JP4235689B2 - 骨疾患を処置するための骨形成タンパク質 - Google Patents
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Description
【0001】
本発明は,ほ乳動物における骨実質を増加するおよび/または骨実質の喪失を防止する手段に関する。
【背景技術】
【0002】
成人は一生に亘って,骨が骨形成と骨吸収(骨転移)との相互作用サイクルを介して再生され続けている。骨吸収は,概して急激に行われ,骨再生部位において単核食細胞の前駆体細胞によって形成された破骨細胞(骨吸収細胞)が介在している。この過程は,次いで,喪失した骨に取って替わって骨を徐々に形成する造骨細胞(骨形成細胞)の出現と継続されていく。再生過程に関与する種々の細胞型の活性は,相互に作用している全身性要因(例えば,ホルモン,リンホカイン,成長因子,ビタミン類)や局所性要因(例えば,サイトカイン,接着分子,リンホカイン,成長因子類)によって制御されている。この過程が完成することが通常はバランスの取れた骨の置換と再生につながるということは,分子のシグナルと,骨再生に影響を及ぼす事象とが緊密に制御されていることを示している。
【0003】
骨再生サイクルにおける失調の原因となる数多くの骨成長障害が知られている。これらのうちで主なものとしては,たとえば,骨粗しょう症,オステオプラシア(骨軟化症),慢性腎不全,副甲状線機能こう進症などの代謝性の骨疾患があり,これらの疾患は骨実質の異常なまたは過剰な喪失を惹起する(骨減少症)。その他の骨疾患としては,ページェット病などが挙げられ,これらもまた局在部位における過剰な骨喪失の原因となる。
【0004】
骨粗しょう症は,骨形成,骨吸収,またはその両方の失調から生じる骨実質の喪失が起因する骨格の構造的劣化であって,骨吸収が骨形成相を支配して病変骨の体重支持能力を減少するものです。健康な成人では,骨形成と骨吸収との割合が緊密に協調し合っていて骨格骨の再生が維持されるようになっている。しかしながら,骨粗しょう症の患者では,これらの骨再生サイクルの不調が進展して,骨実質が喪失しかつ連続した骨格の微小構造に欠損が形成されることになる。これらの骨格欠損は再生連鎖中の不順によって惹起されるが,その欠損が増大して,最終的には骨格構造の統合がひどく破壊されて骨折が起こり易くなってしまう。この不調はほとんどの人が年を取るにつれて徐々に起こるけれども(老人性骨粗しょう症),閉経後の女性ではより激しくかつ急激な割合で発生する。さらに,骨粗しょう症はまた栄養や内分泌の不均衡,遺伝的障害,数多くの悪性変換によって起因する場合もある。
【0005】
慢性腎不全の患者のほとんどは一般的には骨格の骨実質喪失を患っている(腎性骨ジストロフィー)。腎臓の機能不全が血液中のカルシウムとリン酸の不均衡の原因になっているが,今日では透析によってカルシウムとリン酸を補給しても慢性腎不全の患者の腎性骨ジストロフィーを実質的には阻止できないことが知られている。成人において,腎性骨ジストロフィーの症状はり患状態の重大な原因である。子供においても,腎不全は,骨実質を維持したり,骨実質を増加することができなくなり,しばしば成長障害になる。
【0006】
骨軟化症(軟化骨)としても知られているオステオプラシアは,骨無機質化における欠損(例えば,不完全無機質化)であり,典型的にはビタミンD3欠乏(1,25−ジヒドロキシビタミンD3)に関係している。この欠損は,圧迫骨折や,骨実質の減少の原因となるばかりではなく,骨組織の代わりに肥大や増殖性軟骨の領域の拡大の原因にもなる。この欠乏は,栄養欠乏(たとえば,子供におけるくる病),ビタミンDやカルシウムの吸収不良および/またはビタミンの代謝不良によっても生ずる場合がある。
【0007】
副甲状線機能こう進症(副甲状線ホルモンの過剰産生)はカルシウムの吸収不良の原因となり,異常な骨喪失を生ずることになる。子供においては副甲状線機能こう進症は成長を阻害し,成人においては骨格の統合が崩れ,肋骨や椎骨の骨折が特徴的に起こり得る。副甲状線ホルモンの失調は典型的には甲状腺腺腫または腺過形成に起因する場合またはステロイド剤を長期間投与することにより起こる場合がある。二次的副甲状線機能こう進症もまた腎性骨ジストロフィーに起因する場合がある。
【0008】
この疾患の初期段階では,破骨細胞が過剰のホルモンの存在により反応して刺激されて,骨を吸収する。この疾患が進行するにつれて,最終的には小柱骨が吸収されてしまい,骨髄が,微小骨折の結果として,線維形成,マクロファージおよび出血領域に取って替わられる。この状態を,臨床的には,線維性骨炎といっている。
【0009】
ページェット病(変形性骨炎)は,現在では,ビールスが病因であり,局在部位における過剰な骨吸収によって特徴付けられる疾患であり,その部位は発赤し治癒するが,最終的には慢性化し進行性となる。更に悪化して悪性変換となる。この疾患は典型的には25才以上の成人に発生する。
【0010】
今日では,骨減少症の治療は,骨吸収が更に進むことを阻止することにその基盤を置いている。その阻止は,例えば,(1)造血性の単核細胞が成熟した破骨細胞に分化することの阻止,(2)破骨細胞が介在した骨吸収の直接的阻止または(3)骨吸収のホルモンでの制御への作用によって行われている。骨粗しょう症の治療に用いられる薬物療法には,カルシウム補給剤,エストローゲン,カルシトニンおよびジリン酸塩が使用されている。カルシウムとリン酸吸収を強化するとして知られているビタミンD3とその代謝物もまた試みられている。現在の療法はいずれも新しい骨組織の再生を刺激するものではない。更に,これらの薬剤のすべてが骨再生に対して一時的な効果しか持っていない。したがって,ある場合には,疾患の進行が止まったり,遅くなったりしうるけれども,重大な骨劣化を持つ患者にとっては病状が活性化する危険性が依然として残っていることになる。このような危険性は,早期診断が困難だったり,骨の構造的劣化が稀であるがすでに相当進んでいる骨粗しょう症のような疾患において特に顕著に現れることになる。
【0011】
本発明の目的は,例えば,骨格の骨実質を減少する疾患を患っている患者において,特にその疾患が骨再生の失調の原因となっている場合には,骨実質の喪失を阻止または予防するためおよび/または骨形成を増加するための方法および組成物を開発することである。本発明の別の目的は,代謝性骨疾患を含む骨障害を患っている子供の骨成長を強化することである。本発明の更なる目的は,閉経後の女性や老人や透析を受けている患者を含む,骨実質喪失の危険性がある個体の骨劣化を予防または阻止することである。本発明の更に別の目的は,骨折の修復を含む,その構造が傷つけられた骨の微小構造の欠損を修復するための方法ならびに組成物を提供することである。したがって,本発明は,できれば期間を延長して,骨形成を刺激しかつ骨実質を増加することを,更にまた,特に骨格の構造的劣化に起因する骨折が新たに発生することを減少させることを目的としている。
【0012】
本発明のこれらの目的ならびにそのほかの目的および特長を,以下の明細書の記載,図面ならびに請求の範囲によって明かにする。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0013】
本発明は,ほ乳動物,特にヒトにおける骨実質の喪失を阻止するためおよび/または骨形成を刺激するための方法および組成物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【0014】
本発明の第1の態様において,ほ乳動物における骨実質の喪失を予防するためおよび/または骨形成を増加するための療法治療方法および組成物に特長があって,それは,その個体に療法的に有効なモルフォゲンを,その個体において骨実質の喪失を阻止しおよび/またはその骨実質を増加するのに十分な量と期間投与することからなっている。
【0015】
本発明の別の態様では,ほ乳動物における骨実質の喪失を予防するためおよび/または骨形成を増加するための療法治療方法および組成物に特長があって,それは,そのほ乳動物に,内在性モルフォゲンを,そのほ乳動物の体内において,その個体における骨実質の喪失を阻止しおよび/またはその骨実質を増加するのに十分な,療法的に有効な濃度に体内で刺激する化合物を投与することを含んでいる。これらの化合物は,本明細書では,モルフォゲン刺激剤と指称され,ほ乳動物に投与されたときには,通常は,モルフォゲンを産生しおよび/またはモルフォゲンを分泌する能力を持っているかまたはその産生および/または分泌が可能である組織または臓器に作用しかつモルフォゲンの内在レベルを変化させる物質をも包含するものと理解される。このモルフォゲン刺激剤は,例えば,内在モルフォゲンの発現および/または分泌を刺激することによって作用することもできる。
【0016】
ここに記載したモルフォゲンは,個体において適当な骨実質を維持するに当たって重要な役割を果たしているものと信じられている。従って,本発明によって,モルフォゲンを,適当な骨実質を維持するのに助けが必要な個体および/または骨再生における失調に苦しんでいる個体に投与することができる。例えば,本発明によって,モルフォゲンまたはモルフォゲン刺激剤は,腎不全を患っている成人に対して,その疾患に関連している骨劣化を予防するために,例えば後期腎不全による骨喪失を補正するために投与することができる。同様に,腎不全を患っている子供にモルフォゲンを投与することは,子供の骨実質の喪失を軽減すると共に,骨形成を刺激し,それにより成長を促すことが期待できる。更に,骨格の微少構造の欠損を患っている個体にモルフォゲンまたはモルフォゲン刺激剤を投与することは,その欠損の修復になると共に,処置された骨の重量支持能力を強化することも期待される。
【0017】
従って,本発明の別の態様では,本発明に係る療法治療方法および組成物は,骨実質喪失を含む,骨折やその他の骨格の微小構造の欠損の原因となったり,かかる骨折や欠損を生じかつ骨の体重支持能力を傷めるところの骨折やいかなる疾患をも処置するために使用することができる。かかる疾患としては,例えば,慢性腎不全やその他の腎臓疾患,特に透析を必要とするもの;骨軟化症;ビタミンD欠乏誘発骨減少症または骨粗しょう症;閉経後もしくは老人性骨粗しょう症;,副甲状線機能こう進症ならびにページェット病などが挙げられる。
【0018】
本発明の更なる態様において,本発明は,モルフォゲンまたはモルフォゲン刺激剤を予防的に投与することによって骨格の骨実質の喪失または劣化の危険がある個体を保護するための方法と組成物を提供するものである。危険な状態にある個体には,閉経後の女性,老人,特に長期間または慢性的に透析を受けている個人などが含まれる。
【0019】
本発明の好ましい具体的な態様の1つとして,モルフォゲンまたはモルフォゲン刺激剤は,個体に全身的に経口または非経口によって投与される。本発明の他の具体的な態様では,モルフォゲンは,例えば,骨膜または骨内膜に注射することによって骨に直接投与することができる。直接注射は骨折を含む骨の微小構造の欠損を修復するのに特に有用である。
【0020】
本発明のいずれの処置法においても,「モルフォゲン投与」という用語はモルフォゲンを単独でまたは他の分子との併用で投与することを意味している。例えば,モルフォゲンの成熟型は,タンパク質の溶解度を高めることが知られている,モルフォゲンの前駆体”プロ”ドメインに関連して与えられる。タンパク質の溶解度を高めることが知られているその他の有用な分子としては,種々の血清タンパク質の他に,カゼインやその他のミルク成分が含まれる。モルフォゲンまたはモルフォゲン刺激剤に関連することができるその他の有用な分子としては,モルフォゲンまたはモルフォゲン刺激剤を骨に導くことができる組織標的分子も含まれる。本発明の処置プロトコルに有用な組織標的分子としては,例えば,テトラサイクリン,ジリン酸塩ならびに抗体または,骨組織細胞上の表面分子と特異的に相互作用するその他の結合タンパク質が含まれる。
【0021】
更に別の有用な組織標的分子としては,モルフォゲンの前駆体”プロ”ドメイン,特にOP−1,BMP2またはBMP4のそれが含まれる。これらのタンパク質は,天然においては,骨組織に関連しているが,他の組織で合成されており,合成細胞から分泌された後に骨組織を標的としていることが判明している。例えば,主なOP−1合成源は尿管の組織,例えば,腎組織であると考えらているが,そのタンパク質は,後述するように骨組織において活性であることが示されている。更に,そのタンパク質は血清,唾液,種々のミルク中からも同定されている。更にまた,そのタンパク質の分泌型は,完全なモルフォゲンシーケンスのプロドメインに関連する成熟したダイマーからなっている。従って,関連しているモルフォゲンプロドメインが作用して生体内において特異的なモルフォゲンが異なる組織を標的とすることができる。
【0022】
組織を標的にする関連分子または溶解度を高める関連分子はまた,酸に不安定な結合を含む,標準的な化学的手段を用いて,モルフォゲンに共役結合することができ,その結合は骨再生部位の酸性環境下において容易に切断されるのが好ましい。
【0023】
モルフォゲンまたはモルフォゲン刺激剤もまた,骨再生に対して有益な効果を及ぼすことが知られているその他の「補因子」と共に投与することができる。かかる補因子としては,例えば,甲状腺ホルモン,ビタミンD3,プロスタグランジン,デキサメタゾン,IGF(I,II)ならびにそれらの結合タンパク質および造骨細胞活性を強化するその他の薬剤が挙げられる。更にその他の補因子として,カルシトニン,エストローゲン,その他の骨吸収阻害薬剤が含まれる。
【0024】
本発明に有用なモルフォゲンとしては,例えば,元来骨形成タンパク質として同定されたタンパク質,例えば,OP−1,OP−2,CBMP2タンパク質や,アミノ酸シーケンス関連タンパク質,例えば,DPP(キイロショウジョウバエから),Vgl(ツメガエルから),Vgr−1(マウスから;アメリカ特許第5011691号;Oppermann et al.),GDF−1(マウスから;Lee:PNAS88巻,4250−4254頁,1991年)などが挙げられる。これらの全てを下表IIに示し,シーケンスID5−14番とする。また最近同定された60Aタンパク質(キイロショウジョウバエから:Wharton et al.:PNAS88巻,9214−9218頁,1991年;シーケンスID24番)も含まれる。このファミリーの構成員には,C末端領域における実質的なアミノ酸シーケンスホモロジーが共通であるTGF−βスーパーファミリーのタンパク質の構成員も含まれている。そのタンパク質は,典型的には約30個以下の残基からなるN末端シグナルペプチドシーケンスを持つ前駆体として翻訳され,その後に切断されて成熟したシーケンスを生成するプロドメインが続いている。そのシグナルペプチドは,翻訳に際して,VonHeijne法(Nucleic Acids Research:14巻4683−4691頁,1986年)によって所定シーケンスにおける切断部位において,急激に切断される。下表Iには,本明細書に使用された命名を含めて,今日まで同定された種々のモルフォゲンの種類,そのシーケンスID番号およびシーケンス表に含まれていないフルレングスタンパク質のアミノ酸シーケンスの刊行源を記載している。これらの刊行物も本明細書に参照として含まれるものとする。
【表I】
【0025】
【0026】
OP−2タンパク質は,このファミリーの他のタンパク質と共通した保存システイン骨格に加えて,この領域においてもう1つのシステイン残基(例えば,シーケンスID7番と8番の残基41)を有している。GDF−1タンパク質は,保存骨格中に4個のアミノ酸インサート(シーケンスID14番の残基44−47)を有しているが,このインサートは折り畳まれた構造のシステイン類の関係を干渉していない。加えて,CBMP2タンパク質にはそのシステイン骨格中から1個のアミノ酸残基が抜けている。
【0027】
モルフォゲンは,還元されると不活性であるが,酸化ホモダイマーとして活性であり,本発明の他のモルフォゲンと組み合わせて酸化すると活性である。従って,ここで定義したように,モルフォゲンは1対のポリペプチド鎖からなるダイマータンパク質であり,その各ポリペプチド鎖は,シーケンスID5番の残基43−139によって規定されたC末端6システイン骨格から少なくとも構成されていて,それにはこれらのシステインの機能的に均等な配置(例えば,シーケンス中のシステインの線状配置は変化させるけれども折り畳まれた構造中の関係は変更しないアミノ酸挿入または除去)は含まれる。そのポリペプチド鎖が折り畳まれているときには,1対のポリペプチド鎖からなるダイマータンパク質スピーシズ(種)は,そのタンパク質が本明細書で定義されたようにモルフォゲンとして作用することができるように鎖内または鎖間での適当なジスルフィド結合を含む適当な3次元構造を有している。更に具体的には,モルフォゲンは一般的には形態学的に許容される環境下において,下記のような生物学的な機能の全てを果たすことが可能である:祖先細胞の増殖の刺激;祖先細胞の分化の刺激;分化細胞の増殖の刺激;および変形細胞の再分化を含む,分化細胞の成長ならびに維持の支援。加えて,これらのモルフォゲンは,適当な環境条件下で始動細胞の再分化を惹起することが可能であることが容易に予測される。
【0028】
本発明の1つの好ましい態様においては,本発明のモルフォゲンは,2種の一般アミノ酸シーケンスのうちの1つからなっている:一般シーケンス1(シーケンスID1番)または一般シーケンス2(シーケンスID2番)。それぞれのシーケンスにおいて,記号Xaaは天然に存在するL−異性体の20個のα−アミノ酸またはその誘導体からなっている。一般シーケンス1は保存6システイン骨格からなり,一般シーケンス2は保存6システイン骨格に加えてOP−2において同定されたもう1個のシステイン(シーケンスID2番の残基36)からなっている。本発明の別の好ましい態様においては,これらのシーケンスは更にそれらのN末端に次のシーケンスを有している:
前述した一般シーケンス中の好ましいアミノ酸シーケンスは次の通りである:一般シーケンス3(シーケンスID3番);一般シーケンス4(シーケンスID4番);一般シーケンス5(シーケンスID30番);および一般シーケンス6(シーケンスID31番)で,これらは下記にリストされている。これらの一般シーケンスは,表IIで同定したこのモルフォゲンファミリーの種々の好ましい構成員と共通のホモロジーを有すると共に,シーケンスの間でアミノ酸シーケンスが変化している。具体的には,一般シーケンス3と4とは,表IIで示されかつシーケンスID5番ないし14番と同定された下記のタンパク質の複合アミノ酸シーケンスからなっている:ヒトOP−1(hOP−1:シーケンスID5番および16−17番);マウスmOP−1(mOP−1:シーケンスID6番および18−19番);ヒトおよびマウスOP−2(シーケンスID7番,8番および20−22番);CBMP2A(シーケンスID9番);CBMP2B(シーケンスID10番);DPP(キイロショウジョウバエから:シーケンスID11番);Vgl(ツメガエルから:シーケンスID12番);Vgr−1(マウスから:シーケンスID13番);およびGDF−1(マウスから:シーケンスID14番)。これらの一般シーケンスは,表IIに示したシーケンスによって共有されたアミノ酸の同一性と共に,シーケンス中の可変位置において選択できる残基とを包含している。これらの一般シーケンスには,一般シーケンス3または4におけるそれぞれの位置41または46においてシステインが存在していてもよく,それによって分子内または分子間のジスルフィド結合を形成することができかつタンパク質の三次構造に影響を及ぼすある種の臨界アミノ酸を含むことができる。
【0029】
一般シーケンス3
【0030】
上記式において,各Xaaは,以下に定める特定のアミノ酸の1個またはそれ以上のグループから独立に選ばれるものを示している:残基4のXaa=(Ser,AspまたはGlu);残基6のXaa=(Arg,Gln,SerまたはLys);残基7のXaa=(AspまたはGlu);残基8のXaa=(LeuまたはVal);残基11のXaa=(Gln,Leu,Asp,HisまたはAsn);残基12のXaa=(Asp,ArgまたはAsn);残基14のXaa=(IleまたはVal);残基15のXaa=(IleまたはVal);残基18のXaa=Glu,Gln,Leu,Lys,ProまたはArg);残基20のXaa=(TyrまたはPhe);残基21のXaa=(Ala,Ser,Asp,Met,His,LeuまたはGln);残基23のXaa=(Tyr,AsnまたはPhe);残基26のXaa=(Glu,His,Tyr,AspまたはGln);残基28のXaa=(Glu,Lys,AspまたはGln);残基30のXaa=(Ala,Ser,ProまたはGln);残基31のXaa=(Phe,LeuまたはTyr);残基33のXaa=(LeuまたはVal);残基34のXaa=(Asn,Asp,AlaまたはThr);残基35のXaa=(Ser,Asp,Glu,LeuまたはAla);残基36のXaa=(Tyr,Cys,His,SerまたはIle);残基37のXaa=(Met,Phe,GlyまたはLeu);残基38のXaa=(AsnまたはSer);残基39のXaa=(Ala,SerまたはGly);残基40のXaa=(Thr,LeuまたはSer);残基44のXaa=(IleまたはVal);残基45のXaa=(ValまたはLeu);残基46のXaa=(GlnまたはArg);残基47のXaa=(Thr,AlaまたはSer);残基49のXaa=(ValまたはMet);残基50のXaa=(HisまたはAsn);残基51のXaa=(Phe,Leu,Asn,Ser,AlaまたはVal);残基52のXaa=(Ile,Met,Asn,AlaまたはVal);残基53のXaa=(Asn,Lys,AlaまたはGlu);残基54のXaa=(ProまたはSer);残基55のXaa=(Glu,Asp,AsnまたはGly);残基56のXaa=(Thr,Ala,Val,Lys,Asp,Tyr,SerまたはAla);残基57のXaa=(Val,AlaまたはIle);残基58のXaa=(ProまたはAsp);残基59のXaa=(LysまたはLeu);残基60のXaa=(ProまたはAla);残基63のXaa=(AlaまたはVal);残基65のXaa=(ThrまたはAla);残基66のXaa=(Gln,Lys,ArgまたはGlu);残基67のXaa=(Leu,MetまたはVal);残基68のXaa=(Asn,SerまたはAsp);残基69のXaa=(Ala,ProまたはSer);残基70のXaa=(Ile,ThrまたはVal);残基71のXaa=(SerまたはAla);残基72のXaa=(ValまたはMet);残基74のXaa=(TyrまたはPhe);残基75のXaa=(Phe,TyrまたはLeu);残基76のXaa=(AspまたはAsn);残基77のXaa=(Asp,Glu,AsnまたはSer);残基78のXaa=(Ser,Gln,AsnまたはTyr);残基79のXaa=(Ser,Asn,AspまたはGlu);残基80のXaa=(Asn ThrまたはLys);残基82のXaa=(IleまたはVal);残基84のXaa=(LysまたはArg);残基85のXaa=(Lys,Asn,GlnまたはHis);残基86のXaa=(TyrまたはHis);残基87のXaa=(Arg,GlnまたはGlu);残基88のXaa=(Asn,GluまたはAsp);残基90のXaa=(Val,ThrまたはAla);残基92のXaa=(Arg,Lys,Val,AspまたはGlu);残基93のXaa=(Ala,GlyまたはGlu);および残基97のXaa=(HisまたはArg)。
【0031】
一般シーケンス4
【0032】
上記式中において,各Xaaは,以下に定める特定のアミノ酸の1個またはそれ以上のグループから独立に選ばれるものを示している:残基2のXaa=(LysまたはArg);残基3のXaa=(LysまたはArg);残基4のXaa=(HisまたはArg);残基5のXaa=(Glu,Ser,His,Gly,ArgまたはPro);残基9のXaa=(Ser,AspまたはGlu);残基11のXaa=(Arg,Gln,SerまたはLys);残基12のXaa=(AspまたはGlu);残基13のXaa=(LeuまたはVal);残基16のXaa=(Gln,Leu,Asp,HisまたはAsn);残基17のXaa=(Asp,ArgまたはAsn);残基19のXaa=(IleまたはVal);残基20のXaa=(IleまたはVal);残基23のXaa=(Glu,Gln,Leu,Lys,ProまたはArg);残基25のXaa=(TyrまたはPhe);残基26のXaa=(Ala,Ser,Asp,Met,His,LeuまたはGln);残基28のXaa=(Tyr,AsnまたはPhe);残基31のXaa=(Glu,His,Tyr,AspまたはGln);残基33のXaa=(Glu,Lys,AspまたはGln);残基35のXaa=(Ala,SerまたはPro);残基36のXaa=(Phe,LeuまたはTyr);残基38のXaa=(LeuまたはVal);残基39のXaa=(Asn,Asp,AlaまたはThr);残基40のXaa=(Ser,Asp,Glu,LeuまたはAla);残基41のXaa=(Tyr,Cys,His,SerまたはIle);残基42のXaa=(Met,Phe,GlyまたはLeu);残基44のXaa=(Ala,SerまたはGly);残基45のXaa=(Thr,LeuまたはSer);残基49のXaa=(IleまたはVal);残基50のXaa=(ValまたはLeu);残基51のXaa=(GlnまたはArg);残基52のXaa=(Thr,AlaまたはSer);残基54のXaa=(ValまたはMet);残基55のXaa=(HisまたはAsn);残基56のXaa=(Phe,Leu,Asn,Ser,AlaまたはVal);残基57のXaa=(Ile,Met,Asn,AlaまたはVal);残基58のXaa=(Asn,Lys,AlaまたはGlu);残基59のXaa=(ProまたはSer);残基60のXaa=(Glu,AspまたはGly);残基61のXaa=(Thr,Ala,Val,Lys,Asp,Tyr,SerまたはAla);残基62のXaa=(Val,AlaまたはIle);残基63のXaa=(ProまたはAsp);残基64のXaa=(LysまたはLeu);残基65のXaa=(ProまたはAla);残基68のXaa=(AlaまたはVal);残基70のXaa=(ThrまたはAla);残基71のXaa=(Gln,Lys,ArgまたはGlu);残基72のXaa=(Leu,MetまたはVal);残基73のXaa=(Asn,SerまたはAsp);残基74のXaa=(Ala,ProまたはSer);残基75のXaa=(Ile,ThrまたはVal);残基76のXaa=(SerまたはAla);残基77のXaa=(ValまたはMet);残基79のXaa=(TyrまたはPhe);残基80のXaa=(Phe,TyrまたはLeu);残基81のXaa=(AspまたはAsn);残基82のXaa=(Asp,Glu,AsnまたはSer);残基83のXaa=(Ser,Gln,AsnまたはTyr);残基84のXaa=(Ser,Asn,AspまたはGlu);残基85のXaa=(Asn,ThrまたはLys);残基87のXaa=(IleまたはVal);残基89のXaa=(LysまたはArg);残基90のXaa=(Lys,Asn,GlnまたはHis);残基91のXaa=(TyrまたはHis);残基92のXaa=(Arg,GlnまたはGlu);残基93のXaa=(Asn,GluまたはAsp);残基95のXaa=(Val,ThrまたはAla);残基97のXaa=(Arg,Lys,Val,AspまたはGlu);残基98のXaa=(Ala,GlyまたはGlu);および残基102のXaa=(HisまたはArg)。
【0033】
同様に,一般シーケンス5(シーケンスID30番)と一般シーケンス6(シーケンスID31番)とは,表IIで同定したこのモルフォゲンタンパク質ファミリーの全ての構成員と共通のホモロジーを有している。具体的には,一般シーケンス5と6とは,下記のタンパク質の複合アミノ酸シーケンスからなっている:ヒトOP−1(hOP−1:シーケンスID5番および16−17番);マウスmOP−1(mOP−1:シーケンスID6番および18−19番);ヒトおよびマウスOP−2(シーケンスID7番,8番および20−22番);CBMP2A(シーケンスID9番);CBMP2B(シーケンスID10番);DPP(キイロショウジョウバエから:シーケンスID11番);Vgl(ツメガエルから:シーケンスID12番);Vgr−1(マウスから:シーケンスID13番);GDF−1(マウスから:シーケンスID14番および32番);ヒトBMP3(シーケンスID26番);ヒトBMP5(シーケンスID27番);ヒトBMP6(シーケンスID28番);および60A(キイロショウジョウバエから:シーケンスID24番)。これらの一般シーケンスは,6個および7個のシステイン骨格(それぞれ一般シーケンス5および6)で規定されたC末端ドメイン中のこれらのシーケンスによって共有されたアミノ酸の同一性と共に,シーケンス中の可変位置において選択できる残基とを包含している。一般シーケンス3および4のように,これらの一般シーケンス5および6には,位置41(一般シーケンス5)および位置46(一般シーケンス6)にもう1個のシステインが存在していて,それによって分子内または分子間のジスルフィド結合を形成することができかつタンパク質の三次構造に影響を及ぼすある種の臨界アミノ酸を含むことができる。
【0034】
一般シーケンス5
【0035】
上記式において,各Xaaは,以下に定める特定のアミノ酸の1個またはそれ以上のグループから独立に選ばれるものを示している:残基2のXaa=(TyrまたはLys);残基3のXaa=(ValまたはIle);残基4のXaa=(Ser,AspまたはGlu);残基6のXaa=(Arg,Gln,Ser,LysまたはAla);残基7のXaa=(Asp,GluまたはLys);残基8のXaa=(Leu,ValまたはIle);残基11のXaa=(Gln,Leu,Asp,His,AsnまたはSer);残基12のXaa=(Asp,Arg,AsnまたはGlu);残基14のXaa=(IleまたはVal);残基15のXaa=(IleまたはVal);残基16のXaa=(AlaまたはSer);残基18のXaa=(Glu,Gln,Leu,Lys,ProまたはArg);残基19のXaa=(GlyまたはSer);残基20のXaa=(TyrまたはPhe);残基21のXaa=(Ala,Ser,Asp,Met,His,Gln,LeuまたはGly);残基23のXaa=(Tyr,AsnまたはPhe);残基26のXaa=(Glu,His,Tyr,Asp,GlnまたはSer);残基28のXaa=(Glu,Lys,Asp,GlnまたはAla);残基30のXaa=(Ala,Ser,Pro,GlnまたはAsn);残基31のXaa=(Phe,LeuまたはTyr);残基33のXaa=(Leu,ValまたはMet);残基34のXaa=(Asn,Asp,Ala,ThrまたはPro);残基35のXaa=(Ser,Asp,Glu,Leu,AlaまたはLys);残基36のXaa=(Tyr,Cys,His,SerまたはIle);残基37のXaa=(Met,Phe,GlyまたはLeu);残基38のXaa=(Asn,SerまたはLys);残基39のXaa=(Ala,Ser,GlyまたはPro);残基40のXaa=(Thr,LeuまたはSer);残基44のXaa=(Ile,ValまたはThr);残基45のXaa=(Val,LeuまたはIle);残基46のXaa=(GlnまたはARg);残基47のXaa=(Thr,AlaまたはSer);残基48のXaa=(LeuまたはIle);残基49のXaa=(ValまたはMet);残基50のXaa=(His,AsnまたはArg);残基51のXaa=(Phe,Leu,Asn,Ser,AlaまたはVal);残基52のXaa=(Ile,Met,Asn,Ala,ValまたはLeu);残基53のXaa=(Asn,Lys,Ala,Glu,GlyまたはPhe);残基54のXaa=(Pro,SerまたはVal);残基55のXaa=(Glu,Asp,Asn,Gly,ValまたはLys);残基56のXaa=(Thr,Ala,Val,Lys,Asp,Tyr,Ser,Ala,ProまたはHis);残基57のXaa=(Val,AlaまたはIle);残基58のXaa=(ProまたはAsp);残基59のXaa=(Lys,LeuまたはGlu);残基60のXaa=(ProまたはAla);残基63のXaa=(AlaまたはVal);残基65のXaa=(Thr,AlaまたはGlu);残基66のXaa=(Gln,Lys,ArgまたはGlu);残基67のXaa=(Leu,MetまたはVal);残基68のXaa=(Asn,Ser,AspまたはGly);残基69のXaa=(Ala,ProまたはSer);残基70のXaa=(Ile,Thr,ValまたはLeu);残基71のXaa=(Ser,AlaまたはPro);残基72のXaa=(Val,MetまたはIle);残基74のXaa=(TyrまたはPhe);残基75のXaa=(Phe,Tyr,LeuまたはHis);残基76のXaa=(Asp,AsnまたはLeu);残基77のXaa=(Asp,Glu,AsnまたはSer);残基78のXaa=(Ser,Gln,Asn,TyrまたはAsp);残基79のXaa=(Ser,Asn,Asp,GluまたはLys);残基80のXaa=(Asn,ThrまたはLys);残基82のXaa=(Ile,ValまたはAsn);残基84のXaa=(LysまたはArg);残基85のXaa=(Lys,Asn,Gln,HisまたはVal);残基86のXaa=(TyrまたはHis);残基87のXaa=(Arg,Gln,GluまたはPro);残基88のXaa=(Asn,GluまたはAsp);残基90のXaa=(Val,Thr,AlaまたはIle);残基92のXaa=(Arg,Lys,Val,AspまたはGlu);残基93のXaa=(Ala,Gly,GluまたはSer);残基95のXaa=(GlyまたはAla);および残基97のXaa=(HisまたはArg)。
【0036】
一般シーケンス6
【0037】
上記式において,各Xaaは,以下に定める特定のアミノ酸の1個またはそれ以上のグループから独立に選ばれるものを示している: 残基2のXaa=(Lys,Arg,AlaまたはGln);残基3のXaa=(Lys,ArgまたはMet);残基4のXaa=(His,ArgまたはGln);残基5のXaa=(Glu,Ser,His,Gly,Arg,Pro,ThrまたはTyr);残基7のXaa=(TyrまたはLys);残基8のXaa=(ValまたはIle);残基9のXaa=(Ser,AspまたはGlu);残基11のXaa=(Arg,Gln,Ser,LysまたはAla);残基12のXaa=(Asp,GluまたはLys);残基13のXaa=(Leu,ValまたはIle);残基16のXaa=(Gln,Leu,Asp,His,AsnまたはSer);残基17のXaa=(Asp,Arg,AsnまたはGlu);残基19のXaa=(IleまたはVal);残基20のXaa=(IleまたはVal);残基21のXaa=(AlaまたはSer);残基23のXaa=(Glu,Gln,Leu,Lys,ProまたはArg);残基24のXaa=(GlyまたはSer);残基25のXaa=(TyrまたはPhe);残基26のXaa=(Ala,Ser,Asp,Met,His,Gln,LeuまたはGly);残基28のXaa=(Tyr,AsnまたはPhe);残基31のXaa=(Glu,His,Tyr,Asp,GlnまたはSer);残基33のXaa=(Glu,Lys,Asp,GlnまたはAla);残基35のXaa=(Ala,Ser,Pro,GlnまたはAsn);残基36のXaa=(Phe,LeuまたはTyr);残基38のXaa=(Leu,ValまたはMet);残基39のXaa=(Asn,Asp,Ala,ThrまたはPro);残基40のXaa=(Ser,Cys,His,SerまたはIle);残基41のXaa=(Tyr,Cys,His,SerまたはIle);残基42のXaa=(Met,Phe,GlyまたはLeu);残基43のXaa=(Asn,SerまたはLys);残基44のXaa=(Ala,Ser,GlyまたはPro);残基45のXaa=(Thr,LeuまたはSer);残基49のXaa=(Ile,ValまたはThr);残基50のXaa=(Val,LeuまたはIle);残基51のXaa=(GlnまたはArg);残基52のXaa=(Thr,AlaまたはSer);残基53のXaa=(LeuまたはIle);残基54のXaa=(ValまたはMet);残基55のXaa=(His,AsnまたはArg);残基56のXaa=(Phe,Leu,Asn,Ser,AlaまたはVal);残基57のXaa=(Ile,Met,Asn,Ala,ValまたはLeu);残基58のXaa=(Asn,Lys,Ala,Glu,GlyまたはPhe);残基59のXaa=(Pro,SerまたはVal);残基60のXaa=(Glu,Asp,Gly,ValまたはLys);残基61のXaa=(Thr,Ala,Val,Lys,Asp,Tyr,Ser,Ala,ProまたはHis);残基62のXaa=(Val,AlaまたはIle);残基63のXaa=(ProまたはAsp);残基64のXaa=(Lys,LeuまたはGlu);残基65のXaa=(ProまたはAla);残基68のXaa=(AlaまたはVal);残基70のXaa=(Thr,AlaまたはGlu);残基71のXaa=(Gln,Lys,ArgまたはGlu);残基72のXaa=(Leu,MetまたはVal);残基73のXaa=(Asn,Ser,AspまたはGly);残基74のXaa=(Ala,ProまたはSer);残基75のXaa=(Ile,Thr,ValまたはLeu);残基76のXaa=(Ser,AlaまたはPro);残基77のXaa=(Val,MetまたはIle);残基79のXaa=(TyrまたはPhe);残基80のXaa=(Phe,Tyr,LeuまたはHis);残基81のXaa=(Asp,AsnまたはLeu);残基82のXaa=(Asp,Glu,AsnまたはSer);残基83のXaa=(Ser,Gln,Asn,TyrまたはAsp);残基84のXaa=(Ser,Asn,Asp,GluまたはLys);残基85のXaa=(Asn,ThrまたはLys);残基87のXaa=(Ile,ValまたはAsn);残基89のXaa=(LysまたはArg);残基90のXaa=(Lys,Asn,Gln,HisまたはVal);残基91のXaa=(TyrまたはHis);残基92のXaa=(Arg,Gln,GluまたはPro);残基93のXaa=(Asn,GluまたはAsp);残基95のXaa=(Val,Thr,AlaまたはIle);残基97のXaa=(Arg,Lys,Val,AspまたはGlu);残基98のXaa=(Ala,Gly,GluまたはSer);残基100のXaa=(GlyまたはAla);および残基102のXaa=(HisまたはArg)。
【0038】
本発明においてモルフォゲンとして使用するための特に有用なシーケンスとしては,例えば,Vgl,Vgr−1,DPP,OP−1,OP−2,CBMP−2A,CBMP−2B,GDF−1(表II;それぞれシーケンスID5番−14番)のC末端96−102アミノ酸残基を含むC末端ドメイン;ならびに60A,BMP3,BMP5およびBMP6(表II;それぞれシーケンスID24番−28番)のC末端ドメインからなるタンパク質などが挙げられる。これらの全ては,少なくとも保存6または7システイン骨格を含んでいる。更に,アメリカ特許第5011691号に記載されているCOP−1,3−5,7,16のような一般アミノ酸シーケンスからデザインされた生合成構成物もまた有用である。インヒビン/アクチビンタンパク質も含まれる(アメリカ特許第4968590号および第5011691号)。したがって,その他の有用なシーケンスは,上述したいずれのシーケンスとも,少なくとも70%のアミノ酸シーケンスホモロジーもしくは類似性,好ましくは80%のアミノ酸シーケンスホモロジーもしくは類似性を有しているものが好ましい。これらのシーケンスは,対立遺伝子および種変異型や突然変異型,さらには生合成突然変異タンパク質ばかりでなく,タンパク質のこの形態形成ファミリーをも含まれることは明らかに予想される。特に,関連タンパク質のファミリーに含まれるものとしては,形態形成活性を示すタンパク質や,好ましいシーケンスからのアミノ酸変換が同類変換(例えば,Dayoff,et al: Atlas of Protein Sequence and Structure; 5巻追補3,345−362頁,(M.0. Dayoff,ed., Nat’l BioMed. Research Fdn., Washington, D.C. 1979))を含むものなどが挙げられる。本発明に使用されるものとして潜在的に有用であるシーケンスとしては,ニードルマン法(Needleman,et al: J.Mol. Biol., 48: 443-453(1970))を用いて得られた公知のモルフォゲンシーケンスも含まれる。その同一性はアライン(Align)プログラムによって計算される。本明細書で使用する「ホモロジー」または「類似性」という用語はDayoffらによって定義されるような許容された同類置換も含まれる。
【0039】
本発明においてモルフォゲンとして有用な現在もっとも好ましいタンパク質シーケンスは,例えば,hOP1の保存6システイン骨格を規定するアミノ酸シーケンス(例えば,シーケンスID5番の残基43−139)と,例えば,60%以上の同一性,好ましくは65%以上の同一性を有するものである。これらのもっとも好ましいシーケンスは,キイロショウジョウバエからの60Aタンパク質の他に,OP−1およびOP−2タンパク質の対立遺伝子と種変異型を含んでいる。したがって,本発明の別の好ましい態様において,有用なモルフォゲンとしては,本明細書で「OPX」と指称する一般アミノ酸シーケンスを持つポリペプチド鎖からなる活性タンパク質も含まれる。それはOP−1として同定された種々の種とOP−2(シーケンスID29番)として同定された種々の種との間のホモロジーを持っている。
【0040】
本発明に係る方法,組成物ならびに装置に有用なモルフォゲンとしては,天然の源から単離されたかどうかや組換えDNAもしくはその他の合成技術で作製したかどうかにかかわらず,前述したポリペプチド鎖のいずれからなるタンパク質ばかりでなく,天然もしくは生合成の突然変異株のタンパク質の対立遺伝子ならびに種変異型や,種々の切形の構成物ならびに融合構成物も含まれる。その変更が折り畳まれた構造中のこれらのシステインの関係が機能的に崩壊させない限り,保存C末端システイン骨格を変更するものであっても,削除または付加突然変種も活性であるといえる。したがって,かかる活性の形態は本明細書に具体的に記載した構成物と均等物であると考えられる。このタンパク質としては,種々の異なるグリコシレーションパターン形のもの,N末端,アミノ酸シーケンスホモロジーの領域を有する関連タンパク質ファミリーならびに,ホスト細胞中の組換えDNAの発現によって作製された,天然または生合成のタンパク質の活性切形もしくは変異させた形態のものなどが含まれる。形態形成タンパク質は,完全なまたは切形のcDNAからまたは原核細胞または真核細胞中の合成DNAから発現させることができ,その後精製,切断,再生,二量化して形態形成的に活性な組成物を作成する。現在好ましいホスト細胞としては,E.coliや,CHO,COSもしくはBSC細胞のようなほ乳動物の細胞が挙げられる。本発明に係る方法ならびに組成物に有用なモルフォゲンについての詳細は,1991年8月30日付けのアメリカ特許出願第752764号と1991年3月11日付けの同第667274号に記載されている。これらの記載も本明細書に参照として組み込まれているものとする。
【発明の効果】
【0041】
つまり,本明細書の開示から,遺伝子工学の当業者であれば,適当なアミノ酸シーケンスをコードする種々の異なる種のcDNAもしくは遺伝子ライブラリーから遺伝子を単離することまたオリゴヌクレオチドからDNAを構築することができ,次いで,原核細胞もしくは真核細胞を含む,種々の形式のホスト細胞中に発現させて,人を含むほ乳動物において,骨形成を促進するおよび/または異常な骨劣化を阻止することができ,適当な骨実質を維持しかつ骨再生および成人の骨組織を発達させるのに使用する活性タンパク質を大量に製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【0042】
本明細書に記載されたタンパク質が,ほ乳動物に対して全身的に付与されたりまたはその骨組織に向けて注入されたときには,骨実質喪失の防止しおよび/または骨形成を刺激するための有効な薬剤であることが見いだされた。前述したように,これらのタンパク質(モルフォゲン)は,骨再生サイクルの失調の原因となったりおよび/または骨格の微小構造の劣化の原因となる代謝性骨疾患ならびにその他の傷害の治療に使用することができる。
【0043】
本発明は,ほ乳動物における骨組織の形態形成を誘発することができる形態形成タンパク質のファミリーの発見に基づいている。更に詳細には,本発明は,胚形成ばかりではなく,幼若ならびに成長したほ乳動物における骨組織の成長,維持ならびに修復においても重要な役割を果たしていることを見いだしたことに基づいている
モルフォゲン(OP−1,CMBP2,DPP,60Aタンパク質などや,COP5,COP7などの種々の生合成構造物を含む)を,ほ乳動物の皮下部に対して適当なマトリックスと共に移植すれば,アルカリ性ホスファターゼの特異的活性,12日目の移植片のカルシウム含量ならびに組織構造(例えば,アメリカ特許第4968590号,第5011691号,USSN第752857号を参照のこと。なおこれらの内容は本明細書の参照として記載の1部をなしている)によって特定されたように,完全に機能的に新規な骨の形成につながる一連の細胞事象を誘発する。モルフォゲン含有移植片は近接の間葉の幹細胞を漸増し,それらの分化を軟骨細胞に5−7日以内に変化させてしまう。毛細管浸入によって,軟骨細胞肥大が石灰化して,結果的には9−12日経つと新しく形成された骨によって置換される。無機化した骨はついで大幅に再生され,14−21日までには機能的な骨髄要素で満たされる小骨によって占有されることになる。
【0044】
前述したように,本明細書に例示したモルフォゲンは,生体外(in vitro)において造骨細胞の増殖,成長ならびに分化を刺激し(実施例2−7参照),かつ,ほ乳動物に対して会合したマトリックスキャリヤーなしに全身的に付与されたりまたはその骨組織に向けて注入されたときには,生体内(in vivo)で骨粗しょう症の骨組織中での骨形成を誘発することができる(実施例8および9参照)。更に,モルフォゲンは,活性化された初期単核食細胞の多核化を阻止する(実施例12参照)。さらにまた,内在するモルフォゲン活性の阻止はほ乳動物の通常の骨格発達を阻止する(実施例13参照)。
【0045】
実施例1および出願中であるUSSN第752764号ならびに第752861号(これらの記載は本願の記載の1部として引用する)に詳細に記載したように,天然のモルフォゲンは,体内の異なる組織に広く分布している。例えば,ノーザンブロットハイブリダイゼーションによって特定されるように,OP−1は泌尿管(例えば,腎臓ならびに膀胱組織)中で主に発現される。対照的に,Vgr−1,BMP3,BMP4ならびにBMP5は心臓や肺で主に発現されているようである。GDF−1は脳組織で主に発現されているようである(例えば,Ozkaynak et al: JBC参照)。更にまた,合成組織は特異的なモルフォゲンの自然の活動部位とは異なっている。例えば,OP−1は腎臓組織にて主に合成されているようであるけれども,このタンパク質は骨組織において活性化されている。さらに,少なくとも1つのモルフォゲン,OP−1は,唾液,ミルク(ほ乳動物の腺抽出物,初乳や57日乳を含む)や血清(実施例11参照)などの数多くの体液中に存在している。したがって,所定の原理に限定されることなく,例示したモルフォゲンは,内分泌因子,例えば,特定の刺激に反応する因子産生組織から分泌されるタンパク質などとして行動し,離れた部位の組織に輸送され作用することができる。これらの発見によって,モルフォゲンが,タンパク質が作用している組織にて産生される局在もしくはオートクリン因子として作用するところのTGF−βタンパク質を含む,その他のTGF−βスーパーファミリーのその他の構成員と更に区別される。
【0046】
そのプロドメインは,タンパク質の溶解度を高めたりおよび/または特定の組織に対してモルフォゲンが組織標的とするに際しての助けとなる機能を果たすことができる。例えば,OP−1の成熟した,活性化された形態は,完全なシーケンスのプロドメインに会合した細胞から分泌されているようである。従って,本明細書で説明するように,本発明において有用なモルフォゲンは,いかなる原理にも限定されることなく,活性なドメイン中に重要なアミノ酸シーケンスホモロジーを有しかつ組織の形態形成を誘発する能力が類似しているけれども,形態形成タンパク質ファミリーの構成員の中でのシーケンスの違いは,自然条件下において特異的な組織内で各モルフォゲンが果たしている異なる特異的な役割を反映していると仮説することができる。例えば,プロドメイン中の重大なシーケンスの変化は,そのタンパク質シーケンスのこれらの領域が特定のモルフォゲンを形態形成活性のための異なる組織に対して標的として作用させることにおいて重要であることを意味しているということができる。
【0047】
従って,本発明は2つの基本的な態様からなっている。一つの態様においては,本発明の方法ならびに組成物は,個体に投与した場合,その個体における骨実質喪失の防止しおよび/または骨形成を刺激することができるモルフォゲンからなっている。更に別の態様においては,本発明に係る方法ならびに組成物は,個体に投与した場合,その個体における骨実質喪失の防止しおよび/または骨形成を刺激することが可能な程度に治療的に有効な濃度にまで,その個体において十分な内在性モルフォゲンの発現および/または分泌を誘発することができるモルフォゲン刺激剤からなっている。
【0048】
実施例14は,モルフォゲン刺激剤の候補を同定するために化合物をスクリーニングするためのアッセイを説明するものである。モルフォゲン刺激剤の候補を同定するために化合物をスクリーニングするための有用なアッセイについての説明もまた本USSN第752861号(この記載は本願の記載の1部として引用する)に記載されている。その候補モルフォゲン刺激剤は,その生体内(in vivo)での有効性を,例えば,実施例8および9に記載した骨粗しょう症モデルを使用して試験することができる。)
以下に,本発明に係る方法ならびに組成物に有用な適当なモルフォゲンならびにそのモルフォゲンおよび/またはモルフォゲン刺激剤を投与かつ適用するための方法について,詳細に説明する。更に,(1)前述したモルフォゲンならびにモルフォゲン刺激剤がヒトにおける骨実質喪失の防止するためおよび/または骨形成を刺激するための治療剤として適当であることを例示し,かつ,(2)モルフォゲンならびにモルフォゲン刺激剤の候補をその有効性のために試験するアッセイ法を提供する例はこれらに限定されるものではない。
I.有用なモルフォゲン
前述したように,タンパク質が,最終的には臓器特異的な新しい組織に形成される細胞や分子の事象の発達カスケードを誘発することができ,かつ,少なくとも保存C末端6システイン骨格またはその機能的均等シーケンスを有するならば,そのタンパク質は形態形成性がある。具体的には,モルフォゲンは,一般的には,形態形成が許容される環境下において以下の生物学的機能の全てを発揮することができる:祖先細胞(プロジェニターセル)の増殖を刺激すること;祖先細胞(プロジェニターセル)の分化を刺激すること;分化した細胞の増殖を刺激すること;ならびに変形した細胞の再分化を含む,分化した細胞の成長ならびに維持を支援すること。いかにかかるモルフォゲンが本発明に係る方法において有用であるかについては,本明細書の始めに説明している。更にまた,いかにしてかかるモルフォゲンが製造され,使用され,形態形成活性の試験されるかについては,1991年8月30日付けのアメリカ特許出願第752764号と1991年3月11日付けの第667274号に記載されている。これらの記載も本明細書に参照として組み込まれているものとする。それらに記載されているように,モルフォゲンは,天然源の物質から精製すること,または,それらに記載された遺伝子シーケンスを用いて,原核細胞もしくは真核細胞のホスト細胞から遺伝子組換えによって産生することができる。その他にも,新規なモルフォゲンシーケンスはそれらに記載された以下の手順に従って同定することができる。
【0049】
特に有用なタンパク質としては,表IIに例示した天然由来のシーケンスからなるものが含まれる。その他の有用なシーケンスとしては,アメリカ特許第5011691号(この開示も本明細書の記載の1部を構成するするものとする)に記載されているように,生合成構造物(例えば,COP−1,COP−3,COP−4,COP−5,COP−7,COP−16など)が含まれる。
【0050】
従って,本発明に係る方法ならびに組成物において有用なモルフォゲンはまた,前述されたシーケンスのいずれとも,そのホモロジー(類似性)が70%,好ましくは80%のアミノ酸シーケンスを有する形態形成的に活性なタンパク質であると記載することもできる。なお,「ホモロジー」は前述した通りである。
【0051】
本発明に係る方法において有用なモルフォゲンはまた,本明細書に記載した6個の一般シーケンス(一般シーケンス1,2,3,4,5,6)のいずれによっても記載することができる。一般シーケンス1ならびに2はまた,そのN末端が下記のシーケンスを有していてもよい:
下表IIは,モルフォゲンとして同定された天然タンパク質の活性な領域のアミノ酸シーケンスを比較したものである。かかるモルフォゲンとしては,ヒトOP−1(hOP−一:シーケンスID5番ならびに16−17番);マウスOP−1(mOP−1:シーケンスID6番ならびに18−19番);ヒトならびにマウスOP−2(シーケンスID7番,8番ならびに20−23番);CBMP2A(シーケンスID9番);CBMP2B(シーケンスID10番);BMP3(シーケンスID26番),DPP(キイロショウジョウバエから:シーケンスID11番);Vgl(ツメガエルから:シーケンスID12番);Vgr−1(マウスから:シーケンスID13番);GDF−1(マウスから:シーケンスID14番,32番ならびに33番);60Aタンパク質(キイロショウジョウバエから:シーケンスID24番ならびに25番);BMP5(シーケンスID27番)およびBMP6(シーケンスID28番)が含まれる。シーケンスは,実質的には,文献の方法(Needleman et al: J.Mol.Biol.第48巻,443−453頁,1970年)に従って調整され,アライン(Align)プログラム(DNAstar,Inc)を用いて算出される。表中において,3つの点からなる記号は,その位置のアミノ酸がhOP−1におけるアミノ酸と同一であることを示している。3つのダッシュからなる記号は,その位置にはアミノ酸が存在しないことを示しており,ホモロジーを表すために示している。例えば,CBMP−2AならびにCBMP−2Bの残基60のアミノ酸は抜けている。もちろん,この領域の両方のアミノ酸シーケンスはAsn−Ser(残基58,59)からなっており,またCBMP−2AはLysとIleとからなり,CBMP−2BはSerとIleからなっている。
【表II−1】
【0052】
【表II−2】
【0053】
【表II−3】
【0054】
【表II−4】
【0055】
【表II−5】
【0056】
【表II−6】
【0057】
【0058】
前述したアミノ酸シーケンスの比較により明らかなように,形態形成活性を保持しながら,一般シーケンス内において重要なアミノ酸の変化をさせることができる。例えば,表IIに示したGDF−1タンパク質のシーケンスは,記載したhOP−1のシーケンスとは約50%しかアミノ酸の同一性はないけれども,GDF−1シーケンスはhOP−1シーケンスとは70%以上のアミノ酸シーケンスホモロジー(または類似性)を有している。ここで「ホモロジー」または「類似性」とは,文献(Dayoff,et al: Atlas of Protein Sequence and Structure第5巻,追補3,345−362頁(M. O. Dayoff,ed., Nat’l BioMed. Res. Fd’n, Washington D.C. 1979)によって定義されているようなシーケンス中における許容された同類アミノ酸の変化をも包含している。
【0059】
本発明におけるモルフォゲンとして有用な,現在もっとも好ましいタンパク質シーケンスとしては,hOP−1の保存6システイン骨格を規定するアミノ酸シーケンスと,その同一性が60%以上,好ましくは65%以上であるものが含まれる(例えば,シーケンスID5番の残基43−139)。これらのもっとも好ましいシーケンスとしては,キイロショウジョウバエからの60Aタンパク質を含むOP−1ならびにOP−2タンパク質の相対遺伝子ならびにそれらの種変異型が含まれる。従って,本発明の更に別の好ましい態様においては,本発明は,7システイン骨格を規定し,またマウスならびにヒトOP−2タンパク質として同定された種種のタンパク質の間での同一性を保有しているところの,本明細書において「OPX」と称される一般アミノ酸シーケンスを有するポリペプチドのスピーシーズ(種)からなるモルフォゲンも含まれる。OPXのシーケンスIDは29番である。前述したように,所定の位置の残基Xaaは,マウスまたはヒトOP−1またはOP−2のC末端シーケンスにおける対応位置に存在する残基から独立して選択される(シーケンスID5番−8番および/またはシーケンスID16番−23番)。
II.治療用薬剤を投与するための配合物ならびに方法
モルフォゲンは,適当な手段,好ましくは直接に,非経口投与または経口投与によって個体に付与される。モルフォゲンは直接的に(例えば,局所的に,注射などによって骨組織部位への投与)または非経口的に例えば,静脈投与,皮下投与,筋肉注射,眼か内投与,点眼投与,心室内投与,頭蓋骨内投与,腹腔内投与,口腔内投与,直腸内投与,ちつ内投与,鼻腔内投与などのような手段によってまたはエアロゾールなどによって投与することができる。更に,モルフォゲンは水溶液の1部とするのが好ましい。この溶液は生理学的に許容されるので,好ましいモルフォゲンを患者に投与されることに加えて,その溶液は患者の電解質ならびに容量バランスに対して悪影響を及ぼすことはない。従って,モルフォゲンの水溶媒体は通常の生理食塩水(9.85%NaCl,0.15M)pH7−7.4からなっている。モルフォゲンを含有している水溶液は,例えば,アセトニトリルの0.1%トリフルオロ酢酸(TFA)または0.1%HCl溶液または均等な溶媒を含む50%エタノール溶液にタンパク質を溶解することによって調製することができる。得られた溶液の1倍量を,例えば,10倍量のリン酸バッファー生理食塩水(PBS)に添加する。このPBSには更に0.1−0.2%のヒト血清アルブミン(HSA)が含まれていてもよい。得られた溶液はよく撹判するのが好ましい。所望に応じて,所定のモルフォゲンは,適当な分子と会合させてより溶解性を高めることもできる。例えば,成熟したダイマーをモルフォゲンのプロドメインと会合させると,そのタンパク質の溶解度が著しく増加する。実際に,内在性のタンパク質は,この形態で運搬されていると考えられている。溶解度を高めることができる別の分子,特に経口投与に有用なものとして,カゼインが挙げられる。例えば,0.2%カゼインを添加すると,成熟した活性な形態のOP−1の溶解度を80%も増加することができる。ミルクおよび/または種々の血清タンパク質中に見いだされるその他の成分もまた有用である。
【0060】
経口または非経口投与に有用な溶液は,医薬界ではよく知られている文献(例えば,Remington’s Pharmaceutical Sciences(Gennaro, A., ed.)Mack Pub.1990年)に記載された方法であればいずれの方法でも調製することができる。配合物には,例えば,ポリエチレングリコールのようなポリアルキレングリコール,植物由来の油脂,水素化ナフタレン類などが含まれていてもよい。直接投与用配合物は,特に,グリセロールならびに高粘度の組成物を含んでいてもよい。例えば,ヒアルロン酸,コラーゲン,トリカルシウムリン酸,ポリブチレート,ラクチド,ラクチド/グリコリドコーポリマーなどの生適合性,好ましくは生吸収性ポリマーは,生体内(in vivo)でのモルフォゲンの放出を制御する有用な賦形剤である。これらのモルフォゲンのための潜在的に有用な非経口デリバリーシステムとしては,エチレン−ビニル酢酸コポリマー粒子,浸透圧ポンプ,移植可能な注入システム,リポゾームなどが挙げられる。吸入投与用配合物としては,賦形剤として,例えば,ラクトースを含んでいてもよく,また,例えば,ポリオキシエチレン−9−ラウリルエーテル,グリココール酸塩,デオキシコール酸塩などを含んでいてもよい水溶液であっても,鼻腔内点滴での投与用油性溶液であっても,さらには鼻腔内適用されるゲルであってもよい。非経口投与用配合物としてはまた,口腔投与用のグリココール酸塩,肛門投与用のメトキシサリチル酸塩またはちつ投与用のキュトリックアシッド(cutric acid)を含んでいてもよい。
【0061】
その他に,本明細書に記載したモルフォゲンは経口でも投与することができる。治療剤としてタンパク質の経口投与は,ほとんどのタンパク質がほ乳動物の消化器官にある消化酵素や酸によって血液中に吸収される前に容易に分解されてしまうので,一般には行われていない。しかしながら,本明細書に記載されたモルフォゲンは,酸に対して安定であり,プロテアーゼに対して抵抗性を持っている(例えば,アメリカ特許第4968590号)。更に,少なくとも1つのモルフォゲン,OP−1は,ウシの乳房腺抽出物,初乳ならびにミルク(実施例10)や唾液の中で同定されている。加えて,乳房腺抽出物から精製されたOP−1は,形態形成的に活性化されていることが示されている。具体的には,このタンパク質は,例えば,アメリカ特許第4968590号に記載されたような,生体内(in,vivo)での標準的な骨アッセイ法を用いて,適当なマトリックス物質に関連して皮下に移植した場合,ほ乳動物において軟骨細胞形成を誘発することが示されている。更にまた,内在性のモルフォゲンも血流中に検出されている(実施例11)。これらの知見は,経口ならびに非経口投与が個体に対してモルフォゲンを投与するための有効な手段であることを示している。更に,本明細書に記載したある種のモルフォゲンの成熟した形態は典型的にはほとんど溶解しないのに対して,ミルク(ならびに乳房腺抽出物や初乳)中に見いだされた形態のモルフォゲンは,おそらく成熟した形態形成的に活性化された形態が完全なシーケンスのプロドメインと会合することおよび/または1つまたはそれ以上のミルク成分と会合することによって容易に溶解する。従って,本明細書に示された化合物は,生体外(in vitro)または生体内(in vivo)においてそれらの溶解度を高めることができる分子,例えば,モルフォゲンプロドメインの1部または全てならびにカゼインなどと会合することができる。
【0062】
また,本明細書に記載した化合物は,モルフォゲンまたはモルフォゲン刺激剤が骨組織を標的とすることができる分子と会合することができる。例えば,テトラサイクリンやジリン酸塩などは,ほ乳動物に対して全身的に付与された場合に,特に骨再生領域で骨の無機物に結合することが知られている。また,骨組織細胞の表面分子と特異的に相互作用する抗体またはその他の結合タンパク質もまた使用することができる。かかる標的分子はまた,当業者であればよく知っている標準的な化学手段を用いて,例えば,Asp−Pro結合のような,酸に対して不安定な結合を介してモルフォゲンまたはモルフォゲン刺激剤と共役的に結合することもできる。骨再生部位での局在環境は酸性であるので,かかる酸不安定結合はこれらの部位で好ましくは切断され,所望の部位で活性なモルフォゲンまたはモルフォゲン刺激剤を産生するものと期待される。有用な標的分子は,例えば,アメリカ特許第5091513号に開示された単一鎖結合部位技術を用いて,調製することができる。
【0063】
前述したように,本明細書に記載したモルフォゲンは,C末端の活性なドメイン中の重要なシーケンスホモロジーを共有している。対照的に,プロドメインを規定しているシーケンス中ではそのシーケンスは分岐している。従って,プロドメインはモルフォゲン特異的である場合がある。前述したように,今日同定されている種々のモルフォゲンは異なる組織中で特異的に発現される。従って,いかなる所定の原理に限定されることなく,体内の自然の条件下では,選択されたモルフォゲンは典型的には所定の組織に作用することは当然にあり得ることである。従って,溶液中においてモルフォゲンが活性な形態で会合して同定されたプロドメインの1部または全ては,本明細書に記載したモルフォゲンに対して分子を標的とするのに役立つことができる。例えば,プロドメインは標的組織で1つまたはそれ以上のプロドメインと特異的に相互作用して,プロドメインに会合したモルフォゲンをその組織に導くことができる。従って,モルフォゲンを骨組織に標的として導くために有用なその他の標的分子は,モルフォゲンのプロドメインの1部または全部,特にOP−1,BMP2またはBMP4のプロドメインの1部または全部である。これらタンパク質は骨組織と自然では会合して見いだされている。
【0064】
最後に,本明細書に記載したモルフォゲンまたはモルフォゲン刺激剤は,単独でも,過剰な骨喪失の危険性がある個体において適当な骨再生サイクルを維持することに有用な効果を持っていることが知られているその他の分子と組み合わせて投与することができる。有用な補因子の例としては,ビタミンD3,カルシトニン,プロスタグランジン,甲状腺ホルモン,デキサメタゾン,エストローゲン,IGFなどが挙げられる。
【0065】
本明細書に記載した化合物は,医薬的に許容される,非毒性の賦形剤や担体と混合して配合することができる。前述したように,かかる組成物は,非経口投与ができるように,特に溶液または懸濁液の形態で,また経口投与ができるように,特に錠剤またはカプセル剤の形態で,さらに鼻腔内投与ができるように,特に点鼻ドロップやエアロゾルの形態で調製することができる。
【0066】
組成物は,ヒトまたはその他のほ乳動物に対して,非経口または経口投与するために,治療的に有効な分量,例えば,前述したような代謝性骨疾患ならびにその他の骨再生障害を患っている個体に対して,骨実質喪失を阻止しおよび/または骨形成を刺激するのに十分な期間適当な濃度のモルフォゲンを骨組織に付与することができる分量になるように配合することができる。治療的に有効な濃度はまた,骨折や骨格の微小構造における欠損を修復すること,また,骨実質劣化の危険性がある個体を保護することを含めて,幼若者や成人の発達において適当な骨実質の維持を強化することに十分である。
【0067】
当業者であれば容易に予測されることであるが、治療用組成物中の化合物の濃度は、投与する薬剤の用量、使用する化合物の化学的特徴(例えば、疎水性)、投与経路などの種々の因子によって変えることができる。投与する薬剤の好ましい用量はまた骨喪失ならびに欠損の形式と程度、特定の患者の全体的な健康状態、選択された化合物の相対的な生物学的有効性、賦形剤の化合物の配合ならびに投与ルートに依存する場合がある。一般的にいえば、本発明の化合物は、非経口投与用の化合物を約0.1%ないし10%w/vの割合で含有する生理バッファー溶液として付与することができる。典型的な用量範囲は、1日当たり体重1kg当たり約10ng/kgないし1g/kgであり、好ましくは1日当たり体重1kg当たり約0.1μg/kgないし100mg/kgである。最適には、全ての場合において与えられるモルフォゲンの用量は,患者体重1kg当たり1日当たりタンパク質が2−20μg/kgの間である。溶解性モルフォゲンの骨組織に対する局所注射のための現在好ましい用量範囲は,注射1回当たりモルフォゲンが0.1−50μg/kgの間である。例えば,成熟したモルフォゲン(例えば,OP−1を20μg)を21日間連続して通常の成長しているラットに毎日投与しても,明白なモルフォゲン誘発病理学的症状は誘発されていない。更に,モルフォゲン(例えば,OP−1)10μgを通常の新生マウスに全身的に注射した場合でも何等大きな異常は生じていない。
【実施例1】
【0068】
モルフォゲン−発現組織の同定
モルフォゲンの組織分布を決定することは、新規の関連するモルフォゲンを同定するためにもまた与えられた組織中に発現された異なったモルフォゲンを同定するためにも用いることが出来るだろう。同様に組織分布はモルフォゲン刺激試薬の同定とスクリーニングに用いるための有用なモルフォゲン−生産組織を同定するのに用いられるだろう。モルフォゲン(あるいはmRNA転写産物)は容易に標準的な方法や発現が低い組織において本法のわずかの修飾で同定される。例えば、蛋白質分布は標準的なウエスタンブロット分析あるいは免疫蛍光技術とモルフォゲンあるいはモルフォゲン関連の特異的な抗体を用いて測定される。同様に、モルフォゲン転写産物の分布も標準的ノーサンハイブリダイゼーション法と転写物−特異的プローブを用いて同定されうる。
【0069】
転写物に特異的にハイブリダイズでき、そして他の関連する転写物と区別できる如何なるプローブも用いることが出来る。ここで述べたモルフォゲンは、C−末端ドメイン中に高い配列ホモロジーを有していることをここのなかで述べたので、特異的モルフォゲン転写物の組織分布は未成熟蛋白のpro領域に対して特異的なプローブを用いるか及び/又は成熟蛋白のN−末端領域を用いて同定される。他の有用な配列は3’非コーデング領域フランキングとそのすぐ後の終末コドンである。これらの部位の配列は本発明のモルフォゲン種間で異なっている、それ故各々の蛋白質に対して特異的である。例えば、特に有用なvgr−1−特異的プローブ配列はPvuII−SacI断片であって、非翻訳プロ領域の部分と成熟配列のN−末端両者をコードする265bpからなる(cDNA配列の記述についてはライオンス他(1989)PNAS 86:4554−4558を参照)。
【0070】
同様に、特に有益なmOP−1-特異的プローブ配列は、mOP−1プロ領域の約2/3をカバーする0.68Kbの配列であるBstX1−BglI断片;7−システインドメインのすぐ上流の0.2Kbの配列であるStuI−StuI断片;そして3’非翻訳配列の部分を含む0.3Kb 断片であるEar1−Pst1断片である(プロ領域が残基30−291によって実質的に規定されるシーケンス番号16を参照)。同様のアプローチは例えばhOP−1(シーケンス番号16を参照)あるいはヒトあるいはマウスOP−2(シーケンス番号20と22)に用いられる。
【0071】
これらの合成的手法かクローン化配列から得られるであろうモルフォゲン−特異的プローブを用いて、モルフォゲン転写産物は通常の当該分野の熟練研究者が知り得る標準的な方法を用いて哺乳類組織中で同定することができる。主に全RNAは種々の成熟マウス組織(例 肝、腎、精巣、心臓、脳、甲状腺そして胃)からチョムツアスキー他((1987)Anal.Biochem162;156-159)の方法及び以下に述べるような標準的方法によって調製される。ポリ(A)RNAがオリゴ(dT)−セルロースクロマトグラフィー(例 ファーマシア LKB バイかオテクノロジー(株)からのTpe7)を用いて調製される。各々の組織からポリ(A)RNA(一般的に15μg)1%アガロース/ホルムアルデヒドゲルを用いて分画されそしてニトラン膜(シュライヒアー&シュエル)上に移される。移した後、膜は80℃に加熱しRNAは紫外光の元で架橋形成される(一般に1mW/cm2で30秒間)。
【0072】
ハイブリダイゼーション前に適当なプローブを加熱して変性した。ハイブリダイゼーションは,ローラボトル装置で40%ホルムアミドのハイブリダイゼーションmix,5×Denhardts,5×SSPEおよび0.1%SDSを用いて約1rev/分,37℃で約15時間ルーサイトシリンダー中で行った。ハイブリダゼーションに続いて非特異的カウントは50℃で0.1×SSPE,0.1%SDSで濾過洗浄した。
【0073】
発生中のおよび成熟組織におけるVgr−1,OP−1,BMP2,BMP3,BMP4,BMP5,GDF−1そしてOP−2を含有する種々の組織内分布を開示した実施例が、本文中に参照として取入れられた出願中のUSSN 752,764とオズカイナク他(1991)Biochem. Biophys. Res. Commn. 179:116−123およびオズカイナク他(1992)(JBC、出版中)示されている。
【0074】
ここで述べた一般的プローブ化方法、例えば脳、脾臓、肺、心臓、肝臓そして腎臓組織をプローブするため、これらモルフォゲンに対する特異的プローブを用いてノーサンブロットハイブリダイゼーションを実施し、腎臓関連組織がOP−1のプライマリーの発現ソースであって、脳、心臓そして肺組織が2次的なソースであることが示された。肺組織はVgr−1,BMP5,BMP4そしてBMP3に対するプライマリーの組織発現ソースであると思われた。低レベルのVgr−1は同様に腎臓と心臓組織に見られ、そして肝臓はBMP5の2次的な発現組織であると思われた。脾臓はBMP4に対して2次的発現ソースであるように思われた。GDF−1は脳組織に主として現われる。最近、OP−2は初期胚組織においてプライマリーに発現されるように思われた。特にマウス胚と誕生後6日目の動物はノーサンブロットによって8日胚において高いOP−2発現を示す。発現は17日胚で有意に減少し誕生後の動物では検出されない。
【実施例2】
【0075】
ラットとヒト骨芽細胞におけるモルフォゲンのミトゲン効果
骨芽細胞の増殖を誘導するモルフォゲンの活性が下記の分析法によってインビトロで測定される。骨芽細胞培養を含む本例および全ての実施例において、ラット骨芽細胞の初代培養が好んで用いられた。本培養は個々の細胞が分化の異なったステージにあるという点においてヘテロジェナスであるけれども、培養は、確立された細胞系から得られた骨芽細胞よりもより実質的にインビボでの代謝と骨芽細胞の機能を反映すると信じられている。他に示されていないけれども、全ての使われた化学物質は標準的なもので市販で利用できる試薬であって、シグマ化学(株).,セントルイス、カルビオケミ(株).,サンジエゴそしてアルドリッチ化学.,ミルウオーキー等多くの企業より容易に購入できる。
【0076】
ラットの骨芽細胞に富んだ初代培養が縫合の無い新生児ラットカルバリア(例.,ロングエバンス系の1−2日例動物、チャールスリバー研、ウイルミントン、マサチューセッツ)の段階的コラゲナーゼ消化とそれに続く標準的な方法、例えばワング他(1975)PNAS 72:3167−3171に述べられた様な方法によって調製される。ラット単一細胞分散液が次に10%FBS(胎児牛血清)、L−グルタミンとペニシリン/ストレプトマイシンを含むアルファMEM(修飾イーグル培地、ギブコ(株).,ロングアイランド)培地中でウエルあたり50,000骨芽細胞の濃度でマルチウエルプレート(48穴プレート)上に移された。細胞は37℃で24時間インキュベートされ次に生長培地は1%FBSを含むアルファMEM培地で置換されそして細胞はさらに24時間インキュベートされた。その結果細胞は実験時には血清欠乏生長培地中となった。
【0077】
細胞培養は続いて3グループに分割された:(1)モルフォゲン0.1,1.0,10.0,40そして80ngを入れたウエル;(2)局所作用性生長因子の0.1,1.0,10そして40ngを入れたウエル;そして(3)生長因子を入れないコントロールグループ。この実験において、OP−1が試験されたモルフォゲンであった、そしてTGF−βは局所作用性生長因子であった。次に細胞は18時間インキュベートされその後ウエルは3H−チミジンで2μCi/ウエルで標識され6時間インキュベートされた。過剰の標識は次に0.15M NaClの低温溶液で洗浄され、10%トリクロロ酢酸の250μlを各々のウエルに添加しウエルは30分間室温でインキュベートされた。次に細胞は低温の蒸留水で3回洗浄され、そして37℃30分間1%ナトリウムドデシル硫酸(SDS)の250μlを添加して溶解された。細胞溶解液は次に熟練研究者によって良く知られた標準的な手段を用いて収穫され、そして細胞の分裂能の指標として液体シンチレーションによって細胞DNA中への3H−チミジンの取り込みを測定した。結果は図1に示した。(四角によって図中に示した)OP−1はDNA中への3H−チミジンの取り込みを刺激する、そして骨芽細胞の増殖を促進する。無血清培地中でのOP−1の40ngによって刺激された分裂促進(mitogenesis)は10%血清のみの分裂促進効果(mitogenic effect)に等しい。対象的に、(図1にダイアモンド印によって示したように)TGF−βの効果は一時的で二相性(biphasic)のものであった。高濃度でTGF−βは骨芽細胞増殖に有意の効果をもたらさなかった。この系は細胞増殖におけるこれらの効果に対して他のモルフォゲンを試験するために用いられるであろう。
【0078】
骨芽細胞増殖におけるモルフォゲンのインビトロ効果がヒト初代骨芽細胞(正常成熟人の骨組織から得、上記の方法で調製された)を得、そして骨芽ザルコーマ由来細胞上で試験された。全ての場合に細胞増殖を誘導した。加えて、同様の実験がBMP4(BMP2B)とBMP3を用いて達成され、これらのモルフォゲンが骨芽細胞増殖と生長を刺激することを同様に示した。(チェン他.,(1991)J.Bone and Min.Res.6:1387-1393とブキセビック(1991)PNAS 86:8793−8797を参照)。
【0079】
与えられたモルフォゲンの骨細胞生長及び/または発生に対する効果が同様に様々の骨細胞マーカーを用いて試験される:例.,コラーゲン合成、アルカリフォスファターゼ活性、副甲状線ホルモン仲介サイクリックAMP(cAMP)生産、オステオカルシン合成そして骨芽細胞における骨化の石灰化を推測することによって。これらのうち、アルカリフォスファターゼ活性、副甲状線ホルモン−仲介cAMP生産、オステオカルシン合成そして石灰化促進は分化した骨芽細胞表現型の特異的マーカーである。コラーゲン合成と同様これらのパラメーターを試験するための実験系は実施例3−7に記述されている。全ての場合にモルフォゲンのみがこれらの表現型−特異的マーカーの発現を刺激した。実施例3−7においてOP−1が試験されたモルフォゲンであった。BMP4(BMP2B)を用いて行なわれた同様の実験はこのモルフォゲンが同様に骨芽細胞分化を誘導することを示す。(チェン他(1991)T. Bone and Min.Res. 6: 1387-1392およびブキセヴィック、(1989)PNAS86:8793−8797.参照)。
【実施例3】
【0080】
ラット骨芽細胞のコラーゲン合成におけるモルフォゲンの効果
ラット骨芽細胞のコラーゲン生産におけるインビトロでのモルフォゲンの効果が以下で測定される。
【0081】
ラット骨芽細胞が調製され実施例2で述べたようにしてマルチウエルプレート中で培養された。この実験において24ウエルプレートが用いられた。培養細胞は次に3グループに分割された:(1)培地のml当り1,10,40ngのモルフォゲンを受けたウエル;(2)培地のml当り局所作用性生長因子の1,10,40ngを受けたウエル;そして(3)生長因子を受けなかったコントロールグループ。この実施例において、OP−1が試験されたモルフォゲンであるそしてTGF−βが局所作用性生長因子であった。
【0082】
試料は湿潤化されたインキュベーター中で5%CO2とともに37℃で68時間インキュベートされた。3Hプロリンの25μCiが各々のウエル中に添加されそして6時間インキュベートされた。細胞は次に−20℃でコラーゲン分析を行なうまで凍らせた。次に細胞は、全コラゲナーゼ消化性蛋白質中(CDP)に3H−プロリンの取り込みを検出することによってコラーゲン生成を分析した。結果を図2に示した、OP−1は、全CDP中への3H−プロリン取り込みによって測定されたようにタイプIコラーゲン合成を刺激したことを示す。このように,OP−1は前骨芽細胞と成熟骨芽細胞によるインビトロコラーゲン合成を促進する。
【実施例4】
【0083】
モルフォゲンによる骨芽細胞のアルカリフォスファターゼ誘導
4.1モルフォゲン−特異的アルカリフォスファターゼ誘導
アルカリフォスファターゼ生産は分化した機能的な骨芽細胞による骨形成の指標であるので、モルフォゲンはこの骨芽細胞マーカーとそれに続くインビトロ試験系を用いて骨芽細胞の能力を測定できるであろう。
【0084】
ラット骨芽細胞が調製されそして実施例2に述べたようにマルチプレート中で培養された。この実験において24穴プレートが用いられた。培養された細胞は次に3グループに分割された:(1)モルフォゲンの種々の濃度を受けたウエル;(2)局所作用性生長因子の種々の濃度を受けたウエル;そして生長因子を受けなかったコントロールグループ。この実験に於いてOP−1が試験されたモルフォゲンであって下記の濃度で実施された:0.1,1.0,10.0,40.0,80.0ng/ml培地;そしてTGF−βが局所作用性生長因子として0.1,1.0,10.0,40.0,80.0ng/ml培地で試験された。次に細胞は72時間インキュベートされた。インキュベーション期間後細胞層が1%トライトンX−100の0.5mlで抽出された。得られた細胞抽出物は遠心された、抽出物の100μlが90μlのパラニトロソフェニルフォスフェート(PNPP)/グリセリン混合液に加えられ37℃水槽中で30分間インキュベートされ、反応は100μl NaOHで停止された。次に試料はプレートリーダーで読み(例 ダイナテックMR700プレートリーダー、標準としてパラニトロフェノールを用いて400nmで吸収を測定した)アルカリフォスファターゼ活性の存在と量を決定した。蛋白質濃度はバイオラド法によって決定された。アルカリフォスファターゼ活性は単位/μg蛋白質で計算された。ここで1単位=1nmol 37℃で遊離したパラニトロフェノール/30分間を示す。
【0085】
図3に示した結果はモルフォゲン単独で骨芽細胞に於いてアルカリフォスファターゼの生産を刺激する、そして骨芽細胞の分化した発現型の生長と発現を促進することを例証する。図中で四角はOP−1濃度を示し、ダイアモンドはTGF−β濃度を示す。
【0086】
4.2.ラット骨芽細胞によるアルカリフォスファターゼの生産におけるモルフォゲンの長期の効果
ラット骨芽細胞によるアルカリフォスファターゼの生産におけるモルフォゲンの長期の効果を決定するために、下記の分析が為された。
【0087】
ラット骨芽細胞が調製されたそして実施例2で述べたようにマルチウエルプレート中で培養された。本実験において24穴プレートの6セットがウエル当り50,000ラット骨芽細胞を移された。各々のプレートのウエルは上記したように調製され、次に3グループに分割された:(1)培地のml当りのモルフォゲンの1ngを受けたもの;(2)培地のml当りモルフォゲンの40ngを受けたもの;(3)培地のml当りモルフォゲンの80ngを受けたもの。各々のプレートは次に異なった時間でインキュベートされた:0時間(コントロール時間)、24時間、48時間、96時間、120時間そして144時間。各々のインキュベーション時間後細胞層は1%トライトンX−100の0.5mlで抽出された。得られた細胞抽出物は遠心され実施例4におけるようにアルカリフォスファターゼ活性がパラニトロソフェニルホスフェート(PNPP)を用いて測定された。結果は図4に示したように、モルフォゲンのみで骨芽細胞におけるアルカリフォスファターゼの生産を刺激する、OP−1の投与量増大はさらにアルカリフォスファターゼの生産のレベルを増加しそして処置した骨芽細胞におけるアルカリフォスファターゼのモルフォゲンによって刺激され、この上昇したレベルは延長した時間持続する。図中においてマルは1ng OP−1を示す;四角は40ng OP−1;そしてダイアモンドは80ng OP−1を示す。
【実施例5】
【0088】
ラット骨芽細胞におけるモルフォゲン誘導副甲状線ホルモン仲介cAMP生産
インビトロにおいてラット骨芽細胞における副甲状線ホルモン仲介cAMP生産におけるモルフォゲンの効果が下記のように決定された。
【0089】
ラット骨芽細胞が調製されたそして実施例2上に記述されたマルチウエル プレート中で培養された。本実験において24穴プレートが用いられた。次に培養細胞が3グループに分割された:(1)モルフォゲンの種々濃度を受けたウエル(本実験で、OP−1は1.0,10.0そして40.0ng/ml培地);(2)局所作用性生長因子の種々濃度を受けたウエル(本実験において、TGF−βは培地当り0.1,1.0,そして5.0ng/ml);そして(3)他の生長因子を受けなかったコントロールグループ。プレートは次にさらに72時間インキュベートされた。72時間の終わりに細胞は0.5%牛血清アルブミン(BSA)と1mM 3−イソブチル−1−メチル キサンチンを含む培地で20分間処理された。その後200ng/mlの濃度で10分間ヒト組み換え副甲状線ホルモン(hPTH,シグマ、セントルイス)のウエルの半分に添加された。細胞層が各々のウエルから1%のトライトンX−100の0.5mlで抽出された。cAMPレベルが次にラジオイムノ分析キットを用いて決定された(アマーシャム、アーリントンハイト、イリノイ)。結果は図5に示したようにモルフォゲンのみでPTH仲介cAMP応答の増加を刺激したそして骨芽細胞の分化発現型の生長と発現を促進した。
【実施例6】
【0090】
培養における骨芽細胞による石灰化の速度とオステオカルシン合成に対するモルフォゲンの効果
オステオカルシンは骨芽細胞によって合成される骨特異的蛋白質であってインビボで骨の石灰化の速度に中心的な役割を演ずる。血清中のオステオカルシンの循環レベルはインビボでの骨芽細胞活性と骨形成の指標として用いられる。富骨芽細胞−培養はインビトロでのモルフォゲン能を分析するために用いられる。
【0091】
ラット骨芽細胞が調製され実施例2のようにしてマルチウエルプレート中で培養された。本実験において、細胞は24穴プレートで培養された。本例において培地は10%FBSを用いたそして2日後に細胞は新鮮な10mMβ−グリセロフォスフェート(シグマ(株))を添加された新鮮培地で培養した。5日目の初めからその後2週間、細胞は最終濃度50μg/ml培地の濃度で上記全ての成分と新鮮なL(+)アスコルビン酸を含む完全骨化培地中で育てた。次にモルフォゲンが直接にウエルに添加された。本例において、0.1%トリフルオロ酢酸(TFA)を含む50%アセトニトリル(あるいは50%エタノール)中のOP−1が5μl/ml培地を越えないように添加された。コントロールウエルは溶媒成分のみであった。次に細胞は再培養されコンディション培地試料は標準蛋白阻害剤を含む標準免疫分析緩衝液と1:1に希釈したそしてオステオカルシン分析まで−20℃で保存した。オステオカルシン合成は次に市販のラット由来オステオカルシン特異的抗体を用いて標準免疫分析によって測定された。
【0092】
石灰化は固定細胞層上での修飾フォンコッサ染色法を用いて長期間培養(13日)によって測定した:細胞を23℃10分間、新鮮4%パラフォルムアルデヒド中で固定した、続いて冷0.9%NaClで洗浄した。固定した細胞は次に市販のキット(シグマ(株))を用いてpH9.5で10分間内在性アルカリフォスファターゼに対して染色を行なった。
【0093】
紫色に染った細胞を次にメタノールで脱水し空気乾燥した。3%AgNO3中暗黒下で30分間インキュベーション後、水洗浄試料が黒く銀染色された燐酸ノズルを発生させるため254nm 紫外光で30秒間露出した。個々の石灰化したものが(少なくとも大きさで20μm)解剖顕微鏡下で計数され、ノヅル数/培地として現わされた(図6B参照)。
【0094】
図6Aに見られるように、OP−1は骨芽細胞培養においてオステオカルシン合成を刺激する。OP−1に応答するオステオカルシン増大は投与量依存性である、そしてインキュベーション13日後25ngのOP−1/10ml培地を用いると基礎レベルから5倍の上昇を示した。増大したオステオカルシン合成は同様にラットオステオカルシン特異的プローブを用いてオステオカルシンmRNAの上昇(20倍上昇)を検出することによっても確認できる。加えて、オステオカルシン合成増加は長期間の骨芽細胞培養における石灰化の増大とも関連する。このことはミネラルノズルの出現によって決定される(図6Aと6Bの比較)。OP−1は未処理群に比べて約20倍初期石灰化速度を増加させる。TGF−βを用いて行なわれた同様の実験ではTGF−βはオステオカルシン合成を誘導しないしあるいは石灰化工程を促進しないことを示す。このように、モルフォゲンのみが骨芽細胞の分化発現型の生長と発現を促進する。
【実施例7】
【0095】
インビトロ骨由来生長因子誘導におけるモルフォゲンの効果
IGF−IとIGF−IIは骨再生サイクルにおいて骨置換における骨架橋形成に関与している。これらの因子およびTGF−βを含む他の骨由来生長因子の生産におけるモルフォゲンの効果が下記の手段を用いて評価される。
【0096】
ラットあるいはヒト骨芽細胞が調製された、そして実施例2におけるようにマルチウェルプレートで培養された。プレートのウェル穴はモルフォゲンの異なった濃度を加えた(例0,1,10,100ng)グループに分割した。本実験において、OP−1がモルフォゲンとして用いられた。次にプレートは先に述べた時間インキュベートした、例えば72時間そしてIGFのレベルが検出された、例えばIGFに対する特異的な市販の抗体を用いて免疫局所化法によって検出された。OP−1はIGF−IおよびIGF−IIのレベルを有意に誘発する6倍以上のIGF−Iと2倍以上のIGF−IIが100ngOP−1/mlに露出によって誘導された。加えて、OP−1はIGF−I刺激因子、BP3(IGF−I結合蛋白3)を刺激した。
【実施例8】
【0097】
卵巣切除(OVX)ラットの梁骨におけるモルフォゲンの効果
上述したように、血清アルカリフォスファターゼとオステオカルシンのレベルは個体内の骨形成の指標である。インビボでの骨生産におけるモルフォゲンの効果を測定するために、これらのパラメーターが骨形成を促進する条件下で測定された、例 ここで骨粗鬆症はラットにおいて卵巣除去によって誘導される。
【0098】
各々約200gの重さの40日齢エバンスラット(チャールスリバー研究所ウイルミントン)が標準的手段を用いて卵巣切除(OVX)されたそして10匹のラットは偽手術(シャム)された。ラットの卵巣切除はエストロゲン生産減少の結果としてラットに骨粗鬆症状態をもたらす。食物と水は任意に供給した。卵巣切除後8日目に上記に述べたように調製されたラットは5グループに分割された:(A)10匹の偽手術(シャム)ラット;(B)尾静脈から1mlのリン酸生食緩衝液(PBS)を静注した10匹の卵巣切除ラット;(C)尾静脈より約1mgの17βE2(17−β−エストラジオール)を静注した10匹の卵巣切除ラット;(D)22日間尾静脈より約2μgのモルフォゲンを毎日静注した9匹の卵巣切除ラット;そして(E)22日間尾静脈より約20μgのモルフォゲンを毎日静注した9匹の卵巣切除ラット。本実験において、OP−1が試験されたモルフォゲンであった。
【0099】
試験の15日目と21日目に、各々のラットは5mgのテトラサイクリンを投与したそして22日目にラットは屠殺された。体重、卵巣重量、血清アルカリフォスファターゼレベル、血清カルシウムレベルそして血清オステオカルシンレベルが各々のラットについて測定された。結果は表IIIとIVに示した。
【表III】
【0100】
【表IV】
【0101】
表IIIと表IVに示した結果は卵巣切除ラットへのモルフォゲンの静注は血清アルカリフォスファターゼと血清オステオカルシンレベルの有意の増加をもたらし、モルフォゲンの全身性投与は骨粗鬆症中の骨に対して骨形成を刺激することを現わす。
【実施例9】
【0102】
卵巣切除(OVX)ラットの脛長骨におけるモルフォゲンの組織学的分析
重さ約160gの15匹のロングエバンズラット(チャールスリバー研究所、ウイルミントン、マサチュウセッツ)が骨粗鬆症状態をもたらすために卵巣切除(OVX)された。5匹のラットは実施例8でのべたように偽手術された。食物と水は任意に供給された。卵巣除去22日後ラットは4グループに分割された:(A)偽手術された5匹のラット(尾静脈からの静注によってPBSの1mlを投与);(B)OVX、何も投与されない、5匹のラット;(C)OVX、尾静脈からの静注によって約1mgの17βE2を投与そして(D)OVX、尾静脈からの静注によって約1μgのモルフォゲンを投与された5匹のラット。本実験においてOP−1がモルフォゲンとして試験された。
【0103】
ラットは7日間記載されたようにして、13日間何も投与されない群を除いて毎日投与された。次にラットは19日目に屠殺された。脛長骨が次に取り出され、エタノールで固定され組織形態学的分析が熟練者に良く知られている標準的方法を用いて行なわれた。結果は表Vに示す。
【表V】
【0104】
表Vに現わした結果は実施例8の結果を確認する、つまり卵巣切除ラットへのOP−1の静注は個々のラットのエストロゲン減少によって失われた骨の生長を刺激する。特に、OVXラットにおいて海綿骨体積阻害が全身性に供給されたモルフォゲンによって修復された。加えて、モルフォゲン処理ラットにおいて、標識海綿骨ペリメーターと無機物沈殿速度がコンロトロールつまり偽手術されたラットにおいて測定されたレベルに戻っている。さらに、モルフォゲン処置はエストロゲンと違って骨身長の生長を阻害しない、エストロゲンは有意に骨生長を阻害するように思われる。従って、治療レベルで効果的濃度でのモルフォゲンの全身性投与は効果的に自然の骨形成を阻害することなしに哺乳動物における骨の喪失を阻害する。
【実施例10】
【0105】
体液中でのモルフォゲンの存在の測定
OP−1は唾液、ヒト血清並びに哺乳腺抽出物、初乳そして57日後の牛ミルク等の種々のミルク中に同定された。さらに下記に述べたように、蛋白質を抽出した体液がモルフォゲン活性をもっている。モルフォゲンが天然にミルク中に存在していて成熟した活性OP−1が酸に安定で蛋白質分解酵素抵抗性であるという既知のデータは、哺乳類へのモルフォゲンの治療的投与に対する有益な経路として経口投与があげられることを示す。典型的な経口投与は予防的治療のための形態の好ましい方法である。加えて、初乳を含む全てのミルク形におけるモルフォゲンの同定は、蛋白質が若年性の骨発育を含む組織発達に重要な役割を演じていることを示す(下記の実施例13参照)。
【0106】
10.1ミルク中でのモルフォゲン検出
OP−1はラット哺乳動物腺抽出物と牛初乳そして57日目のミルクからクロマトグラフィーカラムシリーズからの通過物より:(例 カチオン−交換、アフィニテイーそして逆層)部分的に精製された。各々のステップで流出物は分画として集められ、そして標準的なイムノブロットによってOP−1の存在が試験された。次に免疫反応性分画が集められ、さらに精製された。最後に部分的に精製された産物がOP−1特異的抗体を用いてウエスタンブロット分析によってOP−1の存在に対してテストされた。そしてインビボとインビトロ活性を同様に試験した。異なるミルクソースから精製されたOP−1は、OP−1とBMP2に対する抗体を用いてウエスタンブロットによって特徴づけられた。抗体は実施例14に一般的に述べたようにそして熟練者によって良く知られている標準的な免疫プロトコールを用いて抗原としてフルレングスの大腸菌生産のOP−1とBMP2を用いて調製された。
【0107】
図7に示したように、初乳から精製したOP−1は抗BMP2抗体とは反応せず、抗OP−1抗体と反応する。図7において、レーン1は遺伝子組み換によって生産され精製され還元されたOP−1を含む;レーン2は精製ウシ初乳からのOP−1を含む、そしてレーン3は還元されたCOP−16を含む、COP−16は生合成構築物であってモルフォゲン活性を有しここで述べた蛋白質上にモデル化されたアミノ酸配列を有するがしかしBMP2と最も高いアミノ酸配列ホモロジーを有している(COP−16アミノ酸配列、USSN5,011,691を参照)。
【0108】
図7Aにおいて、ゲルは抗OP−1抗体でプローブ化された;図7Bにおいて、ゲルは抗−BMP2抗体でプローブ化された。図に見られたように、抗OP−1抗体のみがレーン1と2における蛋白質とハイブリダイズする、しかし3とはしない;そして抗−BMP2抗体はレーン3とのみハイブリダイズする。
【0109】
カラム精製哺乳動物腺抽出物と57日目のミルクが同様に抗OP−1と特異的に反応する、抗OP−1としては全長の(フルレングス)大腸菌OP−1、全長の哺乳類生産OP−1そしてOP−1 Ser−17−Cysペプチド(例 OP−1 N末端の17個のアミノ酸)に対する抗体を含む。
【0110】
哺乳腺抽出物から精製されたOP−1のモルフォゲン活性はインビボで次のように評価された。試料は哺乳腺抽出物由来OP−1最終産物の各々のOP−1免疫反応分画から該分画の一部(33%)を凍結乾燥しそして50%アセトニトリル/0.1%TFAの220μlに再分散することによって調製された。撹拌後、コラーゲンマトリックスの25mgを添加した。試料は1昼夜凍結乾燥された。ロングエバンズラット中に移植された(チャールスリバー研、ウイルミントン、マサチュウセッツ、28−35日齢)。各々の分画は2回づつ行なわれた。コラーゲンマトリックス移植法の詳細は例えばUSSN4,968,590を参照する。12日後、移植物は取り出されそして組織学的観察によって新生骨形成を評価した。
【0111】
結果は図8Aに現わされた、ここで”%活性”は組織試料中の骨によって覆われた骨形成/全領域の%として表示された。図において、四角の棒は哺乳腺抽出物−由来OP−1を用いる移植のものを現わす、各々精製産物の免疫反応分画に対応する棒、分画数はX軸に示されている。斜線の棒は組み換え型生産OP−1(600ng)を用いる移植を現わす。図に見られるように全ての免疫反応分画は骨形成能を有している。同様に、乳腺抽出物から精製されたOP−1のモルフォゲン活性は、次の分析法でインビトロでアルカリフォスファターゼ活性を測定することによってインビボで評価された。試験試料は最終産物から集められた個々の免疫反応性分画の15−20%を用いてインビボ分析のために調製された。アルカリフォスファターゼ活性は実施例4のようにして試験された。図8Bに現わされた結果は免疫反応性分画はインビトロでアルカリフォスファターゼ活性を刺激できることを示す。さらに本活性は高度に精製された組み換え型OP−1によって生産されるものと良く相関する。図8B四角の棒は乳腺精製OP−1で行なわれた分析を示す、各々の棒カラム精製OP−1の免疫反応性分画に対応する。分画数はX軸に示されている;斜線の棒は精製された組み換え型OP−1(100ng)で為された分析を現わす;そしてクロスした斜線の棒はバックグラウンドを示す。
【0112】
10.2血清中でのモルフォゲンの検出
モルフォゲンはモルフォゲン特異的抗体を用いて検出されるであろう。本分析はどの標準的免疫分析を用いても達成されるであろう。例えば、ウエスタンブロット(免疫ブロット)のような。好ましくは、分析はモルフォゲン特異的抗体が結合し次に試料である血清が通過されると関連するモルフォゲンを選択的に溶出できるアフィニテイーカラムを用いて達成される。次にモルフォゲンが溶出される。適切な溶出緩衝液は、初めコントロール分画(例 精製組み換えモルフォゲン)を用いて経験的に適切な結合および溶出条件を決定する、次に標準的な免疫ブロットとN−末端配列の確認結果を用いてモルフォゲンの存在を試験する。好ましくは、アフィニテイーカラムはモノクローナル抗体を使用して調製する。血清あるいは他の液体試料中のモルフォゲンの濃度が次に分光光度計による吸光度測定あるいは結合した抗体の定量等を含む標準的蛋白質定量法を用いて決定される。
【0113】
血清中のOP−1を同定するための試料プロトコールが下記に示されている。本一般的方法に従って他のモルフォゲン類も血清を含む体液から検出されるであろう。
【0114】
血清中でのモルフォゲンの同定は、固体へのモルフォゲンの治療濃度を達成するための全身性投与が適切な手段であることを示す。そしてモルフォゲンは好ましくは内在性因子様因子として全身性に作用する。最後に本プロトコールを用いて内在性モルフォゲンのレベルにおける振れを検出できる。そしてこれらの変化したレベルは骨組織の失調の指標として用いられるだろう。他に、モルフォゲンレベルの振れは、実施例1に述べたように標準的ノーサンブロット分析、あるいは実施例1に一般的に述べたような熟練研究者によって述べられた標準的なRNAハイブリダイゼーションプロトコールとモルフォゲンRNAへ特異的にハイブリダイズできる標識プローブをもちいるインサイチユーによるハイブリダイゼーションのいずれかによって評価される。
【0115】
OP−1は下記の分析によってヒト血清中に検出される。一般的に実施例14に述べられ熟練研究者に良く述べられる標準的免疫技術を用いて哺乳動物からの組み換え体から生産されたOP−1に対して作成されたモノクローナル抗体がアガロース活性化ゲル上を抗体を通過させることによって固定化された[例 次の方法に従って調製されたアフィゲルTM、バイオラッド研究所、リッチモンド、カリフォルニア]そして血清からOP−1を精製するために用いた。ヒト血清が次にカラム上を通過され、そして3MK−チオシアネートで溶出した。K−チオシアネート分画が次に6M尿素、20mM PO4、pH7.0中で透析し、C8HPLCカラムに乗せられ、20分間25−50%アセトニトリル/0.1%TFA勾配で溶出された。成熟した組み換えによって生産されたOP−1ホモダイマー抽出物は20−22分間に溶出した。分画は次に集められ、そして実施例10AのようにOP−1特異的抗体を用いて標準イムノブロットによってOP−1の存在を試験した。図9は還元および酸化条件下でのヒト血清中のOP−1を示すイムノブロットである。図中でレーン1と4はOP−1標準である、レーン1は酸化状態でのそしてレーン4は還元状態でのそれである。レーン5は17、27そして39KDaの分子量マーカーを示す。レーン2と3はヒト血清OP−1、レーン2は酸化条件レーン3は還元条件でのものを示す。
【0116】
モルフォゲンは、骨組織の状態における変化を示す体液モルフォゲンレベルにおける振れを利用して、前もって決定された参照値を用いる体液資料中に存在するモルフォゲンの量を比較することによって診断的用途に用いられるだろう。なお、内在性モルフォゲン抗体のレベルの振れは内在性モルフォゲン抗体と特異的に相互作用できる抗体あるいは他の結合蛋白を用いて、最も好ましくは血清中で本法によって検出される。内在性抗体レベルで検出された振れは組織状態の変化の指標として用いられるだろう。
【実施例11】
【0117】
モルフォゲン誘導骨膜と骨内層形成
骨組織吸収−誘導骨再吸収は最初に骨組織の骨内層表面で起きる。従って、骨再生失調症において骨髄腔が不自然に大きく残っている骨の力を与える重さに脆くなっている。
【0118】
下記の実施例は、哺乳類における骨内層と骨膜実質を増加させる、ここで述べたモルフォゲンの能力を評価する手段を提供する。本実施例において、骨膜と骨内層骨形成両者とも、骨組織に直接に、生体適合性溶液にモルフォゲンを入れて投与することによって誘導される。下記に述べたように、モルフォゲンは新規骨の形成を誘導できるそして直接投与によって骨に供給されたとき骨表面で骨実質を増加させる。直接の投与は、増大した骨髄腔の減少と/または振れを修復し骨組織の微細構造のダメージを効果的濃度で治療するために好ましい投与方法であろう。
【0119】
モルフォゲンが、個々に単回投与によってラット大腿骨の骨膜(骨表面外面あるいは表面)と骨内層(内側の骨表面 例 髄腔に沿った表面)に供給された。特にモルフォゲン(例 OP−1,2−20μg)がリン酸生理食塩緩衝液中でコロイド状分散液として骨組織に供給された。骨内層への投与は手動の整形外科用ドリルを使って微細孔を通して行なわれた。7日後、処置骨は取り出されそしてUSPNo.4,968,590に述べたようにして組織的に評価するために調製された。2μgモルフォゲン程の少量が4−7日以内に投与部位に新骨形成を誘導するために充分である。加えて、骨誘導は投与量依存性である。顕微鏡で見た組織は図10に示されている。図において、”ob”は古い骨を意味する。”bm”は骨髄を意味する。”nb”は新しい骨を意味する、そして”m”は筋肉を意味する。図10Aは骨内層表面にモルフォゲンの投与を行なった新しく形成された骨を示す。図に見られるように、新しい骨は骨髄腔内に形成され、腔の表面を覆っている。
【0120】
図10Bは骨膜表面にモルフォゲンを投与して正常に存在する筋肉に置換して新しく形成された骨を示す。
【実施例12】
【0121】
骨吸収におけるモルフォゲンの効果
骨吸収におけるモルフォゲンの効果が、モルフォゲン存在下と非存在下で牛骨片上でラット溶骨細胞をもちいて、そして膜孔にけるモルフォゲンの効果(吸収の指標)を評価される。標準的条件下でラット溶骨細胞は骨組織を吸収し骨片表面に膜孔形成を引き起こす。本実験に於いて、OP−1が試験されたモルフォゲンであって0,5,10,20,40,50そして100ng/mlで使われた。
結果は図11に現わされている、ここで吸収の指標はコントロールの存在下で%として計算された(例 モルフォゲン非存在下での骨吸収)、与えられた切片表面領域当りの膜孔の数として計算される。40ng以下で、骨吸収が増大された;40ng以上ではOP−1は骨吸収に対して明らかな効果がなかった。本結果は骨再生においてモルフォゲンが演じる不可欠な役割のうちのハイライトである。OP−1はインビボで骨組織に蓄えられる。正常骨再生サイクルにおいて、表面でのOP−1の局所濃度は溶骨細胞が骨を吸収し始めた時低い、そしてその低濃度は骨吸収を増加および/または刺激するだろう。吸収が続くとき、表面でのOP−1の局所濃度は、溶骨細胞の効果がなくなるまで濃度が増加する、しかし骨生長を刺激する骨芽細胞の生長と活性への影響は続く(実施例2−7参照)。
【0122】
加えて、モルフォゲンは単核ファゴサイト細胞が正常に活性化される条件下で同細胞の多核化を阻害できる。例えば、モルフォゲンの無い条件下で、例えば、チタニウム酸化物、あるいは他の全ての基質のような多核巨大細胞形成をもたらすセラミック,石灰化骨からなる移植基質物質(例 皮下に移植)はすぐに多核巨大細胞によって囲まれる、例えば外来産物に応答しそれを壊すために刺激される活性化食細胞である。しかしながら、モルフォゲンの存在下で、新規細胞は単核の前駆体形のままであって、マトリックス物は壊されない。図12はモルフォゲンのこれらの効果を、皮下に移植したチタニウム酸化物基質の組織学的結果の図視的表現によって例証する。図中で、”mg”は多核巨大細胞を意味し、”ob”は骨芽細胞を意味する。図12Bに現わされた基質はモルフォゲン(OP−1)と一緒に移植されたそして新しく形成された骨芽細胞は明らかに基質を取囲んでいる。対照的に、モルフォゲン無しに移植された図12Aに示した基質は多くの多核巨大細胞形成が基質を取囲んで起きているのは明らかであった。
【0123】
従って、哺乳動物における過剰の骨実質の喪失を阻害することにおけるモルフォゲンの効果が同様にこれらの細胞における活性化を阻害しているのかもしれない。
【実施例13】
【0124】
骨生長におけるモルフォゲン中和の効果
発生中の哺乳類における骨生長のここで述べたモルフォゲンの効果が、骨発生におけるこれらに対する抗体の効果を調べることによって、特にモルフォゲンに対する特異的な抗体で中和することによって評価できるだろう。特に抗モルフォゲンモノクローナルそして/またはポリクローナル抗体が下記実施例14に述べたプロトコールを含む標準的方法で調製されるだろう。
【0125】
精製抗体は次に新生児マウスに定期的に投与される、例 10−100μg/投与/日を10から15日。10から21日で、マウスは屠殺されそして骨発生におけるモルフォゲンの効果が体重、大まかな視覚観察と組織的観察によって為された。本実験において、抗OP−1抗体が用いられた。モルフォゲン中和は体重の減少によって示されたように有意に骨生長を含む体重増加を妨げた、そして処置哺乳類の骨長をも減少させた。同様に、モルフォゲン活性は下記分析を用いるマウスモデルの胎児発生を決定した。モルフォゲン−特異的抗体の10−100μg/投与からなる単回の口唇投与が処置とコントロールマウスでの妊娠期間と骨発生のそれぞれの日に妊娠雌マウスに投与しそして誕生時に標準的組織形態学的分析を行なった。同様に口唇投与は若年時のあるいは成熟マウスにも投与される(例10−100μg)が長い時間(例 10−15日間)骨生長における効果と骨蓄積そして骨粗鬆症の程度を評価するため投与された。抗体は、発生中の胚において、骨生長と骨発生を含む組織モルフォゲンを阻害することが予想された。
【実施例14】
【0126】
内在性モルフォゲンレベルを変えると予想される化合物に対するスクリーニング分析
与えられたモルフォゲンのレベルに影響を与えるために投与される予想化合物が次のスクリーニン分析を用いて見出されうる。ここで、モルフォゲンの測定できうるレベルを生産する細胞型によるモルフォゲン生産のレベルが化合物との培地中で細胞を、細胞での化合物の効果を推定するためにインキュベートし、およびインキュベート無しで決定される。これは蛋白質あるいはRNAレベルのいずれかでモルフォゲンを検出することによって達成される。詳細な記述は同様に参照によって上記に記入された米国特許752、861に見出されるだろう。
【0127】
14.1培地での細胞の生長
腎臓、副腎、ぼうこう、脳、あるいは他の器官の細胞培養が広く文献に記述されたように調製される。例えば、腎臓は胎児あるいは新生児あるいは若いまたは成熟げっし類(マウスあるいはラット)から移植されるそして全あるいは切片(1−4mm)組織として器官培養に用いられる。腎臓、副腎、ぼうこう、脳、乳腺あるいは他の組織から由来する初代組織培養と確立された細胞系が通常の細胞培養技術に従ってマルチウエルプレート(6穴または24穴)で確立されるだろう、そして一定期間(1−7日間)血清の存在あるいは非存在下で培養される。細胞は例えば望ましくは血清(例,仔牛血清1−10%)含むダルベッコ修飾イーグル培地(ギブコ、ロングアイランド、ニューヨーク)無血清培地あるいは限定培地(例 インスリン、トランスフェリン、グルコース、アルブミンあるいは他の生長因子を含む)中で培養される。
【0128】
モルフォゲン生産のレベルを試験するための試料は培養上清あるいは細胞溶解物を含み、定期的に集められそしてイムノブロット分析(サムブロック他 編1988、分子クローニング、コールドスプリングハーバー印刷、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク)によるモルフォゲン生産を測定される、あるいは細胞培養の一部が定期的に集められ、そしてRNA分析のためにポリA+RNAを調製される。デノボモルフォゲン合成をモニターするため、幾つかの培養は6−24時間35S−メチオニン/35S−システイン混合物とともに通常の方法に従って標識され、そして通常の免疫沈殿法によってモルフォゲンの蛋白質合成に対して評価された。
14.2モルフォゲンのレベルの測定
細胞型によるモルフォゲン蛋白質の生産を定量するために、免疫分析が該蛋白質に対する特異的なポリクローナルあるいはモノクローナル抗体を用いてモルフォゲンを検出するために行なわれた。例えば、OP−1が下記のようにELISAにおいてOP−1に対する特異的なポリクローナル抗体をもちいて検出されうる。
【0129】
OP−1に特異的なアフィニテイー精製したポリクローナルウサギIgG抗体の1μg/100μlが96ウエルプレートのそれぞれのウエルに添加されそして37℃で1時間インキュベートされた。ウエルは0.1%トイーン20を含む0.15M NaClと0.167Mナトリウムホウ酸緩衝液pH8.2[BSB]で4回洗浄された。非特異的結合を最小限にするため、ウエルは1%牛血清アルブミンを含むBSBで完全に覆うことによってブロックしたそして37℃で1時間インキュベートした。ウエルは次に0.1%トイーン20を含むBSBで4回洗浄した。細胞培養上清の試験試料の各々の適切な希釈した100μl部分がトリプリケートに各ウエルに加えられ37℃で30分間インキュベートした。インキュベーション後、100μlのビオチニル化したウサギ抗OP−1血清(保存溶液は1mg/mlである、使用前に1%BSAを含むBSBで400倍に希釈される)を各ウエルに添加され37℃で30分間インキュベートされる。ウエルは次に0.1%トイーン20を含むBSBで4回洗浄される。100μlストレパビジン−アルカリン(サイサーンバイオテクノロジーアソシエート(株)、バーミンガム、アラバマ、使用前に0.1%トイーン20を含むBSBで2000倍に希釈される。)が各ウエルに添加されそして37℃で3分間インキュベートされた。各プレートは0.5Mトリス食塩緩衝液pH7.2(TBS)で4回洗浄した。50μlの基質が(ELISA増幅システムキット、ライフテクノロジー(株)ベセスダ、MD)が各ウエルに添加され15分間室温でインキュベートされた。次に50μl増幅剤(同じ増幅システムキット)が添加され室温でさらに15分間インキュベートされた。反応は50μlの0.3M硫酸の添加によって停止された。各ウエルの溶液の490nmでの吸収が記録された。培養溶液中のOP−1を定量するためOP−1スタンダード曲線が試験試料と一緒に行なわれた。
【0130】
ポリクローナル抗体は下記のように調製された。各ウサギは、500μl完全フロイントアジュバントと混合された0.1%SDS中で初期免疫用に100μg/500μl大腸菌生産OP−1モノマー(アミノ酸シーケンスNO:5)を与えられた。抗原は動物の背部および側腹部の皮下で多数の場所に投与された。ウサギは不完全フロイントアジュバントをもちいて同様の方法で1ヶ月後ブウス化された。試験血液は7日後耳静脈から採血された。2回の付加的ブーストと試験採血がOP−1に対する抗体がELISA分析で血清中に検出されるまで1ケ月間隔で行なわれた。次にウサギは100μgの抗原で月々にブーストされそして7−10回のブーステイング後に採血(15mlづつ)された。
【0131】
与えられたモルフォゲンに特異的なモノクローナル抗体は下記のように調製される。マウスが大腸菌生産OP−1モノマーの2回の投与を受ける。最初の投与は完全フロイントアジュバント中にOP−1の100μgを含むそして皮下に投与される。第2回目は不完全フロイントアジュバント中の50μgのOP−1を含み腹腔に投与される。次にマウスは8ヵ月以上の様々な期間に4回の腹腔投与に全量230μgのOP−1(アミノ酸307−431 シーケンスID5)を受ける。融合1週間前、両マウスはOP−1の100μgとSMCC架橋結合試薬とともに牛血清アルブミンに添加システインを通じて結合したN−末端ペプチド(Ser293−Asn309−Cys)の30μgで腹腔にブーストされた。このブーストは融合前5日間(IP)、4日間(IP)、3日間(IP)そして1日間(IV)繰り返された。マウス脾臓細胞が次に市販の利用できるミエローマ細胞とPEG1500(ベーリンガーマンハイム、ドイツ)を用いて1:1の割合で融合された。細胞融合はプレート中に入れられ、抗原としてOP−1(307−431)を用いてOP−1特異的抗体を選別した。細胞融合とモノクローナル抗体の選別は当該技術分野に広く利用される標準的テキストに記載されている標準的な良く述べられた方法にしたがって行なわれた。
他の実施例
本発明は本精神と本質的特徴から離れることなしに他の特異的形で実施されうる。本実施例はそれ故、例証的であって限定的なものとしてでなく全ての観点が考慮される。先の説明によってよりもむしろ従属請求項によって示される本発明のスコープと等しい請求項間の意味と領域内におきる全ての変化もそれ故包括的にそれらに含まれる本発明の他の実施例は下記請求項内にある。
【産業上の利用可能性】
【0132】
つまり,本明細書の開示から,遺伝子工学の当業者であれば,適当なアミノ酸シーケンスをコードする種々の異なる種のcDNAもしくは遺伝子ライブラリーから遺伝子を単離することまたオリゴヌクレオチドからDNAを構築することができ,次いで,原核細胞もしくは真核細胞を含む,種々の形式のホスト細胞中に発現させて,人を含むほ乳動物において,骨形成を促進するおよび/または異常な骨劣化を阻止することができ,適当な骨実質を維持しかつ骨再生および成人の骨組織を発達させるのに使用する活性タンパク質を大量に製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【0133】
本発明の上記ならびにその他の目的ならびに特長ばかりでなく,本発明そのものも,添付図面とともに読めば,その記載からより完全に理解することができる。
【図1】ラット骨芽細胞に対するhOP−1とTGF−βの分裂促進効果を比較した図である。
【図2】骨芽細胞のコラーゲン合成に対するヒト骨形成タンパク質−1(hOP−1)の効果を示している。
【図3】ラット骨芽細胞に対するhOP−1とTGF−βのアルカリホスファターゼ誘発効果を比較した図である。
【図4】ラット骨芽細胞によるアルカリホスファターゼ産生に対するhOP−1の長期効果を示している。
【図5】培地中のラット骨芽細胞を用いての甲状腺ホルモン介在CAMP産生に対するhOP−1の効果を示している。
【図6】(A)オステオカルシン合成に対するモルフォゲンの効果を示すグラフであり,(B)無機質化の割合に対するモルフォゲンの効果を示すグラフである。
【図7】OP−1およびBMP2特異性抗体を用いたウシ初乳のウエスタンブロット合成を示している。
【図8】Aおよび8Bは,乳房腺抽出物を精製したOP−1をそれぞれ生体内(in vivo)及び生体外(in vitro)で活性アッセイをした結果を示す。
【図9】血清中のOP−1の存在を示すイムノブロットの光学顕微鏡図を示す。
【図10】(A)骨内膜表面へのモルフォゲン注入に続く新規な骨内膜形成ならびに(B)骨膜表面へのモルフォゲン注入に続く新規な骨膜形成を示す光学顕微鏡酢を示す。
【図11】骨吸収に対するモルフォゲンの薬剤依存効果を示すグラフである。
【図12】AおよびBは,生体内での初期単核食細胞の細胞多核化のモルフォゲン阻止を示す略図である。
【配列表】
(1)一般情報
(i)出願人: タンガベル カバラサンパス
チャールス コーエン
ハーマン オッパーマン
エンジン オカヤナク
ダビト シー.ルエガー
ロイ エッチ.エル.パング
(ii)発明の名称: 代謝性骨疾患において骨実質の損失を予防または/および増加させるための処置
(iii)配列の数:33
(iv)対応する住所
(A)住所:テスタ、フルヴィッツ及びチボールト
(B)ストリート:53 ステートストリート
(C)市: ボストン
(D)州: マサチューセッツ
(E)国: 米国
(F)郵便番号:02109
(v)コンピューター判読形式
(A)媒体の形式:フロッピーディスク
(B)コンピューター: IBM XT
(C)作業システム:DOS 3.30
(D)ソフトウエアー;パテントインレリース 1.0,バージョン1.25
(vi)現在の出願資料
(B)出願日
(vii)先の出願資料
(A)出願番号:US 752,857
(B)出願日:1991年8月30日
(viii)先の出願資料;
(A)出願番号:US 667,274
(B)出願日: 1991年8月30日
(2)配列番号1についての情報
(i)配列の特徴
(A)長さ:97アミノ酸
(B)型: アミノ酸類
(C)トポロジー: 直鎖状
(ii)配列の種類;タンパク質
(ix)特徴:
(A)名称: 一般配列1
(D)その他の情報: 各Xaaは20種の天然型L-アイソマー、α−アミノ酸あるいはそれらの誘導体のひとつを示す。
(xi)配列:配列番号1
(2)配列番号2についての情報
(i)配列の特徴
(A)長さ:97アミノ酸
(B)型: アミノ酸類
(C)トポロジー: 直鎖状
(ii)配列の種類:タンパク質
(ix)特徴:
(A)名称: 一般配列2
(D)その他の情報: 各Xaaは20種の天然型L-アイソマー、α−アミノ酸あるいはそれらの誘導体のひとつを示す。
(xi)配列:配列番号2
(2)配列番号3についての情報
(i)配列の特徴
(A)長さ:97 アミノ酸
(B)型: アミノ酸類
(C)トポロジー: 直鎖状
(ii)配列の種類:タンパク質
(ix)特徴:
(A)名称: 一般配列3
(D)その他の情報: 各Xaaは明細書中で規定されるように1個又はそれ以上の特定アミノ酸の一群から独立に選択される。
(xi)配列:配列番号3
(2)配列番号4についての情報
(i)配列の特徴
(A)長さ:102アミノ酸
(B)型: アミノ酸類
(C)トポロジー: 直鎖状
(ii)配列の種類:タンパク質
(ix)特徴:
(A)名称: 一般配列4
(D)その他の情報: 各Xaaは明細書中で規定されるように1個又はそれ以上の特定のアミノ酸の一群から独立に選択される。
(xi)配列: 配列番号4
(2)配列番号5についての情報
(i)配列の特徴
(A)長さ:139アミノ酸
(B)型: アミノ酸類
(C)トポロジー: 直鎖状
(ii)配列の種類:タンパク質
(ix)特徴:
(A)名称: hOP-1(成熟型)
(xi)配列: 配列番号5
(2)配列番号6についての情報
(i)配列の特徴
(A)長さ:139アミノ酸
(B)型: アミノ酸類
(C)トポロジー: 直鎖状
(ii)配列の種類:タンパク質
(ix)特徴:
(A)名称: mOP-1(成熟型)
(xi)配列: 配列番号6
(2)配列番号7についての情報
(i)配列の特徴
(A)長さ:139アミノ酸
(B)型: アミノ酸類
(C)トポロジー: 直鎖状
(ii)配列の種類:タンパク質
(ix)特徴:
(A)名称: hOP-2(成熟型)
(xi)配列: 配列番号7
(2)配列番号8についての情報
(i)配列の特徴
(A)長さ:139アミノ酸
(B)型: アミノ酸類
(C)トポロジー: 直鎖状
(ii)配列の種類:タンパク質
(ix)特徴:
(A)名称: mOP-2(成熟型)
(xi)配列: 配列番号8
(2)配列番号9についての情報
(i)配列の特徴
(A)長さ: 96アミノ酸
(B)型: アミノ酸類
(C)トポロジー: 直鎖状
(ii)配列の種類:タンパク質
(ix)特徴:
(A)名称: CBMP2A(fx)
(xi)配列: 配列番号9
(2)配列番号10についての情報
(i)配列の特徴
(A)長さ:101アミノ酸
(B)型: アミノ酸類
(C)トポロジー: 直鎖状
(ii)配列の種類:タンパク質
(ix)特徴:
(A)名称: CBMP2B(fx)
(xi)配列: 配列番号10
(2)配列番号11についての情報
(i)配列の特徴
(A)長さ:102アミノ酸
(B)型: アミノ酸類
(C)トポロジー: 直鎖状
(ii)配列の種類:タンパク質
(ix)特徴:
(A)名称: DPP(fx)
(xi)配列: 配列番号11
(2)配列番号12についての情報
(i)配列の特徴
(A)長さ:102アミノ酸
(B)型: アミノ酸類
(C)トポロジー: 直鎖状
(ii)配列の種類:タンパク質
(ix)特徴:
(A)名称: Vgl(fx)
(xi)配列: 配列番号12
(2)配列番号13についての情報
(i)配列の特徴
(A)長さ:102アミノ酸
(B)型: アミノ酸類
(C)トポロジー: 直鎖状
(ii)配列の種類:タンパク質
(ix)特徴:
(A)名称: Vgr-1(fx)
(xi)配列: 配列番号13
(2)配列番号14についての情報
(i)配列の特徴
(A)長さ:106アミノ酸
(B)型: タンパク質
(C)鎖の数: 一本鎖
(D)トポロジー: 直鎖状
(ii)配列の種類:タンパク質
(vi)起源:
(A)動物: ヒト
(F)組織型: 脳
(ix)特徴:
(D)その他の情報:
/生産物=“GDF-1(fx)”
(xi)配列: 配列番号14
(2)配列番号15についての情報
(i)配列の特徴
(A)長さ: 5アミノ酸
(B)型: アミノ酸類
(C)鎖の数: 一本鎖
(D)トポロジー: 直鎖状
(ii)配列の種類:ペプチド
(xi)配列: 配列番号15
(2)配列番号16についての情報
(i)配列の特徴
(A)長さ: 1822塩基対
(B)型: 核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー: 直鎖状
(ii)配列の種類:cDNA
(vi)起源
(A)動物: ホモサピエンス
(F)組織型: 海馬
(ix)特徴
(A)名称/キー:CDS
(B)位置:49..1341
(D)その他の情報: 標準名=“hOP1”
(xi)配列: 配列番号16
(2)配列番号17についての情報
(i)配列の特徴
(A)長さ: 431アミノ酸
(B)型: アミノ酸
(D)トポロジー: 直鎖状
(ii)配列の種類:タンパク質
(ix)特徴:
(D)その他の情報:/生産物=“OP1-PP”
(xi)配列: 配列番号17
(2)配列番号18についての情報
(i)配列の特徴
(A)長さ: 1873塩基対
(B)型: 核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー: 直鎖状
(ii)分子の型:cDNA
(vi)起源
(A)生物名: ムリーダ(MURIDAE)
(F)組織の種類: 胚
(ix)特徴
(A)名称/キー:CDS
(B)位置:104..1393
(D)その他の情報: 標準名=“MOP(cDNA)”
(xi)配列: 配列番号18
(2)配列番号19についての情報
(i)配列の特徴
(A)長さ: 430アミノ酸
(B)型: アミノ酸
(D)トポロジー: 直鎖状
(ii)分子の型:タンパク質
(ix)特徴:
(D)その他の情報:/生産物=“mOP1-PP”
(xi)配列: 配列番号19
(2)配列番号20についての情報
(i)配列の特徴
(A)長さ: 1723塩基対
(B)型: 核酸
(C)鎖の数: 一本鎖
(D)トポロジー: 直鎖状
(ii)分子の型:cDNA
(vi)起源:
(A)生物名: ホモサピエンス
(F)組織の種類: 海馬
(ix)特徴
(A)名称/キー:CDS
(B)位置:490..1696
(D)その他の情報: 標準名=“hOP2(cDNA)”
(xi)配列: 配列番号20
(2)配列番号21についての情報
(i)配列の特徴
(A)長さ: 402アミノ酸
(B)型: アミノ酸
(D)トポロジー: 直鎖状
(ii)分子の型:タンパク質
(ix)特徴:
(D)その他の情報:/生産物=“hOP2-PP”
(xi)配列: 配列番号21
(2)配列番号22についての情報
(i)配列の特徴
(A)長さ: 1926塩基対
(B)型: 核酸
(C)鎖の数: 一本鎖
(D)トポロジー: 直鎖状
(ii)分子の型:cDNA
(vi)起源
(A)生物名: ムリダー
(F)組織の種類: 胚
(ix)特徴
(A)名称/キー:CDS
(B)位置:93..1289
(D)その他の情報: 標準名=“mOP2(cDNA)”
(xi)配列: 配列番号22
(2)配列番号23についての情報
(i)配列の特徴
(A)長さ: 399アミノ酸
(B)型: アミノ酸
(D)トポロジー: 直鎖状
(ii)分子の型:タンパク質
(ix)特徴:
(D)その他の情報:/生産物=“mOP2-PP”
(xi)配列: 配列番号23
(2)配列番号24についての情報
(i)配列の特徴
(A)長さ: 1368塩基対
(B)型: 核酸
(C)鎖の数: 一本鎖
(D)トポロジー: 直鎖状
(ii)分子の型:cDNA
(ix)特徴
(A)名称/キー:CDS
(B)位置:1..1368
(D)その他の情報: 標準名=“60A”
(x)公表情報:
(A)著者: ワートン、クリスティー エー.;トムセン、ジェラルド エッチ.;ゲルバート、ウイリアム エム.
(B)表題: ショウジョウバエ60A 遺伝子
(C)雑誌:PROC.NAT′L ACAD.SCI.USA
(D)巻:88
(E)配列番号3において関連する残基:1から1368
(F)ページ:9214-9218
(G)日付け: 1991年10月
(xi)配列: 配列番号24
(2)配列番号25についての情報
(i)配列の特徴
(A)長さ: 455アミノ酸
(B)型: アミノ酸
(D)トポロジー: 直鎖状
(ii)分子の型:タンパク質
(xi)配列: 配列番号25
(2)配列番号26についての情報
(i)配列の特徴
(A)長さ: アミノ酸類
(B)型: アミノ酸
(C)トポロジー: 直鎖状
(ii)分子の型:タンパク質
(iii)起源
(A)生物名: ホモサピエンス
(ix)特徴
(A)名称/キー: タンパク質
(B)位置:1..102
(D)その他の情報:/ノート=“BMP3”
(2)配列番号26についての情報
(i)配列の特徴
(A)長さ: 104アミノ酸
(B)型: アミノ酸
(C)鎖の数: 一本鎖
(D)トポロジー: 直鎖状
(ii)分子の型:タンパク質
(ix)特徴
(A)名称/キー: タンパク質
(B)位置:1..104
(D)その他の情報:/ノート=“BMP3”
(xi)配列: 配列番号26
(2)配列番号27についての情報
(i)配列の特徴
(A)長さ: 102アミノ酸
(B)型: アミノ酸
(C)鎖の数: 一本鎖
(D)トポロジー: 直鎖状
(ii)分子の型:タンパク質
(vi)起源:
(A)生物名: ホモサピエンス
(ix)特徴
(A)名称/キー: タンパク質
(B)位置:1..102
(D)その他の情報:/ノート=“BMP5”
(xi)配列: 配列番号27
(2)配列番号28についての情報
(i)配列の特徴
(A)長さ: 102アミノ酸
(B)型: アミノ酸
(C)鎖の数: 一本鎖
(D)トポロジー: 直鎖状
(ii)分子の型:タンパク質
(iii)起源:
(A)生物名: ホモサピエンス
(ix)特徴
(A)名称/キー: タンパク質
(B)位置:1..102
(D)その他の情報:/ノート=“BMP6”
(xi)配列: 配列番号28
(2)配列番号29についての情報
(i)配列の特徴
(A)長さ: 102アミノ酸
(B)型: アミノ酸
(D)トポロジー: 直鎖状
(ii)分子の型:タンパク質
(ix)特徴
(A)名称/キー: タンパク質
(B)位置:1..102
(D)その他の情報:/ラベル=OPX/ノート=“ここで各POS’NでのXAAは、マウスあるいはヒトOP1あるいはOP2のC-末端配列において対応するPOS’Nに生じる残基から独立に選択される”(配列番号5,6,7,及び8又は16,18,20,及び22参照)
(xi)配列: 配列番号29
(2)配列番号30についての情報
(i)配列の特徴
(A)長さ: 97アミノ酸
(B)型: アミノ酸類
(C)トポロジー: 直鎖状
(ii)分子の型:タンパク質
(ix)特徴
(A)名称: 一般配列5
(D)その他の情報: ここで各Xaaは、明細書中に定義されるように1個又はそれ以上の特定されたアミノ酸の一群より独立に選択される。
(xi)配列: 配列番号30
(2)配列番号31についての情報
(i)配列の特徴
(A)長さ: 102アミノ酸
(B)型: アミノ酸類
(C)トポロジー: 直鎖状
(ii)分子の型:タンパク質
(ix)特徴
(A)名称: 一般配列6
(D)その他の情報: ここで各Xaaは、明細書中に定義されるように1個又はそれ以上の特定されたアミノ酸の一群より独立に選択される。
(xi)配列: 配列番号31
(2)配列番号32についての情報
(i)配列の特徴
(A)長さ: 1238塩基対、372アミノ酸
(B)型: 核酸、アミノ酸
(C)鎖の数: 一本鎖
(D)トポロジー: 直鎖状
(ii)分子の型:cDNA
(iii)起源
(A)生物名: ヒト
(F)組織の種類: 脳
(iv)特徴:
(A)名称/キー:CDS
(B)位置:
(D)その他の情報:
/生産物=“GDF-1”
/ノート=“GDF-1cDNA”
(x)公表情報:
(A)著者: リー、シー−ジン
(B)表題: 生長/分化因子1の発現
(C)雑誌:Proc.Nat’l Acad.Sci.
(D)巻:88
(E)関連する残基:1-1238
(F)ページ:4250-4254
(G)日付け: 1991年5月
(xi)配列: 配列番号32
(2)配列番号33についての情報
(i)配列の特徴:
(A)長さ:372アミノ酸
(B)型: アミノ酸
(C)鎖の数: 一本鎖
(D)トポロジー: 直鎖状
(ii)分子の型:cDNA
(iii)ハイポセティカル配列:No
(iv)アンチ−センス:No
(vi)起源:
(A)生物名: ヒト
(F)組織の種類: 脳
(ix)特徴:
(A)名称/キー:CDS
(B)位置:
(D)その他の情報:/機能=/生産物=“GDF-1”
(xi)配列: 配列番号33
Claims (16)
- 配列番号5の残基43〜139のアミノ酸配列を含み、かつ生体内での骨検査において軟骨形成誘発活性を有するモルフォゲンを有効成分として含む、哺乳動物の代謝性骨疾患を治療するために全身性に投与される薬剤。
- 代謝性骨疾患が骨粗しょう症または骨軟化症を含む、請求項1の薬剤。
- 骨粗しょう症が閉経後または老人性の骨粗しょう症である、請求項2の薬剤。
- 代謝性骨疾患が骨吸収または骨形成の不均衡に起因する、請求項1の薬剤。
- 代謝性骨疾患がカルシウムまたはリン酸塩の代謝の不均衡に起因する、請求項1の薬剤。
- 代謝性骨疾患が個体におけるビタミンDの不均衡に起因する、請求項1の薬剤。
- 代謝性骨疾患が栄養性またはホルモン性に誘発される、請求項1の薬剤。
- 哺乳動物が閉経後の雌である、請求項1の薬剤。
- 哺乳動物が透析を受けている、請求項1の薬剤。
- 経口または非経口投与用の剤型である、請求項1の薬剤。
- モルフォゲンの溶解度を高めることができる分子と会合して個体に投与する、請求項1の薬剤。
- 前記分子がカゼイン、またはモルフォゲンのプロドメインの一部もしくは全部を含む、請求項11の薬剤。
- 前記プロドメインが、配列番号17の残基30〜292に記載のアミノ酸配列の一部もしくは全部を含む、請求項12の薬剤。
- モルフォゲンを骨組織に配達することができる標的分子と会合して個体に投与する、請求項1の薬剤。
- 前記標的分子が、テトラサイクリン、ジリン酸塩、または骨組織細胞の表面上の分子に特異的に結合する抗体を含む、請求項14の薬剤。
- ビタミンD3、カルシトニン、プロスタグランジン、副甲状腺ホルモン、デキサメタゾン、エストロゲン、またはインスリン様成長因子(IGF)を含む、請求項1の薬剤。
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