CN1867673A - 增强骨矿化的nell－1 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及人类NELL－1基因可以诱导或者上调骨矿化的发现。因此NELL－1基因或基因产品为筛选骨矿化调节剂提供了一个方便的目标物。另外，NELL－1可以用来促进骨折的修复和/或可以在一般情况下增加骨密度。

Description

增强骨矿化的NELL-1
关于申请的对照检索
[0001]本申请要求2002年9月13日申请的USSN 60/410,846的优先权及权利，为了所有的目的，其整体在此一并作为参考。
在联邦政府资助的研究和开发下对完成发明权利的声明
[0002]这项工作得到了全国卫生研究所/国立牙科研究所批号DE94001和CRC/全国卫生研究所批号RR00865的资助。美国政府可能享有本发明的某些权利。
技术领域
[0003]本发明涉及NELL-1的上调可以提高骨钙化的发现。因此NELL-1为筛选骨钙化调节剂提供了一个好的目标物。另外，NELL-1蛋白质可以与骨生成蛋白类似的方法来促进骨修复。
背景技术
[0004]每3000个婴儿中就有1个受到先天性非综合症性颅缝闭合(CS)，即先天性的头盖骨缝闭合的影响，并且其是人类最常见的先天性颅面畸形之一(1)。可以导致头盖畸形的先天性骨缝闭合或源于家族或为偶发。性别和种族都不能用来预测哪一个胎儿会受到影响。虽然与CS相关的综合病症的基因连接分析已经提供出很多关于骨缝形成的分子控制、局部骨缝闭合的生物学、特别是综合病症的信息，但是非家族性CS的大部分仍然是未知的。
[0005]目前，已经将超过85个可以产生不同家族性CS综合病症的人类突变定位于FGF受体基因FGFR1、FGFR2和FGFR3。所有的都是导致受体活性(1)增加的“功能获得”突变。人类CS综合病症与FGF配体没有关系；但是，有几种CS的动物模型和FGF过度表达有关(2，3)。唯一描述的与CS(4)相关的MSX2突变也导致MSX2活性的增加(5-7)。这些候选基因不仅公知为在造骨细胞的增殖和分化过程中发挥重要的作用，其还在胎儿的形成过程中发挥着更广泛的作用。因此，对带有这些基因突变的转基因鼠模型通常显示出在CS病人上观察不到的颅外畸形并不意外(1，2，8)。
[0006]人类CS先天性骨缝闭合可以分为两个可能不同的过程：头盖过度生长和骨融合。虽然头盖过度生长可能对为诱导骨融合而使两个相反的骨质前端接近有重要意义，但是头盖骨过度生产或重叠将会导致骨融合并不是必然的。因此，对先天性骨缝闭合机理的研究必须包括对头盖骨过度生长/重叠以及骨融合的研究。
[0007]最近，已经通过CBFA1-媒介路径在头盖骨缝融合中对FGF2和FGFR1进行暗示(8)。CBFA1的错义突变和头盖发育异常有关，显示为延迟的骨缝闭合(9)。因此，CbBfa1(Runx2)的检查，也就是作为对骨形成非常重要的Fgfr1下游目标可能是理解CS信号流的关键。另外，在CS(5，6)的动物模型中，对Msx2，也就是作为在发展过程中带有多向性的保存完好的Msx同源异形盒基因族中的一员进行了暗示。明确地，增强的骨质细胞增殖被认为是Msx2-过度表达的转基因鼠体内先天性骨缝闭合的机理，其表现为没有骨缝融合的骨缝过度生长/重叠。
发明概述
[0008]为了阐明骨缝闭合的分子路径，我们以前使用差异显示来鉴别在非家族性、非综合病症CS病人中的反常融合骨缝中被特异性上调的基因。我们分离并且鉴别为Nel样、类型1分子(一种在神经组织中强烈表达的蛋白质，编码为EGF样区域)的NELL-1(10-12)。Nell-1是一种分泌的蛋白质。在结构上，Nell-1编码一种分泌的信号肽序列，一个NH2-末端血小板凝血酶敏感蛋白-1(thrombospondin-1)-类的模块，五个维勒布兰德因子-如重复六个半胱氨酸残基，和六个EGF样区域。Nell-1还能在不同物种中得到高度地保留。例如，鼠Nell-1和人Nell-1之间存有93％的同源氨基酸。
[0009]Nell-1编码一条分子重量为90kDa的多肽。当在COS细胞中过度表达时，在真核细胞中，糖基化形式与50-kDa醣类部分进行N-连接，以产生在细胞质中发现的140-kDa形式。140-kDa蛋白质进一步被加工为130-kDa蛋白质。Nell-1蛋白质被分泌为具有很大分子量(约400kDa)的三聚形式(13，14)。
[0010]最初的研究暗示优先在颅盖组织的颅面区域表达NELL-1(12-14)。通过骨质区域的造骨细胞样的过度表达程度使CS病人的先天性骨缝闭合很明显。虽然NELL-1过度表达和先天性骨缝闭合可能是巧合，但是我们的数据显示Nell-1可能是头盖骨缝闭合的一个局部调整因子。在研究中，我们进一步证实了Nell-1在CS中有重要作用。我们制作了一个显示使Nell-1的过度表达泛化的转基因鼠模型。Nell-1转基因动物与带有CS的人类有很多共性。它们显示出颅盖的过度生长/重叠和先天性骨缝闭合。被Nell-1腺病毒(adenoviral)构成物感染的造骨细胞显示出Nell-1提高以及加快了造骨细胞的分化。另外，Nell-1下调抑止造骨细胞的分化。因此，Nell-1代表了产生头盖骨缝闭合的候选基因，以及为CS研究和颅面发展提供了新的视野。
[0011]在一个实施方案中，本发明提供一种调节颅面造骨细胞分化和矿化的方法。所述方法包括改变Nell-1的表达或活性，其Nell-1增加的表达和活性会增加造骨细胞分化或矿化，Nell-1减少的表达和活性会减少造骨细胞分化或矿化。可以通过任何方便的方法(例如，反-Nell-1反义分子，Nell-1特异性酶核(specific riibozyme)，nell-1特异性催化性DNA，Nell-1特异性RNAi，反-Nell-1胞内抗体，和在特异性目标的细胞和/或组织中敲除Nell-1的基因治疗方法)来抑止Nell-1的表达或活性。类似的，可以通过任何一种方便的方法(例如，通过用表达Nell-1的外源核酸转染细胞，用Nell-1蛋白质转染细胞等)来提高Nell-1的表达和活性。哺乳动物可能是经历过反常头盖骨缝发育(例如先天性的头盖骨缝闭合(CS))的哺乳动物(人类或者非人类哺乳动物)。
[0012]本发明还提供一种促进哺乳动物体内潜在TGF-β1活化的方法。该方法包括使哺乳动物服用外源Nell-1，或者增加所述哺乳动物体内内源Nell-1的表达活性。
[0013]本发明还提供一种活化或螯合哺乳动物体内TGF-β超家族成员的方法。该方法包括使哺乳动物服用外源Nell-1，或者增加哺乳动物体内内源Nell-1的表达活性。
[0014]在另外一个实施方案中，本发明提供一种对调整造骨细胞分化的试剂进行筛选的方法。该方法包括使含有NELL-1基因的测试细胞和测试试剂接触；并且检测测试细胞中NELL-1基因表达水平或Nell-1基因活性的改变，将其与对照细胞中Nell-1基因的表达水平或活性进行比较，其中测试细胞和对照细胞中的NELL-1的表达水平或者Nell-1活性的差异显示出所述药剂调整骨矿化。在某些实施方案中，对照是在比测试细胞浓度低的情况下与测试试剂接触(例如，半浓度，没有试剂等)的阴性对照细胞。在某些实施方案中，对照是在比测试细胞浓度高的情况下与试剂接触的阳性对照细胞。在不同的实施方案中，通过测量所述细胞中NELL-1mRNA水平来检测nell-1的表达水平和/或如这里所描述的，通过测量生物细胞中NELL-1蛋白质的表达水平来检测NELL-1的水平。
[0015]在另外一个实施例中，本发明提供一种调整哺乳动物细胞内Nell-1表达的方法。该方法包括变化Msx2和/或Cbfa1的表达或活性。在某些实施例中，上调Cbfa1的表达或活性来上调Nell-1的表达或活性。在某些实施例中，上调Msx2的表达或活性来下调Nell-1的表达或活性。
[0016]类似的，提供调节Nell-1表达或活性的试剂的筛选方法，所述方法包括使含有Msx2和/或Cbfa1基因的测试细胞和测试试剂接触；并且检测所述测试细胞中Cbfa1和/或Msx2基因表达水平或Cbfa1和/或Msx2基因活性的变化，将其与对照细胞中的Cbfa1和/或Msx2基因的表达水平或Cbfa1和/或Msx2基因的活性相对照，其测试细胞和对照细胞之间的Cbfa1和/或Msx2基因的表达水平或CBfa1和/或Msx2基因的活性的差异显示出该药剂调整Nell-1的表达或活性。
[0017]本发明还提供一种药物配方，包括：一种或者多种选自编码Nell-1蛋白质的核酸，Nell-1蛋白质或改变Nell-1蛋白质活性或表达的药剂的活性剂；和药学上可以接受的赋型剂。
[0018]在另外一个实施例中，本发明涉及由人类NELL-1基因编码的多肽诱导骨钙化以及因此为骨质的发现。NELL-1基因和基因产品(例如mRNA，cDNA，蛋白质等)为筛选NELL-1表达和/或活性调节剂、以及由此筛选骨钙化调节剂提供了一个目标物。另外，可以将NELL-1用于与骨形成素蛋白质(BMPS)类似的方法中来加速骨折修复，以及作为骨移植材料的成分。
[0019]如一个优选实施方案所示，本发明提供一种用于筛选调节骨钙化的试剂的方法。该方法包括使含有NELL-1基因的细胞和测试试剂接触；并且检测NELL-1基因表达水平的改变，以及将其与细胞中未与测试试剂接触的NELL-1基因的表达相对比，与测试试剂接触和未接触的在细胞中的NELL-1表达水平的差异(例如普通DNA复制数量，mRNA水平，蛋白质水平，蛋白质活性等)显示出所述试剂调整骨矿化。该方法可以进一步包括改变NELL-1活性调节器数据库或骨矿化调节器数据库中NELL-1核酸或NELL-1蛋白质表达的测试试剂。在实施方案中，通过测量细胞中NELL-1mRNA的水平(例如，通过将所述的mRNA与和特异性NELL-1核酸杂交的探针杂交)来检测NELL-1的表达水平。优选的杂交方法包括但不限于Northern吸印杂交，使用从NELL-1RNA得到的Southern印迹杂交，杂交点阵，亲合色谱法和原位杂交。本发明方法以点阵为基础进行检验。因此，一些实施方案中，探针是形成探针点阵中多个探针中的一员。还可以通过核酸扩增反应(例如PCR)来测定NELL-1的表达水平。
[0020]在本发明的筛选系统的其他实施方案中，通过测定生物样品中NELL-1蛋白质(例如通过毛细管电泳，Western印迹，质谱，ELISA，色谱，免疫层析法，免疫组织化学)的表达水平来检测NELL-1表达。细胞可以是体外培养的或体内或原位。一些实施例中，测试试剂不是抗体和/或蛋白质和/或核酸。优选的测试试剂是有机小分子。
[0021]本发明还提供一种预先筛选潜在的NELL-1表达和/或活性的调节剂的方法。该方法包括使NELL-1核酸或NELL-1蛋白质与测试试剂接触；并且检测所述测试试剂与NELL-1蛋白质或NELL-1核酸之间的特异性键。该方法进一步包括记录和NELL-1活性候选调节器数据库和/或骨矿化候选调节器数据库中NELL-1核酸或NELL-1蛋白质特异性结合的测试试剂。所述测试试剂可以直接与NELL-1蛋白质或NELL-1核酸，或含有核酸或蛋白质的细胞和/或组织和/或生物体(例如哺乳动物)接触。当接触细胞时，细胞可以在主要的或阶段的培养物中。一些实施方案中，所述测试试剂不是抗体和/或不是蛋白质和/或不是核酸。优选的试剂是有机小分子。当测定测试试剂结合核酸的能力时，优选采用Northern吸印杂交，使用DNA的Southern印迹杂交，杂交阵，亲合色谱法或原位杂交。当测定测试试剂结合NELL-1蛋白质的能力时，优选采用毛细管电泳，Western印迹，质谱，ELISA，免疫层析法或者免疫组织化学。)
[0022]在另外一个实施例中，本发明提供了一种增强骨矿化的方法。优选的方法包括增加骨质细胞(例如造骨细胞，间质细胞，成纤维细胞，胎儿胚细胞，干细胞，骨髓细胞，硬脑膜细胞，软骨细胞，成软骨细胞等)中或发现该细胞的环境中的NELL-1基因产品的浓度。在一个优选的实施方案中，通过上调NELL-1基因的表达增加NELL-1基因的浓度。这可以通过很多种方法来完成，包括但不限于上调内源NELL-1基因的表达(例如通过修改内源的调整区域，如启动子)，或用含有表达NELL-1蛋白质的载体转染细胞。当其他优选载体为可诱导时，某些优选载体基本上表达NELL-1蛋白质。在另外一个实施方案中，通过含有NELL-1多肽的骨来增加NELL-1基因产品的浓度。
[0023]本发明还提供一种促进骨折修复的方法。该方法包括增加骨折位置或其周围NELL-1基因产品的浓度。优选的实施方案中，增加骨折位置上或周围的成骨质或骨祖细胞中的NELL-1基因产品。该方法可以包括将过度表达NELL-1的成骨质或骨祖细胞引入到骨折位置。在另一个实施例中，本发明包括增加原位成骨质细胞或所述骨祖细胞的NELL-1基因浓度。可以通过这里的描述来实现NELL-1基因产品的上调。在另一个实施方案中，使细胞和/或骨折位置与NELL-1多肽接触。
[0024]在修复骨折的另一方面中，使骨折位置与NELL-1蛋白质接触。可以通过细胞(例如通过引入过度表达NELL-1蛋白质而引导的)和/或通过单独服用蛋白质或连同药学赋型剂一起服用，和/或服用能够表达NELL-1的“裸露DNA”载体来产生这种蛋白质。NELL-1蛋白质可以作为骨修复/骨移植的材料成分和/或假肢器官装置的一部分。一个优选的移植材料在NELL-1蛋白质和/或表达NELL-1蛋白质的细胞以外还包括骨胶原和/或骨片段。
[0025]在另一个实施方案中，本发明提供一种能够增强被移植动物的骨组织结构的骨移植材料。优选的骨移植材料基本上包括生物适合的基质和NELL-1蛋白质。优选的移植材料是可以重复吸收/生物降解的。此外，所述的基质可以充满NELL-1蛋白质和/或表达NELL-1蛋白质的细胞。优选的骨移植材料包括含有(例如约65到约95重量百分比)充分均匀分散的再生骨胶原；和(例如约35到约5重量百分比)NELL-1蛋白质和/或表达NELL-1蛋白质的细胞的骨胶原轭合物。
定义
[0026]术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在这里可替交地用来表示氨基酸残基的聚合物。这些术语用于指代其中一个或多个氨基酸残基是相应天然氨基酸的人造化学类似物，和天然存在的的氨基酸聚合物的氨基酸聚合物。
[0027]术语“NELL-1 cDNA”和“NELL-1”基因组DNA指由Watanabe等人(1996)Genomics 38(3)：273-276；汀等人(1999)J BoneMineral Res，14：80-89；和GENBANK Accession Number U57523)中所公开的cDNA和基因组DNA。
[0028]NELL-1蛋白质是指由NELL-1基因或cDNA表达的蛋白质。NELL-1蛋白质可以包括具有诱导骨矿化能力的蛋白质片段。
[0029]这里使用的术语“抗体”包括各种形式的修正过或改变的抗体，如完整的免疫球蛋白，只含有轻链和重链可变区的Fv片段，通过二硫键结合的Fv片段(Brinkmann等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：547-551)，含有可变区和部分恒定区的Fab或(Fab)′2片段，单链抗体等(Bird等人(1988)Science 242：424-426；Huston等人(1988)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 85：5879-5883)。抗体可以来自动物(特别是小鼠或大鼠)或者人或者是嵌合的(Morrison等人(1984)Proc Nat.Acad.Sci.USA 81：6851-6855)或人源化(Jones等人(1986)Nature 321：522-525，和出版的英国专利#8707252)。
[0030]术语“结合部分”或“捕获剂”或“结合对”成员是指和其他分子特异性结合以形成结合络合物的分子，如抗体-抗原、外源凝集素-碳水化合物、核酸-核酸、生物素-抗生物素蛋白质等。
[0031]当涉及到生物分子(例如蛋白质，核酸，抗体等)时，这里使用的术语“特异性结合”是指对生物分子在不同种类的分子(例如蛋白质和其他生物制剂)中的存在起决定作用的结合反应。因此，在给定的条件下(例如在有抗体情况下的免疫测定或在核酸存在条件下的严格杂交条件)，特异性的配体或抗体与特异性的“靶”分子结合，而不会大量的和样品中存在的其他分子结合。
[0032]术语骨质疏松症指特征为骨质降低和骨折的多种病症。临床上，骨质疏松症分为类型I和类型II。类型I骨质疏松症主要发生在中年妇女身上，以及其是与更年期缺少雌激素有关，而类型II骨质疏松症却与年纪的增加有关。
[0033]成骨不全症(OI)是指一组特征为骨和软结缔组织脆弱的与遗传相关的组织病(Byers & Steiner(1992)Annu.Rev.Med.43：269-289；Prockop(1990)J.Biol.CHEM.265：15349-15352)。男女都会同样地受影响，现在所估计的总发生率是每5,000-14,000个活产中会有1个。听力损失，牙本质发育不全，呼吸不足，严重脊柱侧凸和肺气肿只是与一种或者多种OI相关的一些情形而已。虽然无法得到准确的卫生保健成本，但是与OI有关的发病率和死亡率肯定是由极端的骨折(OI类型I-IV)和根由骨折修复的反常骨变形(OI类型II-IV)导致的。
[0034]这里的术语“核酸”或者“寡核苷酸”或文义上的等同物指至少两个共价连接在一起的核苷酸。优选地，本发明核酸是指单链或双链并且通常包括磷酸二酯，虽然在下列的某些情况下可以改变主链的核酸类似物也被包括进来，该核酸类似物包括例如磷酰胺(Beaucage等人(1993)Tetrahedron 49(10)：1925)及其参考；Letsinger(1970)J.Org.Chem.35：3800；Sprinzl等人(1977)Eur.J.Biochem.81：579；Letsinger等人(1986)Nucl.Acids Res.14：3487；Sawai等人(1984)CHEM.Lett.805，Letsinger等人(1988)J.Am.Chem.Soc.110：4470；和Pauwels等人(1986)Chemica Scripta 26：1419)，硫代磷酸酯(Mag等人(1991)NucleicAcids Res.19：1437；和U.S.专利No.5,644,048)，二硫代磷酸酯(Briu等人(1989)J.Am.Chem.Soc.111：2321，O-methylphophoroamidite结合(参见Eckstein，Oligonucleotides and Analogues：A Practical Approach，Oxford University Press)，和肽核酸主链和结合(参见Egholm(1992)J.Am.Chem.Soc.114：1895；Meier等人(1992)Chem.Int.Ed.Engl.31：1008；Nielsen(1993)Nature，365：566；Carlsson等人(1996)Nature 380：207)。其他的核酸类似物包括那些阳性主链(Denpcy等人(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：6097；非离子主链(U.S.专利Nos.5,386,023，5,637,684，5,602,240，5,216,141和4,469,863；Angew.(1991)Chem.Intl.Ed.English 30：423；Letsinger等人(1988)J.Am.Chem.Soc.110：4470；Letsinger等人(1994)Nucleoside & Nucleotide 13：1597；第2和3章，ASCSymposium Series 580，″Carbohydrate Modifications in AntisenseResearch″，Ed.Y.S.Sanghui and P.Dan Cook；Mesmaeker等人(1994)，Bioorganic & Medicinal Chem.Lett.4：395；Jeffs等人(1994)J.Biomolecular NMR 34：17；Tetrahedron Lett.37：743(1996))和非核糖主链，包括U.S.专利No.5,235,033和5,034,506，和第6和第7章，ASCSymposium Series 580，Carbohydrate Modifications in Antisense Research，Ed Y.S.Sanghui and P.Dan Cook里面所描述的那些。含有一种或多种环碳糖的核酸也包括在核酸的定义中(参见Jenkins等人(1995)，Chem.Soc.Rev.169-176页)。在Rawls，C & E News June 2，199735页描述了几种其他核酸类似物。对核糖磷酸主链的修正可能有助于额外的部分例如标记的增加，或来增加这些分子在生理环境中的稳定性和半衰期。
[0035]这里使用的术语“特异性地杂交”和“特异性的杂交”和“选择性杂交”，是指核酸分子，特别是在严格条件下的核苷酸序列的结合、转嫁、杂交。术语“严格条件”是指在该条件下探针优先与其目标序列杂交，很少或者根本不会和其他序列杂交。核酸杂交上下文中的严格杂交和严格杂交的冲洗条件是有顺序可依的，并且在不同的环境参数下不同。关于核酸杂交的广泛的指导可以在，例如Tijssen(1993)Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology-Hybridization with Nucleic Acid Probes Part I，chapt 2，，Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acidprobe assays，Elsevier，NY(Tijssen)中可以找到。通常来说，高度严格杂交和冲洗条件选择为对特异性序列而言在确定的离子强度和pH下低于熔点(Tm)5℃。Tm是指(在确定的离子强度和pH下)有50％的目标序列和优选的合适探针杂交时的温度。特别严格条件选择为和特异性探针Tm相同的温度。使用标准的杂交方法的互补核酸杂交的严格杂交条件的一个例子是42℃，该互补核酸在点阵或者Southern或Northern印迹过滤器上有超过100个互补残基(参见例如Sambrook(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(2nd Ed.)Vol.1-3，ColdSpring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Press，NY，和以下详细的讨论)，及杂交过程是在晚上完成的。高度严格冲洗条件的例子是在72℃下以0.15M的NaCl冲洗15分钟。严格冲洗条件的例子是在65℃下以0.2x SSC冲洗15分钟(参见例如Sambrook supra.)关于SSC缓冲器的描述)。通常，高度严格冲洗先通过低度严格冲洗来除去背景探针信号。对例如超过100个核苷酸的双链的中度严格条件冲洗的例子是在45℃下以1x SSC冲洗15分钟。对例如超过100个核苷酸的双链的低度严格条件冲洗的例子是在40℃下以4x-6x SSC冲洗15分钟。
[0036]“成骨质细胞”是指具有矿化能力的细胞。成骨质细胞包括造骨细胞、造骨样细胞、间质细胞、成纤维细胞、胎儿胚胎细胞、干细胞、骨髓细胞、硬脑膜细胞、软骨细胞(chrondrocyes)和成软骨细胞。
[0037]术语“测试试剂”是指在这里描述的一种或多种方法中筛选的试剂。这些试剂本质上可能是任何化合物。其可以以单一的独立化合物或者作为化学库(例如组合的)的一个成员而存在。在特别优选的实施方案中，试剂是有机小分子。
[0038]术语“有机小分子”是指尺寸可以与药学上通常使用的有机分子相配的分子。术语不包括生物大分子(例如蛋白质，核酸等)。优选的有机小分子的尺寸最多约为5000Da，更优选的是最多为2000Da，最优选的最多为1000Da。
[0039]术语数据库是指一种记录和检索信息的工具。在优选的实施方案中，数据库还对储存的信息提供分类和/或搜索的方法。数据库可以包括任何方便的媒体，包括但不限于纸系统、卡系统，机械系统、电子系统、光系统、磁系统或其混合。优选的数据库包括电子数据库(例如以计算机为基础的)。在本领域是公知的用于储存和处理数据库的计算机系统包括但不限于“个人计算机系统”，主机系统，分布在英特尔网/内部网上的网点，储存在特定硬件(例如微芯片)中的数据或数据库。
附图说明
[0040]图1A显示的是NELL-1在E-14大鼠颅盖细胞原始培养物中的过度表达，其是以带有β-牛乳糖的腺病毒作为对照。图1B显示的是NELL-1和β-牛乳糖分别处理后以时间为函数的矿化示意图。试验进行三次。进行了T检验。从统计上看，带有NELL-1的矿化比带有β-牛乳糖的矿化对照高，*P＜0.001。
[0041]图2显示的是Nell-1转基因小鼠和其没有转基因的同窝出生仔畜的比较。(图2A)转基因复制数。奠基者(FA and FB)及其后裔(TF2A1，TF2A2，和TF2B1)的复制数从50到100。TF2A1和TF2A2来自奠基者A系列。TF2B1，TF2B2，和TF2B3来自奠基者B系列。(图2B)在两个奠基者中的Nell-1 RNA表达的RT-PCR分析。C，对照Nell-1质粒；M，肌肉；H，心脏；B，骨；K，肾；L，肝脏。(图2C)新生后裔整个身体(没有头)的RNA。TF2A1和TF2A2表达不同水平的Nell-1。当TF2B2和TF2B3没有表达Nell-1时，TF2B1表达Nell-1很微弱。(图2D)左边，在新生的NF2上皮细胞、肌肉、和颅盖骨中Nell-1蛋白质的免疫定位。除了颅盖骨中的一些染色外没有检测到Nell-1表达(褐变显示Nell-1的存在)。右边，Nell-1蛋白质在TF2A2上皮细胞、肌肉、和颅盖骨中的免疫定位。丰富的Nell-1表达遍及存在于软组织和骨中。Bar代表50μm。
[0042]图3为Nell-1转基因小鼠的表现型分析。(a和b)左边显示的是新生的Nell-1表现型-阳性(TF2A1)小鼠。注意额顶区域的突出(箭头)。右边显示的是NF2同窝出生仔畜。(c)左边，去掉头皮的TF2A2小鼠。矢状的(黄箭头)和PF(黑箭头)骨缝是关闭的。右边，带有显著的矢状(黄箭头)和PF(黑箭头)骨缝以及显著的骨缝下面的脉管系统的NF2同窝出生仔畜的头骨。(d)带有严重的CS、颅发育不良的婴儿。(e)TF2A1小鼠(左)和NF2同窝出生仔畜(右)的头部MRI。注意，与NF2同窝出生仔畜相比(箭头，右)，TF2A1小鼠(箭头，左)完全缺少脑室，意味着提高了头颅压力。(f)新生的Nell-1显型阳性TF2A1(左)和NF2(右)同窝出生仔畜的MCT-改造头骨三维图。箭头显示矢状和PF骨缝位置。在TF2A1小鼠中，矢状和PF骨缝大部分闭合并且被反常的脊代替。在NF2同窝出生仔畜中，矢状和PF骨缝都很明显。完整的不透明与大于50mg/cc的矿化相对应。背景中的垂直柱是与50，100，150，和200mg/cc矿化密度(从左到右)相对应的幻影参考柱。(g)显示的是f中TF2A1(左)和NF2同窝出生仔畜(右)的连续轴向MCT的截面。黄色箭头显示的是头盖骨的变形。绿色箭头显示的是TF2A小鼠(箭头，右)增强矿化的头盖骨。
[0043]图4是Nell-1转基因小鼠的组织和免疫组织分析。(块a)Nell-1显型-阳性TF2A1小鼠矢状骨缝的苏木精和曙红染色。通过颅盖边缘(黑箭头)和闭合的成骨质前方(红箭头)的重叠，显示骨缝闭合。左下方显示的是冯科萨氏(von Kossa)染色。注意闭合接近于矿化的颅盖骨边缘。(块b)NF2同窝出生仔畜矢状骨缝的苏木精和曙红染色。注意在明显骨缝位置上两个颅盖骨边缘(黑箭头)分开的大距离，以及徙前(advancing)的成骨质前额(红箭头)。左下方显示的是冯科萨氏染色。黑色表示矿化。(块c)TF2A1小鼠碱性磷酸酶(ALP)的免疫定位。布朗染色显示的是碱性磷酸酶的存在(箭头)。下方表示在低扩增倍数下的骨桥蛋白质免疫定位。(块d)上方显示的是新生的NF2头盖骨缝中碱性磷酸酶的免疫定位。下方表示在低扩增倍数下的骨桥蛋白质(OP)免疫定位。Bar表示50μm。(块e)TF2矢状骨缝的BrdU染色。增殖细胞的核被染成棕色(黑箭头)。相对于d中显示的NF2而言，增殖细胞明显减少。(块f)新生NF2小鼠矢状骨缝的BrdU染色。很多染成棕色的细胞是沿开放骨缝的颅盖边缘和沿提高的成骨质前方(红箭头)增殖的。H&E，苏木精和曙红。(块g)每块中增殖细胞的数量。
[0044]图5是Nell-1转基因TF2B1小鼠和非转基因同窝出生仔畜的比较。(a)左，去掉头皮的新生TF2B1小鼠。注意的是枕骨区域的反常凸起和相对较窄宽度的头盖骨。右，NF2同窝出生仔畜。在TF2B1转基因动物中，矢状骨缝和几个其他骨缝是闭合的。(b)TF2B1矢状骨缝的苏木精和曙红染色。骨缝的提前闭合显示在颅盖边缘的严重重叠区(红箭头)。为了RNA分析已经切除了下面的脑组织。(c)TF2B1小鼠(左)的三维MCT改造及其NF2同窝出生仔畜(右)。注意的是TF2B1小鼠(箭头，左)的提前中线骨缝闭合区域。
[0045]图6显示的是Nell-1在矿化和骨标记上的过度表达效果。(图6A)用20pfu/细胞的AdNell-1感染FRCC培养物，用冯科萨氏染色。用Adβ-gal感染对照细胞。进行三次试验。将矿化点染成黑色。(图6B)矿化区域的数据和统计分析。Ad Nell-1-感染的培养物显示出相对Adβ-gal对照而言极大的矿化。(图6C)AdNell-1-感染的MC3T3细胞在没有抗坏血酸下生长。显示出典型的微点形状。右方表示的是碱性磷酸酶染色的微点。(图6D-F)AdNell-1-感染的MC3T3细胞分别感染6，9，和12天后的微点阵。通过使用标准的看家基因(HKGs)来使基因表达强度规格化。y轴代表AdNell-1-感染细胞的杂交强度，x轴代表Adβ-gal感染细胞的杂交强度。HKGs r2表示两个样品之间看家基因(填充的方块)的相互关系。ECMs r2表示两个样品之间的候选基因表达(空的方块)的相互关系。每个图形的左上角附有微点阵阅读的照片。红色表示二重或者更多的上调，而二重或者更多的下调用绿色(g)来表示。表格总结了有在AdNell-1感染后为二重高或者低的表达差异的基因，。根据Nell-1/β-Gal.Col，Collagen来计算该比率。[0046]图7显示的是Nell-1在碱性磷酸酶上表达和骨标记上表达的下调效果。(图7A)大鼠FRCCs内用20pfu/细胞AdAntiNell-1或Adβ-Gal对照感染后的Nell-1 Western印迹分析。观察到约60％的下调。(图7B)FRCCs的碱性磷酸酶染色(红色)。AdAntiNell-1-感染的细胞明显比对照和AdNell-1-感染细胞染色少很多。(图7C)感染后3，6，9，和12天后FRCCs的Northern分析。AdAntiNell-l-感染的细胞表达骨钙素(osteocalcin)和骨桥蛋白很少。(图7D)通过磷光显像分析仪测定并且通过GAPDH规格化骨钙素(osteocalcin)(OC)和骨桥蛋白(osteopontin)(OP)的表达。
[0047]图8显示的是提前骨缝闭合中Nell-1功能的假想模型，虚线表示潜在的调节。
具体实施方式
[0048]本发明发现了一种可以促进组织(例如骨)矿化的NELL-1基因产品。不依据特异性的理论，预计通过与TGFβ超家族成员结合，NELL-1蛋白质可以执行其功能。
[0049]根据这里的描述已经认识到NELL-1可以调节组织的矿化，NELL-1核酸和/或NELL-1蛋白质为筛选骨矿化调节剂提供了一个方便的目标。因此，抑止NELL-1表达和/或蛋白质活性和/或蛋白质-蛋白质交互作用的试剂可以减少骨的矿化。相反，上调NELL-1表达和/或蛋白质活性和/或蛋白质-蛋白质交互作用的试剂可以增加骨的矿化。这样的NELL-1“激动剂”预计可以用于很多情况，包括但不限于治疗骨质疏松症、骨折复原、治疗成骨不全、骨改造等。
[0050]因此，在一个实施方案中，本发明提供一种鉴定用来调整(例如上调或下调)NELL-1表达的试剂的方法。该方法包括与NELL-1核酸，和/或含有NELL-1核酸的细胞，和/或含有NELL-1核酸的组织或生物体接触，并且检测NELL-1转录(例如mRNA)和/或NELL-1蛋白质表达水平的变化。在一个实施方案中，通过结合方法“预筛选”来鉴定用于检测的候选试剂。该结合方法包括预先筛选具有特异性结合NELL-1核酸和/或NELL-1蛋白质能力的试剂。通过这些方法鉴定的可以上调NELL-1表达的试剂可用于骨质疏松症和骨折的治疗中。
[0051]另外，以使用骨形成素蛋白质(例如BMP-1到BMP-24)类似的方法，在自然康复很有限或者不存在的情况下，NELL-1多肽可以用来加速骨折的修复或诱导骨修复或复位。通常，这些方法包括在骨折位置增加NELL-1基因产品的数量。可以通过一种或多种方法来增加NELL-1基因产品的浓度。在一种方法中，诱导骨折位置或其周围的细胞来表达提高水平的NELL-1。例如，这些可以通过使用NELL-1表达调节剂，改变NELL-1启动子，或通过转染含有表达NELL-1结构的细胞来实现。这个也可以在细胞体内完成，或者，在其他的实施方案中，通过修正这样的细胞在体外过度表达NELL-1来，然后将其引回宿主生物体(例如骨折位置或其周围)。
[0052]可以将表达或者过度表达NELL-1的细胞合并到骨移植材料中和/或可以将NELL-1多肽合并到所述骨移植材料中。这些移植材料可以用来治疗骨折或促进修复术或骨移植的复位/康复。
I.对调节NELL-1表达试剂的分析
[0053]如上所述，本发明一方面以NELL-1调节骨矿化这一发现为前提，由此为调整骨矿化的新试剂提供了一个好的目标物。因此，在一个实施方案中，本发明提供了用于调整NELL-1表达及骨矿化的试剂的筛选方法。该方法包括在讨论试剂存在的情况下检测NELL-1基因或基因产品(例如NELL-1蛋白质)的表达水平和/或活性水平。在试剂存在的情况下，与没有或低浓度试剂的阴性对照比较，提高的NELL-1表达水平或活性显示出试剂可以上调NELL-1的活性或表达。相反，在试剂存在的情况下，与没有或低浓度试剂的阴性对照比较，降低的NELL-1表达水平或活性显示出试剂可以下调NELL-1的活性或表达。
[0054]可以通过改变基因产品的转录(例如mRNA的转录)和/或改变基因产品的转译(例如蛋白质的转译)和/或转译后的修正(例如蛋白质折叠，糖基化等)来调整基因表达水平。因此本发明优选的方法包括测定转录mRNA(或其他来自NELL-1基因的核酸)的水平，蛋白质转译水平，转译蛋白质的活性等。这些方法的例子如下所述。
A)核酸基础分析
1)目标分子
[0055]通过对从mRNA和/或从mRNA(例如逆转录的cDNA等)得到的核酸的变化进行测定来检测表达水平的变化。为了测定NELL-1表达水平，需要为该分析提供一种核酸样品。在优选的实施方案中，核酸是从生物样品中发现的或来自生物样品。这里使用的术语“生物样品”是指来自有机体或有机体部分(例如细胞)的样品。样品可以是任何生物组织或液体。生物样品还可以包括如用于组织目的的冻结切片的器官或组织切片。
[0056]在某些优选实施方案中，可以按照本领域公知的任何一种方法从样品中分离核酸(例如，来自mRNA的mRNA核酸)。分离mRNA的方法对于本领域人员来说是公知的。例如，Tijssen ed.，(1993)Chapter3 of Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology：Hybridization With Nucleic Acid Probes，Part L Theory and Nucleic AcidPreparation，Elsevier，N.Y.and Tijssen ed里面所描写的核酸分离和纯化方法。
[0057]优选实施方案中，使用例如酸性的胍盐-苯酚-氯仿萃取法对给定样品进行分离得到“总”核酸，通过低(oligo)dT色谱柱或使用(dT)n磁珠(参见例如Sambrook等人，Molecular Cloning：ALaboratory Manual(2nd ed.)，Vols.1-3，Cold Spring Harbor Laboratory，(1989)，或Current Protocols in Molecular Biology，F.Ausubel等人，ed.Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York(1987))分离聚A+mRNA。
[0058]通常，在对表达水平进行分析之前需要对核酸样品进行扩增。扩增核酸的方法在本领域是公知的，包括但不限于聚合酶链反应(PCR，参见例如INNIS等人，(1990)PCR Protocols.A guide to Methodsand Application.Academic Press，Inc.San Diego，)，连接酶链反应(参见Wu and Wallace(1989)Genomics 4：560，Landegren等人(1988)Science241：1077，和Barringer等人(1990)Gene 89：117，转录扩增(Kwoh等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA_86：1173)，自主序列复制系统(Guatelli等人(1990)Proc.NAT.Acad.Sci.USA 87：1874)，点PCR，和连接接头扩增方法，等等)。
[0059]在特别优选实施方案中，需要对样品中NELL-1的转录水平(从而是表达水平)进行量化，核酸样品中的NELL-1mRNA转录浓度或来自NELL-1mRNA转录的核酸的浓度，与所述基因的转录水平(从而是表达水平)成比例关系。类似的，优选杂交信号强度和杂交核酸数量成比例。然而，当优选比例关系是相对严格时(例如双倍的转录速率导致样品核酸库中mRNA的双倍和杂交信号的双倍)，采用更松散的以及甚至非线形的比例技术是很有用的。这样，例如目标mRNA浓度中5倍的差异而导致杂交强度3-6倍的差异的方法对大部分目的来说是足够的。
[0060]当需要进行更准确的量化时，需要进行适当的控制来对按照这里所述的样品制备和杂交导致的变动进行修正。另外，可以根据本领域公知方法，使用“标准”目标核酸(例如mRNA)的连续稀释法来制备校准曲线。当然，当需要样品检测或没有转录或核酸浓度变化有较大不同时，并不需要细心控制或校准。
[0061]在最简单的实施方案中，含有NELL-1的核酸样品是分离的和/或来自生物样品的所有mRNA或cDNA。可以根据上述本领域公知的任何一种方法来从样品中分离核酸。
2)杂交基础分析
[0062]使用已知的NELL-1序列(参见例如(SEQ ID NO：1)检测和/或量化NELL-1转录，通过使用核酸杂交技术(参见例如Sambrook等人supra)可以顺利完成该过程。例如，一种分析NELL-1逆转录cDNA的存在，缺乏或量化的方法包括“Southern印迹”。在Southern印迹中，在电泳凝胶中典型为片段和分离的DNA(例如逆转录mRNA)与NELL-1特异性探针杂交。通过对带有“控制”探针(例如“看家基因”探针)的NELL-1探针的杂交强度信号的比较，可以对目标核酸的相关表达水平进行评估。
[0063]可选的，可以通过Northern印迹直接量化NELL-1mRNA。简而言之，使用例如酸性的胍盐-苯酚-氯仿萃取法从给定的细胞样品中分离mRNA。然后通过电泳mRNA来对不同种类mRNA进行分离，并且将mRNA从凝胶中转移到硝化纤维膜上。Southern印迹中，用标记探针来鉴定和/或量化目标NELL-1mRNA。适当的控制(例如看家基因探针)为分析相关表达水平提供参考。
[0064]一种可选的测定NELL-1表达水平的方法是原位杂交。原位杂交是公知的(例如Angerer(1987)Meth.Enzymol 152：649)。通常来说，原位杂交包括如下步骤：(1)固定需分析的组织或生物结构；(2)生物结构的再次杂交处理，以增强目标DNA的可接近性并减少非特定性结合；(3)将核酸混合物与生物结构或组织中的核酸杂交；(4)杂交后洗去在杂交中没有结合的核酸片段和(5)检测杂交的核酸片段。根据特定的应用，在这些步骤和条件中采用的试剂是不同的。
[0065]在一些应用中，有必要阻止重复序列的杂交能力。在一些实施方案中，使用tRNA，人类基因组DNA，或者Cot-1 DNA来阻止非特异性杂交。
3)扩增基础分析
[0066]在另一个实施方案中，扩增分析可以用来对NELL-1表达(转录)水平进行测定。在所述的扩增分析中，目标核酸序列(也就是NELL-1)作为扩增反应的模板(例如聚合酶链反应(PCR)或反转录PCR(RT-PCR))。在定量扩增中，扩增产品的数量和原始样品中模板(也就是NELL-1mRNA)的数量成比例。与适当(如未对测试试剂暴露的健康组织或细胞)对照的比较提供出对NELL-1转录水平的测定。
[0067]“定量”扩增方法对本领域人员来说是公知的。例如，定量PCR包括使用相同的引物对已知数量的对照序列进行同时共同扩增。这提供了一个可以用于校准PCR反应的内在标准。在Innis等人的(1990)PCR Protocols，A Guide to Methods and Applications，Academic Press，Inc.N.Y.中提供出定量PCR的详细描述。例如，一种包括使用那些与用来扩增目标相同的引物对已知数量的对照序列进行同时共同扩增。这提供了一个可以用于校准PCR反应的内在标准。
[0068]一个优选的内在标准是合成的AW106 cRNA。按照本领域公知的标准方法，将AW106 cRNA和从样品中分离的RNA结合。然后使用逆转录酶将RNA逆转录来提供复制DNA。然后使用标记引物扩增cDNA序列(通过例如PCR)。典型地通过电泳分离扩增产品，测定标记核酸(与扩增产品的数量成比例)的数量。通过与已知AW106 RNA标准产生的信号比较，计算出样品中mRNA的数量。PCR Protocols，AGuide to Methods and Applications，Innis等人(1990)Academic Press，Inc.N.Y.提供了关于定量PCR的详细资料。已知的NELL-1核酸序列足以顺利的选择引物来对该基因的任何部分进行扩增。
4)杂交形式和杂交的优化
a)点阵杂交形式
[0069]实施例中，本发明方法可以采用点阵杂交形式。点阵是一个附在一个或多个表面(例如固体、膜或凝胶)的不同的“探针”或“目标”核酸的多重态。在一个优选的实施方案中，将各种核酸(或其他部分)的多重态附着到单独的相连表面或者互相并列的各种表面上。
[0070]在点阵形式中，基本上可以“平行”进行大量的不同杂交反应。对一个单独的“试验”中的很多杂交提供了快速、基本上同时的分析。进行点阵形式杂交反应的方法对本领域来说是公知的(参见例如Pastinen(1997)Genome Res.7：606-614；Jackson(1996)NatureBiotechnology 14：1685；Chee(1995)Science 274：610；WO 96/17958，Pinkel等人(1998)Nature Genetics 20：207-211)。
[0071]根据很多本领域公知的方法可以产生点阵、特别是核酸点阵。例如，在一个简单的实施方案中，通过测定不同核酸在固体支持物(例如玻璃表面、膜等)上不同位置的点位(例如通过手工使用移液管)来简单的获得“低密度”点阵。
[0072]已经自动地通过这些简单测定点位方法来获得高密度点阵(参见例如U.S.专利No：5,807,522)。这个专利描写了自动系统点击表面上微毛细管来积累小容量生物样品的用途。重复这个过程来获得高密度点阵。
[0073]还可以使用寡核苷酸合成技术来制备点阵。因此，例如，US专利No.5,143,854和PCT专利No.WO 90/15070和92/10092说明了合成高密度寡核苷酸点阵中光引导组合的使用。US专利5,744,305、5,800,992和5,445,934中也描写了高密度点阵的合成。
B)其他杂交形式
[0074]如上所述，对本领域来说多种核酸杂交形式都是公知的。例如，普通的形式包括三明治(sandwich)测定和竞争(competition)测定或取代(displacement)测定。这些点阵形式通常在Hames和Higgins(1985)Nucleic Acid Hybridization，A Practical Approach，IRLPress；Gall和Pardue(1969)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 63：378-383；和John等人(1969)Nature 223：582-587中有所描述。
[0075]三明治测定是用来检测或分离核酸序列的商用杂交测定。此测定利用共价固定在固体支持物上的“捕获”核酸和溶液中的标记“信号”核酸。样品提供目标核酸。“捕获”核酸和“信号”核酸探针与目标核酸杂交形成″三明治″杂交络合物。为了使效果最好，信号核酸不应该与捕获的核酸杂交。
[0076]典型地，标记信号核酸用来检测杂交。可以使用典型用来检测杂交多核苷酸存在的几种方法中任何一种标记互补核酸或信号核酸。最普通的检测方法是采用带有3H，125I，35S，14C或32P标记等的自动射线照相术。其他的标记包括与标记抗体结合的配体，荧光团，化学发光剂，酶和可以作为标记配体的特异性结合对成员的抗体。
[0077]杂交络合物的检测可能需要产生与目标和探针多聚核苷酸或核酸的双链络合的信号的结合。典型地，通过配体和反配体的相互作用，如在与配体结合的探针和与信号结合的反配体之间，发生所述结合。
[0078]通过使用增加被检测的目标核酸的核酸扩增系统提高杂交分析的灵敏度。这些系统的例子包括聚合酶链式反应(PCR)系统和连接酶链式反应(LCR)系统。本领域最近描述的其他方法是依赖核酸序列的扩增(NASBAO，Cangene，Mississauga，Ontario)和Q Beta复制酶系统。
c)杂交条件的优化
[0079]在探针及其互补目标可以通过互补碱基对形成稳定杂合双链的条件下，核酸杂交简单包括提供一种变性探针和目标核酸。然后典型地通过附带的可检测标记的检测来将没有形成杂交链的核酸洗去，留下要接受检测的杂交核酸。通常认为，通过升高温度或者降低含有核酸的缓冲液盐浓度，或加入化学试剂或增加pH值使核酸变性。在低的严格条件(例如低温和/或高盐和/或高目标浓度)下，即使退火序列不是十分互补也将会形成杂交双链(例如DNA:DNA，RNA:RNA或RNA:DNA)。因此，在较低的严格条件下，降低了杂交的特异性。相反，在高度严格(例如高温或低盐)的条件下，成功的杂交需要较少的错配。
[0080]本领域的技术人员将会察觉到可以选择杂交条件来提供任何的严格度。在优选的实施方案中，杂交在低度严格条件下进行以保证杂交，然后在高度严格下洗涤序列以除去错配的杂交双链。可以在不断增加的高度严格(例如在37℃到70℃下以低于0.25X SSPE)下，连续进行洗涤直到获得所需水平的杂交特异性。还可以通过加入例如甲酰胺的试剂来增加严格度。可以通过将试验探针杂交与存在的不同对照杂交进行比较，来分析杂交的特异性。
[0081]通常，在杂交特异性(严格度)和信号强度之间进行一个交换。因此，在优选实施方案中，在高度严格下进行洗涤以产生一致的结果，并且提供约比背景强度大10％的信号强度。因此，在优选实施方案中，可以在连续的高度严格溶液中洗涤杂交点阵并且在每次洗涤之间读取数据。这样获得的对数据组的分析将会揭示出冲洗的严格度，在该严格度之上不能改变杂交模式，并且该严格度可为感兴趣的特异性探针提供足够的信号。
[0082]在优选的实施方案中，在杂交过程中通过使用的抑制剂(例如tRNA，精子DNA，cot-1 DNA等)来减少背景信号以降低非特异性的结合。在杂交中使用抑制剂对于本领域而言是公知的技术(参见例如P.Tijssen，supra.的第八章)。
[0083]优化杂交条件的方法对于本领域而言是公知的技术(参见例如Tijssen(1993)Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology，Vol.24：Hybridization With Nucleic Acid Probes，Elsevier，N.Y.)。
[0084]理想的条件还是用于物质类型不同结合的标记检测(例如荧光)的灵敏度、荧光染料、激发、发射谱带、光点直径等的函数。可以使用低荧光背景表面(参见例如Chu(1992)Electrophoresis13：105-114)。可以通过例如荧光化末端标记DNA片段来测量候选表面上不同直径的点(“目标因子”)的检测灵敏度。然后使用常规的荧光显微镜来显示这些点。然后可以测量来自荧光染料和固体表面不同结合的灵敏度、线形和动态范围。还可以分析已知相关部分的荧光染料对的连续稀释。这决定了荧光比例测量的灵敏度，其反应了超出将探针固定在其上的物质的荧光和检测器允许的动态范围的实际的荧光比例。
d)核酸的标记和检测
[0085]这里使用的用于检测NELL-1表达水平的探针可以是NELL-1mRNA的完整长度或比其短的长度。以经验来说，短探针用于特异性。优选的探针是足够长以至在严格条件下可以特异性地与NELL-1目标核酸进行杂交。优选的尺寸范围是从约20个碱基到NELL-1mRNA的整个长度，更优选的是从约30个碱基到NELL-1mRNA的整个长度，最优选的是从约40个碱基到NELL-1mRNA的整个长度。
[0086]典型地，用可检测得到的标记来标记探针。适合于本发明的检测标记包括可以通过分光镜、光化学、生物化学、免疫化学、电学、光学或化学方法检测得到的任何组合物。本发明中有用的标记包括用标记的抗生物素蛋白结合染色的生物素、磁珠(例如DynabeadsTM)、荧光染料(例如荧光素、德克萨斯红、玫瑰精、绿色荧光蛋白，参见例如Molecular Probes，Eugene，Oregon，USA)、放射性标记(例如3H，125I，35S，14C或32P)、酶(例如辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶和ELISA中常用的其他种类)、和例如胶体金的比色标记(例如散发高效绿光的40-80nm直径尺寸范围的金颗粒)或者有色玻璃或塑料(例如聚苯乙烯、聚丙烯、橡胶等)珠子。说明使用这些标记的专利包括US专利Nos.3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149；和4,366,241。
[0087]优选荧光标记，因为其在弱背景下可以提供很强的信号。在高分辨率和灵敏度下，通过快速扫描程序可检测到该荧光标记。可以用单一的标记，例如单一的荧光标记，对所有的核酸样品进行标记。可选地，在其他实施方案中，带有不同标记的不同的核酸样品可以同时杂交。例如，一个目标用绿色荧光标记而第二个目标用红色标记。扫描步骤可以将绿色荧光标记结合的位置与红色标记结合的位置区分开。每个核酸样品(目标核酸)都可以单独进行分析。
[0088]可以采用的合适色原包括那些在特定波长范围内吸收光以观察到其颜色，或可选的，当用特定波长的射线照射时可以发出光的分子和化合物，例如荧光剂。
[0089]理想地，荧光标记应该吸收约300nm以上，优选约350nm以上，和更优选400nm以上的光，通常在比吸收的光波长大约10nm的波长上发出。值得注意的是，结合染料(bound dye)和非结合染料(unbound dye)的发出和吸收特性不同。因此，当涉及到染料的不同波长范围和特性时，应该指明任一溶液中使用的染料以及没有结合和特征化的染料。
[0090]通常优选荧光剂是因为当用光照射荧光剂时，其可以吸收很多光。因此，单一的标记可以提供很多可以测量的结果。
[0091]化学发光和生物发光源同样可以提供可检测信号。化学发光源包括通过化学反应激化电子，从而发出可以作为检测信号的光，或对荧光接收器提供能量的化合物。可选地，虫荧光素可以和荧光素酶或光泽精联合使用来提供生物发光。
[0092]带有不成对电子自旋的报道分子提供自旋标记物，其可以通过电子白旋共振(ESR)光谱检测到。示范的自旋标记物包括有机自由基，过渡金属络合物，特别地钒，铜，铁，和锰等等。示范的自旋标记物包括硝基氧自由基。
[0093]在杂交前或后可以向目标“样品”核酸中加入标记。称为“直接标记”的是杂交前直接附着或引入到目标“样品”核酸中的可检测到的标记。相反，称为“间接标记”的是杂交后与杂交双链结合的。通常，间接标记在杂交前与已经和目标核酸结合的部分结合。因此，例如在杂交前目标核酸可以是生物素。杂交后，和抗生物素蛋白共扼的荧光团与带有提供易于检测到的标记的杂种双链的生物素结合。关于标记核酸和检测杂交核酸标记的方法的详细说明，可以参考Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology，Vol.24：Hybridization With Nucleic Acid Probes，P.Tijssen，ed.Elsevier，NY.，(1993))。
[0094]在体外的转录反应中，易于加入荧光标记。因此，例如用UTP和CTP标记的荧光团可以加入到体外转录中产生的RNA中。
[0095]可以直接或者通过连接部分附着标记。通常，标记或连接器标记附着的位置不受任何特定的位置的限制。例如，可以在检测或所需杂交干扰不到的任何位置上，将标记附着到核苷、核苷酸、或其类似物上。例如，某些来自Clontech(Palo Alto，CA)的可标记试剂可用来在寡聚核苷酸的整个磷酸盐主链上分散标记以及在3′和5′末端终止标记。如这里的例子所示，可以将标记附着到核糖环或可以修正甚至如需要可除去的核糖上。一些有用的标记试剂的碱基部分可以包括天然存在的或以不干扰其放置目的的修正的那些碱基部分。修正的碱基包括但不限于7-deaza A和G，7-deaza-8-aza A和G，以及其他杂环部分。
[0096]应该认识到荧光标记并不限于单一种类的有机分子，而是包括无机分子，有机和/或无机多分子混合物、晶体、非均相聚合物等。因此，例如包覆在硅土外壳中的CdSe-CdS核心-外壳纳米晶体易于和生物分子偶合(Bruchez等人(1998)Science，281：2013-2016)。类似的，将高荧光量点(硫化锌封端的硒化镉)与生物分子共价偶合，用来进行超灵敏度的生物检测(Warren and Nie(1998)Science，281：2016-2018)。
B)多肽基础测定
1)测定形式
[0097]另外，或者可选的，可以通过检测和/或计算转译NELL-1多肽的数量和/或活性来检测或计算NELL-1核酸表达水平，NELL-1表达的变化。
2)表达蛋白质的检测
[0098]可以通过本领域公知的很多方法的任一种对由NELL-1编码的多肽进行测量和定量。这些方法包括分析的生物化学方法如电泳，毛细管电泳、高效液相色谱(HPLC)、薄层色谱(TLC)、过度扩散色谱(hyperdiffusion chromatography)等等，或各种免疫学方法如液体或凝胶沉淀素反应、免疫扩散(单或双)、免疫电泳、放射免疫测定(RIA)、酶标免疫吸附技术(ELISAs)、荧光免疫检测、Western印迹等等。
[0099]优选的实施方案中，通过电泳蛋白质分离(例如1-或2-维电泳)来对NELL-1多肽进行测定和量化。采用电泳技术测定蛋白质的方法对本领域来说是公知的(通常参考R.Scopes(1982)ProteinPurification，Springer-Verlag，N.Y.；Deutscher，(1990)Methods inEnzymology Vol.182：Guide to Protein Purification，Academic Press，Inc.，N.Y.)。
[0100]在优选的实施方案中，采用Western印迹(免疫印迹)分析对本发明样品中多肽的存在进行测量和量化。这种技术通常包括根据分子重量通过凝胶电泳分离蛋白质样品，将分离的蛋白质转移到合适的固体支持物上，(例如硝化纤维过滤器，尼龙过滤器或衍生尼龙过滤器)，和用与目标多肽特异性结合的抗体孵化样品。
[0101]抗体和目标多肽特异性结合并且可以直接标记，或可选地在随后可以使用与抗体特异性区域结合的标记抗体(标记的羊反鼠抗体)进行检测。
[0102]优选实施方案中，通过免疫测定检测NELL-1多肽。如这里所用的免疫测定是一种利用抗体与被分析物(例如目标多肽)特异性结合的方法。因此，免疫测定的特征在于检测本发明多肽与抗体的特异性结合，该抗体不能使用其他理化性质来进行分离、瞄准和定量分析物。
[0103]很多认为很好的免疫学结合测定(参见例如U.S.专利4,366,241；4,376,110；4,517,288；和4,837,168)都适用于这里鉴定的多肽的检测或量化。关于免疫方法通常还可以参考Asai(1993)Methods InCell Biology Volume 37：Antibodies in Cell Biology，Academic Press，Inc.New York；Stites & Terr(1991)Basic and Clinical Immunology 7thEdition。
[0104]免疫学结合测定(或免疫测定)通常利用“捕获剂”来进行特异性结合并且固定被分析物(NELL-1多肽)。优选的实施方案中，捕获剂是抗体。
[0105]免疫测定也常常利用标记物来进行特异性结合并且标记由捕获剂和被分析物形成的结合络合物。标记物本身可以是包含抗体/被分析物络合物之一。因此，标记物可以是标记的多肽或者是标记的抗体，其可以特异性识别已经结合的目标多肽。可选的，标记物可以是与捕获剂/多肽络合物特异性结合的第三部分，例如另一个抗体。
[0106]能够特异性结合免疫球蛋白恒定区的其他蛋白质，如蛋白质A或蛋白质G也可以用作标记物。这些蛋白质是链球菌细胞膜的常规要素。其显示出对免疫球蛋白恒定区强烈的非免疫原反应(通常参见Kronval等人(1973)J.Immunol.，111：1401-1406，和Akerstrom(1985)J.Immunol.，135：2589-2542)。
[0107]用于检测目标多肽的优选免疫测定可以是竞争性或非竞争性的。非竞争性免疫测定法是指捕获分析物的数量可以直接测量的方法。在优选的“三明治(Sandwish)测定中，例如捕获物(抗体)可以直接和固定的固体物结合。然后这些固定的抗体捕获存在于试样中的目标多肽。然后，用标记试剂，如带有标记的第二抗体结合固定的目标多肽。
[0108]在竞争性测定中，通过捕获剂(抗体)所附加的(外源的)分析物的含量间接测量存在于试样中分析物(NELL-1多肽)的含量，该分析物在捕获剂(抗体)中被存在于样品中的分析物代替(或竞争赶走)。在竞争性的测定中，将已知含量的的标记多肽加入到样品中，然后使样品与捕获剂结合。与抗体结合的标记多肽和样品中目标多肽的浓度成反比。
[0109]在特别优选的实施方案中，抗体固定在固体底物上。或通过测定多肽/抗体络合物中存在的目标多肽的数量，或可选地通过测定残余的没有络合的多肽数量，来测定与抗体结合的目标多肽的含量。
[0110]本发明的免疫测定法包括酶学免疫测定(EIA)，其根据具体使用的方案，利用与NELL-1多肽结合的多克隆或单克隆抗体或抗体片段或抗体单链的标记或未标记(例如酶标)衍生物，可使用其单体或混合物。当与NELL-1结合的抗体没有标记时，可以使用不同的检测指示剂，例如具有与和NELL-1多肽结合的单克隆抗体可以结合的能力的酶标抗体。也可以使用任何一种已知的修正EIA，例如酶联免疫吸附测定法(ELISA)。如上所述，本发明预计还可以采用免疫沉淀技术，如利用酶学检测系统的Western印迹。
[0111]本发明免疫方法还可以是其他的公知免疫方法，例如采用荧光物质，例如荧光素或玫瑰精，抗体或抗原粒子包覆的乳胶粒子粘合的乳胶，带有抗体包覆或抗原包覆的红血球的血凝反应，采用抗生物素-生物素或链锁状球菌抗生物素—生物素检测系统，等等的抗体或抗原共轭化物的荧光免疫。
[0112]根据不同的因素，如样品中的抗原浓度、样品的性质、采用的免疫测定类型等，本发明免疫测定的特定参数可以变化很大。本领域人员可以容易地建立最优条件。某些实施方案中，在没有样品时，和NELL-1多肽结合的抗体数量通常选择50％的检测指示剂结合。如果将纯化抗体用作抗体源，通常每一测定法应用的抗体量为1ng到100ng。典型的条件为约4℃至约45℃的温度，优选约25℃至约37℃，最优选的温度为约25℃，PH值通常在约5至9，优选为约7，离子强度为约0.2M的氯化钠蒸馏水，优选为0.15M的氯化钠蒸馏水。根据试验的性质，时间可以变化很大，通常在约0.1分钟到约24小时之间。可以用不同浓度的缓冲液，如PBS溶液，其他的试剂如盐来提高离子强度，可以使用蛋白质如血清白蛋白，稳定剂，杀虫剂和非离子洗涤剂。
[0113]根据本领域人员公知的标准方法来对发明测定进行评定(作为阳性，阴性或定量目标多肽)。对特异性方法的评定是根据试验形式以及标记的选择。例如，可以根据酶标记产生的可视有色产物评定Western印迹。在合适的分子重量上，可评定清晰有色条带或点来作为阳性结果，而将缺乏清晰的有色条带或点作为阴性结果。条带或点的强度可以定量检测目标多肽浓度。
[0114]这里描述的不同的免疫检测中使用的抗体，可以是通过商业获得的或按照下面描述的方法制备的。
3)NELL-1多肽抗体
[0115]本发明这里描述的免疫检测法中可以采用单克隆或多克隆抗体。单克隆抗体优选将充分纯度的多肽或抗原多肽多重注射(如皮下或肌肉注射)到合适的非人类哺乳动物。可以通过常规技术测量目标肽的抗原性来确定已经用该肽免疫的动物对抗体的反应大小。通常，本发明方法中用来提高抗体的肽应该是那些可以诱导带有对NELL-1编码的目标多肽具有相对高亲合性的高滴定量抗体产生的肽。
[0116]如需要，可以采用公知技术通过结合将免疫肽与运载蛋白偶合。通常使用的和肽化学偶合的载体包括匙孔血蓝蛋白(KLH)，甲状腺球蛋白，牛血清蛋白(BSA)，破伤风类毒素。然后偶合多肽用来使动物(例如鼠或兔)具有免疫性。
[0117]然后，从哺乳动物的血样品中获得抗体。用来产生多克隆抗体的技术在本领域是公知的(参见例如Methods of Enzymology，″Production of Antisera With Small Doses of Immunogen：MultipleINTRADERMAL Injections″，Langone，等人.eds.(Acad.Press，1981))。动物产生的多克隆抗体可以进一步纯化，例如通过和基质结合并洗提基质，将从抗体中洗脱的肽与所述基质结合。本领域人员所知多克隆抗体以及单克隆抗体的纯化和/或浓缩的免疫学的不同技术参见，例如Coligan等人(1991)Unit 9，Current Protocols in Immunology，WileyInterscience)。
[0118]但是，优选地，产生的抗体是单克隆抗体(″mAb′s″)。制备单克隆抗体，优选小鼠或大白鼠免疫法。本发明中使用的术语“抗体”包括完整的分子及其碎片，例如Fab和F(ab′)2′，和/或具有与异位决定因子(epitopic determinant)结合能力的单链抗体(例如scFv)。同时，文中术语“本发明的mab′s”是指具有NELL-1多肽编码的多肽特异性的抗体。
[0119]制备分泌mAbs杂交瘤的通用方法是公知的(Kohler andMilstein(1975)Nature，256：495)。简单地说，如Kohler和Milstein所述，该技术包括从五个分别患有黑素瘤，畸胎癌，子宫颈癌，神经胶质瘤癌或肺癌(样品来自外科标本)的局部排泄淋巴结中分离淋巴细胞，汇集所述细胞并且将其与SHFP-1融合。筛选用于产生与癌细胞系结合的抗体的杂交瘤。通过使用相对常规的筛选技术(例如酶联免疫吸收法或“ELISA”)完成mAb′s中特异性的确定来检测感兴趣的mAb的基本反应模式。
[0120]还可以通过噬菌体显示技术制备/选择抗体片段，例如单链抗体(scFv或其他)。在可以转染细菌(抗菌素或噬菌体)的病毒表面表达抗体片段的能力有可能使单一的结合抗体片段，从例如比1010更大的非结合克隆库中分离出来。为了在噬菌体表面表达抗体片段(噬菌体显示)，将抗体片段基因插入到编码噬菌体表面蛋白(pIII)的基因中，以及在噬菌体表面显示抗体片段-pIII融和蛋白质(McCafferty等人(1990)Nature，348：552-554；Hoogenboom等人(1991)Nucleic Acids Res.19：4133-4137)。
[0121]由于噬菌体表面的抗体片段是功能性的，所以可以通过抗原亲和色谱来将含有结合抗体片段的噬菌体从非结合噬菌体中分离出来(McCafferty等人(1990)Nature，348：552-554)。根据抗体片段的亲合性，可以为单一轮的亲合性选择得到20倍-1,000,000倍的富积因子。然而，通过用洗脱的噬菌体感染细菌，使更多的噬菌体生长并且用于另一轮的选择。通过这种方法，一轮中的1000倍富积可以变为两轮选择中的1,000,000倍富积(McCafferty等人(1990)Nature，348：552-554)。因此，即使富积很低(Marks等人(1991)J.Mol.Biol.222：581-597)，多轮的亲合性选择也可以导致罕见的噬菌体分离。由于噬菌体抗体库对抗原的选择导致富积，在如三到四轮选择的这样少之后，克隆的主要部分与抗原结合。因此，只有相对少数的克隆(几百)需要与抗原结合来进行分析。
[0122]不需要预先免疫，可以通过在噬菌体上显示出很大和多样V-基因的全部组成成分(repertoires)，产生人类抗体(Marks等人(1991)J.Mol.Biol.222：581-597)。在一个实施方案中，通过PCR将人体周围血液的淋巴细胞中自然VH和VL的全部组成成分从没有免疫的捐赠人中分离出来。使用PCR随机地将V-基因的全部组成成分固定在一起，来产生scFv基因的全部组成成分，将scFv基因克隆到噬菌体载体中来产生3000万噬菌体抗体库(Id.)。使用这种简单“幼稚”的噬菌体抗体库，可以从超过17个不同的抗原中分离出结合抗体片段，包括半抗原、多聚糖和蛋白质(Marks等人(1991)J.Mol.Biol.222：581-597；Marks等人(1993).Bio/Technology.10：779-783；Griffiths等人(1993)EMBO J.12：725-734；Clackson等人(1991)Nature.352：624-628)。将对抗自身蛋白质的抗体制备出来，包括人甲状腺球蛋白、免疫球蛋白、肿瘤坏死因子和CEA(Griffiths等人(1993)EMBO J.12：725-734)。还有可能通过直接选择完整细胞来分离对抗细胞表面的抗体。抗体片段对用来选择的抗原是高度特异性的，并且具有在1：M到100nM范围内的亲合性(Marks等人(1991)J.Mol.Biol.222：581-597；Griffiths等人(1993)EMBOJ.12：725-734)。更大的噬菌体抗体库导致更多抗体的分离，该抗体对更高比例的抗原具有高度结合亲合性。
[0123]还可以通过许多商业性服务制备抗体(例如Berkeleyantibody laboratories，Bethyl Laboratories，Anawa，Eurogenetec等)。
C)方法优化
[0124]本发明方法在筛选调节细胞、组织或生物体中NELL-1表达的试剂中有着直接应用。可以根据例如生物样品的来源和/或性质和/或特定的试剂，和/或可以得到的分析结构，在具体的情况下优化本发明的方法。因此，例如，优化可以包括测定结合方法的优化条件，最合适的样品处理条件(例如优选的PCR条件)，使信噪比最大化的杂交条件，提高产出的方法等等。另外，可以根据获得的设备和/或试剂来选择和/或最优化方法的格式。因此，例如，当可以获得商业性抗体或ELISA全套时，需要测定蛋白浓度。相反，当需要筛选改变NELL-1基因的调节器的时候，优选以核酸为基础的方法。
[0125]对本领域人员而言，方法格式的常规选择和优化是公知的。
II.结合NELL-1的试剂的预筛选
[0126]一些实施方案中，需要对具有与NELL-1核酸或多肽交互作用(例如特异性结合)能力的测试试剂进行预筛选。特异性结合测试试剂更易于与NELL-1表达和/或活性进行交互作用，因此调整NELL-1的表达和/或活性。因此，在一些优选实施方案中，在进行上述更复杂测定之前，为了与NELL-1核酸或NELL-1蛋白质结合，预先对试剂进行筛选。
[0127]在一个实施方案中，采用单一结合的方法完成所述预筛选。测定核酸或蛋白特异性结合或对特异性配体的亲和结合方法，对本领域人员而言是公知的。在优选的实施方案中，NELL-1蛋白或核酸是固定的并且暴露在测试试剂中(可以是标记的)，或可选地，测试试剂是固定的并且暴露在NELL-1蛋白或NELL-1核酸中(可以是标记的)。然后洗涤固定部分来除去任何没有结合的材料，并且检测结合的测试试剂或结合的NELL-1核酸或NELL-1蛋白(例如通过对结合分子上附着的标记进行检测)。固定标记的数量和NELL-1蛋白质或核酸与测试试剂之间的结合程度成比例。
III.用于筛选的试剂
[0128]虽然在一个实施方案中，上面描述的的方法用于检测NELL-1存在、没有或定量的表达，但是同样的方法可以用于筛选调节MT-SP1丝氨酸蛋白酶表达和/或活性的试剂。为了筛选潜在的调节剂，在一种或多种测试试剂存在的情况下或使用来自暴露于一种或多种测试试剂中的细胞和/或组织和/或器官和/或生物体的生物样品来进行上述测定。测定MT-SP1活性和/或表达水平，并且在优选实施方案中，与“对照”测定(没有试剂的同样的测定)中观察到的活性水平进行比较。“测试”测定和对照测定之间的MT-SP1水平和/或活性的差异显示出测试试剂是SP1表达或活性的调节剂。
[0129]在优选实施方案中，当测定的蛋白质或核酸水平或蛋白质活性高于测定的或已知的对照样品(例如或是相同种类的正常健康细胞、组织或哺乳动物生物体的、没有与假定调节剂接触的已知测定水平，或同一个体在不同组织和/或不同时间测定的“基线/参考”水平)时，本发明被认为是阳性结果，例如提高的表达和/或MT-SP1活性，基因。在一个特别优选的实施方案中，当样品和“对照”之间具有统计学意义的差异(例如在85％或更大、优选90％或更大、更优选95％或更大、最优选98％或更大可信度)时，该测定被认为是阳性结果。
IV.高通量筛选
[0130]本发明的方法也包括“高通量”筛选的方法。传统地，通过确定具有所需特性或活性的化学化合物(称之为“前药”)，生产多种此类“前药”，以及对这些化学化合物的特性和活性进行评估来产生具有有效特性(比如，调节NELL-1表达和活性)的新化学物质。然而，最近的趋势是缩短药物发明各步骤的时间。因为其具有可以快速有效地检测大量样本，所以高通量筛选方法已经取代了传统“前药”的鉴定方法。
[0131]在优选实施方案中，高通量筛选方法包括提供一个含有大量潜在的具有所需活性的化合物(候选化合物)的库。然后采用这里描述的一种或多种方法对所述“组合化学库”进行筛选，从而鉴定出那些显示出所需特征活性的库成员(特异性的化学品种或亚类)。这样，鉴定出来的化合物用作通常的“前药”或将其本身用作潜在的或实际的治疗剂。
A)组合化学库
[0132]最近，注意力集中在组合化学库上来辅助新化合物主旨的产生。组合化学库是由化学合成或生物合成，通过结合很多化学“构建模块”，如试剂产生的不同种类化合物的集合。例如，由一组给定化合物长度、也就是称为氨基酸的构建模块(即多肽化合物中氨基酸数量)，通过各种可能的方式连接形成线性组合化学库，如多肽。通过组合化学构建模块混合物可以合成数以万计的化合物。例如，评论员观察到，在合成理论上，100个相互改变的化学构建模块的系统组合混合物可以使100百万四聚化合物或10亿五聚化合物合成(Gallop等人(1994)37(9)：1233-1250)。
[0133]组合化学库的制备和筛选对本领域人员而言是公知的。这些组合化学库包括但不限于肽库(参见例如U.S.专利5,010,175,Furka(1991)Int.J.Pept.Prot.Res.，37：487-493，Houghton等人(1991)Nature，354：84-88)。肽合成决不是本发明看到和准备使用的唯一方法。也可以采用其他的产生化学多样性库的化学过程。这些化学过程包括但不限于：肽(PCT出版物No WO 91/19735，26 Dec.1991)，编码的肽(PCT出版物WO 93/20242，14 Oct.1993)，随机生物寡聚体(PCT出版物WO 92/00091，9 Jan.1992)，苯并二氮平类(U.S.专利.No.5,288,514)，diversomers如乙内酰尿类，苯并二氮平类和二肽(Hobbs等人(1993)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 90：6909-6913)，vinylogous多肽(Hagihara等人(1992)J.Amer.Chem.Soc.114：6568)，带有β-D-葡萄糖脚手架的非肽的肽类似物(Hirschmann等人，(1992)J.Amer.Chem.Soc.114：9217-9218)，小化合物库的类似有机合成(Chen等人(1994)J.Amer.Chem.Soc.116：2661)，寡氨基甲酸盐(Cho等人(1993)Science 261：1303)，和/或缩氨酸磷酸酯(Campbell等人(1994)J.Org.Chers.59：658)。通常参考Gordon等人(1994)J.Med.Chem.37：1385，核酸库(参考例如Strategene，Corp.)，核酸肽库(参见例如U.S.专利5,539,083)抗体库(参见例如Vaughn等人(1996)Nature Biotechnology，14(3)：309-314)和PCT/US96/10287)，糖库(参见例如Liang等人(1996)Science，274：1520-1522和U.S.专利5,593,853)，和有机小分子库(参见例如benzodiazepines，Baum(1993)C&EN，Jan 18，page 33，类异戊二烯U.S.专利5,569,588，噻唑啉酮和metathiazanone U.S.专利5,549,974，吡咯烷U.S.专利5,525,735和5,519,134，吗啉化合物U.S.专利5,506,337，苯并二氮平类5,288,514等等)。
[0134]制备组合库的设备可以通过商业渠道获得(参见例如357MPS，390 MPS，Advanced Chem Tech，Louisville KY，Symphony，Rainin，WOBURN，MA，433A Applied Biosystems，Foster City，CA，9050 Plus，Millipore，Bedford，MA)。
[0135]已经发展了的很多公知的用于液相式化学的机器人系统。这些系统包括自动工作站如由Takeda Chemical Industries，LTD.(Osaka，Japan)开发的自动合成设备和利用机器臂的很多机器人系统(ZymateII，Zymark Corporation，Hopkinton，Mass.；Orca，Hewlett-Packard，PaloAlto，Calif.)来模仿化学家人工合成操作。上述任何一种设备都适用于本发明。为了使其可以按照这里的描述进行操作，相关领域的人员清楚对这些设备修改(如果有)的性质和安装。另外，大量组合库本身也可以通过商业渠道获得(参见例如ComGenex，Princeton，N.J.，Asinex，Moscow，Ru，Tripos，INC.，St.Louis，MO，ChemStar，Ltd，Moscow，RU，3DPharmaceuticals，Exton，PA，Martek Biosciences，Columbia，MD，等等)。
B)化学库的高通量方法
[0136]任何调整NELL-1表达或改变NELL-1多肽的特异性结合和/或活性的方法都可以采用高通量筛选。如上所述，已经测定出NELL-1表达和骨矿化有关，很有可能是抑止或增强骨矿化的调节剂。因此，通过测试化合物，优选的测定对转录的抑制(也就是对mRNA产品的抑制)，基因(也就是gDNA或cDNA)或基因产品(也就是mRNA或表达的蛋白质)的结合进行检测。可选地，该测定可以检测NELL-1多肽特征活性的抑制。
[0137]对特异性核酸或蛋白质产品的存在、没有或定量的高通量测定，对本领域人员而言是公知的。类似的，结合测定也是类似公知的。因此，例如U.S.专利5,559,410公开了蛋白质的高通量筛选方法，U.S.专利5,585,639公开了核酸结合(也就是点阵)的高通量筛选方法，还有U.S.专利5,576,220和5,541,061公开了筛选配体/抗体结合的高通量方法。
[0138]另外还可以从商业渠道获得高通量筛选系统(参见例如Zymark Corp.，Hopkinton，MA；Air Technical Industries，Mentor，OH；Beckman Instruments，Inc.Fullerton，CA；Precision Systems，Inc.，Natick，MA，等等)。典型地，这些系统将整个过程自动化，包括对本测定适用的所有样品和试剂的移液，液体配制，时间孵化和测定微量板进行最后的记录。这些结构系统提供了高通量和快启动以及高度的灵活性和自动化。这些系统的生产商提供不同高通量的详细的方案。因此，例如Zymark公司提供描述用于检测基因转录，配体结合等等调节的筛选系统技术公报。
V.使用NELL-1核酸和/或多肽来增加骨的矿化
[0139]在另一个实施方案中，本发明提供增强骨生长的方法和组合物。这在上下文中是很有用的，包括但不限于骨重建，如用于创伤后发生的重建缺陷，发育中的癌外科或错误，成骨不全、骨质疏松的治疗以及大小骨折的康复。
[0140]该方法大体包括增加骨或其周围或者骨祖细胞或其中，和/或与NELL-1多肽或编码NELL-1多肽的载体接触的细胞(例如骨祖细胞)的NELL-1蛋白质浓度。其可以通过改变骨祖细胞来实现，以使其表达了提高水平的内源NELL-1或来自外源转染NELL-1核酸的NELL-1，或使骨、骨折位置、骨祖细胞与NELL-1蛋白或局部或NELL-1蛋白的系统给药接触。
[0141]这里使用的术语“骨祖细胞”是指那些具有最终形成或促使形成新的骨组织的任何或所有细胞。其包括不同分化阶段的各种细胞，如例如干细胞、巨噬细胞、成纤维细胞、血管细胞、造骨细胞、成软骨细胞、破骨细胞等等。骨祖细胞还包括那些体外分离或操作的例如受过试剂刺激的细胞，如细胞活素类或生长因子甚至是遗传工程细胞。使用本发明方法和化合物刺激的骨祖细胞的特异性种类或种类并不重要，只要所述细胞在以其被激活的方法来激活，以及在具体的体内实施方案中最终产生新的骨组织。
[0142]术语“骨祖细胞”还用来特指那些位于骨祖组织内、与其接触或向其移动(也就是″home to″)那些细胞，其细胞直接或间接的刺激成熟骨的形成。像这样，源祖细胞也可以是那些最终分化成成熟的骨细胞本身的细胞，也就是“直接”形成新的骨组织的细胞。那些经过刺激可以吸引更多源祖细胞或促进附近细胞分化成骨形成细胞(例如成为成骨细胞、骨细胞和/或破骨细胞)的细胞也被认为是本公开上下文中的骨祖细胞-因为其的刺激“间接”导致骨的修复或再生。间接影响骨形成的细胞可能通过不同生长因子或细胞因子的加工，或通过其与其他类型细胞的物理交互作用来做这些。在实施本发明中不必考虑骨细胞刺激骨修复的直接或间接机制。骨祖细胞和骨祖组织可以是在自然环境中可以到达活性骨生长、修复或再生区域的细胞和组织。骨祖细胞这个术语还可以是那些吸引或补充到这些区域的细胞。这些细胞可以是位于动物模型中人工制造的截骨术中的细胞。骨祖细胞还可以是从人或动物组织中分离并且保存在体外环境中。获取骨祖细胞的合适的躯体区域是如骨折或其他骨骼缺陷(不管是否是人为创造的位置)周围的骨组织或液体，或确实来自骨髓的区域。可以使用这里公开的方法和化合物来刺激分离的细胞，以及如需要，可以将其送回到动物中骨修复被刺激的合适位置。在这些例子中，含有核酸的细胞本身就是一种治疗制剂的形式。这样的体内方案对本领域人员都是公知的。在本发明优选实施方案中，骨祖细胞和组织将是那些位于需要治疗的骨折或损伤区域的细胞和组织。因此，在治疗实施方案中，没有与将治疗组合物应用在其上的合适目标源祖细胞的鉴定有关的困难。在这些例子中，足以获取这里所公开的适当刺激的组合物(例如NELL-1多肽)并且足以使所述组合物与骨折或损伤位置接触。在没有实施者进一步靶向或细胞鉴定的情况下，这个生物环境的性质将变为活性。
A)增加NELL-1产品的细胞变换
[0143]在更优选的实施方案中，将NELL-1表达核酸(例如cDNA)克隆到可以在体内和/或体外转染细胞(例如人类或其他哺乳动物细胞)的基因治疗载体中。
[0144]可以采用很多方法来将核酸导入细胞体内，体外和生物体外。这些包括脂类或脂质体的基因运送(WO 96/18372；WO 93/24640；Mannino and Gould-Fogerite(1988)BioTechniques 6(7)：682-691；RoseU.S.专利No.5,279,833；WO 91/06309；和Felgner等人(1987)Proc.Natl.Acad.SCI.USA 84：7413-7414)和保护作为逆转录基因组一个部分的治疗性聚核苷酸序列的复制缺陷型逆转录载体(参见例如Miller等人(1990)Mol.Cell.Biol.10：4239(1990)；Kolberg(1992)J.NIH Res.4：43，和Cornetta等人(1991)Hum.Gene Ther.2：215)。
[0145]关于基因治疗程序，参考例如Anderson，Science(1992)256：808-813；Nabel and Felgner(1993)TIBTECH 11：211-217；Mitani andCaskey(1993)TIBTECH 11：162-166；Mulligan(1993)Science，926-932；Dillon(1993)TIBTECH 11：167-175；Miller(1992)Nature 357：455-460；Van Brunt(1988)Biotechnology 6(10)：1149-1154；Vigne(1995)RestorativeNeurology and Neuroscience 8：35-36；Kremer and Perricaudet(1995)British Medical Bulletin 51(1)31-44；Haddada等人(1995)in CurrentTopics in Microbiology and Immunology，Doerfler and BHM(eds)Springer-Verlag，Heidelberg Germany；and Yu等人(1994)Gene Therapy，1：13-26。
[0146]广泛使用的逆转录病毒载体包括以鼠白血病病毒(MuLV)、长臂猿白血病病毒(GaLV)、类人猿免疫缺乏病毒(SIV)、人类免疫缺乏病毒(HIV)为基础的载体及其混合，参考例如Buchscher等人(1992)J.Virol.66(5)2731-2739；Johann等人(1992)J.Virol.66(5)：1635-1640(1992)；SOMMERFELT等人，(1990)Virol.176：58-59；Wilson等人(1989)J.Virol.63：2374-2378；Miller等人，J.Virol.65：2220-2224(1991)；Wong-Staal等人，PCT/US94/05700，和Rosenburg andFauci(1993)in Fundamental Immunology，Third Edition Paul(ed)RavenPress，Ltd.，New York及其参考书，和Yu等人，Gene Therapy(1994)supra)。载体为可选择的假类型(pseudotyped)以使载体的主体范围扩展到没有被与载体对应的逆病毒感染的细胞中。小泡状口腔炎病毒包装糖蛋白(VSV-G)用来构建VSV-G-pseudotyped HIV载体，其可以转染造血干细胞(Naldini等人(1996)Science 272：263，和Akkina等人(1996)J Virol.70：2581)。
[0147]以腺-伴随病毒(AAV)为基础的载体也可以用来导入带有目标核酸的细胞，例如在核酸和肽的体外产品，以及体内和体外基因治疗程序中。关于AAV载体，参见West等人(1987)Virology 160：38-47；Carter等人(1989)U.S.专利No.4,797,368；Carter等人WO 93/24641(1993)；Kotin(1994)Human Gene Therapy 5：793-801；Muzyczka(1994)J.Clin.Invest.94：1351。很多出版物描述了AAV载体重组的构建，包括Lebkowski，U.S.专利No.5,173,414；Tratschin等人(1985)Mol.Cell.Biol.5(11)：3251-3260；Tratschin等人(1984)Mol.Cell.Biol.，4：2072-2081；Hermonat and Muzyczka(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：6466-6470；McLaughlin等人(1988)and Samulski等人(1989)J.Virol.，63：03822-3828。可以由rAAV变换的细胞系的描述包括Lebkowski等人(1988)Mol.Cell.Biol.，8：3988-3996。其他合适的病毒载体包括疱疹病毒和痘苗病毒。
[0148]U.S.专利5,942,496和5,763,416公开了将核酸原位转移到骨细胞和/或刺激骨祖细胞的方法、组合物、全套工具和设备(也参见Evansand Robbins(1995)J.Bone and Joint Surgery，77-A(7)：1103-11l4，Wolff等人(1992)J.Cell Sci.，103：1249-1259)。
B)外源产生的NELL-1的给药
1)NELL-1蛋白质到目标细胞的运送
[0149]本发明NELL-1蛋白(或其生物活性片段)对静脉、肠胃外、局部、口服、或局部给药(例如通过气溶胶、或经皮地)都是有用的。特别优选的给药模式包括动脉内注射，注射到骨折位置或用生物降解的基质运送。NELL-1蛋白试剂通常和药学上可以接受的载体(赋型剂)结合形成药物组合物。药学上可以接受的载体包括生理上可以接受的成分，例如增强药剂的稳定性或吸收。生理上可以接受的成分包括例如如葡萄糖、蔗糖或葡聚糖的糖类，如维生素C或谷光甘肽的抗氧化剂，络合剂，低分子量蛋白，降低抗有丝分裂剂清除率或水解的成分，或赋型剂或其他的稳定剂和/或缓冲剂。
[0150]其他生理上可以接受的成分包括湿润剂、乳化剂、分散剂或特别用来防止微生物生长或活动的防腐剂。不同种类的防腐剂是公知的，包括例如酚、维生素C。本领域人员可以选择药学上可以接受的载体，包括根据例如抗有丝分裂剂的给药和抗有丝分裂剂的特定生理化学性质选择生理上可以接受的成分。U.S.专利5,385,887对优选的骨形成蛋白(BMPs)运送的配方有所描述。
[0151]根据给药方法，施用不同剂量单位的药剂。例如，单位剂量形成合适的口服给药，包括散剂、片剂、丸剂、胶囊和锭剂。公认地，如果口服给药，必须保护NELL-1蛋白不被消化。典型地，其可以通过将蛋白与使其抗酸和水解的组合物络合或将蛋白包装在如脂质体的合适稳定载体中来实现。保护成分不被消化的方法对本领域是公知的(参见例如U.S.专利5,391,377描述用作口服治疗剂的脂类成分)。
[0152]本发明药物组合物对局部给药特别有用，例如在外科伤口治疗中促进骨复原和/或修复。在另外一个实施方案中，组合物对肠胃外给药，例如静脉给药或者体腔或组织腔给药是有用的。所给药的组合物大体包括溶解在药学上可以接受的载体中的NELL-1蛋白质，优选水溶蛋白质的水载体。可以使用很多种类的载体，例如缓冲生理盐水等。溶液是灭菌的并且通常不含有不需的物质。可以通过公知的灭菌技术来对这些组合物进行灭菌。所述组合物可以包括药学上可以接受的辅助物质，该物质需要接近生理条件，如pH调节和缓冲剂，毒性调节剂等等，例如醋酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。
[0153]这些配方中的NELL-1蛋白的浓度可以相差很大，以及根据选择的特定给药模式和病人的需要，可以主要以液体体积、粘度、体重等为基础。典型地，以药学上可以接受的溶液形式(包括来自冻干形式的重建)使用NELL-1蛋白。成骨质蛋白的浓度在约1mg/ml为理想，更优选的是2到8mg/ml，以使在没有过度的成为必要的载体存在的情况下，可以运送药学上有效量的蛋白质。在一些应用中，可能需要2mg/ml以上的浓度。
[0154]如上所述，根据编址的临床适应症和不同病人的可变参数(例如重量、年龄、性别)以及临床表现(例如损伤的程度、位置等)来决定剂量。通常来说，成骨质蛋白的剂量在1到约10000μg的范围内，优选约10到1000μg，更优选约10到100μg。
2)骨移植材料
[0155]骨损伤以及其他很多损伤模型，会开始释放一种对损伤康复过程很关键的生物活性剂。在骨中自然产生的骨形成素蛋白(BMP)，一旦从损伤处释放出来就会刺激骨诱导并且重新产生丢失或损坏的骨组织。这种纯化形式的相同蛋白质可以用来刺激不管是在正常骨骼范围之内还是之外的骨的人工制作中可生物降解的基质上的骨生长。不受特定理论的限制，可以相信以骨形成蛋白质类似的方式来用NELL-1蛋白质刺激骨头的重新矿化。
[0156]根据上面的讨论，可以系统地给药NELL-1蛋白。另外，或可选地，可以直接将NELL-1蛋白应用到骨或骨折位置。其可以在外科中(例如当设置复杂的骨折，当重建骨，当进行骨移植时)进行或直接通过注射完成。
[0157]在某些优选实施方案中，特别是进行外科骨重建或修复时，需要使用持续的运送“载体”给药NELL-1蛋白。持续的运送载体包括但不限于生物降解运送载体。优选的生物降解运送载体是更好的多孔。
[0158]在开发生物降解多孔运送载体中，已经作了很多工作来控制物质的释放，同时为细胞附加和引导组织再生提供定位。生物降解材料通常分为两类：1)亲水的；2)疏水的。亲水材料(去除矿物质的冻干骨，陶瓷，纤维蛋白，明胶等)对在材料内部空隙中易于引入水溶的Nell-1蛋白质的水具有高度亲和性。疏水材料(L-聚乳酸，D，L-聚乳酸，聚-羟乙酸等)虽然在空隙范围、总尺寸、形状和机械特性中具有潜在的无限性，但较难“渗入”水溶液。为了增加这些材料内部表面的溶液沉积，通常将疏水材料用蛋白质或用表面活性剂饱和来增加蛋白质(例如NELL-1)的注入。
[0159]包括如纤维蛋白原、聚乳酸、多孔陶土、明胶、琼脂等等材料的各种可生物降解运送材料可以在例如U.S.专利Nos：5,736,160，4,181,983，4,186,448，3,902,497，4,442,655，4,563,489，4,596,574，4,609,551，4,620,327和5,041,138中找到。
[0160]其他的运送载体包括但不限于骨移植材料。骨移植材料可以来自自然材料(例如移植的骨或骨片段)、合成材料(例如各种聚合物和/或陶瓷)或两者的混合。典型地，骨移植材料可以用来填补或者取代丢失的骨组织。这样的骨移植材料还经常作为假肢器官装置(例如骨替代或支持装置)的组成部分，来促进与活骨的紧密结合/修复性的调整。
[0161]使用生物活性玻璃和磷酸钙、胶原、混合物等的骨移植物具有好的生物相容性，并且在一些例子中引起骨组织的形成和合并。可以或者单独或者为了恢复目的与丙烯酸聚合类、和其他的聚合物合并来使用很多不同的玻璃、玻璃-陶瓷和晶体相材料。这些材料包括羟磷灰石、氟磷灰石、氧磷灰石、硅灰石、钙长石、氟化钙、氟硅钙钠石(agrellite)、失透石、硅碱钙石、金云母、三斜磷钙石、磷酸氢钙、磷酸八钙、白磷矿石、磷酸四钙、堇青石和块磷铝矿。描写这些用途的代表性专利包括U.S.专利No.3,981,736，4,652,534，4,643,982，4,775,646，5,236,458，2,920,971，5,336,642，and 2,920,971。额外的参考包括日本专利No.87-010939和德国专利OS 2,208,236。其他的参考可以在W.F.Brown，″Solubilities of Phosphate & Other Sparingly SolubleCompounds，″Environmental Phosphorous Handbook，Ch.10(1973)中找到。除上述以外，来自动物的包括珊瑚和珍珠的某一材料，也可以作为增强的目的用在生物材料中。
[0162]其他的骨移植材料包括用15到75％重量的生物活性玻璃和1到10％重量的玻璃体矿物纤维强化的柔软、模压的丙烯酸基骨胶接剂(U.S.专利No.4,239,113)，如磷酸三钙的骨填料和添加到可通过如混合胺的过氧化苯甲酰过氧化物系统聚合的双酚-A-缩水甘油基异丁烯酸盐(bis GMA)的生物陶瓷A2，(Vuillemin等人(1987)Arch.Otolygol.Head Neck Surg.113：836-840)。可通过氢化钙接合剂反应固化的两种成分，含有水杨酸盐和丙烯酸酯的树脂合成物在U.S.专利No.4,886,843中有所描述。U.S.专利No.5,145,520和5,238,491公开了装填物和接合剂。可以制作上述材料来引入NELL-1蛋白质。
[0163]另外，包括骨形成蛋白质的移植材料是已知的。因此，例如U.S.专利4,394,370描述了在适合骨缺陷体内移植的棉球上制造重组胶原质和去矿化骨颗粒或重组胶原质和溶解的骨形成蛋白质的络合物。类似的，US专利5,824,084描述了由生物相容的、可植入的，优选带有电荷的表面的移植材料制成的物质。生物相容的、可植入的移植材料的例子包括，含有磷酸钙的合成陶瓷、一些聚合物，去矿化骨基质或矿化骨基质。这些材料可以另外含有结合到物质表面的细胞粘附分子。术语“细胞粘附分子”是指层粘连蛋白、纤维连接蛋白、玻璃粘连蛋白、脉管细胞粘附分子(V-CAM)和细胞间粘附分子(I-CAM)以及胶原质。特别合适的移植材料包括，例如分离的矿物化多孔骨片段，矿物化骨粉末或颗粒，胍-盐酸萃取的去矿化骨基质，烧结的皮层或多孔骨，Interpore出售的商品名称为Interpore 500的珊瑚羟磷灰石和例如Zimmer出售的合并到骨移植代替品Collagraft的粒状陶瓷，或Orquest以胶原质为原料制作的丝状棉球。NELL-1蛋白可以引入到任何一种骨移植材料或取代骨形成蛋白。
VII.试剂盒
[0164]在另一实施方案中，本发明提供实现这里所述测定和组合物用途的试剂盒。在优选实施方案中，试剂盒包括一个或多个含有抗体和/或核酸探针和/或适合检测NELL-1表达和/或活性水平的物质的容器。试剂盒可以选择性地包括有助于实现这里所述方法的任何试剂和/或设备。这样的试剂包括但不限于缓冲剂、标记，标记的抗体，标记的核酸。用于可视荧光标记的过滤装置，印迹膜等等。
[0165]在另外一个实施方案中，试剂盒包括含有NELL-1蛋白或编码NELL-1的载体和/或含有编码NELL-1蛋白质载体的细胞的容器。
[0166]另外，试剂盒可以包括含有对实现本发明方法或这里所述组合物给药与外壳的指导(例如方案)的说明材料。虽然这些说明材料通常包括不限于此的书面或印刷材料。具有储存这些指导和与使用者之间的沟通能力的任何媒介都在本发明预期之内。这些媒介包括但不限于电子储存媒体(磁盘、磁带、卡带、盒式磁带、芯片)，光媒体(例如CD ROM)等等。这些媒体包括提供这些说明材料的英特尔网址。
实施例
[0167]下述实施例是为了解释而不是为了限制本发明的。
实施例1
NELL-1促进胎儿颅盖成骨细胞的矿化
[0168]下述的NELL-1基因的核酸序列全长cDNA与小鸡的Nel基因具有61％的同源性，因此命名为人类NELL-1基因(Watanabe等人(1996)Genomics.38(3)，273-276).NELL-1蛋白质包括一个信号肽，一个NH2-末端血小板反应蛋白(TSP)-样模块
Figure A0382497500471
and Bier(1995)Cell.80(1)：19-20)，5个维勒布兰德因子C结构域和6个EGF-样结构域。
[0169]人类NELL-1基因表达主要定位在骨前端、沿着侧骨缝骨边缘的间质细胞和成骨细胞和新形成骨的凝集间质细胞中。人类多器官组织mRNA印迹测定显示在胎儿脑部，而不在胎儿肺脏、肾脏和肝脏中特异性表达人类NELL-1。我们也发现，在大鼠的颅骨骨原细胞，而不在大鼠的胫骨和培养的基质细胞、成纤维母细胞中表达NELL-1。我们的资料证实主要在头盖膜内骨和神经组织(神经脊器官)中表达NELL-1基因。
A)材料和方法
[0170]对妊娠第7、11、14、17天的小鼠胚胎进行全套RNA分析。构建带有NELL-1cDNA的腺病毒(敲除E1-A并带有MCV启动子的AD5)，并用其感染大鼠胚胎颅骨原细胞和MC3T3细胞系。按下述方法构建病毒：用10mgPJM17(包含有缺陷腺病毒基因组)和pAC-CMV-based质粒(含有使用CaPO4的有义或反义大鼠NELL-1)共转染293个细胞，来在10-14天中产生表达大鼠NELL-1基因的重组腺病毒载体。噬菌斑纯化病毒并且进行Southern印迹方法来确认NELL-1基因的并入。用包含有β-牛乳糖基因的腺病毒作为对照，来检测不同细胞感染的有效性。在MC3T3细胞和NIH3T3细胞中观察到感染的有效性约为80-90％。
[0171]在感染后的14，17，21天，进行冯科萨氏染色。用ImagePro系统定量矿化的区域。用双侧t检验进行统计分析。认为*p＜0.01的统计上P值是有意义的。抽提过量表达NELL-1细胞的RNA，并且进行小鼠cDNA的序列分析。用磷屏成像仪定量杂交信号。
B)结果
[0172]从妊娠14天开始微弱地表达NELL-1mRNA，并在妊娠周期中有少量的增加。妊娠14天是颅骨开始矿化的时间点。培养的第一代大鼠胚胎颅骨细胞与过度表达NELL-1的MC3T3细胞显示出比对照的β-牛乳糖增加的矿化。与对照组相比，在妊娠后第17天，NELL-1过量表达在颅盖成骨原细胞培养物中的矿化作用增强近30倍。根据冯科萨氏染色和IMAGEPRO软件定量分析得到上述结果。上述增加矿化作用在妊娠的21天减弱2倍。NELL-1转染的MC3T3细胞得到的小鼠cDNA序列分析显示与对照组相比，BMP-7基因表达下调20％，以及分手和脚基因(Split Hand and Foot gene)表达上调3倍。这两种基因与骨形成和颅面发育有密切关系。
C)讨论和结论
[0173]这个研究中，我们清楚的证实了NELL-1与骨形成有密切的关系及其增加了颅骨成骨样细胞的矿化。清楚的鉴定出一些下游效应因子在骨形成和胚胎发育中起到的重要作用。颅骨早闭，也就是CS，可能与颅骨的过度形成有关，因此很可能与NELL-1分子的过度表达有关。这些结果以及NELL-1蛋白质功能的初步分析早期表明NELL-1蛋白质是生物学相关蛋白质。NELL-1蛋白质可能作为一种与其他的生长因子相互作用的调节器。最近发现，TSP-1是TGFβ-1的主要激活因子 and Bier(1995)Cell.80(1)：19-20)。TGFβ-1在多数细胞中是以不与细胞受体结合的非活性形式分泌的。TGFβ-1最初与称为潜伏结合蛋白(LAP)的其NH2-末端的二聚体，通过非共价结合而隐藏其活性。在细胞外激活TGFβ-l，使TSP-1与LAP的NH2-末端相互作用，形成三分子络合物。在络合物中，发生构像的改变，使其可以与受体结合。在原肠胚形成中隐藏具有四个vWF C结构域(大概是同三聚体)的高度同源性分子如脊索蛋白(chordin)，而在非洲蟾蜍属腹背模式中起重要作用(Crawford等人(1998)Cell.93(7)：1159-1170)。最近发现脊索蛋白直接与腹部的BMP-4(骨形成蛋白4，TGFβ超家族成员之一)结合，并且中和BMP-4的活性(Piccolo等人(1996)Cell，86(4)：589-598)。上述结果显示，在细胞外NELL-1蛋白质可能是通过与一些TGFβ超家族成员的相互作用来进行其未知功能。因为TGFβ-1是一个已知的调节骨形成的因子，NELL-1的促进矿化作用可以与其和TGF蛋白质超家族的相互作用有关。
实施例2
过度表达Nell-1的转基因小鼠中的颅缝早闭
[0174]前述我们报道了在颅缝早闭(CS)患者颅缝早闭过程中，作为新型分子过度表达的Nell-1，颅缝早闭是常见的先天性颅骨畸形之一。这里我们描述了过度表达Nell-1转基因小鼠的制作和分析。Nell-1转基因动物表现出，从简单到复杂骨性结合的CS样表形。在组织学上，这些动物骨前端的非正常闭合/颅缝闭合说明颅骨的过度生长和交叠是与成骨细胞的分化加速和增值减少同时发生的。此外，尽管Nell-1的广义，非组织特异性的过度表达，异常仅发生于颅骨。在体外，常规的细胞培养中，Nell-1过度表达可以加速颅骨成骨细胞的分化和矿化。并且成骨细胞中的Nell-1过度表达足以促进碱性磷酸酶的表达和小结节的形成。相反地，在体外Nell-1的下调抑制成骨细胞的分化。总的来说，Nell-1过度表达诱导颅骨过度生长，导致啮齿类动物模型的骨缝提前闭合。因此Nell-1在CS发生中具有重要作用，可能是导致颅缝早闭复合链中的一个环节。在一定细胞水平上，Nell-1的表达可以调节成骨细胞的分化，并且对于成骨细胞的分化，其是必须和重要的。
方法
过度表达Nell-1转基因小鼠的制备
[0175]应用CMV启动子和SV40多聚腺苷位点将大鼠Nell-1 cDNA从pTM-70(13，14)亚克隆至pCDNA1.1(Invitrogen，Carlsbad，California，USA)。首先将重组质粒转染至MC3T3细胞(一种小鼠的颅骨细胞系)来证实正确的蛋白质表达(资料未显示)。包含有CMV启动子，Nell-1基因和SV40多聚腺苷位点的4.76-kb DNA片段用于卵母细胞的微注射。用标准方案制备转基因的B6C3小鼠(15)。奠基者(The founder)与其非转基因的同窝出生仔畜交配，建立转基因系。
转基因拷贝数量分析
[0176]应用PCR和Southern印迹分析测定转基因数量。从http://www.med.umich.edu/tamc/spike.html(16)获得测定转基因拷贝数量的PCR方案。基于假定哺乳动物基因组单倍体容量是3□109bp并且其需要10□g DNA来阻止，计算作为N bp转基因DNA/3□109基因组DNA的每5□g基因组DNA中的转基因DNA数量。插入尺寸是4.76kb，一个复制规格是7.933pg每10□g基因组DNA。进行30个周期的PCR，用溴乙锭电泳分离产物。用鹰眼II方法计算强度(Stratagene，La Jolla，California，USA)。
免疫组织化学
[0177]制备Nell-1抗体的详细方法见Kuroda等人的文献(13，14)。抗体识别Nell-1的COOH-末端(CSVDLECIENN)。使用从Nell-1转染的NIH3T3细胞中抽提的蛋白质，通过Western印迹鉴定抗体的特异性。将标准的生物素抗生物素络合物/免疫过氧化酶方案(Vector EliteKit；Vector Laboratories INC.，Burlingame，California，USA)与1∶100抗体稀释液一起使用。二氨基联苯胺过氧化酶基质和3-氨基-9-乙基咔唑用于显色，用苏木素复染片段。
磁共振成像
[0178]使用Bruker Biospec磁共振成像仪(Bruker BioSpin GmbH，Rheinstetten，Germany)将福尔马林保存的样本进行磁共振成像(MRI)，磁共振成像仪带有7.0-T，18-cm的清晰孔磁体，并装有微成像梯度组和35-mm内径的鸟笼射频圈。通过使用带有如下参数的梯度回波过滤像恒定脉冲序列得到脑和颅盖的轴位和矢形图象：TR/TE，229.3/64.1ms；回转角，30°；视野，2.3cm；矩阵，256×256；薄片厚度，1mm；和激发次数，8。平面空间分辨率约为90μm。
微型计算机的体层扫描
[0179]在30kVp和750mA下收集所有数据。使用MicroCat扫描仪(Oak Ridge National Laboratory，Oak Ridge，Tennessee，USA)提供的锥形束运算法则对这些数据进行重建。矩阵是256×256×256，产生140μm的等方性分辨率。定量程序包括含有0，50，250和750mg/cc羟磷灰石骨幻影(图像中的长棒)的布置。通过使用MetaMorph(二维)(Universal Imaging Corp.，West Chester，Pennsylvania，USA)和Amira(三维)(Indeed-Visual Concepts GmbH，Berlin，Germany)得到可视数据。
体内增值分析
[0180]新生小鼠注射100ug/g的BrdU。注射2小时后动物死亡。固定动物并用BrdU抗体(Sigma-Aldrich，St.Louis，Missouri，USA)进行免疫染色。将转基因动物的颅骨骨缝，脑，胫骨与其同窝出生仔畜相比较。
隐藏Nell-1(AdNell-1)和反义Nell-1(AdAntiNell-1)的重组缺陷腺病毒载体
[0181]将大鼠Nell-1 cDNA双向插入到人类CMV IE1启动子和侧面与Ad5病毒的1到454和3,334到6,231核苷酸序列连接的SV40缝接/多腺苷酸位置上。得到的质粒，pAdCMV-Nell-1，转录相对于Ad5标准图左侧的Nell-1。pAdCMV-Nell-1和pJM17(MICROBIX BiosystemsInc.，Toronto，Canada)共同转染293细胞，来分离重组的腺病毒(Ad)(AdNell-1)，致使载体EL-A基因的缺陷。噬菌斑纯化，并用Southern印迹分析证实重组病毒的克隆。当通过CsCl软垫和再次CsCl连续梯度时，AdNell-1和AdLacZ都长至高滴度和纯度。根据293细胞上的噬菌斑格式测定，结果材料是5×109pfu/ml。进行Northern印迹和Western印迹以确认Nell-1基因的插入和蛋白质表达及其表达量。
大鼠颅骨细胞原细胞培养物(FRCCs)
[0182]按前述的方法分离胚胎第18天(E18)的大鼠颅骨成骨细胞(12)。将从老化四、五、六收集的细胞组成库并且平铺为2.5×104/cm2。使用阶段二中的细胞。成骨细胞的腺病毒感染。为了观察Nell-1的过度表达效果，在六孔盘中培养来自不同世系的成骨细胞至80％的融合。培养物是透气的并且将感染剂量(1ml没有血清的培养基中20pfu/细胞)加入到培养物中。使用五组AdNell-1，AdAntiNell-1，和带有β-半乳糖苷酶(Adβ-Gal)的对照Ad。感染12，15和21天后进行冯科萨氏染色。用Pro Plus成像系统(Media Cybernetics，Silver Spring，Maryland，USA)分析矿化的百分比。采用t检验进行大鼠间的比较。为了观察Nell-1下调的效应，按前述的方法在胎鼠颅骨的培养细胞(FRCC)中加入AdAntiNell-1。
微点阵分析
[0183]在感染后的第6，9和12天，对来自AdNell-1-和Adβ-Gal-感染的MC3T3细胞的RNA进行微点阵分析。I.Nishimura和CaliforniaLos Angeles大学微点阵磁心器件人员已经开发了与骨有关的微点阵。该微点阵包括带有多于十个内部对照基因的超过37个基因。确认指示剂包括：骨基质蛋白质(骨桥接素，骨连接素，骨钙素，骨唾液蛋白)；受体(a2-整合素，维生素D受体，甲状旁腺受体，雌激素受体)；造骨细胞指示剂(碱性磷酸酶，Cbfa1)；吸附蛋白(纤维结合素，硫酸软骨素蛋白多糖1，核心蛋白多糖，细胞粘合素，syndecan，层粘连蛋白)；金属蛋白酶(基质金属蛋白酶1和2)；生长因子(Bmp2，Bmp7)；原纤维胶原蛋白(胶原蛋白1A1，1A2，3A1，5A2和11A1)；其他胶原蛋白(胶原蛋白4A1，6A1，7A1，10A1和15A1)，和带有不规则三股螺旋的原纤维-连接胶原蛋白(FACITs)(胶原蛋白9A1，9A2，12，14，16和19)。用随机的六个引物和Cy3-或CY5-dUTP标记RNA(用于Cy3的30ug总RNA和用于Cy5的60LLG)。逆转录酶标记的探针在点阵上杂交。用418点阵扫描仪(Affymetrix Inc.，Santa Clara，California，USA)进行多重激光扫描，来提供有用读数和标准差以验证该方法的可重复性。计算所有内部对照的均值并且使用IPLAB 3.2版本微点阵组(Scanalytics Inc.，Fairfax，Virginia，USA)来使杂交强度规格化。所有造骨细胞指示剂的关系作为一组进行计算并且在AdNell-1-感染的细胞和Adβ-Gal-感染的对照细胞之间进行比较。使用RT-PCR.DNase处理的总RNA。通过高-循环PCR对基因片段表达进行最初证实后，用另外低-循环PCR来对相关的基因表达进行定量(12)。对于每个候选分子，我们测定最可能通过连续的减少循环数量(范围，15-35循环)落入线形扩增范围内的循环数量。进行电泳并且与标记为wit P32的探针特异性序列杂交。使用磷屏成像仪(Molecular Dynamics，Sunnyvale，California，USA)来测定强度。用Gapdh值对每个样品的光密度值进行分组(在20个循环时进行)并且规格化。引物序列如下。Msx2：前，5′-CCT CGG TCA AGT CGG AAA ATT C-3′(SEQ ID NO：2)；逆，5′-TGGACA GGT ACT GTT TCT GGC G-3′(SEQ ID NO：3)；探针，5′-GAG CACCGT GGA TAC AGG AG-3′(SEQ ID NO：4)；(退火温度，68℃)。Cbfa1：前，5′-CTG TGT GGC TCC TAA CAA GTG TG-3′(SEQ ID NO：5)；逆，5′-GGA TTC TGG CAA TCA CAA GCT GTC-3′(SEQ ID NO：6)；探针，5′-CCT ACT CAC TGT CCG GGG AGT CCT GC-3′(SEQ ID NO：7)(退火温度，66℃)。骨钙素：前，5′-ATG AGG ACC CTC TCT CTG CTC-3′(SEQID NO：8)；逆，5′-GTG GTG CCA TAG ATG CGC TTG-3′(SEQ ID NO：9)，探针5′-CAT GTC AAG CAG GGA GGG CA-3′(SEQ ID NO：10)，(退火温度，66℃)。骨桥蛋白：前，5′-AGC AGG AAT ACT AAC TGC-3′(SEQ IDNO：11)；逆，5′-GAT TAT AGT GAC ACA GAC-3′(SEQ ID NO：12)探针5′-GCC CTG AGC TTA GTT CGT TG-3′(SEQ ID NO：13)，(退火温度66℃).Nell-1：(12)。
流式血细胞计数分析
[0184]将细胞以5×105细胞/盘接种到60-mm盘。在AdNell-1和Adβ-Gal感染后24，36，48，和72小时得到细胞。使用一百万个细胞来做流式血细胞计数，重复该程序三次。为了进行流式血细胞计数，在细胞中加入用含有碘化丙啶(propidium iodide)的低渗性DNA染色缓冲液。
结果
CMV启动子/Nell-1转基因小鼠的构建
[0185]为了研究广义上Nell-1在体内的过度表达，制备转基因小鼠，在CMV启动子的控制下表达转基因小鼠中的Nell-1。通过Southern印迹和PCR(图2A)来验证复制数量。RNA分析(图2B)和免疫组织化学(资料未显示)进一步验证了奠基者(founders)中Nell-1的表达。Nell-1-过度表达的奠基者和没有转基因的同窝出生仔畜交叉，并且对F2后代进行了全面分析。由于大多数人类CS显型易于表现在新生儿上，所以检测了来自两个世系的代表六窝的42只新生小鼠。对这些小鼠的形态进行包括骨缝闭合的发育异常分析。随后对这些小鼠进行基因分类。通过骨缝下面的可见血管的不存在(显示骨缝闭合)或存在(显示骨缝明显)来检测骨缝的开放。通过解剖显微镜进一步验证骨缝闭合。检测六窝中的两窝，代表20个后代，没有产生任何带有明显颅面缺陷的新生小鼠，而Nell-1转基因的则有。这些窝没有进行进一步的检测。剩余四窝中的每窝中带有颅面缺陷的后代得到了恢复。这四窝后代(退火温度，66℃)。骨钙素：前，5′-ATG AGG ACC CTC TCT CTG CTC-3′(SEQID NO：14)；逆，5′-GTG GTG CCA TAG ATG CGC TTG-3′(SEQ ID NO：15)，探针5′-CAT GTC AAG CAG GGA GGG CA-3′(SEQ ID NO：16)，(退火温度，66°C)。骨桥蛋白：前，5’-AGC AGG AAT ACT AAC TGC-3′(SEQ ID NO：17)；逆，5′-GAT TAT AGT GAC ACA GAC-3′(SEQ IDNO：18)探针5′-GCC CTG AGC TTA GTT CGT TG-3′(SEQ ID NO：19)，(退火温度，66℃)。Nell-1：(12)。进一步分析(22只小鼠)。这种快速筛选方法的局限性在于可能检测不到只带有骨缝闭合焦点的轻微CS，因此Nell-1过度表达可能出现低外显率。
[0186]22只新生小鼠中有13只(60％)是转基因小鼠，其基因复制数与奠基者Nell-1小鼠相似(预计为50％)。检测13只Nell-1 DNA阳性(F2)小鼠(TF2)的Nell-1 RNA水平。8只(62％)小鼠的Nell-1RNA表达为阳性。但是表达水平各异(图表2C)。虽然有些小鼠具有高的基因复制，而Nell-1表达水平低或几乎不表达Nell-1的原因尚不明确，但是外源性因素如插入区周围异染色质形成可以在转基因表达的高度异质性中起重要作用(17)。从同一窝中分离出来的不同组织的RNA水平不同。Liu等用CMV启动子过度表达Msx2也发现了这种多样性(5，6)。因此Nell-1转基因的表达与其复制基因数不一定相关，并且还可能根据细胞类型变化。为确定转基因模型中的过度表达Nell-1是否与生理作用有关，我们比较了3个轻微CS表型的TF2子代和非转基因正常同窝出生仔畜(NF2小鼠)的Nell-1 RNA表达水平。TF2小鼠的Nell-1表达增加四倍(资料未给出)。这与观察到的CS患者的NELL-1表达水平升高2-4倍相似(12)。这表明我们模型的Nell-1过度表达的水平在临床上是适当的而非超生理的。
Nell-1转基因小鼠的表形分析
[0187]8只Nell-1 RNA阳性的TF2小鼠中的3只有严重的颅面异常，于出生后不久死亡(见图3A-3C和图)。这些小鼠的全身mRNA都可以检测出Nell-1转基因的表达(图2C)，并且通过皮肤，肝脏和颅骨的免疫染色进行证实(图2D)。
[0188]对受到最严重影响的TF2小鼠之一的形态学检查表明在顶骨区域有一个带有完全闭合的矢状面和后前额(PF)骨缝以及局部闭合冠状面骨缝的大突出(图3A-3C)。
在临床上，其与颅骨异常，也就是带有就是矢状面，额状面及冠状面的，并伴有次额骨隆起和脑膨出的过早骨缝闭合的一种人类CS表型非常相似(图3D)(1)。这种TF2小鼠的脑MRI显示出脑室的明显减小以及增加的脑实质水肿，此两者都说明颅内压的增高(图表3E)。在颅缝早闭的颅骨内脑组织的持续生长会造成未经治疗的CS患者的颅压升高。微型计算机断层(MCT)扫描和磁共振分析也显示出上述TF2小鼠的颅骨结构异常(图3F和3G)。
[0189]组织学检查发现Nell-1表型阳性的TF2小鼠与同窝出生的NF2有明显差别。同人类CS相同，TF2小鼠显示出组织学上可见的颅缝早闭，如正面骨缝闭合/重叠形成的浓厚，杂乱的脊(图4a和b)。全部封固骨骼染色显示颅外骨骼没有可观察到的异常。腭骨和下颌骨、脊椎骨和长骨的苏木素、曙红和酒石酸磷酸染色显示出没有任何组织学异常，也没有成骨细胞数量的增加。因此Nell-1的表达看起来仅限于颅骨。尽管周围组织Nell-1的表达归因于CMV启动子的应用，但是TF2小鼠表现出主要影响颅缝的开放和关闭的特异性颅骨异常。在体内的免疫组织化学显示出成骨细胞分化标记物表达的增加(图4块c和d)。
[0190]表达Nell-1的TF2小鼠颅缝早闭的原位BrdU分析显示出沿骨缝边缘，在颅骨生成区域内的细胞增生数量明显减少(表4块e和f)。这些数据显示出Nell-1过度表达与成骨细胞分化有关。沿TF2和NF2小鼠的颅缝，没有观察出每单位面积内细胞数量具有统计学差别(表4块g)。细胞增生的减少有两种可能，有可能是由于分化的成骨细胞的增生能力弱而间接导致的，或是由于成骨细胞增生能力减低而直接造成的。
[0191]第二个严重影响TF2动物的形态学测定显示出明显的颅缝消失，尤其是在带有在枕骨(后部)区域膨出的正中线(也就是矢状线和后额缝)。总之，其颅骨细窄，并且与人类舟状颅和矢状骨连接成熟过早畸形相似。MCT扫描显示后颅缝完全闭合，部分矢状和冠状颅缝闭合(图5B)。组织学上的关联显示出矢状缝附近区域发生的颅骨过度生长和重叠(图5B)。
[0192]为研究TF2妊娠期的胚胎发育过程，处死2只同窝出生的E15 TF2孕鼠。从19只孕鼠中的两只观察到不能存活的露脑畸形样表现型的胎鼠。有趣的是Liu等报道了过度表达Msx2的小鼠也出现相同表型(6)。这种表型的病因学还不清楚。上述结果可能有助于解释严重影响新生小鼠中TF2子代的可观察到的低发生率。
体外Nell-1过度表达可以加速成骨细胞的分化
认为骨形成调节紊乱是颅骨过度生长/重叠和颅缝早闭的一种可能机制(18)。因为骨缝部位的异常骨生成是显示出颅缝早闭的Nell-1 TF2小鼠的主要特征，我们猜测Nell-1过度表达可能会改变正常颅骨成骨细胞的细胞周期和分化路径，从而促进骨生成提前。
[0193]为了证明我们的假说，我们首先测定Nell-1对骨矿化作用的影响，矿化是体外成骨细胞分化的标志。用含有抗坏血酸的20pfu/细胞的AdNell-1感染主要的FRCC和MC3T3(一种小鼠颅骨成骨细胞样细胞系)培养物。抗坏血酸对于诱导和终止成骨细胞的分化和矿化是必须的(19)。ADNell-1转染后的FRCC和MC3T3比Adβ-Gal-感染，作为对照)细胞的矿化更快且更丰富(多6倍)(图6A和6B)。相反，AdNell-1转染并没有在NIH3T3，成熟或胚胎大鼠的成纤维细胞中引起任何矿化响应(资料未给出)。这些资料证实Nell-1加速成骨细胞矿化，以及这种作用具有成骨细胞特异性。
[0194]我们前面的体内BrdU分析结果表明，在TF2小鼠体内沿正面骨生成区域的细胞增值的减少。为了证明体外Nell-1过度表达是否影响细胞周期，在转染后第24和48小时，对AdNell-1-转染的MC3T3细胞(和Adβ-Gal对照，含有或不含有抗坏血酸，经过或不经过24小时的血清饥饿)进行流式血细胞计数分析。不同细胞周期的细胞数在统计学上没有显著性差异(双侧t检验，P＞0.05)。转染Nell-1后MC3T3细胞增值没有减少的事实可能从体外和体内成骨细胞的固有差别，或者细胞外环境或不同细胞分化周期的影响中反映出来。
[0195]通过成骨细胞的分化，及其后的结节形成(成骨细胞聚集物)预示一般的体外成骨细胞矿化。这种分化过程需要抗坏血酸。有趣的是，当在没有抗坏血酸的情况下培养时，AdNell-1转染的MC3T3细胞在转染后的第3天也出现了表达碱性磷酸酶的结节；而对照组Adβ-Gal-转染细胞没有结节。但是可以在没有抗坏血酸的条件下诱导结节形成的Nell-1作用微弱(在100×镜下观察，每个结节中≤20个细胞)，并且通过冯科萨氏染色没有发现矿化(图6C)。而且，在这些“小结节”中没有发现晚期分化标记物如骨桥蛋白。在没有抗坏血酸的条件下由AdNell-1转染成骨细胞得到的小结节形成，说明仅Nell-1就可能引起细胞与细胞的黏附，但是仅有Nell-1不足以诱导成骨细胞分化。
[0196]为了证实Nell-1增强成骨细胞分化，我们在将转染后第6，9和12天，对在带有抗坏血酸的正常条件下培养的AdNell-1转染的MC3T3细胞的RNA进行微点阵分析(图6D-6F)。微点阵分析的目的是应用回归分析来确定AdNell-1转染以及Adβ-Gal-转染的对照细胞的所有成骨细胞分化标记物表达模式是否有显著差别。在第12天，ADNell-1转染的细胞和Adβ-Gal-转染中成骨细胞分化标记物表达模式显示出显著差别(r2＝0.334)。本试验所用的微点阵分析不是为了定量分析单独基因的表达。单个基因表达模式应该谨慎解释，例如应该分析基因的两或多倍以上的上调或下调。还应该应用RT-PCR或RNA分析来证实其结果。在AdNell-1转染的细胞中，晚期分化标记物，如Bmp7，骨桥接素和骨钙素上调了两倍以上，而早期标记物，如胶原蛋白I和骨连接素下调了两倍以上。(图6G)。这表明Nell-1促进成骨细胞的分化。用RNA电泳法证实骨钙素和骨桥接素的RNA上调(见图7C和7D)。或者微点阵分析或者减少循环的RT-PCR分析都没有发现AdNell-1转染的MC3T3细胞的Cbfa1，TGF-β1，-β2，和-β3，或Tgf-β型-I，-II，和-III受体，Fgfr1，或Fgfr2的表达有意义变化(资料未给出)。这些表明Nell-1可以作用于上述候选基因的下游，或可以影响完全不同的通路。
体外下调Nell-1延迟成骨细胞的分化
[0197]为了进一步阐明Nell-1对成骨细胞分化的生理作用，我们用含有反义Nell-1的腺病毒转染成骨细胞，来检测下调Nell-1蛋白质的影响。在有抗坏血酸的情况下，用20pfu/细胞的AdAntiNell-1转染FRCC培养物。AdAntiNell-1下调Nell-1蛋白质表达至普通水平的40％(图7A)。与Adβ-Gal-转染的对照组或AdNell-1转染的细胞相比，AdAntiNell-1转染的FRCC表达的碱性磷酸酶明显减少(图7B)。还下调AdAntiNell-1细胞中骨钙蛋白和骨桥接素RNA的表达(图7C和7D)。通过Northern分析法显示，AdAntiNell-1转染的细胞与Adβ-Gal-对照细胞的骨钙蛋白的比例在第9天是1∶4，在第12天是1∶2。AdAntiNell-1转染的细胞与Adβ-Gal-对照细胞的骨桥接素的比例在第6和第9天是1∶5，在第12天是2∶5。因此，下调数据对过度表达的数据进行了补充，并且证明了Nell-1在成骨细胞分化中具有重要作用。
讨论
[0198]NELL-1是一个相对新发现的从前不知其功能的分子。因为在(CS)患者的颅缝早闭中观察到易变性的NELL-1上调，我们在小鼠模型中模拟了NELL-1的过度表达以研究Nell-1在颅骨发育和病理中的新作用。我们发现Nell-1转基因小鼠中的颅缝早闭，以及增强的成骨细胞分化。因此Nell-1可能是调节颅缝闭合的一个候选基因，其过度表达可能在CS颅缝早闭的机理中具有重要作用。根据我们体外Nell-1过度表达和基因敲除的研究资料，Nell-1最主要的作用是影响成骨细胞的分化，虽然其分子机制尚不清楚。
[0199]Nell-1可能通过与配体结合，然后螯合或激活配体，以及激活受体介导的信号通路(20)来诱导成骨细胞的分化。Nell-1与脊索蛋白样，富含半胱氨酸结构域，NH2-末端凝集蛋白样分子和EGF样重复体的结合使Nell-1可能成为生长因子活性的调节剂。为证实上述可能性，我们进行了预试验。为确定Nell-1是否与已知的EGF-样受体结合，我们先将Nell-1加入表达ErB1，-2，-3或-4的IL-3-依赖细胞中。Nell-1的加入不能激活这些受体的酪氨酸磷酸酶活性。因此，尽管Nell-1是一个已知的带有EGF样重复的隐藏活性蛋白质(13)，Nell-1也不是上述受体的配体。相反，Nell-1可能与其它仅被某种细胞类型表达的特定受体相互作用。运用酵母双杂交体系(14)，我们运用分离潜在Nell-1受体的过程。因为Nell-1与血栓凝集素-1和脊索蛋白有许多相同的结构域单元，因此，其可能激活或螯合TGF-β超家族成员，并且作为血栓凝集素-1样分子，来激活潜伏TGF-β1的活性(21)。最近，Abreu等人证明Nell-1是“脊索蛋白样，富含半胱氨酸结构域”的家族成员，该家族包括脊索蛋白，kielin，crossveinless，扭转的原肠胚形成(Tsg)和连接的TGF(20)。这些脊索蛋白样，富含半胱氨酸结构域的家族成员的共同特点是其表达具有暂时和空间的特异性，尤其是在结构中。其另一共同特点是与Bmp家族成员的相互作用，以及其后起前抗-或抗-Bmp成分。
在体内Nell-1的特异性表达和功能
[0200]在我们以前的研究中，我们报道了最早是在ELL-E14小鼠中发现了Nell-1的表达(12)。在生长发育过程中，出生前和出生后Nell-1都主要表达于颅面部。免疫组织化学显示出Nell-1主要定位于骨缝的骨形成区域和颅骨以及下颌骨的硬化成骨膜上(资料未给出)。颅骨和下颌骨的成骨膜都是神经脊的诱导剂(22)。由神经脊的诱导剂优先表达于颅面区的Nell-1证明Nell-1可能在颅面的生长发育过程中具有重要作用。令人吃惊地，与其它普遍基因过度表达的CS模型不同，尽管基因过度表达没有广义的组织特异性，但是Nell-1转基因小鼠仅显示出颅骨发育异常。这进一步证明我们关于Nell-1通过高度特异的相互作用诱导成骨细胞的分化的假说。因此，Nell-1的表达不太可能通过非特异性干扰同源性分子如血栓凝集素-1来导致颅缝早闭的发生。这在体外的敲除研究中已经得到证实。
Nell-1对成骨细胞分化的影响
[0201]未使用抗坏血酸培养的普通成骨细胞不会分化。在另一方面，过度表达Nell-1的成骨细胞在没有抗坏血酸的情况下形成小结节，并表达碱性磷酸酶。这表明单独Nell-1足以诱导成骨细胞分化。
[0202]另外，对在正常条件下(含有抗坏血酸)培养的成骨细胞中的Nell-1过度表达进行RNA微点阵分析发现，在转染12天后晚期分化标识物上调，AdNell-1转染的成骨细胞于转染后第12天开始增加矿化，这些资料表明Nell-1可能促进颅骨成骨细胞的分化和矿化。
[0203]Nell-1过度表达也许并不能真实反映Nell-1的生理作用，而是反映Nell-1过度表达对血栓凝集素-1样分子的影响。Nell-1的下调明显地对成骨细胞的分化进行抑制。因此Nell-1是体外成骨细胞分化的充分以及必要的条件。然而这个结论是否适用于体内还有待于制备Nell-1裸鼠来加以证实。
Nell-1与目前已知的CS模型的关系
[0204]Nell-1过度表达与体内Msx2过度表达所引起的颅面异常相似。两种模型都表现为颅缝过度生长，以及露脑畸形发生率的增高。然而这两种基因的细胞作用却是不同的；持续的Msx2过度表达诱导增值而且抑制分化，而Nell-1促进分化。因为颅骨融合发生较晚(出生后第16-21天)，并且粗大颅缝交叠不会在Pro250突变小鼠中出现(8)，在Fgfr1中有可诱导Cbfa1的过度表达的Pro→Arg突变的小鼠具有与Nell-1过度表达小鼠表型不同的表型。然而在体外，Cbfa1的细胞作用与Nell-1相同；都能通过上调骨标记物基因诱导成骨细胞分化。Msx2和Cbfa1可以调节Nell-1的表达。FRCCs的Cbfa1转染在24小时内上调Nell-1表达，而Msx2和Cbfa1联合转染后Nell-1表达下调(未出版研究)。虽然所有这些候选基因对了解CS都很重要，但是当Fgfr1/Cbfa1可能在颅缝闭合晚期发挥作用时，Msx2可能在CS早期发挥重要作用(5，6)。对包含有储备Cbfa1和Msx2结合序列的Nell-1启动子的进一步研究，可能进一步阐明其的相互作用(图8)。这些研究结果说明了在颅面生长和发育过程中基因动力学的复杂性和环境间相互作用。
[0205]总之，我们通过过度表达Nell-1建立了人类非综合征性CS的动物模型。与其它已建立的包括FGFRs基因突变和同源异形盒基因(homeobox)(1，2，8)的动物模型不同，我们的动物模型仅显示出在颅面骨中出现的异常。我们假设Nell-1足以促进和加速颅骨成骨细胞的分化和骨形成，也可能是必要的。从机理上，NELL-1过度表达诱导颅缝骨膜内的骨形成，并且可能会导致颅骨的过度生长和过度交叠，以及随后的颅缝早闭。尽管在人类基因组研究中，Nell-1还没有被确定为是CS的治病因子，但是研究资料高度支持Nell-1是颅缝早闭发病机制中的一个环节(1)。NELL-1转基因小鼠和人类非综合征性CS的相似性以及NELL-L与已知的CS治病候选基因间的相互作用为研究CS提供了新的视点。关于Nell-1在颅缝早闭和骨形成中的调节和机制研究可能会加速我们对导致CS的颅缝早闭病因的级联的阐明。
参考文献
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[0228]这里描述的实施例和实施方案仅仅是为了说明目的，本领域人员可以在本申请精神、范围以及所附权利要求的范围内作出修正和改变。因此，为所有目的，在这里将引述的所有出版物、专利、专利申请整体一并作为参考。
                               序列表
<110>加利福尼亚大学校务委员会(The regents of the University of
     California)
<120>增强骨矿化的NELL-1
<130>38586-327000
<140>PCT/US2003/029281
<141>2003-09-15
<150>US60/410,846
<151>2002-09-13
<160>2
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>2977
<212>DNA
<213>人类
<400>1
tagcaagttt ggcggctcca agccaggcgc gcctcaggat ccaggctcat ttgcttccac     60
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<210>2
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<212>DNA
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<221>misc_feature
<222>(1594)..(1594)
<223>n is a，c，g，or t
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<221>misc_feature
<222>(1655)..(1655)
<223>n is a，c，g，or t
<220>
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<222>(1657)..(1657)
<223>n is a，c，g，or t
<220>
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<222>(1697)..(1697)
<223>n is a，c，g，or t
<220>
<221>misc_feature
<222>(1720)..(1720)
<223>n is a，c，g，or t
<400>2
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atttatggat caaattntaa aataaagttg cctgttgtgn aa                        1722

Claims (41)

1.一种调整颅盖成骨细胞分化和矿化的方法，所述方法包括：改变Nell-1的表达或活性，其中增加Nell-1的表达或活性会增加成骨细胞的分化或矿化，而降低Nell-1的表达或活性会减少成骨细胞的分化或矿化。
2.根据权利要求1所述的方法，其中通过选自抗-Nell-1反义分子，Nell-1特异性酶核，Nell-1特异性催化性DNA，Nell-1特异性RNAi，抗-Nell-1内抗体，或在特异性的目标细胞和/或组织中敲除Nell-1的基因治疗方法来对Nell-1的表达或活性进行抑制。
3.根据权利要求1所述的方法，其中通过用表达Nell-1的外源核酸转染细胞，或用Nell-1蛋白质转染细胞来增强Nell-1的表达或活性。
4.根据权利要求2所述的方法，其中在颅骨缝反常发育的哺乳动物中抑制所述Nell-1的表达或活性。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述颅骨缝反常发育包括颅缝早闭(CS)。
6.一种促进哺乳动物体内潜在TGF-β1活化的方法，所述方法包括使所述哺乳动物接受外源Nell-1，或增加所述哺乳动物体内内源Nell-1的表达活性。
7.一种活化或螯合哺乳动物体内TGF-β超家族成员的方法，所述方法包括使所述哺乳动物接受外源Nell-1，或增加所述哺乳动物体内内源Nell-1的表达活性。
8.一种筛选成骨细胞分化调节剂的方法，所述方法包括使含有NELL-1基因的测试细胞与测试试剂接触；以及
检测所述测试细胞中NELL-1基因表达水平或Nell-1基因活性的变化，将其与对照细胞中NELL-1基因的表达水平或Nell-1基因活性进行比较，测试细胞和对照细胞中的NELL-1的表达水平或者Nell-1活性的差异显示出所述药剂调整骨矿化。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述对照是在比所述测试细胞浓度低时与测试细胞接触的阴性对照细胞。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述低浓度是指没有所述测试试剂。
11.根据权利要求8所述的方法，其中所述对照是在比所述测试细胞浓度高时与测试细胞接触的阳性对照细胞。
12.根据权利要求8所述的方法，进一步包括记录改变NELL-1活性调节剂数据库或骨矿化调节剂数据库中NELL-1核酸表达或NELL-1蛋白质的测试试剂。
13.根据权利要求8所述的方法，其中通过测定所述细胞中NELL-1mRNA的水平来检测nell-1的表达水平。
14.根据权利要求13所述的方法，其中通过将所述mRNA与和NELL-1核酸特异性杂交的探针杂交来测定所述NELL-1mRNA的水平。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述杂交选自Northern印迹，使用从nell-1 RNA得到的DNA的Southern印迹，点阵杂交，亲和色谱或原位杂交。
16.根据权利要求14所述的方法，其中所述探针是形成探针点阵的多个探针中的成员。
17.根据权利要求13所述的方法，其中是通过核酸扩增反应来测定所述NELL-1 mRNA的水平。
18.根据权利要求8所述的方法，其中通过测定所述生物样品中的NELL-1蛋白质的表达水平来测定所述NELL-1的水平。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述测定选自毛细管电泳，Western印迹，质谱，ELISA，免疫色谱或免疫组织化学。
20.根据权利要求8所述的方法，其中所述细胞是体外培养的。
21.据权利要求8所述的方法，其中所述测试试剂不是抗体。
22.据权利要求8所述的方法，其中所述测试试剂不是蛋白质。
23.一种改变哺乳动物细胞内Nell-1表达的方法，所述方法包括改变Msx2和/或Cbfal的表达或活性。
24.根据权利要求23所述的方法，包括通过上调Cbfal的表达或活性来上调Nell-1的表达或活性。
25.根据权利要求23所述的方法，包括通过上调Msx2的表达或活性来下调Nell-1的表达或活性。
26.一种筛选Nell-1表达或活性调节剂的方法，所述方法包括：
使含有Msx2和/或Cbfal基因的测试细胞和测试试剂接触；
并且
检测所述测试细胞中Cbfal和/或Msx2基因的表达水平或Cbfal和/或Msx2基因的活性，将其与对照细胞中的Cbfal和/或Msx2基因的表达水平或Cbfal和/或Msx2基因的活性相比较，在测试细胞和对照细胞之间的Cbfal和/或Msx2基因的表达水平或Cbfal和/或Msx2基因的活性的差异显示出该药剂可以调整Nell-1的表达或活性。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述对照是在比所述测试细胞浓度低时与试剂接触的阴性对照细胞。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述低浓度是指没有所述测试试剂。
29.根据权利要求26所述的方法，其中所述对照是在比所述测试细胞浓度高时与试剂接触的阳性对照细胞。
30.根据权利要求26所述的方法，进一步包括记录改变NELL-1活性调节剂数据库或骨矿化调节剂数据库中Cbfal和/或Msx2基因的表达或Cbfal和/或Msx2活性的测试试剂。
31.根据权利要求26所述的方法，其中通过测定所述细胞中Cbfal和/或Msx2mRNA来测量所述nell-1的表达水平。
32.根据权利要求31所述的方法，其中C通过所述mRNA与和Cbfal和/或Msx2核酸特异性杂交的探针杂交来测量所述Cbfal和/或Msx2mRNA的水平。
33.根据权利要求32所述的方法，所述杂交选自Northern吸印杂交，使用从Cbfal和/或Msx2RNA得到的DNA的Southern印迹杂交，点阵杂交，亲和色谱或原位杂交。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述探针是形成探针点阵的很多探针中的成员。
35.根据权利要求31所述的方法，其中CBfal通过核酸扩增反应来测定所述Cbfal和/或Msx2 mRNA的水平。
36.根据权利要求26所述的方法，其中通过测定所述生物样品中的Cbfal和/或Msx2蛋白质的的表达水平来测定所述Cbfal和/或Msx2的水平。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述检测选自毛细管电泳，Western印迹，质谱，ELISA，免疫色谱或免疫组织化学。
38.根据权利要求26所述的方法，其中所述细胞是体外培养的。
39.据权利要求26所述的方法，其中所述测试试剂不是抗体。
40.据权利要求26所述的方法，其中所述测试试剂不是蛋白质。
41.一种药剂配方，所述配方包括：一种或者多种选自编码Nell-1蛋白质的核酸，Nell-1蛋白质或改变Nell-1蛋白质活性或表达的试剂的活性剂；以及药学上可以接受的赋型剂。
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