JPH09510103A

JPH09510103A - 線維芽細胞成長因子−１０

Info

Publication number: JPH09510103A
Application number: JP7523645A
Authority: JP
Inventors: ヒュ，ジン−シャン; ゴカイン，ジーニー・ディ
Original assignee: Human Genome Sciences Inc
Current assignee: Human Genome Sciences Inc
Priority date: 1994-03-08
Filing date: 1995-03-08
Publication date: 1997-10-14
Also published as: SK112996A3; MX9603897A; DE69531892T2; DE69531892D1; FI963475A0; CN1150804A; HUT77578A; EP0750628A1; ZA951886B; PL316202A1; ATE251637T1; ES2208676T3; CA2183961A1; EP1380594A1; NO963728D0; DK0750628T3; US5817485A; AU1986195A; JP2002335982A; WO1995024414A1

Abstract

(57)【要約】ヒトＦＧＦ−１０ポリペプチドおよびそのようなＦＧＦ−１０ポリペプチドをコードするＤＮＡ（ＲＮＡ）を開示する。組換え技術によるそのようなポリペプチドの製造方法も提供する。再血管新生を刺激するため、傷を治療し、神経損傷を防止するためにそのようなポリペプチドを用いる方法も開示する。そのようなポリペプチドに対するアンタゴニスト、および異常な細胞増殖、血管過多の病気、上皮水晶体細胞増殖を防止するための治療剤としてのそれらの使用も開示する。宿主からの試料中のＦＧＦ−１０をコードする配列における変異、およびＦＧＦ−１０タンパク質の濃度の変化を検出する診断方法も開示する。

Description

【発明の詳細な説明】線維芽細胞成長因子−１０本発明は、新しく同定されたポリヌクレオチド、そのようなポリヌクレオチドをコードするポリペプチド、そのようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの使用、並びにそのようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの製造に関する。詳しくは、本発明のポリペプチドは、線維芽細胞成長因子−１０／ヘパリン結合性成長因子−１０(以下ＦＧＦ１０と呼ぶ)である。本発明は、そのようなポリペプチドの作用を阻害することにも関する。線維芽細胞成長因子は、ヘパリンに結合するのが特徴のタンパク質のファミリーであり、それ故、ヘパリン結合成長因子(ＨＢＧＦ)とも呼ばれる。これらのタンパク質の異なったメンバーの発現が様々な組織で見出され、特別な時間的および空間的制御下にある。これらのタンパク質は、線維芽細胞、角膜および血管の内皮細胞、果粒球、副腎皮質細胞、軟骨細胞、筋芽細胞、血管平滑筋細胞、水晶体上皮細胞、メラニン形成細胞、ケラチノサイト、乏突起膠細胞、神経膠星状細胞、骨芽細胞、造血細胞を含む、中胚葉、外胚葉、内胚様起源の様々な細胞に対する強力な分裂促進物質である。各メンバーは他のメンバーとオーバーラップした機能を有し、独自の機能スペクトルをも有す。血管内皮細胞の増殖を刺激する能力の外、ＦＧＦ−１および２の両方は内皮細胞に対して走化性であり、ＦＧＦ−２は内皮細胞が基礎膜に貫入するのを可能にする。これらの性質と一致して、ＦＧＦ−１および２の両方は血管形成を刺激する能力を有する。これらの成長因子の他の重要な特徴は、傷の修復を促進する能力である。ＦＧＦファミリーの多くの他のメンバーは、血管形成の促進および傷の修復等の、ＦＧＦ−１および２と類似の活性を有する。ＦＧＦ遺伝子ファミリーのいくつかのメンバーは、中胚葉形成を誘導して、神経細胞、脂肪細胞、および滑核筋細胞の分化を調節することが示された。正常な組織におけるこれ等の生物学的活性の外に、ＦＧＦタンパク質は、腫瘍血管化を促進することにより、およびそれらの発現が脱制御される場合は形質転換タンパク質として、カルチノーマおよびサルコーマにおける腫瘍形成の促進に関係している。ＦＧＦファミリーは現在のところ８つの構造的に関連したポリペプチドよりなる。各々の遺伝子はクローン化され、配列決定されている。そのメンバーのうちの２つ、ＦＧＦ−１およびＦＧＦ−２は多くの名称の下にキャラクタライズされているが、それぞれ酸性および塩基性線維芽細胞成長因子と呼ばれることが最も多い。正常な遺伝子産物は多くの中胚葉および神経外胚葉由来細胞の一般的な増殖能力に影響を与える。それらはインビボで血管形成を誘導することができ、初期発達に重要な役割を果たすかもしれない(Ｂurgess，Ｗ.Ｈ.およびＭaciag，Ｔ .、Ａnnu．Ｒev．Ｂiochem.、５８:５７５−６０６(１９８９))。分泌型のＦＧＦ−１をコードする真核生物発現ベクターがブタの動脈に遺伝子導入により導入された。このモデルはインビボでの動脈壁における遺伝子機能をはっきりと決める。ＦＧＦ−１の発現は、遺伝子導入の２１日後にブタの動脈の内膜肥厚を誘導した(Ｎabel，Ｅ.Ｇ.等、Ｎature、３６２:８４４−６(１９９３ ))。塩基性線維芽細胞成長因子は腫瘍血管形成におけるその役割とは独立にグリオーム生長および進行を制御すること、および塩基性線維芽細胞成長因子の放出または分泌にはこれらの作用が必要かも知れないことが更に示された(Ｍorrison , Ｒ.Ｓ.等、Ｊ．Ｎeurosci．Ｒes．、３４:５０２−９(１９９３))。塩基性ＦＧＦ等の線維芽細胞成長因子はインビトロでカポシ肉腫細胞の成長に更に関与している（Ｈuang，Ｙ．Ｑ．等、Ｊ．Ｃlin．Ｉnvest.,９１：１１９１ −７（１９９３））。ヒトの塩基性線維芽細胞成長因子をコードするcＤＮＡ配列が、バクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼにより認識される転写プロモーターの下流にクローンされた。得られた塩基性線維芽細胞成長因子は、分裂促進活性、プラスミノーゲンアクチベーターの合成および血管形成アッセイにおいて、ヒト胎盤線維芽細胞成長因子と区別できない生物学的活性を有することが示された(Ｓquires，Ｃ.Ｈ．等、Ｊ．Ｂiol．Ｃhem．、２６３：１６２９７−３０２(１９８８))。米国特許第５,１５５,２１４号は、実質的に純粋な哺乳動物の塩基性線維芽細胞成長因子およびそれらの製造を開示する。ウシおよびヒトの塩基性線維芽細胞成長因子のアミノ酸配列、およびウシ種のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列が開示されている。本発明のポリペプチドは、他のＦＧＦファミリーのメンバーとのアミノ酸配列相同性の結果として、ＦＧＦファミリーのメンバーと推定的に同定された。本発明の一態様によれば、ＦＧＦ−１０である新規な成熟ポリペプチド、並びに生物学的に活性で、診断または治療に有用なそのフラグメント、アナログおよび誘導体が提供される。本発明の該ポリペプチドはヒト起源である。本発明の一態様によれば、mＲＡＮ、ＤＮＡ、cＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、並びにそれらのアンチセンスアナログおよび生物学的に活性で診断または治療に有用なそれらのフラグメントを含む、ヒトＦＧＦ−１０をコードする単離された核酸分子が提供される。本発明の他の態様によれば、ＦＧＦ−１０タンパク質の組換え生産における試剤として有用なクローニングおよび発現プラスミド等の組換えベクター、並びにヒトＦＧＦ−１０核酸配列を含む組換え原核および／または真核宿主細胞を使用して組換え技術によりそのようなポリペプチドを製造する方法が提供される。本発明の更なる態様によれば、治療目的、例えば負傷、熱傷および潰瘍の治癒を促進するために、そのようなポリペプチド、またはそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いる方法を提供し、神経の障害による神経損傷を防止し、皮膚の老化および脱毛を防止する。本発明の更なる態様によれば、そのようなポリペプチドに対する抗体が提供される。本発明の更なる態様によれば、そのようなポリペプチドに対するアンタゴニストが提供され、該アンタゴニストは、例えば腫瘍および血管過多の病気の治療において、そのようなポリペプチドの作用を阻害するのに使用し得る。本発明の他の態様によれば、ヒトＦＧＦ−１０配列に特異的にハイブリダイズする十分な長さの核酸分子を含む核酸プローブが提供される。本発明の他の態様によれば、ＦＧＦ−１０核酸配列における変異またはそのような配列によりコードされるポリペプチドの過発現に関連する病気または病気に対する感受性を検出するための診断アッセイが提供される。本発明の他の態様によれば、科学的研究、ＤＮＡの合成およびＤＮＡベクターの製造に関するインビトロ目的のためにそのようなポリペプチドまたはそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを使用する方法が提供される。本発明のこれらの他の態様は、本明細書から当業者に明らかであろう。次の図面は本発明の具体的態様の単なる説明として意図され、限定として意味するものではない。図１は、ＦＧＦ−１０のcＤＮＡ配列および対応する推定されるアミノ酸配列を示す。示したアミノ酸配列は該プロテインの成熟形を示す。アミノ酸についての標準的な１文字省略を用いている。配列決定の不正確さはポリヌクレオチド配列を決定することを試みる場合の一般的な問題である。配列決定は３７３自動ＤＮＡシークエンサー(Ａpplied Ｂiosystems.，Inc．)を用いて行った。配列決定の正確さは９７％以上の正確さであると予想される。図２は、ＦＧＦ−１０と他のＦＧＦファミリーのメンバーとのアミノ酸配列相同性を説明する。保存されたアミノ酸を太線で示す。図３は、ＦＧＦ−１０タンパク質のインビトロ転写／翻訳後のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。本発明の一態様によれば、図１の推定されたアミノ酸配列(配列番号２)を有する成熟ポリペプチド、または１９９４年３月４日にＡＴＣＣ寄託番号第７５６９６号として寄託されたクローンのcＤＮＡによりコードされた成熟ポリペプチドをコードする単離された核酸分子(ポリヌクレオチド)が提供される。本発明のポリヌクレオチドは、８週令の初期段階のヒト組織に由来するcＤＮＡライブラリーにおいて最初発見され、後に完全鎖長のcＤＮＡがヒトの扁桃に由来するライブラリーで発見された。それは線維芽細胞成長因子遺伝子ファミリーのすべてのメンバーと構造的に関係があり、１８１個のアミノ酸よりなるポリペプチドをコードする読み取り枠を含む。１)１２９個のアミノ酸にわたる脳から単離されたＦＧＦ−９に対する３７％の同一性と６７％の配列類似性; ２)１２１個のアミノ酸の領域でのＦＧＦ−７(ケラチノサイト生長因子)と３６％の同一性と６４％の類似性; ３)１１０個のアミノ酸にわたるＦＧＦ−１(酸性ＦＧＦ )との３３％の同一性と５５％の類似性が最高のマッチにある。さらにＦＧＨ／ＨＢＧＦファミリーの記号（signature）、ＧＸＬＸ(Ｓ,Ｔ,Ａ,Ｇ)Ｘ６(Ｄ、Ｅ) ＣＸＦＸＥは本発明のポリペプチドにおいて保存されている(Ｘはいずれかのアミノ酸を意味し、(Ｄ、Ｅ)はＤまたはＥ残基を意味し; Ｘ６はいずれかの６つのアミノ酸残基を意味する)。本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡの形、またはＤＮＡの形(該ＤＮＡはcＤＮＡ、ゲノムＤＮＡおよび合成ＤＮＡを含む)であり得る。該ＤＮＡは２本鎖または１本鎖であり得る。成熟ポリペプチドをコードするコード配列は、図１に示すコード配列(配列番号１)または寄託されたクローンの配列と同一であってもよく、または遺伝コードの重複または縮重の結果として異なったコード配列であってもよく、図１のＤＮＡ(配列番号１)または寄託されたcＤＮＡとして同じ、成熟したポリペプチドをコードする。図１の成熟ポリペプチド(配列番号２)、または寄託されたcＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、成熟ポリペプチドのコード配列のみ; 成熟ポリペプチドのコード配列およびリーダー若しくは分泌配列またはプロプロテイン配列等の付加的コード配列; 成熟ポリペプチドのコード配列(および場合により付加的コード配列)およびイントロンまたは成熟ポリペプチドのコード配列の非コード配列５'および／または３'等の非コード配列を含む。「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」の語は、ポリペプチドのコード配列のみを含むポリヌクレオチド、および付加的なコードおよび／または非コード配列を含むポリヌクレオチドを包含する。本発明は、図１の推定アミノ酸配列(配列番号２)を有するポリペプチド、または寄託されたクローンのcＤＮＡによりコードされるポリペプチドのフラグメント、アナログおよび誘導体をコードする、上に記載したポリヌクレオチドの変異体に更に関する。ポリヌクレオチドの変異体はポリヌクレオチドの天然に存在するアレル変異体またはポリヌクレオチドの非天然の変異体であり得る。従って本発明は、図１に示すのと同じ成熟ポリペプチド(配列番号２)または寄託されたクローンのcＤＮＡによりコードされた同じ成熟ポリペプチド、並びにそのようなポリヌクレオチドの変異体であって、該変異体は図１のポリペプチド (配列番号２)または寄託されたクローンのcＤＮＡによりコードされるポリペプチドのフラグメント、誘導体、またはアナログをコードするものを含む。そのようなヌクレオチド変異体は、削除変異体、置換変異体および付加または挿入変異体を含む。上に示したように、該ポリヌクレオチドは、図１に示すコード配列(配列番号１)または寄託されたクローンのコード配列の、天然に存在するアレル変異体であるコード配列を有してもよい。当業者に知られているように、アレル変異体は１以上のヌクレオチドの置換、削除または付加を有し、コードされたポリペプチドの機能を実質的に変更しない、別の形のポリヌクレオチド配列である。本発明は、成熟ポリペプチドのコード配列が同じ読み枠で、宿主細胞からのポリペプチドの発現および分泌を助けるポリヌクレオチド配列、例えば細胞からのポリペプチドの輸送を制御する分泌配列として機能するリーダー配列に融合していてもよいポリペプチドをも含む。リーダー配列を有するポリペプチドはプレプロテインであり、宿主細胞により解裂されてそのポリペプチドの成熟形を形成するリーダー配列を有してもよい。該ポリヌクレオチドは成熟タンパク質プラス付加的５'アミノ酸残基であるプロプロテインをコードしてもよい。プロ配列を有する成熟タンパク質はプロプロテインであり、そのタンパク質の不活性形である。プロ配列が一たび解裂すると活性な成熟タンパク質が残る。従って例えば本発明のポリヌクレオチドは、成熟タンパク質、プロ配列を有するタンパク質、またはプロ配列とプレ配列(リーダー配列)をコードし得る。本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドの精製を可能にするマーカー配列に枠内で融合したコード配列を有し得る。マーカー配列は、細菌宿主の場合、マーカーに融合した成熟ポリペプチドの精製に役立つpＱＥ−９ベクターにより提供されるヘキサヒスチジンのタグ(tag)であってもよく、哺乳動物宿主、例えばＣＯＳ−７細胞を用いる場合には、マーカー配列はヘマググルチニン( ＨＡ)タグであってもよい。ＨＡタグはインフルエンザヘマググルチニンタンパク質由来のエピトープに対応する(Ｗilson，Ｉ等、Ｃell、３７:７６７(１９８４))。本発明はさらに、その配列間に少なくとも５０％、好ましくは７０％の同一性があるなら、上述の配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドに更に関する。本発明は特に、上述のポリヌクレオチドにストリンジェント条件下にハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本明細書で「ストリンジェント条件」とは、配列間に少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９７％の同一性がある場合にのみハイブリダイゼーションが起こることを意味する。好ましい態様で上述のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドは、図１のcＤＮＡ(配列番号１)または寄託されたcＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプチドと実質的に同じ生物学的な機能または活性を保持するポリペプチドをコードする。本明細書で言及する寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するプタペスト条約の下に保持される。これらの寄託は単に便利のためにのみ行なわれるのであり、寄託が３５Ｕ.Ｓ.Ｃ．§１１２の下に必要とされるという自認ではない。寄託された物に含まれるポリヌクレオチドの配列、およびそれによってコードされるアミノ酸配列は本明細書の一部を構成し、本明細書の配列の記述と矛盾する場合に照らし合わせる。寄託した物を作り、使用しまたは販売するには実施権が必要で、そのような実施権はここでは許可しない。本発明は、図１の推定アミノ酸配列(配列番号２)または寄託されたcＤＮＡによりコードされたアミノ酸配列を有するＦＧＦ−１０ポリペプチド、並びにそのようなポリペプチドのフラグメント、アナログおよび誘導体に更に関する。図１のポリペプチド(配列番号２)または寄託されたcＤＮＡによりコードされるポリペプチドに言及する場合の「フラグメント」、「誘導体」および「アナログ」の語は、そのようなポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能または活性を保持するポリペプチドを言う。従ってアナログには、プロプロテイン部分の解裂により活性化されて活性な成熟ポリペプチドを産生するプロプロテインが含まれる。本発明のポリペプチドは、組換えポリペプチド、天然ポリペプチド、または合成ポリペプチドであってもよく、好ましくは組換えポリペプチドである。図１のポリペプチド(配列番号２)または寄託されたcＤＮＡによりコードされるポリペプチドのフラグメント、誘導体またはアナログは、(i)１以上のアミノ酸残基が保存または非保存アミノ酸残基(好ましくは保存されたアミノ酸残基)で置換されており、そのような置換されたアミノ酸残基は遺伝コードによりコードされたものであってもよく、コードされたものでなくてもよいもの、(ii)１以上のアミノ酸残基が置換基を含むもの、または(iii)成熟ポリペプチドが該ポリペプチドの半減期を増加させる化合物(例えば、ポリエチレングリコール)等の他の化合物と融合しているもの、または(iv)リーダー配列、分泌配列または成熟ポリペプチドまたはプロプロテインの精製に用いられる配列等の付加的アミノ酸が成熟ポリペプチドに融合しているものであり得る。そのようなフラグメント、誘導体およびアナログは本明細書の教示から当業者の範囲内にあると思われる。本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは単離された形で好ましくは提供され、好ましくは均一にまで精製される。「単離された」の語は、その物質がその元の環境(例えば、それが天然のものであれば天然の環境)から除去されていることを意味する。例えば、生きている動物に存在する天然のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されていないが、同じポリヌクレオチドもしくはＤＮＡまたはポリペプチドが、天然の系における共存物質のいくつかまたはすべてから分離されているなら、単離されている。そのようなポリヌクレオチドはベクターの部分となり得、および／またはそのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは組成物の部分となり得、そのようなベクターまたは組成物はその天然の環境の部分でないという点において、なお単離されている。本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、本発明のベクターで遺伝的に操作された宿主細胞、および組換え技術による本発明のポリペプチドの製造にも関する。例えば、クローニングベクターまたは発現ベクターであり得る本発明のベクターで宿主細胞は遺伝的に操作され得る(トランスデュースされ、トランスフォームされ、またはトランスフェクトされる)。ベクターは例えばプラスミド、ウイルス粒子、ファージ等であり得る。操作された宿主細胞は、プロモーターを活性化し、トランスフォーマントを選択し、またはＦＧＦ−１０遺伝子を増幅するのに適するように改変された従来の栄養培地で培養できる。温度、pＨ等の培養条件は、発現用に選択された宿主細胞について前に用いられたものであり、当業者に明らかであろう。本発明のポリヌクレオチドは組換え技術によりペプチドを製造するのに用い得る。したがって、例えばそのポリヌクレオチド配列を様々な発現ビークル、特にポリペプチド発現用ベクターまたはプラスミドのいずれかに含ませ得る。そのようなベクターは、染色体、非染色体および合成ＤＮＡ配列、例えばＳＶ４０の誘導体、細菌のプラスミド、ファージＤＮＡ、酵母プラスミド、プラスミドをファージＤＮＡと組合せたベクター、ワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病等のウイルスＤＮＡを含む。しかし、他のいずれのベクターまたはプラスミドもそれらが宿主中で複製可能で、成育可能である限り用い得る。適当なＤＮＡ配列を様々な方法によりベクター中に挿入し得る。一般にＤＮＡ配列は、適当な制限エンドヌクレアーゼ部位に当業界で知られた方法により挿入する。そのような方法等は当業者の範囲内にあると考えられる。発現ベクター中のＤＮＡ配列を、適当な発現制御配列(プロモーター)に作動可能に結合し、mＲＮＡ合成を行わせる。そのようなプロモーターの代表例として、ＬＴＲまたはＳＶ４０プロモーター、Ｅ．coliのlacまたはtrp、ファージラムダＰ_Lプロモーター、および原核または真核細胞もしくはそれらのウイルス中で遺伝子の発現を制御することが知られている他のプロモーターを挙げる。発現ベクターは翻訳開始のためのリボソーム結合部位および転写終了をも含む。ベクターは発現を増幅するための適当な配列をも含み得る。さらに、発現ベクターは、真核細胞培養の場合のジヒドロフォレートリダクターゼ、またはネオマイシン耐性、Ｅ．coliにおけるテトラサイクリンまたはアンピシリン耐性等のトランスフォームされた宿主細胞の選択のための表現型特性を提供する遺伝子を好ましくは含む。上記したような適当なＤＮＡ配列、および適当なプロモーターまたは制御配列を含むベクターを用いて適当な宿主をトランスフォームし、宿主にタンパク質を発現させる。適当な宿主の代表的な例として、Ｅ．coli、Ｓalmonella typhimur ium、Ｓtreptomycos等の細菌細胞、酵母等のfungal細胞、Ｄrosophila Ｓ２およびＳpodoptera Ｓf９等の昆虫細胞、ＣＨＯ、ＣＯＳまたはＢowes melanoma 等の動物細胞、アデノウイルス、植物細胞等を挙げ得る。適当な宿主の選択は本明細書の教示から当業者の範囲内にあると考えられる。特には、本発明は上に広く記載した配列の１以上を含んでなる組換え構築物をも含む。その構築物は、その中に本発明の配列を順または逆方向で挿入するベクターを含んでなる。この好ましい態様では、構築物は該配列に作動可能に結合した例えばプロモーターを含む制御配列を更に含む。多数の適当なベクターおよびプロモーターが当業者に知られており、商業的に入手できる。次のベクターを例として挙げる。細菌用: pＱＥ７０、pＱＥ６０、pＱＥ−９(Ｑiagen)、pＢＳ、ファージスクリプト、psiＸ１７４、pＢluescriptＳＫ、pＢsＫＳ、pＮＨ８a、p ＮＨ１６a、pＮＨ１８a、pＮＨ４６a(Ｓtratagene); pＴＲＬ９９Ａ、pＫＫ２２３−３、pＫＫ２３３−３、pＤＲ５４０、pＲＩＴＳ(Ｐharmacia)。真核生物用: pＷＬneo、pＳＶ２cat、pＯＧ４４、pＸＴ１、pＳＧ(Ｓtratagene)、pＳＶＫ３、pＢＰＶ、pＭＳＧ、pＳＶＬ(Ｐharmacia)。しかしながら、他のいずれのプラスミドまたはベクターも、それらが宿主中で複製可能で生存可能である限り用い得る。プロモーター領域は、ＣＡＴ(クロラムフェニコールトランスフェラーゼ)ベクターまたは選択マーカーを有する他のベクターを用いて所望の遺伝子から選択できる。２つの適当なベクターはpＫＫ２３２−８およびpＣＭ７である。個々の名前の付けられた細菌プロモーターは、lacＩ、lacＺ、Ｔ３、Ｔ７、gpt、ラムダＰ_R、Ｐ_Lおよびtrpを含む。真核プロモーターはＣＭＶ即時、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期および後期ＳＶ４０、レトロウイルスからのＬＴＲ、およびマウスメタロチオネイン−Ｉを含む。適当なベクターおよびプロモーターの選択は当業者のレベルの範囲に十分ある。更なる態様において、本発明は上記構築物を含む宿主細胞に関する。宿主細胞は、哺乳動物細胞などの高級真核細胞、酵母細胞等の低級真核細胞であり得、または宿主細胞は細菌細胞等の原核細胞であり得る。構築物の宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクションまたはエレクトロポレーションによって行うことができる(Ｄavi s, Ｌ.、Ｄibner，Ｍ.、Ｂatley，Ｌ.、Ｂasic Ｍethods in Ｍolecular Ｂ iology(１９８６))。宿主細胞中の構築物を通常の方法で用いて、組換え配列によりコードされる遺伝子産物を製造できる。あるいは、本発明のポリペプチドは通常のペプチド合成機によって合成的に製造することができる。成熟タンパク質は適当なプロモーターの制御下に哺乳動物細胞、酵母、細菌、または他の細胞中で発現させることができる。無細胞翻訳系を用いて、本発明のＤＮＡ構築物からのＲＮＡを用い、そのようなタンパク質を製造することもできる。原核および真核宿主で用いる適当なクローニングおよび発現ベクターはＳam brook等、Ｍolecular Ｃloning: ＡＬaboratory Ｍanual，第２編(Ｃold Ｓpring Ｈarbor、ニューヨーク、１９８９)により記載されている。その開示は本明細書の一部を構成する。高級真核生物による本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの転写は、エンハンサー配列をベクター中に挿入することにより増加する。エンハンサーはプロモーターに作用しその転写を増加させる、通常約１０〜３００bpのＤＮＡのシス作用性因子である。例としては複製起源の後期側にあるＳＶ４０エンハンサー(b p１００〜２７０)、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起源の後期側にあるポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーがある。一般に、組換え発現ベクターは複製起源、および宿主細胞のトランスフォーメーションを可能にする選択可能なマーカー、例えばＥ．coliのアンピシリン耐性遺伝子、Ｓ．cerevisiae ＴＲＰ１遺伝子、下流の構造遺伝子の転写を指示する高度に発現される遺伝子由来のプロモーターを含む。そのようなプロモーターは、３−ホスホグリセレートキナーゼ(ＰＧＫ)等の解糖系の酵素、α因子、酸性ホスホターゼ、熱ショックタンパク質をコードするオペロンから誘導できる。ヘテロロガスな構造配列が、翻訳開始および終了配列と共に適当な相へ組立てられる。場合によっては、ヘテロロガスな配列は、所望の特徴、例えば発現された組換え生成物の安定化または精製の簡易化を与えるＮ−末端の確認（identificati on）ペプチドを含む融合タンパク質をコードできる。細菌で使用する有用な発現ベクターは、所望のタンパク質をコードする構造ＤＮＡ配列を、適当な翻訳開始および終了シグナルと共に、機能的なプロモーターを有する作動可能なリーディング相に挿入することにより構築される。そのベクターは１以上の表現型選択可能なマーカーおよび複製起源を含んでなり、ベクターの維持および所望なら宿主内部での増幅を与える。トランスフォーメーション用の適当な原核宿主は、Ｅ．coli、Ｂacillus subtilis、Ｓalmonella typhimur ium、およびＰseudomonas属、Ｓtreptmyces属、およびＳtaphylococcus属の様々な種を含むが、他のものも選択の問題として用い得る。代表的な、しかし非限定的な例として、細菌に使用する有用なベクターは、よく知られたクローニングベクターpＢＲ３２２(ＡＴＣＣ３７０１７)の遺伝因子を含む商業的に入手可能なプラスミド由来の、選択可能なマーカーおよび細菌の複製起源を含むことができる。そのような商業的なベクターは、例えばpＫＫ２２３−３(Ｐharmacia Ｆine Ｃhemicals、Ｕppsala、スエーデン)およびＧＥＭ１(Ｐromega Ｂiotec、Ｍadison、ウィスコンシン、米国)を含む、これらのp ＢＲ３２２「骨核」部分を適当なプロモーターおよび発現されるべき構造配列と結合させる。適当な宿主株のトランスフオーメーション、および宿主株の適当な細胞密度までの増殖の後、選択したプロモーターを適当な手段(例えば温度シフトまたは化学誘導)により脱抑制し、細胞をさらなる期間培養する。細胞は典型的には遠心分離によって収穫し、物理的または化学的手段により破壊し、得られた粗抽出物を更なる精製のために保持する。タンパク質の発現に用いる微生物細胞は、凍結−解凍サイクル、ソニケーション、機械的破壊または細胞溶解剤の使用を含む、従来のいずれの方法によっても破壊できる。様々な哺乳動物細胞培養系を用いて、組換えタンパク質を発現させることもできる。哺乳動物発現系の例は、Ｇluzman、Ｃell、２３：１７５(１９８１)により記載されたサルの腎臓線維芽細胞のＣＯＳ−７系、および適合性のベクターを発現できる他の細胞系、例えばＣ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨelaおよびＢＨＫ細胞系を含む。哺乳動物発現ベクターは、複製起源、適当なプロモーターおよびエンハンサーを含み、必要ないずれかのリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナーおよびアクセプター部位、転写終了配列、５'に隣接する非転写配列も含むであろう。ＳＶ４０ウイルスゲノムに由来するＤＮＡ配列、例えばＳＶ４０複製起源、初期プロモーター、エンハンサー、スプライス、およびポリアデニル化部位を用いて必要な非転写遺伝因子を提供し得る。ＦＧＦ−１０は、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈澱、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水的相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィーを含む、今日までに用いられる方法により、組換え細胞培養物から回収し、精製し得る。天然のタンパク質の立体配置を完成させるために必要に応じてタンパク質の再生工程も用い得る。最後に高速液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)を最終的な精製工程のために用い得る。本発明のポリペプチドは、天然の精製された産物、もしくは化合的合成法の産物であるか、または原核もしくは真核宿主(例えば培養物中の細菌、酵母、高等植物、昆虫および哺乳動物細胞)からの組換え技術により製造し得る。組換え製造方法に用いる宿主により、本発明のポリペプチドは、哺乳動物または他の真核の炭水化物でグリコシル化され得、またはグルコシル化され得ない。本発明のポリペプチドは最初のメチオニンアミノ酸残基を含み得る。血管内皮細胞成長を刺激する能力の結果として、本発明のポリペプチドは、血栓症、動脈硬化および他の心臓血管状態等の様々な病気状態による虚血性組織の再血管化を刺激するための治療に用い得る。ＦＧＦ−１０は外傷、熱傷、手術後組織修復、潰瘍による傷を処置するのに用い得る。なぜならそれは線維芽細胞および骨格筋細胞等の様々な種類の細胞に対する分裂促進剤である能力を有するからである。ＦＧＦ−１０は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ＡＩＤＳ関連コンムプレックス等のある神経の障害または神経変性状態において生じる神経損傷を処置しおよび抑制するのに用いる得る。ＦＧＦ−１０は軟骨細胞生長を刺激する能力を有し、それ故、骨および歯根膜再生を高め、組織移植および骨移植を助けるのに用い得る。ＦＧＦ−１０はケラチノサイト生長を刺激することにより、日焼けによる皮膚老化を防止するのに用い得る。ＦＧＦ−１０は脱毛を防止するのにも用い得る。何故ならＦＧＦ−１０は毛形成細胞を活性化し、メラノサイト生長を促進するからである。同じ系列で、ＦＧＦ−１０は、他のサイトカインと組合せて用いた場合、造血細胞および骨髄細胞の生長と分化を刺激する。ＦＧＦ−１０は移植前の器官を保持するのに、または一次組織の細胞培養を支持するのにも用い得る。本発明の更なる態様によれば、科学的な研究、ＤＮＡの合成、ＤＮＡベクターの調製に関するインビトロ目的のために、およびヒトの病気の処置のための診断薬および治療薬を提供するために、そのようなポリペプチドまたはそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いる方法を提供する。完全鎖長のＦＧＦ−１０遺伝子のフラグメントは、完全鎖長のＦＧＦ−１０遺伝子を単離するための、およびＦＧＦ−１０遺伝子に大きい配列類似性または同様の生物学的活性を有する他の遺伝子を単離するための、cＤＮＡライブラリーについてのハイブリダイゼーションプローブとして用い得る。この種のプローブは一般に少なくとも２０塩基を有する。しかしながら、好ましくはプローブは少なくとも３０塩基を有し、一般には５０塩基を超えないが、より多い塩基を有してもよい。完全鎖長転写に対応するcＤＮＡクローン、および制御およびプロモーター領域、エキソンおよびイントロンを含む完全なＦＧＦ−１０遺伝子を含むゲノムクローンを同定するのにも該プローブは用い得る。スクリーニングの例は、その知られたＤＮＡ配列を用いてオリゴヌクレオチドプローブを合成することにより、ＦＧＦ−１０遺伝子のコード領域を単離することを含む。本発明の遺伝子の配列に相補的な配列を有するラベルされたオリゴヌクレオチドは、ヒトcＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはmＲＮＡのライブラリーをスクリーニングし、ライブラリーのどのメンバーにプローブがハイブリダイズするか決定するのに用いられる。本発明はＦＧＦ−１０ポリペプチドの受容体を同定する方法を提供する。受容体をコードする遺伝子を、当業者に知られた多くの方法、例えばリガンドパンニングおよびＦＡＣＳソーティング(Ｃoligan等、Ｃurrent Ｐrotocols in Ｉm mun.、１(２)、第５章(１９９１))により同定できる。好ましくは、ポリアデニル化ＲＮＡを該ポリペプチドに応答する細胞から作り、このＲＮＡから作ったc ＤＮＡライブラリーをプールに分割し、ＣＯＳ細胞または該ポリペプチドに応答しない他の細胞をトランスフェクトするのに用いる。ガラススライド上で生長したトランスフェクトされた細胞を、ラベルしたポリペプチドにさらす。そのポリペプチドは部位特異的なプロテインキナーゼの認識部位のヨード化または包接を含む種々の手段によりラベルすることができる。固定化とインキュベーションの後に、スライドをオートラジオグラフ分析に付す。ポジティブのプールを同定し、サブプールを調製し、反復サブプーリング（iterative sub-pooling）および再スクリーニング方法を用いて再びトランスフェクトし、推定のレセプターをコードする単一のクローンをついには得る。レセプター同定のための別のアプローチとして、ラベルしたポリペプチドを、レセプター分子を発現する細胞膜または抽出調製物とフォトアフィニティ(photo affinity)に結合させ得る。架橋した物質をＰＡＧＥ分析により分け、Ｘ線フイルムにさらす。そのポリペプチドの受容体を含むラベルしたコンプレックスを切除し、ペプチドフラグメントに分け、タンパク質のミクロ配列決定に付すことができる。ミクロ配列決定から得られるアミノ酸配列を用いて一組の縮重オリゴヌクレオチドプローブをデザインし、cＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、推定の受容体をコードする遺伝子を同定する。本発明はＦＧＦ−１０の作用を調節する化合物を同定するための化合物をスクリーニングする方法を提供する。そのようなアッセイの例は、哺乳動物線維芽細胞、ＦＧＦ−１０、スクリーニングすべき化合物および³[Ｈ]チミジンを、線維芽細胞が通常増殖する細胞培養条件下に一緒にすることを含んでなる。コントロールアッセイをスクリーニングすべき化合物の不存在下に行い、化合物存在下での線維芽細胞増殖量と比較して、各場合における³[Ｈ]チミジン取り込みを測定することにより該化合物がケラチノサイトの増殖を刺激するかどうかを決定する。アンタゴニストをスクリーニングするために同じアッセイを用いることができ、該化合物の線維芽細胞増殖を阻げる能力を測定し、アンタゴニスト能の測定を行う。線維芽細胞増殖量を³[Ｈ]チミジンの取り込みを測定する液体シンチレーションクロマトグラフィーにより測定する。他の方法では、ＦＧＦ−１０受容体を発現する哺乳動物細胞または膜調製物を該化合物の存在下にラベルしたＦＧＦ−１０と共にインキュベートする。この相互作用を高めまたはブロックする化合物の能力を次に測定し得るであろう。あるいは、ＦＧＦ−１０および受容体の相互作用を追跡する公知の第２のメッセンジャーシステムの応答を測定し、化合物の存在下または不存在下に比較する。そのような第２のメッセンジャーシステムはcＡＭＰグアニレートサイクラーゼ、イオンチャンネルまたはホスホイノシチド加水分解を含むが、これらに限定されない。可能性のあるＦＧＦ−１０アンタゴニストの例には、抗体またはある場合には該ポリペプチドに結合するオリゴヌクレオチドを含む。あるいは、可能性のあるＦＧＦ−１０アンタゴニストはＦＧＦ−１０受容体に結合するＦＧＦ−１０の変異体形であり得るが、第２メッセンジャー応答は引き出されず、ＦＧＦ−１０の作用は効果的に阻害されない。他の可能性のあるＦＧＦ−１０アンタゴニストはアンチセンス技術を用いて調製したアンチセンス構築物である。アンチセンス技術を用いて、３重ヘリックス形成またはアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡにより遺伝子発現を制御できる。その両方の方法は、ポリヌクレオチドのＤＮＡまたはＲＮＡへの結合に基づいている。例えば、本発明の成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の５ 'コード部分を用いて、長さで約１０〜４０塩基対のアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドをデザインする。ＤＮＡオリゴヌクレオチドを転写に関与する遺伝子の領域に相補的であるようデザインし(３重ヘリックス、Ｌee等、Ｎucl．Ａci ds Ｒes.、６:３０７３(１９７９); Ｃooney等、Ｓcience、２４１: ４５６(１９８８); およびＤervan等、Ｓcience、２５１:１３６０(１９９１)参照)、それによりＦＧＦ−１０の転写および生産を阻害する。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドはインビボでmＲＮＡにハイブリダイズし、mＲＮＡ分子のＦＧＦ−１０ポリペプチドへの翻訳をブロックする(アンチセンス−Ｏkano、Ｊ．Ｎeuroche m．、５６:５６０(１９９１); Ｏlgodeoxynucleotides as Ａntisense Ｉnhibit ors of Ｇene Ｅxpression、ＣＲＣＰress，Ｂoca Ｒaton、フロリダ(１９８８ ))。上記のオリゴヌクレオチドを細胞に運搬し、アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡがインビボで発現し、ＦＧＦ−１０の生産を阻害することもできる。可能なＦＧＦ−１０アンタゴニストは、ＦＧＦ−１０受容体の結合部位に結合し、占有し、それによって受容体をＦＧＦ−１０に接近不可能にし、その結果、正常な生物学的活性が阻害される、小分子を含む。小分子の例は小さいペプチドまたはペプチド様分子を含むが、これに限定されない。ＦＧＦ−１０アンタゴニストは、ＦＧＦ−１０の腫瘍細胞および組織に及ぼす細胞の生長および増殖効果を阻害し、それ故、異常な細胞生長および増殖、例えば腫瘍生長を抑制し、阻害するのに用い得る。ＦＧＦ−１０アンタゴニストは血管過多の病気を防止し、間接のう外白内障手術後の上皮水晶体細胞の増殖を防止するのにも用い得る。アンタゴニストは薬学的に許容し得る担体(例えば下記のような)と共に組成物で用い得る。本発明のポリペプチド、アゴニスト、アンタゴニストを適当な薬学的担体と組合せて用い、薬学的組成物を作り得る。そのような組成物は治療的に有効量のポリペプチド、アゴニスト、アンタゴニストおよび薬学的に許容し得る担体または賦形剤を含む。そのような担体は、食塩水、緩衝化された食塩水、デキストローズ、水、グリセロール、エタノールおよびそれらの組合せを含むが、それらに限定されない。その調合物は投与様式に適合させるべきである。本発明は本発明の薬学的組成物の１以上の成分を充填した１以上の容器を含む薬学的なパックまたはキットをも提供する。そのような容器には、薬学的または生物学的製品の製造、使用、販売を規制する政府当局により定められた形の通知を付してもよく、その通知はヒトへの投与のための製造、使用または販売の、該当局による承認を表わす。更に本発明のポリペプチド、アゴニストおよびアンタゴニストは他の治療用化合物と組合せて用いてもよい。その薬学的組成物は、経口、局所、静脈、腹腔内、筋肉内、皮下、鼻腔、皮内経路等により便利な方法で投与し得る。薬学的組成物は具体的な適応症の治療および／または予防に有効な量投与される。一般にそれらは少くとも約１０μg／k g体重投与され、たいていの場合１日当り約８mg／kg体重を超えない量投与される。たいていの場合、投与ルートおよび症状を考慮して、用量は毎日約１０μg ／kg〜約１mg／kgである。局所的投与の特殊な場合には用量は好ましくは約０. １μg〜９mg／cm²投与される。ポリペプチドであるＦＧＦ−１０ポリペプチド、アゴニストおよびアンタゴニストは、しばしば「遺伝子治療」と呼ばれるインビボでのそのようなポリペプチドの発現により本発明に従い用い得る。したがって例えば細胞を、エクスビボでそのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド(ＤＮＡまたはＲＮＡ)で処理して、処理された細胞を患者に与えて、そのポリペプチドで治療する。そのような方法は当業界でよく知られている。例えば本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含むレトロウイルス粒子を用いて当業界で知られた方法により細胞を処理する。同様に、例えば当業界で知られた方法により、インビボでのポリペプチドの発現のため細胞をインビボで処理し得る。当業界で知られているように、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含むレトロウイルス粒子を製造するための生産細胞を、インビボで細胞を処理し、インビボでポリペプチドを発現させるため患者に投与する。そのような方法により本発明のポリペプチドを投与するこれらのおよび他の方法は本発明の教示から当業者に明らかであるはずである。例えば細胞を処理するための発現ビークルはレトロウイルス粒子以外のもの、例えばアデノウイルスであってもよく、アデノウイルスは適当な運搬ビークルと組合せた後インビボで細胞を処理するために用い得る。本発明は、ＦＧＦ−１０核酸配列における変異の存在に関連する病気また病気に対する感受性を検出する診断法の一部として、ＦＧＦ−１０遺伝子を用いることにも関する。ＦＧＦ−１０遺伝子における変異を有する個体を様々な技術によりＤＮＡレベで検出する。診断用の核酸は血液、尿、唾液、組織生検、剖検材料などの患者の細胞から得られ得る。ゲノムＤＮＡを検出のため直接用いることができ、または分析前にＰＣＲ(Ｓakai等、Ｎature、３２４:１６３−１６６(１９８６))を用いることにより酵素的に増幅してもよい。ＲＮＡまたはcＤＮＡも同じ目的で使用し得る。一例としてＦＧＦ−１０をコードする核酸に相補的なＰＣＲプライマーを用いて、ＦＧＦ−１０変異体を同定し分析できる。例えば削除または挿入は正常な遺伝子型と比較して増幅産物の大きの変化により検出できる。点変異は増幅したＤＮＡを放射ラベルしたＦＧＦ−１０ＲＮＡ、または放射ラベルしたＦＧＦ−１０アンチセンスＤＮＡ配列にハイブリダイズすることにより同定できる。完全にマッチした配列は、ミスマッチした二重鎖と、ＲＮaseＡ消化により、または融点の相違により区別できる。ＤＮＡ配列の相違に基づく遺伝的試験は、変性剤を用いる、または用いない、ゲル中のＤＮＡフラグメントの電気泳動モビリティの変化の検出により行い得る。小さい配列削除および挿入は高分解ゲル電気泳動により視覚化できる。異った配列のＤＮＡ断片は、そのモビリティが融点または部分融点に従って異った位置でゲル中で減ずる変性ホルムアミドグラジエントゲルで区別し得る(例えばＭyer s等、Ｓcience、２３０:１２４２(１９８５))。特殊な位置での配列変化も、ＲＮaseおよびＳl保護または化学的解裂法等のヌクレアーゼ保護アッセイにより明らかになり得る(例えばＣotton等、ＰＮＡＳ，ＵＳＡ、８５:４３９７〜４４０１(１９８５))。したがって特殊なＤＮＡ配列の検出は、ハイブリダイゼーション、ＲＮase保護、化学的解裂、直接的なＤＮＡ配列決定、または制限酵素の使用(例えば制限断片長多型性(ＲＦＬＰ))、およびゲノムＤＮＡのサザーンブロッテイング等の方法により行い得る。よりありふれたゲル電気泳動およびＤＮＡ配列決定の外に、突然変異はin si tn分析によっても検出し得る。本発明は様々な組織中のＦＧＦ−１０タンパク質のレベルの変化を検出する診断アッセイにも関する。何故なら正常なコントロール組織試料を比べた該タンパク質の過剰発現は、例えば腫瘍等の病気、または病気に対する感受性の存在を検出し得るからである。宿主に由来する試料中のＦＧＦ−１０タンパク質のレベルを検出するのに用いるアッセイは、当業者に周知であり、ラジオイムノアッセイ、競合結合アッセイ、ウエスタンブロット分析、ＥＬＩＳＡアッセイ、および「サンドイッチ」アッセイを含むＥＬＩＳＡアッセイ(Ｃoligan等、Ｃurrent Ｐro tocols in lmmunology、１(２)、第６章(１９９１))はＦＧＦ−１０抗原に特異的な抗体、好ましくはモノクローナル抗体を最初に調製することを含む。更にリポーター抗体をモノクローナル抗体に対して作る。リポーター抗体に放射活性、蛍光またはこの例では西洋ワサビパーオキシダーゼ酵素等の検出可能な試薬を結合させる。試料を宿主から取り出し、試料中のタンパク質を結合する固体担体、例えばポリスチレン皿上でインキュベートする。皿上のフリーなタンパク質結合部位を、ウシ血清アルブミンの様な非特異的なタンパク質を用いてインキュベートすることにより次に被覆する。次にモノクローナル抗体を皿中でインキュベートし、その間にモノクローナル抗体はポリスチレン皿に付着したＦＧＦ−１０タンパク質に付着する。すべての非結合モノクローナル抗体を緩衝液で洗浄除去する。西洋ワサビパーオキシダーゼに結合したリポーター抗体を皿中に置き、ＦＧＦ−１０に結合したモノクローナル抗体にリポーター抗体を結合させる。次に非付着リポーター抗体を洗浄除去する。パーオキシダーゼの基質を次に皿に加え、ある時間に発色した色の量は、標準曲線と比較した場合、一定量の患者の試料中に存在するＦＧＦ−１０タンパク質の尺度である。競合アッセイを用いてもよい。その方法ではＦＧＦ−１０に特異的な抗体を固体担体に付着させ、ラベルしたＦＧＦ−１０および宿主由来の試料を固体担体に通し、例えば液体シンチレーションクロマトグラフィーにより検出したラベルの量を試料中のＦＧＦ−１０量に関連づける。「サンドイッチ」アッセイはＥＬＩＳＡアッセイに類似している。「サンドイッチ」アッセイでは、ＦＧＦ−１０を固体担体に通し、固体担体に付着した抗体に結合させる。第２抗体を次にＦＧＦ−１０に結合させる。ラベルされており、第２抗体に特異的な第３抗体を固体担体に通し、第２抗体に結合させ、量を定量する。本発明の配列は染色体同定にも価値がある。その配列を個々のヒト染色体上のある位置に対して特異的に目標に定めて、ハイブリダイズさせる。さらに染色体上の特定の部位を同定する現在の必要がある。現在染色体位置をマークするのに利用できる、実際の配列データ(リピートポリモルフィズム)に基いた染色体マーキング試料はわずかしかない。本発明による染色体へのＤＮＡのマッピングは、これらの配列を病気と関連する遺伝子と関係づける重要な第一歩である。簡単に言うと、cＤＮＡからのＰＣＲプライマー(好ましくは１５−２５bp)を調製することにより、配列を染色体にマップする。３'非翻訳領域のコンピューター分析を用いて、ゲノムＤＮＡの１以上のエクソンをスパン(spun)しないプライマーを急速に選択し、増幅方法を複雑（complicate）にする。これらのプライマーを、個々のヒトの染色体を含む体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングに次に用いる。プライマーに対応するヒト遺伝子を含むこれらのハイブリッドのみが増幅されたフラグメントを生じるであろう。体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピングは特定のＤＮＡを特定の染色体に帰属させる速い方法である。同じオリゴヌクレオチドプライマーを用いる本発明を用いて、具体的な染色体または大きいゲノムクローンのプールからのフラグメントのパネルを用いて類似の方法でサブローカリゼーションを行うことができる。染色体へマッピングするのに同様に用いることができる他のマッピング戦略は、in situハイブリダイゼーション、ラベルしたフローソートした染色体を用いるプレスクリーニング、および染色体特異的cＤＮＡライブラリーを構築するためのハイブリダイゼーションによるプレセレクションを含む。中期染色体スプレッドへのcＤＮＡクローンの蛍光インサイテュハイブリダイゼーション(ＦＩＳＨ)を用いて正確な染色体位置を一工程で提供できる。この技術は５００〜６００塩基という短いcＤＮＡで用いることができるが、２０００b pより大きいクローンは、簡単な検出のための十分なシグナル強度で、ユニークな染色体位置へのより大きい結合可能性を有する。ＦＩＳＨは、発現配列タグ( 本発明の遺伝子のフラグメント)が由来するクローンの使用を要し、長ければ長いほどよい。例えば２０００bpは良好であり、４０００はより良好であり、４０００以上は良好な結果を得るのに多分必要ない。この技術をレビューするには、Ｖerma等、Ｈuman Ｃhromosomes:a Ｍanual of Ｂasic Ｔechniqnes，Ｐer gamon Ｐress、ニューヨーク(１９８８)を参照する。一度ある配列が正確な染色体位置にマップされると、その染色体上のその配列の物理的な位置を遺伝マップデータと関連づけることができる。そのようなデータは例えばＶ．ＭcＫusick、Ｍendelian Ｉnheritance in Ｍan(ジョンホプキンス大学のウエルチメディカルライブラリーを介してオンラインで利用できる )中に見出される。同じ染色体領域にマップされた遺伝子と病気との間の関係を次に結合分析(物理的に隣接した遺伝子の共遺伝(coinheritance))により確認される。次に、病気に冒された個体と冒されない個体との間のcＤＮＡまたはゲノム配列の相違を決定することが必要である。もしある変異が病気に冒された個体のいくつかまたはすべてに認められるが、いずれの正常な個体にも認められなかったなら、その変異はその病気の原因となるものであるようである。物理的マッピングと遺伝的マッピングの現在の分析により、病気と関連づけられた染色体領域に正確に位置づけられたcＤＮＡは５０〜５００の可能な原因となる遺伝子の一つである。(これは１メガベースのマッピングレゾリューションと２０kb当り１遺伝子を仮定する)。ポリペプチド、それらのフラグメント若しくは他の誘導体、またはそれらのアナグロ、またはそれらを発現する細胞は、それらに対する抗体を製造するための免疫源として用い得る。これらの抗体は例えばポリクローナルまたはモノクローナル抗体であり得る。本発明は、キメラ、単鎖、およびヒト化抗体並びにＦabフラグメントまたはＦab発現ライブラリーの生成物をも含む。当業界で知られた様々の方法をそのような抗体およびフラグメントの製造に用い得る。本発明の配列に対応するポリペプチドに対して生成した抗体は、ポリペプチドを動物に直接注入することにより、またはそのポリペプチドを動物に、好ましくは人でない動物に、投与することにより得ることができる。かく得られた抗体はそのポリペプチド自体に結合するであろう。この方法では、ポリペプチドのフラグメントのみをコードする配列さえも、全体の本来のポリペプチドを結合する抗体を作り出すのに用いることができる。そのような抗体を用いて次にそのポリペプチドを発現する組織からそのポリペプチドを単離できる。モノクローナル抗体を調製するために、連続的な細胞系培養により産生される抗体を生じるどのような技術も使用できる。例としては、ハイブリドーマ技術( ＫohlerおよびＭilstein、１９７５、Ｎature、２５６:４９５−４９７)、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術(Ｋozbor等、１９８３、Ｉmmunolog y Ｔoday ４:７２)、およびヒトモノクローナル抗体を作るＥＢＶ−ハイブリドーマ技術(Ｃole等、１９８５、Ｍonoclonal Ａntibodies and Ｃancer Ｔhe rapy中、Ａlan Ｒ．Ｌiss,Ｉnc．、７７−９６頁)がある。単鎖抗体の製造について記載された技術(米国特許第４,９４６,７７８号)は、本発明の免疫原性ポリペプチド生産物に対する単鎖抗体を製造するのに適応させることができる。遺伝子導入マウスを用いて、本発明の免疫原性ポリペプチド生産物に対するヒト化抗体を発現させ得る。本発明を次の実施例によって更に記載するが、本発明はそのような実施例に限定されないことを理解すべきである。ことわらない限りすべての部または量は重量による。次の実施例の理解を促進するために、いくつかのしばしば用いる方法および／または用語を記載する。「プラスミド」は先行するpおよび／またはそれに続く大文字および／または数字により示す。出発プラスミドは商業的に入手可能で限定されずに公的に入手できるか、公開された方法に従い入手可能なプラスミドから構築できる。さらに記載されたものに同等のプラスミドは当業界で知られ、当業者に明らかであろう。ＤＮＡの「消化」とは、ＤＮＡのある配列のみに作用する制限酵素でＤＮＡを触媒的に解裂することをいう。本明細書で用いる様々な制限酵素は商業的に入手でき、その反応条件、コファクターおよび他の必要条件は当業者に知られているように用いられた。分析目的のために、典型的には１μgのプラスミドまたはＤＮＡフラグメントを約２０μlの緩衝溶液中で約２単位の酵素と共に用いる。プラスミド構築のためのＤＮＡフラグメントを単離する目的のために、典型的には５〜５０μgのＤＮＡをより大きい体積中で２０〜２５０単位の酵素で消化する。個々の制限酵素のための適当な緩衝剤および基質量は製造者により指定されている。３７℃における約１時間のインキュベーション時間を通常用いるが、供給者の指示に従い変更してよい。消化後、反応物をポリアクリルアミドゲルで直接電気泳動して所望のフラグメントを単離する。解裂したフラグメントの大きさによる分離は、Ｇoeddel,Ｄ等、Ｎucleic Ａc id Ｒes．、８:４０５７(１９８０)により記載された８％ポリアクリルアミドゲルを用いて行う。「オリゴヌクレオチド」とは、化学的に合成し得る、一本鎖ポリデオキシヌクレオチド、または２つの相補性ポリヌクレオチド鎖をいう。そのような合成オリゴヌクレオチドは５'リン酸を有さず、従ってキナーゼの存在下にＡＴＰによりリン酸を付加せずに他のオリゴヌクレオチドにライゲートしないであろう。合成オリゴヌクレオチドは脱リン酸化されていないフラグメントにライゲートするであろう。「ライゲーション」とは、２つの２本鎖核酸フラグメント間にホスホジエステル結合を形成する工程をいう(Ｍaniatis,Ｔ．等、同書、１４６ページ)。特にことわらない限り、ライゲーションは、ライゲートすべきＤＮＡの約当量の０.５μg 当り１０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ(「リガーゼ」)と共に公知の緩衝液および条件を用いて行い得る。ことわらない限り、トランスフォーメーションは、Ｇraham,ＦおよびＶan de r Ｅb,Ａ、Ｖirology、５２:４５６−４５７(１９７３)の方法に記載された如く行った。実施例１ヒトの大人の組織におけるＦＧＦ−１０mＲＮＡの組成分布ＦＧＦ−１０mＲＮＡの発現を分析するために、プローブとして放射ラベルした完全なＦＧＦ−１０cＤＮＡを用いて、いくつかのヒトの成人組織からのポリＡ⁺mＲＮＡ２μgでノーザーン分析を行った。その結果は、１.４kbメッセージが骨格筋で最も豊富に発現され、中間レベルで心臓、脳、胎盤、腎臓および膵臓中で、低レベルで肝臓中で発現されることを示す。心臓では、４.４kb、２.４kbおよび０.５kbの大きさの３つの他のフラグメントも存在する。心臓中のこの異なる大きさのmＲＮＡは別のスプライシングから生じるらしい。脳では４.４kbのm ＲＮＡも存在する。膜に結合したいくつかのヒト成人組織からのポリＡ⁺mＲＮＡ２μｇを有するナイロンブロットは、Ｃlontech Ｌaboratories，Ｉnc．Ｐalo Ａlto、カリホルニアから得た。そのブロットをランダムプライムラベリングにより放射活性dＣＴＰでラベルした完全なＦＧＦ−１０cＤＮＡとハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションは７％ＳＤＳ、０.５ＭＮaＰＯ₄、pＨ７.２、１％ＢＳＡ中で、６５℃で一晩行った。０.２×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ中で６５ ℃で２×３０分洗滌の後、そのブロットを、スクリーンを強化してＸ線フイルムに一晩さらした。実施例２インビトロ転写および翻訳によるＦＧＦ−１０の発現ＦＧＦ−１０ cＤＮＡ(ＡＴＣＣ＃７５６９６)をインビトロで転写し、翻訳して、完全鎖長の、および部分的なＦＧＦ−１０cＤＮＡによりコードされた翻訳可能なポリプペチドの大きさを決定した。pＢluescript ＳＫベクター中のＦＧＦ−１０の完全鎖長および部分的cＤＮＡ挿入物を３対のプライマー、１)Ｍ１３ −逆および順プライマー;２)Ｍ１３−逆プライマーおよびＦＧＦプライマーＰ２０;３)Ｍ１３−逆プライマーおよびＦＧＦプライマーＰ２２を用いるＰＣＲにより増幅した。これらのプライマーの配列は以下の通りである。Ｍ１３−２逆プライマー: この配列はpＢluescriptベクター中のＦＧＦ−１０ cＤＮＡ挿入物の５'末端の上流に配置され、そのcＤＮＡに関してアンチセンス配位である。Ｔ３プロモーター配列をこのプライマーとＦＧＦ−１０cＤＮＡの間に配置するＭ１３−２順プライマー: この配列はpＢluescriptベクター中のＦＧＦ−１０ cＤＮＡの３'末端の下流に配置され、そのcＤＮＡ挿入物に関してアンチセンス配位である。ＦＧＦプライマーＰ２０: ３'プライム上のこのプライマーの１５bp配列は、終止コドンから１２bp下流にある、ＦＧＦ−１０c ＤＮＡ配列bp７８０−７６６にアンチセンスである。ＦＧＦプライマーＰ２２: この配列はアンチセンス配位でＦＧＦ−１０ cＤＮＡの内部に配置され、停止コドンから約２１３bp下流にある。３対のプライマーすべてについてのＰＣＲ反応は、cＤＮＡ挿入物の前部でＴ３プロモーター配列による増幅された生成物を産生する。３対のプライマーのすべては完全鎖長ＦＧＦ−１０ポリペプチドをコードするＰＣＲ産物を産生する。第１のプライマー対からの約１μgのＰＣＲ産物、第２のプライマー対からの０.３μg、第３のプライマー対からの０.３μgをインビトロ転写／翻訳に用いた。インビトロ転写／翻訳反応を、Ｔ_NＴ^TM Ｃoupled Ｒeticulocyte Ｌysate Ｓ ystems (Ｐromega、ＣＡＴ＃Ｌ４９５０)を用いて、２５μl体積中で行った。具体的には、その反応は、１２.５μlのＴ_NＴラビット網状赤血球溶解産物、２ μlのＴ_NＴ反応緩衝液、１μlのＴ３ポリメラーゼ、１μlの１mＭアミノ酸混合物(メチオニンを除く)、４μlの³⁵Ｓ−メチオニン(＞１０００Ｃi／mmol、１０m Ｃi／ml)、１μlの４０Ｕ／μl,ＲＮasinリボヌクレアーゼ阻害剤、０.５または１μgのＰＣＲ産物を含む。ヌクレアーゼを含まないＨ₂Ｏを加えて２５μlの体積にした。その反応を３０℃で２時間インキュベートした。反応生成物の５μl を４−２０％グラジエントＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分析した。２５％イソプロパノールおよび１０％酢酸中で固定した後、そのゲルを乾燥し、Ｘ線フイルムに一晩７０℃でさらした。図３に示すように完全鎖長ＦＧＦ−１０cＤＮＡおよび３'非翻訳領域(３'−ＵＴＲ)に約３４０bpおよび約１４０bpを欠いたcＤＮＡは、同じ長さの翻訳産物を生じ、その分子量は約１９kdであると見積られる(レーン２−４)。本発明の様々な改変および変更は上記の教示を考慮すれば可能であり、それ故特許請求の範囲の範囲内にあり、本発明は特に記載した以外でも行い得る。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９６年６月３日【補正内容】【図１】【図１】【図１】【図２】【図２】【図２】【図３】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＡ６１Ｋ 38/22 ＡＣＢ 9051−4ＣＡ６１Ｋ 37/24 ＡＢＸＡＤＡＡＣＢＡＤＴＡＢＳＡＧＡＡＤＴＣ０７Ｈ 21/04 ＡＤＡＣ１２Ｐ 21/02 ＡＡＭ 21/08 ＡＡＢＧ０１Ｎ 33/566 ＡＧＡ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＦＩ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＩ，ＳＫ，ＵＡ (72)発明者ゴカイン，ジーニー・ディアメリカ合衆国20902メリーランド州シルバー・スプリング、ハーモン・ロード 2715番

Claims

【特許請求の範囲】１．（a）配列番号２の推定されたアミノ酸配列を有するポリペプチド、または該ポリペプチドのフラグメント、アナログ、または誘導体をコードするポリヌクレオチド；（b）ＡＴＣＣ寄託第７５６９６号に含まれるcＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチド、または該ポリペプチドのフラグメント、アナログ、または誘導体をコードするポリヌクレオチド、よりなる群から選択される単離されたポリヌクレオチド。２．ポリヌクレオチドがＤＮＡである請求項１に記載のポリヌクレオチド。３．ポリヌクレオチドがＲＮＡである請求項１に記載のポリヌクレオチド。４．ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡである請求項１に記載のポリヌクレオチド。５．ポリヌクレオチドが配列番号２の推定されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする請求項２に記載のポリヌクレオチド。６．ポリヌクレオチドがＡＴＣＣ寄託第７５６９６号のcＤＮＡによりコードされるポリペプチドをコードする請求項２に記載のポリヌクレオチド。７．配列番号１に示すコード配列を有する請求項１に記載のポリヌクレオチド。８．ＡＴＣＣ寄託第７５６９６号として寄託したポリペプチドのコード配列を有する請求項２に記載のポリヌクレオチド。９．請求項２に記載のＤＮＡを含むベクター。１０．請求項９に記載のベクターで遺伝的に操作した宿主細胞。１１．請求項１０に記載の宿主細胞から、該ＤＮＡによりコードされるポリペプチドを発現させることを含んでなるポリペプチドの製造方法。１２．請求項９に記載のベクターで細胞を遺伝的に操作することを含んでなる、ポリペプチドを発現できる細胞を調製する方法。１３．請求項２に記載のＤＮＡにハイブリダイズでき、ＦＧＦ−１０活性を有するポリペプチドをコードする単離されたＤＮＡ。１４．(ｉ)配列番号２の推定されたアミノ配列を有するポリペプチド、並びにそのフラグメント、アナログおよび誘導体；および (ii)ＡＴＣＣ寄託第７５６９６号のcＤＮＡによりコードされたポリペプチド、並びにそのフラグメント、アナログおよび誘導体、よりなる群から選択されたポリペプチド。１５．ポリペプチドが配列番号２の推定されたアミノ酸配列を有するＦＧＦ−１０である請求項１４に記載のポリペプチド。１６．請求項１４に記載のポリペプチドに対する抗体。１７．請求項１４に記載のポリペプチドに対するアゴニストとして有効な化合物。１８．請求項１４に記載のポリペプチドに対するアンタゴニストとして有効な化合物。１９．ＦＧＦ−１０の必要を有する患者の処置方法であって、該患者に治療的に有効量の請求項１４に記載のポリペプチドを投与することを含んでなる方法。２０．ＦＧＦ−１０を阻害する必要を有する患者の治療方法であって、該患者に治療的に有効量の請求項１８に記載の化合物を投与することを含んでなる方法。２１．患者に該ポリペプチドをコードするＤＮＡを与え、該ポリペプチドをインビボで発現させることにより治療的に有効量のポリペプチドを投与することを含んでなる請求項１９に記載の方法。２２．ＦＧＦ−１０に対するアゴニストおよびアンタゴニストとして活性な化合物を同定する方法であって、（a）ＦＧＦ−１０、スクリーニングすべき化合物、および細胞を含む反応混合物を、細胞がＦＧＦ−１０により正常に刺激される条件下にいっしょにし(該反応混合物は細胞が増殖するに従い細胞中に導入される標識を含む)；そして（b）細胞の増殖の程度を測定して、該化合物が有効なアゴニストまたはアンタゴニストであるかどうか決定する、ことを含んでなる方法。２３．請求項１４に記載のポリペプチドの下方発現に関係する病気または病気に対する感受性を診断する方法であって、該ポリペプチドをコードする該酸配列中の変異を決定することを含んでなる方法。２４．宿主に由来する試料中の請求項１４に記載のポリペプチドの存在を分析することを含んでなる診断方法。