HUT77578A - A 10-es számú fibroblaszt növekedési faktor (FGF-10) - Google Patents

Description

A 10-es számú fibroblaszt-növekedési faktor

A találmány tárgyát újonnan azonosított polinukleotidok, az ilyen polinukleotidok által kódolt polipeptidek, az ilyen polinukleotidok és polipeptidek alkalmazása, valamint azok előállítási eljárása képezi.

Közelebbről, a találmány tárgyát a 10-es számú fibroblaszt-növekedési faktor / 10-es számú heparinkötő növekedési faktor (a továbbiakban FGF-10) elnevezésű polipeptidek és az ilyen polipeptidek hatásának gátlását célzó eljárások képezik, továbbá a találmány szerinti polipeptideket kódoló polinukleotidok, a találmány szerinti polipeptidek elleni antitestek, a találmány szerinti polipeptidek agonistái és antagonistái, a találmány szerinti polinukleotidot tartalmazó vektorok, az ilyen vektorokkal manipulált gazdasejtek, valamint eljárás a találmány szerinti polipeptidek előállítására, eljárás FGF-10 működését, illetve gátlását igénylő páciensek kezelésére, eljárás az FGF-10 agonistáinak és antagonistáinak azonosítására, eljárás a találmány szerinti polipeptidekkel összefüggő betegség diagnosztizálására és diagnosztikai eljárás a találmány szerinti polipeptid jelenlétének kimutatására.

Aktaszámunk: 84373-7177/PÁ

A találmány szerinti polipeptidek előnyösen alkalmazhatók új erek képződésének serkentésére irányuló kezelésekre, sérülések, égések, fekélyek, sebek, idegsejtkárosodások kezelésére és megakadályozására, a bőr öregedésének megakadályozására, valamint hajhullás megelőzésére.

A fibroblaszt növekedési faktorok a proteinek olyan családját képezik, amelyek képesek a heparin megkötésére (emiatt ezeket a proteineket heparinkötő növekedési faktoroknak (HBGF) is nevezik. E proteincsalád különböző tagjainak expressziója különféle szövetekben megfigyelhető, és időbeli és térbeli szabályozás alatt állnak. Ezek a proteinek számos mezodermális, ektodermális és endodermális eredetű sejt (köztük a fibroblasztok, a szaruhártya és az érfal endotélsejtjei, a granulociták, a mellékvesekéregsejtek, a chondrociták, a mioblasztok, az érfali símaizomsejtek, a szemlencse epithelsejtjei, a melanociták, keratinociták, oligodendrociták, asztrociták, oszteoblasztok és vérképző sejtek) hatásos mitogénjei.

A fibroblaszt növekedési faktor család minden tagjának működése átfedő a család többi tagjának működésével, de mindegyiknek megvan egyedi funkciója is. Az érfali endotélsejtek proliierációjának serkentésén kívül mind az FGF-1, mind az FGF-2 kemotaxist gyakorol az endotélsejtekre, és az FGF-2-ről kimutatták, hogy meggátolja az endotélsejtek alapmembránon történő áthatolását. E tulajdonságoknak megfelelően az FGF-1 és FGF-2 egyaránt képes az angiogenezis serkentésére. E növekedési faktorok egy másik lényeges jellemzője, hogy képesek a sebgyógyulás elő• · • · · · · segítésére. Az FGF-család számos más tagja hasonló tulajdonságokkal rendelkezik, mint az FGF-1 és FGF-2 (pl. az angiogenezis és a sebgyógyulás serkentése). Az FGFgéncsalád több tagjáról kimutatták, hogy indukálják a mezodermaképződést, és modulálják az idegsejtek, adipociták és vázizomsejtek differenciálódását.

A normális szövetekben kifejtett biológiai működéseken kívül az FGF-proteinek karcinomákban és szarkomákban a tumor vaszkularizációjának elősegítésével, továbbá, (szabályozás nélküli expressziójuk esetében) transzformáló proteinekként - a tumorképződés serkentésében is szerepet j átszanak.

Az FGF-család jelenlegi ismereteink szerint nyolc szerkezetileg rokon - polipeptidből áll. Mind a nyolc polipeptid génjét klónozták és szekvenálták. Az FGF-l-et és FGF-2-t számos néven jellemezték, de leggyakrabban a savas, illetve bázisos fibroblaszt növekedési faktor elnevezés használatos. A normális géntermékek befolyásolják az mezoderma- és neuroektoderma-eredetű sejtek többségének általános ploriferációs képességét. Ezek a polipeptidek képesek az angiogenezis (érképződés) in vivő indukálására, és lényeges szerepet játszhatnak a korai fejlődésben [ Burgess, W.H. és Maciag, T.: Annu. Rév. Biochem. 58, 575 (1989)] .

Az FGF-1 egy szekretált alakját kódoló eukarióta expressziós vektort génbevitellel sertésartériákba juttattak be. Ez a modell definiálja az artéria falában megfigyelhető in vivő génfunkciót. A sertésartériákban az FGF-1expresszió - 21 nappal a génbevitel után - vékonyította az ··· · ·· · ····· ér belhártyáját [Nabel, E.G. és mtsai.: Natúré 3 62, 844 (1993)] . Kimutatták továbbá, hogy a bázikus fibroblaszt növekedési faktor - tumor angiogenezisben betöltött szerepétől függetlenül - irányíthatja a gliomanövekedést és progressziót, és hogy az ilyen működésekhez a bázikus fibroblaszt növekedési faktor felszabadulására vagy szekréciójára lehet szükség [Morrison, R.S. és mtsai.: J.

Neurosci. Rés. 34, 502 (1993)] .

A fibroblaszt növekedési faktorok - mint pl . a bázikus FGF - szerepet játszanak a Kaposi-szarkómasejtek in vitro növekedésében is [ Huang, Y.Q. és mtsai.: J. Clin.

Invest. 91, 1191 (1993)] . Az emberi bázikus fibroblaszt növekedési faktort kódoló cDNS-szekvenciát - a T7-bakteriofág RNS-polimeráza által felismert - transzkripciós promótertől

3' -irányban klónozták. Az így kapott bázikus fibroblaszt növekedési faktorokról kimutatták, hogy a mitogénaktivitás, a plazminogén-aktivátor-szintézis és az angiogenezis vizsgálataiban az emberi méhlepény eredetű fibroblaszt növekedési faktortól megkülönböztethetetlen biológiai aktivitást mutatnak [Squires, C.H. és mtsai.: J. Bioi. Chem. 263,

16297 (1988)] .

Az 5,155,214 számú Egyesült Államok-beli szabadalmi leírásban lényegében tiszta emlős bázikus fibroblaszt növekedési faktorokat, valamint előállítási eljárásukat írják le. Feltárják a szarvasmarha és az emberi bázikus fibroblaszt növekedési faktor aminosav-szekvenciáját, valamint a szarvasmarha polipeptidet kódoló DNS-szekvenciát.

A találmány szerinti polipeptidet - az FGF-család más tagjaival mutatott aminosavszekvencia-homológia alapján - az FGF-család tagjaként azonosítottuk.

A találmány tárgyát érett polipeptidek képezik. Ezek a polipeptidek az FGF-10, valamint annak biológiailag aktív és diagnosztikai vagy terápiás szempontból hasznos fragmensei, analógjai és származékai. A találmány szerinti polipeptidek emberi eredetűek.

A találmány tárgyát képezik továbbá az emberi FGF10-et kódoló, izolált nukleinsav-molekulák, amelyek közé mRNS-ek, DNS-ek, genomi eredetű DNS, valamint ezek antiszensz analógjai és biológiailag aktív, illetve diagnosztikai vagy terápiás szempontból hasznos fragmensei tartoznak .

Szintén a találmány tárgyát képezi egy eljárás a találmány szerinti polipeptidek rekombináns technikákkal történő előállítására, melynek során rekombináns vektorokat, például - az FGF-10 rekombináns módszerekkel történő előállítására előnyösen alkalmazható klónozó és expressziós plazmidokat, továbbá - emberi FGF-10-nukleinsav-szekvenciát tartalmazó - rekombináns prokarióta és/vagy eukarióta gazdasejteket alkalmazunk.

A találmány tárgyát képezi továbbá egy eljárás a találmány szerinti polipeptid vagy az azt kódoló polinukleotid terápiás célokra (pl. sebek, égések és fekélyek gyógyulásának elősegítésére, idegszöveti rendellenességeknek köszönhető idegrendszeri károsodás megelőzésére, valamint a bőr öregedésének és a hajhullás megakadályozására) történő alkalmazására.

Szintén a találmány tárgyát képezik a találmány szerinti polipeptidek elleni antitestek.

A találmány tárgyát képezik továbbá a találmány szerinti polipeptidek antagonistái, amelyek az ilyen polipeptidek működésének gátlására (pl. daganatok és túlzott érképződéssel kapcsolatos betegségek kezelésére) alkalmazhatók .

A találmány tárgyát képezik továbbá az olyan nukleinsav-próbák, amelyek elegendő hosszúságú nukleinsavmolekulákat tartalmaznak ahhoz, hogy specifikusan hibridizálódjanak az emberi FGF-10 szekvenciájával.

Szintén a találmány tárgyát képezik diagnosztikai vizsgálatok az FGF-10-nukleinsav-szekvenciák mutációival vagy az ilyen szekvenciák által kódolt polipeptidek túlzott expressziójával kapcsolatos betegségek (vagy az ilyen betegségekre való hajlam) kimutatására.

A találmány tárgyát képezi továbbá egy eljárás a találmány szerinti polipeptidek vagy - az ilyen polipeptideket kódoló - polinukleotidok tudományos kutatási célokkal, DNS-szintézissel és DNS-vektorok előállításával kapcsolatos in vitro alkalmazására.

A találmány szerinti megoldás fent említett és további részletei a leírásban adott kitanítás alapján szakember számára világossá válnak.

• · · · • · · · • · · • · · · · · • ·

Ί

A következőkben az ábrák rövid leírását ismertetjük; az ábrákat a találmány specifikus megvalósítási módjainak szemléltetése, és semmi esetre sem az igényelt oltalmi kör bárminemű korlátozása céljából mutatjuk be.

Az 1. ábrán az FGF-10 cDNS-szekvenciája, valamint a cDNS-nek megfelelő, leszármaztatott aminosav-szekvenciája látható. A bemutatott aminosav-szekvencia a protein érett alakját reprezentálja. Az ábrán az aminosavak hagyományos egy betűs rövidítését alkalmazzuk. A polinukleotidszekvenciák meghatározásának megkísérlése során a szekvenálási pontatlanságok általános problémát jelentenek. A szekvenálást 373 Automated DNA sequencer (Applied Biosystems, Inc.) alkalmazásával végeztük. A szekvenálás pontosságát 97 %-nál nagyobbnak ítéljük meg.

A 2. ábrán Az FGF-10 és az FGF-család egyéb tagjai közötti aminosavszekvencia-homológiát mutatjuk be. Az konzervált aminosavakat félkövér betűtípussal szedtük.

A 3. ábrán az in vitro transzkripció és transzláció után kapott FGF-10-protein SDS-PAGE-analízisének eredményét mutatjuk be.

A találmány tárgyát olyan izolált nukleinsavmolekulák (polinukleotidok) képezik, amelyek az 1. ábrán bemutatott leszármaztatott aminosav-szekvenciát (2. azonosítószámú szekvencia) tartalmazó érett polipeptidet, vagy az ATCC 75696 deponálási számon 1994. március 4-én letétbe helyezett klón cDNS-e által kódolt érett polipeptidet kódolják.

A találmány szerinti polinukleotidot először egy nyolc hetes, korai stádiumú emberi szövetből származó cDNSkönyvtárban fedeztük fel, majd később a teljes hosszúságú cDNS-t emberi Amygdala-ból származó könyvtárban találtuk meg. Ez a polinukleotid szerkezeti rokonságot mutat a fibroblaszt növekedési faktor géncsalád valamennyi tagjával, és 181 aminosavas polipeptidet kódoló nyitott leolvasási keretet tartalmaz. Az FGF-10 FGF-család többi tagjával mutatott főbb egyezések a következők: 1) az agyból izolált FGF-9 szekvenciájával - 129 aminosavas régióban - 37 %-os azonosság és 67 %-os hasonlóság; 2) az FGF-7 (keratinocita növekedési faktor) szekvenciájával - 121 aminosavas régióban - 36 %-os azonosság és 64 %-os hasonlóság; 3) az FGF-1 (savas FGF) szekvenciájával - 110 aminosavas régióban - 33 %-os azonosság és 55 %-os hasonlóság. Ezenfelül, a találmány szerinti polipeptidben az FGF/HBGF-család jellemző szekvenciája [ GXLX (S, T, A, G) X6 (D, E) CXFXE] konzervált [ X jelentése bármilyen aminosav; (D,E) jelentése D vagy E aminosav; X6 jelentése hat bármilyen aminosav] .

A találmány szerinti polinukleotid lehet RNS vagy DNS (cDNS, genomi eredetű DNS vagy szintetikus DNS). A DNS lehet kétszálú vagy egyszálú. Az érett polipeptidet kódoló szekvencia azonos lehet az 1. ábrán bemutatott kódolószekvenciával (1. azonosítószámú szekvencia) vagy a letétbe helyezett klón kódolószekvenciájával, illetve - a genetikai kód degeneráltsága miatt - ugyanolyan érett polipeptidet kódolhat, mint az 1. ábrán bemutatott DNS (1. azonosítószámú szekvencia) vagy a letétbe helyezett cDNS.

• · · • · ·

Az 1. ábrán bemutatott, érett polipeptidet (2. azonosítószámú szekvencia) vagy a letétbe helyezett cDNS által kódolt érett polipeptidet kódoló polinukleotid a következőket tartalmazhatja: csal az érett polipeptid kódolószekvenciáját; az érett polipeptid kódolószekvenciáját és egy további kódolószekvenciát, például egy vezető- vagy szekréciós szekvenciát vagy egy pro-proteinszekvenciát; az érett polipeptid kódolószekvenciáját (és adott esetben egy másik kódolószekvenciát), valamint nem kódoló szekvenciát, például intronokat vagy az érett polipeptid kódolószekvenciájától 5' - és/vagy 3' -irányban lévő nem kódoló szekvenciát.

Ennek megfelelően, az egy polipeptidet kódoló polinukleotid kifejezés egyaránt vonatkozik az olyan polinukleotidra, amely csak a polipeptid kódolószekvenciáját tartalmazza, valamint olyan polinukleotidra, amely további kódoló és/vagy nem kódoló szekvenciákat is tartalmaz.

Szintén a találmány tárgyát képezik a fentebb említett polinukleotidok olyan változatai, amelyek az 1. ábrán bemutatott, leszármaztatott aminosav-szekvenciát (2.

azonosítószámú szekvencia) tartalmazó polipeptid fragmenseit, analógjait vagy származékait, vagy a letétbe helyezett klón cDNS-e által kódolt polipeptidet kódolják. A polinukleotid-változatok a polinukleotid természetben előforduló allélváltozatai, illetve a polinukleotid nem természetes változatai egyaránt lehetnek.

- 10 Ennek megfelelően, a találmány tárgyát képezik azok a polinukleotidok, amelyek az 1. ábrán bemutatott érett polipeptiddel (2. azonosítószámú szekvencia) vagy a letétbe helyezett klón cDNS-e által kódolt érett polipeptiddel azonos polipeptidet kódolnak; továbbá az ilyen polinukleotidok változatai, amelyek az 1. ábrán bemutatott polipeptid (2. azonosítószámú szekvencia) vagy a letétbe helyezett klón cDNS-e által kódolt polipeptid fragmensét, származékát vagy analógját kódolják. Az ilyen polinukleotid-változatok közé deléciós, szubsztitúciós, addíciós és inszerciós változatok tartoznak.

Ahogy azt fentebb említettük, a találmány szerinti polinukleotid tartalmazhat olyan kódolószekvenciát, amely az 1. ábrán bemutatott kódolószekvencia (1. azonosítószámú szekvencia) vagy a letétbe helyezett klón kódolószekvenciájának természetben előforduló allélváltozata. Ahogy az ismeretes, az allélváltozat a polinukleotidszekvencia egy olyan alakja, amely egy vagy több nukleotidot érintő szubsztitúciót, deléciót vagy addíciót tartalmaz, melyek a kódolt polipeptid működését alapvetően nem változtatják meg.

Szintén a találmány tárgyát képezik az olyan polinukleotidok, amelyekben az érett polipeptid kódolószekvenciája - azonos leolvasási keretben - egy olyan polinukleotid-szekvenciához kapcsolódik, amely elősegíti a polipeptid expresszióját és gazdasejtből történő szekrécióját; az ilyen polinukleotid-szekvencia például kódolhat egy vezetőszekvenciát, amely szekréciós szekvenciaként egy

- 11 polipeptid sejtből történő transzportjának irányítására szolgál. A vezetőszekvenciát tartalmazó polipeptid egy preprotein, amelyről a vezetőszekvenciát a gazdasejt - a polipeptid érett alakját létrehozva - lehasíthatja. A találmány szerinti polinukleotidok kódolhatnak pro-proteint is, amely az érett proteinből és 5' -irányban további aminosavakból áll. A pro-szekvenciát tartalmazó érett proteint pro-proteinnek nevezzük, amely a protein inaktív alakja. A pro-szekvencia lehasítása után az érett, aktív proteint kapjuk.

Ennek megfelelően, a találmány szerinti polinukleotid kódolhat érett proteint, pro-szekvenciát tartalmazó proteint vagy pro- és pre-szekvenciát (vezetőszekvenciát) egyaránt tartalmazó proteint.

A találmány szerinti polinukleotidok a kódolószekvenciát - azonos leolvasási keretben - egy markerszekvenciához kapcsolva is tartalmazhatják, ami lehetővé teszi a találmány szerinti polipeptid tisztítását. A markerszekvencia lehet egy pQE-9-vektorból származó hexahisztidin-toldalék, amely - baktérium gazdasejt alkalmazása esetén - lehetővé teszi a markerszekvenciához kapcsolt érett polipeptid tisztítását. Markerszekvenciaként emlős gazdasejt (pl. COS-7-sejtek) esetében - hemagglutinin (HA) toldalék is alkalmazható. A HA-toldalék az influenzahemagglutinin-proteinből származó epitópnak felel meg [ Wilson, I. és mtsai.: Cell 37, 767 (1984)] .

A találmány tárgyát képezik továbbá az olyan polinukleotidok, amelyek a hibridizálódnak a fentebb leírt • * V

- 12 szekvenciákkal, amennyiben a szekvenciák között legalább 50 %-os, előnyösen 70 %-os azonosság van. Szintén a találmány tárgyát képezik azok a polinukleotidok, amelyek szigorú feltételek mellett hibridizálódnak a fentebb leírt polinukleotidokkal. Ahogy itt használjuk, a szigorú feltételek kifejezés azt jelenti, hogy a hibridizáció csak abban az esetben következik be, ha a szóban forgó szekvenciák között legalább 95 %-os, előnyösen legalább 97 %-os azonosság van. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint azok a polinukleotidok, amelyek a fentebb leírt polinukleotidokkal hibridizálódnak, olyan proteineket kódolnak, amelyek lényegében azonos biológiai működésűek vagy aktivitásúak, mint az 1. ábrán bemutatott cDNS (1.

azonosítószámú szekvencia) vagy a letétbe helyezett cDNS által kódolt érett polipeptid.

A leírásban említett letétbe helyezett klónokat a Budapest Szerződésben foglaltaknak megfelelően tartják fenn. A kiónokat csupán a könnyű hozzáférhetőség céljából helyeztük letétbe, és ez nem jelenti annak elismerését, hogy a letétbe helyezés a 35. U.S.C. 112. paragrafusa alapján elengedhetetlen lenne. A letétbe helyezett anyagokban lévő polinukleotidok szekvenciáját, valamint a polinukleotidok által kódolt polipeptidek aminosavszekvenciáját a kitanítás részének kell tekinteni, és a leírásban a szekvenciák ismertetésével kapcsolatos bármilyen ellentmondás esetén a letétbe helyezett anyagokban lévő szekvenciákat kell figyelembe venni. A letétbe helyezett anyagok előállításához, alkalmazásához vagy értékesítéséhez • · ·

- 13 engedélyre van szükség, amit ezennel semmi esetre sem adunk meg.

Szintén a találmány tárgyát képezi egy FGF-10polipeptid, amely az 1. ábrán bemutatott leszármaztatott aminosav-szekvenciát (2. azonosítószámú szekvencia) vagy a letétbe helyezett cDNS- által kódolt aminosav-szekvenciát tartalmazza. A találmány tárgyát képezik az ilyen polipeptid fragmensei, analógjai és származékai is.

A fragmens, származék és analóg kifejezések amennyiben az 1. ábrán bemutatott polipeptidre (2. azonosítószámú szekvencia) vagy a letétbe helyezett cDNS által kódolt polipeptidre vonatkoznak - olyan polipeptidet jelentenek, amely lényegében azonos biológiai működésű vagy aktivitású, mint az említett polipeptidek. Ennek megfelelően egy analóg lehet egy pro-protein, amely a pro-szekvencia lehasításával aktiválható, miáltal aktív, érett polipeptid j ön létre.

A találmány szerinti polipeptid rekombináns, természetes vagy szintetikus polipeptid, előnyösen rekombináns polipeptid lehet.

Az 1. ábrán bemutatott polipeptid (2. azonosítószámú szekvencia) vagy a letétbe helyezett cDNS által kódolt polipeptid fragmense, származéka vagy analógja lehet (a) olyan szekvencia, amelyben egy vagy több aminosav konzervált vagy nem konzervált aminosavval - előnyösen konzervált aminosavval - van helyettesítve (és az ilyen helyettesített aminosav a genetikai kód által vagy nem a genetikai kód által kódolt aminosav lehet); (b) olyan szekvencia, • ·

- 14 amelyben egy vagy több aminosav szubsztituens csoportot

tartalmaz;	(c)	olyan	szekvencia,	amelyben az érett
polipeptid	egy	másik	vegyülethez	kapcsolódik, például
olyanhoz,	amely	növeli	a polipeptid	felezési idejét (pl-
polietilén·	-glikolhoz);	vagy (d) olyan	szekvencia, amelyben

az érett polipeptidhez további aminosavak vannak kapcsolva, mint pl. vezetőszekvencia vagy szekréciós szekvencia, vagy az érett polipeptid vagy a pro-protein tisztítására alkalmazható szekvencia. Az ilyen fragmensek, származékok és analógok - a kitanítás alapján - szakember számára megvalósíthatók .

A találmány szerinti polipeptidek és polinukleotidok előnyösen izolált alakban vannak, és előnyösen homogén állapot eléréséig vannak tisztítva.

Az izolált kifejezés azt jelenti, hogy az anyag el van távolítva eredeti környezetéből (például., természetben előforduló anyag esetében a természetes környezetéből). Például, az élő állatban lévő, természetesen előforduló polinukleotid vagy polipeptid nincs izolálva, de ugyanezt a polinukleotidot, DNS-t, vagy polipeptidet, amely a természetes rendszerben vele együtt előforduló anyagok némelyikétől vagy mindegyikétől el van különítve, izoláltnak tekintjük. Az ilyen polinukleotid képezheti egy vektor részét, és/vagy az ilyen polinukleotid vagy polipeptid képezheti egy készítmény részét, és ebben az esetben is izoláltnak tekinthető (amennyiben az ilyen vektor vagy készítmény nem képezi természetes környezetének részét).

• ·

Szintén a találmány tárgyát képezik a találmány szerinti polinukleotidokat tartalmazó vektorok; az ilyen vektorokkal génsebészetileg manipulált gazdasejtek; valamint a találmány szerinti polipeptidek rekombináns technikák alkalmazásával történő előállítási eljárása.

A találmány szerinti vektorokkal (például, klónozóvektorral vagy expressziós vektorral) a gazdasejtek génsebészeti módszerekkel manipulálhatók (transzdukálhatók, transzformálhatok vagy transzfektálhatók). Vektorként plazmidot, vírusrészecskét, fágot és hasonlókat alkalmazhatunk. A manipulált gazdasejtek hagyományos - a promóterek aktiválása, a transzformánsok szelektálása vagy az FGF-10gének amplifikálása céljából megfelelően módosított - tápközegben tenyészthetők. A tenyésztéshez ugyanolyan feltételeket (hőmérséklet, pH, stb.) alkalmazunk, mint az expresszáltatásra kiválasztott gazdasejt esetében. Az ilyen tenyésztési feltételek szakember számára kézenfekvők.

A találmány szerinti polinukleotidot egy polipeptid

- rekombináns módszerekkel történő - előállítására alkalmazhatjuk. Ilyenformán, a polinukleotid-szekvenciát, például, a különböző expressziós hordozók valamelyikébe (elsősorban polipeptid expresszáltatására alkalmas vektorokba vagy plazmidokba) foglalhatjuk. Az ilyen vektorok közé kromoszómális, nem kromoszómális és szintetikus DNSszekvenciák tartoznak; ilyenek például az SV40 származékai, a bakteriális plazmidok, a fág-DNS, az élesztőplazmidok, a plazmidok és fág-DNS kombinálásából származó vektorok, valamint a virális DNS-ek (vaccinia, adenovírus, ···· ····

- 16 baromfihimlő-vírus és pseudorabies) , azonban bármilyen más vektor vagy plazmid is alkalmazható, amennyiben a gazdasejtben replikádé-, illetve életképesek.

A megfelelő DNS-szekvenciát számos eljárással inszertálhatjuk a vektorba. A DNS-szekvenciát általában ismert eljárások alkalmazásával - megfelelő restrikciós endonukleázos helyre inszertáljuk. Az ilyen és egyéb eljárások szakember számára kézenfekvők.

Az expressziós vektorban lévő DNS-szekvenciát működőképesen - az mRNS-szintézis irányítása érdekében - megfelelő expressziós irányítószekvenciá(k)hoz (promóter) kapcsoljuk. Az ilyen promóterek jellemző példáiként a következők említhetők: LTR- vagy SV4 0-promóter; az E. coli lacvagy trp-promótere; a λ-fág P_L-promótere; valamint egyéb promóterek, melyekről ismert, hogy prokarióta vagy eukarióta sejtekben, illetve vírusaikban gének expresszióját irányítják. Az expressziós vektor - a transzláció beindítására szolgáló - riboszómakötő-helyet, valamint transzkripciós terminátort is tartalmaz. A vektor az expresszió fokozására alkalmas szekvenciákat is tartalmazhat .

Ezen túlmenően, az expressziós vektorok előnyösen tartalmaznak egy olyan gént is, amely a transzformált gazdasejtek szelektálása céljából fenotípusos jellemvonást biztosít. Ilyen génként - eukarióta sejttenyészet esetében - dihidrofolát-reduktáz- vagy neomicinrezisztencia-gén, E. coli esetében pedig tetraciklin- vagy ampicillinrezisztencia-gén alkalmazható.

- 17 A fentebb leírt, megfelelő DNS-szekvenciát, valamint megfelelő promótert vagy irányítószekvenciát tartalmazó vektor alkalmas gazdasejt transzformálására alkalmazható, melynek eredményeként a gazda a kívánt proteint expresszálja. Az alkalmas gazdák jellemző példái közé tartoznak a baktériumsejtek (pl. E. coli, Salmonella typhimurium, Streptomyces); gombasejtek, pl. élesztősejtek; rovarsejtek, pl. Drosophila S2- és Spodoptera Sf9-sejtek; állati sejtek, pl. CHO-, COS- vagy Bowes melanomasejtek; adenovírusok; növényi sejtek, stb. Az alkalmas gazda kiválasztása - a találmány leírása alapján - szakember számára nem okoz gondot.

Szintén a találmány tárgyát képezik az olyan rekombináns konstrukciók, amelyek a fentebb leírt szekvenciák közül egyet vagy többet tartalmaznak. A találmány szerinti konstrukciók egy vektort (pl. plazmidot vagy virális vektort) tartalmaznak, amelybe - szabályos vagy fordított orientációban - egy találmány szerinti szekvencia van inszertálva. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint a konstrukció regulatorszekvenciákat is tartalmaz, például - a szekvenciához működőképesen kapcsolódó promótert. Számos alkalmas vektor és promóter ismeretes, melyek kereskedelmi forgalomban beszerezhetők. Példaként a következő vektorokat említjük: bakteriális vektorok: pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen) ; pBS, phagescript-vektor, psiX174,

pBluescript-SK, pBsKS,	pNHÖa, pNHl6a, pNHlöa,	pNH46a
(Stratagene); pTRO99A,	pKK223-3, pKK233-3, pDR540,	pRIT5
(Pharmacia); eukarióta	vektorok: pWLneo, pSV2cat,	pOG44,

- 18 pXTl, pSG (Stratagene); pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL (Pharmacia); azonban bármilyen más vektor vagy plazmid is alkalmazható, amennyiben a gazdasejtben replikáció-, illetve életképesek.

Promóterrégiók - CAT- (kloramfenikol-transzferáz) vektorok vagy más, szelektálható markert tartalmazó vektorok alkalmazásával - bármely kívánt génből kiválaszthatók. Két alkalmas vektor a pKK232-8 és a pCM7. Az alkalmas bakteriális promóterek közé tartozik a lacl-, lacZ-, T3-, T7-, gpt-, lambda-P_R-, lambda-P_L- és trp-promóter. Az eukarióta promóterek közé tartozik a CMV közvetlen korai promótere, a HSV-timidin-kináz promótere, a korai és kései SV40promóter, a retrovirusból származó hosszú terminális ismétlődések (LTR-ek) és az egér metallothionenin-I. A megfelelő vektor és promóter kiválasztása szakember feladata.

Szintén a találmány tárgyát képezik a fentebb leírt konstrukciókat tartalmazó gazdasejtek. A gazdasejt lehet magasabb rendű eukarióta sejt, például emlőssejt; lehet alacsonyabb rendű eukarióta sejt, mint pl. élesztősejt; illetve lehet prokarióta sejt is, például baktériumsejt. A gazdasejtbe a konstrukciót kalcium-foszfátos transzfekcióval, DEAE-dextrán közvetítésével végzett transzfekcióval vagy elektroporációval vihetjük be [ Davis, L., Dibner, M., Battey, I.: Basic Methods in Molecular Biology (1986)] .

A gazdasejtekben a konstrukciókat - hagyományos módon - a rekombináns szekvencia által kódolt géntermék előállítására alkalmazhatjuk. Más módon, a találmány szerinti polipeptidek - hagyományos peptidszintetizáló berendezések • · alkalmazásával - szintetikus úton is előállíthatok.

Az érett proteinek emlős-, élesztő-, baktériumvagy egyéb sejtekben megfelelő promóterek irányítása alatt expresszáltathatók. Az ilyen proteinek előállítására sejtmentes transzlációs rendszerek is alkalmazhatók; ilyen esetben a találmány szerinti DNS-konstrukciókból származó

RNS-eket alkalmazzuk. A prokarióta és eukarióta gazdasejtekben alkalmazható klónozó és expressziós vektorok leírását ld. Sambrook és mtsai.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2. kiadás, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), melyet teljes terjedelmében a kitanítás részének kell tekinteni.

A találmány szerinti polipeptideket kódoló DNS magasabb rendű eukariótákban lejátszódó transzkripcióját úgy fokozhatjuk, ha a vektorba erősítőszekvenciát (enhancer ) inszertálunk. Az erősítőszekvenciák a DNS cis-működésű rendszerint 10-300 bázispár hosszúságú - elemei, amelyek úgy hatnak a promóterre, hogy fokozzák annak transzkripcióját. Az erősítőszekvenciák példái közé tartozik a replikációs kezdőhely kései oldalán lévő SV40erősítőszekvencia (100-270 bp) , a citomegalovírus korai promóterének erősítőszekvenciája, a replikációs kezdőhely kései oldalán lévő polioma-erősítőszekvencia, valamint az adenovírus erősítőszekvenciái.

A rekombináns expressziós vektorok általában olyan replikációs kezdőhelyet és szelektálható markereket tartalmaznak, amelyek elősegítik a gazdasejt transzformálását (ilyen pl. az E. coli ampicillinrezisztencia-génje, és a S.

- 20 cerevisiae TRPl-génje), továbbá tartalmaznak egy magas szinten expresszált génből származó promótert, amely egy 3' -irányban lévő strukturális szekvencia transzkripcióját irányítja. Az ilyen promóterek - többek között glikolízises enzimeket [pl. 3-foszfo-glicerát-kinázt (PGK)] , α-faktort, savas foszfatázt vagy hősokk-proteineket kódoló operonokból származhatnak. A heterológ eredetű strukturális szekvenciát - megfelelő leolvasási keretben transzlációs, iniciációs és terminációs szekvenciákkal kapcsoljuk össze. A heterológ szekvencia - adott esetben - fúziós proteint is kódolhat (pl. egy N-terminális azonosító pepiidet, amely kívánt tulajdonságokat biztosít, pl. az expresszáltatott rekombináns termék stabilizálását vagy egyszerűbb tisztítását.

A bakteriális gazdasejtekben előnyösen alkalmazható expressziós vektorokat úgy állítjuk elő, hogy a kívánt proteint kódoló strukturális DNS-szekvenciát - egy funkcionális promóterrel működőképes leolvasási keretben - alkalmas transzlációs, iniciációs és terminációs szignálszekvenciákkal kapcsoljuk össze. A vektor egy vagy több - fenotípusos jellemzők alapján szelektálható - markert és replikációs kezdőhelyet tartalmaz, amely biztosítja a vektor fennmaradását és - kívánt esetben - a gazdán belüli amplifikációt. A transzformálásra alkalmas prokarióta gazdasejtek közé tartozik az E. coli, Bacillus subtilis , Salmonella typhimurium, valamint a Pseudomonas, Streptomyces és Staphylococcus nemzetség különböző fajai, de egyéb gazdasejtek is alkalmazhatók.

- 21 Jellemző - de nem korlátozó - példaként megemlítjük, hogy a bakteriális gazdasejtekben előnyösen alkalmazható expressziós vektorok tartalmazhatnak olyan szelektálható markert és bakteriális replikációs kezdőhelyet, amelyek kereskedelmi forgalomban beszerezhető - a jól ismert pBR322-klónozóvektor (ATCC 37017) genetikai elemeit tartalmazó - plazmidokból származnak. Az ilyen szokványos vektorok közé tartozik, például, a pKK223-3 (Pharmacia Fine

Chemicals, Uppsala, Svédország) és a GEM1 (Promega Biotec, Madison, WI, USA) . Az ilyen pBR322 gerinc-szakaszokat megfelelő promóterrel, és az expresszáltatni kívánt strukturális szekvenciával kapcsoljuk össze.

Az alkalmas gazdatörzs transzformálása és megfelelő sejtsűrűség eléréséig történő szaporítása után a kiválasztott promótert alkalmas módon indukáljuk (pl. hőmérsékletváltoztatással vagy kémiai indukcióval), és a sejteket tovább tenyésztjük.

A sejteket rendszerint centrifugálással gyűjtjük be, majd fizikai vagy kémiai eljárással feltárjuk, és a kapott nyers kivonatot további tisztításnak vetjük alá.

A proteinek expresszáltatására alkalmazott mikrobiális sejteket bármilyen alkalmas eljárással (pl. fagyasztás és felolvasztás váltakoztatásával, ultrahangkezeléssel, mechanikai feltárással vagy sejtemésztő reagensek alkalmazásával) feltárhatjuk.

Rekombináns protein expresszáltatására különböző emlős sejttenyészeti rendszerek is felhasználhatók. Az emlős expressziós rendszerek példái közé tartoznak a majomve-22 -

se-fibroblasztok COS-7 sejtvonalai [ Gluzman: Cell 23, 175 (1981)] , valamint a kompatibilis vektorokat expresszálni képes egyéb sejtvonalak (C127, 3T3, CHO, HeLa és BHK). Az emlős gazdasejtekben alkalmazható expressziós vektorok replikációs kezdőhelyet, megfelelő promótert és erősítőszekvenciát, továbbá riboszómakötő-helyet, poliadenilációs helyet, splice-donort, akceptor-helyeket, transzkripciós terminációs szekvenciákat, és 5' -szegélyező, nem átíródó szekvenciákat. A nem átíródó genetikai elemek biztosítása céljából SV40-genomból származó DNS-szekvenciák (pl. SV40kezdőhely, korai promóter, erősítőszekvencia, splicedonor és poliadenilációs helyek) alkalmazhatók.

Az FGF-10 rekombináns sejttenyészetekből történő kinyerését és tisztítását ismert eljárásokkal végezzük, például ammónium-szulfátos vagy etanolos kicsapással, savas extrakcióval, anion- vagy kationcserélő kromatográfiával, foszfocellulóz-kromatográfiával, hidrofób kölcsönhatási kromatográfiával, affinitáskromatográfiával, hidroxiapatit-kromatográfiával és lektin-kromatográfiával. Az érett protein konfigurációjának kialakítása céljából, szükség esetén, protein-refolding lépések alkalmazhatók. A végleges tisztításra nagyteljesítményű folyadékkromatográfia (HPLC) alkalmazható.

A találmány szerinti polipeptidek lehetnek természetes módon tisztított termékek, kémiai szintézissel előállított termékek, valamint - rekombináns eljárások alkalmazásával - prokarióta vagy eukarióta gazdasejtekben (pl. tenyésztett baktérium- és élesztősejtekben, magasabb rendű • ·

- 23 • · · · · növényi sejtek, rovar- és emlőssejtekben) előállított termékek. A rekombináns eljárással végzett előállítás során alkalmazott gazdasejttől függően a találmány szerinti polipeptidek emlős vagy más eukarióta szénhidrátokkal lehetnek glikozilálva, illetve lehetnek glikozilálatlanok is.

A találmány szerinti polipeptidek a kezdő metionint is magukban foglalják.

A találmány szerinti polipeptidek - érfali endotélsejtek növekedését serkentő képességüknek köszönhetően - előnyösen alkalmazhatók különböző betegségek, például trombózis, arterioszklerózis és más szív- és érrendszeri rendellenességek következtében helyi vértelenségben szenvedő (isémiás) szövetekben új erek képződésének serkentésére irányuló kezelésben.

Az FGF-10 sérülések, égések, műtét utáni szövethelyreállítás és fekélyek következtében kialakult sebek kezelésére is alkalmazható, mivel a különböző sejttípusok (pl. fibroblasztsejtek és vázizomsejtek) mitogén ágenseként képes működni.

Az FGF-10 alkalmas a bizonyos idegi rendellenességek vagy idegdegenerációs állapotok (mint pl. az Alzheimerkór, Parkinson-kór, AIDS-szel kapcsolatos betegségkomplexum) következtében kialakuló idegsejt-károsodások kezelésére és megakadályozására is.

Az FGF-10 - keratinociták szaporodását serkentő hatásának köszönhetően - felhasználható a bőr (napon történő lesülés okozta) öregedésének megakadályozására is.

• · · · · · ··· · ·· · ·· ...

Az FGF-10 alkalmazható hajhullás megelőzésére is, mivel aktiválja a hajképző sejteket, és elősegíti a melanociták szaporodását. Az FGF-10 - más citokinekkel együtt alkalmazva - serkenti a vérképző sejtek és a csontvelősejtek szaporodását és differenciálódását.

Az FGF-10 felhasználható továbbá a szervek transzplantáció előtti fenntartására és az elsődleges szövetek sejttenyészetének fenntartására.

A találmány tárgyát képezi a találmány szerinti polipeptidek (vagy az azokat kódoló polinukleotidok) - tudományos kutatással, DNS-szintézissel vagy DNS-vektorok előállításával kapcsolatos - in vitro célokra, valamint emberi betegségek kezelésében diagnosztikai és terápiás célokra történő alkalmazási eljárása is.

A teljes hosszúságú FGF-10-gén fragmensei - teljes hosszúságú FGF-10-gén izolálása és egyéb, az FGF-10-génhez nagyon hasonló (illetve hasonló biológiai aktivitású) gének izolálása érdekében - cDNS-könyvtár hibridizációs próbájaként alkalmazhatók. Az ilyen típusú próbák rendszerint legalább 20 bázist, azonban legalább 30, és általában nem több, mint 50 bázist tartalmaznak, de tartalmazhatnak ennél több bázist is. A próbák egy teljes hosszúságú transzkriptumnak megfelelő cDNS-klón, valamint a teljes

FGF-10-gént (regulátor- és promóterrégiókkal, exonokkal és intronokkal együtt) tartalmazó genomi klón vagy kiónok azonosítására is alkalmazhatók. A szkrínelés egyik példája szerint az FGF-10-gén kódolórégióját úgy izoláljuk, hogy oligonukleotid-próba szintetizálására az ismert DNS• ·

- 25 szekvenciát alkalmazzuk. A találmány szerinti gén szekvenciájával komplementer szekvenciát tartalmazó, jelölt oligonukleotidokat emberi cDNS-, genomi eredetű DNS- vagy mRNS-könyvtár szkrínelésére alkalmazzuk, hogy meghatározzuk, vajon a próba a könyvtár mely tagjaihoz hibridizálódik.

Szintén a találmány tárgyát képezi egy eljárás az FGF-1O-polipeptid receptorainak azonosítására. A receptort kódoló gén számos - szakember számára ismert - eljárással azonosítható, például ligandum-panning eljárással vagy FACS-osztályozással [Coligan és mtsai.: Current Protocols in Immun. 1(2), 5. fejezet (1991)] . Erre a célra előnyösen expressziós klónozást alkalmazunk, melynek során a polipeptidekre érzékeny sejtekből poliadenilált RNS-t állítunk elő, és az ebből az RNS-ből készített cDNS-könyvtárat több - elvileg egymástól nem különböző - részre (poolokra) osztjuk, és ezeket COS-sejtek vagy más - a polipeptidekre nem érzékeny - sejtek transzfektálására alkalmazzuk. A tárgylemezeken szaporított transzfektált sejteket a jelölt polipeptidekkel érintkeztetjük. A polipeptidek különböző eljárásokkal - például jódozással vagy egy helyspecifikus protein-kináz felismerési helyének beiktatásával - jelölhetők. A tárgylemezeket - fixálás és inkubálás után - autoradiográfiás analízisnek vetjük alá, melynek során azonosítjuk a alállományokat készítünk, pozitív állományokat, ezeket - ismétlődő, es alállományokra történő bontás és újraszkrínelés alkalmazásával - újratranszfektáljuk, miáltal egyetlen olyan kiónt kapunk, amely a feltételezett receptort kódolja.

A receptor azonosításának egy másik lehetősége szerint a jelölt polipeptideket fényaffinitás-kötéssel sejtmembránhoz vagy olyan kivonatkészítményekhez kapcsoljuk, amelyek expresszálják a receptormolekulát. PAGE-analízissel felbontjuk a keresztkötött anyagot, és röntgenfilmre exponáljuk. A polipeptidek receptorait tartalmazó jelölt komplexet kivágjuk, peptidfragmensekre bontjuk, és proteinmikroszekvenálásnak vetjük alá. A mikroszekvenálással kapott aminosav-szekvenciát - a feltételezett receptorokat kódoló gének azonosítása érdekében cDNS-könyvtár szkrínelésére alkalmas - degenerált oligonukleotid-próbák sorozatának megtervezésére alkalmazhatjuk.

Szintén a találmány tárgyát képezi a vegyületek olyan vizsgálati eljárása, amellyel azonosítható, hogy mely vegyületek módosítják az FGF-10 működését. Az ilyen vizsgálat során, például, egy emlős fibroblasztsejtét, az FGF-10et, a vizsgálandó vegyületet es [ H] -timidint olyan sejttenyésztési feltételek mellett elegyítünk, amely lehetővé teszi a fibroblasztsejtek normális proliierációját. A vizsgálni kívánt vegyület nélkül kontrollvizsgálatot végzünk, és a vegyület jelenlétében megfigyelt fibroblasztproliferáció mértékét összehasonlítjuk a kontroll eredményeivel, hogy - meghatározzuk, vajon a vizsgált vegyület serkenti-e a keratinociták proliierációját (a proliferáció mértékét minden esetben a ³[ H] -timidin felvétele alapján határozzuk meg).

- 27 Az antagonisták szkrínelése érdekében azonos vizsgálatot végezhetünk, melyben mérjük a vizsgálandó vegyület fibroblaszt-prolíferációt gátló hatását, és meghatározzuk az antagonista-képességet. A fibroblaszt-proliferáció mértékét folyadékszcintillációs kromatográfia alkalmazásával, a [ H] -timidin felvételének mérésével határozzuk meg.

Egy másik eljárás szerint egy - FGF-10-receptort expresszáló - emlőssejtet vagy membránkészítményt a tesztelni kívánt vegyület jelenlétében jelölt FGF-10-zel inkubálunk. A tesztelt vegyület jelölt FGF-10 és FGF-10receptor közötti kölcsönhatást gátló hatását mérjük. Más módon, az FGF-10 és receptora közötti kölcsönhatás után egy ismert második hírvivőrendszer reakcióját mérjük, és összehasonlítjuk a tesztelt vegyület jelenlétében, illetve hiányában kapott eredményeket. Második hírvivőrendszerként, többek között, cAMP-guanilát-ciklázt, ioncsatornákat vagy foszfo-inozidit-hidrolízist alkalmazhatunk.

A potenciális FGF-1O-antagonisták példái az antitestek, vagy néhány esetben a polipeptidhez kötődő oligonukleotidok. Más lehetőség szerint, potenciális FGF1O-antagonista lehet az FGF-10 mutáns alakja, amely FGF-10receptorokhoz kötődik, azonban második hírvivőreakciót nem vált ki, ezáltal az FGF-10 működése hatásos blokkolás alá kerül.

Egy további potenciális FGF-10-antagonista az antiszensz technológia alkalmazásával előállított antiszensz konstrukció. Az antiszensz technológia - tripla hélix vagy antiszensz DNS vagy RNS kialakításával - a • · ·

- 28 génexpresszió szabályozására alkalmazható; mindkét eljárás egy polinukleotid DNS-hez vagy RNS-hez történő kapcsolásán alapul. Például, a találmány szerinti érett polipeptideket kódoló polinukleotid-szekvencia 5' -végi kódoló szakaszát kb. 10-40 bp-os antiszensz RNS-oligonukleotid megtervezésére alkalmazzuk. DNS-oligonukleotidot úgy tervezünk, hogy az a 'gén transzkripcióban szerepet játszó régiójával komplementer legyen [ tripla hélix; ld. Lee és mtsai.: Nucl. Acids Rés. 6_, 3073 (1979); Cooney és mtsai.: Science 241, 456 (1988) ; és Dervan és mtsai. : Science 251, 1360 (1991)] , megakadályozva ezáltal az FGF-10 transzkripcióját és termelődését. Az antiszensz RNS-oligonukleotid in vivő az mRNShez hibridizálódik, és meggátolja az mRNS-molekula FGF-10polipeptiddé történő transzlációját [Okano: J. Neurochem.

56, 560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense

Inhibitors of Gene Expression CRC Press, Boca Raton, FL (1988)] . Az fenti oligonukleotidok úgy is bejuttathatok a sejtekbe, hogy az antiszensz RNS vagy DNS in vivő expresszálódjon, gátolva ezáltal az FGF-10 termelődését.

A potenciális FGF-10-antagonisták közé kisméretű molekulák tartoznak, amelyek az FGF-10-receptor kötőhelyéhez kötődnek és elfoglalják azt, ezáltal a receptort hozzáférhetetlenné teszik az FGF-10 számára, megakadályozva ezáltal normális biológiai aktivitását. Az ilyen kisméretű molekulák, többek között, kis peptidek vagy peptidszerű molekulák lehetnek.

Az FGF-10-antagonisták a sejtnövekedés gátlására és az FGF-10 - daganatos sejtekre és szövetekre gyakorolt • ·· ··«

- 29 proliferációs hatásának gátlására (következésképpen, az abnormális sejtnövekedés és -proliferáció, például a tumornövekedés visszatartására és gátlására) is alkalmazhatók .

Az FGF-10 antagonisták túlzott érképződéssel kapcsolatos betegségek megelőzésére, valamint extrakapszuláris hályogműtét után - az epitheliális szemlencse-sejtek proliferációjának megakadályozására is alkalmazhatók .

Az antagonisták gyógyászati szempontból elfogadható hordozóval együtt előállított készítményben is alkalmazhatók .

A találmány szerinti polipeptidek, agonisták és antagonisták megfelelő gyógyászati hordozóval együtt, gyógyászati készítmény részeként alkalmazhatók. Az ilyen készítmények a találmány szerinti polipeptid, agonista vagy antagonista terápiás szempontból hatásos mennyiségét, valamint gyógyászatilag elfogadható hordozót és kötőanyagot tartalmaznak. Az alkalmas hordozók közé tartozik, többek között, a sóoldat, puffereit sóoldat, dextróz, víz, glicerin, etanol és ezek kombinációi. Az alkalmazott készítményt a beadási módnak megfelelően kell kiválasztani.

Szintén a találmány tárgyát képezi egy gyógyászati reagenskészlet, amely - a találmány szerinti gyógyászati készítmények egy vagy több alkotórészét tartalmazó - egy vagy több edényt tartalmaz. Az ilyen edény(ek)hez mellékelhető egy - a gyógyászati vagy biológiai termékek gyártását, alkalmazását és forgalmazását szabályozó hivatalos szerve- 30 zet által előírt - tanúsítvány, amely a termék emberi beadás céljára történő gyártására, alkalmazására vagy forgalmazására vonatkozó jóváhagyást igazolja. Ezenfelül, a találmány szerinti polipeptidek, agonisták és antagonisták más terápiás vegyületekkel együtt is alkalmazhatók.

A gyógyászati készítmények hagyományos módokon, például, szájon keresztül, helyileg, intravénásán, intraperitoneálisan, intramuszkulárisan, szubkután, orron keresztül vagy intradermálisan adhatók be. A gyógyászati készítményeket az adott betegség vagy rendellenesség kezelésére és/vagy megelőzésére hatásos mennyiségben adjuk be. A készítményeket általában legalább naponta kb. 10 gg/testtömeg-kilogramm mennyiségben, leginkább nem több, mint naponta kb. 8 mg/testtömeg-kilogramm mennyiségben adagoljuk. Az adagolás - a beadás módjától, a tünetektől és hasonló tényezőktől függően - leggyakrabban napi kb. 10 gg/testtömeg-kilogrammtól és kb. 1 mg/testtömeg-kilogrammig terjed. A helyi alkalmazás speciális esetében a készítményeket előnyösen 0,1 ^ig/cm² és 9 mg/cm² közötti mennyiségben adagoljuk.

A találmány szerinti megoldás értelmében az FGF-10polipeptidek, azok agonistái és antagonistái (amelyek szintén polipeptidek) in vivő expresszáltatás útján is alkalmazhatók, amit gyakran génterápiának nevezünk.

Ennek megfelelően, a sejtek például - ismert eljárásokkal - ex vivő a polipeptidet kódoló polinukleotiddal (DNS-sel vagy RNS-sel) manipulálhatók. Egy páciens sejtjeinek in vivő manipulálása és a találmány szerinti polipeptid

- 31 in vivő expresszáltatása céljából egy találmány szerinti polipeptidet kódoló RNS-t tartalmazó retrovírus-részecskét termelő sejtet adhatunk be a páciensnek. A találmány szerinti polipeptid beadásának fenti és egyéb eljárásai a találmány leírása alapján szakember számára nyilvánvalóak. A sejtek manipulálására szolgáló expressziós hordozóként nemcsak retrovírus-részecskét, hanem - például - adenovírust is felhasználhatunk, amely megfelelő hordozó vektorral végzett egyesítés után a sejtek in vivő manipulálására alkalmazható .

A találmány tárgyát képezi az FGF-10-gén diagnosztikai vizsgálat részeként történő alkalmazása az FGF-10nukleinsav-szekvenciákban lévő mutációkkal összefüggő betegségek (vagy az ilyen betegségekre való érzékenység) kimutatására .

Az FGF-10-génben mutációkat hordozó egyéneket

DNS-szinten - különböző technikák alkalmazásával azonosíthatjuk. A diagnózishoz szükséges nukleinsavakat a beteg sejtjeiből (pl. vérből, vizeletből, nyálból, szövetbiopsziából és boncolási anyagból) nyerjük ki. A genomi eredetű DNS detektálásra közvetlenül alkalmazható vagy a vizsgálat előtt - polimeráz láncreakció alkalmazásával [ Saiki és mtsai. : Natúré 324, 163 (1986)] enzimatikusan amplifikálható. Ilyen célra RNS vagy cDNS is alkalmazható. Például, az FGF-1O-mutációk azonosítására és vizsgálatára FGF-10-et kódoló nukleinsavval komplementer PCR-láncindítók alkalmazhatók. A deléciók és inszerciók, például, az amplifikált termék méretének - normális genotí- 32 pushoz viszonyított - változása alapján mutathatók ki. A pontmutációk az amplifikált DNS radioaktívan jelölt FGF-10RNS-hez (vagy más módon, radioaktívan jelölt antiszensz

FGF-10-DNS-szekvenciákhoz) történő hibridizálásával mutathatók ki. A pontosan illeszkedő szekvenciák a hibás bázispárosodású duplexektől RN-áz-A-emésztéssel vagy az olvadáspontok különbségei alapján különböztethetők meg.

A DNS-szekvencia-különbségeken alapuló genetikai tesztelés a DNS-fragmensek - denaturáló ágenseket tartalmazó vagy azok nélküli - géleken mutatott elektroforetikus mobilitása változásának kimutatásával valósítható meg. A kis szekvenciadeléciók és -inszerciók nagy felbontású gélelektroforézissel tehetők láthatóvá. A különböző szekvenciák DNS-fragmensei denaturáló formamid-gradiens gélen különböztethetők meg egymástól, amelyben a különböző DNSfragmensek - specifikus olvadáspontjuknak vagy részleges olvadáspontjuknak megfelelően - különböző mobilitással mozognak [ ld. pl. Myers és mtsai.: Science 230, 1242 (1985)] .

A specifikus helyeken lévő szekvenciaváltozások nukleáz-védelmi vizsgálatokkal (pl. RN-áz- vagy Slvédelemmel, illetve kémiai hasítási eljárással is kimutathatók [ Cotton és mtsai.: PNAS, USA 85, 4397 )1985)] .

A fentieknek megfelelően, egy specifikus DNSszekvencia, például, hibridizációval, RN-áz-védelemmel, kémiai hasítással, közvetlen DNS-szekvenálással, restrikciós enzimek alkalmazásával (pl. restrikciós fragmenshosszúság polimorfizmus; RFLP) vagy genomi eredetű DNS Southernblot-analízisével mutatható ki.

»4·· ···« ··* · ··· • ·· ·*·

- 33 A mutációk - a hagyományos gélelektroforézisen és

DNS-szekvenáláson kívül - in situ analízissel is kimutathatók .

A találmány tárgyát képezi továbbá egy diagnosztikai vizsgálat az FGF-10-protein megváltozott szintjének különböző szövetekben történő kimutatására. A proteinek (normál kontroll szövetben tapasztalható szinthez viszonyított) túlzott expressziója betegségre - pl. daganatos betegségre - vagy betegségre való fogékonyságra utalhat. Az FGF-10-protein gazdaszervezetből származó mintában történő kimutatási eljárásai jól ismertek; ezek közé tartoznak a radioimmunvizsgálatok, a kompetitív kötődési vizsgálatok, a western-blot-analízis, az ELISA-vizsgálatok és az ún.

sandwich-vizsgálat. Az ELISA-vizsgálat során [Coligan és mtsai.: Current Protocols in Immunology 1(2), 6. fejezet (1991)] először egy FGF-10-antigénre specifikus antitestet (előnyösen monoklonális antitestet) állítunk elő, majd egy monoklonális antitest elleni - riporter-antitestet is előállítunk. A riporter-antitestet detektálható reagenssel jelöljük (pl. radioaktív izotóppal, fluoreszcens anyaggal vagy - esetünkben - tormaperoxidáz enzimmel). A páciensből mintát veszünk, amelyet - a mintában lévő proteineket megkötő - szilárd felületen (pl- polisztirol csészében) inkubálunk. Ezután a csészében lévő szabad proteinkötőhelyeket nem specifikus proteinnel, például szarvasmarha szérumalbuminnal végzett inkubálással befedjük. Ezt követően a monoklonális antitesteket annyi ideig inkubáljuk a csészében, amely elegendő ahhoz, azok a polisztirol csészé- 34 • · · · • · · · • · » · · · · · hez kapcsolódott FGF-10-proteinekhez kötődjenek. A nem kötődött monokionális antitesteket pufferrel leöblítjük. A tormaperoxidázhoz kapcsolt riporter-antitestet ekkor adjuk a csészéhez, és a riporter-antitest az FGF-10-hez kötődött monokionális antitestekhez kapcsolódik. A nem kapcsolódott riporter-antitesteket mosással eltávolítjuk, majd a csészébe peroxidáz-szubsztrátokat adunk, és a páciensből vett mintában lévő FGF-10-protein mennyiségét az adott idő alatt kifejlődött szín intenzitása alapján - standard görbéhez viszonyítva - határozzuk meg.

Az FG-10-protein kimutatására alkalmazott kompetíciós vizsgálat során FGF-10-re specifikus antitesteket szilárd hordozóhoz kapcsolunk, és jelölt FGF-10-et, valamint a páciensből származó mintát átengedjük a szilárd hordozón, és a - például folyadékszcintillációs kromatográfiával - detektált jelölőanyag mennyiségéből a mintában lévő FGF-10 mennyiségére következtetünk.

A sandwich-vizsgálat hasonló az ELISAvizsgálathoz; ennek során az FGF-10-et szilárd hordozón engedjük át, és a protein a szilárd hordozóhoz kapcsolt antitestekhez kötődik. Ezután egy második antitestet kapcsolunk az FGF-10-hez, és a szilárd hordozón egy harmadik - a második antitestre specifikus - jelölt antitestet engedünk át, amelynek második antitesthez történő kötődése alapján meghatározható az FGF-10 mennyisége.

A találmány szerinti szekvenciák kromoszómák azonosítására is alkalmasak. A szekvencia egy emberi kromoszóma adott helyét célozza meg, és azzal hibridizálódik. Ezen • · · ·· ···

- 35 túlmenően, szükség van a kromoszóma adott helyeinek azonosítására is. A kromoszómák helyeinek megjelölésére jelenleg kevés - tényleges szekvenciaadatokon alapuló - kromoszómajelölő reagens áll rendelkezésre. A DNS-ek kromoszómákon történő - találmány szerinti - térképezése lényeges kiindulási lépése a betegséggel kapcsolatos gének és az ilyen szekvenciák közötti összefüggés megállapításának.

A szekvenciák kromoszómákon történő térképezése során cDNS-ből polimeráz láncreakcióhoz alkalmazható (előnyösen 15-25 bp-os) láncindítókat készítünk. A 3' -végi transzlálatlan régió számítógépes analízisével olyan láncindítókat választunk ki, amelyek a genomi eredetű DNS egy exonjánál nem nagyobb szakaszt ívelnek át (ami bonyolultabbá tenné az amplifikációt) . Ezeket a láncindítókat egyedi kromoszómákat tartalmazó szomatikus hibrid sejtek PCRszkrínelésére alkalmazzuk. Csak azok a hibridek eredményeznek amplifikált fragmenst, amelyek az alkalmazott láncindítónak megfelelő emberi gént tartalmaznak.

A szomatikus sejthibridek PCR-térképezése gyors eljárás, amellyel egy adott DNS adott kromoszómához rendelhető. A találmány szerinti megoldással, azonos láncindító oligonukleotidok alkalmazásával - specifikus kromoszómákból vagy nagy genomi kiónok állományaiból (pool) származó fragmensekkel szublokalizációt végezhetünk. Egy adott szekvencia kromoszómájára történő térképezésének egyéb eljárásai közé tartozik az in situ hibridizáció, a jelzett, áramoltatva osztályozott (flow sorted) kromoszómákkal végzett előzetes szkrínelés és a kromoszómaspecifikus cDNS• ·

- 36 könyvtárak előállítása céljából hibridizációval végzett előzetes szelekció.

Egy cDNS-klón metafázisos kromoszómakenethez történő fluoreszcens in situ hibridizációja (FISH) a pontos kromoszómális elhelyezkedés egylépéses meghatározására alkalmazható. Ez a technika mindössze 500-600 bázisból álló cDNS-ek esetében is alkalmazható, azonban a 2000 bp-nál hosszabb kiónok esetében nagyobb a valószínűsége annak, hogy a klón - az egyszerűbb kimutatás érdekében - megfelelő szignálintenzitással egy egyedi kromoszómahelyhez kapcsolódjon. A FISH-eljáráshoz olyan kiónok alkalmazására van szükség, amelyekből az expresszált szekvenciatoldalék (a találmány szerinti gén egy fragmense) származik. A hosszabb kiónok előnyösebbek; például, a 2000 bp-os hosszúság jó, a 4000 bp-os hosszúság még jobb. 4000 bp-nál nagyobb hosszúságra valószínűleg nincs szükség ahhoz, hogy nagy arányban jó eredményeket kapjunk. E technika leírását ld. Verma és mtsai.: Humán Chromosomes: A Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York (1988).

Miután egy szekvenciát a kromoszóma egy pontos helyére sikerült térképezni, a kromoszómán a szekvencia fizikai elhelyezkedését a genetikai térkép adataival hozhatjuk összefüggésbe (ilyen adatok találhatók pl.: V. McKusick:

Mendelian Inheritance in Mán; hálózaton elérhető a Johns

Hopkins University Welch Medical könyvtáron keresztül). A térképezéssel azonos kromoszómarégión meghatározott gének és betegségek közötti összefüggés kapcsoltsági analízissel határozható meg (fizikailag szomszédos gének együttes örök• ·

- 37 lődése).

Szükség van az érintett, illetve egészséges egyének cDNS- vagy genomi szekvenciája közötti különbségek feltárására is. Ha valamennyi vagy néhány érintett egyén esetében olyan mutáció figyelhető meg, amely az egészséges egyének egyikében sem található, valószínű, hogy a mutáció a betegség okozója.

A fizikai és genetikai térképezési technikák jelenlegi felbontóképességével egy, a betegséggel összefüggő kromoszómarégión pontosan lokalizált cDNS 50-500 potenciális betegségokozó gén egyike lehet (ez 1 megabázisos térképezési felbontást és 20 kb-onként egy gént feltételez).

A találmány szerinti polipeptidek, fragmenseik vagy egyéb származékaik és analógjaik, valamint az ezeket expresszáló sejtek immunogénként ellenük irányuló antitestek előállítására alkalmazhatók. Az antitestek lehetnek, például, poliklonálisak vagy monoklonálisak. A találmány tárgyát képezik a kiméra, egyláncú és humanizált antitestek, a Fab-fragmensek, valamint a Fab expressziós könyvtár terméke. Az ilyen antitestek és antitest-fragmensek előállítására számos eljárás ismert.

A találmány szerinti szekvenciának megfelelő polipeptidek elleni antitestek előállíthatok oly módon, hogy a polipeptideket közvetlenül egy állatba injektáljuk vagy beadjuk egy állatnak (előnyösen nem embernek). Az így kapott antitest ezután önmagától a polipeptidekhez kötődik. Ezen a módon a polipeptidek csupán egy fragmensét kódoló szekvenciát is felhasználhatjuk az antitestek előállításá• · • · · • · · · · · ··· · ·· ······

- 38 ra, mely antitestek az egész polipeptidet megkötik. Az ilyen antitestek a polipeptid - polipeptidet expresszáló szövetből történő - izolálására alkalmazhatók.

A monoklonális antitestek előállítására bármilyen folyamatos sejtvonal-tenyészet által termelt antitesteket biztosító - eljárás alkalmazható. Az ilyen eljárások példái közé tartozik a hibridóma-technika [Kohler és Milstein:

Natúré 256, 495 (1975)] , a trióma-technika, az emberi Bsejt-hibridóma-technika [ Kozbor és mtsai.: Immunology Today ^4, 72 (1983)] , valamint az emberi monoklonális antitestek előállítására szolgáló EBV-hibridóma-technika [ Colé és mtsai.: Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alán R.

Liss, Inc., 77-96. old. (1985)] .

Az egyláncú antitestek előállítási eljárásai (4,946,778 számú Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás) alkalmazhatók a találmány szerinti immunogén polipeptidek elleni egyláncú antitestek előállítására is. Az ilyen immunogén polipeptidek elleni humanizált antitestek expresszáltatására transzgénikus egerek alkalmazhatók.

A találmány szerinti megoldást a továbbiakban kísérleti példákon keresztül fogjuk szemléltetni, melyekkel nem szándékozzuk a találmány oltalmi körét korlátozni. A példákban megadott százalékértékek tömeg%-ot jelentenek.

A példák jobb megértésének elősegítése érdekében megadjuk néhány gyakrabban előforduló kifejezés jelentését.

A plazmidokat kis p betűvel jelöljük, amely előtt és/vagy után nagybetűk és/vagy számok állnak. Kiindulási plazmidként kereskedelmi forgalomban beszerezhető

• ·

- 39 plazmidot, szabadon hozzáférhető plazmidot, vagy ismert eljárásokkal előállított plazmidot alkalmazhatunk. Ezenkívül, a leírt plazmidokkal egyenértékű plazmidok szakember számára ismertek.

A DNS-emésztés kifejezés a DNS olyan restrikciós enzimmel végzett katalitikus hasítását jelenti, amely csak a DNS adott szekvenciáinál hasít. A találmány szerinti megoldás gyakorlati megvalósítása során kereskedelmi forgalomban beszerezhető restrikciós enzimeket alkalmazunk, melyek reakciófeltételei, kofaktorai és alkalmazásuk egyéb feltételei szakember számára kézenfekvők. Analitikai célokra kb.

μΐ pufferoldatban kb. 2 egység enzimmel rendszerint 1 μg plazmidot vagy DNS-fragmenst alkalmazunk. A plazmidok előállítása érdekében DNS-fragmensek izolálása céljából nagyobb térfogatban 20-250 egység enzimmel jellemzően 5-50 μg DNS-t emésztünk. Az egyes restrikciós enzimek esetében alkalmazható puffereket és szubsztrátmennyiségeket a gyártó adja meg. Az inkubálást általában kb. egy órán át 37 °C-on végezzük, de ezek az értékek a forgalmazó útmutatásai függvényében változhatnak. Az emésztés után a reakció termékeit a kívánt fragmens izolálása érdekében - közvetlenül poliakril-amid-gélen elektroforizáljuk.

A hasított fragmensek méret szerinti elválasztását %-os poliakril-amid-gél alkalmazásával, Goeddel, D. és mtsai. leírása szerint végezzük [ Nucleic Acids Rés. 8, 4057 (1980)] .

Az oligonukleotid kifejezés egyszálú polidezoxinukleotidokra vagy két komplementer

- 40 polidezoxinukleotid szálra vonatkozik, amelyek kémiai úton szintetizálhatok. Az ilyen szintetikus oligonukleotidok 5' végükön nem tartalmaznak foszfátcsoportot, így - kináz és ATP jelenlétében - foszfát hozzáadása nélkül nem ligálódnak más oligonukleotiddal. A szintetikus oligonukleotid olyan fragmenshez ligálódik, amely előzőleg nem volt defoszforilálva.

A ligálás kifejezésen két kétszálú nukleinsavfragmens között foszfodiészter-kötések kialakulásának folyamatát értjük [Maniatis, T. és mtsai. Id., 146. old.] . Ha másképpen nem jelezzük, a ligálás ismert pufferek és feltételek alkalmazásával - a hozzávetőleg ekvimoláris mennyiségű, ligálni kívánt DNS-fragmensek 0,5 pg-jára vonatkoztatva - 10 egység T4-DNS-ligázzal hajtható végre.

Ha másképpen nem jelezzük, a transzformációt Graham, F. és Van dér Eb, A. leírása szerint végeztük [Virology 52, 456 (1973)] .

1. példa

Az FGF-10-mRNS eloszlása felnőtt emberi szövetekben

Az FGF-10-mRNS expressziójának vizsgálata érdekében különböző felnőtt emberi szövetekből származó 2 pg poli-A⁺mRNS-sel - próbaként radioaktívan jelölt teljes FGF-10-cDNS alkalmazásával - northern-analízist végeztünk. A kapott eredmények azt mutatják, hogy egy 1,4 kb-os mRNS leggyakrabban a vázizmokban, közepes szinten a szívben, agyban, méhlepényben, vesében és hasnyálmirigyben, alacsonyabb szinten pedig a májban expresszálódik. A szívben három má- 41 sik fragmens (4,4 kb; 2,4 kb és 0,5 kb) szintén megtalálható. Valószínű, hogy ezek a szívben található különböző méretű mRNS-ek alternatív splicing eredményei. Az agyban szintén jelen van egy 4,4 kb-os mRNS-fragmens. A Clontech Laboratories, Inc.-tói (Palo Alto, CA) beszereztünk egy több felnőtt emberi szövetből származó 2 pg poli-A*-RNS-t membránhoz kötve tartalmazó - nylonmembrán-lenyomatot (nylon biot) . A lenyomatot - radioaktív dCTP-vel jelölt teljes FGF-10-cDNS-sel hibridizáltűk. A hibridizációt éjszakán át 7% SDS, 0,5 M NaPCh (pH=7,2) és % BSA elegyében, 65 °C-on egy végeztük. 0,2xSSC és 0,1 % SDS elegyében, 65 °C-on kétszer 30 percig végzett mosás után a lenyomatot erősítőernyő alkalmazásával - egy éjszakán át röntgenfilmre exponáltuk.

2. példa

Az FGF-10 expresszáltatása in vívó transzkripció és transzláció alkalmazásával

Az FGF-10 cDNS-t (ATCC 75696) in vitro transzkripciónak és transzlációnak vetettük alá, hogy meghatározzuk a teljes hosszúságú és részleges FGF-10-cDNS által kódolt polipeptid hosszúságát. Az FGF-10 - pBluescript-SKvektorban lévő - teljes hosszúságú és részleges szakaszait polimeráz-láncreakcióval, három pár láncindító alkalmazásával amplifikáltuk. A láncindító-párok a következők voltak:

1) fordított és normális M13-láncindító; 2) fordított M13láncindító és FGF-20-láncindító; és 3) fordított M13láncindító és FGF-P22-láncindító. E láncindítók szekvenciája a következő:

• · · · ·

- 42 Fordított M13-2-láncindító: 5' -ATGCTTCCGGCTCGTATG3' (3. azonosítószámú szekvencia).

Ez a szekvencia a pBluescript-vektorban az FGF-10-cDNSinszert 5' -végén, 5' -irányban található, és a cDNS-hez viszonyítva antiszensz orientációban helyezkedik el. E láncindító és az FGF-10-cDNS között a T3-promóter található.

M13-2 láncindító: 5' -GGGTTTTCCCAGTCACGAC-3' (4. azonosítószámú szekvencia).

Ez a szekvencia a pBluescript-vektorban az FGF-10-cDNSinszert 3' -végén, 3' -irányban található, és a cDNS-hez viszonyítva antiszensz orientációban helyezkedik el.

FGF-P20-láncindító: 5' -GTGAGATCTGAGGGAAGAAGGGGA-3' (5. azonosítószámú szekvencia).

E láncindító 3' oldali 15 bp-os szekvenciája az FGF-10cDNS-szekvencia 780-766. nukleotidjaiból álló szakaszhoz viszonyítva antiszensz orientációjú, és kb. 12 bp távolságra helyezkedik el a stopkodontól.

FGF-P22-láncindító : 5' -CCACCGATAATCCTCCTT-3' (6. azonosítószámú szekvencia).

Ez a szekvencia az FGF-10-cDNS-ben antiszensz orientációban, a stopkodontól kb. 213 bp távolságra helyezkedik el.

A három láncindító-párral végzett polimerázláncreakciók olyan amplifikált termékeket eredményeztek, amelyek a cDNS-inszert előtt T3-promóterszekvenciát tartalmaztak, és amelyek a teljes hosszúságú FGF-10-polipeptidet kódolták.

Az ín vitro transzkripció és transzláció céljára az első láncindító-párral kapott PCR-termék hozzávetőleg 1 ^ig• · · ·· · ·· ··· ját, illetve a második és harmadik láncindító-párral kapott PCR-termék 0,3-0,3 gg-ját alkalmaztuk. Az in vitro transzkripciós és transzlációs reakciót 25 μΐ reakciótérfogatban, T_NT Coupled Reticulocyte Lysate Systems (Promega; katalógusszám: L4950) alkalmazásával végeztük. A reakcióelegy 12,5 μΐ T_NT-nyúlretikulocita-lizátumot, 2 μΐ T_NTreakciópuffért, 1 μΐ T3-polimerázt, 1 μΐ 1 mM aminosavelegyet (metionin nélkül), 4 μΐ ³⁵S-metionint (>1000 Ci/mmól, 10 mCi/ml), 1 μΐ (40 E/ml koncentrációjú) RN-azin ribonukleáz-inhibitort, és 0,5 μg vagy 1 μg PCR-terméket tartalmazott. A reakcióelegy térfogatát nukleázmentes vízzel 25 μΙ-re egészítettük ki. A reakcióelegyet 30 °C-on 2 óra hosszat inkubáltuk. A reakciótermék 5 μΙ-ét 4-2 % gradiens SDS-PAGE gélen analizáltuk. A gélt - 25 %-os izopropanolban és 10 % ecetsavban végzett fixálás után megszárítottuk és 70 °C-on egy éjszakán át röntgenfilmre exponáltuk.

Ahogy a 3. ábrán látharó, a teljes hosszúságú FGF10-cDNS-t, valamint az olyan cDNS-t tartalmazó PCRtermékek, amely cDNS 3' -transzlálatlan régiójában (3' -UTR) kb. 340 bp, illetve kb. 140 bp hiányzik, azonos hosszúságú transziáit terméket eredményeztek. A termékek molekulatömegét kb. 19 kD-nak becsültük (2-4. oszlopok).

A találmány szerinti megoldás gyakorlati megvalósításában különböző változtatások hajthatók végre, anélkül, hogy eltérnénk a találmányi gondolattól. Az ilyen megoldások az igényelt oltalmi körön belül maradnak.

SZEKVENCIALISTA

AZ 1. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 1121 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: cDNS

AZ 1. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GGCAAAGTGG	GATGATCTGT	CACTACACCT	GCAGCACCAC	GCTCGGAGGA	CAGCTCCTGC	60
CTGCAGCTTC	CAGACCCAGG	AAGCCTGAGG	GGAAGGAAGG	AAGTACGGGC	GAAATCATCA	120
GATTGGCTTC	CCAGATTTGG	GAATCTGAAG	CGGGCCCACA	TCTTCCGGCC	AACTTCCATT	180
GAACTTCCCA	GCACTCGAAA	GGGACCGAAA	TGGAGAGCAA	AGAACCCCAG	CTCAAAGGGA	240
TTGTGACAAG	GTTATTCAGC	CAGCAGGGAT	ACTTCCTGCA	GATGCACCCA	GATGGTACCA	300
TTGATGGGAC	CAAGGACGAA	AACAGCGACT	ACACTCTCTT	CAATCTAATT	CCCGTGGGCC	360
TGCGTGTAGT	GGCCATCCAA	GGAGTGAAGG	CTAGCCTCTA	TGTGGCCATG	AATGGTGAAG	420
GCTATCTCTA	CAGTTCAGAT	gttttcactc	CAGAATGCAA	ATTCAAGGAA	TCTGTGTTTG	480
AAAACTACTA	TGTGATCTAT	TCTTCCACAC	TGTACCGCCA	GCAAGAATCA	GGCCGAGCTT	540
GGTTTCTGGG	ACTCAATAAA	GAAGGTCAAA	TTATGAAGGG	GAACAGAGTG	AAGAAAACCA	600
AGCCCTCATC	ACATTTTGTA	CCGAAACCTA	TTGAAGTGTG	TATGTACAGA	feAACCATCGC	660
TACATGAAAT	TGGAGAAAAA	CAAGGGCGTT	CAAGGAAAAG	TTCTGGAACA	CCAACCATGA	720
ATGGAGGCAA	AGTTGTGAAT	CAAGATTCAA	CATAGCTGAG	AACTCTCCCC	TTCTTCCCTC	780
TCTCATCCCT	TCCCCTTCCC	TTCCTTCCCA	TTTACCCATT	TCCTTCCAGT	AAATCCACCC	840
AAGGAGAGGA	AAATAAAATG	ACAACGCAAG	CACCTAGTGG	CTAAGATTCT	GCACTCAAAA	900
TCTTCCTTTG	TGTAGGACAA	GAAAATTGAA	CCAAAGCTTG	CTTGTTGCAA	TGTTGTAGAA	960
AATTCACGTT	CACAAAGATT	ATCACACTTA	AAAGCAAAGG	AAAAAATAAA	TCAGAACTCC	1020
ATAAATATTA	AACTAAACTG	TATTGTTATT	AGTAGAAGGC	TAATTGTAAT	GAAGACATTA	108C
ATAAAGGTGA	AATAAACTTA	AAAAAAAAAA	AAAAAAAAAA	A		1121

- 45 A 2. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 181 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ:

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

A 2. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Met

Glu Ser Lys Glu Pro Gin Leu Lys Gly

Ile

Val

Thr

Arg

Leu 15

5

10

Phe

Ser

Gin

Gin

Gly

Tyr

Phe

Leu

Gin

Met

His

Pro

Asp

Gly

Thr

20

25

30

Ile

Asp

Gly

Thr

Lys

Asp

Glu

Asn

Ser

Asp

Tyr

Thr

Leu

Phe

Asn

35

40

45

Leu

Ile

Pro

Val

Gly

Leu

Arg

Val

Val

Alá

Ile

Gin

Gly

Val

Lys

50

55

60

Alá

Ser

Leu

Tyr

Val

Alá

Met

Asn

Gly

Glu

Gly

Tyr

Leu

Tyr

Ser

65

70

75

Ser

Asp

Val

Phe

Thr

Pro

Glu

Cys

Lys

Phe

Lys

Glu

Ser •

Val

Phe

80

85

90

Glu

Asn

Tyr

Tyr

Val

Ile

Tyr

Ser

Ser

Thr

Leu

Tyr

Arg

Gin

Gin

95

100

•

105

Glu

Ser

Gly

Arg

Alá

Trp

Phe

Leu

Gly

Leu

Asn

Lys

Glu

Gly

Gin

110

115

120

Ile

Met

Lys

Gly

Asn

Arg

Val

Lys

Lys

Thr

Lys

Pro

Ser

Ser

His

125

130

135

Phe

Val

Pro

Lys

Pro

Ile

Glu

Val

Cys

Met

Tyr

Arg

Glu

Pro

Ser

140

145

150

Leu

His

Glu

Ile

Gly

Glu

Lys

Gin

Gly

Arg

Ser

Arg

Lys

Ser

Ser

155

160

165

Gly

Thr

Pro

Thr

Met

Asn

Gly

Gly

Lys

Val

Val

Asn

Gin

Asp

Ser

170 175 180

Thr • ·

- 46 A 3. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 18 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: oligonukleotid

A 3. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

ATGCTTCCGG CTCGTATG 18

A 4. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 19 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: oligonukleotid

A 4. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GGGTTTTCCC AGTCACGAC 19

AZ 5. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 24 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: oligonukleotid • · ·· · ·· ···

- 47 AZ 5. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GTGAGATCTG AGGGAAGAAG GGGA

A 6. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 18 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: oligonukleotid

A 6. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CCACCGATAA TCCTCCTT

Claims (21)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Izolált polinukleotid, amely (a) a 2. azonosítószámú szekvenciaként bemutatott, leszármaztatott aminosav-szekvenciát vagy annak fragmensét, analógját vagy származékát kódoló polinukleotid; vagy (b) az ATCC 75696 deponálási számon letétbe helyezett klón bán található cDNS által kódolt aminosavszekvenciát tartalmazó polipeptidet vagy annak fragmensét,

   analógj át 2 . vagy Az származékát i kódoló polinukleotid. 1 . igénypont szerinti polinukleotid, amely DNS . 3 . Az 1 . igénypont szerinti polinukleotid, amely RNS . 4 . Az 1 . igénypont szerinti polinukleotid, amely

   genomi eredetű DNS.

   5. A 2. igénypont szerinti polinukleotid, amely a
2. 2. azonosítószámú szekvenciaként bemutatott, leszármaztatott aminosav-szekvenciát tartalmazó polipeptidet kódolja.
3. 6. A 2. igénypont szerinti polinukleotid, amely az ATCC 75696 deponálási számon letétbe helyezett klón cDNS-e által kódolt polipeptidet kódolja.
4. 7. Az 1. igénypont szerinti polinukleotid, amely az

   1. azonosítószámú szekvenciaként bemutatott kódolószekvenciát tartalmazza.
5. 8. A 2. igénypont szerinti polinukleotid, amely az

   ATCC 75696 deponálási számon letétbe helyezett polipeptid kódolószekvenciáját tartalmazza.

   • · · · · · · » · · · · ·« • · · · * ««· · ·* ·*»···

   - 49
6. 9. Vektor, amely 2. igénypont szerinti DNS-t tartalmaz .
7. 10. Gazdasejt, amely génsebészeti módszerek alkalmazásával 9. igénypont szerinti vektorral van manipulálva.
8. 11. Eljárás polipeptid előállítására, azzal jellemezve, hogy a 10. igénypont szerinti sejttel a vektorban található kódoló DNS által kódolt polipeptidet expresszáltatjuk.
9. 12. Eljárás polipeptidet expresszálni képes sejtek előállítására, azzal jellemezve, hogy sejteket 9. igénypont szerinti vektorral, génsebészeti módszerek alkalmazásával manipulálunk.
10. 13. Izolált DNS, amely 2. igénypont szerinti DNSsel hibridizálódni képes, és FGF-10-aktivitású polipeptidet kódol.
11. 14. Polipeptid, amely (a) a 2. azonosítószámú szekvenciaként bemutatott, leszármaztatott aminosav-szekvenciát tartalmazó polipeptid vagy annak fragmense, analógja vagy származéka; vagy (b) az ATCC 75696 deponálási számon letétbe helyezett kiónban található cDNS által kódolt polipeptid vagy annak fragmense, analógja vagy származéka.
12. 15. A 14. igénypont szerinti polipeptid, amely a 2.

    azonosítószámú szekvenciaként bemutatott, leszármaztatott aminosav-szekvenciát tartalmazó FGF-10-polipeptid.
13. 16. Antitest, amely a 14. igénypont szerinti polipeptid ellen irányul.

    • · · « r · · • · λ , · · « • · · · · ··· * · η ·'····

    - 50
14. 17. Vegyület, amely a 14. igénypont szerinti polipeptid agonistájaként hatásos.
15. 18. Vegyület, amely a 14. igénypont szerinti polipeptid antagonistájaként hatásos.
16. 19. Eljárás FGF-10 beadására szoruló páciens kezelésére, azzal jellemezve, hogy a páciensnek 14 . igénypont szerinti polipeptid hatásos mennyiségét beadjuk.
17. 20. Eljárás FGF-10 gátlására szoruló páciens kezelésére, azzal jellemezve, hogy a páciensnek 18. igénypont szerinti vegyület gyógyászati szempontból hatásos mennyiségét beadjuk.
18. 21. A 19. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a polipeptid gyógyászati szempontból hatásos mennyiségét a polipeptidet kódoló DNS beadásával és a polipeptid in vivő expresszáltatásával biztosítjuk.
19. 22. Eljárás az FGF-10 agonistájaként vagy antagonistajaként aktív vegyületek azonosítására, azzal jellemezve, hogy (i) FGF-10-et, a vizsgálni kívánt vegyületet és sejteket tartalmazó reakcióelegyet (amely reakcióelegy olyan jelölőanyagot tartalmaz, amely a sejtek proliterációja során a sejtekbe épül) olyan körülmények között elegyítünk, melyek között az FGF-10 normálisan stimulálja a sejteket; és (ii) meghatározzuk a sejtek proliferációjának mértékét, miáltal azonosítható, hogy a vizsgált vegyület hatásos agonista vagy antagonista-e.

    * · ·· · ·· ···

    - 51
20. 23. Eljárás a 14. igénypont szerinti polipeptid alacsony szintű expressziójával kapcsolatos betegség vagy ilyen betegségre való fogékonyság diagnosztizálására, azzal jellemezve, hogy a polipeptidet kódoló nukleinsavszekvenciában meghatározunk egy mutációt.
21. 24. Diagnosztikai eljárás, azzal jellemezve, hogy egy gazdaszervezetből származó mintában vizsgáljuk a 14. igénypont szerinti polipeptid jelenlétét.