KR20050084550A - Ｎｅｌｌ-1 향상 골 무기질화 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 인간 NELL-1이 골 무기질화를 유도하거나 상향조절한다는 발견에 관한 것이다. HELL-1 유전자 또는 유전자 생성물은 골 무기질화의 조절제를 스크리닝하기 위한 편리한 표적을 제공한다. 또한, HELL-1는 골절의 복구를 촉진하고/하거나 골밀도를 전반적으로 증가시키기 위해 사용될 수 있다.

Description

ＮＥＬＬ-1 향상 골 무기질화 {NELL-1 ENHANCED BONE MINERALIZATION}
본 발명은 NELL-1의 상향조절이 골 석회화를 향상시킨다는 발견에 관한 것이다. 따라서 NELL-1은 골 석회화의 조절제를 스크리닝하기 위한 양호한 표적으로서 이용된다. 또한, NELL-1 단백질은 골 형태형성 단백질과 유사한 방법으로 이용되어 골 회복을 촉진할 수 있다.
두개골 봉합부의 조기 폐쇄증인 두개골 조기유합증(CS)은 유아 3000명당 1명꼴로 발생하므로 가장 일반적인 인간 선천성 두개안면 기형이다(1). 두개골 이상형태증을 초래하는 조기 봉합부 폐쇄는 가족성이거나 산발성이다(1). 성별뿐 아니라 인종도 유아가 영향을 받은 지를 예측하는데 사용될 수 없다. CS-관련 증후군의 유전적 연관 분석을 실시하여 봉합부 형성의 분자 조절에 관한 다량의 새로운 정보를 얻었지만, 특히 비증후군성 및 비가족성 CS에서 국소적 봉합부 폐쇄의 생물학적 특성은 아직 대부분 알려지지 않고있다.
오늘날, 여러가지 가족성 CS 증상을 초래하는 85종 이상의 인간 돌연변이들이 FGF 수용체 유전자인 FGFR1, FGFR2 및 FGFR3로 집중되어 왔다. 이들 모두는 수용체 활성을 증가시키는 기능획득(gain-of-function) 돌연변이이다(1). 인간 CS 증후군이 상기 FGF 리간드와 관련되지 않았었지만, CS의 몇 가지 동물 모델이 FGF 과발현과 관련되어 왔다 (2, 3). CS와 관련되는 것으로 유일하게 공지된 MSX2(4)만이 MSX2 활성을 증가시킨다(5-7). 이러한 후보 유전자들은 골모세포 증식 및 분화에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있지만, 배아형성 동안에도 더욱 일반적인 역할을 한다. 따라서, 이러한 유전자들에서 돌연변이를 갖는 유전자이식 마우스 모델이 흔히, 대부분의 CS 환자에서 관찰되지 않는 외두개골 비정상을 나타낸다는 사실은 놀라운 것이 아니다(1, 2, 8).
인간 CS의 조기 봉합 폐쇄는 두개관의 과성장 및 골융합으로 구성되는 두 가지의 뚜렷한 과정으로 나눌 수 있다. 두개관의 과성장은 두 개의 대향한 골원성 전방부들을 서로 근접시켜서 골융합을 유도하는데 필수적이지만, 두개관의 과성장 또는 중복이 단독으로 골융합을 초래하는 것으로 반드시 이해되는 것은 아니다. 따라서, 조기 봉합 폐쇄 기작의 연구에는 봉합부의 비정상적 과성장/중복 및 골융합 모두의 연구가 포함되어야 한다(6).
최근에, FGF2 및 FGFR1이 CBFA1-매개 경로를 통해 조기 두개골 봉합부 융합에 관련되어 왔다(8). CBFA1의 미스센스 돌연변이는 봉합 폐쇄의 지연을 나타내는 쇄골두개 이골증과 관련이 있다(9). 따라서, 골형성에 필수적인 Fgfr1의 하류 표적인 Cbfa1 (Runx2)를 검사하는 것이 CS에서 신호전달 캐스케이드(signaling cascade)를 이해하기 위한 열쇠일 수 있다. 또한, 다면발현 효과를 갖는 고도로 보존된 Msx 호메오박스 유전자 패밀리의 일원인 Msx2가 CS의 동물모델에 관련되어 왔다(5, 6). 구체적으로, 봉합부 융합이 없이 봉합부의 과성장/중복을 나타내는 Msx2-과발현 유전자이식 마우스의 조기 봉합부 폐쇄 기작으로서 골원성 세포 증식의 증가가 제안되어 왔다.
발명의 개요
봉합부 폐쇄에 대한 분자 경로를 규명하기 위하여, 본 출원인은 이전에 차별적 디스플레이(differential display)을 이용하여, 비가족성 및 비증후군성 CS 환자의 비정상적으로 융합된 봉합부내에서 특이적으로 상향조절되는 유전자를 확인하였다. 본 출원인은 Nel-유사 제 1 형 분자(EGF-유사 도메인을 엔코딩하며, 신경 조직에서 강하게 발현되는 단백질)인 NELL-1을 분리 및 특성화했다. NELL-1은 분비 단백질이다. 구조적으로, NELL-1은 분비 신호 펩타이드 서열, NH2-말단 트롬보스포딘-1-유사 분자, 6 개의 시스테인 잔기를 갖는 5 개의 폰 빌레브란트 인자(von Willebrand factor)-유사 반복체, 및 6 개의 EGF-유사 영역을 엔코딩한다. 또한, Nell-1은 종 간에 고도로 보존된다. 예를 들어, 93% 아미노산 서열 상동성이 래트 Nell-1과 인간 NELL-1 사이에 존재한다.
Nell-1 은 90 kDa의 분자량을 갖는 폴리펩타이드를 엔코딩한다. COS 세포에서 과발현되는 경우, 글리코실화 형태는 진핵세포의 50 kDa 탄수화물 부분에 N-결합되어 세포질에서 발견되는 140 kDa 형태를 생성한다. 이러한 140 kDa 단백질은 130 kDa 단백질로 추가로 프로세싱된다. Nell-1 단백질은 고분자량 (약 400 kDa)을 갖는 삼량체 형태로 분비된다(13, 14).
초기의 연구 결과, NELL-1은 두개관 조직의 두개안면 영역에서 우선적으로 발현되는 것으로 제시되었다(12-14). CS 환자의 조기 봉합부 폐쇄증은 골원성 영역에서 골모세포-유사 세포에 의한 NELL-1 과발현도에 대해 현저하게 된다. Nell-1의 과발현 및 조기 봉합부 폐쇄가 우연적 발견일 수 있지만, 본 발명의 데이터는 Nell-1이 두개골 봉합부 폐쇄의 국소적 조절 인자일 수 있음을 제시한다. 본 발명의 연구에서, 본 발명자들은 Nell-1 이 CS에서 역할을 한다는 것도 확인하였다. 본 발명자들은 일반화된 Nell-1 과발현을 나타내는 유전자이식 마우스 모델을 만들었다. Nell-1 유전자이식 동물은 CS를 갖는 인간과 많은 동일한 특징을 공유한다. 이러한 마우스는 두개관의 과성장/중복 및 조기 봉합부 폐쇄를 나타낸다. 골모세포를 Nell-1 아데노바이러스 작제물로 감염시킨 결과, Nell-1은 골모세포 계통 세포에서 분화를 촉진하고 가속시키는 것으로 확인되었다. 또한, Nell-1를 하향조절한 결과, 골모세포의 분화가 억제되었다. 따라서, Nell-1은 두개골 봉합부 폐쇄를 생성하기 위한 후보 유전자를 대표하고, CS 및 두개안면 발달의 연구에서 새로운 통찰을 제공한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명은 두개관의 골모세포 분화 및 무기질화를 조절하기 위한 방법을 제공한다. 상기 방법은 Nell-1의 발현 또는 활성을 변화시키는 것을 포함하는데, 이때 Nell-1 발현 또는 활성을 증가시키면 골모세포 분화 또는 무기질화가 증가하고 Nell-1 발현 또는 활성을 감소시키면 골모세포 분화 또는 무기질화가 감소한다. Nell-1 의 발현 또는 활성은 어떤 편리한 방법(예, 항-Nell-1 안티센스 분자, Nell-1 특이적 리보자임, Nell-1 특이적 촉매 DNA, Nell-1 특이적 RNAi, 항-Nell-1 인트라보디(intrabody), 및 특정의 표적 세포 및/또는 조직에서 Nell-1을 녹아웃시키는 유전자 요법)에 의해 억제될 수 있다. 마찬가지로, Nell-1의 발현 또는 활성은 어떤 편리한 방법(예, Nell-1을 발현하는 외인성 핵산으로 세포를 트랜스펙션시키거나 Nell-1 단백질로 세포를 트랜스펙션시키는 것 등)에 의해 증가될 수 있다. 포유동물은 비정상적인 두개골 봉합부의 발생(예, 두개골 조기유합증(CS))을 겪고있는 포유동물(인간 또는 인간이 아닌 포유동물)일 수 있다.
또한, 본 발명은 포유동물의 잠복성 TGF-β1 활성화를 촉진하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 외인성 Nell-1을 포유동물에게 투여하거나 상기 포유동물에서 외인성 Nell-1의 발현 활성을 증가시키는 것을 포함할 수 있다.
또한, 포유동물에서 TGF-β1 수퍼패밀리의 일원을 활성화하거나 격리시키는 방법을 제공한다. 상기 방법은 포유동물에게 외인성 Nell-1을 투여하거나 포유동물에서 외인성 Nell-1의 발현 활성을 증가시키는 것을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 골모세포 분화를 조절하는 작용제를 스크리닝하기 위한 방법을 제공한다. 상기 방법은 NELL-1 유전자를 함유하는 시험 세포를 시험 작용제와 접촉시키고; 대조 세포에서의 NELL-1 유전자의 발현 또는 Nell-1의 활성과 비교하여 시험 세포에서의 NELL-1 유전자의 발현 수준 또는 Nell-1의 활성의 변화를 검출하는 것을 포함하며, 이때, 상기 시험 세포 및 대조 세포에서의 NELL-1의 발현 수준 또는 Nell-1의 활성이 차이가 상기 작용제가 골 무기질화를 조절한다는 것을 나타낸다. 특정의 실시양태에서, 상기 대조군은 시험 세포보다 낮은 농도(예, 1/2 농도이거나 시험 작용제가 없는 것 등)로 시험 작용제와 접촉하는 음성 대조 세포이다. 특정의 실시양태에서, 상기 대조군은 시험 세포보다 높은 농도로 시험 작용제와 접촉하는 양성 대조 세포이다. 여러가지 실시양태에서, nell-1의 발현 수준은 상기 세포에서 NELL-1 mRNA의 수준을 측정함으로써 검출되고/되거나 NELL-1의 수준은 예를 들어 본 명세서에서 설명하는 바와 같이 생물학적 세포에서 NELL-1 단백질의 발현 수준을 측정함으로써 검출된다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 포유동물 세포에서 Nell-1의 발현을 변화시키는 방법을 제공한다. 상기 방법은 Msx2 및/또는 Cbfa1의 발현 또는 활성을 변화시키는 것을 포함한다. 특정의 실시양태에서, Cbfa1의 발현 또는 활성이 상향조절되어 Nell-1의 발현 또는 활성이 상향조절된다. 특정의 실시양태에서, Msx2의 발현 또는 활성이 상향조절되어 Nell-1의 발현 또는 활성이 하향조절된다.
유사하게는, Nell-1의 발현 또는 활성을 조절하는 작용제를 스크리닝하기 위한 방법을 제공하는데, 상기 방법은 Cbfa1 및/또는 Msx2 유전자를 함유하는 시험 세포를 시험 작용제와 접촉시키고; 대조 세포에서의 Cbfa1 및/또는 Msx2의 발현 또는 활성과 비교하여 상기 시험 세포에서의 Cbfa1 및/또는 Msx2의 발현 수준 또는 활성의 변화를 검출하는 것을 포함하며, 이때, 상기 시험 세포와 대조 세포에서의 Cbfa1 및/또는 Msx2의 발현 수준 또는 활성의 차이는 상기 작용제가 Nell-1의 발현 또는 활성을 조절한다는 것을 나타낸다.
또한, 본 발명은 Nell-1 단백질을 엔코딩하는 핵산, Nell-1 단백질, 및 Nell-1 단백질의 발현 또는 활성을 변화시키는 작용제로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상의 활성제와, 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학적 제형을 제공한다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 인간 NELL-1 유전자에 의해 엔코딩되는 폴리펩타이드가 골 무기질화를 유도하고 따라서 골원성이라는 발견에 관한 것이다. 상기 NELL-1 유전자 및 유전자 생성물(들)(예, mRNA, cDNA, 단백질, 등)은 NELL-1의 발현 및/또는 활성의 조절제, 따라서 골 무기질화의 조절제를 스크리닝하기 위한 우수한 표적으로 이용된다. 또한, NELL-1은 골절 회복을 촉진하기 위해 골 형태형성 단백질 (BMP)을 사용하는 것과 유사한 방법으로 사용되고, 골이식 물질의 성분으로서 사용될 수 있다.
나타낸 바와 같이, 하나의 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 골 무기질화를 변화시키는 작용제를 스크리닝하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 NELL-1 유전자를 함유하는 세포를 시험 작용제와 접촉시키고; 상기 시험 작용제와 접촉하지 않는 세포에서의 NELL-1 유전자의 발현과 비교하여 NELL-1 유전자의 발현 수준의 변화를 검출하는 것을 포함하며, 이때, 접촉한 세포 및 접촉하지 않는 세포에서의 NELL-1의 발현 수준(예, 게놈 DNA 복사체 수, mRNA 수준, 단백질 수준, 단백질 활성 등으로 나타냄)이 차이가 상기 작용제가 골 무기질화를 조절한다는 것을 나타낸다. 또한, 상기 방법은 NELL-1 활성 조절제의 데이터베이스 또는 골 무기질화 조절제의 데이터베이스에서 NELL-1 핵산 또는 NELL-1 단백질의 발현을 변화시키는 시험 작용제를 추가로 포함할 수도 있다. 특정의 실시양태에서, NELL-1의 발현 수준은 세포에서 NELL-1 mRNA의 수준을 측정함으로써(예, NELL-1 핵산에 특이적으로 하이브리드화되는 프로브에 상기 mRNA를 하이브리드화함으로써) 검출된다. 바람직한 하이브리드화 방법으로는 노던 블롯, NELL-1 RNA로부터 유래된 DNA를 이용하는 서던 블롯, 어레이 하이브리드화, 친화성 크로마토그래피 및 인 시튜 (in situ) 하이브리드화 등이 있으나 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 방법은 어레이(array)를 이용한 방법에 적용될 수 있다. 따라서, 일부의 실시양태에서는, 상기 프로브는 프로브들의 어레이를 형성하는 다수 프로브의 일원이다. 또한, NELL-1 발현 수준은 핵산 증폭 반응(예, PCR)을 이용하여 측정할 수 있다.
본 발명의 스크리닝 시스템의 다른 실시양태에서, NELL-1의 발현은 생물학적 시료중에서 NELL-1 단백질의 발현 수준을 (예를 들어 모세관 전기영동, 웨스턴 블럿, 질량 분광분석, ELISA, 면역크로마토그래피, 면역조직화학분석 등에 의하여) 측정함으로써 검출된다. 상기 세포는 생체외, 생체내 및/또는 인 시튜에서 배양될 수 있다. 특정의 실시양태에서, 상기 시험 작용제는 항체 및/또는 단백질 및/또는 핵산이 아니다. 바람직한 시험 작용제는 작은 유기 분자이다.
또한, 본 발명은 NELL-1 발현 및/또는 활성의 가능한 조절제를 미리 스크리닝하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 NELL-1 핵산 또는 NELL-1 단백질을 시험 물질과 접촉시키고; 상기 NELL-1 단백질 또는 핵산에 대한 상기 시험 물질의 특이적 결합을 검출하는 것을 포함한다. 또한, 상기 방법은 NELL-1 활성의 후보 조절제의 데이터베이스 및/또는 골 무기질화의 후보 조절제의 데이터베이스에서 상기 NELL-1 핵산 또는 NELL-1 단백질에 특이적으로 결합하는 시험 작용제를 기록하는 것을 추가로 포함할 수도 있다. 상기 시험 작용제는 NELL-1 핵산 및/또는 단백질과 직접 접촉하거나, 상기 핵산 및/또는 단백질을 함유하는 세포 및/또는 조직 및/또는 유기체(예, 포유동물)와 접촉할 수 있다. 세포가 접촉하는 경우, 상기 세포는 일차 또는 계대(passaged) 배양물에 존재할 수 있다. 특정의 실시양태에서, 상기 시험 작용제는 항체 및/또는 단백질 및/또는 핵산이 아니다. 바람직한 시험 물질은 작은 유기 분자이다. 상기 분석이 핵산에 결합하는 시험 물질의 능력을 측정하는 것인 경우, 바람직한 분석은 노던 블롯, DNA를 이용한 서던 블롯, 어레이 하이브리드화, 친화성 크로마토그래피, 또는 인 시튜 하이브리드화를 이용한다. 상기 분석이 NELL-1 단백질에 결합하는 시험 작용제의 능력을 측정하는 것인 경우, 바람직한 분석법은 모세관 전기영동, 웨스턴 블롯, 질량 분광분석, ELISA, 면역크로마토그래피, 또는 면역조직화학을 이용한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 골 무기질화를 증가시키는 방법을 제공한다. 바람직한 방법은 골원성 세포(예, 골모 세포, 간엽 세포, 섬유아세포, 태아 배아세포, 줄기 세포, 골수 세포, 경막 세포, 연골 세포, 연골모세포 등) 또는 상기 세포가 발견되는 환경에서 NELL-1 유전자 생성물의 농도를 증가시키는 것을 포함한다. 하나의 바람직한 실시양태에서, NELL-1 유전자 생성물의 농도는 NELL-1 유전자의 발현을 상향조절함으로써 증가된다. 이것은 내인성 NELL-1 유전자의 발현을 상향 조절하는 것(예, 프로모터와 같은 외인성 조절 영역을 변화시킴으로써) 또는 NELL-1 단백질을 발현하는 벡터로 세포를 트랜스펙션시키는 것 등을 포함하지만 이들에 제한되지 않는 여러가지 방법들중 어느 하나의 방법에 의해 달성될 수 있다. 특정의 바람직한 벡터는 NELL-1 단백질을 구성적으로 발현하지만, 다른 바람직한 벡터는 유도가능한 것이다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 상기 NELL-1 유전자 생성물 농도는 NELL-1 폴리펩타이드를 갖는 골(bone)에 의하여 증가된다.
또한, 본 발명은 골절의 회복을 촉진하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 골절 부위 또는 그 근처에서 NELL-1 유전자 생성물의 농도를 증가시키는 것을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 상기 NELL-1 유전자 생성물은 골절 부위 또는 그 근처에 존재하는 골원 세포 또는 골 전구 세포에서 증가한다. 상기 방법은 NELL-1 을 과발현하는 골원 세포 또는 골 전구 세포를 골절 부위내로 도입하는 것을 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 상기 골원 세포 또는 골 전구 세포에서 NELL-1 유전자 생성물의 농도를 인 시튜에서 증가시키는 것을 포함할 수 있다. 상기 NELL-1 유전자 생성물의 상향 조절은 본 명세서에서 설명한 바와 같이 달성될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 상기 세포 및/또는 골절 부위는 NELL-1 폴리펩타이드와 접촉한다.
골절 회복을 위한 또 다른 방법에서, 골절 부위는 NELL-1 단백질과 접촉한다. 상기 단백질은 세포(예, NELL-1 단백질을 과발현하는 세포의 도입에 의해 도입됨)에 의하여 및/또는 상기 단백질을 단독으로 또는 약리학적 부형제와 병용하여 투여함으로써, 및/또는 NELL-1을 발현할 수 있는 "네이키드(naked) DNA" 벡터를 투여함으로써 생성될 수 있다. 상기 NELL-1 단백질은 골 회복/골 이식 물질의 성분 및/또는 보철기구의 일부일 수 있다. 한 가지 바람직한 이식 물질은 NELL-1 단백질 및/또는 NELL-1 단백질을 발현하는 세포외에도 콜라겐 및/또는 골 파편을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 이식되는 동물에서 골조직의 형성을 향상시킬 수 있는 골 이식 물질을 제공한다. 바람직한 골 이식 물질은 셍체적합성 매트릭스 및 NELL-1 단백질을 필수 성분으로 포함한다. 바람직한 이식 물질은 재흡수성/생분해성이다. 상기 매트릭스는 NELL-1 단백질 및/또는 NELL-1 단백질을 발현하는 세포로 함침될 수 있다. 바람직한 골 이식 물질은, 실질적으로 균일하게 분산된 재구성된 콜라겐(예를 들어 약 65 내지 약 95 중량%)과, NELL-1 단백질 및/또는 NELL-1 단백질을 발현하는 세포(예를 들어 약 35 내지 5 중량%)를 함유하는 콜라겐 컨쥬게이트를 포함한다.
용어 정의
본 발명에서 사용되는 용어 "폴리펩타이드", "펩타이드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 중합체를 나타내도록 상호교환적으로 사용된다. 이러한 용어들은 하나 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 자연 발생 아미노산의 인공 화학적 유사체인 아미노산 중합체에 적용되는 외에도, 자연 발생 아미노산 중합체에 적용된다.
용어 "NELL-1 cDNA" 및 "NELL-1" 게놈 DNA는 다음문헌[Watanabe 등 (1996) Genomics 38(3):273-276; Ting 등 (1999) J Bone Mineral Res, 14:80-89; 및 GenBank Accession Number U57523]에서 기재한 바와 같이 cDNA 및 게놈 DNA를 나타낸다.
NELL-1 단백질은 NELL-1 유전자 또는 cDNA에 의해 발현되는 단백질이다. 상기 NELL-1 단백질은 골 무기질화를 유도하는 능력을 유지하는 NELL-1 단백질 단편을 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "항체"는 온전한 면역글로불린, 경쇄 및 중쇄 가변 영역만을 함유하는 Fv 단편, 디설파이드 결합에 의해 결합된 Fv 단편(Brinkmann 등, (1993) Proc Natl. Acad. Sci. USA, 90:547-551), 가변 영역 및 불변 영역의 일부를 함유하는 Fab 또는 (Fab)'2 단편, 단일 사슬 항체 등과 같은 여러가지 형태의 변형 또는 변경된 항체를 포함한다((Bird 등, (1988) Science 242:424-426; Huston 등, (1988) Proc. Nat, Acad. Sci. USA 85:5879-5883). 상기 항체는 동물(특히 마우스 또는 래트) 기원 또는 인간 기원일 수 있거나 키메라(Morrison 등, (1984) Proc Nat. Acad. Sci. USA 81:6851-6855) 또는 인간화(Jones 등, (1986) Nature 321:522-525, 및 공개된 영국 특허 출원 #8707252호)될 수 있다.
용어 "결합 파트너", 또는 "포획제", 또는 "결합쌍"의 일원은 항체-항원, 렉틴-탄수화물, 핵산-핵산, 비오틴-아비딘 등과 같은 결합 착물을 형성하도록 다른 분자와 특이적으로 결합하는 분자를 나타낸다.
본 발명에서 생체분자(예, 단백질, 핵산, 항체 등)를 나타낼 때 사용되는 용어 "특이적으로 결합하는"은 분자(예, 단백질 및 기타 생물학적 물질)들의 이종 개체군에서 생체 분자의 존재를 결정하는 결합 반응을 나타낸다. 따라서, 지정된 조건(예, 항체의 경우의 면역분석 조건 또는 핵산의 경우의 엄중한 하이브리드화 조건)하에서, 지정된 리간드 또는 항체는 이의 특정의 "표적" 분자에 결합하지만 시료에 존재하는 다른 분자와는 유의적인 양으로 결합하지 않는다.
용어 "골다공증"은 골 질량의 감소 및 골절에 특징이 있는 질환의 불균일한 군의 질환을 나타낸다. 임상학적으로, 골다공증은 제 1 형 및 제 2 형으로 분리된다. 제 1 형 골다공증은 중년 여성에게서 주로 발생하고 폐경기의 에스트로겐 손실과 관련이 있지만, 제 2 형 골다공증은 연령 증가와 관련이 있다.
불완전 골형성증(OI)은 골 및 연질 결합 조직의 취약성에 특징이 있는 유전성 결체 조직 질환들의 군을 말한다(Byers & Steiner (1992) Annu. Rev. Med. 43: 269-289; Prockop (1990) J. Biol. Chem. 265: 15349-15352). 남성 및 여성이 균등하게 걸리며, 오늘날 전체 발병율은 5,000-14,000명의 생존 신생아 당 1명인 것으로 추정되고 있다. 모발 손실, 상아질 형성 부전증, 호흡 부전, 중증 척추축만증 및 폐기종이 바로 하나 이상의 형태의 OI와 관련이 있는 증상의 일부이다. 건강 관리 비용의 정확한 견적을 이용할 수는 없지만, OI과 관련이 있는 이병율 및 치사율은 골절로의 극한 경향(제 1 내지 제 4 형 OI) 및 골절 회복후 비정상적 골 변형(제2 내지 제 4형 OI)에서 비롯된다는 것이 확실하다.
용어 "핵산" 또는 "올리고뉴클레오티드" 또는 문법상의 등가물은 최소한 두 개의 뉴클레오티드가 서로 공유결합된 것을 말한다. 본 발명의 핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥인 것이 바람직하고 포스포디에스테르 결합을 일반적으로 함유하지만, 후술하는 바와 같이 일부의 경우에 있어서는, 예를 들어 포스포르아미드(Beaucage 등 (1993) Tetrahedron 49(10):1925 및 여기에 기재된 참조문헌; Letsinger (1970) J. Org. Chem. 35:3800; Sprinzl 등 (1977) Eur. J. Biochem. 81:579; Letsinger 등 (1986) Nucl. Acids Res. 14:3487; Sawai 등(1984) Chem. Lett. 805, Letsinger 등 (1988) J. Am. Chem. Soc. 110:4470; 및 Pauwels 등 (1986) Chemica Scripta 26:1419), 포스포로티오에이트(Mag 등 (1991) Nucleic Acid Res. 19:1437; 및 미합중국 특허 제 5,664,048호), 포스포로디티오에이트(Briu 등 (1989) J. Am. Chem. Soc. 111:2321), O-메틸포포로아미다이트(Eckstein, Oligonucleotides and Analogues; A Practical Approach, Oxford University Press), 및 펩타이드 핵산 골격 및 결합(Egholm (1992) J. Am. Chem. Soc. 114:1895; Meier 등 (1992) Chem. Int. Ed. Engl. 31:1009; Nielsen (1993) Nature, 365:566; Carlsson 등 (1996) Nature 380:207)를 포함하는 번갈은 골격을 가질 수 있는 핵산 유사체가 함유된다. 다른 유사 핵산으로는 양성 골격(Denpcy 등 (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA92; 6097), 비이온성 골격(미합중국 특허 제 5,386,023호, 5,637,684호, 5,602,240호, 5,216,141호 및 4,469,863호; Angew (1991) Chem. Intl. Ed. English 30:423; Letsinger 등 (1988) J. Am. Chem. Soc. 110:4470; Letsinger 등(1994) Nucleoside & Nucleotide 13:1597; Chapters 2 and 3, ASC Symposium Series 580, "Carbohydrate Modifications in Antisense Research", Ed. Y.S.Sanghui and P.Dan Cook; Mesmaejer 등 (1994), Bioorganic & Medicinal Chem. Lett. 4: 395; Jeffs 등 (1994) J. Biomolecular NMR 34:17; Tetrahedron Lett. 37:743(1996)), 및 다음문헌[미합중국 특허 제 5,235,033 호 및 5,034,506호, 및 Chapters 6 and 7, ASC Symposium Series 580, Carbohydrate Modifications in Antisense Research, Ed. Y.S.Sanghui and P.Dan Cook)에 기재된 것들을 포함한 비-리보스 골격을 갖는 것들이 있다. 또한, 하나 이상의 탄소고리 당을 함유하는 핵산이 핵산의 정의에 포함된다(Jenkins 등 (1995), Chem. Soc. Rev. pp169-176). 몇 개의 핵산 유사체가 다음문헌[Rawls, C & E News June 2, 1997, page 35]에 기재되어 있다. 이러한 리보스-포스페이트 골격의 변형이 라벨(label)와 같은 추가의 부분들의 첨가를 촉진하거나 생리학적 환경에서 상기 분자들의 안정성 및 반감기를 증가시키도록 수행될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "특이적으로 하이브리드화되는" 및 "특이적 하이브리드화"는 핵산 분자가 엄중한 조건하에서 특정의 뉴클레오티드 서열에 우선적으로 결합, 듀플렉싱 또는 하이브리드화되는 것을 말한다. 용어 "엄중한 조건"은 프로브가 이의 표적 서열에 우선적으로 하이브리드화되지만 다른 서열에 보다 적은 정도로 또는 전혀 혼성화되지 않는다. 핵산 하이브리드화의 문맥에서 엄격한 하이브리드화 및 엄격한 하이브리드화 세척 조건은 서열 의존적이고, 상이한 환경 조건하에서 서로 다르다. 핵산의 하이브리드화에 대한 광대한 가이드가 예를들어 다음문헌에서 확인된다: Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes part I, chapter 2, Overview of principle of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays, Elsevier, NY (Tijssen). 일반적으로, 아주 엄중한 하이브리드화 및 세척 조건은 한정된 이온 강도 및 pH에서 특정 서열의 경우 열융점(Tm)보다 5 ℃ 낮도록 선택된다. 상기 Tm은 표적 서열의 50%가 완전히 매치되는 프로브에 하이브리드화되는 온도(정의된 이온 강도 및 pH하에서)이다. 매우 엄중한 조건은 특정 프로브에 대한 Tm과 같도록 선택된다. 서던 또는 노던 블롯시 필터 또는 어레이에서 100개 이상의 상보적 잔기들을 갖는 상보적 핵산의 하이브리드화를 위한 엄중한 하이브리드화 조건의 일례는 표준 하이브리드화 용액을 이용하여 42 ℃ 인데(Sambrook (1989) Molecular Cloning; A Laboratory Manual (2nd ed.) Vol.1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, NY, 및 하기의 상세한 설명), 상기 하이브리드화는 밤새 수행된다. 아주 엄중한 세척 조건의 일례는 72 ℃에서 약 15분 동안 0.15M NaCl 이다. 엄중한 세척 조건의 일례는 65 ℃에서 약 15 분간 0.2xSSC 세척이다 (상기 참조: Sambrook). 흔히, 고엄중성 세척은 저엄중성 세척에 앞서 실시되어 배경 프로브 신호를 제거한다. 100 개 이상의 뉴클레오티드의 듀플렉스에 대한 중간 엄격성 세척의 일례는 45 ℃에서 15 분간 1xSSC 이다. 예를 들어 100 개 이상의 뉴클레오티드의 듀플렉스에 대한 저엄격성 세척의 일례는 40 ℃에서 15 분간 4x 내지 6x SSC 이다.
"골원 세포"는 무기질화할 수 있는 세포이다. 골원 세포로는 골모세포, 골모세포 유사 세포, 간엽세포, 섬유아세포, 태아 배아 세포, 줄기 세포, 골수 세포, 경막 세포, 연골세포 및 연골모세포가 있다.
용어 "시험 작용제"는 본 명세서에서 기재된 하나 이상의 분석에서 스크리닝될 물질을 말한다. 상기 작용제는 실질적으로 어떠한 화합물일 수 있다. 이것은 단일의 분리 화합물로서 존재할 수 있거나 또는 화학적(예, 결합) 라이브러리의 일원일 수 있다. 특히 바람직한 실시양태에서, 상기 시험 작용제는 작은 유기 분자일 수 있다.
용어 "작은 유기 분자"는 약학에서 일반적으로 사용되는 유기 분자와 동등한 크기를 갖는 분자를 말한다. 이러한 용어는 생물학적 거대분자(예, 단백질, 핵산 등)는 제외한다. 바람직한 작은 유기 분자는 약 5000 Da 이하, 더욱 바람직하게는 2000 Da 이하, 가장 바람직하게는 약 1000 Da 이하의 크기를 갖는다.
용어 데이터베이스는 정보를 기록 및 검색하기 위한 수단을 말한다. 바람직한 실시양태에서, 상기 데이터베이스는 저장된 정보를 분류 및/또는 검색하기 위한 수단을 제공한다. 상기 데이터베이스는 페이퍼 시스템, 카드 시스템, 기계적 시스템, 전자 시스템, 광학 시스템, 마그네틱 시스템, 또는 이들의 조합을 비롯한 어떠한 편리한 매체를 포함할 수 있다. 바람직한 데이터베이스로는 전자(예, 컴퓨터 지원) 데이터베이스가 있다. 데이터베이스의 저장 및 처리에 사용하기 위한 컴퓨터 시스템은 당업계에 잘 알려져 있고 이의 예로는 퍼스널 컴퓨터 시스템, 메인프레임 시스템, 인터넷 또는 인트라넷상의 분포된 노드, 특수한 하드웨어(예, 마이크로칩)에 저장된 데이터 또는 데이터베이스 등이 있다.
도 1A는 대조군으로 β-갈락토시다제와 함께 아데노바이러스를 이용한 E-14 래트 두개골 일차 세포 배양에서 NELL-1의 과발현을 예시한다. 도 1B는 NELL-1 및 β-갈락토시다제로 각각 처리한 후의 시간에 따른 무기질화를 도시한다. 실험은 삼중으로 실시하였다. 스튜던트 T 테스트가 수행되었다. NELL-1에 의한 무기질화는 β-갈락토시다제 대조군에 의한 무기질화보다 통계학적으로 더욱 높았다. *P<0.001.
도 2는 비유전자이식 한배새끼들과 비교한 Nell-1 유전자이식 마우스를 도시한다. 도 2A는 이식유전자 복사체 수를 도시한다. 파운더(founder)(FA 및 FB) 및 이들의 프로제니(progeny)(TF2A1, TF2A2, 및 TF2B1)은 50 내지 100의 복사체 수를 갖는다. TF2A1,및 TF2A2는 파운더 A 계통으로부터 얻은 것이다. TF2B1, TF2B2 및 TF2B3는 파운더 B 계통으로부터 얻은 것이다. 도 2B는 두 파운더에서 Nell-1 RNA 발현의 RT-PCR 분석을 도시한다. C: 대조군 Nell-1 플라스미드, M: 근육, H: 심장, B: 골, K: 신장, L: 간. 도 2C는 신생 프로제니의 전신(머리 제외) RNA를 도시한다. TF2A1 및 TF2A2는 상이한 수준의 Nell-1을 발현한다. TF2B1은 Nell-1을 약하게 발현하지만, TF2B2 및 TF2B3는 Nell-1을 발현하지 않는다. 도 2D의 좌측 패널은 신생 NF2 상피, 근육 및 두개골의 Nell-1 단백질의 면역국소화를 도시한다. 두개골 뼈에서 약간의 염색을 제외하고 검출가능한 Nell-1의 발현(갈색 염색은 Nell-1의 존재를 나타냄)이 없다. 우측 패널은 TF2A2 상피, 근육, 및 두개골 뼈에서 Nell-1 단백질의 면역국소화를 도시한다. 많은 Nell-1 발현이 모든 연조직층에 걸쳐서 존재하는 외에도 뼈에 존재한다. 막대는 50 ㎛를 도시한다.
도 3은 Nell-1 유전자이식 마우스의 표현형 평가를 도시한다. a 및 b의 죄측 패널은 신생 Nell-1 표현형-양성(TF2A1) 마우스를 도시한다. 전방두정부 영역의 돌출부(화살표)를 주목하라. 우측 패널은 NF2 한배새끼를 도시한다. (c)의 좌측 패널은 머리가죽이 제거된 TF2A2 마우스를 도시한다. 시상(황색 화살표) 및 PF(흑색 화살표) 봉합부가 폐쇄되어 있다. 우측 패널은 개방된 시상(황색 화살표) 및 PF(흑색 화살표) 봉합부 및 상기 개방된 봉합부 아래의 정상 혈관계를 갖는 NF2 한배새끼의 두개골을 도시한다. (d)는 CS의 중증 형태인 두개피질 이형성증을 갖는 유아를 도시한다. (e)는 TF2A1 마우스(좌측) 및 NF2 한배새끼(우측)의 뇌 MRI를 도시한다. 공동이 완전히 없기 때문에 NF2 한배새끼(화살표, 우측)에 대한 TF2A1(화살표, 좌측)에서 두개내 압력의 증가를 알 수 있다. (f)는 신생 Nell-1 표현형 양성 TF2A1 (좌측) 및 NF2(우측) 한배새끼의 MCT-재구성 삼차원 두개골을 도시한다. 화살표는 시상 및 PF 봉합 부위를 나타낸다. TF2A1 마우스에서, 시상 및 PF 봉합부는 대부분 폐쇄되어 있고 비정상적인 융기부(ridge)로 대체되어 있다. NF2 한배새끼에서, 시상 및 PF 봉합부 모두는 개방되어 있다. 완전한 불투명성은 50 mg/cc 보다 큰 무기질화에 해당한다. 바탕의 수직 막대는 50, 100, 150, 및 200 mg/cc의 무기질 밀도(좌측에서 우측)에 해당하는 외견상 기준 막대를 도시한다. (g)는 f에서 도시한 TF2A1(좌측) 및 NF2 한배새끼(우측)의 일련의 축방향 MCT 섹션을 나타낸다. 황색 화살표는 두개의 변형을 나타낸다. 녹색 화살표는 TF2A 마우스(우측 화살표)에서 두개관의 무기질화의 증가를 나타낸다.
도 4는 Nell-1 유전자이식 마우스의 조직학적 및 면역조직학적 평가를 도시한다. 패널 a는 Nell-1 표현형 양성 TF2A1 마우스의 시상 봉합부의 헤마톡실린 및 에오신 염색을 도시한다. 두개관 에지(흑색 화살표) 및 폐쇄 골원 전방부(적색 화살표)의 중복으로 도시한 바와 같이 봉합부의 폐쇄가 있다. 좌측 아래의 패널은 폰 코사(von Kossa) 염색을 나타낸다. 무기질화된 두개관 에지들의 인접부를 주목하라. 패널 b는 NF2 한배새끼의 시상 봉합부의 헤마톡실린 및 에오신 염색을 도시한다. 개방된 봉합부위에서의 두 개의 두개관 에지(흑색 화살표)를 분리하는 큰 간격, 및 전진하는 골원 전방부(적색 화살표)를 주목하라. 좌측 아래의 패널은 폰 코사 염색을 도시한다. 흑색은 무기질화를 나타낸다. 패널 c는 TF2A1 마우스에서 알칼리성 포스파타아제(ALP)의 면역국소화를 도시한다. 갈색 염색은 알칼리성 인산분해효소의 존재를 나타낸다(화살표). 패널 d의 상부 패널은 신생 NF2 두개 봉합에서의 알칼리성 포스파타아제의 면역국소화를 도시한다. 하부의 패널은 더욱 낮은 배율에서 오스테오폰틴(OP)의 면역국소화를 나타낸다. 막대는 50 ㎛를 나타낸다. 패널 e는 TF2 시상 봉합부의 BrdU 염색을 도시한다. 증식 세포의 핵이 갈색으로 염색되어 있다(흑색 화살표). 증식 세포는 d에서 NF2에 대하여 도시한 것들과 비교하여 상당히 감소한다. 패널 f는 신생 NF2 마우스 시상 봉합부의 BrdU 염색을 도시한다. 다수의 갈색 염색 세포들이 개방된 봉합부의 두개관 에지(흑색 화살표) 및 전진하는 골원 전방부(적색 화살표)를 따라 증식하고 있다. H & E: 헤마톡실린 및 에오신. 패널 g는 필드(field)당 증식 세포의 수를 나타낸다.
도 5는 비유전자이식 한배새끼와 비교한 Nell-1 유전자이식 TF2B1 마우스를 도시한다. (a)의 좌측은 머리가죽이 제거된 신생 TF2B1 마우스를 도시한다. 후두부의 비정상적인 불룩화 및 두개골의 비교적 좁은 폭을 주목하라. 우측은 NF2 한배새끼를 도시한다. 상기 TF2B1 유전자이식 동물에 있어서, 시상 봉합부 및 몇 개의 다른 봉합부가 폐쇄되어 있다. (b)는 TF2B1 두개골 봉합부의 헤마톡실린 및 에오신 염색을 도시한다. 상기 봉합부의 조기 폐쇄가 두개관 에지의 중증 중복부에서 보여진다(적색 화살표). 그 하부의 뇌 조직은 RNA 분석을 위해 분리되었다. (c)는 TF2B1 마우스(좌측) 및 이의 NF2 한배새끼(우측)의 삼차원적 MCT 재구성을 도시한다. TF2B1 마우스(좌측 화살표)에서의 조기 중간라인 봉합부 폐쇄 영역을 주목하라.
도 6은 무기질화 및 골 마커 발현에 관한 Nell-1 과발현의 효과를 예시한다. 도 6A는 폰 코사 염색된 20 pfu/cell AdNell-1으로 감염된 FRCC 배양물을 도시한다. 대조 세포 배양물을 Ad β-Gal로 감염시켰다. 실험은 삼중으로 실시하였다. 무기질화된 결절은 흑색으로 염색되었다. 도 6B는 무기질화 영역의 정량화 및 통계학적 분석을 도시한다. AdNell-1-감염 배지는 Ad β-Gal 대조군보다 유의적으로 더 많은 무기질화를 입증했다. 도 6C는 아스코르브산이 없이 성장한 AdNell-1 감염 MC3T3 세포를 도시한다. 대표적인 미세결절의 외관이 도시된다. 우측 패널은 미세결절의 알칼리성 포스파타아제 염색을 나타낸다. 도 6D 내지 도 6F (도면에서는 모두 6D로 표시됨)는 감염후 6, 9 및 12 일째 AdNell-1-감염 MC3T3 세포의 마이크로어레이를 도시한다. 유전자 발현 세기는 표준 하우스키핑 유전자(HKGs)를 이용하여 표준화되었다. AdNell-1-감염 세포의 하이브리드화 세기는 y 축상에 표시되어 있다. Ad β-Gal-감염 세포의 하이브리드화 세기는 x 축상에 표시되어 있다. HKGs r2는 두 시료들 사이의 하우스키핑 유전자(채워진 사각형)의 상관관계를 나타낸다. ECMs r2는 두 시료들 사이의 후보 유전자 발현(개방된 사각형)의 상관관계를 도시한다. 마이크로어레이 판독 사진이 각 다이어그램의 상부 좌측 코너에 첨부되어 있다. 2배 이상의 상향 조절은 표에서 적색으로 표시되지만, 2배 이상의 하향 조절은 녹색(g)으로 표시된다. 표는 AdNell-1-감염후 20 배 이상 또는 이하인 발현율 차이를 갖는 유전자를 요약하고 있다. 상기 비율은 Nell-1/β-Gal.Col (콜라겐)으로 계산된다.
도 7은 알칼리성 포스파타아제 발현 및 골 마커 발현에 관한 Nell-1 하향 조절의 효과를 예시한다. 도 7A는 20 pfu/cell AdAntiNell-1 또는 Adβ-Gal 대조군으로 감염시킨 래트 FRCC에서의 Nell-1 단백질 발현의 웨스턴 블롯 분석을 도시한다. 약 60%의 하향조절이 관찰된다. 도 7B는 FRCC의 알칼리성 인산분해효소 염색(적색)을 도시한다. AdAntiNell-1 감염 세포는 대조군 및 AdNell-1-감염 세포보다 유의적으로 덜 염색되어 있다. 도 7C는 감염후 3, 6, 9 및 12일후FRCC의 노던 블롯 분석을 도시한다. AdAntiNell-1 감염 세포는 오스테오칼신 및 오스테오폰틴 발현이 유의적으로 낮다. 도 7D는 PhosphorImager로 측정하고 GAPDH로 표준화한 오스테오칼신(OC) 및 오스테오폰틴(OP)의 발현을 도시한다.
도 8은 조기 봉합부 폐쇄에서 Nell-1 기능의 가설 모델을 예시한다. 점선은 가능한 조절을 나타낸다.
본 발명은 NELL-1 유전자 생성물이 조직(예, 골) 무기질화를 향상시킨다는 발견에 관한 것이다. 특정의 이론에 구속되지 않고, NELL-1 단백질은 TGFβ 수퍼패밀리의 일원과 상호작용함으로써 그 기능을 수행하는 것으로 판단된다.
본 명세서에서 기재한 바와 같이 NELL-1이 조직 무기질화를 매개한다는 것을 인식함으로써, NELL-1 핵산 및/또는 NELL-1 단백질은 골 무기질화의 조절제를 스크리닝하기 위한 적절한 표적으로서 이용된다. 따라서, NELL-1 발현 및/또는 단백질 활성 및/또는 단백질-단백질 상호작용을 억제하는 작용제는 골 무기질화를 감소시키게 된다. 반대로, NELL-1 발현 및/또는 단백질 활성 및/또는 단백질-단백질 상호작용을 상향조절하는 작용제는 골 무기질화를 증가시키는 것으로 예상된다. 이러한 NELL-1 "효능제들"은 골다공증의 치료, 골절 치유, 골형성 부전증의 치료, 골 재구성 등을 비롯한 여러가지 폭넓은 용도로 유용한 것으로 예상된다.
따라서, 하나의 실시양태에서, 본 발명은 NELL-1 발현을 조절(예, 상향 조절 또는 하향 조절)하는 작용제를 동정하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 NELL-1 핵산, 및/또는 NELL-1 핵산을 함유하는 세포, 및/또는 NELL-1 핵산을 함유하는 세포를 포함하는 조직 또는 유기체를 접촉시키고 NELL-1 전사체(예, mRNA) 및/또는 NELL-1 단백질의 수준의 변화를 검출하는 것을 포함한다. 하나의 실시양태에서, 이러한 분석을 위한 후보 시험 작용제는 결합 분석 예비스크리닝(binding assay prescreen)에서 동정된다. 이러한 결합 분석은 NELL-1 핵산 및/또는 NELL-1 단백질에 특이적으로 결합하려는 능력에 대하여 시험 작용제(들)을 예비 스크리닝하는 것을 포함한다. 이러한 분석을 통하여 NELL-1 발현을 상향조절하는 것으로 확인된 작용제들은 골다공증 및 골절의 치료에 유용한 것으로 예상된다.
또한, 골형성 단백질(예, BMP-1 내지 BMP-24)의 사용과 유사한 방법으로, NELL-1 폴리펩타이드(들)를 이용하여, 골절 회복을 촉진하거나, 또는 자연적 치유가 제한 또는 존재하지 않는 경우 골 회복 또는 교체를 유도할 수 있다. 일반적으로 이러한 방법은 골내의 골절 부위 또는 그 근처에서 NELL-1 유전자 생성물의 양을 증가시키는 것을 포함한다. 상기 NELL-1 유전자 생성물 농도는 다수의 방법들중 하나의 방법을 이용하여 증가시킬 수 있다. 하나의 방법에 있어서, 골절 부위 또는 그 근처의 세포가 NELL-1을 증가된 수준으로 발현하도록 유도된다. 이것은 예를 들어, NELL-1 발현 조절제의 사용을 통해서, 또는 NELL-1 프로모터를 변화시킴으로써, 또는 NELL-1을 발현하는 작제물로 세포를 형질감염시킴으로써 달성될 수 있다. 이것은 생체내에서 달성될 수 있거나, 또는 또 다른 실시양태에서, 이러한 세포는 생체외에서 NELL-1을 과발현하도록 변형된 다음 대상 유기체(예, 골절 부위 또는 그 근처)에 다시 도입될 수 있다.
NELL-1을 발현 또는 과발현하는 세포는 골 이식 재료내로 도입될 수 있고/거나 NELL-1 폴리펩타이드가 이러한 골 이식 물질내로 도입될 수 있다. 이러한 이식 재료는 골절 치료에 사용될 수 있거나 또는 보철/골 이식물의 교체/치료를 촉진하기 위해 이용될 수 있다.
I. NELL-1 발현을 조절하는 작용제의 분석
전술한 바와 같이, 하나의 실시양태에서, 본 발명은 NELL-1이 골 무기질화를 매개하므로 골 무기질화를 조절하는 새로운 작용제에 대한 양호한 표적물로 이용된다는 발견에 기초한 것이다. 따라서, 하나의 실시양태에서, 본 발명은 NELL-1 발현을 조절함으로써 골 무기질화를 조절하는 작용제를 스크리닝하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 시험 작용제(들)의 존재하에서 NELL-1 유전자 또는 유전자 생성물(예, NELL-1 단백질)의 발현 수준 및/또는 활성 수준을 검출하는 것을 포함한다. 시험 작용제가 없거나 또는 감소된 농도로 존재하는 음성 대조군과 비교하였을 때 상기 시험 작용제의 존재하에서 NELL-1 발현 수준 또는 활성 수준이 증가하는 것은 상기 작용제가 NELL-1 활성 또는 발현을 상향조절한다는 것을 나타낸다. 반대로, 시험 작용제가 존재하지 않거나 감소된 농도로 존재하는 음성 대조군과 비교하였을 때 시험 작용제의 존재하에서 NELL-1 발현 수준 또는 활성 수준이 감소하는 것은 상기 시험 작용제가 NELL-1 활성 또는 발현을 하향조절한다는 것을 나타낸다.
유전자의 발현 수준은 유전자 생성물의 전사(즉, mRNA의 전사)를 변화시키거나 및/또는 유전자 생성물의 번역(즉, 단백질의 번역)을 변화시키거나, 및/또는 번역후 변형(예, 단백질 접힘, 글리코실화 등)에 의하여 변화시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 바람직한 분석법은 전사된 mRNA(또는 NELL-1 유전자로부터 유도된 다른 핵산)의 수준, 번역된 단백질의 수준, 번역된 단백질의 활성 등을 분석하는 것을 포함한다. 이러한 방법들의 예가 아래에 기재되어 있다.
A) 핵산을 이용한 분석
1) 표적 분자
발현 수준의 변화는 mRNA 및/또는 mRNA로부터 유도한 핵산(예, 역전사 cDNA 등)의 변화를 검출함으로써 측정할 수 있다. NELL-1 발현 수준을 측정하기 위하여, 이러한 분석에 핵산 시료를 제공하는 것이 바람직하다. 바람직한 실시양태에서, 상기 핵산은 생물학적 시료내에 존재하거나 또는 그로부터 유도되는 것이다. 본 발명에서 사용되는 용어 "생물학적 시료"는 유기체 또는 유기체의 성분(예, 세포)로부터 얻은 시료를 말한다. 상기 시료는 어떠한 생물학적 조직 또는 체액일 수 있다. 또한 생물학적 시료는 조직학적 용도로 수득한 동결 부분과 같은 기관 또는 조직의 부분을 포함할 수도 있다.
특정의 바람직한 실시양태에서, 핵산(예, mRNA로부터 유도한 mRNA 핵산)은 당업자에게 잘 알려진 다수의 방법들중 하나의 방법에 따라 분리된다. mRNA를 분리하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, 핵산의 분리 및 정제가 다음문헌[Tijssen ed., (1993) Chapter 3 of Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology: Hybridization With Nucleic Acid Probes, Part I. Theory and Nucleic Acid Preparation, Elsevier, NY and Tijssen ed.]에 상세히 기재되어 있다.
바람직한 실시양태에서, "전체" 핵산은 예를 들어 산 구아니디늄-페놀-클로로포름 추출 방법을 이용하여 소정의 시료로부터 분리되고, polyA + mRNA는 올리고 dT 컬럼 크로마토그래피 또는 (dT)n 마그네틱 비이드를 이용하여 분리된다(Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989), 또는 Current Protocols in Molecular Biology, F. Ausubel et al., ed, Green Publishing and Wiley-Interscience, New York (1987)).
흔히, 발현 수준을 평가하기 전에 핵산 시료를 증폭하는 것이 바람직하다. 핵산을 증폭하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 이의 예로는 중합효소 연쇄 반응(PCR)(Innis 등, (1990) PCR Protocols. A guide to Methods and Amplication. Academic Press, Inc. San Diego), 리가제 연쇄 반응(LCR)(Wu and Wallace (1989) Genomics 4:560, Landegren et al. (1988) Science 241:1077, 및 Barringer 등 (1990) Gene 89:117), 전사 증폭(Kwoh 등 (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 56: 1173), 자기-지속 서열 복제 (Guatelli 등, (1990) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 87: 1874), 도트 PCR 및 링커 어뎁터 PCR 등이 있으며, 이들에 한정되지 않는다.
특히 바람직한 실시양태에서, 시료중의 NELL-1 의 전사 수준 및 발현 수준을 정량화하는 것이 요구되는 경우, 상기 핵산 시료는 NELL-1 mRNA 전사체(들)의 농도, 또는 NELL-1 mRNA 전사체(들)로부터 유도한 핵산의 농도가 그 유전자의 전사수준 및 발현 수준에 비례하는 것이다. 마찬가지로, 하이브리드화 신호 세기는 하이브리드화된 핵산의 양에 비례하는 것이 바람직하다. 이러한 비례는 비교적 엄격한 것이 바람직하지만(예, 두 배의 전사율은 시료 핵산 풀에서 두 배의 mRNA 전사체 및 두 배의 하이브리드화 신호를 초래한다), 이러한 비례는 더욱 완화될 수 있고 심지어는 비선형적일 수 있다는 것이 당업자에게 명백하다. 따라서, 예를 들어, 표적 mRNA의 농도의 5배 차이가 하이브리드화 세기의 3-6배 차이를 초래하는 분석법이 대부분의 목적에 충분하게 된다.
더욱 정밀한 정량화가 요구되는 경우, 적당한 조절을 진행하여 본 명세서에서 기재된 바와 같이 시료 제조 및 하이브리드화시에 도입되는 편차를 보정할 수 있다. 또한, 표준 표적 핵산(예, mRNA)의 순차적 희석액들을 이용하여, 당업자에 잘 알려진 방법에 따라 검정선을 작성할 수 있다. 전사체의 존재 여부의 단순한 검출 또는 핵산 농도 변화의 큰 차이의 검출이 요구되는 경우, 정밀한 조절 또는 검정이 필요하지 않음은 물론이다.
가장 간단한 실시양태에서, NELL-1을 함유하는 핵산 시료는 전체 mRNA 이거나 또는 생물학적 시료로부터 분리 및/또는 유도한 전체 cDNA이다. 상기 핵산은 전술한 바와 같이 당업자에게 잘 알려진 다수의 방법들중 어느 방법에 따라 시료로부터 분리할 수 있다.
2) 하이브리드화에 기초한 분석
NELL-1 의 알려진 서열(SEQ ID NO: 1 참조)을 이용하여, NELL-1 전사체(들)을 검출 및/또는 정량화하는 것은 핵산 하이브리드화 방법을 이용하여 통상적으로 달성할 수 있다(상기의 Sambrook 등의 문헌 참조). 예를 들어, NELL-1 역전사 cDNA의 존재 여부 또는 양을 평가히기 위한 한 가지 방법은 "서던 블롯"을 이용한다. 서던 블롯에서, 전기영동 겔상에서 전형적으로 단편화 및 분리된 DNA(예, 역전사 NELL-1 mRNA)는 NELL-1에 특이적인 프로브에 하이브리드화된다. 상기 NELL-1 프로브로부터의 하이브리드화 신호 세기를 대조 프로브(예, 하우스키핑 유전자용 프로브)와 비교하면 표적 핵산의 상대 발현 수준을 평가할 수 있다.
그렇지 않으면, NELL-1 mRNA는 노던 블롯에서 직접 정량화할 수 있다. 간략히 말해서, 상기 mRNA는 예를 들어 산 구아니디늄-페놀-클로로포름 추출 방법을 이용하여 소정의 시료로부터 분리된다. 다음에, 상기 mRNA는 전기영동되어 mRNA 종들을 분리한 다음 상기 mRNA는 겔로부터 니트로셀룰로오스 막으로 전달된다. 서던 블롯에서와 마찬가지로, 표적 NELL-1 mRNA를 동정 및/또는 정량화하기 위하여 표지 프로브를 이용한다. 적절한 대조군(예, 하우스키핑 유전자에 대한 프로브)이 상대 발현 수준을 평가하기 위한 기준으로 이용된다.
NELL-1 발현 수준을 측정하기 위한 대안의 방법은 인 시튜 하이브리드화이다. 인 시튜 하이브리드화 분석법은 잘 알려져 있다(예, Angerer (1987) Meth. Enzymol 152:649). 일반적으로, 인 시튜 하이브리드화는 하기의 주된 단계들을 포함한다: (1) 분석할 조직 또는 생물학적 구조를 고정하는 단계; (2) 상기 생물학적 구조를 예비 하이브리드화 처리하여 표적 DNA의 접근성을 증가시키고 비특이 결합을 감소시키는 단계; (3) 핵산 혼합물을 상기 생물학적 구조 또는 조직중의 핵산에 하이브리드화하는 단계; (4) 하이브리드화후 세척하여, 상기 하이브리드화에서 결합되지 않은 핵산 단편을 제거하는 단계; (5) 상기 하이브리드화된 핵산 단편을 검출하는 단계. 이러한 각각의 단계에서 사용되는 시약 및 사용 조건은 특정의 경우에 따라 다르다.
일부의 경우에 있어서, 반복성 서열의 하이브리드화 능력을 차단할 필요가 있다. 따라서, 일부의 실시양태에서, tRNA, 인간 게놈 DNA, 또는 Cot-1 DNA를 이용하여 비특이적 하이브리드화를 차단한다.
3) 증폭을 이용한 분석
또 다른 실시양태에서, 증폭을 이용한 분석법을 이용하여 NELL-1 발현(전사) 수준을 측정할 수 있다. 이러한 증폭을 이용한 분석법에 있어서, 표적 핵산 서열(즉, NELL-1)은 증폭 반응(들)(예, 중합효소 연쇄 반응(PCR) 또는 역전사 PCR(RT-PCR)에서 주형(들)으로 작용한다. 정량적 증폭에서, 증폭 생성물의 양은 최초 시료에서의 주형(예, NELL-1 mRNA)의 양에 비례한다. 적절한 대조군(예, 시험 물질에 노출시키지 않은 건강한 조직 또는 세포)과 비교하면 NELL-1 전사 수준을 측정할 수 있다.
"정량적" 증폭 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, 정량적 PCR은 동일 프라이머들을 이용하여 기지량의 대조군 서열을 동시에 공동 증폭하는 것을 포함한다. 이는 PCR 반응을 검정하는데 사용될 수 있는 내부 표준을 제공한다. 정량적 PCR의 상세한 방법이 다음문헌[Innis 등 (1990) PCR protocols, A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc. NY]에 제공되어 있다. 예를 들어, 한 가지 방법은 표적물의 증폭에 사용된 것과 동일한 프라이머를 이용하여 기지량의 대조군 서열을 동시에 공동증폭하는 것을 포함한다. 이는 PCR 반응을 검정하는데 사용할 수 있는 내부 표준을 제공한다.
한 가지 바람직한 내부 표준은 합성 AW106 cRNA이다. 상기 AW106 cRNA는 당업자에게 알려진 표준 방법에 따라 시료로부터 분리한 RNA와 결합된다. 다음에, 상기 RNA는 역전사효소를 이용하여 역전사되어 카피 DNA를 제공한다. 다음에, 상기 cDNA 서열은 표지 프라이머를 이용한 PCR에 의해 증폭된다. 상기 증폭 생성물은 일반적으로는 전기영동에 의해 분리되고, 표지 핵산의 양(증폭 생성물의 양에비례함)이 측정된다. 다음에, 시료중의 mRNA의 양이, 기지의 AQ106 RNA 표준에 의해 생성된 신호와 비교하여 측정된다. 정량적 PCR의 상세한 방법이 [Innis 등 (1990) PCR protocols, A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc. NY]에 제공되어 있다. NELL-1에 대한 기지의 핵산 서열(들)은 당업자가 상기 유전자의 어떤 부분을 증폭하기 위한 프라이머들을 선택할 수 있도록 하기에 충분한 것이다.
4) 하이브리드화 포멧 및 하이브리드화의 최적화
a) 어레이를 이용한 하이브리드화 포멧(format)
하나의 실시양태에서, 본 발명의 방법은 어레이에 기초한 하이브리드화 포멧에 이용될 수 있다. 어레이(array)는 하나 이상의 표면(예, 고체, 막 또는 겔)에 부착되는 다수의 상이한 "프로브" 또는 "표적" 핵산(또는 기타 화합물)이다. 바람직한 실시양태에서, 상기 다수의 핵산(또는 다른 잔기)은 단일의 연속적인 표면 또는 서로 병치되는 다수의 표면에 부착된다.
어레이 포멧에서, 다수의 상이한 하이브리드화 반응이 실질적으로 동시에 진행될 수 있다. 이는 단일 실험에서 다수의 하이브리드화에 대한 신속하고 실질적으로 동시적인 평가를 제공한다. 어레이에 기초한 포멧에서 하이브리드화 반응을 수행하는 방법이 당업자에게 잘 알려져 있다(예를 들어, Pastinen (1997) Genome Res. 7:606-614; Jackson (1996) Nature Biotechnology 14:1685; Chee (1995) Science 274:610; WO 96/17958, Pinkel 등 (1998) Nature Genetics 20: 207-211).
어레이, 특히 핵산 어레이는 당업자에게 잘 알려진 여러가지 방법에 따라 제조할 수 있다. 예를 들어, 가장 간단한 실시양태에 있어서, 상이한 핵산들을 고체 지지체(예, 유리 표면, 막 등)상의 상이한 위치에 점적(예, 피펫을 이용하여)함으로써 저밀도 어레이를 간단히 제조할 수 있다.
이러한 간단한 점적 방법은 고밀도 점적 어레이를 제조하기 위해 자동화되어 왔다(예를 들어, 미합중국 특허 제 5,807,522호 참조). 이러한 특허는 작은 체적의 생물학적 시료를 적층할 표면에 대하여 미세모세관을 개방시키는 자동화 시스템의 사용을 기재하고 있다. 이러한 공정은 고밀도 어레이가 제조되도록 반복된다.
또한, 올리고뉴클레오티드 합성 기술을 이용하여 어레이를 제조할 수도 있다. 따라서, 예를 들어, 미합중국 특허 제 5,143,854호 및 PCT 특허 공보 WO 90/15070호 및 92/10092호는 고밀도 올리고뉴클레오티드 어레이의 광-유도된 조합 합성을 기재하고 있다. 또한, 고밀도 어레이의 합성은 미합중국 특허 제 5,744,305 호 및 5,445,934호에도 기재되어 있다.
b) 기타 하이브리드화 포멧
전술한 바와 같이, 여러가지의 핵산 하이브리드화 포멧이 당업자에게 알려져 있다. 예를 들어, 일반적인 포멧으로는 샌드위치 분석법 및 경쟁 및 변위 분석법이 있다. 이러한 분석 포멧은 일반적으로 다음문헌[Hames 및 Higgins (1985) Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press; Gall 및 Pardue (1969) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63:378-383; 및 John 등 (1969) Nature 223:582-587]에 기재되어 있다.
샌드위치 분석법은 핵산 서열을 검출 또는 분리하기 위한 상업적으로 이용가능한 하이브리드화 분석법이다. 이러한 분석법은 고체 지지체에 공유적으로 고정되는 포착(cpature) 핵산 및 용액 상태의 표지 신호(signal) 핵산을 이용한다. 상기 시료는 표적 핵산을 제공하게 된다. 상기 포착 핵산 및 신호 핵산 프로브는 표적 핵산과 하이브리드화되어 샌드위치 하이브리드화 착물을 형성한다. 가장 효과적이도록 하기 위하여, 상기 신호 핵산은 상기 포착 핵산과 하이브리드화되지 않아야 한다.
대표적으로, 표지 신호 핵산을 이용하여 하이브리드화를 검출한다. 상보적인 핵산 또는 신호 핵산은 하이브리드화된 폴리뉴클레오티드의 존재를 검출하기 위해 대표적으로 이용되는 몇 가지 방법들중 한 가지 방법을 이용하여 표지될 수 있다. 가장 일반적인 검출 방법은 3H, 125I, 35S, 14C, 또는 32P-표지 프로브를 이용한 자가방사기록법을 사용하는 것이다. 다른 라벨로는 표지 항체에 결합하는 리간드, 형광발색단, 화학발광제, 효소 및 표지 리간드에 특이적인 결합쌍 일원으로 이용될 수 있는 항체가 있다.
하이브리드화 착물의 검출에는 표적 및 프로브 폴리뉴클레오티드 또는 핵산의 듀플렉스에 신호 발생 착물을 결합하는 것이 필요할 수 있다. 대표적으로, 이러한 결합은 리간드-결합 프로브와 신호 결합 항리간드 사이에서와 같이 리간드와 항리간드 사이의 상호작용을 통해 일어난다.
하이브리드화 분석법의 감작성은 검출되는 표적 핵산을 증식시키는 핵산 증폭 시스템을 이용하여 향상시킬 수 있다. 이러한 시스템의 예로는 중합효소 연쇄 반응(PCR) 시스템 및 리가제 연쇄 반응(LCR) 시스템이 있다. 당업계에서 최근에 발표된 다른 방법은 핵산 서열에 기초한 증폭(NASBAO, Cangene, Mississauga, Ontario) 및 Q Beta Replicase 시스템이다.
c) 하이브리드화 조건의 최적화
핵산의 하이브리드화는 단순히, 프로브 및 이의 상보적 표적이 상보적 염기 페어링(paring)을 통해 안정한 하이브리드 듀플렉스를 형성할 수 있는 조건하에서 변성 프로브 및 표적 핵산을 제공하는 것을 포함한다. 다음에, 하이브리드 듀플렉스를 형성하지 않는 상기 핵산은 세척 제거되어, 부착된 검출가능한 라벨을 통해 검출될 하이브리드화 핵산을 남긴다. 상기 핵산은 이를 함유하는 완충액의 온도를 증가시키거나 또는 염농도를 감소시키거나 또는 화학제를 첨가하거나 또는 pH를 증가시킴으로써 변성될 수 있다. 저엄중성 조건(예, 낮은 온도 및/또는 높은 염농도 및/또는 높은 표적 농도)하에서 하이브리드 듀플렉스(예, DNA:DNA, RNA:RNA, 또는 RNA:DNA)는 어닐링된 서열이 완전히 상보적이지 않은 경우에도 형성된다. 따라서 하이브리드화의 특이성은 엄중성(stringency)이 감소함에 따라 감소한다. 반대로, 엄중성이 높아짐에 따라(예, 높은 온도 또는 낮은 염 농도), 몇 개의 미스매칭이 성공적인 하이브리드화를 위해 요구된다.
당업자는 어느 정도의 엄중성이 제공되도록 하이브리드화 조건을 선택할 수 있음을 알 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 하이브리드화는 낮은 엄중성으로 수행되어 하이브리드화를 확보한 다음, 세척이 높은 엄중성으로 실시되어 미스매칭된 하이브리드 듀플렉스를 제거한다. 계속하여, 원하는 수준의 하이브리드화 선택성이 얻어질 때 까지 엄중성을 증가시키면서(예, 30-70 ℃에서 0.25x SSPE까지 감소) 세척을 실시한다. 또한, 포름아미드와 같은 물질을 첨가하여 엄중성을 증가시킬 수도 있다. 시험 프로브에 대한 하이브리드화를 존재할 수 있는 여러가지 대조군에 대한 하이브리드화와 비교하여 하이브리드화 특이성을 평가한다.
일반적으로, 하이브리드화 특이성(엄중성)과 신호 세기 사이에는 트래이드오프(tradeoff)가 있다. 따라서, 바람직한 실시양태에서, 일관된 결과를 생성하고 배경 세기의 약 10% 이상의 신호 세기를 제공하는 최대 엄중성으로 세척을 실시한다. 따라서, 바람직한 실시양태에서는, 하이브리드화된 어레이는 게속적으로 증가하는 엄중성의 용액으로 세척되고 각각의 세척사이에서 판독될 수 있다. 이와 같이 생성되는 데이터를 분석하면, 그 이상에서는 하이브리드화 양상이 감지할 수 없을 정도로 변화되고 특정의 프로브에 대한 충분한 신호를 제공할 수 있는 세척 엄중성(wash stringency)을 확인할 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 하이브리드화동안 블로킹제(예, tRNA, sperm DNA, cot-1 DNA 등)를 이용하여 배경 신호를 감소시켜서 비특이적 결합을 감소시킨다. 하이브리드화에서 블로킹제를 사용하는 것은 당업자에게 잘 알려져 있다(예를 들어, 상기 P. Tijssen 문헌의 Chapter 8 참조).
하이브리드화 조건을 최적화하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다(예를 들어, Tijssen (1993) Laboratory Technique in Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 24: Hybridization With Nucleic Acid Probes, Elsevier, N.Y. 참조).
또한, 최적 조건은 기질 형태, 형광색소, 여기 및 방출 밴드, 스팟 크기 등의 여러가지 조합에 대한 표지(예,형광) 검출 감도의 함수이기도 하다. 저형광 배경 표면을 이용할 수 있다(예를 들어, Chu (1992) Electrophoresis 13:105-114 참조). 후보 표면상의 여러가지 직경의 스팟(표적 성분)의 검출 감도는, 예를 들어 말단이 형광 표지된 DNA 단편의 희석액을 점적하여 쉽게 구할 수 있다. 다음에, 상기 스팟은 통상적인 형광 현미경분석을 이용하여 이미지화된다. 따라서, 형광 색소 및 고체 표면(예, 유리, 융합 실리카 등)의 여러가지 조합으로부터 이용할 수 있는 감도, 선형성 및 동적 범위가 측정될 수 있다. 또한, 알려진 상대 비율에서 형광색소 쌍들의 순차적인 희석액이 분석될 수도 있다. 따라서, 프로브가 고정된 기판의 형광성 및 검출기에 의해 허용되는 동적 범위에서 실제 형광색소 비율을 반영하는 형광비 측정치가 정확히 결정된다.
d) 핵산의 표지 및 검출
NELL-1의 발현 수준을 검출하기 위해 본 발명에서 사용되는 프로브는 NELL-1 mRNA의 전길이 이거나 또는 그보다 작을 수 있다. 더욱 짧은 프로브의 특이성을 시험한다. 바람직한 프로브는 엄중한 조건하에서 NELL-1 표적 핵산(들)과 특이적으로 결합하도록 충분히 긴 것이다. 바람직한 크기 범위는 약 20 개 염기 내지 NELL-1 mRNA의 길이, 더욱 바람직하게는 약 30 개 염기 내지 NELL-1 mRNA의 길이, 가장 바람직하게는 약 40 개 염기 내지 NELL-1 mRNA의 길이이다.
대표적으로, 상기 프로브들은 검출가능한 라벨로서 표지된다. 본 발명에서 사용하기에 적당한 검출가능한 라벨로는 분광분석, 광화학, 생화학, 면역화학, 전기, 광학 또는 화학적 수단에 의해 검출가능한 어떠한 조성물이 있다. 본 발명에서 유용한 라벨로는 표지된 스트렙타비딘 접합물로 염색하기 위한 비오틴, 마그네틱 비이드(예, DynabeadsTM), 형광 염료(예, 플루오레신, 텍사스 레드, 로다민, 그린 형광 단백질 등)(예를 들어, Molecular Probes, Eugene, Oregon, USA 참조), 방사성라벨(예, 3H, 125I, 35S, 14C, 또는 32P), 효소(예, 겨자무 과산화효소, 알칼리성 인산분해효소 및 ELISA에서 일반적으로 사용되는 다른 효소), 및 콜로이드성 금(예, 고효율로 녹색광을 소산시키는 40-80 nm 직경 크기의 금 입자) 또는 착색된 유리 또는 플라스틱(예, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 라텍스 등) 비이드와 같은 비색측정 라벨이 있다. 이러한 라벨의 사용을 나타내는 특허로는 미합중국 특허 제 3,817,837호, 3,850,752호, 3,939,350호, 3,996,345호, 4,277,437호, 4,275,149호 및 4,366,241호가 있다.
형광 라벨은 낮은 배경을 갖는 매우 강한 신호를 제공하기 때문에 바람직한 것이다. 또한 이것은 신속한 스크리닝 과정을 통해 고해상도 및 감도로 광학적으로 검출될 수 있다. 상기 핵산 시료 모두는 단일 라벨(예, 단일 형광 라벨)로 표지될 수 있다. 그렇지 않으면, 또 다른 실시양태에서, 상이한 핵산 시료들이 동시에 하이브리드화될 수 있는데, 이때 각각의 핵산 시료는 상이한 라벨을 갖는다. 예를 들어, 하나의 표적은 녹색 형광 라벨을 가질 수 있고, 제 2의 표적은 적색 형광 라벨을 가질 수 있다. 스캐닝 단계는 상기 적색 표지 결합 부위를 녹색 표지 결합 부위로부터 구별시키게 된다. 각각의 핵산 시료(표적 핵산)는 서로 독립적으로 분석될 수 있다.
이용될 수 있는 적당한 색원체로는 특유의 파장 범위에서 빛을 흡수함으로써 색이 관찰될 수 있도록 하거나 또는 그렇지 않으면 특정 파장 또는 파장 범위의 방사선이 조사되는 때 빛을 방출하는 분자 또는 화합물, 예를 들어 플루오르서(fluorescer)가 있다.
형광 라벨은 약 300 nm 이상, 바람직하게는 약 350 nm 이상, 더욱 바람직하게는 약 400 nm 이상의 빛을 흡수하여, 상기 흡수되는 빛의 파장보다 약 10 nm 더 높은 파장에서 빛을 방출하여야 한다. 상기 결합된 염료의 흡광 및 발광 특성은 결합되지 않은 염료와 다를 수 있다는 것을 유념하여야 한다. 따라서, 염료의 여러가지 파장 범위 및 특성을 나타낼 때, 이는 임의의 용매에서 결합되지 않고 특성화되는 염료가 아니라 이용되는 용매를 나타내는 것으로 해석된다.
플루오르서가 일반적으로 바람직한데, 이는 플루오르서에 빛을 조사하여 다수의 발광을 얻을 수 있기 때문이다. 따라서, 다수의 측정에 단일 라벨을 이용할 수 있다.
또한, 화학발광원 또는 생물발광원에 의해서도 검출가능한 신호를 제공할 수 있다. 화학발광원으로는 화학 반응에 의해 전자적으로 여기된 다음, 검출가능한 신호로서 이용되거나 또는 형광 수용체에 에너지를 공여하는 빛을 방출할 수 있는 화합물이 있다. 또는 그렇지 않으면, 루시페린을 루시퍼라제 또는 루시게닌과 함께 사용하여 생물발광을 제공할 수도 있다.
전자 스핀 공명(ESR) 분광분석으로 검출할 수 있는 비공유 전자 스핀을 갖는 리포터 분자에 의하여 스핀 라벨(spin label)이 제공된다. 스핀 라벨의 예로는 유기 자유 리디칼, 전이 금속 착물, 특히 바나듐, 구리, 철 및 망간 등이 있다. 스핀 라벨의 다른 예로는 니트록사이드 자유 라디칼이 있다.
상기 라벨은 하이브리드화 전 또는 후에 표적(시료) 핵산(들)에 첨가될 수 있다. 이른바 "직접 라벨"은 하이브리드화 전에 표적(시료) 핵산에 직접 부착 또는 혼입되는 검출가능한 라벨이다. 이와 대조로, 이른바 "간접 라벨"은 하이브리드화 후 하이브리드 듀플렉스에 결합되는 것이다. 흔히, 상기 간접 라벨은 하이브리드화 전에 표적 핵산에 부착되어진 결합 부분에 부착된다. 따라서, 예를 들어, 상기 표적 핵산은 하이브리드화 전에 비오틴화될 수 있다. 하이브리드화 후, 아비딘-결합 형광색소가 상기 비오틴 함유 하이브리드 듀플렉스에 결합되어, 용이하게 검출되는 라벨로 이용된다. 핵산을 표지하고 표지된 하이브리드화 핵산을 검출하는 방법에 대하여는 다음문헌[Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 24: Hybridization With Nucleic Acid Probes, P. Tijssen, ed. Elsevier, N.Y., (1993)]을 참조한다.
형광 라벨은 시험관내 전사 반응 동안에 용이하게 첨가된다. 따라서, 예를 들어, 시험관내 전사 동안에 생성되는 RNA내로 플루오레신 표지 UTP 또는 CTP를 혼입할 수 있다.
상기 라벨은 직접 부착되거나 또는 링커 부분을 통해 부착될 수 있다. 일반적으로, 라벨 또는 링커-라벨 부착 부위는 어떤 특별한 위치로 제한되지 않는다. 예를 들어, 원하는 검출 또는 하이브리드화를 방해하지 않는 어떤 위치를 통해 뉴클레오시드, 뉴클레오티드, 또는 이의 유사체에 라벨을 부착할 수 있다. 예를 들어, Clontech(Palo Alto, CA)로부터 입수한 특정의 Label-ON Reagents는 올리고뉴클레오티드의 인산 골격 도처에 산재하는 표지 또는 3' 및 5' 말단의 표지를 제공한다. 본 명세서에서 예로서 나타낸 바와 같이, 리보스 고리상의 위치에 라벨을 부착하거나 또는 리보스를 변형시키고 필요한 경우 제거할 수 있다. 유용한 표지 시약의 염기 잔기로는 자연 발생되거나 사용 목적을 방해하지 않도록 변형되는 것들이 있다. 변형된 염기로는 7-deaza A 및 G, 7-deaza-8-aza A 및 G, 및 기타 헤테로고리 잔기가 있다.
형광 라벨은 단일종 유기 분자로 제한되지 않지만, 무기 분자, 유기 및/또는 무기 분자들의 다분자 혼합물, 결정체, 이종중합체 등을 포함하는 것으로 이해된다. 따라서, 예를 들어, 실리카 셸에 함유되는 CdSe-CdS 코어-셸 나노결정체를 쉽게 유도하여 생물학적 분자에 커플링할 수 있다(Bruchez 등 (1998) Science, 281:2013-2016). 마찬가지로, 고형광성 양자점(황화아연으로 캐핑한 카드뮴 셀레나이드)을 생물 분자에 공유결합시켜서 초민감성 생물학적 검출에 사용하여왔다(Warren 및 Nie (1998) Science, 281:2016-2018).
B) 폴리펩타이드를 이용한 분석
1) 분석 포멧
NELL-1 핵산 발현 수준(들)의 검출외에도 또는 상기 검출 대신에, 번역된 NELL-1 폴리펩타이드의 양 및/또는 활성을 검출 및/또는 정량함으로써 NELL-1 의 발현의 변화를 검출 및/또는 정량할 수 있다.
2) 발현된 단백질의 검출
NELL-1 에 의해 엔코딩되는 폴리펩타이드(들)는 당업자에게 잘 알려진 다수의 방법들중 어느 방법에 따라 검출 및 정량할 수 있다. 이러한 방법으로는 전기영동, 모세관 전기영동, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 박층 크로마토그래피(TLC), 과확산 크로마토그래피 등과 같은 생화학적 분석 방법, 또는 유체 또는 겔 침전 반응, 면역 확산(단일 또는 이중), 면역전기영동, 방사면역분석(RIA), 효소면역측정(ELISA), 면역형광 분석, 웨스턴 블로팅 등과 같은 여러가지 면역학적 방법이 있다.
하나의 바람직한 실시양태에서, 상기 NELL-1 폴리펩타이드(들)는 전기영동 단백질 분리(예, 1 또는 2 차원적 전기영동)시에 검출/정량된다. 전기영동법을 이용하여 단백질을 검출하는 수단은 당업자에게 잘 알려져 있다(R, Scopes (1982) Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y.,; Deutscher, (1990) Methods in Enzymology Vol. 182: Guide to Protein Purification, Academic Press, Inc., N.Y.).
또 다른 바람직한 실시양태에서, 웨스턴 블롯(면역블롯) 분석을 이용하여, 시료중의 본 발명의 폴리펩타이드(들)의 존재를 검출 및 정량한다. 일반적으로, 이러한 방법은 분자량을 기준으로 겔 전기영동하여 시료 단백질을 분리하고, 상기 분리된 단백질을 적당한 고체 지지체(예, 니트로셀룰로오스 필터, 나일론 필터, 또는 유도된 나일론 필터)에 전달하고, 상기 표적 폴리펩타이드(들)에 특이적으로 결합하는 항체와 함께 상기 시료를 배양하는 것을 포함한다.
상기 항체들은 표적 폴리펩타이드(들)에 특이적으로 결합하는 것으로서, 직접 표지되거나 또는 그렇지 않으면, 상기 항체의 영역에 특이적으로 결합하는 표지 항체(예, 표지된 양의 항마우스 항체)를 이용하여 나중에 검출할 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 상기 NELL-1 폴리펩타이드(들)는 면역분석법을 이용하여 검출된다. 본 명세서에서 사용되는 것으로 면역분석법은 분석물(예, 표적 폴리펩타이드(들))에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하는 분석법이다. 따라서, 상기 면역분석법은 다른 화학적 또는 물리적 특성을 이용하여 분석물을 분리, 표적화 및 정량하는 것과 대조적으로, 항체에 대한 본 발명의 폴리펩타이드의 특이 결합을 검출하는데 특징이 있다.
본 발명에서 확인된 폴리펩타이드(들)의 검출 또는 정량화를 위하여는, 다수의 잘 알려진 면역학적 결합 분석법(미합중국 특허 제 4,366,241호, 4,376,110호, 4,517,288호 및 4,837,168호)들중 어떤 방법이 적합하다. 일반적인 면역분석법의 설명에 대하여는 다음문헌[Asai (1993) Methods in Cell Biology Volume 37: Antibodies in Cell Biology, Academic Press, Inc. New York; Stites & Terr (1991) Basic and Clinical Immunology 7th Edition]을 또한 참조한다.
대표적으로, 면역학적 결합 분석법(또는 면역분석법)은 분석물(NELL-1 폴리펩타이드)에 특이적으로 결합하여 상기 분석물을 고정시키는 포착 물질(capture agent)을 이용한다. 바람직한 실시양태에서, 상기 포착제는 항체이다.
또한, 면역분석법은 포착 물질 및 분석물로 이루어진 결합 착물에 특이적으로 결합하여 상기 착물을 표지하는 표지 물질을 이용하기도 한다. 상기 표지 물질 그 자체는 상기 항체/분석물 복합체를 포함하는 부분들중 하나일 수 있다. 따라서, 상기 표지 물질은 이미 결합된 표적 폴리펩타이드를 특이적으로 인식하는 표지된 항체 또는 표지된 폴리펩타이드일 수 있다. 그렇지 않으면, 상기 표지 물질은 포착물질/폴리펩타이드 착물에 특이적으로 결합하는 제 3의 부분(예, 또 다른 항체일 수도 있다.
또한, 단백질 A 또는 단백질 G와 같이, 면역글로불린 불변 영역을 특이적으로 결합할 수 있는 다른 단백질도 표지 물질로서 사용될 수 있다. 이러한 단백질은 스트렙토코커스 박테리아의 세포벽의 정상적인 구성물이다, 이러한 단백질은 여러가지 종의 면역글로불린 불변 영역과 강한 면역원 반응성을 나타낸다(Kronval 등 (1973) J. Immunol., 111:1401-1406, 및 Akerstrom (1985) J. Immunol., 135:2589-2542).
상기 표적 폴리펩타이드(들)를 검출하기 위한 바람직한 면역분석법은 경쟁적 또는 비경쟁적 방법이다. 비경쟁적 면역분석법은 포착된 분석물의 양을 직접 측정하는 분석법이다. 하나의 바람직한 "샌드위치" 분석법에서, 예를 들어, 포착 물질(항체)이 고체 기판에 직접 부착되어 고정될 수 있다. 다음에, 상기 고정된 항체는 시료내에 존재하는 표적 폴리펩타이드를 포착한다. 다음에, 이와 같이 고정되는 표적 폴리펩타이드는 라벨을 갖는 제 2 항체와 같은 표지 물질에 의해 결합된다.
경쟁적 분석법에 있어서, 시료내에 존재하는 분석물에 의해 포착 물질(항체)로부터 변위되는 추가된(외인성) 항체의 양을 측정함으로써, 시료내에 존재하는 분석물(NELL-1 폴리펩타이드)의 양을 측정한다. 한 가지 경쟁적 분석법에 있어서, 기지량의 표지된 폴리펩타이드를 시료에 첨가한 다음, 상기 시료를 포착 물질과 접촉시킨다. 상기 항체에 결합되는 표지 폴리펩타이드의 양은 시료내에 존재하는 표적 폴리펩타이드의 농도에 반비례한다.
하나의 특히 바람직한 실시양태에 있어서, 상기 항체는 고체 기판상에 고정된다. 폴리펩타이드/항체 착물에 존재하는 표적 폴리펩타이드의 양을 측정하거나 또는 그렇지 않으면, 남아있는 비착물화 폴리펩타이드의 양을 측정함으로써, 상기 항체에 결합된 표적 폴리펩타이드의 양을 측정할 수 있다.
본 발명의 면역분석 방법으로는 이용되는 특정의 방식에 의존하여, NELL-1 폴리펩타이드(들)를 결합하는 폴리클론 또는 모노클론 항체 또는 항체 단편 또는 단일 사슬 항체의 비표지 또는 표지(예, 효소-표지) 유도체를 단독으로 또는 조합 상태로 이용하는 효소 면역분석법(ELA)이 있다. NELL-1를 결합하는 항체가 표지되지 않는 경우, 상이한 검출가능한 마커, 예를 들어 NELL-1 폴리펨타이드를 결합하는 모노클론 항체에 결합할 수 있는 효소-표지된 항체를 이용할 수 있다. 또한, EIA의 알려진 변형 방법들중 어느 방법, 예를 들어, 효소결합 면역흡착법(ELISA)을 사용할 수도 있다. 전술한 바와 같이, 효소 검출 시스템을 이용하는 웨스턴 블로팅과 같은 면역블로팅 면역분석 방법도 본 발명에 포함된다.
또한, 본 발명의 면역분석 방법은 다른 공지의 면역분석 방법일 수도 있는데, 이의 예로는 플루오레신 또는 로다민과 같은 형광 물질의 항체 접합체 또는 항원 접합체를 이용하는 형광 면역분석법, 항체 코팅 또는 항원 코팅 라텍스 입자를 이용한 라텍스 응집법, 항체 코팅 또는 항원 코팅 적혈구를 이용한 혈구응집법, 및 아미딘-비오틴 또는 스트렙아비딘-비오틴 검출계를 이용하는 면역분석법 등이 있다.
본 발명의 면역분석법에서 이용되는 특정의 파라미터들은 시료중 항원의 농도, 시료의 성질, 이용되는 면약분석법의 형태와 같은 여러가지 인자에 따라 광범위하게 변화할 수 있다. 당업자는 최적의 조건을 용이하게 설정할 수 있다. 특정의 실시양태에서, NELL-1 폴리펩타이드를 결합하는 항체의 양은 시료가 없을 때 검출가능한 마커의 50%를 결합하도록 선택되는 것이 일반적이다. 정제 항체를 항체원으로 이용하는 경우, 분석당 사용되는 항체의 양은 약 1 ng 내지 약 100 ng의 범위인다. 대표적인 분석 조건에는, 약 4 ℃ 내지 약 45 ℃, 바람직하게는 약 25 ℃ 내지 약 37 ℃, 가장 바람직하게는 약 25 ℃의 온도, 약 5 내지 9, 바람직하게는 약 7의 pH, 및 증류수의 이온 강도 내지 약 0.2M 염화나트륨의 이온 강도, 바람직하게는 0.15M 염화나트륨의 이온 강도가 포함된다. 분석 시간은 분석의 성질에 따라 광범위하게 변화할 수 있는데, 일반적으로는 약 0.1 분 내지 약 24 시간이다. PBS와 같은 넓은 종류의 완충액이 이용될 수 있고, 이온 강도를 향상시키기 위한 염, 혈청 알부민과 같은 단백질, 안정화제, 살생물제 및 비이온성 세정제 등의 다른 시약이 포함될 수도 있다.
본 발명의 검정법은 당업자에게 널리 공지된 표준 방법에 따라 (포지티브 또는 네가티브, 또는 표적 폴리펩티드의 양으로서) 평가된다. 특정 평가 방법은 검정 포맷 및 표지의 선택에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, 웨스턴 블롯 검정법은 효소 표지에 의한 발색 산물을 가시화시킴으로써 평가될 수 있다. 정확한 분자량에서 선명하게 가시화된 밴드 또는 스팟은 포지티브 결과로서 평가되는 반면, 선명하게 가시화된 스팟 또는 밴드가 없는 경우엔 네가티브로서 평가된다. 밴드 또는 스팟의 강도는 표적 폴리펩티드 농도에 대한 정량적 측정을 제공할 수 있다.
본 명세서에 설명된 다양한 면역검정에서 사용하는 항체는 시판되고 있거나 하기 설명하는 바와 같이 제조될 수 있다.
3) NELL-1 폴리펩티드에 대한 항체
폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체가 본 발명의 면역검정법에 사용될 수 있다. 바람직하게는 폴리클로날 항체는 사람을 제외한 적합한 포유동물내로 실질적으로 순수한 폴리펩티드 또는 항원성 폴리펩티드의 다중 주입 (예컨대, 피하 또는 근내 주입)에 의해 증가될 수 있다. 표적 펩티드의 항원성은 상기 펩티드에 의해 면역화된 동물의 항체 반응의 크기를 결정하기 위한 통상적인 기술에 의해 결정될 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 방법에 사용하기 위한 항체를 증가시키는데 사용되는 상기 펩티드는 일반적으로 NELL-1에 의해 엔코딩된 표적 폴리펩티드에 대해 비교적 높은 친화도를 갖는 높은 역가의 항체의 생성을 유도하는 펩티드이어야 한다.
바람직한 경우, 면역 펩티드는 당업자에게 널리 공지된 기술을 이용한 컨쥬게이션에 의해 캐리어 단백질과 결합될 수 있다. 상기 펩티드와 화학적으로 결합하는 이렇게 보편적으로 사용되는 캐리어에는 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH), 티로글로불린 (thyroglobulin), 우혈청 알부민 (BSA) 및 파상풍 변성독소가 포함된다. 그런 다음, 상기 결합된 펩티드는 동물 (예컨대, 마우스 또는 토끼)을 면역화시키는데 사용된다.
그런 다음 항체를 상기 포유동물로부터 취한 혈액 샘플로부터 수득한다. 폴리클로날 항체를 개발하기 위해 사용된 기술은 당업자에게 널리 공지되어 있다 [참고문헌: Methods of Enzymology, "Production of Antisera With Small Doses of Immunogen: Multiple Intradermal Injections", Langone, et al. eds. (Acad. Press, 1981)]. 상기 동물에 의해 생성된 폴리클로날 항체는 예컨대, 증가된 항체에 결합된 펩티드를 매트릭스에 결합시키고 이로부터 용출함으로써 추가로 정제될 수 있다. 당업자는 모노클로날 항체 뿐만 아니라 폴리클로날 항체를 정제하고/거나 농축하기 위한 면역학 분야의 보편적이고 다양한 기술을 알고 있을 것이다 [참고문헌: Coligan, et al. (1991) Unit 9, Current Protocols in Immunology, Wiley Interscience)].
그러나, 바람직하게는 생성된 항체는 모노클로날 항체 (이하, "mAb's")일 것이다. 모노클로날 항체의 제조를 위해, 마우스 또는 래트의 면역화가 바람직하다. 본 발명에 사용되는 용어 "항체"는 에피토프 결정인자를 결합시킬 수 있는 단일-사슬 항체 (예컨대, scFv) 및/또는 온전한 분자 뿐만 아니라 Fab 및 F(ab')2'와 같은 이들의 단편을 포함한다. 또한, 이같은 맥락에서 용어 "본 발명의 mab's"는 NELL-1 폴리펩티드에 의해 엔코딩된 폴리펩티드에 대해 특이성을 갖는 모노클로날 항체를 말한다.
mAb를 분비하는 하이브리도마를 생산하기 위해 사용되는 일반적인 방법은 널리 공지되어 있다 [참고문헌: Kohler and Milstein (1975) Nature, 256:495]. 요약하면, 콜러 (Kohler) 및 밀스테인 (Milstein)에 의해 기술된 바와 같이 상기 기술은 흑색종, 기형암종 또는 자궁암, 신경교종 또는 폐암에 걸린 5명의 개별 암환자의 주위 배수 림프절 (regional draining lymph node)로부터 림프구를 단리하고 (여기서, 샘플은 외과적 검체로부터 입수하였다), 상기 세포를 푸울링 (pooling)하고, SHFP-1 세포를 융합시키는 단계를 포함한다. 하이브리도마는 암 세포주에 결합하는 항체의 생성에 대해 스크리닝된다. mAb 사이의 특이성 확인은 목적 mAb의 기본적인 반응 패턴을 결정하기 위한 비교적 일반적인 스크리닝 기술 ("ELISA" (enzyme-linked immunosorbent assay)와 같은)을 사용하여 수행될 수 있다.
항체 단편, 예컨대 단일 사슬 항체 (scFv 또는 기타)는 또한 파아지 디스플레이 기술을 사용하여 생산/선택될 수 있다. 박테리아를 감염시키는 바이러스 (박테리오파아지 또는 파아지)의 표면상에 항체 단편을 발현시키는 능력은 예컨대, 1010 비결합 클론 보다 더 큰 라이브러리로부터 단일 결합 항체 단편을 단리할 수 있도록 해준다. 파아지의 표면상에 항체 단편을 발현 (파아지 디스플레이)시키기 위해, 항체 단편 유전자는 파아지 표면 단백질 (예컨대, pIII)를 엔코딩하는 유전자내로 삽입되고 항체 단편-pIII 융합 단백질은 파아지 표면상에 디스플레이된다 [참고문헌: McCafferty et al. (1990) Nature, 348: 552-554; Hoogenboom et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19: 4133-4137).
파아지의 표면상의 항체 단편은 기능적이기 때문에, 항체 단편에 결합하는 항원을 가진 파아지는 항원 친화도 크로마토그래피에 의해 비-결합 파아지와 구별될 수 있다 [참고문헌: McCafferty et al. (1990) Nature, 348: 552-554]. 항체 단편의 친화도에 따라, 20배-1,000,000배의 부화 인자 (enrichment factor)가 1회의 친화도 선별에 의해 수득된다. 그러나, 용출된 파아지로 박테리아를 감염시킴으로써, 더 많은 파아지가 증식될 수 있고 추가적인 선별이 수행될 수 있다. 이러한 방법으로, 1회에서의 1000배의 부화는 2회의 선별을 통해 1,000,000배가 될 수 있다 [참고문헌: McCafferty et al. (1990) Nature, 348: 552-554]. 따라서 부화가 낮은 때 일지라도 [참고문헌: Marks et al. (1991) J. Mol. Biol. 222: 581-597], 여러 회의 친화도 선별을 통해 희박한 파아지가 단리될 수 있다. 항원에 대한 파아지 항체 라이브러리의 선별이 부화를 초래하기 때문에, 3회 내지 4회의 선별 후에는 다수의 클론이 항원에 결합한다. 따라서 비록 비교적 소수의 클론 (수 백)일지라도 항원 결합을 분석하기 위해 필요하다.
사람 항체는 파아지상에 매우 거대하고 다양한 V-유전자 레퍼토리를 디스플레이시킴으로써 선 면역화없이 생성될 수 있다 [참고문헌: Marks et al. (1991) J. Mol. Biol. 222: 581-597]. 일 구체예에서, 사람 말초혈액 림프구에 존재하는 천연 VH 및 VL 레퍼토리를 PCR에 의해 면역화되지 않은 공여자로부터 분리하였다. V-유전자 레퍼토리를 PCR을 사용하여 무작위로 스플라이싱 (splicing)시켜 scFv 유전자 레퍼토리를 만들고 이를 파아지 벡터내로 클로닝하여 3천만개 파아지 항체의 라이브러리를 만들었다 (상동). 단일 "나이브 (naive)" 파아지 항체 라이브러리로부터 결합 항체 단편이 합텐 (hapten), 다당류 및 단백질을 포함하여 17종 이상의 상이한 항원에 대해 분리되었다 [참고문헌: Marks et al. (1991) J. Mol. Biol. 222: 581; Marks et al. (1993). Bio/Technology. 10: 779-783; Griffiths et al. (1993) EMBO J. 12: 725-734; Clackson et al. (1991) Nature. 352: 624-628]. 사람 티로글로불린, 면역글로불린, 종양괴사인자 및 CEA를 포함하여, 자가 단백질에 대한 항체가 생성되었다 [참고문헌: Griffiths et al. (1993) EMBO J. 12: 725-734]. 또한, 온전한 세포에서 직접 선별함으로써 세포 표면 항원에 대한 항체를 분리하는 것이 가능하다. 항체 단편은 선별을 위해 사용되는 항원에 대해 고도로 특이적이고 1:M 내지 100 nM 범위의 친화도를 갖는다 [참고문헌: Marks et al. (1991) J. Mol. Biol. 222: 581-597; Griffiths et al. (1993) EMBO J. 12: 725-734]. 파아지 항체 라이브러리가 거대할수록 더 높은 비율의 항원에 대한 더 높은 결합 친화도를 가진 더 많은 항체가 단리된다.
또한 항체는 수많은 상용서비스에 의해 제조될 수 있다 (참조: Berkeley antibody laboratories, Bethyl Laboratories, Anawa, Eurogenetec 등).
C) 검정법 최적화
본 발명의 검정법은 세포, 조직 또는 생물체의 NELL-1 발현을 조절하는 작용제를 스크리닝하는데 즉시 사용된다. 본 발명의 검정법은 예컨대, 생물학적 샘플의 출처 및/또는 성질 및/또는 특정한 시험 작용제, 및/또는 가용한 분석 시설에 따라 특정 환경에서의 사용을 위해 최적화될 수 있다. 따라서, 예컨대 최적화는 결합 검정을 위한 최적 조건, 최적의 샘플 처리 조건 (예컨대, 바람직한 PCR 조건), 노이즈에 대한 시그널을 최대화하기 위한 하이브리드화 조건, 처리량을 향상시키기 위한 프로토콜 등을 결정하는 것과 관련될 수 있다. 또한, 검정 포맷은 설비 및/또는 시약의 이용가능성에 따라 선택되고/되거나 최적화될 수 있다. 따라서, 예컨대 상용 항체 또는 ELISA 키트가 유용한 경우, 단백질 농도를 검정하기 위해 이를 사용할 수도 있다. 반대로, NELL-1 유전자 전사를 변경하는 조절인자를 스크리닝하기 원하는 경우, 핵산에 기초한 검정이 바람직하다.
검정 포맷의 통상적인 선택 및 최적화는 당업자에게 널리 공지되어 있다.
II. NELL-1 에 결합하는 작용제에 대한 예비-스크리닝
특정 구체예에서, NELL-1 핵산 또는 폴리펩티드와 상호작용하는 (예컨대, 특이적으로 결합하는) 능력에 대해 시험 작용제를 예비-스크리닝하는 것이 바람직하다. 특이적으로 결합하는 시험 작용제는 NELL-1 와 상호작용하기가 더욱 용이하여 NELL-1 발현 및/또는 활성을 조절한다. 따라서, 바람직한 구체예에서, 시험 작용제(들)는 상기 기술한 더욱 복잡한 검정을 수행하기 전에 NELL-1 핵산 또는 NELL-1 단백질과의 결합에 대해 예비-스크리닝된다.
일 구체예에서, 이러한 예비-스크리닝은 간단한 결합 검정법에 의해 수행된다. 핵산 또는 단백질에 대한 특정 리간드의 특이적인 결합 또는 결합 친화도를 검정하는 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 바람직한 결합 검정법에서, NELL-1 단백질 또는 핵산은 고정되어 (표지될 수 있는) 시험 작용제에 노출되거나, 대안적으로는 시험 작용제(들)가 고정되고 (표지될 수 있는) NELL-1 단백질 또는 NELL-1 핵산에 노출된다. 그런 다음 고정된 잔기를 세척하여 결합되지 않은 물질을 제거하고 결합된 시험 작용제 또는 결합된 NELL-1 핵산 또는 단백질은 (예컨대, 결합된 분자에 부착된 표지의 검출에 의해) 검출된다. 고정된 표지의 양은 NELL-1 단백질 또는 핵산과 시험 작용제 사이의 결합 정도에 비례한다.
III. 스크리닝용 작용제.
일 구체예에서, 상기 기술한 검정법이 NELL-1 의 존재여부를 검출하거나, NELL-1 의 발현을 정량하는 방법을 제공하는 한편, 동일한 검정법이 MT-SP1 세린 프로테아제의 발현 및/또는 활성을 조절하는 작용제를 스크리닝하기 위해 사용될 수 있음이 이해될 것이다. 잠재적인 조절인자를 스크리닝하기 위해, 상기 기술한 검정법을 하나 이상의 시험 작용제의 존재하에 수행하거나 하나 이상의 시험 작용제에 노출된 세포 및/또는 조직 및/또는 기관 및/또는 생물체로부터의 생물학적 샘플을 사용하여 수행한다. 바람직한 구체예에서, MT-SP1 활성 및/또는 발현 수준을 측정하고, "대조군 (control)" 검정법 (예컨대, 시험 작용제가 결핍된 동일조건의 검정법)에서 관찰된 활성 수준(들)을 비교하였다. 대조 검정법과 비교하여 "시험" 검정법에서 MT-SP1 발현 및/또는 활성 사이의 차이는 시험 작용제가 SP1 발현 및/또는 활성의 "조절인자"임을 나타낸다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 검정법에서의 수준이란 측정된 단백질 또는 핵산 수준 또는 단백질 활성이 대조군 샘플에 대해 측정되거나 공지된 수준 (예컨대, 조절인자 (시험 작용제) 또는 추정 조절인자에 노출되지 않은 동일 종의 정상적인 건강한 세포, 조직 또는 포유동물에 대해 공지되거나 측정된 수준, 또는 동일 개체에 대해 상이한 조직 및/또는 상이한 시간에 측정된 "기준선/참조" 수준) 보다 큰 경우, 포지티브 결과, 예컨대 증가된 발현 및/또는 MT-SP1 활성, 유전자를 나타내는 것으로 간주된다. 더욱 바람직한 구체예에서, 상기 검정법은 샘플 및 "대조군" 사이의 차이가 통계적으로 현저한 경우 (예컨대, 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 신뢰 수준), 포지티브 결과를 나타내는 것으로 간주된다.
IV. 고효율 (High throughput) 스크리닝
본 발명의 검정법은 또한 "고효율" 형태로 수정될 수 있다. 보편적으로, 유용한 특성 (예컨대, NELL-1 발현 또는 활성의 조절)을 가진 신규한 화학물질은 어떤 바람직한 특성 또는 활성을 갖는 화학 화합물 (소위, "리드 화합물 (lead compound)")을 동정하고, 리드 화합물의 변형물을 만들고, 이들 변형 화합물의 특성 및 활성을 평가함으로써 생성된다. 그러나, 현재 동향은 약물 발견의 모든 측면에 대해 시간을 단축시키는 것이다. 수많은 시험물을 신속하고 효율적으로 시험하는 능력으로 인해, 고효율 스크리닝 (HTS) 방법은 통상적인 리드 화합물 동정 방법을 대체한다.
하나의 바람직한 구체예에서, 고효율 스크리닝 방법은 잠재적으로 바람직한 활성을 가진 수많은 화합물 (후보 화합물)을 포함하는 라이브러리를 제공하는 것과 관련있다. 그런 다음 상기 "조합적인 화학 라이브러리"는 바람직한 특징적 활성을 나타내는 이들 라이브러리 구성원 (특정한 화학 종 또는 아류)을 동정하기 위해 본 명세서에 기술한 바와 같은 하나 이상의 검정법으로 스크리닝된다. 따라서 동정된 화합물은 통상적인 "리드 화합물"로서 제공될 수 있거나 그 자체로 잠재적 또는 실제 치료에 사용될 수 있다.
A) 조합적인 화학 라이브러리
최근, 새로운 화학 화합물 리드의 생성에 도움이 되는 조합적인 화학 라이브러리의 용도에 관심이 집중되고 있다. 조합적인 화학 라이브러리는 시약과 같은 수많은 화학적 "빌딩 블록 (building block)"을 조합하는 화학적 합성 또는 생물학적 합성에 의해 생성된 다양한 화학 화합물의 집합이다. 예를 들어, 폴리펩티드 라이브러리와 같은 선형의 조합적인 화학 라이브러리는 소정의 화합물 길이 (즉, 폴리펩티드 화합물에서 아미노산의 수)를 위해 모든 가능한 방법으로 아미노산으로 불리는 화학적 빌딩 블록의 세트를 조합함으로써 형성된다. 수백만 가지의 화학 화합물은 화학적 빌딩 블록의 이러한 조합적인 혼합을 통해 합성될 수 있다. 예를 들어, 한 논평가는 100개의 상호교환가능한 화학적 빌딩 블록의 체계적이고 조합적인 혼합이 이론적으로 1억개의 4량체 화합물 또는 100억개의 5량체 화합물을 합성할 수 있음을 알게 되었다 [참고문헌: Gallop et al. (1994) 37(9): 1233-1250].
조합적인 화학 라이브러리의 제조 및 스크리닝은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 이러한 조합적인 화학 라이브러리에는 펩티드 라이브러리가 포함되지만 이에 한정되지 아니한다 [참고문헌: U.S. Patent 5,010,175, Furka (1991) Int. J. Pept. Prot. Res., 37: 487-493, Houghton et al. (1991) Nature, 354: 84-88]. 펩티드 합성은 본 발명에 사용하기 위해 계획되고 의도된 유일한 접근법이 결코 아니다. 화학적으로 다양한 라이브러리를 생성하기 위한 다른 화학이 또한 사용될 수 있다. 이러한 화학에는 하기가 포함되지만, 이에 한정되지 아니한다: 펩토이드 (peptoid) [참고문헌: PCT Publication No WO 91/19735, 26 Dec. 1991], 엔코딩된 펩티드 [참고문헌: PCT Publication WO 93/20242, 14 Oct. 1993], 무작위 바이오-올리고머 [참고문헌: PCT Publication WO 92/00091, 9 Jan. 1992], 벤조디아제핀 [참고문헌: U.S. Pat. No. 5,288,514], 히단토인 (hydantoin), 벤조디아제핀 및 디펩티드와 같은 다이버소머 (diversomer) [참고문헌: Hobbs et al., (1993) Proc. nat. Acad. Sci. USA 90: 6909-6913], 비닐 폴리펩티드 (vinylogous polypeptide) [참고문헌: Hagihara et al. (1992) J. Amer. Chem. Soc. 114: 6568], 베타-D-글루코오스 스캐폴딩 (scaffolding)을 가진 비펩티드 펩티도모사체 (nonpeptidal peptidomimetics) [참고문헌: Hirschmann et al., (1992) J. Amer. Chem. Soc. 114: 9217-9218], 소 화합물 라이브러리의 아날로그 유기 합성 [참고문헌: Chen et al. (1994) J. Amer. Chem. Soc. 116: 2661], 올리고카르바메이트 [참고문헌: Cho, et al., (1993) Science 261: 1303], 및/또는 펩티딜 포스포네이트 (peptidyl phosphonate) [참고문헌: Campbell et al., (1994) J. Org. Chem. 59: 658]. [참고문헌: Gordon et al., (1994) J. Med. Chem. 37: 1385], 핵산 라이브러리 (참조: 스트라타진 (Strategene) 사), 펩티드 핵산 라이브러리 [참고문헌: U.S. Patent 5,539,083], 항체 라이브러리 [참고문헌: Vaughn et al. (1996) Nature Biotechnology, 14(3): 309-314, and PCT/US96/10287], 탄수화물 라이브러리 [참고문헌: Liang et al. (1996) Science, 274: 1520-1522, and U.S. Patent 5,593,853], 및 유기 소분자 라이브러리 [참고문헌: benzodiazepines (Baum (1993) C&EN, Jan 18, page 33), isoprenoids (U.S. Patent 5,569,588), thiazolidinones and metathiazanones (U.S. Patent 5,549,974), pyrrolidines (U.S. Patents 5,525,735 and 5,519,134), morpholino compounds (U.S. Patent 5,506,337), benzodiazepines (5,288,514) and the like].
조합적인 라이브러리 제조를 위한 장치는 시판되고 있다 (참조: 357 MPS, 390 MPS, Advanced Chem Tech, Louisville KY, Symphony, Rainin, Woburn, MA, 433A Applied Biosystems, Foster City, CA, 9050 Plus, Millipore, Bedford, MA).
또한 널리 공지된 수많은 로봇 시스템이 액상 화학을 위해 개발되고 있다. 이들 시스템에는 다케다 사 (Takeda Chemical Industries, LTD., Osaka, Japan)에 의해 개발된 자동화된 합성 장치와 같은 자동화된 워크스테이션 및 화학자에 의해 수행되는 수동 합성 작업을 모방한 로봇 팔을 이용하는 많은 로봇공학 시스템 (Zymate II, Zymark Corporation, Hopkinton, Mass.; Orca, Hewlett-Packard, Palo Alto, Calif.)이 포함된다. 상기 장치들 중 어떤 것은 본 발명의 용도로 적합하다. (가능한 경우) 이들 장치의 성질 및 이행을 수정하여 본 명세서에서 논의된 바와 같이 실험자가 작업할 수 있음은 당업자에게 자명할 것이다. 또한, 수많은 조합적 라이브러리는 그 자체가 시판되고 있다 (참조: ComGenex, Princeton, N.J., Asinex, Moscow, Ru, Tripos, Inc., St. Louis, MO, ChemStar, Ltd, Moscow, RU, 3D Pharmaceuticals, Exton, PA, Martek Biosciences, Columbia, MD, etc.).
B) 화학 라이브러리의 고효율 검정
NELL-1의 발현을 조절하거나 NELL-1 폴리펩티드의 결합 특이성 및/또는 활성을 변경하는 것에 대한 여하한 검정법은 고효율 스크리닝을 위해 수정될 수 있다. 상기 기술한 바와 같이, NELL-1 발현이 뼈의 무기질화와 관련되어 있기 때문에, 조절인자는 뼈의 무기질화를 억제하거나 증가시킨다. 따라서 바람직한 검정법은 시험 화합물(들)에 의한 전사의 억제 (즉, mRNA 생성의 억제), 시험 화합물(들)에 의한 단백질 발현의 억제, 또는 시험 화합물(들)에 의한 유전자 (예컨대, gDNA 또는 cDNA) 또는 유전자 산물 (예컨대, mRNA 또는 발현된 단백질)에 대한 결합을 검출하는 것이다. 또한, 상기 검정법은 NELL-1 폴리펩티드의 특징적인 활성의 억제를 검출할 수 있다.
특정 핵산 또는 단백질 산물의 존재, 부재 또는 정량을 위한 고효율 검정법은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 유사하게, 결합 검정법은 마찬가지로 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 제 5,559,410호는 단백질에 대한 고효율 스크리닝 방법을 기술하고 있고, 미국 특허 제 5,585,639호는 핵산 결합 (즉, 어레이에서)에 대한 고효율 스크리닝 방법을 기술하고 있는 반면, 미국 특허 제 5,576,220호 및 제 5,541,061호에는 리간드/항체 결합에 대한 고효율 스크리닝 방법이 기재되어 있다.
또한, 고효율 스크리닝 시스템은 시판되고 있다 (참조: Zymark Corp., Hopkinton, MA; Air Technical Industries, Mentor, OH; Beckman Instruments, Inc. Fullerton, CA; Precision Systems, Inc., Natick, MA, etc.). 이들 시스템은 모든 샘플 및 시약 피펫팅, 액체 분배, 시간조절 배양, 및 검정에 적합한 검출기(들)에서의 마이크로플레이트의 최종 판독을 포함하여 전형적으로 전체 과정을 자동화한다. 이러한 배열가능한 시스템은 고효율 및 신속한 시작 뿐만 아니라 고도의 융통성 및 맞춤성을 제공한다. 상기 시스템의 제작자는 다양한 고효율처리를 위한 상세한 프로토콜을 제공한다. 예를 들어, 지마크 사(Zymark Corp.)는 유전자 전사, 리간드 결합 등의 조절을 검출하기 위한 스크리닝 시스템을 설명하는 기술 안내서를 제공한다.
V. NELL-1 핵산 및/또는 폴리펩티드를 사용한 뼈의 무기질화의 증가
또 다른 구체예에서, 본 발명은 뼈의 성장을 향상시키는 조성물 및 방법을 제공한다. 이것은 외상, 암 수술 또는 발달 장애로 인한 결함을 재건하는데 사용되는 것과 같은 뼈의 재건, 골형성 부전증의 치료, 골다공증의 치료, 및 경중한 골절의 치료를 포함하지만 이에 한정되지 않는 다양한 상황에 유용하다.
상기 방법은 일반적으로 NELL-1 폴리펩티드 또는 NELL-1 폴리펩티드를 엔코딩하는 벡터를 사용하여 뼈나 뼈 인근 또는 뼈의 전구 세포 또는 접촉 세포 (예컨대, 뼈의 전구 세포) 및 그 안에 NELL-1 단백질 농도를 증가시키는 것과 관련있다. 이것은 뼈 전구 세포를 형질전환시켜 내인성 NELL-1의 발현 수준을 증가시키거나 트랜스펙션된 외인성 NELL-1 핵산으로부터 NELL-1을 발현시키거나, 뼈, 골절부위, 뼈 전구 세포를 NELL-1 단백질(들)과 접촉시키거나 NELL-1 단백질의 국소 또는 전신 투여에 의해 수행될 수 있다.
본 명세서에 사용하는 용어 "뼈의 전구 세포"는 새로운 뼈 조직을 궁극적으로 형성시키거나 뼈 조직 형성에 기여하는 능력을 가진 세포 전부 또는 일부를 말한다. 이는 예컨대, 줄기 세포, 매크로파아지, 섬유아세포, 혈관세포, 골모세포, 연골모세포, 파골세포 등과 같은 분화의 상이한 단계의 다양한 세포를 포함한다. 또한 뼈 전구 세포는 시험관내에서 (in vitro) 단리되고 조작된 예컨대, 사이토카인 또는 성장인자와 같은 작용제로 자극 처리된 세포 또는 심지어 유전학적으로 조작된 세포도 포함한다. 본 발명의 방법 및 조성물을 사용하여 자극처리된 특정 타입(들)의 뼈 전구 세포는 세포들이 활성화되어 생체내 (in vivo) 구체예에서 궁극적으로 새로운 뼈 조직을 발생시키는 방법으로 자극되는 한 중요하지 않다.
또한 용어 "뼈의 전구 세포"는 뼈 전구 조직내에 위치하거나 이와 접촉하거나 이를 향해 이동하여 (즉, "홈 투(home to)") 이들 세포가 직접적으로 또는 간접적으로 성숙한 뼈의 형성을 자극하는 세포를 말한다. 이와 같이, 상기 전구 세포는 그 자체가 궁극적으로 성숙한 뼈 세포로 분화하는 세포, 즉 "직접적으로" 새로운 뼈 조직을 형성하는 세포일 수 있다. 자극시에, 추가의 전구 세포를 유인하거나 인근 세포를 조장하여 뼈-형성 세포 (예컨대, 골모세포, 골세포 및/또는 파골세포로) 분화시키는 세포는 상기 설명한 맥락에서 -- 이들의 자극이 "간접적으로" 뼈 복구 및 재생을 이끌었기 때문에 전구 세포로 고려될 수 있다. 간접적으로 뼈 형성에 영향을 미치는 세포는 다양한 성장 인자 또는 사이토카인에 의해, 또는 다른 타입의 세포와 이들의 물리적인 상호작용에 의해 뼈를 형성시킬 수 있다. 전구 세포 자극에 의한 뼈 복구의 직접적이거나 간접적인 메카니즘은 본 발명을 실시하는데 고려할 필요가 없다. 뼈 전구 세포 및 뼈 전구 조직은 이들의 천연 환경에서 활발한 뼈 성장, 복구 또는 재생 지역에 도달한 세포 및 조직일 수 있다. 뼈 전구 세포와 관련하여, 이들은 또한 상기 지역으로 유인되거나 보충된 세포일 수도 있다. 이들은 동물 모델에서 인위적으로 만들어진 뼈수술 부위내에 존재하는 세포일 수도 있다. 또한 뼈 전구 세포는 동물 또는 사람 조직으로부터 단리되어 시험관내 환경에서 유지될 수 있다. 뼈 전구 세포를 얻기 위한 적합한 신체 부위는 골절 또는 기타 골격 결함 (인위적으로 만들어진 부위에 상관없이) 주위의 뼈 조직 및 체액과 같은 지역, 또는 실제로 골수로부터이다. 단리된 세포는 본 명세서에 기술된 방법 및 조성물을 사용하여 자극될 수 있으며, 원하는 경우 뼈 복구가 자극되어야 하는 동물의 적절한 부위로 되돌려진다. 이러한 경우, 상기 핵산을 함유하는 세포는 그 자체로 치료제의 형태가 될 것이다. 이러한 생체외 (ex vivo) 프로토콜은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 뼈 전구 세포 및 조직은 치료가 바람직한 골절 또는 손상 지역에 도달한 세포 및 조직일 것이다. 따라서, 치료 구체예에서, 치료 조성물이 적용되어야 하는 적합한 표적 전구 세포의 동정과 관련된 어려움은 없다. 이러한 경우에는, 본 명세서에 기술한 바와 같이, 적절한 자극 조성물 (예컨대, NELL-1 폴리펩티드)을 수득하고 상기 조성물을 골절 또는 결함 부위에 접촉시키는 것으로 충분하다. 상기 생물학적 환경의 본질은 실시자에 의한 어떠한 추가적인 표적화 또는 세포 동정 없이 적합한 세포가 활성화될 것이라는 점이다.
A) NELL-1 생성을 증가시키기 위한 세포의 형질전환
더욱 바람직한 구체예에서, NELL-1을 발현시키는 핵산 (예컨대, cDNA(s))은 시험관내 및/또는 생체내에서 세포 (사람 또는 사람을 제외한 포유류 세포)를 트랜스펙션시키는데 유능한 유전자 치료 벡터내로 클로닝된다.
생체내, 생체외 및 시험관내에서 핵산을 세포내로 도입시키기 위한 몇몇 접근법들이 사용되어 왔다. 이에는 지질 또는 리포솜에 기초한 유전자 전달법 [참고문헌: WO 96/18372; WO 93/24640; Mannino and Gould-Fogerite (1988) BioTechniques 6(7): 682-691; Rose U.S. Pat No. 5,279,833; WO 91/06309; and Felgner et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413-7414] 및 레트로바이러스 게놈의 일부로서 치료 폴리누클레오티드 서열을 보유한 복제-결함 레트로바이러스 벡터 [참고문헌: Miller et al. (1990) Mol. Cell. Biol. 10:4239 (1990); Kolberg (1992) J. NIH Res. 4: 43, and Cornetta et al. (1991) Hum. Gene Ther. 2: 215]가 포함된다.
유전자 치료 절차를 검토하기 위해선 다음 문헌을 참조하라 [참고문헌: Anderson, Science (1992) 256: 808-813; Nabel and Felgner (1993) TIBTECH 11: 211-217; Mitani and Caskey (1993) TIBTECH 11: 162-166; Mulligan (1993) Science, 926-932; Dillon (1993) TIBTECH 11: 167-175; Miller (1992) Nature 357: 455-460; Van Brunt (1988) Biotechnology 6(10): 1149-1154; Vigne (1995) Restorative Neurology and Neuroscience 8: 35-36; Kremer and Perricaudet (1995) British Medical Bulletin 51(1) 31-44; Haddada et al. (1995) in Current Topics in Microbiology and Immunology, Doerfler and Bohm (eds) Springer-Verlag, Heidelberg Germany; and Yu et al., (1994) Gene Therapy, 1:13-26].
널리 사용되는 레트로바이러스 벡터에는 뮤린 백혈병 바이러스 (MuLV), 기본 원숭이 백혈병 바이러스 (GaLV), 원숭이 면역 결핍 바이러스 (SIV), 사람 면역 결핍 바이러스 (HIV) 및 이들의 조합이 포함된다 [참고문헌: Buchscher et al. (1992) J. Virol. 66(5) 2731-2739; Johann et al. (1992) J. Virol. 66 (5):1635-1640 (1992); Sommerfelt et al., (1990) Virol. 176:58-59; Wilson et al. (1989) J. Virol. 63:2374-2378; Miller et al., J. Virol. 65:2220-2224 (1991); Wong-Staal et al., PCT/US94/05700, and Rosenburg and Fauci (1993) in fundamental Immunology, Third Edition Paul (ed) Raven Press, Ltd., New York and the references therein, and Yu et al., Gene Therapy (1994) supra]. 상기 벡터들은 벡터에 상응하는 레트로바이러스에 의해 감염되지 않은 세포로 벡터의 숙주 범위를 확장시키기 위해 임의로 의사형 (pseudotype)이 될 수 있다. 소수포구내염 바이러스 외피 당단백질 (VSV-G)은 조혈 줄기 세포를 감염시킬 수 있는 VSV-G-의사형 HIV 벡터를 작제하기 위해 사용되었다 [참고문헌: Naldini et al. (1996) Science 272:263, and Akkina et al. (1996) J Virol 70:2581].
또한 아데노-관련 바이러스 (AAV)에 기초한 벡터가 예컨대, 핵산 및 펩티드의 시험관내 생산, 및 생체내 및 생체외 유전자 치료 절차에서 표적 핵산을 세포로 형질도입시키기 위해 사용되었다 [참고문헌: West et al. (1987) Virology 160:38-47; Carter et al. (1989) U.S. Patent No. 4,797,368; Carter et al. WO 93/24641 (1993); Kotin (1994) Human Gene Therapy 5:793-801; Muzyczka (1994) J. Clin. Invest. 94: 1351]. 재조합 AAV 벡터의 작제는 수많은 문헌에 기술되어 있다 [참고문헌: Lebkowski, U.S. Pat. No. 5,173,414; Tratschin et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5(11):3251-3260; Tratschin, et al. (1984) Mol. Cell. Biol., 4: 2072-2081; Hermonat and Muzyczka (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6466-6470; McLaughlin et al. (1988) and Samulski et al. (1989) J. Virol., 63:03822-3828]. rAAV에 의해 형질전환될 수 있는 세포주에는 다음 문헌에 기술된 것들이 포함된다 [참고문헌: Lebkowski et al. (1988) Mol. Cell. Biol., 8:3988-3966]. 기타 적합한 바이러스 벡터에는 헤르페스 바이러스 및 백시니아 바이러스가 포함된다.
미국 특허 제 5,942,496호 및 제 5,763,416호에는 핵산을 동일계에서 (in situ) 뼈 세포내로 전달하는데 사용하고/거나 뼈 전구 세포를 자극하기 위한 방법, 조성물, 키트 및 장치가 기술되어 있다 [참고문헌: Evans and Robbins (1995) J. Bone and Joint Surgery, 77-A(7):1103-1114, Wolff et al. (1992) J. Cell Sci., 103:1249-1259].
B) 외인성으로 생산된 NELL-1의 투여
1) 표적 세포로의 NELL-1 단백질의 전달
본 발명의 NELL-1 단백질 (또는 이의 생물학적으로 활성인 단편)은 정맥내, 비경구, 국소, 경구 또는 국부 투여 (예컨대, 에어로졸 또는 경피적으로)에 유용하다. 특히 바람직한 투여 모드에는 동맥내 주입, 골절부위내로의 주입 또는 생분해성 매트릭스로 전달하는 것이 포함된다. NELL-1 단백질 작용제는 전형적으로 약리학적 조성물을 형성하기 위해 약제학적으로 허용되는 캐리어 (부형제)와 혼합된다. 약제학적으로 허용되는 캐리어는 예컨대, 조성물을 안정화시키거나 작용제의 흡수를 증가시키거나 감소시키는 작용을 하는 생리학적으로 허용되는 화합물을 함유할 수 있다. 생리학적으로 허용되는 화합물은 예컨대, 글루코오스, 수크로오스 또는 덱스트란과 같은 탄수화물, 아스코르브산 또는 글루타티온과 같은 항산화제, 킬레이팅제, 저분자량 단백질, 항-유사분열 작용제의 제거 또는 가수분해를 감소시키는 조성물, 또는 부형제 또는 기타 안정화제 및/또는 완충제를 포함할 수 있다.
다른 생리학적으로 허용되는 화합물은 습윤제, 에멀션화제, 분산제 또는 미생물의 성장 및 작용을 예방하는데 특히 유용한 보존제를 포함한다. 다양한 보존제들이 널리 공지되어 있으며, 예컨대, 페놀 및 아스코르브산이 포함된다. 당업자는 생리학적으로 허용되는 화합물을 포함하여 약제학적으로 허용되는 캐리어의 선택이 예컨대 항-유사분열 작용제의 투여 경로 및 항-유사분열 작용제의 특정한 물리-화학적 특징에 달려있음을 이해할 것이다. 골형성 단백질 (BMP)의 전달을 위한 바람직한 제형은 미국 특허 제 5,385,887호에 상세히 기재되어 있다.
약제학적 조성물은 투여 방법에 따라 다양한 단위 용량 형태로 투여될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여에 적합한 단위 용량 형태에는 분말, 정제, 알약, 캡슐 및 로젠지 (lozenge)가 포함된다. 경구적으로 투여되는 경우, NELL-1 단백질(들)이 소화작용으로부터 보호되어야 하는 것으로 알려져 있다. 이것은 단백질을 산성 및 효소적 가수분해에 내성을 나타내도록 하는 조성물과 복합시키거나 리포솜과 같은 적당한 내성 캐리어로 단백질을 포장함으로써 달성된다. 소화작용으로부터 화합물을 보호하는 수단은 당 분야에 널리 공지되어 있다 [참고문헌: U.S. Patent 5,391,377: 치료제의 경구 전달을 위한 지질 조성물을 기술함].
본 발명의 약제학적 조성물은 뼈 재건 및/또는 복구를 치료하기 위해 예컨대, 외과적 부상 부위에 국소 투여하는데 특히 유용하다. 또 다른 구체예에서, 상기 조성물은 정맥내 투여 또는 체강 또는 기관의 루멘내로의 투여와 같은 비경구 투여에 유용하다. 투여용 조성물은 통상적으로 약제학으로 허용되는 캐리어, 바람직하게는 수용성 단백질을 위한 수성 캐리어에 용해된 NELL-1 단백질 용액을 포함할 것이다. 다양한 캐리어가 예컨대, 완충 염수 등이 사용될 수 있다. 이들 용액은 무균상태이고 일반적으로 불순물을 포함하지 않는다. 이들 조성물은 통상적으로 널리 공지된 멸균 기술에 의해 멸균처리될 수 있다. 상기 조성물은 pH 조정제 및 완충제, 독성 조절제 등, 예컨대 아세트산나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 나트륨 락테이트 등과 같은 생리학적 조건을 맞추는데 필요한 약제학적으로 허용되는 보조 물질을 포함할 수 있다.
이들 제형에서 NELL-1 단백질의 농도는 폭넓게 다를 수 있으며, 선택된 특정 투여 모드 및 환자의 필요에 따라 유체 부피, 점도, 체중 등에 기초하여 기본적으로 선택될 것이다. 전형적으로 NELL-1 단백질은 약제학적으로 허용되는 용액의 형태 (동결건조된 형태로부터의 재구성물을 포함하여)로 사용된다. 적어도 약 1 mg/ml, 바람직하게는 약 2 내지 8 mg/ml의 농도로 골형성 단백질이 용해되도록 최적화함으로써 약제학적 유효량의 단백질이 필요한 과도한 부피의 캐리어 없이 전달될 수 있다. 일부 적용을 위해, 2 mg/ml 이상의 농도가 바람직할 수도 있다.
상기에서 언급한 바와 같이, 투여법은 지정된 임상학적 징후 뿐만 아니라 다양한 환자의 변수 (예컨대, 체중, 연령, 성별) 및 임상학적 표시 (예컨대, 상처의 크기, 상처 부위 등)에 의해 결정될 것이다. 일반적으로, 골형성 단백질의 투여량은 1 내지 약 10000 ㎍, 바람직하게는 약 10 내지 1000 ㎍, 더욱 바람직하게는 약 10 내지 100 ㎍의 범위일 것이다.
2) 뼈 이식 재료
뼈 손상 뿐만 아니라 많은 다른 손상 모델은 손상의 치료 과정에 중요한 생물학적으로 활성인 작용제의 방출을 시작한다. 뼈에서 자연적으로 발생하여 손상부위로부터 방출되는 골형성 단백질 (BMP)은 골유도를 자극하고 손실되거나 손상된 뼈 조직을 재생시킨다. 정제된 형태의 이들 동일 단백질은 정상적인 골격 경계 내부 및 외부에서 뼈의 인위적 생성이 가능하도록 생분해성 매트릭스내에서 뼈 성장을 자극하기 위해 사용될 수 있다. 특정 이론에 구애됨이 없이, NELL-1 단백질은 골형성 단백질의 용도와 유사한 방식으로 뼈의 재-무기질화를 자극하기 위해 사용될 수 있다고 생각된다.
NELL-1 단백질은 상기 논의한 바와 같이 전신적으로 투여될 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, NELL-1 단백질은 뼈 또는 골절 부위에 직접 적용될 수 있다. 이것은 외과수술 동안 (예컨대, 복합 골절 세팅, 뼈 재건, 뼈 이식 등) 수행될 수 있거나 직접적인 주입에 의해 수행될 수 있다.
특정한 바람직한 구체예에서, 특히 뼈 재건 또는 복구가 외과적으로 수행되는 경우, 지속적인 전달 "비히클 (vehicle)"을 사용하여 NELL-1을 투여하는 것이 바람직하다. 지속적인 전달 비히클에는 생분해성 전달 비히클이 포함되지만 이에 한정되지 아니한다. 바람직한 생분해성 전달 비히클은 바람직하게는 다공성이다.
세포 부착을 위한 위치선정 및 조직 재생을 제공하는 한편 물질의 제어 방출을 위한 생분해성 다공성 전달 비히클을 개발하는 많은 연구가 수행되고 있다. 생분해성 재료는 두 개의 카테고리로 나뉜다: 1) 친수성 재료; 및 2) 소수성 재료. 친수성 재료 (탈무기질화된 동결건조된 뼈, 세라믹, 섬유소, 젤라틴 등)는 재료의 내부 다공 내로 수성의 NELL-1 단백질 용액의 용이한 통합을 제공하는 물에 대해 높은 친화도를 가지고 있다. 소수성 재료 (L-폴리락트산, D,L-폴리락트산, 폴리-글리코산 등)는 다공성, 전체 크기, 모양 및 기계적 특징의 범위에 잠재적으로 제한은 없지만 수용액에 "침투"하기가 더욱 어렵다. 상기 재료들의 내부 표면내로 용액의 증착을 증가시키기 위해, 소수성 재료를 종종 단백질에 침지시키거나 단백질 (예컨대, NELL-1)과의 침지를 촉진하기 위해 계면활성제를 사용한다.
피브리노겐, 폴리락트산, 다공성 세라믹, 젤라틴, 아가 등과 같은 재료를 포함하는 다양한 생분해성 전달 재료에 대한 상세한 설명은 다음 문헌에서 발견할 수 있다 [참고문헌: U.S. Patent Nos: 5,736,160, 4,181,983, 4,186,448, 3,902,497, 4,442,655, 4,563,489, 4,596,574, 4,609,551, 4,620,327, and 5,041,138].
다른 전달 비히클에는 뼈 이식 재료들이 포함되지만 이에 한정되지 아니한다. 뼈 이식 재료들은 천연 재료 (예컨대, 이식된 뼈 또는 뼈 단편), 합성 재료 (예컨대, 다양한 중합체 및/또는 세라믹) 또는 이들의 조합으로부터 유래될 수 있다. 뼈 이식 재료는 전형적으로 공간을 채우거나 아니면 유실된 뼈 재료를 대체하기 위해 사용된다. 또한 이러한 이식 재료들은 종종 생 뼈와 보조 (prostheic) 장치를 강력하게 결합/어닐링시키기 위한 보조 장치 (예컨대, 뼈 대체물 또는 지지물)의 구성요소로서 제공된다.
생활성 글래스 및 칼슘 포스페이트, 콜라겐, 혼합물 등을 사용하는 뼈 이식물은 우수한 생체적합성을 가지며 뼈 조직을 형성시키고 어떤 경우엔 통합시킨다. 수많은 글래스, 글래스-세라믹 및 결정상 재료가 아크릴 중합성 종, 및 다른 종류의 중합체 단독 또는 조합으로 회복을 위해 사용되고 있다. 이들에는 하이드록시아파타이트, 플루오르아파타이트, 옥시아파타이트, 규회석, 회장석, 칼슘 플루오라이드, 아그렐라이트, 데비트라이트, 카나사이트, 금운모, 모네타이트, 브루샤이트, 옥토칼슘 포스페이트, 휘틀록카이트, 테트라칼슘 포스페이트, 근청석 및 베를리나이트가 포함된다. 이들의 용도를 기술한 대표적인 특허는 다음과 같다: 미국 특허 제 3,981,736호, 제 4,652,534호, 제 4,643,982호, 제 4,775,646호, 제 5,236,458호, 제 2,920,971호, 제 5,336,642호 및 제 2,920,971호. 추가적인 참고문헌은 다음과 같다: 일본 특허 제 87-010939호 및 독일 특허 제 OS 2,208,236호. 기타 참고문헌은 다음과 같다 [참고문헌: W. F. Brown, "Solubilities of Phosphate & Other Sparingly Soluble Compounds," Environmental Phosphorous Handbook, Ch. 10 (1973)]. 또한, 산호 및 진주층을 포함하는 특정 동물로부터 유래된 재료가 회복을 위한 생재료로 사용되고 있다.
다른 뼈 이식 재료에는 15 내지 75 중량%의 생활성 글래스와 함께 1 내지 10중량%의 유리질 미네랄 섬유로 보강된 쉽게 휘어지고 주조가 가능한 아크릴-기재 뼈 시멘트 [참고문헌: U.S. Pat. No. 4,239,113], 아민과 혼합된 벤조일 퍼옥시드와 같은 퍼옥시드 시스템의 작용을 통해 중합될 수 있는 비스페놀-A-디글리시딜 메트아크릴레이트 (bis GMA)내로의 트리칼슘 포스페이트 및 바이오세라믹 A2와 같은 뼈 충전재 [참고문헌: Vuillemin et al. (1987) Arch. Otolygol. Head Neck Surg. 113: 836-840]가 포함된다. 칼슘 하이드록시드 시멘트 반응을 통해 경화된 두 가지 구성요소, 살리시레이트 및 아크릴레이트 둘 모두를 함유하는 수지 복합물은 미국 특허 제 4,886,843호에 기술되어 있는 한편, 미국 특허 제 5,145,520호 및 제 5,238,491호에는 충전재 및 시멘트가 기술되어 있다. 상기 재료들은 NELL-1 단백질과 혼합되도록 제조될 수 있다.
또한 골형성 단백질을 포함하는 이식 재료들이 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 제 4,394,370호는 뼈 결함에서 생체내 이식에 적합한 해면조직에서 제작된 재구성된 콜라겐 및 탈무기질화된 뼈 입자 또는 재구성된 콜라겐 및 용해된 골형성 단백질의 복합체를 기술하고 있다. 유사하게 미국 특허 제 5,824,084호는 바람직하게는 하전된 표면을 갖는 생체적합성의 이식가능한 이식 재료로 부터 만들어진 물질을 기술하고 있다. 생체적합성의 이식가능한 이식 재료의 예에는 칼슘 포스페이트, 일부 중합체, 탈무기질화된 뼈 매트릭스 또는 무기질화된 뼈 매트릭스를 포함하는 합성 세라믹이 포함된다. 이들 재료는 추가로 기질의 표면에 결합된 세포 흡착 분자를 포함할 수 있다. 용어 "세포 흡착 분자"란 집합적으로 라미닌, 피브로넥틴, 비트로넥틴, 혈관 세포 흡착 분자 (V-CAM) 및 세포간 흡착 분자 (I-CAM) 및 콜라겐을 말한다. 예를 들어, 특히 적합한 이식 재료에는 단리된 무기질화된 망상조직의 뼈 부분, 무기질화된 뼈의 분말 또는 미립자, 탈무기질화된 망상조직의 뼈 부분, 탈무기질화된 뼈의 분말 또는 미립자, 구아니딘-HCl 추출된 탈무기질화된 뼈 매트릭스, 소결된 피층 또는 망상조직의 뼈, 인터포어 500 (Interpore 500)이라는 상표명으로 시판되는 산호질의 하이드록시아파타이트, 및 뼈 이식 대체물 콜라그래프트 (Collagraft, Zimmer)내에 통합된 미립자 세라믹, 또는 오르퀘스트 (Orquest)에 의해 콜라겐으로부터 만들어진 것과 같은 섬유상 해면조직이 포함된다. NELL-1 단백질은 이들 이식 재료내로 통합되거나 골형성 단백질 위치에 대체될 수 있다.
VII. 키트
또 다른 구체예에서, 본 발명은 본 명세서에 기술한 검정법을 실시하고 조성물을 사용하기 위한 키트를 제공한다. 하나의 바람직한 구체예에서, 키트는 항체 및/또는 핵산 프로브 및/또는 NELL-1 발현 및/또는 활성 수준의 검출을 위해 적합한 기질이 담긴 하나 이상의 용기를 포함한다. 키트는 임의로 본 명세서에 기술한 검정법의 실시를 용이하게 하는 어떤 시약 및/또는 기구를 포함할 수 있다. 이러한 시약에는 완충액, 표지, 표지된 항체, 표지된 핵산, 형광 표지의 가시화를 위한 필터 세트, 블로팅 멤브레인 등이 포함되지만 이에 한정되지 아니한다.
또 다른 구체예에서, 키트는 NELL-1 단백질, 또는 NELL-1을 엔코딩하는 벡터 및/또는 NELL-1 단백질을 엔코딩하는 벡터를 포함하는 세포가 담긴 용기를 포함할 수 있다.
또한, 키트는 주의사항과 함께 본 발명의 검정 방법 또는 본 명세서에 기술한 조성물의 투여의 실시를 위한 지시사항 (즉, 프로토콜)이 담긴 설명서를 포함할 수 있다. 설명서는 전형적으로 글로 작성된 것 또는 인쇄물을 포함하지만 이에 한정되지 아니한다. 이러한 설명이 저장되어 최종 사용자에게 이를 전달할 수 있는 매체가 본 발명에 포함된다. 이러한 매체에는 전자 저장 매체 (예컨대, 자기 디스크, 테잎, 카트리지, 칩), 광학 매체 (예컨대, CD ROM) 등이 포함되지만 이에 한정되지 아니한다. 상기 매체는 상기 설명서를 제공하는 인터넷 사이트로 지정될 수도 있다.
실시예
하기 실시예들은 본 발명을 예시하는 것이나, 이에 본 발명이 제한되는 것은 아니다.
실시예 1
NELL-1은 태아 머리덮개뼈 골모세포에서 무기질화를 증진시킨다
본 명세서에 기술된 NELL-1 유전자의 전장 cDNA의 누클레오티드 서열은 병아리 Nel 유전자와 약 61% 상동성을 가지고 있으며, 따라서 사람 NELL-1로 명명되었다 [참고문헌: Watanabe et al. (1996) Genomics. 38(3), 273-276]. NELL-1 단백질은 단일 펩티드, NH2-말단 트롬보스폰딘 (TSP)-유사 모듈 [참고문헌: Francois and Bier (1995) Cell. 80(1):19-20], 5개의 본 윌리브랜드 (von Willebrand) 인자 C 도메인, 및 6개의 EGF-유사 도메인을 포함한다.
사람 NELL-1 유전자 발현을 파라봉합 (parasutural) 뼈 가장자리를 따라 골형성 앞부분에서 중간엽세포 및 골모세포, 및 새롭게 형성된 뼈의 응축하는 중간엽세포 내에 일차적으로 국소화시켰다. 사람 다중-기관 조직 mRNA 블롯은 사람 NELL-1 이 태아 폐, 신장 또는 간이 아닌 태아 뇌에서 특이적으로 발현됨을 보여주었다. 본 발명자들은 또한 NELL-1 이 래트 머리덮개뼈 골전구 세포에서 발현되지만 래트 경골, 스트로마 세포 및 섬유아세포 배양에서는 대개 부재하였음을 입증하였다. 본 발명의 자료는 NELL-1 유전자가 머리덮개뼈 막내부 뼈 및 신경 조직 (신경 관모 기원)에서 우선적으로 발현됨을 시사한다.
A) 재료 및 방법
임신 7일, 11일, 14일, 17일 째 되는 태아로부터 모든 마우스 배아 RNA 분석을 수행하였다. NELL-1 cDNA를 함유하는 아데노바이러스 (E1-A 녹-아웃 및 MCV 프로모터를 가진 AD5)를 작제하고 래트 태아 머리덮개뼈 일차 세포 배양물 및 MC3T3 세포주내로 감염시켰다. 바이러스를 다음 프로토콜에 따라 작제하였다: 293 세포를 각각 10 mg의 pJM17 (결함 아데노바이러스 게놈을 포함하는) 및 pAC-CMV-기재 플라스미드 (CaPO4를 이용하는 센스 또는 안티센스 래트 NELL-1 을 포함하는)로 공동-트랜스펙션시켜 10일 내지 14일에 래트 NELL-1 를 발현하는 재조합 아데노바이러스 벡터를 제조하였다. 바이러스를 플라크-정제하고 써던 블롯을 수행하여 NELL-1 유전자의 통합을 확인하였다. β-갈락토시다제 유전자를 함유하는 아데노바이러스를 대조군으로 사용하였고 상이한 세포 타입을 사용하여 감염 효능에 대해 검사하였다. 약 80 내지 90% 감염 효능이 MC3T3 및 NIH3T3 세포 모두에서 관찰되었다.
감염후 14일, 17일, 21일에 본 코사 (Von Kossa) 염색을 수행하였다. 무기질화 지역을 이미지프로 (ImagePro) 시스템에 의해 정량하였다. 통계학적 분석을 이원 스튜던츠 티 시험 (two-tailed Student's t test)에 의해 수행하였다. *p<0.01의 통계학적 P 값은 유의한 것으로 고려되었다. 과발현된 NELL-1 세포로부터 RNA를 추출하고 마우스 cDNA 어레이 분석을 수행하였다. 하이브리드화 시그널을 포스포이미져 (phosphoimager)에 의해 정량하였다.
B) 결과
NELL-1 mRNA가 임신 14일 부터 희미하게 발현되어 임신 기간 내내 조금씩 증가하였다. 임신 14일은 태아 머리덮개뼈가 무기질화되기 시작한 시점이다. 일차 래트 태아 머리덮개뼈 세포 배양물 및 MC3T3 세포 배양물 둘 모두에서 과발현된 NELL-1 는 β-갈락토시다제 대조군 보다 무기질화 측면에서 증가를 나타내었다. NELL-1 의 과발현은 대조군에 비해 감염후 17일에 약 30배 까지 머리덮개뼈 골형성 일차 세포 배양물에서 무기질화를 향상시켰다. 이러한 결과는 본 코사 염색법 및 이미지프로 소프트웨어에 의한 정량에 기초한 것이었다. 이러한 상대적인 증가는 감염후 21일까지 2배로 감소하였다. NELL-1 감염된 MC3T3 세포의 마우스 cDNA 어레이는 대조군에 비해 BMP-7 유전자 발현에서 20% 하향 조절 및 스플리트 핸드 (Split Hand) 및 풋 (Foot) 유전자의 3배 상향 조절을 보여주었다. 이들 두 유전자는 골형성 및 두개안면 발달과 밀접한 관계에 있다.
C) 토론 및 결론
본 연구에서, 본 발명자들은 NELL-1 이 골형성과 밀접하게 관련되어 있고 머리덮개뼈 골모-유사 세포의 무기질화를 향상시켰음을 확실히 확인하였다. 일부 하류 이펙터가 골형성 및 발생학적인 발달에 명백하게 중요한 역할을 함을 확인하였다. CS에서 보여진 바와 같이, 미성숙 두개 봉합 폐쇄는 두개골의 과생산 및 따라서 가능하게는 NELL-1 분자의 과발현과 관련되었기 때문일 수도 있다. NELL-1 에 대한 상기 결과 및 예비 단백질 기능 분석으로 상기 단백질은 생물학적으로 적절한 분자로 분류되었다. NELL-1 의 가능한 역할로서, 상기 단백질은 다른 성장 인자와 상호작용하는 조절인자로서 작용할 수 있다. 최근에 TSP-1은 TGFβ-1의 주요한 활성인자임이 알려졌다 [참고문헌: Francois and Bier (1995) Cell. 80(1):19-20]. TGFβ-1은 세포 수용체와 상호작용할 수 없는 불활성 형태로 대부분의 세포에 의해 분비된다. TGFβ-1의 활성은 이의 NH2-말단 프로펩티드 (LAP (latency-associated protein))의 이량체와 이의 비공유결합에 의해 처음에 가장되었다. 세포외에서 TGFβ-1 활성화시에, TSP-1은 LAP의 NH2-말단 영역과 상호작용하여 삼분자 복합체를 형성한다. 이 복합체 내에서, 형태변화 (conformational change)가 일어나고 이것이 TGFβ-1가 수용체에 접근할 수 있도록 만든다. 4개의 vWF C 도메인 (추정적으로 동종3량체)을 갖는 초르딘 (chordin)과 높은 상동성을 가진 분자는 낭배형성 동안 분비되어 제노푸스 (Xenopus) 복배방향 결정 (dorsoventral patterning)에 중추적인 역할을 한다 [참고문헌: Crawford et al. (1998) Cell. 93(7):1159-1170]. 최근, 초르딘은 복면의 BMP-4 (골형성 단백질 4, TGFβ 슈퍼패밀리 중 하나)와 직접적으로 결합하여 BMP-4 활성을 중화시키는 것으로 밝혀졌다 [참고문헌: Piccolo et al. (1996) Cell, 86(4):589-598]. 이들 결과는 NELL-1 단백질이 TGFβ 슈퍼패밀리 구성원 중 어느 것과 상호작용함으로써 세포외적으로 확인되지 않은 기능을 수행할 수도 있음을 시사한다. TGFβ-1은 골형성의 조절인자로서 알려져있기 때문에, 무기질화를 향상시키는 NELL-1 의 효과는 TGFβ 슈퍼패밀리와 이의 상호작용과 관련있을 수도 있다.
실시예 2
Nell-1을 과발현시키는 트랜스제닉 마우스에서의 두개골조기유합증
상기에서 가장 보편적인 선천성 두개안면 기형중 하나인 두개골조기유합증 (CS)에 걸린 환자에서 미성숙 두개 봉합 폐쇄 동안 과발현된 신규 분자로서 Nell-1을 보고하였다. 이제 Nell-1을 과발현시키는 트랜스제닉 마우스의 제조 및 분석을 기술한다. Nell-1 트랜스제닉 동물은 단순 내지 복합 골유합까지의 CS-유사 표현형을 나타내었다. 조직학적으로, 이들 동물에서 비정상적으로 폐쇄중/폐쇄된 봉합의 골형성 전방부는 머리덮개뼈 과성장 및 증가된 골모세포 분화에 따른 중첩 및 세포 증식이 감소하는 것으로 밝혀졌다. 또한, 기형은 머리덮개뼈에 제한적이었고, 일반화되었음에도 불구하고, Nell-1의 조직-특이적인 과발현은 없었다. 시험관내에서, Nell-1 과발현은 정상적인 배양 조건하에서 머리덮개뼈 골모세포 분화 및 무기질화를 촉진하였다. 또한, 골모세포에서의 Nell-1 과발현은 알칼리성 포스파타제 발현 및 미세결절 형성을 촉진시키기에 충분하였다. 반대로, Nell-1의 하향조절은 시험관내에서 골모세포 분화를 억제하였다. 요약하면, Nell-1 과발현은 설치류 모델에서 미성숙 봉합 폐쇄를 초래하는 머리덮개뼈 과성장을 유도하였다. 따라서, Nell-1은 아마도 미성숙 봉합 폐쇄를 초래하는 사건의 복잡한 사슬의 일부로서 CS 발달에서 신규한 역할을 갖는다. 세포 수준에서, Nell-1 발현은 골모세포 분화를 조절할 수 있고 골모세포 분화를 위해 충분할 뿐만 아니라 필요하다.
방법
Nell-1을 과발현시키는 트랜스제닉 마우스의 제조
래트 Nell-1 cDNA를 pTM-70 (13, 14)으로부터 pCDNA1.1 (CMV 프로모터 및 SV40 폴리아데닐화 부위를 사용하는) (Invitrogen, Carlsbad, California, USA)로 서브클로닝하였다. 재조합 플라스미드를 먼저 MC3T3 세포 (마우스 머리덮개뼈 세포주)내로 트랜스펙션시켜 적당한 단백질 발현을 확인하였다 (자료 제시 안함). CMV 프로모터, Nell-1 cDNA 및 SV40 폴리아데닐화 부위를 포함하는 4.76-kb DNA 단편을 난모세포의 미세주입에 사용하였다. B6C3 마우스를 표준 프로토콜 (15)을 사용하여 트랜스제닉 마우스를 만드는데 사용하였다. 파운더 (founder)를 이들의 비-트랜스제닉 한배 새끼와 짝짓기시켜 트랜스제닉 라인을 구성시켰다.
이식유전자 복제 수의 분석
이식유전자 복제 수를 PCR 및 써던 블롯 분석에 의해 추정하였다. 이식유전자 복제 수를 확인하는 PCR 프로토콜은 웹사이트 (http://www.med.umich.edu/ tamc/spike.html (16))에서 입수하였다. 포유류 게놈의 반수체 함량이 3 □109 bp이고 10 □g DNA가 스파이크 (spike)에 달한다는 가정에 기초하여, 5 □g 게놈 DNA 당 이식유전자 DNA의 양을 N bp 이식유전자 DNA/3 □109 게놈 DNA로 계산하였다. 삽입물의 크기는 4.76 kb이고, 표준 1-복제물은 10 □g 게놈 DNA 당 7.933 pg이다. PCR을 30회 수행하였고 산물을 EtBr (ethidium bromide)을 함유하는 전기영동 겔상에서 분리하였다. 이글 아이 II (Eagle Eye II, Stratagene, La Jolla, California, USA)를 사용하여 강도를 계산하였다.
면역조직화학
Nell-1 항체의 상세한 제법은 쿠로다 (Kuroda) 등의 문헌 (13, 14)에 기술되어 있다. 상기 항체는 Nell-1의 COOH-말단 영역 (CSVDLECIENN)을 인식한다. 항체의 특이성을 Nell-1-트랜스펙션된 NIH3T3 세포로부터 추출된 단백질을 사용한 웨스턴 블롯에 의해 확인하였다. 표준 아비딘비오틴 복합체/이뮤노퍼옥시다제 프로토콜 [참조: Vector Elite Kit; Vector Laboratories Inc., Burlingame, California, USA]을 1:100 Nell-1 항체 희석에 사용하였다. 디아미노벤지딘 퍼옥시다제 기질 및 3-아미노-9-에틸카르바졸을 사용하여 가시화시키고, 절편을 헤마톡실린으로 대조염색시켰다.
자기 공명 영상법
자기 공명 영상법 (MRI)을 마이크로이미징 구배 세트 및 35-mm 내부 직경 버드케이지 무선주파수 코일이 장착된 7.0-T, 18-cm 클리어-보어 자석을 갖춘 장비 (Bruker Biospec MR imager, Bruker BioSpin GmbH, Rheinstetten, Germany)를 사용하여 포르말린-보존된 검체상에서 수행하였다. 뇌 및 머리덮개뼈의 횡단면 및 시상 이미지를 다음 변수로 구배 에코 필터링된 이미징 평형-상태 펄스 시퀀스를 사용하여 수득하였다: TR/TE, 229.3/64.1 ms; 플립 각, 30°; 시야, 2.3 cm; 매트릭스, 256 x 256; 슬라이스 두께, 1 mm; 및 여기 수, 8. 인플레인 공간 해상도는 약 90 ㎛였다.
마이크로컴퓨터 단층촬영 스캔
모든 자료는 30 kVp 및 750 mA에서 수집하였다. 자료를 마이크로캣 스캐너 (MicroCat scanner, Oak Ridge National Laboratory, Oak Ridge, Tennessee, USA)에 의해 제공된 콘-빔 (cone-beam) 알고리즘을 사용하여 재구성하였다. 매트릭스는 256 x 256 x 256이었고, 140 ㎛의 등방성 해상도를 수득하였다. 상기 정량적 절차는 0, 50, 250 및 750 mg/cc 하이드록시아파타이트를 포함하는 뼈 팬텀 (이미지에서 긴 막대)의 배치를 포함한다. 자료의 가시화를 메타모프 (이차원) (MetaMorph, Universal Imaging Corp., West Chester, Pennsylvania, USA) 및 아미라 (삼차원) (Amira, Indeed - Visual Concepts GmbH, Berlin, Germany)를 사용하여 수행하였다.
생체내 증식 분석
신생 마우스에 BrdU를 100 ㎍/g 주입하였다. 동물을 주입한 지 2시간 후에 치사시켰다. 동물을 고정시키고 BrdU 항체 (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA)를 사용하여 면역염색시켰다. 트랜스제닉 동물 및 이들의 정상적인 한배 새끼로부터의 머리덮개뼈 봉합, 뇌 및 경골을 비교하였다.
Nell-1 (AdNell-1) 및 안티센스 Nell-1 (AdAntiNell-1)을 보유한 재조합 결함 아데노바이러스 벡터
래트 Nell-1 cDNA를 사람 CMV IE1 프로모터 및 Ad5 바이러스의 1 내지 454 및 3,334 내지 6,231의 누클레오티드 서열에 의해 플랭킹된 SV40 스플라이스/폴리아데닐화 부위 사이에 양지향성으로 삽입하였다. 수득된 플라스미드 pAdCMV-Nell-1은 표준 Ad5 지도와 관련하여 좌측으로 Nell-1을 전사시킨다. 재조합 아데노바이러스 (Ad) (AdNell-1)를 pAdCMV-Nell-1 및 pJM17 (Microbix Biosystems Inc., Toronto, Canada)로 293 세포를 공동트랜스펙션시킴으로써 단리시켜, E1-A 바이러스 유전자에 결함이 있는 벡터를 수득하였다. 재조합 바이러스의 클론들을 플라크 정제하고 써던 블롯 분석에 의해 확인하였다. AdNell-1 및 AdLacZ 둘 모두를 높은 역가까지 증식시키고 CsCl 쿠션으로 한번 정제하고 연속적인 CsCl 구배상에서 다시 정제하였다. 수득된 스톡은 293 세포상에서 플라크 형성에 의해 검정된 바와 같이 5 x 109 pfu/ml이었다. 노던 및 웨스턴 블롯을 수행하여 Nell-1 유전자의 통합 및 발현, 및 이의 단백질 산물을 확인하였다.
래트 머리덮개뼈 일차 세포 배양 (FRCCs)
선행기술 (12)에 기재된 바와 같이, 18일된 배아 (E18) 래트 머리덮개뼈로부터 골형성 세포를 단리하였다. 4회, 5회, 6회 소화 (digestion)로부터 수집된 세포를 푸울링하고 2.5 x 104/cm2로 플레이팅하였다. 2 계대 동안의 세포를 사용하였다. 골모세포의 아데노바이러스 감염. 과발현 Nell-1의 효과를 관찰하기 위해, 상이한 계통으로부터의 골모세포를 6-웰 플레이트에서 80% 컨플루언스 (confluence)까지 증식시켰다. 배지를 흡인시키고 감염 용량 (1 ml 무혈청 배지에 20 pfu/세포)을 배양물에 첨가하였다. AdNell-1, AdAntiNell-1, 및 β-갈락토시다제를 가진 대조군 Ad (Adβ-Gal)의 5 세트를 사용하였다. 감염후 12일, 15일 및 21일에, 본 코사 염색을 수행하였다. 무기질화된 지역의 백분율을 이미지-프로 플러스 시스템 (Image-Pro Plus system, Media Cybernetics, Silver Spring, Maryland, USA)을 사용하여 분석하였다. 마우스 간의 비교를 스튜던트 t 시험을 사용하여 수행하였다. Nell-1 하향조절에 대한 효과를 관찰하기 위해, AdAntiNell-1을 상기 기술한 바와 같이 태아 래트 머리덮개뼈 세포 (FRCC) 배양물에 첨가하였다.
마이크로어레이 분석
감염시킨지 6일, 9일 및 12일 후의 AdNell-1- 및 Ad β-Gal-감염된 MC3T3 세포로부터의 RNA를 사용하여 마이크로어레이를 수행하였다. I. 니시무라 등 (Nishimura and the University of California Los Angeles Microarrays Core Facility staff)은 뼈-관련 마이크로어레이를 개발하였다. 마이크로어레이는 10개의 내부 대조군 유전자 보다 더 많은 37개 이상의 유전자를 포함한다. 확인된 마커에는 다음이 포함된다: 뼈 매트릭스 단백질 (오스테오폰틴, 오스테오넥틴, 오스테오칼신, 뼈 시알로단백질); 수용체 (α2-인테그린, 비타민 D 수용체, 부갑상선 수용체, 에스트로겐 수용체); 골모세포 마커 (알칼리성 포스파타제, Cbfa1); 흡착 단백질 (피브로넥틴, 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸 1, 데코린, 테나신, 신데칸, 라미닌); 금속단백질분해효소 (매트릭스 금속단백질분해효소 1 및 2); 성장인자 (Bmp2, Bmp7); 원섬유 콜라겐 (콜라겐 1A1, 1A2, 3A1, 5A2, 및 11A1); 기타 콜라겐 (콜라겐 4A1, 6A1, 7A1, 10A1 및 15A1); 및 개입된 3중 헬릭스를 지니는 원섬유-관련 콜라겐 (FACIT) (콜라겐 9A1, 9A2, 12, 14, 16 및 19). RNA (Cy3용 30 ㎍ 전체 RNA 및 Cy5용 60 ㎍)를 무작위 6량체 프라이머 및 Cy3- 또는 Cy5-dUTP를 사용하여 표지시켰다. 역전사효소-표지된 프로브를 어레이상에 하이브리드화시켰다. 418 어레이 스캐너 (418 Array Scanner, Affymetrix Inc., Santa Clara, California, USA)를 사용하여 다중 레이저 스캔을 수행하여 평균 판독 및 표준 오차를 수득하고 측정의 재현성을 확인하였다. 모든 내부 대조군의 평균을 계산하였고 IPLab (IPLab version 3.2 MicroArray suite, Scanalytics Inc., Fairfax, Virginia, USA)을 사용하여 하이브리드화 강도를 표준화하는데 사용하였다. 그룹으로서 모든 골모세포 마커의 상관성을 계산하였고 AdNell-1-감염된 세포 및 Ad β-Gal-감염된 대조군 세포를 비교하였다. RT-PCR. DNase-처리된 전체 RNA를 사용하였다. 처음에 고-사이클 PCR (high-cycle PCR)을 통해 유전자 단편 발현을 확인한 후에, 또 다른 저-사이클 PCR (low-cycle PCR)을 수행하여 관련 유전자 발현을 정량하였다 (12). 각 후보 분자에 대해, 사이클 수를 연속적으로 감소시킴으로써 선형 증폭 범위내에 가장 가능성 있는 사이클 수를 결정하였다 (범위 15-35 사이클). 전기영동을 수행하고 P32로 표지된 서열-특이적 프로브를 사용하여 하이브리드화시켰다. 포스포이미져 (PhosphorImager, Molecular Dynamics, Sunnyvale, California, USA)를 사용하여 강도를 측정하였다. 예를 들어, 농도계 값을 Gapdh 값 (20 사이클에서 수행된)으로 나누고 표준화하였다. 프라이머 서열은 다음과 같았다. Msx2: 전위, 5'-CCT CGG TCA AGT CGG AAA ATT C-3' (서열번호: 2); 역위, 5'-TGG ACA GGT ACT GTT TCT GGC G-3' (서열번호: 3); 프로브, 5'-GAG CAC CGT GGA TAC AGG AG-3' (서열번호: 4) (어닐링 온도, 68℃). Cbfa1: 전위, 5'-CTG TGT GGC TCC TAA CAA GTG TG-3' (서열번호: 5); 역위, 5'-GGA TTC TGG CAA TCA CAA GCT GTC-3' (서열번호: 6); 프로브, 5'-CCT ACT CAC TGT CCG GGG AGT CCT GC-3' (서열번호: 7) (어닐링 온도, 66℃). 오스테오칼신: 전위, 5'-ATG AGG ACC CTC TCT CTG CTC-3' (서열번호: 8); 역위, 5'-GTG GTG CCA TAG ATG CGC TTG-3' (서열번호: 9), 프로브, 5'-CAT GTC AAG CAG GGA GGG CA-3' (서열번호: 10) (어닐링 온도, 66℃). 오스테오폰틴: 전위, 5'-AGC AGG AAT ACT AAC TGC-3' (서열번호: 11); 역위, 5'-GAT TAT AGT GAC ACA GAC-3' (서열번호: 12); 프로브, 5'-GCC CTG AGC TTA GTT CGT TG-3' (서열번호: 13) (어닐링 온도, 66℃). Nell-1: (12).
유량 세포계수 분석
세포를 5 x 105 세포/플레이트로 60-mm 플레이트에 시딩하였다. AdNell-1 및 Ad β-Gal로 감염시킨후 24시간, 36시간, 48시간 및 72시간에 세포를 수확하였다. 유량 세포계수를 위해 1백만개 세포를 사용하였고, 이 절차를 3회 반복하였다. 유량 세포계수를 위해 PI (propidium iodide)를 함유하는 저장성 DNA 염색 완충액을 세포에 첨가하였다.
결과
CMV 프로모터/Nell-1 트랜스제닉 마우스의 제조
생체내에서 일반화된 Nell-1 과발현의 효과를 조사하기 위해, Nell-1이 CMV 프로모터의 제어 하에 발현되는 트랜스제닉 마우스를 만들었다. 복제 수를 써던 블롯 및 PCR (도 2a)에 의해 확인하였다. RNA 분석 (도 2b) 및 면역조직화학 (자료 제시 안함)에 의해 파운더 (founder)에서 Nell-1의 발현을 추가로 확인하였다. Nell-1-과발현 파운더를 비-트랜스제닉 한배 새끼와 교잡시키고, F2 자손에 대해 포괄적인 분석을 수행하였다. 대부분의 사람 CS 표현형이 신생아에서 쉽게 식별할 수 있기 때문에, 두개의 라인으로부터 6개의 한배 새끼를 나타내는 42마리의 신생 마우스를 검사하였다. 이들 마우스의 형태학을 봉합 폐쇄를 포함하는 발달 기형에 대해 평가하였다. 후속적으로 마우스의 유전자형을 분석하였다. 봉합 개방은 봉합 아래에 가시적인 혈관의 부재 (봉합 폐쇄를 나타냄) 또는 존재 (봉합 개방을 나타냄)에 의해 결정되었다. 봉합 폐쇄를 해부 현미경하에서 추가로 확인하였다. 검사된 6개의 한배 새끼 중 2개는 20마리의 자손을 나타내는데, 명백한 두개안면 결함을 가진 신생 마우스는 없었으며 Nell-1 이식유전자 네가티브였다. 이들 한배 새끼를 추가로 검사하지 않았다. 두개안면 결함을 가진 자손은 4개의 나머지 한배 새끼 각각에서 회복되었다. 자손은 이들 4개의 한배 새끼의 자손이다. (어닐링 온도, 66℃). 오스테오칼신: 전위, 5'-ATG AGG ACC CTC TCT CTG CTC-3' (서열번호: 14); 역위, 5'-GTG GTG CCA TAG ATG CGC TTG-3' (서열번호: 15), 프로브, 5'-CAT GTC AAG CAG GGA GGG CA-3' (서열번호: 16), (어닐링 온도, 66 ℃). 오스테오폰틴: 전위, 5'-AGC AGG AAT ACT AAC TGC-3' (서열번호: 17); 역위, 5'-GAT TAT AGT GAC ACA GAC-3' (서열번호: 18), 프로브, 5'-GCC CTG AGC TTA GTT CGT TG-3' (서열번호: 19), (어닐링 온도, 66 ℃). Nell-1: (12). (22 마우스)를 추가로 분석하였다. 본 신속한 스크리닝 방법의 한계는 단지 봉합 폐쇄의 초점을 가진 온화한 CS가 검출되지 않을 수 있고, 따라서 Nell-1 과발현이 더 낮은 침투도를 가지는 것으로 나타날 수도 있다는 것이다.
22마리 신생 자손 중 13마리 (60%)를 트랜스제닉으로 만들어 파운더 Nell-1 마우스와 유사한 유전자 복제 수를 가지도록 하였다 (예상: 50%). 13마리의 Nell-1 DNA-포지티브 트랜스제닉 F2 (TF2) 마우스의 Nell-1 RNA 수준을 검사하였다. 8마리 (62%)가 Nell-1 RNA 발현에 대해 포지티브였다. 그러나, 발현 수준은 다양했다 (도 2c). 이들의 높은 이식유전자 복제 수에도 불구하고 일부 TF2 마우스에서 낮거나 거의 전무한 Nell-1 발현의 원인은 명확하지 않지만, 삽입물 주위에 이질염색질 형성과 같은 후성 효과가 이식유전자 발현의 높은 변이성에 중요한 역할을 한 것일 수도 있다 (17). 또한 RNA 수준은 동일한 한배 새끼로부터 단리된 상이한 조직에서 상이하였다. 리우 (Liu) 등의 연구에서도 CMV 프로모터를 사용하여 Msx2를 과발현시킨 경우 이러한 다양성이 관찰되었다 (5, 6). 그러므로 트랜스제닉 Nell-1 전사는 유전자 복제 수와 필수적으로 상호관련되지 있지 않을 수 있고, 또한 세포 타입에 따라 달라질 수 있다. 본 발명의 트랜스제닉 모델에서 Nell-1 과발현이 생리학적으로 관련있는 지를 결정하기 위해, 온화한 CS 표현형을 갖는 3마리 TF2 자손의 전체 두부로부터의 Nell-1 RNA 발현 수준을 정상적인 비-트랜스제닉 한배 새끼 (NF2 마우스)에서의 수준과 비교하였다. TF2 마우스는 4배-증가된 Nell-1 발현을 나타내었다 (자료 제시 안함). 이것은 2배 내지 4배 증가가 관찰된 사람 CS 환자에서의 NELL-1 과발현의 수준에 필적하는 것이었다 (12). 이는 본 발명의 모델에서 Nell-1 과발현 수준이 초생리적이라기 보다는 임상학적으로 관련있음을 시사한다.
Nell-1 트랜스제닉 마우스의 표현형 분석
8마리의 Nell-1 RNA-포지티브 TF2 마우스 중 3마리는 심각한 두개안면 기형을 나타냈고 생후 얼마되지 않아 사망하였다 (도 3a 내지 도 3c, 및 도 5). 또한 이들 마우스는 신체 전체 mRNA에서 검출가능한 Nell-1 이식유전자 발현을 보여주었고 (도 2c) 이는 피부, 간 및 머리덮개뼈의 Nell-1 면역염색에 의해 확인되었다 (도 2d).
가장 심각하게 영향을 받은 TF2 마우스 중 하나의 형태학적 검사를 통해 완전히 폐쇄된 시상 및 PF (posterior-frontal) 봉합 및 부분적으로 폐쇄된 두정 봉합을 갖는 정중옆 측막 지역에 거대한 돌기가 밝혀졌다 (도 3a 내지 도 3c). 임상학적으로, 이것은 이차 전두골 돌출 및 정중옆 뇌류에 걸린 미성숙 시상, 전두 및 관상 봉합 폐쇄를 갖는 사람 CS의 한 형태인 두개골 형성장애(craniotelencephalic dysplasia)와 유사하다 (도 3d) (1). TF2 마우스의 뇌 MRI를 통해 현저하게 감소된 공동 크기 및 증가된 유조직 부종이 밝혀졌으며, 둘 모두는 증가된 두개내 압력을 시사한다 (도 3e). 또한 미성숙 봉합 폐쇄의 측면에서 계속되는 뇌 성장은 치료되지 않은 CS를 가진 사람에게서 증가된 두개내 압력을 생성한다. MCT (microcomputerized tomography) 스캔 및 MRI 분석은 또한 TF2 마우스의 두개골에서 구조적 장애를 입증하였다 (도 3f 및 도 3g).
Nell-1 표현형-포지티브 TF2 마우스의 조직학적 검사는 NF2 한배 새끼와의 명확한 차이를 밝혔다. 사람 CS에서와 같이, TF2 마우스는 폐쇄/중첩하는 골형성 전방을 가진 조직학적으로 두꺼워지고 무질서한 머리덮개뼈 융선처럼 보이는 미성숙하게 폐쇄하는 봉합을 보였다 (도 4 패널 a 및 b). 전체 마운트 골격 염색법은 관찰가능한 어떠한 두개외 골격 기형을 보여주지 않았다. 구개 및 중간하악 봉합, 척추 및 긴 뼈의 헤마톡실린 및 에오신 및 TRAP (tartrateresistant acid phosphatase) 염색법은 어떠한 조직학적 장애 또는 파골세포 수의 증가를 밝히지 못했다. 그러므로, Nell-1 발현의 효과는 머리덮개뼈에 한정되는 것 같다. CMV 프로모터의 사용으로 인한 전체-조직 Nell-1 발현에도 불구하고, TF2 마우스는 일차적으로 머리덮개뼈 봉합 개방 및 폐쇄에 영향을 미치는 두개-특이적 장애를 나타내었다. 면역조직화학은 골모세포 분화 마커의 증가된 생체내 발현을 보여주었다 (도 4 패널 c 및 d).
동일계내에서 Nell-1-발현 TF2 마우스에서 미성숙하게 폐쇄하는 두개 봉합의 BrdU 분석은 봉합 가장자리를 따라 골형성 지역내에 증식하는 세포의 현저하게 감소된 수를 입증하였다 (도 4 패널 e 및 f). 이러한 자료는 Nell-1 과발현이 골모세포 분화와 관련됨을 시사한다. TF2 및 NF2 마우스의 봉합을 따라 영역 당 세포의 전체 수 (도 4 패널 g)에서 관찰된 통계학적으로 유의한 차이는 없었다. 증식하는 세포에서의 관찰된 감소는 분화된 골모세포의 감소된 증식 능력에 대해 이차적일 수 있거나 골모세포 증식에서의 일차적인 결함을 반영할 수도 있다.
두번째로 심각하게 영향받은 TF2 동물의 형태학적 검사는 일차적으로 뒤통수 (후측) 지역에서 팽창을 갖는 정중선 (즉, 시상 및 후측 전방 봉합)에서 현저한 두개 봉합 소멸을 보여주었다. 전체적으로, 두개골은 협소하고 주상두 및 미성숙 시상 골유합을 가진 사람 두개골과 유사하였다. MCT 스캐닝은 완전한 PF 봉합 및 부분적인 시상 및 관상 봉합 폐쇄를 밝혔다 (도 5b). 조직학적 상관성은 시상 봉합의 폐쇄된 지역에서의 마킹된 머리덮개뼈 과성장 및 중첩을 밝혔다 (도 5b).
임신 동안 TF2 발생학적 발달을 검사하기 위해, E15 TF2 자손의 두 한배 새끼를 치사시켰다. 머리뼈없음증-유사 표현형을 가진 생육불가능한 한배 새끼가 19개 배아 중 2에서 관찰되었다. 흥미롭게도, 류 (Liu) 등의 연구에서 Msx2-과발현 마우스에 대해 머리뼈없음증에 대한 유사한 발견이 보고되었다 (6). 상기 표현형의 병인은 불명확하다. 이러한 결과는 또한 신생 마우스 중에 심각하게 영향을 받은 TF2 자손의 낮은 발생률을 설명하는데 도움을 줄 수 있다.
시험관내 Nell-1 과발현은 골모세포 분화를 촉진시킨다
조절장애 골형성은 머리덮개뼈 과성장/중첩 및 미성숙 봉합 폐쇄에 대한 가능한 메카니즘으로서 제안되어왔다 (18). 비정상적인 봉합 부위 골형성은 미성숙 봉합 폐쇄를 나타내는 Nell-1 TF2 마우스의 두개 특징이기 때문에, Nell-1 과발현이 정상적인 머리덮개뼈 골모세포 순환 및 분화 경로를 변경시켜 미성숙 골형성을 촉진할 수도 있다는 가설을 세웠다.
상기 가설을 시험하기 위해, 우선 시험관내에서 골모세포 분화의 특징인 무기질화에 대한 Nell-1의 효과를 검사하였다. 일차 FRCC 및 MC3T3 (마우스 머리덮개뼈 골모세포-유사 세포주) 배양물을 아스코르브산 존재하에 20 pfu/세포로 AdNell-1을 사용하여 감염시켰다. 아스코르브산은 골모세포의 유도 및 말기 분화/무기질화를 위해 필수적이다 (19). AdNell-1-감염된 FRCC 및 MC3T3 배양물은 Ad β-Gal-감염된 대조구 보다 더욱 빠르고 풍부하게 (6배 이상) 무기질화되었다 (도 6a 및 도 6b). 이와 대조적으로, AdNell-1 감염은 NIH3T3 어른 또는 태아 래트 일차 섬유아세포에서 어떠한 무기질화 반응을 일으키지 않았다 (자료 제시 안함). 이들 자료는 Nell-1이 골모세포 무기질화를 촉진시키고 그 효과가 골모세포-특이적임을 시사한다.
상기 생체내 BrdU 결과는 TF2 마우스에서 골형성 전방을 따라 세포 증식이 현저하게 감소되었음을 입증하였다. 시험관내에서 Nell-1 과발현이 세포 주기에 영향을 미치는 지를 결정하기 위해, AdNell-1-감염된 MC3T3 세포 (및 Ad β-Gal 대조군, 아스코르브산 처리 및 처리하지 않고, 및 24시간의 혈청고갈 처리 및 처리하지 않고)를 감염시킨 지 24시간 및 48시간 후에 유량 세포계수에 의해 검사하였다. 세포 주기의 상이한 단계에서 개체수에 대해 통계학적으로 유의한 어떠한 변화도 관찰되지 않았다 (이원 스튜던트 t 시험, P>0.05). MC3T3 세포가 Nell-1 트랜스펙션 후에 감소된 증식을 나타내지 않았다는 사실은 생체내 및 시험관내 골모세포 사이의 고유한 차이 또는 세포외 환경 및 세포 분화의 단계의 영향을 반영하는 것일 수도 있다.
정상적인 시험관내 골모세포 분화는 무기질화에 의해 후속되는 결절 형성 (골모세포 응집)에 의해 예고된다. 이러한 분화 프로그램은 아스코르브산을 필요로 한다. 흥미롭게도, 아스코르브산 없이 배양되는 경우, AdNell-1-감염된 MC3T3 세포는 감염후 3일째에 알칼리성 포스파타제를 발현하는 결절을 형성하기 시작한다; 대조군 Ad β-Gal-감염된 세포는 그렇지 않다. 그러나, 아스코르브산 부재하에 Nell-1-감염된 결절은 더 작고 (≤20 세포/결절, 100x 확대시에 검출가능), 본 코사 염색에 의해 무기질화가 밝혀지지 않았다 (도 6c). 또한, 오스테오폰틴과 같은 후기 분화 마커가 "미세결절"에서 발현되지 않았다. 아스코르브산 부재하에 AdNell-1-감염된 골모세포에 의한 미세결절의 형성은 Nell-1이 단독으로 세포-세포 흡착에 영향을 줄 수 있지만 완전한 골모세포 분화를 유도하기에 충분하지 않음을 시사한다.
Nell-1이 골모세포 분화를 증진시킨다는 것을 증명하기 위해, 아스코르브산과 함께 정상 조건하에서 배양된 AdNell-1-감염된 MC3T3 세포로부터의 RNA를 감염후 6일, 9일 및 12일에 다양한 뼈-특이적인 마커로 마이크로어레이 분석을 수행하였다 (도 6d 내지 도 6f). 상기 마이크로어레이의 목적은 회귀 분석을 사용하여 AdNell-1-감염된 세포 및 대조군 Ad β-Gal-감염된 세포가 전체 골모세포 분화 마커 발현 패턴에 분명한 차이를 나타내는 지를 결정하는 것이다. 12일 까지, 골모세포 분화 마커의 발현 패턴은 AdNell-1-감염된 세포 및 Ad β-Gal-감염된 세포간에 분명한 차이를 나타내었다 (r2=0.334). 본 실험에 사용한 마이크로어레이 분석은 개별 유전자의 발현을 정량화하고자 한 것은 아니었다. 개별 유전자 발현 패턴은 주의깊게 해석되어져야 하며 예컨대 2배 이상을 갖는 유전자 또는 하향조절이 분석되어야 한다. 또한 결과는 RT-PCR 또는 RNA 분석에 의해 확인되어야 한다. Bmp7, 오스테오폰틴 및 오스테오칼신과 같은 후기 분화 마커를 AdNell-1-감염된 세포에서 2배 이상 상향조절된 반면, 그 보다 이른 타입 I 콜라겐 및 오스테오넥틴과 같은 마커는 2배 이상 하향조절되었다 (도 6g). 이는 Nell-1이 골모세포 분화를 촉진함을 시사한다. 오스테오칼신 및 오스테오폰틴 RNA 상향조절을 RNA 전기영동에 의해 확인하였다 (도 7c 및 도 7d). 마이크로어레이 뿐만 아니라 감소된-사이클 RT-PCR 분석은 AdNell-1-감염된 MC3T3 세포에서 Cbfa1, Tgf-β1, -β2, 및 -β3, 또는 Tgf-β타입-I, -II, 및 -III 수용체, Fgfr1, 또는 Fgfr2의 발현에서 유의한 어떠한 변화도 보여주지 않았다 (자료 제시 안함). 이는 Nell-1이 상기 후보 유전자의 다운스트림을 조절할 수 있거나 명백하게 상이한 경로에 영향을 미칠 수 있음을 시사한다.
시험관내에서 Nell-1의 하향조절은 골모세포 분화를 지연시킨다
골모세포 분화에서 Nell-1의 생리학적인 기능을 추가로 알아보기 위해, 골모세포에 아데노바이러스 안티센스 Nell-1 감염을 통해 Nell-1 단백질 하향조절의 효과를 시험하였다. FRCC 배양물을 아스코르브산 존재하에 20 pfu/세포로 AdAntiNell-1로 감염시켰다. AdAntiNell-1 는 Nell-1 단백질 발현을 정상 발현 수준의 40%로 하향조절하였다 (도 7a). FRCC 배양물은 Ad β-Gal-감염된 대조군 또는 AdNell-1-감염된 세포 보다 현저하게 적은 알칼리성 포스파타제를 발현하였다 (도 7b). 또한 오스테오칼신 및 오스테오폰틴 RNA 발현은 AdAntiNell-1 세포에서 하향조절되었다 (도 7c 및 도 7d). AdAntiNell-1 -감염된 세포에서의 오스테오칼신 대 Ad β-Gal 대조군에서의 오스테오칼신의 비는 노던 분석에 의하면 9일째에 1:4 미만 및 12일째에 1:2 였다. AdAntiNell-1 -감염된 세포에서의 오스테오폰틴 대 Ad β-Gal 대조군에서의 오스테오폰틴의 비는 6일 및 9일째에 1:5 미만, 및 12일째에 2:5 미만이었다. 그러므로, 녹다운 자료는 과발현 자료를 보완하며 Nell-1이 골모세포 분화에서 중요한 역할을 함을 시사한다.
토론
NELL-1은 이전에 공지되지 않은 기능을 가진 상대적으로 새롭게 발견된 분자이다. CS 환자에서 미성숙 봉합 폐쇄 동안 관찰된 NELL-1의 일시적인 상향조절때문에 (12), 두개안면 발달 및 병리학에서 Nell-1의 신규한 잠재적인 기능을 조사하기 위해 마우스 모델에서 NELL-1을 과발현시켰다. 본 발명자들은 Nell-1 트랜스제닉 마우스에서 초기 봉합 폐쇄 및 증가된 골모세포 분화를 관찰하였다. 그러므로, Nell-1은 국부 봉합 폐쇄의 조절을 위한 후보물질로 여겨지며 Nell-1의 과발현은 CS에서 미성숙 봉합 폐쇄의 메카니즘에서 중요한 역할을 할 수도 있다. 과발현 및 녹다운 시험관내 자료에 기초하여, Nell-1은 골모세포 분화에 영향을 미치는 것으로 여겨진다. 그러나, 분자적 메카니즘은 알려지지 않았다.
Nell-1은 리간드에 결합한 다음 이를 격리시키거나 활성화시킴에 의해서 뿐만 아니라 수용체-매개 신호전달을 촉진함에 의해 골모세포 분화를 유도할 수 있다 (20). 코르딘-유사 시스테인-풍부 도메인, NH2-말단 트롬보스폰딘-유사 모듈 및 EGP 유사 반복체의 Nell-1의 조합은 이를 성장 인자 활성의 유망한 조절제가 되게 한다. 본 출원인은 이러한 가능성을 시험하기 위한 예비적 실험을 수행하였다. Nell-1이 공지된 EGF-유사 수용체에 결합하는 지의 여부를 결정하기 위해, 본 출원인은 이전에 Nell-1을 ErbB1, -2, -3 또는 -4를 발현하는 IL-3 의존성 세포에 첨가시켰다. Nell-1의 첨가는 이들 수용체의 티로신 인산화를 일으키지 않았다. 따라서, Nell-1은 이들 수용체에 대한 리간드는 아니지만, Nell-1은 EGF-유사 반복체를 지닌 공지된 분비 단백질이다 (13). 대신, Nell-1은 특정한 세포 유형에 의해서만 발현될 수 있는 그 밖의 특정 수용체와 상호작용할 수 있다. 효소 2-하이브리드 시스템 (14)을 사용하여, 본 출원인은 Nell-1 수용체를 단리하는 과정에 있었다. Nell-1이 트롬보스폰딘-1 및 코르딘과 다수의 모티프를 공유하므로, 이는 가설적으로 TGF-β 수퍼패밀리의 일원을 활성화시키거나 격리시키고, 잠복성 TGF-β1 활성화를 촉진하기 위한 트롬보스폰딘-1-유사 분자로서 작용한다 (21). 최근에, 아브레우 (Abreu) 등은 Nell-1이 코르딘, 케엘린, 크로스베인레스(crossveinless), 트위스티드 개스트룰레이션 (twisted gastrulation; Tsg), 및 결합 TGF를 포함하는 "코르딘-유사 시스테인-풍부 도메인" 패밀리의 일원임을 제시했다 (20). 코르딘-유사 시스테인-풍부 도메인 패밀리 일원의 공통적인 특징은 이들의 발현이 일시적이며 특히 패턴화에 있어서 공간적으로 특이적이라는 것이다. 또 다른 공통적 특징은 Bmp 패밀리의 일원과의 상호작용 및 프로- 및 안티-Bmp로서의 후속 기능이다.
생체내에서의 Nell-1의 특이적 발현 및 기능
본 출원인의 이전 실험에서, 본 출원인은 E11-E14 마우스에서의 가장 이른 검출가능한 Nell-1 발현을 보고하였다. Nell-1은 성장 및 발달 도중에 출생전 및 출생후 둘 모두에서 두개 안면 영역에서 우선적으로 발현된다. 면역조직화학은 Nell-1이 두개관 및 봉합의 골 형성 영역 및 하악골의 골화막 골에 주로 국재화됨을 나타내었다 (데이터는 제시되지 않음). 두개관 및 하악골 막골 둘 모두는 중성 능선 유도체인 것으로 여겨진다 (22). 중성 능선 유도체에 의한 두개 안면 영역에서의 우선적 Nell-1 발현은 Nell-1이 두개 안면 골격 성장 및 발달 동안 중요할 수 있는 것으로 제시된다. 의외로, 일반화된 유전자 발현에 관여하는 그 밖의 CS 모델과 달리, Nell-1 유전자이식 마우스는 일반화된 비조직 특이적 Nell-1 과발현에도 불구하고 두개관골에 한정되는 비정상성을 나타냈다. 이는 Nell-1이 골모세포 분화를 유도하기 위해 매우 특이적인 상호작용을 거친다는 본 출원인의 가설을 추가로 뒷받침한다. 따라서, Nell-1 과발현은 트롬보스폰딘-1과 같은 상동 분자의 기능을 비특이적으로 교란시킴으로써 봉합 폐쇄를 초래하는 것으로 여겨지지 않는다.
골모세포 분화에 대한 Nell-1의 효과
아스코르브산없이 배양된 정상적 골모세포는 분화되지 않는다. 다른 한편, Nell-1을 과발현하는 골모세포는 마이크로노듈(micronodule)을 형성하고, 아스코르브산의 부재하에서 알칼리 포스파타아제를 발현시킨다. 이는 Nell-1이 단독으로 어느 정도의 골모세포 분화를 유도하기에 충분함을 제시한다.
또한, 정상 조건 (즉, 아스코르브산 부재)하에서 배양된 골모세포에서의 Nell-1 과발현의 RNA 마이크로어레이 분석은 트랜스펙션 후 12일째에서의 후기 분화 마커의 상향조절을 나타내었다. 또한, AdNell-1 트랜스펙션된 골모세포는 트랜스펙션 후 12일째에 시작되는 무기질화 증가를 나타내었다. 이들 데이터는 Nell-1이 두개관 골모세포 분화 및 무기질화의 속도를 가속시킬 수 있음을 나타낸다.
Nell-1 과발현은 Nell-1의 실제 생리학적 기능을 반영할 수 없었지만, 그 밖의 트롬보스폰딘-유사 분자에 대한 Nell-1 과발현의 효과를 반영하였다. Nell-1의 하향조절은 명백히 골모세포 분화를 억제하였다. 따라서, Nell-1은 시험관내에서 골모세포 분화에 있어서 충분하고 필요한 것으로 여겨진다. 그러나, Nell-1이 없는 마우스를 생체내에서의 이러한 결론을 입증하기 위해 생성시킬 필요가 있었다.
현재 공지된 CS 모델에 대한 Nell-1의 관계
Nell-1 과발현은 생체내에서의 Msx2 과발현으로부터 초래된 비정상성과 유사한 두개 안면 비정상성을 일으킨다. 둘 모두의 마우스 모델은 봉합 과잉성장 및 뇌탈의 발생 증가를 나타낸다. 그러나, 이들 두 유전자의 세포성 기능은 뚜렷히 상이한 것으로 여겨지는데, 연속적 Msx2 과발현은 증식을 유도하고 분화를 억제하는 반면, Nell-1은 분화를 향상시킨다. Cbfa1 과발현을 유도하는 Fgfr1에서의 Pro250→Arg 돌연변이를 지닌 마우스는 Nell-1을 과발현하는 마우스로부터의 뚜렷히 상이한 표현형을 지니는데, 이는 두개관 융합이 훨씬 후기에 일어나며 (출생후 16 내지 21일) 총체적 봉합 오버랩이 Pro250 돌연변이를 지닌 마우스에서 일어나지 않기 (18) 때문이다. 그러나, Cbfa1은 시험관내에서 Nell-1에 대한 유사한 세포성 기능을 지니는데, 둘 모두는 골모세포 분화를 유도시키며 골 마커 유전자를 상향조절한다. Nell-1 발현은 Msx2 및 Cbfa1에 의해 조절된다. FRCC의 Cbfa1 트랜스펙션은 24시간내에 Nell-1 발현을 상향조절하는 반면, Msx2 트랜스펙션 및 Cbfa1/Msx2 코트랜스펙션은 Nell-1 발현을 하향조절하였다 (미발표 결과). 이들 모든 후보 유전자가 CS의 이해에 있어서 중요하지만, Msx2는 CS의 보다 초기 스테이지에서 중요할 수 있는 (5, 6) 반면, Fgfr1/Cbfa1은 봉합 폐쇄의 후기 스테이지에서 역할을 할 수 있다. 보존된 Cbfa1 및 Msx 결합 서열을 함유하는 Nell-1 프로모터의 추가 조사는 이들의 상호작용의 추가의 이해를 제공할 수 있다 (도 8). 이들 결과는 두개 안면 성장 및 발달에서 동적 유전자 및 환경 상호작용의 복잡성을 강조한다.
결론적으로, 본 발명자들은 Nell-1을 과발현시킴으로써 인간 비증후군성 CS의 동물 모델을 생성시켰다. FGFR 또는 호메오박스(homeobox) 유전자에서의 돌연변이를 함유하는 그 밖의 이용가능한 CS 모델 (1, 2, 8)과 달리, 본 출원인의 동물 모델은 두개 안면 골격에 국재화되는 비정상성을 나타내었다. 본 출원인은 Nell-1이 두개관 골모세포 분화 및 골 형성에 충분하며 아마도 필요한 것으로 가설을 세웠다. 기계학적으로, Nell-1 과발현은 두개 봉합에서 막내 골 형성을 유도하며, 두개관 과성장/오버랩 및 후속 조기 봉합 폐쇄를 일으킬 수 있다. Nell-1이 아직 인간 유전자 실험에서 CS의 원인으로서 확인되지 않았다고 하더라도, 데이터는 Nell-1가 조기 봉합 폐쇄를 초래하는 복합한 연쇄 작용의 일부임을 강력히 제시한다 (1). 비증후군성 CS를 지닌 인간과의 Nell-1 유전자이식 마우스의 유사성 및 공지된 CS 후보 유전자와의 Nell-1의 관련성은 CS 연구에 대한 새로운 통찰력을 제공한다. 봉합 폐쇄 및 골 형성에서의 Nell-1의 조절 및 메커니즘의 추가의 조사는 CS에서의 조기 봉합 폐쇄에 이르게 하는 일련의 작용에 대한 본 출원인의 이해를 잠재적으로 가속시킬 수 있다.
참고 문헌
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Claims (41)

  1. Nell-1의 발현 또는 활성을 변화시키는 것을 포함하여, 두개관 골모세포 분화 및 무기질화를 조절하는 방법으로서, Nell-1의 증가된 발현 또는 활성이 골모세포 분화 또는 무기질화를 증가시키고, Nell-1의 감소된 발현 또는 활성이 골모세포 분화 또는 무기질화를 감소시키는 것인 두개관 골모세포 분화 및 무기질화를 조절하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, Nell-1 발현 또는 활성이 항-Nell-1 안티센스 분자, Nell-1 특이적 리보자임, Nell-1 특이적 촉매 DNA, Nell-1 특이적 RNAi, 항-Nell-1 인트라보디(intrabody) 및 특정 표적 세포 및/또는 조직에서 Nell-1을 녹아웃시키는 유전자 요법으로 구성된 군으로부터 선택된 방법에 의해 억제됨을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1항에 있어서, Nell-1 발현 또는 활성이 세포를 Nell-1을 발현시키는 외인성 핵산으로 트랜스펙션시키는 방법 및 세포를 Nell-1 단백질로 트랜스펙션시키는 방법으로 구성된 군으로부터 선택된 방법에 의해 증가됨을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 2항에 있어서, Nell-1 발현 또는 활성이 비정상적 두개 봉합 발달을 겪고있는 포유류에서 억제됨을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 4항에 있어서, 비정상적 두개 봉합 발달이 두개골조기유합증(CS)을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  6. 외인성 Nell-1을 포유류에 투여하거나 포유류에서 내인성 Nell-1의 발현 또는 활성을 증가시키는 것을 포함하여, 포유류에서 잠복성 TGF-β1 활성화를 촉진하는 방법.
  7. 외인성 Nell-1을 포유류에 투여하거나 포유류에서 내인성 Nell-1의 발현 또는 활성을 증가시키는 것을 포함하여, 포유류에서 TGF-β 수퍼패밀리의 일원을 활성화시키거나 격리시키는 방법.
  8. NELL-1 유전자를 함유하는 시험 세포를 시험 작용제와 접촉시키고,
    대조 세포에서의 NELL-1 유전자의 발현 또는 Nell-1의 활성과 비교하여 시험 세포에서의 NELL-1 유전자의 발현 수준 또는 Nell-1의 활성의 변화를 검출하는 것을 포함하여, 골모세포 분화를 조절하는 작용을 스크리닝하는 방법으로서, 시험 세포에서의 NELL-1의 발현 수준 또는 Nell-1의 활성의 차이가 상기 작용제가 골 무기질화를 조절하는 것을 나타내는 골모세포 분화를 조절하는 작용을 스크리닝하는 방법
  9. 제 8항에 있어서, 대조군이 시험 세포 보다 저농도로 시험 작용제와 접촉하는 음성 대조 세포임을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 9항에 있어서, 저농도가 시험 작용제가 존재하지 않는 것임을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 8항에 있어서, 대조군이 시험 세포 보다 고농도로 시험 작용제와 접촉하는 양성 대조 세포임을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 8항에 있어서, NELL-1 활성의 조절제의 데이터베이스 또는 골 무기질화의 조절제의 데이터베이스에서 NELL-1 핵산 또는 NELL-1 단백질의 발현을 변화시키는 시험 작용제를 기록하는 것을 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 8항에 있어서, nell-1의 발현 수준이 상기 세포에서 NELL-1 mRNA의 수준을 측정함으로써 검출됨을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 13항에 있어서, NELL-1 mRNA의 수준이 NELL-1 핵산에 특이적으로 하이브리드화되는 프로브에 상기 mRNA를 하이브리드화시킴으로써 측정됨을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 14항에 있어서, 하이브리드화가 노던 블롯, nell-1 RNA로부터 유래된 DNA를 사용하는 서던 블롯, 어레이 하이브리드화, 친화성 크로마토그래피, 및 인 시튜 (in situ) 하이브리드화로 구성된 군으로부터 선택된 방법에 따라 수행됨을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 15항에 있어서, 프로브가 프로브의 어레이를 형성하는 다수의 프로브의 일원임을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 13항에 있어서, NELL-1 mRNA의 수준이 핵산 증폭 반응을 사용하여 측정됨을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 8항에 있어서, NELL-1의 수준이 상기 생물학적 샘플에서 NELL-1 단백질의 발현 수준을 측정함으로써 검출됨을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 18항에 있어서, 검출이 모세관 전기영동, 웨스턴 블롯, 질량 분광분석, ELISA, 면역크로마토그래피, 및 면역조직화학으로 구성된 군으로부터 선택된 방법에 의해 수행됨을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 8항에 있어서, 세포가 체외에서 배양됨을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 8항에 있어서, 시험 작용제가 항체가 아님을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 8항에 있어서, 시험 작용제가 단백질이 아님을 특징으로 하는 방법.
  23. Msx2 및/또는 Cbfa1의 발현 또는 활성을 변화시키는 것을 포함하여, 포유류 세포에서 Nell-1 발현을 변화시키는 방법.
  24. 제 23항에 있어서, Nell-1 발현 또는 활성을 상향조절하기 위해 Cbfa1 발현 또는 활성을 상향조절하는 것을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 23항에 있어서, Nell-1 발현 또는 활성을 하향조절하기 위해 Msx2 발현 또는 활성을 상향조절하는 것을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  26. Cbfa1 및/또는 Msx2 유전자를 함유하는 시험 세포를 시험 작용제와 접촉시키고,
    대조 세포에서의 Cbfa1 및/또는 Msx2 유전자의 발현 또는 Cbfa1 및/또는 Msx2의 활성과 비교하여 시험 세포에서의 Cbfa1 및/또는 Msx2 유전자의 발현 수준 또는 Cbfa1 및/또는 Msx2의 활성의 변화를 검출하는 것을 포함하여, Nell-1 발현 또는 활성을 조절하는 작용제를 스크리닝하는 방법으로서, 시험 세포 및 대조 세포에서의 Cbfa1 및/또는 Msx2의 발현 수준 또는 Cbfa1 및/또는 Msx2의 활성의 차이가 상기 작용제가 Nell-1 발현 또는 활성을 조절하는 것을 나타내는 Nell-1 발현 또는 활성을 조절하는 작용제를 스크리닝하는 방법.
  27. 제 26항에 있어서, 대조군이 시험 세포 보다 저농도로 시험 작용제와 접촉하는 음성 대조 세포임을 특징으로 하는 방법.
  28. 제 27항에 있어서, 저농도가 시험 작용제가 존재하지 않는 것임을 특징으로 하는 방법.
  29. 제 26항에 있어서, 대조군이 시험 세포 보다 고농도로 시험 작용제와 접촉하는 양성 대조 세포임을 특징으로 하는 방법.
  30. 제 26항에 있어서, NELL-1 활성의 조절제의 데이터베이스 또는 골 무기질화의 조절제의 데이터베이스에서 Cbfa1 및/또는 Msx2 유전자의 발현 또는 Cbfa1 및/또는 Msx2의 활성을 변화시키는 시험 작용제를 기록하는 것을 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
  31. 제 26항에 있어서, nell-1의 발현 수준이 상기 세포에서 Cbfa1 및/또는 Msx2 mRNA의 수준을 측정함으로써 검출됨을 특징으로 하는 방법.
  32. 제 31항에 있어서, Cbfa1 및/또는 Msx2 mRNA의 수준이 Cbfa1 및/또는 Msx2 핵산에 특이적으로 하이브리드화되는 프로브에 상기 mRNA를 하이브리드화시킴으로써 측정됨을 특징으로 하는 방법.
  33. 제 32항에 있어서, 하이브리드화가 노던 블롯, Cbfa1 및/또는 Msx2 RNA로부터 유래된 DNA를 사용하는 서던 블롯, 어레이 하이브리드화, 친화성 크로마토그래피, 및 인 시튜 하이브리드화로 구성된 군으로부터 선택된 방법에 따라 수행됨을 특징으로 하는 방법.
  34. 제 33항에 있어서, 프로브가 프로브의 어레이를 형성하는 다수의 프로브의 일원임을 특징으로 하는 방법.
  35. 제 31항에 있어서, Cbfa1 및/또는 Msx2 mRNA의 수준이 핵산 증폭 반응을 사용하여 측정됨을 특징으로 하는 방법.
  36. 제 26항에 있어서, Cbfa1 및/또는 Msx2의 수준이 상기 생물학적 샘플에서 Cbfa1 및/또는 Msx2 단백질의 발현 수준을 측정함으로써 검출됨을 특징으로 하는 방법.
  37. 제 36항에 있어서, 검출이 모세관 전기영동, 웨스턴 블롯, 질량 분광분석, ELISA, 면역크로마토그래피, 및 면역조직화학으로 구성된 군으로부터 선택된 방법에 의해 수행됨을 특징으로 하는 방법.
  38. 제 26항에 있어서, 세포가 체외에서 배양됨을 특징으로 하는 방법.
  39. 제 26항에 있어서, 시험 작용제가 항체가 아님을 특징으로 하는 방법.
  40. 제 26항에 있어서, 시험 작용제가 단백질이 아님을 특징으로 하는 방법.
  41. Nell-1 단백질을 엔코딩하는 핵산, Nell-1 단백질 및 Nell-1 단백질의 발현 또는 활성을 변화시키는 작용제로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 활성제; 및
    약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약제학적 제형.
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