JP2002508173A

JP2002508173A - 軟部組織細胞の組織に適切な表現型を維持または回復するための方法。

Info

Publication number: JP2002508173A
Application number: JP2000539059A
Authority: JP
Inventors: クーバーティー．サンパス，; チャールズエム．コーエン，; 栄一大枝; 浩平宮園; 正博川畑
Original assignee: クリエイティブバイオモレキュールズ，インコーポレイテッド
Priority date: 1997-12-17
Filing date: 1998-12-16
Publication date: 2002-03-19
Also published as: EP1040126A2; AU2003257871A1; CA2314821A1; AU1921899A; AU763488B2; WO1999031136A3; WO1999031136A2

Abstract

(57)【要約】疾患の哺乳動物軟部組織細胞、損傷を受けた哺乳動物軟部組織細胞、もしくは加齢した哺乳動物軟部組織細胞の組織に適切な表現型を維持または回復するための方法、および内因性モルフォゲン発現のレベルの低下により特徴付けられる障害を処置するための方法。本発明の方法は、表現型特異的タンパク質発現のモルフォゲン活性化調節経路の任意の１つまたはいくつかの局面を操作するために役立つ。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本願は、１９９７年１２月１７日出願の米国仮出願番号６０／０６９，９３１
および１９９８年１２月１日出願の米国仮出願番号６０／１１０，４９８の利益
を主張する。

【０００２】（発明の分野）本発明は一般的に、軟部組織細胞における組織に適切な表現型を維持または回
復するための方法に関する。より詳細には、本発明は疾患の軟部組織、損傷を受
けた軟部組織、もしくは加齢した軟部組織の組織に適切な表現型を、表現型特異
的タンパク質発現に導く調節経路を操作することによって維持または回復するた
めの方法に関する。

【０００３】（発明の背景）多数の因子が細胞の増殖、分化、および維持に影響を及ぼすことが公知である
。増殖因子および分化因子の中で最も重要な群の１つは、軟骨内骨形態形成を誘
導する能力により最初に同定された、骨形態発生タンパク質ファミリーのメンバ
ーを含むＴＧＦβファミリー（特にモルフォゲン）のメンバーである。しかし、
それらは現在、一般的に組織における増殖および分化を維持し得る、一般的な増
殖因子および分化因子の群のうちの１つとして認識されている。さらに、モルフ
ォゲンは細胞性アポトーシスに関連している。

【０００４】本明細書で使用される場合、用語「モルフォゲン」、「骨モルフォゲン」、「
骨形態形成タンパク質」、「ＢＭＰ］、「形態発生タンパク質」および「形態形
成タンパク質」は全て、ヒト骨形成タンパク質１（ｈＯＰ−１）により代表され
るタンパク質のクラスを含む。ｈＯＰ−１についてのヌクレオチド配列およびア
ミノ酸配列は配列番号７に示される。記載の平易化のため、ｈＯＰ−１はモルフ
ォゲンを代表するものである。ＯＰ−1は真の組織モルフォゲンのＴＧＦ−βサブクラスを単に代表するものであることが理解され、そしてこの記載を限定する
ことは意図されない。好ましいモルフォゲンは、ｈＯＰ−１のＣ末端の７つのシ
ステインドメインと少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性、または好ましくは
少なくとも７０％のアミノ酸配列相同性を共有するモルフォゲンである。他の公
知でありかつ有用なモルフォゲンは、哺乳動物骨形成タンパク質−１（ＯＰ−１
（ＢＭＰ−７としてもまた公知）、およびＤｒｏｓｏｐｈｉｌａホモログ６０Ａ
）、骨形成タンパク質−２（ＯＰ−２（ＢＭＰ−８としてもまた公知））、骨形
成タンパク質−３（ＯＰ−３）、ＢＭＰ−２（ＢＭＰ−２ＡまたはＣＢＭＰ−２
Ａとしてもまた公知）、およびＤｒｏｓｏｐｈｉｌａホモログＤＰＰ）、ＢＭＰ
−３、ＢＭＰ−４（ＢＭＰ−２ＢまたはＣＢＭＰ−２Ｂとしてもまた公知）、Ｂ
ＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ならびにそのマウスのホモログであるＶｇｒ−１、ＢＭ
Ｐ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１２、ＧＤＦ３（Ｖｇｒ２とし
てもまた公知）、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−９、ＧＤＦ−１０、ＧＤＦ−１１、ＧＤ
Ｆ−１２、ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ−１４、ＢＭＰ−１５、ＧＤＦ−５（ＣＤＭＰ
−１またはＭＰ５２としてもまた公知）、ＧＤＦ−６（ＣＤＭＰ−２としてもま
た公知）、ＧＤＦ−７（ＣＤＭＰ−３としてもまた公知）、Ｘｅｎｏｐｕｓホモ
ログであるＶｇｌおよびＮＯＤＡＬ、ＵＮＩＶＩＮ、ＳＣＲＥＷ、ＡＤＭＰなら
びにＮＥＵＲＡＬ、そして任意のそれらの形態発生的に活性なアミノ酸改変体（
例えば、保存的置換改変体）を含むが、それらに限定されない。代表的には、そ
れらのモルフォゲンはインビボでの骨のアッセイにおいて軟骨内の骨形成を刺激
する能力、またはＮＧ１０８−１５ニューロン細胞培養においてＮ−ＣＡＭもし
くはＬ１アイソフォーム産生を刺激する能力のような機能的特徴を共有する。米
国特許第４，９６８，５９０号；Ｓａｍｐａｔｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８０：６５９１−６５９５（１９８３）を参照のこと（
これらは、本明細書において参考として援用される）。モルフォゲンを同定する
際に有用な、モルフォゲン活性についての他の機能的アッセイは、当該分野にお
いて公知である。

【０００５】モルフォゲンは、共通の構造的特徴を共有する分泌ペプチドを含む。代表的に
は、成熟形態のタンパク質は、前駆体である「プロ（ｐｒｏ−）形態」からプロ
セスされる。成熟形態は、保存されたパターンのシステインを含有する、およそ
９７〜１０６アミノ酸を有するカルボキシ末端活性ドメインを含むダイマーであ
る。活性形態は、ジスルフィド結合したホモダイマーまたはヘテロダイマーのい
ずれかである。例えば、Ｍａｓｓａｇｕｅ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．ＣｅｌｌＢｉ
ｏｌ．６：５９７（１９９０）；Ｓａｍｐａｔｈら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
２６５：１３１９８（１９９０）を参照のこと。モルフォゲンは構造において有
意な相同性および類似性を有するが、形態発生タンパク質遺伝子内の改変体は、
例えば、前駆体細胞増殖の刺激、組織特異的もしくは組織で好適な表現型の維持
、および／または分化率の刺激もしくは調節、高代謝回転により特徴付けられる
組織細胞の増殖もしくは複製を含む特定の組織において、特異的な役割を有し得
る。

【０００６】タンパク質のＴＧＦ−βスーパーファミリーの形態発生的活性は、適切で形態
発生的に寛容な環境における組織形態形成の発生的なカスケードを開始および維
持することを可能にする。これは幹細胞を組織特異的様式において増殖および分
化するよう刺激し、そして最終的に新しい組織形成となる事象の進行を誘導する
。詳細には、モルフォゲンは、形態発生的に寛容な環境において、少なくとも以
下のように生物学的に機能し得る：前駆体細胞の増殖を刺激すること；前駆体細
胞の分化を刺激すること；分化した細胞の増殖を刺激すること；および分化した
細胞の増殖および維持を支持すること（これらは、形質転換細胞の「再分化」を
含む）。

【０００７】これらの形態発生的活性はまた、このタンパク質が、疾患、損傷、または加齢
に起因する表現型を変更するために以前に誘導されて方向付けられた細胞の「再
分化」を刺激することを可能にする。モルフォゲンは、疾患の組織、損傷を受け
た組織、または加齢した組織の置換において、特に、その損傷を受けた組織が正
常な組織または器官の機能を干渉する場合において、有用である。例えば、増加
したモルフォゲン発現は、気腫から生じる損傷を受けた肺組織；損傷を受けた腎
細胞；肝硬変細胞；損傷を受けた心臓または血管；潰瘍またはその修復から生じ
る損傷を受けた胃組織；損傷を受けた神経組織（例えば、発作から生じる）また
はニューロパシー（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン
舞踏病、および多発性硬化症）；損傷を受けた骨格または整形外科組織；あるい
は疾患または機械的損傷もしくは傷害から生じ得るような損傷を受けた象牙質お
よび歯周組織の修復を誘導する。さらに、モルフォゲンは疾患の軟部組織細胞、
損傷を受けた軟部組織細胞、または加齢した軟部組織細胞から生じる症状（例え
ば、ニューロパシー痛を含む、痛み）を処置する際に有用である。

【０００８】モルフォゲンは、表現型特異的遺伝子産物の発現を生じる細胞内カスケードを
誘導するように作用する。そのような遺伝子産物は、構造タンパク質、酵素など
を含む表現型を維持、増強、もしくは回復するのに必要または十分なタンパク質
を含む。一般的には、モルフォゲンは特異的なＩ型および／またはＩＩ型膜貫通
レセプター（各レセプターは、代表的にはセリン／トレオニンキナーゼと結合し
ている）についてのリガンドとして作用する。一般的なシナリオにおいて、リガ
ンド結合の後、ＩＩ型レセプターは隣接するＩ型レセプターをリン酸化する。そ
の活性化されたＩ型レセプターは、Ｓｍａｄタンパク質ファミリーの特定のメン
バーを認識し、少なくともカルボキシ末端セリン残基でそれらをリン酸化する。
８つの異なるＳｍａｄタンパク質が、哺乳動物において同定されている。これら
は、経路を制限されるＳｍａｄ（Ｒ−Ｓｍａｄ）、一般的メディエータＳｍａｄ
（ｃｏ−Ｓｍａｄ）、および阻害性Ｓｍａｄ（ａｎｔｉ−Ｓｍａｄ）を含む３つ
のサブグループに分類される。Ｒ−ＳｍａｄはＩ型レセプターにより直接活性化
されｃｏ−Ｓｍａｄと複合体を形成し、そして核内に移行する。Ｓｍａｄヘテロ
マーはＤＮＡに直接結合し、そしてまた他のＤＮＡ結合タンパク質と結合し、従
って標的遺伝子の転写を調節する。Ｓｍａｄ１、５、および８はＢＭＰレセプタ
ーにより活性化され、そしてＳｍａｄ２および３はＴＧＦ−βおよびアクチビン
レセプターにより活性化される。Ｓｍａｄ４はｃｏ−Ｓｍａｄとして機能する。
Ｓｍａｄ６およびＳｍａｄ７は構造に関して他のＳｍａｄと関連性が低く、そし
てａｎｔｉ−Ｓｍａｄとして作用する。

【０００９】Ｓｍａｄ１、Ｓｍａｄ２、Ｓｍａｄ３、およびＳｍａｄ５タンパク質は、Ｓｍ
ａｄ間でより分岐する領域によって連結される、保存されたアミノ末端ドメイン
およびカルボキシ末端ドメインからなる。カルボキシ末端ドメインは、エフェク
ター機能を有する。アミノ末端ドメインは、カルボキシ末端ドメインと物理的に
相互作用し（このエフェクター機能を阻害）、ＤＮＡ結合に寄与する。カルボキ
シ末端ドメインの末端のセリン残基の、レセプターに媒介されるリン酸化は、ア
ミノ末端ドメインの阻害作用からカルボキシル末端ドメインを開放する。リン酸
化されたＳｍａｄ分子は、少なくとも１つの他の特異的なＳｍａｄファミリー分
子とヘテロマー複合体を形成する。次いで、生じたＳｍａｄ複合体は細胞核に移
行し、蓄積する。ヘテロマーＳｍａｄ複合体は、単独またはＤＮＡ結合タンパク
質（例えば、フォークヘッド（ｆｏｒｋｈｅａｄ）アクチビンシグナルトランス
デューサー−１（ＦＡＳＴ１））との特異的な相互作用のいずれかによって転写
応答を制御する。

【００１０】ＯＰ−１またはＢＭＰ−２の活性化経路についての特定の参照とともに図２に
示すように、モルフォゲンは、Ｉ型およびＩＩ型レセプターに対するリガンドで
ある。ＩＩ型レセプターは、Ｉ型レセプターをリガンド結合に対してトランスリ
ン酸化する構成的に活性なキナーゼを含む。ＩＩ型レセプターによるＩ型レセプ
ターのリン酸化に続いて、Ｉ型レセプターは、Ｓｍａｄ１のホモ二量体を特異的
にリン酸化する。Ｉ型レセプターはまた、Ｓｍａｄ５のホモ二量体を特異的にリ
ン酸化する。次いで、ホモ二量体は分離し（リン酸化されたＳｍａｄ４分子との
会合において）、少なくともＳｍａｄ１およびＳｍａｄ４を含むリン酸化された
ヘテロマー複合体を形成する。あるいは、リン酸化されたＳｍａｄ１／Ｓｍａｄ
５／Ｓｍａｄ４ヘテロ三量体を形成し得る。次いで、ヘテロマー複合体は、核に
移行し、核内で蓄積する。核内において、このＳｍａｄ複合体は、単独または特
定のＤＮＡ結合タンパク質（図２のＸ−タンパク質）との会合のいずれかで、オ
ペレーターＤＮＡと結合し、ＤＮＡ転写を開始する。「Ｘ−タンパク質」はＤＮ
Ａ結合タンパク質として作用し、Ｓｍａｄヘテロマー複合体をＤＮＡに結合する
。内因性のモルフォゲンの発現を導く経路は、上記に記載されるＳｍａｄヘテロ
マー複合体がモルフォゲンをコードする遺伝子の転写を誘導する経路に類似する
。他の細胞内経路はモルフォゲンによって誘導され、本明細書に記載される様式
で影響され得る。

【００１１】病的な軟部組織細胞、傷害性の軟部組織細胞、または加齢の軟部組織細胞は、
部分的に、形態発生タンパク質、特にＯＰ−１の内因性発現の減少によって特徴
付けられる。形態発生タンパク質の内因性発現の減少は、細胞に組織に不適切な
表現型（極端な場合、細胞死を生じる）を呈する脱分化を引き起こす。例えば、
脳の黒質における細胞は、アルツハイマー病を患う患者において進行性の機能障
害を生じる。同様に、肝臓細胞は、アルコール乱用または他の原因に起因してそ
れらの表現型を失い得る（すなわち、硬変を生じる）。従って、当該分野におい
て、組織に適切な表現型を維持または回復するために、病的細胞、傷害性細胞、
または加齢細胞を刺激する方法が必要とされる。

【００１２】（発明の要旨）現在、細胞表現型の保存および維持が、増殖因子および分化因子によって正常
に調節される経路の活性化によって成し遂げられることが知られている。さらに
、現在、それらの経路の阻害が、適切な表現型を保存または誘導するためのさら
なる方法として認識される。

【００１３】通常の表現型は、発生的な合図（ｃｕｅ）だけではなく、種々の内因性の増殖
因子によっても制御される。しかし、疾患、損傷、または加齢は、正常細胞の表
現型を導く遺伝子の発現を調節する、増殖因子および分化因子の能力に関する細
胞機能の１つ以上の局面に影響し得る。例えば、慢性変性疾患は、生化学的機能
障害だけではなく、冒された組織の失われた細胞を置換する能力の無力化を生じ
得る。

【００１４】本発明は、種々の細胞内経路の作用を介した表現型効果の活性化工程および制
御工程を含む。このようにして、モルフォゲン活性化経路は、組織増殖および組
織分化を調節し得る方法の例として使用される。しかし、本明細書に開示される
方法は、任意の増殖因子および分化因子によって正常に調節される任意の細胞内
経路での作用を介した表現型の修復および／または維持に有用である。

【００１５】従って、本発明は、軟部組織細胞における組織に適切な表現型を維持または保
存するための方法を提供する。本発明の方法に従って、組織に適切な表現型は、
表現型特異的タンパク質の内因性発現の増加によって、維持または保存される。
好ましい実施態様において、内因性の表現型特異的タンパク質の発現は、そのよ
うなタンパク質をコードする遺伝子の発現を調節する細胞内制御経路を操作する
ことによって増加される。従って、本発明の方法は、増殖因子および維持因子（
例えば、モルフォゲン）が、表現型特異的タンパク質（例えば、表現型の保存、
回復、または増強に関連するタンパク質）の発現を誘起する細胞内経路の少なく
とも１部分と相互作用する組成物の投与工程を含む。このような方法はまた、細
胞を内因性の増殖因子産物および維持因子産物が刺激される経路に相互作用する
組成物に曝露し、その結果、細胞の増殖因子発現および維持因子発現の増加を刺
激する工程を含む。好ましい実施態様において、本発明の方法は、所定の細胞ま
たは細胞集団において欠損している細胞生物学的構成成分を検出する工程、次い
で、経路の活性化または阻害を標的する工程を包含し、この結果は、欠損してい
る構成成分の補強または修復である。

【００１６】本発明の方法は、表現型特異的遺伝子産物の発現を正常に導く経路の１つ以上
の構成成分の内因性刺激を含む。特定の表現型特異的遺伝子の発現は、特定経路
の調節の直接的または即時性の結果であり得るか、あるいはこのような調節から
生じる１つ以上の任意の生化学的効果の結果であり得る。例えば、特定経路の調
節は、表現型特異的遺伝子産物の増加された発現を究極的に生じる、異なる制御
経路を順々に活性化し得る、ＯＰ−１の内因性発現の増加を生じる。原型の経路
を図２に示す。図に見られるように、レセプターの結合は、細胞内キナーゼを活
性化し、Ｓｍａｄと呼ばれる細胞内メッセンジャー分子のリン酸化を引き起こす
。このＳｍａｄは特徴付けられており、当該分野に公知である（例えば、Ｂａｋ
ｅｒら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．，７：４６７−４７３
（１９９７）（本明細書中で参考として援用する）を参照のこと）。リン酸化に
よって種々のＳｍａｄサブタイプは複合体を形成し、次いで、核内に移行する。
いったん核内に移行すると、自身または転写活性化因子と関連してのいずれかに
おけるＳｍａｄ複合体は、直接的または間接的にのいずれかで、刺激された細胞
の特徴である特異的遺伝子産物の発現を調節する。このような遺伝子産物の１つ
はモルフォゲン自身である。従って、この経路は、モルフォゲンの発現に対する
陽性のフィードバックとしての役割を果たし得、従って、表現型特異的遺伝子の
発現を生じる他の経路に影響し得る。

【００１７】本発明の方法はまた、正常の細胞表現型を縮小する細胞構成成分の効果を阻害
するために使用され得る。任意の特異的な細胞構成成分が細胞表現型を増強また
は縮小するかどうかは、局所的な環境、発育状態、および細胞の疾患／損傷状態
に依存する。例えば、創傷治癒の間、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ
−β）は、線維形成を介して瘢痕組織の形成を促進する。創傷治癒の研究におい
て、モルフォゲンはこの効果を相殺することが示された。特殊な２つのＳｍａｄ
タンパク質、Ｓｍａｄ６およびＳｍａｄ７は、ＴＧＦ−βを阻害することも示さ
れた。従って、１つに実施態様において、本発明の方法は、創傷治癒部位でＴＧ
Ｆ−βを阻害するためにＳｍａｄ６／Ｓｍａｄ７を活性化する工程を包含する。
モルフォゲンに誘導される細胞内経路のさらなる活性化は、さらに、治癒ならび
に創傷部位での正常細胞の提示を促進する。本発明の方法に基づく制御の正確な
性質は、組織の存在する環境、組織の加齢、および組織の疾患または損傷状態に
依存する。しかし、本明細書に記載されるようなモルフォゲンに誘導される経路
の活性化は、正常な表現型の修復および維持を生じる。生化学的機能にわたる正
確な制御は、加齢、疾患、および／または損傷によって有害な作用を及ぼしてい
る特定の経路を標的化することによって達成される。

【００１８】他の局面において、本発明は、内因性の表現型特異的タンパク質のレベルを増
加するための方法を提供し、細胞制御経路のいくつかの部分を制御する低分子を
導入して、表現型特異的なタンパク質の発現または活性の効果的な増加を生じる
工程を包含する。これは、表現型特異的タンパク質の内因性発現の増加の刺激か
ら生じる得るか、あるいは正常（適切な発達および解剖学的な含有量）な表現型
のインヒビターの発現または阻害活性の減少から生じ得るかのいずれかである。
例えば、低分子は、Ｉ型またはＩＩ型モルフォゲンレセプター；あるいはセリン
／トレオニンキナーゼ、またはそれらのレセプターの他のキナーゼドメインで作
用し得る。経路活性化の別の標的は、単量体形態、二量体（ヘテロマー複合体お
よびホモマー複合体を含む）形態、または三量体（ヘテロマー複合体およびホモ
マー複合体を含む）形態を含むＳｍａｄタンパク質である。あるいは、転写因子
（例えば、図２に示されるＸ−タンパク質）の活性化は、表現特異的な発現を導
く。低分子はまた、１つまたはいくつかの任意の以下を促進し、模倣し、または
所望であれば妨害し得る：Ｉ型および／またはＩＩ型レセプター結合、Ｉ型レセ
プターのリン酸化、Ｓｍａｄ分子のリン酸化、Ｓｍａｄ複合体の形成、Ｓｍａｄ
の核内への移行、Ｓｍａｄ複合体の核内蓄積、またはＳｍａｄ複合体の転写調節
。さらに、低分子はＳｍａｄまたはＳｍａｄ複合体に作用し、三次構造を変化さ
せ得、その結果、ＳｍａｄまたはＳｍａｄ複合体の、レセプターキナーゼドメイ
ン、他のＳｍａｄ、ＤＮＡ結合タンパク質、またはＤＮＡ自身との相互作用を促
進または阻害する。

【００１９】特に好ましい実施態様において、低分子は患者に投与され、ここで低分子は、
表現型特異的遺伝子の発現を促進するように、Ｓｍａｄ複合体の形成を促進する
（特に、Ｓｍａｄ１、Ｓｍａｄ２、Ｓｍａｄ３、Ｓｍａｄ４、Ｓｍａｄ５、およ
び／またはＳｍａｄ８の分子を含む複合体）。好ましい実施態様において、方法
はまた、モルフォゲンＩ型またはＩＩ型レセプターに会合するセリン／トレオニ
ンキナーゼドメインを活性化する組成物の投与、その結果、モルフォゲン誘導遺
伝子の発現に関連する経路を活性化する工程を包含する。別の実施態様において
、本発明の方法は、Ｓｍａｄ１に会合するＳｍａｄ４の活性化し、その結果、モ
ルフォゲン応答性の表現型遺伝子の発現を誘導する工程を包含する。本発明の方
法はまた、Ｓｍａｄと、表現型特異的遺伝子の発現のプロモーター（すなわち、
表現型タンパク質に対する遺伝子の発現；表現型の保存、回復、または増強に関
連するタンパク質（特徴的な脂質または炭水化物のような非タンパク質の表現型
マーカーの産生に決定的なタンパク質を含む）；表現型機能または表現型形態の
性能に関連するタンパク質；またはモルフォゲン）のような特定の核酸との相互
作用を促進し得る。このような相互作用は、例えば、遺伝子の制御領域、および
同時に、Ｓｍａｄ複合体のような１つ以上の制御タンパク質に結合し得る転写制
御因子に関連し得る（図２を参照のこと）。本明細書で使用されるように、表現
型特異的遺伝子の発現またはモルフォゲンに誘導される遺伝子の発現は、モルフ
ォゲンの制御化にある遺伝子の発現、または正常かつ健常な細胞においてモルフ
ォゲンによって制御され得る遺伝子の発現をいう。

【００２０】本発明の別の局面は、表現型の増強、保存、または回復は、モルフォゲンＩ型
またはＩＩ型レセプターでアゴニストとして作用する低分子を提供し、その結果
、表現型特異的遺伝子の発現またはモルフォゲンの発現を導く経路の活性化を刺
激することによって達成され得る。

【００２１】本発明の方法はまた、モルフォゲンに誘導される表現型特異的タンパク質の発
現の阻害を減少し得る低分子を含む組成物の投与工程を包含する。モルフォゲン
の阻害は、白血病阻害因子またはサイトカインのような内因性の阻害性化合物の
形態であり得るか、または外因的に供されるインヒビターの形態であり得る。さ
らに、Ｓｍａｄ６および／またはＳｍａｄ７は、表現型特異的タンパク質の発現
の制御経路に対して阻害活性を有する。従って、本発明の方法はまた、Ｓｍａｄ
６および／またはＳｍａｄ７の活性に影響を与える工程を包含する。

【００２２】本発明は、さらに、モルフォゲン発現のレベル減少で特徴付けられる軟部組織
の障害を処置するための方法を提供する。軟部組織細胞の脱分化を生じるモルフ
ォゲン発現のレベル減少で特徴付けられる障害としては以下が挙げられる：気腫
により生じる肺損傷；腎臓の硬変または肝組織の硬変；筋組織の損傷；心筋症お
よび／またはアテローム血栓症の発作もしくは心塞栓性の発作に起因し得るよう
な、損傷を受けた心臓または血管の組織；潰瘍性穿孔またはその修復に起因する
胃または腸組織の損傷：ならびに発作または神経障害（例えば、アルツハイマー
病、パーキンソン病、ハンティングトン舞踏病、または多発性硬化症）のような
物理的傷害または化学的傷害、あるいは上記のいずれかに関連する神経障害性の
疼痛または他の疼痛に起因し得る神経組織の損傷（視覚および聴覚組織を含む）
。本発明の方法は、軟部組織細胞の疾患、損傷、または加齢を有する組織部位に
、表現型特異的遺伝子の発現を導く経路に影響する低分子を投与する工程を含み
得るか、または外因性の形態発生タンパク質もしくはそのアゴニストを投与する
工程を含み得る。このタンパク質またはそのアゴニストとしては、モノマー、ダ
イマー、および／または可溶性の複合体形態（モルフォゲンダイマーに非共有結
合的に会合した１つ以上のモルフォゲンのプロドメインを含む）が挙げられる。
この形態発生のタンパク質を含む組成物は、さらにマトリックスを含み得る。有
用なマトリックス物質としては、コラーゲン、脱無機化された骨、ヒドロキシア
パタイト、生物活性セラミックス、リン酸カルシウムセラミックスまたは上記の
物質のいずれか１つ以上を含む混合物が挙げられる。

【００２３】本発明は、さらに、形態発生のタンパク質発現のレベル減少で特徴付けられる
軟部組織の障害を処置するための方法を提供する。この方法は、モルフォゲンお
よび表現型特異的タンパク質発現の阻害を放出し得る低分子を含む組成物の投与
の工程を包含する。

【００２４】さらなる別の局面では、本発明は、形態発生のタンパク質または表現型特異的
タンパク質の外因性の発現のレベルを上昇させるインビボの方法を提供する。こ
の方法は、形態発生のタンパク質または表現型特異的タンパク質をコードする裸
のＤＮＡまたはｍＲＮＡを、軟部組織細胞の損傷、疾患または加齢の部位に直接
的に投与する工程を包含する。米国特許第５，５８０，８５９号（その教示が参
考として本明細書に援用されている）を参照のこと。別の局面では、本発明は、
形態発生のタンパク質または表現型特異的タンパク質の外因性の発現のレベルを
上昇させるエキソビボの方法を提供する。この方法は、形態発生のタンパク質ま
たは表現型特異的タンパク質をコードするＤＮＡを、軟部組織細胞に導入する工
程、および軟部組織の損傷、疾患または加齢を有する組織部位に、形質転換され
た軟部組織細胞を置く工程を包含する。形態形成のタンパク質または表現型特異
的タンパク質をコードするＤＮＡの軟部組織細胞への導入は、種々の手段および
方法により成し遂げられ得る。この方法および手段には以下が挙げられる：プラ
スミドＤＮＡ；レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、単純ヘ
ルペスウイルス、ＳＶ４０、ポリオーマウイルス、パピローマウイルスおよびピ
コルナウイルスを含むウイルスベクター；リポソームまたはプロテオリポソーム
との境界のＤＮＡまたはそれに被包されたＤＮＡ；リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ
−デキストラン；ポリブレン；ポリシン／ＤＮＡ結合体；あるいはエレクトロポ
レーションまたはマイクロインジェクション。

【００２５】さらに、本発明は、モルフォゲン活性化調節経路を調節することによりアポト
ーシスに影響することによる軟部組織障害の処置のための方法を提供する。アポ
トーシスは、特徴的なクロマチン凝集およびＤＮＡ断片化により表された細胞死
の特有の形態であり、正常な細胞周期の部分として細胞のプログラムされた死を
生じる。しかし、アポトーシスはまた、病理的な刺激により誘導され得る。いく
つかの場合には、遺伝子転写およびタンパク質合成が、アポトーシスの誘導のた
めに必要であり、そしてこの工程は、正常な細胞増殖および分化に関与する遺伝
子のセットにより調節される。

【００２６】アポトーシスは、多数の生理学的および病理学的事象の原因である。例えば、
アポトーシスは、胚形成の際の細胞のプログラムされた破壊（着床、器官形成、
発育の退行を含む）、および変態の原因である。アポトーシスはまた、月経周期
の際の子宮内膜の細胞破壊、閉経における卵胞の閉鎖、および離乳後の授乳乳房
の退行のような、成体におけるホルモン依存性退行の原因である。アポトーシス
はまた、腸管陰窩上皮のような、細胞集団の増殖における細胞欠失において機能
する。さらに、アポトーシスは、最も頻繁には退行中の腫瘍において、また活性
な細胞増殖を有する腫瘍においても、細胞死の原因である。さらに、アポトーシ
スは、サイトカイン枯渇後のＢリンパ球およびＴリンパ球の両方の免疫細胞の死
、ならびに発生中の胸腺における自己反応性Ｔ細胞の欠損の原因である。さらに
、アポトーシスは、去勢後の前立腺萎縮および糖質コルチコイド投与後の胸腺に
おけるリンパ球の損失のようなホルモン依存性の組織の病理的萎縮の原因である
。アポトーシスはまた、細胞性免疫拒絶および対宿主性移植片病のような、細胞
傷害性Ｔ細胞により誘導される管閉塞細胞死の後の実質器官における病理的萎縮
の原因である。さらに、アポトーシスは、例えばウイルス性肝炎（ここで肝臓に
おけるアポトーシス細胞フラグメントは、カウンシルマン小体として公知である
）のような特定のウイルス疾患における細胞傷害において役割を果たす。アポト
ーシスはまた、中度熱傷、放射線、細胞傷害性抗癌薬および潜在的な低酸素（そ
れらは壊死を生じ得るが、低用量の場合は、アポトーシスを誘発する）を含む種
々の傷害性刺激により産生される細胞死の原因である。

【００２７】アポトーシスが誘導される経路は、刺激および細胞型に依存して変化する。ア
ポトーシスの１つの重要な特徴は、遺伝子活性化および新しいタンパク質合成で
の多くの（ただし全てではない）例におけるアポトーシスの依存性である。多数
の遺伝子がアポトーシスを生じる刺激によって誘導され得る（例えば、熱ショッ
クタンパク質および癌原遺伝子）。細胞死を刺激または阻害するアポトーシスに
特異的な遺伝子は記載されている。癌の増殖および原因に関与している特定の遺
伝子（癌遺伝子およびサプレッサー遺伝子）が、アポトーシスの誘導において調
節的役割を果たす。これらの遺伝子には、以下を含む：ホルモンおよびサイトカ
インによって誘導されたアポトーシスを阻害し、従って、細胞生存を延長する癌
遺伝子ｂｃｌ−２；そのタンパク質産生が細胞増殖またはアポトーシスを刺激し
得る癌遺伝子ｃ−ｍｙｃ；通常、アポトーシスを刺激するが、変異したまたは存
在しないときは、細胞生存を支持するｐ５３。しかし、アポトーシスの多くのモ
デルにおいて、新しい遺伝子の発現は必要でなく、そして実際に遺伝子発現の全
くの阻害はアポトーシスを生じる。従って、本発明の方法はまた、モルフォゲン
活性化調節経路を調節することにより軟部組織細胞におけるアポトーシスの促進
または阻害を提供する。

【００２８】本発明の方法は、疾患、傷害または加齢の結果として表現型の機能を減少した
または消失した任意の組織において実行され得る。あるいは、本発明の方法は、
発生中の胚組織において適用可能である。

【００２９】本明細書において記載される好ましい方法および実施例は、例証されるのみで
あり、制限される意図ではない。本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な
説明および請求項の範囲から明白である。

【００３０】（詳細な説明）本発明の方法は、その一部は、軟部組織細胞において組織に適切な表現型を維
持することにおける、モルフォゲンならびに他の増殖因子および分化因子の役割
に依存している。本明細書で用いられる「軟部組織」は、骨および軟骨を除くす
べての哺乳動物組織を含む。モルフォゲン応答性経路の調節は、本明細書におい
て例証される。しかし、増殖および分化の基礎の生物学のため、他の増殖因子誘
導経路は、本明細書で記載された様式で調節されることが意図される。モルフォ
ゲン、特にＯＰ−１の、外因性発現の減少は、細胞の疾患、損傷または加齢の特
有である。本発明の方法は、疾患、損傷または加齢によって脱分化をはじめた、
軟部組織細胞の組織に適切な表現型を維持または回復するために有用である。詳
細には、本発明の方法は、通常、このようなタンパク質発現に影響する調節経路
の操作によって表現型特異的タンパク質発現を増強するために有用である。

【００３１】本発明の方法は、表現型特異的タンパク質（例えば、表現型の保存、修復また
は増強に関連するタンパク質）；表現型機能の能力に関連するタンパク質、また
は健常な細胞の形態学に特有のタンパク質の発現を上昇させるための調節経路の
活性化を含む。外因性のモルフォゲン（例えば、ＯＰ−１）を発現する細胞、お
よび傷害、疾患または加齢により損傷される細胞は、特定の組織特異的な表現型
マーカーを発現する能力を失う。モルフォゲンを発現するためのこのような細胞
の誘導、またはモルフォゲン刺激タンパク質は、特徴的な表現型マーカーの発現
、表現型機能の能力、および正常な（健常な）表現型の形態学の表示により証明
されるように、細胞の表現型を回復する。

【００３２】例えば、肝細胞は大きく、多角体の細胞であり、これは身体の栄養状態に依存
して可変の細胞質形態を有する。肝細胞の核は、大きく、末梢分散型クロマチン
および目立った核を有している。しかしこの核は、サイズが大きく変化する。こ
れは、肝細胞の半分より多くの正常な補体が染色体物質の正常な量の２倍を含み
、いくつかは正常量の４倍または８倍をも含むという事実を反映する。肝細胞は
、一般にグリコーゲン、脂肪および特定のビタミンを貯蔵する表現型機能を実行
する。肝細胞はまた、必要な栄養素を血液に送達するように、常食中の栄養素の
物質を別のものに変換する。例えば、肝細胞は、必要な場合には、タンパク質を
炭水化物に変換し得る。さらに、肝細胞は、特定の産物を無毒化するように変換
および／または抱合する。さらに、肝細胞は、血液において、糖のような特定の
物質の濃度を調節する。肝細胞はまた、アルブミン、フィブリノーゲンおよびグ
ロブリンとして、このような表現型タンパク質を発現する。モルフォゲンは、正
常な機能に特徴的な１つ以上の構造的または生化学的機能を失った肝細胞に健常
な表現型を回復する。一旦、同定されれば、減少された表現型の機能は、表現型
特異的なタンパク質産生を導く経路の活性化により、全体にまたは部分的に、回
復される。代表的には、このような経路はモルフォゲン調節下である。

【００３３】当業者は、他の細胞型に対して、表現型に特異的なマーカー、機能、および形
態学が周知であることを理解する。

【００３４】（低分子媒介のアップレギュレージョン）遺伝子発現を調節する経路は、広範な種々の発生的な刺激および環境的な刺激
により影響される。従ってこれは、それぞれの細胞型がその遺伝子の特有でそし
て特徴的なサブセットを発現すること、ならびに必要な場合、特定の遺伝子産物
の発現を調節することを可能にする。発現制御の重要性は、まさに、遺伝子調節
機構の機能における遺伝されたまたは獲得された欠損がヒトの疾患に広範に寄与
するように、マウスにおける重要な調節分子の標的された破壊が、しばしば強烈
な表現型異常を生じるという事実により強調される。この点において、表現型特
異的な遺伝子の発現を制御し得る低分子の有用性は有利である。モルフォゲン活
性化の調節経路は、例えば、表現型特異的タンパク質の発現を刺激し得る低分子
の投与により調節され得る。

【００３５】低分子は、ＯＰ−１のようなモルフォゲンによる調節経路の活性化を擬態する
モルフォゲンアナログであり得る。低分子のモルフォゲンアナログは、例えば、
本明細書中で参考として援用される、同時係属特許出願、Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０８
／５０７，７５０中で報告されるように同定される。このような擬態の性質を有
する任意の物質は、その化学的または生物化学的な性質にかかわらず、本明細書
中で教示されるようにモルフォゲンアナログとして有用である。本発明のモルフ
ォゲンアナログは、生存系によってか、あるいは化学的または生物化学的な合成
技術を通じて産生される単一物質または複合体物質であり得る。それは、天然で
生じる物質、または例えば、合理的な薬物設計の原理に従って調製された、新規
な物質であり得る。それは、レセプター相互作用に関与する溶媒に曝露されたモ
ルフォゲン表面エピトープに構造的に類似する物質、そうでなければ膜貫通型モ
ルフォゲンレセプターを刺激する物質、またはモルフォゲン応答細胞のシグナル
伝達経路の任意の１つ以上の細胞内の局面と相互作用する細胞膜を浸透する物質
であり得る。例えば、天然で供給されるＯＰ−１またはモルフォゲンアナログは
、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、炭水化物、脂質、アミノ酸、核酸、糖、脂
肪酸、ステロイド、または上記の化合物の任意の１つの誘導体を含み得る。それ
は、真核生物細胞または原核生物細胞の代謝の中間体または最終産物であり得る
。あるいは、このアナログは、生物学的応答修飾因子または毒素であり得る。

【００３６】制限されることなく、本発明の方法において有用なモルフォゲンアナログの１
つの型は、米国特許第５，１３２，４０５号，同第５，０９１，５１３号および
同第５，２５８，４９８号（この教示は、本明細書中に参考として援用される）
に示されるように、生合成の抗体結合部位（ＢＡＢＳ）技術の原理の適用を通じ
て調製され得る。ＢＡＢＳアナログ構築物は、モルフォゲン膜貫通型レセプター
に特異的に結合する、好ましくはハイブリドーマ細胞によって産生された、抗体
から調製される。あるいは、ＢＡＢＳ分析は、モルフォゲン生物学的活性をブロ
ックする抗体の抗原結合部位と特異的に反応する抗イディオタイプ抗体に基づく
。Ｖｕｋｉｃｅｖｉｃら（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ
．１９８：６９３〜７００（１９９４））は、ＯＰ−１特異的モノクローナル抗
体の調製を教示する。当業者は、このような抗体を、本発明のＢＡＢＳアナログ
が調製され得る、抗イディオタイプ抗体の慣用的な調製において、免疫原として
使用し得ることを理解する。

【００３７】モルフォゲンアナログの構造的に異なるクラス（例証のために本明細書中で再
び示されるのであって限定のためではない）は、Ｔｕｅｒｋら、Ｓｃｉｅｎｃｅ
２４９：５０５〜５１０（１９９０）、Ｆａｍｕｌｏｋら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈ
ｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３１：９７９〜９８８（１９９２）およびＢ
ｏｃｋら、Ｎａｔｕｒｅ３５５：５６４〜５５６（１９９２）（各々の教示は
、本明細書中で参考として援用される）に示されるように、定方向の分子進化の
原理の適用を通じて調製され得る。この定方向の分子進化プロセスは、タンパク
質のような選択されたリガンドに高親和性で結合する、核酸分子、代表的にはＲ
ＮＡの単離を含む。このような核酸分子は、当該分野において「アプタマー」と
呼ばれる。この所望のアプタマーは最初、核酸分子の無作為プールに存在し、そ
してリガンド結合核酸のＰＣＲに基づく増幅と交互にリガンド親和性に基づくク
ロマトグラフィーを数回実行することによって単離される。上記のＢｏｃｋら（
１９９２）は、哺乳動物におけるインビボでの使用に適切であり、血液凝固促進
因子、トロンビンを特異的に阻害するアプタマーの調製を実証した。

【００３８】さらに、モルフォゲンアナログの別の構造的に異なるクラスが、無作為ペプチ
ドライブラリーの適切なメンバー（Ｓｃｏｔｔら、（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ
２４９：３８６〜３９０）、あるいは有機化合物または無機化合物のコンビナ
トリアル合成された無作為ライブラリーを選択することによって調製される。Ｎ
ｅｅｄｅｌｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：１０
７００〜１０７０４（１９９３）；Ｏｈｌｍｅｙｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：１０９２２〜１０９２６（１９９３）。当業
者は、生物学的に産生された物質をスクリーニングする伝統的な原理を伴なう、
前述の技術および他の関連技術が、モルフォゲンアナログ活性についてスクリー
ニングするための候補組成物の広範な整列を提供することを理解する。

【００３９】従って、本明細書中で使用されるように、モルフォゲンアナログは、細胞また
は組織において少なくとも１つの「モルフォゲン媒介性生物学的効果」を誘導す
る表現型特異的な遺伝子発現の調節経路のモルフォゲン活性を擬態する物質であ
る。この効果は、組織に適切な表現型の維持または修復を含むがこれらに限定さ
れない、モルフォゲンに曝露するかまたは接触させることから生じる任意の生物
学的効果であり得る。モルフォゲン媒介性生物学的効果は、例えば、同時継続特
許出願Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０８／２６０，６７５および米国特許第５，６５６，５
９３号（この開示は、本明細書中で参考として援用される）に記載されるように
、モルフォゲンの曝露に対する細胞応答および分子応答を含む。従って、モルフ
ォゲン媒介性生物学的効果は、インビトロまたはインビボのいずれであれ、モル
フォゲン応答細胞または組織がモルフォゲンに曝露するかまたはモルフォゲンと
接触することから生じる任意の生物学的効果であることが理解される。本明細書
中の特に目的とするモルフォゲン媒介性生物学的効果は、ＤＮＡ発現調節エレメ
ントに対する細胞内物質の結合の刺激を含む、１つ以上の表現型特異的遺伝子の
発現の刺激を含む。好ましいモルフォゲン媒介性生物学的効果は、分化した表現
型の維持、もしくは再分化の誘導、ならびに／または細胞増殖および細胞分化の
刺激を含む。

【００４０】非常に好ましい実施態様において、この低分子は、通常はモルフォゲンの調節
下である少なくとも１つの細胞内経路に作用する化合物である。このような低分
子は、好ましくは、その活性を刺激または阻害するために、細胞内に侵入し、そ
して１つ以上の細胞内経路の成分を標的とする能力を有する。例えば、Ｓｍａｄ
１と、Ｓｍａｄ４と、Ｓｍａｄ５との間のＳｍａｄ複合体形成を促進する低分子
は、表現型特異的タンパク質をコードする遺伝子の発現に至る経路を刺激する。

【００４１】候補の低分子を同定するための１つの方法は、モルフォゲンの有効な全身濃度
または局所濃度を調節する候補物の能力についてアッセイすることである。これ
は、例えば、モルフォゲンを産生する細胞培養物中で候補物をインキュベートし
、そして米国特許第５，７４１，６４１号および／または米国特許第５，６５０
，２７６号（各々の教示は、本明細書中で参考として援用される）の方法に従っ
て、モルフォゲンの産生レベルにおける変化の指標となるパラメーターについて
この培養物をアッセイすることによって実行され得る。あるいは、候補化合物は
、モルフォゲン活性がない細胞培養物において、表現型特異的なタンパク質の産
生を誘導するそれらの能力についてスクリーニングされる。モルフォゲンまたは
他の表現型特異的タンパク質の産生に関するそれらの効果についてスクリーニン
グされ得る組成物の例は、化学物質、生物学的応答修飾因子（例えば、リンホカ
イン、サイトカイン、ホルモン、またはビタミン）、植物抽出物、微生物ブロス
および真核生物細胞、体液、または組織抽出物で馴化した抽出物培地（ｅｘｔｒ
ａｃｔｍｅｄｉｕｍ）を含むがこれらに限定されない。次いで、有用な候補組
成物が、適切な動物モデルにおいてインビボでの効率について試験され得る。次
いで、これらの組成物は、インビボで使用され、表現型特異的タンパク質の発現
のモルフォゲン活性化調節経路を上方制御し得る。

【００４２】低分子組成物が培養細胞中の表現型特異的タンパク質のレベルにおける変化に
影響したか否かを決定する簡単な方法は、米国特許第５，７４１，６４１号（こ
の開示は、本明細書中で参考として援用される）中で提供される。低分子への曝
露から生じる細胞中の標的表現型特異的タンパク質のレベルを測定する。あるい
は、細胞内経路成分の活性または量の変化を、候補低分子の適用に応じて測定す
る。タンパク質産生または経路調節に関して所望の影響を有する候補物を、本発
明の方法における使用のために選択する。例えば、組成物が、腎臓細胞株による
ＯＰ−１の産生を上方制御する場合、動物モデルにおいてこの化合物の全身投与
を試験し、それがインビボでのＯＰ−１の産生を上方制御するか否かを決定する
ことが所望され得る。身体におけるモルフォゲンのレベルは、広範な範囲の身体
的な状態（例えば、関節炎、気腫、骨粗しょう症、腎疾患、肺疾患、心筋症、お
よび肝硬変を含む疾患を生じるような組織変性）の結果であり得る。身体中のモ
ルフォゲンレベルの減少はまた、加齢の通常のプロセスの結果として生じ得る。
同じストラテジーが、細胞内経路成分に影響する組成物に対して使用される。次
いで、これらのスクリーニング方法により選択された組成物を、処置または予防
として使用する。

【００４３】適切な試験細胞は、検出可能な表現型特異的遺伝子産物をコードするレポータ
ー遺伝子に作動可能に結合されたモルフォゲン応答性転写活性化エレメントを規
定するＤＮＡを含む任意の細胞である。このようなＤＮＡは、試験細胞中で天然
に生じ得るか、またはトランスフェクトされたＤＮＡであり得る。この誘導され
た細胞内効果は、代表的には、上記のような、Ｓｍａｄ活性化、または生化学的
な現象のカスケードの活性化のような、あるいは環状ヌクレオチド、ジアシルグ
リセロール、ならびに／または、そして、組織形態形成の指標である、遺伝子の
転写から生じるｍＲＮＡの誘導および／もしくはｍＲＮＡ転写物の翻訳から生じ
るタンパク質合成の誘導を含む、遺伝子発現の活性化もしくは抑制のような細胞
内シグナル伝達の他の指標を含む、形態発生生物学的活性の特徴である。例示的
なモルフォゲン応答細胞は、好ましくは、哺乳動物起源であり、そして骨形成前
駆細胞；頭蓋冠由来細胞；骨芽細胞；破骨細胞；骨肉腫細胞および肝臓起源また
は神経起源の細胞を含むがこれらに限定されない。任意のこのようなモルフォゲ
ン応答細胞は、誘導される候補物質がモルフォゲンアナログであるか否かを評価
するための適切な試験細胞であり得る。

【００４４】好ましい同定方法は、少なくとも１つの候補物質に試験細胞を曝露し、そして
このような曝露がモルフォゲン応答性転写活性化エレメントに作動可能に結合さ
れた検出可能な表現型特異的遺伝子産物の発現を誘導するか否かを検出すること
によって実行される。この遺伝子産物の発現は、この候補物質がモルフォゲン媒
介性生物学的効果を誘導することを示す。当業者は、本明細書中に提供されるガ
イダンスを考慮して、当該分野で周知である組換えベクターおよびトランスフェ
クション技術を使用して、えり抜きのモルフォゲン応答細胞およびレポーター遺
伝子からの応答エレメントを有する試験細胞を構築し得る。本明細書中で有用で
ある多数の周知のレポーター遺伝子が存在する。これらは、例えば、クロラムフ
ェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、ヒト成長
ホルモン（ｈＧＨ）、β−ガラクトシダーゼ、ならびに市販で入手可能なアッセ
イ系および試薬を含む。当業者によって理解されるように、この列挙したレポー
ター遺伝子は、本明細書中で使用され得る少数の可能性のあるレポーター遺伝子
のみを示す。このようなレポーター遺伝子の例は、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒ
ｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、
ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ、（１９８９）に見出
され得る。広くは、検出可能な産物（例えば、検出可能な酵素活性を有するか、
または特異的な抗体が惹起され得る任意の産物）をコードする任意の遺伝子が、
本同定方法におけるレポーター遺伝子として使用され得る。

【００４５】現在好ましいレポーター遺伝子系は、ホタルルシフェラーゼレポーター系であ
る。Ｇｏｕｌｄら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７：４０４〜４０８（１９８８
）は、本明細書で参考として援用される。このルシフェラーゼアッセイは、高速
および感受性である。このアッセイ系において、試験細胞の溶解物を調製し、そ
してＡＴＰおよび基質のルシフェリンと組合せる。このコードされた酵素のルシ
フェラーゼは、光放出産物を生成するために基質の迅速なＡＴＰ依存性酸化を触
媒する。この総放出光は、測定され、そして広範な範囲の酵素濃度にわたって存
在するルシフェラーゼ量に比例する。ＣＡＴは別の頻繁に使用されるレポーター
遺伝子系である；この系の主要な利点は、それが広範に確証されており、そして
プロモーター活性の測定物として広範に認容されることである。Ｇｏｒｍａｎら
、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２：１０４４〜１０５１（１９８２）は、本明
細書中で参考として援用される。この系において、試験細胞を、ＣＡＴ発現ベク
ターでトランスフェクトし、そして最初のトランスフェクションの２〜３日内に
候補物質とともにインキュベートする。その後、細胞抽出物を調製する。この抽
出物を、アセチルＣｏＡおよび放射性クロラムフェニコールとともにインキュベ
ートする。インキュベーションの後に、アセチル化クロラムフェニコールを薄層
クロマトグラフィーによって非アセチル化型から分離する。このアッセイでは、
アセチル化の程度が、特定のプロモーターを有するＣＡＴ遺伝子活性を反映する
。

【００４６】別の適切なレポーター遺伝子系は、ｈＧＨの免疫性検出に基づく。この系はま
た、使用することが迅速かつ容易である。Ｓｅｌｄｅｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．
Ｂｉｏｌ．６：３１７３〜３１７９（１９８６）は、本明細書中で参考として援
用される。このｈＧＨ系は、発現されたｈＧＨポリペプチドが、細胞抽出物中よ
りも、むしろ培地中でアッセイされるという点で有利である。従って、この系は
、試験細胞の破壊を必要としない。このレポーター遺伝子系の原理は、ｈＧＨに
限定されず、むしろ受容可能な特異性の抗体が利用可能であるかまたは調製され
得る、任意のポリペプチドを用いる使用に適合されることが理解される。

【００４７】低分子組成物は、任意の１つ以上の部位に作用することにより、モルフォゲン
活性化経路をアップレギュレートし得る。例えば、経路の低分子の相乗作用は、
レセプターレベルで開始され得る。経路に依存して、膜貫通レセプターは、Ｉ型
および／もしくはＩＩ型であってもよいし、またはＩ型もしくはＩＩ型のいずれ
かのレセプターの変異体を含んでもよい。例えば、ＯＰ−Ｉは、Ｉ型およびＩＩ
型の両方のレセプターの少なくとも２つの変異体を含む調節経路を活性化し得る
（それぞれＡｃｔＲ−１およびＢＭＰＲ−１Ｂ、そしてＡｃｔＲＩＩおよびＢＭ
ＰＲ−ＩＩ）。低分子は、リガンドとして作用し、そしていずれかのレセプター
と結合することにより経路を刺激し得、それにより、Ｉ型レセプターおよび／ま
たはＳｍａｄ分子のリン酸化を誘導する。同様に、低分子は、レセプターのセリ
ン／スレオニンキナーゼドメインのレベルで、調節経路を活性化し得、それによ
り、Ｉ型レセプターおよび／またはＳｍａｄ分子のリン酸化を刺激する。

【００４８】さらなる代替として、低分子は、Ｓｍａｄ複合体形成のレベルで調節経路を活
性化し得る。低分子は、Ｓｍａｄファミリーのホモダイマー、ヘテロダイマー、
あるいは他のホモマーまたはヘテロマーの複合体の形成を刺激し得る。さらに、
低分子は、Ｓｍａｄ分子またはＳｍａｄ複合体との相互作用により経路を活性化
し得、それにより、その三次構造を変化させる。

【００４９】あるいは、またはさらに、低分子は、細胞の核内でのＳｍａｄ分子もしくはＳ
ｍａｄ複合体の転移の促進、またはＳｍａｄ分子もしくはＳｍａｄ複合体の蓄積
の促進により調節経路を活性化し得る。ＤＮＡ結合タンパク質または転写活性化
因子として作用することにより、低分子が、Ｓｍａｄ分子またはＳｍａｄ複合体
により引き起こされる転写活性の増加により調節経路を活性化し得る。

【００５０】さらに、低分子は、経路のインヒビターを妨害することにより調節経路を刺激
するように作用し得る。例えば、Ｓｍａｄ１、Ｓｍａｄ２、Ｓｍａｄ３およびＳ
ｍａｄ５とは構造的に異なっているＳｍａｄ６およびＳｍａｄ７は、望ましい表
現型特異的タンパク質の発現の特定の型のインヒビターとして作用する（例えば
、瘢痕組織形成を誘導するＴＧＦ−βを活性化することにより）。Ｓｍａｄ６は
、Ｉ型レセプターと安定な結合を形成し、そしてＳｍａｄ２およびＳｍａｄ１を
含む他のＳｍａｄタンパク質のリン酸化、およびそれらの続くＳｍａｄ４とのヘ
テロマー化を妨害する。Ｓｍａｄ７はまた、活性化されたＩ型レセプターと安定
な結合を形成し、特定のＳｍａｄ分子の接近およびリン酸化をブロックし、それ
により特定のＳｍａｄへテロマー複合体の形成を阻害する。Ｓｍａｄ７はまた、
Ｓｍａｄへテロマー複合体の核への蓄積を阻害する。低分子は、例えば、どちら
か片方または両方のタンパク質と密接に結合し、そして片方のタンパク質をＩ型
レセプターと安定に結合できないようにすることによるか、あるいは競合的に結
合し、そしてモルフォゲン活性化膜貫通レセプターを刺激することにより、これ
らのＳｍａｄタンパク質の阻害的な活性を妨害し得る。あるいは、低分子は、望
ましくない効果（例えば、ＴＧＦβ活性）を阻害するためにこれらのＳｍａｄの
阻害性効果を活性化し得る。

【００５１】病的な、損傷した、あるいは加齢した軟部組織細胞の脱分化は、モルフォゲン
活性化調節経路の１つ以上の構成成分における障害に起因し得る。最も適切な治
療は、病的な、損傷したまたは加齢した細胞における細胞内プロセスのスクリー
ニングにより明白となる。経路での障害の正確な本質の解明において、低分子組
成物は、障害を矯正または回避するように設計され得、それにより再開するため
の表現型特異的遺伝子産物の正常な発現が可能となる。本発明の有用な実施態様
を以下に例証する。

【００５２】（実施例）（モルフォゲンを用いた腎臓表現型の修復）モルフォゲンは、発生中の腎臓において発現される。例えば、ＢＭＰ−３は、
発生中のヒト腎臓において発現していることが示されている。Ｖｕｋｉｃｅｖｉ
ｃら、Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．４２：８６９−８７５（１
９９４）。また、ＯＰ−１（ＢＭＰ−７）は、免疫組織化学的に、ヒトの胚の曲
尿細管における基底膜との結合が見られる。Ｖｕｋｉｃｅｖｉｃら、Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９８：６９３−７００（１９
９４）。さらに、モルフォゲンは、成体の腎臓においても発現され、そして成体
のマウスの腎臓において、高レベルのマウスＯＰ−１の発現が観察されている。
Ｏｚｋａｙｎａｋら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ
．１７９：１１６−１２３（１９９１）。モルフォゲンは、特に、表現型特異的
遺伝子の発現を引き起こすことにより、腎臓表現型の保存を助ける。表現型特異
的遺伝子発現のためのモルフォゲン誘導経路の活性化による、そのような遺伝子
の発現を増加させるための方法を、以下に記載する。

【００５３】ラットの部分（５／６）腎摘出またはラットレムナント腎臓モデル（ＲＰＫＭ
）モデルは、基本的にＶｕｋｉｃｅｖｉｃら、Ｊ．ＢｏｎｅＭｉｎｅｒａｌ
Ｒｅｓ．２：５３３（１９８７）に記載のように使用される。オスのラット（２
〜３ヶ月齢、体重約１５０〜２００ｇ）に、片側（左または右のいずれかの腎臓
）腎摘出を行なった。約１週間後、残った腎臓の２／３を、外科的に取り除く。
手術後すぐに、血漿クレアチニンおよびＢＵＮのレベルが、腎臓の質量および機
能を失ったために劇的に上昇する。この「急性の」不全期のさらに数週間後、生
存している動物の血漿クレアチニンおよびＢＵＮのレベルは、正常の値に向かっ
ていくらか減少するが、上昇したままである。次いで、腎機能は、変動期間にた
いして比較的定常または安定なままであるようである。この時点の後、動物は死
ぬまで腎機能が基本的に直線的に減少する慢性的な腎不全の期間に入る。外科的
なコントロールとして、さらなるラットを、腎臓を皮膜剥離するが、腎組織は取
り除かない「偽の（ｓｈａｍ）」手術を行なう。

【００５４】腎摘出術および見せかけの手術を行なった両方のラットを、手術後約５〜６ヶ
月維持する。この時点において、生存している腎摘出された動物は、慢性的な腎
不全の状態となった。

【００５５】ラットを、各グループに１２ラットを有する８グループに分ける。腎摘出した
ラットの２つのグループを、コントロール（Ｎｘコントロール）として使用する
。それらのグループのうち１つは全く処置を受けないが、他方は、ビヒクル緩衝
液のみの注射を受ける。さらに、見せかけの手術を受けたラットの２つのグルー
プをコントロール（偽コントロール）として用い、１つのグループは、ビヒクル
緩衝液のみを受けるが、他方は、Ｓｍａｄ複合体形成の低分子活性化因子を受け
る。腎摘出した４つの実験的なグループを用いて、腹腔内注射により低分子溶液
を与える。処置されたラットおよびビヒクルのみのラットは、４〜８週間の間１
週間あたり３回の注射を受ける。総注射量は、約３００μｌである。統計的有意
差が、２つのコントロールグループの間または２つの偽コントロールグループの
間で観察されないことが予想される。

【００５６】ビヒクルのみを受けた偽グループと比較して、ビヒクルのみを受けたＮｘグル
ープは、この研究の終わりに、腎機能の有意な欠損を示す、血清クレアチニンの
有意な上昇（ｐ＜０．０１）を実証することが予想される。Ｓｍａｄ複合体誘導
性低分子で処置された腎摘出ラットは、Ｎｘコントロールと比較した場合、血清
クレアチニンの有意な減少を示すべきではないが、低分子を処置した腎摘出ラッ
トは、クレアチニン値の有意な減少を示すべきである。同様の結果が、血清尿素
レベルにおいても観察されるべきである。全ての腎摘出ラットは、偽の手術をし
たラットと比較した場合、有意により高い血清尿素を示すことが予想される。

【００５７】組織学的な観察によって、ビヒクル処理をしたＮｘグループとは対照的に、Ｏ
Ｐ−１を処置した腎摘出ラットが、比較的正常な糸球体の組織像の提示を示すこ
とが予想される。組織形態計測的な分析は、低分子Ｎｘラットが、Ｎｘコントロ
ールラットと比較して糸球体硬化症、ループ崩壊、比較的散発性の硬化症および
微細動脈瘤の発生率を減少させ、そしてより多くの生存可能な糸球体を示すこと
が予想される。そのような効果は、１つ以上の表現型特異的遺伝子生成物産生の
増加に起因し、この生成物産生の増加は上述したモルフォゲン誘導経路における
Ｓｍａｄ複合体形成の低分子活性化に起因することが予想される。

【００５８】（ＭＡＰキナーゼの阻害性活性の低分子阻害によるモルフォゲン活性化調節経
路のアップレギュレート）モルフォゲン活性化表現型特異的遺伝子調節経路の媒介物であるＳｍａｄ１は
また、表皮性増殖因子および肝細胞増殖因子のレセプタータンパク質チロシンキ
ナーゼ（ＲＴＫｓ）を介した分裂促進増殖因子シグナル伝達の標的である。Ｋｒ
ｅｔｚｓｃｈｍａｒら、Ｎａｔｕｒｅ３８９：６１８−６２１（１９９７）。
リン酸化は、Ｓｍａｄ１の阻害性ドメインおよびエフェクタードメインを結合す
る領域内の特定のセリンで生じ、そして分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ
（ＭＡＰキナーゼ）のＥｒｋファミリーにより触媒作用を受ける。カルボキシ末
端のセリンに影響を与え、そしてＳｍａｄ１の核における蓄積を誘導するＳｍａ
ｄ１のモルフォゲン刺激によるリン酸化とは対照的に、Ｅｒｋ媒介リン酸化は、
Ｓｍａｄ１の核への蓄積を特異的に阻害する。Ｓｍａｄ１は、ＲＴＫｓおよびモ
ルフォゲンレセプターセリン／スレオニンキナーゼを介した逆の調節性の投入を
受ける。従って、ＭＡＰキナーゼのＥｒｋファミリーは、通常モルフォゲン活性
化調節経路の刺激に起因する表現型特異的タンパク質発現を阻害するように機能
する。

【００５９】ＲＴＫのモルフォゲン活性化調節経路の競合的な阻害を妨害するために、低分
子組成物が調製される。低分子組成物は、変異型増殖因子タンパク質分子を含有
する。変異型増殖因子タンパク質分子は、表皮増殖因子レセプターおよび／また
は肝細胞増殖因子レセプターに結合し得るが、チロシンキナーゼを活性化し得な
い。増殖因子レセプターの結合およびチロシンキナーゼ活性の抑制により、Ｓｍ
ａｄ１分子のリンカードメインは、リン酸化されないままである。これらのＳｍ
ａｄ１分子のカルボキシ末端ドメインのセリンは、モルフォゲンレセプターのセ
リン／スレオニンキナーゼによりリン酸化され、それによりＳｍａｄ１分子が調
節経路に関与して、表現型特異的遺伝子の転写を誘導する細胞核へ転移させるこ
とを可能にする。

【００６０】低分子組成物の刺激効果は、モルフォゲンＩ型レセプターおよびモルフォゲン
ＩＩ型レセプターを活性化するための、モルフォゲンの添加によって、さらに増
強される。従って、この低分子組成物は、Ｓｍａｄ１のリン酸化およびＳｍａｄ
１ヘテロマー複合体の形成を増加するために、ならびにＳｍａｄ１ヘテロマー複
合体の核の蓄積の阻害を解除するために、同時に作用する。

【００６１】（肝細胞中への裸のＳｍａｄ１ｍＲＮＡの送達による、モルフォゲン調節化
転写活性の刺激）Ｓｍａｄ１および他のＳｍａｄタンパク質は、表現型特異的遺伝子に関連して
、転写活性因子の配列を刺激する。この活性は、カルボキシ末端ドメインに位置
し、そしてアミノ末端ドメインの除去の際に現れる。Ｓｍａｄ１の転写活性は、
モルフォゲンレセプター媒介性シグナルによって刺激され得る。Ｓｍａｄ１の過
剰な発現は、内因性のモルフォゲンシグナル、または外因性のモルフォゲン刺激
に対して細胞を感作し、そして細胞内の転写活性を増加する。

【００６２】Ｌｉｕら、Ｎａｔｕｒｅ、３８１：６２０−６２３（１９９７）の方法を本質
的に使用して（この教示は、本明細書中で参考として援用される）、Ｓｍａｄ１
タンパク質の、少なくともカルボキシ末端ドメインをコードするｍＲＮＡが、調
製される。米国特許第５，５８０，８５９号、およびＢｕｄｋｅｒら、Ｇｅｎｅ
Ｔｈｅｒａｐｙ３（７）：５９３−５９８（１９９７）の一般的な方法（こ
れらの両方の教示は、本明細書中で参考として援用される）に従って、全長Ｓｍ
ａｄ１タンパク質をコードする裸のｍＲＮＡおよびレセプター遺伝子（例えば、
ＣＡＴ）が、高張液中に置かれる。この溶液は、一過性の閉塞肝静脈を有する哺
乳動物の肝臓において、門脈内に注射される。裸のｍＲＮＡの発現は、上記のよ
うな適切なレポーター遺伝子アッセイを使用して、少なくとも４８時間後に立証
される。

【００６３】（処置の方法、投与の経路、および処置のための化合物）正常細胞性の表現型を失った軟部組織を処置する方法は、上記のモルフォゲン
活性化発現経路の１つ以上の局面を刺激し得る組成物を投与する工程を包含する
。投与は、任意の適合性の経路により行われ得る。従って、投与は、適切な場合
、疾患組織、損傷組織、または老齢組織の局所的な環境に対して直接行われ得る
。投与の、他の意図される経路には、静脈経路および腹腔内経路を含む、経口ま
たは非経口の経路が挙げられる。さらに、投与は、組成物のボーラスの定期的な
注射によって行われ得、あるいは外部（例えば、静脈バッグ）または内部（例え
ば、生体浸食性の（ｂｉｏｅｒｏｄａｂｌｅ）移植、もしくは移植されたモルフ
ォゲン産生細胞のコロニー)にあるレザーバーから、静脈投与または腹腔内投与によって、より連続的に行われ得る。

【００６４】本発明によって意図された治療的組成物は、任意の適切な手段によって、直接
的に（例えば、局所的に（組織部位に対する注射、移植もしくは局所的な投与に
よるような））または全身的に（例えば、非経口的に、もしくは経口的に）個体
に提供され得る。この組成物が、非経口的に（例えば、静脈の、皮下の、分子内
の、眼の、腹腔内の、筋内の、頬の、直腸の、膣の、眼窩内の、大脳内の、頭蓋
内の、脊椎内の、心室内の、鞘内の、槽内の（ｉｎｔｒａｃｉｓｔｅｒｎａｌ）
包内の、鼻内の投与によって、またはエアロゾル投与によって）提供されるべき
場合、この組成物は、水性もしくは生理学的に適合性の液体の懸濁液または溶液
の一部を含み得る。従って、キャリアまたはビヒクルは、生理学的に受容可能で
あり、その結果患者に対する所望の組成物の送達に加えて、患者の電解質および
／または容積平衡に、別の悪影響を与えない。従って、試薬に対する液体媒体は
、正常な生理食塩水（例えば、９．８５％のＮａＣｌ水溶液（０．１５Ｍ、ｐＨ
７〜７．４））を含み得る。

【００６５】非経口投与のために有用な溶液は、薬学分野で周知の任意の方法（例えば、Ｒ
ＥＭＩＮＧＴＯＮ’ＳＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳＣＩＥＮＣＥ（Ｇｅ
ｎｎａｒｏ，Ａ編；ＭａｃｋＰｕｂｌ、１９９０）に記載される）によって調
製され得る。本発明の治療剤の処方物には、例えば、ポリアルキレングリコール
（例えば、ポリエチレングリコール）、植物由来の油、硬化ナフタレン（ｈｙｄ
ｒｏｇｅｎａｔｅｄｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅｓ）などが挙げられ得る。直接的
な投与のための処方物には、特に、所望の部位で試薬を保持することを助けるた
めに、高い粘性を有するグリセロールおよび他の組成物が挙げられ得る。生体適
合性の、好ましくは、生体再吸収性の（ｂｉｏｒｅｓｏｒｂａｂｌｅ）ポリマー
（例えば、ヒアルロン酸、コラーゲン、リン酸三カルシウム、ポリブチレート、
ラクチド、およびグリコリドポリマーならびにラクチド／グリコリドのコポリマ
ーを含む）は、インビボで試薬の放出を制御するために有用な賦形剤であり得る
。これらの試薬のための、他の潜在的に有用な非経口の送達系には、エチレン−
ビニルアセテートのコポリマー粒子、浸透圧ポンプ、移植可能な注入系、および
リポソームが挙げられる。吸入投与のための処方物は、賦形剤として、例えば、
ラクトースを含み、あるいは水溶液（例えば、ポリオキシエチレン−９−ラウリ
ルエーテル、グリココール酸およびデオキシコール酸を含む）、または点鼻薬も
しくは鼻内で適用されるゲルのような形式での投与のための油性の溶液を含み得
る。非経口投与のための処方物にはまた、頬の投与のためのグリココール酸、直
腸の投与のためのメトキシサリチル酸、膣の投与のためのクエン酸が挙げられ得
る。直腸の投与のための坐薬はまた、非刺激性の賦形剤（例えば、室温で個体で
あり、かつ体温で液体である、ココアバターまたは他の組成物）を伴うモルフォ
ゲン阻害を解除し得る分子（単独で、またはモルフォゲンと組み合わせて）を混
合することによって調製され得る。

【００６６】皮膚表面に対する局所的な投与のための処方物は、皮膚科学的に受容可能なキ
ャリア（例えば、ローション、クリーム、軟膏または石けん）でモルフォゲン阻
害を解除し得る分子（単独で、またはモルフォゲンと組み合わせて）を分散する
ことによって調製され得る。皮膚上にフィルムまたは層を形成し得るキャリアが
、適用を局在化し、そして除去を阻害するために、特に有用である。内部組織表
面に対する局所的な投与のために、試薬は、組織表面に対する吸収を増強するこ
とが公知な、液体組織接着剤または他の物質において、分散され得る。例えば、
ヒドロキシプロピルセルロースまたはフィブリノーゲン／トロンビン溶液は、好
都合に使用され得る。あるいは、組織被膜溶液（例えば、ペクチン含有処方物が
、使用され得る。

【００６７】組成物が、ＣＮＳの障害のための治療としての使用を意図される場合、以下の
さらなる問題に取りかからなければならない：全てを効果的に排除する血液脳関
門、毛細血管壁構造を克服すること。しかし選択されたカテゴリーの物質は血液
中に存在し、脳内へのこれらの通過を妨げる。血液脳関門は、脳内で、モルフォ
ゲン阻害を解除し得る分子（単独で、もしくはモルフォゲンと組み合わせて）の
直接的な注入によって、または嗅覚神経による取込みおよび逆行性の輸送のため
に適切な、処方物の鼻内の投与もしくは吸入によって、効果的に回避され得る。

【００６８】（アポトーシスの調節）表現型特異的遺伝子の発現を制御する細胞性経路の調節は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉ
ｌａｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒモデルにおいて実証された。ＢＭＰサブファミ
リーのメンバーであるＤＰＰは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａの発生の間、背面の外胚
葉のパターン化を確立し、消化管の形態形成を調節し、そして羽および眼のよう
な成虫盤の成長を調節するために重要な役割を果たす。Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａに
おけるアポトーシス１タンパク質のＤｒｏｓｏｐｈｉｌａインヒビター（ＤＩＡ
Ｐ１）は、ＤＰＰＩ型レセプターの相互作用タンパク質である。太い血管（Ｔ
ｋｖ）のＤＩＡＰ１は、アポトーシスのバキュロウイルスインヒビター（ＩＡＰ
）タンパク質のホモログであり、またアポトーシスのインヒビターである。同様
のホモログが、ウイルス（ＯｐＩＡＰ、ＶｐＩＡＰ）、マウス（ＭＩＨＡ、ｍｃ
−ＩＡＰ−１）、およびヒト（ＸＩＡＰ／ｎＩＬＰ、ＭＩＨＢ／ｃ−ＩＡＰ１／
ｈＩＡＰ２、ＭＩＣＨ／ｃ−ＩＡＰ１／ｈＩＡＰ１、ＮＡＰＩ）において報告さ
れているが、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａが、本明細書中で、例示のためのモデル系と
して使用された。以下に示す、これらと同様の結果が、ヒトおよび他の哺乳動物
において予測される。

【００６９】ＩＡＰは、それらのＮ末端領域に２つまたは３つのバキュロウイルスＩＡＰ反
復（ＢＩＲ）ドメインを含む保存された領域、およびＣ末端領域に１つのＲＩＮ
Ｇフィンガードメインを共有する。ＩＡＰは、カスパーゼファミリープロテアー
ゼであるインターロイキン−１β変換酵素（ＩＣＥ）によって誘導される、細胞
のアポトーシスを妨げ得る。ＤＩＡＰ１タンパク質は、ＤＩＡＰ１のＣ末端ＲＩ
ＮＧフィンガードメインによって、Ｔｋｖなど（例えば、腫瘍壊死因子レセプタ
ー関連因子（ＴＲＡＦ）１および２）に結合する。

【００７０】Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａにおけるアポトーシスは、いくつかの遺伝的エレメント
の制御下にある。ｄｏｏｍ遺伝子（これは、昆虫細胞においてアポトーシスを誘
導する）は、これらに含まれる。ｄｏｏｍは、その結合タンパク質と同様、核に
局在化する。Ｒｅａｐｅｒ（６５アミノ酸のポリペプチド）はまた、アポトーシ
スに関与する。ＤＩＡＰ２タンパク質は、ＤＩＡＰ２のＢＩＲドメインを結合す
ることによって、Ｒｅａｐｅｒ誘導細胞死を妨げる。Ｒｅａｐｅｒは、細胞質に
局在化し、そしてＩＡＰが存在する場合、核周囲の位置において蓄積する。

【００７１】（プラスミドの構築）ＬｅｘＡＤＮＡ結合ドメインおよびＴｋｖの細胞質領域の融合タンパク質を
コードする、ベイトプラスミドであるｐＥＧ−Ｔｋｖを、以下のように構築した
。Ｔｋｖの細胞質領域を、全長クローンであるＢｒｋ２５Ｄ２から、ポリメラー
ゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅し、そしてｐＥＧ２０２のＥｃｏＲＩとＸｈ
ｏＩ部位との間に挿入した。Ｔｋｖのプレイプラスミド、ｐＪＧ−ＴｋｖをｐＪ
Ｇ４−５内にＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩフラグメントを挿入することによって構築し
た。Ｔｋｖ変異体を、Ｃｈａｍｅｌｅｏｎ変異誘発キット（Ｓｔａｒａｔａｇｅ
ｎｅ）を使用する、部位特異的変異誘発によって構築した。Ｔｋｖ（ΔＪＭ）は
、野生型のＴｋｖの膜近傍領域（アミノ酸２０５〜２５４位）を欠失する。Ｔｋ
ｖ（Ｑ２５３Ｄ）およびＴｋｖ（Ｋ２８１Ｒ）は、２５３位のグルタミン酸の代
わりにアスパラギン酸、および２８１位のリジンの代わりにアルギニンをそれぞ
れ有する。ｐｃＤＮＡ３−ＨＡを、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＸ
ｈｏＩ部位とＸｂａＩ部位との間にアニーリングされたオリゴヌクレオチドを挿
入することによって、作製した。ｐｃＤＮＡ３−ＦＬＡＧは、Ｏｋａｄｏｍｅら
、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７１：２１６８７〜２１６９０（１９９６）に
記載された。Ｔｋｖの全コード領域を、ＰＣＲによって増幅した。ＥｃｏＲＩ部
位およびＸｈｏＩ部位を、開始コドンより前に付加し、次いで終止コドンの代わ
りに、ｐｃＤＮＡ３−ＨＡのＥｃｏＲＩ部位とＸｈｏＩ部位との間の挿入した。
Ｔｋｖの内部のＥｃｏＲＩ部位を、部位特異的変異誘発によって除去した。

【００７２】ＤＩＡＰ１の酵母発現プラスミドを、ＰＣＲによって増幅した、ＥｃｏＲＩ−
ＸｈｏＩフラグメントをｐＥＧ２０２およびｐＪＧ４−５中へサブクローニング
することによって作製した。終止コドンのない、ＤＩＡＰ１のコード領域を、ｐ
ｃＤＮＡ−ＦＬＡＧのＥｃｏＲＩとＸｈｏＩとの間でサブクローニングし、ＦＬ
ＡＧタグ化ＤＩＡＰ１を得た。ＤＩＡＰ２プラスミドを、ＤＩＡＰ１と同様の様
式で構築した。

【００７３】（スクリーニングおよび相互作用アッセイ）Ｔｋｖと相互作用するタンパク質について探索するために、Ｇｙｕｒｉｓら、
Ｃｅｌｌ、７５：７９１〜８０３（１９９３）；Ｋａｗａｂａｔａら、Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２９６２８〜２９６３１（１９９５）（両方とも、本
明細書中で参考として援用される）によって本質的に記載されるような、相互作
用トラップスクリーニング（ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｔｒａｐｓｃｒｅｅｎ
）を使用した。簡単にいえば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ成虫盤のｃＤＮＡライブラ
リーを、ベイトとして、Ｔｋｖの細胞質領域でスクリーニングした。酵母菌株で
あるＥＧＹ４８を、レポーターであるｐＳＨ１８−３４およびｐＥＧ−Ｔｋｖで
形質転換する。次いで、ｃＤＮＡライブラリーをＥＧＹ４８に導入した。この形
質転換体を、適切な選択培地で増殖させ、そしてポジティブクローンを、β−ガ
ラクトシダーゼ活性およびロイシン原栄養に基づいて選択した。ライブラリーの
プラスミドを、ＥＧＹ４８から採集し、細菌中で増殖し、そして配列決定した。
相互作用トラップを使用する相互作用アッセイを、以下に記載されるように実施
した。Ｋａｗａｂａｔａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２９６２８〜２
９６３１（１９９５）。

【００７４】（全長ＤＩＡＰ１のクローニング）ポジティブクローンの１つは、ＤＩＡＰ１部分的なＣ末端領域を含んだ（図３
）。ＰＣＲを、標準条件下で実施して、ｐＮＢ４０ベクター中のＤｒｏｓｏｐｈ
ｉｌａ４〜８時間齢胚ｃＤＮＡライブラリー由来の欠失Ｎ末端領域を、増幅した
。ＤＩＡＰ１の全コード領域を、ＰＣＲから得られたＥｃｏＲＩ−ＢａｎＩＩフ
ラグメントと、相互作用トラップスクリーニングから得られたＢａｎＩＩ−Ｘｈ
ｏＩフラグメントとを連結することによって作製した。

【００７５】（インビボでのタンパク質相互作用）ＣＯＳ−７細胞を、１０％ウシ胎児血清、１００単位／ｍｌのペニシリン、お
よび４．５ｇ／リットルのグルコースを含有するダルベッコ改変イーグル培地中
で維持した。細胞を、１０μｇのプラスミドとともにＤＭＲＩＥ−Ｃ（Ｇｉｂｃ
ｏＢＲＬ）を使用して一過性トランスフェクションをした。２日後、細胞を２２
．８ｍＣｉ／ｍｌ［³⁵Ｓ］メチオニンおよびシステイン混合物（Ａｍｅｒｓｈａ
ｍ）を用いて５時間標識し、そして１．５％のアプロチニンを含有する１５０ｍ
ＭＮａＣｌ、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、および１％Ｔｒｉ
ｔｏｎＸ−１００中で溶解した。明澄化した溶解物を、２本のチューブに分け
、そして抗ＦＬＡＧＭ２（ＥａｓｔｍａｎＫｏｄａｋ）または抗ＨＡ１２
ＣＡ５（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）モノクローナル抗体ととも
に、インキュベートした。免疫複合体を、プロテインＧセファロース（Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａ）またはプロテインＡセファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に結合さ
せた。沈殿物を洗浄し、そしてＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ
−ＰＡＧＥ）（８．５％または１０％ゲル）に供し、そして蛍光間接撮影または
ＦｕｊｉＢＡＳ２０００Ｂｉｏ−ＩｍａｇｉｎｇＡｎａｌｙｚｅｒ（Ｆｕ
ｊｉＰｈｏｔｏＦｉｌｍ）を用いて解析した。

【００７６】（結果）相互作用捕捉スクリーニングを使用して、Ｔｋｖと相互作用するタンパク質を
検索した。Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ成虫原基ｃＤＮＡライブラリーを、餌（ｂａｉ
ｔ）としてＴｋｖの細胞質領域を使用して、スクリーニングした。スクリーニン
グした１６０，０００形質転換体から、４つの陽性クローンを単離した。１つの
クローンは、ＴβＲ−Ｉを含む哺乳動物Ｉ型レセプターの結合タンパク質として
公知のヒトＦＫＢＰ１２のホモログであるＤｒｏｓｏｐｈｉｌａＦＫＢＰ１２
をコードした。別のクローンは、バキュロウイルスＩＡＰのホモログであるＤＩ
ＡＰ１（ＰＣ１）のＣ末端部分領域をコードした。図３を参照のこと。残りの２
つの陽性クローンは、解析しなかった。

【００７７】Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａの４〜８時間胚のｃＤＮＡライブラリーを使用するＰＣ
Ｒを行って、不足しているＮ末端領域を得た。全長ＤＩＡＰ１と、Ｔｋｖの相互
作用を、相互作用捕捉を使用して試験した。図４に要約されるように、ＤＩＡＰ
１は、野生型Ｔｋｖと強力に相互作用したが、その相互作用は、部分クローンＰ
Ｃ１の相互作用よりも若干弱かった。異なるシグナル伝達活性を有するＴｋｖ変
異体もまた、ＤＩＡＰ１との相互作用について試験した。グルタミン２５３をア
スパラギン酸に置換する１つのＴｋｖ変異体（ＱＤ）（構成的にキナーゼ活性を
有すると報告されている）は、ＤＩＡＰ１およびＰＣ１に対して強力な相互作用
を示した。リジン２８１をアルギニンに置換する別の変異体（ＫＲ）（キナーゼ
活性を欠損すると予測される）は、ＤＩＡＰ１およびＰＣ１に対して弱い相互作
用を示した。また、ＩＩ型レセプターのリン酸基転移部位で、膜近傍領域（アミ
ノ酸２０５〜２５４）を欠損する欠失変異体もまた試験した。変異体Ｔｋｖ（Δ
ＪＭ）は、ＰＣ１ともＤＩＡＰ１とも相互作用しなかった。Ｔｋｖとは反対に、
別のＤＰＰＩ型レセプターであるＳａｘｏｐｈｏｎｅ（Ｓａｘ）、またはＤＰ
ＰのＩＩ型レセプターであるＰｕｎｔは、ＰＣ１ともＤＩＡＰ１とも相互作用し
なかった。従って、ＤＩＡＰ１は、酵母系においてＴｋｖと特異的に相互作用し
た。

【００７８】Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａにおけるアポトーシスの第２のインヒビターであるＤＩ
ＡＰ２もまた、Ｔｋｖとの相互作用について試験した。図３に示すように、ＤＩ
ＡＰ２は、３つのＢＩＲドメインを有するが、その一方、ＤＩＡＰ１は、２つの
ＢＩＲドメインを有する。ＤＩＡＰ２は、酵母系においてＴｋｖ、Ｓａｘ、また
はＰｕｎｔの野生型とも変異体とも相互作用を示さなかった。

【００７９】種々の短縮形態（ＴＦ）のＤＩＡＰ１を構築し、Ｔｋｖと相互作用するＤＩＡ
Ｐ１の領域を同定した。図３を参照のこと。野生型Ｔｋｖは、ＴＦ４と相互作用
したのみであって、他の短縮形態とは相互作用しなかった。図５を参照のこと、
ＴＦ４は、ＲＩＮＧフィンガードメインを有するのみなので、相互作用領域は、
ＤＩＡＰ１中のＲＩＮＧフィンガードメインにマッピングされる。Ｓａｘおよび
Ｐｕｎｔは、ＴＦ４と相互作用しなかった。

【００８０】ＤＩＡＰ１とＴｋｖとの間のインビボでの相互作用もまた、試験した。ＤＩＡ
Ｐ１を、そのＣ末端でＦＬＡＧでエピトープタグ化した（ＤＩＡＰ１−ＦＬＡＧ
）。ＨＡタグ化Ｔｋｖおよび／またはＤＩＡＰ１−ＦＬＡＧを、ＣＯＳ−７細胞
内で一過性発現した。標識された溶解物を、抗ＨＡまたは抗ＦＬＡＧモノクロー
ナル抗体で免疫沈降し、そして次に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。各抗体は、Ｔ
ｋｖ−ＨＡおよびＤＩＡＰ１−ＦＬＡＧをそれぞれ特異的に認識した。抗ＦＬＡ
Ｇ抗体は、ＤＩＡＰ１が発現した場合にのみＴｋｖを共沈殿し、このことは、Ｄ
ＩＡＰ１がＴｋｖとインビボで相互作用することを実証した。構成性活性（ＱＤ
）変異体およびキナーゼ不活性（ＫＲ）変異体の両方は、野生型Ｔｋｖと同程度
に効率的にＤＩＡＰ１と相互作用した。

【００８１】インビボでのＤＩＡＰ２とＴｋｖとの相互作用もまた試験した。Ｔｋｖ−ＨＡ
および／またはＤＩＡＰ２−ＦＬＡＧを、ＣＯＳ−７細胞内で一過性にトランス
フェクションした。ＤＩＡＰ２とＴｋｖとの相互作用は、酵母系において検出さ
れなかったが（図４）、ＤＩＡＰ２もまた、野生型Ｔｋｖ、ならびにＱＤおよび
ＫＲ変異体とインビボで共沈殿した。

【００８２】ＢＩＲドメイン（ＢＩＲ−ＦＬＡＧ）およびＤＩＡＰ１のＣ末端領域（ＰＣ１
−ＦＬＡＧ）の発現プラスミドを、インビボでのＴｋｖとの相互作用に必要なＤ
ＩＡＰ１の領域を決定するために、構築した（図６）。Ｔｋｖ−ＨＡをＢＩＲ−
ＦＬＡＧまたはＰＣ１−ＦＬＡＧと同時発現した。Ｔｋｖ−ＨＡを、ＰＣ１−Ｆ
ＬＡＧをともなう安定な複合体中で検出したが、ＢＩＲ−ＦＬＡＧとともには検
出しなかった。酵母アッセイにおける結果と一致して、これらの結果は、ＤＩＡ
Ｐ１の相互作用領域がＲＩＮＧフィンガードメインを含むＣ末端であることを示
す。

【００８３】従って、Ｔｋｖは、ＤＩＡＰ１機能を抑制することにより、アポトーシスを誘
導する。

【００８４】（Ｓｍａｄタンパク質を用いる間葉細胞のトランスフェクション、およびＢＭ
Ｐを用いるトランスフェクション細胞の活性化）異なるＳｍａｄタンパク質の生物学的効果を、アデノウイルスベースのベクタ
ー系を使用して、Ｃ２Ｃ１２未分化間葉細胞において試験した。Ｓｍａｄ１およ
びＳｍａｄ５のようなＢＭＰレセプターによって活性化される経路制限Ｓｍａｄ
（Ｒ−Ｓｍａｄ）は、Ｃ２Ｃ１２細胞内のアルカリホスファターゼの産生を誘導
したが、ＴＧＦ−β／アクチビン経路によって活性化されるＲ−Ｓｍａｄ（Ｓｍ
ａｄ２およびＳｍａｄ３）は、誘導しなかった。ＢＭＰ−６の添加は、Ｓｍａｄ
１または５によって誘導されるアルカリホスファターゼの産生を劇的に増大した
。この誘導は、ＢＭＰ−６により誘導されるＲ−Ｓｍａｄの核移行に起因し得る
。Ｓｍａｄ１および５を活性化することが公知であるＡＬＫ−３、ＡＬＫ−６、
およびＡＬＫ−２のようなＢＭＰＩ型レセプターはまた、これらの細胞におい
てアルカリホスファターゼの産生を誘導した。抗Ｓｍａｄ（すなわち、Ｓｍａｄ
６およびＳｍａｄ７）は、Ｓｍａｄ１および５によって誘導されたアルカリホス
ファターゼの産生を阻害した。ＢＭＰレセプターによって活性化されたＲ−Ｓｍ
ａｄを、細胞質中で、Ｓｍａｄ６またはＳｍａｄ７の存在下で検出した。従って
、ＢＭＰによって誘導された骨芽細胞の分化は、主にＢＭＰによって活性化され
たＲ−Ｓｍａｄによって媒介され、そしてＲ−Ｓｍａｄの効果は、抗Ｓｍａｄに
よって妨害され得る。

【００８５】これらの実験手順は、プラスミド構築、細胞培養、およびアデノウイルスの感
染、免疫ブロット法、アルカリホスファターゼおよびオステオカルシンの産生に
ついてのアッセイ、軟骨形成、およびＳｍａｄタンパク質の細胞内局在化の解析
を含んだ。これらの手順の全ては、当該分野において周知である。

【００８６】（結果）（Ｓｍａｄ１およびＳｍａｄ５による、Ｃ２Ｃ１２細胞の骨芽細胞への分化誘
導）Ｃ２Ｃ１２未分化間葉細胞は、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、およびＯＰ−１／Ｂ
ＭＰ−７の処置によって、骨芽細胞様の細胞に分化する。Ｃ２Ｃ１２細胞を、ア
デノウイルスベースのベクターであるｐＡｘＣＡｗｔを使用することにより、異
なるＤＮＡを用いてトランスフェクションした。トランスフェクション効率は、
ＬａｃＺによる細胞の染色によって決定した場合、非常に高かった。異なるＳｍ
ａｄ由来のｃＤＮＡを含むプラスミドを構築し、そしてＣ２Ｃ１２細胞にトラン
スフェクションした。ＦＬＡＧエピトープタグ化Ｓｍａｄの発現を、抗ＦＬＡＧ
抗体を使用する免疫ブロット法によって解析し、そしてアルカリホスファターゼ
の産生を、６日後の細胞の染色によって決定した。Ｓｍａｄ１、Ｓｍａｄ５およ
びＳｍａｄ４は、Ｃ２Ｃ１２細胞内で高発現した。

【００８７】これらの細胞をアルカリホスファターゼの産生について染色した場合、Ｓｍａ
ｄ５またはＳｍａｄ１を用いてトランスフェクションした細胞は、高い感染多重
度で陽性に染色された。対照的に、ＴＧＦ−βおよびアクチビンレセプターによ
って活性化されるＳｍａｄ２およびＳｍａｄ３は、アルカリホスファターゼの合
成を誘導しなかった。

【００８８】哺乳動物において共通のＳｍａｄメディエータであるＳｍａｄ４は、単独でト
ランスフェクションした場合アルカリホスファターゼ産生を誘導しなかったが；
Ｓｍａｄ１／５感染細胞へのＳｍａｄ４の同時感染は、ＢＭＰ活性化Ｓｍａｄの
効果を増強した。Ｓｍａｄ４は、Ｓｍａｄ３感染Ｃ２Ｃ１２細胞内でのアルカリ
ホスファターゼの産生を、弱く誘導した。従って、Ｓｍａｄ３は、弱くではある
が、有意に、Ｓｍａｄ４存在下でアルカリホスファターゼ遺伝子の転写を活性化
する。

【００８９】ＢＭＰ−６は、構造的に最もＯＰ−１／ＢＭＰ−７と類似する。２００ｎｇ／
ｍｌのＢＭＰ−６は、Ｃ２Ｃ１２細胞の骨芽細胞への分化を効率的に誘導した。
このＣ２Ｃ１２細胞を、Ｓｍａｄ１またはＳｍａｄ５で感染し、そして２００ｎ
ｇ／ｍｌのＢＭＰ−６で処理した場合、アルカリホスファターゼの産生は、劇的
に増強された。しかし、Ｓｍａｄ２は、アルカリホスファターゼの産生を促進し
なかった。

【００９０】（ＢＭＰＩ型レセプターによるＣ２Ｃ１２細胞の分化誘導）哺乳動物における７つの異なるＩ型レセプター（ＡＬＫ−１〜７）の中で、Ａ
ＬＫ−３およびＡＬＫ−６は、特異的ＢＭＰＩ型レセプターとして機能する。
ＡＬＫ−２もまた、ＯＰ−１／ＢＭＰ−７およびＢＭＰ６に結合し、そしてＢＭ
ＰＩ型レセプターとして機能する。ＨＡタグ化ＡＬＫプラスミドの構成的活性
形態を、Ｃ２Ｃ１２細胞内に感染し、そしてアルカリホスファターゼの産生を試
験した。ＡＬＫ−３（ＱＤ）およびＡＬＫ−６（ＱＤ）、ならびにＡＬＫ−２（
ＱＤ）は、アルカリホスファターゼの合成を強力に誘導した。最も構造的にＡＬ
Ｋ−２に類似するＡＬＫ−１（ＱＤ）もまた、アルカリホスファターゼの産生を
誘導した。対照的に、ＡＬＫ−４（ＴＤ）、ＡＬＫ−５（ＴＤ）、およびＡＬＫ
−７（ＴＤ）は、この細胞においてアルカリホスファターゼ活性を誘導しなかっ
た。このことは、ＴＧＦ−βまたはアクチビンレセプターは、Ｃ２Ｃ１２細胞の
骨芽細胞分化を効率的に誘導しないことを示す。

【００９１】（Ｓｍａｄの核移行は、Ｃ２Ｃ１２細胞内のアルカリホスファターゼ合成を誘
導する）Ｓｍａｄの細胞内局在化を、Ｓｍａｄ５に対する抗ＦＬＡＧ抗体を使用する、
細胞の間接免疫蛍光染色によって決定した。Ｓｍａｄ５は、主に細胞質中で観察
された。ＢＭＰ−６を用いるかまたは用いない、Ｓｍａｄ５およびＡＬＫ−２（
ＱＤ）による細胞の処理は、Ｓｍａｄ４の核移行を強力に誘導した。ＡＬＫ−３
（ＱＤ）およびＡＬＫ−６（ＱＤ）はまた、Ｓｍａｄ５の核移行を誘導した。Ｓ
ｍａｄ５の過剰発現は、Ｓｍａｄの核での蓄積を生じないが、少量のＳｍａｄ５
は、自発的に核に移行し得る。従って、ＢＭＰ−６の効果の増強は、Ｓｍａｄ５
の核移行によって誘導される。

【００９２】（抗ＳｍａｄはＢＭＰによって誘導されるＣ２Ｃ１２細胞の骨芽細胞への分化
をブロックする）Ｓｍａｄ６およびＳｍａｄ７は、ｐ３ＴＰ−ｌｕｘプロモーターおよびサイク
リンＡプロモーターを使用してアッセイした場合、Ｒ−Ｓｍａｄの転写活性を阻
害する。哺乳動物およびＸｅｎｏｐｕｓにおけるＳｍａｄ６およびＳｍａｄ７は
、Ｘｅｎｏｐｕｓ胚アッセイにおけるＢＭＰ活性を妨げることがまた、示された
。しかし、骨芽細胞の分化に対する抗Ｓｍａｄの効果は、試験されていない。Ｃ
２Ｃ１２細胞をＳｍａｄ６またはＳｍａｄ７を用いてトランスフェクションし、
そしてＢＭＰ−６で処理した。免疫ブロット法によって測定した場合、Ｓｍａｄ
６およびＳｍａｄ７の発現は、感染多重度と相関した。アルカリホスファターゼ
の合成は、ＢＭＰ−６によって誘導された。この合成は、ＬａｃＺを発現するコ
ントロールプラスミドによって影響されなかった。Ｓｍａｄ６およびＳｍａｄ７
の両方は、ＢＭＰ−６によって誘導されるアルカリホスファターゼの産生を阻害
した。

【００９３】ＡＬＫ−３（ＱＤ）、ＡＬＫ−６（ＱＤ）、またはＡＬＫ−２（ＱＤ）でＣ２
Ｃ１２細胞を感染した場合、アルカリホスファターゼは、劇的に誘導された。Ｓ
ｍａｄ６またはＳｍａｄ７の同時感染は、タンパク質の発現に依存して、この細
胞の骨芽細胞への分化を妨げた。

【００９４】Ｓｍａｄ６およびＳｍａｄ７の両方が、細胞の全体で観察されたが、Ｓｍａｄ
６は、細胞質でより多量に観察され、その一方、Ｓｍａｄ７は、核でより多量に
検出された。Ｓｍａｄ５は、ＡＬＫ−３（ＱＤ）またはＡＬＫ−６（ＱＤ）の刺
激により核へ移行した。しかし、Ｓｍａｄ６およびＳｍａｄ７の同時感染は、Ｓ
ｍａｄ５の核移行をブロックし、そしてＳｍａｄ５タンパク質は、細胞質におい
てのみ観察された。この細胞を抗Ｓｍａｄ５抗体で染色すると、Ｓｍａｄ７は、
完全にＳｍａｄ５の核移行をブロックしたが、その一方で、Ｓｍａｄ６感染細胞
内では、アルカリホスファターゼ合成はＳｍａｄ７感染細胞内と同様に阻害され
たが、Ｓｍａｄ５は核で弱く染色された。従って、Ｓｍａｄ６およびＳｍａｄ７
は、Ｓｍａｄ５の核移行を妨げ、それにより、Ｃ２Ｃ１２細胞の骨芽細胞様細胞
への分化を阻害する本発明の実施態様のさらなる局面は、当業者とって明らかである。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、本明細書に規定される形態発生のタンパク質のファミリ
ーの種々のメンバーがＣ末端の７つのシステイン骨格においてｈＯＰ−１と共有
する、アミノ酸配列同一性パーセント、およびアミノ酸配列相同性（「類似性」
）の表である。

【図２】図２は、表現型特異的な遺伝子の発現のためのモルフォゲン活性
化調節経路の概略図である。

【図３】図３は、数で示したアミノ酸位を有するＤＩＡＰおよび短縮され
た形態のＤＩＡＰ１の概略図である。

【図４】図４は、種々のＤＰＰレセプターを有する種々の形態のＤＩＡＰ
１の相互作用を要約する表である。

【図５】図５は、種々のＤＰＰレセプターを有する種々の形態のＤＩＡＰ
１の相互作用を要約する表である。

【図６】図６は、本明細書で記載された実験に用いられたＤＩＡＰ１構築
物の概略図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＪＰ，ＵＳ (72)発明者コーエン，チャールズエム．アメリカ合衆国マサチューセッツ 02193，ウエストン，ハリントンレーン１ (72)発明者大枝栄一山口県宇部市小串455−３−ビー202 (72)発明者宮園浩平埼玉県志木市本町５−５−34 (72)発明者川畑正博東京都世田谷区桜丘４−23−20

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】疾患、損傷、または加齢により影響された細胞における細胞
表現型を回復するための方法であって、該方法は以下の工程：表現型特異的遺伝子の発現を誘導する細胞内経路を活性化する工程、それによって、細胞表現型を回復する工程、を包含する、方法。
【請求項２】前記経路が、モルフォゲンのその膜貫通レセプターへの特異
的結合により活性化される活性化される経路である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】前記活性化する工程が、表現型特異的遺伝子の発現を誘導し
得るＳｍａｄ複合体の細胞内形成を誘導する工程を包含する、請求項１に記載の
方法。
【請求項４】前記Ｓｍａｄ複合体が、Ｓｍａｄ１およびＳｍａｄ４を含む
、請求項３に記載の方法。
【請求項５】前記誘導する工程が、Ｓｍａｄ分子のリン酸化を含む、請求
項３に記載の方法。
【請求項６】前記活性化する工程が、モルフォゲンＩ型レセプターおよび
モルフォゲンＩＩ型レセプターを有する細胞を、モルフォゲンＩ型レセプターま
たはモルフォゲンＩＩ型レセプターのアゴニストであり得る低分子に曝露する工
程を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】細胞核内への前記Ｓｍａｄ複合体の移行を誘導する工程をさ
らに包含する、請求項３に記載の方法。
【請求項８】前記細胞が肝細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】前記細胞が腎細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】前記活性化する工程がＳｍａｄタンパク質の発現を誘導す
る工程を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】前記細胞をＳｍａｄタンパク質をコードするＤＮＡでトラ
ンスフェクトする工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】前記トランスフェクトする工程がアデノウイルスに基づく
ベクターを使用することにより実施される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】前記トランスフェクトする工程が、前記ＤＮＡを含むプラ
スミドを使用することにより実施される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】疾患、損傷、または加齢により影響された細胞における細
胞表現型を回復する方法であって、該方法は以下の工程：正常表現型のインヒビターである遺伝子の発現を誘導する細胞内経路を阻害す
る工程、それによって、細胞表現型を回復する工程、を包含する、方法。
【請求項１５】前記遺伝子がＴＧＦ−βをコードする、請求項１４に記載
の方法。
【請求項１６】前記阻害する工程が、Ｓｍａｄ６の発現を誘導する工程を
包含する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】前記阻害する工程が、Ｓｍａｄ７の発現を誘導する工程を
包含する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】前記活性化する工程が、患者にモルフォゲンを投与する工
程を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】請求項１８に記載の方法であって、前記モルフォゲンが、
ＯＰ−１、ＯＰ−２、ＯＰ−３、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−３ｂ、ＢＭ
Ｐ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１、
ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ−１５、ＤＰＰ、Ｖｇｌ、Ｖｇｒ−１、Ｇ
ＤＦ−１、ＧＤＦ−２、ＧＤＦ−３、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、Ｇ
ＤＦ−８、ＧＤＦ−９、ＧＤＦ−１０、ＧＤＦ−１１、ＧＤＦ−１２、６０Ａ、
ＮＯＤＡＬ、ＵＮＩＶＥＮ、ＳＣＲＥＷ、ＡＤＭＰ、およびＮＥＵＲＡＬからな
る群より選択される、方法。