CN1355881A - 生长分化因子抑制剂及其用途 - Google Patents

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Abstract

公开了几种GDF蛋白如GDF－8或GDF－11的抑制剂。还公开了鉴定和应用这些抑制剂的方法,例如产生转基因动物和治疗多种疾病。

Description

生长分化因子抑制剂及其用途
相关的申请
本申请要求如下优先权：1999年1月21日申请的美国专利临时申请号60/116,639以及1999年6月10日申请的美国专利临时申请号60/138,363，在此均被全部引入作为参考。
发明领域
本发明是关于GDF蛋白如GDF-8和GDF-11蛋白的抑制剂，以及鉴定这些抑制剂的方法和应用它们的方法。
发明背景
生长和分化因子-8(GDF-8)也被称为Myostatin，是结构相关性生长因子的转化生长因子-β(TGF-β)超家族的一个成员，所有的成员均具有生理学重要的生长调节和形态发生特征(D.M.Kingsley等(1994)，基因与发育，8，133-46，P.A.Hoodless等(1988)，微生物学和免疫学的现代话题，228，235-72)。TGF-β超家族的成员通过异数的蛋白激酶受体复合物发送信号。此家族还包括骨形态发生蛋白(BMPs)、活化素、抑制素、Mullerian抑制物质、神经胶质衍生神经营养因子以及仍在增加数目的生长和分化因子(GDFs)。Myostatin本身特别在发育的和成熟的骨骼肌中被高度表达，而在脂肪内只有很小程度的表达。Myostatin看来与许多生理过程有关，其中完全确定的是它调节骨骼肌容量的能力，并因此被称为“Myostatin”。
通过基因靶向产生的Myostatin无效小鼠发育正常，但具有多于正常骨骼肌一倍的肌肉容量(A.C.McPherron等(1997)自然，387，83-90)。对于其表型是由于Myostatin基因突变产生的二个品种双倍肌肉牛比利时兰和Piedmontese以及超肌肉Compt突变小鼠的鉴定表明，在这二种动物Myostatin具有相同的发育功能(A.C.McPherron等(1997)PNAS，94，12457-61；R.Jambadur等(1997)基因研究，7，910-15；G.Szabo等(1998)哺乳动物基因组，9，671-2)。来自不同种动物的序列资料表明在脊椎动物中GDF-8是高度保守的，这暗示GDF-8可能具有超越物种的相同作用(McPherron和Lee，(1997)PNAS，94，12457-61)。
与上述结果一致，最近的研究已显示在人类HIV-感染相关性肌肉消耗伴随有Myostatin蛋白表达增加(N.F.Gonzalez-Gadavid等(1998)PNAS，95，14938-43)。总的说来，此证据有力地支持GDF-8(或Myostatin)对控制骨骼肌容量的重要作用。
发明概述
本发明至少部分地基于发现从表达GDF-8的细胞获得的培养基中存在GDF-8抑制活性。因此，一方面本发明的特征在于一种方法，用于鉴定抑制GDF如GDF-8活性的GDF抑制剂如GDF-8抑制剂，例如它是一种GDF多肽。在一个实施方案中，该抑制剂本身不具有GDF如GDF-8活性(例如该抑制剂是一种本身不具有GDF活性的GDF多肽)。该方法包括获得在其中已培养了产生GDF多肽的细胞的培养基，并测定培养基成分抑制GDF活性的能力，从而鉴定GDF抑制剂。在一个实施方案中，该方法包括在测定培养基抑制GDF活性的能力之前对培养基进行层析。在另一实施方案中，该方法包括对从层析中获得的组分进行电泳，例如初步的非还原性或还原性SDS-PAGE，并通过例如电洗脱回收这些组分。
在另一些优选的实施方案中，这种表达GDF多肽的细胞是例如CHO细胞，此细胞已被用含有编码GDF多肽的插入片段的质粒转染了。在还有其它一些优选的实施方案中，这种细胞产生内源性GDF多肽如GDF-8。这类细胞包括例如杆状肌肉瘤系RD(ATCC，CCL-136)和QM7肌肉成肌细胞(ATCC，CRL-1962)。
另一方面，本发明的特征在于一种用于鉴定GDF抑制剂的方法，它包括制备GDF多肽的多肽片段，并测定这些片段抑制GDF活性的能力，从而鉴定GDF抑制剂。可以通过消化GDF多肽如天然的GDF多肽或重组产生的GDF多肽来制备这种多肽片段，或者它们还可以被重组合成或人工合成。例如，可以用蛋白酶消化GDF多肽，包括但不局限于胰蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶或其它任何已知的蛋白酶。然后可以在对这种多肽测定抑制GDF活性的能力之前将它们分离出。
在制备该种肽片段之前，为了引发通过免疫应答对内源性GDF的中和作用还可以对此肽进行选择。可以通过筛选该多肽片段引发导致产生GDF抑制性抗体的免疫应答的能力而对该多肽片段进行测定。
GDF多肽抑制剂可以是足以抑制GDF活性的任何长度多肽。通常此多肽的长度范围是5-10，10-25，25-40或者40或40个以上氨基酸。在某些优选的实施方案中，该GDF多肽片段的长度至少是5，10，15，20，25，30，35，40或45个氨基酸。
另一方面，本发明的特征在于一种GDF抑制剂，例如一种可能具有或不具有GDF活性的抑制剂，此GDF抑制剂具有如下的一个或几个特征：它可以从已通过柱层析分离出其中一种细胞(例如CHO)的培养基中被分离出，此细胞是用含有编码GDF-8或GDF-11的插入片段的表达质粒稳定转染的细胞；在100℃加热直到10分钟之后它仍保持活性；在还原之后它保持或不保持活性；以及在用6M尿素处理之后它仍保持活性。在一个实施方案中，本发明的特征在于一种在还原和变性凝胶中具有小于70kDa分子量的GDF-8抑制剂。
另一方面，本发明的特征在于一种借助于在此所述的方法发现的GDF抑制剂，例如一种GDF多肽。
另一方面，本发明的特征在于一种包含GDF多肽前功能区或其一部分的GDF抑制剂。在优选的实施方案中，此GDF多肽前功能区或其一部分是糖基化的。
另一方面，本发明的特征在于一种包含GDF多肽变异体的GDF抑制剂。在一个实施方案中，此GDF多肽变异体是半胱氨酸变异体。在另一实施方案中，此GDF多肽变异体是前功能区变异体。还有一个实施方案中，此GDF多肽变异体是翻译后修饰变异体。还有另一个实施方案中，此GDF多肽变异体是位点切割变异体。
在另一方面，本发明的特征在于一种包含分离核酸分子的GDF抑制剂，此核酸分子连接和/或粘附于由编码GDF多肽的基因产生的RNA转录物。在某些实施方案中，此核酸是含有SEQ ID NO：1-4任何之一核苷酸序列的核酶。在其它实施方案中，此核酸是含有SEQ ID NOs：5-24任何之一核苷酸序列的反义分子。
另一方面，本发明的特征在于一种用于测定GDF活性的测定法，此方法可用于鉴定GDF抑制剂。适合于测定对GDF活性抑制作用的生物测定法包括但不限于：检测肌肉特异性酶如肌酸激酶活性的测定法；检测脂肪细胞分化如3T3-L1前-脂肪细胞分化的测定法；DNA复制测定法；以及基于转录作用的测定法。
再一方面，本发明的特征在于一种应用基于蛋白质分泌作用的测定法测定细胞系统中GDF抑制剂的方法。
另一方面，本发明的特征在于几种转基因动物，在这种转基因动物中，编码本发明GDF抑制剂的基因表达含干扰GDF多肽的加工、GDF多肽的分泌、和/或GDF多肽的生物活性。
本发明其它几方面的特征在于将本发明的GDF抑制剂用于例如治疗多种疾病的方法。
从下面的详述和权利要求，本发明的其它特征和有益用途将是显而易见的。
附图简述
图1显示对在230nm测定的组分A和B的离子交换层析图谱(HQ柱)。
图2显示在215nm测定的组分A离子交换层析图谱。插入图表显示用于洗脱的梯度，在此缓冲液A是20mM磷酸钠盐pH5.0，缓冲液B是20mM磷酸钠盐pH5.0/2M NaCl。
图3显示在215nm测定的组分B离子交换层析图谱。插入图表显示用于洗脱的梯度液，在此缓冲液A是20mM磷酸钠盐pH5.0，缓冲液B是20mM磷酸钠盐pH5.0/2M NaCl。
图4显示对在21-23分钟之间洗脱的组分A的反相层析(C4柱)图谱。也显示了用于洗脱的梯度，在此缓冲液A是0.1％TFA，缓冲液B是在80％乙腈中的0.1％TFA。
图5显示对在27-29分钟洗脱的组分B的反相层析(C4柱)图谱。也显示了用于洗脱的梯度，在此缓冲液A是0.1％TFA，缓冲液B是在80％乙腈中的0.085％TFA。
图6A和B图解显示组分A抑制GDF-8对细胞增殖的作用。图6A显示如通过BrdU掺入所测定的组分A对G8或肌细胞中DNA合成的作用。图6B显示如通过[3H]-TdR掺入所测定的组分A对水貂肺CCL-64上皮细胞中DNA合成的作用。
图7A和B图解显示通过基于转录的测定法监测的组分A的GDF-8-抑制活性。萤光素酶的表达来源于报道质粒p(CAGA)12-MLP(图7A和7B)。
图8图解显示组分A对GDF-8抑制作用的特异性。
图9图解显示通过基于转录的测定法监测的组分B的GDF-8抑制活性。
图10图解显示组分B对GDF-8抑制作用的特异性。
图11是对鼠、大鼠、人、狒狒、牛、猪、绵羊、鸡、火鸡和斑马鱼GDF-8氨基酸序列顺序的描绘。
图12示意表示不同GDF-8的结构。图12A显示野生型全长度GDF-8的结构。GDF-8在细胞中被加工产生成熟的GDF-8和剩余前-肽。图12B显示带有被取代的切割位点的未断开的突变体。此突变体作为前体分子被分泌。图12C显示独立表达的GDF-8前功能区。
图13显示小鼠GDF-8的核苷酸和氨基酸序列。指示出了为产生GDF-8变异体所导入的突变。切割位点被加上了方框。用三角形标示出了在除去信号序列之后前-功能区的起始和末端。在下面划线指示预测的N-连接的糖基化位点。
图14图解显示GDF-8的前区域可抑制成熟GDF-8的活性。
图15图解显示GDF-8的前功能区对GDF-8抑制作用的特异性。
图16的曲线显示其前功能区对GDF-8活性的剂量依赖性抑制作用。
图17显示预测的人GDF-11(上列)和人GDF-8(下列)氨基酸序列的序列比较。纵线指示同样的氨基酸。图点表示为了使此序列比较最大化所引入的缺口。数字表示相对于N-末端氨基酸的位置。用空框标示假定的蛋白水解加工位点。用阴影框标示C-末端区保守的半胱氨酸残基。
图18显示小鼠GDF-8 mRNA序列中核酶的靶标位点。倒置箭头指示出在小鼠GDF-8mRNA序列中被选择的4个核酶的切割位点。加底线的核苷酸指示与每个核酶中位于催化功能区两侧的序列互补的区域。加方框指示对于GDF-8蛋白的翻译起始和终止密码子。
图19显示4种小鼠GDF-8核酶的核苷酸序列。每个核酶序列被显示在它与之互补的小鼠GDF-8mRNA序列的下面。倒置箭头指示在此GDF-8序列中核酶切割的靶标位点。
图20显示含有在图19中所示、前后排列的4种核酶的DNA盒核苷酸序列及其反向重复序列。加阴影突出4种核酶的序列(SEQ IDNOs：1-4)，在下面加箭头线的序列指示反向重复序列。
图21显示所选择的核酶表达构建体。带有反向重复序列的核酶盒被连接进入三种不同的质粒。pGDF8R-1含有小鼠GDF-8翻译起始位点、外置子1、内含子1，以及部分外显子2 2.8kb上游序列，此外显子2来自连接核酶盒上游序列的小鼠GDF-8基因。来自SV40巨大T抗原基因的聚腺苷酸化信号被连接在核酶盒的其它位点上。pMLCR-1含有连接核酶盒上游序列的大鼠肌球蛋白轻链1基因转录起始部位的～1500bp上游序列，以及包含连接核酶盒下游序列的大鼠肌球蛋白轻链基因3′增强子的～900bp片段。pCMVR-1含有连接核酶上游序列的大约500bp的人巨细胞病毒紧连的主要初始基因启动子。Rib1、Rib2、Rib3和Rib4表示编码4种不同核酶的DNA区；带有反向箭头的方框相当于反向重复序列。
图22显示与所示区域内人GDF-8cDNA序列互补的20个寡核苷酸的序列(SEQ ID NOs：5-24)。在寡核苷酸序列下面加圆圈的数字指示各个寡核苷酸序列的5′端。
图23显示为了进一步鉴定组分B特征进行的电喷射/电离质谱分析结果。此质谱图显示出由带有29472.0Da分子量的主要成分的600Da分隔的三个峰。
图24图解显示化学修饰的GDF-8前功能区对它抑制成熟GDF-8治疗能力的影响。
图25图解显示从组分B中纯化的GDF-8前功能区对GDF-8诱导A204细胞中报道质粒的作用。图25显示了使用报道质粒p(CAGA)12-MLP所得到的结果。
图26图解显示通过基于肌酸激酶的测定法所测定的，GDF-8和TGF-β1对C2C12和鸡初始成肌细胞肌源性分化的作用。
图27图解显示GDF-8对3T3-L1脂肪细胞内萄萄糖摄入的作用。数据表明在对胰岛素应答时GDF-8抑制葡萄糖摄入3T3-L1细胞中。
图28图解显示组分B体外去糖基化导致丧失其抑制活性。
图29图解显示为了测定QM-7成肌细胞产生的GDF-8复合物的生物活性，而进行的基于转录的报导质粒激活测定法的测定结果。
图30A-B图解显示为了测定来自m-钙蛋白酶处理的QM-7细胞(以WT-GDF-8-F构建体转化的细胞或者对照细胞)上清液的生物活性，而进行的基于转录的报导质粒激活测定法的测定结果。
图31图解显示TGF-β和GDF-8对CCL-64细胞中萤光素酶报导质粒诱导的作用。
图32图解显示TGF-β和GDF-8对R1B细胞中萤光素酶报导质粒诱导的作用。
图33图解显示通过将ALK-5 I型受体重新导入R1B细胞而挽救R1B细胞对TGFβ和GDF-8的应答性。
图34图解显示TGFβ和GDF-8对DR26细胞中萤光素酶报导质粒诱导的作用。
图35图解显示ActRIIB KR表达载体对DR26细胞对GDF-8应答性的影响。
详述
本发明提供了几种用于抑制生长分化因子(GDF)蛋白的组合物和方法，以及用于鉴定这种抑制剂的方法。
特别是可以应用多种筛选方法鉴定本发明的GDF抑制剂，这些筛选方法可对来自GDF蛋白如GDF-8和GFD-11的肽，或者对来自产生GDF蛋白的细胞的培养基测定其GDF抑制活性。在一个筛选方法中，是制备GDF肽的片段(即比整个全长度的蛋白质小的、包含GDF蛋白任何部分的肽)并测定其GDF抑制活性。在优选的实施方案中，此片段是来源于GDF蛋白的前区，例如来源于此蛋白前-区(前功能区)的N末端。例如，此片段可以是来源于GDF-8中精氨酸99上游的前功能区的区域(见图11)。例如可根据它诱导产生抗抑制GDF活性的GDF蛋白抗体的能力来选择这种肽。另一种方面如下面所详述的，可以从产生GDF蛋白的细胞的培养基中直接鉴定和分离出GDF抑制剂。例如按照在此所述的研究，以表达GDF-8的CHO细胞的培养基中分离出了二个层析组分，组分A和组分B。
如在此使用的名词“GDF多肽”和“GDF蛋白”包括结构相关性生长因子的转化生长因子-β(TGF-β)超家族的成员，所有这些成员均具有生理学重要的生长调节和形态发生特征。例如在如下文献中论述了此相关生长因子的家族：D.M.Kingsley等(1994)基因与发育，8，133-46；P.A.Hoodless等(1998)微生物学和免疫学现代话题，228，235-72，此文献的内容在此被引入作为参考。TGF-β超家族成员通过异数蛋白激酶受体复合物发送信号。
因此，在此使用的名词“GDF多肽”和“GDF蛋白”是指TGF-β超家族中的蛋白质，包括骨形态发生蛋白(BMPs)、活化素、抑制素、Mullerian抑制物质、神经胶质衍生神经营养因子，以及仍在增加数目的生长和分化因子(GDFs)，包括GDF-8(Myostatin)和GDF-11。
在此使用的名词“GDF抑制剂”包括能够抑制GDF蛋白的活性、表达、加工和/或分泌的任何作用剂，包括但不局限于特异性抑制GDF蛋白作用的肽、肽相似物、核酶、反义寡核苷酸、或小分子。GDF抑制剂可能具有GDF活性，或者优选地是一种不具有GDF活性的GDF抑制剂。
在此使用的名词“GDF-8抑制剂”和“GDF-11抑制剂”包括能够抑制GDF-8或GDF-11活性、表达、加工和/或分泌的任何作用剂，包括但不局限于肽、肽相似物、核酶、反义寡核苷酸、或小分子，这些作用剂特异性抑制GDF-8或GDF-11的作用而优选地保留不损害TGF-β或活化素或者TGF-β超家族其它成员的活性。GDF-8或GDF-11抑制剂可能具有GDF-8或GDF-11活性，或者优选地是不具有GDF-8或GDF-11活性的GDF-8或GDF-11抑制剂。
在此使用的名词“GDF-8或GDF-11活性”包括由GDF-8或GDF-11中介的任何活性。例如已知GDF-8抑制成纤维细胞分化成脂肪细胞，调节肌肉特异性酶如肌酸激酶的产生，以及调节细胞摄取葡萄糖和刺激成肌细胞增殖。因此，可以通过例如测定GDF-8或GDF-11的活性来鉴定GDF-8或GDF-11抑制剂，如通过如下能力测定的GDF-8或GDF-11活性：GDF-8或GDF-11干扰3T3-L1前脂肪细胞(成纤维细胞)变成脂肪细胞分化过程的能力，调节肌肉特异性酶如肌酸激酶活性的能力，调节细胞摄取葡萄糖的能力，或者刺激成肌细胞细胞增殖的能力。
如在此使用的名词“生物测定性”包括为鉴定GDF抑制剂所设计的任何测定方法。此测定法可以是适合于鉴定是在GDF抑制剂可抑制GDF蛋白一种或几种生物功能的体外或体内测定法。适合的生物测定法包括例如DNA复制测定法，基于转录的测定法，肌酸激酶测定法，基于3T3-L1前脂肪细胞分化的测定法，基于3T3-L1脂肪细胞中葡萄糖摄取的测定法，以及免疫测定法。
下面的章节将对本发明的各个方面作进一步详细的论述。为了便于说明本发明这些章节均针对GDF-8和GDF-11(二种高度同源的GDF蛋白)的抑制剂。但是本发明(例如下面的论述和测定法)可用于产生和使用对于任何GDF蛋白的抑制剂，因此不应该解释为本发明仅限于GDF-8和GDF-11。I.蛋白抑制剂
A.GDF-8和GDF-11蛋白抑制剂
1.从在其中已培养了表达GDF-8或GDF-11的细胞的培养基
中鉴定GDF-8或GDF-11抑制剂
在一个实施方案中，本发明提供了一种方法，包括获得其中已培养了产生GDF-8或GDF-11的细胞的培养基，以及测定此培养基抑制GDF-8或GDF-11活性的能力，从而鉴定GDF-8或GDF-11抑制剂。
从其中鉴定了GDF-8或GDF-11抑制剂的培养基可以包含以质粒转染的细胞，此质粒含有编码GDF-8或GDF-11的插入片段。另一方面，从其中鉴定了GDF-8或GDF-11抑制剂的培养基可以包含产生内源性GDF-8或GDF-11(即天然的GDF-8或GDF-11)的细胞。在此使用的名词“天然蛋白质”包括从天然存在的来源中回收的蛋白质。
产生GDF-8或GDF-11的细胞可以是任何一种原核细胞或真核细胞。例如可在细菌如大肠杆菌细胞、昆虫细胞、酵母或哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或COS细胞)中表达GDF-8或GDF-11蛋白。对于本领域的技术人员也容易找到其它适合的宿主细胞。
借助于常规的转化或转染技术可以将含有编码GDF-8或GDF-11的插入片段的质粒导入原核或真核细胞。在此使用的名词“转化”和“转染”打算意指用于将外来的核酸(如DNA)导入宿主细胞的各种被认可的人工技术，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀法、DEAE-葡聚糖-介导的转染、脂染法(lipofection)或电穿孔法。可以在Sambrook等(分子克隆：实验室手册，第二版，冷泉港实验室，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，1989)和其它实验室手册中找到适合于转化或转染宿主细胞的方法。
关于哺乳动物细胞的稳定转染，已知取决于所使用的表达载体和转染技术，只有小部分细胞可能将外来的DNA整合进入它们的基因组。为了鉴定和选择这些整合组分，通常使一个编码可选择标记(例如对抗菌素的抗性)的基因与所需基因一起被导入宿主细胞。优选的可选择标记包括可赋予对药物如G418、潮霉素和氨甲喋呤抗性的标记。编码可选择标记的核酸可以在与编码GDF-8或GDF-11蛋白的相同载体上被导入宿主细胞，或者也可以在单独的载体上被导入。通过药物选择可以鉴别以导入的核酸稳定转染的细胞(例如已掺入可选择标记基因的细胞将存活，而其它的细胞将死亡)。
在此使用的名词“GDF-8”包括所有已知的GDF-8形式，包括但不限于人GDF-8、牛GDF-8、鸡GDF-8、鼠GDF-8、大鼠GDF-8、猪GDF-8、绵羊GDF-8、火鸡GDF-8、狒狒GDF-8和鱼GDF-8。在参考文献McPherron A.C等(1997)美国国家科学院学报，94：12457-12461中描述了这些分子，此文献的内容在此被引入作为参考。这些蛋白质的氨基酸序列被显示在图11中。
在此使用的名词“GDF-11”包括所有已知的GDF-11形式，包括但不限于人GDF-11、牛GDF-11、鸡GDF-11、鼠GDF-11、大鼠GDF-11、猪GDF-11、绵羊GDF-11、火鸡GDF-11、狒狒GDF-11和鱼GDF-11。在例如美国专利5,871,935和文献L.W.Gamer等(1999)发育生物学，208，222-232中描述了这些分子，这些文献的内容在此被引入作为参考。GDF-8或GDF-11蛋白氨基酸序列的序列比较被显示在图17中。
应用本领域已知的纯化肽或蛋白质的技术，可以从表达GDF-8或GDF-11的细胞的培养基中纯化和分离出GDF-8或GDF-11抑制剂，这些技术包括离子交换层析、反相层析、凝胶过滤层析、超过滤、电泳、以及用对GDF-8或GDF-11抑制剂，或者对它们的一部分特异性抗体的免疫亲和性纯化法。在一个实施方案中，如在实施例部分所述，是使从表达GDF-8或GDF-11的细胞培养物中得到的培养基经受高效液相层析(HPLC)。
然后如下面所述，可对所得到的样品测定其GDF-8或GDF-11抑制活性。
2.鉴定来自GDF-8或GDF-11的抑制GDF-8或GDF-11活
性的肽
本发明的另一方面是通过筛选GDF-8或GDF-11片段的抑制活性鉴定GDF-8或GDF-11抑制剂。可通过各种已知的人工技术产生GDF-8或GDF-11片段。例如可以合成(如化学合成或重组合成)跨越GDF-8或GDF-11序列的特定寡肽(大约10-25个氨基酸长度)，并应用例如在此所述的测定法测定它们抑制GDF-8或GDF-11的能力。可以应用在如下文献中所述的标准技术合成此GDF-8或GDF-11肽片段：Bodansky，M.肽合成原理，Springer Verlag，Berlin(1993)和Grant，G.A(ed)合成肽：使用者指南，W.H.Freeman和Company，New York(1992)。自动肽合成仪可作为商品购买到(例如Advanced ChemTech 396型；Milligen/Biosearch 9600)。
按另一种方式，可通过应用蛋白酶例如胰蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、胰凝乳蛋白酶或胃蛋白酶消化天然的或重组产生的GDF-8或GDF-11来产生GDF-8或GDF-11片段。计算机分析法(应用可购买到的软件例如Mac Vector，Omega，PCGene，分子模拟公司)可用于鉴定蛋白水解切割位点。
本发明的GDF-8或GDF-11肽优选地是被分离的。在此使用的“分离”或“纯化的”蛋白质或者其生物活性肽基本上不含细胞或组织来源的细胞物质或其它污染蛋白质，该GDF-8或GDF-11蛋白或肽是从此细胞或组织来源产生的，或者当被化学合成是基本上不含化学前体物或其它化学试剂。措辞“基本上不含细胞物质”包括这样一种GDF-8或GDF-11蛋白质或其肽的制备物，其中的蛋白质或其肽是从分离或重组产生它的细胞的细胞成分中被分离出。在一个实施方案中，措辞“基本上不含细胞物质”包括这样一种GDF-8或GDF-11蛋白质或其肽的制备物，此制备物含有少于大约30％(以干重计)的非-GDF-8或GDF-11蛋白质或其肽的物质(在此也被称为“污染蛋白”)，较优选地是少于大约20％的非-GDF-8或GDF-11蛋白质或其肽的物质，更加优选地是少于大约10％的非-GDF-8或GDF-11蛋白质或其肽的物质，而最优选地是少于大约5％的非-GDF-8或GDF-11蛋白质或其肽的物质。当此GDF-8或GDF-11蛋白质或其生物活性部分是由重组产生时，优选地它也基本上不含培养基，也就是说，培养基占此蛋白质制备物的体积少于大约20％，较优选地是少于大约10％，而最优选地是少于大约5％。
二步法可用于产生和分离这种蛋白水解切割的GDF-8或GDF-11肽。第一步包括酶促消化此GDF-8或GDF-11蛋白。GDF-8或GDF-11即可作为二聚体从CHO细胞限制的培养基中，作为单体在大肠杆菌或酵母中被产生，也可从天然产生GDF-8或GDF-11的细胞中被分离出。在借助于例如HPLC层析纯化GDF-8或GDF-11的单体或二聚体之后，如下面所述对它们进行酶促消化。如本领域所知道的，在消化过程中被切割的氨基酸取决于在此实验中所使用的特定蛋白酶。例如，如果选择的蛋白酶是胰蛋白酶，切割位点将是精氨酸和赖氨酸。可以使用一种或几种这样的蛋白酶消化GDF-8或GDF-11蛋白。
在消化之后，第二步包括分离由蛋白质消化产生的肽组分。可借助于例如下面所述的高分辨能力的肽分离法完成此步骤。一旦组分被分离，如下面所述，可借助于适当的生物测定法测定它们的GDF-8或GDF-11抑制活性。
蛋白水解或合成的GDF-8或GDF-11片段可以包含例如部分地或完全抑制GDF-8或GDF-11功能所必需数目的氨基酸残基，优选的长度是包含至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100个或更多氨基酸。
在一个实施方案中，选择了不含有足够数量T细胞抗原表位用于诱导T细胞介导性免疫应答的肽，以及/或者选择含有足够数量B细胞抗原表位的肽，以便当给予哺乳动物时诱发产生抗体。优选的GDF-8或GDF-11抑制剂不含有足够数量诱导T细胞介导性(例如细胞因子)应答的T细胞抗原表位。但是B细胞表位是符合需要的，可以通过例如下面所论述的测定此肽诱发抗体应答的能力来选择。
应用许多熟知的技术可以鉴定GDF-8或GDF-11片段内的T细胞抗原表位。例如应用算法(参见例如Rothbard，J和Taylor，W.R(1998)EMBO杂志，7：93-100；Berzofsky，J.A(1989)Philos TransR.Soc.Lond.323：535-544)可预测T细胞抗原表位。优选地，应用已知的结合特定氨基酸残基的HLA II类可预测GDF-8或GDF-11蛋白中的人T细胞抗原表位。在如下文献中报导了已成功地被用于预测具有T细胞刺激活性多肽的一种算法：Rothbard，第一届病毒学论会，巴士德研究所年刊，pp518-526(1986年12月)；Rothbard和Taylor(1988)Embo杂志，7：93-100；以及EP0304279。这些文献报导了对一般T细胞模式的判定(算法)，它的统计学显著性和它同已知抗原表位的相关性，以及它在预测多种蛋白质抗原和自身抗原以前未发现的T细胞抗原表位中的成功应用。如在上述文献中报导的T细胞抗原表位的一般模式似乎包含由带电氨基酸残基或甘氨酸组成的，随后是二个疏水性残基的线性模式。已被用于预测以前未确定的蛋白质T细胞抗原表位的其它算法包括由Margalit等(1987)免疫学杂志，138：2213-2229报导的算法，它是基于一种双亲性螺旋模型。
用于鉴定T细胞抗原表位的其它方法包括筛选本发明GDF-8或GDF-11抑制肽对人T细胞的刺激活性。可应用一种或几种不同的测定法实现此目的。例如在体外，可通过使本发明的肽与T细胞培养物中呈递合适MHC分子的抗原呈递细胞相接触来测定T细胞刺激活性。将本发明的GDF-8或GDF-11抑制性肽与适合的MHC分子相结合呈递给T细胞，连同必需的共同刺激作用，可具有对诱导产生增加水平的细胞因子，特别白介素-2和白介素-4的T细胞传递信号的作用。取得这种培养物的上清液并测定白介素-2或其它已知的细胞因子。例如可采用白介素-2的几种常规测定法中的任何一种，如美国国家科学院学报86：1333(1989)中所述的测定法，此文献的全部内容在此被引入作为参考。用于测定干扰素产生的试剂盒也可从Genzyme公司(剑桥，MA)获得。
通常测定T细胞增殖需要测定氚标记胸苷的掺入。通过在体外测定掺入培养细胞复制DNA的3H标记胸苷的量可测量T细胞的增殖。因此，可定量测定DNA合成的速度，并进而定量测定细胞分裂的速度。
应用本领域技术人员熟知的计算机分析程序，可以鉴定位于该蛋白质表面如亲水区及高抗原性区的GDF-8或GDF-11的其它优选片段或具有高度表面机率得分的片段(Hopp和Wood(1983)，分子免疫学，20，483-9，Kyte和Doolittle(1982)，分子生物学杂志，157，105-32，Corrigan和Huang(1992)，生物医学计算机程序，3，163-8)。
其它一些将被测定GDF-8或GDF-11抑制活性的优选GDF-8或GDF-11片段还包含有一种或几种B-细胞抗原表位。通过如下步骤可鉴定这种肽：用此肽单独或者与佐剂(如半抗原)组合或连接免疫接种哺乳动物，并测定来自被免疫接种动物血清中的抗-GDF-8或GDF-11抗体。优选的肽产生抑制GDF-8或GDF-11活性的抗-GDF-8或GDF-11抗体。例如，应用在此所述的任何一种GDF-8或GDF-11生物测定法可测定来自被免疫接种动物血清的GDF-8或GDF-11抑制活性。可以用蛋白水解的或合成的GDF-8或GDF-11片段(单独或与半抗原连接)免疫接种合适的受试动物(例如兔、山羊、小鼠或其它的哺乳动物或者脊椎动物)。例如可采用在美国专利NOs 5,422,110；5,837,268；5,708,155；5,723,129和5,849,531中所述的方法(这些专利的内容在此被引入作为参考)。这种致免疫性制备物还可进一步包含一种佐剂如福氏完全或不完全佐剂，或者类似的免疫激活剂。用致免疫性水解蛋白或合成的GDF-8或GDF-11片段的制备物免疫接种合适的受试动物可诱发多克隆抗-GDF-8或GDF-11抗体应答。可借助于标准的技术如使用固定化GDF-8或GDF-11的酶联免疫吸附试验(ELISA)在一段时间内监测被免疫接种受试者体内抗-GDF-8或GDF-11抗体的滴度。随后可应用在此所述的任何生物测定法，测定来自被免疫接种受试者血清的GDF-8或GDF-11抑制活性。
从该哺乳动物(例如从血液中)可分离出定向针对GDF-8或GDF-11的抗体分子，并且借助于熟知的技术如蛋白A层析法可进一步纯化得到IgG组分。可在免疫接种后的适当时间如抗-GDF-8或GDF-11抗体滴度最高时，从此受试动物取得产生抗体的细胞，用于借助于标准的技术如最初由Kohle和Milstein(1957)自然，256：495-497)所描述的杂交瘤技术制备例如单克隆抗体(也见Brown等(1981)免疫学杂志，127：539-46；Brown等(1980)生物化学杂志，255：4980-83；Yeh等(1976)美国国家科学院学报，76：2927-31；以及Yeh等(1982)国际癌症杂志，29：26975)，还可应用EBV-杂交瘤技术(Cole等，(1985)，单克隆抗体和癌症治疗，Alan R.Liss，Inc.pp77-96)或者trioma技术。产生单克隆抗体杂交瘤的技术也是熟知的(通常可参见R.H.Kenneth，单克隆抗体：生物学分析中的新尺度，Plenum出版公司，纽约，(1989)；E.A.Lerner(1981)耶鲁大学生物医学杂志，54：387-402；M.L.Gefter等(1977)，体细胞遗传，3：231-36)。概括地说，使永生化的细胞系(通常是骨髓瘤细胞)与来自如上所述用GDF-8或GDF-11免疫原免疫接种的哺乳动物的淋巴细胞(通常是脾细胞)融合，然后筛选所形成杂交瘤细胞的培养上清液，以便鉴定产生可结合GDF-8或GDF-11的单克隆抗体的杂交瘤。
为了产生抗-GDF-8或GDF-11单克隆抗体，用于融合淋巴细胞和永生化细胞系的许多已知方案中任何一种都可被采用(见例如G.Galfre等(1977)自然，266：55052；Gefter等体细胞遗传，同上；Lerner，耶鲁大学生物医学杂志，同上；Kenneth，单克隆抗体，同上)。而且一般的技术人员都将意识到，还可采用与这些方法不同的许多方法。永生化的细胞系(例如骨髓瘤)通常来源于与此淋巴细胞相同种哺乳动物。例如通过使来自以本发明的致免疫性制备物免疫接种小鼠的淋巴细胞与永生化的小鼠细胞系融合可形成鼠杂交瘤。优选的永生化细胞系是小鼠骨髓瘤细胞系，此细胞系对含有次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷的培养基(“HAT培养基”)敏感。多种骨髓瘤细胞系中的任何一种都可以按照标准的技术用作融合配体，例如P3-NS1/1-Ag4-1，P3-x63-Ag8.653或Sp2/O-Ag14骨髓瘤系。这些骨髓瘤系都可从ATCC获得。一般是用聚乙二醇(“PEG”)使HAT-敏感性小鼠骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞融合。然后用HAT培养基选择由融合形成的杂交瘤细胞，此培养基杀死未融合的和未配合成的骨髓瘤细胞(未融合的脾细胞在几天后也死亡，因为它未被转化)。通过例如应用标准的ELISA试验筛选杂交瘤培养物上清液中可结合GDF-8或GDF-11的抗体检测出产生本发明单克隆抗体的杂交瘤细胞。然后可应用例如在此所述的检测法测定此抗体的GDF-8或GDF-11抑制活性。
本发明的另一方面是，GDF-8肽抑制剂包含全部或一部分GDF-8前-功能区。应用多种表达系统(例如CHO，杆状病毒等)都可产生GDF-8前-功能区或它的一部分。可通过例如应用Bottinger等(1996)PNAS 93：5877-5882中所述的方法，或者其它任何技术上被认可的肽纯化法纯化被表达的GDF-8前-功能区。另一方面，如在下面实施例中所述，可用例如FLAG或6-His标记该前-功能区。此外，通过切割，例如化学切割天然GDF-8也可产生GDF-8前-功能区或其一部分。而且还可应用在此所述的已知技术化学合成GDF-8前-功能区或其一部分。
在特定的实施方案中，GDF-8抑制剂是一个肽，例如二十五肽，它包括(例如跨越)成熟GDF-8的C-末端。优选地此GDF-8肽长度是大约25个氨基酸，包括或基本上由选自如下的序列组成：ANYCSGECEFVFLQKYPHTHLVH(SEQ ID NO：25)，KIPAMVVDRCGCS(SEQ ID NO：29)和/或LSKLRLETAPNISKDVIRQLLP(SEQ ID NO：30)。在另一个实施方案中，该GDF-8抑制剂具有全部或部分上面所鉴定的序列，并且有长度大约20-25，25-30，30-35，35-40或40-45个氨基酸残基。然后可应用在此所述的检测法测定基于这些肽的GDF-8肽抑制剂的GDF-8或GDF-11抑制活性。
在另一个实施方案中，本发明的GDF-8或GDF-11抑制剂是肽、肽相似物或小分子，它们可抑制从GDF-8/前-功能区复合物中释放出成熟的GDF-8蛋白，和/或它们可稳定GDF-8/前-功能区复合物。这类GDF-8和GDF-11抑制剂包括半胱氨酸蛋白酶抑制剂如m-钙蛋白酶抑制剂。
还有在另一个实施方案中，本发明的GDF-8和GDF-11抑制剂是(同GDF-8或GDF-11)竞争结合于GDF-8或GDF-11受体的可溶性GDF-8或GDF-11受体，例如可溶性GDF-8或GDF-11受体片段。将在此描述这类可溶性GDF-8或GDF-11受体。
B.抑制GDF-8和GDF-11活性的GDF-8和GDF-11蛋白
变异体
在另一实施方案中，本发明的GDF-8和GDF-11抑制剂是不具有可检测GDF-8活性的GDF-8或GDF-11蛋白变异体。本发明的GDF-8或GDF-11变异体可能含有野生型GDF-8或GDF-11氨基酸序列的一个或几个保守性或非保守性氨基酸取代、缺失、插入或未成熟的短片段。另一方面，该变异体在GDF-8或GDF-11蛋白活性的关键性残基或关键性区域也可能含有一个或几个保守性或非保守性氨基酸取代、插入或缺失。所形成的GDF-8或GDF-11蛋白变异体将干扰例如GDF-8或GDF-11的加工、分泌或/和它的生物活性，从而起GDF-8或GDF-11抑制剂的作用。
“保守性氨基酸取代”是其中的氨基酸残基被具有相似侧链(例如电荷、大小等)的氨基酸残基代替的取代。“非-保守性氨基酸取代”是其中的氨基酸残基被具有不相似侧链(例如电荷、大小等)的氨基酸残基代替的取代。在本领域对具有相似侧链的氨基酸残基家族已有定义。这些家族包括带有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，带有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)，带有不带电荷极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)，带有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)，带有β-分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及带有芳香族侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。
1.切割位点变异体
在一个实施方案中，本发明的GDF-8和GDF-11抑制剂是GDF-8和GDF-11蛋白的优势阴性突变体。属于TGF-β超家族如GDF-8和GDF-11的生长因子通过二个前体分子的二聚体化形成同源二聚体和异源二聚体。这种相互作用对于这些因子的分泌是必不可少的。配体二聚体的激活需要切去羧基端成熟的肽，遗留氨基端前体，并在正确的生理条件下发生。因此，在保守的切割序列中需要激活的突变可导致合成非功能性GDF-8和GDF-11分子。而且，这些突变前体分子的过度表达可导致在竞争性融合中带有内源性未修饰单体的突变GDF-8和GDF-11多肽形成异源二聚体。当GDF-8和GDF-11突变体以高水平表达时，大多数内源性二聚体将由于异源二聚体形成被滴定出，因此，以特异性方式完全阻断活性生长因子如GDF-8和/或GDF-11的分泌。如在下面实施例中所述的，可应用在例如如下文献中所述的技术制备GDF-8和GDF-11优势阴性突变体如切割位点突变体：Lopez等(1992)分子细胞生物学，12，1674-1679；Wittbrodt和Rosa(1994)基因与发育，8，1448-1462；Suzuki等(1997)发育生物学，189，112-122；以及Hawley等(1995)基因与发育，9，2923-2935。这些文献的内容在此均被引入作为参考。
2.半胱氨酸变异体
在另一实施方案中，本发明的GDF-8和GDF-11抑制剂是在一个或几个关键性半胱氨酸残基包含点突变的GDF-8或GDF-11蛋白，此半胱氨酸残基是包含在例如维持TGF-β家族成员如GDF-8和GDF-11的三级结构的分子内半胱氨酸桥中。例如，保留在所有TGF-β超家族成员中半胱氨酸残基如在GDF-8多肽位置313的半胱氨酸残基可以用不具有相似侧链的氨基酸残基(如上面所述)非保守地代替。如在下面实施例部分所述，应用在如下文献中所述的技术可以制成本发明的半胱氨酸突变：McPherron和Lee(1977)自然，387，83-90，以及Kambadur等(1997)基因组研究，7，910-15，这些文献的内容在此均被引入作为参考。
3.前-功能区变异体
在另一实施方案中，本发明的GDF-8和GDF-11抑制剂是包含全部或部分GDF-8或GDF-11多肽前-功能区的GDF-8或GDF-11多肽的被修饰形式。如在前面小节和下面实施例部分所述，可应用如下文献中所述技术制备在此被分别称为“前-GDF-8”和“前-GDF-11”的含有GDF-8和GDF-11蛋白前-功能区的抑制剂：Bottinger等(1996)PNAS，93，5877-5882以及Gentry和Nash(1990)生物化学，29，6851-6857，这些文献的内容在此均被引入作为参考。本发明的“前-GDF-8”和“前-GDF-11”抑制剂可被用于在此前-功能区来源于其中的相同种动物中，或者在不同种动物中抑制GDF-8或GDF-11活性(例如小鼠前-GDF-8可被用于抑制人GDF-8活性)。在优选的实施方案中，该抑制剂(如前-GDF-8)包含GDF-8前-功能区的N-末端(例如包含在Arg99上游的前-功能区的区域(见图11))。
4.翻译后修饰变异体
在进一步的实施方案中，本发明的GDF-8和GDF-11抑制剂包括不含有GDF-8或GDF-11蛋白或肽活性所必需的翻译后修饰的GDF-8或GDF-11蛋白或肽(例如它含有变异的翻译后修饰)。在此使用的名词“变异”包括来源于GDF-8或GDF-11多肽野生型翻译后修饰的翻译后修饰。变异的翻译后修饰包括翻译后修饰的增加或减少，以及不遵循GDF-8或GDF-11多肽翻译后修饰野生型模式的翻译后修饰。在此使用的名词“翻译后修饰”包括在GDF-8或GDF-11多肽已被翻译之后(例如肽键形成已发生之后)它所经受的任何修饰。翻译后修饰的实例包括糖基化、酰化、有限的蛋白质水解、磷酸化和异戊二烯化(isoprenylation)。翻译后修饰对蛋白质的加工、分泌和生物功能有重要的作用。
在优选的实施方案中，本发明的GDF-8和GDF-11抑制剂含有变异的糖基化。例如，本发明的某些GDF-8抑制剂在GDF-8前-功能区内预测的N-连接糖基化位点含有一个突变(见图13)。II.GDF-8和GDF-11核酸抑制剂
A.核酶(Ribozymes)
在另一个实施方案中，本发明的GDF-8和GDF-11抑制剂是定向针对GDF-8或GDF-11基因转录的核酶。核酶是具有核糖核酸酶活性的催化性RNA分子，它能够切割由于具有互补区它们可对其杂交的单链核酸如mRNA。因此，本发明的核酶(例如在Haselhoff和Gerlach(1988)自然，334：585-591中所述的锤头结构核酶)可用于催化切割GDF-8或GDF-11mRNA转录物，从而抑制GDF-8或GDF-11mRNA的翻译。根据例如在如下文献中所述的GDF-8或GDF-11cDNA核苷酸序列，可以设计对GDF-8或GDF-11-编码核酸具有特异性的核酶：McPherron A.C等(1997)国家科学院学报，94：12457-12461和美国专利申请系列号08/706958，这些文献的内容在此均被引入作为参考。例如可以构建其中活性位点的核苷酸序列与GDF-8-或GDF-11-编码mRNA中待切割核苷酸序列互补的四膜虫L-19IVS RNA的衍生物(见例如Cech等，美国专利No.4,987,071；和Cech等，美国专利No.5,116,742)。另外，GDF-8或GDF-11mRNA可用于从RNA分子库中选择具有特异性核糖核酸酶活性的催化性RNA(见例如Bartel，D.和Szostak，J.W(1993)科学，261：1411-1418)。
另一方面，GDF-8或GDF-11抑制剂核酶还可以包含与GDF-8或GDF-11基因的一个或几个调节区(例如GDF-8或GDF-11启动子和/或增强子)互补的核苷酸序列，从而形成阻碍靶细胞内GDF-8或GDF-11基因转录的三联螺旋结构(在例如Helenc.C(1991)抗癌药物研究6(6)：569-84；Helenc，C等(1992)纽约科学院年报，660：27-36；以及Maher，L.J(1992)生物测定法，14(12)：807-15中描述了用于此目的的技术)。
在特定的实施方案中，本发明的GDF-8和GDF-11抑制剂是包含在SEQ ID NOs：1-4中所提供的四个核苷酸序列之一的核酶。本发明的GDF-8和GDF-11抑制剂还包括具有与在SEQ ID NOs：1-4中列举的抑制GDF-8或GDF-11表达的核苷酸序列至少70％，80％，85％，90％，95％，98％，或更多同一性的核苷酸序列的核酶。为了确定二个核酸序列同一性的百分数，将这些序列排成直线以便于最佳比较的目的(例如为了最佳排列可在第一和第二核酸序列的一个或二个序列中导入缺口，并且为了比较的目的对非-同源性序列可忽略不计)。在优选的实施方案中，为比较的目的而排列的参照序列的长度是参照序列长度的至少30％，优选地是至少40％，较优选地是至少50％，更优选地是至少60％，而更加优选地是至少70％、80％或90％。然后将在对应核苷酸位置的核苷酸作比较。当第一序列中的一个位置被与第二序列中对应位置相同的核苷酸占据时，那未该分子在此位置是相同的(在此使用的核酸“同一性”等同于核酸的“同源性”)。考虑到为了此二序列的最佳排列需要引入的缺口数和每个缺口的长度，二个序列之间同一性百分数是二序列共有的相同位置数的函数。
应用一个计算公式可实现二个序列间的序列比较和确定同一性百分数。在优选的实施方案中，是应用GCG软件包(可在http：//www.gcg.com获得)中的GAP程序确定二个核苷酸序列之间的同一性百分数，使用NWSgapdna.CMP矩阵以及缺口权重40、50、60、70或80，和长度权重1、2、3、4、5或6。在另一实施方案中，是应用E.Meyers和W.Miller(CABIOS，4：11-17(1989))的公式确定二个核苷酸序列之间的同一性百分数，此算法已被编入ALIGN程序(版本2.0)，使用PAM120权重残数表，一个缺口长度补偿为12，一个缺口补偿为4。
B.GDF-8和GDF-11反义寡核苷酸
另一方面，本发明提供了以分离的反义核酸分子形式存在的GDF-8或GDF-11抑制剂。“反义”核酸包含与编码蛋白质的“有义”核酸互补的核苷酸序列，例如与双链cDNA分子编码链互补的，或者与mRNA序列互补的核苷酸序列。因此，反义核酸可同有义核酸杂交结合。本发明的反义核酸可以是与整个GDF-8或GDF-11编码链，或者与其一部分互补。在一个实施方案中，GDF-8或GDF-11反义核酸是对编码GDF-8或GDF-11核苷酸序列编码区反义的。名词“编码区”指包含将被翻译成氨基酸残基的密码子的核苷酸区域。在另一实施方案中，反义核酸是对编码GDF-8或GDF-11的核苷酸序列非编码区反义的。名词“非编码区”指编码区二侧不被翻译成氨基酸的5′和3′序列(即也被称为5′和3′非翻译区)。
基于已知的编码GDF-8和GDF-11的核苷酸序列，按照Watson和Crick碱基配对原则可以设计本发明的反义核酸。此反义核酸分子可以是与GDF-8或GDF-11 mRNA的整个编码区互补的，但通常是仅对GDF-8或GDF-11 mRNA的一部分编码区或非编码区反义的寡核苷酸。例如，此反义寡核苷酸可以是与GDF-8或GDF-11mRNA翻译起始位点周围的区域互补的。适合的反义寡核苷酸是例如大约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个核苷酸的长度。按照本领域已知程序，应用化学合成和酶促连接反应可构建本发明适合的反义GDF-8或GDF-11抑制剂。例如可使用天然存在的核苷酸，或者使用为增加分子生物学稳定性或为增加反义和有义核酸之间形成的双螺旋物理稳定性而设计的各种修饰的核苷酸，化学合成反义核酸(如反义寡核苷酸)，例如可以使用硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸。可用于形成反义核酸的被修饰核苷酸的实例包括：5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胺嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨甲基-2-硫尿苷、5-羧甲基氨甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖基queosine次黄苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基次黄苷、2，2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基queosine、5-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲基硫-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、wybutoxosine、拟尿嘧啶、queosine、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶、(acp3)W、和2，6-二氨基嘌呤。另一方面，还可应用核酸已按反义取向亚克隆进入其中的表达载体以生物学方法产生反义核酸(也就是说，从插入核酸片段转录的RNA将是对所需靶标核酸反义取向的，下面的小节中将进一步论述)。
通常是将本发明的反义GDF-8或GDF-11抑制剂对受试者给药，或者使其在原位产生，以致使它们可同编码GDF-8或GDF-11多肽的细胞mRNA和/或基因组DNA杂交或结合，从而例如通过抑制转录和/或翻译而抑制该多肽的表达。这种杂交可以是通过常规的核苷酸互补形成稳定的双螺旋，或者例如在结合于DNA双螺旋的反义核酸分子的情况下是通过双螺旋主槽内的特异性相互作用。给予本发明反义核酸分子的途径包括在组织部位直接注射。另外可以修饰反义核酸分子使之对准选定的细胞，然后通过全身性给药。例如，为了全身给药，可以如此修饰反义GDF-8或GDF-11分子以致于它们能特异性地结合于在所选定细胞表面表达的受体或抗原，例如通过将此反义核酸分子连接于与细胞表面受体或抗原结合的肽或抗体。还可以使用本领域已知的载体来投递这种反义GDF-8或GDF-11核酸分子(例如这种表达载体被抄录成定向针对GDF-8或GDF-11 mRNA的反义mRNA)。为了使细胞内达到足够的反义GDF-8或GDF-11分子浓度，优选的载体结构是其中的反义GDF-8或GDF-11核酸分子被置于强启动子如pol II或pol III启动子的控制之下。
在再一个实施方案中，本发明的反义GDF-8或GDF-11抑制剂包括α-异头核酸分子。α-异头核酸分子形成带有互补RNA的特定双链杂交体，与通常的β-单位相反，其中的链是相互平行排列(Gaultier等(1987)核酸研究，15：6625-6641)。该反义核酸分子还可以包含2′-o-甲基核糖核苷酸(Inoue等(1987)核酸研究，15：6131-6148)或嵌合的RNA-DNA类似物(Inoue等(1987)FEBS通讯，215：327-330)。
在特别优选的实施方案中，本发明的GDF-8和GDF-11抑制剂是含有在SEQ ID NOs：5-24中列举的205个核苷酸序列之一的反义寡核苷酸。III.测定其抑制作用的GDF-8或GDF-11测定法
可应用各种适当的测定对GDF-8或GDF-11活性抑制作用的测定法鉴定本发明的GDF-8或GDF-11抑制剂。优选地此抑制作用是特异性的。即GDF-8抑制剂可特异性地抑制GDF-8蛋白而不影响其它蛋白质的活性，GDF-11抑制剂可特异性地抑制GDF-11蛋白而不影响其它蛋白质的活性。在某些实施方案中GDF-8抑制剂也能够抑制GDF-11的活性，GDF-11抑制剂也能够抑制GDF-8的活性。
在此使用的名词“测定法”包括为鉴定GDF-8或GDF-11抑制剂而设计的任何检测法。这种测定法可以是适合于鉴定是否该GDF-8或GDF-11抑制剂影响例如下调GDF-8或GDF-11的一种或几种生物功能的体外或体内测定法。适合的测定法包括例如DNA复制测定法、基于转录的测定法、肌酸激酶测定法、基于3T3-L1前脂肪细胞分化的测定法、基于3T3-L1脂肪细胞中葡萄糖摄入控制的测定法以及免疫学测定法，所有这些方法都将在下面的小节II和随后的实施例中描述。用于鉴定GDF-8或GDF-11抑制剂的肌酸激酶生物测定法
GDF-8和GDF-11调节肌肉特异性酶肌酸激酶的蛋白质水平，因此调节它的活性。GDF-8或GDF-11的这种作用可用于筛选可能的GDF-8或GDF-11抑制剂。特别是可以在成肌细胞，如小鼠骨骼肌成肌细胞系CIC12或从11天的鸡胚中分离的鸡初始成肌细胞中实施肌酸激酶测定法。为了测定此抑制剂调节肌酸激酶活性的能力，通常在48孔培养板中培养细胞，其中含血清的培养基可保持细胞不分化。当已达到70％汇合时将培养基改变成1％血清，这样使细胞能够分化并能够表达肌酸激酶。在改变培养基时，对某些孔加入可能的GDF-8或GDF-11抑制性组分，某些时间之后加入GDF-8或GDF-11本身。将细胞返回培养箱中再培养2-3天的时间。最后使细胞裂解、使用可购买到的试剂盒(通过Sigms.St Louis，MO获得)测定细胞裂解中肌酸激酶的活性。基于3T3-L1前-脂肪细胞分化的测定法
GDF-8和GDF-11干扰3T3-L1前-脂肪细胞(成纤维细胞)分化成脂肪细胞的过程。GDF-8或GDF-11的这种作用可用于筛选可能的GDF-8或GDF-11抑制剂。特别是可以按如下方式实施本发明的生物测定。培养3T3-L1前-脂肪细胞使达到汇合，随后按如下步骤通过连续地取代它们的含血清DMEM培养基可实现分化：DMEM+血清+甲基异丁基黄嘌呤+地塞米松+胰岛素培养2天，DMEM+血清+胰岛素再培养2天，DMEM+血清再培养3天(Spiegelman等(1993)生物化学杂志，268，6823-6826)。可在分化开始时加入GDF-8和可能的抑制剂，并在每次再进行培养基改变时再加入一次。可通过各种途径测定脂肪细胞分化的程度，例如通过观察评估前-脂肪细胞中脂滴的含量，或者通过使用来自Sigma(St Louis，MO)三甘油酯(Gro-Trinder)试剂盒，按照厂商说明书定量测定细胞裂解液中甘油/三甘油酯的含量。基干3T3-L1脂肪细胞中葡萄糖摄入控制的测定法
GDF-8和GDF-11调节脂肪细胞中葡萄糖摄入的控制。GDF-8或GDF-11的这种作用可用于筛选可能的GDF-8或GDF-11抑制剂。特别是按照上面所述的方案可诱导3T3-L1前-脂肪细胞充分地分化。随后进行葡萄糖转运测定。简要地说，在分化之后将培养基改变成无血清DMEM，并用GDF-8或GDF-11抑制剂以及GDF-8或GDF-11处理细胞，持续从2小时至3天的不同时间。随之将细胞转移至低葡萄糖，无血清的DMEM培养基(无辅助因子和抑制剂)中4小时。然后用Ringer/Krebs液洗细胞2次，并对它们加入胰岛素(0.01-1μM)作用5-20分钟。洗去胰岛素2次，以在Ringer缓冲液中1μCi/ml的最后浓度加入氚标记(放射活性的)脱氧葡萄糖(NENDupont)。使葡萄糖摄取持续进行5-10分钟，然后用过量的Krebs液洗细胞，使细胞裂解，通过对细胞裂解液作闪烁计数测定放射活性葡萄糖的摄入量。DNA复制测定法
应用DNA复制测定法也可以测定本发明的GDF-8和GDF-11抑制剂。这种生物测定法是以细胞为基础的生长测定法，可以在对GDF-8或GDF-11敏感的任何细胞类型中进行。在这种类型的测定中，DNA复制，从而其增殖，通过使溴代-脱氧尿苷(BrdU)或氚化胸苷([3H]-TdR)标记掺入此DNA中可被精确地测定。可使用几种细胞系进行这种生物测定，包括但不局限于G8小鼠骨骼肌成肌细胞、C2C12小鼠成肌细胞和貂肺上皮细胞系、CCL-64以及它的突变体衍生物。
简要地说是用适合的培养条件在培养板内培养细胞。例如G8成肌细胞是在以0.1％明胶(Sigma)包被的96-孔培养板中培养，而CCL-64细胞是在未包被的培养板中培养。细胞以10×103个细胞/孔的密度在含有0.1％w/v BSA的无血清DMEM培养基中培养。第二天除去原培养基，以新鲜培养基代替。加入有关的抑制性组分，并将细胞返回培养箱培养60分钟，然后对它们加入生长因子(GDF-8、活化素等)。在另一实施方案中，可使抑制性组分与生长因子在室温下混合30分钟-2小时，便于抑制剂-配体相互作用，然后将此混合液施加于细胞上。对于G8成肌细胞，是在加入待测因子之后24小时加入适当的标记，并允许掺入过程再持续进行24小时。对于CCL-64细胞，是在加入待测因子12小时之后加入适当的标记，并允许掺入过程再持续进行4小时。当BrdU被用作标记时，使用购得的试剂盒(Boehringer-Mannheim)按照厂商的说明书手册最后固定和处理细胞。对掺入的BrdU作比色测定。当用[3H]-胸苷(NEN-Dupont)作标记时，用10％三氯乙酸洗细胞2次，用0.3N NaOH提取放射活性并通过闪烁计数测定。基于转录的测定法
在另一实施方案中，可在任何一种包括但不局限于G8成肌细胞、C2C12成肌细胞、CCL-64貂肺上皮细胞和A204人杆状肌肉瘤细胞的GDF-8或GDF-11敏感细胞系中，应用基于转录的测定法鉴定本发明的GDF-8或GDF-11抑制剂。
对GDF-8或GDF-11有应答的人工报导质粒可用于这种类型的测定。例如，在此测定法中可使用p3TP-Lux(例如在Wrana等(1992)细胞，71，1003-14中所描述的)和p(CAGA)12-MLP(例如在Dennler等(1998)EMBO杂志，17，3091-3100中所描述的)。不论在p3TP-Lux和在p(CAGA)12-MLP中，通过对TGF-β家族成员有应答的最小人工启动子都可驱动萤光素酶基因转录(因此驱动其活性)。因此，细胞裂解液中萤光素酶活性与所施加生长因子对细胞的刺激作用程度呈线性相关。
简要地说，用48孔培养板，在以10％胎牛血清、抗菌素和L-谷氨酰胺补充的适当培养基(例如对CCL-64用DMEM，对A204用McCoy氏培养基)中培养细胞。在达到80％细胞汇合时，按照厂商的说明书用FuGENE-6(Boehringer-Mannheim)转染细胞，以便促进质粒的摄入。用如下二种质粒的混合质粒瞬时转染细胞：监测转染效果的pSV-β-gal质粒和二种萤光素酶报导质粒中的一种。在与此转染作用剂共同温育过夜之后，用含有0.1％BSA的适当无血清培养基洗细胞2次。然后加入假定的抑制性因子，将细胞返回培养箱培养60分钟。在此培养结束时可加入如下因子：从表达GDF-8的CHO细胞条件化培养基中得到的重组人Myostatin/GDF-8，人TGF-β1(R&D Biosystems，Minneapolis)和来自表达活化素βA的CHO细胞的浓缩条件化培养基。
在另一实施方案中，在室温下将假定的抑制剂同GDF-8、GDF-11、或其它配体混合30分钟，然后将此混合物加在该接受细胞上。培育6小时后使细胞裂解，使用购自Tropix公司的双光萤光素酶测定试剂盒可在同一样品内测定萤光素酶和β-半乳糖苷酶活性。活性以相对萤光素酶单位(RLU)表示，即萤光素酶活性被校正为由在相同样品内测定的相应β-半乳糖苷酶活性给出的转染效率。基于蛋白质分泌的测定法
在另一实施方案中，可应用基于蛋白质分泌的测定法鉴定本发明的GDF-8或GDF-11抑制剂。简要地说，可将编码GDF-8或GDF-11抑制剂的构建体(例如优势的阴性突变体、半胱氨酸突变体、前-功能区变异体和翻译后修饰变异体)与产生野生型GDF-8或GDF-11的构建体一起导入或共导入肌肉细胞系如QM7和RD。随后可借助于例如蛋白质印迹分析法测定此共转染细胞产生和分泌成熟GDF-8或GDF-11的能力。然后可以挑选出抑制成熟GDF-8或GDF-11产生和/或分泌的GDF-8或GDF-11抑制剂。IV.GDF-8或GDF-11抑制剂的用途
另一方面，本发明提供了通过在此所述方法鉴定的GDF-8或GDF-11抑制剂，还有组合物如药剂组合物，以及应用这抑制剂的方法。通过在此所述方法鉴定的GDF-8或GDF-11抑制剂可被用于为治疗目的调节GDF-8或GDF-11的表达或其活性。在例证性实施方案中，使细胞与GDF-8或GDF-11抑制剂接触，这种抑制剂可调节与此细胞有关的一种或几种GDF-8或GDF-11蛋白质的活性。这种接触可以在体外实现(例如通过与GDF-8或GDF-11抑制剂一起共培养此细胞)，也可以在体内实现(例如对受试者给予GDF-8或GDF-11抑制剂)，或者在卵内实现(例如通过将GDF-8或GDF-11抑制剂注射进卵内)。应用例如下面文献的技术可如在此所述实现卵注射：H.Kocamis等(1998)家禽学，77，1913-1919；或P.A.Johnston等(1997)家禽学，76，165-178；C.E.Dean等(1993)生长、发育与衰老，57，59-72。
因此，本发明进一步提供了治疗受一些疾病或失调折磨的个体的方法，这种疾病或失调是以GDF-8或GDF-11蛋白或核酸分子的异常表达或异常活性为特征，例如与肌肉有关的疾病。在GDF-8或GDF-11被异常上调的情况下，和/或在降低GDF-8或GDF-11活性很可能具有有利作用的情况下，所希望的是抑制GDF-8或GDF-11活性。使用本发明的GDF-8或GDF-11抑制剂可治疗的病症包括例如与肌肉有关的病症如癌症、肌肉营养不良、脊髓损伤、损伤性伤害、充血阻塞性肺部疾病、AIDS或恶病质。此外，本发明的GDF-8或GDF-11抑制剂还可用于治疗肥胖及有关的失调，或者治疗与脂肪细胞异常增殖有关的失调。
在优选的实施方案中，本发明的GDF-8或GDF-11抑制剂被用于治疗糖尿病、肥胖和与肥胖有关的失调。例如，本发明的GDF-8或GDF-11抑制剂可用于调节受试者体内葡萄糖的转运，例如通过增加受试者体内葡萄糖转运体GLUT4的活性。
本发明的GDF-8或GDF-11抑制剂还可以进一步用于降低受试者体内GDF-8或GDF-11的活性。在此使用的名词“受试者”包括表达GDF-8或GDF-11的任何动物，优选的是哺乳动物。在优选的实施方案中受试者是脊椎动物。在更加优选的实施方案中，此脊椎动物是鸡、火鸡、猪、母牛、小鼠、大鼠、兔、山羊、鱼、或人。例如本发明的GDF-8或GDF-11抑制剂可用于增加受试者如鸡的肌肉容量。
可将本发明的GDF-8或GDF-11抑制剂掺入适合于给药的药剂组合物。这种组合物通常包含GDF-8或GDF-11抑制剂和药剂学允许的载体。在此使用的措辞“药剂学允许的载体”试图包括与药剂给药相适应的任何溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸水延缓剂等。这些基质和作用剂对药剂活性成分的用途是本领域熟知的。除去与GDF-8或GDF-11抑制剂不相容的任何常规基质或作用剂之外，仍打算将常规基质或作用剂用于该组合物。还可将补充的活性化合物掺入此组合物。
本发明的药剂组合物被配制成与其计划的给药途径相适应。给途径包括例如非经肠道给药如静脉内给药、皮内给药、皮下给药、口服(如吸入)给药、透皮(局部)给药、透粘膜给药和直肠给药。用于注射、皮内、或皮下给药的溶液或悬液可包括如下成分：无菌稀释剂如注射用水、生理盐溶液、不挥发油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它的合成溶剂；抗菌剂如苯甲酰基醇或甲基parabens；抗氧化剂如抗坏血酸或硫酸氢钠；螯合剂如乙二胺四乙酸；缓冲剂如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐，以及渗透调节剂如氯化钠或葡萄糖，pH可用酸或碱调节，如盐酸或氢氧化钠。注射剂可被封装在玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器、或多剂量药瓶内。
适合于注射使用的药剂组合物包括无菌的水溶液(当是水可溶性时)或水分散体，以及用于临时配制成无菌注射液或分散体的无菌粉末。用于静脉内给药的适合载体包括生理盐水、抑菌水、CremophorELTM(BASF，Parsippany，NJ)或磷酸缓冲盐水(PBS)。在所有情况下此组合物都必须是无菌的，并且应该是易于以可注射状态存在的流质。在生产和贮存条件下它必须是稳定的，并且必须防止微生物如细菌和真菌的污染作用。此载体可以是溶剂或分散介质，包括例如水、乙醇、多羟基化合物(甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)，以及它们的适合混合液。例如借助于如下方法可保持其适当的流动性：使用包衣如卵磷脂、在分散体的情况下保持所需的颗粒大小，以及使用表面活性剂。用各种抗菌剂和抗真菌剂可达到防止微生物作用的目的，例如对羟基苯甲酸酯类、三氯叔丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等。在很多情况下，最好是在组合物内包含等渗剂例如糖、多元醇如manitol、山梨醇、氯化钠。通过在组合物内包含延缓吸收剂如单硬脂酸铝和明胶可引起注射的组合物延长吸收时间。
通过将所需量GDF-8或GDF-11抑制剂在适当的溶剂内同上面列举的一种或几种组合成分相混合可制备成无菌注射液，需要时可作过滤除菌。分散体的制备通常是将GDF-8或GDF-11抑制剂掺入含有碱性分散基质和上面列举的其它所需成分的无菌赋形剂中。对于用于配制无菌注射液的无菌粉末剂，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，这样产生的粉末剂包含活性成分加来自其以前的无菌滤液中的任何所需添加成分。
口服组合物通常包含情性稀释剂或可食用的载体。可以将它们封装在明胶胶囊内或压制成片剂。为便于口服治疗给药的目的，可使GDF-8或GDF-11抑制剂同赋形剂混合，以片剂、锭剂或胶囊剂的形式使用。使用液体载体也可以制备口服组合物用作口内洗液，此时液体载体内的化合物被口服使用，漱口、被吐出或被吞咽。作为组合物的一部分还可包含药剂学相容的结合剂和/或佐剂材料。片剂、丸剂、胶囊剂、锭剂等可以包含任何如下成分或类似特性的化合物：结合剂如微晶纤维素、西黄蓍树脂或明胶；赋形剂如淀粉或乳糖；崩解剂如藻酸、Primogel或玉米淀粉；润滑剂如硬脂酸镁或Sterotes；助流剂如胶体二氧化硅；甜味剂如蔗糖或糖精；或者芳香剂如薄荷、甲基水扬酸酯或橙芳香剂。
为了通过吸入给药，可以通过气雾剂喷雾的形式给予这些化合物，可用装有适当推进剂如二氧化碳气体的压缩容器或分发器，或者喷雾器作气溶胶喷雾。
还可以通过透粘膜或透皮方式进行全身性给药。为了透过粘膜或透皮给药，这种制剂中使用了适于透过屏障的渗透剂。这种渗透剂是本领域通常所知的，包括例如用于透粘膜给药的除垢剂、胆汁盐和梭链孢酸衍生物。通过使用鼻喷雾剂或栓剂可实现透粘膜给药。为了透皮给药，是将活性化合物配制进本领域通常已知的软膏、油膏、凝胶或乳脂中。
GDF-8或GDF-11抑制剂还可被配制成用于直肠给药的栓剂形式(例如同常规的栓剂基质如红褐色黄油和其它的甘油酯一起配制)或滞留灌肠剂。
在一个实施方案中，将GDF-8或GDF-11抑制剂同防止该化合物从体内快速清除的载体配制在一起，形成例如受控的释放制剂，包括植入剂和微囊给药系统。可以使用可生物降解的生物相容性多聚体如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。制备这种制剂的方法是本领域技术人员熟知的。材料也可从Alza公司和Nova制药公司购得。还可以将脂质体悬液(包括带有针对病毒抗原单克隆抗体的靶定感染细胞的脂质体)用作药剂学允许的载体。可按照本领域技术人员已知的方法，例如美国专利No.4,522,811中所述的方法制备这种脂质体。
以剂量单位形式配制的口服或非经肠道的组合物，因为便于给药和剂量一致而特别优越。在此使用的剂量单位形式意指适宜对治疗对象作为单位剂量的物理分离单位，每一剂量单位含有与所需药物载体结合经计算将产生所希望治疗作用的预定量活性化合物。本发明剂量单位形式的规格由如下因素确定并直接取决于这些因素：活性化合物的独特特征和将要达到的特定治疗作用，以及配制这种活性化合物用于个体治疗在技术上的内在局限性。
借助于在培养细胞或实验动物进行的标准药剂学程序可确定这种化合物的毒性和治疗效果，例如测定LD50(导致50％群体死亡的剂量)和ED50(对50％群体治疗有效的剂量)。毒性作用和治疗作用之间的剂量比例是治疗指数，可表示为LD50/ED50的比率。优选的是表现出大治疗指数的GDF-8或GDF-11抑制剂。在可能使用表现出毒副作用的GDF-8或GDF-11抑制剂时，应该仔细设计一个使这种GDF-8或GDF-11抑制剂对准受损害组织部位的给药系统，以便使对未感染细胞的可能损伤减到最小，从而降低副作用。
可将从细胞培养测定和动物实验获得的数据用于配制人用的剂量范围。这类化合物的剂量优选地是位于包括带有少量毒性或不具毒性的ED50剂量的血液循环浓度范围之内。此剂量可以在此范围内变动，取决于采用的剂型和给药途径。对于在本发明方法中使用的任何GDF-8或GDF-11抑制剂，可根据细胞培养测定初步估算出治疗有效剂量。根据动物模型可配制此剂量，使之达到包括如在细胞培养中测定的IC50(即达到对症状半数最大抑制的待测GDF-8或GDF-11抑制剂的浓度)在内的血液循环血浆浓度范围。这种信息可用于更精确地确定对人的有效剂量。例如借助于高效液相层析可测定血浆浓度。
可将这种药剂组合物包装在容器、密封筒或分发器内，并附有给药说明书。
可以进一步将本发明的GDF-8和GDF-11抑制剂如核酶或反义抑制物插入载体中用于基因治疗。例如通过静脉内注射、局部给药(见美国专利5,328,470)或通过立体策略注射(stereotactic injection)(见例如Chen等(1994)美国国家科学院学报，91：3054-3057)，可将基因治疗载体对受试者给药。基因治疗的药物制剂可以包含在可接受稀释剂中的基因治疗载体，或者可以包含此基因投递赋形剂被包埋在其中的缓释基质。另一方面，在可从重组细胞完整地形成完全的基因投递载体如反转录病毒载体的情况下，此药物制剂可包含一种或几种形成该基因投递系统的细胞。
适合用于基因治疗的载体是本领域已知的。例如可使用腺病毒来源的载体。可以操纵腺病毒基因组以致使它编码并表达所需的基因产物，但是它在正常的病毒裂解生命生命周期内的复制能力被失活。参见例如Berkner等(1988)生物技术，6：616；Rosenfeld等(1991)科学，252：431-434；和Rosenfeld等(1992)细胞，68：143-155。来源于腺病毒Ad5型dl324株或其它腺病毒(如Ad2、Ad3、Ad7等)的适合腺病毒载体是本领域技术人员熟知的。在某些情况下当它们不能感染未分化细胞时使用重组腺病毒可能有利。而且此病毒颗粒比较稳定，经得起纯化和浓缩处理，并且如上面所述可被修饰以致于改变其感染范围。此外，导入的腺病毒DNA(和在此包含的外来DNA)不被整合进入宿主细胞的基因组而保持游离基因状态，从而避免在被导入的DNA被整合进入宿主基因组的情况下(例如反转录病毒DNA)由插入诱变而引发的可能问题。而且，相对于其它基因投递载体腺病毒基因组携带外来DNA的能力比较强(达到8千个碱基)(Berkner等同上；Haj-Ahmand和Graham(1986)病毒学杂志，57：267)。已使目前使用的并因此受本发明促进的大部分复制缺陷性腺病毒载体缺失了全部或部分病毒E1和E3基因，但是保存了多达80％的腺病毒遗传物质(见例如Jones等(1979)细胞，16：683；Berkner等同上；和Graham等，分子生物学方法，E.J.Murray编著(Humana，Clifton，NJ，1991)卷7，pp109-127)。包含在此核酸分子内的所需基因的表达可在如下启动子的控制之下：例如E1A启动子、主要晚期启动子(MLP)和结合前导序列，E3启动子，或者外源性加入的启动子序列。
还有一种可用于投递本发明GDF-8和GDF-11抑制剂的病毒载体系统是腺伴随病毒(AAV)。腺伴随病毒是天然存在的缺损病毒，为了有效地复制和增殖性生命周期需要另一种病毒如腺病毒或疱疹病毒作辅助病毒(综述见Muzyczka等，微生物学和免疫学的当前话题(1992)158：97-129)。腺伴随病毒表现出高出现率的稳定整合作用(见例如Flotte等(1992)美国呼吸细胞分子生物学杂志，7：349-356；Samulski等(1989)病毒学杂志，63：3822-3838；和McLaughlin等(1989)病毒学杂志，62：1963-1973)。包含少至300个碱基对的AAV载体可以被包裹并可以整合。外源DNA的空间被限制在大约4.5kb。可使用例如在Tratschin等(1985)分子细胞生物学，5：3251-3260中所述的AAV载体将DNA导入T细胞中。使用AAV载体已将多种核酸导入不同类型的细胞内(见例如Hermonat等(1984)美国国家科学院学报，81：6466-6470；Tratschin等(1985)分子细胞生物学，4：2072-2081；Wondisford等(1988)分子内分泌学，2：32-39；Tratschin等(1984)病毒学杂志，51：611-619；和Flotte等(1993)生物化学杂志，268：3781-3790)。可用于投递本发明GDF-8和GDF-11抑制剂的其它病毒载体系统来源于疱疹病毒、痘苗病毒和几种RNA病毒。
本发明的GDF-8和GDF-11抑制剂可被进一步用于产生转基因动物，其中的GDF-8和GDF-11抑制剂干扰GDF-8或GDF-11的加工、分泌和/或它的生物学活性。在此使用的“转基因动物”是非人类动物，优选的是哺乳动物，更优选的是啮齿动物如大鼠或小鼠，其中动物的一种或几种细胞包含有转基因。转基因动物的其它例子包括非人类灵长动物、绵羊、犬、母牛、山羊、鸡、火鸡、两栖动物和鱼等。转基因是被整合进入一种细胞基因组的外源性DNA，从这种细胞可发育形成转基因动物，并且转基因保留在此成熟动物的基因组内，从而在转基因动物的一种或几种类型细胞或组织内定向表达所编码的基因产物。
通过将编码GDF-8或GDF-11抑制剂的核酸或者编码GDF-8或GDF-11的核酸导入已受精卵母细胞的雄性原核，例如通过显微注射、反转录病毒感染、以及使此卵母细胞能够在假妊娠的雌性养育动物体内发育可产生转基因动物。为了增加转基因的表达效率在此转基因中还可以包含内含子序列和聚腺苷酸化信号序列。可将组织特异性调节序列有效地连接于GDF-8或GDF-11转基因，以便将GDF-8或GDF-11抑制剂的表达定向于特定的细胞。通过胚胎操作和显微注射产生转基因动物特别是例如小鼠的方法已成为本领域的常规技术，已被描述在如下文献中：例如Leder等的美国专利No.4,736,866和4,870,009；Wagner等的美国专利No.4,873,191以及Hogan B.操作小鼠胚胎(冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，1986)。类似的方法被用于产生其它的转基因动物。根据它基因组内存在GDF-8或GDF-11抑制剂转基因，以及/或者在该动物的组织或细胞内GDF-8或GDF-11抑制剂mRNA的表达可鉴定转基因初始动物。然后可用转基因初始动物生育另外的携带此转基因的动物，而且携带编码GDF-8或GDF-11抑制剂转基因的转基因动物可以进一步与携带其它转基因的其它转基因动物配种。
按照例如在WilmutI等(1997)自然，385：810-813，以及PCT国际专利申请号WO97/07668和WO97/07669中描述的方法还可以产生GDF-8或GDF-11抑制剂转基因动物的克隆。简单地说，可分离出来自该转基因动物的一种细胞如体细胞，并可诱导它退出生长周期而进入Go期。然后可通过例如使用电脉冲使这种静止细胞与来自从其中分离出静止细胞的同种动物的去核卵母细胞融合。培养此重建的卵母细胞使其发育至桑椹期或胚细胞，然后转移至假妊娠的雌性养育动物。产自这种雌性养育动物的后代将是从其中分离出细胞如体细胞动物的克隆。
在优选的实施方案中，可选择GDF-8或GDF-11抑制剂转基因动物，致使GDF-8或GDF-11功能仅部分地被抑制。
将通过如下不应被看作是限制的实施例对本发明作进一步说明。此整篇专利申请所引用的所有参考文献、专利和已公布专利申请的全部内容以及序列表和图表在此均被引入作为参考。
                         实施例材料和方法
首先说明用于如下实施例的材料和方法。1.非还原性SDS-PAGE和电印迹分析
采用Novex NuPAGE方案(Novex)。从样品和层析缓冲剂中除去了还原剂。2.凝胶洗脱
采用BioRad小型凝胶洗脱器方案。带有洗脱缓冲液(25mM Tris，pH8.3和6M尿素)。3.丙酮沉淀作用
为了成功地进行胰蛋白酶消化除去过量的SDS是必要的。因此对含有SDS的样品加入冰冷的丙酮，达到最后v/v20％的浓度。在低于-20℃静置此溶液20分钟。然后通过以最大转速(13000×g)在4℃离心15分钟回收无SDS的蛋白质。取出上清液而不搅动沉淀。直到借助于SDS-PAGE已证实沉淀中存在蛋白质之前不要丢弃此溶液。通常可达到高百分率的回收(每次操作＞90％)，但在某些情况下，此方法所需的最佳丙酮浓度可以是蛋白质依赖性的，应该仔细地监测。4.增溶溶解无SDS的蛋白质
使无SDS蛋白质样品空气干燥几分钟，以便蒸发大部分丙酮(切勿使沉淀干透)。为了溶解此样品对此湿沉淀加入固体尿素或者10M尿素溶液。由于在随后的胰蛋白酶消化中大重稀释，因此被用于增溶溶解的容量保持在最小体积(＜5μl)以避免丢失样品中的蛋白质。5.胰蛋白酶消化
对样品加入足够量的消化缓冲液(100mM碳酸氢铵，pH7.8-8，不需校准pH)(尿素的最后浓度应保持低于0.1M)。在按w/w1(酶)∶20(底物)的比例加入胰蛋白酶(以溶于1mM HCl中的1μg/ml浓度)之后，37℃温育开始消化。温育过夜(12-16小时)之后，加入PMSF(在乙醇中配制的贮备液)至最后浓度1mM终止反应。6.高分辨率肽分离
将PMSF处理的胰蛋白酶消化样品液分为二等份，然后应用下述条件对它们进行HPLC分离。一份用还原剂(最后浓度50mM的TCEP)处理，另一份不处理(加入水校正体积)。在60℃温育此样品30分钟，然后用10％TFA酸化。在采用另一种样品处理法的情况下也应当考虑由于聚集作用片段丢失的可能性。例如可对PMSF处理的胰蛋白酶消化样品液加入固体盐酸胍成最后浓度4M。随后可采用上面所述的方案。层析柱：C18RP柱(2.1×250mm)。溶剂：A：水中配制的0.1％TFA，B：在80％乙腈中配制的0.1％TFA。流速：0.2ml/分钟。梯度：在60-90分钟内由0％B至100％B。检测：215nm
为了获得对于含二硫化物峰的最大分辨率必须使梯度最优化。7.第二次消化
蛋白酶的选择作用是高度序列依赖性的。当靶标序列未知时，可按照本领域熟知的方法使用适当的蛋白酶(比胰蛋白酶较少特异性)，例如嗜热菌蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶或任何其它可购买到的蛋白酶。因为这些蛋白酶的靶标底物十分广泛并且非特异性，所以它们通常可以切割胰蛋白酶消化片段，产生更小的片段。也可使用比所述那些蛋白酶具有较强特异性的蛋白酶以便产生较大的片段。优选地应用类似于在上面第5小节所述的胰蛋白酶消化程序进行第二次消化，区别仅在于缓冲液和pH水平不同。8.抑制剂去糖基化
为了溶解该无-SDS样品(5-10μg)，可按2-3μl的小增加量同时加入最小量的氢化Triton X-100和50mM碳酸氢铵缓冲液(pH7.8-8.0)。最后体积应该少于30μl，并且此去垢剂的浓度应该在0.5％以下(为了防止酶变性)。然后对此反应混合物加入1单位肽N-糖苷酶F(PNGase F)。将此样品在37℃温育16小时然后用10％TFA酸化。通过C4 RPHPLC进一步纯化此去糖基化蛋白，并用适当的生物测定法监测其任何抑制活性。还可以使用N-糖苷酶F去糖基化试剂盒(Boehringer-Mannheim)进行去糖基化。9.定位诱变和载体构建
应用重叠PCR技术产生了编码带有被取代切割位点(RSRR)蛋白质的突变GDF-8cDNA。一对掺入切割位点(RSSR至NAQT)突变的重叠内引物被用于在第一个PCR循环中扩增小鼠GDF-8 cDNA的5′和3′末端。然后合并PCR产物用作模板，以外引物产生被称为优势阴性突变体(Mut-GDF-8)的全长度突变GDF-8cDNA。此PCR片段被连接进入PCR2.1载体(Invitrogen)并测序证实突变的掺入。然后将编码Mut-GDF-8的cDNA插入FLAG-CMV-5a载体(Sigma)产生在3′端带有FLAG表位的框内融合。FLAG表位可被用于检测和纯化未加工的GDF-8蛋白。此载体含有巨细胞病毒启动子序列，此启动子序列可导致真核细胞内高水平的表达。
通过相同的方法产生了含有GDF-8前-功能区的表达质粒。借助于基于PCR的诱变产生了编码GDF-8-前功能区(残基1-266)(在此被称为“前-GDF-8”)的部分小鼠cDNA。天冬氨酸Asp-267密码子(GAT)被改变成终止密码子(TGA)。将形成的cDNA连接进入PCR2.1载体，测序并如上所述被插入FLAG-CMV-5a中。野生型(WT)小鼠GDF-8 cDNA也被亚克隆进入相同的载体，产生了全长度前体蛋白。形成的构建体被称为WTGDF-8。10.转染、聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹分析
使用FuGene试剂(Boehringer Mannheim)通过瞬时转染将此表达构建物导入QM7鹌鹑成肌细胞中。先在60mm平皿上铺板培养细胞24小时然后转染，转染时细胞达到70-80％汇合。通过含有β-半乳糖苷酶的报导构建物的监测，转染的效率是大约70-80％。转染的细胞保持在Opti-MEM培养基(Gibco-Life Sciences)内，转染后48小时收集条件化培养基，在Centricon柱(Amicon)内浓缩大约50倍。借助于SDS-PAGE和以抗-FLAG M2特异性抗体(Sigma)进行免疫印迹分析证实QM-7细胞内表达了多种形式的重组GDF-8蛋白。用化学发光技术按照厂商的说明书(ECL，Amersham)检测与抗-FLAG抗体有反应活性的蛋白质。11.蛋白质纯化
使用偶联于定向针对FLAG表位的特异性单克隆抗体(Sigma)的亲和性凝胶，按照厂商说明书应用亲和层析法纯化来自QM-7细胞条件化培养基的WT-GDF-8-FLAG，WutGDF-8-FLAG，和Pro-GDF-8-FLAG。用0.1M甘氨酸(pH3.5)洗脱被结合的蛋白质并在银染色的SDS-PAGE凝胶(Novex)中作定量测定。12.代谢标记和免疫沉淀
被转染的QM-7细胞在Opti-MEM培养基中保存48小时，然后在含有200pCi/ml[35S]半胱氨酸(Amersham)的无半胱氨酸DMEM中标记3小时。洗细胞2次，在Opti-MEM培养基中温育指定的时间。然后收集条件化培养基，细胞在500μl裂解缓冲液(10mM Tris-HCl[pH7.5]，150mM NaCl，5mM EDTA，1％SDS，0.25％脱氧胆酸盐，0.25％NP-40，蛋白酶抑制剂混合物[BoehringerMannheim])中裂解，并离心10分钟。为了进行免疫沉淀，将1ml条件化培养基或者250μl细胞裂解液(用10mM Tris-HCl[pH7.5]，150mM NaCl，5mM  EDTA作1∶2稀释)在4℃与抗-FLAG M2亲和凝胶(Sigma)共温育过夜。将沉淀再混悬于含有2％巯基乙醇的2×Laemmli装填缓冲液中，40℃加热10分钟，然后在14％SDS-PAGE凝胶中电泳。用Amplify(Amersham)渗透凝胶，干燥后在-70℃对Kodak胶片暴光。13.鉴定GDF-8-抑制活性/基于转录的测定法
这种类型的生物测定是以转录为基础，在二个不同的细胞系进行。用A204人杆状肌肉瘤细胞监测抑制效果，因为它们对Myostatin高度敏感。为了进一步鉴定此抑制作用的特异性，既使用了A204细胞，又使用了已充分了解其特征的貂肺上皮细胞系CCL-64。CCL-64比A204有二方面优势：第一，与A204细胞不同CCL-64对TGF-β敏感，第二，多年来CCL-64细胞已被用作阐明TGF-β超家族成员作用分子机理的模型细胞系。此测定法中使用了人工的报导质粒p(CAGA)12-MLP(Dennler等(1998)EMBO杂志，17，3019-3100中描述的)。由被TGF-β家族成员诱导的最小人工启动子驱动萤光素酶基因转录，从而诱发萤光素酶活性。因此，细胞裂解液中萤光素酶活性与施加的生长因子对细胞的刺激强度线性相关。
用48孔培养板，在补充了10％胎牛血清、抗菌素和L-谷氨酰胺的它们各自的培养基(CCL64是DMEM，A204是McCoy氏培养基)中培养这二种细胞。达到80％汇合时按照厂商的说明书用促进质粒摄入的FuGENE-6(Boehringer-Mannheim)转染细胞。用二种质粒，监测转染效果的pSV-β-gal质粒和萤光素酶报导质粒的混合质粒瞬时转染细胞。在Dennler等(1998)同上中描述了报导质粒p(CAGA)12-MLP。与转染试剂共温育过夜之后，用含有0.1％BSA的适当无血清培养基洗细胞2次。然后加入抑制性组分，并将细胞在培养箱内再培养60分钟。培养结束时对细胞加入如下因子：从表达Myostatin的CHO细胞条件化培养基得到的重组人Myostatin，人TGF-β，以及从表达活化素的CHO细胞得到的浓缩条件化培养基。培育6小时后使细胞裂解，使用双光萤光素酶测定试剂盒(Tropix公司)对同一样品测定萤光素酶活性和β-半乳糖苷酶活性。以相对萤光素酶单位(RLU)表示酶活性，即萤光素酶活性被校正为转染效率，由在同一样品中测定的相应β-半乳糖苷酶活性值给出。
为了化学还原此抑制剂样品，加入过量的50mM Na2PO4，pH7.0使样品稀释，对此溶液加入尿素和三(2-羧乙基)氢氯化膦(TCEP)分别达到最后浓度6M和10mM，然后在37℃温育此溶液30分钟。为了终止反应加入碘乙酰胺至最后浓度10mM，并在室温下温育此溶液30分钟。然后用10％TFA酸化此样品，并将其缓冲液更换成0.1％TFA。实施例1：组分A和B的产生和纯化
应用相同的纯化方案分别得到了组分A和组分B，各来自独立批次的CHO条件化培养基。从以表达质粒G8P-1/0.1稳定转染的CHO细胞收集条件化培养基，此表达质粒含有编码人GDF-8的插入片段。CHO细胞被培养在以0.1M氨甲喋呤和1mg/ml G418(Geneticin，GIBCO-生命科学公司)补充的α-培养基中。
为了得到组分A和B，使CHO-条件化培养基通过三种不同的HPLC柱。第一种柱是离子交换柱(HQ，从Pharmacia获得)，其中培养基成分的一个组分与径流有关。图1显示在230nm测定的代表性层析图谱。宽平峰表示HQ径流，尖锐峰显示结合物质。随后用6N HCl调整HQ径流的pH至pH5.0，这样使HQ径流物质中的某些成分能够结合于SP离子交换柱(Pharmacia)。应用微小的梯度，收集在6-9分钟洗脱的SP-结合物质，从一批次CHO条件化培养基中得到组分A，收集在14-19分钟洗脱的SP-结合物质，从另一批次CHO条件化培养基中得到组分B。用于组分A和B的梯度和在215nm测定的层析图谱分别显示在图2和3中。用20mM pH5.0的磷酸钠使在上述时间洗脱的SP物质脱盐。然后应用微小的乙腈梯度将每种SP物质注入C4柱。收集C4组分，应用快速真空干燥除去乙腈。用于产生组分A(在21-23分钟洗脱的)和B(在27分钟洗脱的)的C4层析过程的梯度和在215nm测定的层析图谱分别显示在图4和5中。C4组分被保存在0.1％三氟乙酸(TFA)中，如下面所述测定其GDF-8抑制活性。
为了使样品变性，加入尿素至最后浓度6M，并在70℃温育样品10分钟，随后在冰上冷却。为了还原组分A和B，通过加入过量的pH7.050mM的磷酸钠稀释组分A和B中的TFA。对此溶液加入尿素和三(2-羧乙基)氢氯化膦(TCEP)分别达到2M和10mM的最后浓度。在37℃温育此溶液30分钟。为了终止反应，加入碘乙酰胺至最后浓度10mM，并在室温温育此溶液30分钟。然后用10％TFA酸化此样品，并将其缓冲液更换成0.1％TFA。收集来自单独的空白C4层析过程(未加入蛋白样品)，在22.5或27分钟洗脱的样品，与组分A和B一道平行处理，以便在生物测定中用作适合的缓冲液对照。实施例2：鉴定组分A和B的GDF-8抑制活性
为了测定从最初的CHO-条件化培养基获得的C4组分抑制性潜在能力，建立了二种不同类型的生物测定法。DNA复制测定法
第一种生物测定法是用G8小鼠骨骼肌成肌细胞和貂肺上皮细胞系CCL-64进行的生长测定法。在这种类型的测定法，通过将溴-脱氧-尿苷(BrdU)或氚化胸苷标记掺入DNA可精确地测定DNA复制，并因此精确地测定DNA的增殖。
简要地说，用以0.1％明胶(Sigma)包被96孔培养板培养G8成肌细胞，而以来包被的培养板培养CCL-64细胞。在培养板内将这二种类型细胞以10×103个细胞/孔在含有0.1％w/v BSA的无血清DMEM中培养。第二天除去培养基，更换新鲜的培养基。加入相关的抑制组分，将细胞返回孵箱内培养60分钟，然后对它们施加生长因子。在加入测试因子之后24小时对G8成肌细胞加入以1∶1000最后稀释的BrdU标记(Boehringer-Mannheim)，允许掺入过程再进行24小时。然后使用购得的试剂盒(Boehringer-Mannheim)按照厂商的说明书手册固定和处理G8成肌细胞。比色测定掺入的BrdU。加入待测因子之后12小时对CCL-64上皮细胞加入[3H]-胸苷(NEN-Dupont)共作用4小时。用10％三氯乙酸洗CCL-64细胞2次，用0.3N NaOH提取放射活性并通过闪烁计数测定。基于转录的测定法
第二种类型的生物测定法是以转录为基础并在二种不同的细胞系进行。A204人杆状肌肉瘤细胞被用于监测抑制作用的效果，因为它们对GDF-8特别敏感。为了进一步鉴定抑制作用的特异性，使用了A204细胞和已充分鉴定的貂肺上皮细胞系CCL-64二种细胞。CCL-64在二方面优于A204：第一，不同于A204细胞，CCL-64对TGF-β敏感，第二，多年来CCL-64细胞已被用作阐明TGF-β超家族成员作用分子机理的模型细胞系。此测定法中使用了二种人工报导质粒：p3TP-Lux(Wrana等(1992)细胞，7，1003-14)和p(CAGA)12-MLP(Dennler等(1998)EMBO杂志，17，3091-3100)。在这二种质粒中，是通过对TGF-β家族成员敏感的人工最小启动子驱动萤光素酶基因转录(并且因此驱动其活性)。因此，细胞裂解液中萤光素酶的活性与所施加生长因子对细胞刺激的程度线性相关。
简要地说，用48孔培养板，在补充了10％胎牛血清、抗菌素和L-谷氨酰胺的它们各自的培养基(对CCL-64是DMEM，对A204是McCoy氏培养基)中培养这二种细胞。达到80％汇合时按照厂商的说明书用促进质粒摄入的FuGENE-6(Boehringer-Mannheim)转染细胞。用二种质粒，监测转染效果的pSV-β-gal质粒(Promega)和二种萤光素酶报导质粒中的一种的混合质粒瞬时转染细胞。第一个报导质粒p3TP-lux被描述在Wrana等1992同上中，第二个报导质粒p(CAGA)12-MLP在Dennler等1998同上中有详细描述。在与转染试剂共温育过夜之后，用含有0.1％BSA的适当无血清培养基洗细胞2次。然后加入抑制性组分，细胞返回培养箱温育60分钟。温育结束时对细胞加入如下因子：表达人重组GDF-8的CHO细胞条件化培养基，人TGF-β1(R&D Biosystems，Minneapolis)以及来自表达活化素βA的CHO细胞(剑桥大学遗传研究所，MA)的浓缩条件化培养基。来自模拟转染细胞的培养基缺乏活性。
温育6小时后裂解细胞，使用来自Tropix公司的双光萤光素酶测定试剂盒在同一样品内测定萤光素酶和β-半乳糖苷酶活性。酶活性以相对萤光素酶单位(RLU)表示，即萤光素酶活性被校正为转染效率，由在同一样品中测定的相应β-半乳糖苷酶活性值表示。组分A(在22.5分钟洗脱的C4柱组分)的抑制作用I.对G8成肌细胞和CCL-64貂肺上皮细胞增殖的作用
如通过测定BrdU标记掺入DNA增加表明GDF-8本身在100ng/ml提高G8成肌细胞增殖6倍(图6)。用于再混悬来自C4柱组分的缓冲液赋形剂在此测定法对其本身缺乏活性，并且基本上不影响100mg/ml GDF-8的作用(图6A)。
在从C4柱获得的不同组分中鉴定出在22.5分钟洗脱的生物活性峰，被称为组分A。组分A本身对G8成肌细胞增殖没有作用。但是它能够几乎完全消除GDF-8对细胞增殖的阳性作用(图6A)。当使用氚化胸苷而不是BrdU作标记时，以及对另一类型细胞，CCL-64细胞测定GDF-8和组分A的作用时，观察到组分A类似的GDF-8抑制作用(图6B)。与它对肌源性细胞系的作用不同，GDF-8对CCL-64上皮细胞系抑制细胞增殖，此作用与TGF-β的作用相同。当在加入GDF-8之前先用过量(重量/重量)组分A预处理CCL-64细胞60分钟，GDF-8的这种生长抑制作用被反转(图6B)。总之，不管细胞系、GDF-8增殖作用的类型(阳性或阴性)、以及测定细胞增殖的方法，与GDF-8相比较组分A都一致地显示出明确的抑制活性。II.对来源于最小启动子的转录的作用/对变性和还原作用的敏感性/作用的特异性
如在图7A中显示的，与组分A共同预温育1小时，消除了3ng/ml或10ng/ml GDF-8对A204杆状肌肉瘤细胞中p(CAGA)12-MLP萤光素基因转录的作用。使用第二种单独的报导质粒p3TP-Lux在相同的细胞也观察到这种作用。
不管使用哪种报导质粒，用二种不同的还原剂DTT和TCFP/碘乙酰胺不影响组分A的抑制性潜能，表明此组分中的活性部分对强还原剂不敏感(图7A)。通过显示例如这些条件可以消除另一个还原敏感性组分组分B的活性(见图9)，独立地支持了它们确实能够影响还原作用的事实。
通过加热处理(100℃10分钟，然后迅速冰上冷却)或者通过6M尿素和加热处理使组分A变性都不影响它的抑制活性(图7B)。
使用报导质粒p(CAGA)12-MLP在CCL-64细胞内寻找此特异性的来源。比较了组分A对TGF-β家族三个不同成员的作用：TGF-β本身，GDF-8和活化素。
如在图8中显示的，组分A(或它的溶媒)本身既不调节基础(背景)萤光素酶活性，也不明显可察觉地改变TGF-β或活化素的作用。相反，它还对GDF-8显示出强抑制活性。这个证据表明，组分A可以明确地区分同样具有显著程度同源性(在氨基酸水平约40％相同)的结构相关因子。组分B(在27分钟洗脱的C4柱组分)的抑制作用I.组分B对来源于最小启动子的转录的作用/对变性和还原的敏感性/作用的特异性
从加工单独批次CHO条件化培养基还鉴定出第二个独立产生的抑制性组分。此新型抑制组分在C4柱中具有27分钟的保留时间。在与组分A相同的条件下用基于转录的生物测定法测定了此组分。类似于组分A，组分B也能够功能性地抑制A204杆状肌肉瘤细胞中GDF-8对萤光素酶活性的作用(图9)。
进一步分析表明，类似于组分A的活性，组分B中的抑制活性对强变性条件(6M尿素和加热)不敏感。但是与组分A不同，TCEP还原组分B样品消除了它的抑制活性(图9)。
为了测定此新型C4组分的特异性，在CCL-64细胞，用报导质粒质p(CAGA)12-MLP进行了一系列补充实验。所得到的结果表明，在能够特异性地抑制GDF-8作用方面组分B与组分A相似，也同时保留TGF-β或活化素的活性不受影响(图10)。实施例3：组分A和B的生物化学特征
作为为了较好地了解组分A和B组合物努力的一部分，在还原和非还原条件下对组分A和B进行了银染色。前面叙述了用于还原组分A的方法。溶液中的组分A不论在还原状态或非还原状态都包含有几种成分，重量范围从非常低(与染料前沿共迁移的)至200kDa。但是当样品被还原时出现了一些低分子量的新电泳带，而某些高分子量的电泳带消失了。
使用Novex提供的方法和还原剂还原了组分B。结果显示在非还原状态的组分B中存在2种主要成分和几种次要成分。在还原状态，出现了一条12kDa左右的新带，使总共具有3种主要成分还同时存在几种次要成分。实施例4：对组分A和B中GDF-8抑制剂的鉴定和特征描述
可按如下实施鉴定和描述组分A和B中抑制剂特征的四步骤方案：I.鉴定组分A和B中抑制GDF-8活性的成分
组分A和B中存在几种不同的成分。因此有必要进一步加工这些组分成为单独的成分，以便明确地鉴定抑制GDF-8的活性部分(例如成分)。可按照下面实施例5中所述，通过进行制备性非还原SDS-PAGE和通过随后以电洗脱回收分离的成分实施这种加工。然后可应用在此所述的生物测定法鉴定具有GDF-8抑制活性的成分。
在成功地鉴定了一种或几种GDF-8抑制成分之后，可如下面实施例5中所述进一步研究这些成分的特异性。例如，包括在此研究中的几种与GDF-8具有结构和生物活性类似的分子如活化素、BMPs和TGF-β，可被用于测定GDF-8特异性抑制活性。可测定纯化的GDF-8抑制剂具有以剂量依赖性和GDF-8特异性方式拮抗GDF-8作用的能力。II.对GDF-8抑制剂的特征鉴定
如在下面实施例5中所述，可通过一次或几次N-末端测序列和质谱分析的联合测定对此抑制剂作特征鉴定。对于N-末端测定分析至少可对非还原性SDS-PAGE加样10-15μg二种组分之一，然后电泳分离蛋白质并电印迹在PVDF膜上。以考马斯兰染色之后，切取与此抑制剂相对应的蛋白质泳带用于测序分析。每次测序循环观察到的残基数目与样品中不同成分的数目直接相对应，在每次测序循环属于不同信号的强度比被用于估算各种不同成分的比例。
借助于在不存在和存在还原剂时作电喷雾/离子化/质谱分析(ESI/MS)可确定该抑制剂的精确分子量和它的组成成分。质谱分析信息与根据已知初始序列计算的预测分子量相结合可被用于二个目的：第一证实或限定了通过N-末端测序分析得到的该抑制剂的组成，第二评价与该抑制剂可能被C-末端截短、内部切割或翻译后修饰有关的完整性，N-末端测序分析不能对此提供回答。III.鉴定GDF-8抑制剂的二硫键分布特征
鉴定二硫键分布特征的实验特别适合于鉴定具有对还原作用敏感的抑制活性的组分如组分B，并因此可鉴定它含有二硫键。对二硫键的成功鉴定取决于样品制备和高分辨率肽序列作图的一致性。通过对三(2-羧乙基)膦(TCEP)处理(还原)的样品和非TCEP处理的样品比较HPLC层析图谱可鉴别含有二硫键的片段。
除去层析图谱的初始区(非保留物)之外，对TCEP处理的样品层析图谱中消失的峰暗示为含二硫键的片段。借助于N-末端测序以及基质促进的激光解吸附/离子化和飞行时间(time-of-flight)质谱(MALDI-TOF/MS)分析二种方法可分析来自非TCEP处理样品中的相应组分。在有单一二硫键存在的情况下，每个测序循环可证明带有相似信号强度的二个氨基酸残基。
对抑制性组分A和B的初步特征鉴定，以及它们存在于GDF-8表达性CHO细胞的条件化培养基中，都与它们是GDF-8相关的(即含有抑制GDF-8活性的GDF-8肽)观点相符合。如果这点得到上述测序结果的支持，那末通过同已知的GDF-8初始序列相比较，就容易确定GDF-8序列中二硫键连接肽的同一性，更重要的是确定二硫键的位置。MALDI-TOF/MS分析主要是用于此确证的目的。
在涉及多个序列或者多个二硫键的情况下，为了产生可分析的片段需要用蛋白酶(蛋白酶的选择完全是序列依赖性的)作第二次消化。然后可以如在上面材料和方法部分所述进行肽序列作图的另一步骤。IV.对GDF-8抑制剂翻译后修饰的鉴定
哺乳动物蛋白质修饰的最普遍形式之一是糖基化，在某些情况下糖基化随后可影响此蛋白质的生物活性。因此，重要的是研究GDF-8抑制性肽的糖基化是否修饰此肽的抑制活性。
为此目的，可以如在上面材料和方法部分所述的以及在如下实施例中所说明的，使此抑制性物质去糖基化。借助于在此所述的对GDF-8抑制作用的生物测定法，可以证实或者排除结构(糖基化)和功能活性(抑制作用)之间的相关性。实施例5：对组分B中GDF-8抑制剂的鉴定和特征描述
通过进行制备性非还原SDS-聚丙烯酰胺(SDS-Page)凝胶电泳并通过电洗脱作成分分离，确定了组分B中导致对GDF-8抑制的单独成分。已确定一种具有大约36kDa分子量的肽引起对GDF-8的抑制作用。还如下面所述显示了其GDF-8抑制作用的特异性。
鉴定此抑制剂特征的第一步是通过电喷雾/离子化质谱分析确定其精确的分子量。其质谱图显示出被具有29472.0Da分子质量主要成分的600Da分隔的三个峰(M-Scan公司)(图23)。质谱分析和SDS-Page分析之间分子量的差异可归因于凝胶和分子量标示物。
下一步是通过以5个循环的脉冲相N-末端测序(测定头5个氨基酸)确定该抑制剂的氨基酸序列。表1显示出被检测的主要和次要氨基酸，存在的主要氨基酸多于90％。序列(NENSE)(SEQ ID NO：26)相当于在GDF-8前-功能区发现的序列。
表I
  循环号 被检测的主要PTH氨基酸 被检测的次要PTH氨基酸
    1     Asn       ---------
    2     Glu     Pro，Ala，Phe
    3     Asn     Gln，Val，Lys
    4     Ser     Asp，Lys
    5     Glu     Leu
再下一步是确定被称为“前-GDF-8”的来自组分B(即GDF-8的前-功能区)的抑制剂是否受翻译后修饰的影响。对于哺乳动物蛋白质最普遍的修饰形式是糖基化。在GDF-8的前-功能区仅有一个供糖基化的天冬酰胺。为了确定保持GDF-8前功能区的抑制活性是否需要天冬酰胺的糖基化，使用N-糖苷酶F去糖基化试剂盒(Boehringer-Mannheim)将来自组分B的前-GDF-8抑制剂去糖基化。使此去糖基化的蛋白质通过C4柱除去酶、变性剂和盐。应用基于转录的生物测定法(用(CAGA)12-MLP构建体)测定糖基化和去糖基化蛋白质的抑制活性。结果表明，为了抑制GDF-8，GDF-8前-功能区必须被糖基化。
上述所有的研究证明，从组分B分离出的GDF-8肽抑制剂是糖基化形式的GDF-8整个前功能区，并且糖基化(例如在可以糖基化此肽的细胞内产生此肽)对于抑制活性是必需的。应用DNA复制测定法鉴定组分A抑制剂的特征
如在图6A中所显示的，通过测定BrdU标记增加掺入DNA表明的100ng/ml GDF-8本身促进G8成肌细胞增殖增加6倍。在此测定中用于再混悬前-GDF-8的溶媒缓冲液没有活性，并且基本上不影响100ng/ml GDF-8的作用。但是前-GDF-8能够几乎完全抵消GDF-8对细胞增殖的阳性作用。
当使用氚化胸苷代替BrdU作标记，并且是在另一细胞类型CCL-64细胞进行测定时观察到前-GDF-8类似的GDF-8抑制作用(图6B)。与它对成肌细胞系的作用不同，GDF-8抑制CCL-64上皮细胞系细胞增殖，这是一种与TGF-β的作用相同的作用。当用重量/重量6倍过量的前-GDF-8预先处理CCL-64细胞60分钟，然后加入成熟的GDF-8蛋白时，GDF-8的这种生长抑制作用被逆转(图6B)。
总之，无论用哪种细胞系，无论GDF-8对增殖的作用是哪种类型(阳性或阴性)，以及无论用于测定DNA复制的标记是哪种，这种改进的生长测定法都能精确地反映GDF-8的活性，因此可被用于测定GDF-8拮抗剂如前-GDF-8的GDF-8抑制性潜能。应用基于转录的测定法鉴定GDF-8抑制剂(组分B)的特征
如图7A所示，报导基因构建体p(CAGA)12-MLP以剂量依赖性方式对GDF-应答，具有早在施加此生长因子后6小时就可检测的基本诱导作用。但是以GDF-8的前功能区预处理细胞1小时，消除了A204杆状肌肉瘤细胞中3ng/ml或10ng/ml成熟的GDF-8对p(CAGA)12-MLP萤光素酶基因转录的作用(图25)。使用第二个独立的报导质粒p3TP-Lux在相同的细胞也观察到这种作用。
这种类型的基于转录的测定法对GDF-8的作用比较灵敏(比较图7A和7B中与图6A和6B中GDF-8的浓度)。这种类型的测定法还可确定抑制作用的特异性，例如使用p(CAGA)12-MLP报导质粒在CCL-64细胞中。特别是比较了前-GDF-8对如下三种不同的TGF-β家族成员的作用：TGF-β本身，GDF-8和活化素。如在图8中可见，前-GDF-8(或它的溶媒)本身既不调节基础(背景)萤光素酶活性，也不明显可察觉地改变TGF-β或活化素的作用。相反，它还对GDF-8表现出强抑制活性。
总之，上述基于转录的生物测定法可特别有效地用于灵敏地监测GDF-8活性以及用于对假定的GDF-8拮抗剂测定其抑制性潜力，无论它们的作用机制是什么(例如是否它们通过结合和灭活GDF-8或者通过阻断其同源受体而发挥作用)。应用肌酸激酶测定法鉴定GDF-8抑制剂的特征
如在图26所示，在分化开始时用GDF-8处理鸡原始成肌细胞或C2C12成肌细胞72小时，降低了细胞裂解液中肌酸激酶的活性。通过在有和没有GDF-8存在时比较细胞形态这点也明显可见。在后一种情况下，培养皿中形成的管状物少得多。TGF-β1在C2C12细胞具有类似于GDF-8的作用，但在鸡原始成肌细胞没有这种作用(图26)。因此，通过测定GDF-8抑制剂如前-GDF-8抑制GDF-8引起的肌酸激酶活性降低的能力，肌酸激酶测定法可用于鉴定和描述这种抑制剂的特征。应用基于3T3-L1前脂肪细胞分化的测定法鉴定GDF-8抑制剂的特征
按照特定的方案，3T3-L1前脂肪细胞可分化成脂肪细胞，表现出代表体内脂肪细胞的充分程度的分子标记和形态特征。如此实验结果表明，在分化过程开始时用GDF-8处理3T3-L1细胞导致严重的分化阻碍。应用二个独立的标准对此进行了评定。由于几乎没有包含脂滴的折射细胞使GDF-8的作用明显可见。在mRNA水平，在GDF-8处理的细胞中脂肪细胞特异性基因GLUT4的表达被阻断。以前就认为与脂肪细胞代谢控制有关的二个名为TNF-α和TGF-β的细胞因子可以模拟GDF-8的作用。此外，如在材料和方法部分所述，可以借助于多种免疫学、生物化学和分子生物学方法检测这种细胞的分化程度。对缺乏功能性GDF-8的小鼠和牛多脂性的改变已有描述。因此，这种测定法对体内GDF-8活性提供了一种有生理学意义的度量标准。从而，GDF-8抑制剂对GDF-8阻断脂肪细胞分化的作用可被用于评价这种抑制剂。应用葡萄糖摄入3T3-L1脂肪细胞的测定法鉴定GDF-8抑制剂的特征
在已分化的脂肪细胞中，胰岛素刺激葡萄糖以剂量-依赖性方式转运通过Glut-4转运体(图27)。可通过用GDF-8处理细胞72小时以剂量-依赖性方式阻断这种作用(图27)。重要的是，此测定法对GDF-8在体内的身体脂肪代谢功能提供了一种体外的相关测定。实施例6：产生来源于GDF-8前功能区的GDF-8抑制剂
为了产生包含全部或一部分GDF-8蛋白前功能区的GDF-8抑制剂，通过基于PCR的诱变产生了编码GDF-8前功能区(也称为“前-GDF-8”)(图13中显示的残基1-266)的小鼠部分cDNA。在TA载体(Invitrogen)内亚克隆了此PCR片段，并测序证实掺入了突变。将此编码前-GDF-8的cDNA插入FLAG-CMV-5a载体(Sigma)，以便产生在3′末端与FLAG抗原表位的框内融合，用于检测和纯化前-GDF-8蛋白(图12C)。此载体包含有引起真核细胞高水平表达的巨细胞病毒启动子序列。用同样的载体产生了表达野生型GDF-8(WT-GDF-8)的构建体(图12A)。
应用相同的方法通过在前功能区与成熟蛋白质之间的分界处取代预定的切割位点，使不可切割的全长度GDF-8突变体被表达(图13B和14)。
使用FuGENE试剂(Boehringer Mannheim)通过瞬时转染将形成的三种表达构建体导入鹌鹑QM-7成肌细胞。通过含有β-gal的报导构建体监测其转染效力大约是70-80％。使用偶联于定向针对FLAG表位的特异性单克隆抗体(Sigma)的亲和性凝胶，通过亲和层析纯化这些重组蛋白，它们是来自转染的QM-7细胞条件化培养基的Mut-GDF-FLAG和前-GDF-8-FLAG。在0.1M甘氨酸(pH3.5)中洗脱被结合的蛋白质，通过SDS-PAGE定量测定，随后被银染色(Novex)。纯化前-GDF-8的估计浓度是大约20ng/ml。
还用AntiFlag抗体通过免疫印迹法分析了这些被洗脱的蛋白质。从层析柱中适当地回收了Mut-GDF-8和前-GDF-8蛋白，这些预期分子量的免疫反应性蛋白存在于回收组分中，将被用于基于转录的生物测定法。
为了测定GDF-8的前区(前-GDF-8)是否能够干扰成熟GDF-8的作用，将层析柱纯化的前-GDF-8与特定量人重组GDF-8一起在室温下预温育30分钟。平行地将相同量BSA、甘氨酸缓冲液或全长度不可切割的-GDF-8(Mut-GDF-8)加入装有GDF-8的单独试管中用作对照。选择了前-GDF-8的二个不同的稀释度，使之与GDF-8相比达到30倍和10倍的(重量/重量)过量。在预温育之后，将此混合液转移至用p(CAGA)12-MLP或者用与pSV-β-gal质粒混合的p3T3-Lux报导质粒转染的A204细胞上。6小时后使细胞裂解并测定细胞裂解液中萤光素酶和β-半乳糖苷酶的活性。每个孔中缓冲液和柱纯化蛋白质的最后浓度是10ng/ml GDF-8，300ng/ml和1000ng/ml前-GDF-8，以及1000ng/ml不可切割的全长度GDF-8。
如在图16中可见，层析柱纯化的GDF-8前功能区能够完全抑制GDF-8对萤光素酶活性的诱导作用。当被施加给细胞之前，GDF-8已同BSA甘氨酸缓冲液(用于层析柱洗脱的)或者同全长度不可切割的GDF-8蛋白(Mut-GDF-8)一起被预温育过，这种诱导作用则不受影响。这种作用是剂量-依赖性的(图16)，并且是对GDF-8特异性的，因为前-GDF-8不影响TGF-β1或活化素对萤光素酶活性的诱导作用(图15)。
类似于组分A和B，测定了变性和还原对前-GDF-8抑制活性的作用。如在图24中可见，在用6M尿素变性处理之后前-GDF-8保持了它的抑制活性。但是还原处理前-GDF-8导致其抑制作用完全丧失。
为了研究此前功能区对野生型GDF-8分泌的作用，对来自用前-GDF-8和WT-F-GDF-8表达质粒共转染的QM-7细胞的条件化培养基进行了分析。在还原条件下以抗-FLAG特异性抗体作蛋白质印迹分析，在来自用前-GDF-8转染细胞的条件化培养基中检测出按38kDa迁移的主要免疫反应性蛋白质。这与对GDF-8前功能区预测的分子量相一致。还发现与FLAG抗体有免疫反应性的另一种多肽。这种多肽具有大约25kDa的分子量。
为了确定以38kDa带和25kDa带所呈现的多肽的同一性，通过亲和层析将这二种多肽纯化，并对来自考马斯染色凝胶的相应带进行N-末端测序。25kDa多肽的N-末端序列是DDSSD(SEQ ID NO：27)，证明此25kDa多肽是在特异性位点(Arg99)另一种切割的产物。(对于野生型和切割位点突变GDF-8前体也都发现此相同的切割位点)。
按80kDa迁移的前-功能区二聚体以及前-功能区的单体形式也存在于非还原性凝胶上。
以WT-F-GDF-8构建体共转染前-GDF-8构建体导致成熟GDF-8的分泌量明显减少。
因为在以前-GDF-8转染的QM-7细胞的条件化培养基中检测出二种FLAG免疫反应性蛋白质，所以，重要的是确定这二种多肽中的哪一种对GDF-8具有抑制活性。通过从变性SDS-PAGE洗脱这二种蛋白质而实现了此目的。然后以上述的激活报导质粒的生物测定法，对各个多肽测定它们作为GDF-8抑制剂起作用的能力。结果证明，只是代表全长度前-功能区的较高分子量的多肽(按38kDa迁移的)具有抑制活性，而按25kDa迁移的多肽，即在Arg99另一种切割的产物无活性。这表明抑制性(或GDF-8-结合性)功能区是位于前-功能区的N-末端，Arg99的上游。因此，根据Arg99上游的前功能区序列(见图13)可设计小分子量的GDF-8抑制剂。
所有的上述研究都证明，在体外基于转录的测定法中GDF-8前功能区能够特异性地抑制GDF-8的生物活性，并且当与野生型GDF-8蛋白共同被表达时它影响培养细胞在条件化培养基中分泌成熟GDF-8。实施例7：产生过渡表达GDF-8前功能区的转基因小鼠
为了在体内证实上述实施例6中的结果，在小鼠体内产生了用于肌肉特异性表达GDF-8前功能区的DNA构建体。简单地说，使编码前功能区(图13中显示的残基1-266)的小鼠部分cDNA与FLAG表位在C-端融合，并在大鼠Myosin轻链1启动子的下游插入pMEX-NMCS2表达载体。已显示此载体促进转基因小鼠骨骼肌中快速纤维的特异性表达(Neville，C等(1996)发育与遗传，19：157)。
借助于标准的原核微注射产生了转基因小鼠。以对FLAG表位特异性引物通过加尾PCR技术筛选其子代对转基因的整合作用。确立了14个种系整合的创立者。用GDF-8特异性探针对肌肉组织作RNA印迹分析在骨骼肌中发现了具有高水平转基因表达的3个种系。对此转基因(GDF-8前功能区)的表达超过内源性GDF-8的水平3-10倍。实施例8：GDF-8被分泌在含有被酸化激活的其前功能区的潜在性复合物中
在鉴定来自用WT GDF-8转染的QM-7细胞的培养基时检测出一条附加的38kDa“双重”带。为了确定此多肽的同一性，通过亲和层析纯化了FLAG靶标蛋白，并对来自考马斯染色凝胶的泳带进行N-端测序。此38kDa“双重”带多肽的N-端序列是DDSSD(SEQ IDNO：27)，表明它是在特异性位点(Arg99)另一种切割的产物。对此按38kDa迁移的“双重”带的序列分析也揭示了带有氨基-末端序列GPVDLNE(SEQ ID NO：28)的多肽，此氨基末端序列与GDF-8前体蛋白的氨基末端序列相同。此带代表缺乏信号肽的前-功能区，它与FLAG标记的GDF-8前体和成熟片段一起被共纯化出。这种多肽不被抗-FLAG M2特异性抗体识别，与独立表达的前-功能区一起共迁移。因为FLAG表位定位于WT-GDF-8蛋白的C-末端，所以如果它确实与成熟GDF-8有关，此GDF-8前功能区可能只结合于抗-FLAG亲和性凝胶。
为了进一步鉴定所分泌的GDF-8复合物，使用Microcon离心滤器(具有50K的分子量截止孔径)对来自用WT-GDF-8转染的QM-7细胞的培养基进行了大小分级分离。保留物中含有几乎全部GDF-8相关的免疫反应性蛋白，进一步支持存在高分子量复合物的观点，此复合物在非还原条件下按60-120kDa迁移。在还原条件下，检测出按15kDa迁移的成熟GDF-8片段以及未加工形式的GDF-8。在流过的组分中发现了未成熟的GDF-8二聚体。这些资料证实成熟的GDF-8存在于细胞培养基中的高分子量复合物内。
为了测定由QM-7成肌细胞产生的GDF-8复合物的生物活性，使用了基于转录的报导质粒激活测定法(见图29)。未加工的细胞培养基不显示出任何GDF-8样的生物活性。相反，纯化的人成熟GDF-8有效地诱发了来自报导质粒p(CAGA)12-MLP的萤光素酶活性(如上面所述)。不同于未加工的培养基，亲和性纯化的GDF-8复合物也具有活性。这种有限的激活很可能是由于用甘氨酸缓冲液(pH3.5)洗脱而引起的化学酸化作用所致。通过HPLC C4柱进一步纯化亲和性纯化的复合物(当用TFA酸化时)导致发现了在大约18分钟洗脱的比较有活性的组分。此组分(组分#18)在基于转录的生物测定法中诱发了最高的应答，它主要是由在还原肽SDS-PAGE上按15kDa迁移的成熟GDF-8组成。重要的是，组分#18包含比初始物质(图29，泳道1)或组分#20(图29，泳道4)少得多的未加工GDF-8的含量。
因此可能是，由QM-7细胞分泌的并且与成熟GDF-8一起被共纯化的(通过亲和性层析)高分子量GDF-8-相关的蛋白质可以抑制它的生物活性。上述结果暗示，成熟GDF-8是由QM-7细胞分泌在包含其前功能区的潜在的复合物内。这点与在基于转录的测定法中纯化的前功能区抑制GDF-8活性的能力(上面所述的)相一致。其根本的机制可能是使成熟GDF-8与它的前功能区相关联，阻止它与发送信号的受体相互作用。实施例9：钙蛋白酶对潜在性GDF-8复合物的激活作用
M-钙蛋白酶是一种被普遍表达的，半胱氨酸蛋白酶的钙蛋白酶家族的钙依赖性成员。在这些实验中对m-钙蛋白酶激活GDF-8复合物的能力进行了研究。首先在体外(即在试管内)研究了m-钙蛋白酶切割GDF-8蛋白的能力。简单地说，在37℃用0，0.1，和1U/ml的钙蛋白酶处理含有WT-GDF-8或前-GDF-8-F蛋白的QM-7条件化培养基温育过夜。结果证明，m-钙蛋白酶能够特异性地切割GDF-8前功能区，产生更多的低分子量物质。特别是野生型GDF-8的全长度前体物也是m-钙蛋白酶的底物。用较高浓度的钙蛋白酶(1U/ml)处理导致全长度野生型GDF-8蛋白的完全消耗。仅检测出这种切割的微量蛋白水解产物。重要的是，m-钙蛋白酶没有使成熟GDF-8降解。QM-7细胞存在时m-钙蛋白酶也能切割此前功能区，低分子量泳带在SDS-PAGE上的出现证明了这点。
因为m-钙蛋白酶能够消化GDF-8前功能区，所以推测m-钙蛋白酶可激活此潜在性GDF-8复合物。为了证明此假设，用0或10/mlm-钙蛋白酶在37℃处理来自以WT-GDF-8-F-构建体转染的QM-7细胞的或来自假转染细胞的上清液2小时，然后在抗-FLAG柱上亲和性纯化GDF-8复合物(如上面所述)。用在此所述的基于转录的生物测定法纯化蛋白质的活性。在与m-钙激活中性蛋白一起共温育GDF-8复合物之后，同未处理的对照相比较萤光素酶活性高2.5倍(图30A)。与它不能消化这种成熟的因子相一致，m-钙蛋白酶不抑制成熟的人重组GDF-8(hrGDF-8)的活性(图30B)。但是，将此前功能区与m-钙蛋白酶一起预温育，大大降低了此前功能区抑制成熟GDF-8的能力(图30B)。这些结果证明，m-钙蛋白酶可通过切割其前功能区从潜在性复合物中释放活性GDF-8。
上述资料表明，激活GDF-8和从GDF-8/前功能区复合物中释放成熟GDF-8蛋白的目的都为了抑制GDF的功能，例如，可以使前功能区的稳定性增加从而防止它可能被细胞蛋白酶切割。这本身又将导致使GDF-8/前功能区复合物稳定化，因此阻止活性GDF-8的释放。实施例10：GDF-8切割位点突变体(优势阴性突变体)的产生和特征鉴定
按如下方法产生GDF-8切割位点突变体(优势阴性突变体)并测定其GDF-8抑制作用：
简要地说，通过在前功能区与成熟蛋白分界处取代预定的切割位点产生表达不可切割的全长度GDF-8突变体(Mut-GDF-8)的构建体。除去信号肽之后，此预定的蛋白质包含后面紧连C-末端GDF-8成熟区的前功能区(图12B)。与野生型GDF-8不同，此不可切割的突变体不能被切割产生成熟GDF-8蛋白而因此没有生物活性。还在相同载体内亚克隆野生型(WT)小鼠GDF-8cDNA产生了在C-末端以FLAG表位标记的全长度前体蛋白。所形成的构建体被称为WT-F-GDF-8(图12A)。在基于CMV的表达载体内亚克隆的未修饰(未标记)的GDF-8cDNA被称为WT-GDF-8。
通过瞬时转染将两个表达构建体都导入QM-7鹌鹑成肌细胞，并且用抗-FLAG亲和凝胶从条件化培养基中免疫沉淀GDF-8蛋白。借助于SDS-PAGE进一步分析此免疫沉淀物，随后如方法中所述用抗-FLAG特异性抗体检测。野生型(WT-F-GDF-8)在QM-7细胞内被适当地表达和加工。在还原条件下检测出代表全长度前体(45-50kDa)和成熟GDF-8(15kDa)的二个免疫反应性电泳带。这些蛋白质的分子量同以前报导的GDF-8的分子量一致。剩余物(前功能区)不能检测，因为它缺乏FLAG表位。对来自以对照空载体转染的细胞的条件化培养基未检测出免疫反应性蛋白。如所预测的，转染不可切割的突变体Mut-GDF-8导致产生了与前体分子相对应的主要免疫反应性物质以及一定量按38kDa迁移的GDF-8相关蛋白。
为了测定此切割位点突变体作为野生型GDF-8的优势-阴性抑制物起作用的能力，用不同比例的Mut-GDF-8-F和WT-GDF-8-F构建体共转染QM-7细胞。结果证明，此切割位点突变体以剂量依赖性方式抑制成熟GDF-8的分泌。为证实此切割位点突变体也抑制未标记的野生型GDF-8，将Mut-GDF-8-F的WT-GDF-8构建体共导入QM-7细胞中，并用针对GDF-8的抗体检测被表达的蛋白质。此结果类似于用FLAG标记的GDF-8得到的结果。
使用重组BMP-2测定此抑制作用的特异性，重组BMP-2是TGF-β家族的一个成员，在成熟区内与GDF-8具有41％的相同性。将表达BMP-2和Mut-GDF-8的构建体共导入QM-7细胞中，同抗-BMP-2抗体检测分泌的蛋白质。结果证明，突变体GDF-8不影响成熟BMP-2的分泌和加工。因此，Mut-GDF-8的抑制作用对于TGF-β蛋白家族的其它成员是有选择性的。
为了探寻优势阴性突变体稳定性的来由，和试图揭示此抑制作用的机制，在有200μCi/ml[35S]半胱氨酸存在时培养转染的QM-7细胞2小时，并在指定的时间内进行探测。收集此条件化培养基并制备细胞裂解液用于进一步分析。用抗-FLAG M2亲和性凝胶免疫沉淀所有的FLAG标记的蛋白质，并通过SDS-PAGE作分级分离。此实验结果证明前体形式的WT-F-GDF-8和全长度Mut-GDF-8蛋白开始在细胞内积累。在用WT-F-GDF-8转染细胞的上清液中检测出三种形式的GDF-8：前体、成熟GDF-8和前功能区。未检测出细胞内积累的GDF-8加工形式，C-末端成熟GDF-8和前功能区都是在切割后立即被分泌，并且早至合成后3小时就在上清液中被检测出。被加工的GDF-8形式在条件化培养基内至少24小时是稳定的。在37℃温育条件化培养24小时之后未观察到加工形式的GDF-8有更多的积累。这表明细胞的存在对加工处理似乎是必要的。但是存在这样的可能性：当可获得特异性蛋白酶时某些切割可在细胞外发生。虽然未加工形式的WT-F-GDF-8和全长度Mut-GDF-8也被有效地分泌，但同样也观察到某些细胞内积累。
当与Mut-GDF-8一起共转染WT-F-GDF-8时，观察到积累在细胞内的一个成熟C-末端片段库。当将Mut-GDF-8导入组成型表达WT-F-GDF-8的稳定QM-7细胞系时也观察到同样的现象。用Mut-GDF-8构建体瞬时转染二个阳性克隆，如上作标记，并在24小时后对细胞裂解液进行分析。结果表明，只在用突变体GDF-8共转染的细胞内存在可检测的细胞相关性成熟C-末端片段库。这些结果证实了借助于不可切割的突变体对GDF-8分泌优势-阴性抑制作用的假设机制，即在野生型和突变体蛋白之间形成异二聚体(或其它的复合体)而干扰这种生长因子的正常分泌。
只有当成熟GDF-8这样被产生时，并且当它不是像含有GDF-8前-功能区序列的不可切割的GDF-8(Mut-GDF-8)那样被埋藏在大蛋白分子中时，前-GDF-8可同它相互作用并抑制它的活性。上述研究表明，当以蛋白质的形式将前-GDF-8对受试者给药时，或者当它从适当的载体中被表达(即基因治疗式的方法)时，前-GDF-8都可作为内源性成熟GDF-8的拮抗剂而起作用，因为它的靶标是被分泌的，已加工的成熟GDF-8。可是，Mut-GDF-8的作用模式是细胞内，在GDF-8的合成过程中，导致在细胞内形成不可切割的异二聚体。因此，当其在细胞内被表达时Mut-GDF-8可以抑制GDF-8的功能。实施例11：产生和测定GDF-8半胱氨酸突变体
如对其它的GDF-8突变体所述的，通过应用基于PCR的方法将点突变导入GDF-8 cDNA而产生了GDF-8半胱氨酸突变体。将此突变的GDF-8序列插入FLAG-CMV-5a表达载体而产生与FLAG表位的读框内融合。将所形成的构建体(C-Mut-GDF-8)单独导入QM-7细胞中，或者用WT-F-GDF-8转染以便测定此突变体对成熟GDF-8的产生和积累的作用。
因为借助于蛋白质印迹分析在用C-Mut-GDF-8转染的细胞条件化培养基中不能检测出免疫反应性蛋白质，所以在转染之后对这些细胞进行了代谢标记。这些实验证明，C-Mut-GDF-8蛋白在QM-7细胞内产生并被适当加工，但是与野生型GDF-8相比它被分泌的量非常少。大部分全长度前体形式积累在细胞内，而在条件化培养基中分泌成熟的和未加工的形式。因此，在GDF-8成熟区内一个半胱氨酸的突变仍然可被加工和分泌。但是共转染实验证明，半胱氨酸突变体当它与WT GDF-8一起被导入QM-7细胞时具有抑制野生型成熟因子分泌的能力。实施例12：分析GDF-8变异体N-连接糖基化的作用
糖基化是蛋白质翻译后修饰的主要形式之一。糖蛋白的糖类结构在蛋白质的加工、分泌和生物活性中起重要的作用。GDF-8前体在其前功能区内Asn 72含有一个预测的N-连接糖基化位点。为了确定是否此糖基化位点有用，首先用N-糖苷酶F处理纯化的重组GDF-8蛋白。这种酶能够从蛋白质骨架上释放所有普通种类的N-聚糖。应用抗-FLAG亲和层析纯化WT-F-GDF-8、Mut-GDF-8和前-GDF-8蛋白。使此蛋白质样品变性，在试管内与N-糖苷酶共温育，并在还原条件下进行SDS-PAGE。此实验结果证明，此酶在体外催化除去了野生型和成熟GDF-8的前体形式的糖类结构，导致向明显的低分子量移动。对于独立被表达的GDF-8前功能区也观察到相同的移动。引人注目的是，GDF-8成熟形式的迁移率没有改变，这与在此区内不存在假定的糖基化位点相符合。
为了测定在GDF-8的加工和分泌过程中糖基化的作用，使用了糖基化抑制剂衣霉素。这种核苷抗菌素阻止形成寡聚糖加入新生多肽链所必需的多萜醇中间体。用表达野生型GDF-8的构建体，或者GDF-8变异体(切割位点突变体和前功能区)瞬时转染鹌鹑QM-7成肌细胞。所有三个蛋白质都被融合到C-末端FLAG表位。转染后用2μg/ml衣霉素处理细胞16小时。24小时后通过蛋白质印迹法或免疫沉淀法分析条件化培养基和细胞裂解液，随后用抗-FLAG抗体检测这些蛋白质。来自此实验的结果证明，衣霉素看来堵塞了所有三种GDF-8形式的分泌出口。观察到比糖基化物质迁移更快速的GDF-8和其前功能区的细胞相关性非糖基化前体形式增加。此结果暗示GDF-8是一种糖蛋白，它的糖基化对于正常加工和分泌是必需的。用N-糖苷酶F处理组分B可消除前功能区的抑制作用(图36)，这样提供了进一步证据表明N-连接的糖基化对于前功能区的抑制活性是重要的。实施例13：来自组分B的人GDF-8前功能区和小鼠GDF-8前功能区对鸡的生长和肌肉发育的作用
因为通过基因打靶产生的GDF-8敲除小鼠发育正常，但是具有2倍于正常骨骼肌的容量，所以推测在发育过程中导入GDF-8前功能区可能导致被处理的动物增加骨骼肌容量。为了检验这个假设并测定卵内给予GDF-8前功能区对增进骨骼肌发育的功效，将纯化的GDF-8前功能区(来自上述组分B人GDF-8前功能区或来自实施例6小鼠GDF-8前功能区)注射进入Cobb和Ross鸡的受精卵(鸡蛋)内。如在此所述，应用在例如H.Kocamis等(1998)家禽科学，77，1913-1919中描述的技术，在0天，第1、2、3、11、12、13、14、15、18和第20天注射受精卵。得到在42天生长期末的活体重，躯干、胸部和腿的重量。表II显示与对照禽(未注射的)相比较，被处理的雄禽和雌禽活体、胸部和腿重量增加百分数(Cobb卵，注射时间第13天和第20天)。
表II
    Cobb    活体重    胸部     腿
  雄性(第13天)     11.8     18.0     18.6
  雌性(第13天)     7.7     9.7     13.8
  雄性(第20天)     3.4     13.8     7.4
  雌性(第20天)     10.4     17.4     13.8
表III显示与对照禽(单注射缓冲液)相比较，被处理的雄禽和雌禽活体、躯干、胸部和腿重量增加的百分数(Ross卵，注射时间第15天)。
表III
     Ross   活体重     躯干     胸部     腿
  雄性(第15天)     4.2     5.5     3.3     6.7
  雌性(第15天)     15.8     18.0     20.8     9.2
这些结果证明，卵内给予GDF-8前功能区可导致受处理家禽骨骼肌容量增加。实施例14：对可用作GDF-8抑制剂的GDF-8受体的鉴定[125-I]-GDF-8对在COS-7细胞中所表达受体的结合
为了鉴定可以结合GDF-8的已知的(克隆的)II型受体，使用FuGENE 6(Boehringer Monnheim)通过瞬时转染将编码3个不同丝氨酸-苏氨酸受体的表达构建体或空载体(对照)导入COS-7细胞(50％汇合的)。所使用的II型受体是TGF-βII型受体、Ativin IIB型受体(B2剪接变异体的异形)和BMP II型受体。使用[125-I]-标记的GDF-8作配体在48小时后实施结合测定。随后进行二种类型的分析。第一种分析进行包括细胞裂解和应用闪烁计数定量测定结合于被不同构建体转染的细胞表面的GDF-8。第二种类型的分析是验证性的，包括观察结合于COS-1细胞表面的GDF-8，并按例如Lin等(1992)细胞，68，775-85中描述的进行这种类型的分析。基于来自受体构建体的GDF-8诱导性转录的功能测定
在2个不同的细胞系，A204人杆状肌肉瘤细胞系和貂肺上皮细胞系CCL-64进行基于转录的生物测定法。在此测定法中使用了二种人工报导质粒：p3TP-Lux和p(CAGA)12-MLP(前面所述的)。在此二种质粒中，都是通过对TGF-β家族成员应答的人工最小启动子驱动萤光素酶基因转录(并因此激发其活性)。因此，细胞裂解液中萤光素酶的活性与所施加生长因子对此细胞刺激作用的程度线性相关。
用48孔培养板，在以10％胎牛血清、抗菌素和L-谷氨酰胺补充的它们各自的培养基(对于CCL-64是DMEM，对于A204是McCoy氏培养基)中培养这二种类型细胞。生长达到80％汇合时，按厂商的说明书使用促进质粒摄入的FuGENE-6(Boehringer-Mannheim)转染细胞。用如下质粒的混合物瞬时转染细胞：受体表达质粒pCMV-ΔNβRII K-R(编码突变的优势阴性II型TGF-β受体)，pCMV-ΔNActRIIB2 K-R(编码突变的优势阴性II型活化素受体)以及报导质粒pSV-β-gal(用于监测转染效果)和二种萤光素酶报导质粒中的一种。与转染试剂一起共温育过夜之后，用含有0.1％BSA的适当无血清培养基洗细胞2次。然后对此细胞加入人重组GDF-8。温育6小时后使细胞裂解，用双光萤光素酶测定试剂盒(Tropix公司)在同一样品内测定萤光素酶和β-半乳糖苷酶活性。以相对萤光素酶单位(RLU)表示酶活性，即萤光素酶活性被校正为转染效率，由在同一样品内测定的相应β-半乳糖苷酶活性值表示。对作为GDF-8I型受体的TGF-β受体Alk-5的功能鉴定
貂肺上皮细胞系CCL-64对TGF-β是高度敏感的。通过化学诱变由CCL-64产生的细胞系R1B对TGF-β不敏感。已确定它的不敏感性是由于缺乏功能性TβRI受体。作为决定性的证据，当通过用编码此受体的质粒转染在此细胞系内重新导入TβRI时可以完全恢复TGF-β应答(Wrana等，细胞(1992)，71，1003-14)。
与TGF-β相似，GDF-8也在野生型细胞系CCL-64中引发强应答(图31)，但在R1B突变体中无活性(图31)。但是，当用编码TβRI的质粒转染R1B细胞时GDF-8的应答性可完全恢复，这样引起了完全的功能性挽救(图33)。上述结果表明TβRI是功能性GDF-8I型受体。对作为GDF-8II型受体的ActRIIB2的鉴定
另一CCL-64来源的突变细胞系DR26缺乏TGF-βII型受体，因此对TGF-β不敏感。与R1B细胞系不同，DR26细胞充分保留它们对GDF-8的应答性，表明TGF-βII受体对于GDF-8的活性是不必要的，必须有其它某种II型受体亚单位介导GDF-8的应答(图34)  。
为了查明是否任何已知的(克隆的)II型丝氨酸-苏氨酸激酶受体亚单位可以用作GDF-8受体，将编码II型受体的多种表达构建体转染进入COS-7细胞内。随后测定细胞对[125-I]-GDF-8的结合。与上面小节中所述的功能分析一致，没有检测出对TGF-β或BMP II型受体的特异性GDF-8结合。可是，活化素II型受体ActRIIB2被鉴定为GDF-8-结合受体。[125-I]-GDF-8对用ActRIIB转染的COS-7细胞表面结合增加，而用对照载体转染的细胞不表现出特异性结合证实了这点。
通过应用ActRIIB2的优势阴性形式进一步证明了这些结合资料的功能意义。优势阴性受体同种型是由细胞内受体功能区多个受体构建体中特定氨基酸残基的点突变(K-R突变)而产生。这些突变不干扰II型亚单位在细胞膜内被适当表达的能力、结合配体的能力或者与各自的I型亚单位形成异聚体的能力。但是这些突变可消除此受体的激酶活性，而因此阻碍它们在配体结合后转换功能信号的能力(Wrana等(1992)细胞，71，1003-14)。
将这些优势阴性受体同种型导入对GDF-8高度灵敏的CCL-64貂肺上皮细胞或A204人杆状肌肉瘤细胞中。如根据结合实验资料和在R1B细胞获得的功能资料所预期的，TGF-βII型受体的ΔN形式不影响GDF-8的应答，因此证实在这方面它是不必要的。可是，在此二种细胞的背景中导入ActRIIB2的ΔN形式导致在因此受体构建体转染的DR26细胞(图35)和A204细胞中抑制了GDF-8的应答。推测是通过外竞争内源性ActRIIB2受体(即通过以优势阴性方式起作用)。
综合结合资料和功能资料证明，AtRIIB2可用作功能性GDF-8受体。上述研究都证明，TβRI和ActRIIB2的异聚体复合物是可介导GDF-8应答的功能性受体组合。值得注意的是，I型-II型受体单位的这种特殊组合，还没有被描述作为任何其它TGF-β生长因子家族成员应答的功能转换器。很可能TβRI-ActRIIB2异聚体只能被GDF-8以及与GDF-8高度相同的分子激活。GDF-11的活性(成熟)区与GDF-8的活性区具有大于90％的相同性，暗示这二种密切相关的因子共同具有相似的结合和发送信号特性。因此，在此所述的作用剂以及它们的运用既可用于GDF-8也可用于GDF-11的生物学研究和诊断。运用GDF-8受体的方法
对GDF-8受体的鉴定使有可能构建“受体探针”。这类“受体探针”的效用直接与它们识别和结合如下物质的能力有关：GDF-8、GDF-8-同类分子(如GDF-11)、以及推测的其它结构相关或不相关的分子或肽，不论它们是化学合成的或天然存在的。这些物质由于它们与GDF-8“受体探针”相互作用可能是GDF-8抑制剂。
所有这些“受体探针”都有多种运用途径：(1)以可溶性受体形式作为GDF-8蛋白的捕捉物在体内直接结合和中和GDF-8，(2)作为改变的ELISA系统检测和定量测定生物液体和其它液体中的GDF-8，用于对人诊断肌肉的损耗，或者(3)作为在受体水平鉴定GDF-8抑制剂/拮抗剂的筛选试剂。
GDF-8“受体探针”的产生可以包括产生GDF-8受体融合蛋白(应用在例如George等(1999)美国国家科学院学报，96：12719-12724中所述的技术)，简要地说，该受体融合蛋白质如下二种融合蛋白的异聚体复合物：融合于例如免疫球蛋白G1(IgG1)Fc片段的GDF-8I型受体细胞外功能区，以及融合于例如免疫球蛋白G1(IgG1)Fc片段的GDF-8II受体细胞外功能区(或者是包含融合于蛋白功能区X的GDF-8I型受体细胞外功能区的，和包含融合于蛋白功能区Y的GDF-8II型受体细胞外功能区的任何其它融合蛋白，从而蛋白功能区X和蛋白功能区Y可以相互作用形成此二种融合蛋白的异聚体复合物)。融合受体的构建并不局限于使用Fc片段，具有形成二聚体或异二聚体特性的不论哺乳动物和细菌的蛋白质或蛋白的一部分都可以用这种方式被利用(例如基本的螺旋-环-螺旋功能区)。在例如Davis等(1994)科学，266：816-819和美国专利No.5,844,099中描述了制备这种融合受体蛋白的方法，这些文献的内容在此被引入作为参考。
下面是建立异二聚体复合物或“受体探针”所必需的步骤。产生受体/Fc杂合体
通过多次PCR循环产生了编码受体/Fc融合蛋白的DNA。根据以对其它TGF-β家族成员的受体进行的类似实验，从cDNA克隆扩增编码该受体氨基一端160个氨基酸的DNA。其3′PCR引物与将被包括在此融合基因中的人IgG1序列的5′序列重叠。同样地使用与该受体序列重叠的5′引物从人基因组DNA扩增编码人IgG1基因Fc区(Pro100-Lys 330)的DNA。然后将此受体和IgG1 PCR产物组合并用作重叠模板，以便产生代表编码受体的配体结合功能区和此IgG1 Fc区的序列融合的扩增产物。将此最后的PCR产物连接进入TA克隆载体(Invitrogen，圣地亚哥，CA)，然后亚克隆进入pCMV5(Sigma)以便产生可以在转染的真核细胞内表达此融合蛋白的构建体。可在CHO细胞和小鼠NSO肌瘤细胞中测定此构建体。
使用蛋白A琼脂糖柱(Pharmacia，Piscataway，NJ)从转染细胞的条件化培养基中纯化受体/Fc杂合体蛋白质。这种融合蛋白是以同二聚体的形式被纯化。通过在有助于断裂链间二硫键而不影响链内二硫键的条件下还原此同二聚体可产生异二聚体。以等摩尔量混合这二种不同类型的单体，并被氧化形成同二聚体和异二聚体的混合物。然后可借助于HPLC使同二聚体与异二聚体分离。按另一种方式，可用一串羧基端组氨酸残基标记此融合蛋白中的一种，这样使有可能借助于镍-螯合层析法纯化此重组蛋白。然后通过使用逐渐增加的咪唑含量洗脱此结合的蛋白质分离出三种类型二聚体蛋白。在最低浓度的咪唑中洗脱出缺乏组氨酸标记的同二聚体；在中间浓度洗脱出带有仅一种被标记蛋白的异二聚体；而在最高浓度的咪唑中仅洗脱出其中二种亚单位都具有组氨酸标记的同二聚体。
借助于聚丙烯酰胺凝胶电泳分析受体/Fc异二聚体制备物，并对存在的污染蛋白质作银染色。如果必要可实施补充纯化步骤。如下面所述，还要测定此纯化的异二聚体以便证实它们可以结合GDF-8，并且按照在此所述的一种生物测定法作为拮抗剂对它们进行测定。建立一种“配体陷阱”测定法用于定量测定GDF-8蛋白
该GDF-8定量测定系统是修改的夹心ELASA测定法，它引入了竞争技术和捕捉技术，并且使用受体/Fc杂合体蛋白的异二聚体作为捕捉剂代替捕捉抗体。下面的步骤包括可被用于GDF-8“配体陷阱”测定法的一般方案。用受体/Fc蛋白异二聚体包被ELAS检测板，洗去未附着的受体/Fc蛋白。使此蛋白质固定并再次洗测定板。使蛋白质样品与不同稀释度的GDF-8标准品混合，加入抗-GDF-8抗体，并在37℃温育此测定板。对已包被的测定板加入此蛋白与抗体的混合物，在严格条件下洗去未附着的配体，加入偶联于辣根过氧化物酶(HRP)的第二抗体，并洗去未结合的第二抗体。随后加入OPD底物，用微量滴定板测定仪测定光密度。最后应用吸光度值计算法确定样品中GDF-8的水平。等同形式
本领域的技术人员仅仅使用常规实验就将意识到，或者能够确信有许多与在此所述的本发明特定实施方案相似的等同形式。打算通过下面的权利要求将这些等同形式包括在本发明中。
                              序列表<110>METAMORPHIX，INC.<120>生长分化因子抑制剂及其用途<130>MTN-024PC<140><141><150>60/116,639<151>1999-01-21<150>60/138,363<151>1999-06-10<160>30<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>42<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：合成序列<400>1aatataaaca ctgatgagtc cgtgaggacg aaacatttgc ag                     42<210>2<211>42<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：合成序列<400>2gcacatgcat ctgatgagtc cgtgaggacg aaacacagcc cc                     42<210>3<211>42<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：合成序列<400>3gttgggcttt ctgatgagtc cgtgaggacg aaactacttt gt                     42<210>4<211>42<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：合成序列<400>4ttcacatcaa ctgatgagtc cgtgaggacg aaactctgcc aa                     42<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：合成序列<400>5acgtttttga cgttgagaca                                              20<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：合成序列<400>6aaatataaat ggacaaatac                                              20<210>7<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：合成序列<400>7ctcttgtcac tcgtttttct                                              20<210>8<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：合成序列<400>8tacatgaacc tctgttttgt                                              20<210>9<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：合成序列<400>9atgtttagga gtcatttgaa                                              20<210>10<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：合成序列<400>10tctacaatat tctgttaaaa                                              20<210>11<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：合成序列<400>11actagtcata ctacaggtct                                              20<210>12<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：合成序列<400>12tactgctaat agtgcgatgt                                              20<210>13<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：合成序列<400>13agactaaaag attacgttca                                              20<210>14<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：合成序列<400>14atataaactc tgggcagctc                                              20<210>15<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：合成序列<400>15tgaggatgtt gtcacaaaca                                              20<210>16<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：合成序列<400>16tctgagtagt ttggatactt                                              20<210>17<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：合成序列<400>17tctgccatgt tccatatgac                                              20<210>18<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：合成序列<400>18agactttgaa ctgtacttg                                               19<210>19<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：合成序列<400>19ggtccgtgac cataaaccgt c                                            21<210>20<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：合成序列<400>20acttctgtca caacgtttta                                              20<210>21<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：合成序列<400>21accgagtttg ttggacttag                                              20<210>22<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：合成序列<400>22taactttatt ttcgaaatct                                              20<210>23<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：合成序列<400>23actcttacca gtactagaac                                              20<210>24<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：合成序列<400>24gggtcctggt cctcttctac                                              20<210>25<211>23<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列描述：合成序列<400>25Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu Phe Val Phe Leu Gln Lys Tyr1               5                  10                  15Pro His Thr His Leu Val His
         20<210>26<211>5<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列描述：合成序列<400>26Asn Glu Asn Ser Glu1               5<210>27<211>5<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列描述：合成序列<400>27Asp Asp Ser Ser Asp1               5<210>28<211>7<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列描述：合成序列<400>28Gly Pro Val Asp Leu Asn Glu1               5<210>29<211>13<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列描述：合成序列<400>29Lys Ile Pro Ala Met Val Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser1               5                  10<210>30<211>22<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列描述：合成序列<400>30Leu Ser Lys Leu Arg Leu Glu Thr Ala Pro Asn Ile Ser Lys Asp Val1               5                  10                  15Ile Arg Gln Leu Leu Pro
         20

Claims (55)

1.一种鉴定GDF蛋白抑制剂的方法，包括：
(a)获得在其中已培养过产生GDF蛋白的细胞的培养基；
(b)测定此培养基抑制GDF活性的能力，从而鉴定GDF抑制剂。
2.权利要求1的方法，进一步包括在测定该培养基抑制GDF活性的能力之前对该培养基进行层析。
3.权利要求1的方法，进一步包括对从所述层析获得的组分进行电泳。
4.权利要求1的方法，其中是用含有编码GDF-蛋白的插入片段的质粒转化所述的细胞。
5.权利要求4的方法，其中的细胞是CHO细胞。
6.权利要求1的方法，其中该细胞内源性地产生GDF蛋白。
7.权利要求2的方法，其中的层析法是离子交换层析和反相层析。
8.权利要求3的方法，其中的电泳选自制备性非还原SDS-PAGE和制备性还原SDS-PAGE。
9.权利要求1的方法，其中的GDF蛋白是人GDF蛋白。
10.权利要求1的方法，其中的GDF蛋白选自牛GDF-8或GDF-11，鸡GDF-8或GDF-11，鼠GDF-8或GDF-11，大鼠GDF-8或GDF-11，猪GDF-8或GDF-11，绵羊GDF-8或GDF-11，火鸡GDF-8或GDF-11，以及狒狒GDF-8或GDF-11。
11.权利要求1的方法，其中的测定是检测肌肉特异性酶的活性。
12.权利要求11的方法，其中的肌肉特异性酶是肌酸激酶。
13.权利要求1的方法，其中的测定是检测脂肪细胞分化。
14.权利要求13的方法，其中是检测3T3-L1前脂肪细胞的分化。
15.权利要求1的方法，其中是应用基于转录的测定法进行测定。
16.权利要求1的方法，其中的GDF抑制剂是一种GDF多肽。
17.权利要求1的方法，其中该GDF抑制剂包含GDF蛋白的前功能区或前功能区的一部分。
18.一种鉴定GDF蛋白抑制剂的方法，包括：
(a)制备GDF蛋白的片段；
(b)测定这些片段抑制GDF活性的能力，从而鉴定GDF抑制剂。
19.权利要求18的方法，其中所述的片段是通过消化GDF蛋白来制备。
20.权利要求18的方法，其中的片段是人工合成的。
21.权利要求18的方法，进一步包括在测定这些片段抑制GDF活性的能力之前将它们分离出。
22.权利要求18的方法，进一步包括选择不诱发T细胞介导应答的片段。
23.权利要求18的方法，进一步包括选择具有将引发免疫应答的氨基酸序列的片段。
24.权利要求18的方法，其中的测定包括筛选所述片段引发免疫应答的能力，此免疫将导致产生GDF抑制抗体。
25.权利要求18的方法，其中的GDF蛋白是通过重组产生的。
26.权利要求18的方法，其中的GDF蛋白是天然GDF蛋白。
27.权利要求19的方法，其中是用蛋白酶消化该GDF蛋白。
28.权利要求27的方法，其中的蛋白酶选自胰蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和胃蛋白酶。
29.权利要求18的方法，其中这些片段的长度是10-25个氨基酸。
30.权利要求18的方法，其中这些片段的长度是25-40个氨基酸。
31.一种GDF-8或GDF-11抑制剂，它可以从已通过离子交换层析分离出其中CHO细胞的培养基中被分离出，此CHO细胞是用含有编码人GDF-8或GDF-11的插入片段的表达质粒稳定转染的细胞，在100℃加热直到10分钟之后此抑制剂仍保持活性，在还原之后它仍保持活性，以及在用6M尿素处理之后它仍保持活性。
32.权利要求31的GDF-8或GDF-11抑制剂，它具有小于大约70kDa的分子量。
33.一种GDF-8或GDF-11抑制剂，它可以从通过离子交换层析分离出其中CHO细胞的培养基中被分离出，此CHO细胞是用含有编码人GDF-8或GDF-11的插入片段的表达质粒稳定转染的细胞，在100℃加热直到10分钟之后此抑制剂仍保持活性，在还原之后它丧失活性，以及在用6M尿素处理之后它仍保持活性。
34.权利要求33的GDF-8或GDF-11抑制剂，它具有小于大约70kDa的分子量。
35.权利要求31或33中任何之一的GDF-8或GDF-11抑制剂，其中该抑制剂不具有GDF-8或GDF-11活性。
36.一种GDF抑制剂，是借助于权利要求1或17中任何之一的方法鉴定的。
37.权利要求36的GDF抑制剂，其中该抑制剂是一种GDF蛋白。
38.一种GDF蛋白或肽，它可抑制GDF活性。
39.权利要求38的蛋白或肽，其中该蛋白或肽本身不显示出GDF活性。
40.权利要求38的蛋白或肽，其中该蛋白或肽是人工合成的。
41.权利要求38的蛋白或肽，其中该蛋白或肽来源于天然GDF多肽。
42.权利要求38的蛋白质或肽，是通过重组技术产生的。
43.一种GDF抑制剂，它包含GDF蛋白的前功能区或该前功能区的一部分。
44.权利要求43的GDF抑制剂，其中该抑制剂是被糖基化的。
45.一种包含选自SEQ ID NO：1，2，3和4核苷酸序列的分离核酸，当它被转染进入细胞可抑制GDF表达。
46.一种包含选自SEQ ID NO：5-24核苷酸序列的分离核酸，当它被转染进入细胞可抑制GDF表达。
47.一种GDF抑制剂，包含GDF蛋白的变异体。
48.权利要求47的GDF抑制剂，其中的GDF蛋白变异体是半胱氨酸变异体。
49.权利要求47的GDF抑制剂，其中的GDF蛋白变异体是前功能区变异体。
50.权利要求47的GDF抑制剂，其中的GDF蛋白变异体是翻译后修饰变异体。
51.一种包含选自SEQ ID NOs：25，29或30氨基酸序列的分离多肽，其中该分离多肽可抑制细胞内的GDF活性。
52.一种表达GDF抑制剂的非人动物。
53.权利要求52的非人动物，其中该GDF抑制剂包含GDF蛋白的前-功能区。
54.权利要求53的非人动物，其中的GDF蛋白是GDF-8或GDF-11。
55.权利要求55的非人动物，其中该动物是鸡。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7867973B2 (en) 2004-04-15 2011-01-11 Techno Networks Shikoku Co., Ltd. Follistatin variant polypeptide
CN101282992B (zh) * 2005-10-12 2013-02-13 伊莱利利公司 抗肌抑制素抗体
CN101848997B (zh) * 2007-10-15 2013-06-19 生物领先公司 用于Myo-2肽多聚体和肌生成抑制素的融合蛋白表面表达载体以及由其转化的微生物

Families Citing this family (83)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7393682B1 (en) 1993-03-19 2008-07-01 The Johns Hopkins University School Of Medicine Polynucleotides encoding promyostatin polypeptides
US6891082B2 (en) * 1997-08-01 2005-05-10 The Johns Hopkins University School Of Medicine Transgenic non-human animals expressing a truncated activintype II receptor
US6656475B1 (en) * 1997-08-01 2003-12-02 The Johns Hopkins University School Of Medicine Growth differentiation factor receptors, agonists and antagonists thereof, and methods of using same
US7037501B2 (en) 2001-01-04 2006-05-02 Regents Of The University Of Minnesota Myostatin immnoconjugate
TW200526779A (en) 2001-02-08 2005-08-16 Wyeth Corp Modified and stabilized GDF propeptides and uses thereof
EP1790726B1 (en) * 2001-02-08 2013-07-03 Wyeth LLC Modified and stabilized GDF propeptides and uses thereof
US7629317B2 (en) 2001-03-29 2009-12-08 The University Of Chicago Control of growth and repair of gastro-intestinal tissues by gastrokines and inhibitors
US6734289B2 (en) 2001-03-29 2004-05-11 The University Of Chicago Gastrokines and derived peptides including inhibitors
NZ530025A (en) * 2001-06-05 2005-06-24 Inst Genetics Llc Methods for purifying highly anionic proteins
EP1404866B1 (en) * 2001-07-11 2008-09-03 ORICO Limited Bioassay for myostatin
US7320789B2 (en) 2001-09-26 2008-01-22 Wyeth Antibody inhibitors of GDF-8 and uses thereof
MXPA04008150A (es) 2002-02-21 2005-06-17 Wyeth Corp Gasp1: una proteina que contiene dominio de folistatina.
KR20040096592A (ko) 2002-02-21 2004-11-16 와이어쓰 폴리스타틴 도메인을 포함하는 단백질
US7261893B2 (en) 2002-10-22 2007-08-28 Wyeth Neutralizing antibodies against GDF-8 and uses therefor
US7511012B2 (en) * 2002-12-20 2009-03-31 Amgen Inc. Myostatin binding agents
CA2526669A1 (en) 2003-06-02 2004-12-16 Wyeth Use of myostatin (gdf8) inhibitors in conjunction with corticosteroids for treating neuromuscular disorders
US7625867B2 (en) 2004-03-26 2009-12-01 Acceleron Pharma Inc. BMP-3 propeptides and related methods
WO2005113590A2 (en) 2004-05-12 2005-12-01 Acceleron Pharma Inc. Bmp10 propeptides and related methods
CA2572330A1 (en) 2004-06-24 2006-01-05 Acceleron Pharma Inc. Gdf3 propeptides and related methods
EP2332977B1 (en) 2004-07-23 2015-11-25 Acceleron Pharma Inc. ActRII receptor polypeptides
AR050187A1 (es) * 2004-07-29 2006-10-04 Schering Plough Ltd Uso de inhibidores de alk 5 para modular o inhibir la actividad de miostatina, a fin de lograr mayor acumulacion de tejido magro en animales
US20060240488A1 (en) * 2005-03-23 2006-10-26 Nowak John A Detection of an immune response to GDF-8 modulating agents
MX2007011400A (es) * 2005-03-23 2007-10-11 Wyeth Corp Deteccion de agentes moduladores de crecimiento y la diferenciacion del factor 8 (gdf 8).
US8017576B2 (en) 2005-05-10 2011-09-13 The University Of Chicago Methods and compositions to treat mucositis
EP2407486B1 (en) 2005-08-19 2017-11-22 Wyeth LLC Antagonist antibodies against GDF-8 and uses in treatment of ALS and other GDF-8-associated disorders
CA2624976A1 (en) 2005-10-06 2007-04-19 Eli Lilly And Company Anti-myostatin antibodies
US8067562B2 (en) 2005-11-01 2011-11-29 Amgen Inc. Isolated nucleic acid molecule comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:1
KR20190006086A (ko) 2005-11-23 2019-01-16 악셀레론 파마 인코포레이티드 액티빈-ａｃｔｒⅱａ 길항제 및 골 성장을 촉진하기 위한 이들의 용도
US8128933B2 (en) 2005-11-23 2012-03-06 Acceleron Pharma, Inc. Method of promoting bone growth by an anti-activin B antibody
JP5058261B2 (ja) 2006-09-05 2012-10-24 イーライ リリー アンド カンパニー 抗ミオスタチン抗体
US8895016B2 (en) 2006-12-18 2014-11-25 Acceleron Pharma, Inc. Antagonists of activin-actriia and uses for increasing red blood cell levels
EP2446896A1 (en) 2006-12-18 2012-05-02 Acceleron Pharma, Inc. Activin-ActRII Antagonists for use in Increasing Red Blood Cells, increasing reticulocyte levels, or promoting erythropoiesis
RU2473362C2 (ru) 2007-02-01 2013-01-27 Акселерон Фарма Инк. АНТАГОНИСТЫ АКТИВИНА-ActRIIa-Fc И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ИЛИ ПРОФИЛАКТИКИ РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ
TWI548647B (zh) 2007-02-02 2016-09-11 艾瑟勒朗法瑪公司 衍生自ＡｃｔＲＩＩＢ的變體與其用途
EA025371B1 (ru) 2007-02-09 2016-12-30 Акселерон Фарма Инк. АНТАГОНИСТЫ АКТИВИНА-ActRIIa И ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ СТИМУЛЯЦИИ РОСТА КОСТИ У БОЛЬНЫХ РАКОМ
TWI573802B (zh) 2007-03-06 2017-03-11 安美基公司 變異之活動素受體多肽及其用途
US8501678B2 (en) 2007-03-06 2013-08-06 Atara Biotherapeutics, Inc. Variant activin receptor polypeptides and uses thereof
GB0715087D0 (en) 2007-08-03 2007-09-12 Summit Corp Plc Drug combinations for the treatment of duchenne muscular dystrophy
EP3243524A1 (en) 2007-09-18 2017-11-15 Acceleron Pharma Inc. Activin-actriia antagonists and uses for decreasing or inhibiting fsh secretion
PE20091163A1 (es) 2007-11-01 2009-08-09 Wyeth Corp Anticuerpos para gdf8
LT3494986T (lt) 2008-08-14 2020-07-10 Acceleron Pharma Inc. Gdf gaudyklės
US8216997B2 (en) 2008-08-14 2012-07-10 Acceleron Pharma, Inc. Methods for increasing red blood cell levels and treating anemia using a combination of GDF traps and erythropoietin receptor activators
CN104371024A (zh) 2008-11-26 2015-02-25 安姆根有限公司 激活素iib受体多肽的变异体及其用途
WO2010083034A1 (en) 2009-01-13 2010-07-22 Acceleron Pharma Inc. Methods for increasing adiponectin
US8178488B2 (en) 2009-06-08 2012-05-15 Acceleron Pharma, Inc. Methods for increasing thermogenic adipocytes
KR20190090049A (ko) 2009-06-12 2019-07-31 악셀레론 파마 인코포레이티드 절두된 ＡｃｔＲＩＩＢ-ＦＣ 융합 단백질
NZ712943A (en) 2009-08-13 2017-08-25 Acceleron Pharma Inc Combined use of gdf traps and erythropoietin receptor activators to increase red blood cell levels
MX2012003924A (es) * 2009-10-01 2012-08-03 Covita Ltd Antagonistas peptidicos sinteticos de miostatina.
JP5836961B2 (ja) 2009-11-03 2015-12-24 アクセルロン ファーマ， インコーポレイテッド 脂肪肝疾患を処置するための方法
ES2658292T3 (es) 2009-11-17 2018-03-09 Acceleron Pharma, Inc. Proteínas ActRIIB y variantes y usos de las mismas con respecto a la inducción de la utrofina para el tratamiento de la distrofia muscular
US20120121576A1 (en) 2010-11-08 2012-05-17 Jasbir Seehra Actriia binding agents and uses thereof
BR122019023166B1 (pt) 2011-10-17 2021-02-23 Acceleron Pharma, Inc Uso de um polipeptídeo para a fabricação de um medicamento paratratar anemia associada à mielofibrose
MX358358B (es) 2011-12-19 2018-08-15 Amgen Inc Polipeptidos de receptores de activina variantes y sus usos.
MX364738B (es) 2012-06-15 2019-05-03 Pfizer Anticuerpos antagonistas mejorados contra factor-8 de crecimiento y diferenciacion y usos de los mismos.
CA2880649C (en) 2012-08-01 2023-03-14 Elizabeth MCNALLY Mitigating tissue damage and fibrosis via latent transforming growth factor beta binding protein (ltbp4)
EA201590693A1 (ru) 2012-10-05 2015-08-31 Ригель Фармасьютикалс, Инк. Ингибиторы gdf-8
CA2890217C (en) 2012-11-02 2021-07-20 Yifu FANG Activin-actrii antagonists and uses for treating bone and other disorders
MX2015009901A (es) 2013-02-01 2016-04-06 Santa Maria Biotherapeutics Inc Administración de un compuesto de antiactivina a a un sujeto.
CA2911514A1 (en) 2013-05-06 2014-11-13 Scholar Rock, Inc. Compositions and methods for growth factor modulation
BR112016024319B1 (pt) 2014-04-18 2024-01-23 Acceleron Pharma Inc USO DE UMA COMPOSIÇÃO COMPREENDENDO UM ANTAGONISTA DE ActRII PARA A FABRICAÇÃO DE UM MEDICAMENTO PARA TRATAR OU PREVINIR UMA COMPLICAÇÃO DE ANEMIA FALCIFORME
KR20210119546A (ko) 2014-06-04 2021-10-05 악셀레론 파마 인코포레이티드 폴리스타틴 폴리펩티드를 이용한 장애의 치료방법 및 치료를 위한 조성물
AU2015274277B2 (en) 2014-06-13 2021-03-18 Acceleron Pharma, Inc. Methods and compositions for treating ulcers
MA41052A (fr) 2014-10-09 2017-08-15 Celgene Corp Traitement d'une maladie cardiovasculaire à l'aide de pièges de ligands d'actrii
EP3221318B1 (en) 2014-11-21 2021-08-25 Rigel Pharmaceuticals, Inc. Fused imidazole derivatives as tgf-beta inhibitors
MA41119A (fr) 2014-12-03 2017-10-10 Acceleron Pharma Inc Méthodes de traitement de syndromes myélodysplasiques et d'anémie sidéroblastique
DK3227675T3 (da) 2014-12-03 2023-05-30 Celgene Corp Activin-actrii-antagonister og anvendelser til behandling af myelodysplastisk syndrom
ES2928084T3 (es) 2015-02-20 2022-11-15 Rigel Pharmaceuticals Inc Inhibidores de GDF-8
EP3265454B1 (en) 2015-03-02 2020-02-26 Rigel Pharmaceuticals, Inc. Tgf-beta inhibitors
EP3283479B1 (en) 2015-04-01 2022-12-14 Rigel Pharmaceuticals, Inc. Tgf-beta inhibitors
US10822337B2 (en) 2015-04-01 2020-11-03 Rigel Pharmaceuticals, Inc. TGF-β inhibitorC
JP6810702B2 (ja) 2015-04-06 2021-01-06 アクセルロン ファーマ インコーポレイテッド シングルアームｉ型およびｉｉ型受容体融合タンパク質およびその使用
MA41919A (fr) 2015-04-06 2018-02-13 Acceleron Pharma Inc Hétéromultimères alk4:actriib et leurs utilisations
WO2016164503A1 (en) 2015-04-06 2016-10-13 Acceleron Pharma Inc. Alk7:actriib heteromultimers and uses thereof
PL3286206T3 (pl) 2015-04-22 2021-09-13 Biogen Ma Inc. Nowe hybrydowe białka pułapki na ligand actriib do leczenia chorób powodujących zanik mięśni
EP3380121B1 (en) 2015-11-23 2023-12-20 Acceleron Pharma Inc. Actrii antagonist for use in treating eye disorders
EP3496739B1 (en) 2016-07-15 2021-04-28 Acceleron Pharma Inc. Compositions comprising actriia polypeptides for use in treating pulmonary hypertension
AU2017302282A1 (en) 2016-07-27 2019-02-07 Acceleron Pharma Inc. Methods and compositions for treating myelofibrosis
CN110036025B (zh) 2016-10-05 2024-03-22 阿塞勒隆制药公司 变体ActRIIB蛋白及其用途
EP4026556A1 (en) 2016-10-05 2022-07-13 Acceleron Pharma Inc. Compositions and method for treating kidney disease
KR20190075078A (ko) 2016-10-05 2019-06-28 악셀레론 파마 인코포레이티드 ALK4:ActRIIB 이형다량체 및 이의 용도
WO2020132647A1 (en) 2018-12-21 2020-06-25 Northwestern University Use of annexins in preventing and treating muscle membrane injury
US20220062299A1 (en) 2018-12-26 2022-03-03 Northwestern University Use of glucocorticoid steroids in preventing and treating conditions of muscle wasting, aging and metabolic disorder
EP3995153A4 (en) * 2019-06-26 2023-11-22 KNC Laboratories Co., Ltd. NUCLEIC ACID DRUG SUPPRESSING MYOSTATIN GENE MRNA PRODUCTION

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5254678A (en) * 1987-12-15 1993-10-19 Gene Shears Pty. Limited Ribozymes
CA2157577C (en) * 1993-03-19 2009-11-17 Se-Jin Lee Growth differentiation factor-8
US5616466A (en) * 1993-11-05 1997-04-01 Cantor; Glenn H. Ribozyme-mediated inhibition of bovine leukemia virus
ATE305036T1 (de) * 1994-07-08 2005-10-15 Univ Johns Hopkins Med Wachstums-differenzierungsfaktor-11
US6008434A (en) * 1994-07-08 1999-12-28 Johns Hopkins University School Of Medicine Growth differentiation factor-11 transgenic mice
US5674748A (en) * 1995-03-14 1997-10-07 Thomas Jefferson University Human cyclin-dependent kinase-like proteins and methods of using the same
US6124115A (en) * 1995-09-22 2000-09-26 Endorecherche Inc. Production and use of isolated type 5 17β-hydroxysteroid dehydrogenase
WO1998024925A1 (en) * 1995-11-08 1998-06-11 Medical University Of South Carolina Tissue specific and target rna-specific ribozymes as antimicrobial therapeutics against microbial pathogens
US5824519A (en) * 1995-11-08 1998-10-20 Medical University Of South Carolina Tissue-specific and target RNA-specific ribozymes
AU6274298A (en) * 1997-02-05 1998-08-25 Johns Hopkins University School Of Medicine, The Growth differentiation factor-8
NO971997D0 (no) * 1997-04-29 1997-04-29 Kjetil Tasken Bruk av immunmodulerende midler
PT2045322E (pt) * 1997-07-14 2015-10-16 Université de Liège Musculatura dupla em mamíferos
AU8666398A (en) * 1997-08-01 1999-02-22 Johns Hopkins University School Of Medicine, The Methods to identify growth differentiation factor (gdf) receptors
US6369201B1 (en) * 1998-02-19 2002-04-09 Metamorphix International, Inc. Myostatin multimers
NZ528341A (en) * 1998-07-28 2005-06-24 Univ Johns Hopkins Med Use of reagents that affect growth differentiation factor-11 (GDF-11) to treat chronic or acute renal disease

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7867973B2 (en) 2004-04-15 2011-01-11 Techno Networks Shikoku Co., Ltd. Follistatin variant polypeptide
CN1993463B (zh) * 2004-04-15 2012-10-03 四国技术网络株式会社 促滤泡素抑制素突变多肽
CN101282992B (zh) * 2005-10-12 2013-02-13 伊莱利利公司 抗肌抑制素抗体
CN101848997B (zh) * 2007-10-15 2013-06-19 生物领先公司 用于Myo-2肽多聚体和肌生成抑制素的融合蛋白表面表达载体以及由其转化的微生物

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AU2004203398A1 (en) 2004-08-19
JP2003517580A (ja) 2003-05-27
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WO2000043781A3 (en) 2001-02-01
CA2359242A1 (en) 2000-07-27

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