JPH11510054A

JPH11510054A - モルフォゲンアナログを同定するための方法および組成物

Info

Publication number: JPH11510054A
Application number: JP9507668A
Authority: JP
Inventors: ティー．サンパス，クーバー
Original assignee: クリエイティブバイオモレキュールズ，インコーポレイテッド
Priority date: 1995-07-26
Filing date: 1996-07-22
Publication date: 1999-09-07
Also published as: DE69637242T2; WO1997005241A2; AU6678696A; EP0842268B1; US6110460A; CA2227694A1; EP0842268A2; ATE373083T1; WO1997005241A3; DE69637242D1; AU715772B2; US5932716A

Abstract

(57)【要約】本明細書中では、モルフォゲンのアナログを同定するための方法および組成物が開示される。好ましい方法は、レポーター遺伝子に作動可能に結合するモルフォゲン応答性転写活性化エレメントを規定するDNA含む試験細胞の使用に基づく。特定の実施態様において、方法は、骨形成タンパク質１（OP-1）応答性転写活性化エレメントを含む。OP-1応答性転写活性化エレメントを活性化する物質は、本明細書中で、OP-1のようなモルフォゲンのインビボ効果を再生するために有用である見込みがあると考えられている。

Description

【発明の詳細な説明】モルフォゲンアナログを同定するための方法および組成物発明の分野本発明は、一般にモルフォゲンアナログとして有用な物質をスクリーニングおよび同定するための方法および組成物に関する。特定の実施態様において、同定された物質は、哺乳動物における細胞の遺伝子発現および/または組織特異的形態発生に関する骨形成タンパク質１（OP-1）の生物学的効果を模倣するために用いられ得る。発明の背景ヒト起源の骨形成タンパク質１（hOP-1）（米国特許第5,011,691号および同第 5,266,683号、ならびにOzkaynakら、（1990）EMBO J. 9: 2085-2093に記載されている）は、最近では、哺乳動物において骨の軟骨内の形態発生を含む真の組織形態発生を誘導する能力があることが理解されている。Whartonら、（1991）Pro c ．Natl．Acad．Sci．USA 88:9214-9218に記載されているマウスOP-1（米国特許第5,266,683号参照のこと）およびDrosophilaメラノガスター(melanogaster)遺伝子産物60Aが、哺乳動物において真の組織形態発生を誘導することがさらに理解されている。関連のタンパク質（OP-2（Ozkaynak（1992）J.Biol.Chem. 267:2 5220-25227および米国特許第5,266,683号）；BMP5、BMP6（Celesteら、（1991）Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 87 :9843-9847、Vgr-1(Lyonsら、（1989）Proc ．Na tl．Acad. Sci．USA 86:4554-4558)を含む）などは、同様に哺乳動物組織の真の形態発生を誘導する能力があると考えられている。その結果、これらおよび他の機能的および構造的に関連するタンパク質（集合的にはモルフォゲン）を、損傷または罹患した哺乳動物の組織または器官の修復性治癒における使用のために、特徴付けおよび開発することに多大な努力が捧げられてきた。損傷または罹患した哺乳動物骨組織の治療のためのモルフォゲンに基づく治療学（例えば、骨折のような骨欠損の修復性治癒を誘導するため、ならびに罹患骨組織（例えば、オステオペニアの骨組織）における健常な代謝特性を保存または回復するための治療組成物を含む）の開発に特別な努力が捧げられてきた。ヒトを含む哺乳動物における使用のためのモルフォゲンに基づく治療学を開発および特徴付けするための努力の完全な説明は、同時係属中の米国特許出願第08/404,113号、同第08/396,930号、同第08/445,467号、同第08/152,901号、同第08/432,883号、同第08/155,343号、同第08/260,675号、同第08/165,541号、同第08/174,605号、および同第07/971,091 号（これらの各々の教示は、本明細書中に参考として援用される）に記載されている。しかし、現在、モルフォゲンタンパク質のような治療高分子の産生、処方、およびインビボ使用は、特定の問題に直面している。例えば、このようなタンパク質は、代表的には、適切な宿主細胞の発酵または培養により産生される。現在、ヒトにおける使用のためにこのような宿主細胞から産生されたいかなる生物学的産物も、宿主細胞の混入物（例えば、分泌または放出されたタンパク質、ウイルス粒子、またはそれらの分解産物）を本質的に含まないことが示されなければならない。このような保証を提供することは、生物学的高分子の商業用生産のコストおよび技術的困難さに有意に加算する。さらに、生産された高分子に商業用に妥当な有効期間を、生物学的な有効性を著しく失うことなしに与えるために、適切な処方物が開発されなければならない。状況が、生産および処方された高分子による長期間の治療的処置を正当化する場合には、さらなる厄介な要素が生じる：処置された哺乳動物は高分子に対する免疫学的応答を発達させ得、そしていかなるこのような応答もその有効性に干渉し得る。極端な状況においては、処置を終止しなければならない。従って、前述のモルフォゲンの治療的に有効なアナログ、特に、生産するのに費用が比較的かからず、貯蔵にあたり頑強であり、そして哺乳動物への慢性的または反復した投与の際に所望でない副作用を誘起する傾向が減少したアナログの同定に対する必要性が残存する。モルフォゲンアナログを同定する、すなわち、生きている細胞または組織におけるモルフォゲンの生物学的効果を模倣する物質を同定するための方法および組成物を提供することは、本明細書中に記載される本発明の目的である。本発明の同定方法により同定されるアナログを提供することは、本発明のさらなる目的である。治療組成物を必要とする哺乳動物（例えば、代謝性骨疾患（例えば、オステオペニアにより特徴付けされる疾患）に悩む哺乳動物）への投与に適切である同定されたアナログを含む治療組成物を提供することは、本発明のなおさらなる目的である。発明の要旨本発明は、モルフォゲンアナログを同定するための方法および組成物を提供する。本発明のモルフォゲンアナログは、好ましくはそれを必要とする哺乳動物への投与に適切である、モルフォゲン媒介生物学的効果を誘導し得る物質である。すなわち、本発明のアナログは、生きている哺乳動物細胞または組織においてモルフォゲンにより天然に誘導される生物学的効果を再生し得る。本明細書中で用いられる用語「モルフォゲン」は、ヒト骨形成タンパク質１（hOP-1）によりタイプ分けされる（typefied）タンパク質のクラスを包含する。hOP-1および機能的に等価なモルフォゲンは、哺乳動物起源の分化が方向づけられていない（unco mmitted）細胞が、最終的には機能的な、分化した哺乳動物組織（例えば、骨、肝臓、神経、歯の象牙質、歯周組織、胃腸管内壁組織など）を形成するに至る細胞および分子の事象のカスケードを行うように誘導する二量体のタンパク質である。本明細書中に記載されるように、モルフォゲンアナログは、候補物質が、レポーター遺伝子のOP-1媒介発現を誘導することにより、および/またはOP-1媒介生物学的効果を誘導することによりモルフォゲンOP-1を模倣し得るかどうかを評価することにより同定される。本発明は、本明細書中に記載の方法によりモルフォゲンアナログとして同定された物質を包含する。さらに、本発明は、同定されたモルフォゲンアナログの商業的に有意な量の生産を提供する。なおさらに本発明は、モルフォゲン応答性転写活性化エレメントを含むDNAの製造および使用を提供する。本発明のDNAは、目的の遺伝子（例えば、OP-1または機能的に等価なモルフォゲンまたはそれらのアナログにより誘導され得る検出可能な遺伝子産物をコードするレポーター遺伝子）を発現させるために使用され得る。なおさらに、本発明のDNAは、OP-1またはアナログで誘導し得るインビトロまたはインビボでの目的の遺伝子産物の発現のための細胞の製造において使用され得る。従って、１つの局面において、本発明は１つの同定方法を特徴づけ、その方法においては、モルフォゲンアナログとしての活性を有することが疑われる少なくとも１つの候補物質に試験細胞が曝される。試験細胞は、OP-1に応答性の転写活性化エレメントを規定するDNA、およびこれに作動可能に結合して、検出可能な遺伝子産物をコードするレポーター遺伝子を含む。従って、DNAがOP-1応答性細胞（例えば、OP-1レポーターを提示する細胞）に存在する場合には、OP-1応答性細胞がOP-1に曝されるとき、DNAはレポーター遺伝子の転写を誘導するように働く。本発明の方法はさらに、試験細胞が候補物質に曝された後に検出可能な遺伝子産物の発現を検出する工程を包含する。検出可能な遺伝子産物の発現は、候補物質がOP-1媒介生物学的効果を誘導する能力があることを示す。本明細書中で特に注目されるOP-1媒介生物学的効果は、OP-1応答性遺伝子、つまり本発明の活性化エレメントが天然に作動可能に結合している遺伝子の転写の活性化を含む。特定の実施態様において、本発明の方法はさらに、OP-1応答性細胞を上記のように同定された推定のモルフォゲンアナログと接触させる工程、およびそのアナログがOP-1応答性細胞内でOP-1により天然に媒介されると知られる生物学的効果を誘導し得るかどうかを検出する工程を含む。所望であれば、この確認工程は、最初の同定工程と同時に行われ得る。特に特定の実施態様において、試験細胞は、OP-1応答性細胞である。他の実施態様において、本発明の方法は、上記のように同定された推定のモルフォゲンアナログを、哺乳動物の形態発生的に許容可能な組織特異的部位に投与する工程、およびそのアナログがその部位において組織特異的形態発生を誘導し得るかどうかを検出する工程をさらに含む。この確認工程は、有利には、アナログがインビボで組織特異的形態発生を誘導するかどうかを示す。関連の局面において、本発明は、上記のOP-1応答性転写活性化エレメントの少なくとも一部に結合する能力がある実質的に純粋な物質であり、その結果その物質がそのように結合した場合、前記の転写活性化エレメントに作動可能に結合する遺伝子の発現を調節するような物質を提供する。この物質は、本明細書中で「発現活性化因子」と呼ばれる。本発明は、生物学的起源の無細胞の溶解物または抽出物のようなサンプルが発現活性化因子を含むかどうかを評価するための方法を提供することが理解される。この方法において、サンプルは上記のDNAと接触され、そしてその後発現活性化因子のDNAへの結合が公知の方法に従い検出される。この同定方法は、発現活性化因子の精製された調製物を得るために、アフィニティー精製法としての使用に日常的に適合され得る。発現活性化因子は新規の細胞内タンパク質（例えば、DNA結合タンパク質のfosファミリーのメンバー）であり得ると考えられる。本発明のアナログ同定方法の結果として、本発明は治療的グレードの商業用に有意な量の同定されたモルフォゲンアナログの生産を提供する。本発明は、最初に同定されたアナログのいかなる所望でない特性（例えばインビボ毒性またはまたは貯蔵に際して変性する傾向など）も軽減されているモルフォゲンアナログの誘導体の生産をさらに提供する。従って、モルフォゲンアナログまたはその機能的に等価な誘導体が、それを必要とする哺乳動物への投与に適切な治療組成物中に処方され得る。好ましくは、治療組成物は、ヒトのような霊長類への投与に適切である。本明細書中に記載の教示に従って同定されたモルフォゲンアナログを必要とする哺乳動物は、モルフォゲンの生物学的効果の誘発が哺乳動物の健康または臨床的状態における改善（悪化傾向の状態の安定化を含む）を提供するであろう任意の疾患または状態に悩み得る。例えば、この哺乳動物は代謝性骨疾患（例えば、オステオペニアにより特徴づけられる疾患）に悩まされ得る。OP-1および関連のモルフォゲンは、オステオペニアの骨組織の代謝平衡を、健康な成人の骨組織の代謝特性がその中で回復されるように有利に変化させることが予測される。あるいは、哺乳動物は、虚血性、潰瘍性、もしくは炎症性の組織損傷に、またはモルフォゲン応答性組織（例えば、骨、肝臓、神経、胃腸管内壁、歯の象牙質、歯周組織など）の傷害もしくは悪化に悩まされ得る。さらに治療的組成物は、哺乳動物の組織または細胞のエクスビボでの処置または保存（例えば、器官または組織移植の目的）に適切であり得る。本発明の他の局面は、モルフォゲンの誘導性発現のための細胞を提供する。この細胞は、モルフォゲンをコードする第１DNAおよびこれと転写的に作動可能に結合しそして上記のOP-1応答性転写活性化エレメントを含む第２DNAを含む。この細胞はさらに、細胞が細胞外誘導因子に接触する場合に第２DNAに結合しその結果第１DNAによりコードされるモルフォゲンの発現を刺激する細胞内物質を産生するための細胞手段を含む。従って、例えば細胞は本発明の細胞内発現活性化因子を産生する手段を含む。もちろん、本明細書中に記載する発明の主要部に従い、本発明の細胞は任意の所望の遺伝子産物をコードする第１DNAを含み得、このDNAの発現は、モルフォゲン、特にOP-1、または本発明のモルフォゲンアナログによって有利に誘導される。特定の実施態様において、第１DNAは、検出可能な遺伝子産物をコードするレポーター遺伝子を含む。このような第１DNAを含む細胞は、モルフォゲンアナログの同定のための上記の方法における使用に適切である。他の実施態様において、第１DNAは生物学的活性（例えば、酵素、成長因子、リンホカイン、サイトカイン、血液または血清タンパク質、凝固因子など）を有する遺伝子産物をコードする遺伝子を含む。従って、第１DNAは、腎臓、骨、肝臓、神経、膵臓、副腎または他の哺乳動物体組織により天然に産生されるポリペプチドをコードし得る。このような第１DNAを含む細胞は、生物学的に活性なコードされる遺伝子産物のインビトロまたはインビボのいずれかにおける誘導性産生に適切である。従って、他の局面において、本発明は第１DNAによりコードされるモルフォゲンのような遺伝子産物の発現（自己分泌発現を含む）を誘導するための方法を提供する。本発明の方法は、上記の細胞の１つを提供する工程、および第１DNAに存在する遺伝子の発現を誘導するのに十分な条件下でOP-1またはそのアナログのような細胞外誘導因子に細胞を接触させる工程を含む。細胞外誘導因子が第１DN Aによりコードされるものと同一の物質であり、その結果細胞外誘導因子の最初の用量が第１DNAの持続する発現を生物学的系において天然に存在する自己分泌発現または正のフィードバック発現に類似の様式で誘発する場合には、誘導された発現は、本明細書中で自己分泌発現と呼ばれる。本発明の特定の実施態様はさらに、第１DNAによりコードされる産物のインビボ産生のために哺乳動物に上記の細胞を提供するさらなる工程を含む。有利には、上記の接触工程は、細胞外誘導因子を細胞が移植される哺乳動物に投与することにより行われ得る。従って本発明は、生物学的活性を有するモルフォゲンまたは他の遺伝子産物をそれを必要とする哺乳動物に投与するための新規の方法を提供する。本発明の方法は、哺乳動物がモルフォゲンまたは他の遺伝子産物を長期にわたり必要とする場合（例えば、哺乳動物が、例えばオステオペニアのような代謝性骨疾患を有する場合）に特別な利点を提供する。あるいは、本発明の方法は、哺乳動物が天然の組織の機能の臨床的に急性の欠損を患い、従って増強された組織機能が、損傷した天然の組織の治癒または再生が起こるために十分な期間供給されなければならない場合に利点を提供する。本発明の細胞は、例えば、腎臓または肝臓の組織により通常産生される産物を、腎臓または肝臓の不全に悩む哺乳動物であって、必要に応じて再生的な量のモルフォゲン（例えば、OP-1）が同時にその哺乳動物に投与されている哺乳動物に供給し得る。従って、本発明は、OP-1応答性転写活性化エレメントまたは細胞内発現活性化因子の結合のために十分なその一部を規定するDNAを特徴付けることが明らかである。本発明のDNAは、検出可能な遺伝子産物をコードするレポーターまたは生物学的活性を有する産物をコードする治療遺伝子のような遺伝子の挿入に適切なクローン化部位に作動可能に結合している。レポーター遺伝子がクローン化部位に挿入される場合、そのレポーター遺伝子はモルフォゲン応答性転写活性化エレメントに作動可能に結合し、その結果検出可能な遺伝子産物が本発明の細胞内に存在する場合に産生され、そしてその細胞はモルフォゲンのような細胞外誘導因子に接触される。すなわち、本明細書中で記載されるDNAは、挿入された遺伝子の転写を誘導するように働く。本発明のDNAの特定の現在好ましい実施態様は、少なくとも哺乳動物のＸ型コラーゲン遺伝子のプロモーター領域に天然に存在するOP-1応答性転写活性化エレメントを含む。従って、１つの特に好ましい実施態様において、本発明DNAの配列は、本明細書中で開示される配列番号１のヌクレオチド697-728を含む。本発明のDNAは、上記の方法のいかなるものの実施をも容易にするためのキットを提供するための適切な容器に含められ得る。必要に応じて、本発明のキットは、モルフォゲンおよび/または本発明に従って同定されたモルフォゲンアナログをさらに含む。本発明の前述のおよび他の目的、特徴および利点は、以下の本発明の好ましい実施態様の詳細な説明からより明らかにされる。図面の簡単な説明本発明の前記および他の目的、特徴、および利点、ならびに本発明自身は、添付する図面と共に読まれる場合、以下の好ましい実施態様の説明からより十分に理解される。図１は、本発明のDNA、およびOP-1媒介生物学的効果（例えば、それと作動可能に結合したレポーター遺伝子の転写が誘導されるような、細胞内物質のDNAへの結合）の存在を示すことにおけるその有用性の模式図である。図２は、有糸分裂の測定として³H-チミジンの取り込みを用いた、C5.18胎児頭蓋骨細胞の増殖に対するOP-1およびTGFβの効果を示す棒グラフである。図３は、72時間にわたるC5.18胎児頭蓋骨細胞におけるＸ型コラーゲンmRNAに対するOP-1の効果を示すRNAブロット分析の結果のオートラジオグラフである。図４は、72時間にわたる骨芽細胞表現型マーカー（例えば、I型コラーゲン、アルカリホスファターゼ、およびオステオカルシン）に対するOP-1の効果を示す RNAブロット分析の結果のオートラジオグラフである。図５は、骨芽細胞表現型マーカー（例えば、アルカリホスファターゼおよびオステオカルシン）に対するOP-1およびTGFβの効果を示すRNAブロット分析の結果のオートラジオグラフである。図６は、軟骨細胞表現型マーカー（例えば、II型コラーゲンおよびＸ型コラーゲン）に対するOP-1およびTGFβの効果を示すRNAブロット分析の結果のオートラジオグラフである。図７は、プロモーターを有さないルシフェラーゼレポーター遺伝子ならびにKp nIおよびMluI制限酵素クローニング部位を有する例示的なベクターを示すベクターマップである。図８は、ルシフェラーゼレポーター遺伝子に作動可能に連結され、そして後に OP-1と接触されるC5.18胎児頭蓋骨細胞にトランスフェクトされた、Ｘ型コラーゲンプロモーターの種々の欠失構築物のOP-1誘導ルミネッセンスを示す棒グラフである。図９は、相同的なＸ型コラーゲンプロモーターの最小セグメントに対するOP-1 応答性を付与する、選択された欠失構築物のOP-1誘導ルミネッセンスを示す棒グラフである。図10は、非相同的な（異種の）RSVプロモーターの最小セグメントに対するOP- 1応答性を付与する、選択された欠失構築物のOP-1誘導ルミネッセンスを示す棒グラフである。図11は、Ｘ型コラーゲンプロモーターの一部に作動可能に結合したレポーター遺伝子の誘導に対するOP-1およびTGFβの効果を示す棒グラフである。図12は、ルシフェラーゼレポーター遺伝子のOP-1応答性に対するOP-1応答性転写活性化エレメントの変異の抑制的な効果を示す棒グラフである。好ましい実施態様の詳細な説明本明細書中に記載の発明は、モルフォゲン、特にOP-1が、哺乳動物細胞のゲノムに天然に存在する特定の遺伝子の発現に影響し得るという発見を利用する。すなわち、哺乳動物細胞のOP-1での刺激は、多くの生物学的効果（選択された細胞の遺伝子の転写活性化を包含するが、これに限定されない）を誘導する。少なくとも１つのこのような遺伝子のプロモーター領域は、分析されており、そして本明細書中に開示されるように、OP-1応答性転写活性化エレメントを含むことが見出されている。本発明は、本明細書中に示されるような種々の局面および実施態様に有利な、この転写活性化エレメントのOP-1応答特性を使用する。本発明の説明は、本発明の転写アクチベーターの予測される作用機序を図的に概要する、図１の模式図に照らして考慮すると、より十分に理解される。図１は、OP-1応答性細胞に含まれる、本発明のOP-1応答性転写活性化エレメントを示す。この細胞と OP-1との接触後、活性化エレメントは、このエレメントの下流に位置し、そして作動可能に連結される遺伝子の、少なくとも転写を特異的に誘導する。この特異的な転写活性化は、細胞内物質（「発現アクチベーター」）のOP-1応答性転写活性化エレメントへの結合を包含する。この細胞内物質は、ATリッチであるエレメントの5'領域およびAP1結合部位配列に類似するその3'領域で、哺乳動物のＸ型コラーゲン遺伝子のプロモーター領域内に天然に配置される好ましいOP-1応答性転写活性化エレメントと結合する。OP-1応答性転写活性化エレメントの欠失または変異は、エレメントと作動可能に結合された下流の遺伝子のOP-1応答性転写活性化の消失をもたらすことが本明細書中で示される。従って、本発明の方法および組成物は、新規に発見された転写活性化エレメントのOP-1応答特性を利用する。一般的に、本発明の方法および組成物は、当業者に、モルフォゲン（例えば、OP-1）により誘導される生物学的な効果を模倣し得る物質（モルフォゲンアナログ）を同定するのに十分な分析ツールおよび技術的情報を提供する。従って、本明細書中で提供される指針、モルフォゲンアナログ特性についての種々の異なる物質の評価を容易にし、これにより、モルフォゲンが臨床的利益を提供すると予想される、疾患、傷害、および悪化する疾患（例えば、代謝的骨疾患）を改善および/または処置するための潜在的な治療候補物の範囲を広げる。本明細書中に定義されるモルフォゲンは、哺乳動物細胞、特に、分化が決定付けられていない(uncommitted)始原細胞を誘導するかまたは再誘導し、状況または局所的な生物学的環境に適切な型の十分に分化した機能的な組織の形態発生において最高に達する、生物学的および分子的な事象の十分に統合された発生カスケードを受ける。ここで、このような状況において天然に存在する組織に特徴的な、任意の血管新生、結合組織形成、脈系化（ennervation）などを含む、形態発生が誘導される。例えば、細胞が、神経、骨、または肝臓組織においてOP-1により刺激される場合、形態発生の生じるカスケードは、選択された局所的な環境に適切な、新しい分化組織または再生した分化組織の形成において最高に達する。従って、モルフォゲンは、瘢痕組織（例えば、繊維性結合組織）が形成され、そして分化した機能的な組織における病変または他の欠損を満たす単純な修復治癒プロセスとは非常に異なる。さらに、本明細書中で意図される形態発生は、形態発生（例えば、再生または再生治癒）を妨げも、抑制もしない局所的環境を意味する、「許容環境」において生じる。許容環境は、例えば、胚組織あるいは損傷組織または疾患組織（外科的処置を受けた組織を含む）において存在する。しばしば、許容環境は、分化を受ける細胞が固着し得る、適切なマトリックスまたは基底を含む。例示的なマトリックスは、組織特異的構造成分、例えば、所望の組織において天然に存在するのと同じ型のコラーゲンまたはグリコサミノグリカンを含む。許容環境の他の成分は、典型的には、分化の組織特異性を指向するシグナル（例えば、細胞表面マーカーまたは細胞外分泌物質）を含む。モルフォゲンは、OP-1に構造的におよび機能的に関連し、従って真核生物細胞により天然に産生され、そして哺乳動物に移植される場合、組織特異的モルフォゲン活性（例えば、誘導性の軟骨内骨形態発生における活性）を有する、ダイマータンパク質のファミリーを含む。従って、モルフォゲンは、「TGFβ様」タンパク質の「スーパーファミリー」のサブクラスを含む。成熟した生物学的に活性な形態で天然の供給源から単離されたモルフォゲンは、SDS-PAGEにより決定されるように、典型的に約30〜36kDaの見かけの分子量を有するグリコシル化されたダイマーである。還元すると、30kDaのタンパク質は、約16kDaおよび18kDaの見かけの分子量を有する２つのグリコシル化ペプチドサブユニットを生じる。還元されたポリペプチド自身は、検出可能なモルフォゲン活性を有さない。しかし、グリコシル化は、生物学的活性には必要とされない。非グリコシル化タンパク質は、約27kDaの見かけの分子量を有する。還元すると、27kDaのタンパク質は、約 14kDa〜16kDaの分子量を有する、２つの非グリコシル化ポリペプチドを生じる。生物学的に活性なダイマーを共に形成するポリペプチドは、米国特許出願第08/3 96,930号（この教示は、本明細書中に参考として援用される）に示される、少なくとも６つ、好ましくは少なくとも７つの位置で保存されたシステイン残基を含む。上記のように、本発明の目的のための、代表的なモルフォゲンは、OP-1または OP-1関連ポリペプチドを含む。有用なOP-1ポリペプチドの配列は、米国特許第5, 011,691号；同第5,018,753号；同第5,266,683号；Ozkaynakら(1990)EMBO J 9:20 85-2093;およびSampathら(1993)Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 90:6004-6008において記載される。さらなる有用な配列は、DPP（Drosophila由来）、Vgl（Xenopu s由来）、60A（Drosophila由来、Whartonら(1991),Proc．Natl．Acad．Sci．USA 88:9214-9218）、Vgr-1（マウス由来）のＣ末端ドメイン、OP-1タンパク質およびOP-2タンパク質（Oppermannらによる米国特許第5,011,691号）、ならびにBMP2 、BMP3、BMP4（WO88/00205、米国特許第5,013,649号およびWO91/18098を参照のこと）、BMP5およびBMP6(WO90/11366、PCT/US90/01630を参照のこと)、ならびに BMP8および9として言及されるタンパク質において存在する。前記のポリペプチドのそれぞれは、酸化およびダイマー化される場合、本明細書中のモルフォゲンとして有用である。さらに、モルフォゲンタンパク質のこのファミリーは、所定のタンパク質のより長い形態、ならびに系統発生的（例えば、種および対立遺伝子の）変異体、およびその生合成的変異体を含む。これらの変異体は、骨の形態形成を許容するマトリックスと共に哺乳動物に移植されたとき、変化により、タンパク質が形態形成（例えば、軟骨内骨形成）を誘導し得るコンホメーションを有するダイマー種を依然として形成することを可能にするという条件で、保存されたＣ末端システイン骨格を変化させ得るような、付加および欠失変異体および改変体を含む。さらに、本発明において有用なモルフォゲンは、種々のグリコシル化パターンおよび種々のＮ末端を有する形態を含み得、天然に存在し得るかまたは生合成的に得られ得、そして確立された技術に従って、原核生物宿主細胞または真核生物宿主細胞において組換えDNAの発現により産生され得る。タンパク質は、ホモダイマーまたはヘテロダイマーのいずれかとして活性である。モルフォゲンは、一般的に、形態発生的に許容な環境において以下の生物学的な機能の全てを包含する：始原細胞の増殖の刺激；始原細胞の分化の刺激；分化細胞の増殖の刺激；および分化細胞の増殖および維持の支援。用語「始原細胞」は、そのゲノムレパートリーおよび形態形成が誘導される許容環境の組織特異性に依存して、分化細胞の１つ以上の特定の型に分化し得る、分化が決定付けられていない細胞、好ましくは哺乳動物起源の中立細胞を包含する。好ましくは、モルフォゲンは、哺乳動物の身体内で天然に存在する組織の構造特性および機能特性を有する分化組織の形成において最高に達する。さらにモルフォゲンは、老化または休止に関連した、表現型および/または組織機能の喪失の開始を遅延または緩和し得る。なおさらにモルフォゲンは、分化細胞の表現型発現（その代謝的および/または機能的（例えば、分泌）特性の発現を包含する）を刺激し得る。さらに、モルフォゲンは、適切な環境条件下で形質転換された細胞の再分化を包含し得る。上記のように、少なくとも、哺乳動物の骨始原細胞の増殖および分化を誘導し、そして/または哺乳動物の軟骨内骨組織の形成、増殖、維持、および機能的特性を支援するモルフォゲンは、本明細書中で特に目的とするところである。従って、モルフォゲンアナログは、モルフォゲン(例えば、OP-1)により誘導および/または媒介される生物学的効果を模倣する物質である。その化学的または生物学的性質にかかわらず、このような模倣特性を有する任意の物質は、本明細書中でモルフォゲンアナログとして使用され得る。本発明のモルフォゲンアナログは、生物(living)系によりまたは化学的もしくは生化学的な合成技術により産生される、単純または複雑な物質であり得る。例えば、合理的な薬物設計の原理に従って合成される、自然に存在する物質または新規な物質であり得る。レセプター相互作用に関連する溶媒に曝されるモルフォゲン表面エピトープに構造的に類似する物質、そうでなければモルフォゲン応答細胞の表面上に提示されるモルフォゲンレセプターを刺激する物質、またはモルフォゲン応答性細胞のシグナル伝達機構の細胞内成分と相互作用する細胞膜透過性物質であり得る。従って、例えば、そして本明細書に限定されることなく、本発明のモルフォゲンアナログの１つの型は、米国特許第5,132,405号、同第5,091,513号、および同第5,258,498号に示されるような生合成抗体結合部位(BABS)の原理の賢明な適用により調製され得る。これらの教示は本明細書中に参考として援用される。BABS アナログ構築物は、モルフォゲン細胞表面レセプターに特異的に結合する抗体、好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生された抗体から調製され得る。あるいは、BABS分析は、モルフォゲンの生物学的活性を阻止する抗体の抗原結合部位と特異的に反応する抗イディオタイプ抗体から調製され得る。Vukicevicら(1994 )Biochem.Biophys.Res Comm.198:693-700は、OP-1特異的モノクローナル抗体の調製を教示する。当業者は、このような抗体は、本発明のBABSアナログ由来が調製され得る、抗イディオタイプ抗体の日常的な調製における免疫原として使用され得ることを理解する。また、本明細書中に示される（例示のためであり、そして限定のためではない）モルフォゲンアナログの構造的に異なるクラスは、Tuerkら(1990)Science 2 49:505-510、Famulokら(1992)Angew.Chem.Intl.Ed.Engl.31:979-988およびBock ら(1992)Nature 355:564-556において示されるような指向された(directed)分子進化の原理の賢明な適用により調製され得る。これらのそれぞれの教示は、本明細書中に参考として援用される。指向された分子進化プロセスは、高い親和性で選択されたリガンド（例えば、タンパク質）に結合する核酸分子（典型的には、 RNA）の単離を包含する。このような核酸分子は、当該分野において「アプタマー(aptamer)」といわれる。所望のアプタマーは、最初、核酸分子のランダムプールに存在し、そしてリガンド結合核酸のPCRに基づく増幅と交互に行う、リガンドアフィニティーに基づくクロマトグラフィーを数回行うことにより単離される。上記のBockら(1992)は、血液凝固促進因子であるトロンビンを特異的に阻害する、哺乳動物におけるインビボ使用に適切なアプタマーの調製を証明した。モルフォゲンアナログのなお別の構造的に異なるクラスは、ランダムペプチドライブラリー(Scottら(1990)Science 249:386-390)、または有機化合物または無機化合物の組合せにより合成されたランダムライブラリー(Needelsら(1993)Proc . Natl ．Acad．Sci．USA 90:10700-10704;Ohlmeyerら(1993)Proc ．Natl．Acad． Sci．USA 90:10922-10926)の適切なメンバーを選択することにより調製され得る。当業者は、前記のおよび他の関連する技術は、生物学的に産生された物質をスクリーニングするための長い間確立された原理と共に、モルフォゲンアナログの活性についてスクリーニングするための多くの配列の候補物質を提供することを理解する。従って、天然起源のOP-1またはモルフォゲンアナログは、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、炭水化物、脂質、アミノ酸、核酸、糖、脂肪酸、ステロイド、または上記の化合物のいずれか１つの誘導体を包含し得る。これは、真核生物細胞または原核生物細胞の代謝物の中間産物または終末産物であり得る。あるいは、このアナログは、生体反応修飾物質または毒素であり得る。従って、本発明の方法に従って同定されたモルフォゲンアナログは、モルフォゲン応答性の細胞または組織において少なくとも１つの「モルフォゲン媒介生物学的効果」を誘導することによりモルフォゲンを模倣する物質である。この効果は、モルフォゲンに対する曝露またはモルフォゲンとの接触から生じる任意の生物学的効果であり得、組織特異的形態形成の誘導を含むが、これに限定されない。モルフォゲン媒介生物学的効果は、例えば、08/115,914、08/155,343、08/260 ,675、08/165,541および08/174,605に記載のモルフォゲン曝露に対する細胞応答および分子応答を包含する。これらの開示は本明細書中に参考として援用される。従って、「OP-1媒介生物学的効果」は、インビトロまたはインビボのいずれにしても、OP-1でのモルフォゲン応答性の細胞または組織への曝露または接触から生じる任意の生物学的効果である。本明細書中において特に目的とするOP-1媒介生物学的効果は、細胞内物質のDNA発現調節エレメントへの結合の刺激を含む、１つ以上の特定の遺伝子の発現の刺激を包含する。他のOP-1媒介生物学的効果は、細胞増殖の刺激、細胞分化、分化表現型の維持、および適切な環境下での再分化の誘導を包含する。さらに好ましいOP-1媒介生物学的効果は、組織特異的形態形成（例えば、軟骨内骨形成または神経再生）に関連する分子的効果または生化学的効果である。軟骨内骨形成に関与する、特異的OP-1により媒介される生物学的効果は、有糸分裂の誘導、ならびにラット胎児の頭蓋冠細胞における軟骨細胞および骨芽細胞の分化についての表現型マーカーを包含する。有用な誘導された表現型マーカーは、Ｉ型、II型、およびＸ型コラーゲン；アルカリホスファターゼ；およびオステオカルシンを包含する。従って、本発明の方法および組成物を用いてOP-1アナログとして同定された候補化合物は、前述の生物学的効果の少なくとも１つを誘導することによりOP-1を模倣し得る。従って、第１の局面において、本発明は、OP-1に媒介される生物学的効果を誘導するモルフォゲンアナログの同定方法を特徴とする。本方法は、OP-1応答性転写活性化エレメントを規定するDNA、およびそれと作動可能に連結した、検出可能な遺伝子産物をコードするレポーター遺伝子を含む試験細胞を提供する工程を包含する。本発明のOP-1（またはモルフォゲン）応答性転写活性化エレメントは、シス作用性DNAエレメントであり、この好ましい配列は本明細書中に開示され、このエレメントは、OP-1（またはモルフォゲン）応答性細胞における下流の遺伝子の発現を調節する。OP-1応答性転写活性化エレメントは、遺伝子の転写開始部位の上流の約100〜600塩基対、好ましくは約250〜400塩基対の間に位置し得る。その正確な相対的位置にかかわらず、OP-1応答性エレメントは、その活性化がその転写を刺激するならば、下流の遺伝子と作動可能に連結されている。つまり、 OP-1がOP-1応答性細胞の細胞表面に結合し、それにより生物学的応答の細胞内カスケードを誘導する場合、このような応答は、この下流遺伝子の発現の誘導を含む。本明細書中に示す証拠は、この効果が、OP-1応答性転写活性化エレメントへの細胞内物質（発現アクチベーターという）の結合を通して達成されることを示す。本発明の試験細胞は、検出可能な遺伝子産物をコードするレポーター遺伝子に作動可能に連結される、OP-1応答性転写活性化エレメントを規定するDNAを含む任意の細胞である。このようなDNAは、試験細胞において自然に生じ得るか、またはトランスフェクトされたDNAであり得る。従って、試験細胞は、必要に応じて、OP-1応答性細胞であり得る。「OP-1応答性細胞」は、その表面にレセプターを提示する任意の細胞である。このレセプターには、OP-1が結合して、細胞内で OP-1に媒介される生物学的効果を誘導する。モルフォゲン応答性細胞は、本明細書中では同様に定義される。誘導された細胞内生物学的効果は、形態形成性生物学的活性の特徴である。このような活性には、例えば、環状ヌクレオチド、ジアシルグリセロール、および／または細胞内シグナル伝達の他のインディケーター（遺伝子転写により生じるmRNAの誘導、および／または組織形態形成を示すmRNA 転写物の翻訳により生じるタンパク質合成の誘導を含む）に関与する事象（例えば、遺伝子発現の活性化または抑制）の２次メッセンジャーカスケードの活性化が挙げられる。例示的なOP-1応答性細胞は、好ましくは、哺乳動物起源であり、そして骨形成始原細胞；頭蓋冠由来細胞；骨芽細胞；破骨細胞；骨肉腫細胞、および肝臓起源または神経起源の細胞を包含するが、これらに限定されない。このようなOP-1またはモルフォゲンに応答性の任意の細胞は、誘導された候補物質がモルフォゲンアナログであるか否かを評価するために適切な試験細胞であり得る。本発明の同定方法は、試験細胞を、少なくとも１つの候補物質に曝露する工程；および、このような曝露が、本発明のOP-1応答性転写活性化エレメントに作動可能に連結された検出可能な遺伝子産物の発現を誘導するか否かを検出する工程により行われる。この遺伝子産物の発現は、候補物質が、OP-1に媒介される生物学的効果を誘導し得ることを示す。当業者は、本明細書中に提供されるガイダンスに照らしてみれば、OP-1応答性細胞由来の応答性エレメントおよび選り抜きのレポーター遺伝子を有する試験細胞を、当該分野で周知の組換えベクターおよびトランスフェクション技術を用いて構築し得る。本明細書中で有用な、多数の周知のレポーター遺伝子が存在する。これらは、例えば、市販の供給源より入手可能なクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）、ルシフェラーゼ、ヒト成長ホルモン（hGH）、β-ガラクトシダーゼ、アッセイ系、および試薬を包含する。当業者に認識されるように、列挙したレポーター遺伝子は、本明細書中で使用され得る可能なレポーター遺伝子のいくつかを示したのみである。このようなレポーター遺伝子の例は、F.A.Ausubelら編，Current Protocols in Molecular Biology ，John Wiley & Sons，New York，(1989)に見出され得る。広範には、検出可能な産物（例えば、検出可能な酵素活性を有するか、またはそれに対して特定の抗体が惹起され得る、任意の産物）をコードする任意の遺伝子が、本発明の同定方法においてレポーター遺伝子として使用され得る。現在の好ましいレポーター遺伝子系は、ホタルルシフェラーゼレポーター系（本明細書中に参考として援用される、Gould，S.J.およびSubramani，S．（1988 ）Anal.Biochem.，7:404-408）である。ルシフェラーゼアッセイは、迅速かつ感度が高い。このアッセイ系では、試験細胞の溶解物が調製され、そしてATPおよび基質ルシフェリンと合わされる。コードされる酵素ルシフェラーゼは、基質の迅速なATP依存性の酸化を触媒して、発光性の生成物を生成する。全発光が測定され、そしてこれは広範囲の酵素濃度にわたって存在するルシフェラーゼの量に比例する。 CATは、頻繁に用いられる別のレポーター遺伝子系である；この系の主な利点は、大規模に確認されており、そしてプロモーター活性の尺度として広範囲に受け入れられていることである（本明細書中に参考として援用される、Gorman C． M.，Moffat,L.F.,およびHoward，B.H.（1982）Mol ．Cell．Biol.，2: 1044-1051 ）。この系において、試験細胞は、CAT発現ベクターでトランスフェクトされ、そして最初のトランスフェクションの２〜３日以内に候補物質とともにインキュベートされる。その後、細胞抽出物を調製する。抽出物を、アセチルCoAおよび放射活性なクロラムフェニコールとともにインキュベートする。インキュベーション後、アセチル化されたクロラムフェニコールを、薄層クロマトグラフィーにより、アセチル化していない形態から分離する。このアッセイにおいて、アセチル化の程度が、特定のプロモーターを伴うCAT遺伝子活性を反映する。別の適切なレポーター遺伝子系は、hGHの免疫学的検出に基づく。この系はまた、迅速であり、そして使用が容易である。（本明細書中に参考として援用される、Selden，R.，Burke-Howie，K.Rowe，M.E.，Goodman，H.M.,およびMoore，D. D．(1986)，Mol.Cell.Biol.，6:3173-3179）。hGH系は、発現されたhGHポリペプチドが、細胞抽出物中ではなく培地中でアッセイされる点で、有利である。従って、この系は、試験細胞の破壊を必要としない。このレポーター遺伝子系の原理は、hGHに限定されず、むしろ、特異性が許容できる抗体が、利用可能かまたは調製され得る、任意のポリペプチドでの使用に適用されることが認識される。使用したレポーター遺伝子系にかかわらず、候補物質は、OP-1に媒介される生物学的効果（検出可能な遺伝子産物の産生）が誘導されるのに充分な期間、および充分な細胞培養条件下で、試験細胞に曝露される。例えば、現在の好ましいOP -1応答性転写活性化エレメントおよびラット胎児頭蓋冠細胞を以下の実施例に記載のように用いると、OP-1に媒介される生物学的効果は、少なくとも約24時間、 OP-1へ曝露することにより誘導される。従って、適切な、無毒性で生物学的に関連する濃度に希釈され、そして本実施例のラットの頭蓋冠試験細胞に曝露された候補物質は、少なくとも約16時間、好ましくは約24時間、およびその物質へのこの細胞の曝露の約36時間前に、検出可能な遺伝子産物の産生を誘導することが期待される。曝露工程に適切な細胞培養条件は、試験細胞の正確な性質に依存して変化し、そして過度な実験を要することなく当業者により最適化され得る。さらに、一旦推定のモルフォゲンアナログが上記の同定方法を用いて同定されれば、当業者は、本方法の他の特定の実施態様を実施し得る。つまり、推定のアナログの確認のためのスクリーニングは、それと共にOP-1応答性細胞を接触させる工程、およびOP-1応答性細胞においてOP-1により媒介されることが公知の生物学的効果の誘導を検出する工程の、さらなる工程を含み得る。生物学的効果の誘導により、潜在的なOP-1（またはモルフォゲン）アナログとしての物質の同一性がさらに確認される。当業者は、特定の環境下では、レポーター遺伝子の発現の検出と生物学的効果の誘導の検出とが、同時に生じ得ることを認識している。同様に、試験細胞は、それ自身がOP-1応答性であり得る。本方法の特定の他の実施態様は、上記の推定のアナログのさらなる確認のためのスクリーニングを可能にする。このような任意の方法は、推定のアナログを、哺乳動物内の形態形成的に許容される組織特異的位置に提供する工程、およびその位置での組織特異的形態形成の誘導を検出する工程との、さらなる工程を含み、この誘導は、哺乳動物において組織特異的形態形成を誘導する、アナログの能力を示す。この実施態様によって、有望な物質が実際にOP-1またはモルフォゲンアナログとしての有用性を有することを、当業者が合理的な確実度で確認するのが可能になる。従って、上記の同定されたモルフォゲンアナログは、治療に役立つ程度で、商業的に意味のある量で産生され得、そして治療的効果のために、哺乳動物、好ましくはヒトへの投与のために処方され得る。所望であれば、例えば、毒性を低減させるため、有効期限または生物学的効力を改善するために、実質的にそれと同一のモルフォゲン模倣特性を有する、同定されたモルフォゲンアナログの誘導体もまた産生し得る。任意の適切な方法が、特定のモルフォゲンアナログの産生のために用いられ得る。例えば、このような方法は、例えば、宿主細胞からの生物学的産生の方法またはペプチドの合成産生を包含するが、これらに限定されない。さらに、方法は、非生物学的な化学合成を包含し得る。なお他の方法は、アナログ化合物を産生する細胞を用いる発酵または細胞培養による産生を包含し得る。天然に供給されるアナログは、例えば、原核生物宿主細胞または真核生物宿主細胞においてインタクトな、もしくは短縮された、ゲノムDNAもしくはcDNAから、または合成DNAから発現され得、そして活性な分子を形成するのに必要なように精製、切断、再折り畳み、および酸化され得る。有用な宿主細胞は、E.coliおよびB.subtilisを含む原核生物、ならびに哺乳動物細胞（例えば、線維芽細胞3T3細胞、CHO、COS、メラノーマ、またはBSC細胞、Helaおよび他のヒト細胞）、昆虫／バキュロウイルス系、ならびに酵母および他の微生物宿主細胞系を含む、真核生物細胞を包含する。あるいは、タンパク質は、当該分野で充分に記載され、そして市販される標準的な化学的ペプチド合成法を用いて化学的に合成され得る。同様に、非ペプチド分子は、標準的な化学的プロトコルを用いて化学的に合成され得る。別の局面において、本発明はOP-1に媒介される生物学的効果を誘導するための DNAを特徴とする。本発明のDNAは、OP-1応答性転写活性化エレメントを規定する。その結果、DNAが、OP-1と接触したOP-1応答性細胞において存在する場合、作動可能に連結した前記エレメントの下流に位置する遺伝子の転写を誘導するのに役立つ。特に、１つの実施態様において、OP-1応答性転写活性化エレメントを規定するDNAの配列は、最も好ましくは、本明細書中に記載される配列番号１のコアヌクレオチド697〜728により示される配列である。別の実施態様において、好ましいDNAは、配列番号１のヌクレオチド682〜731により示される。この配列は、コア配列に5'末端で隣接するヌクレオチド682〜696、およびコア配列に3'末端で隣接するヌクレオチド729-731を含む。なお別の実施態様において、好ましいD NAは、配列番号１のヌクレオチド682〜761により示される。この配列は、コア配列に5'末端で隣接するヌクレオチド682〜696、およびコア配列に3'末端で隣接するヌクレオチド729-761をさらに含む。さらに、本発明は、上記のDNA配列のいずれか１つに特異的にハイブリダイズするDNAを包含する。本明細書中で用いる、「特異的にハイブリダイズする」は、当該分野で低いストリンジェンシー条件として定義される条件下でのハイブリダイズを意味する。従って、例示的な条件のセットは、以下の通りである：30％ホルムアミド、１Ｍ NaCl、50mM Tris(pH7.5 )、0.5％ SDS、10％デキストラン硫酸、１×デンハルト溶液、および１mg/ml変性サケ精子DNA中で、42℃にて合計20時間のハイブリダイゼーション、その後、それぞれ、15分間室温で２×SSC/0.1％ SDS中での洗浄が１回、次いで、55℃で１×SSC/0.1％ SDS中での洗浄が２回。例えば、その開示が本明細書中に参考として援用される米国特許第5,359,047号を参照のこと。従って、現在の好ましいOP-1応答性転写活性化エレメントは、配列番号１の69 7位〜728位のヌクレオチドを含む。この特定のコア配列は、当該分野で以前に記載されたAP1 DNA配列に類似したDNA結合部位の配列に特異的にハイブリダイズすると期待される（配列番号２；例えば、Leeら,（1989）Cell 49: 741-752を参照のこと）。配列番号１の697位〜712位のヌクレオチドにより示されるように、このコア配列の5'末端はATリッチであるが、一方、3'末端（配列番号１のヌクレオチド715〜724）は、AP1結合部位に類似する配列を含む。本明細書中に開示されるように、本発明のOP-1応答性転写活性化エレメントのヌクレオチド配列内の変異は、OP-1応答性の喪失をもたらす（配列番号３）。具体的には、AP1結合部位に類似する3'配列の変異は、OP-1応答性をなくす。つまり、変異は、上記の細胞内アクチベーターが本発明の転写活性化エレメントに結合する能力を抑止する。従って、別の局面において、本発明は、上記のOP-1応答性転写活性化エレメントまたはその一部への結合に適当な実質的に純粋な物質を提供する。その結果、上記のDNAがそのエレメントに作動可能に結合されており、そしてこの物質がそれに結合する場合、この物質は遺伝子産物をコードする遺伝子の発現を調節する特性を有する。現在の好ましい実施態様において、この実質的に純粋な物質（本明細書中では、発現アクチベーターという）が、現在の好ましいOP-1応答性エレメントのコア配列（例えば、配列番号１のヌクレオチド697〜728）に結合し、これにより、この応答性エレメントに作動可能に連結された遺伝子産物をコードする下流の遺伝子の発現が調節される。以前に議論し、そして本明細書中以下に例示したように、現在の好ましい物質は、fosファミリータンパク質の一般的な免疫学的特性を有するタンパク質性細胞内物質である。つまり、１つの現在の好ましい実施態様において、この物質は、ヒトのc-fosの保存されたドメイン；特に、配列番号４におけるアミノ酸残基１〜25により示されるような、ヒトのc-fos タンパク質のアミノ酸残基128〜152と免疫反応性を共有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。特に、１つの例示的な物質は、Santa Cruz Biotechnolo gy,Inc.，Santa Cruz，CAからカタログ番号sc-253として入手可能な「c-fos(K-2 5)」と称される抗体により結合されるエピトープを含む。この抗体は、ヒトのc- fos p62の高度に保存されたドメイン内にマッピングされるアミノ酸128〜152に対応するペプチドに対して惹起され、アフィニティー精製されたウサギポリクローナル抗体である。ヒトのc-fos p62は、種々の生物学的に活性な因子により誘導される64kdの核リンタンパク質であり、そして転写レギュレーターAP1の成分である（例えば、Bohmannら(1987)，Science 238: 1386-1392を参照のこと）。抗体c-fos（K-25）は、免疫沈降、ウエスタンブロッティング、および細胞染色により、脊椎動物のc-fos、およびfos B、fra-1およびfra-2として知られる、c- fosの周知の機能的ホモログと反応する。例えば、Cohenら(1989)，Genes and De v. 3: 173-184およびNishinaら(1990)，Proc.Natl.Acad.Sci ．USA 87: 3619-362 3を参照のこと。本明細書中では、その対立遺伝子変異体および種間変異体、または他の天然に存在するかまたは合成されたアミノ酸配列変異体を含む、本発明の細胞内発現アクチベーターのアミノ酸変異体もまた意図される。本明細書中で使用する、「アミノ酸配列変異体」は、天然に存在する配列とは異なるアミノ酸配列を有するが、しかし以下の実施例に報告したアクチベーターとしての実質的に同じ機能的特性（配列番号１のヌクレオチド682〜761についての結合能力を含む）を保持しているポリペプチドを含む。実質的に純粋な発現アクチベーターが、周知の精製技術（例えば、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、および高速液体クロマトグラフィー、しかしこれらに限定されない）を用いて調製され得ることが意図される。特に、本明細書中の配列番号１の転写活性化エレメントへのその結合に基づく、リガンドアフィニティークロマトグラフィーにより調製され得る。当業者は、本発明に従って実質的に純粋なアクチベーターを得るためには、ルーチンな実験のみを用いればよい。関連する局面において、本発明はさらに、サンプルがこのようなアクチベーターを含むか否かを評価する方法を提供する。この方法は、上記のコアDNA配列を提供する工程；DNAをサンプルと接触させる工程；およびアクチベーターによるそれらへの結合を検出する工程を、包含する。所望の場合、対立遺伝子の配列、種間配列、および縮重配列を含む、コアDNA配列の等価物が用いられ得る。「縮重配列」は、本発明のコア配列とは異なるが、上記の細胞内発現アクチベーターとインタクトなOP-1反応性転写活性化エレメントとの間の結合相互作用を変化させないヌクレオチド配列を包含する。この方法は、OP-1またはモルフォゲンアナログについての、別のスクリーニングアッセイまたはさらなるスクリーニングアッセイの両方を提供する。なぜなら、以下に例示するように、OP-1のようなモルフォゲンは、応答性エレメントへのこの物質の結合を誘導および／または媒介するからである。従って、OP-1により誘導される、（例えば、DNAとこのような物質との間の）相互作用についてのスクリーニングは、例えば、化合物がOP-1を模倣する能力をさらに特徴付ける。このようなDNA-タンパク質相互作用が検出され得る例示的な条件は、その開示が本明細書中に参考として援用される、Augereau ら，(1986)，EMBO J. 5: 1791-1797において以前に記載された。簡略には、タンパク質を含有する核抽出物は、10％グリセロール、10mM Hepes(pH7.9)、50mM KC l、５mM MgCl₂、0.5mM DTT中のE.coli DNAとともに、氷上で15分間予備インキュベートされ；目的の特定のDNA配列を添加したら、インキュベーションを15分間続けてタンパク質-DNA複合体を形成させる。なお別の局面において、本発明は、モルフォゲンの誘導性発現のための細胞を提供する。この細胞は、モルフォゲンをコードする第１のDNA配列；第１のDNAと転写的に作動可能に連結された第２のDNAを有し、第２のDNAは、上記のOP-1反応性転写活性化エレメント（例えば、配列番号１のヌクレオチド682〜761を含むか、またはその機能的等価物）を含む。細胞は、細胞内物質（発現アクチベーター）を産生するための細胞手段をさらに含む。この細胞内物質は、細胞が細胞外の誘導性因子と接触したときに、第２のDNAと結合して第１のDNAによりコードされるモルフォゲンの発現を刺激する。特定の好ましい実施態様において、細胞外の誘導性因子は、本明細書中に記載される本発明の原理に従って同定されたモルフォゲンまたはそのアナログである。特定の実施態様において、細胞外の誘導性因子は、OP-1またはそのアナログである。前記の細胞は哺乳動物細胞、好ましくは霊長類細胞、最も好ましくはヒト細胞である。特定の実施態様において、前記の細胞は、ネズミ科の細胞（例えば、マウス、ラット、またはハムスターの細胞）である。本発明の細胞は、天然に存在し得、培養中に不死化され得るか、または組換え技術または細胞融合技術により構築され得る。本発明が、任意の所望の遺伝子産物の誘導性発現のために細胞を構築するために使用され得、そしてモルフォゲンをコードする第１のDNAとの使用に限定されないことが認識される。さらに別の局面において、本発明は、上記の細胞を用いて、実際は遺伝子産物であるモルフォゲン（例えば、OP-1）の発現（オートクリン発現を含む）を誘導するための方法を提供する。これらの方法において、上記の細胞の１つを、OP-1、モルフォゲン、またはモルフォゲンアナログと、第１の DNAによりコードされる遺伝子産物の発現を誘導するに充分な条件下で接触させる。必要に応じて、前記の方法は、上記の細胞のいずれか１つを哺乳動物に提供することにより、インビボで実施され得る。これらの実施態様において、接触工程は、誘導性因子を哺乳動物に投与することにより実施される。この方法は、モルフォゲン（例えば、OP-1、しかしこれに限定されない）を、モルフォゲンの長期の投与が臨床的利点を提供すると予測される、代謝性骨疾患または他の損傷、疾患、または病的状態に罹った哺乳動物に投与するために特に良く適している。なお別の現在の好ましい実施態様において、本発明は、モルフォゲンにより媒介される生物学的効果を誘導するためのDNAを提供する。このDNAは、モルフォゲン応答性転写活性化エレメント、および検出可能な遺伝子産物をコードするレポーター遺伝子または生物学的に活性な遺伝子産物をコードする治療的遺伝子の挿入に適切な、クローニング部位を規定する。レポーター遺伝子がクローニング部位で挿入される場合、このレポーター遺伝子はモルフォゲン応答性転写活性化エレメントに作動可能に連結され、その結果、DNAがモルフォゲン応答性細胞中に存在し、そしてこの細胞がモルフォゲンまたはそのアナログに接触する場合、検出可能な遺伝子産物が産生される。特定の現在の好ましい実施態様において、モルフォゲン応答性転写活性化エレメントは、OP-1またはそのアナログに対して応答性である。予め存在するクローニング部位内にレポーター遺伝子を挿入するための材料およびプロトコルは、容易に入手可能であり、当該分野で周知である。例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual(Maniatisら編;Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor; 第２版)(1989)を参照のこと。当業者は、本発明のDNAを調製するためには演習的なルーチンの実験が必要であるのみである。従って、本明細書中に示す本発明の実施を容易にするために、モルフォゲン模倣特性について候補物質をスクリーニングするためのキットが提供される。このキットは、遺伝子産物の誘導性産生のための細胞を調製するためのキットである。本明細書中のキットは、DNAを入れるための容器を備え、そしてDNAは、OP-1応答性転写活性化エレメント、およびこの活性化エレメントに作動可能に連結した遺伝子の挿入に適切なクローニング部位を規定する。必要に応じて、DNAは、検出可能な遺伝子産物（例えば、検出可能な酵素活性を有する産物）をコードするレポーター遺伝子を含む。特定の実施態様において、キットは、細胞が本発明の DNAを内在化するのを誘導するための手段をさらに備える。特定の他のキットは、モルフォゲン、および／または本発明の方法によりモルフォゲンにより媒介されるかまたはOP-1により媒介される生物学的効果を誘導する能力を有すると同定される化合物を含む。これらの任意のキット成分は、本明細書中に開示される同定方法の実施のためのコントロール物質として有用である。本発明の実施は、以下の実施例からなおさらに十分に理解される。この実施例は、例示のためにのみ本明細書中に示され、そして本発明をいかようにも限定しないと解釈されるべきである。実施例１： C5.18 細胞の増殖および分化に対するOP-1の効果骨由来細胞株に対するOP-1の生物学的効果を特徴づけるために、自然に不死化したラット胎児頭蓋冠細胞(当該分野に周知であり、そして、例えば、Grigoriad isら、(1990)Developmental Biology 142:313-318およびVon Schroederら、(199 4)Teratology 50:54-62に記載され、その開示は本明細書中で参考として援用される)であるC5.18細胞において、OP-1応答を試験した。C5.18細胞を、15％ウシ胎児血清を含むαMEMを含む12ウェル培養ディッシュにプレーティングした(1×1 0⁵細胞/ウェル)。以下に記載するように、種々の量の組換えヒトOP-1(Creative BioMolecules，Inc.，Hopkinton，MA)を培養培地に添加し、そして頭蓋冠細胞を、以下に示す種々の期間、OP-1含有培地と共にインキュベートした。OP-1は、一般に以前にU.S．5,258,494号、同第5,266,683号、および同第5,354,557号(その開示は本明細書中に参考として援用される)に記載されるように、調製しそして処方した。簡潔に述べると、ラット胎児頭蓋冠細胞のOP-1処置により、軟骨細胞および骨芽細胞の有糸分裂および表現型マーカーが誘導される。例えば、OP-1は、軟骨細胞のマーカーであるII型コラーゲン、および肥大軟骨細胞の特異的マーカーであるＸ型コラーゲンをそれぞれ誘導した。続いて、OP-1は、I型コラーゲンならびに骨芽細胞のマーカーであるオステオカルシンおよびアルカリホスファターゼを誘導した。これらの分子マーカーの規則正しい発現は、インビボでOP-1によって誘導されたときの軟骨内での骨形態形成の間の観察される事象の順序を再現する。U.S．4.,968,590号、およびSampathら、（1983）Proc ．Natl．Acad．Sci. USA 80:6591-6595(その開示は、本明細書中に参考として援用される)を参照のこと。骨芽細胞のマーカーであるアルカリホスファターゼおよびオステオカルシン、ならびに軟骨細胞マーカーであるII型コラーゲンおよびＸ型コラーゲンを、Hara daら、(1994)J ．Clinical Investigation 93:2490-2496に開示されるようなRNA ブロット分析について標準的な技術を用いて試験した。ラットアルカリホスファターゼおよびオステオカルシンのcDNAプローブを、例えば、Yoonら、（1987）Bi oChem ，Biophys．Res．Commun. 148:1129-1136に開示されているような当該分野で認識されている方法に従って調製した。マウスII型およびＸ型プロコラーゲンのcDNAプローブをまた、Asahinaら、(1993)J ．Cell Biology 123:921〜933およびChenら、(1995)J ．Cell Science 108:105-114にそれぞれ開示されるような当該分野で認識されている方法に従って調製した。上記の各参考文献の関連する教示は、本明細書中で参考として援用される。詳細には、300ng/mlのOP-1は、当該分野で認識されている方法に従って一般に実施されている³H-チミジン取り込み研究によって測定した際、有糸分裂を誘導した(図２)。図２は、OP-1(300ng/ml)が³H-チミジンの取り込みを刺激したことを示す。OP-1を用いないコントロール培養物またはTGFβ(ブタ；カタログ番号10 2-B2、R and D Systems，Inc.，Minneapolis，MN)のみで処理した培養物では、この同様の結果は得られなかった。軟骨細胞および骨芽細胞の表現型マーカーの発現に対するOP-1の効果もまた、研究した。例証したように、OP-1は、マトリックス産生性軟骨細胞のマーカーであるII型コラーゲン、および肥大軟骨細胞の特異的マーカーであるＸ型コラーゲンを、12時間および24時間で、それぞれ誘導した(図３)。さらにOP-1は、48時間でI型コラーゲンを、そして72時間でオステオカルシンおよびアルカリホスファターゼの発現を誘導した。これらは共に、骨芽細胞のマーカーとしてよく特徴づけられている(図４)。従って、ラット胎児頭蓋冠細胞において、OP-1は、インビボでOP-1によって誘導される事象の順序に似ており、そして軟骨内での骨形成において最高点に達する、分子事象のカスケードを誘導した。OP-1はまた、アルカリホスファターゼに対して陽性である小結節の形成を誘導した。対照的に、TGFβは、これらの同じ骨芽細胞のマーカー(図５)または軟骨細胞のマーカー(図６)の発現に対しては、取るに足らない効果しか誘発しなかった。これらの観察から、C5.18細胞は、試験物質がOP-1アナログとして機能するかどうかを評価するための、ならびにOP-1 が誘導した軟骨細胞および／または骨芽細胞分化に関連する１つ以上の生物学的機構をさらに描写するための、有用な細胞培養モデルを提供することを示唆する。当業者は、C5.18に基づくインビトロのモデル系の一般原則およびパラメーター(Ｉ型、II型、およびＸ型コラーゲン、ならびにアルカリホスファターゼのような、表現型マーカーの発現のモニタリングを含む)は、他の容易に入手可能である細胞培養系に容易に適合し得ることを認識している。例えば、ニワトリ骨芽細胞インビトロアッセイ系の記載についてはMauducaら、（1992）Cell Biology 57: 193-201；ニワトリ胚胸骨系の記載については、Reginatoら、（1993）Dev ． Dyn. 198:284-295；新生ラット頭蓋冠の初代培養物を使用するインビトロ系の記載についてはAsahinaら、（1993）J．Cell Biology 123:921-933を参照のこと。上述の先行技術文献の開示は、本明細書中で参考として援用される。実施例２：Ｘ型コラーゲンプロモーターに対するOP-1の効果Ｘ型コラーゲンの発現に対するOP-1の上記の効果は、この表現型マーカーが肥大軟骨細胞に特異的であり、従って、軟骨内での骨形成のマーカーであることが一般に理解されているので、特に興味深い。OP-1に対するＸ型コラーゲン遺伝子の応答性のより深い研究を、以下のように行った：マウスＸ型コラーゲン遺伝子のプロモーター領域(Elimaら、（1993）Biochem. J. 289:247-253、およびGenBank EBML Data Bank: 登録番号X67348；COLI0A1遺伝子；Ｘ型コラーゲンα１によって表される、ヌクレオチド１〜1067)(本明細書中ではまた、配列番号１のヌクレオチド１〜1067として表される)を、KpnI部位を有する34塩基対の５'プライマー、およびMluI部位を有する33塩基対の３’プライマーを使用して、マウスゲノムDNA(Clonetech，Palo Alto，CA)から、周知のPCR(ポリメラーゼ連鎖反応)法に従ってクローン化した。これらのプライマー配列を、Elimaら、（1993）Biochem ．J. 289:247-253(その開示は、本明細書中で参考として援用される)に公開されたような、マウスＸ型コラーゲンプロモーターの配列を使用して確認した。本明細書中で使用したクローン化Ｘ型コラーゲンプロモーターDNAの配列を、USB(United States Biochemical．Cleveland．OH) より入手可能なSequence Version 2.0 DNA Sequencing Kitを使用して、ヌクレオチド配列決定によって確認した。クローン化プロモーターDNAを使用して、ルシフェラーゼレポーター遺伝子およびマウスＸ型コラーゲン遺伝子の一部を有する、一連の欠失構築ベクターを調製した。検出可能な酵素ルシフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を含むプロモーターのないpGL2に基づくプラスミド(Promega，Madison WI)を、基本のベクターとして使用した(図７)。上記のインタクトなマウスＸ型コラーゲンプロモーター配列(配列番号１)を、KpnIおよびMluIでの消化後にpGL2プラスミドに挿入した。同様に、連続する５'欠失フラグメント(上記のように、PCR法によって調製した)を、KpnIおよびMluIで消化したpGL2プラスミドの調製物にサブクローン化した。従って、クローン化したプロモーターDNAまたはその一部は、ルシフェラーゼレポーター遺伝子と関連して転写的に作動可能に配置される。前記のベクターを、標準的な技術を使用して頭蓋冠細胞にトランスフェクトした。C5.18細胞を、12ウェルの培養ディッシュ内の15％ウシ胎児血清を含むαMEM (完全培地)中にプレーティングした(１×10⁵細胞/ウェル)。72時間後、上記のベクターをリン酸カルシウム法を使用して、完全培地中で６時間、培養細胞にトランスフェクトした。PBS中の10％溶液DMSOを、トランスフェクションを終結させるために使用した。その後、トランスフェクトした細胞を、完全培地中で培養した。24時間後、トランスフェクトした細胞をOP-1と接触させ、そしてさらに24時間培養した。外因的に添加したOP-1によって誘導されたルシフェラーゼ活性を、 Promega Luciferase Assay System(Promega，Madison WI)を使用して測定した。図８に例証するように、OP-1処理(100ng/ml)によって、COLXプロモーターの10 67塩基対のフラグメント(配列番号１のヌクレオチド１〜1067)を含むインタクトなＸ型コラーゲン構築物のルシフェラーゼ活性が刺激された。この同量のOP-1によって、COLXプロモーターの387塩基対のフラグメント(配列番号１のヌクレオチド682〜1067)を含む構築物が約３倍まで刺激された。しかし、さらなる42塩基対の５'フラグメントの欠失によって、OP-1の応答性がなくなった。この結果から、少なくとも配列番号１の682〜723位のヌクレオチドは、Ｘ型コラーゲン遺伝子のOP-1応答性を担うことが推論された。さらなる研究によって、配列番号１の残基682〜761を含む80bpの核酸フラグメントは、COLXプロモーターまたは異種(RSV)プロモーターに対するOP-1応答性を付与するに十分であることが確認された。これらの研究(その結果を図９および図10に示す)は、上記のCOLXプロモーターベクターおよび周知のRSVプロモーター駆動性のルシフェラーゼベクター(例えば、Towlerら、（1995）Endocrinology 1 36:1089-1096を参照のこと、その開示は本明細書中で参考として援用される)の両方、および上記の一般的なトランスフェクションアッセイ手順およびルシフェラーゼアッセイ手順を用いて行った。 RSVプロモーター構築物の３'欠失分析に基づくなおさらなる研究によって、配列番号１のヌクレオチド682〜731位にわたる、50塩基対の配列(図10)としてOP-1 応答性エレメントがより正確に同定された。さらに、配列番号１のヌクレオチド 682〜707によって表される26塩基対の欠失によって、OP-1応答性がなくなり、このことは、配列番号１のヌクレオチド697〜712にわたる５'AT富化配列がOP-1応答性に必要であることを示唆する(図９)。対照的に、TGFβ2(２ng/ml)が上記の手順に従ってトランスフェクトしたC5.18 細胞によって生じたp3TP-Luxベクター構築物のTGFβ応答性刺激を首尾良く誘導したことを確認したにもかかわらず、同じTGFβ調製物は、RSVプロモーター構築物(図11)においてOP-1応答性エレメント(配列番号１のヌクレオチド682〜761)に対してほとんど効果を有さなかった。さらなる実験を行って、Ｘ型コラーゲンプロモーター内でOP-1応答性エレメントの特性をさらに描写した。詳細には、DNaseフットプリンティングを、配列番号１のヌクレオチド682〜761を含む核酸プローブを使用して、確立された技術に従って、行った。フットプリンティング分析によって、C5.18細胞由来の核抽出物が、DNaseＩによる分解から32塩基対領域(これは、配列番号１のヌクレオチド 697〜728に対応する)を保護したことが示された。保護された領域は、５'AT富化配列および配列番号２に示される周知のAP1結合部位配列に対する類似性を有する３'配列の両方を含んでいた。次に、電気泳動のゲル移動度シフトアッセイを、確立された技術に従って行った。これらのアッセイによって、C5.18細胞をOP-1へ曝露すると、COLXプロモーターのOP-1応答性の最小の32塩基対のフラグメントに結合する核抽出物成分(おそらくはタンパク質)の量または活性が２、３倍増加することが示された。抽出成分の結合により、複合体化していないDNAプローブの移動度と比較して遅れた電気泳動移動度を有するDNA/タンパク質複合体が生じる。OP-1が誘導したDNAタンパク質複合体が、抗c-fos抗体で処理した場合、ゲル分析の間にスーパーシフトし得た。この効果は、fos遺伝子ファミリーのメンバーの保存されたドメイン( ヒトc-fosのa.a．128-152;カタログ番号sc-253、Santa Cruz Biotechnology，In c.，Santa Cruz CA)(配列番号４)に結合する抗体を使用して観察された。しかし、OP-1で誘導したタンパク質-DNA複合体は、関連タンパク質c-fos、fos-B、fra- 1、fra-2、またはc-junに特異的に反応性である抗体によってはスーパーシフトされなかったようであった。UV架橋を、核抽出物成分と複合体化したコア32塩基対プローブ配列を使用して行った。架橋研究の結果から、約55kDaおよび150kDa の相対的な分子量を有するタンパク質は、配列番号１のヌクレオチド682〜741を含むプローブフラグメントに架橋したことが示唆された。最終的に、AP1結合部位配列である配列番号２、すなわちTTCCTCATCA(配列番号３のヌクレオチド１〜10)に対する配列番号１のヌクレオチド715〜724におけるTGAA TCATCAに類似のマウスＸ型コラーゲンプロモーターの上記のドメインの部位特異的変異は、DNAタンパク質相互作用をなくし、そしてOP-1応答性を抑制した (図12)。前記の研究は、Ｘ型コラーゲン遺伝子プロモーターのOP-1応答性エレメントの発見および特徴付けに達した。このOP-1応答性エレメントのコア領域(32bp)は、 OP-1で刺激したC5.18細胞から産生された核抽出物に存在する物質によって結合される。この物質は、fosファミリータンパク質の一般的な免疫学的特性を有し、そしてfosファミリーの新規のメンバーであり得る。従って、fos様タンパク質の外観、および特異的な生物学的効果、および／またはＸ型コラーゲンプロモーターとの相互作用は、組織特異的形態形成の分子に基づく先例のない洞察を提供する。この発見は、OP-1によって誘導される特定の生物学的効果および／または細胞内事象を再生し得る物質の同定のために、本発明によって活用される。実施例３：インビトロおよびインビボでのOP-1による血管内皮増殖因子発現の誘導新脈管形成は、軟骨形成から骨形成への転移における初期の事象の１つである。血管内皮増殖因子(VEGF)は、血管内皮細胞に特異的に分泌される唯一の有糸分裂促進物質であり、生理学的および病理学的新脈管形成に関連している。骨芽細胞におけるVEGFの発現は、プロスタグランジンE₁およびE₂によって増加し、そしてグルココルチコイドによって抑制されるという報告書が示されている(Harada ら、(1994)J．Clin．Invest．93:2490-2496)。正常ラット骨切片の予備的な組織化学的分析によって、VEGFの発現は軟骨の肥大領域に局在化し得ることが示唆された。この観察からVEGFは軟骨内の骨化作用において役割を果たし得ることがさらに示唆された。従って、VEGFの発現は、本明細書中で開示されるOP-1およびOP -1アナログによって誘導される軟骨内骨形成の指標であり、そして以下のアッセイの手段によってインビボで測定し得る。 OP-1をチャージした骨特異的マトリックスペレット(Creative BioMolecules， Inc.，Hopkinton，MA)を、U.S．4,968,590号、およびSampathら、（1983）Proc. Natl ．Acad．Sci．USA 80:6591-6595に記載される以前に参照された方法に従って、４週齢の雄ラットに移植した。軟骨内骨形態形成が開始される適切なインキュベーション期間の後、小節から抽出したRNAは、OP-1または候補化合物によって誘導された。OP-1の場合、VEGFmRNAは、Ｘ型コラーゲンmRNAの誘導(９日目)に続いて、OP-1の移植後11日で高度に発現した。OP-1処理した動物において、VEGF mRNAは肥大性軟骨細胞と関連し、長骨の増殖板(growth plate)領域でのその発現と一致する。 OP-1はまた、インビトロでC5.18細胞において、VEGF mRNAを誘導した。VEGF m RNAは、軟骨マーカーの誘導に続いて、OP-1処置後48時間でピークに達した。対照的に、OP-1は、RCT-3骨芽細胞におけるVEGF mRNAに対しては影響を及ぼさなかった。RCT-3は、Heathら、（1989）Endocrinology 124:3060-3068(本明細書中に参考として援用される)に記載されるように、骨芽細胞の特性を構成的に示すレトロウイルス不死化胚ラット頭蓋冠細胞由来のクローンな細胞株である。この観察から、VEGF産生に対する上記の効果は細胞型特異的であることが示唆される。それは、両方の細胞株におけるTGFβ1誘導VEGF mRNAであるが、時間経過は異なる(12時間)。これらの観察から、VEGF mRNAは、インビボでの軟骨から骨への形態形成的変移の間に発現し、そしてOP-1は、細胞型特異的様式で、インビトロで軟骨-骨祖細胞においてVEGF mRNAを誘導することが示される。アナログは、類似する誘導効果を有することが予測される。実施例４：骨芽細胞分化マーカーの誘導所望であれば、組織特異的なOP-1誘導性形態形成のための他の細胞マーカーおよび分子マーカーをモニターして、Ｘ型コラーゲン遺伝子プロモーターに関する上記の細胞内事象を再生する試験物質が、OP-1アナログとして実際に見られるかどうかを確認し得る。従って、PCT US92/07432は、OP-1が特定化していない哺乳動物始原細胞（胚間葉性細胞(embryonic mesenchymal cells)および初期の骨芽細胞を含む）の分化を優先的に誘導することを開示した。従って、OP-1の潜在的なアナログは、例えば、アルカリホスファターゼ活性、PTH媒介性cAMP産生、およびオステオカルシン発現（これら全ては、初期の骨芽細胞がヒトまたはマウス OP-1、そのショウジョウバエホモログである、60A、あるいはヒトBMP2またはそのショウジョウバエホモログである、DPP、あるいはモルフォゲンファミリーの他のメンバーのようなモルフォゲンに曝されたときに誘導される）のような特異的な分子マーカーを誘導するこれらのアナログの能力を測定することにより、初期の骨芽細胞の分化を誘導する同様の能力についてスクリーニングされ得る。ラットのような良く特徴付けられたモデル哺乳動物由来の骨芽細胞富化初代培養物を、好ましくは本発明を確証する研究のために用いる。このような培養物は、その個々の細胞が分化の異なる段階にある点で異種であるが、これらの培養物はインビボで骨芽細胞の代謝および機能を正確に反映すると考えられる。他に示さない限り、以下に参照されるすべての化学薬品は標準的な試薬であり、Sigma Chemical，Co.，St．Louis; Calbiochem，Corp.，San DiegoおよびAldrich Chem ical Co.，Milwaukeeを含む多くの商業的供給源から容易に入手可能である。ラット骨芽細胞富化初代培養物を、標準的な手順（例えば、Wongら(1975)Proc .Natl.Acad.Sci. 72:3167-3171に記載）に従って、新生無縫合(suture-free)ラット頭蓋冠（例えば、１〜２日齢の動物、Long-Evans株、Charles River Labora tories．Wilmington，MA）の連続的なコラーゲン消化により調製する。次いで、ラット骨芽細胞単一細胞懸濁物を、10％FBS（ウシ胎児血清）、Ｌ-グルタミン、およびペニシリン／ストレプトマイシンのような標準的な抗生物質を含有するα MEM（改変Eagle培地、Gibco，Inc.，Long Island）を含むウェルあたり50,000個の骨芽細胞の濃度でマルチウェルプレート（例えば、24ウェルプレート）にプレートする。細胞を37℃で24時間インキュベートする。環境下で適切であれば、増殖培地を１％FBSを含有するαMEMで置き換え、そして細胞をさらに24時間インキュベートする。 (a)骨芽細胞におけるアルカリホスファターゼ活性の誘導培養細胞を、OP-1、疑OP-1アナログまたは陰性コントロールを所定の範囲の濃度で用いてインキュベートする。代表的には、例えば、0.1、1.0、10.0、40.0、 80.0 ngのOP-1/ml培地を使用する。インキュベーション期間の72時間後、細胞層を0.5mlの１％Triton X-100で抽出する。次いで、得られた細胞抽出物を遠心分離し、そして100μlの抽出物を90μlのパラニトロソフェニルホスフェート(pNPP )/グリセリン混合物に添加し、そして37℃の水浴中で30分間インキュベートし、そして反応を100μlのNaOHで停止する。次いで、サンプルを従来の分光光学的プレートリーダー（例えば、Dynatech MR700プレートリーダー）で分析する。p-ニトロフェノールを標準として用いて吸光度を400 nmで測定して、アルカリホスファターゼ活性の存在および量を決定する。タンパク質濃度をBiorad法により決定する。アルカリホスファターゼ活性をユニット／mgタンパク質で計算する。ここで、１ユニット＝37℃での１nmolの遊離p-ニトロフェノール／30分間である。OP -1は、この方法によりアルカリホスフェートの細胞特異的な活性の５倍の増大を誘導する。アナログは同様の誘導効果を有すると予想される。 (b)骨芽細胞におけるPTH-媒介cAMP産生の誘導哺乳動物（例えば、ラット）の初期培養物である、骨芽細胞を調製し、そして上記のようにマルチウェルプレートで培養する。次いで、培養細胞を３つの群に分ける：(1)例えば、1.0、10.0および40.0 ng OP-1/ml培地を入れたウェル；(2) 候補アナログを種々の濃度範囲で入れたウェル；および(3)OP-1またはそのアナログを希釈するために用いた培地の等価容量を入れたコントロール群。次いで、プレートをさらに72時間インキュベートする。その後、細胞を0.5％のウシ血清アルブミン(BSA)および１mM 3-イソブチル-1-メチルキサンチンを含む培地で20 分間処理し、その後、半分のウェルに、200ng/mlの濃度でヒト組換え甲状腺ホルモン(hPTH，Sigma，St Louis)を添加して10分間処理する。次いで、細胞層を、0 .5mlの１％Triton X-100で各ウェルから抽出する。次いで、サイクリックAMPレベルを広く市販されているラジオイムノアッセイキット（例えば、Amersham，Ar lington Heights，Illinois）を用いて決定する。OP-1は、PTHの存在下でcAMP産生を倍化する。アナログは同様の誘導効果を有することが予測される。 (c)骨芽細胞におけるオステオカルシン産生の誘導オステオカルシンは、骨芽細胞により産生される骨-特異的タンパク質であり、そして血流中に分泌される。オステオカルシンは、哺乳動物において骨ミネラル化の速度を調製する肝要な役割を果たしている。従って、オステオカルシンの血清レベルは、インビボでの骨芽細胞活性の指標および骨形成の指標としてモニターされ得る。同様に、骨芽細胞富化培養物におけるオステオカルシン合成の誘導が、推測されるOP-1アナログが実際にOP-1処置の全身効果を再生し得るかどうかを確認するために用いられ得る。ラット骨芽細胞を調製し、そして上記のマルチウェルプレートにおいて培養する。オステオカルシン分析については、培地は10％FBSを含有し、そして２日目に、細胞に新鮮な10 mM β-グリセロホスフェート(Sigma，Inc.)を補充した新鮮な培地を与える。５日目に開始し、そしてその後毎週２回、細胞に、上記のすべての成分および新鮮なＬ(+)アスコルベートを含む完全ミネラル化培地を50mg/ml 培地の最終濃度で与える。次いで、OP-1またはOP-1アナログを、５mg OP-1/ml培地を超えない濃度、ウェル（例えば、0.1％トリフルオロ酢酸(TFA)を含有する50 ％アセトニトリル（または50％エタノール）を含む）に直接添加する。コントロールウェルは溶媒ビヒクルのみを受容する。次いで、細胞に再度与え、そして標準的なプロテアーゼインヒビターを含む標準ラジオイムノアッセイ緩衝液中で調節した培地サンプルを１：１に希釈し、そしてオステオカルシンについてアッセイするまで−20℃で保存する。オステオカルシン合成を、市販のオステオカルシン特異的抗体を用いて標準ラジオイムノアッセイにより測定し、そしてOP-1またはOP-1アナログの存在下または非存在下において産生されるオステオカルシンmR NAの量を計算するためにノーザンブロット分析により確認し得る。OP-1はオステオカルシン産生を用量依存的に増加させ（25 ngのOP-1タンパク質／mlを用いた場合５倍増加）、そしてオステオカルシンmRNAにおいて20倍増加する。アナログは同様の誘導効果を有することが予測される。ミネラル化を、固定した細胞層上での改変von Kossa染色技術を用いて長期培養物(13日間)で決定する。細胞を、新鮮な４％パラホルムアルデヒド中で23℃で 10分間固定し、その後冷0.9％NaClでリンスする。次いで、固定した細胞を市販のキット(Sigma，Inc.，St．Louis，MO)を用いて内因性のアルカリホスファターゼについてpH 9.5にて10分間染色する。次いで、紫色に染色された細胞をメタノールで脱水し、そして風乾する。暗下での３％AgNO₃中の30分間のインキュベーション後、H₂Oでリンスしたサンプルを、254 nmのUV光に30秒間曝露して、黒い銀染色されたホスフェート小瘤を発生させる。個々のミネラル化された焦点（少なくとも20mmのサイズ）を解剖顕微鏡下で計数し、そして小瘤／培養物として表す。OP-1は最初のミネラル化割合の20倍増加を誘導する。アナログは同様の誘導効果を有することが予測される。実施例５．形態形成アナログによるニューロンマーカーの誘導；CAM発現本明細書中で意図されるOP-1の第２の形態形成アナログが、それらの形態形成の誘導の一部として、CAMの発現、特にN-CAMの発現を誘導することがさらに予測される。CAMは、組織発達の必須手段としての、全ての組織、特に神経組織において同定された形態形成調節分子である。N-CAMは、（これは、少なくとも３つのイソ型（N-CAM-180，N-CAM-140、およびN-CAM-120、ここで「180」、「140」および「120」は、ポリアクリルアミド電気泳動により測定されたイソ型の見かけの分子量を示す）を含む）発達組織において少なくとも一過的に、そして神経組織においては永久的に発現される。N-CAM-180およびN-CAM-140イソ型の両方は、発達組織および成人組織の両方で発現される。N-CAM-120イソ型は成人組織のみで見出される。別の神経性CAMはL1である。 N-CAMは、ニューロン特異的組織モルフォゲンまたはそのアナログの指標として有用である。これらは、適切な神経発達（適切な神経管形成(neuroulation)、ニューロン移動、束形成、およびシナプス形成(synaptogenesis)を含む）を包含する。N-CAM産生の阻害（分子がN-CAM特異的抗体と複合体化することによるような）は、網膜構築（網膜の軸索移動を含む）、および末梢神経系における軸索の再生、ならびに標的筋肉細胞との軸索の対合を阻害する。さらに、有意な証拠は、ニューロンに対する物理的または化学的外傷、腫瘍形成形質転換およびいくつかの遺伝的神経学的障害がCAM発現の変化により達成されることを示す。これらは、これらの細胞の接着または移動性質を改変する。さらに、増大したN-CAMレベルがハンチントン病線条（例えば、線条体の脳幹神経節）において報告され、そして減少した接着がアルツハイマー病において注目される。本明細書中で意図されるOP-1の第２のモルフォゲンアナログは、CAM産生、特にL1およびN-CAM産生（すべての３つのイソ型のN-CAM分子を含む）を刺激することが予測される。例えば、N-CAMの発現は、米国特許出願第08/260,675号（これは本明細書中に参考として援用される）；ならびにPeridesら(1994)J.Biol.Chem . 269:765-770および(1993)J.Biol.Chem. 268:25197-25205（これらもまた本明細書中に参考として援用される）に先に記載されたような、モルフォゲン処理NG10 8-15細胞において有意に刺激され得る。NG108-15は、形質転換された胚ニューロンに特徴的な形態を示す形質転換されたハイブリッド細胞株（神経芽腫x神経膠腫、American Type Culture Collection，Rockville，MD）である。未処理のNG1 08-15細胞は線維芽細胞様の、または最小限に分化した形態を示し、そして発達細胞と通常関連するN-CAMの180および140イソ型のみを発現する。モルフォゲン（例えば、OP-1）処理後、これらの細胞は、成熟ニューロンに特徴的な形態を示し、そして増大したレベルのすべての３つのN-CAMイソ型を発現する。以下に記載のものと類似のプロトコルを用いた、NG108-15細胞とOP-1またはモルフォゲンアナログとの処理は、真のOP-1と同程度のL1発現を誘導する。 NG108-15細胞を、漸増濃度のOP-1またはOP-1アナログの存在下で４日間培養し、そして、次いで、標準的なウェスタンブロットを全細胞抽出物で行う。N-CAM イソ型をすべての３つのイソ型と交差反応する抗体（mAbH28.123、Sigma Chemic al Co.，St.Louisから入手）で検出する。異なるイソ型は電気泳動ゲルでのそれらの異なる移動度により区別され得る。コントロールNG108-15細胞（未処理）は、100 mgまでのタンパク質を用いるウェスタンブロット分析により決定されたように、140 kDaおよび180 kDaの両方のイソ型を発現するが、120 kDaのイソ型は発現しない。NG108-15細胞とOP-1との処理は、180 kDaおよび140 kDaのイソ型の発現、ならびに120 kDaのイソ型の誘導において用量依存的な増大を生じる。さらに、N-CAM発現の増大は、用量依存的様式で、多細胞性凝集のモルフォゲン誘導と一致する。処理された細胞上でmAb H28.123を用いて行われる標準的な免疫学的局在性決定研究は、N-CAMクラスター形成が、処理された細胞の周辺およびプロセスと関連することを示す。さらに、処理は、細胞計測または³H-チミジン取り込みにより決定されるように、細胞分裂を阻害しない。さらに、NG108-15細胞上のOP-1またはOP-1アナログのこれらの細胞凝集効果を、抗N-CAM抗体またはアンチセンスN-CAMオリゴヌクレオチドを用いて阻害し得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、当該分野で公知の標準的な手段を用いて、ヌクレオチド合成機で合成的に作製され得る。好ましくは、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド(「S-オリゴ」)を調製し、細胞膜を横切るヌクレオチドの輸送を増強する。N- CAMの誘導を阻害するのに十分なN-CAM抗体およびN-CAMアンチセンスオリゴヌクレオチドの濃度はまた、多層化された細胞凝集物の形成を阻害した。特に、0.3 〜３mMのN-CAMアンチセンスS-オリゴ、５〜500 mMの非修飾N-CAMアンチセンスオリゴ、または10 mg/mlのmAb H28.123とのNG108-115細胞のインキュベーションは、細胞凝集を有意に阻害する。インビボでのN-CAM発現におけるモルフォゲンアナログ処理の効力は、日常的な方法およびmAb H28.123のようなN-CAM特異的抗体でN-CAM分子を検出することによる免疫組織化学を用いる組織バイオプシーにより評価され得る。あるいは、髄液または血清中に存在するN-CAMタンパク質またはタンパク質フラグメントのレベルをまた検出して、処理の効果を評価し得る。N-CAM分子は、細胞表面を崩れ落とし(slough off)、そして血清および髄液の両方で検出されることが既知である。さらに、変化したレベルの可溶型のN-CAMは、正常圧力水頭症およびII型精神分裂症と関連する。N-CAM液体レベルを、日常的なイムノアッセイ手順を用いたmAb H28.123のようなN-CAM特異的抗体を用いて検出し得る。実施例６．一般的な処方および投与の考察 OP-1アナログを含むモルフォゲンアナログを、それが必要である哺乳動物、好ましくはヒトに投与するために薬学的組成物の一部として処方し得る。組成物を適切な手段（例えば、非経口、経口または局所）により投与し得る。モルフォゲンアナログが局所的に（例えば、注射によって）所望の組織部位へ、あるいは、例えば、静脈内、皮下、筋肉内、眼窩内、眼、心室内、頭蓋内、包内、髄腔内、槽内、腹膜内、頬、直腸、膣、鼻腔内によってまたはエアゾール投与によって全身的に投与される場合、組成物は、好ましくは、水溶液を含む。溶液は、好ましくは、生理学的に受容可能であり、その結果哺乳動物へのそれの投与が哺乳動物の正常な電解質液および溶液体用量バランスに反作用的に影響しない。従って、水溶液は、例えば、正常な生理学的生理食塩水(0.9％NaCl，0.15M)、pH ７〜7.4 を含み得る。経口または非経口全身投与に有用な溶液は、例えば、Remington's Pharmaceut ical Sciences ，(Gennaro，A.,編、Mack Pub.，1990)に記載されるような、薬学的分野で周知の方法のいずれかにより調製され得る。処方物は、例えば、ポリエチレングリコールのようなポリアルキレングリコール、野菜起源の油、水素化ナフタレンなどを含み得る。特に、直接投与のための処方物は、グリセロールおよび高粘性の他の組成物を含み得る。生物学的適合性の、好ましくは、生物再吸収可能なポリマー（例えば、ヒアルロン酸、コラーゲン、トリカルシウムホスフェート、ポリブチレート、ポリラクチド、ポリグリコリドおよびラクチド／グリコリドコポリマーを含む）が、インビボでのモルフォゲンアナログの放出を制御するための有用な賦形剤であり得る。本発明のアナログのための他の潜在的に有用な非経口送達系は、エチレンビニルアセテートコポリマー粒子、浸透圧ポンプ、移植可能な注入システム、およびリポソームを含み得る。吸入投与のための処方物は、例えば、ラクトースを賦形剤として含むか、あるいは例えば、ポリオキシエチレン-９-ラウリルエーテル、グリココレートもしくはデオキシコレートを含む水溶液、または鼻腔滴の形態でもしくは鼻腔内に適用されるゲルとして投与するための油溶液であり得る。あるいは、本明細書中に記載されるように同定されたOP-1アナログを含むモルフォゲンアナログを、経口的に投与され得る。例えば、モルフォゲンアナログの液体処方物を、Remington's Pharmaceutical Sciences(Gennaro，A.,編、Mack P ub.，1990)（この開示は、本明細書中に参考として援用される）に記載のような標準的な実施に従って調製し得る。次いで、このような液体処方物を、投与のための飲料または別の食物追加物に添加し得る。経口投与はまた、これらの液体処方物のエアゾールを用いて達成され得る。あるいは、当該分野で認識された乳化剤を用いて調製された固体処方物を、経口投与に適切な錠剤、カプセルまたはトローチ剤へと作製し得る。必要に応じて、アナログを、所望の組織によるアナログの取り込みを増大するための手段を包含する組成物中で処方し得る。例えば、テトラサイクリンおよびジホスホネート（ビスホスホネート）が哺乳動物において全身的に提供される場合、それらが特に骨再形成領域において骨ミネラルに結合することが公知である。従って、このような成分を用いて、骨組織による本発明のアナログの送達を増大し得る。あるいは、所望の標的組織（例えば、細胞表面抗原）に特異的に関連する利用可能な物質に特異的に結合する抗体またはその部分もまた使用し得る。所望であれば、例えば、化学的架橋により、または標準的な遺伝子操作技術を用いて、例えば、Asp-Pro結合のような酸不安定結合を作ることにより、このような特異的標的化分子を本発明のアナログに共有結合し得る。有用な標的化分子を、例えば、米国特許第 5,091,513号の教示に従って設計し得る。なおさらに、本発明のアナログを単独で、または組織形態形成に有益な効果を有することが既知の別の物質と組み合わせて、それが必要である哺乳動物に投与し得る。このような物質（本明細書中では補因子）の例としては、組織修復および再生を促進するならびに／または炎症を阻害する物質が挙げられる。骨粗鬆症の個体において骨組織の成長を刺激するために有用な補因子の例としては、例えば、ビタミンD₃、カルシトニン、プロスタグランジン、甲状腺ホルモン、デキサメタゾン、エストロゲンおよびIGF-IまたはIGF-IIが挙げられるが、これらに限定されない。神経組織の修復および再生に有用な補因子は神経増殖因子を含み得る。他の有用な補因子としては、抗菌物質、抗生物質、抗ウイルスおよび抗真菌剤ならびに鎮痛剤および麻酔を含む、症状緩和補因子が挙げられる。アナログを、好ましくは、薬学的に受容可能な、非毒性の賦形剤およびキャリアとの混合により薬学的組成物中で処方する。上記で注記したように、このような組成物を、特に液体溶液または懸濁液の形態での全身的（例えば、非経口）投与；特に錠剤またはカプセルの形態での経口投与；または特に粉末、鼻腔滴またはエアゾールの形態での鼻腔内投与のために調製し得る。組織表面への接着が所望である場合、組成物は、フィブリノーゲン-トロンビン分散剤または例えば、P CT US91/09275（この開示は本明細書中に参考として援用される）に開示されるような他の生物接着剤を含み得る。次いで、組成物は、所望の表面組織に塗布され得るか、スプレーされ得るか、またはその他で適用され得る。組成物を、治療有効量（例えば、所望の効果を誘導するのに十分な時間標的組織に適切な濃度のモルフォゲンアナログを提供する量）でヒトまたは他の哺乳動物に非経口または経口投与するために処方し得る。好ましくは、本発明の組成物は、組織特異的機能の維持または老化組織（例えば、骨減少の骨組織）に対する組織特異的表現型の回復のような、モルフォゲン関連生物学的応答についての哺乳動物の必要性を緩和または軽減する。当業者により認識されるように、哺乳動物に投与するために処方された組成物中の本発明のモルフォゲンアナログの濃度は、投与されるべき特定のアナログの用量、使用されるアナログの化学的特徴（例えば、疎水性）、投与経路、および投与の頻度または間隔を含む、多くの因子に依存して変化する。投与されるべきアナログの好ましい用量はまた、組織の損失または欠如のタイプおよび程度、特定の哺乳動物の全体の健康状態、選択されたアナログの相対的な生物学的効力または毒性、組成物の処方、および処方物中の賦形剤の存在およびタイプのような変化に依存するようである。等価物本発明は、本発明の精神または必須の特徴を逸脱することなく他の特定の形態で具体化され得る。従って、前述の実施態様は、本明細書中に記載された本発明を制限するというよりもむしろすべての点の例示であると考えられるべきである。従って、本発明の範囲は、前述の記載よりもむしろ添付の請求の範囲により示され、そして請求の範囲と同等の意義および範囲で生じるすべての変更が本明細書中に包含されるべきことが意図される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＡ６１Ｋ 31/00 ６０１Ａ６１Ｋ 31/00 ６０９Ｆ６０９６１９Ｄ６１９６２６Ｎ６２６６２９６２９６４３Ｃ６４３ 35/12 35/12 45/00 38/27 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 45/00 Ａ６１Ｋ 37/36 (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims

【特許請求の範囲】１．モルフォゲンの誘導性発現のための細胞であって、以下：（a）該モルフォゲンをコードする第１DNA；（b）該第１DNAと転写的に作動可能に結合する第２DNA、配列番号１のヌクレオチド697-728を含む該第２DNAの配列；および、（c）該細胞が細胞外誘導因子と接触する際に、該第１DNAによりコードされるモルフォゲンの発現を刺激するように、該第２DNAと結合する細胞内物質を産生するための細胞手段、を含む、細胞。２．前記第２DNAの配列が、配列番号１のヌクレオチド682-696および729-731をさらに含む、請求項１に記載の細胞。３．前記第２DNAの配列が、配列番号１のヌクレオチド732-761をなおさらに含む、請求項２に記載の細胞。４．前記細胞外因子が、前記モルフォゲンである、請求項１、２、または３に記載の細胞。５．遺伝子産物のOP-1誘導性発現のための細胞であって、以下：（a）該遺伝子産物をコードする第１DNA；（b）該第１DNAと転写的に作動可能に結合する第２DNA、配列番号１のヌクレオチド697-728を含む該第２DNAの配列；および、（c）該細胞がOP-1と接触する際に、該第１DNAによりコードされる遺伝子産物の発現を刺激するように、該第２DNAと結合する、細胞内物質を産生するための細胞手段、を含む、細胞。６．前記第２DNAの配列が、配列番号１のヌクレオチド682-696および729-731をさらに含む、請求項５に記載の細胞。７．前記第２DNAの配列が、配列番号１のヌクレオチド732-761をなおさらに含む、請求項６に記載の細胞。８．遺伝子産物の誘導性発現のための細胞であって、以下：（a）該遺伝子産物をコードする第１DNA；（b）該第１DNAと転写的に作動可能に結合する第２DNA、配列番号１のヌクレオチド697-728を含む該第２DNAの配列；および、（c）該第２DNAと結合し、その結果、該細胞がOP-1またはモルフォゲンのアナログと接触する際に、該遺伝子産物の発現を刺激する細胞内物質を産生するための細胞の手段、を含む、細胞。９．前記第２DNAの配列が、配列番号１のヌクレオチド682-696および729-731をさらに含む、請求項８に記載の細胞。１０．前記第２DNAの配列が、配列番号１のヌクレオチド732-761をなおさらに含む、請求項９に記載の細胞。１１．モルフォゲンの自己分泌発現を誘導するための方法であって、以下の工程：（a）請求項１に記載の細胞を提供する工程；および、（b）該細胞を、前記第１DNAによりコードされる第２モルフォゲンの発現を誘導するために十分な条件下で、第１モルフォゲンと接触させる工程、を含む、方法。１２．前記第１および第２モルフォゲンが同一のモルフォゲンである、請求項１１に記載の方法。１３．遺伝子産物の発現を誘導するための方法であって、以下の工程：（a）請求項５に記載の細胞を提供する工程；および、（b）該細胞を、該遺伝子産物の発現を誘導するために十分な条件下で、OP-1と接触させる工程、を含む、方法。１４．遺伝子産物の発現を誘導するための方法であって、以下の工程：（a）請求項８に記載の細胞を提供する工程；および、（b）該細胞を、該遺伝子産物の発現を誘導するために十分な条件下で、前記OP- 1またはモルフォゲンのアナログと、接触させる工程、を含む、方法。１５．前記細胞を哺乳動物に提供するさらなる工程を含み、さらに、ここで前記接触する工程（b）が前記モルフォゲンを該哺乳動物に投与することにより行われる、請求項１１に記載の方法。１６．前記細胞を哺乳動物に提供するさらなる工程を含み、さらに、ここで前記接触する工程（b）がOP-1を該哺乳動物に投与することにより行われる、請求項１３に記載の方法。１７．前記細胞を哺乳動物に提供するさらなる工程を含み、さらに、ここで前記接触する工程（b）が前記化合物を該哺乳動物に投与することにより行われる、請求項１４に記載の方法。１８．前記第１DNAによりコードされる前記遺伝子産物がOP-1である、請求項１６または１７に記載の方法。１９．前記哺乳動物が代謝性骨疾患を有する、請求項１８に記載の方法。２０．前記代謝性骨疾患がオステオペニアにより特徴付けられる、請求項１９に記載の方法。２１．モルフォゲン媒介性の生物学的効果を誘導するDNAであって、以下：（a）モルフォゲン応答性転写活性化エレメント、および（b）生物学的活性を有する遺伝子産物をコードする遺伝子の挿入に適切なクローン化部位、ここで該遺伝子が該クローン化部位に挿入される場合に、該遺伝子が作動可能に該モルフォゲン応答性転写活性化エレメントに結合し、その結果該生物学的に活性な遺伝子産物が産生される、で定義されるDNAを含み；該DNAが、モルフォゲンと接触するモルフォゲン応答性細胞に存在する場合に、該挿入されたレポーター遺伝子の転写を誘導するために働く、DNA。２２．前記遺伝子産物が、腎臓、骨、肝臓、および神経組織からなる群から選択される組織によって天然に産生されるポリペプチドである、請求項２１に記載の DNA。２３．前記遺伝子産物がモルフォゲンポリペプチドである、請求項２１に記載の DNA。２４．前記モルフォゲンポリペプチドがOP-1ポリペプチドである、請求項２３に記載のDNA。