；和Calvanese等人(2009)15(3):175-183]。除了本文的教导之外，这些参考文献充分地提供了关于如何产生保留一种或多种正常活性(例如，配体结合活性)的ALK4变体的指导。
例如，称为三指毒素折叠的定义结构基序对于I型和II型受体的配体结合而言是重要的，并且由位于每种单体受体的细胞外结构域内的不同位置处的保守半胱氨酸残基形成[Greenwald等人(1999)Nat Struct Biol 6:18-22；和Hinck(2012)FEBS Lett 586:1860-1870]。因此，如由这些保守半胱氨酸的最外侧划分的人ALK4的核心配体结合结构域对应于SEQ ID NO:9(ALK4前体)的位置34-101。因此，在这些半胱氨酸划分的核心序列侧翼的结构上不太有序的氨基酸可以在N末端被截短1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个残基或在C末端被截短1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或26个残基，而不必改变配体结合。用于N末端和/或C末端截短的示例性ALK4细胞外结构域包括SEQ ID NO:10和20。
因此，ALK4的活性部分(例如，配体结合部分)的通式包含氨基酸34-101。因此，ALK4多肽可以例如包含与ALK4的一部分至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，基本上由所述氨基酸序列组成，或由所述氨基酸序列组成，所述ALK4的一部分以对应于SEQ ID NO:1的氨基酸24-34中的任何一个的残基开始(例如，以氨基酸24、25、26、27、28、29、30、31、32、33或34中的任何一个开始)，并且以对应于SEQ ID NO:9的氨基酸101-126中的任何一个的位置结束(例如，以氨基酸101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125或126中的任何一个结束)。其他例子包括如下构建体，所述构建体以来自SEQ ID NO:9的24-34(例如，位置24、25、26、27、28、29、30、31、32、33或34中的任何一个)、25-34(例如，位置25、26、27、28、29、30、31、32、33或34中的任何一个)或26-34(例如，位置26、27、28、29、30、31、32、33或34中的任何一个)的位置开始，并且以来自SEQ ID NO:9的101-126(例如，位置101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125或126中的任何一个)、102-126(例如，位置102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125或126中的任何一个)、101-125(例如，位置101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124或125中的任何一个)、101-124(例如，位置101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123或124中的任何一个)、101-121(例如，位置101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120或121中的任何一个)、111-126(例如，位置111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125或126中的任何一个)、111-125(例如，位置111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124或125中的任何一个)、111-124(例如，位置111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123或124中的任何一个)、121-126(例如，位置121、122、123、124、125或126中的任何一个)、121-125(例如，位置121、122、123、124或125中的任何一个)、121-124(例如，位置121、122、123或124中的任何一个)或124-126(例如，位置124、125或126中的任何一个)的位置结束。还考虑了这些范围内的变体，特别是与SEQ ID NO:9的相应部分具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的变体。
本文描述的变异能以各种方式组合。在一些实施方案中，ALK4变体包含在配体结合口袋中的不超过1、2、5、6、7、8、9、10或15个保守氨基酸变化。结合口袋外部的位点(在此处可变性可以特别地良好耐受)包括细胞外结构域的氨基和羧基末端(如上所述)。
在一些实施方案中，本公开文本考虑了通过修饰ALK4多肽和/或ActRIIB多肽的结构来制备功能变体。变体可以通过氨基酸取代、缺失、添加或其组合产生。例如，可以合理地预期用异亮氨酸或缬氨酸单独地置换亮氨酸、用谷氨酸单独地置换天冬氨酸、用丝氨酸单独地置换苏氨酸或用结构上相关的氨基酸类似地置换氨基酸(例如，保守突变)将不会对所得分子的生物活性产生重要影响。保守置换是在其侧链相关的氨基酸的家族内发生的置换。通过评估变体多肽以类似于野生型多肽的方式在细胞中产生反应或者与一种或多种TGF-β超家族配体结合的能力，可以容易地确定本公开文本的多肽的氨基酸序列的变化是否导致功能同源物，所述一种或多种TGF-β超家族配体包括例如BMP2、BMP2/7、BMP3、BMP4、BMP4/7、BMP5、BMP6、BMP7、BMP8a、BMP8b、BMP9、BMP10、GDF3、GDF5、GDF6/BMP13、GDF7、GDF8、GDF9b/BMP15、GDF11/BMP11、GDF15/MIC1、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、激活素AB、激活素AC、激活素BC、激活素AE、激活素BE、nodal、胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、神经营养因子、artemin、persephin、MIS和Lefty。
在一些实施方案中，本公开文本考虑了通过修饰ALK4和/或ActRIIB多肽的结构来制备功能变体，用于如增强治疗功效或稳定性(例如，增加保质期和/或对蛋白质水解降解的抗性)的目的。
在一些实施方案中，本公开文本考虑了ALK4多肽和/或ActRIIB多肽的特定突变，以改变多肽的糖基化。可以选择此类突变以引入或消除一个或多个糖基化位点，如O-连接或N-连接的糖基化位点。天冬酰胺连接的糖基化识别位点通常包含三肽序列，即天冬酰胺-X-苏氨酸或天冬酰胺-X-丝氨酸(其中“X”是任何氨基酸)，它被适当的细胞糖基化酶特异性地识别。也可以通过将一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基添加或取代至多肽序列来进行改变(对于O-连接的糖基化位点)。糖基化识别位点的第一或第三氨基酸位置中的一个或两个处的多种氨基酸取代或缺失(和/或第二位置处的氨基酸缺失)导致修饰的三肽序列处的非糖基化。增加多肽上碳水化合物部分的数目的另一种手段是通过将糖苷与多肽进行化学或酶促偶联。根据所用的偶联模式，可以将一种或多种糖附接至(a)精氨酸和组氨酸；(b)游离羧基基团；(c)游离巯基基团如半胱氨酸的游离巯基；(d)游离羟基基团如丝氨酸、苏氨酸或羟脯氨酸的游离羟基；(e)芳香族残基如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的芳香族残基；或(f)谷氨酰胺的酰胺基团。去除多肽上存在的一个或多个碳水化合物部分可以化学地和/或酶促地完成。化学去糖基化可以涉及例如将多肽暴露于化合物三氟甲磺酸或等同的化合物。该处理导致除连接糖(N-乙酰葡糖胺或N-乙酰半乳糖胺)之外的大部分或所有糖的切割，同时保持氨基酸序列完整。如Thotakura等人[Meth.Enzymol.(1987)138:350]所述，通过使用多种内切和外切糖苷酶可以实现多肽上碳水化合物部分的酶促切割。根据所用的表达系统的类型，可以适当地调节多肽的序列，因为哺乳动物、酵母、昆虫和植物细胞都可以引入可被该肽的氨基酸序列影响的不同的糖基化模式。一般而言，用于人的本公开文本的异聚复合物可以在提供适当糖基化的哺乳动物细胞系(如HEK293或CHO细胞系)中表达，但预期其他哺乳动物表达细胞系也是可用的。
本公开文本进一步考虑了产生突变体(特别是一组ALK4和/或ActRIIB多肽的组合突变体以及截短突变体)的方法。组合突变体的库尤其可用于鉴定功能活性(例如，TGF-β超家族配体结合)ALK4和/或ActRIIB序列。筛选此类组合文库的目的可以是产生例如具有改变的特性(如改变的药代动力学或改变的配体结合)的多肽变体。下面提供了多种筛选测定，并且此类测定可以用于评价变体。例如，可以针对与一种或多种TGF-β超家族配体结合以防止TGF-β超家族配体与TGF-β超家族受体结合和/或干扰通过TGF-β超家族配体引起的信号传导的能力来筛选ALK4:ActRIIB复合物变体。
可以例如在基于细胞的或体内测定中测试ALK4:ActRIIB异多聚体的活性。例如，可以评估ALK4:ActRIIB异多聚体对肌肉细胞中肌肉产生中涉及的基因表达或蛋白质活性的影响。根据需要，这可以在一种或多种TGF-β超家族配体的存在下进行，并且可以转染细胞以产生ALK4:ActRIIB异多聚体和任选的TGF-β超家族配体。同样地，可以将ALK4:ActRIIB异多聚体给予小鼠或其他动物，并且可以使用本领域公认的方法评估一个或多个量度如肌肉形成和强度。类似地，可以例如在成骨细胞、脂肪细胞和/或神经元细胞中例如通过如本文所述的测定以及本领域公知的测定针对对这些细胞生长的任何影响来测试ALK4:ActRIIB异多聚体或其变体的活性。SMAD反应性报告基因可以用于此类细胞系以监测对下游信号传导的影响。
可以产生组合衍生的变体，其相对于参考ALK4:ActRIIB异多聚体具有增加的选择性或通常增加的效力。当从重组DNA构建体表达时，此类变体可以用于基因疗法方案。同样地，诱变可以产生具有与相应的未修饰的ALK4:ActRIIB异多聚体显著不同的细胞内半衰期的变体。例如，可以使改变的蛋白质对于蛋白质水解降解或导致未修饰的多肽破坏或以其他方式失活的其他细胞过程更稳定或更不稳定。此类变体和编码它们的基因可以用于通过调节多肽的半衰期来改变多肽复合物水平。例如，短半衰期可以产生更短暂的生物学作用，并且当作为可诱导表达系统的一部分时可以允许更严格地控制细胞内的重组多肽复合物水平。在Fc融合蛋白中，可以在接头(如果有的话)和/或Fc部分中进行突变以改变ALK4:ActRIIB异多聚体的一种或多种活性，包括例如免疫原性、半衰期和溶解性。
组合文库可以通过编码多肽文库的基因的简并文库产生，所述多肽均至少包含潜在的ALK4和/或ActRIIB序列的一部分。例如，可以将合成寡核苷酸的混合物酶促地连接至基因序列中，使得潜在的ALK4和/或ActRIIB编码核苷酸序列的简并组可以作为单独的多肽表达，或者可替代地作为一组较大的融合蛋白表达(例如，用于噬菌体展示)。
有许多方式可以由简并寡核苷酸序列产生潜在的同源物的文库。简并基因序列的化学合成可以在自动DNA合成仪中进行，然后可以将合成基因连接至适当的载体中进行表达。简并寡核苷酸的合成是本领域公知的[Narang,SA(1983)Tetrahedron 39:3；Itakura等人(1981)Recombinant DNA,Proc.3rd Cleveland Sympos.Macromolecules,编辑AGWalton,Amsterdam:Elsevier第273-289页；Itakura等人(1984)Annu.Rev.Biochem.53:323；Itakura等人(1984)Science 198:1056；以及Ike等人(1983)Nucleic Acid Res.11:477]。此类技术已被用于其他蛋白质的定向进化中[Scott等人,(1990)Science249:386-390；Roberts等人(1992)PNAS USA 89:2429-2433；Devlin等人(1990)Science 249:404-406；Cwirla等人,(1990)PNAS USA 87:6378-6382；以及美国专利号：5,223,409、5,198,346和5,096,815]。
可替代地，其他形式的诱变可以用于产生组合文库。例如，ALK4:ActRIIB异多聚体可以通过使用以下方法进行筛选而从文库产生和分离：例如丙氨酸扫描诱变[Ruf等人(1994)Biochemistry 33:1565-1572；Wang等人(1994)J.Biol.Chem.269:3095-3099；Balint等人(1993)Gene 137:109-118；Grodberg等人(1993)Eur.J.Biochem.218:597-601；Nagashima等人(1993)J.Biol.Chem.268:2888-2892；Lowman等人(1991)Biochemistry 30:10832-10838；和Cunningham等人(1989)Science 244:1081-1085]、通过接头扫描诱变[Gustin等人(1993)Virology 193:653-660；和Brown等人(1992)Mol.Cell Biol.12:2644-2652；McKnight等人(1982)Science 232:316]、通过饱和诱变[Meyers等人,(1986)Science232:613]、通过PCR诱变[Leung等人(1989)Method Cell Mol Biol 1:11-19]或通过随机诱变，包括化学诱变[Miller等人(1992)A Short Course in Bacterial Genetics,CSHLPress,Cold Spring Harbor,NY；和Greener等人(1994)Strategies in Mol Biol 7:32-34]。接头扫描诱变特别是在组合设置中是用于鉴定ALK4和/或ActRIIB多肽的截短(生物活性)形式的有吸引力的方法。
本领域已知广泛范围的技术用于筛选通过点突变和截短产生的组合文库的基因产物，并且就此而言，所述技术用于筛选具有某种特性的基因产物的cDNA文库。此类技术通常适用于快速筛选由ALK4:ActRIIB异多聚体的组合诱变产生的基因文库。用于筛选大基因文库的最广泛使用的技术通常包括将该基因文库克隆至可复制的表达载体中，用所得载体文库转化适当的细胞以及在检测所需活性促进相对容易地分离编码基因(所述基因的产物被检测到)的载体的条件下表达该组合基因。优选的测定包括TGF-β超家族配体(例如，BMP2、BMP2/7、BMP3、BMP4、BMP4/7、BMP5、BMP6、BMP7、BMP8a、BMP8b、BMP9、BMP10、GDF3、GDF5、GDF6/BMP13、GDF7、GDF8、GDF9b/BMP15、GDF11/BMP11、GDF15/MIC1、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、激活素AB、激活素AC、激活素BC、激活素AE、激活素BE、nodal、胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、神经营养因子、artemin、persephin、MIS和Lefty)结合测定和/或TGF-β配体介导的细胞信号传导测定。
在某些实施方案中，除了ALK4和/或ActRIIB多肽中天然存在的任何修饰之外，ALK4:ActRIIB异多聚体可以进一步包含翻译后修饰。此类修饰包括但不限于乙酰化、羧基化、糖基化、磷酸化、脂化和酰化。因此，ALK4:ActRIIB异多聚体可以包含非氨基酸元件如聚乙二醇、脂质、多糖或单糖和磷酸盐。可以如本文对于其他异多聚体变体所述那样测试此类非氨基酸元件对异多聚体复合物的功能的影响。当在细胞中通过切割新生形式的多肽产生本公开文本的多肽时，翻译后加工对于蛋白质的正确折叠和/或功能而言也可能是重要的。不同的细胞(例如，CHO、HeLa、MDCK、293、WI38、NIH-3T3或HEK293)具有此类翻译后活性的特定的细胞机器和特征机制，并且可以进行选择以确保ALK4和/或ActRIIB多肽以及包含ALK4和/或ActRIIB多肽的异多聚体的正确修饰和加工。
在某些优选的实施方案中，本文所述的异多聚体包含与至少一种ActRIIB多肽共价或非共价缔合的至少一种ALK4多肽。优选地，本文公开的多肽形成异二聚体复合物，但也包括更高阶的异多聚体复合物，例如但不限于异三聚体、异四聚体和其他寡聚体结构(参见例如图6)。在一些实施方案中，ALK4和/或ActRIIB多肽包含至少一种多聚化结构域。如本文所公开的，术语“多聚化结构域”是指促进至少第一多肽与至少第二多肽之间的共价或非共价相互作用的氨基酸或氨基酸序列。本文公开的多肽可以与多聚化结构域共价或非共价连接。优选地，多聚化结构域促进第一多肽(例如，ALK4多肽)与第二多肽(例如，ActRIIB多肽)之间的相互作用以促进异多聚体形成(例如，异二聚体形成)，并且任选地阻碍或以其他方式不利于同多聚体形成(例如，同二聚体形成)，从而增加所需异多聚体的产量(参见例如图6)。
本领域已知的许多方法可以用于产生ALK4:ActRIIB异多聚体。例如，可以通过如下方法来构建非天然存在的二硫键：用含有游离硫醇的残基(如半胱氨酸)置换第一多肽(例如，ALK4多肽)上天然存在的氨基酸，使得该游离硫醇与第二多肽(例如，ActRIIB多肽)上的另一个含有硫醇的残基相互作用，使得在该第一与第二多肽之间形成二硫键。促进异多聚体形成的相互作用的另外的例子包括但不限于离子相互作用，如Kjaergaard等人,WO2007147901所述；静电转向效应，如Kannan等人,U.S.8,592,562所述；卷曲螺旋相互作用，如Christensen等人,U.S.20120302737所述；亮氨酸拉链，如Pack&Plueckthun,(1992)Biochemistry 31:1579-1584所述；以及螺旋-转角-螺旋基序，如Pack等人,(1993)Bio/Technology 11:1271-1277所述。各个区段的连接可以经由例如共价结合(如通过化学交联、肽接头、二硫桥等)或亲和相互作用(如通过亲和素-生物素或亮氨酸拉链技术)获得。
在某些方面，多聚化结构域可以包含相互作用对的一个组分。在一些实施方案中，本文公开的多肽可以形成包含与第二多肽共价或非共价缔合的第一多肽的蛋白质复合物，其中该第一多肽包含ALK4多肽的氨基酸序列和相互作用对的第一成员的氨基酸序列；并且该第二多肽包含ActRIIB多肽的氨基酸序列和相互作用对的第二成员的氨基酸序列。该相互作用对可以是相互作用以形成复合物(特别是异二聚体复合物)的任何两个多肽序列，但是可操作的实施方案也可以使用可形成同二聚体复合物的相互作用对。相互作用对的一个成员可以与如本文所述的ALK4或ActRIIB多肽融合，所述ALK4或ActRIIB多肽包括例如如下多肽序列，所述多肽序列包含与SEQ ID NO:2、3、5、6、10和20中的任何一个的序列至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，基本上由所述氨基酸序列组成，或由所述氨基酸序列组成。可以选择相互作用对以赋予改善的特性/活性(如增加的血清半衰期)或充当衔接子，在所述衔接子上附接另一个部分以提供改善的特性/活性。例如，聚乙二醇部分可以附接至相互作用对的一个或两个组分，以提供改善的特性/活性如改善的血清半衰期。
相互作用对的第一和第二成员可以是不对称对，这意味着该对的成员优先彼此缔合而不是自我缔合。因此，不对称相互作用对的第一和第二成员可以缔合以形成异二聚体复合物(参见例如图6)。可替代地，该相互作用对可以是非引导的，这意味着该对的成员可以彼此缔合或自我缔合而没有实质的偏好，因此可以具有相同或不同的氨基酸序列。因此，非引导相互作用对的第一和第二成员可以缔合以形成同二聚体复合物或异二聚体复合物。任选地，该相互作用对(例如，不对称对或非引导相互作用对)的第一成员与该相互作用对的第二成员共价缔合。任选地，该相互作用对(例如，不对称对或非引导相互作用对)的第一成员与该相互作用对的第二成员非共价缔合。
作为具体例子，本公开文本提供了融合蛋白，其包含与包含免疫球蛋白恒定结构域(如免疫球蛋白的CH1、CH2或CH3结构域或Fc结构域)的多肽融合的ALK4或ActRIIB。本文提供了来源于人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的Fc结构域。已知降低CDC或ADCC活性的其他突变，并且总体上这些变体中的任何一种都包含在本公开文本中并且可以用作本公开文本的异多聚体复合物的有利组分。任选地，SEQ ID NO:31的IgG1 Fc结构域具有在残基如Asp-265、Lys-322和Asn-434(根据相应的全长IgG1编号)处的一个或多个突变。在某些情况下，具有这些突变中的一个或多个(例如，Asp-265突变)的突变Fc结构域相对于野生型Fc结构域具有降低的与Fcγ受体结合的能力。在其他情况下，具有这些突变中的一个或多个(例如，Asn-434突变)的突变Fc结构域相对于野生型Fc结构域具有增加的与MHC I类相关Fc受体(FcRN)结合的能力。
可用于人IgG1的Fc部分(G1Fc)的天然氨基酸序列的例子如下所示(SEQ ID NO:31)。虚下划线表示铰链区，并且实下划线表示具有天然存在的变体的位置。部分地，本公开文本提供了多肽，其包含与SEQ ID NO:31具有70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，基本上由所述氨基酸序列组成，或由所述氨基酸序列组成。根据SEQ ID NO:31中使用的编号系统，G1Fc中天然存在的变体将包括E134D和M136L(参见Uniprot P01857)。
可用于人IgG2的Fc部分(G2Fc)的天然氨基酸序列的例子如下所示(SEQ ID NO:32)。虚下划线表示铰链区，并且双下划线表示在该序列中存在数据库冲突的位置(根据UniProt P01859)。部分地，本公开文本提供了多肽，其包含与SEQ ID NO:32具有70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，基本上由所述氨基酸序列组成，或由所述氨基酸序列组成。
可用于人IgG3的Fc部分(G3Fc)的氨基酸序列的两个例子如下所示。G3Fc中的铰链区可以是其他Fc链中的最多四倍，并且含有三个相同的15个残基的区段，其前面是相似的17个残基的区段。如下所示的第一G3Fc序列(SEQ ID NO:33)含有由单个15个残基的区段组成的短铰链区，而第二G3Fc序列(SEQ ID NO:34)含有全长铰链区。在每种情况下，虚下划线表示铰链区，并且实下划线表示具有天然存在的变体的位置(根据UniProt P01859)。部分地，本公开文本提供了多肽，其包含与SEQ ID NO:33和34具有70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，基本上由所述氨基酸序列组成，或由所述氨基酸序列组成。
当转化为SEQ ID NO:33中使用的编号系统时，G3Fc中天然存在的变体(例如，参见Uniprot P01860)包括E68Q、P76L、E79Q、Y81F、D97N、N100D、T124A、S169N、S169del、F221Y，并且本公开文本提供了包含含有这些变异中的一个或多个的G3Fc结构域的融合蛋白。另外，人免疫球蛋白IgG3基因(IGHG3)显示出以不同铰链长度为特征的结构多态性[参见Uniprot P01859]。具体地，变体WIS缺少大部分V区和所有CH1区。除了通常存在于铰链区中的11之外，它还在位置7处具有额外的链间二硫键。变体ZUC缺少大部分V区、所有CH1区和部分铰链。变体OMM可以代表等位基因形式或另一个γ链亚类。本公开文本提供了另外的融合蛋白，其包含含有这些变体中的一种或多种的G3Fc结构域。
可用于人IgG4的Fc部分(G4Fc)的天然氨基酸序列的例子如下所示(SEQ ID NO:35)。虚下划线表示铰链区。部分地，本公开文本提供了多肽，其包含与SEQ ID NO:35具有70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，基本上由所述氨基酸序列组成，或由所述氨基酸序列组成。
关于G1Fc序列(SEQ ID NO:31)本文提出了Fc结构域中的多种工程化突变，并且G2Fc、G3Fc和G4Fc中的类似突变可以来源于在图3中它们与G1Fc的比对。由于不相等的铰链长度，基于同种型比对(图3)的类似Fc位置在SEQ ID NO:31、32、33、34和35中具有不同的氨基酸编号。还可以理解，由铰链、CH2和CH3区组成的免疫球蛋白序列(例如，SEQ ID NO:31、32、33、34和35)中的给定氨基酸位置将通过与当编号涵盖如在Uniprot数据库中的整个IgG1重链恒定结构域(由CH1、铰链、CH2和CH3区组成)时的相同位置不同的编号来鉴定。例如，人G1Fc序列(SEQ ID NO:31)、人IgG1重链恒定结构域(Uniprot P01857)和人IgG1重链中选择的CH3位置之间的对应关系如下。
从单一细胞系大规模生产基于不对称免疫球蛋白的蛋白质中出现的问题被称为“链缔合问题”。正如在双特异性抗体的生产中突出地面临的那样，链缔合问题涉及从多种组合中有效生产所需多链蛋白的挑战，所述多种组合在单一细胞系中产生不同的重链和/或轻链时固有地产生[Klein等人(2012)mAbs 4:653-663]。当在同一细胞中产生两种不同的重链和两种不同的轻链时，这个问题最为严重，在这种情况下，当通常只需要一种时，总共有16种可能的链组合(但其中一些是相同的)。然而，相同的原理解释了仅包含两种不同(不对称)重链的所需多链融合蛋白的降低的产量。
本领域已知多种方法，其在单一细胞系中增加所需的含Fc融合多肽链的配对以在可接受的产量下产生优选的不对称融合蛋白[Klein等人(2012)mAbs 4:653-663；和Spiess等人(2015)Molecular Immunology 67(2A):95-106]。获得所需的含Fc链的配对的方法包括但不限于基于电荷的配对(静电转向)、“杵臼结构(knobs-into-holes)”空间配对、SEED体配对和基于亮氨酸拉链的配对[Ridgway等人(1996)Protein Eng 9:617-621；Merchant等人(1998)Nat Biotech 16:677-681；Davis等人(2010)Protein Eng Des Sel 23:195-202；Gunasekaran等人(2010)；285:19637-19646；Wranik等人(2012)J Biol Chem 287:43331-43339；US 5932448；WO 1993/011162；WO 2009/089004和WO 2011/034605]。如本文所述，这些方法可以用于产生ALK4-Fc:ActRIIB-Fc异多聚体复合物。参见图6。
例如，可促进特定多肽之间相互作用的一种手段是通过工程化突起入腔(protuberance-into-cavity)(杵臼结构)互补区域，如Arathoon等人,U.S.7,183,076和Carter等人,U.S.5,731,168中所述。通过用较大侧链(例如，酪氨酸或色氨酸)从第一多肽(例如，第一相互作用对)的界面置换小氨基酸侧链来构建“突起”。通过用较小的氨基酸侧链(例如，丙氨酸或苏氨酸)置换大氨基酸侧链，任选地在第二多肽(例如，第二相互作用对)的界面上产生与该突起具有相同或相似大小的互补“腔”。当在第一或第二多肽的界面处存在适当定位和尺寸的突起或腔时，仅需要在相邻界面处分别工程化相应的腔或突起。
在中性pH(7.0)下，天冬氨酸和谷氨酸带负电，并且赖氨酸、精氨酸和组氨酸带正电。这些带电的残基可以用于促进异二聚体形成，并且同时阻碍同二聚体形成。在相反的电荷之间发生吸引的相互作用，并且在相同电荷之间发生排斥的相互作用。部分地，本文公开的蛋白质复合物利用吸引的相互作用来促进异多聚体形成(例如，异二聚体形成)，并且任选地通过带电界面残基的定点诱变利用排斥的相互作用来阻碍同二聚体形成(例如，同二聚体形成)。
例如，IgG1CH3结构域界面包含涉及结构域之间相互作用的四个独特的电荷残基对：Asp356-Lys439’、Glu357-Lys370’、Lys392-Asp399’和Asp399-Lys409’[第二链中的残基编号用(’)表示]。应当注意，本文用于命名IgG1CH3结构域中残基的编号方案符合Kabat的EU编号方案。由于CH3-CH3结构域相互作用中存在2倍对称性，因此每种独特的相互作用将在该结构中表示两次(例如，Asp-399-Lys409’和Lys409-Asp399’)。在野生型序列中，K409-D399’有利于异二聚体和同二聚体的形成。在第一链中转换电荷极性(例如，K409E；正电至负电)的单个突变导致对于形成第一链同二聚体不利的相互作用。由于在相同电荷之间发生的排斥相互作用(负-负；K409E-D399’和D399-K409E’)而产生了不利的相互作用。在第二链中转换电荷极性(D399K’；负电至正电)的类似突变导致对于第二链同二聚体形成不利的相互作用(K409’-D399K’和D399K-K409’)。但是，与此同时，这两个突变(K409E和D399K’)导致对于异二聚体形成有利的相互作用(K409E-D399K’和D399-K409’)。
通过另外的带电残基的突变可以进一步增强对异二聚体形成和同二聚体阻遏的静电转向效应，所述另外的带电残基可以与第二链中的带相反电荷的残基(包括例如Arg355和Lys360)配对或不配对。下表列出了可单独或组合使用以增强ALK4:ActRIIB异多聚体形成的可能的电荷变化突变。
在一些实施方案中，将构成本申请的融合蛋白中的CH3-CH3界面的一个或多个残基用带电的氨基酸置换，使得相互作用变得静电不利。例如，将界面中的带正电的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸或组氨酸)用带负电的氨基酸(例如，天冬氨酸或谷氨酸)置换。可替代地，或与上述取代组合，将界面中的带负电的氨基酸用带正电的氨基酸置换。在某些实施方案中，将该氨基酸用具有所需电荷特征的非天然存在的氨基酸置换。应当注意，使带负电的残基(Asp或Glu)突变为His将导致侧链体积增加，这可能引起空间问题。此外，His质子供体和受体形式取决于局部环境。这些问题应在设计策略中加以考虑。因为界面残基在人和小鼠IgG亚类中是高度保守的，所以本文公开的静电转向效应可以应用于人和小鼠IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。该策略还可以扩展到在CH3结构域界面处将不带电的残基修饰为带电残基。
部分地，本公开文本使用基于电荷配对(静电转向)工程化为互补的Fc序列提供了所需的不对称的含Fc多肽链的配对。具有静电互补性的一对Fc序列中的一个可以在有或没有任选接头的情况下任意地与构建体的ALK4或ActRIIB多肽融合，以产生ALK4:ActRIIB异多聚体。该单链可以在选择的细胞中与互补于第一Fc的Fc序列共表达，以有利于产生所需的多链构建体(例如，ALK4:ActRIIB异多聚体)。在基于静电转向的该例子中，SEQ ID NO:23[人G1Fc(E134K/D177K)]和SEQ ID NO:24[人G1Fc(K170D/K187D)]是互补Fc序列的例子，其中工程化的氨基酸取代是加双下划线的，并且该构建体的TGF-β超家族I型或II型受体多肽可以与SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24融合，但不能与两者融合。鉴于天然hG1Fc、天然hG2Fc、天然hG3Fc和天然hG4Fc之间的高度氨基酸序列同一性，可以理解hG2Fc、hG3Fc或hG4Fc(参见图3)中相应位置处的氨基酸取代将产生互补Fc对，可以使用它们来代替下面的互补hG1Fc对(SEQ ID NO:23和24)。
部分地，本公开文本使用针对空间互补性工程化的Fc序列提供了所需的不对称的含Fc多肽链的配对。部分地，本公开文本提供了杵臼结构配对作为空间互补性的一个例子。具有空间互补性的一对Fc序列中的一个可以在有或没有任选接头的情况下任意地与构建体的ALK4或ActRIIB多肽融合，以产生ALK4:ActRIIB异多聚体。该单链可以在选择的细胞中与互补于第一Fc的Fc序列共表达，以有利于产生所需的多链构建体。在基于杵臼结构配对的该例子中，SEQ ID NO:25[人G1Fc(T144Y)]和SEQ ID NO:26[人G1Fc(Y185T)]是互补Fc序列的例子，其中工程化的氨基酸取代是加双下划线的，并且该构建体的ALK4或ActRIIB多肽可以与SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:26融合，但不能与两者融合。鉴于天然hG1Fc、天然hG2Fc、天然hG3Fc和天然hG4Fc之间的高度氨基酸序列同一性，可以理解hG2Fc、hG3Fc或hG4Fc(参见图3)中相应位置处的氨基酸取代将产生互补Fc对，可以使用它们来代替下面的互补hG1Fc对(SEQ ID NO:25和26)。
在SEQ ID NO:27[hG1Fc(S132C/T144W)]和SEQ ID NO:28[hG1Fc(Y127C/T144S/L146A/Y185V)]中公开了基于与工程化二硫键结合的杵臼结构配对的Fc互补性的例子。这些序列中的工程化的氨基酸取代是加双下划线的，并且该构建体的TGF-β超家族I型或II型多肽可以与SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:28融合，但不能与两者融合。鉴于天然hG1Fc、天然hG2Fc、天然hG3Fc和天然hG4Fc之间的高度氨基酸序列同一性，可以理解hG2Fc、hG3Fc或hG4Fc(参见图3)中相应位置处的氨基酸取代将产生互补Fc对，可以使用它们来代替下面的互补hG1Fc对(SEQ ID NO:27和28)。
部分地，本公开文本使用工程化为产生人IgG和IgA CH3结构域的交错β-链区段的Fc序列提供了所需的不对称的含Fc多肽链的配对。此类方法包括使用链交换工程化结构域(SEED)CH3异二聚体，从而允许SEED体融合蛋白的形成[Davis等人(2010)Protein EngDesign Sel 23:195-202]。具有SEED体互补性的一对Fc序列中的一个可以在有或没有任选接头的情况下任意地与构建体的ALK4或ActRIIB融合，以产生ALK4:ActRIIB融合多肽。该单链可以在选择的细胞中与互补于第一Fc的Fc序列共表达，以有利于产生所需的多链构建体。在基于SEED体(Sb)配对的该例子中，SEQ ID NO:29[hG1Fc(SbAG)]和SEQ ID NO:30[hG1Fc(SbGA)]是互补IgG Fc序列的例子，其中来自IgA Fc的工程化的氨基酸取代是加双下划线的，并且该构建体的ALK4或ActRIIB多肽可以与SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:30融合，但不能与两者融合。鉴于天然hG1Fc、天然hG2Fc、天然hG3Fc和天然hG4Fc之间的高度氨基酸序列同一性，可以理解hG1Fc、hG2Fc、hG3Fc或hG4Fc(参见图3)中相应位置处的氨基酸取代将产生Fc单体，它可以用于下面的互补IgG-IgA对(SEQ ID NO:29和30)。
部分地，本公开文本提供了所需的不对称的含Fc多肽链的配对，所述多肽链具有在Fc CH3结构域的C末端处附接的可切割亮氨酸拉链结构域。亮氨酸拉链的附接足以引起异二聚体抗体重链的优先组装[Wranik等人(2012)J Biol Chem 287:43331-43339]。如本文所公开的，附接至亮氨酸拉链形成链的一对Fc序列中的一个可以在有或没有任选接头的情况下任意地与构建体的ALK4或ActRIIB多肽融合，以产生ALK4或ActRIIB融合多肽。该单链可以在选择的细胞中与附接至互补亮氨酸拉链形成链的Fc序列共表达，以有利于产生所需的多链构建体。用纯化后的细菌内切蛋白酶Lys-C对构建体进行蛋白质水解消化可以释放亮氨酸拉链结构域，从而产生Fc构建体，其结构与天然Fc的结构相同。在基于亮氨酸拉链配对的该例子中，SEQ ID NO:36[hG1Fc-Ap1(酸性)]和SEQ ID NO:37[hG1Fc-Bp1(碱性)]是互补IgG Fc序列的例子，其中工程化的互补亮氨酸拉链序列是加下划线的，并且该构建体的ALK4或ActRIIB多肽可以与SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:37融合，但不能与两者融合。鉴于天然hG1Fc、天然hG2Fc、天然hG3Fc和天然hG4Fc之间的高度氨基酸序列同一性，可以理解在有或没有任选接头的情况下亮氨酸拉链形成序列附接至hG1Fc、hG2Fc、hG3Fc或hG4Fc(参见图3)将产生Fc单体，它可以用于下面的互补亮氨酸拉链形成对(SEQ ID NO:36和37)。
在某些方面，本公开文本涉及包含改变ALK4多肽的等电点(pI)的一个或多个氨基酸修饰的ALK4多肽(例如，ALK4-Fc融合蛋白)和/或包含改变ActRIIB多肽的等电点的一个或多个氨基酸修饰的ActRIIB多肽(例如，ActRIIB-Fc融合蛋白)。在一些实施方案中，选择具有高于约5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5或9.0的pI值的一个或多个候选结构域用于构建完整的多结构域蛋白。在其他实施方案中，选择具有小于约9.0、8.5、8.0、7.5、7.0、6.5、6.0、5.5或5.0的pI值的一个或多个候选结构域用于构建完整的多结构域蛋白。本领域技术人员将理解，单一蛋白质将具有多种电荷形式。不希望受任何特定理论的束缚，蛋白质的电荷可以通过许多不同的机制修饰，包括但不限于氨基酸取代、阳离子化、脱氨基化、羧基末端氨基酸异质性、磷酸化和糖基化。
蛋白质的pI可以通过多种方法测定，包括但不限于等电聚焦和多种计算机算法(参见例如Bjellqvist等人,1993,Electrophoresis 14:1023)。在一个实施方案中，使用具有多温冷藏浴再循环单元和EPS 3501XL电源的Pharmacia Biotech Multiphor 2电泳系统测定pI。将预制的两性电解质凝胶(例如，Amersham Biosciences，pI范围2.5-10)加载蛋白质样品。广泛范围的pI标记标准品(例如，Amersham，pI范围3-10，8.mu.L)用于测定蛋白质的相对pI。电泳例如在1500V、50mA下进行105分钟。使用例如用纯化水稀释至1x的Sigma固定溶液(5x)将凝胶固定。例如，使用Simply Blue染色剂(Invitrogen)在室温下进行染色。例如，使用由25％乙醇、8％乙酸和67％纯化水组成的溶液进行脱色。使用例如Bio-Rad密度计相对于标准品的校准曲线测定等电点。该一个或多个度量可以进一步包括表征在一个或多个不同条件下的结构域稳定性的度量，所述一个或多个不同条件选自不同的pH值、不同的温度、不同的剪切应力和不同的冷冻/解冻循环。
部分地，本公开文本提供了通过上述方法与促进所需异聚物质纯化的Fc结构域中的另外的突变的组合进行的所需的不对称的含Fc多肽链的配对。一个例子是基于如SEQ IDNO:27-28中公开的与工程化二硫键，加上一个含Fc多肽链中两个带负电氨基酸(天冬氨酸或谷氨酸)和互补的含Fc多肽链(SEQ ID NO:66-67)中两个带正电氨基酸(例如，丙氨酸)的另外取代相结合的杵臼结构配对的Fc结构域的互补性。这四个氨基酸取代促进基于等电点或净分子电荷的差异从异质多肽混合物选择性地纯化所需的异聚融合蛋白。这些序列中的工程化的氨基酸取代是在下面加双下划线的，并且构建体的ALK4或ActRIIB多肽可以与SEQID NO:66或SEQ ID NO:67融合，但不能与两者融合。鉴于天然hG1Fc、天然hG2Fc、天然hG3Fc和天然hG4Fc之间的高度氨基酸序列同一性，可以理解hG2Fc、hG3Fc或hG4Fc(参见图3)中相应位置处的氨基酸取代将产生互补Fc对，可以使用它们来代替下面的互补hG1Fc对(SEQ IDNO:66-67)。
另一个例子涉及基于如SEQ ID NO:27-28中公开的与工程化二硫键，加上一个含Fc多肽链(SEQ ID NO:68)中位置213处的组氨酸到精氨酸取代相结合的杵臼结构配对的Fc结构域的互补性。该取代(在Kabat等人的编号系统中表示为H435R)促进基于对蛋白质A的亲和力的差异将所需的异聚体与不需要的同二聚体分离。工程化的氨基酸取代用双下划线表示，并且构建体的ALK4或ActRIIB多肽可以与SEQ ID NO:68或SEQ ID NO:28融合，但不能与两者融合。鉴于天然hG1Fc、天然hG2Fc、天然hG3Fc和天然hG4Fc之间的高度氨基酸序列同一性，可以理解hG2Fc、hG3Fc或hG4Fc(参见图3)中相应位置处的氨基酸取代将产生互补Fc对，可以使用它们来代替SEQ ID NO:68(下文)和SEQ ID NO:28的互补hG1Fc对。
以上关于G1Fc序列(SEQ ID NO:31)提供了Fc结构域中的多种工程化突变。G2Fc、G3Fc和G4Fc中的类似突变可以来源于在图3中它们与G1Fc的比对。由于不相等的铰链长度，基于同种型比对(图3)的类似Fc位置在SEQ ID NO:31、32、33、34和35中具有不同的氨基酸编号，如下表中所总结。
应当理解，融合蛋白(例如，免疫球蛋白Fc融合蛋白)的不同元件能以与所需功能一致的任何方式排列。例如，ALK4和/或ActRIIB多肽结构域可以位于异源结构域的C末端，或者可替代地异源结构域可以位于ALK4和/或ActRIIB多肽结构域的C末端。ALK4和/或ActRIIB多肽结构域和异源结构域不必在融合蛋白中相邻，并且另外的结构域或氨基酸序列可以被包含在任一个结构域的C末端或N末端或这些结构域之间。
例如，ALK4和/或ActRIIB受体融合蛋白可以包含如式A-B-C中所示的氨基酸序列。B部分对应于ALK4或ActRIIB多肽结构域。A和C部分可以独立地是零个、一个或多于一个氨基酸，并且A和C部分在存在的情况下对于B均是异源的。A和/或C部分可以经由接头序列附接至B部分。接头可以富含甘氨酸(例如，2-10、2-5、2-4、2-3个甘氨酸残基)或甘氨酸和脯氨酸残基，并且可以例如含有苏氨酸/丝氨酸和甘氨酸的单个序列或苏氨酸/丝氨酸和/或甘氨酸的重复序列，例如GGG(SEQ ID NO:13)、GGGG(SEQ ID NO:14)、TGGGG(SEQ ID NO:15)、SGGGG(SEQ ID NO:16)、TGGG(SEQ ID NO:17)、SGGG(SEQ ID NO:18)或GGGGS(SEQ ID NO:58)单个序列或重复序列。在某些实施方案中，ALK4和/或ActRIIB融合蛋白包含如式A-B-C中所示的氨基酸序列，其中A是前导(信号)序列，B由ALK4和/或ActRIIB多肽结构域组成，并且C是增强体内稳定性、体内半衰期、吸收/给予、组织定位或分布、蛋白质复合物的形成和/或纯化中的一种或多种的多肽部分。在某些实施方案中，ALK4和/或ActRIIB融合蛋白包含如式A-B-C中所示的氨基酸序列，其中A是TPA前导序列，B由ALK4或ActRIIB受体多肽结构域组成，并且C是免疫球蛋白Fc结构域。优选的融合蛋白包含SEQ ID NO:39、41、42、44、45、46、47、48、70、72、74、76、78和80中的任何一个中所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体进一步包含一个或多个异源部分(结构域)以赋予所需特性。例如，一些融合结构域特别适用于通过亲和色谱法分离融合蛋白。此类融合结构域的公知的例子包括但不限于多组氨酸、Glu-Glu、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、硫氧还蛋白、蛋白质A、蛋白质G、免疫球蛋白重链恒定区(Fc)、麦芽糖结合蛋白(MBP)或人血清白蛋白。为了亲和纯化的目的，使用亲和色谱法的相关基质，如谷胱甘肽、淀粉酶和镍或钴缀合的树脂。此类基质中有许多能以“试剂盒”形式获得，如可与(HIS6)融合配偶体一起使用的Pharmacia GST纯化系统和QIAexpressTM系统(Qiagen)。作为另一个例子，可以选择融合结构域以促进检测配体捕获多肽。此类检测结构域的例子包括多种荧光蛋白(例如，GFP)以及“表位标签”，所述表位标签通常是可获得特异性抗体的短肽序列。可容易获得特异性单克隆抗体的公知的表位标签包括FLAG、流感病毒血凝素(HA)和c-myc标签。在一些情况下，融合结构域具有如用于因子Xa或凝血酶的蛋白酶切割位点，其允许相关蛋白酶部分地消化融合蛋白，从而从中释放重组蛋白。然后可以通过随后的色谱分离从融合结构域分离释放的蛋白质。
在某些实施方案中，ALK4和/或ActRIIB多肽可以含有能够稳定多肽的一个或多个修饰。例如，此类修饰增强多肽的体外半衰期，增强多肽的循环半衰期和/或减少多肽的蛋白质水解降解。此类稳定化修饰包括但不限于融合蛋白(包括例如包含ALK4和/或ActRIIB多肽结构域和稳定结构域的融合蛋白)、糖基化位点的修饰(包括例如将糖基化位点添加至本公开文本的多肽)以及碳水化合物部分的修饰(包括例如从本公开文本的多肽去除碳水化合物部分)。如本文所用，术语“稳定结构域”不仅指在融合蛋白情况下的融合结构域(例如，免疫球蛋白Fc结构域)，而且包括非蛋白质修饰如碳水化合物部分或非蛋白质部分如聚乙二醇。
在优选的实施方案中，根据本文所述的方法使用的ALK4:ActRIIB异多聚体是分离的复合物。如本文所用，分离的蛋白质(或蛋白质复合物)或多肽(或多肽复合物)是已经与其天然环境的组分分离的蛋白质或多肽。在一些实施方案中，将本公开文本的异多聚体纯化至大于95％、96％、97％、98％或99％纯度，如通过例如电泳(例如，SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或色谱法(例如，离子交换或反相HPLC)所测定的。用于评估抗体纯度的方法是本领域公知的[Flatman等人,(2007)J.Chromatogr.B848:79-87]。在一些实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体制剂基本上不含ALK4和/或ActRIIB同多聚体。例如，在一些实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体制剂包含小于约10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或小于1％的ALK4同多聚体。在一些实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体制剂包含小于约10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或小于1％的ActRIIB同多聚体。在一些实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体制剂包含小于约10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或小于1％的ALK4同多聚体和小于约10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或小于1％的ActRIIB同多聚体。
在某些实施方案中，本公开文本的ALK4和/或ActRIIB多肽以及包含ALK4和/或ActRIIB多肽的异多聚体可以通过多种本领域已知的技术产生。例如，多肽可以使用标准蛋白质化学技术合成，如在Bodansky,M.Principles of Peptide Synthesis,SpringerVerlag,Berlin(1993)和Grant G.A.(编辑),Synthetic Peptides:A User's Guide,W.H.Freeman and Company,纽约(1992)中描述的标准蛋白质化学技术。另外，自动化肽合成仪是可商购的(Advanced ChemTech Model 396；Milligen/Biosearch 9600)。可替代地，多肽(包括其片段或变体)可以使用如本领域公知的多种表达系统[大肠杆菌、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、COS细胞、杆状病毒]重组地产生。在进一步的实施方案中，修饰的或未修饰的多肽可以通过使用例如蛋白酶(例如，胰蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶或成对碱性氨基酸转化酶(PACE))消化重组产生的全长ALK4和/或ActRIIB多肽来产生。计算机分析(使用可商购的软件，例如MacVector、Omega、PCGene，Molecular Simulation,Inc.)可以用于鉴定蛋白质水解切割位点。
3.编码ALK4和/或ActRIIB多肽的核酸
在某些实施方案中，本公开文本提供了编码本文公开的ALK4和/或ActRIIB多肽(包括其片段、功能变体和融合蛋白)的分离的和/或重组的核酸。例如，SEQ ID NO:11编码天然存在的人ALK4前体多肽，而SEQ ID NO:12编码ALK4的加工的细胞外结构域。主题核酸可以是单链或双链的。此类核酸可以是DNA或RNA分子。这些核酸可以用于例如制备如本文所述的ALK4:ActRIIB异多聚体的方法中。
如本文所用，一种或多种分离的核酸是指已经与其天然环境的组分分离的核酸分子。分离的核酸包括细胞中含有的核酸分子，所述细胞通常含有该核酸分子，但该核酸分子存在于染色体外或存在于不同于其天然染色体位置的染色体位置。
在某些实施方案中，编码本公开文本的ALK4和/或ActRIIB多肽的核酸应理解为包括SEQ ID NO:7、8、11、12、21、22、40、43、71、73、75、77、79、81、82或83中的任何一个及其变体。变体核苷酸序列包括因一个或多个核苷酸取代、添加或缺失而不同的序列(包括等位基因变体)，并且因此将包括与SEQ ID NO:7、8、11、12、21、22、40、43、71、73、75、77、79、81、82或83中的任何一个中指定的核苷酸序列不同的编码序列。
在某些实施方案中，本公开文本的ALK4和/或ActRIIB多肽由分离的或重组的核酸序列编码，所述分离的或重组的核酸序列包含与SEQ ID NO:7、8、11、12、21、22、40、43、71、73、75、77、79、81、82或83至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列，基本上由所述序列组成，或由所述序列组成。本领域普通技术人员将理解，如下核酸序列也在本公开文本的范围内，所述核酸序列包含互补于与SEQ ID NO:7、8、11、12、21、22、40、43、71、73、75、77、79、81、82或83至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列的序列，基本上由所述序列组成，或由所述序列组成。在进一步的实施方案中，本公开文本的核酸序列可以与异源核苷酸序列分离、重组和/或融合，或者在DNA文库中。
在其他实施方案中，本公开文本的核酸还包括核苷酸序列，所述核苷酸序列在严格条件下与SEQ ID NO:7、8、11、12、21、22、40、43、71、73、75、77、79、81、82或83中指定的核苷酸序列，SEQ ID NO:7、8、11、12、21、22、40、43、71、73、75、77、79、81、82或83的互补序列或其片段杂交。本领域普通技术人员将容易理解，可以改变促进DNA杂交的适当的严格条件。例如，可以在约45℃下在6.0x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)下杂交，接着在50℃下用2.0x SSC洗涤。例如，洗涤步骤中的盐浓度可以从50℃下约2.0x SSC的低严格性到50℃下约0.2x SSC的高严格性进行选择。另外，洗涤步骤中的温度可以从室温约22℃下的低严格条件增加至约65℃下的高严格条件。温度和盐均可以变化，或者温度或盐浓度可以保持不变，而另一个变量变化。在一个实施方案中，本公开文本提供了核酸，所述核酸在室温下在6x SSC的低严格条件下杂交，接着在室温下在2x SSC下洗涤。
与如SEQ ID NO:7、8、11、12、21、22、40、43、71、73、75、77、79、81、82或83中所示的核酸在遗传密码的简并性方面不同的分离的核酸也在本公开文本的范围内。例如，许多氨基酸由多于一个的三联体指定。指定相同氨基酸的密码子或同义密码子(例如，CAU和CAC是组氨酸的同义密码子)可以导致“沉默”突变，其不影响蛋白质的氨基酸序列。然而，预期在哺乳动物细胞中存在确实导致主题蛋白质的氨基酸序列变化的DNA序列多态性。本领域技术人员将理解，由于天然等位基因变异，编码特定蛋白质的核酸的一个或多个核苷酸(高达约3％-5％的核苷酸)的这些变异可以存在于给定物种的个体中。任何和所有此类核苷酸变异和所得氨基酸多态性都在本公开文本的范围内。
在某些实施方案中，本公开文本的重组核酸可以与表达构建体中的一个或多个调节核苷酸序列可操作地连接。调节核苷酸序列通常适合于用于表达的宿主细胞。本领域已知多种宿主细胞的多种类型的适当的表达载体和合适的调节序列。通常，所述一个或多个调节核苷酸序列可以包括但不限于启动子序列、前导序列或信号序列、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列以及增强子或激活子序列。本公开文本考虑了如本领域已知的组成型或诱导型启动子。启动子可以是天然存在的启动子或结合多于一种启动子的元件的杂合启动子。表达构建体可以存在于细胞中的附加体如质粒上，或者该表达构建体可以插入染色体中。在一些实施方案中，表达载体含有可选择的标记基因以允许选择转化的宿主细胞。可选择的标记基因是本领域公知的，并且随着使用的宿主细胞而变化。
在某些方面，主题核酸在包含编码ALK4和/或ActRIIB多肽的核苷酸序列的表达载体中提供，并且与至少一个调节序列可操作地连接。调节序列是本领域公认的，并且被选择用于指导ALK4和/或ActRIIB多肽的表达。因此，术语调节序列包括启动子、增强子和其他表达控制元件。示例性调节序列描述于Goeddel；Gene Expression Technology:Methods inEnzymology,Academic Press,San Diego,CA(1990)。例如，在与其可操作地连接时控制DNA序列表达的多种表达控制序列中的任何一种都可以用于这些载体中以表达编码ALK4和/或ActRIIB多肽的DNA序列。此类有用的表达控制序列包括例如SV40的早期和晚期启动子、tet启动子、腺病毒或巨细胞病毒立即早期启动子、RSV启动子、lac系统、trp系统、TAC或TRC系统、T7启动子(其表达由T7 RNA聚合酶指导)、噬菌体λ的主要操纵子和启动子区域、fd外壳蛋白的控制区域、3-磷酸甘油酸激酶或其他糖酵解酶的启动子、酸性磷酸酶的启动子(例如，Pho5)、酵母α-交配因子的启动子、杆状病毒系统的多面体启动子和已知控制原核或真核细胞或其病毒的基因表达的其他序列及其各种组合。应当理解，表达载体的设计可以取决于诸如待转化的宿主细胞和/或期望表达的蛋白质类型的选择等因素。此外，还应考虑载体的拷贝数、控制该拷贝数的能力以及由该载体编码的任何其他蛋白质如抗生素标记物的表达。
通过将克隆的基因或其一部分连接至适合于在原核细胞、真核细胞(酵母、禽类、昆虫或哺乳动物)或两者中表达的载体中，可以产生本公开文本的重组核酸。用于产生重组ALK4和/或ActRIIB多肽的表达运载体包括质粒和其他载体。例如，合适的载体包括用于在原核细胞(如大肠杆菌)中表达的以下类型的质粒：pBR322衍生的质粒、pEMBL衍生的质粒、pEX衍生的质粒、pBTac衍生的质粒和pUC衍生的质粒。
一些哺乳动物表达载体含有促进载体在细菌中繁殖的原核序列以及在真核细胞中表达的一种或多种真核转录单位。pcDNAI/amp、pcDNAI/neo、pRc/CMV、pSV2gpt、pSV2neo、pSV2-dhfr、pTk2、pRSVneo、pMSG、pSVT7、pko-neo和pHyg衍生的载体是适合于转染真核细胞的哺乳动物表达载体的例子。将这些载体中的一些用来自细菌质粒(如pBR322)的序列修饰，以促进原核和真核细胞中的复制和药物抗性选择。可替代地，病毒如牛乳头瘤病毒(BPV-1)或爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barr virus)(pHEBo、pREP衍生的和p205)的衍生物可以用于在真核细胞中蛋白质的短暂表达。其他病毒(包括逆转录病毒)表达系统的例子可以在以下基因疗法递送系统的描述中找到。用于制备质粒和转化宿主生物的多种方法是本领域公知的。对于原核和真核细胞的其他合适的表达系统，以及一般的重组程序[Molecular Cloning A Laboratory Manual,第3版,Sambrook,Fritsch和Maniatis编辑Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001]。在一些情况下，可能需要通过使用杆状病毒表达系统来表达重组多肽。此类杆状病毒表达系统的例子包括pVL衍生的载体(如pVL1392、pVL1393和pVL941)、pAcUW衍生的载体(如pAcUW1)和pBlueBac衍生的载体(如含有β-gal的pBlueBac III)。
在优选的实施方案中，将设计载体用于在CHO细胞中产生主题ALK4和/或ActRIIB多肽，如Pcmv-Script载体(Stratagene，拉荷亚，加利福尼亚州)、pcDNA4载体(Invitrogen，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)和pCI-neo载体(Promega，麦迪逊，威斯康星州)。清楚的是，主题基因构建体可以用于在培养物中繁殖的细胞中引起主题ALK4和/或ActRIIB多肽的表达，例如以产生蛋白质(包括融合蛋白或变体蛋白)以供纯化。
本公开文本还涉及用重组基因转染的宿主细胞，所述重组基因包括主题ALK4和/或ActRIIB多肽中的一种或多种的编码序列。宿主细胞可以是任何原核或真核细胞。例如，ALK4和/或ActRIIB多肽可以在细菌细胞(如大肠杆菌)、昆虫细胞(例如，使用杆状病毒表达系统)、酵母或哺乳动物细胞[例如，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系]中表达。其他合适的宿主细胞是本领域技术人员已知的。
因此，本公开文本进一步涉及产生主题ALK4和/或ActRIIB多肽的方法。例如，可以在允许发生ALK4和/或ActRIIB多肽的表达的适当条件下培养用编码ALK4和/或ActRIIB多肽的表达载体转染的宿主细胞。多肽可以分泌并从细胞和含有该多肽的培养基的混合物中分离。可替代地，ALK4和/或ActRIIB多肽可以从获得自收获且裂解的细胞的细胞质或膜级分中分离。细胞培养物包括宿主细胞、培养基和其他副产物。用于细胞培养的合适培养基是本领域公知的。可以使用本领域已知的用于纯化蛋白质的技术从细胞培养基、宿主细胞或两者中分离主题多肽，所述技术包括离子交换色谱法、凝胶过滤色谱法、超滤、电泳、用对ALK4和/或ActRIIB多肽的特定表位具特异性的抗体进行免疫亲和纯化以及用结合与ALK4和/或ActRIIB多肽融合的结构域的药剂进行亲和纯化(例如，蛋白质A柱可以用于纯化ALK4-Fc和/或ActRIIB-Fc融合蛋白)。在一些实施方案中，ALK4和/或ActRIIB多肽是含有促进其纯化的结构域的融合蛋白。
在一些实施方案中，通过一系列柱色谱法步骤实现纯化，包括例如以任何顺序的以下步骤中的三步或更多步：蛋白质A色谱法、Q琼脂糖色谱法、苯基琼脂糖色谱法、尺寸排阻色谱法和阳离子交换色谱法。纯化可以用病毒过滤和缓冲液交换完成。ALK4和/或ActRIIB多肽及其融合蛋白可以纯化至如通过尺寸排阻色谱法测定的>90％、>95％、>96％、>98％或>99％的纯度，以及如通过SDS PAGE测定的>90％、>95％、>96％、>98％或>99％的纯度。目标纯度水平应该是足以在哺乳动物系统(特别是在非人灵长类动物、啮齿动物(小鼠)和人类)中获得期望的结果的纯度水平。
在另一个实施方案中，编码纯化前导序列(如重组ALK4和/或ActRIIB多肽的所需部分的N末端处的聚(His)/肠激酶切割位点序列)的融合基因可以允许通过使用Ni2+金属树脂的亲和色谱法纯化表达的融合蛋白。然后可以通过用肠激酶处理随后去除纯化前导序列以提供纯化的ALK4和/或ActRIIB多肽及其异多聚体[Hochuli等人(1987)J.Chromatography 411:177；和Janknecht等人(1991)PNAS USA 88:8972]。
用于制备融合基因的技术是公知的。实质上，编码不同多肽序列的各种DNA片段的连接按照常规技术进行，采用平端或错端末端进行连接，进行限制酶消化以提供适当的末端，适当地填充粘性末端，进行碱性磷酸酶处理以避免不期望的连接以及进行酶促连接。在另一个实施方案中，融合基因可以通过包括自动化DNA合成仪的常规技术合成。可替代地，可以使用锚定引物进行基因片段的PCR扩增，所述锚定引物在两个连续基因片段之间产生互补突出端，所述片段随后可以退火以产生嵌合基因序列。参见例如Current Protocolsin Molecular Biology,编辑Ausubel等人,John Wiley&Sons:1992。
4.示例性治疗用途
在某些实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体(例如，ALK4:ActRIIB异二聚体)可以用于治疗或预防与ALK4:ActRIIB结合配体的异常活性相关的疾病或病症。这些疾病、障碍或病症在本文中通常称为“ALK4:ActRIIB相关病症”或“ALK4:ActRIIB相关障碍”。在某些实施方案中，本公开文本提供了通过向有需要的个体给予治疗有效量的ALK4:ActRIIB异多聚体来治疗或预防个体的ALK4:ActRIIB相关病症的方法。术语“受试者”、“个体”或“患者”在整个说明书中是可互换的。本公开文本的任何ALK4:ActRIIB异多聚体可以潜在地单独或组合使用用于本文公开的治疗用途。这些方法特别针对哺乳动物的治疗性和预防性治疗，所述哺乳动物包括例如啮齿动物、灵长类动物和人类。
如本文所用，“预防”障碍或病症的治疗剂是指如下化合物，其在统计样品中相对于未治疗的对照样品降低了治疗的样品中该障碍或病症的发生，或相对于未治疗的对照样品延迟了该障碍或病症的一种或多种症状的发作或降低了其严重程度。如本文所用的术语“治疗”包括一旦确诊就改善或消除该病症。在任一种情况下，可以在医生或其他医疗服务人员提供的诊断和该治疗剂的给予的预期结果中辨别预防或治疗。
一般而言，通过以“有效量”给予本公开文本的ALK4:ActRIIB异多聚体来实现如本公开文本所述的疾病或病症的治疗或预防。药剂的有效量是指在必要的剂量和持续必要的时间段的情况下能有效实现所需的治疗或预防结果的量。本公开文本的药剂的“治疗有效量”可以根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重以及药剂在个体中引发所需反应的能力等因素而变化。“预防有效量”是指在必要的剂量和持续必要的时间段的情况下能有效实现所需预防结果的量。
天然存在的ALK4和ActRIIB受体-配体复合物在组织生长以及早期发育过程如正确形成多种结构中或在一种或多种发育后能力(包括性发育、垂体激素产生以及骨和软骨的产生)中发挥重要作用。因此，ALK4:ActRIIB相关病症包括但不限于异常组织生长和发育缺陷。另外，ALK4:ActRIIB相关病症包括但不限于细胞生长和分化的障碍，如炎症、变态反应、自身免疫疾病和肿瘤。
例如，ALK4:ActRIIB相关病症包括神经肌肉障碍(例如，肌营养不良和肌肉萎缩)、充血性阻塞性肺病(和与COPD相关的肌肉消耗)、肌肉消耗综合征、少肌症、恶病质、脂肪组织障碍(例如，肥胖症)、2型糖尿病(NIDDM，成人发病的糖尿病)和骨退行性疾病(例如，骨质疏松症)。其他示例性ALK4:ActRIIB相关病症包括肌肉退行性和神经肌肉障碍、组织修复(例如，伤口愈合)、神经退行性疾病(例如，肌萎缩侧索硬化)和免疫障碍(例如，与淋巴细胞的异常增殖或功能相关的障碍)。
在一些实施方案中，ALK4:ActRIIB相关病症是间质性肺病(例如，特发性肺纤维化)。在一些实施方案中，间质性肺病是肺纤维化。在一些实施方案中，间质性肺病由以下任何一种引起：矽肺、石棉沉滞症、铍中毒、过敏性肺炎、药物使用(例如，抗生素、化疗药物、抗心律失常药剂、他汀类药物)、系统性硬化、多肌炎、皮肌炎、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、感染(例如，非典型肺炎、肺孢子虫性肺炎、肺结核、沙眼衣原体和/或呼吸道合胞体病毒)、淋巴管性癌病、吸烟或发育障碍。在一些实施方案中，间质性肺病是特发性的(例如，结节病、特发性肺纤维化、阿曼-里什综合征(Hamman-Rich syndrome)和/或抗合成酶综合征)。在特定实施方案中，间质性肺病是特发性肺纤维化。在一些实施方案中，特发性肺纤维化的治疗与另外的治疗剂组合给予。在一些实施方案中，另外的治疗剂选自：吡非尼酮、N-乙酰半胱氨酸、泼尼松、硫唑嘌呤、尼达尼布(nintedanib)、其衍生物及其组合。
在某些实施方案中，本公开文本的ALK4:ActRIIB异多聚体可以用作肌营养不良治疗的一部分。术语“肌营养不良”是指以骨骼肌有时是心肌和呼吸肌的逐渐减弱和退化为特征的一组退行性肌肉疾病。肌营养不良是以进行性肌肉消耗和肌无力为特征的遗传病，其以肌肉的微观变化开始。当肌肉随着时间的推移而退化时，人的肌肉力量下降。可用包括主题TGF-β超家族异多聚体复合物的方案治疗的示例性肌营养不良包括：杜氏肌营养不良(DMD)、贝氏肌营养不良(BMD)、埃-德二氏肌营养不良(Emery-Dreifuss musculardystrophy，EDMD)、肢带型肌营养不良(LGMD)、面肩肱型肌营养不良(FSH或FSHD)(也称为兰迪二氏肌营养不良(Landouzy-Dejerine))、肌强直性营养不良(MMD；也称为施泰纳特病(Steinert's Disease))、眼咽肌营养不良(OPMD)、远端肌营养不良(DD)、先天性肌营养不良(CMD)。
杜氏肌营养不良(DMD)首先由法国神经学家Guillaume Benjamin AmandDuchenne在19世纪60年代描述。贝氏肌营养不良(BMD)以德国医生Peter Emil Becker的名字命名，他在20世纪50年代首次描述了DMD的该变体。DMD是男性中最常见的遗传病之一，每3,500名男孩中累及一名。当位于X染色体短臂上的肌营养不良蛋白基因有缺陷时，发生DMD。由于男性只携带X染色体的一个拷贝，因此他们只有肌营养不良蛋白基因的一个拷贝。在没有肌营养不良蛋白的情况下，肌肉在收缩和放松的循环过程中容易受损。虽然在该疾病的早期肌肉通过再生得到补偿，但在后期肌肉祖细胞无法跟上持续的损害，并且健康的肌肉被非功能性纤维脂肪组织替代。
BMD由肌营养不良蛋白基因中的不同突变引起。BMD患者具有一些肌营养不良蛋白，但其数量不足或质量差。一些肌营养不良蛋白的存在保护BMD患者的肌肉不像DMD患者那样严重或快速地退化。
动物研究表明抑制GDF8信号传导途径可以有效地治疗DMD和BMD患者的疾病的各个方面(Bogdanovich等人,2002,Nature 420:418-421；Pistilli等人,2011,Am J Pathol178:1287-1297)。因此，本公开文本的ALK4:ActRIIB拮抗剂可以充当GDF8抑制剂(拮抗剂)，并且在DMD和BMD患者体内构成阻断通过GDF8和/或相关TGFβ超家族配体进行的信号传导的替代手段。
类似地，本公开文本的ALK4:ActRIIB异多聚体可以提供在需要肌肉生长的其他疾病状况下增加肌肉量的有效手段。例如，肌萎缩侧索硬化(ALS)(也称为路格瑞病(LouGehrig’s disease)或运动神经元病)是一种慢性、进行性且无法治愈的能攻击运动神经元的CNS障碍，所述运动神经元是引发骨骼肌收缩所需的中枢神经系统的组分。在ALS中，运动神经元退化并最终死亡，虽然人的大脑通常保持功能完善和警觉，但肌肉收缩的引发在脊柱水平上被阻断。患ALS的个体通常在40至70岁之间，并且首先退化的运动神经元是支配手臂或腿的运动神经元。ALS患者可能行走困难、可能掉东西、摔倒、说话含糊不清并且无法控制地笑或哭。随着疾病的进展，四肢肌肉开始因废用而萎缩。肌无力使人虚弱，并且患者最终需要轮椅或被限制在床上。在疾病发作后3-5年大多数ALS患者死于呼吸衰竭或呼吸机辅助并发症如肺炎。
在一些实施方案中，本公开文本的ALK4:ActRIIB异多聚体可以用于治疗炎性肌肉疾病/障碍如皮肌炎、包涵体肌炎或多肌炎。在一些实施方案中，炎性肌肉疾病/障碍是皮肌炎。在一些实施方案中，炎性肌肉疾病/障碍是多肌炎。在一些实施方案中，炎性肌肉疾病/障碍是包涵体肌炎。在一些实施方案中，包涵体肌炎是遗传性包涵体肌炎。在一些实施方案中，包涵体肌炎是散发性包涵体肌炎。
散发性包涵体肌炎与自身免疫和退行性过程均相关。这种障碍通常首先出现在50岁以上的患者中，并且主要出现在男性中。临床上，散发性包涵体肌炎的特征在于进行性股四头肌和深屈肌无力和萎缩。在症状发作后10-15年，许多患者依赖轮椅并严重残疾。由于食管肌和咽肌受累，患者还经常出现吞咽困难。散发性包涵体肌炎的诊断通常基于一些因素组合，如血液中肌酸激酶水平升高、肌电图结果异常；或肌肉活检显示炎性细胞浸润肌肉、空泡变性和/或异常蛋白质斑块的包涵体。
通过ALK4:ActRIIB异多聚体促进增加的肌肉量也可能使患有肌肉消耗疾病的人受益。Gonzalez-Cadavid等人(同上)报道GDF8表达与人体中的无脂肪物质负相关，并且GDF8基因表达的增加与患有AIDS消耗综合征的男性的体重减轻相关。通过抑制AIDS患者中GDF8的功能，即使不能完全消除但至少可以减轻某些AIDS症状，从而显著改善AIDS患者的生活质量。
由于GDF8功能的丧失也与在没有减少营养素摄入的情况下的脂肪减少有关(Zimmers等人，同上；McPherron和Lee，同上)，因此主题ALK4:ActRIIB异多聚体可以进一步用作减缓或预防肥胖症和2型糖尿病的发展的治疗剂。
癌症厌食-恶病质综合征是癌症最令人虚弱和危及生命的方面。这种综合征是许多癌症类型的共同特征，其存在于大约80％的死亡时的癌症患者中，并且这种综合征不仅造成生活质量差和化疗反应差，而且造成与具有可比较的肿瘤但没有体重减轻的患者中所发现的存活时间相比更短的存活时间。如果在六个月的时间段内发生超过百分之五的发病前体重的非自愿体重减轻，则癌症患者通常被怀疑有恶病质。与厌食、脂肪和肌肉组织的消耗以及心理困扰相关，恶病质由癌症与宿主之间的复杂相互作用产生。癌症恶病质影响细胞因子产生、脂质动员和蛋白质水解诱导因子的释放以及中间代谢的改变。虽然厌食是常见的，但仅减少食物摄入无法解释癌症患者中观察到的身体组成的变化，并且增加营养素摄入无法逆转消耗综合征。目前，没有控制或逆转恶病质过程的治疗。由于发现GDF8在成年小鼠中的全身过表达诱导类似于在人恶病质综合征中所观察到的严重的肌肉和脂肪减少(Zimmers等人，同上)，因此主题ALK4:ActRIIB异多聚体可以有益地用于预防、治疗或减轻需要肌肉生长的恶病质综合征的症状。如上所述用于预防、治疗或减轻肌肉减少的异聚复合物的例子是ALK4:ActRIIB异二聚体。
在某些实施方案中，本公开文本的ALK4:ActRIIB异多聚体可以用于诱导骨和/或软骨形成、预防骨质流失、增加骨矿化、预防骨脱矿和/或增加骨密度的方法中。ALK4:ActRIIB异多聚体可用于诊断为亚临床低骨密度的患者中，作为对抗骨质疏松症发展的保护措施。
在一些实施方案中，本公开文本的ALK4:ActRIIB异多聚体可以在人和其他动物的骨折和软骨缺损的愈合中具有医学实用性。主题方法和组合物还可以在闭合性和开放性骨折复位中以及在人工关节的改进固定中具有预防性用途。由成骨剂诱导的从头骨形成可用于修复先天性、创伤诱导的或由肿瘤切除术引起的颅面缺损，并且也可用于美容整形手术。此外，本发明的方法和组合物可以用于治疗牙周病和其他牙齿修复过程。在某些情况下，ALK4:ActRIIB异多聚体可以提供吸引骨形成细胞，刺激骨形成细胞生长或诱导骨形成细胞的祖细胞分化的环境。本公开文本的ALK4:ActRIIB异多聚体也可用于治疗骨质疏松症。此外，ALK4:ActRIIB异多聚体可以用于修复软骨缺损和预防/逆转骨关节炎。如本文所述可用于诱导骨形成、预防骨质流失、增加骨矿化、预防骨脱矿和/或增加骨密度的异聚复合物的例子是ALK4:ActRIIB异二聚体。
Rosen等人(编辑)Primer on the Metabolic Bone Diseases and Disorders ofMineral Metabolism,第7版American Society for Bone and Mineral Research,华盛顿(通过引用并入本文)提供了可以用ALK4:ActRIIB异多聚体治疗的骨障碍的广泛讨论。本文提供了部分列表。本发明的方法和组合物可以应用于特征在于或引起骨质流失的病症，如骨质疏松症(包括继发性骨质疏松症)、甲状旁腺功能亢进、慢性肾病矿物质骨障碍、性激素匮乏或消融(例如雄激素和/或雌激素)、糖皮质激素治疗、类风湿性关节炎、重度烧伤、甲状旁腺功能亢进、高钙血症、低钙血症、低磷酸盐血症、骨软化症(包括肿瘤诱导的骨软化症)、高磷酸盐血症、维生素D缺乏症、甲状旁腺功能亢进(包括家族性甲状旁腺功能亢进)和假性甲状旁腺功能减退症、肿瘤转移瘤到骨、肿瘤或化疗导致的骨质流失、骨和骨髓肿瘤(例如，多发性骨髓瘤)、缺血性骨障碍、牙周病和口腔骨质流失、库欣病(Cushing’s disease)、佩吉特病(Paget’s disease)、甲状腺毒症、慢性腹泻状态或吸收不良、肾小管酸中毒或神经性厌食。本发明的方法和组合物还可以应用于特征在于骨形成或愈合失败的病症，包括骨不连骨折、原本愈合缓慢的骨折、胎儿和新生儿骨发育不良(例如，低钙血症、高钙血症、钙受体缺陷和维生素D缺乏症)、骨坏死(包括颌骨坏死)和成骨不全。另外，合成代谢作用将导致此类拮抗剂减少与骨损害或侵蚀相关的骨痛。作为抗再吸收作用的结果，此类拮抗剂可用于治疗异常骨形成的障碍，如成骨细胞肿瘤转移(例如，与原发性前列腺癌或乳腺癌相关)、成骨性骨肉瘤、骨硬化病、进行性骨干发育不良、骨内膜骨质增生、骨斑点症和烛泪样骨质增生症。可治疗的其他障碍包括纤维性结构不良和软骨发育不全。
在另一个特定的实施方案中，本公开文本提供了用于修复骨折以及与软骨和/或骨缺损或牙周病相关的其他病症的治疗方法和组合物。本发明进一步提供了用于伤口愈合和组织修复的治疗方法和组合物。伤口的类型包括但不限于烧伤、切口和溃疡。参见例如PCT公开号WO 84/01106。此类组合物包含治疗有效量的至少一种本公开文本的ALK4:ActRIIB异多聚体与药学上可接受的运载体、载体或基质的混合物。
在一些实施方案中，本公开文本的ALK4:ActRIIB异多聚体可以应用于导致骨质流失的病症，如骨质疏松症、甲状旁腺功能亢进、库欣病、甲状腺毒症、慢性腹泻状态或吸收不良、肾小管酸中毒或神经性厌食。通常认为，女性、体重低且主要为久坐不动的生活方式是骨质疏松症的风险因素(骨矿物质密度损失，从而导致骨折风险)。然而，骨质疏松症也可能由长期使用某些药物而导致。由药物或其他医疗状况引起的骨质疏松症被称为继发性骨质疏松症。在库欣病中，身体产生的过量皮质醇导致骨质疏松症和骨折。与继发性骨质疏松症相关的最常见的药物是皮质类固醇，一类起到与皮质醇类似作用的药物，皮质醇是一种由肾上腺自然产生的激素。尽管骨发育需要足够的甲状腺激素水平，但过量的甲状腺激素可以随着时间的推移减少骨量。当具有肾脏问题的人(尤其是经历透析的人)服用高剂量的含有铝的抗酸药时，其可能导致骨质流失。可引起继发性骨质疏松症的其他药物包括用于预防癫痫的苯妥英(Dilantin)和巴比妥类药物；甲氨蝶呤(Rheumatrex、Immunex、FolexPFS)，一种用于一些形式的关节炎、癌症和免疫障碍的药物；环孢菌素(Sandimmune、Neoral)，一种用于治疗一些自身免疫疾病和在器官移植患者中抑制免疫系统的药物；促黄体激素释放激素激动剂(Lupron、Zoladex)，其用于治疗前列腺癌和子宫内膜异位症；肝素(Calciparine、Liquaemin)，一种抗凝血药物；以及消胆胺(Questran)和考来替泊(Colestid)，其用于治疗高胆固醇。由癌症疗法引起的骨质流失是公认的，并且称为癌症疗法诱导的骨质流失(CTIBL)。骨转移可以在骨中产生空腔，所述空腔可以通过用ALK4:ActRIIB异多聚体治疗进行纠正。骨质流失也可以由牙龈疾病引起，牙龈疾病是一种其中位于牙龈凹陷处的细菌产生毒素和有害酶的慢性感染。
在进一步的实施方案中，本公开文本提供了用于治疗与异常或不希望的骨生长相关的疾病或障碍的方法和治疗剂。例如，患有先天性障碍进行性骨化性纤维发育不良(FOP)的患者被软组织中自发或响应于组织创伤的进行性异位骨生长折磨，对生活质量具有重大影响。另外，在髋关节置换手术后可能发生异常的骨生长，从而破坏手术结果。这是病理性骨生长的更常见的例子，以及主题方法和组合物可以在治疗上有用的情况。相同的方法和组合物也可用于治疗其他形式的异常骨生长(例如，创伤、烧伤或脊髓损伤后骨的病理性生长)，以及用于治疗或预防与关于转移性前列腺癌或骨肉瘤所观察到的异常骨生长相关的不期望的病症。
在某些实施方案中，本公开文本的ALK4:ActRIIB异多聚体可以用于促进癌症患者中的骨形成。患有某些肿瘤(例如前列腺、乳腺、多发性骨髓瘤或引起甲状旁腺功能亢进的任何肿瘤)的患者由于肿瘤诱导的骨质流失、骨转移和治疗剂而具有骨质流失的高风险。即使没有骨质流失或骨转移的迹象，此类患者也可以用TGF-β超家族异多聚体复合物或复合物的组合进行治疗。还可以针对骨质流失或骨转移的迹象监测患者，并且如果指示物表明风险增加，则可以用ALK4:ActRIIB异多聚体进行治疗。通常，DEXA扫描用于评估骨密度的变化，而骨重建的指示物可以用于评估骨转移的可能性。可以监测血清标记物。骨特异性碱性磷酸酶(BSAP)是存在于成骨细胞中的酶。在患有骨转移和导致骨重建增加的其他病症的患者中，BSAP的血液水平增加。骨钙蛋白和前胶原肽也与骨形成和骨转移有关。在患有由前列腺癌引起的骨转移的患者中已检测到BSAP的增加，并且在来自乳腺癌的骨转移中检测到较低程度的增加。BMP7水平在转移至骨的前列腺癌中高，但在由膀胱、皮肤、肝或肺癌引起的骨转移中不高。I型羧基末端端肽(ICTP)是在胶原蛋白中发现的在骨再吸收过程中形成的交联物。由于骨不断被破坏和改造，因此ICTP将遍布全身。然而，在骨转移部位，该水平将显著高于正常骨区域中的水平。在由前列腺、肺和乳腺癌引起的骨转移中，已发现高水平的ICTP。另一种胶原蛋白交联物(即I型N末端端肽(NTx))在骨转换过程中与ICTP一起产生。在由许多不同类型的癌症(包括肺、前列腺和乳腺癌)引起的骨转移中NTx的量增加。此外，NTx的水平随着骨转移的进展而增加。因此，该标记物可以用于检测转移以及测量该疾病的程度。其他再吸收标记物包括吡啶啉和脱氧吡啶啉。再吸收标记物或骨转移标记物的任何增加表明在患者中需要采用ALK4:ActRIIB异多聚体的疗法。
在另一个实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体可以用于患有慢性肾病矿物质骨障碍(CKD-MBD)的患者中，CKD-MBD是一种由肾病引起的相互关联的骨骼、心血管和矿物质代谢障碍的广泛综合征。CKD-MBD包括通常被称为肾性骨营养不良(ROD)的各种骨骼病理，这是采用ALK4:ActRIIB异多聚体治疗的优选实施方案。根据不同致病因子的相对贡献，ROD表现为骨重建的多种病理模式(Hruska等人,2008,Chronic kidney disease mineral bonedisorder(CKD-MBD)；在Rosen等人(编辑)Primer on the Metabolic Bone Diseases andDisorders of Mineral Metabolism,第7版American Society for Bone and MineralResearch,华盛顿,第343-349页)。在谱带的一端是伴有尿毒症骨营养不良和低骨转换的ROD，其特征在于少量的活性重建位点、深度抑制的骨形成和低的骨再吸收。另一个极端是伴有甲状旁腺功能亢进、高骨转换和纤维性骨炎的ROD。鉴于ALK4:ActRIIB异多聚体可以发挥合成代谢和抗吸收作用，这些药剂可用于跨越ROD病理谱带的患者中。
本公开文本的ALK4:ActRIIB异多聚体可以与其他骨活性药剂联合给予。联合给予可以通过给予单个共制剂、通过同时给予或通过在分开的时间给予来完成。ALK4:ActRIIB异多聚体在与其他骨活性剂一起给予时可能特别有利。患者可以受益于联合地接受ALK4:ActRIIB异多聚体和服用钙补充剂、维生素D、适当的运动和/或(在一些情况下)其他药物。其他药物的例子包括双膦酸盐(阿仑膦酸盐、伊班膦酸盐和利塞膦酸盐)、降钙素、雌激素、甲状旁腺素和雷洛昔芬。双膦酸盐(阿仑膦酸盐、伊班膦酸盐和利塞膦酸盐)、降钙素、雌激素和雷洛昔芬影响骨重建周期，并且被归类为抗再吸收药物。骨重建由两个不同的阶段组成：骨再吸收和骨形成。抗再吸收药物减缓或停止骨重建周期的骨再吸收部分，而不会减缓该周期的骨形成部分。因此，新的形成在比骨再吸收更大的速率下继续，并且骨密度可能随时间的推移增加。特立帕肽(一种形式的甲状旁腺激素)增加骨重建周期中骨形成的速度。阿仑膦酸盐被批准用于绝经后骨质疏松症的预防(每天5mg或每周一次35mg)和治疗(每天10mg或每周一次70mg)。阿仑膦酸盐减少骨质流失，增加骨密度并且降低脊柱、腕部和髋部骨折的风险。阿仑膦酸盐还被批准用于治疗男性和女性的由于长期使用这些药物(即，泼尼松和可的松)而导致的糖皮质激素诱导的骨质疏松症以及用于治疗男性的骨质疏松症。阿仑膦酸盐加上维生素D被批准用于治疗绝经后女性的骨质疏松症(每周一次70mg加上维生素D)，以及用于治疗以改善患有骨质疏松症的男性中的骨量。伊班膦酸盐被批准用于预防和治疗绝经后骨质疏松症。作为每月一次的丸剂(150mg)服用，伊班膦酸盐应该在每个月的同一天服用。伊班膦酸盐减少骨质流失，增加骨密度并且降低脊柱骨折的风险。利塞膦酸盐被批准用于预防和治疗绝经后骨质疏松症。每日服用(5mg剂量)或每周服用(35mg剂量或35mg剂量加钙)，利塞膦酸盐减缓骨质流失，增加骨密度并且降低脊柱和非脊柱骨折的风险。利塞膦酸盐还被批准用于男性和女性以预防和/或治疗由长期使用这些药物(即，泼尼松或可的松)而导致的糖皮质激素诱导的骨质疏松症。降钙素是一种参与钙调节和骨代谢的天然存在的激素。在绝经超过5年的女性中，降钙素减缓骨质流失，增加脊柱骨密度，并且可以缓解与骨折相关的疼痛。降钙素降低脊柱骨折的风险。降钙素可作为注射剂(每日50-100IU)或鼻喷剂(每日200IU)使用。
患者也可以受益于联合地接受ALK4:ActRIIB异多聚体和其他骨活性药物。雌激素疗法(ET)/激素疗法(HT)被批准用于预防骨质疏松症。ET已被证明减少骨质流失，增加脊柱和髋部中的骨密度，并且降低绝经后女性的髋部和脊柱骨折的风险。ET最常以丸剂或皮肤贴剂的形式给予，其每日递送大约0.3mg的低剂量或每日大约0.625mg的标准剂量，并且即使在70岁以后开始也是有效的。当单独服用雌激素时，它会增加女性患子宫内膜的癌症(子宫内膜癌)的风险。为了消除这种风险，医疗服务人员为具有完整子宫的那些女性开出黄体酮激素与雌激素的组合(激素替代疗法或HT)。ET/HT缓解绝经症状，并且已被证明对骨健康有益。副作用可能包括阴道流血、乳房胀痛、情绪紊乱和胆囊疾病。每日60mg雷洛昔芬被批准用于预防和治疗绝经后骨质疏松症。它来自一类名为选择性雌激素受体调节剂(SERM)的药物，它们已经被开发用于提供雌激素的有益作用而没有雌激素的潜在缺点。雷洛昔芬增加骨量并且降低脊柱骨折的风险。目前还没有数据证明雷洛昔芬可以降低髋部和其他非脊柱骨折的风险。特立帕肽(一种形式的甲状旁腺激素)被批准用于治疗绝经后女性和具有骨折高风险的男性的骨质疏松症。这种药物刺激新骨形成并显著地增加骨矿物质密度。在绝经后女性中，注意到脊柱、臀部、足部、肋骨和腕部中的骨折减少。在男性中，注意到脊柱中的骨折减少，但没有充分的数据评估其他部位的骨折减少。特立帕肽作为每日注射剂自我给予长达24个月。
在其他实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体可以用于调节动物中的体脂含量，以及用于治疗或预防与其相关的病症，特别是与其相关的健康危害病症。根据本发明，调节(控制)体重可以指减少或增加体重、减少或增加体重增加的速度或者增加或减少体重减轻的速度，并且还包括积极维持或不显著地改变体重(例如，抵抗可能原本增加或减少体重的外部或内部影响)。本公开文本的一个实施方案涉及通过向有需要的动物(例如，人)给予ALK4:ActRIIB异多聚体来调节体重。
在一些实施方案中，本公开文本的ALK4:ActRIIB异多聚体可以用于降低动物的体重和/或降低体重增加，更具体地，用于治疗或改善具有肥胖症风险或患有肥胖症的患者的肥胖。在另一个特定的实施方案中，本发明涉及用于治疗不能增加或保持体重的动物(例如，患有消耗综合征的动物)的方法和化合物。此类方法有效地增加体重和/或体量，或降低体重和/或体量减轻，或改善与不期望的低(例如，不健康)体重和/或体量相关或由其引起的病症。另外，可以用本公开文本的ALK4:ActRIIB异多聚体治疗高胆固醇的障碍(例如，高胆固醇血症或血脂异常)。
在其他实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体可以用于调节动物中的体脂含量，以及用于治疗或预防与其相关的病症，特别是与其相关的健康危害病症。根据本发明，调节(控制)体重可以指减少或增加体重、减少或增加体重增加的速度或者增加或减少体重减轻的速度，并且还包括积极维持或不显著地改变体重(例如，抵抗可能原本增加或减少体重的外部或内部影响)。本公开文本的一个实施方案涉及通过向有需要的动物(例如，人)给予ALK4:ActRIIB异多聚体来调节体重。例如，在一些实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体可以用于治疗或预防障碍或病症，所述障碍或病症选自肥胖症(例如，腹部肥胖症)；超重；胰岛素抗性；代谢综合征和其他代谢疾病或病症；脂质障碍，如低HDL水平、高LDL水平、高脂血症、高甘油三酯血症或血脂异常；脂蛋白畸变；降低的甘油三酯；炎症(例如，肝脏炎症和/或脂肪组织的炎症)、脂肪肝病；非酒精性脂肪肝病；高血糖症；糖耐量受损(IGT)；高胰岛素血症；高胆固醇(例如，高LDL水平和高胆固醇血症)；心血管疾病，如心脏病包括冠心病、充血性心力衰竭、中风、外周血管病、动脉粥样硬化；动脉硬化和高血压症；X综合征；血管再狭窄；神经病；视网膜病；神经退行性疾病；内皮功能障碍，呼吸功能障碍；胰腺炎；多囊卵巢综合征；尿酸水平升高；血色素沉着症(铁超负荷)；黑棘皮病(皮肤上有黑斑)；或癌症(例如，卵巢、乳腺、子宫内膜和结肠癌)；或与上述一种或多种疾病或病症有关的其他障碍/病症。在一些实施方案中，使用ALK4:ActRIIB异多聚体治疗的疾病或病症与超重(例如，BMI≥25kg/m2)或体脂过多有关。
在一个实施方案中，本公开文本提供了降低体重的方法，其包括向希望降低体重或有需要的受试者给予有效量的ALK4:ActRIIB异多聚体。在一些实施方案中，该受试者超重(例如，肥胖前期)。在一些实施方案中，该受试者的体重指数(BMI)为25kg/m2或更大。在进一步的实施方案中，该受试者的BMI为25kg/m2至29.9kg/m2、30kg/m2至39.9kg/m2、25kg/m2至39.9kg/m2或25kg/m2至50kg/m2。在一些实施方案中，该受试者是肥胖的。在一些实施方案中，该受试者的BMI为30kg/m2或更大(例如，30kg/m2至39.9kg/m2或30kg/m2至50kg/m2)。在一些实施方案中，该受试者是病态肥胖的。在一些实施方案中，该受试者的BMI为40kg/m2或更大。在进一步的实施方案中，该受试者的BMI为40kg/m2至45kg/m2或40kg/m2至50kg/m2。在一些实施方案中，该受试者患有向心性肥胖症(例如，包括腹部脂肪和/或内脏脂肪在内的腹部区域的过度肥胖)。在一些实施方案中，该受试者的腰围/臀围比(WHR)为0.85或更大。在一些实施方案中，该受试者患有外周性肥胖症(例如，臀部过度肥胖)。在一些实施方案中，该受试者患有2型糖尿病。ALK4:ActRIIB异多聚体可以单独给予或与其他类型的支持疗法一起作为组合疗法给予。例如，在一些实施方案中，支持疗法是饮食和/或锻炼。
在一个实施方案中，本公开文本提供了降低体重增加的方法，其包括向希望降低体重增加或有需要的受试者给予有效量的ALK4:ActRIIB异多聚体。在一些实施方案中，该受试者超重(例如，肥胖前期)。在一些实施方案中，该受试者的BMI为25kg/m2或更大。在进一步的实施方案中，该受试者的BMI为25kg/m2至29.9kg/m2、30kg/m2至39.9kg/m2、25kg/m2至39.9kg/m2或25kg/m2至50kg/m2。在一些实施方案中，该受试者是肥胖的。在一些实施方案中，该受试者的BMI为30kg/m2或更大(例如，30kg/m2至39.9kg/m2或30kg/m2至50kg/m2)。在一些实施方案中，该受试者是病态肥胖的。在一些实施方案中，该受试者的BMI为40kg/m2或更大。在进一步的实施方案中，该受试者的BMI为40kg/m2至45kg/m2或40kg/m2至50kg/m2。在一些实施方案中，该受试者患有2型糖尿病。
还提供了治疗或预防与体重超重相关的疾病或病症的方法，其包括向需要治疗或预防的受试者给予有效量的ALK4:ActRIIB异多聚体。在一个实施方案中，治疗或预防的疾病或病症是肥胖症。在一个实施方案中，治疗或预防的疾病或病症是胰岛素抗性。在一个实施方案中，治疗或预防的疾病或病症是选自以下的成员：血脂异常、高脂血症(总胆固醇水平>240mg/dL)、高胆固醇血症(例如，总胆固醇水平>200mg/dL、>220mg/dL、>240mg/dL、>250mg/dL或>275mg/dL)、低HDL血清水平(例如，<40mg/dL、<45mg/dL或<50mg/dL)、高LDL血清水平(例如，≥100mg/dL、≥130mg/dL、≥160mg/dL或≥190mg/dL)以及高甘油三酯血症(例如，空腹TG水平≥150mg/dL、≥175mg/dL、≥200mg/dL、≥300mg/dL、≥400mg/dL或≥499mg/dL)。在某些情况下，ALK4:ActRIIB拮抗剂治疗是饮食和/或运动的辅助。
在另一个实施方案中，本公开文本提供了降低超重受试者的体重的方法。该方法包括向超重受试者给予有效量的ALK4:ActRIIB异多聚体。在一些实施方案中，该受试者的体重指数(BMI)为25kg/m2或更大。在进一步的实施方案中，该受试者的BMI为25kg/m2至29.9kg/m2、30kg/m2至39.9kg/m2、25kg/m2至39.9kg/m2或25kg/m2至50kg/m2或27至40kg/m2。在一些实施方案中，该受试者是肥胖的。在一些实施方案中，该受试者的BMI为30kg/m2或更大(例如，30kg/m2至39.9kg/m2或30kg/m2至50kg/m2)。ALK4:ActRIIB异多聚体单独给予或作为组合疗法给予。在一些实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体治疗是饮食和/或运动的辅助。
在一个实施方案中，本公开文本提供了降低肥胖受试者的体重的方法。该方法包括向该受试者给予有效量的ALK4:ActRIIB异多聚体。在一些实施方案中，该受试者的BMI为30kg/m2或更大(例如，30kg/m2至39.9kg/m2或30kg/m2至50kg/m2)。在一些实施方案中，该受试者的BMI为40kg/m2或更大。在一些实施方案中，该受试者患有向心性肥胖症(例如，包括腹部脂肪和/或内脏脂肪在内的腹部区域的过度肥胖)。在一些实施方案中，该受试者的腰围/臀围比(WHR)为0.85或更大。在一些实施方案中，该受试者患有外周性肥胖症(例如，臀部过度肥胖)。在一些实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体治疗是饮食和/或运动的辅助。
在另一个实施方案中，本公开文本提供了治疗和/或改善肥胖症或与肥胖症相关的疾病或病症的方法，其包括向肥胖受试者给予有效量的ALK4:ActRIIB异多聚体。在一些实施方案中，该受试者的BMI为30kg/m2或更大。在进一步的实施方案中，该受试者的BMI为30kg/m2至39.9kg/m2或30kg/m2至50kg/m2。在一些实施方案中，该受试者是病态肥胖的。在一些实施方案中，该受试者的身体BMI为40kg/m2或更大。在进一步的实施方案中，该受试者的BMI为40kg/m2至45kg/m2或40kg/m2至50kg/m2。在一些实施方案中，该受试者患有2型糖尿病。在一些实施方案中，该受试者的BMI为30kg/m2或更大(例如，30kg/m2至39.9kg/m2)。在一些实施方案中，该受试者的BMI为至少40kg/m2。在一些实施方案中，该受试者患有向心性肥胖症(例如，包括腹部脂肪和/或内脏脂肪在内的腹部区域的过度肥胖)。在一些实施方案中，该受试者的腰围/臀围比(WHR)为0.85或更大。在一些实施方案中，该受试者患有外周性肥胖症(例如，臀部过度肥胖)。在一些实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体治疗是饮食和/或运动的辅助。
还提供了治疗或预防与肥胖症相关的疾病或病症的方法，其包括向需要治疗或预防的受试者给予有效量的ALK4:ActRIIB异多聚体。在一个实施方案中，治疗或预防的疾病或病症是选自以下的成员：血脂异常、高脂血症(总胆固醇水平>240mg/dL)、高胆固醇血症(例如，总胆固醇水平>200mg/dL、>220mg/dL、>240mg/dL、>250mg/dL或>275mg/dL)、低HDL血清水平(例如，<40mg/dL、<45mg/dL或<50mg/dL)、高LDL血清水平(例如，≥100mg/dL、≥130mg/dL、≥160mg/dL或≥190mg/dL)以及高甘油三酯血症(例如，空腹TG水平≥150mg/dL、≥175mg/dL、≥200mg/dL、≥300mg/dL、≥400mg/dL或≥499mg/dL)。在一个实施方案中，治疗或预防的疾病或病症是心血管疾病。在另外的实施方案中，治疗或预防的疾病或病症是高血压症(高血压)、心肌梗塞、外周动脉疾病、血管调节功能障碍、动脉硬化、充血性心力衰竭、动脉粥样硬化、冠心病或微血管疾病。在一个实施方案中，治疗或预防的疾病或病症是肝脏疾病。在一个实施方案中，治疗或预防的肝脏疾病或病症是NAFLD。在一个实施方案中，肝脏疾病是脂肪肝。在一个实施方案中，肝脏疾病是NASH。在另一个实施方案中，治疗或预防的疾病或病症是选自以下的成员：脂肪性肝炎、脂肪变性、纤维化和/或肝硬化。在某些情况下，ALK4:ActRIIB异多聚体治疗是饮食和/或运动的辅助。
在另一个实施方案中，本公开文本提供了治疗、改善和/或预防2型糖尿病或与糖尿病相关的疾病或病症的方法，其包括向患有2型糖尿病或有患2型糖尿病的风险的受试者给予有效量的异多聚体。在一些实施方案中，该受试者的体重指数BMI为30kg/m2或更大(例如，30kg/m2至39.9kg/m2)。在一些实施方案中，该受试者的BMI为至少40kg/m2。在一些实施方案中，该受试者患有向心性肥胖症(例如，包括腹部脂肪和/或内脏脂肪在内的腹部区域的过度肥胖)。在一些实施方案中，该受试者的WHR为0.85或更大。在一些实施方案中，该受试者患有外周性肥胖症(例如，臀部过度肥胖)。在一些实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体治疗是饮食和/或运动的辅助。
还提供了治疗、改善或预防与糖尿病相关的疾病或病症的方法，其包括向患有糖尿病的受试者给予有效量的ALK4:ActRIIB异多聚体。在一个实施方案中，治疗或预防的疾病或病症是选自以下的成员：血脂异常、高脂血症(总胆固醇水平>240mg/dL)、高胆固醇血症(例如，总胆固醇水平>200mg/dL、>220mg/dL、>240mg/dL、>250mg/dL或>275mg/dL)、低HDL血清水平(例如，<40mg/dL、<45mg/dL或<50mg/dL)、高LDL血清水平(例如，≥100mg/dL、≥130mg/dL、≥160mg/dL或≥190mg/dL)以及高甘油三酯血症(例如，空腹TG水平≥150mg/dL、≥175mg/dL、≥200mg/dL、≥300mg/dL、≥400mg/dL或≥499mg/dL)。在一个实施方案中，治疗或预防的疾病或病症是心血管疾病。在另外的实施方案中，治疗或预防的疾病或病症是高血压症(高血压)、心肌梗塞、外周动脉疾病、血管调节功能障碍或动脉硬化。在一个实施方案中，治疗或预防的疾病或病症是肝脏疾病。在另一个实施方案中，治疗或预防的疾病或病症是选自以下的成员：脂肪肝病、脂肪性肝炎、脂肪变性和/或肝硬化。在一个实施方案中，治疗或预防的疾病或病症是选自以下的成员：白内障、阻塞性睡眠呼吸暂停、静脉炎、痛风、骨关节炎、胆囊疾病和高胆固醇。在某些情况下，ALK4:ActRIIB异多聚体治疗是饮食和/或运动的辅助。
本公开文本还提供了用于改善受试者的血脂概况的方法，其包括向需要这种治疗的受试者给予有效量的ALK4:ActRIIB异多聚体。在一些实施方案中，本公开文本提供了用于降低LDL胆固醇水平或增加HDL胆固醇水平的方法。在一个实施方案中，该受试者患有血脂异常。在另一个实施方案中，该受试者具有升高的血清脂质(例如，胆固醇(高胆固醇血症)和/或甘油三酯(例如，高甘油三酯血症))。在一个实施方案中，该受试者的LDL-C≥100mg/dL、≥130mg/dL或≥160mg/dL。在一个实施方案中，该受试者的TG≥150mg/dL、≥160mg/dL、≥170mg/dL。在一个实施方案中，该受试者具有升高的血浆胰岛素水平(高胰岛素血症；例如，空腹胰岛素水平>20ug/ml可以超过100)。在一些实施方案中，该受试者患有II型糖尿病。
根据一个实施方案，本公开文本提供了治疗或预防代谢疾病或障碍或与代谢疾病或障碍相关的病症的方法，其包括向有需要的受试者给予ALK4:ActRIIB异多聚体。在一个实施方案中，治疗的代谢疾病、障碍或病症是高血糖症(例如，在空腹状态下或在口服葡萄糖耐量试验过程中给予葡萄糖后>130mg/dL)。在一个实施方案中，治疗的代谢疾病、障碍或病症是脂质代谢疾病、障碍或病症。在一个实施方案中，治疗的代谢疾病、障碍或病症是血脂异常。在进一步的实施方案中，脂质代谢疾病、障碍或病症是选自以下的成员：低HDL水平、高LDL水平、高甘油三酯水平、高脂血症和脂蛋白畸变。在一个实施方案中，该受试者的总胆固醇水平>200mg/dL、>220mg/dL、>240mg/dL、>250mg/dL或>275mg/dL。在一个实施方案中，该受试者的HDL血清水平<40mg/dL、<45mg/dL或<50mg/dL。在一个实施方案中，该受试者的LDL血清水平≥100mg/dL、≥130mg/dL、≥160mg/dL或≥190mg/dL。在一个实施方案中，该受试者的空腹TG水平≥150mg/dL、≥175mg/dL、≥200mg/dL、≥300mg/dL、≥400mg/dL或≥499mg/dL。在一个实施方案中，治疗的代谢疾病、障碍或病症是葡萄糖代谢疾病、障碍或病症。在进一步的实施方案中，葡萄糖代谢疾病、障碍或病症是选自以下的成员：葡萄糖不耐受、胰岛素抗性、糖耐量受损(IGT)、空腹血糖受损(IFG)。在一个实施方案中，治疗的代谢疾病、障碍或病症是选自以下的成员：高尿酸水平、NAFLD、脂肪肝、NASH和多囊卵巢综合征。在一个实施方案中，该治疗的受试者患有高胰岛素血症。在一个实施方案中，该治疗的受试者是肥胖的(例如，该受试者患有腹部肥胖症)。在另一个实施方案中，该治疗的受试者患有II型糖尿病。
代谢综合征是一种涉及增加心脏病风险的一系列障碍的病症。代谢综合征的主要组成部分是超重、心血管参数(高血压、血脂异常、血液中的高甘油三酯水平和/或低HDL水平)、动脉粥样硬化、糖尿病和/或胰岛素抗性。具有若干这些组成部分(即代谢综合征)的受试者极易患心脏病，尽管每种组成部分都是危险因素。本公开文本还提供了用于治疗或预防上述代谢综合征的组成部分中的1、2、3或更多种的方法，其包括向需要治疗的受试者给予有效量的ALK4:ActRIIB异多聚体。
另外提供了治疗、预防或改善心血管疾病或病症的方法，其包括向有需要的受试者给予ALK4:ActRIIB异多聚体。在一个实施方案中，治疗、预防或改善的心血管疾病或病症是动脉粥样硬化。在一个实施方案中，治疗、预防或改善的心血管疾病或病症是高血压(例如，在静息状态下，血压>130/80mmHg或>140/90mmHg)。在一个实施方案中，心血管疾病是动脉粥样硬化(冠心病)。
在一个实施方案中，本公开文本提供了用于治疗和/或改善炎性肝脏疾病或病症的方法，其包括向有需要的受试者给予ALK4:ActRIIB异多聚体。在一个实施方案中，该疾病或病症是NAFLD。在进一步的实施方案中，该疾病或病症是脂肪肝。在进一步的实施方案中，该疾病或病症是脂肪变性(例如，非酒精性脂肪性肝炎(NASH))。在进一步的实施方案中，该疾病或病症是酒精性脂肪肝病。
本公开文本还提供了改善血糖控制的方法，其包括向需要治疗的受试者给予有效量的ALK4:ActRIIB异多聚体。在一个实施方案中，被给予的受试者的空腹血糖水平>130mg/dL、>135mg/dL、>140mg/dL、>145mg/dL或>150mg/dL。在一个实施方案中，被给予的受试者在进食后2小时的餐后血糖水平>180mg/dL、>185mg/dL、>190mg/dL、>195mg/dL或>200mg/dL。在某些情况下，ALK4:ActRIIB异多聚体治疗是饮食和/或运动的辅助。该给予还可以降低体重或治疗肥胖症。在某些情况下，该受试者患有2型糖尿病症。在某些情况下，该受试者的BMI为27kg/m2至40kg/m2。在某些情况下，该受试者的BMI为30kg/m2至39.9kg/m2。在某些情况下，该受试者的BMI为至少40。在某些情况下，该受试者超重。在某些情况下，该受试者是肥胖的。可以使用本领域已知的技术如混合餐测试来评估血糖控制的改善。
本公开文本还提供了用于治疗、预防或改善受试者的高血糖症或与高血糖症相关的病症的组合物和方法，其包括向需要这种治疗的受试者给予有效量的ALK4:ActRIIB异多聚体。在一个实施方案中，被给予的受试者的空腹血糖水平>130mg/dL、>135mg/dL、>140mg/dL、>145mg/dL或>150mg/dL。在一个实施方案中，被给予的受试者在进食后2小时的餐后血糖水平>180mg/dL、>185mg/dL、>190mg/dL、>195mg/dL或>200mg/dL。在一个实施方案中，该治疗、预防或改善的结果是选自以下的成员：与治疗前受试者的血清水平相比血清葡萄糖水平降低、血清甘油三酯水平降低、血清胰岛素水平降低和/或血清非酯化脂肪酸水平降低。在一个实施方案中，该治疗、预防或改善的结果是与治疗前受试者的体温相比，体温升高约0.4℃至1℃。在一些实施方案中，ALK4:ActRIIB治疗也降低了受试者的体重。
在另一个实施方案中，本公开文本提供了降低受试者的血浆胰岛素水平的方法，其包括向需要这种治疗的受试者给予有效量的ALK4:ActRIIB异多聚体。在一个实施方案中，该受试者的空腹血糖水平>130mg/dL、>135mg/dL、>140mg/dL、>145mg/dL或>150mg/dL。在一个实施方案中，该受试者在进食后2小时的餐后血糖水平>180mg/dL、>185mg/dL、>190mg/dL、>195mg/dL或>200mg/dL。在一个实施方案中，该受试者超重。在一个实施方案中，该受试者是肥胖的。在另一个实施方案中，该受试者患有2型糖尿病。
本公开文本还提供了用于治疗、预防或改善受试者的高血糖症或与高血糖症相关的病症的组合物和方法，其包括向需要这种治疗的受试者给予有效量的ALK4:ActRIIB异多聚体。在一个实施方案中，该受试者的空腹血糖水平>130mg/dL、>135mg/dL、>140mg/dL、>145mg/dL或>150mg/dL。在一个实施方案中，该受试者在进食后2小时的餐后血糖水平>180mg/dL、>185mg/dL、>190mg/dL、>195mg/dL或>200mg/dL。在一个实施方案中，该治疗、预防或改善的结果是选自以下的成员：与治疗前受试者的血清水平相比血清葡萄糖水平降低、血清甘油三酯水平降低、血清胰岛素水平降低和/或血清非酯化脂肪酸水平降低。在一个实施方案中，该治疗、预防或改善的结果是与治疗前受试者的体温相比，体温升高约0.4℃至1℃。在一些实施方案中，ALK4:ActRIIB异多聚体治疗也降低了受试者的体重。
在另一个实施方案中，本公开文本提供了降低受试者的血浆胰岛素水平的方法，其包括向需要这种治疗的受试者给予有效量的ALK4:ActRIIB异多聚体。在一个实施方案中，该受试者的空腹血糖水平>130mg/dL、>135mg/dL、>140mg/dL、>145mg/dL或>150mg/dL。在一个实施方案中，该受试者在进食后2小时的餐后血糖水平>180mg/dL、>185mg/dL、>190mg/dL、>195mg/dL或>200mg/dL。在一个实施方案中，该受试者超重。在一个实施方案中，该受试者是肥胖的。在另一个实施方案中，该受试者患有2型糖尿病。
在另一个实施方案中，本公开文本提供了治疗、预防或改善受试者的肝脏疾病的方法，其包括向患有肝脏疾病的受试者给予有效量的ALK4:ActRIIB异多聚体。在一个实施方案中，该受试者患有肝脏炎症。在一个实施方案中，该受试者患有NAFLD。在一个实施方案中，该受试者患有脂肪肝。在另一个实施方案中，该受试者患有NASH。在一个实施方案中，该受试者患有脂肪肝。在另一个实施方案中，该受试者患有酒精性脂肪肝病。在一个实施方案中，治疗、预防或改善的肝脏疾病是纤维化、瘢痕形成、肝硬化或肝衰竭。在另一个实施方案中，治疗、预防或改善的肝脏疾病是肝癌。在一个实施方案中，该受试者超重。在另一个实施方案中，该受试者是肥胖的。在另一个实施方案中，该受试者患有2型糖尿病。
纤维化通常是指在器官或组织中胶原纤维和细胞外基质的过度沉积以及细胞数目的相对减少。虽然该过程是损伤后天然伤口愈合的重要特征，但纤维化可能导致包括例如肺、肾、肝、骨、肌肉和皮肤在内的多种组织和器官的病理损害。TGF-β在纤维化中的作用已得到广泛研究。然而，其他TGF-β超家族配体也已经参与纤维化，所述配体包括例如激活素(例如，激活素A和激活素B)和GDF8[Hedger等人(2013)Cytokine and Growth FactorReviews 24:285-295；Hardy等人(2015)93:567-574；以及Cantini等人(2008)J Sex Med5:1607-1622]。因此，在一些实施方案中，本公开文本的ALK4:ActRIIB异多聚体可以用于治疗纤维化，特别是纤维化相关障碍和病症。例如，ALK4:ActRIIB异多聚体可以用于治疗或预防以下中的一种或多种：肺纤维化、过敏性肺炎、特发性纤维化、肺结核、肺炎、囊性纤维化、哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、肺气肿、肾脏(肾)纤维化、肾脏(肾)衰竭、慢性肾脏(肾)疾病、骨纤维化、骨髓纤维化、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、硬皮病、结节病、伴有多血管炎的肉芽肿病、佩洛尼病(Peyronie’s disease)、肝纤维化、威尔逊病(Wilson’sdisease)、糖原贮积病(特别是III、IV、IX和X型)、铁超负荷、戈谢病(Gaucher disease)、泽尔韦格综合征(Zellweger syndrome)、非酒精性和酒精性脂肪性肝炎、胆汁性肝硬化、硬化性胆管炎、布-加综合征(Budd-Chiari syndrome)、手术相关纤维化、克罗恩病(Crohn’sdisease)、杜普挛缩(Duputren’s contracture)、纵隔纤维化、肾源性纤维化(nephrogeneic fibrosis)、腹膜后纤维化、心房纤维化、心内膜心肌纤维化、胰腺纤维化和特发性肺纤维化。
肾维持血液的许多特征，包括体积、pH平衡、电解质浓度和血压，并且承担毒素和废物过滤的责任。这些功能依赖于肾的肾单位的复杂结构、恒定的血流通过肾的各个毛细血管、以及通过来自身体其他部分的信号(包括内分泌激素)对肾的调节。肾功能的问题通过直接机制(例如遗传缺陷、感染或毒素暴露)和间接机制逐渐从长期压力因素如心肌肥大和超滤(其本身通常是对肾功能的更直接损害的结果)开始表现出来。由于肾在血液维持和废物分泌中有核心作用，肾相关疾病的临床表现是各种各样且有变化的；它们可以在Harrison’s Principles of Internal Medicine,第18版,McGraw Hill,N.Y.,第13节,第277-289章中进行综述。
如本文所述，ALK4:ActRIIB异多聚体在肾病模型中具有多种有益作用。具体地，用ALK4:ActRIIB异多聚体治疗减少了患有单侧输尿管梗阻的患者的肾组织损害、炎症和纤维化。这些数据表明ALK4:ActRIIB异多聚体可以用于治疗或预防肾病，特别是治疗或预防包括例如肾组织损害、炎症和/或纤维化在内的肾病的多种并发症(临床表现)。
因此，本发明的方法可以应用于多种肾相关疾病或病症。如本文所用，“肾相关疾病或病症”可以指影响肾或肾脏系统的任何疾病、障碍或病症。肾相关疾病或病症的例子包括但不限于慢性肾病(或衰竭)、急性肾病(或衰竭)、原发性肾病、非糖尿病肾病、肾小球肾炎、间质性肾炎、糖尿病肾病、糖尿病性肾病、肾小球硬化症、快速进行性肾小球肾炎、肾脏纤维化、奥尔波特综合征、IDDM肾炎、系膜增生性肾小球肾炎、膜增生性肾小球肾炎、新月体性肾小球肾炎、肾脏间质纤维化、局灶性节段性肾小球硬化症、膜性肾病、微小病变肾病、微量免疫快速进行性肾小球肾炎、IgA肾病、多囊肾病、登特病、肾钙质沉着症、海曼肾炎、常染色体显性遗传(成人)多囊肾病、常染色体隐性遗传(儿童)多囊肾病、急性肾损伤、肾病综合征、肾脏缺血、足细胞疾病或障碍、蛋白尿、肾小球疾病、膜性肾小球肾炎、局灶性节段性肾小球肾炎、先兆子痫、子痫、肾病变、胶原血管病、良性直立性(体位性)蛋白尿、IgM肾病、膜性肾病、结节病、糖尿病、药物引起的肾损害、法布里病、氨基酸尿症、范可尼综合征、高血压性肾硬化、间质性肾炎、镰状细胞病、血红蛋白尿、肌红蛋白尿、韦格纳肉芽肿病、糖原贮积病1型、慢性肾病、慢性肾脏衰竭、低肾小球滤过率(GFR)、肾血管硬化、狼疮肾炎、ANCA阳性微量免疫新月体性肾小球肾炎、慢性同种异体移植物肾病、肾毒性、肾脏毒性、肾坏死、肾损害、肾小球和肾小管损伤、肾功能障碍、肾炎综合征、急性肾脏衰竭、慢性肾脏衰竭、近端肾小管功能障碍、急性肾同种异体移植物排斥、慢性肾移植排斥、非IgA系膜增生性肾小球肾炎、感染后肾小球肾炎、伴有任何类型肾脏受累的血管炎、任何遗传性肾脏疾病、任何间质性肾炎、肾脏移植失败、肾癌、与其他病症(例如，高血压症、糖尿病和自身免疫疾病)相关的肾病、登特病、肾钙质沉着症、海曼肾炎、原发性肾病、塌陷性肾小球病、致密沉积物病、冷球蛋白血症相关肾小球肾炎、亨诺-许兰病、感染后肾小球肾炎、细菌性心内膜炎、显微镜下多血管炎、许尔-施特劳斯综合征、抗GBM抗体介导的肾小球肾炎、淀粉样变性、单克隆免疫球蛋白沉积病、原纤维性肾小球肾炎、免疫触须样肾小球病、缺血性肾小管损伤、药物诱导的肾小管间质性肾炎、毒性肾小管间质性肾炎、传染性肾小管间质性肾炎、细菌性肾盂肾炎、由多瘤病毒感染或HIV感染引起的病毒感染性肾小管间质性肾炎、代谢诱导的肾小管间质性疾病、混合性结缔组织病、管型肾病、可能由尿酸盐或草酸盐或药物诱导的晶体沉积引起的晶体肾病、急性细胞性肾小管间质同种异体移植物排斥、由淋巴瘤或移植后淋巴组织增生性疾病引起的肿瘤浸润性疾病、阻塞性肾病、血管疾病、血栓性微血管病、肾血管硬化、粥样硬化栓塞性疾病、混合性结缔组织病、结节性多动脉炎、神经钙蛋白抑制剂诱导的血管疾病、急性细胞性血管同种异体移植物排斥、急性体液同种异体移植物排斥、早期肾脏功能衰退(ERFD)、终末期肾脏疾病(ESRD)、肾脏静脉血栓形成、急性肾小管坏死、急性间质性肾炎、确诊的慢性肾病、肾脏动脉狭窄、缺血性肾病、尿毒症、药物和毒素诱导的慢性肾小管间质性肾炎、反流性肾病、肾结石、古德帕斯彻综合征、正常红细胞正常色素性贫血、肾性贫血、糖尿病慢性肾病、IgG4相关疾病、冯·希佩尔-林道综合征、结节性硬化症、肾痨、髓质囊性肾病、肾细胞癌、腺癌、肾母细胞瘤、淋巴瘤、白血病、低唾液酸化障碍、慢性环孢素肾病、肾脏再灌注损伤、肾发育不良、氮质血症、双侧动脉闭塞、急性尿酸性肾病、血容量不足、急性双侧梗阻性尿路病、高钙血症肾病、溶血性尿毒症综合征、急性尿潴留、恶性肾硬化、产后肾小球硬化症、硬皮病、非古德帕斯彻抗GBM病、显微镜下结节性多动脉炎、变应性肉芽肿病、急性放射性肾炎、链球菌感染后肾小球肾炎、沃尔登斯特伦巨球蛋白血症、镇痛剂肾病、动静脉瘘、动静脉移植、透析、异位肾、髓质海绵肾、肾性骨营养不良、孤立肾、肾积水、微量白蛋白尿、尿毒症、血尿、高脂血症、低白蛋白血症、脂肪尿、酸中毒、高钾血症和水肿。
在一些实施方案中，本公开文本的ALK4:ActRIIB异多聚体可以用于治疗或预防慢性肾病，任选地与用于治疗慢性肾病的一种或多种支持疗法组合。在一些实施方案中，本公开文本的ALK4:ActRIIB异多聚体可以用于治疗或预防慢性肾病的一种或多种并发症(症状或临床表现)，任选地与用于治疗慢性肾病的一种或多种支持疗法组合。在一些实施方案中，本公开文本的ALK4:ActRIIB异多聚体可以用于治疗或预防终末期肾衰竭，任选地与用于治疗终末期肾病的一种或多种支持疗法组合。慢性肾病(CKD)(也称为慢性肾脏疾病)是肾脏功能经数月或数年的时间段的进行性丧失。肾功能恶化的症状可能包括感觉总体感不适和经历食欲下降。通常，慢性肾病作为筛查已知具有肾问题的风险的人(如患有高血压或糖尿病的人和具有CKD血亲的人)的结果而被诊断出。当该疾病导致其公认的并发症之一(如心血管疾病、贫血或心包炎)时，可以鉴定出该疾病。最近的专业指南将CKD的严重程度分为五个阶段，其中第1阶段最轻且通常引起很少症状，并且第5阶段是严重疾病，如果不治疗则预期寿命短。第5阶段CKD通常被称为终末期肾病、终末期肾脏疾病或终末期肾衰竭，并且在很大程度上与现在已经过时的术语慢性肾脏衰竭或慢性肾衰竭是同义的；并且通常意味着该患者需要肾脏替代疗法，其可能涉及一种形式的透析，但理想地是进行肾移植。CKD最初没有特定症状，并且通常仅被检测为尿液中血清肌酸酐或蛋白质的增加。随着肾功能降低，可能表现出如下所述的多种症状。血压可能由于液体超负荷和肾经由肾素-血管紧张素系统产生的血管活性激素的产生而增加，从而增加了人患高血压症和/或患充血性心力衰竭的风险。尿素可能积聚，从而导致氮质血症并最终导致尿毒症(症状范围从嗜睡到心包炎和脑病)。由于其全身循环高，尿素以高浓度在小汗腺汗中排出，并在汗液蒸发时在皮肤上结晶(“尿毒症霜”)。钾可能在血液中积聚(伴有包括不舒服和可能致命的心律失常在内的一系列症状的高钾血症)。高钾血症通常不会发展，直到肾小球滤过率降至低于20-25ml/min/1.73m2，此时肾排出钾的能力下降。CKD中的高钾血症可以由于酸血症(其导致钾的细胞外转移)和胰岛素缺乏而加重。红细胞生成素合成可能减少，从而导致贫血。可能出现流体体积超负荷症状，范围从轻度水肿到危及生命的肺水肿。由于磷酸盐排泄减少，高磷酸盐血症可能通常在肾小球过滤减少后发生。高磷酸盐血症与心血管风险增加有关，是血管钙化的直接刺激因素。可能表现出低钙血症，这通常是由成纤维细胞生长因子-23的刺激引起的。骨细胞负责增加FGF23的产生，FGF23是酶1-α-羟化酶(其负责将25-羟胆钙化醇转化为1,25二羟基维生素D3)的有效抑制剂。随后，这进展为继发性甲状旁腺功能亢进、肾性骨营养不良和进一步损害心脏功能的血管钙化。可能发生代谢性酸中毒(由于硫酸盐、磷酸盐、尿酸等的积聚)并且由于过量的酸作用于酶而导致酶活性改变；并且还通过促进由过量酸(酸血症)引起的高钾血症而增加心脏和神经元膜的兴奋性。酸中毒也是由于从近端小管的细胞产生足够的氨的能力降低引起的。随着肾功能降低而患病率增加的缺铁性贫血在需要血液透析的人中尤为普遍。缺铁性贫血的原因是多因素的，但包括增加的炎症、红细胞生成素的减少和导致骨髓抑制的高尿酸血症。患有CKD的人患有加速的动脉粥样硬化并且比一般人群更有可能患心血管疾病。患有CKD和心血管疾病的患者往往比仅患有后者的患者具有明显更差的预后。
如本文所用，“与……组合”、“……的组合”或“联合给予”是指任何形式的给予，使得另外的疗法(例如，第二、第三、第四等)在体内仍然有效(例如，多种化合物同时对患者有效，这可以包括那些化合物的协同作用)。有效性可能与血液、血清或血浆中可测量的药剂浓度无关。例如，不同的治疗性化合物可以在同一制剂中或在单独的制剂中伴随地或顺序地并且按不同的时间表给予。因此，接受这种治疗的个体可以受益于不同疗法的组合作用。本公开文本的一种或多种ALK4:ActRIIB异多聚体可以与一种或多种其他另外的药剂或支持疗法同时给予、在一种或多种其他另外的药剂或支持疗法之前或之后给予。一般而言，每种治疗剂将以针对该特定药剂确定的剂量和/或时间表给予。待在方案中使用的特定组合将考虑本公开文本的拮抗剂与该疗法和/或期望的相容性。
在一些实施方案中，如果患者患有杜氏肌营养不良或贝氏肌营养不良，则可以将本文公开的任何ALK4:ActRIIB异多聚体与以下中的一种或多种组合给予：依特立生(eteplirsen)、皮质类固醇(例如，地夫可特(deflazacourt))、类固醇(例如，泼尼松)、血压和/或心脏药物(例如，血管紧张素转化酶抑制剂、β阻断剂和利尿剂)、平喘药(例如，沙丁胺醇)、维生素/营养素/抗氧化剂(例如，氨基酸、肉毒碱、辅酶Q10、肌酸、鱼油、绿茶提取物、维生素E)、手术、物理疗法、干细胞疗法、基因疗法、辅助通气、饮食和/或运动。
在一些实施方案中，如果患者患有面肩肱型肌营养不良，则本文公开的任何ALK4:ActRIIB异多聚体可以与以下中的一种或多种组合给予：沙丁胺醇、言语疗法、手术、助行器、背支架、T细胞抑制剂(例如，截短的组氨酰基-tRNA合成酶)、干细胞治疗、基因疗法和/或足部支持装置。
在一些实施方案中，如果患者患有肌萎缩侧索硬化，则本文公开的任何ALK4:ActRIIB异多聚体可以与以下中的一种或多种组合给予：利鲁唑、依达拉奉、马赛替尼、抗氧化剂、物理疗法、言语疗法、营养支持、呼吸支持(例如，非侵入性呼吸机)、干细胞疗法和/或基因疗法。
在一些实施方案中，如果患者患有散发性包涵体肌炎，则本文公开的任何ALK4:ActRIIB异多聚体可以与以下中的一种或多种组合给予：皮质类固醇、泼尼松、氧雄龙、甲氨蝶呤、麦考酚酸酯、静脉内免疫球蛋白、β干扰素-1a、依那西普、阿仑单抗、卵泡抑素、锂、比马鲁单抗(bimagrumab)、阿莫氯醇(arimoclomol)、雷帕霉素、抗氧化剂、肉毒碱、辅酶Q10、物理疗法、职业疗法、干细胞疗法和/或基因疗法。
在一些实施方案中，如果患者患有奥尔波特综合征，则本文公开的任何ALK4:ActRIIB异多聚体可以与以下中的一种或多种组合给予：血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂(例如，贝那普利、西拉普利、依那普利、福辛普利、赖诺普利、培哚普利(perinopril)、拉玛普利(ramapril)和喹那普利)、血管紧张素受体阻断剂(例如，坎地沙坦、依普沙坦(epresartan)、厄贝沙坦、氯沙坦、替米沙坦和缬沙坦)、他汀类(例如，氟伐他汀)、非二氢吡啶钙通道阻断剂(例如，地尔硫卓)、环孢菌素和/或醛固酮抑制剂。
在一些实施方案中，如果患者患有少肌症，则本文公开的任何ALK4:ActRIIB异多聚体可以与以下中的一种或多种组合给予：尿皮素(urocortin)II、激素替代疗法(例如，睾酮或人生长激素)、肌酸、维生素D、运动、饮食和/或力量训练。
肺高压(PH)先前被分类为原发性(特发性)或继发性。最近，世界卫生组织(WHO)将肺高压分为五组：第1组：肺动脉高压(PAH)；第2组：伴有左心病的肺动脉高压；第3组：伴有肺病和/或低氧血症的肺高压；第4组：慢性血栓性和/或栓塞性疾病引起的肺高压；和第5组：其他病症(例如，结节病、组织细胞增生症X、淋巴管瘤病和肺血管压迫)。参见例如，Rubin(2004)Chest 126:7-10。
在某些方面，本公开文本涉及治疗、预防肺高压或降低肺高压的进展速度和/或严重程度(例如，治疗、预防肺高压的一种或多种并发症或降低肺高压的一种或多种并发症的进展速度和/或严重程度)的方法，其包括向有需要的患者给予有效量的ALK4:ActRIIB异多聚体。在一些实施方案中，该方法涉及患有肺动脉高压的肺高压患者。在一些实施方案中，该方法涉及患有伴有左心病的肺高压的肺高压患者。在一些实施方案中，该方法涉及患有肺病和/或低氧血症的肺高压患者。在一些实施方案中，该方法涉及患有慢性血栓性和/或栓塞性疾病的肺高压患者。在一些实施方案中，该方法涉及患有结节病、组织细胞增生症X或淋巴管瘤病和肺血管压迫的肺高压患者。
肺动脉高压是肺脉管系统的一种严重、进行性且危及生命的疾病，其特征在于深度血管收缩和肺动脉壁中平滑肌细胞的异常增殖。肺中血管的严重收缩导致非常高的肺动脉压。这些高压使得心脏难以将血液泵送通过肺进行充氧。PAH患者遭受极度的呼吸短促，因为心脏难以泵送血液对抗这些高压。PAH患者通常会出现肺血管阻力(PVR)的显著增加和肺动脉压(PAP)的持续升高，这最终导致右心室衰竭和死亡。被诊断患有PAH的患者具有差的预后并且同样累及的生活质量，如果不治疗，则从诊断时起平均预期寿命为2至5年。
多种因素促成肺高压的发病机理，包括可促成血管重构(即，增生)的肺细胞的增殖。例如，肺血管重构主要因患有肺高压的患者的动脉内皮细胞和平滑肌细胞的增殖而发生。多种细胞因子的过表达被认为促进肺高压。此外，已经发现肺动脉高压可能起因于肺动脉平滑细胞和肺内皮细胞的过度增殖。更进一步地，晚期PAH的特征可在于远端肺小动脉的肌化、同心内膜增厚和增殖内皮细胞阻塞血管腔。Pietra等人,J.Am.Coll.Cardiol.,43:255-325(2004)。
在某些方面，本公开文本涉及治疗、预防肺高压或降低肺高压的进展速度和/或严重程度(例如，治疗、预防肺高压的一种或多种并发症或降低肺高压的一种或多种并发症的进展速度和/或严重程度)的方法，其包括向有需要的患者给予有效量的ALK4:ActRIIB异多聚体，其中该患者具有至少25mmHg(例如，25、30、35、40、45或50mmHg)的静息肺动脉压(PAP)。在一些实施方案中，该方法涉及具有至少25mmHg的静息PAP的患者。在一些实施方案中，该方法涉及具有至少30mmHg的静息PAP的患者。在一些实施方案中，该方法涉及具有至少35mmHg的静息PAP的患者。在一些实施方案中，该方法涉及具有至少40mmHg的静息PAP的患者。在一些实施方案中，该方法涉及具有至少45mmHg的静息PAP的患者。在一些实施方案中，该方法涉及具有至少50mmHg的静息PAP的患者。
在一些实施方案中，本公开文本涉及将该PH患者的一个或多个血液动力学参数调整至更正常的水平(例如，与相似年龄和性别的健康人相比的正常水平)的方法，其包括向有需要的患者给予有效量的ALK4:ActRIIB异多聚体。在一些实施方案中，该方法涉及降低PAP。在一些实施方案中，该方法涉及将该患者的PAP降低至少3mmHg。在某些实施方案中，该方法涉及将该患者的PAP降低至少5mmHg。在某些实施方案中，该方法涉及将该患者的PAP降低至少7mmHg。在某些实施方案中，该方法涉及将该患者的PAP降低至少10mmHg。在某些实施方案中，该方法涉及将该患者的PAP降低至少12mmHg。在某些实施方案中，该方法涉及将该患者的PAP降低至少15mmHg。在某些实施方案中，该方法涉及将该患者的PAP降低至少20mmHg。在某些实施方案中，该方法涉及将该患者的PAP降低至少25mmHg。在一些实施方案中，该方法涉及降低肺血管阻力(PVR)。在一些实施方案中，该方法涉及升高肺毛细血管楔压(PCWP)。在一些实施方案中，该方法涉及升高左心室舒张末压(LVEDP)。
在某些方面，本公开文本涉及治疗、预防肺高压的一种或多种并发症或降低肺高压的一种或多种并发症的进展速度和/或严重程度的方法，其包括向有需要的患者给予有效量的ALK4:ActRIIB异多聚体。在一些实施方案中，该方法涉及治疗、预防肺高压患者的肺动脉中的细胞增殖或降低肺高压患者的肺动脉中的细胞增殖的进展速度和/或严重程度。在一些实施方案中，该方法涉及治疗、预防肺高压患者的肺动脉中的平滑肌和/或内皮细胞增殖或降低肺高压患者的肺动脉中的平滑肌和/或内皮细胞增殖的进展速度和/或严重程度。在一些实施方案中，该方法涉及治疗、预防肺高压患者的肺动脉中的血管生成或降低肺高压患者的肺动脉中的血管生成的进展速度和/或严重程度。在一些实施方案中，该方法涉及增加患有肺高压的患者的身体活动。在一些实施方案中，该方法涉及治疗、预防肺高压患者的呼吸困难或降低肺高压患者的呼吸困难的进展速度和/或严重程度。在一些实施方案中，该方法涉及治疗、预防肺高压患者的胸痛或降低肺高压患者的胸痛的进展速度和/或严重程度。在一些实施方案中，该方法涉及治疗、预防肺高压患者的疲劳或降低肺高压患者的疲劳的进展速度和/或严重程度。在一些实施方案中，该方法涉及治疗、预防肺高压患者的肺纤维化或降低肺高压患者的肺纤维化的进展速度和/或严重程度。在一些实施方案中，该方法涉及治疗、预防肺高压患者的纤维化或降低肺高压患者的纤维化的进展速度和/或严重程度。在一些实施方案中，该方法涉及治疗、预防肺高压患者的肺血管重构或降低肺高压患者的肺血管重构的进展速度和/或严重程度。在一些实施方案中，该方法涉及治疗、预防肺高压患者的右心室肥大或降低肺高压患者的右心室肥大的进展速度和/或严重程度。
在某些方面，本公开文本涉及提高患有肺高压的患者的运动耐力的方法，其包括向有需要的患者给予有效量的ALK4:ActRIIB异多聚体。可以使用任何合适的运动耐力量度。例如，6分钟步行测试(6MWT)中的运动耐力测量受试者在6分钟内可以行走多远，即6分钟步行距离(6MWD)，其经常用于评估肺高压严重程度和疾病进展。博格呼吸困难指数(BDI)是用于评估感观呼吸困难(呼吸不适)的数值标度。它测量呼吸急促的程度，例如在完成6MWT后，其中BDI为0表示无呼吸急促，且10表示最大呼吸急促。在一些实施方案中，该方法涉及将患有肺高压的患者的6MWD增加至少10米。在一些实施方案中，该方法涉及将患有肺高压的患者的6MWD增加至少20米。在一些实施方案中，该方法涉及将患有肺高压的患者的6MWD增加至少30米。在一些实施方案中，该方法涉及将患有肺高压的患者的6MWD增加至少40米。在一些实施方案中，该方法涉及将患有肺高压的患者的6MWD增加至少50米。在一些实施方案中，该方法涉及将患有肺高压的患者的6MWD增加至少60米。在一些实施方案中，该方法涉及将患有肺高压的患者的6MWD增加至少70米。在一些实施方案中，该方法涉及将患有肺高压的患者的6MWD增加至少80米。在一些实施方案中，该方法涉及将患有肺高压的患者的6MWD增加至少90米。在一些实施方案中，该方法涉及将患有肺高压的患者的6MWD增加至少100米。在一些实施方案中，该方法涉及将患有肺高压的患者的BDI降低至少0.5个指数点。在一些实施方案中，该方法涉及将患有肺高压的患者的BDI降低至少1个指数点。在一些实施方案中，该方法涉及将患有肺高压的患者的BDI降低至少1.5个指数点。在一些实施方案中，该方法涉及将患有肺高压的患者的BDI降低至少2个指数点。在一些实施方案中，该方法涉及将患有肺高压的患者的BDI降低至少2.5个指数点。在一些实施方案中，该方法涉及将患有肺高压的患者的BDI降低至少3个指数点。在一些实施方案中，该方法涉及将患有肺高压的患者的BDI降低至少3.5个指数点。在一些实施方案中，该方法涉及将患有肺高压的患者的BDI降低至少4个指数点。在一些实施方案中，该方法涉及将患有肺高压的患者的BDI降低至少4.5个指数点。在一些实施方案中，该方法涉及将患有肺高压的患者的BDI降低至少5个指数点。在一些实施方案中，该方法涉及将患有肺高压的患者的BDI降低至少5.5个指数点。在一些实施方案中，该方法涉及将患有肺高压的患者的BDI降低至少6个指数点。在一些实施方案中，该方法涉及将患有肺高压的患者的BDI降低至少6.5个指数点。在一些实施方案中，该方法涉及将患有肺高压的患者的BDI降低至少7个指数点。在一些实施方案中，该方法涉及将患有肺高压的患者的BDI降低至少7.5个指数点。在一些实施方案中，该方法涉及将患有肺高压的患者的BDI降低至少8个指数点。在一些实施方案中，该方法涉及将患有肺高压的患者的BDI降低至少8.5个指数点。在一些实施方案中，该方法涉及将患有肺高压的患者的BDI降低至少9个指数点。在一些实施方案中，该方法涉及将患有肺高压的患者的BDI降低至少9.5个指数点。在一些实施方案中，该方法涉及将患有肺高压的患者的BDI降低至少3个指数点。在一些实施方案中，该方法涉及将患有肺高压的患者的BDI降低10个指数点。
基线处的肺高压可以是轻度、中度或重度的，如例如由世界卫生组织(WHO)功能类别所测量的，其是患有肺动脉高压的患者的疾病的严重程度的量度。WHO功能分类是纽约心脏协会(New York Heart Association，NYHA)系统的改编，并且常用于定性地评估活动耐受性，例如用于监测疾病进展和对治疗的反应(Rubin(2004)Chest 126:7-10)。在WHO系统中公认四种功能类别：I类：不会导致身体活动受限的肺高压；普通的身体活动不会引起过度的呼吸困难或疲劳、胸痛或近昏厥；II类：导致身体活动轻微受限的肺高压；患者在休息时舒服；普通的身体活动导致过度的呼吸困难或疲劳、胸痛或近昏厥；III类：导致体力活动明显受限的肺高压；患者在休息时舒服；低于普通活动导致过度的呼吸困难或疲劳、胸痛或近昏厥；IV类：导致无法进行任何无症状下的身体活动的肺高压；患者表现出右心室衰竭的体征；即使在休息时也可能出现呼吸困难和/或疲劳；任何身体活动都会增加不适。
在某些方面，本公开文本涉及治疗、预防肺高压或降低肺高压的进展速度和/或严重程度(例如，治疗、预防肺高压的一种或多种并发症或降低肺高压的一种或多种并发症的进展速度和/或严重程度)的方法，其包括向有需要的患者给予有效量的ALK4:ActRIIB异多聚体，其中该患者患有如WHO所公认的I类、II类、III类或IV类肺高压。在一些实施方案中，该方法涉及患有如WHO所公认的I类肺高压的患者。在一些实施方案中，该方法涉及患有如WHO所公认的II类肺高压的患者。在一些实施方案中，该方法涉及预防或延迟患者从如WHO所公认的I类肺高压到II类肺高压的进展。在一些实施方案中，该方法涉及促进或增加患者从如WHO所公认的II类肺高压到I类肺高压的退化。在一些实施方案中，该方法涉及患有如WHO所公认的III类肺高压的患者。在一些实施方案中，该方法涉及预防或延迟患者从如WHO所公认的II类肺高压到III类肺高压的进展。在一些实施方案中，该方法涉及促进或增加患者从如WHO所公认的III类肺高压到II类肺高压的退化。在一些实施方案中，该方法涉及促进或增加患者从如WHO所公认的III类肺高压到I类肺高压的退化。在一些实施方案中，该方法涉及患有如WHO所公认的IV类肺高压的患者。在一些实施方案中，该方法涉及预防或延迟患者从如WHO所公认的III类肺高压到IV类肺高压的进展。在一些实施方案中，该方法涉及促进或增加患者从如WHO所公认的IV类肺高压到III类肺高压的退化。在一些实施方案中，该方法涉及促进或增加患者从如WHO所公认的IV类肺高压到II类肺高压的退化。在一些实施方案中，该方法涉及促进或增加患者从如WHO所公认的IV类肺高压到I类肺高压的退化。
没有已知的治愈肺高压的方法；目前的治疗方法集中于延长患者寿命和提高患者的生活质量。目前肺高压的治疗方法包括给予：血管扩张药，如前列环素、依前列醇和西地那非；内皮素受体拮抗剂，如波生坦；钙通道阻断剂，如氨氯地平、地尔硫卓和硝苯地平；抗凝血剂，如华法林；以及利尿剂。还使用氧疗法、房间隔造口术、肺动脉血栓内膜剥脱术以及肺和/或心脏移植来进行肺高压的治疗。然而，这些方法中的每一种都存在一个或多个缺点，其可能包括缺乏有效性、严重的副作用、患者依从性低和成本高。在某些方面，该方法涉及治疗、预防肺高压或降低肺高压的进展速度和/或严重程度(例如，治疗、预防肺高压的一种或多种并发症或降低肺高压的一种或多种并发症的进展速度和/或严重程度)，其包括向有需要的患者与以下组合地给予有效量的ALK4:ActRIIB异多聚体(例如，在相同时间或不同时间给予，但总体上以实现重叠的药理学/生理学作用的方式给予)：用于治疗肺高压的一种或多种另外的活性剂和/或支持疗法(例如，血管扩张药，如前列环素、依前列醇和西地那非；内皮素受体拮抗剂，如波生坦；钙通道阻断剂，如氨氯地平、地尔硫卓和硝苯地平；抗凝血剂，如华法林；利尿剂；氧疗法；房间隔造口术；肺动脉血栓内膜剥脱术：以及肺和/或心脏移植)；BMP9多肽；BMP10多肽；甲基巴多索隆或其衍生物；齐墩果酸或其衍生物。
5.药物组合物
在某些方面，本公开文本的ALK4:ActRIIB异多聚体可以单独地或作为药物制剂(也称为治疗性组合物或药物组合物)的组分给予。药物制剂是指如下制剂，其呈使得其中所含活性成分(例如，本公开文本的药剂)的生物活性有效的形式，并且不含对给予制剂的受试者具有不可接受的毒性的另外的组分。主题化合物可以配制用于以任何方便的方式给予以供在人或兽医医学中使用。例如，本公开文本的一种或多种药剂可以与药学上可接受的载体一起配制。药学上可接受的载体是指药物制剂中除活性成分之外的成分，其通常对受试者无毒。药学上可接受的载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂和/防腐剂。一般而言，当给予受试者时，用于本公开文本的药物制剂呈无热原的、生理学上可接受的形式。可任选地包含在如上所述制剂中的除了本文所述药剂之外的治疗上有用的药剂可以在本公开文本的方法中与主题药剂组合给予。
在某些实施方案中，组合物将肠胃外地[例如，通过静脉内(I.V.)注射、动脉内注射、骨内注射、肌内注射、鞘内注射、皮下注射或皮内注射]给予。适用于肠胃外给予的药物组合物可以包含本公开文本的一种或多种药剂与一种或多种药学上可接受的无菌等渗水溶液或非水溶液、分散液、悬浮液或乳液或可以刚好在使用之前重构成无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末的组合。可注射溶液或分散液可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、悬浮剂、增稠剂或使该制剂与预期接受者的血液等渗的溶质。可用于本公开文本的药物制剂中的合适的水性和非水性载体的例子包括水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、聚乙二醇等)、植物油(例如，橄榄油)、可注射有机酯(例如，油酸乙酯)及其合适的混合物。例如，通过使用包衣材料(例如，卵磷脂)，在分散液的情况下通过维持所需的粒度以及通过使用表面活性剂，可以维持适当的流动性。
在一些实施方案中，本公开文本的治疗方法包括从植入物或装置全身地或局部地给予药物组合物。此外，该药物组合物能以用于递送至目标组织部位(例如，骨髓或肌肉)的形式包封或注射。在某些实施方案中，本公开文本的组合物可以包含能够将本公开文本的一种或多种药剂递送至目标组织部位(例如，骨髓或肌肉)的基质，从而提供用于发育中组织并且最佳地能够被吸收至体内的结构。例如，该基质可以提供本公开文本的一种或多种药剂的缓慢释放。此类基质可以由目前用于其他植入医学应用的材料形成。
基质材料的选择可以基于以下中的一种或多种：生物相容性、生物降解性、机械特性、美容外观和界面特性。主题组合物的特定应用将定义适当的制剂。组合物的潜在基质可以是可生物降解的且化学上定义的硫酸钙、磷酸三钙、羟基磷灰石、聚乳酸和聚酸酐。其他潜在的材料是可生物降解的且生物学上明确定义的，包括例如骨或真皮胶原。其他基质包括纯蛋白质或细胞外基质组分。其他潜在的基质是不可生物降解的且化学上定义的，包括例如烧结的羟基磷灰石、生物玻璃、铝酸盐或其他陶瓷。基质可以包括任何上述类型的材料的组合，包括例如聚乳酸和羟基磷灰石或胶原和磷酸三钙。可以改变生物陶瓷的组成(例如，钙-铝酸盐-磷酸盐)和加工以改变孔径、粒度、粒子形状和生物降解性中的一种或多种。
在某些实施方案中，本公开文本的药物组合物可以局部地给予。“局部施用”或“局部地”意指药物组合物与体表(包括例如皮肤、伤口部位和粘膜)接触。局部药物组合物可以具有多种施用形式，并且通常包含含药物层，其适合于在局部给予该组合物时放置在组织附近或与组织直接接触。适合于局部给予的药物组合物可以包含组合地配制成液体、凝胶、乳膏、洗剂、软膏、泡沫、糊剂、油灰(putty)、半固体或固体的本公开文本的一种或多种ALK4:ActRIIB异多聚体。呈液体、凝胶、乳膏、洗剂、软膏、泡沫、糊剂或油灰形式的组合物可以通过在目标组织上摊开、喷涂、涂抹、轻搽或滚动该组合物来施用。该组合物还可以浸渍至无菌敷料、透皮贴剂、膏药和绷带中。油灰、半固体或固体形式的组合物可以是可变形的。它们可以是弹性的或非弹性的(例如，柔性或刚性的)。在某些方面，该组合物形成复合材料的一部分并且可以包括纤维、微粒或具有相同或不同组成的多个层。
呈液体形式的局部组合物可以包括药学上可接受的溶液、乳液、微乳液和悬浮液。除了一种或多种活性成分之外，液体剂型可以含有本领域常用的惰性稀释剂，包括例如水或其他溶剂、增溶剂和/或乳化剂[例如，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇或1,3-丁二醇、油(例如，棉籽、花生、玉米、胚芽、橄榄、蓖麻和芝麻油)、甘油、四氢呋喃醇、聚乙二醇、脱水山梨糖醇的脂肪酸酯及其混合物]。
局部凝胶、乳膏、洗剂、软膏、半固体或固体组合物可以包含一种或多种增稠剂，如多糖、合成聚合物或基于蛋白质的聚合物。在本发明的一个实施方案中，本文的胶凝剂是合适的无毒并且提供所需粘度的胶凝剂。增稠剂可以包括以下的聚合物、共聚物和单体：乙烯吡咯烷酮、甲基丙烯酰胺、丙烯酰胺N-乙烯基咪唑、羧基乙烯基、乙烯基酯、乙烯基醚、聚硅酮、聚氧化乙烯、聚乙二醇、乙烯醇、丙烯酸钠、丙烯酸酯、马来酸、NN-二甲基丙烯酰胺、双丙酮丙烯酰胺、丙烯酰胺、丙烯酰基吗啉、普朗尼克、胶原、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸酯、聚乙烯醇、聚乙烯基撑、聚乙烯硅酸酯、用糖(例如，蔗糖、葡萄糖、葡糖胺、半乳糖、海藻糖、甘露糖或乳糖)取代的聚丙烯酸酯、酰基酰胺丙烷磺酸、四甲氧基正硅酸酯、甲基三甲氧基正硅酸酯、四烷氧基正硅酸酯、三烷氧基正硅酸酯、二醇、丙二醇、丙三醇、多糖、海藻酸酯、葡聚糖、环糊精、纤维素、改性纤维素、氧化纤维素、壳聚糖、几丁质、瓜尔胶、角叉菜胶、透明质酸、菊粉、淀粉、改性淀粉、琼脂糖、甲基纤维素、植物胶、hylaronan、水凝胶、明胶、葡糖氨基葡聚糖、羧甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、果胶、低甲氧基果胶、交联葡聚糖、淀粉-丙烯腈接枝共聚物、淀粉聚丙烯酸钠、甲基丙烯酸羟乙酯、丙烯酸羟乙酯、聚乙烯基撑、聚乙烯基乙醚、聚甲基丙烯酸甲酯、聚苯乙烯、聚氨酯、聚链烷酸酯、聚乳酸、聚乳酸酯、聚(3-羟基丁酸酯)、磺化水凝胶、AMPS(2-丙烯酰胺基-2-甲基-1-丙磺酸)、SEM(甲基丙烯酸磺乙酯)、SPM(甲基丙烯酸磺丙酯)、SPA(丙烯酸磺丙酯)、N,N-二甲基-N-甲基丙烯酸氧乙基-N-(3-磺丙基)铵甜菜碱、甲基丙烯酸酰胺基丙基-二甲基铵磺基甜菜碱、SPI(衣康酸-双(1-丙基磺酸-3)酯二钾盐)、衣康酸、AMBC(3-丙烯酰胺基-3-甲基丁酸)、β-羧乙基丙烯酸酯(丙烯酸二聚体)以及马来酸酐-甲基乙烯醚聚合物、其衍生物、其盐、其酸及其组合。在某些实施方案中，本公开文本的药物组合物可以口服地给予，例如以下列形式：胶囊、扁囊剂、丸剂、片剂、锭剂(使用调味基质如蔗糖和阿拉伯胶或黄蓍胶)、粉末、颗粒、在水性或非水性液体中的溶液或悬浮液、水包油或油包水液体乳液或酏剂或糖浆或软锭剂(使用惰性基质如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯胶)和/或漱口水，每一种均含有预定量的本公开文本的化合物和任选的一种或多种其他活性成分。本公开文本的化合物和任选的一种或多种其他活性成分也能以大丸药、药糖剂或糊剂给予。
在用于口服给予的固体剂型(例如，胶囊、片剂、丸剂、糖衣丸、粉末和颗粒)中，本公开文本的一种或多种化合物可以与一种或多种药学上可接受的载体混合，所述载体包括例如柠檬酸钠、磷酸二钙、填料或增量剂(例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇和硅酸)、粘合剂(例如，羧甲基纤维素、海藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶)、保湿剂(例如，甘油)、崩解剂(例如，琼脂、碳酸钙、马铃薯或树薯淀粉、海藻酸、硅酸盐和碳酸钠)、溶液阻滞剂(例如，石蜡)、吸收促进剂(例如，季铵化合物)、润湿剂(例如，鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯)、吸收剂(例如，高岭土和膨润土)、润滑剂(例如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠)、着色剂及其混合物。在胶囊、片剂和丸剂的情况下，药物制剂(组合物)也可以包含缓冲剂。类似类型的固体组合物也可以用作使用包括例如乳糖(“lactose”或“milk sugar”)以及高分子量聚乙二醇在内的一种或多种赋形剂的软和硬填充明胶胶囊中的填充剂。
用于口服给予药物组合物的液体剂型可以包括药学上可接受的乳液、微乳液、溶液、悬浮液、糖浆和酏剂。除了一种或多种活性成分之外，液体剂型可以含有本领域常用的惰性稀释剂，包括例如水或其他溶剂、增溶剂和/或乳化剂[例如，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇或1,3-丁二醇、油(例如，棉籽、花生、玉米、胚芽、橄榄、蓖麻和芝麻油)、甘油、四氢呋喃醇、聚乙二醇、脱水山梨糖醇的脂肪酸酯及其混合物]。除惰性稀释剂外，口服制剂还可以包含佐剂，包括例如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、调味剂、着色剂、芳香剂、防腐剂及其组合。
除活性化合物外，悬浮液可以含有悬浮剂，包括例如乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨糖醇、脱水山梨糖醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂、黄蓍胶及其组合。
通过包含多种抗细菌剂和抗真菌剂(包括例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇和苯酚山梨酸)可以确保防止微生物的作用和/或生长。
在某些实施方案中，可能需要在该组合物中包含等渗剂，包括例如糖或氯化钠。另外，通过包含延迟吸收的试剂(包括例如单硬脂酸铝和明胶)，可以实现可注射药物形式的延长吸收。
应当理解，剂量方案将由主治医师通过考虑改变本公开文本的一种或多种药剂的作用的多种因素来确定。在促进红细胞形成的ALK4:ActRIIB异多聚体的情况下，多种因素可以包括但不限于患者的红细胞计数、血红蛋白水平、期望的目标红细胞计数、患者的年龄、患者的性别、患者的饮食、可能有助于红细胞水平下降的任何疾病的严重程度、给予时间和其他临床因素。向最终组合物中添加其他已知的活性剂也可能影响剂量。可以通过定期评估红细胞水平、血红蛋白水平、网织红细胞水平和造血过程的其他指示物中的一种或多种来监测进展。
在某些实施方案中，本公开文本还提供了用于体内产生本公开文本的一种或多种药剂的基因疗法。这种疗法将通过将药剂序列引入具有以上列出的一种或多种障碍的细胞或组织中来实现其治疗作用。例如，通过使用重组表达载体如嵌合病毒或胶体分散系统，可以实现药剂序列的递送。本公开文本的一种或多种药剂序列的优选治疗性递送是靶向脂质体的使用。
如本文所教导的可用于基因疗法的多种病毒载体包括腺病毒、疱疹病毒、牛痘或RNA病毒(例如，逆转录病毒)。逆转录病毒载体可以是鼠或禽逆转录病毒的衍生物。可以插入单个外源基因的逆转录病毒载体的例子包括但不限于：莫洛尼鼠白血病病毒(Moloneymurine leukemia virus，MoMuLV)、哈维鼠肉瘤病毒(Harvey murine sarcoma virus，HaMuSV)、鼠乳腺瘤病毒(MuMTV)和劳斯肉瘤病毒(Rous Sarcoma Virus，RSV)。许多另外的逆转录病毒载体可以掺入多种基因。所有这些载体都可以转移或掺入可选择的标记的基因，使得可以鉴定和产生转导的细胞。逆转录病毒载体可以通过附着例如糖、糖脂或蛋白质而成靶特异性的。优选的靶向通过使用抗体来完成。本领域技术人员将认识到，可以将特定多核苷酸序列插入逆转录病毒基因组中或附着于病毒包膜，以允许含有本公开文本的一种或多种药剂的逆转录病毒载体的靶特异性递送。
可替代地，可以通过常规磷酸钙转染，用编码逆转录病毒结构基因(gag、pol和env)的质粒直接转染组织培养细胞。然后用含有感兴趣基因的载体质粒转染这些细胞。所得的细胞将逆转录病毒载体释放至培养基中。
用于本公开文本的一种或多种药剂的另一种靶向递送系统是胶体分散系统。胶体分散系统包括例如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠粒和基于脂质的系统，其包括水包油乳液、胶团、混合胶团和脂质体。在某些实施方案中，本公开文本的优选胶体系统是脂质体。脂质体是人工膜囊泡，其在体外和体内可用作递送运载体。RNA、DNA和完整的病毒粒子可以包封在水性内部，并以生物活性形式递送至细胞中[Fraley等人(1981)TrendsBiochem.Sci.,6:77]。使用脂质体运载体进行有效基因转移的方法是本领域已知的[Mannino等人(1988)Biotechniques,6:682,1988]。
脂质体的组成通常是磷脂的组合，所述磷脂可以包括类固醇(例如胆固醇)。脂质体的物理特征取决于pH、离子强度和二价阳离子的存在。也可以使用其他磷脂或其他脂质，包括例如磷脂酰化合物(例如，磷脂酰甘油、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、鞘脂、脑苷脂和神经节苷脂)、卵磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱和二硬脂酰磷脂酰胆碱。基于例如器官特异性、细胞特异性和细胞器特异性，脂质体的靶向也是可能的，并且是本领域已知的。
通过引用并入
本文提及的所有出版物和专利均通过引用以其整体并入本文，如同每个单独的出版物或专利被特别且单独地指出通过引用并入一样。
虽然已经讨论了主题的特定实施方案，但是上述说明书是说明性的而非限制性的。在审阅本说明书和以下权利要求后，许多变化对于本领域技术人员而言将变得清楚。本发明的全部范围应该通过参考权利要求及其等同物的全部范围以及说明书和此类变化来确定。
实施例
现在一般性地描述本发明，通过参考以下实施例将更容易地理解本发明，所述实施例仅用于说明本发明的某些实施方案和实施方案的目的而被包括在内，并不旨在限制本发明。
实施例1.ALK4:ActRIIB异二聚体的产生
构建包含人ActRIIB和人ALK4的细胞外结构域的可溶性ALK4-Fc:ActRIIB-Fc异聚复合物，所述细胞外结构域采用位于该细胞外结构域与Fc结构域之间的接头各自分别与Fc结构域融合。各个构建体分别称为ActRIIB-Fc融合多肽和ALK4-Fc融合多肽，并且下面提供了各自的序列。
与ActRIIB-Fc或ALK4-Fc同二聚体复合物相反，用于促进ALK4-Fc:ActRIIB-Fc异聚复合物形成的方法是在Fc结构域的氨基酸序列中引入改变，以引导不对称异聚复合物的形成。在本公开文本中描述了使用Fc结构域制备不对称相互作用对的许多不同方法。
在一种方法中，分别在SEQ ID NO:39-41和42-44的ActRIIB-Fc和ALK4-Fc多肽序列中说明，改变一个Fc结构域以在相互作用面引入阳离子氨基酸，而改变另一个Fc结构域以在相互作用面引入阴离子氨基酸。ActRIIB-Fc融合多肽和ALK4-Fc融合多肽各自使用组织纤溶酶原激活物(TPA)前导序列：MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSP(SEQ ID NO:38)。
ActRIIB-Fc多肽序列(SEQ ID NO:39)如下所示：
前导(信号)序列和接头是加下划线的。为了促进ALK4-Fc:ActRIIB-Fc异二聚体而不是任何一种可能的同二聚体复合物的形成，可以将两个氨基酸取代(用赖氨酸置换酸性氨基酸)引入ActRIIB融合蛋白的Fc结构域中，如以上
所示。SEQ ID NO:39的氨基酸序列可以任选地提供为从C末端去除赖氨酸(K)。
该ActRIIB-Fc融合蛋白由以下核酸序列(SEQ ID NO:40)编码：
成熟的ActRIIB-Fc融合多肽(SEQ ID NO:41)如下，并且其可以任选地提供为从C末端去除赖氨酸(K)。
ALK4-Fc融合多肽的互补形式(SEQ ID NO:42)如下：
前导序列和接头是加下划线的。为了用上述SEQ ID NO:39和41的ActRIIB-Fc融合多肽引导异二聚体形成，可以将两个氨基酸取代(用天冬氨酸置换赖氨酸)引入ALK4-Fc融合多肽的Fc结构域中，如以上
所示。SEQ ID NO:42的氨基酸序列可以任选地提供为在C末端添加赖氨酸(K)。
该ALK4-Fc融合蛋白由以下核酸(SEQ ID NO:43)编码：
成熟的ALK4-Fc融合蛋白序列(SEQ ID NO:44)如下，并且其可以任选地提供为在C末端添加赖氨酸(K)。
SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:44的ActRIIB-Fc和ALK4-Fc蛋白分别可以在CHO细胞系中共表达并从中纯化，以产生包含ALK4-Fc:ActRIIB-Fc的异聚复合物。
在使用不对称Fc融合蛋白促进异多聚体复合物形成的另一种方法中，改变Fc结构域以引入互补的疏水性相互作用和另外的分子间二硫键，分别如SEQ ID NO:45-46和47-48的ActRIIB-Fc和ALK4-Fc多肽序列中所示。ActRIIB-Fc融合多肽和ALK4-Fc融合多肽各自使用组织纤溶酶原激活物(TPA)前导序列：MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSP(SEQ ID NO:38)。
ActRIIB-Fc多肽序列(SEQ ID NO:45)如下所示：
前导(信号)序列和接头是加下划线的。为了促进ALK4-Fc:ActRIIB-Fc异二聚体而不是任何一种可能的同二聚体复合物的形成，可以将两个氨基酸取代(用半胱氨酸置换丝氨酸和用色氨酸置换苏氨酸)引入融合蛋白的Fc结构域中，如以上
所示。SEQ IDNO:45的氨基酸序列可以任选地提供为从C末端去除赖氨酸(K)。
成熟的ActRIIB-Fc融合多肽如下：
ALK4-Fc融合多肽的互补形式(SEQ ID NO:47)如下，并且其可以任选地提供为从C末端去除赖氨酸(K)。
前导序列和接头是加下划线的。为了用上述SEQ ID NO:45和46的ActRIIB-Fc融合多肽引导异二聚体形成，可以将四个氨基酸取代引入ALK4融合多肽的Fc结构域中，如以上所示。SEQ ID NO:47的氨基酸序列可以任选地提供为从C末端去除赖氨酸(K)。
成熟的ALK4-Fc融合蛋白序列如下，并且其可以任选地提供为从C末端去除赖氨酸(K)。
SEQ ID NO:46和SEQ ID NO:48的ActRIIB-Fc和ALK4-Fc蛋白分别可以在CHO细胞系中共表达并从中纯化，以产生包含ALK4-Fc:ActRIIB-Fc的异聚复合物。
各种ALK4-Fc:ActRIIB-Fc复合物的纯化可以通过一系列柱色谱法步骤实现，包括例如以任何顺序的以下步骤中的三步或更多步：蛋白质A色谱法、Q琼脂糖色谱法、苯基琼脂糖色谱法、尺寸排阻色谱法、阳离子交换色谱法和基于表位的亲和色谱法(例如，采用针对ALK4或ActRIIB上的表位的抗体或功能等效配体)。纯化可以用病毒过滤和缓冲液交换完成。
在使用不对称Fc融合蛋白促进异多聚体复合物形成的另一种方法中，改变Fc结构域以引入互补的疏水性相互作用、另外的分子间二硫键和两个Fc结构域之间的静电差异，以促进基于净分子电荷的纯化，如分别在SEQ ID NO:70-73和74-77的ActRIIB-Fc和ALK4-Fc多肽序列中所示。ActRIIB-Fc融合多肽和ALK4-Fc融合多肽各自使用组织纤溶酶原激活物(TPA)前导序列：MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSP(SEQ ID NO:38)。
ActRIIB-Fc多肽序列(SEQ ID NO:70)如下所示：
前导序列和接头是加下划线的。为了促进ALK4-Fc:ActRIIB-Fc异二聚体而不是任何一种可能的同二聚体复合物的形成，可以将两个氨基酸取代(用半胱氨酸置换丝氨酸和用色氨酸置换苏氨酸)引入融合蛋白的Fc结构域中，如以上
所示。为了促进ALK4-Fc:ActRIIB-Fc异二聚体的纯化，也可以将两个氨基酸取代(用酸性氨基酸置换赖氨酸)引入融合蛋白的Fc结构域中，如以上
所示。SEQ ID NO:70的氨基酸序列可以任选地提供为在C末端添加赖氨酸。
该ActRIIB-Fc融合蛋白由以下核酸(SEQ ID NO:71)编码：
成熟的ActRIIB-Fc融合多肽如下所示(SEQ ID NO:72)，并且其可以任选地提供为在C末端添加赖氨酸。
该ActRIIB-Fc融合多肽由以下核酸(SEQ ID NO:73)编码：
ALK4-Fc融合多肽的互补形式(SEQ ID NO:74)如下，并且其可以任选地提供为从C末端去除赖氨酸。
前导序列和接头是加下划线的。为了用上述SEQ ID NO:70和72的ActRIIB-Fc融合多肽引导异二聚体形成，可以将四个氨基酸取代(用半胱氨酸置换酪氨酸，用丝氨酸置换苏氨酸，用丙氨酸置换亮氨酸，和用缬氨酸置换酪氨酸)引入ALK4融合多肽的Fc结构域中，如以上
所示。为了促进ALK4-Fc:ActRIIB-Fc异二聚体的纯化，也可以将两个氨基酸取代(用精氨酸置换天冬酰胺和用精氨酸置换天冬氨酸)引入ALK4-Fc融合多肽的Fc结构域中，如以上所示。SEQ ID NO:74的氨基酸序列可以任选地提供为从C末端去除赖氨酸。
该ALK4-Fc融合多肽由以下核酸(SEQ ID NO:75)编码：
成熟的ALK4-Fc融合多肽序列如下(SEQ ID NO:76)，并且其可以任选地提供为从C末端去除赖氨酸。
该ALK4-Fc融合多肽由以下核酸(SEQ ID NO:77)编码：
SEQ ID NO:72和SEQ ID NO:76的ActRIIB-Fc和ALK4-Fc蛋白分别可以在CHO细胞系中共表达并从中纯化，以产生包含ALK4-Fc:ActRIIB-Fc的异聚复合物。
各种ALK4-Fc:ActRIIB-Fc复合物的纯化可以通过一系列柱色谱法步骤实现，包括例如以任何顺序的以下步骤中的三步或更多步：蛋白质A色谱法、Q琼脂糖色谱法、苯基琼脂糖色谱法、尺寸排阻色谱法、阳离子交换色谱法、基于表位的亲和色谱法(例如，采用针对ALK4或ActRIIB上的表位的抗体或功能等效配体)和多元色谱法(例如，采用含有静电配体和疏水性配体的树脂)。纯化可以用病毒过滤和缓冲液交换完成。
在使用不对称Fc融合蛋白促进异多聚体复合物形成的另一种方法中，改变Fc结构域以引入互补的疏水性相互作用、另外的分子间二硫键以及特别是在ActRIIB-Fc多肽链中的组氨酸到精氨酸取代，以促进基于蛋白质A亲和力的纯化，如SEQ ID NO:78-81的ActRIIB-Fc多肽序列以及SEQ ID NO:47、48、82和83的ALK4-Fc多肽序列中所示。ActRIIB-Fc融合多肽和ALK4-Fc融合多肽各自使用TPA前导序列：MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSP(SEQ IDNO:38)。
ActRIIB-Fc多肽序列(SEQ ID NO:78)如下所示：
前导序列和接头是加下划线的。为了促进ALK4-Fc:ActRIIB-Fc异二聚体而不是任何一种可能的同二聚体复合物的形成，可以将两个氨基酸取代(用半胱氨酸置换丝氨酸和用色氨酸置换苏氨酸)引入ActRIIB-Fc融合多肽的Fc结构域中，如以上
所示。也可以将另一个氨基酸取代(用精氨酸置换组氨酸)引入融合蛋白的Fc结构域中，如以上
所示，以促进ALK4-Fc:ActRIIB-Fc异二聚体的纯化。SEQ ID NO:78的氨基酸序列可以任选地提供为从C末端去除赖氨酸。
该ActRIIB-Fc融合蛋白由以下核酸(SEQ ID NO:79)编码：
成熟的ActRIIB-Fc融合多肽如下(SEQ ID NO:80)，并且其可以任选地提供为从C末端去除赖氨酸。
该ActRIIB-Fc融合多肽由以下核酸(SEQ ID NO:81)编码：
ALK4-Fc融合多肽的互补形式是SEQ ID NO:47(如上所示)，其含有四个氨基酸取代以用SEQ ID NO:78和80的ActRIIB-Fc融合多肽引导异二聚体形成，并且其可以任选地提供为从C末端去除赖氨酸。
该ALK4-Fc融合多肽由以下核酸(SEQ ID NO:82)编码：
成熟的ALK4-Fc融合多肽序列是SEQ ID NO:48(如上所示)，并且其可以任选地通过为从C末端去除赖氨酸。
该ALK4-Fc融合多肽由以下核酸(SEQ ID NO:83)编码：
SEQ ID NO:80和SEQ ID NO:48的ActRIIB-Fc和ALK4-Fc蛋白分别可以在CHO细胞系中共表达并从中纯化，以产生包含ALK4-Fc:ActRIIB-Fc的异聚复合物。
各种ALK4-Fc:ActRIIB-Fc复合物的纯化可以通过一系列柱色谱法步骤实现，包括例如以任何顺序的以下步骤中的三步或更多步：蛋白质A色谱法、Q琼脂糖色谱法、苯基琼脂糖色谱法、尺寸排阻色谱法以及基于表位的亲和色谱法(例如，采用针对ALK4或ActRIIB上的表位的抗体或功能等效配体)和多元色谱法(例如，采用含有静电配体和疏水性配体的树脂)。纯化可以用病毒过滤和缓冲液交换完成。
实施例2.ALK4-Fc:ActRIIB-Fc异二聚体与ActRIIB-Fc同二聚体和ALK4-Fc同二聚体相比的配体结合概况
使用基于BiacoreTM的结合测定来比较上述ALK4-Fc:ActRIIB-Fc异二聚体复合物的配体结合选择性与ActRIIB-Fc和ALK4-Fc同二聚体复合物的配体结合选择性。使用抗Fc抗体将ALK4-Fc:ActRIIB-Fc异二聚体、ActRIIB-Fc同二聚体和ALK4-Fc同二聚体独立地捕获至该系统上。注射配体并使其流过捕获的受体蛋白。结果总结在下表中，其中最指示有效配体陷阱的配体解离速率(kd)由灰色阴影表示。
这些比较性结合数据证明ALK4-Fc:ActRIIB-Fc异二聚体相对于ActRIIB-Fc或ALK4-Fc同二聚体具有改变的结合概况/选择性。ALK4-Fc:ActRIIB-Fc异二聚体展示出与任一种同二聚体相比增强的与激活素B的结合，保留如对于ActRIIB-Fc同二聚体所观察到的与激活素A、GDF8和GDF11的强结合，并且显示出与BMP9、BMP10和GDF3的明显降低的结合。具体地，BMP9对ALK4-Fc:ActRIIB-Fc异二聚体展示出低或观察不到的亲和力，而该配体与ALK4-Fc:ActRIIB-Fc异二聚体强烈结合。与ActRIIB-Fc同二聚体一样，该异二聚体保留与BMP6的中等水平结合。参见图4。
另外，A-204报告基因测定用于评估ALK4-Fc:ActRIIB-Fc异二聚体和ActRIIB-Fc:ActRIIB-Fc同二聚体对通过激活素A、激活素B、GDF11、GDF8、BMP10和BMP9进行的信号传导的影响。细胞系：人类横纹肌肉瘤(来源于肌肉)。报告载体：pGL3(CAGA)12(如Dennler等人,1998,EMBO 17:3091-3100中所述)。CAGA12基序存在于TGF-β反应性基因(PAI-1基因)中，因此该载体通常用于通过Smad2和3的因子信号传导。以下概述了示例性A-204报告基因测定。
第1天：将A-204细胞分离至48孔板中。
第2天：用10ug pGL3(CAGA)12或pGL3(CAGA)12(10ug)+pRLCMV(1ug)和Fugene转染A-204细胞。
第3天：添加因子(稀释至培养基+0.1％BSA中)。在添加至细胞中之前，抑制剂需要与因子一起预孵育约一小时。约六小时后，用PBS冲洗细胞，然后裂解。
按照上述步骤，申请人进行了荧光素酶测定。
在该测定中，ALK4-Fc:ActRIIB-Fc异二聚体和ActRIIB-Fc:ActRIIB-Fc同二聚体均被确定为激活素A、激活素B、GDF11和GDF8的有效抑制剂。具体地，正如从图7中所示的比较性同二聚体/异二聚体IC50数据中可以看出，ALK4-Fc:ActRIIB-Fc异二聚体与ActRIIB-Fc:ActRIIB-Fc同二聚体类似地抑制激活素A、激活素B、GDF8和GDF11信号传导途径。然而，与ActRIIB-Fc:ActRIIB-Fc同二聚体相比，ALK4-Fc:ActRIIB-Fc异二聚体对BMP9和BMP10信号传导途径的抑制显著降低。该数据与上述结合数据一致，其中观察到ALK4-Fc:ActRIIB-Fc异二聚体和ActRIIB-Fc:ActRIIB-Fc同二聚体均展示出与激活素A、激活素B、GDF8和GDF11的强结合，但是与ActRIIB-Fc:ActRIIB-Fc同二聚体相比，BMP10和BMP9对ALK4-Fc:ActRIIB-Fc异二聚体的亲和力显著降低。
因此，这些数据共同证明与ActRIIB-Fc同二聚体相比，ALK4-Fc:ActRIIB-Fc异二聚体是激活素B、激活素A、GDF8和GDF11的更具选择性的拮抗剂。因此，ALK4-Fc:ActRIIB-Fc异二聚体在这种选择性拮抗作用是有利的某些应用中比ActRIIB-Fc同二聚体更有用。例子包括治疗性应用，其中需要保留激活素A、激活素B、激活素AB、GDF8和GDF11中的一种或多种的拮抗作用，而最小化BMP9、BMP10、GDF3和BMP6中的一种或多种的拮抗作用。
实施例3.在小鼠中ALK4-Fc:ActRIIB-Fc异二聚体与ActRIIB-Fc同二聚体相比的活性概况
在小鼠中测试同二聚体和异二聚体复合物以研究它们在体内的活性概况的差异。以大约10周龄开始，野生型C57BL/6小鼠用ActRIIB-Fc同二聚体(10mg/kg)、ALK4-Fc:ActRIIB-Fc异二聚体(3mg/kg或10mg/kg)或运载体(磷酸盐缓冲盐水，PBS)每周皮下给药两次，持续4周(每组n＝9只小鼠)。ALK4-Fc同二聚体未在体内测试，因为其在如通过表面等离子体共振测定的无细胞条件下不能以高亲和力结合配体。研究终点包括：体重；在基线和研究完成时(4周)如通过核磁共振(NMR)测定的总瘦肉量和总脂肪量；在基线和4周时如通过双能X射线吸收测定法(DEXA)测定的总骨矿物质密度；以及在4周时测定的腓肠肌、股直肌和胸肌的重量。
研究结果总结在上表中。正如所预期的，ActRIIB-Fc同二聚体引起身体组成的显著变化，许多变化与GDF8和激活素抑制的已知作用一致。与运载体处理的对照相比，在研究过程中用ActRIIB-Fc同二聚体处理野生型小鼠使体重增加超过两倍。与运载体相比，伴随该净重增加的是总瘦肉量和总骨矿物质密度的显著增加以及总脂肪量的显著降低。应该认识到，瘦肉和脂肪组织的归一化(基于百分比)变化不同于其与绝对变化的对应关系，因为瘦肉量(通常为小鼠体重的约70％)远大于脂肪量(通常为体重的约10％)。在用ActRIIB-Fc同二聚体处理的过程中，与运载体对照相比，检查的个体骨骼肌(包括腓肠肌、股骨和胸肌)的重量均显著增加。
ALK4-Fc:ActRIIB-Fc异二聚体产生了与ActRIIB-Fc同二聚体的作用惊人地相似的某些作用，尽管这两种复合物具有差异的配体选择性。如上表所示，对于所有列出的终点，用10mg/kg剂量水平的ALK4-Fc:ActRIIB-Fc异二聚体处理小鼠匹配、几乎匹配或超过在相同剂量水平下ActRIIB-Fc同二聚体的作用。对于几个终点，与10mg/kg相比，在3mg/kg下ALK4-Fc:ActRIIB-Fc异二聚体的作用轻微减弱，因此提供了剂量-作用关系的证据。
因此，ALK4-Fc:ActRIIB-Fc异二聚体对骨骼肌和骨发挥有益的合成代谢作用，并且对脂肪组织发挥分解代谢作用，这与ActRIIB-Fc同二聚体的作用非常相似。然而，与ActRIIB同二聚体不同，ALK4-Fc:ActRIIB-Fc异二聚体仅显示出与BMP9和BMP10的低亲和力或短暂结合，因此应该对由这些配体介导的过程(如血管生成)几乎没有并发抑制。这种新颖的选择性将可用于例如治疗需要对肌肉和骨的刺激作用和对脂肪的抑制作用但不需要改变血管生成的患者。
实施例4.ALK4:ActRIIB异多聚体处理抑制肾纤维化和炎症并减少肾损伤。
在小鼠单侧输尿管梗阻模型中评估实施例2中描述的ALK4-Fc:ActRIIB-Fc异二聚体对肾病的作用。参见例如Klahr和Morrissey(2002)Am J Physiol Renal Physiol 283:F861-F875。
12周龄的二十四只C57BL/6雄性小鼠在肾的下极水平下进行两次左侧单侧输尿管结扎。3天后，将八只小鼠安乐死，并从各个动物收获肾以评估肾损伤。将剩余的小鼠随机分成两组：i)在手术后第3天、第7天、第10天和第14天，将八只小鼠皮下注射10mg/kg剂量的ALK4-Fc:ActRIIB-Fc异二聚体；以及ii)在手术后第3天、第7天、第10天和第14天，将八只小鼠皮下注射运载体对照磷酸盐缓冲盐水(PBS)。根据相关的动物护理指南，在第17天处死两组小鼠。从UUO肾和对侧肾收集来自各个动物的半个肾用于组织学分析(H&E和马松三色(Masson’s Trichrome)染色)，并且1/4肾用于RNA提取(RNeasy Midi Kit，Qiagen，伊利诺伊州)。
对UUO肾样品进行基因表达分析以评估各个基因的水平。在CFX ConnectTM实时PCR检测系统(Bio-Rad，加利福尼亚州)上进行qRT-PCR，以评估各个纤维化基因(Col1a1、纤连蛋白、PAI-1、CTGF和a-SMA)、炎性基因(TNFa和MCP1)、细胞因子(TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3和激活素A)和肾损伤基因(NGAL)的表达。参见图8。用ALK4-Fc:ActRIIB-Fc异二聚体处理小鼠显著地抑制纤维化和炎性基因的表达，抑制TGFβ1/2/3的上调并且减少肾损伤。组织学数据证实，ALK4-Fc:ActRIIB-Fc异二聚体处理在UUO模型中显著地抑制肾纤维化并减少肾损伤。
总之，这些数据证明ALK4:ActRIIB异多聚体治疗抑制肾纤维化和炎症并减少肾损伤。此外，这些数据表明其他ALK4:ActRIIB拮抗剂可用于治疗或预防肾病，包括例如ALK4和/或ActRIIB结合配体的拮抗剂、ALK4和/或ActRIIB受体的拮抗剂、ALK4和/或ActRIIB下游信号传导介质(例如，Smad)的拮抗剂以及与ALK4和/或ActRIIB相关的TGFβ超家族共受体的拮抗剂。
实施例5.ALK4:ActRIIB异多聚体处理在奥尔波特小鼠模型中抑制肾纤维化并减少蛋白尿。
在Col4a3-/-和Col4a5奥尔波特小鼠模型中评估实施例2中描述的ALK4-Fc:ActRIIB-Fc异二聚体对肾病的作用。参见例如，Cosgrove D等人,(1996)Genes Dev.10(23):2981-92；Rheault MN等人,(2004)J Am Soc Nephrol.15(6):1466-74。
将2周龄的十六只Col4a3-/-雄性小鼠随机分成两组：i)八只小鼠每两周一次皮下注射10mg/kg剂量的ALK4-Fc:ActRIIB-Fc异二聚体，持续5周；ii)八只小鼠皮下注射运载体对照磷酸盐缓冲盐水(PBS)，持续5周。分别在4周、5周、6周和7周龄时通过代谢笼收集来自各个动物的尿样品。两组均在7周龄时处死，并收获来自各个动物的肾以评估肾损伤。收集来自各个动物的半个肾以供组织学分析(H&E和马松三色染色)，并且将来自各个动物的尿样品用于评估白蛋白尿，它是奥尔波特综合征中肾小球损害的标志(小鼠白蛋白抗原测定，Molecular Innovation，密歇根州；QuantiChrom肌酸酐测定试剂盒，BioAssay System，加利福尼亚州)。
进行白蛋白尿分析以评估相对于尿肌酸酐归一化后尿中的白蛋白水平(ACR：白蛋白与肌酸酐比率)。用ALK4-Fc:ActRIIB-Fc异二聚体处理小鼠显著地减少白蛋白尿(图9A)并抑制通过胶原-I的免疫荧光染色所测量的细胞外基质沉积(图10A)。与白蛋白尿结果一致，组织学数据证实在Col4a3-/-小鼠中ALK4-Fc:ActRIIB-Fc异二聚体处理显著地抑制肾纤维化(图10B)并减少硬化肾小球(图10C)。
为了证实奥尔波特小鼠模型的白蛋白尿的抑制，在Col4a5X连锁的奥尔波特小鼠模型中评估ALK4-Fc:ActRIIB-Fc异二聚体。将17周龄的三十只Col4a5半合子雄性小鼠随机分成两组：i)十五只小鼠每两周一次皮下注射10mg/kg剂量的ALK4-Fc:ActRIIB-Fc异二聚体，持续12周；ii)十五只小鼠皮下注射运载体对照磷酸盐缓冲盐水(PBS)，持续12周。分别在17周、20周、23周、26周和29周龄时通过代谢笼收集来自各个动物的尿样品以供白蛋白尿分析。与Col4a3-/-小鼠的结果一致，用ALK4-Fc:ActRIIB-Fc异二聚体处理Col4a5半合子小鼠显著地减少白蛋白尿(图9B)。
总之，这些数据证明ALK4:ActRIIB异二聚体处理抑制肾纤维化并减少硬化肾小球，这与奥尔波特小鼠模型的白蛋白尿的改善有关。此外，这些数据表明其他ALK4:ActRIIB拮抗剂可用于治疗或预防奥尔波特综合征中的肾功能障碍。
实施例6.ALK4:ActRIIB异多聚体处理在小鼠肌萎缩侧索硬化(ALS)模型中改善肌肉量和强度。
在SOD1小鼠肌萎缩侧索硬化(ALS)模型中评估实施例2中描述的ALK4-Fc:ActRIIB-Fc异二聚体对疾病状况下的肌肉量和强度的影响。参见例如，Gurney等人(1994)Science 264(5166):1772-1775。在SOD1模型中，小鼠在大约12周龄时出现轻度疾病症状：肌无力和/或僵硬，并且它们在大约16周龄时出现更严重的症状：肌肉麻痹和/或呼吸衰竭。在该研究中，在8周龄(“有症状前”阶段)、12周龄(“疾病发作”阶段)和16周龄(“疾病进展”阶段)时检查SOD1小鼠。
将5周龄的SOD1[B6SJL-Tg(SOD1*G93A)1Gur/J]小鼠分成单独的组：i)每周两次皮下注射运载体对照磷酸盐缓冲盐水的小鼠；和ii)每周两次皮下注射10mg/kg剂量的ALK4-Fc:ActRIIB-Fc异二聚体的小鼠。还将这两个处理组与5周龄的每周两次接受运载体对照磷酸盐缓冲盐水的皮下注射的野生型小鼠进行比较。观察小鼠在11周的过程中肌肉量、肌纤维区域的变化和肌肉强直力的变化。与野生型小鼠相比，接受运载体的SOD1小鼠在12周龄(大约55mg相对于40mg肌肉量)和16周龄(大约60mg相对于35mg肌肉量)时展示出显著降低的胫骨前肌(TA)肌肉量。相比之下，接受ALK4-Fc:ActRIIB-Fc的SOD1小鼠在8周龄(大约55mg相对于80mg肌肉量)和12周龄(大约60mg相对于85mg肌肉量)时惊人地展示出比野生型小鼠显著更多的TA肌肉量。在疾病进展阶段的小鼠中，接受ALK4-Fc:ActRIIB-Fc的SOD1小鼠展示出与野生型动物相比轻微降低的TA肌肉量，但是ALK4-Fc:ActRIIB-Fc处理的动物具有与接受运载体的SOD1小鼠相比显著更多(>80％)的TA肌肉量。在检查TA肌纤维面积(μm2)时观察到类似的趋势。具体地，与野生型小鼠相比，接受运载体的SOD1小鼠在12周龄时展示出TA肌纤维的轻微减少(大约1900μm2相对于1700μm2肌纤维)，并且在疾病进展阶段的小鼠中观察到TA肌纤维的大幅减少(大约2200μm2相对于1450μm2肌纤维)。相比之下，接受ALK4-Fc:ActRIIB-Fc的SOD1小鼠在12周龄时展示出比野生型小鼠显著更多的TA肌肉量(大约2300μm2相对于1900μm2肌纤维)。在疾病进展阶段的小鼠中，接受ALK4-Fc:ActRIIB-Fc的SOD1小鼠展示出与野生型动物相比略微降低的TA肌纤维浓度，但是ALK4-Fc:ActRIIB-Fc处理的动物具有与接受运载体的SOD1小鼠相比显著更高(>29％)的TA肌纤维浓度。TA肌肉量和纤维含量的增加与强度的增加有关。例如，与野生型小鼠相比，接受运载体的SOD1小鼠在12周龄时展示出通过肌肉的强直力峰值(mN)所测量的适度降低的TA肌肉强度(大约1300mN相对于900mN强直力峰值)，并且在疾病进展阶段的小鼠中观察到TA肌肉强度的大幅降低(大约1250mN相对于600mN强直力峰值)。接受ALK4-Fc:ActRIIB-Fc的SOD1小鼠在12周龄(>25％增加的肌肉强度)和16周龄(>43％增加的肌肉强度)时展示出比接受运载体的SOD1小鼠显著增强的TA肌肉强度。
总之，数据证明ALK4-mFc:ActRIIB-mFc疗法在小鼠ALS模型中能够增加肌肉量和强度。因此，数据表明ALK4-mFc:ActRIIB-mFc和可能的其他ALK4:ActRIIB拮抗剂可以用于治疗其他肌肉障碍，特别是运动神经元和神经肌肉疾病。
实施例7.ALK4:ActRIIB异多聚体处理在小鼠肌营养不良模型中改善膈肌强度。
在mdx小鼠肌营养不良模型中进一步评估实施例2中描述的ALK4-Fc:ActRIIB-Fc异二聚体对疾病状况下的肌肉量和强度的影响。在该mdx模型中，可以在任何早期龄(即，大约7周龄)时观察到肌营养不良蛋白缺乏的表型。
将5周龄的mdx(D2.B10-Dmdmdx/J)小鼠分成单独的组：i)每周两次皮下注射运载体对照磷酸盐缓冲盐水的小鼠；和ii)每周两次皮下注射10mg/kg剂量的ALK4-Fc:ActRIIB-Fc异二聚体的小鼠。还将这两个处理组与5周龄的每周两次接受运载体对照磷酸盐缓冲盐水的皮下注射的野生型小鼠进行比较。在处理8周后观察小鼠肌肉强度的变化。与野生型小鼠相比，接受运载体的mdx小鼠在8周后展示出通过肌肉的比力(kPa)所测量的膈肌强度的显著降低[即，大约89kPa(野生型)相对于32kPa(dmx)]。相比之下，与接受运载体对照的mdx小鼠相比，观察到ALK4-Fc:ActRIIB-Fc处理显著地增强膈肌强度(>63％)。
数据证明ALK4-mFc:ActRIIB-mFc疗法在小鼠mdx模型中能够增强强度。因此，数据表明ALK4-mFc:ActRIIB-mFc和可能的其他ALK4:ActRIIB拮抗剂可以用于治疗其他肌肉障碍，特别是肌营养不良，包括例如DMD和BMD。
Claims (269)
1.一种重组ALK4:ActRIIB异多聚体，其包含至少一种ALK4-Fc融合蛋白和至少一种ActRIIB-Fc融合蛋白，其中该ALK4-Fc融合蛋白包含改变该ALK4-Fc融合蛋白的等电点(pI)的一个或多个氨基酸修饰和/或其中该ActRIIB-Fc融合蛋白包含改变该ActRIIB-Fc融合蛋白的pI的一个或多个氨基酸修饰。
2.权利要求1的ALK4:ActRIIB异多聚体，其中：
a)该ALK4-Fc融合蛋白中的该一个或多个氨基酸修饰赋予该ALK4-Fc融合蛋白与该ActRIIB-Fc融合蛋白之间pI的增加的差异；
b)该ActRIIB-Fc融合蛋白中的该一个或多个氨基酸修饰赋予该ActRIIB-Fc融合蛋白与该ALK4-Fc融合蛋白之间pI的增加的差异；或
c)该ALK4-Fc融合蛋白中的该一个或多个氨基酸修饰赋予该ALK4-Fc融合蛋白与该ActRIIB-Fc融合蛋白之间pI的增加的差异，并且该ActRIIB-Fc融合蛋白中的该一个或多个氨基酸修饰赋予该ActRIIB-Fc融合蛋白与该ALK4-Fc融合蛋白之间pI的增加的差异。
3.权利要求2的ALK4:ActRIIB异多聚体，其中：
a)该ALK4-Fc融合蛋白包含提高该ALK4-Fc融合蛋白的pI的一个或多个氨基酸修饰；并且
b)该ActRIIB-Fc融合蛋白包含降低该ActRIIB-Fc融合蛋白的pI的一个或多个氨基酸修饰。
4.权利要求1-3中任一项的ALK4:ActRIIB异多聚体，其中ALK4-Fc融合蛋白Fc结构域是IgG1 Fc结构域，并且其中该IgG1 Fc结构域包含改变该ALK4-Fc融合蛋白的pI的一个或多个氨基酸修饰。
5.权利要求4的ALK4:ActRIIB异多聚体，其中该ALK4-Fc融合蛋白IgG1 Fc结构域包含与SEQ ID NO:31的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更相同的氨基酸序列。
6.权利要求5的ALK4:ActRIIB异多聚体，其中该ALK4-Fc融合蛋白IgG1 Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代选自：
a)在对应于SEQ ID NO:31的N162的位置处的氨基酸取代；
b)在对应于SEQ ID NO:31的D179的位置处的氨基酸取代；以及
c)在对应于SEQ ID NO:31的N162的位置处的氨基酸取代和在对应于SEQ ID NO:31的D179的位置处的氨基酸取代。
7.权利要求6的ALK4:ActRIIB异多聚体，其中该ALK4-Fc融合蛋白IgG1 Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代选自：
a)在对应于SEQ ID NO:31的N162的位置处的精氨酸、赖氨酸或组氨酸取代(N162R、N162K或N162H)；
b)在对应于SEQ ID NO:31的D179的位置处的精氨酸、赖氨酸或组氨酸取代(D179R、D179K或D179H)；以及
c)在对应于SEQ ID NO:31的N162的位置处的精氨酸、赖氨酸或组氨酸取代(N162R、N162K或N162H)和在对应于SEQ ID NO:31的D179的位置处的精氨酸、赖氨酸或组氨酸取代(D179R、D179K或D179H)。
8.权利要求7的ALK4:ActRIIB异多聚体，其中该ALK4-Fc融合蛋白IgG1 Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代选自：
a)在对应于SEQ ID NO:31的N162的位置处的精氨酸取代(N162R)；
b)在对应于SEQ ID NO:31的D179的位置处的精氨酸取代(D179R)；以及
c)在对应于SEQ ID NO:31的N162的位置处的精氨酸取代(N162R)和在对应于SEQ IDNO:31的D179的位置处的精氨酸取代(D179R)。
9.权利要求1-3中任一项的ALK4:ActRIIB异多聚体，其中ALK4-Fc融合蛋白Fc结构域是IgG2 Fc结构域，并且其中该IgG2 Fc结构域包含改变该ALK4-Fc融合蛋白的pI的一个或多个氨基酸修饰。
10.权利要求9中任一项的ALK4:ActRIIB异多聚体，其中该ALK4-Fc融合蛋白IgG2 Fc结构域包含与SEQ ID NO:32的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更相同的氨基酸序列。
11.权利要求10的ALK4:ActRIIB异多聚体，其中该ALK4-Fc融合蛋白IgG2 Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代选自：
a)在对应于SEQ ID NO:32的N160的位置处的氨基酸取代；
b)在对应于SEQ ID NO:32的D177的位置处的氨基酸取代；以及
c)在对应于SEQ ID NO:32的N160的位置处的氨基酸取代和在对应于SEQ ID NO:32的D177的位置处的氨基酸取代。
12.权利要求11的ALK4:ActRIIB异多聚体，其中该ALK4-Fc融合蛋白IgG2 Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代选自：
a)在对应于SEQ ID NO:32的N160的位置处的精氨酸、赖氨酸或组氨酸取代(N160R、N160K或N160H)；
b)在对应于SEQ ID NO:32的D177的位置处的精氨酸、赖氨酸或组氨酸取代(D177R、D177K或D177H)；以及
c)在对应于SEQ ID NO:32的N160的位置处的精氨酸、赖氨酸或组氨酸取代(N160R、N160K或N160H)和在对应于SEQ ID NO:32的D177的位置处的精氨酸、赖氨酸或组氨酸取代(D177R、D177K或D177H)。
13.权利要求1-3中任一项的ALK4:ActRIIB异多聚体，其中ALK4-Fc融合蛋白Fc结构域是IgG3 Fc结构域，并且其中该IgG3 Fc结构域包含改变该ALK4-Fc融合蛋白的pI的一个或多个氨基酸修饰。
14.权利要求13的ALK4:ActRIIB异多聚体，其中该ALK4-Fc融合蛋白IgG3 Fc结构域包含与SEQ ID NO:33的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更相同的氨基酸序列。
15.权利要求14的ALK4:ActRIIB异多聚体，其中该ALK4-Fc融合蛋白IgG3 Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代选自：
a)在对应于SEQ ID NO:33的S169的位置处的氨基酸取代；
b)在对应于SEQ ID NO:33的D186的位置处的氨基酸取代；以及
c)在对应于SEQ ID NO:33的S169的位置处的氨基酸取代和在对应于SEQ ID NO:33的D186的位置处的氨基酸取代。
16.权利要求15的ALK4:ActRIIB异多聚体，其中该ALK4-Fc融合蛋白IgG3 Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代选自：
a)在对应于SEQ ID NO:33的S169的位置处的精氨酸、赖氨酸或组氨酸取代(S169R、S169K或S169H)；
b)在对应于SEQ ID NO:33的D186的位置处的精氨酸、赖氨酸或组氨酸取代(D186R、D186K或D186H)；以及
c)在对应于SEQ ID NO:33的S169的位置处的精氨酸、赖氨酸或组氨酸取代(S169R、S169K或S169H)和在对应于SEQ ID NO:33的D186的位置处的精氨酸、赖氨酸或组氨酸取代(D186R、D186K或D186H)。
17.权利要求1-3中任一项的ALK4:ActRIIB异多聚体，其中ALK4-Fc融合蛋白Fc结构域是IgG4 Fc结构域，并且其中该IgG4 Fc结构域包含改变该ALK4-Fc融合蛋白的pI的一个或多个氨基酸修饰。
18.权利要求17的ALK4:ActRIIB异多聚体，其中该ALK4-Fc融合蛋白IgG4 Fc结构域包含与SEQ ID NO:35的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更相同的氨基酸序列。
19.权利要求18的ALK4:ActRIIB异多聚体，其中该ALK4-Fc融合蛋白IgG4 Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代选自：
a)在对应于SEQ ID NO:35的N166的位置处的氨基酸取代；
b)在对应于SEQ ID NO:35的D183的位置处的氨基酸取代；以及
c)在对应于SEQ ID NO:35的N166的位置处的氨基酸取代和在对应于SEQ ID NO:35的D183的位置处的氨基酸取代。
20.权利要求19的ALK4:ActRIIB异多聚体，其中该ALK4-Fc融合蛋白IgG4 Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代选自：
a)在对应于SEQ ID NO:35的N166的位置处的精氨酸、赖氨酸或组氨酸取代(N166R、N166K或N166H)；
b)在对应于SEQ ID NO:35的D183的位置处的精氨酸、赖氨酸或组氨酸取代(D183R、D183K或D183H)；以及
c)在对应于SEQ ID NO:35的N166的位置处的精氨酸、赖氨酸或组氨酸取代(N166R、N166K或N166H)和在对应于SEQ ID NO:32的D183的位置处的精氨酸、赖氨酸或组氨酸取代(D183R、D183K或D183H)。
21.权利要求3的ALK4:ActRIIB异多聚体，其中：
a)该ALK4-Fc融合蛋白包含用一个或多个带正电的氨基酸[例如，精氨酸(R)、赖氨酸(K)或组氨酸(H)]取代一个或多个中性或带负电的氨基酸；并且
b)该ActRIIB-Fc融合蛋白包含用一个或多个带负电的氨基酸[例如，天冬氨酸(E)或谷氨酸(D)]取代一个或多个中性或带正电的氨基酸。
22.权利要求1-21中任一项的ALK4:ActRIIB异多聚体，其中该ActRIIB-Fc融合蛋白Fc结构域是IgG1 Fc结构域，并且其中该IgG1 Fc结构域包含改变该ActRIIB-Fc融合蛋白的pI的一个或多个氨基酸修饰。
23.权利要求22的ALK4:ActRIIB异多聚体，其中该ActRIIB-Fc融合蛋白IgG1 Fc结构域包含与SEQ ID NO:31的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更相同的氨基酸序列。
24.权利要求23的ALK4:ActRIIB异多聚体，其中该ActRIIB-Fc融合蛋白IgG1 Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代选自：
a)在对应于SEQ ID NO:31的K138的位置处的氨基酸取代；
b)在对应于SEQ ID NO:31的K217的位置处的氨基酸取代；以及
c)在对应于SEQ ID NO:31的K138的位置处的氨基酸取代和在对应于SEQ ID NO:31的K217的位置处的氨基酸取代。
25.权利要求24的ALK4:ActRIIB异多聚体，其中该ActRIIB-Fc融合蛋白IgG1 Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代选自：
a)在对应于SEQ ID NO:31的K138的位置处的天冬氨酸或谷氨酸取代(K138E或K138D)；
b)在对应于SEQ ID NO:31的K217的位置处的天冬氨酸或谷氨酸取代(K217E或K217D)；以及
c)在对应于SEQ ID NO:31的K138的位置处的天冬氨酸或谷氨酸取代(K138E或K138D)和在对应于SEQ ID NO:31的K217的位置处的天冬氨酸或谷氨酸取代(K217E或K217D)。
26.权利要求25的ALK4:ActRIIB异多聚体，其中该ALK4-Fc融合蛋白IgG1 Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代选自：
a)在对应于SEQ ID NO:31的K138的位置处的谷氨酸取代(K138E)；
b)在对应于SEQ ID NO:31的K217的位置处的天冬氨酸取代(K217D)；以及
c)在对应于SEQ ID NO:31的K138的位置处的谷氨酸取代(K138E)和在对应于SEQ IDNO:31的K217的位置处的天冬氨酸取代(K217D)。
27.权利要求1-21中任一项的ALK4:ActRIIB异多聚体，其中该ActRIIB-Fc融合蛋白Fc结构域是IgG2 Fc结构域，并且其中该IgG2 Fc结构域包含改变该ActRIIB-Fc融合蛋白的pI的一个或多个氨基酸修饰。
28.权利要求27的ALK4:ActRIIB异多聚体，其中该ActRIIB-Fc融合蛋白IgG2 Fc结构域包含与SEQ ID NO:32的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更相同的氨基酸序列。
29.权利要求28的ALK4:ActRIIB异多聚体，其中该ActRIIB-Fc融合蛋白IgG2融合Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代选自：
a)在对应于SEQ ID NO:32的K136的位置处的氨基酸取代；
b)在对应于SEQ ID NO:32的K215的位置处的氨基酸取代；以及
c)在对应于SEQ ID NO:32的K136的位置处的氨基酸取代和在对应于SEQ ID NO:32的K215的位置处的氨基酸取代。
30.权利要求29的ALK4:ActRIIB异多聚体，其中该ActRIIB-Fc融合蛋白IgG2 Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代选自：
a)在对应于SEQ ID NO:32的K136的位置处的天冬氨酸或谷氨酸取代(K136E或K136D)；
b)在对应于SEQ ID NO:32的K215的位置处的天冬氨酸或谷氨酸取代(K215E或K215D)；以及
c)在对应于SEQ ID NO:32的K136的位置处的天冬氨酸或谷氨酸取代(K136E或K136D)和在对应于SEQ ID NO:32的K215的位置处的天冬氨酸或谷氨酸取代(K215E或K215D)。
31.权利要求1-21中任一项的ALK4:ActRIIB异多聚体，其中该ActRIIB-Fc融合蛋白Fc结构域是IgG3 Fc结构域，并且其中该IgG3 Fc结构域包含改变该ActRIIB-Fc融合蛋白的pI的一个或多个氨基酸修饰。
32.权利要求31的ALK4:ActRIIB异多聚体，其中该ActRIIB-Fc融合蛋白IgG3 Fc结构域包含与SEQ ID NO:33的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更相同的氨基酸序列。
33.权利要求32的ALK4:ActRIIB异多聚体，其中该ActRIIB-Fc融合蛋白IgG3融合Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代选自：
a)在对应于SEQ ID NO:33的K145的位置处的氨基酸取代；
b)在对应于SEQ ID NO:33的K224的位置处的氨基酸取代；以及
c)在对应于SEQ ID NO:33的K145的位置处的氨基酸取代和在对应于SEQ ID NO:33的K224的位置处的氨基酸取代。
34.权利要求33的ALK4:ActRIIB异多聚体，其中该修饰的ActRIIB-Fc融合蛋白IgG3 Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代选自：
a)在对应于SEQ ID NO:33的K145的位置处的天冬氨酸或谷氨酸取代(K145E或K145D)；
b)在对应于SEQ ID NO:33的K224的位置处的天冬氨酸或谷氨酸取代(K224E或K224D)；以及
c)在对应于SEQ ID NO:33的K145的位置处的天冬氨酸或谷氨酸取代(K145E或K145D)和在对应于SEQ ID NO:33的K224的位置处的天冬氨酸或谷氨酸取代(K224E或K224D)。
35.权利要求1-21中任一项的ALK4:ActRIIB异多聚体，其中该ActRIIB-Fc融合蛋白Fc结构域是IgG4 Fc结构域，并且其中该IgG4 Fc结构域包含改变该ActRIIB-Fc融合蛋白的pI的一个或多个氨基酸修饰。
36.权利要求35的ALK4:ActRIIB异多聚体，其中该ActRIIB-Fc融合蛋白IgG4 Fc结构域包含与SEQ ID NO:35的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更相同的氨基酸序列。
37.权利要求36的ALK4:ActRIIB异多聚体，其中该ActRIIB-Fc融合蛋白IgG4融合Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代
选自：
a)在对应于SEQ ID NO:35的K142的位置处的氨基酸取代；
b)在对应于SEQ ID NO:35的K221的位置处的氨基酸取代；以及
c)在对应于SEQ ID NO:35的K142的位置处的氨基酸取代和在对应于SEQ ID NO:35的K221的位置处的氨基酸取代。
38.权利要求37的ALK4:ActRIIB异多聚体，其中该ActRIIB-Fc融合蛋白IgG4 Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代选自：
a)在对应于SEQ ID NO:35的K142的位置处的天冬氨酸或谷氨酸取代(K142E或K142D)；
b)在对应于SEQ ID NO:35的K221的位置处的天冬氨酸或谷氨酸取代(K221E或K221D)；以及
c)在对应于SEQ ID NO:35的K142的位置处的天冬氨酸或谷氨酸取代(K142E或K142D)和在对应于SEQ ID NO:35的K221的位置处的天冬氨酸或谷氨酸取代(K221E或K221D)。
39.权利要求2的ALK4:ActRIIB异多聚体，其中：
a)该ActRIIB-Fc融合蛋白包含提高该ActRIIB-Fc融合蛋白的pI的一个或多个氨基酸修饰；并且
b)该ALK4-Fc融合蛋白包含降低该ALK4-Fc融合蛋白的pI的一个或多个氨基酸修饰。
40.权利要求39的ALK4:ActRIIB异多聚体，其中：
a)该ActRIIB-Fc融合蛋白包含用一个或多个带正电的氨基酸[例如，精氨酸(R)、赖氨酸(K)或组氨酸(H)]取代一个或多个中性或带负电的氨基酸；并且
b)该ALK4-Fc融合蛋白包含用一个或多个带负电的氨基酸[例如，天冬氨酸(E)或谷氨酸(D)]取代一个或多个中性或带正电的氨基酸。
41.权利要求39或40的ALK4:ActRIIB异多聚体，其中该ActRIIB-Fc融合蛋白Fc结构域是IgG1 Fc结构域，并且其中该IgG1 Fc结构域包含改变该ALK4-Fc融合蛋白的pI的一个或多个氨基酸修饰。
42.权利要求41的ALK4:ActRIIB异多聚体，其中该ActRIIB-Fc融合蛋白IgG1 Fc结构域包含与SEQ ID NO:31的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更相同的氨基酸序列。
43.权利要求42的ALK4:ActRIIB异多聚体，其中该ActRIIB-Fc融合蛋白IgG1 Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代选自：
a)在对应于SEQ ID NO:31的N162的位置处的氨基酸取代；
b)在对应于SEQ ID NO:31的D179的位置处的氨基酸取代；以及
c)在对应于SEQ ID NO:31的N162的位置处的氨基酸取代和在对应于SEQ ID NO:31的D179的位置处的氨基酸取代。
44.权利要求43的ALK4:ActRIIB异多聚体，其中该ActRIIB-Fc融合蛋白IgG1 Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代选自：
a)在对应于SEQ ID NO:31的N162的位置处的精氨酸、赖氨酸或组氨酸取代(N162R、N162K或N162H)；
b)在对应于SEQ ID NO:31的D179的位置处的精氨酸、赖氨酸或组氨酸取代(D179R、D179K或D179H)；以及
c)在对应于SEQ ID NO:31的N162的位置处的精氨酸、赖氨酸或组氨酸取代(N162R、N162K或N162H)和在对应于SEQ ID NO:31的D179的位置处的精氨酸、赖氨酸或组氨酸取代(D179R、D179K或D179H)。
45.权利要求44的ALK4:ActRIIB异多聚体，其中该ActRIIB-Fc融合蛋白IgG1 Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代选自：
a)在对应于SEQ ID NO:31的N162的位置处的精氨酸取代(N162R)；
b)在对应于SEQ ID NO:31的D179的位置处的精氨酸取代(D179R)；以及
c)在对应于SEQ ID NO:31的N162的位置处的精氨酸取代(N162R)和在对应于SEQ IDNO:31的D179的位置处的精氨酸取代(D179R)。
46.权利要求39或40的ALK4:ActRIIB异多聚体，其中该ActRIIB-Fc融合蛋白Fc结构域是IgG2 Fc结构域，并且其中该IgG2 Fc结构域包含改变该ActRIIB-Fc融合蛋白的pI的一个或多个氨基酸修饰。
47.权利要求46的ALK4:ActRIIB异多聚体，其中该ActRIIB-Fc融合蛋白IgG2 Fc结构域包含与SEQ ID NO:32的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更相同的氨基酸序列。
48.权利要求47的ALK4:ActRIIB异多聚体，其中该ActRIIB-Fc融合蛋白IgG2 Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代选自：
a)在对应于SEQ ID NO:32的N160的位置处的氨基酸取代；
b)在对应于SEQ ID NO:32的D177的位置处的氨基酸取代；以及
c)在对应于SEQ ID NO:32的N160的位置处的氨基酸取代和在对应于SEQ ID NO:32的D177的位置处的氨基酸取代。
49.权利要求48的ALK4:ActRIIB异多聚体，其中该ActRIIB-Fc融合蛋白IgG2 Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代选自：
a)在对应于SEQ ID NO:32的N160的位置处的精氨酸、赖氨酸或组氨酸取代(N160R、N160K或N160H)；
b)在对应于SEQ ID NO:32的D177的位置处的精氨酸、赖氨酸或组氨酸取代(D177R、D177K或D177H)；以及
c)在对应于SEQ ID NO:32的N160的位置处的精氨酸、赖氨酸或组氨酸取代(N160R、N160K或N160H)和在对应于SEQ ID NO:32的D177的位置处的精氨酸、赖氨酸或组氨酸取代(D177R、D177K或D177H)。
50.权利要求39或40的ALK4:ActRIIB异多聚体，其中该ActRIIB-Fc融合蛋白Fc结构域是IgG3 Fc结构域，并且其中该IgG3 Fc结构域包含改变该ActRIIB-Fc融合蛋白的pI的一个或多个氨基酸修饰。
51.权利要求50的ALK4:ActRIIB异多聚体，其中该ActRIIB-Fc融合蛋白IgG3 Fc结构域包含与SEQ ID NO:33的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更相同的氨基酸序列。
52.权利要求51的ALK4:ActRIIB异多聚体，其中该ActRIIB-Fc融合蛋白IgG3 Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代选自：
a)在对应于SEQ ID NO:33的S169的位置处的氨基酸取代；
b)在对应于SEQ ID NO:33的D186的位置处的氨基酸取代；以及
c)在对应于SEQ ID NO:33的S169的位置处的氨基酸取代和在对应于SEQ ID NO:33的D186的位置处的氨基酸取代。
53.权利要求52的ALK4:ActRIIB异多聚体，其中该修饰的ActRIIB-Fc融合蛋白IgG3 Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代选自：
a)在对应于SEQ ID NO:33的S169的位置处的精氨酸、赖氨酸或组氨酸取代(S169R、S169K或S169H)；
b)在对应于SEQ ID NO:33的D186的位置处的精氨酸、赖氨酸或组氨酸取代(D186R、D186K或D186H)；以及
c)在对应于SEQ ID NO:33的S169的位置处的精氨酸、赖氨酸或组氨酸取代(S169R、S169K或S169H)和在对应于SEQ ID NO:33的D186的位置处的精氨酸、赖氨酸或组氨酸取代(D186R、D186K或D186H)。
54.权利要求39或40的ALK4:ActRIIB异多聚体，其中该ActRIIB-Fc融合蛋白Fc结构域是IgG4 Fc结构域，并且其中该IgG4 Fc结构域包含改变该ActRIIB-Fc融合蛋白的pI的一个或多个氨基酸修饰。
55.权利要求54的ALK4:ActRIIB异多聚体，其中该ActRIIB-Fc融合蛋白IgG4 Fc结构域包含与SEQ ID NO:35的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更相同的氨基酸序列。
56.权利要求55的ALK4:ActRIIB异多聚体，其中该ActRIIB-Fc融合蛋白IgG4 Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代选自：
a)在对应于SEQ ID NO:35的N166的位置处的氨基酸取代；
b)在对应于SEQ ID NO:35的D183的位置处的氨基酸取代；以及
c)在对应于SEQ ID NO:35的N166的位置处的氨基酸取代和在SEQ ID NO:35的位置D183处的氨基酸取代。
57.权利要求56的ALK4:ActRIIB异多聚体，其中该ActRIIB-Fc融合蛋白IgG4 Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代选自：
a)在对应于SEQ ID NO:35的N166的位置处的精氨酸、赖氨酸或组氨酸取代(N166R、N166K或N166H)；
b)在对应于SEQ ID NO:35的D183的位置处的精氨酸、赖氨酸或组氨酸取代(D183R、D183K或D183H)；以及
c)在对应于SEQ ID NO:35的N166的位置处的精氨酸、赖氨酸或组氨酸取代(N166R、N166K或N166H)和在对应于SEQ ID NO:35的D183的位置处的精氨酸、赖氨酸或组氨酸取代(D183R、D183K或D183H)。
58.权利要求2的ALK4:ActRIIB异多聚体，其中该ALK4-Fc融合蛋白中的该一个或多个氨基酸修饰降低该ALK4-Fc融合蛋白的pI。
59.权利要求2或39-40的ALK4:ActRIIB异多聚体，其中该ALK4-Fc融合蛋白Fc结构域是IgG1 Fc结构域，并且其中该IgG1 Fc结构域包含改变该ALK4-Fc融合蛋白的pI的一个或多个氨基酸修饰。
60.权利要求59的ALK4:ActRIIB异多聚体，其中该ALK4-Fc融合蛋白IgG1 Fc结构域包含与SEQ ID NO:31的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更相同的氨基酸序列。
61.权利要求59或60的ALK4:ActRIIB异多聚体，其中该ALK4-Fc融合蛋白IgG1融合Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代选自：
a)在对应于SEQ ID NO:31的K138的位置处的氨基酸取代；
b)在对应于SEQ ID NO:31的K217的位置处的氨基酸取代；以及
c)在对应于SEQ ID NO:31的K138的位置处的氨基酸取代和在对应于SEQ ID NO:31的K217的位置处的氨基酸取代。
62.权利要求61的ALK4:ActRIIB异多聚体，其中该ALK4-Fc融合蛋白IgG1 Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代选自：
a)在对应于SEQ ID NO:31的K138的位置处的天冬氨酸或谷氨酸取代(K138E或K138D)；
b)在对应于SEQ ID NO:31的K217的位置处的天冬氨酸或谷氨酸取代(K217E或K217D)；以及
c)在对应于SEQ ID NO:31的K138的位置处的天冬氨酸或谷氨酸取代(K138E或K138D)和在对应于SEQ ID NO:31的K217的位置处的天冬氨酸或谷氨酸取代(K217E或K217D)。
63.权利要求62的ALK4:ActRIIB异多聚体，其中该ALK4-Fc融合蛋白IgG1 Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代选自：
a)在对应于SEQ ID NO:31的K138的位置处的谷氨酸取代(K138E)；
b)在对应于SEQ ID NO:31的K217的位置处的天冬氨酸取代(K217D)；以及
c)在对应于SEQ ID NO:31的K138的位置处的谷氨酸取代(K138E)和在对应于SEQ IDNO:31的K217的位置处的天冬氨酸取代(K217D)。
64.权利要求2或39-40的ALK4:ActRIIB异多聚体，其中该ALK4-Fc融合蛋白Fc结构域是IgG2 Fc结构域，并且其中该IgG2 Fc结构域包含改变该ALK4-Fc融合蛋白的pI的一个或多个氨基酸修饰。
65.权利要求64的ALK4:ActRIIB异多聚体，其中该ALK4-Fc融合蛋白IgG2 Fc结构域包含与SEQ ID NO:32的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更相同的氨基酸序列。
66.权利要求64或65的ALK4:ActRIIB异多聚体，其中该ALK4-Fc融合蛋白IgG2融合Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代选自：
a)在对应于SEQ ID NO:32的K136的位置处的氨基酸取代；
b)在对应于SEQ ID NO:32的K215的位置处的氨基酸取代；以及
c)在对应于SEQ ID NO:32的K136的位置处的氨基酸取代和在对应于SEQ ID NO:32的K215的位置处的氨基酸取代。
67.权利要求66的ALK4:ActRIIB异多聚体，其中该ALK4-Fc融合蛋白IgG2 Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代选自：
a)在对应于SEQ ID NO:32的K136的位置处的天冬氨酸或谷氨酸取代(K136E或K136D)；
b)在对应于SEQ ID NO:32的K215的位置处的天冬氨酸或谷氨酸取代(K215E或K215D)；以及
c)在对应于SEQ ID NO:32的K136的位置处的天冬氨酸或谷氨酸取代(K136E或K136D)和在对应于SEQ ID NO:32的K215的位置处的天冬氨酸或谷氨酸取代(K215E或K215D)。
68.权利要求2或39-40的ALK4:ActRIIB异多聚体，其中该ALK4-Fc融合蛋白Fc结构域是IgG3 Fc结构域，并且其中该IgG3 Fc结构域包含改变该ALK4-Fc融合蛋白的pI的一个或多个氨基酸修饰。
69.权利要求68的ALK4:ActRIIB异多聚体，其中该ALK4-Fc融合蛋白IgG31 Fc结构域包含与SEQ ID NO:33的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更相同的氨基酸序列。
70.权利要求68或69的ALK4:ActRIIB异多聚体，其中该ALK4-Fc融合蛋白IgG3融合Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代选自：
a)在对应于SEQ ID NO:33的K145的位置处的氨基酸取代；
b)在对应于SEQ ID NO:33的K224的位置处的氨基酸取代；以及
c)在对应于SEQ ID NO:33的K145的位置处的氨基酸取代和在对应于SEQ ID NO:33的K224的位置处的氨基酸取代。
71.权利要求70的ALK4:ActRIIB异多聚体，其中该ALK4-Fc融合蛋白IgG3 Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代选自：
a)在对应于SEQ ID NO:33的K145的位置处的天冬氨酸或谷氨酸取代(K145E或K145D)；
b)在对应于SEQ ID NO:33的K224的位置处的天冬氨酸或谷氨酸取代(K224E或K224D)；以及
c)在对应于SEQ ID NO:33的K145的位置处的天冬氨酸或谷氨酸取代(K145E或K145D)和在对应于SEQ ID NO:33的K224的位置处的天冬氨酸或谷氨酸取代(K224E或K224D)。
72.权利要求2或39-40的ALK4:ActRIIB异多聚体，其中该ALK4-Fc融合蛋白Fc结构域是IgG4 Fc结构域，并且其中该IgG4结构域包含改变该ALK4-Fc融合蛋白的pI的一个或多个氨基酸修饰。
73.权利要求72的ALK4:ActRIIB异多聚体，其中该ALK4-Fc融合蛋白IgG4 Fc结构域包含与SEQ ID NO:35的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更相同的氨基酸序列。
74.权利要求72或73的ALK4:ActRIIB异多聚体，其中该ALK4-Fc融合蛋白IgG4融合Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代选自：
a)在对应于SEQ ID NO:35的K142的位置处的氨基酸取代；
b)在对应于SEQ ID NO:35的K221的位置处的氨基酸取代；以及
c)在对应于SEQ ID NO:35的K142的位置处的氨基酸取代和在对应于SEQ ID NO:35的K221的位置处的氨基酸取代。
75.权利要求74的ALK4:ActRIIB异多聚体，其中该ALK4-Fc融合蛋白IgG4 Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代选自：
a)在对应于SEQ ID NO:35的K142的位置处的天冬氨酸或谷氨酸取代(K142E或K142D)；
b)在对应于SEQ ID NO:35的K221的位置处的天冬氨酸或谷氨酸取代(K221E或K221D)；以及
c)在对应于SEQ ID NO:35的K142的位置处的天冬氨酸或谷氨酸取代(K142E或K142D)和在对应于SEQ ID NO:35的K221的位置处的天冬氨酸或谷氨酸取代(K221E或K221D)。
76.权利要求4-8和22-26中任一项的ALK4:ActRIIB异多聚体，其中：
a)该ALK4-Fc融合蛋白IgG1 Fc结构域包含SEQ ID NO:31的位置S132处的半胱氨酸取代(S132C)和SEQ ID NO:31的位置T144处的色氨酸取代(T144W)；并且
b)该ActRIIB-Fc融合蛋白IgG1 Fc结构域包含SEQ ID NO:31的位置Y127处的半胱氨酸取代(Y127C)、SEQ ID NO:31的位置T144处的丝氨酸取代(T144S)、SEQ ID NO:31的位置L146处的丙氨酸取代(L146A)和SEQ ID NO:31的位置Y185处的缬氨酸取代(Y185V)。
77.权利要求4-8和22-26中任一项的ALK4:ActRIIB异多聚体，其中：
a)该ActRIIB-Fc融合蛋白IgG1 Fc结构域包含SEQ ID NO:31的位置S132处的半胱氨酸取代(S132C)和SEQ ID NO:31的位置T144处的色氨酸取代(T144W)；并且
b)该ALK4-Fc融合蛋白IgG1 Fc结构域包含SEQ ID NO:31的位置Y127处的半胱氨酸取代(Y127C)、SEQ ID NO:31的位置T144处的丝氨酸取代(T144S)、SEQ ID NO:31的位置L146处的丙氨酸取代(L146A)和SEQ ID NO:31的位置Y185处的缬氨酸取代(Y185V)。
78.权利要求41-45和59-63中任一项的ALK4:ActRIIB异多聚体，其中：
a)该ALK4-Fc融合蛋白IgG1 Fc结构域包含SEQ ID NO:31的位置S132处的半胱氨酸取代(S132C)和SEQ ID NO:31的位置T144处的色氨酸取代(T144W)；并且
b)该ActRIIB-Fc融合蛋白IgG1 Fc结构域包含SEQ ID NO:31的位置Y127处的半胱氨酸取代(Y127C)、SEQ ID NO:31的位置T144处的丝氨酸取代(T144S)、SEQ ID NO:31的位置L146处的丙氨酸取代(L146A)和SEQ ID NO:31的位置Y185处的缬氨酸取代(Y185V)。
79.权利要求41-45和59-63中任一项的ALK4:ActRIIB异多聚体，其中：
a)该修饰的ActRIIB-Fc融合蛋白IgG1 Fc结构域包含SEQ ID NO:31的位置S132处的半胱氨酸取代(S132C)和SEQ ID NO:31的位置T144处的色氨酸取代(T144W)；并且
b)该修饰的ALK4-Fc融合蛋白IgG1 Fc结构域包含SEQ ID NO:31的位置Y127处的半胱氨酸取代(Y127C)、SEQ ID NO:31的位置T144处的丝氨酸取代(T144S)、SEQ ID NO:31的位置L146处的丙氨酸取代(L146A)和SEQ ID NO:31的位置Y185处的缬氨酸取代(Y185V)。
80.权利要求9-12和27-30中任一项的ALK4:ActRIIB异多聚体，其中：
a)该ALK4-Fc融合蛋白IgG2 Fc结构域包含SEQ ID NO:32的位置S130处的半胱氨酸取代(S130C)和SEQ ID NO:32的位置T142处的色氨酸取代(T142W)；并且
b)该ActRIIB-Fc融合蛋白IgG2 Fc结构域包含SEQ ID NO:32的位置Y125处的半胱氨酸取代(Y125C)、SEQ ID NO:32的位置T142处的丝氨酸取代(T142S)、SEQ ID NO:32的位置L144处的丙氨酸取代(L144A)和SEQ ID NO:32的位置Y183处的缬氨酸取代(Y183V)。
81.权利要求9-12和27-30中任一项的ALK4:ActRIIB异多聚体，其中：
a)该ActRIIB-Fc融合蛋白IgG2 Fc结构域包含SEQ ID NO:32的位置S130处的半胱氨酸取代(S130C)和SEQ ID NO:32的位置T142处的色氨酸取代(T142W)；并且
b)该ALK4-Fc融合蛋白IgG2 Fc结构域包含SEQ ID NO:32的位置Y125处的半胱氨酸取代(Y125C)、SEQ ID NO:32的位置T142处的丝氨酸取代(T142S)、SEQ ID NO:32的位置L144处的丙氨酸取代(L144A)和SEQ ID NO:32的位置Y183处的缬氨酸取代(Y183V)。
82.权利要求46-49和64-67中任一项的ALK4:ActRIIB异多聚体，其中：
a)该ALK4-Fc融合蛋白IgG2 Fc结构域包含SEQ ID NO:32的位置S130处的半胱氨酸取代(S130C)和SEQ ID NO:32的位置T142处的色氨酸取代(T142W)；并且
b)该ActRIIB-Fc融合蛋白IgG2 Fc结构域包含SEQ ID NO:32的位置Y125处的半胱氨酸取代(Y125C)、SEQ ID NO:32的位置T142处的丝氨酸取代(T142S)、SEQ ID NO:32的位置L144处的丙氨酸取代(L144A)和SEQ ID NO:32的位置Y183处的缬氨酸取代(Y183V)。
83.权利要求46-49和64-67中任一项的ALK4:ActRIIB异多聚体，其中：
a)该修饰的ActRIIB-Fc融合蛋白IgG2 Fc结构域包含SEQ ID NO:32的位置S130处的半胱氨酸取代(S130C)和SEQ ID NO:32的位置T142处的色氨酸取代(T142W)；并且
b)该修饰的ALK4-Fc融合蛋白IgG2 Fc结构域包含SEQ ID NO:32的位置Y125处的半胱氨酸取代(Y125C)、SEQ ID NO:32的位置T142处的丝氨酸取代(T142S)、SEQ ID NO:32的位置L144处的丙氨酸取代(L144A)和SEQ ID NO:32的位置Y183处的缬氨酸取代(Y183V)。
84.权利要求13-16和31-34中任一项的ALK4:ActRIIB异多聚体，其中：
a)该ALK4-Fc融合蛋白IgG3 Fc结构域包含SEQ ID NO:33的位置S139处的半胱氨酸取代(S139C)和SEQ ID NO:33的位置T151处的色氨酸取代(T151W)；并且
b)该ActRIIB-Fc融合蛋白IgG3 Fc结构域包含SEQ ID NO:33的位置Y134处的半胱氨酸取代(Y134C)、SEQ ID NO:33的位置T151处的丝氨酸取代(T151S)、SEQ ID NO:33的位置L153处的丙氨酸取代(L153A)和SEQ ID NO:33的位置Y192处的缬氨酸取代(Y192V)。
85.权利要求13-16和31-34中任一项的ALK4:ActRIIB异多聚体，其中：
a)该ActRIIB-Fc融合蛋白IgG3 Fc结构域包含SEQ ID NO:33的位置S139处的半胱氨酸取代(S139C)和SEQ ID NO:33的位置T151处的色氨酸取代(T151W)；并且
b)该ALK4-Fc融合蛋白IgG3 Fc结构域包含SEQ ID NO:33的位置Y134处的半胱氨酸取代(Y134C)、SEQ ID NO:33的位置T151处的丝氨酸取代(T151S)、SEQ ID NO:33的位置L153处的丙氨酸取代(L153A)和SEQ ID NO:33的位置Y192处的缬氨酸取代(Y192V)。
86.权利要求50-53和68-71中任一项的ALK4:ActRIIB异多聚体，其中：
a)该ALK4-Fc融合蛋白IgG3 Fc结构域包含SEQ ID NO:33的位置S139处的半胱氨酸取代(S139C)和SEQ ID NO:33的位置T151处的色氨酸取代(T151W)；并且
b)该ActRIIB-Fc融合蛋白IgG3 Fc结构域包含SEQ ID NO:33的位置Y134处的半胱氨酸取代(Y134C)、SEQ ID NO:33的位置T151处的丝氨酸取代(T151S)、SEQ ID NO:33的位置L153处的丙氨酸取代(L153A)和SEQ ID NO:33的位置Y192处的缬氨酸取代(Y192V)。
87.权利要求50-53和68-71中任一项的ALK4:ActRIIB异多聚体，其中：
a)该ActRIIB-Fc融合蛋白IgG3 Fc结构域包含SEQ ID NO:33的位置S139处的半胱氨酸取代(S139C)和SEQ ID NO:33的位置T151处的色氨酸取代(T151W)；并且
b)该ALK4-Fc融合蛋白IgG3 Fc结构域包含SEQ ID NO:33的位置Y134处的半胱氨酸取代(Y134C)、SEQ ID NO:33的位置T151处的丝氨酸取代(T151S)、SEQ ID NO:33的位置L153处的丙氨酸取代(L153A)和SEQ ID NO:33的位置Y192处的缬氨酸取代(Y192V)。
88.权利要求17-20和35-38中任一项的ALK4:ActRIIB异多聚体，其中：
a)该ALK4-Fc融合蛋白IgG4 Fc结构域包含SEQ ID NO:35的位置S136处的半胱氨酸取代(S136C)和SEQ ID NO:35的位置T148处的色氨酸取代(T148W)；并且
b)该ActRIIB-Fc融合蛋白IgG4 Fc结构域包含SEQ ID NO:35的位置Y131处的半胱氨酸取代(Y131C)、SEQ ID NO:35的位置T148处的丝氨酸取代(T148S)、SEQ ID NO:35的位置L150处的丙氨酸取代(L150A)和SEQ ID NO:35的位置Y189处的缬氨酸取代(Y189V)。
89.权利要求17-20和35-38中任一项的ALK4:ActRIIB异多聚体，其中：
a)该ActRIIB-Fc融合蛋白IgG4 Fc结构域包含SEQ ID NO:35的位置S136处的半胱氨酸取代(S136C)和SEQ ID NO:35的位置T148处的色氨酸取代(T148W)；并且
b)该ALK4-Fc融合蛋白IgG4 Fc结构域包含SEQ ID NO:35的位置Y131处的半胱氨酸取代(Y131C)、SEQ ID NO:35的位置T148处的丝氨酸取代(T148S)、SEQ ID NO:35的位置L150处的丙氨酸取代(L150A)和SEQ ID NO:35的位置Y189处的缬氨酸取代(Y189V)。
90.权利要求54-58和72-75中任一项的ALK4:ActRIIB异多聚体，其中：
a)该ALK4-Fc融合蛋白IgG4 Fc结构域包含SEQ ID NO:35的位置S136处的半胱氨酸取代(S136C)和SEQ ID NO:35的位置T148处的色氨酸取代(T148W)；并且
b)该ActRIIB-Fc融合蛋白IgG4 Fc结构域包含SEQ ID NO:35的位置Y131处的半胱氨酸取代(Y131C)、SEQ ID NO:35的位置T148处的丝氨酸取代(T148S)、SEQ ID NO:35的位置L150处的丙氨酸取代(L150A)和SEQ ID NO:35的位置Y189处的缬氨酸取代(Y189V)。
91.权利要求54-58和72-75中任一项的ALK4:ActRIIB异多聚体，其中：
a)该ActRIIB-Fc融合蛋白IgG4 Fc结构域包含SEQ ID NO:35的位置S136处的半胱氨酸取代(S136C)和SEQ ID NO:35的位置T148处的色氨酸取代(T148W)；并且
b)该ALK4-Fc融合蛋白IgG4 Fc结构域包含SEQ ID NO:35的位置Y131处的半胱氨酸取代(Y131C)、SEQ ID NO:35的位置T148处的丝氨酸取代(T148S)、SEQ ID NO:35的位置L150处的丙氨酸取代(L150A)和SEQ ID NO:35的位置Y189处的缬氨酸取代(Y189V)。
92.权利要求22或59的ALK4:ActRIIB异多聚体，其中该IgG1 Fc结构域与SEQ ID NO:66的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。
93.权利要求92的ALK4:ActRIIB异多聚体，其中该IgG1 Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代选自：
a)在对应于SEQ ID NO:66的138的位置处的谷氨酸；
b)在对应于SEQ ID NO:66的217的位置处的天冬氨酸；以及
c)在对应于SEQ ID NO:66的138的位置处的谷氨酸和在对应于SEQ ID NO:66的217的位置的天冬氨酸。
94.权利要求92或93的ALK4:ActRIIB异多聚体，其中该修饰的IgG1 Fc结构域包含在对应于SEQ ID NO:66的132的位置处的半胱氨酸和在对应于SEQ ID NO:66的144的位置处的色氨酸。
95.权利要求4或41的ALK4:ActRIIB异多聚体，其中该IgG1 Fc结构域与SEQ ID NO:67的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。
96.权利要求95的ALK4:ActRIIB异多聚体，其中该IgG1 Fc结构域包含一个或多个氨基酸取代，所述一个或多个氨基酸取代选自：
a)在对应于SEQ ID NO:67的162的位置处的精氨酸；
b)在对应于SEQ ID NO:67的179的位置处的精氨酸；以及
c)在对应于SEQ ID NO:67的162的位置处的精氨酸和在对应于SEQ ID NO:67的179的位置处的精氨酸。
97.权利要求95或96的ALK4:ActRIIB异多聚体，其中该修饰的IgG1 Fc结构域包含在对应于SEQ ID NO:67的127的位置处的半胱氨酸、在对应于SEQ ID NO:67的144的位置处的丝氨酸、在对应于SEQ ID NO:67的146的位置处的丙氨酸和在对应于SEQ ID NO:67的185的位置处的缬氨酸。
98.一种重组ALK4:ActRIIB异多聚体，其包含至少一种ALK4-Fc融合蛋白和至少一种ActRIIB-Fc融合蛋白，其中：
a)该ALK4-Fc融合蛋白包含IgG1 Fc结构域，所述IgG1 Fc结构域包含在对应于SEQ IDNO:31的S132的位置处的半胱氨酸(S132C)、在对应于SEQ ID NO:31的T144的位置处的色氨酸(T144W)和在对应于SEQ ID NO:31的H213的位置处的酸性氨基酸；并且
b)该ActRIIB-Fc融合蛋白包含IgG1 Fc结构域，所述IgG1 Fc结构域包含在对应于SEQID NO:31的Y127的位置处的半胱氨酸(Y127C)、在对应于SEQ ID NO:31的T144的位置处的丝氨酸(T144S)、在对应于SEQ ID NO:31的L146的位置处的丙氨酸(L146A)和在对应于SEQID NO:31的Y185的位置处的缬氨酸(Y185V)。
99.一种重组ALK4:ActRIIB异多聚体，其包含至少一种ALK4-Fc融合蛋白和至少一种ActRIIB-Fc融合蛋白，其中：
a)该ActRIIB-Fc融合蛋白包含IgG1 Fc结构域，所述IgG1 Fc结构域包含在对应于SEQID NO:31的S132的位置处的半胱氨酸(S132C)、在对应于SEQ ID NO:31的T144的位置处的色氨酸(T144W)和在对应于SEQ ID NO:31的H213的位置处的酸性氨基酸；并且
b)该ALK4-Fc融合蛋白包含IgG1 Fc结构域，所述IgG1 Fc结构域包含在对应于SEQ IDNO:31的Y127的位置处的半胱氨酸(Y127C)、在对应于SEQ ID NO:31的T144的位置处的丝氨酸(T144S)、在对应于SEQ ID NO:31的L146的位置处的丙氨酸(L146A)和在对应于SEQ IDNO:31的Y185的位置处的缬氨酸(Y185V)。
100.一种重组ALK4:ActRIIB异多聚体，其包含至少一种ALK4-Fc融合蛋白和至少一种ActRIIB-Fc融合蛋白，其中：
a)该ALK4-Fc融合蛋白包含IgG1 Fc结构域，所述IgG1 Fc结构域包含在对应于SEQ IDNO:31的S132的位置处的半胱氨酸(S132C)和在对应于SEQ ID NO:31的T144的位置处的色氨酸(T144W)；并且
b)该ActRIIB-Fc融合蛋白包含IgG1 Fc结构域，所述IgG1 Fc结构域包含在对应于SEQID NO:31的Y127的位置处的半胱氨酸(Y127C)、在对应于SEQ ID NO:31的T144的位置处的丝氨酸(T144S)、在对应于SEQ ID NO:31的L146的位置处的丙氨酸(L146A)、在对应于SEQID NO:31的Y185的位置处的缬氨酸(Y185V)和在对应于SEQ ID NO:31的H213的位置处的酸性氨基酸。
101.一种重组ALK4:ActRIIB异多聚体，其包含至少一种ALK4-Fc融合蛋白和至少一种ActRIIB-Fc融合蛋白，其中：
a)该ActRIIB-Fc融合蛋白包含IgG1 Fc结构域，所述IgG1 Fc结构域包含在对应于SEQID NO:31的S132的位置处的半胱氨酸(S132C)和在对应于SEQ ID NO:31的T144的位置处的色氨酸(T144W)；并且
b)该ALK4-Fc融合蛋白包含IgG1 Fc结构域，所述IgG1 Fc结构域包含在对应于SEQ IDNO:31的Y127的位置处的半胱氨酸(Y127C)、在对应于SEQ ID NO:31的T144的位置处的丝氨酸(T144S)、在对应于SEQ ID NO:31的L146的位置处的丙氨酸(L146A)和在对应于SEQ IDNO:31的Y185的位置处的缬氨酸(Y185V)以及在对应于SEQ ID NO:31的H213的位置处的酸性氨基酸。
102.权利要求98-101中任一项的ALK4:ActRIIB异多聚体，其中在对应于SEQ ID NO:31的H213的位置处的该酸性氨基酸是天冬氨酸。
103.权利要求98-101中任一项的ALK4:ActRIIB异多聚体，其中在对应于SEQ ID NO:31的H213的位置处的该酸性氨基酸是谷氨酸。
104.权利要求98-103中任一项的ALK4:ActRIIB异多聚体，其中该IgG1 Fc结构域与SEQID NO:31的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更相同。
105.一种重组ALK4:ActRIIB异多聚体，其包含至少一种ALK4-Fc融合蛋白和至少一种ActRIIB-Fc融合蛋白，其中：
a)该ALK4-Fc融合蛋白包含IgG2 Fc结构域，所述IgG2 Fc结构域包含在对应于SEQ IDNO:32的S130的位置处的半胱氨酸(S130C)、在对应于SEQ ID NO:32的T142的位置处的色氨酸(T142W)和在对应于SEQ ID NO:32的H211的位置处的酸性氨基酸；并且
b)该ActRIIB-Fc融合蛋白包含IgG2 Fc结构域，所述IgG2 Fc结构域包含在对应于SEQID NO:32的Y125的位置处的半胱氨酸(Y125C)、在对应于SEQ ID NO:32的T142的位置处的丝氨酸(T142S)、在对应于SEQ ID NO:32的L144的位置处的丙氨酸(L144A)和在对应于SEQID NO:32的Y183的位置处的缬氨酸(Y183V)。
106.一种重组ALK4:ActRIIB异多聚体，其包含至少一种ALK4-Fc融合蛋白和至少一种ActRIIB-Fc融合蛋白，其中：
a)该ActRIIB-Fc融合蛋白包含IgG2 Fc结构域，所述IgG2 Fc结构域包含在对应于SEQID NO:32的S130的位置处的半胱氨酸(S130C)、在对应于SEQ ID NO:32的T142的位置处的色氨酸(T142W)和在对应于SEQ ID NO:32的H211的位置处的酸性氨基酸；并且
b)该ALK4-Fc融合蛋白包含IgG2 Fc结构域，所述IgG2 Fc结构域包含在对应于SEQ IDNO:32的Y125的位置处的半胱氨酸(Y125C)、在对应于SEQ ID NO:32的T142的位置处的丝氨酸(T142S)、在对应于SEQ ID NO:32的L144的位置处的丙氨酸(L144A)和在对应于SEQ IDNO:32的Y183的位置处的缬氨酸(Y183V)。
107.一种重组ALK4:ActRIIB异多聚体，其包含至少一种ALK4-Fc融合蛋白和至少一种ActRIIB-Fc融合蛋白，其中：
a)该ALK4-Fc融合蛋白包含IgG2 Fc结构域，所述IgG2 Fc结构域包含在对应于SEQ IDNO:32的S130的位置处的半胱氨酸(S130C)和在对应于SEQ ID NO:32的T142的位置处的色氨酸(T142W)；并且
b)该ActRIIB-Fc融合蛋白包含IgG2 Fc结构域，所述IgG2 Fc结构域包含在对应于SEQID NO:32的Y125的位置处的半胱氨酸(Y125C)、在对应于SEQ ID NO:32的T142的位置处的丝氨酸(T142S)、在对应于SEQ ID NO:32的L144的位置处的丙氨酸(L144A)、在对应于SEQID NO:32的Y183的位置处的缬氨酸(Y183V)和在对应于SEQ ID NO:32的H211的位置处的酸性氨基酸。
108.一种重组ALK4:ActRIIB异多聚体，其包含至少一种ALK4-Fc融合蛋白和至少一种ActRIIB-Fc融合蛋白，其中：
a)该ActRIIB-Fc融合蛋白包含IgG2 Fc结构域，所述IgG2 Fc结构域包含在对应于SEQID NO:32的S130的位置处的半胱氨酸(S130C)和在对应于SEQ ID NO:32的T142的位置处的色氨酸(T142W)；并且
b)该ALK4-Fc融合蛋白包含IgG2 Fc结构域，所述IgG2 Fc结构域包含在对应于SEQ IDNO:32的Y125的位置处的半胱氨酸(Y125C)、在对应于SEQ ID NO:32的T142的位置处的丝氨酸(T142S)、在对应于SEQ ID NO:32的L144的位置处的丙氨酸(L144A)、在对应于SEQ IDNO:32的Y183的位置处的缬氨酸(Y183V)和在对应于SEQ ID NO:32的H211的位置处的酸性氨基酸。
109.权利要求105-108中任一项的ALK4:ActRIIB异多聚体，其中在对应于SEQ ID NO:32的H211的位置处的该酸性氨基酸是天冬氨酸。
110.权利要求105-108中任一项的ALK4:ActRIIB异多聚体，其中在对应于SEQ ID NO:32的H211的位置处的该酸性氨基酸是谷氨酸。
111.权利要求105-110中任一项的ALK4:ActRIIB异多聚体，其中该修饰的IgG2 Fc结构域与SEQ ID NO:32的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更相同。
112.一种重组ALK4:ActRIIB异多聚体，其包含至少一种ALK4-Fc融合蛋白和至少一种ActRIIB-Fc融合蛋白，其中：
a)该ALK4-Fc融合蛋白包含IgG4 Fc结构域，所述IgG4 Fc结构域包含在对应于SEQ IDNO:35的S136的位置处的半胱氨酸(S136C)、在对应于SEQ ID NO:35的T148的位置处的色氨酸(T148W)和在对应于SEQ ID NO:35的H217的位置处的酸性氨基酸；并且
b)该ActRIIB-Fc融合蛋白包含IgG4 Fc结构域，所述IgG4 Fc结构域包含在对应于SEQID NO:35的Y131的位置处的半胱氨酸(Y131C)、在对应于SEQ ID NO:35的T148的位置处的丝氨酸(T148S)、在对应于SEQ ID NO:35的L150的位置处的丙氨酸(L150A)和在对应于SEQID NO:35的Y189的位置处的缬氨酸(Y189V)。
113.一种重组ALK4:ActRIIB异多聚体，其包含至少一种ALK4-Fc融合蛋白和至少一种ActRIIB-Fc融合蛋白，其中：
a)该ActRIIB-Fc融合蛋白包含IgG4 Fc结构域，所述IgG4 Fc结构域包含在对应于SEQID NO:35的S136的位置处的半胱氨酸(S136C)、在对应于SEQ ID NO:35的T148的位置处的色氨酸(T148W)和在对应于SEQ ID NO:35的H217的位置处的酸性氨基酸；并且
b)该ALK4-Fc融合蛋白包含IgG4 Fc结构域，所述IgG4 Fc结构域包含在对应于SEQ IDNO:35的Y131的位置处的半胱氨酸(Y131C)、在对应于SEQ ID NO:35的T148的位置处的丝氨酸(T148S)、在对应于SEQ ID NO:35的L150的位置处的丙氨酸(L150A)和在对应于SEQ IDNO:35的Y189的位置处的缬氨酸(Y189V)。
114.一种重组ALK4:ActRIIB异多聚体，其包含至少一种ALK4-Fc融合蛋白和至少一种ActRIIB-Fc融合蛋白，其中：
a)该ALK4-Fc融合蛋白包含IgG4 Fc结构域，所述IgG4 Fc结构域包含在对应于SEQ IDNO:35的S136的位置处的半胱氨酸(S136C)和在对应于SEQ ID NO:35的T148的位置处的色氨酸(T148W)；并且
b)该ActRIIB-Fc融合蛋白包含IgG4 Fc结构域，所述IgG4 Fc结构域包含在对应于SEQID NO:35的Y131的位置处的半胱氨酸(Y131C)、在对应于SEQ ID NO:35的T148的位置处的丝氨酸(T148S)、在对应于SEQ ID NO:35的L150的位置处的丙氨酸(L150A)、在对应于SEQID NO:35的Y189的位置处的缬氨酸(Y189V)和在对应于SEQ ID NO:35的H217的位置处的酸性氨基酸。
115.一种重组ALK4:ActRIIB异多聚体，其包含至少一种ALK4-Fc融合蛋白和至少一种ActRIIB-Fc融合蛋白，其中：
a)该ActRIIB-Fc融合蛋白包含IgG4 Fc结构域，所述IgG4 Fc结构域包含在对应于SEQID NO:35的S136的位置处的半胱氨酸(S136C)和在对应于SEQ ID NO:35的T148的位置处的色氨酸(T148W)；并且
b)该ALK4-Fc融合蛋白包含IgG4 Fc结构域，所述IgG4 Fc结构域包含在对应于SEQ IDNO:35的Y131的位置处的半胱氨酸(Y131C)、在对应于SEQ ID NO:35的T148的位置处的丝氨酸(T148S)、在对应于SEQ ID NO:35的L150的位置处的丙氨酸(L150A)、在对应于SEQ IDNO:35的Y189的位置处的缬氨酸(Y189V)和在对应于SEQ ID NO:35的H217的位置处的酸性氨基酸。
116.权利要求112-115中任一项的ALK4:ActRIIB异多聚体，其中在对应于SEQ ID NO:35的H217的位置处的该酸性氨基酸是天冬氨酸。
117.权利要求112-115中任一项的ALK4:ActRIIB异多聚体，其中在对应于SEQ ID NO:35的H217的位置处的该酸性氨基酸是谷氨酸。
118.权利要求112-117中任一项的ALK4:ActRIIB异多聚体，其中该修饰的IgG4 Fc结构域与SEQ ID NO:35的氨基酸序列至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更相同。
119.权利要求1-118中任一项的ALK4:ActRIIB异多聚体，其中该ALK4-Fc融合蛋白包含ALK4多肽结构域，所述ALK4多肽结构域包含选自以下的氨基酸序列：
a)与如下多肽至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，所述多肽
i)以SEQ ID NO:9的氨基酸24、25、26、27、28、29、30、31、32、33或34中的任何一个开始，并且
ii)以SEQ ID NO:9的氨基酸101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125或126中的任何一个结束；
b)与SEQ ID NO:9的氨基酸34-101至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；
c)与SEQ ID NO:10至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；
d)与如下多肽至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，所述多肽
i)以SEQ ID NO:19的氨基酸24、25、26、27、28、29、30、31、32、33或34中的任何一个开始，并且
ii)以SEQ ID NO:19的氨基酸101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125或126中的任何一个结束；
e)与SEQ ID NO:19的氨基酸34-101至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及
f)与SEQ ID NO:20至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
120.权利要求中任一项的ALK4:ActRIIB异多聚体，其中该ActRIIB-Fc融合蛋白包含ActRIIB多肽结构域，所述ActRIIB多肽结构域包含选自以下的氨基酸序列：
a)与如下多肽至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，所述多肽：
i)以SEQ ID NO:1的氨基酸20、21、22、23、24、25、26、27、28或29中的任何一个开始，并且
ii)以SEQ ID NO:1的氨基酸109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133或134中的任何一个结束；
b)与SEQ ID NO:1的氨基酸29-109至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；
c)与SEQ ID NO:1的氨基酸25-131至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；
d)与SEQ ID NO:2至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；
e)与SEQ ID NO:3至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；
f)与SEQ ID NO:5至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及
g)与SEQ ID NO:6至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
121.权利要求120的ALK4:ActRIIB异多聚体，其中该ActRIIB多肽结构域不包含在对应于SEQ ID NO:1的L79的位置处的酸性氨基酸。
122.权利要求1-121中任一项的ALK4:ActRIIB异多聚体，其中该ALK4-Fc融合蛋白进一步包含位于该ALK4结构域与该Fc结构域之间的接头结构域和/或该ActRIIB融合蛋白进一步包含位于该ActRIIB结构域与该Fc结构域之间的接头结构域。
123.权利要求122的ALK4:ActRIIB异多聚体，其中该接头结构域选自：TGGG(SEQ IDNO:17)、TGGGG(SEQ ID NO:15)、SGGGG(SEQ ID NO:16)、GGGGS(SEQ ID NO:58)、GGG(SEQ IDNO:13)、GGGG(SEQ ID NO:14)、SGGG(SEQ ID NO:18)和GGGGS(SEQ ID NO:58)。
124.一种重组ALK4:ActRIIB异多聚体，其包含至少一种ALK4-Fc融合蛋白和至少一种ActRIIB-Fc融合蛋白，其中该ALK4-Fc融合蛋白包含与SEQ ID NO:76的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，并且其中该ActRIIB-Fc融合蛋白包含与SEQID NO:72的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
125.权利要求124的ALK4:ActRIIB异多聚体，其中该ALK4-Fc融合蛋白包含一个或多个氨基酸，所述一个或多个氨基酸选自：
a)在对应于SEQ ID NO:76的234的位置处的半胱氨酸、在对应于SEQ ID NO:76的251的位置处的丝氨酸、在对应于SEQ ID NO:76的253的位置处的丙氨酸和在对应于SEQ ID NO:76的292的位置处的缬氨酸；
b)在对应于SEQ ID NO:76的269的位置处的带正电的氨基酸；
c)在对应于SEQ ID NO:76的D286的位置处的带正电的氨基酸；
d)在对应于SEQ ID NO:76的269的位置处的带正电的氨基酸和在对应于SEQ ID NO:76的286的位置处的带正电的氨基酸；
e)在对应于SEQ ID NO:76的234的位置处的半胱氨酸、在对应于SEQ ID NO:76的251的位置处的丝氨酸、在对应于SEQ ID NO:76的253的位置处的丙氨酸、在对应于SEQ ID NO:76的292的位置处的缬氨酸(Y292V)和在对应于SEQ ID NO:76的269的位置处的带正电的氨基酸；
f)在对应于SEQ ID NO:76的234的位置处的半胱氨酸、在对应于SEQ ID NO:76的251的位置处的丝氨酸、在对应于SEQ ID NO:76的253的位置处的丙氨酸、在SEQ ID NO:76的位置292处的缬氨酸和在对应于SEQ ID NO:76的286的位置处的带正电的氨基酸；以及
g)在对应于SEQ ID NO:76的234的位置处的半胱氨酸、在对应于SEQ ID NO:76的251的位置处的丝氨酸、在对应于SEQ ID NO:76的253的位置处的丙氨酸和在对应于SEQ ID NO:76的292的位置处的缬氨酸、在对应于SEQ ID NO:76的269的位置处的带正电的氨基酸和在对应于SEQ ID NO:76的286的位置处的带正电的氨基酸。
126.权利要求124或125的ALK4:ActRIIB异多聚体，其中该ActRIIB-Fc融合蛋白包含一个或多个氨基酸，所述一个或多个氨基酸选自：
a)在对应于SEQ ID NO:72的250的位置处的半胱氨酸和在SEQ ID NO:72的位置262处的色氨酸；
b)在对应于SEQ ID NO:72的256的位置处的带负电的氨基酸；
c)在对应于SEQ ID NO:72的335的位置处的带负电的氨基酸；
d)在对应于SEQ ID NO:72的256的位置处的带负电的氨基酸和在对应于SEQ ID NO:72的335的位置处的带负电的氨基酸；
e)在对应于SEQ ID NO:72的250的位置处的半胱氨酸、在SEQ ID NO:72的位置262处的色氨酸和在对应于SEQ ID NO:72的256的位置处的带负电的氨基酸；
f)在对应于SEQ ID NO:72的250的位置处的半胱氨酸、在SEQ ID NO:72的位置262处的色氨酸和在对应于SEQ ID NO:72的335的位置处的带负电的氨基酸；以及
g)在对应于SEQ ID NO:72的250的位置处的半胱氨酸、在SEQ ID NO:72的位置262处的色氨酸、在对应于SEQ ID NO:72的256的位置处的带负电的氨基酸和在对应于SEQ ID NO:72的335的位置处的带负电的氨基酸。
127.一种重组ALK4-Fc融合蛋白，其包含与SEQ ID NO:76的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
128.权利要求127的ALK4-Fc融合蛋白，其中该融合蛋白包含一个或多个氨基酸，所述一个或多个氨基酸选自：
a)在对应于SEQ ID NO:76的234的位置处的半胱氨酸、在对应于SEQ ID NO:76的251的位置处的丝氨酸、在对应于SEQ ID NO:76的253的位置处的丙氨酸和在对应于SEQ ID NO:76的292的位置处的缬氨酸；
b)在对应于SEQ ID NO:76的269的位置处的带正电的氨基酸；
c)在对应于SEQ ID NO:76的286的位置处的带正电的氨基酸；
d)在对应于SEQ ID NO:76的269的位置处的带正电的氨基酸和在对应于SEQ ID NO:76的286的位置处的带正电的氨基酸；
e)在对应于SEQ ID NO:76的234的位置处的半胱氨酸、在对应于SEQ ID NO:76的251的位置处的丝氨酸、在对应于SEQ ID NO:76的253的位置处的丙氨酸、在SEQ ID NO:76的位置292处的缬氨酸和在对应于SEQ ID NO:76的269的位置处的带正电的氨基酸；
f)在对应于SEQ ID NO:76的234的位置处的半胱氨酸、在对应于SEQ ID NO:76的251的位置处的丝氨酸、在对应于SEQ ID NO:76的253的位置处的丙氨酸、在对应于SEQ ID NO:76的292的位置处的缬氨酸和在对应于SEQ ID NO:76的286的位置处的带正电的氨基酸；以及
g)在对应于SEQ ID NO:76的234的位置处的半胱氨酸、在对应于SEQ ID NO:76的251的位置处的丝氨酸、在对应于SEQ ID NO:76的253的位置处的丙氨酸和在对应于SEQ ID NO:76的292的位置处的缬氨酸、在对应于SEQ ID NO:76的269的位置处的带正电的氨基酸和在对应于SEQ ID NO:76的286的位置处的带正电的氨基酸。
129.一种重组ActRIIB-Fc融合蛋白，其包含与SEQ ID NO:72的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
130.权利要求129的ActRIIB-Fc融合蛋白，其中该融合蛋白包含一个或多个氨基酸，所述一个或多个氨基酸选自：
a)在对应于SEQ ID NO:72的250的位置处的半胱氨酸和在对应于SEQ ID NO:72的262的位置处的色氨酸；
b)在对应于SEQ ID NO:72的256的位置处的带负电的氨基酸；
c)在对应于SEQ ID NO:72的335的位置处的带负电的氨基酸；
d)在对应于SEQ ID NO:72的256的位置处的带负电的氨基酸和在对应于SEQ ID NO:72的335的位置处的带负电的氨基酸；
e)在对应于SEQ ID NO:72的250的位置处的半胱氨酸、在SEQ ID NO:72的位置262处的色氨酸和在对应于SEQ ID NO:72的256的位置处的带负电的氨基酸；
f)在对应于SEQ ID NO:72的250的位置处的半胱氨酸、在SEQ ID NO:72的位置262处的色氨酸和在对应于SEQ ID NO:72的335的位置处的带负电的氨基酸；以及
g)在对应于SEQ ID NO:7的250的位置处的半胱氨酸、在SEQ ID NO:72的位置262处的色氨酸、在对应于SEQ ID NO:72的256的位置处的带负电的氨基酸和在对应于SEQ ID NO:72的335的位置处的带负电的氨基酸。
131.一种重组ALK4-Fc融合蛋白，其包含与SEQ ID NO:74的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
132.权利要求131的ALK4-Fc融合蛋白，其中该融合蛋白包含一个或多个氨基酸，所述一个或多个氨基酸选自：
a)在对应于SEQ ID NO:74的258的位置处的半胱氨酸、在对应于SEQ ID NO:74的275的位置处的丝氨酸、在对应于SEQ ID NO:74的277的位置处的丙氨酸和在SEQ ID NO:74的位置316处的缬氨酸；
b)在对应于SEQ ID NO:74的293的位置处的带正电的氨基酸；
c)在对应于SEQ ID NO:74的310的位置处的带正电的氨基酸；
d)在对应于SEQ ID NO:74的293的位置处的带正电的氨基酸和在对应于SEQ ID NO:74的310的位置处的带正电的氨基酸；
e)在对应于SEQ ID NO:74的258的位置处的半胱氨酸、在对应于SEQ ID NO:74的275的位置处的丝氨酸、在对应于SEQ ID NO:74的277的位置处的丙氨酸、在SEQ ID NO:74的位置316处的缬氨酸和在对应于SEQ ID NO:74的293的位置处的带正电的氨基酸；
f)在对应于SEQ ID NO:74的258的位置处的半胱氨酸、在对应于SEQ ID NO:74的275的位置处的丝氨酸、在对应于SEQ ID NO:74的277的位置处的丙氨酸、在对应于SEQ ID NO:74的316的位置处的缬氨酸和在对应于SEQ ID NO:74的310的位置处的带正电的氨基酸；
g)在对应于SEQ ID NO:74的258的位置处的半胱氨酸、在对应于SEQ ID NO:74的275的位置处的丝氨酸、在对应于SEQ ID NO:74的277的位置处的丙氨酸、在对应于SEQ ID NO:74的316的位置处的缬氨酸、在对应于SEQ ID NO:74的293的位置处的带正电的氨基酸和在对应于SEQ ID NO:74的310的位置处的带正电的氨基酸。
133.一种重组ActRIIB-Fc融合蛋白，其包含与SEQ ID NO:70的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
134.权利要求133的ActRIIB-Fc融合蛋白，其中该融合蛋白包含一个或多个氨基酸，所述一个或多个氨基酸选自：
a)在对应于SEQ ID NO:70的275的位置处的半胱氨酸和在对应于SEQ ID NO:70的287的位置处的色氨酸；
b)在对应于SEQ ID NO:70的281的位置处的带负电的氨基酸；
c)在对应于SEQ ID NO:70的360的位置处的带负电的氨基酸；
d)在对应于SEQ ID NO:70的281的位置处的带负电的氨基酸和在对应于SEQ ID NO:70的360的位置处的带负电的氨基酸；
e)在对应于SEQ ID NO:70的275的位置处的半胱氨酸、在对应于SEQ ID NO:70的287的位置处的色氨酸和在对应于SEQ ID NO:70的281的位置处的带负电的氨基酸；
f)在对应于SEQ ID NO:70的275的位置处的半胱氨酸、在对应于SEQ ID NO:70的287的位置处的色氨酸和在对应于SEQ ID NO:70的360的位置处的带负电的氨基酸；以及
g)在对应于SEQ ID NO:70的275的位置处的半胱氨酸、在对应于SEQ ID NO:70的287的位置处的色氨酸、在对应于SEQ ID NO:70的281的位置处的带负电的氨基酸和在对应于SEQID NO:70的360的位置处的带负电的氨基酸。
135.权利要求125、128和132中任一项的异多聚体或融合蛋白，其中该带正电的氨基酸残基是修饰的或天然存在的(例如，R、K或H)氨基酸。
136.权利要求135的异多聚体或融合蛋白，其中该带正电的氨基酸残基是R。
137.权利要求126、130和134中任一项的异多聚体或融合蛋白，带负电的氨基酸残基是修饰的或天然存在的(例如，D或E)氨基酸。
138.权利要求137的异多聚体或融合蛋白，其中该带负电的氨基酸残基是D。
139.权利要求137的异多聚体或融合蛋白，其中该带负电的氨基酸残基是E。
140.一种重组ALK4:ActRIIB异多聚体，其包含至少一种ALK4-Fc融合蛋白和至少一种ActRIIB-Fc融合蛋白，其中该ALK4-Fc融合蛋白包含与SEQ ID NO:48的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，并且其中该ActRIIB-Fc融合蛋白包含与SEQID NO:80的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
141.权利要求140的ALK4:ActRIIB异多聚体，其中该ALK4-Fc融合蛋白包含在对应于SEQ ID NO:48的234的位置处的半胱氨酸、在对应于SEQ ID NO:48的251的位置处的丝氨酸、在对应于SEQ ID NO:48的253的位置处的丙氨酸和在SEQ ID NO:48的位置292处的缬氨酸。
142.权利要求140或141的ALK4:ActRIIB异多聚体，其中该ActRIIB-Fc融合蛋白包含在对应于SEQ ID NO:80的250的位置处的半胱氨酸、在对应于SEQ ID NO:80的262的位置处的色氨酸和在对应于SEQ ID NO:80的331的位置处的精氨酸。
143.一种重组ALK4-Fc融合蛋白，其包含与SEQ ID NO:48的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
144.权利要求143的ALK4-Fc融合蛋白，其中该ALK4-Fc融合蛋白包含在对应于SEQ IDNO:48的234的位置处的半胱氨酸、在对应于SEQ ID NO:48的251的位置处的丝氨酸、在对应于SEQ ID NO:48的253的位置处的丙氨酸和在SEQ ID NO:48的位置292处的缬氨酸。
145.一种重组ActRIIB-Fc融合蛋白，其包含与SEQ ID NO:80的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
146.权利要求145的ActRIIB-Fc融合蛋白，其中该ActRIIB-Fc融合蛋白包含在对应于SEQ ID NO:80的250的位置处的半胱氨酸、在对应于SEQ ID NO:80的262的位置处的色氨酸和在对应于SEQ ID NO:80的331的位置处的精氨酸。
147.一种重组ALK4-Fc融合蛋白，其包含与SEQ ID NO:47的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
148.权利要求147的ALK4-Fc融合蛋白，其中该ALK4-Fc融合蛋白包含在对应于SEQ IDNO:47的258的位置处的半胱氨酸、在对应于SEQ ID NO:47的275的位置处的丝氨酸、在对应于SEQ ID NO:47的277的位置处的丙氨酸和在SEQ ID NO:47的位置316处的缬氨酸。
149.一种重组ActRIIB-Fc融合蛋白，其包含与SEQ ID NO:78的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
150.权利要求145的ActRIIB-Fc融合蛋白，其中该ActRIIB-Fc融合蛋白包含在对应于SEQ ID NO:78的275的位置处的半胱氨酸、在对应于SEQ ID NO:78的287的位置处的色氨酸和在对应于SEQ ID NO:78的356的位置处的精氨酸。
151.权利要求1-150中任一项的ALK4:ActRIIB异多聚体、ALK4-Fc融合蛋白或ActRIIB-Fc融合蛋白，其中该异多聚体或融合蛋白包含一个或多个修饰的氨基酸残基，所述一个或多个修饰的氨基酸残基选自：糖基化氨基酸、PEG化氨基酸、法尼基化氨基酸、乙酰化氨基酸、生物素化氨基酸和与脂质部分缀合的氨基酸。
152.权利要求151的ALK4:ActRIIB异多聚体、ALK4-Fc融合蛋白或ActRIIB-Fc融合蛋白，其中该异多聚体或融合蛋白是糖基化的并且具有可从中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系获得的糖基化模式。
153.权利要求1-152中任一项的ALK4:ActRIIB异多聚体、ALK4-Fc融合蛋白或ActRIIB-Fc融合蛋白，其中该异多聚体或融合蛋白与选自以下的一种或多种配体结合：激活素(例如，激活素A和/或激活素B)、GDF8、GDF11、BMP6、BMP10和GDF3。
154.权利要求1-153中任一项的ALK4:ActRIIB异多聚体、ALK4-Fc融合蛋白或ActRIIB-Fc融合蛋白，其中该异多聚体或融合蛋白基本上不与BMP9结合。
155.权利要求1-126、135-142和151-154中任一项的异多聚体，其中与相应的ActRIIB同多聚体相比，该异多聚体以更弱的亲和力结合BMP10。
156.权利要求1-126、135-142和151-155中任一项的异多聚体，其中与相应的ActRIIB同多聚体相比，该异多聚体以更弱的亲和力结合BMP9。
157.权利要求1-126、135-142和151-156中任一项的异多聚体，其中与相应的ActRIIB同多聚体相比，该异多聚体以更弱的亲和力结合GDF3。
158.权利要求1-126、135-142和151-157中任一项的异多聚体，其中与相应的ActRIIB同多聚体相比，该异多聚体以更强的亲和力结合激活素B。
159.权利要求1-158中任一项的ALK4:ActRIIB异多聚体、ALK4-Fc融合蛋白或ActRIIB-Fc融合蛋白，其中该异多聚体或融合蛋白抑制通过选自以下的一种或多种配体进行的信号传导：激活素(例如，激活素A和/或激活素B)、GDF8、GDF11、BMP6、BMP10和GDF3。
160.权利要求1-126、135-142和151-154中任一项的异多聚体，其中该异多聚体不能持续地抑制BMP9信号传导。
161.权利要求1-126、135-142和151-160中任一项的异多聚体，其中与相应的ActRIIB同多聚体相比，该异多聚体是BMP10信号传导的较弱抑制剂。
162.权利要求1-126、135-142和151-161中任一项的异多聚体，其中与相应的ActRIIB同多聚体相比，该异多聚体是BMP9信号传导的较弱抑制剂。
163.权利要求1-126、135-142和151-162中任一项的异多聚体，其中与相应的ActRIIB同多聚体相比，该异多聚体是GDF3信号传导的较弱抑制剂。
164.权利要求1-126、135-142和151-163中任一项的异多聚体，其中与相应的ActRIIB同多聚体相比，该异多聚体是激活素B的较强抑制剂。
165.权利要求159-164中任一项的异多聚体，其中在基于细胞的测定中测量该配体信号传导。
166.权利要求1-126、135-142和160-165中任一项的异多聚体，其中该异多聚体是异二聚体。
167.权利要求1-166中任一项的异多聚体或Fc融合蛋白，其中该一个或多个氨基酸修饰将pI改变至少0.1(例如，改变至少0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.7、0.8、0.9、1.0、1.3、1.5、1.7、2.0、2.3、2.5、2.7、3.0、3.3、3.5、3.7或改变至少4.0)。
168.任一前述权利要求的异多聚体，其中：
a)该ALK4-Fc融合蛋白中的该一个或多个氨基酸修饰赋予该ALK4-Fc融合蛋白与该ActRIIB-Fc融合蛋白之间等电点的增加的差异；
b)该ActRIIB-Fc融合蛋白中的该一个或多个氨基酸修饰赋予该ActRIIB-Fc融合蛋白与该ALK4-Fc融合蛋白之间等电点的增加的差异；
或
c)该ALK4-Fc融合蛋白中的该一个或多个氨基酸修饰赋予该ALK4-Fc融合蛋白与该ActRIIB-Fc融合蛋白之间等电点的增加的差异，并且该ActRIIB-Fc融合蛋白中的该一个或多个氨基酸修饰赋予该ActRIIB-Fc融合蛋白与该ALK4-Fc融合蛋白之间等电点的增加的差异。
169.权利要求167的异多聚体，其中该ALK4-Fc融合蛋白和该ActRIIB-Fc融合蛋白具有至少0.7的pI差异(例如，至少0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2.、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9或至少4.0的pI差异)。
170.一种药物制剂，其包含权利要求1-126、135-142和160-169中任一项的异多聚体和药学上可接受的载体。
171.权利要求170的药物制剂，其中该药物制剂基本上不含热原。
172.权利要求170或171中任一项的药物制剂，其中该药物制剂包含小于约10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或小于约1％的ALK4同多聚体。
173.权利要求170-172中任一项的药物制剂，其中该药物制剂包含小于约10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或小于约1％的ActRIIB同多聚体。
174.一种重组核酸，其包含权利要求1-169中任一项的ALK4-Fc融合蛋白的编码序列。
175.权利要求174的重组核酸，其中该核酸包含与SEQ ID NO:75至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核酸序列。
176.权利要求174的重组核酸，其中该核酸包含与SEQ ID NO:77至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核酸序列。
177.权利要求174的重组核酸，其中该核酸包含与SEQ ID NO:82至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核酸序列。
178.权利要求174的重组核酸，其中该核酸包含与SEQ ID NO:83至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核酸序列。
179.一种重组核酸，其包含权利要求1-169中任一项的ActRIIB-Fc融合蛋白的编码序列。
180.权利要求179的重组核酸，其中该核酸包含与SEQ ID NO:71至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核酸序列。
181.权利要求179的重组核酸，其中该核酸包含与SEQ ID NO:73至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核酸序列。
182.权利要求179的重组核酸，其中该核酸包含与SEQ ID NO:79至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核酸序列。
183.权利要求179的重组核酸，其中该核酸包含与SEQ ID NO:81至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核酸序列。
184.一种重组多核苷酸，其包含与权利要求174-178中任一项的ALK4多肽的编码序列可操作地连接的启动子序列。
185.一种重组多核苷酸，其包含与权利要求179-183中任一项的ActRIIB多肽的编码序列可操作地连接的启动子序列。
186.一种重组多核苷酸，其包含与权利要求174-178中任一项的ALK4多肽的编码序列和权利要求179-183中任一项的ActRIIB多肽的编码序列可操作地连接的启动子序列。
187.一种载体，其包含权利要求174-186中任一项的重组多核苷酸。
188.一种用权利要求174-186中任一项的重组多核苷酸或权利要求187的载体转化的细胞。
189.权利要求186的细胞，其中该细胞是CHO细胞。
190.一种制备包含ALK4多肽和ActRIIB多肽的异多聚体的方法，其包括在适合于表达ALK4多肽和ActRIIB多肽的条件下培养细胞，其中该细胞包含权利要求174-176中任一项的重组多核苷酸和权利要求179-183中任一项的重组多核苷酸。
191.一种制备包含ALK4多肽和ActRIIB多肽的异多聚体的方法，其包括在适合于表达ALK4多肽和ActRIIB多肽的条件下培养细胞，其中该细胞包含权利要求186的重组多核苷酸。
192.一种制备包含ALK4多肽和ActRIIB多肽的异多聚体的方法，其包括：
a)在适合于表达ALK4多肽的条件下培养第一细胞，其中该第一细胞包含权利要求174-178中任一项的重组多核苷酸；
b)回收如此表达的ALK4多肽；
c)在适合于表达ActRIIB多肽的条件下培养第二细胞，其中该第二细胞包含权利要求179-183中任一项的重组多核苷酸；
d)回收如此表达的ActRIIB多肽；
e)在适合于ALK4:ActRIIB异多聚体形成的条件下合并该回收的ALK4多肽和该回收的ActRIIB多肽。
193.权利要求190-192中任一项的方法，其中该方法进一步包括回收该异多聚体的步骤。
194.权利要求190-193中任一项的方法，其中使用TPA前导序列表达该ALK4多肽。
195.权利要求190-193中任一项的方法，其中使用TPA前导序列表达该ActRIIB多肽。
196.权利要求194或195的方法，其中该TPA前导序列包含SEQ ID NO:38的编码序列。
197.权利要求190-196中任一项的方法，其中该细胞是CHO细胞。
198.权利要求190-197中任一项的方法，其中该异多聚体是异二聚体。
199.一种重组ALK4:ActRIIB异多聚体，其包含至少一种ALK4-Fc融合蛋白和至少一种ActRIIB-Fc融合蛋白，其中该ALK4-Fc融合蛋白包含与SEQ ID NO:76的氨基酸序列至少90％、95％、97％或99％相同的氨基酸序列，并且其中该ActRIIB-Fc融合蛋白包含与SEQ IDNO:72的氨基酸序列至少90％、95％、97％或99％相同的氨基酸序列。
200.权利要求199的重组ALK4:ActRIIB异多聚体，其中该ALK4-Fc融合蛋白包含SEQ IDNO:76的氨基酸序列，并且其中该ActRIIB-Fc融合蛋白包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列。
201.权利要求199的重组ALK4:ActRIIB异多聚体，其中该ActRIIB-Fc融合蛋白包含SEQID NO:38的前导序列。
202.权利要求199-201中任一项的重组ALK4:ActRIIB异多聚体，其中该ActRIIB-Fc融合蛋白包含与SEQ ID NO:70的氨基酸序列至少90％、95％、97％或99％相同的氨基酸序列。
203.权利要求199-202中任一项的重组ALK4:ActRIIB异多聚体，其中该ActRIIB-Fc融合蛋白包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列。
204.权利要求199-203中任一项的重组ALK4:ActRIIB异多聚体，其中该ALK4-Fc融合蛋白包含SEQ ID NO:38的前导序列。
205.权利要求199-201中任一项的重组ALK4:ActRIIB异多聚体，其中该ALK4-Fc融合蛋白包含与SEQ ID NO:74的氨基酸序列至少90％、95％、97％或99％相同的氨基酸序列。
206.重组ALK4:ActRIIB异多聚体，其中该ALK4-Fc融合蛋白包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列。
207.一种用于治疗患有与肌肉减少或肌肉生长不足相关的障碍的患者的方法，其包括向有需要的患者给予有效量的权利要求1-126、135-142、151-169和199-206中任一项的异多聚体。
208.权利要求207的方法，其中该患者患有肌肉萎缩。
209.权利要求207的方法，其中该患者患有肌营养不良。
210.权利要求208的方法，其中该肌营养不良是杜氏肌营养不良。
211.权利要求210的方法，其中该患者是青少年，并且在诊断为杜氏肌营养不良的日期的一至五年内开始治疗。
212.权利要求208的方法，其中该肌营养不良是贝氏肌营养不良。
213.权利要求210-212中任一项的方法，其中该异多聚体与以下中的一种或多种组合给予：依特立生、皮质类固醇(例如，地夫可特)、类固醇(例如，泼尼松)、血压和/或心脏药物(例如，血管紧张素转化酶抑制剂、β阻断剂和利尿剂)、平喘药(例如，沙丁胺醇)、维生素/营养素(例如，氨基酸、肉毒碱、辅酶Q10、肌酸、鱼油、绿茶提取物、维生素E)、干细胞疗法、基因疗法、辅助通气、手术、物理疗法、饮食和/或运动。
214.权利要求209的方法，其中该肌营养不良是面肩肱型肌营养不良。
215.权利要求214的方法，其中该异多聚体与以下中的一种或多种组合给予：沙丁胺醇、言语疗法、手术、助行器、背支架、T细胞抑制剂(例如，截短的组氨酰基-tRNA合成酶)、干细胞治疗、基因疗法和/或足部支持装置。
216.权利要求207的方法，其中该患者患有肌萎缩侧索硬化。
217.权利要求216的方法，其中该患者在诊断为肌萎缩侧索硬化后接受治疗。
218.权利要求216或217的方法，其中该异多聚体与以下中的一种或多种组合给予：利鲁唑、依达拉奉、马赛替尼、抗氧化剂、物理疗法、言语疗法、营养支持、呼吸支持(例如，非侵入性呼吸机)、干细胞疗法和/或基因疗法。
219.权利要求207的方法，其中该障碍是与癌症或癌症疗法相关的恶病质。
220.权利要求207的方法，其中该障碍是少肌症。
221.权利要求220的方法，其中该异多聚体与尿皮素II、激素替代疗法(例如，睾酮或人生长激素)、肌酸、维生素D、运动、饮食和/或力量训练组合给予。
222.权利要求207的方法，其中该障碍是散发性包涵体肌炎。
223.权利要求222的方法，其中该异多聚体与以下中的一种或多种组合给予：皮质类固醇、泼尼松、氧雄龙、甲氨蝶呤、麦考酚酸酯、静脉内免疫球蛋白、β干扰素-1a、依那西普、阿仑单抗、卵泡抑素、锂、比马鲁单抗、阿莫氯醇、雷帕霉素、抗氧化剂、肉毒碱、辅酶Q10、物理疗法、职业疗法、干细胞疗法和/或基因疗法。
224.一种用于治疗患有与神经退行性变相关的障碍的患者的方法，其包括向有需要的该患者给予有效量的权利要求1-126、135-142、151-169和199-207中任一项的异多聚体。
225.权利要求224的方法，其中该障碍是肌萎缩侧索硬化。
226.权利要求225的方法，其中该异多聚体与以下中的一种或多种组合给予：利鲁唑、依达拉奉、马赛替尼、抗氧化剂、物理疗法、言语疗法、营养支持、呼吸支持(例如，非侵入性呼吸机)、干细胞疗法和/或基因疗法。
227.一种用于治疗纤维化或与纤维化相关的障碍或病症的方法，其包括向有需要的患者给予有效量的权利要求1-126、135-142、151-169和199-207中任一项的异多聚体。
228.权利要求227的方法，其中与纤维化相关的该障碍或病症选自：肺纤维化、过敏性肺炎、特发性纤维化、肺结核、肺炎、囊性纤维化、哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、肺气肿、肾脏(肾)纤维化、肾脏(肾)衰竭、慢性肾脏(肾)疾病、骨纤维化、骨髓纤维化、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、硬皮病、结节病、伴有多血管炎的肉芽肿病、佩洛尼病、肝纤维化、威尔逊病、糖原贮积病(特别是III、IV、IX和X型)、铁超负荷、戈谢病、泽尔韦格综合征、非酒精性和酒精性脂肪性肝炎、胆汁性肝硬化、硬化性胆管炎、布-加综合征、手术相关纤维化、克罗恩病、杜普挛缩、纵隔纤维化、肾源性纤维化、腹膜后纤维化、心房纤维化、心内膜心肌纤维化、胰腺纤维化。
229.权利要求227的方法，其中与纤维化相关的该障碍或病症是特发性肺纤维化。
230.一种用于降低受试者的体重的方法，其包括向有需要的受试者给予有效量的权利要求1-126、135-142、151-169和199-207中任一项的异多聚体。
231.一种用于降低受试者的体重增加的方法，其包括向有需要的受试者给予有效量的权利要求1-126、135-142、151-169和199-207中任一项的异多聚体。
232.一种用于治疗或预防糖尿病的方法，其包括向有需要的受试者给予有效量的权利要求1-126、135-142、151-169和199-207中任一项的异多聚体。
233.权利要求232的方法，其中该受试者患有II型糖尿病。
234.一种用于治疗或预防肥胖症的方法，其包括向有需要的受试者给予有效量的权利要求1-126、135-142、151-169和199-207中任一项的异多聚体。
235.一种用于治疗或预防脂肪肝病的方法，其包括向有需要的受试者给予有效量的权利要求1-126、135-142、151-169和199-207中任一项的异多聚体。
236.权利要求235的方法，其中该受试者患有非酒精性脂肪肝病。
237.一种用于降低受试者的胆固醇和/或甘油三酯的方法，其包括向有需要的受试者给予有效量的权利要求1-126、135-142、151-169和199-207中任一项的异多聚体。
238.权利要求230-237中任一项的方法，其中该受试者的体重指数(BMI)为25kg/m2或更大。
239.权利要求230-237中任一项的方法，其中该受试者是肥胖的。
240.权利要求239的方法，其中该受试者的体重指数(BMI)为30kg/m2或更大。
241.权利要求230-240中任一项的方法，其中该受试者患有胰岛素抗性。
242.权利要求230-241中任一项的方法，其中该受试者患有2型糖尿病。
243.权利要求230-242中任一项的方法，其中该受试者患有选自以下的疾病或病症：血脂异常、高脂血症、高胆固醇血症、低HDL血清水平、高LDL血清水平和高甘油三酯血症。
244.权利要求230-243中任一项的方法，其中该受试者患有选自以下的疾病或病症：高血压症(高血压)、心肌梗塞、外周动脉疾病、血管调节功能障碍、动脉硬化、充血性心力衰竭、动脉粥样硬化、冠心病或微血管疾病。
245.权利要求230-244中任一项的方法，其中该受试者患有脂肪肝病。
246.权利要求245的方法，其中该受试者患有非酒精性脂肪肝病。
247.一种用于治疗或预防与不希望的体重增加相关的障碍或病症和/或代谢障碍的方法，其包括向有需要的受试者给予有效量的权利要求1-126、135-142、151-169和199-207中任一项的异多聚体。
248.权利要求247的方法，其中该障碍或病症选自：高血糖症、脂质代谢疾病、障碍、血脂异常、低HDL水平、高LDL水平、高甘油三酯水平、高脂血症、脂蛋白畸变、葡萄糖代谢疾病、葡萄糖不耐受、胰岛素抗性、糖耐量受损(IGT)、空腹血糖受损(IFG)、高尿酸水平、NAFLD、脂肪肝、NASH、多囊卵巢综合征、高胰岛素血症、肥胖症、II型糖尿病、心脏病、高血压、动脉粥样硬化、X综合征、代谢综合征和高血压症。
249.一种用于治疗受试者的纤维化或与纤维化相关的障碍或病症的方法，其包括向有需要的受试者给予有效量的权利要求1-126、135-142、151-169和199-207中任一项的异多聚体。
250.权利要求248的方法，其中与纤维化相关的该障碍或病症选自：肺纤维化、过敏性肺炎、特发性纤维化、肺结核、肺炎、囊性纤维化、哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、肺气肿、肾脏(肾)纤维化、肾脏(肾)衰竭、慢性肾脏(肾)疾病、骨纤维化、骨髓纤维化、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、硬皮病、结节病、伴有多血管炎的肉芽肿病、佩洛尼病、肝纤维化、威尔逊病、糖原贮积病(特别是III、IV、IX和X型)、铁超负荷、戈谢病、泽尔韦格综合征、非酒精性和酒精性脂肪性肝炎、胆汁性肝硬化、硬化性胆管炎、布-加综合征、手术相关纤维化、克罗恩病、杜普挛缩、纵隔纤维化、肾源性纤维化、腹膜后纤维化、心房纤维化、心内膜心肌纤维化和胰腺纤维化。
251.权利要求249的方法，其中与纤维化相关的该障碍或病症是特发性肺纤维化。
252.一种用于治疗肾病或肾病并发症的方法，其包括向有需要的患者给予有效量的权利要求1-126、135-142、151-169和199-207中任一项的异多聚体。
253.权利要求252的方法，其中该患者患有慢性肾病或衰竭。
254.权利要求252的方法，其中该患者患有急性肾病或衰竭。
255.权利要求252的方法，其中该患者患有1期、2期、3期、4期或5期肾病。
256.权利要求255的方法，其中该方法延迟或预防从1期到2期肾病、从2期到3期肾病、从3期到4期肾病或从4期到5期肾病的进展。
257.权利要求252-256中任一项的方法，其中该方法预防或减少肾炎。
258.权利要求252-257中任一项的方法，其中该方法预防或减少肾组织损害。
259.权利要求252-258中任一项的方法，其中该方法预防或减少肾纤维化。
260.权利要求252-259中任一项的方法，其中该患者患有以下疾病中的一种或多种：非糖尿病肾病、肾小球肾炎、间质性肾炎、糖尿病肾病、糖尿病性肾病、肾小球硬化症、快速进行性肾小球肾炎、肾脏纤维化、奥尔波特综合征、IDDM肾炎、系膜增生性肾小球肾炎、膜增生性肾小球肾炎、新月体性肾小球肾炎、肾脏间质纤维化、局灶性节段性肾小球硬化症、膜性肾病、微小病变肾病、微量免疫快速进行性肾小球肾炎、IgA肾病、多囊肾病、登特病、肾钙质沉着症、海曼肾炎、常染色体显性遗传(成人)多囊肾病、常染色体隐性遗传(儿童)多囊肾病、急性肾损伤、肾病综合征、肾脏缺血、足细胞疾病或障碍、蛋白尿、肾小球疾病、膜性肾小球肾炎、局灶性节段性肾小球肾炎、先兆子痫、子痫、肾病变、胶原血管病、良性直立性(体位性)蛋白尿、IgM肾病、膜性肾病、结节病、糖尿病、药物引起的肾损害、法布里病、氨基酸尿症、范可尼综合征、高血压性肾硬化、间质性肾炎、镰状细胞病、血红蛋白尿、肌红蛋白尿、韦格纳肉芽肿病、糖原贮积病1型、慢性肾病、慢性肾脏衰竭、低肾小球滤过率(GFR)、肾血管硬化、狼疮肾炎、ANCA阳性微量免疫新月体性肾小球肾炎、慢性同种异体移植物肾病、肾毒性、肾脏毒性、肾坏死、肾损害、肾小球和肾小管损伤、肾功能障碍、肾炎综合征、急性肾脏衰竭(急性肾损伤)、慢性肾脏衰竭、近端肾小管功能障碍、急性肾同种异体移植物排斥、慢性肾移植排斥、非IgA系膜增生性肾小球肾炎、感染后肾小球肾炎、伴有任何类型肾脏受累的血管炎、任何遗传性肾脏疾病、任何间质性肾炎、肾脏移植失败、肾癌、与其他病症(例如，高血压症、糖尿病和自身免疫疾病)相关的肾病、登特病、肾钙质沉着症、海曼肾炎、原发性肾病、塌陷性肾小球病、致密沉积物病、冷球蛋白血症相关肾小球肾炎、亨诺-许兰病、感染后肾小球肾炎、细菌性心内膜炎、显微镜下多血管炎、许尔-施特劳斯综合征、抗GBM抗体介导的肾小球肾炎、淀粉样变性、单克隆免疫球蛋白沉积病、原纤维性肾小球肾炎、免疫触须样肾小球病、缺血性肾小管损伤、药物诱导的肾小管间质性肾炎、毒性肾小管间质性肾炎、传染性肾小管间质性肾炎、细菌性肾盂肾炎、由多瘤病毒感染或HIV感染引起的病毒感染性肾小管间质性肾炎、代谢诱导的肾小管间质性疾病、混合性结缔组织病、管型肾病、可能由尿酸盐或草酸盐或药物诱导的晶体沉积引起的晶体肾病、急性细胞性肾小管间质同种异体移植物排斥、由淋巴瘤或移植后淋巴组织增生性疾病引起的肿瘤浸润性疾病、阻塞性肾病、血管疾病、血栓性微血管病、肾血管硬化、粥样硬化栓塞性疾病、混合性结缔组织病、结节性多动脉炎、神经钙蛋白抑制剂诱导的血管疾病、急性细胞性血管同种异体移植物排斥、急性体液同种异体移植物排斥、早期肾脏功能衰退(ERFD)、终末期肾脏疾病(ESRD)、肾脏静脉血栓形成、急性肾小管坏死、肾脏闭塞、急性间质性肾炎、确诊的慢性肾病、肾脏动脉狭窄、缺血性肾病、尿毒症、药物和毒素诱导的慢性肾小管间质性肾炎、反流性肾病、肾结石、古德帕斯彻综合征、正常红细胞正常色素性贫血、肾性贫血、糖尿病慢性肾病、IgG4相关疾病、冯·希佩尔-林道综合征、结节性硬化症、肾痨、髓质囊性肾病、肾细胞癌、腺癌、肾母细胞瘤、淋巴瘤、白血病、低唾液酸化障碍、慢性环孢素肾病、肾脏再灌注损伤、肾发育不良、氮质血症、双侧动脉闭塞、急性尿酸性肾病、血容量不足、急性双侧梗阻性尿路病、高钙血症肾病、溶血性尿毒症综合征、急性尿潴留、恶性肾硬化、产后肾小球硬化症、硬皮病、非古德帕斯彻抗GBM病、显微镜下结节性多动脉炎、变应性肉芽肿病、急性放射性肾炎、链球菌感染后肾小球肾炎、沃尔登斯特伦巨球蛋白血症、镇痛剂肾病、动静脉瘘、动静脉移植、透析、异位肾、髓质海绵肾、肾性骨营养不良、孤立肾、肾积水、微量白蛋白尿、尿毒症、血尿、高脂血症、低白蛋白血症、脂肪尿、酸中毒和高钾血症。
261.权利要求260的方法，其中该患者患有奥尔波特综合征。
262.权利要求261的方法，其中该异多聚体与以下中的一种或多种组合给予：血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂(例如，贝那普利、西拉普利、依那普利、福辛普利、赖诺普利、培哚普利、拉玛普利和喹那普利)、血管紧张素受体阻断剂(例如，坎地沙坦、依普沙坦、厄贝沙坦、氯沙坦、替米沙坦和缬沙坦)、他汀类(例如，氟伐他汀)、非二氢吡啶钙通道阻断剂(例如，地尔硫卓)、环孢菌素和/或醛固酮抑制剂。
263.一种治疗肺动脉高压的方法，其包括向有需要的患者给予有效量的任一前述权利要求的ALK4:ActRIIB异多聚体。
264.一种治疗肺高压的方法，其包括向有需要的患者给予有效量的任一前述权利要求的ALK4:ActRIIB异多聚体。
265.一种治疗、预防肺高压的一种或多种并发症或降低肺高压的一种或多种并发症的进展速度和/或严重程度的方法，其包括向有需要的患者给予有效量的任一前述权利要求的ALK4:ActRIIB异多聚体。
266.权利要求265的方法，其中该肺高压的一种或多种并发症选自：肺动脉中的平滑肌和/或内皮细胞增殖、肺动脉中的血管生成、呼吸困难、胸痛、肺血管重构、右心室肥大和肺纤维化。
267.权利要求264-266中任一项的方法，其中该肺高压是肺动脉高压。
268.一种治疗、预防间质性肺病的一种或多种并发症或降低间质性肺病的一种或多种并发症的进展速度和/或严重程度的方法，其包括向有需要的患者给予有效量的任一前述权利要求的ALK4:ActRIIB异多聚体。
269.权利要求269的方法，其中该间质性肺病是特发性肺纤维化。
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