JP2003517580A - 増殖分化因子インヒビター及びそれらの用途 - Google Patents

増殖分化因子インヒビター及びそれらの用途

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Abstract

(57)【要約】 GDF-8またはGDF-11のようなGDFタンパク質のインヒビターが開示される。また、これらのインヒビターを同定する方法並びに例えばトランスジェニック動物を作製するため及び様々な疾患を処置するために使用する方法も開示される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】関連出願 本願は、引用することにより全部が本明細書に組み込まれる、1999年1月21日
に出願した米国仮出願第60/116,639号及び1999年6月10日に出願した米国仮出願
第60/138,363号に優先権を請求する。発明の分野 本発明は、GDF-8及びGDF-11タンパク質のようなGDFタンパク質のインヒビター
並びにこれらのインヒビターを同定する方法及びそれらを使用する方法に関する
。発明の背景 ミオスタチン（Myostatin）としても知られている増殖及び分化因子-8(GDF-8)
は、構造的に関連する増殖因子のトランスフォーミング増殖因子-β(TGF-β)ス
ーパーファミリーのメンバーであり、これらの全ては生理学的に重要な増殖調節
及び形態発生特性を有する（D. M. Kingsley et al. (1994) Genes Dev., 8, 13
3-46; P. A. Hoodless et al. (1998) Curr. Topics Microbiol. Immunol., 228
, 235-72）。TGF-βスーパーファミリーのメンバーは、ヘテロマーのプロテイン
キナーゼ受容体複合体を介してシグナルを伝える。このファミリーには、骨誘導
因子（BMP）、アクチビン、インヒビン、ミュラー管抑制物質、グリア由来神経
栄養因子及びなお増大する数の増殖分化因子（GDF）も包含される。ミオスタチ
ン自体は、特に発生中及び成体の骨格筋で非常に、そして脂肪でははるかに少な
い程度に発現される。ミオスタチンは、多数の生理学的プロセスに関与している
ようであり、これらのうち最もよく確立しているのは骨格筋質量を調節するその
能力であり、それ故、その名称「ミオスタチン」がついている。
【０００２】 遺伝子ターゲッティングにより作製されたミオスタチン「ノックアウト」マウ
スは正常に発生するが、通常の２倍の骨格筋質量を有する（A. C. McPherron et
al. (1997) Nature, 387, 83-90）。表現型がミオスタチン遺伝子の突然変異の
ためである、２倍に筋肉のあるウシBelgian Blue及びPiedmonteseの２品種並び
に過度に筋肉が発達したCompt突然変異体マウスの同定は、ミオスタチンがこれ
ら２種において同じ発生上の役割を有することを示唆する（A. C. McPherron et
al. (1997) PNAS, 94, 12457-61; R. Kambadur et al. (1997) Genome Res., 7
, 910-15; G. Szabo et al. (1998) Mammalian Genome, 9, 671-2）。様々な種
からの配列データは、GDF-8が脊椎動物間で非常に保存されていることを示し、G
DF-8が種を越えて同じ役割を有する可能性があることを示唆する（McPherron an
d Lee, (1997) PNAS, 94, 12457-61）。
【０００３】 上記のことと一致して、最近の研究によりヒトにおけるHIV-感染に関連する筋
肉消耗にはミオスタチンタンパク質発現の増加が伴うことが示されている（N. F
. Gonzalez-Cadavid et al. (1998) PNAS, 95, 14938-43）。結局、この証拠は
、骨格筋質量の制御におけるGDF-8（またはミオスタチン）のきわめて重要な役
割を強く裏付ける。発明の要約 本発明は、少なくとも一つには、GDF-8を発現する細胞から得られた培地にお
けるGDF-8阻害活性の同定に基づく。従って、一つの態様として、本発明は、GDF
、例えばGDF-8活性を阻害するGDFポリペプチドのようなGDFインヒビター、例え
ばGDF-8インヒビターを同定する方法を特徴とする。一つの態様として、インヒ
ビターはそれ自体GDF、例えばGDF-8活性を保有しない（例えば、インヒビターは
、それ自体GDF活性を保有しないGDFポリペプチドである）。該方法は、GDFポリ
ペプチドを生産する細胞を培養した培地を得ること及びGDF活性を阻害する能力
に関して該培地の成分を試験し、それによりGDFインヒビターを同定することを
含む。一つの態様として、該方法は、GDF活性を阻害する能力に関して培地を試
験する前に該培地に対してクロマトグラフィーを実施することを含む。別の態様
として、該方法は、クロマトグラフィーから得られた画分に対して電気泳動、例
えば分取非還元または還元SDS-PAGEを実施すること及び例えば電気溶出により画
分を回収することを含む。
【０００４】 別の好ましい態様として、GDFポリペプチドを発現する細胞は、GDFポリペプチ
ドをコードするインサートを含有するプラスミドでトランスフェクションされて
いる細胞、例えばCHO細胞である。さらに別の好ましい態様として、細胞はGDFポ
リペプチド、例えばGDF-8を内因的に生産する。そのような細胞には、例えば、
横紋筋肉腫系RD(ATCC, CCL-136)及びQM7筋肉筋芽細胞(ATCC, CRL-1962)が包含さ
れる。
【０００５】 別の態様として、本発明は、GDFポリペプチドのポリペプチドフラグメントを
調製すること及びGDF活性を阻害する能力に関して該フラグメントを試験し、そ
れによりGDFインヒビターを同定することを含む、GDFインヒビターを同定する方
法を特徴とする。ポリペプチドフラグメントは、GDFポリペプチド、例えば天然
のGDFポリペプチドもしくは組換え的に製造したGDFポリペプチドを消化すること
により調製することができ、またはそれらは組換え的にもしくは合成的に合成す
ることができる。例えば、GDFポリペプチドは、トリプシン、サーモリシン、キ
モトリプシン、ペプシンまたはあらゆる他の既知のプロテアーゼを包含するがこ
れらに限定されるものではないプロテアーゼを用いて消化することができる。次
いでこれらのポリペプチドをGDF活性を阻害する能力に関して試験する前に単離
することができる。
【０００６】 ペプチドフラグメントを調製する前に、免疫応答によって内因性GDFの中和を
引き出すためにペプチドを選択することもできる。ポリペプチドフラグメントの
試験は、GDF阻害抗体の産出もたらす免疫応答を引き出す能力に関してポリペプ
チドフラグメントをスクリーニングすることにより実施することができる。
【０００７】 GDFポリペプチドインヒビターは、GDF活性を阻害するために十分なあらゆる長
さであることができる。典型的には、ポリペプチドは、5-10、10-25、25-40もし
くは40またはそれ以上のアミノ酸の長さである。ある好ましい態様として、GDF
ポリペプチドフラグメントは、少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40また
は45アミノ酸の長さである。
【０００８】 別の態様として、本発明は以下の特性：GDF-8またはGDF-11をコードするイン
サートを含有する発現プラスミドで安定にトランスフェクションした細胞（例え
ばCHO）を単離した培地からカラムクロマトグラフィーにより単離することがで
きる；100℃で10分までの間加熱した後に活性を保持する；還元後に活性を保持
するかもしくは保持しない；そして6M尿素での処理後に活性を保持する、の１ま
たはそれ以上を有するGDFインヒビター、例えば、GDF活性を保有してもしなくて
もよいインヒビターを特徴とする。一つの態様として、本発明は、還元変性ゲル
において70kDa未満の分子量を有するGDF-8インヒビターを特徴とする。
【０００９】 別の態様として、本発明は、本明細書に記述する方法により同定されるGDFイ
ンヒビター、例えばGDFポリペプチドを特徴とする。
【００１０】 別の態様として、本発明はGDFポリペプチドのプロ-ドメインまたはその一部を
含んでなるGDFインヒビターを特徴とする。好ましい態様として、GDFポリペプチ
ドのプロ-ドメインまたはその一部はグリコシル化されている。
【００１１】 別の態様として、本発明はGDFポリペプチドの変異体を含んでなるGDFインヒビ
ターを特徴とする。一つの態様として、GDFポリペプチド変異体はシステイン変
異体である。別の態様として、GDFポリペプチド変異体はプロ-ドメイン変異体で
ある。さらに別の態様として、GDFポリペプチド変異体は翻訳後修飾変異体であ
る。なおさらなる態様として、GDFポリペプチド変異体は切断部位変異体である
。
【００１２】 別の態様として、本発明は、GDFポリペプチドをコードする遺伝子により産生
されるRNA転写産物に結合し、そして/またはそれを切断する単離された核酸分子
を含んでなるGDFインヒビターを特徴とする。ある態様として、核酸は、配列番
号：1-4のいずれかのヌクレオチド配列を含んでなるリボザイムである。別の態
様として、核酸は、配列番号：5-24のいずれかのヌクレオチド配列を含んでなる
アンチセンス分子である。
【００１３】 別の態様として、本発明はGDF活性を測定するアッセイを特徴とし、GDFインヒ
ビターを同定するためにこれを用いることができる。GDF活性の阻害を試験する
適当なバイオアッセイには、クレアチンキナーゼのような筋肉特異的酵素の活性
を検出するアッセイ；3T3-L1前脂肪細胞の分化のような脂肪細胞分化を検出する
アッセイ；DNA複製アッセイ；及び転写に基づくアッセイが包含されるがこれら
に限定されるものではない。
【００１４】 さらに別の態様として、本発明は、タンパク質分泌に基づくアッセイを用いて
、細胞系においてGDFインヒビターを試験する方法を特徴とする。
【００１５】 さらなる態様として、本発明は、本発明のGDFインヒビターをコードする遺伝
子の発現によりGDFポリペプチドのプロセシング、GDFポリペプチドの分泌及び/
またはGDFポリペプチドの生物学的活性が妨げられるトランスジェニック動物を
特徴とする。
【００１６】 別の態様として、本発明は、例えば、様々な疾患を処置するために本発明のGD
Fインヒビター を用いる方法を特徴とする。 本発明の他の特徴及び利点は、以下の詳細な記述及び請求項から明らかである。 発明の詳細な記述 本発明は、増殖分化因子（GDF）タンパク質を阻害する組成物及び方法並びに
そのようなインヒビターを同定する方法を提供する。
【００１７】 詳細には、本発明のGDFインヒビターは、GDF-8及びGDF-11のようなGDFタンパ
ク質からのペプチドまたはGDFタンパク質を生産する細胞からの培地をGDF阻害活
性に関して試験する様々なスクリーニング方法を用いて同定することができる。
一つのスクリーニング方法として、GDFタンパク質のフラグメント（すなわち、
完全な全長タンパク質より少ないGDFタンパク質の任意の部分を含んでなるペプ
チド）を調製し、GDF阻害活性に関して試験する。好ましい態様として、フラグ
メントはGDFタンパク質のプロ-領域から、例えばタンパク質のプロ-領域（プロ-
ドメイン）のN末端から得られる。例えば、フラグメントは、GDF-8のArg99の上
流であるプロ-ドメインの領域から得ることができる（図11参照）。ペプチドは
、例えば、GDF活性を阻害するGDFタンパク質に対する抗体を引き出す能力により
選択することができる。あるいはまた、GDFインヒビターは、以下に詳細に記述
するように、GDFタンパク質を生産する細胞の培地から直接同定し、単離するこ
とができる。例えば、本明細書に記述する研究では、GDF-8を発現するCHO細胞の
培地から２つのクロマトグラフィー画分、画分A及びBが単離された。
【００１８】 本明細書において用いる場合、「GDFポリペプチド」及び「GDFタンパク質」と
いう用語には、構造的に関連する増殖因子のトランスフォーミング増殖因子-β(
TGF-β)スーパーファミリーのメンバーが包含され、これらの全ては生理学的に
重要な増殖調節及び形態発生特性を有する。関連する増殖因子のこのファミリー
は、例えば、D. M. Kingsley et al. (1994) Genes Dev., 8, 133-46; P. A. Ho
odless et al. (1998) Curr. Topics Microbiol. Immunol., 228, 235-72に記述
されており、これらの内容は引用することにより本明細書に組み込まれる。TGF-
βスーパーファミリーのメンバーは、ヘテロマーのプロテインキナーゼ受容体複
合体を介してシグナルを伝える。
【００１９】 従って、「GDFポリペプチド」及び「GDFタンパク質」という用語は、本明細書
において用いる場合、骨誘導因子（BMP）、アクチビン、インヒビン、ミュラー
管抑制物質、グリア由来神経栄養因子、並びにGDF-8（ミオスタチン）及びGDF-1
1を包含するなお増大する数の増殖分化因子（GDF）を含むTGF-βスーパーファミ
リー内のタンパク質をさす。
【００２０】 本明細書において用いる場合、「GDFインヒビター」という用語には、GDFタン
パク質の作用 を特異的に阻害するペプチド、ペプチド模倣物、リボザイム、ア
ンチセンスオリゴヌクレオチドまたは小分子を包含するがこれらに限定されるも
のではないGDFタンパク質の活性、発現、プロセシング及び/または分泌を阻害す
ることができるあらゆる作用因子が包含される。GDFインヒビターは、GDF活性を
保有することができ、または好ましくは、GDF活性を保有しないGDFインヒビター
である。
【００２１】 本明細書において用いる場合、「GDF-8インヒビター」及び「GDF-11インヒビ
ター」という用語には、好ましくはTGF-βもしくはアクチビンまたはTGF-βスー
パーファミリーの他のメンバーの活性を損なわないままにしながら、GDF-8また
はGDF-11の作用を特異的に阻害するペプチド、ペプチド模倣物、リボザイム、ア
ンチセンスオリゴヌクレオチドまたは小分子を包含するがこれらに限定されるも
のではないGDF-8またはGDF-11の活性、発現、プロセシング及び/または分泌を阻
害することができるあらゆる作用因子が包含される。GDF-8もしくはGDF-11イン
ヒビターは、GDF-8もしくはGDF-11活性を保有することができ、または好ましく
は、GDF-8もしくはGDF-11活性を保有しないGDF-8もしくはGDF-11インヒビターで
ある。
【００２２】 本明細書において用いる場合、「GDF-8もしくはGDF-11活性」という用語には
、GDF-8もしくはGDF-11によりもたらされるあらゆる活性が包含される。例えば
、GDF-8は、脂肪細胞への繊維芽細胞の分化を阻害すること、筋肉特異的酵素、
例えばクレアチンキナーゼの生産を調節すること及び細胞によるグルコースの取
り込みを調節すること及び筋芽細胞の細胞増殖を刺激することが知られている。
従って、GDF-8またはGDF-11インヒビターは、例えば、脂肪細胞への3T3-L1前脂
肪細胞（繊維芽細胞）の分化プロセスを妨げるGDF-8もしくはGDF-11の能力、筋
肉特異的酵素、例えばクレアチンキナーゼの活性を調節する能力、細胞によるグ
ルコースの取り込みを調節する能力または筋芽細胞の細胞増殖を刺激する能力に
より測定されるような、GDF-8またはGDF-11活性を試験することにより同定する
ことができる。
【００２３】 本明細書において用いる場合、「バイオアッセイ」という用語には、GDFイン
ヒビターを同定するために考案されたあらゆるアッセイが包含される。アッセイ
は、GDFインヒビターがGDFタンパク質の１またはそれ以上の生物学的機能を阻害
することができるかどうかを同定するために適当なインビトロまたはインビボア
ッセイであることができる。適当なバイオアッセイの例には、DNA複製アッセイ
、転写に基づくアッセイ、クレアチンキナーゼアッセイ、3T3-L1前脂肪細胞の分
化に基づくアッセイ、3T3-L1脂肪細胞におけるグルコースの取り込みに基づくア
ッセイ及び免疫学的アッセイが包含される。
【００２４】 本発明の様々な態様を以下の小節においてさらに詳細に記述する。本発明を例
示するために 、これらの小節はGDF-8及びGDF-11（２つの非常に相同なGDFタン
パク質）のインヒビターに関する。しかしながら、本発明（例えば、以下の記述
及びアッセイ）は、あらゆるGDFタンパク質のインヒビターを製造し、使用する
ために適用することができ、従って、GDF-8及びGDF-11に限定されると解釈され
るべきではない。Ｉ．タンパク質インヒビター Ａ．GDF-8及びGDF-11ペプチドインヒビター １．GDF-8またはGDF-11を発現する細胞を培養した培地からのGDF-8またはGDF-11 インヒビターの同定 一つの態様として、本発明は、GDF-8またはGDF-11を生産する細胞を培養した
培地を得ること；及びGDF-8またはGDF-11活性を阻害する能力に関して該培地を
試験し、それによりGDF-8またはGDF-11インヒビターを同定することを含む方法
を提供する。
【００２５】 GDF-8またはGDF-11インヒビターが同定される培地は、GDF-8またはGDF-11をコ
ードするインサートを含有するプラスミドでトランスフェクションされている細
胞を含むことができる。あるいはまた、GDF-8またはGDF-11が同定される培地は
、GDF-8またはGDF-11を内因的に、すなわち、天然のGDF-8またはGDF-11を生産す
る細胞を含むことができる。本明細書において用いる場合、「天然のタンパク質
」という用語には、天然に存在する供給源から回収されたタンパク質が包含され
る。
【００２６】 GDF-8またはGDF-11を生産する細胞は、あらゆる原核または真核細胞であるこ
とができる。例えば、GDF-8またはGDF-11タンパク質は、エシェリキア・コリ(E.
coli)のような細菌細胞、昆虫細胞、酵母または（チャイニーズハムスター卵巣
細胞（CHO）もしくはCOS細胞のような）哺乳類細胞において発現させることがで
きる。他の適当な宿主細胞は当業者に容易に理解される。
【００２７】 GDF-8またはGDF-11をコードするインサートを含有するプラスミドは、通常の
形質転換またはトランスフェクション技術によって原核または真核細胞中に導入
することができる。本明細書において用いる場合、「形質転換」及び「トランス
フェクション」という用語は、リン酸カルシウムもしくは塩化カルシウム共沈殿
、DEAE-デキストランによるトランスフェクション、リポフェクションまたは電
気穿孔を包含する、宿主細胞中に外来核酸（例えばDNA）を導入するための様々
な当該技術分野で認められている技術をさすものとする。宿主細胞を形質転換ま
たはトランスフェクションするための適当な方法は、Sambrook, et al.(Molecul
ar Cloning: A Laboratory Manual, 第2版, Cold Spring Harbor Laboratory, C
old Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989)及び他
の実験マニュアルに見いだすことができる。
【００２８】 哺乳類細胞の安定なトランスフェクションでは、用いる発現ベクター及びトラ
ンスフェクション技術により、細胞のほんの一部分のみがそれらのゲノム中に外
来DNAを組込む可能性があることが知られている。これらの組込み体を同定し、
選択するために、一般に、選択マーカー（例えば、抗生物質に対する耐性）をコ
ードする遺伝子が目的の遺伝子と一緒に宿主細胞中に導される。好ましい選択マ
ーカーには、G418、ハイグロマイシン及びメトトレキセートのような薬剤に対す
る耐性を与えるものが包含される。選択マーカーをコードする核酸は、GDF-8も
しくはGDF-11タンパク質をコードするものと同じベクター上で宿主細胞中に導入
することができ、または別個のベクター上で導入することができる。導入した核
酸で安定にトランスフェクションされた細胞は、薬剤選択により同定することが
できる（例えば、選択マーカー遺伝子を取り込んでいる細胞は生存し、一方、他
の細胞は死ぬ）。
【００２９】 本明細書において用いる場合、「GDF-8」という用語には、ヒトGDF-8、ウシGD
F-8、ニワトリGDF-8、マウスGDF-8、ラットGDF-8、ブタGDF-8、ヒツジGDF-8、シ
チメンチョウGDF-8、ヒヒGDF-8及び魚類GDF-8を包含するがこれらに限定される
ものではないGDF-8のあらゆる既知の形態が包含される。これらの分子は、McPhe
rron A. C. et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. 94:12457-12461に記述され
ており、その内容は引用することにより本明細書に組み込まれる。これらのタン
パク質のアミノ酸配列を図11に示す。
【００３０】 本明細書において用いる場合、「GDF-11」という用語には、ヒトGDF-11、ウシ
GDF-11、ニワトリGDF-11、マウスGDF-11、ラットGDF-11、ブタGDF-11、ヒツジGD
F-11、シチメンチョウGDF-11、ヒヒGDF-11及び魚類GDF-11を包含するがこれらに
限定されるものではないGDF-11のあらゆる既知の形態が包含される。これらの分
子は、例えば、米国特許5,871,935及びL. W. Gamer et al. (1999) Development
al Biology, 208, 222-232に記述されており、これらの内容は引用することによ
り本明細書に組み込まれる。GDF-8及びGDF-11タンパク質のアミノ酸配列の整列
を図17に示す。
【００３１】 GDF-8またはGDF-11インヒビターは、イオン交換クロマトグラフィー、逆相ク
ロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、限外濾過、電気泳動及びGDF-
8もしくはGDF-11インヒビターまたはその一部に特異的な抗体での免疫アフィニ
ティー精製を包含するペプチドまたはタンパク質を精製するための当該技術分野
において既知の技術を用いてGDF-8またはGDF-11を発現する細胞の培地から同定
し、単離することができる。一つの態様として、GDF-8またはGDF- 11を発現する
細胞の培養から得られた培地を実施例の節において記述するように高速液体クロ
マトグラフィー（HPLC）に供する。
【００３２】 次に、得られたサンプルを以下に記述するようにGDF-8またはGDF-11阻害活性
に関して試験することができる。
【００３３】 ２．GDF-8またはGDF-11活性を阻害するGDF-8またはGDF-11からのペプチドの同 定 本発明の別の態様として、GDF-8またはGDF-11インヒビターは、阻害活性に関し
てGDF-8またはGDF-11のフラグメントをスクリーニングすることにより同定され
る。GDF-8またはGDF-11フラグメントは、様々な当該技術分野で既知の技術によ
り調製することができる。例えば、GDF-8またはGDF-11配列にまたがる特定のオ
リゴペプチド（約10-25アミノ酸の長さ）を合成することができ（例えば化学的
にまたは組換え的に）、そして例えば本明細書に記述するアッセイを用いて、GD
F-8またはGDF-11を阻害するそれらの能力に関して試験することができる。GDF-8
またはGDF-11ペプチドフラグメントは、Bodansky, M. Principles of Peptide S
ynthesis, Springer Verlag, Berlin (1993)及びGrant, G. A. (ed.) Synthetic
Peptides: A User's Guide, W. H. Freeman and Company, New York (1992)に
記述されているもののような標準的技術を用いて合成することができる。自動ペ
プチド合成機は市販されている（例えばAdvanced ChemTech Model 396; Millige
n/Biosearch 9600）。
【００３４】 あるいはまた、GDF-8またはGDF-11フラグメントは、例えば、プロテアーゼ、
例えばトリプシン、サーモリシン、キモトリプシンまたはペプシンを用いること
により天然のまたは組換え的に製造したGDF-8またはGDF-11の消化により調製す
ることができる。タンパク質分解切断部位を同定するためにコンピューター分析
（市販されているソフトウェア、例えばMacVector、Omega、PCGene、Molecular
Simulation, Inc,を使用する）を用いることができる。
【００３５】 好ましくは、本発明のGDF-8またはGDF-11ペプチドは単離される。本明細書に
おいて用いる場合、「単離された」または「精製された」タンパク質またはその
生物学的に活性のペプチドは、GDF-8もしくはGDF-11タンパク質もしくはペプチ
ドが由来する細胞もしくは組織源からの細胞材料もしくは他の混入タンパク質を
実質的に含まず、または化学的に合成する場合には化学的前駆体もしくは他の化
学製品を実質的に含まない。「細胞材料を実質的に含まない」という用語には、
GDF-8またはGDF-11タンパク質またはそのペプチドが、単離されるかまたは組換
え的に製造される細胞の細胞成分から分離されているGDF-8またはGDF-11タンパ
ク質またはそのペプチドの調製物が包含される。一つの態様として、「細胞材料
を実質的に含まない」という用語には、（乾量により）約30％未満の非GDF-8ま
たはGDF-11タンパク質またはそのペプチド（本明細書において「混入タンパク質
」とも呼ばれる）、より好ましくは約20％未満の非GDF-8またはGDF-11タンパク
質またはそのペプチド、さらにより好ましくは約10％未満の非GDF-8またはGDF-1
1タンパク質またはそのペプチド、そして最も好ましくは約５％未満の非GDF-8ま
たはGDF-11タンパク質またはそのペプチドを有するGDF-8またはGDF-11タンパク
質またはそのペプチドの調製物が包含される。GDF-8またはGDF-11タンパク質ま
たはその生物学的に活性の部分を組換え的に製造する場合、それは好ましくは培
養培地も実質的に含まず、すなわち、培養培地はタンパク質調製物の容量の約20
％未満、より好ましくは約10％未満、そして最も好ましくは約５％未満に相当す
る。
【００３６】 そのようなタンパク質分解的に切断したGDF-8またはGDF-11ペプチドを調製し
、単離するために2段階の方法を用いることができる。第一段階は、GDF-8または
GDF-11タンパク質の酵素消化を含む。GDF-8またはGDF-11は、CHO細胞ならし培地
から二量体として、エシェリキア・コリもしくは酵母において単量体として製造
することができ、またはGDF-8もしくはGDF-11を生来生産する細胞から単離する
ことができる。例えばHPLCクロマトグラフィーによりGDF-8またはGDF-11単量体
または二量体を精製した後、それらの酵素消化を以下に記述するように実施する
。消化中に切断されるアミノ酸は、当該技術分野において既知であるように実験
に使用する特定のプロテアーゼにより決まる。例えば、選択したプロテアーゼが
トリプシンである場合、切断部位はアミノ酸のアルギニン及びリシンである。GD
F-8またはGDF-11タンパク質を１またはそれ以上のそのようなプロテアーゼを用
いて消化することができる。
【００３７】 消化した後、第二段階は、タンパク質消化により生じたペプチド画分の単離を
含む。これは、例えば以下に記述するように高分解能ペプチド分離により行うこ
とができる。いったん画分が単離されると、それらのGDF-8またはGDF-11阻害活
性を以下に記述するように適切なバイオアッセイにより試験することができる。
【００３８】 タンパク質分解または合成のGDF-8またはGDF-11フラグメントは、GDF-8または
GDF-11機能を例えば部分的にまたは完全に阻害するために必要なだけ多くのアミ
ノ酸残基を含んでなることができ、そして好ましくは少なくとも5、10、15、20
、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100または
それ以上のアミノ酸の長さを含んでなる。
【００３９】 一つの態様として、T細胞性免疫応答を誘導するために十分な数のT細胞エピト
ープを含有せず、そして/または哺乳類に投与した場合に抗体を引き出すために
十分な数のB細胞エピトープを含有するペプチドが選択される。好ましいGDF-8ま
たはGDF-11ペプチドインヒビターは、T細胞性（例えばサイトカイン）応答を誘
導するために十分な数のT細胞エピトープを含有し ない。しかしながら、B細胞
エピトープは望ましい可能性があり、例えば、以下に説明するように、抗体応答
を引き出すペプチドの能力を試験することにより選択することができる。
【００４０】 GDF-8またはGDF-11フラグメント内のT細胞エピトープは、多数の周知の技術を
用いて同定することができる。例えば、T細胞エピトープは、アルゴリズム（例
えば、Rothbard, J. and Taylor, W. R. (1988) EMBO J. 7:93-100; Berzofsky,
J. A. (1989) Philos Trans R. Soc. Lond. 323:535-544を参照）を用いて予測
することができる。好ましくは、GDF-8またはGDF-11タンパク質内のヒトT細胞エ
ピトープは、既知のクラスII HLA結合特異的アミノ酸残基を用いて予測すること
ができる。成功して使用されているT細胞刺激活性を有するペプチドを予測する
一つのアルゴリズムは、Rothbard, 1 st Forum in Virology, Annals of the Pa
steur Institute, pp518-526 (1986年、12月), Rothbard and Taylor, (1988) E
mbo J. 7:93-100及びEP 0 304 279に報告されている。これらの文書は、一般的
なT細胞パターンを特定すること（アルゴリズム）、その統計的有意性及び既知
のエピトープとのその相関関係並びに様々なタンパク質抗原及び自己抗原の以前
に特定されていないT細胞エピトープを予測することにおけるその成功した使用
を報告している。上記の文書に報告されているようなT細胞エピトープの一般的
パターンは、荷電したアミノ酸残基またはグリシン及びそれに続く２個の疎水性
残基からなる線状パターンを含有するようである。以前に特定されていないタン
パク質のT細胞エピトープを予測するために用いられている他のアルゴリズムに
は、Margalit et al., (1987) J. Immunol., 138:2213-2229により報告されたア
ルゴリズムが包含され、これは両親媒性へリックスモデルに基づく。
【００４１】 T細胞エピトープを同定する他の方法は、ヒトT細胞刺激活性に関して本発明の
GDF-8またはGDF-11阻害ペプチドをスクリーニングすることを含む。これは、１
またはそれ以上のいくつかの異なるアッセイを用いて行うことができる。例えば
、T細胞培養において適切なMHC分子を提示する抗原提示細胞と本発明のペプチド
とを接触させることにより、インビトロで、T細胞刺激活性をアッセイすること
ができる。必要な共刺激と関連して、適切なMHC分子と会合した本発明のGDF-8ま
たはGDF-11阻害ペプチドのT細胞への提示は、サイトカイン、特にインターロイ
キン-2及びインターロイキン-4の増加したレベルの生産を誘導するT細胞へのシ
グナルを伝達する作用を有することができる。培養上清を得、インターロイキン
-2または他の既知のサイトカインに関してアッセイすることができる。例えば、
Proc. Natl. Acad. Sci USA, 86:1333 (1989) に記述されているアッセイのよう
な、インターロイキン-2のいくつかの通常のアッセイのいずれかを用いることが
でき、その全内容は引用することにより本明細書に組み込まれる。インターフェ
ロンの生産をアッセイするキットもまたGenzyme Corporation（Cambridge, MA）
から入手可能である。
【００４２】 T細胞増殖の一般的なアッセイは、トリチウム化したチミジンの取り込みを測
定することを伴う。T細胞の増殖は、培養した細胞の複製するDNA中に取り込まれ
る3Hで標識したチミジンの量を決定することによりインビトロで測定することが
できる。従って、DNA合成の速度及び同様に細胞分裂の速度を定量することがで
きる。
【００４３】 タンパク質の表面上に位置するGDF-8またはGDF-11の他の好ましいフラグメン
ト、例えば親水性領域、並びに高い抗原性を有する領域または高い表面確率スコ
アを有するフラグメントは、当業者に周知のコンピューター分析プログラムを用
いて同定することができる（Hopp and Wood, (1983), Mol. Immunol., 20, 483-
9, Kyte and Doolittle. (1982), J. Mol. Biol., 157, 105-32, Corrigan and
Huang, (1982), Comput. Programs Biomed, 3, 163-8）。
【００４４】 GDF-8またはGDF-11阻害活性に関して試験するGDF-8またはGDF-11のさらに他の
好ましいフラグメントは、１またはそれ以上のB細胞エピトープを含む。そのよ
うなペプチドは、該ペプチドを単独でまたはアジュバント（例えばハプテン）と
組み合わせるかもしくはそれに連結して用いて哺乳類を免疫化し、そして免疫化
した動物からの血清を抗-GDF-8またはGDF-11抗体に関して試験することにより同
定することができる。好ましいペプチドは、GDF-8またはGDF-11活性を阻害する
抗-GDF-8またはGDF-11抗体を生じる。例えば、免疫化した動物からの血清は、本
明細書に記述するGDF-8またはGDF-11バイオアッセイのいずれかを用いてGDF-8ま
たはGDF-11阻害活性に関して試験することができる。
【００４５】 タンパク質分解または合成のGDF-8またはGDF-11フラグメント（単独またはハ
プテンに連結した）は、適当な被験体（例えばウサギ、ヤギ、マウスまたは他の
哺乳類もしくは脊椎動物）を免疫化するために用いることができる。例えば、米
国特許第5,422,110号；5,837,268号；5,708,155号；5,723,129号；及び5,849,53
1号に記述されている方法を用いることができる（これらの特許の内容は引用す
ることにより本明細書に組み込まれる）。免疫原性調製物はさらにフロイント完
全もしくは不完全アジュバントのようなアジュバントまたは同様の免疫刺激剤を
含むことができる。免疫原性のタンパク質分解または合成のGDF-8またはGDF-11
フラグメント調製物での適当な被験体の免疫化は、ポリクローナル抗-GDF-8また
はGDF-11抗体反応を誘導する。免疫化した被験体における抗-GDF-8またはGDF-11
抗体力価は、固定したGDF-8またはGDF-11を用いる固相酵素免疫検定法（ELISA）
でのような標準的技術により継時的にモニターすることができる。続いて、免疫
化した被験体からの血清を本明細書に記述するバイオアッセイのいずれかを用い
てそれらのGDF-8またはGDF-11阻害活性に関して試験することがで きる。 GDF-8またはGDF-11に対して誘導された抗体分子を哺乳類から（例えば血液から
）単離し、そしてIgG画分を得るためのプロテインＡクロマトグラフィーのよう
な周知の技術によりさらに精製することができる。免疫化後の適当な時点で、例
えば抗-GDF-8またはGDF-11抗体力価が最高である時に、抗体産生細胞を被験体か
ら得、そして最初にKohler及びMilstein (1975) Nature 256:495-497（Brown et
al. (1981) J. Immunol. 127:539-46； Brown et al. (1980) J. Biol. Chem.
255:4980-83；Yeh et al. (1976) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:2927-31；及
びYeh et al. (1982) Int. J. Cancer 29:269-75も参照）により記述されたハイ
ブリドーマ技術、より最近のヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Kozbor et al. (1
983) Immunol Today 4:72）、EBV-ハイブリドーマ技術（Cole et al. (1985), M
onoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp.77-96）
またはトリオーマ技術のような標準的技術により例えばモノクロ−ナル抗体を調
製するために用いることができる。モノクローナル抗体ハイブリドーマを作製す
るための技術は周知である（一般に、R. H. Kenneth, Monoclonal Antibodies：
A New Dimension In Biological Analysis中, Plenum Publishing Corp., New Y
ork, New York (1980)； E. A. Lerner (1981) Yale J. Biol. Med., 54:387-40
2； M. L. Gefter et al. (1977) Somatic Cell Genet. 3:231-36を参照）。簡
潔に言えば、上記のようなGDF-8またはGDF-11免疫原で免疫化した哺乳類からの
リンパ球（典型的には脾臓細胞）に不死細胞系（典型的には骨髄腫）を融合させ
、そして得られたハイブリドーマ細胞の培養上清をスクリーニングしてGDF-8ま
たはGDF-11に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを同定する
。
【００４６】 抗-GDF-8またはGDF-11モノクローナル抗体を作製する目的のために、リンパ球
と不死化細胞系を融合させるために用いられる多数の周知のプロトコルのいずれ
かを適用することができる（例えば、G. Galfre et al. (1977) Nature 266:550
52；Gefter et al. Somatic Cell Genet., 上記引用；Lerner, Yale J. Biol. M
ed., 上記引用；Kenneth, Monoclonal Antibodies, 上記引用を参照）。さらに
、同様に有用であると思われるそのような方法の多数の変形があることを当業者
は認識する。典型的には、リンパ球と同じ哺乳類種から不死細胞系（例えば骨髄
種細胞系）を得る。例えば、本発明の免疫原性調製物で免疫化したマウスからの
リンパ球を不死化したマウス細胞系と融合させることによりマウスハイブリドー
マを作製することができる。好ましい不死細胞系は、ヒポキサンチン、アミノプ
テリン及びチミジンを含有する培養培地（「HAT培地」）に感受性であるマウス
骨髄種細胞系である。多数の骨髄種細胞系のいずれか、例えばP3-NS1/1-Ag4-1、
P3-x63-Ag8.653またはSp２/O-Ag14骨髄種系を標準的 な技術に従って融合相手と
して用いることができる。これらの骨髄種系はATCCから入手可能である。典型的
には、ポリエチレングリコール（「PEG」）を用いてHAT-感受性マウス骨髄種細
胞をマウス脾臓細胞に融合させる。次に、融合から生じたハイブリドーマ細胞を
、HAT培地を用いて選択し、それは融合していない及び非生産的に融合した骨髄
種細胞を殺す（融合していない脾臓細胞は、トランスフォーメーションされてい
ないので数日後に死ぬ）。本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドー
マ細胞は、例えば標準的なELISAアッセイを用いて、GDF-8またはGDF-11に結合す
る抗体に関してハイブリドーマ培養上清をスクリーニングすることにより検出さ
れる。次に、これらの抗体を例えば本明細書に記述するアッセイを用いてGDF-8
またはGDF-11阻害活性に関して試験することができる。
【００４７】 本発明の別の態様として、GDF-8ペプチドインヒビターは、GDF-8プロ-ドメイ
ンの全部または一部を含んでなる。GDF-8のプロ-ドメインまたはその一部は、様
々な発現系（例えばCHO、バキュロウイルス等）を用いて作製することができる
。GDF-8の発現されたプロ-ドメインは、例えば、Bottinger et al. (1996) PNAS
93:5877-5882に記述されている方法またはペプチドを精製するためのあらゆる
他の当該技術分野で認められている方法を用いることにより精製することができ
る。あるいはまた、以下の実施例において記述するように、プロ-ドメインを例
えばFLAGまたは6-Hisで標識することができる。さらに、GDF-8のプロ-ドメイン
またはその一部は、天然のGDF-8の切断、例えば化学的切断により作製すること
ができる。さらに、GDF-8のプロ-ドメインまたはその一部は、本明細書に記述す
る当該技術分野で既知の技術を用いて化学的に合成することができる。
【００４８】 特定の態様として、GDF-8インヒビターは、成熟GDF-8のC末端を含む（例えば
それにまたがる）ペプチド、例えばペンタコサペプチド（pentacosapeptide）で
ある。好ましくは、GDF-8ペプチドは約25アミノ酸の長さであり、そしてANYCSGE
CEFVFLQKYPHTHLVH（配列番号:25）、KIPAMVVDRCGCS（配列番号:29）及び/または
LSKLRLETAPNISKDVIRQLLP（配列番号:30）から選択される配列を含んでなるかま
たは本質的にそれからなる。別の態様として、GDF-8インヒビターは上記定義の
配列の全部または一部及び約20-25、25-30、30-35、35-40または40-45アミノ酸
残基の長さを有する。次に、これらのペプチドに基づくGDF-8ペプチドインヒビ
ターを本明細書に記述するアッセイを用いてGDF-8またはGDF-11阻害活性に関し
て試験することができる。
【００４９】 別の態様として、本発明のGDF-8及びGDF-11インヒビターは、GDF-8/プロ-ドメ
イン複合体からの成熟GDF-8タンパク質の遊離を阻害する及び/またはGDF-8/プロ
-ドメイン複合体を安定させるペプチド、ペプチド模倣物または小分子である。
そのようなGDF-8及びGDF-11インヒビターにはシステインプロテアーゼインヒビ
ター、例えばm-カルパインインヒビターが包含され る。 さらに別の態様として、本発明のGDF-8またはGDF-11インヒビターは、可溶性のG
DF-8またはGDF-11受容体、例えばGDF-8またはGDF-11受容体への結合に関して（G
DF-8またはGDF-11と）競合するGDF-8またはGDF-11受容体の可溶性フラグメント
である。そのような可溶性のGDF-8またはGDF-11受容体は本明細書に記述されて
いる。 Ｂ．GDF-8及びGDF-11活性を阻害するGDF-8及びGDF-11タンパク質変異体 別の態様として、本発明のGDF-8及びGDF-11インヒビターは、検出可能なGDF-8
活性を保有しないGDF-8またはGDF-11タンパク質変異体である。本発明のGDF-8ま
たはGDF-11変異体は、野生型GDF-8またはGDF-11のアミノ酸配列の１またはそれ
以上の保存的または非保存的アミノ酸置換、欠失、挿入または早発の切断（prem
ature truncation）を含有することができる。あるいはまた、これらの変異体は
、GDF-8またはGDF-11タンパク質の活性にとって重要な残基または重要な領域中
に１またはそれ以上の保存的または非保存的アミノ酸置換、挿入または欠失を含
有することができる。得られたGDF-8またはGDF-11タンパク質変異体は、例えば
、GDF-8またはGDF-11のプロセシング、分泌または/及び生物学的活性を妨げ、そ
れによりGDF-8またはGDF-11インヒビターとして働く。
【００５０】 「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が同様の側鎖（例えば電荷、大きさ
等）を有するアミノ酸残基で置換されるものである。「非保存的アミノ酸置換」
は、アミノ酸残基が同様でない側鎖（例えば電荷、大きさ等）を有するアミノ酸
残基で置換されるものである。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは
、当該技術分野において定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖
（例えばリシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えばアスパラギン酸
、グルタミン酸）、荷電していない極性側鎖（例えばグリシン、アスパラギン、
グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例え
ばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、
メチオニン、トリプトファン）、β-分枝側鎖（例えばトレオニン、バリン、イ
ソロイシン）及び芳香族側鎖（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトフ
ァン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が包含される。
【００５１】 １．切断部位変異体 一つの態様として、本発明のGDF-8及びGDF-11インヒビターは、GDF-8及びGDF-
11タンパク質のドミナントネガティブ突然変異体である。GDF-8及びGDF-11のよ
うな、TGF-βスーパーファミリーに属する増殖因子は、２個の前駆体分子の二量
化によりホモ二量体及びヘテロ二量体 を形成する。この相互作用は、これらの
因子の分泌にとって必要である。リガンド二量体の活性化は、アミノ末端の前駆
体残部からのカルボキシ末端の成熟ペプチドの切断を必要とし、そして適当な生
理的条件下で起こる。従って、活性化のために必要とされる保存された切断配列
の突然変異は、非機能性GDF-8及びGDF-11分子をもたらすことができる。さらに
、これらの突然変異した前駆体分子の過剰発現は、内因性の改変していない単量
体と突然変異したGDF-8及びGDF-11ポリペプチドとのヘテロ二量体形成を競合的
に導くことができる。GDF-8及びGDF-11突然変異体が高レベルで発現される場合
、内因性二量体の大部分はヘテロ二量体形成により滴定して除かれ、従って、活
性のある増殖因子、例えばGDF-8及び/またはGDF-11の分泌を特異的に完全に妨げ
る。GDF-8及びGDF-11ドミナントネガティブ突然変異体、例えば切断部位突然変
異体は、例えば、Lopez et al. (1992) Mol. Cell. Biol., 12, 1674-1679; Wit
tbrodt and Rosa, (1994) Genes & Dev., 8, 1448-1462; Suzuki et al. (1997)
Dev. Biol., 189, 112-122;及びHawley et al. (1995) Genes & Dev., 9, 2923
-2935に記述されている技術を用いて以下の実施例において記述するように製造
することができ、これらの内容は引用することにより本明細書に組み込まれる。
【００５２】 ２．システイン変異体 別の態様として、本発明のGDF-8及びGDF-11インヒビターは、例えば、GDF-8及
びGDF-11のようなTGF-βファミリーメンバーの三次構造を維持する分子内システ
イン架橋に関与する1またはそれ以上の重要なシステイン残基で点突然変異を含
有するGDF-8及びGDF-11タンパク質である。例えば、TGF-βスーパーファミリー
の全てのメンバー間で保存されているシステイン残基、例えばGDF-8ポリペプチ
ドの位置313のシステイン残基を（上記のような）同様の側鎖をもたないアミノ
酸残基で非保存的に置換することができる。本発明のシステイン突然変異体は、
例えば、McPherron and Lee (1997) Nature, 387, 83-90及びKambadur et al. (
1997) Genome Res., 7, 910-15に記述されている技術を用いて以下の実施例の節
において記述するように製造することができ、これらの内容は引用することによ
り本明細書に組み込まれる。
【００５３】 ３．プロ-ドメイン変異体 別の態様として、本発明のGDF-8及びGDF-11インヒビターは、GDF-8またはGDF-
11ポリペプチドのプロ-ドメインの全部または一部を含むGDF-8またはGDF-11ポリ
ペプチドの改変した形態である。本明細書においてそれぞれ「プロ-GDF-8」及び
「プロ-GDF-11」と呼ばれるGDF-8及びGDF-11タンパク質のプロ-ドメインを含ん
でなるインヒビターは、例えば、Bottinger et al. (1996) PNAS, 93, 5877-588
2及びGentry and Nash (1990) Biochemistry 29, 6851-6857に記述されている技
術を用いて先の小節及び以下の実施例の節において記述したように製造すること
ができ、これらの内容は引用することにより本明細書に組み込まれる。本発明の
「プロ-GDF-8」及び「プロ-GDF-11」インヒビターは、プロ-ドメインが得られた
同じ種または異なる種においてGDF-8またはGDF-11活性を阻害するために用いる
ことができる（例えば、ヒトGDF-8活性を阻害するためにマウスプロ-GDF-8を用
いることができる）。好ましい態様として、インヒビター（例えばプロ-GDF-8）
は、GDF-8のプロ-ドメインのN末端を含んでなる（例えば、Arg99の上流であるプ
ロ-ドメインの領域を含んでなる（図11参照））。
【００５４】 ４．翻訳後修飾変異体 さらなる態様として、本発明のGDF-8及びGDF-11インヒビターは、GDF-8または
GDF-11タンパク質またはペプチドの活性に必要な翻訳後修飾を含まない（例えば
、異常な翻訳後修飾を含む）GDF-8またはGDF-11タンパク質またはペプチドを包
含する。本明細書において用いる場合、「異常な」という用語には、GDF-8また
はGDF-11ポリペプチドの野生型翻訳後修飾から逸脱する翻訳後修飾が包含される
。異常な翻訳後修飾には、増加したまたは減少した翻訳後修飾並びにGDF-8また
はGDF-11ポリペプチドの翻訳後修飾の野生型パターンに従わない翻訳後修飾が包
含される。本明細書において用いる場合、「翻訳後修飾」という用語には、GDF-
8またはGDF-11ポリペプチドが翻訳された後（例えばペプチド結合形成が起こっ
た後）に受けるあらゆる修飾が包含される。翻訳後修飾の例には、グリコシル化
、アシル化、限定タンパク質分解、リン酸化及びイソプレニル化が包含される。
翻訳後修飾は、タンパク質のプロセシング、分泌及び生物学的活性において重要
な役割を果たす。
【００５５】 好ましい態様として、本発明のGDF-8及びGDF-11インヒビターは、異常なグリ
コシル化を有する。例えば、本発明のある種のGDF-8インヒビターは、GDF-8プロ
-ドメイン内の予測されるN-連結グリコシル化部位で突然変異を含有する（図13
参照）。II．GDF-8及びGDF-11核酸インヒビター Ａ．リボザイム さらに別の態様として、本発明のGDF-8及びGDF-11インヒビターは、GDF-8また
はGDF-11遺伝子転写産物に対して導かれるリボザイムである。リボザイムは、そ
れらが相補的領域を有することに基づいてハイブリダイズするmRNAのような一本
鎖核酸を切断することができるリボヌクレアーゼ活性を有する触媒RNA分子であ
る。従って、GDF-8またはGDF-11 mRNA転写産物を触媒的に切断し、それによりGD
F-8またはGDF-11 mRNAの翻訳を阻害するために本発明のリボザイム（例えば、Ha
selhoff and Gerlach (1988) Nature 334:585-591に記述されているハンマーヘ
ッド型リボザイム）を用いることができる。GDF-8またはGDF-11をコードする核
酸に特異性を有するリボザイムは、McPherron A. C. et al. (1997) Proc. Natl
. Acad. Sci. 94: 12457-12461及び米国出願第08/706958号に記述されているも
ののようなGDF-8またはGDF-11 cDNAのヌクレオチド配列に基づいて設計すること
ができ、これらの内容は引用することにより本明細書に組み込まれる。例えば、
活性部位のヌクレオチド配列がGDF-8またはGDF-11をコードするmRNAおいて切断
されるヌクレオチド配列に相補的であるテトラヒメナ(Tetrahymena)L-19 IVS RN
Aの誘導体を構築することができる(例えば、Cech et al. 米国特許第4,987,071
号;及びCech et al. 米国特許第5,116,742号を参照)。あるいはまた、RNA分子の
プールから特定のリボヌクレアーゼ活性を有する触媒RNAを選択するためにGDF-8
またはGDF-11 mRNAを用いることができる（例えば、Bartel, D. and Szostak, J
. W. (1993) Sience 261:1411-1418を参照）。
【００５６】 あるいはまた、GDF-8またはGDF-11インヒビターリボザイムは、標的細胞にお
けるGDF-8またはGDF-11遺伝子の転写を妨げる三重らせん構造を形成するようにG
DF-8またはGDF-11遺伝子の１またはそれ以上の調節領域（例えば、GDF-8またはG
DF-11のプロモーター及び／またはエンハンサー）に相補的なヌクレオチド配列
を含んでなることができる。（この技術は、例えば、Helene, C. (1991) Antica
ncer Drug Des. 6(6):569-84; Helene, C. et al. (1992) Ann. N.Y. Acad. Sci
. 660:27-36;及びMaher, L. J. (1992) Bioassays 14(12):807-15に記述されて
いる）。
【００５７】 特定の態様として、本発明のGDF-8及びGDF-11インヒビターは、配列番号：1-4
に記述する４つのヌクレオチド配列の一つを含んでなるリボザイムである。また
、本発明のGDF-8及びGDF-11インヒビターには、GDF-8またはGDF-11の発現を阻害
する配列番号：1-4に記述するヌクレオチド配列に少なくとも70%、75%、80%、85
%、90%、95%、98%またはそれ以上同一であるヌクレオチド配列を有するリボザイ
ムも包含される。2つの核酸配列の同一性%を決定するために、それらの配列を最
適比較目的のために整列させる（例えば、最適整列のために第一及び第二の核酸
配列の一方または両方にギャップを導入することができ、そして比較目的のため
に非相同配列を無視することができる）。好ましい態様として、比較目的のため
に整列させる照合配列の長さは、対照配列の長さの少なくとも30%、好ましくは少
なくとも40%、より好ましくは少なくとも50%。さらにより好ましくは少なくとも60
%、そしてさらにより好ましくは少なくとも70%、80%または90%である。次に、対応
するヌクレオチド位置のヌクレオチドを比較する。第一の配列中のある位置が第
二の配列中の対応する位置と同じヌクレオチドで占められる場合、これらの分子
はその位置で同一である（本明細書において用いる場合、核酸「同一性」は核酸
「相同性」と等しい）。２つの配列間の同一性%は、２つの配列の最適整列のた
めに導入される必要があるギャップの数及び各ギャップの長さを考慮して、それ
らの配列により共有される同一位置の数の関数である。
【００５８】 ２つの配列間の配列の比較及び同一性%の決定は、数学的アルゴリズムを用い
て実施することができる。好ましい態様として、2つのヌクレオチド配列間の同
一性％は、NWSgapdna.CMPマトリックス並びに40、50、60、70または80のギャッ
プ加重及び1、2、3、4、5または6の長さ加重を用いて、GCGソフトウェアパッケ
ージ（http://www.gcg.comで入手可能）中のGAPプログラムを使用して決定する
。別の態様として、2つのヌクレオチド配列間の同一性％は、PAM120重み残基表
、12のギャップ長ペナルティー及び4のギャップペナルティーを用いて、ALIGNプ
ログラム（バージョン2.0）中に組み込まれているE. Meyers及びW. Miller（CAB
IOS, 4:11-17(1989)）のアルゴリズムを使用して決定する。 Ｂ．GDF-8及びGDF-11アンチセンスオリゴヌクレオチド 別の態様として、本発明は単離されたアンチセンス核酸分子の形態のGDF-8ま
たはGDF-11インヒビターを提供する。「アンチセンス」核酸は、タンパク質をコ
ードする「センス」核酸に相補的な、例えば二本鎖cDNA分子のコーディング鎖に
相補的なまたはmRNA配列に相補的なヌクレオチド配列を含んでなる。従って、ア
ンチセンス核酸は、センス核酸に水素結合することができる。本発明のアンチセ
ンス核酸は、全GDF-8もしくはGDF-11コーディング鎖またはその一部に相補的で
あることができる。一つの態様として、GDF-8またはGDF-11アンチセンス核酸は
、GDF-8またはGDF-11をコードするヌクレオチド配列のコーディング領域にアン
チセンスである。「コーディング領域」という用語は、アミノ酸残基に翻訳され
るコドンを含んでなるヌクレオチド配列の領域をさす。別の態様として、アンチ
センス核酸は、GDF-8またはGDF-11をコードするヌクレオチド配列の非コーディ
ング領域にアンチセンスである。「非コーディング領域」という用語は、アミノ
酸に翻訳されないコーディング領域に隣接する5'及び3'配列をさす（すなわち、
5'及び3'非翻訳領域とも呼ばれる）。
【００５９】 GDF-8及びGDF-11をコードする既知のヌクレオチド配列に基づき、ワトソン・
クリック塩基対合の規則に従って本発明のアンチセンス核酸を設計することがで
きる。アンチセンス核酸分子は、GDF-8またはGDF-11 mRNAの全コーディング領域
に相補的であることができるが、典型的にはGDF-8またはGDF-11 mRNAのコーディ
ングまたは非コーディング領域の一部のみにアンチセンスであるオリゴヌクレオ
チドである。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、GDF-8またはGDF-11
mRNAの翻訳開始部位を取り囲む領域に相補的であることができる。適当なアンチ
センスオリゴヌクレオチドは、例えば、約5、10、15、20、25、30、35、40、45または50
ヌクレオチドの長さである。本発明のそのようなアンチセンスGDF-8またはGDF-1
1インヒビターは、当該技術分野において既知の方法に従って化学合成及び酵素
連結反応を用いて構築すること ができる。例えば、アンチセンス核酸（例えば
アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然に存在するヌクレオチドまたは分子
の生物学的安定性を増すためもしくはアンチセンスとセンス核酸間で形成される
二重鎖の物理的安定性を増すために設計された様々に改変されたヌクレオチドを
用いて化学的に合成することができ、例えば、ホスホロチオエート誘導体及びア
クリジン置換されたヌクレオチドを用いることができる。アンチセンス核酸を作
製するために用いることができる改変されたヌクレオチドの例には、5-フルオロ
ウラシル、5-ブロモウラシル、5-クロロウラシル、5-ヨードウラシル、ヒポキサ
ンチン、キサンチン、4-アセチルシトシン、5-(カルボキシヒドロキシメチル)ウ
ラシル、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウリジン、5-カルボキシメチ
ルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β-D-ガラクトシルキューオシン
、イノシン、N6-イソペンテニルアデニン、1-メチルグアニン、1-メチルイノシ
ン、2,2-ジメチルグアニン、2-メチルアデニン、2-メチルグアニン、3-メチルシ
トシン、5-メチルシトシン、N6-アデニン、7-メチルグアニン、5-メチルアミノ
メチルウラシル、5-メトキシアミノメチル-2-チオウラシル、β-D-マンノシルキ
ューオシン、５'-メトキシカルボキシメチルウラシル、5-メトキシウラシル、2-
メチルチオ-N6-イソペンテニルアデニン、ウラシル-5-オキシ酢酸(v)、ワイブト
キソシン、プソイドウラシル、キューオシン、2-チオシトシン、5-メチル-2-チ
オウラシル、2-チオウラシル、4-チオウラシル、5-メチルウラシル、ウラシル-5
-オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル-5-オキシ酢酸（ｖ）、5-メチル-2-チオ
ウラシル、3-(3-アミノ-3-N-2-カルボキシプロピル)ウラシル、(acp3)w及び2,6-
ジアミノプリンが包含される。あるいはまた、アンチセンス核酸は、核酸がアン
チセンスの向きにサブクローン化されている発現ベクターを用いて生物学的に製
造することができる（すなわち、挿入した核酸から転写されるRNAは、目的の標
的核酸にアンチセンスの向きのものである、以下の小節においてさらに記述する
）。
【００６０】 本発明のアンチセンスGDF-8またはGDF-11インヒビターは、典型的には、それ
らがGDF-8またはGDF-11ポリペプチドをコードする細胞mRNA及び／またはゲノムD
NAとハイブリダイズするかまたは結合してそれにより例えば転写及び／または翻
訳を阻害することによりポリペプチドの発現を阻害するように被験体に投与され
るかまたはインサイチューで作製される。ハイブリダイゼーションは、安定な二
重鎖を形成するための通常のヌクレオチド相補性によるか、または例えばDNA二
重鎖に結合するアンチセンス核酸分子の場合には、二重らせんの主溝における特
異的相互作用によってであることができる。本発明のアンチセンス核酸分子の投
与経路の例には、組織部位での直接注入が包含される。あるいはまた、アンチセ
ンス核酸分子は、選択した細胞を標的とするように改変され、次に全身的に投与
することができる。例えば、全身投与のために、アンチセンスGDF-8またはGDF-1
1分子は、例えば、細胞表面受容体または抗原に結合するペプチドまたは抗体に
アンチセンス核酸分子を連結することにより、選択した細胞表面上に発現される
受容体または抗原にそれらが特異的に結合するように改変することができる。ア
ンチセンスGDF-8またはGDF-11核酸分子はまた、当該技術分野で既知のベクター
（例えば、GDF-8またはGDF-11 mRNAに対して導かれるアンチセンスmRNAとして転
写される発現ベクター）を用いて細胞に送達することもできる。アンチセンスGD
F-8またはGDF-11分子の十分な細胞内濃度を得るために、アンチセンスGDF-8また
はGDF-11核酸分子が強力なプロモーター、例えばpol IIまたはpol IIIプロモー
ターの制御下に置かれるベクター構築物が好ましい。
【００６１】 さらに別の態様として、本発明のアンチセンスGDF-8またはGDF-11インヒビタ
ーにはα-アノマー核酸分子が包含される。α-アノマー核酸分子は相補的RNAと
特異的二本鎖ハイブリッドを形成し、その場合、通常のβ-ユニットとは異なり
、それらの鎖は相互に平行に伸びる（Gaultier et al. (1987) Nucleic Acids.
Res. 15:6625-6641）。アンチセンス核酸分子はまた、2'-o-メチルリボヌクレオ
チド（Inoue et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15:6131-6148）またはキメラR
NA-DNA類似体(Inoue et al. (1987) FEBS Lett. 215:327-330)を含んでなること
もできる。
【００６２】 特に好ましい態様として、本発明のGDF-8及びGDF-11インヒビターは、配列番
号：5-24に記述する20のヌクレオチド配列の一つを含んでなるアンチセンスオリ
ゴヌクレオチドである。III．阻害に関して試験するためのGDF-8またはGDF-11アッセイ 本発明のGDF-8またはGDF-11インヒビターは、GDF-8またはGDF-11活性の阻害に
関して試験する様々な適当なアッセイを用いて同定することができる。好ましく
は、阻害は特異的であり、すなわち、GDF-8インヒビターは、他のタンパク質の
活性に影響を及ぼさずにGDF-8タンパク質を特異的に阻害することができ、そし
てGDF-11インヒビターは、他のタンパク質の活性に影響を及ぼさずにGDF-11タン
パク質を特異的に阻害することができる。ある態様として、GDF-8インヒビター
はGDF-11活性を阻害することもでき、そしてGDF-11インヒビターはGDF-8活性を
阻害することもできる。
【００６３】 本明細書において用いる場合、「アッセイ」という用語には、GDF-8またはGDF
-11インヒビターを同定するために考案されたあらゆるアッセイが包含される。
アッセイは、GDF-8またはGDF-11インヒビターがGDF-8またはGDF-11の１またはそ
れ以上の生物学的機能に影響を及ぼす、例えばダウン調節する（downmodulate）
かどうかを同定するために適当なインビトロまたはインビボアッセイであること
ができる。適当なアッセイの例には、全て以下の小節II及び以 下の実施例にお
いて記述するような、DNA複製アッセイ、転写に基づくアッセイ、クレアチンキ
ナーゼアッセイ、3T3-L1前脂肪細胞の分化に基づくアッセイ、3T3-L1脂肪細胞に
おけるグルコース取り込み制御に基づくアッセイ及び免疫学的アッセイが包含さ
れる。GDF-8またはGDF-11インヒビターの同定のためのクレアチンキナーゼバイオアッ
セイ GDF-8及びGDF-11は、筋肉特異的酵素クレアチンキナーゼのタンパク質レベル
、従って活性を調節する。GDF-8またはGDF-11のこの作用は、可能性があるGDF-8
またはGDF-11インヒビターをスクリーニングするために用いることができる。詳
細には、クレアチンキナーゼアッセイは、筋芽細胞、例えばマウス骨格筋芽細胞
細胞系C1C12または11日ヒヨコ胚から単離された初代（primary）ヒヨコ筋芽細胞
において実施することができる。クレアチンキナーゼの活性を調節するインヒビ
ターの能力を試験するために、典型的には、細胞を未分化に保つ血清含有培地中
で48穴トレーにおいて細胞を増殖させる。70%の融合が達せられると、培地を１%
血清に交換し、このようにして分化させ、クレアチンキナーゼを発現させる。交
換時に、可能性があるGDF-8またはGDF-11阻害画分をいくつかのウェルに加え、
続いてしばらくした後にGDF-8またはGDF-11自体を加える。細胞をさらに2〜3日
の期間インキュベーターに戻す。最後に細胞を溶解し、そして市販されているキ
ット（Sigma, St Louis, MOにより入手可能）を用いてライセートのクレアチン
キナーゼ活性を測定する。3T3-L1前脂肪細胞の分化に基づくアッセイ GDF-8及びGDF-11は、脂肪細胞への3T3-L1前脂肪細胞（繊維芽細胞）の分化プ
ロセスを妨げる。GDF-8またはGDF-11のこの作用は、可能性があるGDF-8またはGD
F-11インヒビターをスクリーニングするために用いることができる。詳細には、
本発明のバイオアッセイを以下のように実施することができる。3T3-L1前脂肪細
胞が融合に達するようにし、続いてそれらの血清を含有するDMEM培地を以下のよ
うに：DMEM＋血清＋メチルイソブチルキサンチン＋デキサメタゾン+インシュリ
ンで2日間、DMEM＋血清＋インシュリンでさらに2日間、DMEM＋血清でさらに3日
間逐次置換することにより分化を達成することができる（Spiegelman et al., (
1993) J. Biol. Chem. 268, 6823-6826）。GDF-8及び可能性があるインヒビター
を分化の開始時に加え、そして追加の各培地交換時に再供給することができる。
脂肪細胞分化の程度は様々な方法により、例えば、前脂肪細胞中の脂肪小滴の含
有量の概算により視覚的に、またはSigma（St Louis, MO）からのトリグリセリ
ド（Gro-Trinder）キットを製造業者の説明書に従って用いて、細胞ライセート
のグリセロール/トリグリセリド含有量の定量により評価することができる。3T3-L1脂肪細胞におけるグルコース取り込み制御に基づくアッセイ GDF-8及びGDF-11は、脂肪細胞におけるグルコース取り込み制御を調節する。G
DF-8またはGDF-11のこの作用は、可能性があるGDF-8またはGDF-11インヒビター
をスクリーニングするために用いることができる。詳細には、3T3-L1前脂肪細胞
を上記のプロトコルに従って完全に分化するように誘導することができる。続い
て、グルコース輸送アッセイを実施する。簡潔に言えば、分化後に、培地を無血
清DMEMに変え、そして細胞をGDF-8またはGDF-11インヒビターとGDF-8またはGDF-
11で2時間〜3日間の様々な期間にわたって処理する。続いて、細胞を（因子及び
インヒビターを含まない）低グルコース無血清DMEMに4時間交換する。次いで、
細胞をリンガー/クレブス（Ringer/Krebs）溶液で2回洗浄し、そしてそれらにイ
ンシュリン（0.01〜1μM）を5〜20分間加える。インシュリンを2回洗浄し、トリ
チウム化した（放射性）デオキシグルコース（NEN Dupont）をリンガーバッファ
ー中1μCi/mlの最終濃度で加える。グルコースの取り込みを5〜10分間続行した
ままにし、この時点で細胞を過剰容量のクレブスで洗浄し、可溶化し、そして放
射性グルコースの取り込みを細胞ライセートのシンチレーション計数により決定
する。DNA複製アッセイ 本発明のGDF-8及びGDF-11インヒビターは、DNA複製アッセイを用いて試験する
ことができる。このバイオアッセイは、細胞に基づく増殖アッセイであり、そし
てGDF-8またはGDF-11に応答するあらゆる細胞タイプにおいて実施することがで
きる。このタイプのアッセイにおいて、DNA複製、従って増殖は、DNAへのブロモ
-デオキシ-ウリジン（BrdU）またはトリチウム化したチミジン（[3H]-TdR）標識
の取り込みにより正確に測定される。このバイオアッセイは、G8マウス骨格筋芽
細胞、C2C12マウス筋芽細胞及びミンク肺上皮細胞系、CCL-64及びその突然変異
体誘導体を包含するがこれらに限定されるものではないいくつかの細胞系を用い
て実施することができる。
【００６４】 簡潔に言えば、適当な培養条件を用いて細胞を平板培養する。例えば、0.1%ゼ
ラチン（Sigma）を被覆した96穴培養プレートでG8筋芽細胞を平板培養し、そし
て被覆していないプレートでCCL-64細胞を平板培養する。細胞は、0.1% w/v BSA
を含有する無血清DMEM中でウェルあたり10 x 103細胞で平板培養する。翌日、培
地を取り除き、新しい培地に取り替える。関連阻害画分を加え、そして細胞をイ
ンキュベーターに60分間戻し、その後それらに増殖因子（GDF-8、アクチビン等
）を加える。別の態様として、阻害画分を増殖因子と室温で30分〜2時間混合し
てインヒビター-リガンド相互作用を与え、その後でこの混合物を細胞上に加え
ることができる。G8筋芽細胞では、適当な標識を試験因子の24時間後に加え、取
り込みをさらに24時間続行させる。CCL-64細胞では、適当な標識を試験因子の12
時間後に加え、取り込みをさらに4時間続行させる。BrdUを標識として加える場
合、最後に、市販されているキット（Boehringer-Manheim）を用いて製造業者の
説明マニュアルに従って細胞を固定し、処理する。取り込まれたBrdUは、比色定
量的に決定する。[3H]-チミジン（NEN-Dupont）を標識として用いる場合、細胞
を10%トリクロロ酢酸で2回洗浄し、そして放射能を0.3N NaOHで抽出し、シンチ
レーション計数により決定する。転写に基づくアッセイ 別の態様として、本発明のGDF-8またはGDF-11インヒビターは、G8筋芽細胞、C
2C12筋芽細胞、CCL-64ミンク肺上皮細胞系及びA204ヒト横紋筋肉腫細胞を包含す
るがこれらに限定されるものではないあらゆるGDF-8-またはGDF-11-応答細胞系
における転写に基づくアッセイを用いて同定することができる。
【００６５】 このタイプのアッセイではGDF-8またはGDF-11に応答する人工レポータープラ
スミドを用いることができる。例えば、p3TP-Lux（例えば、Wrana et al. (1992
) Cell, 71, 1003-14に記述されている）及びp(CAGA)12-MLP（例えば、Dennler
et al. (1998) EMBO J., 17, 3091-3100に記述されている）をこのアッセイに用
いることができる。p3TP-Lux及びp(CAGA)12-MLPの両方において、ルシフェラー
ゼ遺伝子転写（従って活性）は、TGF-βファミリーのメンバーに応答する人工最
小プロモーターにより導かれる。従って、細胞ライセートのルシフェラーゼ活性
は、加えた増殖因子による細胞の刺激の程度と一次的相関関係にある。
【００６６】 簡潔に言えば、細胞を、10%ウシ胎仔血清、抗生物質及びL-グルタミンを補足
した適当な培地（例えば、CCL-64はDMEM、そしてA204はマッコイ（McCoy's）培
地）中48穴プレートで平板培養する。80%の融合に達すると、プラスミドの取り
込みを促進するためにFuGENE-6（Boehringer-Manheim）を用いて製造業者の説明
書に従って細胞をトランスフェクションする。２つのプラスミド；トランスフェ
クション効率をモニターするためのpSV-β-galプラスミド及び２つのルシフェラ
ーゼレポータープラスミドのいずれかのカクテルで細胞を一過性トランスフェク
ションする。トランスフェクション試薬と一晩インキュベーションした後、0.1%
BSAを含有する適当な無血清培地で細胞を2回洗浄する。次に、推定される阻害
画分を加え、細胞をインキュベーターに60分間戻す。この期間の終わりに、以下
の因子：GDF-8を発現するCHO細胞ならし培地から調製したヒト組換えミオスタチ
ン/GDF-8、ヒトTGF-β1（R & D Biosystems, Minneapolis）及びアクチビンβA
を発現するCHO細胞からの濃縮したならし培地を加えることができる。
【００６７】 別の態様として、推定されるインヒビターをGDF-8、GDF-11または他のリガン
ドと室温で30分〜2時間混合し、そしてこの混合物をレシピエント細胞上に加え
る。6時間のインキュベーション後に細胞を溶解し、そしてTropix Inc.からのDu
al-Lightルシフェラーゼアッセイキットを用いてルシフェラーゼ及びβ-ガラク
トシダーゼ活性を同じサンプルにおいて決定することができる。活性は、相対ル
シフェラーゼ単位（RLU）、すなわち、同じサンプルにおいて測定されたβ-ガラ
クトシダーゼ活性の対応する値により与えられるトランスフェクション効率を補
正したルシフェラーゼ活性で表される。タンパク質分泌に基づくアッセイ 別の態様として、本発明のGDF-8またはGDF-11インヒビターは、タンパク質分
泌に基づくアッセイを用いて同定することができる。簡潔に言えば、GDF-8また
はGDF-11インヒビター（例えば、ドミナントネガティブ突然変異体、システイン
突然変異体、プロ-ドメイン変異体及び翻訳後修飾変異体）をコードする構築物
を、野生型GDF-8またはGDF-11を生産する構築物と共に、QM7及びRDのような筋肉
細胞系に導入するかまたは共導入することができる。続いて、成熟GDF-8またはG
DF-11を生産し、分泌する共トランスフェクションした細胞の能力を、例えばウ
ェスタンブロット分析により試験することができる。次に、成熟GDF-8またはGDF
-11の生産及び/または分泌を阻害するGDF-8またはGDF-11インヒビターを選択す
ることができる。IV．GDF-8またはGDF-11インヒビターの使用 別の態様として、本発明は、本明細書に記述する方法により同定されるGDF-8
またはGDF-11インヒビター並びに組成物、例えば製薬学的組成物及びこれらのイ
ンヒビターを使用する方法を提供する。本明細書に記述する方法により同定され
るGDF-8またはGDF-11インヒビターは、治療目的のためにGDF-8またはGDF-11の発
現または活性を調節するために用いることができる。代表的態様として、細胞を
その細胞と関連するGDF-8またはGDF-11タンパク質活性の１またはそれ以上の活
性を調節するGDF-8またはGDF-11インヒビターと接触させる。接触はインビトロ
（例えば、細胞をGDF-8またはGDF-11インヒビターと培養することにより）、イ
ンビボ（例えば、被験体にGDF-8またはGDF-11インヒビターを投与することによ
り）またはインオボ（in ovo）（例えば、卵にGDF-8またはGDF-11インヒビター
を注入することにより）で実施することができる。卵注入は、例えば、H. Kocam
is et al. (1998) Poult. Sci. 77, 1913-1919;またはP. A. Johnston et al.,
(1997) Poult. Sci. 76, 165-178; C. E. Dean et al. (1993) Growth Dev. Agi
ng 57, 59-72の技術を用いて本明細書に記述するように実施することができる。
【００６８】 そのようなものとして、本発明はさらに、GDF-8またはGDF-11タンパク質また
は核酸分子の異常な発現または活性を特徴とする疾病または疾患、例えば筋肉関
連疾患に悩んでいる個体を処置する方法を提供する。GDF-8またはGDF-11活性の
阻害は、GDF-8またはGDF-11が異常にアップレギュレーションされ、そして／ま
たは減少したGDF-8またはGDF-11活性が有益な効果を有すると思われる状況にお
いて望ましい。本発明のGDF-8またはGDF-11インヒビターを用いて処置すること
ができる疾患の例には、癌、筋ジストロフィー、脊髄損傷、外傷性損傷、うっ血
性閉塞性肺疾患、エイズまたは悪液質のような筋肉関連疾患が包含される。さら
に、本発明のGDF-8またはGDF-11インヒビターは、肥満症及び関連疾患または脂
肪細胞の異常な増殖と関連する疾患を処置するために用いることができる。
【００６９】 好ましい態様として、本発明のGDF-8またはGDF-11インヒビターは、糖尿病、
肥満症及び肥満症と関連する疾患を処置するために用いられる。例えば、本発明
のGDF-8またはGDF-11インヒビターは、例えば、被験体におけるグルコース輸送
体GLUT4の活性を上げることにより、被験体におけるグルコース輸送を調節する
ために用いることができる。
【００７０】 本発明のGDF-8またはGDF-11インヒビターはさらに、被験体におけるGDF-8また
はGDF-11活性を下げるために用いることができる。本明細書において用いる場合
、「被験体」という用語には、GDF-8またはGDF-11を発現するあらゆる動物、好
ましくは哺乳類が包含される。好ましい態様として、被験体は脊椎動物である。
さらにより好ましい態様として、脊椎動物はニワトリ、シチメンチョウ、ブタ、
ウシ、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、魚類またはヒトである。例えば、本発明
のGDF-8またはGDF-11インヒビターは、被験体、例えばニワトリの筋肉質量を増
加するために用いることができる。
【００７１】 本発明のGDF-8またはGDF-11インヒビターは、投与のために適当な製薬学的組
成物中に導入することができる。そのような組成物は、典型的に、GDF-8またはG
DF-11インヒビター及び製薬学的に許容しうる担体を含んでなる。本明細書にお
いて用いる場合、「製薬学的に許容しうる担体」という用語には、製薬学的投与
に適合する全ての溶媒、分散媒質、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤
及び吸収遅延剤等が包含されるものとする。製薬学的に有効な物質のためのその
ような媒質及び薬剤の使用は、当該技術分野において周知である。あらゆる通常
の媒質または薬剤は、GDF-8またはGDF-11インヒビターと配合禁忌でない限り、
組成物におけるそれらの使用が考えられる。補足的活性化合物もまた組成物中に
導入することができる。
【００７２】 本発明の製薬学的組成物は、その意図される投与経路に適合するように調合さ
れる。投与経路の例には、非経口、例えば静脈内、皮内、皮下、経口（例えば吸
入）、経皮（局所）、経粘膜及び直腸投与が包含される。非経口、皮内または皮
下用途のために用いる溶液または懸 濁液は、以下の成分を含むことができる：
注入用の水、食塩水溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、
プロピレングリコールまたは他の合成溶媒のような滅菌した希釈剤；ベンジルア
ルコールまたはメチルパラベンのような抗菌剤；アスコルビン酸または重亜硫酸
ナトリウムのような酸化防止剤；エチレンジアミン四酢酸のようなキレート剤；
酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩のようなバッファー及び塩化ナトリウムまた
はデキストロースのような張性の調整のための薬剤。pHは、塩酸または水酸化ナ
トリウムのような酸または塩基で調整することができる。非経口製剤は、ガラス
またはプラスチック製のアンプル、使い捨て注射器または多用量バイアル中に封
入することができる。
【００７３】 注入可能な用途のために適当な製薬学的組成物には、滅菌した水溶液（水溶性
の場合）または分散液及び滅菌した注入可能な溶液または分散液の必要に応じた
調製のための滅菌した粉末が包含される。静脈内投与のために、適当な担体には
生理食塩水、静菌水、Cremophor ELTM(BASF, Parsippany, NJ)またはリン酸緩衝
食塩水（PBS）が包含される。全ての場合において、組成物は無菌でなければな
らず、そして容易に注入できる程度に流動性であるべきである。それは製造及び
貯蔵の条件下で安定でなければならず、そして細菌及び真菌のような微生物の混
入作用から保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリ
オール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレング
リコール等）並びにこれらの適当な混合物を含有する溶媒または分散媒質である
ことができる。適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用
により、分散液の場合には必要な粒度の維持により、そして界面活性剤の使用に
より保つことができる。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例
えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサー
ル等により行うことができる。多くの場合において、等張剤、例えば、糖、マン
ニトール、ソルビトールのようなポリアルコール、塩化ナトリウムを組成物中に
含むことが好ましい。注入可能な組成物の遷延吸収は、吸収を遅らせる薬剤、例
えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを組成物中に含むことによりも
たらすことができる。
【００７４】 滅菌した注入可能な溶液は、必要に応じて、上に挙げた成分の一つまたは組み
合わせと共に適当な溶媒中に必要な量のGDF-8またはGDF-11インヒビターを導入
し、続いて濾過滅菌により調製することができる。一般に、分散剤は、基本分散
媒質及び上に挙げたものからの必要な他の成分を含有する滅菌した賦形剤中にGD
F-8またはGDF-11インヒビターを導入することにより調製される。滅菌した注入
可能な溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は真空乾燥及び凍
結乾燥であり、それにより先に滅菌濾過した溶液から任意の追加の適切な成分を
加えた有効成分の粉末が得られる。
【００７５】 一般に、経口組成物は不活性希釈剤または可食性担体を含む。それらをゼラチ
ンカプセル中 に封入するかまたは錠剤に圧縮することができる。経口治療投与
の目的のためには、GDF-8またはGDF-11インヒビターを賦形剤と混合し、錠剤、
トローチ剤またはカプセル剤の形態で使用することができる。経口組成物はまた
、口内洗浄剤としての使用のために液体担体を用いて調製することもでき、その
場合、液体担体中の化合物は経口的に投与され、さっと動かされ、そして吐き出
されるかまたは飲み込まれる。製薬学的に適合した結合剤及び/または添加剤材
料を組成物の一部として含むことができる。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ
剤等は以下の成分のいずれかまたは同様の性質の化合物を含有することができる
：微晶質セルロース、トラガカントゴムもしくはゼラチンのような結合剤；澱粉
もしくはラクトースのような賦形剤；アルギン酸、Primogelもしくはコーンスタ
ーチのような崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムもしくはSterotesのような潤滑
剤；コロイド二酸化ケイ素のような減摩剤（glidant）；ショ糖もしくはサッカ
リンのような甘味料；またはペパーミント、サリチル酸メチルもしくはオレンジ
香料のような香料。
【００７６】 吸入による投与のために、組成物は適当な噴射剤、例えば二酸化炭素のような
気体を含有する加圧容器もしくはディスペンサー、または噴霧器からエアゾール
スプレーの形態で送達される。
【００７７】 全身投与はまた経粘膜または経皮手段によることもできる。経粘膜または経皮
投与のために、透過する障壁に対して適当な浸透剤を製剤中に用いる。そのよう
な浸透剤は一般に当該技術分野において既知であり、例えば、経粘膜投与のため
には、洗剤、胆汁塩及びフシジン酸誘導体が包含される。経粘膜投与は、鼻スプ
レーまたは座薬の使用により実施することができる。経皮投与のために、活性化
合物は、当該技術分野において一般に既知であるように軟膏、膏薬、ゲルまたは
クリームに調合される。
【００７８】 GDF-8またはGDF-11インヒビターはまた、直腸送達のために座薬（例えば、コ
コアバター及び他のグリセリドのような通常の座薬基剤を含む）または停留浣腸
の形態に調製することもできる。
【００７９】 一つの態様として、GDF-8またはGDF-11インヒビターは、移植及びマイクロカ
プセル化送達系を包含する制御放出製剤のような、体からの迅速な除去から化合
物を保護する担体を用いて調製される。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリ
グリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル及びポリ乳酸のような生物分解
性の生体適合性ポリマーを用いることができる。そのような製剤の調製方法は当
業者に明らかである。それらの材料はまた、Alza Corporation及びNova Pharmac
euticals, Inc.からも市販されている。（ウイルス抗原に対するモノクロ ーナ
ル抗体で感染細胞を標的とするリポソームを包含する）リポソーム懸濁液もまた
、製薬学的に許容しうる担体として用いることができる。これらは、例えば米国
特許第4,522,811号に記述されているような、当業者に既知の方法に従って調製
することができる。
【００８０】 投与の容易さ及び投薬量の均一性のために、単位剤形の経口または非経口組成
物を調合することが特に有益である。本明細書において用いる場合、単位剤形は
、処置する被験体に単位投薬量として適当な物理的に分割された単位をさし；各
単位は、必要な製薬学的担体と会合して所望の治療効果を生じるように計算され
た予め定められた量の活性化合物を含有する。本発明の単位剤形の仕様は、活性
化合物の独特な特性及び得られる特定の治療効果並びに個体の処置のためにその
ような活性化合物を調合する当該技術分野に固有の制約により決定され、そして
それらに直接依存する。
【００８１】 そのような化合物の毒性及び治療効能は、例えば、LD50（集団の50%に致死的
な用量）及びED50（集団の50%において治療的に有効な用量）を決定するための
、細胞培養または実験動物における標準的な製薬学的方法により決定することが
できる。毒性と治療効果の用量比は治療指数であり、それは比率LD50 /ED50とし
て表すことができる。大きい治療指数を示すGDF-8またはGDF-11インヒビターが
好ましい。有毒な副作用を示すGDF-8またはGDF-11インヒビターを用いることが
できるが、感染していない細胞に対する可能性がある損傷を最小限に抑え、それ
により副作用を減らすために、冒された組織の部位にそのようなGDF-8またはGDF
-11インヒビターを向ける送達系を設計することに注意が払われるべきである。
【００８２】 細胞培養アッセイ及び動物研究から得られたデータは、ヒトにおける使用のた
めの投薬量の範囲を定めることに用いることができる。そのような化合物の投薬
量は、好ましくは、ほとんどまたは全く毒性なしにED50を含む循環濃度の範囲内
にある。投薬量は、用いる剤形及び利用する投与経路によりこの範囲内で変わる
ことができる。本発明の方法に用いるあらゆるGDF-8またはGDF-11インヒビター
に対して、治療的に有効な用量を最初に細胞培養アッセイから概算することがで
きる。細胞培養において決定したようなIC50（すなわち、症状の最大阻害の半分
を達成する試験GDF-8またはGDF-11インヒビターの濃度）を含む循環血漿濃度範
囲を達成するように動物モデルにおいて用量を定めることができる。そのような
情報は、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定するために用いることができ
る。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーにより測定するこ
とができる。
【００８３】 製薬学的組成物は、投与説明書と一緒に容器、パックまたはディスペンサー中
に入れることができる。
【００８４】 さらに、本発明のGDF-8またはGDF-11インヒビター、例えばリボザイムまたは
アンチセンスイ ンヒビターは、ベクター中に挿入し、遺伝子治療に用いること
ができる。遺伝子治療ベクターは、例えば、静脈注射、局所投与（米国特許第5,
328,470号を参照）によるかまたは定位固定注入（例えば、Chen et al. (1994)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3054-3057を参照）により被験体に送達するこ
とができる。遺伝子治療ベクターの製薬学的調製物は、許容しうる希釈剤中に遺
伝子治療ベクターを含むことができ、または遺伝子送達媒体が埋め込まれる徐放
性マトリックスを含んでなることができる。あるいはまた、完全な遺伝子送達ベ
クターを組換え細胞から完全に生産することができる場合（例えばレトロウイル
スベクター）、製薬学的調製物は遺伝子送達系を生産する１またはそれ以上の細
胞を含むことができる。
【００８５】 遺伝子治療における使用のために適当なベクターは、当該技術分野において既
知である。例えば、アデノウイルスに由来するベクターを用いることができる。
アデノウイルスのゲノムは、それが目的の遺伝子産物をコードし発現するが通常
の溶解（lytic）ウイルス生活環における複製能力の点で不活性化されるように
操作することができる。例えばBerkner et al. (1988) BioTechniques 6:616; R
osenfeld et al. (1991) Science 252:431-434;及びRosenfeld et al. (1992) C
ell 68:143-155を参照。アデノウイルス株Ad 5型dl324またはアデノウイルスの
他の株（例えばAd2、Ad3、Ad7等）に由来する適当なアデノウイルスベクターは
当業者に周知である。組換えアデノウイルスは、それらが非分裂細胞に感染する
ことができない点である状況において有益であることができる。さらに、ウイル
ス粒子は比較的安定であり、精製及び濃縮が容易にでき、そして上記のように感
染性の範囲を変えるように改変することができる。さらに、導入したアデノウイ
ルスDNA（及びその中に含まれる外来DNA）は宿主細胞のゲノム中に組込まれずに
エピソームのままであり、それにより導入したDNAが宿主ゲノム中に組込まれる
ようになる状況（例えばレトロウイルスDNA）において挿入突然変異誘発の結果
として起こる可能性がある潜在的な問題を回避する。さらに、アデノウイルスゲ
ノムの外来DNAの保有容量は他の遺伝子送達ベクターに対して大きい（8キロ塩基
まで）（Berkner et al. 上記引用; Haj-Ahmand and Graham (1986) J. Virol.
57:267）。現在使用されており従って本発明により好ましい大部分の複製欠損性
アデノウイルスベクターは、ウイルスE1及びE3遺伝子の全部または一部を欠失し
ているがアデノウイルスの遺伝物質の80%程度を保持する（例えば、Jones et al
. (1979) Cell 16:683; Berkner et al.,上記;及びGraham et al. Methods in M
olecular Biology中, E. J. Murray, Ed. (Humana, Clifton, NJ, 1991) vol. 7
. pp 109-127を参照）。核酸分子中に含んでなる目的の遺伝子の発現は、例えば
、E1Aプロモーター、主要後期プロモーター（MLP）及び付随するリーダー配列、
E3プロモーターまたは外因的に付加したプロモーター配列の制御下であることが
できる。
【００８６】 本発明のGDF-8及びGDF-11インヒビターの送達のために有用なにさらに別のウ
イルスベクター 系は、アデノ随伴ウイルス（AAV）である。アデノ随伴ウイルス
は、効率のよい複製及び増殖生活環のためにヘルパーウイルスとしてアデノウイ
ルスまたはヘルペスウイルスのような別のウイルスを必要とする天然に存在する
欠損ウイルスである（総説には、Muzyczka et al. Curr. Topics in Micro. And
Immunol. (1992) 158:97-129を参照）。アデノ随伴ウイルスは、高頻度の安定
な組込みを示す（例えばFlotte et al. (1992) Am. J. Respir. Cell. Mol. Bio
l. 7:349-356; Samulski et al. (1989) J.Virol. 63:3822-3828;及びMcLaughli
n et al. (1989) J. Virol. 62:1963-1973を参照）。AAVの300塩基対程度を含有
するベクターをパッケージングすることができ、そしてそれは組込むことができ
る。外来DNAのスペースは約4.5kbに限定される。Tratschin et al. (1985) Mol.
Cell. Biol. 5:3251-3260に記述されているもののようなAAVベクターは、T細
胞中にDNAを導入するために用いることができる。様々な核酸が、AAVベクターを
用いて異なる細胞タイプに導入されている（例えば、Hermonat et al. (1984) P
roc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6466-6470; Tratschin et al. (1985) Mol. Cel
l. Biol. 4:2072-2081; Wondisford et al. (1988) Mol. Endocrinol. 2:32-39;
Tratschin et al. (1984) J. Virol. 51: 611-619;及びFlotte et al. (1993)
J. Biol. Chem. 268:3781-3790を参照）。本発明のGDF-8またはGDF-11インヒビ
ターの送達のために有用な可能性がある他のウイルスベクター系は、ヘルペスウ
イルス、ワクシニアウイルス及びいくつかのRNAウイルスに由来する。
【００８７】 本発明のGDF-8及びGDF-11インヒビターはさらに、GDF-8及びGDF-11インヒビタ
ーがGDF-8もしくはGDF-11のプロセシング、GDF-8もしくはGDF-11の分泌及び/ま
たはGDF-8もしくはGDF-11の生物学的活性を妨げるトランスジェニック動物を作
製するために用いることができる。本明細書において用いる場合、「トランスジ
ェニック動物」は、動物の１またはそれ以上の細胞が導入遺伝子を含有する非ヒ
ト動物、好ましくは哺乳類、より好ましくはラットまたはマウスのような齧歯類
である。トランスジェニック動物の他の例には、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、
ウシ、ヤギ、ニワトリ、シチメンチョウ、両生類、魚類等が包含される。導入遺
伝子は、トランスジェニック動物が発生する細胞のゲノム中に組込まれ、そして
成熟した動物のゲノム中にとどまり、それによりトランスジェニック動物の１ま
たはそれ以上の細胞タイプまたは組織においてコード遺伝子産物の発現を導く外
来DNAである。
【００８８】 トランスジェニック動物は、例えば、微量注入、レトロウイルス感染により、
受精した卵母細胞の雄性前核中にGDF-8もしくはGDF-11インヒビターをコードす
る核酸またはGDF-8もしくはGDF-11をコードする核酸を導入し、該卵母細胞を偽
妊娠メス仮親動物において発生させることにより作製することができる。また、
導入遺伝子の発現の効率を上げるためにイントロ ン配列及びポリアデニル化シ
グナルを導入遺伝子中に含むこともできる。GDF-8またはGDF-11インヒビターの
発現を特定の細胞に導くために組織特異的調節配列（１つまたは複数）をGDF-8
またはGDF-11導入遺伝子に操作可能に連結することができる。胚操作及び微量注
入によりトランスジェニック動物、特にマウスのような動物を作製する方法は当
該技術分野において慣例的になってきており、例えば、両方ともLeder et al.に
よる米国特許第4,736,866号及び4,870,009号、Wagner et al.による米国特許第4,
873,191号並びにHogan, B., Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Ha
rbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986)に記述されている。
同様の方法が他のトランスジェニック動物の作製に用いられる。トランスジェニ
ック創始動物は、そのゲノム中のGDF-8もしくはGDF-11インヒビター導入遺伝子
の存在及び/または動物の組織もしくは細胞におけるGDF-8もしくはGDF-11インヒ
ビターmRNAの発現に基づいて同定することができる。次に、トランスジェニック
創始動物を用いて導入遺伝子を保有する追加の動物を育種することができる。さ
らに、GDF-8またはGDF-11インヒビターをコードする導入遺伝子を保有するトラ
ンスジェニック動物は、他の導入遺伝子を保有する他のトランスジェニック動物
に交配させることができる。
【００８９】 GDF-8またはGDF-11インヒビタートランスジェニック動物のクローンはまた、
例えば、Wilmut, I. et al. (1997) Nature 385:810-813並びにPCT国際公開第WO
97/07668号及びWO 97/07669号に記述されている方法に従って作製することもで
きる。簡潔に言えば、トランスジェニック動物からの細胞、例えば体細胞を単離
し、増殖周期を出てＧ0期に入るように誘導することができる。次に、静止細胞
を単離した同じ種の動物からの除核した卵母細胞に、例えば電気パルスの使用に
より、静止細胞を融合させることができる。次に、再構成した卵母細胞をそれが
桑実胚または胚盤胞に発生するように培養し、次に偽妊娠メス仮親動物に移す。
このメス仮親動物から生まれた子孫は、細胞、例えば体細胞を単離した動物のク
ローンである。
【００９０】 好ましい態様として、GDF-8またはGDF-11インヒビタートランスジェニック動
物は、GDF-8またはGDF-11機能が部分的にのみ阻害されるように選択することが
できる。
【００９１】 本発明は、限定すると解釈されるべきではない以下の実施例によりさらに例示
される。本願の全体にわたって引用される全ての参考文献、特許及び公開特許出
願の全内容並びに配列表及び図面は、引用することにより本明細書に組み込まれ
る。
【００９２】 実施例 材料及び方法 以下の実施例において使用する材料及び方法を最初に記述する。 １．非還元SDS-PAGE及び電気ブロッティング Novex NuPAGEプロトコルを使用した（Novex）。サンプル及びランニングバッ
ファーの両方から還元剤を省いた。 ２．ゲル溶出 溶出バッファー（25mM Tris, pH 8.3及び6M尿素）を用いて、BioRadミニゲル
溶出装置（elutor）プロトコルを使用した。 ３．アセトン沈殿 トリプシン消化をうまく行うためには過剰のSDSの除去が必要である。それ故
、SDSを含有するサンプルによく冷えたアセトンを20%の最終v/vを得るように加
えた。溶液を-20℃より低く20分間保った。次に４℃で最大速度（13,000 x g）
で15分間の遠心分離によりSDSを含まないタンパク質を回収した。次にペレット
を乱さずに上清を除いた。この溶液は、ペレット中のタンパク質の存在がSDS-PA
GEにより確認されるまで廃棄しなかった。通常、高いパーセンテージの回収（実
験当たり>90%）が得られるが、ある場合には、この方法に必要なアセトンの最適
濃度がタンパク質に依存する可能性があり、注意深いモニタリングを行うべきで
ある。 ４．SDSを含まないタンパク質の可溶化 大部分のアセトンを蒸発させるためにSDSを含まないタンパク質サンプルを数
分間風乾させた（決してペレットを乾燥しきらせない）。サンプルを可溶化する
ために、固体の尿素または10M尿素溶液のいずれかを湿ったペレットに加えた。
次のトリプシン消化における大容量希釈のために、可溶化に使用する容量はサン
プル中のタンパク質の損失を避けるために最小限（<5μl）に保った。 ５．トリプシン消化 十分な量の消化バッファー（100mM重炭酸アンモニウム、pH 7.8〜8.0、pHの調
整は必要ない）をサンプルに加えた（尿素の最終濃度は0.1M未満に保たれなけれ
ばならない）。トリプシン（1mM HCl中1μg/mlで）を1（酵素）：20（基質）のw
/w比で加えた後、37℃でインキュベーションすることにより消化を開始した。一
晩のインキュベーション（12-16時間）後、PMSF（エタノール中に調製したスト
ック溶液）を1mMの最終濃度まで加えることにより反応をクエンチした。 6. 高分解能ペプチド分離 PMSFで処理したトリプシンサンプル溶液を２等分に分け、その後にそれを以下
に記述する条件を用いてHPLC分離に供した。一方の部分は還元剤（TCEP/50mMの
最終濃度）で処理し、そしてもう一方の部分は未処理のままである（容量を調整
するために水を加える）。これらのサンプルを60℃で30分間インキュベーション
し、その後10% TFAで酸性化した。別のサンプル処理を用いる場合には、凝集に
よるフラグメント損失の可能性も考慮しなければならない。例えば、PMSFで処理
したトリプシンサンプル溶液に固体のグアニジンHCLを4Mの最終濃度まで加える
ことができる。続いて上記のプロトコルを用いることができる。 カラム：C18 RPカラム（2.1 x 250mm）。 溶媒：A：水中0.1%のTFA、B：80%アセトニトリル中0.1%のTFA。 流速：0.2ml/分。 勾配：60〜90分で0%B〜100%B。 検出器：215nm ジスルフィドを含有するピークに関して最大の分解能を得るために勾配の最適
化が必要である。 ７．二次消化 プロテアーゼの選択は非常に配列に依存する。標的配列が既知でない場合、（
トリプシンより特異性が低い）適当なプロテアーゼ、例えばサーモリシン、キモ
トリプシン、ペプシンまたはあらゆる他の市販されているプロテアーゼを当該技
術分野において周知の方法に従って使用することができる。これらのプロテアー
ゼの標的基質はかなり幅広く、非特異的であるので、それらはたいていトリプシ
ンフラグメントを切断してより小さいフラグメントを生成することができる。ま
た、より大きいフラグメントを生成するために、挙げたものより特異性が高いプ
ロテアーゼを使用することもできる。二次消化は、好ましくは、バッファー及び
pHレベルの違いを除いて５節において上に記述したトリプシン消化と同様の方法
を用いて実施される。 ８．インヒビターの脱グリコシル化 SDSを含まないサンプル（5〜10μg）を可溶化するために、最少量の水素化Tri
ton X-100及び50mMの重炭酸アンモニウムバッファー（pH 7.8〜8.0）を一度に2
〜3μlのわずかな増加で加えることができる。最終容量は30μl未満であるべき
であり、そして溶剤濃度は（酵素の変性を防ぐために）0.5%未満であるべきであ
る。次に反応混合物に1ユニットのペプチドN-グリコシダーゼF（PNGアーゼF）を
加える。サンプルを37℃で16時間インキュベーションし、その後10% TFAで酸性
化する。脱グリコシル化したタンパク質をC4 RPHPLCによりさらに精製し、そし
てあらゆる阻害活性を適当なバイオアッセイによりモニターする。脱グリコシル
化はまた、N-グリコシダーゼF脱グリコシル化キット（Boehringer-Mannheim）を
用いて実施することもできる。 ９．部位特異的突然変異誘発及びベクター構築 切断部位（RSRR）を置換したタンパク質をコードする突然変異したGDF-8 cDNA
を、重複PCR技術を用いて作製した。切断部位の突然変異（RSSR→NAQT）を導入
する重複する内側プライマー対をマウスGDF-8 cDNAの5'及び3'末端を増幅するた
めに１回目のPCRにおいて用いた。次にPCR産物を合わせ、ドミナント-ネガティ
ブ突然変異体（Mut-GDF-8）と呼ばれる全長の突然変異したGDF-8 cDNAを作製す
るために外側プライマーの鋳型として用いた。PCRフラグメントをPCR 2.1ベクタ
ー（Invitrogen）に連結し、突然変異の取り込みを確認するため配列決定した。
次に、Mut-GDF-8をコードするcDNAをFLAG-CMV-5aベクター（Sigma）に3'末端でF
LAGエピトープとインフレーム融合を生じるように挿入した。FLAGエピトープは
、プロセシングされていないGDF-8タンパク質の検出及び精製に用いることがで
きる。このベクターは、真核細胞において高レベル発現をもたらすサイトメガロ
ウイルスプロモーター配列を含有する。
【００９３】 GDF-8のプロ-ドメインを含有する発現プラスミドを同じ方法により作製した。
本明細書において「プロ-GDF-8」と呼ばれる、GDF-8のプロ-ドメイン（残基1-26
6）をコードする部分マウスcDNAをPCRに基づく突然変異誘発により作製した。As
p-267コドン（GAC）を終止コドン（TGA）に変えた。得られたcDNAを本明細書に
記述するようにPCR 2.1ベクターに連結し、配列決定し、そしてFLAG-CMV-5aに挿
入した。全長の前駆体タンパク質を作製するために野生型（WT）のマウスGDF-8
cDNAも同じベクターにサブクローン化した。得られた構築物をWTGDF-8と称する
。 １０．トランスフェクション、ポリアクリルアミドゲル電気泳動及び免疫ブロッ
ティング 発現構築物をFuGene試薬（Boehringer Mannheim）を用いて一過性トランスフ
ェクションによりQM-7ウズラ筋芽細胞中に導入した。トランスフェクションの前
に細胞を60mm皿上で24時間平板培養し、トランスフェクション時には70-80%の融
合であった。β-ガラクトシダーゼを含有するレポーター構築物によりモニター
したトランスフェクションの効率は約70-80%であった。トランスフェクションし
た細胞をOpti-MEM（Gibco-Life Sciences）中で維持し、そしてトランスフェク
ションの48時間後にならし培地を集め、Centriconカラム（Amicon）で約50倍濃
縮した。QM-7細胞における組換えGDF-8タンパク質の様々な形態の発現は、SDS-P
AGE及び抗-FLAG M2特異的抗体（Sigma）での免疫ブロッティングにより確かめた
。抗-FLAG抗体と反応するタンパク質は、製造業者の説明書（ECL, Amersham）に
従って化学発光技術により検出した。 １１．タンパク質精製 QM-7細胞のならし培地からWT-GDF-8-FLAG、MutGDF-8-FLAG及びプロ-GDF-8-FLA
Gを精製するために、FLAGエピトープに対して導かれる特定のモノクローナル抗
体に結合したアフィニティーゲル（Sigma）を用いるアフィニティークロマトグ
ラフィーを製造業者の説明書に従って使用した。結合したタンパク質を0.1Mグリ
シン（pH 3.5）中に溶出し、銀染色したSDS-PAGEゲル（Novex）で定量した。 １２．代謝標識及び免疫沈降 トランスフェクションしたQM-7細胞をOpti-MEM中で48時間維持し、次に200pCi
/mlの[35S]システイン（Amersham）を含有するシステインを含まないDMEM中で3
時間標識した。細胞を２回洗浄し、Opti-MEM中で示した期間インキュベーション
した。次にならし培地を集め、細胞を500μlの溶解バッファー（10mM Tris-HCl
[pH 7.5], 150mM NaCl, 5mM EDTA, 1% SDS, 0.25%デオキシコール酸塩, 0.25% N
P-40, プロテアーゼインヒビターカクテル[Boehringer Mannheim]）中で溶解し
、10分間回転させた。免疫沈降のために、1mlのならし培地または250μlのライ
セート（10mM Tris-HCl [pH 7.5], 150mM NaCl, 5mM EDTAで1：2に希釈した）の
いずれかを抗-FLAG M2アフィニティーゲル（Sigma）と4℃で一晩インキュベーシ
ョンした。免疫沈降物を2%メルカプトエタノールを含有する2X Laemmliローディ
ングバッファー中に再懸濁し、40℃で10分間加熱し、14% SAS-PAGEゲルで電気泳
動した。ゲルにAmplify（Amersham）を浸透させ、乾燥させ、-70℃でKodakフィ
ルムに感光させた。 １３．GDF-8阻害活性の同定/転写に基づくアッセイ このタイプのバイオアッセイは転写に基づき、そして２つの異なる細胞系にお
いて実施した。A204ヒト横紋筋肉腫細胞は、ミオスタチンに非常に応答するので
阻害の効能をモニターするために用いた。阻害の特異性をさらに特性化するため
に、A204及び十分に特性化されたミンク肺上皮細胞系CCL-64の両方を用いた。A2
04より優れたCCL-64の利点は２倍であり：第一に、A204細胞と異なり、CCL-64は
TGF-βに応答し、そして第二に、CCL-64細胞はTGF-βスーパーファミリーメンバ
ーの作用の分子機構を解明するためにモデル細胞系として長年にわたって使用さ
れている。人工レポータープラスミドp(CAGA)12-MLP（Dennler et al. (1998) E
MBO J., 17, 3091-3100に記述されている）をこのアッセイに用いた。ルシフェ
ラーゼ遺伝子転写、従って活性は、TGF-βファミリーのメンバーにより誘導され
る人工最小プロモーターにより導かれる。従って、細胞ライセートのルシフェラ
ーゼ活性は、用いた増殖因子による細胞の刺激の程度と一次的相関関係にある。
【００９４】 両方の細胞タイプを10%ウシ胎仔血清、抗生物質及びL-グルタミンを補足した
それらのそれぞれの培地（CCL-64はDMEM、A204はマッコイ培地）中で48穴プレー
トにおいて平板培養した。80%の融合に達すると、プラスミドの取り込みを促進
するためにFuGENE-6（Boehringer-Mannheim）を用いて製造業者の説明書に従っ
て細胞をトランスフェクションした。細胞を２つのプラスミド；トランスフェク
ション効率をモニターするためのpSV-β-galプラスミド及びルシフェラーゼレポ
ータープラスミドのカクテルで一過性トランスフェクションした。レポータープ
ラスミドp(CAGA)12-MLPは、Dennler et al. (1998)上記に記述されている。トラ
ンスフェクション試薬と一晩インキュベーションした後、0.1% BSAを含有する適
当な無血清培地で細胞を2回洗浄した。次に阻害画分を加え、細胞をインキュベ
ーターに60分間戻した。この期間の終わりに、以下の因子：ミオスタチンを発現
するCHO細胞ならし培地から調製した組換えヒトミオスタチン、ヒトTGF-β及び
アクチビンβAを発現するCHO細胞からの濃縮したならし培地を細胞に加えた。6
時間のインキュベーション後に細胞を溶解し、ルシフェラーゼ及びβ-ガラクト
シダーゼ活性をDual-Lightルシフェラーゼアッセイキット（Tropix, Inc.）を用
いて同じサンプルにおいて決定した。活性は、相対ルシフェラーゼ単位（RLU）
、すなわち、同じサンプルにおいて測定されたβ-ガラクトシダーゼ活性の対応
する値により与えられるトランスフェクション効率を補正したルシフェラーゼ活
性の単位で表される。
【００９５】 インヒビターサンプルを化学的に還元するために、過剰の50mM Na2PO4, pH 7.
0を加えることによりそれを希釈し、この溶液に尿素及びトリス(2-カルボキシエ
チル)ホスフィン塩酸塩（TCEP）をそれぞれ6M及び10mMの最終濃度で加え、そし
て溶液を37℃で30分間インキュベーションした。還元をクエンチするために、ヨ
ードアセトアミドを10mMの最終濃度まで加え、溶液を室温で30分間インキュベー
ションした。次にサンプルを10% TFAで酸性化し、バッファーを0.1% TFAに交換
した。実施例1：画分A及びBの製造及び精製 画分A及びBは、各々、CHO-ならし培地の独立したバッチから同じ精製プロトコ
ルを用いて別個に得られた。ならし培地は、ヒトGDF-8をコードするインサート
を含有する発現プラスミドG8P-1/0.1で安定にトランスフェクションしたCHO細胞
から集めた。CHO細胞は、0.1mMメトトレキセート及び1mg/ml G418（ジェネティ
シン、 GIBCO-Life Sciences）を補足したアルファ培地中で培養した。
【００９６】 画分A及びBを得るために、CHO-ならし培地を３つの異なるHPCLカラムに通した
。第一のカラムはイオン交換カラム（PharmaciaからのHQ）であり、ここで、培
地成分の画分は素通り（flow-through）に付随した。図1は230nmで測定した代表
的なクロマトグラムを示す。幅広いピークはHQの素通りを表し、そして鋭いピー
クは結合した物質を表す。続いて、HQの素通りのpHを6N HClでpH 5.0に調整し、
これによりHQの素通り物質のある成分はSPイオン交換カラム（Pharmacia）に結
合した。浅い勾配を用いて、6-9分の間に溶出されたSPに結合した物質を集めてC
HOならし培地の一方のバッチから画分Aを得、そして14-19分の間に溶出されたSP
に結合した物質を集めてCHOならし培地のもう一方のバッチから画分Bを得た。画
分A及びBの勾配及び215nmで測定したクロマトグラムをそれぞれ図2及び3に示す
。上記の時間で溶出したSP物質を20mM リン酸Na、pH 5.0を用いて脱塩した。次
に各SP物質を浅いアセトニトリル勾配を用いてC4カラムに注入した。C4画分を集
め、スピードバック（speed vac）を用いてアセトニトリルを除いた。画分A（21
-23分の間で溶出した）及びB（27分で溶出した）を生じたC4実験の勾配及び215n
mで測定したクロマトグラムをそれぞれ図４及び5に示す。C4画分を0.1%トリフル
オロ酢酸（TFA）中で保存し、以下に記述するようにGDF-8阻害活性に関して試験
した。
【００９７】 サンプルを変性するために、尿素を6Mの最終濃度まで加え、サンプルを70℃で
10分間インキュベーションし、続いて氷上で冷却した。画分A及びBを還元するた
めに、過剰の50mM リン酸Na, pH 7.0を加えることにより画分A及びB中のTFAを希
釈した。この溶液に尿素及びトリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩（TC
EP）をそれぞれ2M及び10mMの最終濃度で加えた。溶液を37℃で30分間インキュベ
ーションした。還元をクエンチするために、ヨードアセトアミドを10mMの最終濃
度まで加え、溶液を室温で30分間インキュベーションした。次にサンプルを10%
TFAで酸性化し、バッファーを0.1% TFAに交換した。バイオアッセイの適当なバ
ッファーコントロールとして使用するために、22.5または27分で溶出する別個の
ブランクC4実験（投入タンパク質なし）からのサンプルを集め、画分A及びBと同
時に処理した。実施例２：画分A及びBにおけるGDF-8阻害活性の同定 最初のCHO-ならし培地から得られたC4画分の阻害能力に関して試験するために
２つの別個のタイプのバイオアッセイを開発した。DNA複製アッセイ 第一のバイオアッセイは、G8マウス骨格筋芽細胞及びミンク肺上皮細胞系CCL-
64において実施した増殖アッセイであった。このタイプのアッセイでは、DNA中
へのブロモ-デオキシ-ウリジン(BrdU)またはトリチウム化したチミジン標識の取
り込みによりDNA複製、従って増殖が正確に測定される。
【００９８】 簡潔に言えば、G8筋芽細胞は0.1%ゼラチン（Sigma）を被覆した96穴培養プレ
ートで平板培養し、一方、CCL-64細胞は被覆していないプレートで平板培養した
。両方の細胞タイプを、0.1% w/v BSAを含有する無血清DMEM中でウェルあたり10
x 103細胞で平板培養した。翌日、培地を取り除き、新しい培地に取り替えた。
関連阻害画分を加え、そして細胞をインキュベーターに60分間戻し、その後それ
らに増殖因子を加えた。試験因子を添加した24時間後にG8筋芽細胞に1：1,000の
最終希釈のBrdU標識（Boehringer-Manheim）を加え、取り込みをさらに24時間続
行させた。次にG8筋芽細胞を、市販されているキット（Boehringer-Manheim）を
用いて製造業者の説明マニュアルに従って固定し、処理した。取り込まれたBrdU
を比色定量的に決定した。試験因子を添加した12時間後にCCL-64上皮細胞に[3H]
-チミジン（NEN-Dupont）を全部で4時間の期間にわたって加えた。CCL-64細胞を
10%トリクロロ酢酸で2回洗浄し、そして放射能を0.3N NaOHで抽出し、シンチレ
ーション計数により決定した。転写に基づくアッセイ 第二のタイプのバイオアッセイは転写に基づき、２つの異なる細胞系において
実施した。A204ヒト横紋筋肉腫細胞はGDF-8に特に応答するので、阻害の効能を
モニターするために用いた。阻害の特異性をさらに特性化するために、A204細胞
及び十分に特性化されたミンク肺上皮細胞系CCL-64の両方を用いた。A204より優
れたCCL-64の利点は２倍であり：第一に、A204細胞と異なり、CCL-64はTGF-βに
応答し、そして第二に、CCL-64細胞はTGF-βスーパーファミリーメンバーの作用
の分子機構を解明するためにモデル細胞系として長年にわたって使用されている
。2つの人工レポータープラスミド：p3TP-Lux（Wrana et al., (1992) Cell, 71
, 1003-14）及びp(CAGA)12-MLP（Dennler et al. (1998) EMBO J., 17, 3091-31
00）をこのアッセイに用いた。両方とも、ルシフェラーゼ遺伝子転写（従って活
性）は、TGF-βファミリーのメンバーに応答する人工最小プロモーターにより導
かれる。従って、細胞ライセートのルシフェラーゼ活性は、用いた増殖因子によ
る細胞の刺激の程度と一次的相関関係にある。
【００９９】 簡潔に言えば、両方の細胞タイプを10%ウシ胎仔血清、抗生物質及びL-グルタ
ミンを補足したそれらのそれぞれの培地（CCL-64はDMEM、A204はマッコイ培地）
中で48穴プレートにおいて平板培養した。80%の融合に達すると、プラスミドの
取り込みを促進するためにFuGENE-6（Boehringer-Mannheim）を用いて製造業者
の説明書に従って細胞をトランスフェクションした。細胞を２つのプラスミド；
トランスフェクション効率をモニターするためのpSV-β-galプラスミド（Promeg
a）及び2つのルシフェラーゼレポータープラスミドのいずれかのカクテルで一過
性トランスフェクションした。第一のレポーター、p3TP-LuxはWrana et al., 19
92, 上記に記述されている。第二のp(CAGA)12-MLPはDennler et al., 1998, 上
記に詳細に記述されている。トランスフェクション試薬と一晩インキュベーショ
ンした後、0.1% BSAを含有する適当な無血清培地で細胞を2回洗浄した。次に阻
害画分を加え、細胞をインキュベーターに60分間戻した。この期間の終わりに、
以下の因子：ヒト組換えCDF-8を発現するCHO細胞ならし培地、ヒトTGF-β1（R &
D Biosystems, Minneapolis）及びアクチビンβAを発現するCHO細胞からの濃縮
したならし培地（Genetics Institute, Cambridge, MA）を細胞に加えた。擬似
トランスフェクションした細胞からの培地は活性がなかった。
【０１００】 6時間インキュベーションした後に細胞を溶解し、そしてルシフェラーゼ及び
β-ガラクトシダーゼ活性をTropix Inc.からのDual-Lightルシフェラーゼアッセ
イキットを用いて同じサンプルにおいて決定した。活性は、相対ルシフェラーゼ
単位（RLU）、すなわち、同じサンプルにおいて測定されたβ-ガラクトシダーゼ
活性の対応する値により与えられるトランスフェクション効率を補正したルシフ
ェラーゼ活性の単位で表される。画分A（22.5分で溶出したC4カラム画分）の阻害作用 Ｉ．G8筋芽細胞及びCCL-64ミンク肺上皮細胞の増殖に対する作用 GDF-8自体は100ng/mlで、DNA中のBrdU標識の増加した取り込みにより測定した
場合に、G8筋芽細胞の増殖を６倍増大した（図6A）。C4カラムから得られた画分
を再懸濁するために用いたバッファー賦形剤はこのアッセイにおいてそれ自体で
は活性がなく、そして100ng/mlのGDF-8の作用に実質的に影響を与えなかった（
図6A）。
【０１０１】 C4カラムから得られた様々な画分のうち、22.5分で溶出する生物活性ピークが
同定され、画分Aと称した。画分A自体は、G8筋芽細胞の増殖に対していかなる作
用ももたなかった。しかしながら、それは細胞増殖に対するGDF-8の正の作用を
ほとんど無効にすることができた（図6A）。画分Aの同様のGDF-8阻害作用は、ト
リチウム化したチミジンをBrdUの代わりに標識として用いた場合に、そしてGDF-
8及び画分Aの作用を別の細胞タイプ、CCL-64細胞で試験した場合に認められた（
図6B）。GDF-8は、筋原性細胞系に対するその作用と異なり、CCL-64上皮細胞系
では細胞増殖を阻害し、TGF-βと同じ作用である。GDF-8のこの増殖阻害は、GDF
-8の添加前にCCL-64細胞を過剰の重量/重量の画分Aで60分間前処置すると取り消
された（図6B）。要するに、細胞系、GDF-8の増殖作用のタイプ（正または負）
及び細胞増殖を測定する方法にかかわらず、画分Aは一貫してGDF-8に対して明白
な反対の活性を示した。 II．最小プロモーターからの転写に対する作用/変性及び還元に対する感受性/作 用の特異性 図7Aに示すように、画分Aとの1時間のプレインキュベーションは、A204横紋筋
肉腫細胞におけるp(CAGA)12-MLPルシフェラーゼ遺伝子転写に対する3または10ng
/mlのGDF-8の作用を無効にした。この作用はまた、同じ細胞において第二の別個
のレポータープラスミドp3TP-Luxを用いても認められた。
【０１０２】 ２つの異なる還元剤、DTT及びTCEP/ヨードアセトアミドを用いた画分Aの還元
は、用いたレポータープラスミドにかかわらず、画分Aの阻害能力に影響を与え
ず、この画分内の活性成分が強い還元剤に対して感受性でないことを示す（図7A
）。これらの条件が実際に還元をもたらし得ることは、例えば、それらが別の還
元感受性画分、画分Bの活性を無効にできることを示すことにより別個に裏付け
られた（図9参照）。
【０１０３】 熱（100℃で10分間、次に氷上で素早く冷却すること）によるかまたは6M尿素
と熱による画分Aの変性は、いずれもその阻害活性に影響を与えなかった（図7B
）。
【０１０４】 特異性の問題は、p(CAGA)12-MLPレポーターを用いてCCL-64細胞において検討
した。TGF-βファミリーの３つの異なるメンバー：TGF-β自体、GDF-8及びアク
チビンに対する画分Aの作用を比較した。
【０１０５】 図8に示すように、画分A（またはその賦形剤）はそれ自体では、基礎（バック
グラウンド）ルシフェラーゼ活性を調節せず、またTGF-βもしくはアクチビンの
作用も認めうるほどには改変しなかった。対照的に、それはGDF-8に対する強い
阻害活性をやはり示した。この一例の証拠は、画分Aが、かなりの程度の相同性
（アミノ酸レベルで〜40％）を共有する構造的に関連した因子間を明白に識別で
きることを示す。画分B（27分で溶出したC4カラム画分）の阻害作用 I．最小プロモーターからの転写に対する画分Bの作用/変性及び還元に対する感
受性/作用の特異性 第二の独立して得られた阻害画分もまたCHO-ならし培地の別個のバッチの処理
から同定された。この新規なインヒビター画分は、C4カラムにおいて27分の保持
時間を有した。この画分を画分Aと同じ条件下で転写に基づくバイオアッセイに
おいて試験した。画分Aと同様に、画分BはA204横紋筋肉腫細胞においてルシフェ
ラーゼ活性に対するGDF-8の作用を機能的に阻害することができた（図9）。
【０１０６】 さらなる分析により、画分Aの活性と同様に、画分B内の阻害活性は強い変性条
件（6M尿素と熱）に非感受性であることが示された。しかしながら、画分Aと異
なり、画分BサンプルのTCEP還元は、その阻害活性を無効にした（図9）。
【０１０７】 この新規なC4画分の特異性を試験するために、追加の一連の実験をp(CAGA)12-
MLPレポーターを用いてCCL-64細胞において実施した。得られた結果は、画分Bが
、TGF-βまたはアクチビンの活性を損なわないままにしながら、GDF-8の作用を
特異的に阻害するその能力の点で画分Aと類似していることを示す（図10）。
【０１０８】 実施例３：画分A及びBの生化学的特性化 画分A及びBの組成をよりよく理解する努力の一部として、還元及び非還元の両
方の条件下で銀染色を画分A及びBで実施した。画分Aを還元するために用いた方
法は上記である。溶液中の画分Aは、それが還元または非還元の状態であろうと
、非常に低分子量（色素最前部と共に移動する）〜200kDaの重量のいくつかの成
分を含んでなる。しかしながら、このサンプルを還元すると新しいバンドがより
低分子量で現れ、いくつかのより高分子量のバンドが消失する。
【０１０９】 画分Bは、Novexにより供給される方法論及び還元剤を用いて還元した。結果は
、画分Bの非還元状態では２つの主要な種及びいくつかの微量の種があることを
示す。還元状態では、約12kDaの新しいバンドが存在し、全部で３つの主要な成
分を同様に存在するいくつかの微量の成分と共に与える。実施例４：画分A及びB中のGDF-8インヒビターの同定及び特性化 画分A及びB中のインヒビターを同定し、特性化するための４段階の方法を以下
のように実施することができる： Ｉ．GDF-8活性を阻害する画分A及びBの成分の同定 いくつかの異なる種が画分A及びBに存在する。従って、活性成分または複数の
成分（例えば、GDF-8を阻害する成分（１または複数））を明白に同定するため
にはこれらの画分をそれらの個々の成分にさらに処理することが必要である。こ
の工程は、以下の実施例5に記述するように、分取非還元SDS-PAGEを実施するこ
とにより、そして続いて電気溶出により分離した成分を回収することにより行う
ことができる。次に、本明細書に記述するバイオアッセイを用いてGDF-8阻害活
性を保有する成分を同定することができる。
【０１１０】 １またはそれ以上のGDF-8阻害成分をうまく同定した後、これらの成分の特異
性を以下の実施例5に記述するようにさらに調べることができる。例えば、GDF-8
特異的阻害活性に関して試験するために、アクチビン、BMP及びTGF-βのような
、この研究に含まれるGDF-8と同様の構造的及び生物学的活性を有するいくつか
の分子を用いることができる。精製したGDF-8インヒビターは、投与量に依存し
且つGDF-8特異的にGDF-8の作用を中和する能力に関して試験することができる。
II．GDF-8インヒビターの特性化 以下の実施例5に記述するように、インヒビターを特性化するためにＮ末端配
列決定及び質量分析法の分析の１またはそれ以上の組み合わせを用いることがで
きる。Ｎ末端配列決定分析では、少なくとも10〜15μgのいずれかの画分を非還
元SDS-PAGE上に載せることができる。次にタンパク質を分離し、PVDF膜上に電気
ブロッティングする。クーマシーブルーで染色した後、インヒビターに対応する
タンパク質バンドを配列決定分析のために切り出す。各配列決定サイクルで認め
られる残基の数はサンプル中の異なる成分の数と直接一致し、そして各サイクル
での様々なシグナル間の強さの比は、各異なる成分の割合を概算するために用い
られる。
【０１１１】 インヒビター及びその成分の正確な分子量は、還元剤の非存在下及び存在下で
の電子スプレー（electrospray）/イオン化質量分析法（ESI/MS）により決定す
ることができる。質量分析法の情報は、既知の一次配列から計算される予想分子
量と合わせて、２つの目的のために：第一に、N末端配列決定分析によるインヒ
ビターの組成を確認するかまたは正確なものにするために、そして第二に、N末
端配列決定分析が答えを与えることができない潜在的なC末端切断、内部切断ま
たは翻訳後修飾に関してインヒビターの完全性を評価するために用いることがで
きる。 III．GDF-8インヒビターのジスルフィドパターンの特性化 ジスルフィドパターンを特性化する実験は、還元に対して感受性であり従って
ジスルフィド結合を含有する阻害活性を有する画分Bのような画分の特性化に特
に関係がある。ジスルフィド結合の成功した特性化は、サンプル調製及び高分解
能ペプチドマッピングの両方の一貫性に依存する。ジスルフィドを含有するフラ
グメントは、トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)で処理した（還元し
た）サンプルとTCEPで処理していないサンプル間のHPLCクロマトグラムを比較す
ることにより同定される。
【０１１２】 クロマトグラムの初期領域（非保持領域（non-retentate））を除いて、TCEP
で処理したサンプルのクロマトグラムにおけるピークの消失は、ジスルフィドを
含有するフラグメントを示唆する。TCEPで処理していないサンプルからの対応す
る画分をN末端配列決定並びにマトリックス補助レーザー脱離（matrix-assisted
laser desorption）/イオン化及び飛行時間型質量分析法（MALDI-TOF/MS）の両
方の分析により分析する。単一のジスルフィド結合が存在する場合、各配列決定
サイクルで、2個のアミノ酸残基が同じシグナル強度で明白に示される。
【０１１３】 阻害画分A及びBの予備特性化並びにGDF-8を発現するCHO細胞のならし培地中の
それらの存在は、それらがGDF-8に関連する（例えば、GDF-8活性を阻害するGDF-
8のペプチドを含有する）という考えと一致する。これが上記の配列決定作業に
より裏付けられる場合、GDF-8の既知の一次配列との比較により、ジスルフィド
で連結されたペプチドの正体、より重要なことには、GDF-8配列内のジスルフィ
ドの位置が容易に決定される。MALDI-TOF/MS分析は、主として確認の目的のため
に用いる。
【０１１４】 多数の配列または多数のジスルフィド結合のいずれかが関与している場合、分
析可能なフラグメントを作製するためにプロテアーゼによる二次消化（プロテア
ーゼの選択は全く配列に依存する）が必要とされる。次に、上記の材料及び方法
の節において記述したようにペプチドマッピングの別の実験を実施することがで
きる。 IV．GDF-8インヒビターの翻訳後修飾の同定 哺乳類のタンパク質修飾の最も一般的な形態の一つはグリコシル化であり、そ
れはタンパク質の生物活性に実質的に影響を与えることができる場合がある。従
って、GDF-8阻害ペプチドのグリコシル化がこのペプチドの阻害活性を調節する
かどうかを調べることは重要である。
【０１１５】 そうするために、上記の材料及び方法の節において記述したように、そして以
下の実施例において例示するように阻害種を脱グリコシル化することができる。
構造（グリコシル化）と機能活性（阻害）の間の相関関係は、本明細書に記述す
るGDF-8阻害のバイオアッセイにより確かめるかまたは除外することができる。 実施例５：画分B中のGDF-8インヒビターの同定及び特性化 GDF-8の阻害を招く画分B中の個々の成分は、分取非還元SDS-PAGEゲルを泳動し
、そして電気溶出により成分を分離することにより決定された。約36kDaの分子
量を有するペプチドがGDF-8の阻害を招くと決定された。GDF-8阻害の特異性もま
た以下に記述するように示された。
【０１１６】 インヒビターの特性化の第一段階は、電子スプレー/イオン化質量分析法によ
る正確な分子量の決定であった。質量分析スペクトルは、29,472.0Daの分子質量
の主要成分を含む600Da離れた3本のピークを示した（M-Scan, Inc.）（図23）。
質量分析及びSDS-PAGEからの分子量の違いは、ゲル及び分子量マーカーのためで
あった可能性がある。
【０１１７】 次の段階は、5サイクル（最初の5個のアミノ酸を決定する）でパルス相（puls
ed phase）Ｎ末端配列決定によりインヒビターのアミノ酸配列を決定することで
あった。表Iは、検出された主要アミノ酸及び微量アミノ酸を示し、主要アミノ
酸は90%より多く存在する。この配列（NENSE）（配列番号：26）は、GDF-8のプ
ロ-ドメインに存在する配列に相当する。
【０１１８】
【表１】
【０１１９】 次の段階は、「プロ-GDF-8」と呼ばれる画分Bからのインヒビター（すなわち
、GDF-8のプロ-ドメイン）が翻訳後修飾によりもたらされるかどうかを決定する
ことであった。哺乳類のタンパク質における修飾の最も一般的な形態はグリコシ
ル化である。GDF-8のプロ-ドメインには、グリコシル化のための1個のみのアス
パラギンが存在する。このアスパラギンのグリコシル化がGDF-8プロ-ドメインの
阻害活性を維持するために必要とされるかどうかを決定するために、画分Bから
のプロ-GDF-8インヒビターをN-グリコシダーゼF脱グリコシル化キット（Boehrin
ger Mannheim）を用いて脱グリコシル化した。脱グリコシル化したタンパク質を
C4カラムに通すことにより酵素、変性試薬及び塩を除いた。グリコシル化及び脱
グリコシル化タンパク質の阻害活性を決定するために転写に基づくバイオアッセ
イ（p(CAGA)12-MLP構築物を用いる）を用いた。これらの結果は、GDF-8を阻害す
るためにGDF-8プロ-ドメインがグリコシル化されなければならないことを示した
（図28）。
【０１２０】 結局、前述の研究により、画分BからのGDF-8ペプチドインヒビター単離物がグ
リコシル化された形態のGDF-8の全プロ-ドメインであること及びグリコシル化（
例えば、ペプチドをグリコシル化することができる細胞におけるペプチドの生産
）が阻害活性のために必要であることが示された。DNA複製アッセイを用いる画分Aインヒビターの特性化 図6Aに示すように、GDF-8自体は100ng/mlで、DNA中のBrdU標識の増加した取り
込みにより測定した場合に、G8筋芽細胞増殖を６倍増大する。プロ-GDF-8を再懸
濁するために用いたバッファー賦形剤はこのアッセイにおいてそれ自体では活性
がなく、100ng/mlのGDF-8の作用に実質的に影響を与えなかった。しかしながら
、プロ-GDF-8は細胞増殖に対するGDF-8の正の作用をほとんど無効にすることが
できた。
【０１２１】 プロ-GDF-8の同様のGDF-8阻害作用は、トリチウム化したチミジンをBrdUの代
わりに標識として用いた場合に、そしてアッセイを別の細胞タイプ、CCL-64細胞
において実施した場合に認められた（図6B）。GDF-8は、筋原性細胞系に対する
その作用と異なり、CCL-64上皮細胞系では細胞増殖を阻害し、TGF-βと同じ作用
である。GDF-8のこの増殖阻害は、成熟GDF-8タンパク質の添加前にCCL-64細胞を
6倍過剰の重量/重量のプロ-GDF-8で60分間前処置すると取り消された（図6B）。
【０１２２】 要するに、細胞系、増殖に対するGDF-8の作用のタイプ（正または負）及びDNA
複製を測定す るために用いる標識にかかわらず、この改変した増殖アッセイはG
DF-8の活性を正確に示し、そしてプロ-GDF-8のようなGDF-8アンタゴニストのGDF
-8阻害能力を決定するために用いることができる。転写に基づくアッセイを用いるGDF-8インヒビター（画分B）の特性化 図7Aに示すように、レポーター遺伝子構築物p(CAGA)12-MLPはGDF-8に投与量に
依存して応答し、増殖因子の添加後6時間程度の早期に実質的な誘導が検出され
た。しかしながら、GDF-8のプロ-ドメインでの細胞の1時間の前処理は、A204横
紋筋肉腫細胞におけるp(CAGA)12-MLPルシフェラーゼ遺伝子転写に対する3または
10ng/mlの成熟GDF-8の作用を無効にした（図25）。この作用はまた、同じ細胞に
おいて第二の別個のレポータープラスミドp3TP-Luxを用いても認められた。
【０１２３】 このタイプの転写に基づくアッセイは、GDF-8の作用に対してより高感度であ
る（図7A及び7BのGDF-8濃度を図6A及び6Bのものと比較せよ）。このタイプのア
ッセイはまた、例えば、p(CAGA)12-MLPレポーターを用いてCCL-64細胞において
、阻害の特異性も決定する。詳細には、TGF-βファミリーの３つの異なるメンバ
ー：TGF-β自体、GDF-8及びアクチビンに対するプロ-GDF-8の作用を比較した。
図8に示すように、プロ-GDF-8（またはその賦形剤）はそれ自体では基礎（バッ
クグラウンド）ルシフェラーゼ活性を調節せず、またTGF-βもしくはアクチビン
の作用も認めうるほどには改変しなかった。対照的に、それはGDF-8に対する強
い阻害活性をやはり示した。
【０１２４】 要するに、上記の転写に基づくバイオアッセイは、特に、GDF-8活性の高感度
のモニタリング及び推定されるGDF-8アンタゴニストの阻害能力をそれらの作用
機構（例えば、それらがGDF-8に結合して不活性化することにより作用するかま
たはコグネイト受容体を妨げることにより作用するか）にかかわらず決定するこ
とができるように最適化される。クレアチンキナーゼアッセイを用いるGDF-8インヒビターの特性化 図26に示すように、分化の開始時にGDF-8でヒヨコ始原筋芽細胞またはC2C12筋
芽細胞を72時間処理することにより、細胞ライセートのクレアチンキナーゼの活
性が減少した。これはGDF-8の存在下及び非存在下での細胞形態の比較によって
も明らかであった。後者の場合、ずっと少数の管が皿に形成した。TGF-β1はC2C
12細胞においてGDF-8のものと同様の作用を有したが、ヒヨコ始原筋芽細胞では
そうではなかった（図26）。従って、クレアチンキナーゼアッセイは、GDF-8に
よるクレアチンキナーゼ活性の減少を阻害する能力を決定することにより、プロ
-GDF-8のようなGDF-8インヒビターを同定し、特性化するために用いることがで
きる。3T3-L1前脂肪細胞の分化に基づくアッセイを用いるGDF-8インヒビターの特性化 特定のプロトコルに従って、3T3-L1前脂肪細胞は脂肪細胞に分化し、インビボ
で脂肪細胞に特有の分子マーカーの完全な範囲及び形態学的特徴を示すことがで
きる。この実験の結果が示すように、分化プロセスの開始時にGDF-8で3T3-L1細
胞を処理することにより、分化の激しい妨害がもたらされた。これは２つの独立
した規準を用いて評価された。GDF-8の作用は、脂質小滴を含有する屈折性細胞
がほとんどないことにより明らかである。mRNAレベルで、脂肪細胞特異的遺伝子
GLUT4の発現は、GDF-8で処理した細胞で妨げられる。以前に脂肪細胞代謝の制御
に関連づけられている２つのサイトカイン、すなわちTNF-α及びTGF-β1は、GDF
-8の作用によく似ることができる。さらに、分化の程度は、材料及び方法の節に
おいて挙げたように、様々な免疫学的、生化学的及び分子生物学的方法により検
討することができる。機能性GDF-8を欠くマウス及びウシの脂肪状態（adipocity
）の変化は記述されている。それ故、このアッセイは、インビボでのGDF-8活性
の生理学的に有用な測定を提供する。従って、脂肪細胞分化のGDF-8妨害に対す
るGDF-8インヒビターの作用は、そのようなインヒビターを評価するために用い
ることができる。3T3-L1脂肪細胞におけるグルコース取り込みアッセイを用いるGDF-8インヒビタ
ーの特性化 分化した脂肪細胞において、インシュリンは投与量に依存してGlut-4輸送体に
よるグルコース輸送を刺激する（図27）。この作用は、GDF-8でこれらの細胞を7
2時間処理することにより投与量に依存して妨げることができる（図27）。重要
なことには、このアッセイは、インビボ体脂肪代謝機能のGDF-8活性のインビト
ロ相関物を提供する。実施例６：GDF-8プロ-ドメインから得られるGDF-8インヒビターの作製 GDF-8 タンパク質のプロ-ドメインの全部または一部を含んでなるGDF-8インヒ
ビターを製造するために、GDF-8のプロ-ドメイン（図13に示す残基1-266）（「
プロ-GDF-8」とも呼ばれる）をコードする部分マウスcDNAをPCRに基づく突然変
異誘発により作製した。PCRフラグメントをTAベクター（Invitrogen）にサブク
ローン化し、突然変異の取り込みを確かめるために配列決定した。プロ-GDF-8を
コードするcDNAをFLAG-CMV-5aベクター（Sigma）に、プロ-GDF-8タンパク質の検
出及び精製に使用する3'末端のFLAGエピトープとインフレーム融合を生じるよう
に挿入した（図12C）。このベクターは、真核細胞において高レベルの発現をも
たらすサイトメガロウイルスプロモーター配列を含有する。野生型GDF-8を発現
する構築物（WT-GDF-8）を同じベクターを用いて作製した（図12A）。
【０１２５】 切断できない全長GDF-8突然変異体は、プロ-ドメインと成熟タンパク質間の境
界の予測される切断部位を置換することにより、同じ方法を用いて発現させた（
図13B及び14）。
【０１２６】 得られた３つの発現構築物をFuGENE試薬（Boehringer Mannheim）を用いて一
過性トランスフェクションによりQM-7ウズラ筋芽細胞に導入した。β-galを含有
するレポーター構築物によりモニターしたトランスフェクションの効率は約70-8
0%であった。トランスフェクションしたQM-7細胞のならし培地から組換えタンパ
ク質、すなわち、Mut-GDF-8-FLAG及びプロ-GDF-8-FLAGを精製するために、FLAG
エピトープに対して導かれる特定のモノクローナル抗体に結合したアフィニティ
ーゲル（Sigma）を使用するアフィニティークロマトグラフィーを用いた。結合
したタンパク質を0.1Mグリシン（pH 3.5）中に溶出し、SDS-PAGE、続いて銀染色
（Novex）により定量した。精製されたプロ-GDF-8の概算濃度は約20ng/mlであっ
た。
【０１２７】 溶出したタンパク質は、抗-FLAG抗体での免疫ブロッティングによっても分析
した。Mut-GDF-8及びプロ-GDF-8タンパク質はカラムから適切に回収され、そし
て回収された画分には予想される分子量の免疫反応性タンパク質が存在し、転写
に基づくバイオアッセイに使用した。
【０１２８】 GDF-8のプロ-領域（プロ-GDF-8）が成熟GDF-8の作用を妨げることができるか
どうかを試験するために、カラムで精製したプロ-GDF-8を特定の量のヒト組換え
GDF-8と室温で30分間プレインキュベーションした。同時に、GDF-8を含有する別
個のチューブに匹敵する量のBSA、グリシンバッファーまたは全長の切断できな
いGDF-8（Mut-GDF-8）を加え、コントロールとして用いた。GDF-8に比較して30
倍及び10倍の重量/重量過剰を達成するために、プロ-GDF-8の２つの異なる希釈
を選択した。プレインキュベーション後に、pSV-β-galプラスミドと混合したp(
CAGA)12-MLPまたはp3TP-Luxレポータープラスミドのいずれかでトランスフェク
ションしたA204細胞上に混合物を移した。6時間後に細胞を溶解し、ライセート
中のルシフェラーゼ及びβ-ガラクトシダーゼ活性を測定した。各ウェル中のバ
ッファー及びカラム精製したタンパク質の最終濃度は、GDF-8では10ng/ml、プロ
-GDF-8では300ng/ml及び1,000ng/ml、そして切断できない全長GDF-8では1,000ng
/mlであった。
【０１２９】 図16に示すように、GDF-8のカラム精製したプロ-ドメインは、GDF-8によるル
シフェラーゼ活性の誘導を完全に抑制することができた。この誘導は、GDF-8を
細胞への添加の前にBSA、グリシンバッファー（カラム溶出に用いた）または全
長の切断できないGDF-8タンパク質（Mut-GDF-8）のいずれかとプレインキュベー
ションした場合には影響を受けなかった。この作用は投与量に依存し（図16）、
そしてプロ-GDF-8はTGF-β1またはアクチビンによるルシフェラーゼ活性の誘導
に影響を与えなかったので（図15）GDF-8に特異的であった。
【０１３０】 画分A及びBと同様に、プロ-GDF-8の阻害活性に対する変性及び還元の影響を調
べた。図24に示すように、プロ-GDF-8は6M尿素で変性した後にその阻害活性を保
持した。しかしながら、プロ-GDF-8の還元は阻害の完全な喪失をもたらした。
【０１３１】 野生型GDF-8の分泌に対するプロ-ドメインの影響を調べるために、プロ-GDF-8
及びWT-F-GDF-8発現プラスミドで共トランスフェクションしたQM-7細胞からのな
らし培地を分析した。還元条件下で抗-FLAG特異的抗体でのウェスタンブロッテ
ィングにより、プロ-GDF-8でトランスフェクションした細胞からのならし培地に
おいて38kDaに移動する主要な免疫反応性タンパク質が検出された。これは、GDF
-8プロ-ドメインの予測される大きさと一致する。また、FLAG抗体と免疫反応す
る追加のポリペプチドも同定された。このポリペプチドは約25kDaの分子量を有
する。
【０１３２】 38kDa及び25kDaのバンドにより示されるポリペプチドの正体を決定するために
、これらのポリペプチドをアフィニティークロマトグラフィーにより精製し、そ
してクーマシー染色したゲルからの対応するバンドをN末端配列決定に供した。2
5kDaポリペプチドのN末端配列はDDSSD（配列番号：27）であり、この25kDaポリ
ペプチドが特定の部位（Arg99）での別の切断の産物であることを示す。（同じ
切断部位は、野生型及び切断部位突然変異体GDF-8前駆体の両方でも同定された
）。
【０１３３】 80kDaに移動するプロ-ドメインの二量体並びにプロ-ドメインの単量体形態も
また非還元ゲル上に存在した。
【０１３４】 WT-F-GDF-8構築物とプロ-GDF-8構築物との共トランスフェクションは、分泌し
た成熟GDF-8の量の著しい減少をもたらした。
【０１３５】 プロ-GDF-8でトランスフェクションしたQM-7細胞のならし培地には2つのFLAG-
免疫反応性タンパク質が検出されたので、これらのポリペプチドのどちらがGDF-
8に阻害活性を有するかを決定することは重要であった。これは、変性SDS-PAGE
からのこれらのタンパク質の溶出により行われた。次に、個々のポリペプチドを
上記のようにレポーター活性化バイオアッセイにおいてGDF-8インヒビターとし
て作用するそれらの能力に関して試験した。結果は、全長のプロ-ドメインに相
当するより高分子量の方のポリペプチド（38kDaに移動する）のみが阻害活性を
保有し、一方、Arg99での別の切断の産物である25kDaに移動するポリペプチドは
不活性であったことを示す。これは、阻害（またはGDF-8結合）ドメインがArg99
の上流のプロ-ドメインのN末端に位置することを示す。従って、Arg99の上流の
プロ-ドメインの配列に基づいて小さい分子サイズのGDF-8インヒビターを設計す
ることができる（図13参照）。
【０１３６】 結局、前述の研究は、GDF-8プロ-ドメインが転写に基づくアッセイにおいてイ
ンビトロでGDF-8の生物学的活性を特異的に阻害できること及びそれを野生型GDF
-8タンパク質と共発現させると培養した細胞のならし培地における成熟GDF-8の
分泌に影響を与えることを示す。実施例７：GDF-8プロ-ドメインを過剰発現するトランスジェニックマウスの作製 実施例6における上記の結果をインビボで確かめるために、マウスにおけるGDF
-8プロ-ドメインの筋肉特異的発現のためのDNA構築物を作製した。簡潔に言えば
、プロ-ドメイン（図13に示す残基1-266）をコードする部分マウスcDNAをC末端
でFLAGエピトープと融合させ、ラットミオシン軽鎖1プロモーターの下流でpMEX-
NMCS2発現ベクターに挿入した。このベクターは、トランスジェニックマウスの
骨格筋における速繊維特異的発現を促進することが示された（Neville, C. et a
l. (1996) Dev. Genetics 19:157）。
【０１３７】 標準的な前核微量注入によりトランスジェニックマウスを作製した。子孫をFL
AGエピトープに特異的なプライマーでの尾PCRにより導入遺伝子の組込みに関し
てスクリーニングした。14匹の生殖系列に組込まれた創始動物が確定された。GD
F-8特異的プローブでの筋肉組織のノーザンブロッティング分析により、骨格筋
における高レベルの導入遺伝子発現を有する3系統が同定された。導入遺伝子（G
DF-8プロ-ドメイン）の発現は、内因性GDF-8のレベルを3-10倍上回った。実施例８：GDF-8はそのプロ-ドメインとの潜在複合体内で分泌され、酸性化によ り活性化される WT GDF-8でトランスフェクションしたQM-7細胞からの培地の特性化の際に、追
加の38kDa「二重」バンドが検出された。このポリペプチドの正体を決定するた
めに、FLAG標識したタンパク質をアフィニティークロマトグラフィーにより精製
し、クーマシー染色したゲルからのバンドをN末端配列決定に供した。38kDa「二
重」バンドポリペプチドのN末端配列はDDSSD（配列番号：27）であり、これが特
定の部位（Arg99）での別の切断の産物であることを示す。38kDaに移動するこの
「二重」バンドの配列分析は、GDF-8前駆体タンパク質のものと同じであるアミ
ノ末端配列GPVDLNE（配列番号：28）を有するポリペプチドも示した。このバン
ドは、シグナルペプチドを欠いているプロ-ドメインに相当し、それはFLAG標識
したGDF-8前駆体及び成熟フラグメントと共に精製される。抗-FLAG M2特異的抗
体により認識されないこのポリペプチドは、独立して発現されたプロ-ドメイン
と共に移動する。FLAGエピトープはWT-GDF-8タンパク質のC末端に位置するので
、GDF-8プロ-ドメインは、それが成熟GDF-8と実際に会合している場合にのみ抗-
FLAGアフィニティーゲルに結合できるはずである。
【０１３８】 分泌されたGDF-8複合体をさらに特性化するために、WT-GDF-8-Fでトランスフ
ェクションしたQM-7細胞からの細胞培地をMicrocon遠心濾過器（50Kの分子量カ
ットオフを有する）を用いてサイズ分画した。保持物（retentate）はほとんど
全てのGDF-8関連免疫反応性タンパク質を含有し、非還元条件下で60-120kDaに移
動する高分子量複合体の存在をさらに裏付けた。還元すると、15kDaに移動する
成熟GDF-8フラグメント並びにGDF-8のプロセシングされていない形態が検出され
た。成熟GDF-8二量体は素通り画分に存在しなかった。これらのデータは、成熟G
DF-8が高分子量複合体内で細胞培地中に存在することを裏付ける。
【０１３９】 QM-7筋芽細胞により生産されたGDF-8複合体の生物学的活性を評価するために
、転写に基づくレポーター活性化アッセイを用いた（図29参照）。未精製の細胞
培地は、いかなるGDF-8様生物学的活性も示さなかった。それに反して、精製し
たヒト成熟GDF-8は、レポータープラスミドp(CAGA)12-MLP（上記）からのルシフ
ェラーゼ活性を効率よく誘導した。未精製の細胞培地と異なり、アフィニティー
精製したGDF-8複合体は活性を保有した。この限定活性化は、おそらく、グリシ
ンバッファー（pH 3.5）での溶出に起因する化学的酸性化から起こったと思われ
る。アフィニティー精製した複合体のHPLC C4カラムによるさらなる精製（TFAで
の酸性化時）は、約18分で溶出するさらに活性のある画分の同定をもたらした。
この画分（画分#18）は、転写に基づくバイオアッセイにおいて最高の応答を引
き起こし、そして主に還元SDS-PAGEで15kDaに移動する成熟GDF-8からなる。重要
なことには、画分#18は、出発材料（図29、レーン1）または画分#20（図29、レ
ーン4）よりはるかに少ない量のプロセシングされていないGDF-8を含有する。
【０１４０】 従って、QM-7細胞により分泌され、成熟GDF-8と（アフィニティークロマトグ
ラフィーにより）共精製される高分子量のGDF-8関連タンパク質はその生物学的
活性を阻害できる可能性がある。上記の結果は、成熟GDF-8が、プロ-ドメインを
含有する潜在複合体内でQM-7細胞により分泌されることを示唆する。これは、転
写に基づくアッセイ（上記）においてGDF-8の活性を阻害する精製したプロ-ドメ
インの能力と一致する。この基礎をなす機構は、シグナリング受容体との相互作
用を妨げる、成熟GDF-8のそのプロ-ドメインとの会合である可能性がある。実施例９：カルパインによる潜在GDF-8複合体の活性化 M-カルパインは、システインプロテアーゼのカルパインファミリーの遍在的に
発現されるカルシウム依存性メンバーである。これらの実験では、GDF-8複合体
を活性化するm-カルパインの能力を調べた。第一に、インビトロで（すなわち、
試験管で）GDF-8タンパク質を切断するm-カルパインの能力を調べた。簡潔に言
えば、WT-GDF-8-FまたはPro-GDF-8-Fタンパク質を含有するQM-7ならし培地を0、
0.1及び1U/mlのカルパインで37℃で一晩の期間にわたって処理した。これらの結
果は、m-カルパインがGDF-8のプロ-ドメインを特異的に切断し、追加のより低分
子量の種を生じることを示した。注目すべきことに、野生型GDF-8の全長前駆体
もまたm-カルパインの基質である。より高濃度のカルパイン（1U/ml）での処理
は、全長の野生型GDF-8タンパク質の完全な喪失をもたらした。この切断の微量
のタンパク質分解産物のみが検出された。重要なことには、成熟GDF-8はm-カル
パインにより分解されなかった。QM-7細胞の存在下で、m-カルパインは、SDS-PA
GE上のより低分子量のバンドの出現により明らかに示されるように、プロ-ドメ
インも切断した。
【０１４１】 m-カルパインはGDF-8プロ-ドメインを消化することができたので、m-カルパイ
ンは潜在GDF-8複合体を活性化するかもしれないと仮説を立てた。この仮説を確
かめるために、WT-GDF-8-F構築物でトランスフェクションしたQM-7細胞または擬
似トランスフェクションした細胞からの上清を0または1U/mlのm-カルパインで37
℃で２時間処理し、続いて抗-FLAGカラム上でGDF-8複合体をアフィニティー精製
した（上記）。精製したタンパク質を本明細書に記述する転写に基づくバイオア
ッセイにおいて活性に関して試験した。未処理のコントロールに比較して、m-カ
ルパインとGDF-8複合体とのインキュベーション後にルシフェラーゼ活性は2.5倍
高かった（図30A）。m-カルパインは、それが成熟因子を消化することができな
いことと一致して、成熟ヒト組換えGDF-8（hrGDF-8）の活性を阻害しなかった（
図30B）。しかしながら、m-カルパインとプロ-ドメインとのプレインキュベーシ
ョンは、成熟GDF-8を阻害するプロ-ドメインの能力を劇的に減少した（図30B）
。これらの結果は、m-カルパインがプロ-ドメインを切断することにより潜在複
合体から活性のあるGDF-8を遊離できることを示す。
【０１４２】 上記のデータは、GDF-8の活性化及びGDF-8/プロ-ドメイン複合体からの成熟GD
F-8タンパク質の遊離がGDF機能を阻害する標的となることを示す。例えば、プロ
-ドメインの安定性を増すことができ、それにより細胞のプロテアーゼによるそ
の潜在的切断を防ぐことができる。これは、同様に、GDF-8/プロ-ドメイン複合
体の安定化を導き、従って、活性のあるGDF-8の遊離を防ぐ。実施例10：GDF-8切断部位突然変異体（ドミナントネガティブ突然変異体）の製
造及び特性化 GDF-8切断部位突然変異体（ドミナントネガティブ突然変異体）を以下のよう
に作製し、GDF-8阻害に関して試験した： 簡潔に言えば、プロ-ドメインと成熟タンパク質間の境界の予測される切断部
位を置換することにより、切断できない全長GDF-8突然変異体（Mut-GDF-8）を発
現する構築物を作製した。シグナルペプチドの除去後に、予測されるタンパク質
は、プロ-ドメイン及びそれに続くGDF-8のC末端の成熟領域を含んでなる（図12B
）。野生型GDF-8と異なり、切断できない突然変異体は切断して成熟GDF-8タンパ
ク質を生じることができず、従って、生物学的に活性でない。C末端でFLAGエピ
トープを標識した全長前駆体タンパク質を作製するために野生型（WT）マウスGD
F-8 cDNAも同じベクターにサブクローン化した。得られた構築物をWT-F-GDF-8と
称する（図12A）。CMVに基づく発現ベクターにサブクローン化した改変していな
い（標識していない）GDF-8 cDNAはWT-GDF-8と称する。
【０１４３】 両方の発現構築物を一過性トランスフェクションによりQM-7ウズラ筋芽細胞に
導入し、GDF-8タンパク質を抗-FLAGアフィニティーゲルでならし培地から免疫沈
降させた。免疫沈降物をSDS-PAGE、続いて方法において記述したような抗-FLAG
特異的抗体での検出によりさらに分析した。野生型（WT-F-GDF-8）は、QM-7細胞
において発現され、そして正しくプロセシングされた。還元条件下で、全長前駆
体（45-50kDa）及び成熟GDF-8（15kDa）に相当する２本の免疫反応性バンドが検
出された。これらのタンパク質の大きさは、GDF-8について以前に報告されたも
のと一致する。残りの部分（プロ-ドメイン）は、FLAGエピトープを欠いている
ので検出できない。コントロールの空のベクターでトランスフェクションした細
胞からのならし培地ではいかなる免疫反応性タンパク質も検出されなかった。切
断できない突然変異体MutGDF-8のトランスフェクションは、予想されるように、
前駆体分子に相当する主要な免疫反応性の種並びに38kDaに移動するいくらかの
量のGDF-8関連タンパク質の生成をもたらした。
【０１４４】 野生型GDF-8のドミナントネガティブインヒビターとして作用する切断部位突
然変異体の能力を試験するために、QM-7細胞を異なる比率のMut-GDF-8-F及びWT-
GDF-8-F構築物で共トランスフェクションした。これらの結果は、切断部位突然
変異体が投与量に依存して成熟GDF-8の分泌を阻害することを示した。切断部位
突然変異体が標識していない野生型GDF-8の分泌も阻害することを確かめるため
に、Mut-GDF-8-F及びWT-GDF-8構築物をQM-7細胞に共導入し、発現タンパク質を
検出するためにGDF-8に対する抗体を用いた。これらの結果は、FLAG標識したGDF
-8でのものと同様であった。
【０１４５】 阻害の特異性は、成熟領域内でGDF-8と41%の相同性を共有するTGF-βファミリ
ーのメンバーである組換えBMP-2を用いて調べた。BMP-2及びMut-GDF-8-Fの両方
の発現構築物をQM-7細胞中に共導入し、分泌タンパク質を抗-BMP-2抗体で検出し
た。このデータは、突然変異体GDF-8が成熟BMP-2の分泌及びプロセシングに影響
を与えないことを示した。従って、Mut-GDF-8の阻害作用は、TGF-βタンパク質
ファミリーの他のメンバーに関して選択的である。
【０１４６】 ドミナントネガティブ突然変異体の安定性の問題を検討するため及び阻害の機
構を明らかにしょうと試みて、トランスフェクションしたQM-7細胞を200μCi/ml
の[35S]システインの存在下で２時間増殖させ、そして示した期間で追跡した。
ならし培地を集め、細胞ライセートをさらなる分析のために調製した。全てのFL
AG標識したタンパク質を抗-FALG M2アフィニティーゲルで免疫沈降させ、SDS-PA
GE上で分画した。この実験からのデータは、WT-F-GDF-8の前駆体形態及び全長Mu
t-GDF-8タンパク質が最初に細胞内部に蓄積することを示す。WT-F-GDF-8でトラ
ンスフェクションした細胞の上清中には、3形態のGDF-8：前駆体、成熟GDF-8及
びプロドメインが検出された。GDF-8のプロセシングされた形態のいかなる細胞
内蓄積も検出されず、C末端の成熟GDF-8及びプロ-ドメインは両方とも切断後す
ぐに分泌され、そして合成後３時間程度と早期に上清中に検出された。GDF-8の
プロセシングされた形態は、少なくとも24時間ならし培地中で安定であった。37
℃で24時間のならし培地のインキュベーション後にGDF-8のプロセシングされた
形態のいかなる追加の蓄積も認められなかった。これは、細胞の存在がプロセシ
ングに必須と思われることを示す。しかしながら、特定のプロテアーゼが利用で
きるといくらかの切断が細胞の外側で起こることができる可能性がある。WT-F-G
DF-8のプロセシングされていない形態及び全長Mut-GDF-8もまた効率よく分泌さ
れたが、いくらかの細胞内蓄積も同様に認められた。
【０１４７】 Mut-GDF-8と一緒にWT-F-GDF-8を共トランスフェクションすると、細胞の内部
に蓄積する成熟C末端フラグメントのプールが認められた。同じ現象が、WT-F-GD
F-8を構成的に発現するQM-7安定細胞系にMut-GDF-8を導入した場合に認められた
。陽性クローンのうち２個をMut-GDF-8構築物で一過性トランスフェクションし
、上記のように標識し、そして24時間後に細胞ライセートを分析した。データが
示すように、突然変異体GDF-8で共トランスフェクションした細胞においてのみ
、成熟C末端フラグメントの検出可能な細胞に付随するプールがあった。これら
のデータは、切断できない突然変異体によるGDF-8の分泌のドミナントネガティ
ブ阻害の仮定された機構、すなわち、この増殖因子の正常な分泌を妨げる野性型
と突然変異体タンパク質間のヘテロ二量体（または他の複合体）の形成を裏付け
る。
【０１４８】 プロ-GDF-8は、それがそのようなものとして生産される場合にのみ成熟GDF-8
と相互作用してその活性を阻害し、GDF-8プロ-ドメイン配列を含有する切断でき
ないGDF-8（Mut-GDF-8）での場合のように、より大きいタンパク質中に埋め込ま
れる場合にはそうしない。上記の研究は、プロ-GDF-8の標的は分泌したプロセシ
ングされた成熟GDF-8であるので、プロ-GDF-8は、タンパク質形態で被験体に投
与されるかまたは適当なベクターから発現される（すなわち、遺伝子治療タイプ
の方法）いずれかの場合に、内因性成熟GDF-8のアンタゴニストとして作用でき
ることを示す。それに反して、Mut-GDF-8の作用形態は細胞内の、GDF-8合成中で
あり、切断できないヘテロ二量体の細胞内形成をもたらす。結果として、Mut-GD
F-8は細胞内で発現される場合にGDF-8機能を阻害することができる。実施例11：GDF-8システイン突然変異体の製造及び試験 GDF-8システイン突然変異体は、他のGDF-8突然変異体について記述したように
PCRに基づく方法を用いてGDF-8 ｃDNA中に点突然変異を導入することにより製造
した。突然変異したGDF-8配列をFLAG-CMV-5a発現ベクターにFLAGエピトープとの
インフレーム融合を生じるように導入した。得られた構築物（C-Mut-GDF-8）は
、単独でQM7細胞中に導入するかまたは成熟GDF-8の生産及び蓄積に対する突然変
異体の影響を試験するためにWT-F-GDF-8と共トランスフェクションした。
【０１４９】 C-Mut-GDF-8でトランスフェクションした細胞のならし培地ではウェスタンブ
ロッティングにより免疫反応性タンパク質を検出できなかったので、トランスフ
ェクション後にこれらの細胞の代謝標識を実施した。これらの実験により示され
たように、C-Mut-GDF-8タンパク質はQM-7細胞において生産され、正しくプロセ
シングされたが、それは野生型GDF-8よりかなり少ない量で分泌された。全長前
駆体形態の大部分は細胞内部に蓄積し、一方、成熟及びプロセシングされていな
い形態の両方がならし培地に分泌された。従って、GDF-8の成熟領域中のシステ
インの1個の突然変異は、それでもなおプロセシングし、分泌することができる
。しかしながら、共トランスフェクション実験は、システイン突然変異体が、WT
-GDF-8と一緒にQM-7細胞中に導入した場合に野生型成熟因子の分泌を阻害する能
力を有することを示した。実施例12：GDF-8変異体のN-連結グリコシル化の役割の分析 グリコシル化は、タンパク質の翻訳後修飾の主要な形態の一つである。糖タン
パク質の炭水化物構造は、タンパク質のプロセシング、分泌及び生物学的活性に
おいて重要な役割を果たす。GDF-8前駆体は、そのプロ-ドメイン内のAsn72でN-
連結グリコシル化の1個の予測される部位を含有する。このグリコシル化部位が
用いられるかどうかを決定するために、精製した組換えGDF-8タンパク質を最初
にN-グリコシダーゼFで処理した。この酵素は、タンパク質主鎖から全ての一般
的な種類のN-グリカンを遊離することができる。WT-F-GDF-8、Mut-GDF-8及びPro
-GDF-8タンパク質をFLAGアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製した。
タンパク質サンプルを変性させ、試験管中でN-グリコシダーゼFとインキュベー
ションし、そして還元条件でSDS-PAGEに供した。この実験の結果により示された
ように、炭水化物構造のインビトロでの酵素的除去は、野生型及び突然変異体GD
F-8の前駆体形態のより低い見かけの分子量への移動をもたらす。同じ移動が、
独立して発現させたGDF-8のプロドメインで認められた。注目すべきことに、GDF
-8の成熟形態の移動度は、この領域内に推定されるグリコシル化部位がないこと
と一致して、いかなる変化もなかった。
【０１５０】 GDF-8のプロセシング及び分泌におけるグリコシル化の役割を調べるために、
グリコシル化インヒビターのツニカマイシンを用いた。このヌクレオシド抗生物
質は、新生ポリペプチド鎖へのオリゴ糖付加のために必要なドリコール中間体の
形成を妨げる。野生型GDF-8またはGDF-8変異体（切断部位突然変異体及びプロ-
ドメイン）を発現する構築物でQM-7ウズラ筋芽細胞を一過性トランスフェクショ
ンした。３つ全てのタンパク質をC-末端FLAGエピトープに融合させた。トランス
フェクションの16時間後に細胞を2μg/mlのツニカマイシンで処理した。24時間
後にならし培地及び細胞ライセートをウェスタンブロッティングまたは免疫沈降
、続いて抗-FLAG抗体でのタンパク質の検出により分析した。この実験からの結
果は、ツニカマイシンがGDF-8の３つ全ての形態の分泌出口を妨げるようである
ことを示す。グリコシル化された種より速く移動するGDF-8及びそのプロ-ドメイ
ンの細胞に付随するグリコシル化されていない前駆体形態の増加が認められた。
このデータは、GDF-8が糖タンパク質であり、そしてそのグリコシル化が正常な
プロセシング及び分泌のために必須であることを示唆する。N-グリコシダーゼF
での画分B（プロ-ドメインを含有する）の処理は、プロ-ドメインの阻害活性を
除き（図36）、従って、N-連結グリコシル化がプロ-ドメインの阻害活性にとっ
て重要であるさらなる証拠を与える。実施例13：ニワトリの成長及び筋肉発生に対する画分BからのヒトGDF-8プロ-ド
メイン及びマウスGDF-8プロ-ドメインの作用 遺伝子ターゲッティングにより作製したGDF-8「ノックアウト」マウスは正常
に発生するが、通常の２倍の骨格筋質量を有するので、発生中にGDF-8プロ-ドメ
インを導入することにより処置した動物の骨格筋質量の増加をもたらすことがで
きると仮説を立てた。この仮説及び骨格筋発生を増大するGDF-8プロ-ドメインの
インオボ投与の効能を試験するために、精製したGDF-8プロ-ドメイン（上記の画
分Bからのヒトまたは実施例６からのマウス）をCobb及びRossニワトリからの受
精卵に注入した。例えばH. Kocamis et al. (1998) Poult. Sci. 77, 1913-1919
に記述されている技術を用いて本明細書に記述するように0、1、2、3、11、12、
13、14、15、18及び20日目に受精卵に注入した。42日の生育期間の終わりに生体
、胴体、胸部及び脚重量を得た。表IIは、コントロールの鳥（注入していない）
に対する処置したオス及びメス鳥（Cobb卵、注入日13日及び20日）の生体、胸部
及び脚重量の増加パーセンテージを示す。
【０１５１】
【表２】
【０１５２】 表IIIは、コントロールの鳥（バッファーのみ）に対する処置したオス及びメ
ス鳥（Ross卵、注入日15日）の生体、胴体、胸部及び脚重量の増加パーセンテー
ジを示す。
【０１５３】
【表３】
【０１５４】 これらの結果は、GDF-8プロ-ドメインのインオボ投与が処置した鳥の骨格筋質
量の増加をもたらすことを示す。実施例14：GDF-8インヒビターとして用いることができるGDF-8受容体の同定 COS-7細胞において発現させた受容体への[125-I]-GDF-8の結合 GDF-8に結合することができる既知の（クローン化された）II型受容体を同定
するために、３つの異なるセリン-トレオニン受容体をコードする発現構築物ま
たは空のベクター（コントロール）をFuGENE 6（Boehringer Mannheim）を用い
てCOS-7細胞（50%融合した）中に一過性トランスフェクションにより導入した。
用いたII型受容体は、TGF-β II型受容体、アクチビンIIB型受容体（B2スプライ
ス変異体アイソフォーム）及びBMP II型受容体であった。48時間後に、[125-I]
で標識したGDF-8をリガンドとして、続いて2タイプの分析を用いて結合アッセイ
を実施した。第一に、細胞溶解及びシンチレーション計数を用いる様々な構築物
によりトランスフェクションした細胞の表面へのGDF-8結合の定量測定を含む分
析を実施した。第二のタイプの分析は確認であり、COS-1細胞の表面へのGDF-8結
合の視覚化を含み、例えばLin et al. (1992) Cell 68, 775-85に記述されてい
るように実施した。レポーター構築物からのGDF-8により誘導される転写に基づく機能アッセイ 転写に基づくバイオアッセイを２つの異なる細胞系、A204ヒト横紋筋肉腫細胞
系及びミンク肺上皮細胞系CCL-64で実施した。２つの人工レポータープラスミド
：p3TP-Lux及びp(CAGA)12-MLP（上記）をこのアッセイに用いた。両方において
、ルシフェラーゼ遺伝子転写（従って活性）は、TGF-βファミリーのメンバーに
応答する人工最小プロモーターにより導かれる。従って、細胞ライセートのルシ
フェラーゼ活性は、加えた増殖因子による細胞の刺激の程度と一次的相関関係に
ある。
【０１５５】 両方の細胞タイプを、10%ウシ胎仔血清、抗生物質及びL-グルタミンを補足し
たそれらのそれぞれの培地（CCL-64はDMEM、A204はマッコイ培地）中48穴プレー
トで平板培養した。80%の融合に達すると、プラスミドの取り込みを促進するた
めにFuGENE-6（Boehringer-Manheim）を用いて製造業者の説明書に従って細胞を
トランスフェクションした。細胞を以下のプラスミド；受容体発現プラスミドpC
MV-ΔNβRII K-R（突然変異したドミナントネガティブII型TGF-β受容体をコー
ドする）、pCMV-ΔNActRIIB2 K-R（突然変異したドミナントネガティブII型アク
チビン受容体をコードする）及びレポータープラスミドpSV-β-gal（トランスフ
ェクション効率をモニターするために用いる）及び２つのルシフェラーゼレポー
タープラスミドのいずれかのカクテルで一過性トランスフェクションした。トラ
ンスフェクション試薬と一晩インキュベーションした後、0.1% BSAを含有する適
当な無血清培地で細胞を2回洗浄した。次に、ヒト組換えGDF-8を細胞に加えた。
6時間のインキュベーション後に細胞を溶解し、ルシフェラーゼ及びβ-ガラクト
シダーゼ活性をDual-Lightルシフェラーゼアッセイキット（Tropix Inc.）を用
いて同じサンプルにおいて決定した。活性は、相対ルシフェラーゼ単位（RLU）
、すなわち、同じサンプルにおいて測定されたβ-ガラクトシダーゼ活性の対応
する値により与えられるトランスフェクション効率を補正したルシフェラーゼ活
性の単位で表される。GDF-8のI型受容体としてのTGF-β受容体Alk-5の機能同定 ミンク肺上皮細胞系CCL-64はTGF-βに非常に応答する。化学突然変異誘発によ
りCCL-64から得られた細胞系R1Bは、TGF-βに応答しない。この非応答性は機能
性TβRI受容体の欠如のためであることが確立されている。明白な証拠として、
この受容体をコードするプラスミドでのトランスフェクションによりこの細胞系
にTβRIを再導入すると、TGF-β応答を完全に回復させることができる（Wrana e
t al., Cell, (1992), 71, 1003-14）。
【０１５６】 TGF-βと同様に、GDF-8もまた野生型細胞系CCL-64では強い応答を引き出すが
（図31）、R1B突然変異体では不活性である（図31）。しかしながら、GDF-8の応
答性は、TβRIをコードするプラスミドでR1B細胞をトランスフェクションすると
完全に回復し、従って、完全な機能レスキューをもたらすことができる（図33）
。前述のデータは、TβRIが機能性GDF-8 I型受容体であることを示す。GDF-8のII型受容体としてのActRIIB2の同定 別のCCL-64から得られた突然変異体細胞系、DR26は、TGF-β II型受容体を欠
き、それ故、TGF-βに応答しない。R1B細胞系と異なり、DR26細胞はGDF-8に対す
るそれらの応答性を完全に保持し、TGF-β II型受容体がGDF-8活性に必須ではな
く、そして何か別のII型受容体サブユニットがGDF-8応答をもたらすはずである
ことを示す（図34）。
【０１５７】 すでに既知の（クローン化された）II型セリン-トレオニンキナーゼ受容体サ
ブユニットのいずれがGDF-8受容体として働くことができるかを明らかにするた
めに、II型受容体をコードする様々な発現構築物をCOS-7細胞にトランスフェク
ションした。続いて、細胞を[125-I]-GDF-8結合に関して試験した。前の段落に
おいて記述した機能分析と一致して、TGF-βまたはBMP II型受容体への特異的GD
F-8結合は検出されなかった。それに反して、アクチビンII型受容体ActRIIB2がG
DF-8結合受容体として同定された。これは、ActRIIBでトランスフェクションし
たCOS-7細胞の表面への[125-I]-GDF-8の増加した結合により確かめられ、一方、
コントロールベクターでトランスフェクションした細胞はいかなる特異的結合も
示さなかった。
【０１５８】 結合データの機能的意義は、ActRIIB2のドミナントネガティブ（ΔN）形態を
用いることによりさらに示された。ドミナントネガティブ受容体アイソフォーム
は、受容体の細胞内ドメイン領域中の各受容体構築物の特定のアミノ酸残基の点
突然変異（K→R突然変異）により得られた。これらの突然変異は、II型サブユニ
ットが細胞膜中に正しく発現される能力、リガンドに結合する能力またはそれぞ
れのI型サブユニットとヘテロマーを形成する能力を妨げない。しかしながら、
これらの突然変異は、受容体のキナーゼ活性を除き、従って、リガンド結合後に
機能性シグナルを中継するそれらの能力を妨げる（Wrana et al. (1992) Cell 7
1, 1003-14）。
【０１５９】 これらのドミナントネガティブ受容体アイソフォームをCCL-64ミンク肺上皮細
胞またはGDF-8に非常に応答するA204ヒト横紋筋肉腫細胞に導入した。R1B細胞に
おいて得られた結合実験データ及び機能データから予想されるように、TGF-β I
I型受容体のΔN形態はGDF-8応答に影響を与えず、従って、それはこの点で必須
でないことを裏付ける。それに反して、両方の細胞バックグラウンドにおけるAc
tRIIB2のΔN形態の導入は、おそらく内因性ActRIIB2受容体を競合してなくすこ
とにより（すなわち、ドミナントネガティブのように作用することにより）、レ
ポーター構築物でトランスフェクションしたDR26細胞（図35）及びA204細胞にお
いてGDF-8応答の阻害をもたらした。
【０１６０】 結合及び機能データの組み合わせは、ActRIIB2が機能性GDF-8受容体として働
くことができることを示す。全部で、上記の研究は、TβRI及びActRIIB2のヘテ
ロマー複合体がGDF-8応答をもたらす機能性受容体の組み合わせであることを示
す。重要なことに、I型-II型受容体単位のこの特定の組み合わせは、TGF-β増殖
因子ファミリーのいかなる他のメンバーの応答の機能性トランスデューサーとし
ても記述されていない。TβRI-ActRIIB2ヘテロマーは、GDF-8及びGDF-8に非常に
相同な分子によってのみ活性化することができると思われる。GDF-11の活性（成
熟）領域は、GDF-8のものに90%以上の相同性を有し、これら２つの近縁の因子が
同様の結合及びシグナリング特性を共有することを示唆する。従って、本明細書
に記述する試薬並びにそれらの応用は、GDF-8及びGDF-11の両方の生物学的研究
及び診断に用いることができる。GDF-8受容体の使用方法 GDF-8受容体の同定により、「受容体プローブ」の構築が可能である。そのよ
うな「受容体プローブ」の有用性は、GDF-8、GDF-8様分子（例えばGDF-11）及び
おそらく他の構造的に関連したもしくは関連のない分子もしくはペプチドが化学
的に合成されようとまたは天然に存在しようと、これらを認識し、結合するそれ
らの能力に直接関係する。これらは、GDF-8「受容体プローブ」とそれらとの相
互作用に基づき、可能性があるGDF-8インヒビターである。
【０１６１】 結局、「受容体プローブ」は、多数の方法で：（１）GDF-8に直接結合し、中
和することによりインビボでGDF-8タンパク質トラップとして可溶性受容体の形
態で、（２）ヒトにおける筋肉消耗を診断する用途のために、生物学的及び他の
流体におけるGDF-8検出及び定量のための改変したELISA系として、または（３）
受容体レベルでGDF-8インヒビター/アンタゴニストを同定するためのスクリーニ
ング試薬として利用することができる。
【０１６２】 GDF-8「受容体プローブ」の作製は、GDF-8受容体融合タンパク質の作製を含む
ことができる（例えば、George et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96
: 12719-12724に記述されている技術を用いて）。簡潔に言えば、受容体融合タ
ンパク質は、２つの融合タンパク質：例えば免疫グロブリンG1(IgG1)Fcフラグメ
ントに融合したGDF-8 I型受容体細胞外ドメイン及び例えば免疫グロブリンG1(Ig
G1)Fcフラグメントに融合したGDF-8 II型受容体細胞外ドメインのヘテロマー複
合体である（またはタンパク質ドメインXに融合したGDF-8 I型受容体の細胞外ド
メイン及びタンパク質ドメインYに融合したGDF-8 II型受容体細胞外ドメインを
含有するあらゆる他の融合タンパク質、それによりタンパク質ドメインX及びタ
ンパク質ドメインYは相互作用して２つの融合タンパク質のヘテロマー複合体を
形成することができる）。融合受容体の構築は、Fcフラグメントを用いることに
限定されず；二量体またはヘテロ二量体を形成する特性を有する哺乳類及び細菌
の両方のタンパク質またはタンパク質の一部をこの方法に利用することができる
（例えば塩基性へリックス-ループ-へリックスドメイン）。そのような融合受容
体タンパク質を製造する方法は、例えば、Davis et al. (1994) Science 266:81
6-819または米国特許第5,844,099号に記述されており、これらの内容は引用する
ことにより本明細書に組み込まれる。
【０１６３】 以下の工程は、ヘテロ二量体複合体または「受容体プローブ」を開発するため
に必要である。受容体/Fcハイブリッドの作製 受容体/Fc融合タンパク質をコードするDNAは、複数回のPCRにより作製した。
他のTGF-βファミリーメンバーの受容体で行われた同様の実験に基づき、受容体
のアミノ末端の160アミノ酸をコードするDNAをcDNAクローンから増幅する。3' P
CRプライマーは、融合遺伝子に含まれることになるヒトIgG1配列の5'配列と重複
する。同様に、ヒトIgG1遺伝子のFc領域（Pro 100-Lys 330）をコードするDNAを
、受容体配列と重複する5'プライマーを用いてヒトゲノムDNAから増幅する。次
に、受容体及びIgG1 PCR産物を合わせ、そして受容体リガンド結合ドメイン及び
IgG1 Fc領域をコードする配列の融合物に相当する増幅産物を作製するために重
複する鋳型として用いる。最終PCR産物をTAクローニングベクター（Invitrogen,
San Diego, CA）に連結し、次に、pCMV5（Sigma）にサブクローン化して、トラ
ンスフェクションした真核細胞において融合タンパク質を発現することができる
構築物を作製する。構築物をCHO細胞及びNSOマウス骨髄腫細胞において試験する
。
【０１６４】 トランスフェクションした細胞のならし培地から受容体/Fcハイブリッドタン
パク質をプロテインAセファロースカラム（Pharmacia, Piscataway, NJ）を用い
て精製する。融合タンパク質はホモ二量体の形態で精製される。鎖内ジスルフィ
ドに影響を与えずに鎖間ジスルフィド結合の破壊を与える条件下でホモ二量体を
還元することによりヘテロ二量体を作製する。２つの異なるタイプの単量体を等
モル量で混合し、酸化してホモ及びヘテロ二量体の混合物を生成せしめる。次に
ホモ二量体をヘテロ二量体からHPLCにより分離することができる。あるいはまた
、融合タンパク質の一方を、ニッケル-キレートクロマトグラフィーにより組換
えタンパク質を精製することができる一続きのカルボキシ末端ヒスチジン残基で
標識することができる。次に、3タイプのダイマータンパク質を、増加する量の
イミダゾールを用いる結合したタンパク質の溶出により分離する。ヒスチジン標
識を欠いているホモ二量体は最も低い濃度のイミダゾールで溶出され；1個の標
識タンパク質のみを有するヘテロ二量体は中間の濃度で溶出され；そして両方の
サブユニットがヒスチジン標識を有するホモ二量体は最も高い濃度のイミダゾー
ルでのみ溶出される。
【０１６５】 受容体/Fcヘテロ二量体調製物を混入タンパク質の存在に関してポリアクリル
アミドゲル電気泳動及び銀染色により分析する。必要に応じて、追加の精製工程
を実施する。精製したヘテロ二量体はまた、以下に記述するように、それらがGD
F-8に結合できることを保証するために試験し、そして本明細書に記述するバイ
オアッセイの一つにおいてアンタゴニストとして試験する。GDF-8タンパク質の定量のための「リガンドトラップ」アッセイの開発 GDF-8定量系は、競合及び捕捉技術を含み且つ捕捉抗体の代わりに捕捉試薬と
して受容体/Fcハイブリッドタンパク質のヘテロ二量体を用いる改変したサンド
イッチELISAである。以下の工程は、GDF-8「リガンドトラップ」アッセイで用い
ることができる一般的なプロトコルを含んでなる。ELISAプレートを受容体/Fcタ
ンパク質へテロ二量体で被覆し、そして結合していない受容体/Fcタンパク質を
洗浄して除く。タンパク質を固定し、プレートを再び洗浄する。タンパク質サン
プルをGDF-8基準と異なる希釈で合わせ、抗-GDF-8抗体を加え、プレートを37℃
でインキュベーションする。タンパク質/抗体混合物を被覆プレートに加え、結
合していないリガンドをストリンジェントな条件下で洗浄して除き、西洋わさび
ペルオキシダーゼ（HRP）に結合した二次抗体を加え、結合していない二次抗体
を洗浄して除く。続いて、OPD基質を加え、マクロプレート読み取り装置を用い
て光学密度を測定する。最後に、吸光度値法を用いてサンプル中のGDF-8のレベ
ルを決定する。同等物 当業者は、本明細書に記述する本発明の特定の態様の多数の同等物を認識する
かまたは慣例の実験のみを用いて確かめることができる。そのような同等物は、
以下の請求項により包含されるものとする。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 230nmで測定した画分A及びBのイオン交換クロマトグラム（HQカラム）を示す
。
【図２】 215nmで測定した画分Aのイオン交換クロマトグラム（SPカラム）を示す。挿入
物は、溶出に使用した勾配を示し、ここで、バッファーAは20mMリン酸Na pH 5.0
であり、そしてバッファーBは20mMリン酸Na pH 5.0/2M NaClであった。
【図３】 215nmで測定した画分Bのイオン交換クロマトグラム（SPカラム）を示す。挿入
物は、溶出に使用した勾配を示し、ここで、バッファーAは20mMリン酸Na pH 5.0
であり、そしてバッファーBは20mMリン酸Na pH 5.0/2M NaClであった。
【図４】 21-23分の間に溶出する画分Aの逆相クロマトグラフィー（C4カラム）のクロマ
トグラムを示す。溶出に使用した勾配も示し、ここで、バッファーAは0.1% TFA
であり、そしてバッファーBは80%アセトニトリル中0.085%のTFAであった。
【図５】 27-29分で溶出する画分Bの逆相クロマトグラフィー（C4カラム）のクロマトグ
ラムを示す。溶出に使用した勾配も示し、ここで、バッファーAは0.1% TFAであ
り、そしてバッファーBは80%アセトニトリル中0.085%のTFAであった。
【図６Ａ及びＢ】 画分Aが、細胞増殖に対するGDF-8の作用を阻害することを示すグラフである。
図6Aは、BrdUの取り込みにより測定した場合のG8筋芽細胞におけるDNA合成に対
する画分Aの作用を示す。図6Bは、[3H]-TdRの取り込みにより測定した場合のCCL
-64ミンク肺上皮細胞におけるDNA合成に対する画分Aの作用を示す。
【図７Ａ及びＢ】 転写に基づくアッセイによりモニターした画分AのGDF-8阻害活性を示すグラフ
である。ルシフェラーゼ発現は、レポータープラスミドp(CAGA)12-MLPから誘導
される（図7A及び7B）。
【図８】 GDF-8に対する画分Aの阻害作用の特異性を示すグラフである。
【図９】 転写に基づくアッセイによりモニターした画分BのGDF-8阻害活性を示すグラフ
である。
【図１０】 GDF-8に対する画分Bの阻害作用の特異性を示すグラフである。
【図１１】 マウス、ラット、ヒト、ヒヒ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ニワトリ、シチメンチョ
ウ及びミノカサゴGDF-8のアミノ酸配列の整列を示す。
【図１２】 様々なGDF-8構築物の概念図である。図12Aは野生型の全長GDF-8の構築物を示
す。GDF-8は細胞中でプロセシングされて成熟GDF-8及び残りのプロ-ペプチドを
生じる。図12Bは、置換された切断部位を有する切断できない突然変異体を示す
。この突然変異体は前駆体分子として分泌される。図12Cは、独立して発現され
る、GDF-8のプロ-ドメインを示す。
【図１３】 マウスGDF-8のヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す。GDF-8変異体を作製する
ために導入した突然変異を示す。切断部位を四角で囲む。シグナル配列の除去後
のプロ-ドメインの始まり及び終わりを三角で示す。N-連結グリコシル化の予測
される部位に下線を引く。
【図１４】 GDF-8のプロ-領域が成熟GDF-8の活性を阻害できることを示すグラフである。
【図１５】 GDF-8に対するGDF-8のプロ-ドメインの阻害作用の特異性を示すグラフである
。
【図１６】 プロ-ドメインによるGDF-8活性の投与量に依存する阻害を示すグラフである。
【図１７】 ヒトGDF-11（上の列）及びヒトGDF-8（下の列）の予測アミノ酸配列の整列を
示す。垂直線は同一性を示す。点は、整列を最大にするために導入したギャップ
を示す。番号はN末端に対するアミノ酸の位置を示す。推定されるタンパク質分
解プロセシング部位を開いた枠により示す。C末端領域上の保存されるシステイ
ン残基を影付きの枠により示す。
【図１８】 マウスGDF-8 mRNA配列中のリボザイム標的部位を示す。逆さの矢印は、マウス
GDF-8 mRNA配列において選択した４個のリボザイム切断部位を示す。下線を引い
たヌクレオチドは、各リボザイムの触媒ドメインに隣接する配列に相補的な領域
を示す。GDF-8タンパク質の翻訳開始及び終止コドンを枠で囲む。
【図１９】 4個のマウスGDF-8リボザイムのヌクレオチド配列を示す。各リボザイムの配列
は、それが相補的であるマウスGDF-8 mRNA配列の下に示す。逆さの矢印は、GDF-
8配列中のリボザイム切断の標的部位を示す。
【図２０】 図19に示した4個の縦列に配置したリボザイム及び逆向き反復を含有するDNAカ
セットのヌクレオチド配列を示す。4個のリボザイム（配列番号：1-4）の配列を
強調し、そして逆向き反復は該配列の下の矢印により示す。
【図２１】 選択したリボザイム発現構築物を示す。逆向き反復を有するリボザイムカセッ
トを３つの異なるプラスミドに連結した。pGDF8R-1は、リボザイムカセットの上
流に連結したマウスGDF-8翻訳開始部位の上流2.8kb、マウスGDF-8遺伝子からの
エキソン1、イントロン1及びエキソン2の一部を含有する。SV40ラージT抗原遺伝
子からのポリアデニル化シグナルをリボザイムカセットのもう一方の側に連結し
た。pMLCR-1は、リボザイムカセットの上流に連結したラットミオシン軽鎖1遺伝
子の転写開始部位の上流〜1500bp及びリボザイムカセットの下流に連結したラッ
トミオシン軽鎖遺伝子3'エンハンサーを含む〜900bpフラグメントを含有する。p
CMVR-1は、リボザイムカセットの上流に連結した約500bpのヒトサイトメガロウ
イルス主要前初期遺伝子プロモーターを含有する。Rib1、Rib2、Rib3及びRib4は
、4個の異なるリボザイムをコードするDNAの領域を示し；逆さの矢印を含むブロ
ックは逆向き反復に相当する。
【図２２】 示した領域のヒトGDF-8 cDNA配列に相補的な20のオリゴヌクレオチド（配列番
号：5-24）の配列を示す。オリゴヌクレオチド配列の下の丸で囲んだ番号は、そ
れぞれのオリゴヌクレオチドの5'末端を示す。
【図２３】 画分Bをさらに特性化するために実施した電子スプレー/イオン化質量分析法の
分析からの結果を示すグラフである。質量分析スペクトルは、29472.0Daの分子
質量の主要成分を含む600Da離れた3本のピークを示した。
【図２４】 成熟GDF-8の活性を阻害する能力に対するGDF-8のプロ-ドメインの化学的改変
の影響を示すグラフである。
【図２５】 A204細胞におけるレポータープラスミドのGDF-8誘導に対する画分Bから精製し
たGDF-8プロ-ドメインの作用を示すグラフである。図25は、レポータープラスミ
ドp(CAGA)12-MLPを用いて得られた結果を示す。
【図２６】 クレアチンキナーゼに基づくアッセイにより決定した場合のC2C12及びヒヨコ
始原筋芽細胞の筋形成分化に対するGDF-8及びTGF-β1の作用を示すグラフである
。
【図２７】 3T3-L1脂肪細胞におけるグルコースの取り込みに対するGDF-8の作用を示すグ
ラフである。このデータは、インシュリンに応答した3T3-L1細胞におけるグルコ
ースの取り込みをGDF-8が阻害すること示す。
【図２８】 画分Bのインビトロ脱グリコシル化がその阻害活性の喪失をもたらすことを示
すグラフである。
【図２９】 QM-7筋芽細胞により生産されるGDF-8複合体の生物学的活性を評価するために
実施した転写に基づくレポーター活性化アッセイからの結果を示すグラフである
。
【図３０Ａ−Ｂ】 m-カルパイン処理したQM-7細胞（WT-GDF-8-F構築物またはコントロールのいず
れかでトランスフェクションした）からの上清の生物学的活性を評価するために
実施した転写に基づくレポーター活性化アッセイからの結果を示すグラフである
。
【図３１】 CCL-64細胞におけるルシフェラーゼレポータープラスミドの誘導に対するTGF-
β及びGDF-8の作用を示すグラフである。
【図３２】 R1B細胞におけるルシフェラーゼレポータープラスミドの誘導に対するTGF-β
及びGDF-8の作用を示すグラフである。
【図３３】 R1B細胞へのALK-5 I型受容体の再導入によるTGF-β及びGDF-8に対するR1B細胞
の応答性のレスキューを示すグラフである。
【図３４】 DR26細胞におけるルシフェラーゼレポータープラスミドの誘導に対するTGF-β
及びGDF-8の作用を示すグラフである。
【図３５】 GDF-8へのDR26細胞の応答性に対するActRIIB KR発現ベクターの影響を示すグ
ラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 3/10 Ａ６１Ｐ 11/00 11/00 19/00 19/00 25/00 25/00 35/00 35/00 Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｎ 9/99 Ｃ１２Ｎ 9/99 Ｃ１２Ｑ 1/37 15/09 ＺＮＡ Ｇ０１Ｎ 30/88 Ｊ Ｃ１２Ｑ 1/37 33/15 Ｚ Ｇ０１Ｎ 30/88 Ｃ０７Ｋ 14/475 33/15 Ｃ１２Ｑ 1/50 // Ｃ０７Ｋ 14/475 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｑ 1/50 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ラトビツキ，タマラ アメリカ合衆国メリーランド州21044コロ ンビア・ヘイゼルテイケツトテラス6509 (72)発明者 リアング，リ−フアング アメリカ合衆国メリーランド州21075エル クリツジ・ハンターロード6645 (72)発明者 ブラデイ，ジエイムズ・エル，ジユニア アメリカ合衆国メリーランド州20814ベセ スダ・バツテリーレイン4977・アパートメ ント821 (72)発明者 シンハ，デバシシ アメリカ合衆国メリーランド州20877ゲイ ザースバーグ・フアータイルメドウコート 18022 (72)発明者 ヤスエン−コークリー，リンダ アメリカ合衆国メリーランド州20902シル バースプリング・ダブリンドライブ1606 Ｆターム(参考） 2G045 AA40 DA36 FB01 FB03 FB05 FB06 4B024 AA01 AA11 BA80 CA01 DA02 GA11 GA18 4B063 QA01 QA18 QQ79 QR16 QR48 QS16 QS17 QX01 4C084 AA02 AA03 AA17 BA03 BA44 CA53 NA14 ZA022 ZA592 ZA702 ZA942 ZB262 ZC352 ZC552 4H045 AA10 BA15 BA16 BA17 BA18 BA19 CA40 DA55 EA28 FA74 HA06

Claims (55)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 （ａ）GDFタンパク質を生産する細胞を培養した培地を得る
    こと；（ｂ）GDF活性を阻害する能力に関して該培地を試験し、それによりGDFイ
    ンヒビターを同定すること： を含んでなる、GDFタンパク質のインヒビターの同定方法。
  2. 【請求項２】 GDF活性を阻害する能力に関して該培地を試験する前に該培
    地に対してクロマトグラフィーを実施することをさらに含んでなる請求項１の方
    法。
  3. 【請求項３】 該クロマトグラフィーから得られた画分に対して電気泳動を
    実施することをさらに含んでなる請求項１の方法。
  4. 【請求項４】 該細胞がGDFタンパク質をコードするインサートを含有する
    プラスミドでトランスフェクションされている請求項１の方法。
  5. 【請求項５】 細胞がCHO細胞である請求項４の方法。
  6. 【請求項６】 細胞がGDFタンパク質を内因的に生産する請求項１の方法。
  7. 【請求項７】 クロマトグラフィーがイオン交換及び逆相クロマトグラフィ
    ーである請求項２の方法。
  8. 【請求項８】 電気泳動が分取非還元SDS-PAGE及び分取還元SDS-PAGEよりな
    る群から選択される請求項３の方法。
  9. 【請求項９】 GDFタンパク質がヒトGDFタンパク質である請求項１の方法。
  10. 【請求項１０】 GDFタンパク質が、ウシGDF-8もしくはGDF-11、ニワトリGD
    F-8もしくはGDF-11、マウスGDF-8もしくはGDF-11、ラットGDF-8もしくはGDF-11
    、ブタGDF-8もしくはGDF-11、ヒツジGDF-8もしくはGDF-11、シチメンチョウGDF-
    8もしくはGDF-11及びヒヒGDF-8もしくはGDF-11よりなる群から選択される請求項
    １の方法。
  11. 【請求項１１】 試験が筋肉特異的酵素の活性を検出する請求項１の方法。
  12. 【請求項１２】 筋肉特異的酵素がクレアチンキナーゼである請求項１１の
    方法。
  13. 【請求項１３】 試験が脂肪細胞分化を検出する請求項１の方法。
  14. 【請求項１４】 3T3-L1前脂肪細胞の分化を検出する請求項１３の方法。
  15. 【請求項１５】 転写に基づくアッセイを用いて試験を実施する請求項１の
    方法。
  16. 【請求項１６】 GDFインヒビターがGDFポリペプチドである請求項１の方法
    。
  17. 【請求項１７】 GDFインヒビターがGDFタンパク質のプロ-ドメインまたは
    プロ-ドメインの一部を含んでなる請求項１の方法。
  18. 【請求項１８】 （ａ）GDFタンパク質のフラグメントを調製すること；（
    ｂ）GDF活性を阻害する能力に関して該フラグメントを試験し、それによりGDFイ
    ンヒビターを同定すること： を含んでなる、GDFタンパク質のインヒビターの同定方法。
  19. 【請求項１９】 GDFタンパク質を消化することにより該フラグメントを調
    製する請求項１８の方法。
  20. 【請求項２０】 フラグメントを合成的に合成する請求項１８の方法。
  21. 【請求項２１】 GDF活性を阻害する能力に関してフラグメントを試験する
    前にそれらを単離することをさらに含んでなる請求項１８の方法。
  22. 【請求項２２】 T細胞性応答を誘導しないフラグメントを選択することを
    さらに含んでなる請求項１８の方法。
  23. 【請求項２３】 免疫応答を引き出すアミノ酸配列を有するフラグメントを
    選択することをさらに含んでなる請求項１８の方法。
  24. 【請求項２４】 試験が、GDF阻害抗体の産出をもたらす免疫応答を引き出
    す能力に関して該フラグメントをスクリーニングすることを含んでなる請求項１
    ８の方法。
  25. 【請求項２５】 GDFタンパク質を組換え的に製造する請求項１８の方法。
  26. 【請求項２６】 GDFタンパク質が天然のGDFタンパク質である請求項１８の
    方法。
  27. 【請求項２７】 GDFタンパク質をプロテアーゼの使用により消化する請求
    項１９の方法。
  28. 【請求項２８】 プロテアーゼがトリプシン、サーモリシン、キモトリプシ
    ン及びペプシンよりなる群から選択される請求項２７の方法。
  29. 【請求項２９】 フラグメントが10-25アミノ酸の長さである請求項１８の
    方法。
  30. 【請求項３０】 フラグメントが25-40アミノ酸の長さである請求項１８の
    方法。
  31. 【請求項３１】 ヒトGDF-8またはGDF-11をコードするインサートを含有す
    る発現プラスミドで安定にトランスフェクションしたCHO細胞を単離した培地か
    らイオン交換クロマトグラフィーにより単離することができ、100℃で10分まで
    の間加熱した後に活性を保持し、還元後に活性を保持し、そして6M尿素での処理
    後に活性を保持するGDF-8またはGDF-11インヒビター。
  32. 【請求項３２】 約70kDa未満の分子量を有する請求項31のGDF-8またはGDF-
    11インヒビター。
  33. 【請求項３３】 ヒトGDF-8またはGDF-11をコードするインサートを含有す
    る発現プラスミドで安定にトランスフェクションしたCHO細胞を単離した培地か
    らイオン交換クロマトグラフィーにより単離することができ、100℃で10分まで
    の間加熱した後に活性を保持し、還元後に活性を失い、そして6M尿素での処理後
    に活性を保持するGDF-8またはGDF-11インヒビター。
  34. 【請求項３４】 約70kDa未満の分子量を有する請求項33のGDF-8またはGDF-
    11インヒビター。
  35. 【請求項３５】 インヒビターがGDF-8またはGDF-11活性を保有しない請求
    項31または33のいずれかのGDF-8またはGDF-11インヒビター。
  36. 【請求項３６】 請求項１または１７のいずれかの方法により同定されるGD
    Fインヒビター。
  37. 【請求項３７】 インヒビターがGDFタンパク質である請求項３６のGDFイン
    ヒビター。
  38. 【請求項３８】 GDF活性を阻害するGDFタンパク質またはペプチド。
  39. 【請求項３９】 タンパク質またはペプチドがそれ自体GDF活性を示さない
    請求項３８のタンパク質またはペプチド。
  40. 【請求項４０】 合成的に製造される請求項３８のタンパク質またはペプチ
    ド。
  41. 【請求項４１】 タンパク質またはペプチドが天然のGDFポリペプチドから
    得られる請求項３８のタンパク質またはペプチド。
  42. 【請求項４２】 組換え的に製造される請求項38のタンパク質またはペプチ
    ド。
  43. 【請求項４３】 GDFタンパク質のプロ-ドメインまたはプロ-ドメインの一
    部を含んでなるGDFインヒビター。
  44. 【請求項４４】 インヒビターがグリコシル化されている請求項４３のGDF
    インヒビター。
  45. 【請求項４５】 細胞にトランスフェクションするとGDF発現を阻害する、
    配列番号：1、2、3及び4よりなる群から選択されるヌクレオチド配列を含んでな
    る単離された核酸。
  46. 【請求項４６】 細胞にトランスフェクションするとGDF発現を阻害する、
    配列番号：5-24よりなる群から選択されるヌクレオチド配列を含んでなる単離さ
    れた核酸。
  47. 【請求項４７】 GDFタンパク質の変異体を含んでなるGDFインヒビター。
  48. 【請求項４８】 GDFタンパク質変異体がシステイン変異体である請求項４
    ７のGDFインヒビター。
  49. 【請求項４９】 GDFタンパク質変異体がプロ-ドメイン変異体である請求項
    ４７のGDFインヒビター。
  50. 【請求項５０】 GDFタンパク質変異体が翻訳後修飾変異体である請求項４
    ７のGDFインヒビター。
  51. 【請求項５１】 細胞におけるGDF活性を阻害する、配列番号：25、29また
    は30よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる単離されたポリペプチ
    ド。
  52. 【請求項５２】 GDFインヒビターを発現する非ヒト動物。
  53. 【請求項５３】 GDFインヒビターがGDFタンパク質のプロ-ドメインを含ん
    でなる請求項５２の非ヒト動物。
  54. 【請求項５４】 GDFタンパク質がGDF-8またはGDF-11である請求項５３の非
    ヒト動物。
  55. 【請求項５５】 動物がニワトリである請求項５５の非ヒト動物。
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