JP3303211B2 - ｂＦＧＦムテインおよびその製造法 - Google Patents

ｂＦＧＦムテインおよびその製造法

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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、塩基性線維芽細胞成長
因子（以下、 bＦＧＦと略称することもある。）のムテ
イン，該ムテインの製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】bＦＧＦは分子量約１７０００の塩基性
ポリペ プチドであり、当初ＢＡＬＢ／c３Ｔ３細胞など
の線維芽細胞に強い増 殖促進作用を示す因子として分
離された［D．Gospodarowicz；ネイチャー（Nature）２
４９：１２３（１９７４）］。しかし、その後中胚葉由
来の殆んど全ての細胞に対して増殖促進作用を示すこと
が判明した［D．Gospodarowicz ら：ナシ ョナル・キャ
ンサー・インスティテュート・モノグラフ（National
Cancer Institute Monograph）４８；１０９（１９７
８）］。中でもbＦＧＦの血管新生 作用は細胞増殖促進
作用と相まって損傷の治療薬および血栓症，動脈硬化症
などの予防治療薬としての可能性を示すものである。
【０００３】ウシのbＦＧＦは、プロシーデングス・オ
ブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・ザ・ユナイテ
ッド・ステーツ・オブ・アメリカ（Proc. Natl. Acad.
Sci.ＵＳＡ），第８２巻 第６５０７−６５１１頁（１
９８５年）に発表され、また、サイエンス（Science）
２３３，５４５（１９８６）には、 ウシbＦＧＦのcＤＮ
Ａをクローン化し、これから推測されるウシbＦＧＦの
構成アミノ酸が示されている。ヒトbＦＧＦについて
は、バイオケミカル・アンド・バイオフイジカル・リサ
ーチ・コミュニケーションズ（Biochemical and Biophy
sical Research Communications），第１３５巻，５４
１頁（１９８６年）には、人の脳からヒトbＦＧＦを抽
出したことを報告している。また、ＥＭＢＯジャーナル
（European Molecular Biology Organization Journa
l）第５巻，２５２３頁（１９８６年）およびＰＣＴ国
際公開Ｎo. ＷＯ８７／０１７２８には、牛のbＦＧＦを
プローブとして用い、ヒトbＦＧＦのcＤＮＡをクロ ー
ン化し、これよりヒトbＦＧＦの構成アミノ酸を推定し
ている。さらに、フエブス・レターズ（FEBS Letters）
２１３，１８９（１９８７）、およびバイオケミカル・
アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーシ
ョンズ（Biochem. Biophys. Res. Commun. １４６ ４
７０−４７７（１９８７）にはヒトbＦＧＦのcＤＮＡを
クローン化し、形質転換体の培養によりヒトbＦＧ Ｆを
製造することが記載されている。（用いられたcＤＮＡ
の塩基配列およびヒ トbＦＧＦのアミノ酸配列を図１
（配列表：配列番号６）に示す。）
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明者らはアミノ酸
配列を修飾することによって、bＦＧＦの安定性，細胞
における産生能、分子当りの細胞増殖活性の上昇、さら
に未知の生物活性の賦活化がなされるであろうと考え
た。特に安定性に関しては多くの場合蛋白質の変性は、
その生物学的活性の消失を伴う。従って、蛋白質を医薬
品として用いようとする場合、蛋白質の高次構造の安定
性は重要な問題である。蛋白質の高次構造は、基本的に
はその一次構造によって決定されるものと考えられてお
り、高次構造の安定性は、主にアミノ酸側鎖間の、もし
くは側鎖−ポリペプチド主鎖間の相互作用、すなわち水
素結合、システイン残基間のＳ−Ｓ結合、静電的引力、
疎水結合によるものとされている。
【０００５】bＦＧＦには４個のＣys残基が含まれてい
るが、それらは活性に本質的なものではなく、又どの残
基も分子内Ｓ−Ｓ結合を形成していない（X. Zhu らSci
ence，２５１，９０−９３（１９９１））。従ってbＦ
ＧＦの高次構造は前記水素結合、静電的引力、疎水結合
等によってお り、共有結合（Ｓ−Ｓ結合）による強固
な拘束は受けていない。このことはbＦＧＦの分子内の
運動の自由度が大きく、この蛋白質が種々の物理的、化
学的条件によって変性しやすいことの大きな原因となっ
ている。
【０００６】先に妹尾ら（特開平２−１９３）はbＦＧ
Ｆ分子中の構成アミノ酸を他の種々のアミノ酸に置換す
る事によって、より安定なbＦＧＦムテインを得る事を
試みた。特にＣys残基をＳer等の残基に置換することに
よって、Ｃys残基が分子間または分子内の望ましくない
Ｓ−Ｓ結合を形成する可能性を減少ないし排除すること
による分子の安定化、さらにはbＦＧＦの精製効率の向
上を計って成功している。
【０００７】本発明者らは、bＦＧＦの構成アミノ酸を
別のアミノ酸、特にシステインに置換したムテインを作
製し、これら新たに導入したシステイン残基同志、もし
くはこれらのシステイン残基と元々bＦＧＦ分子中に存
在するシステイン残基間で、本来存在しなかったＳ−Ｓ
結合を新たに形成せしめる事により、bＦＧＦの高次構
造を固定し、安定化する事を考えた。
【０００８】
【課題を解決するための手段】蛋白質分子内に新たにＳ
−Ｓ結合を設ける場合、それに関与するシステイン残基
の側鎖の空間的な相互間距離は近接していなくてはなら
ない。このことより、Ｘ線結晶解析から得られる高次構
造に関する知見は非常に有用であり、目的とする性状を
有する蛋白質の創製に際し、論理的かつ能率的に研究を
進めることができる。本発明者らはbＦＧＦおよびその
ムテインの結晶化に成功し（特開平３−４７１９８）、
その立体構造の解析をした（H. Ago et al. Journal of
Biochemistry. １１０，３６０−３６３(１９９
１)）。
【０００９】本発明者らは、ここから得られた知見をも
とに、組換えＤＮＡ技術および、特定部位指向性変異
（Site directecl mutagenesis）により、修飾されたb
ＦＧＦのムテインを作製し、安定性の向上、細胞内での
産生能、活性の上昇および生物活性の変化につき鋭意研
究したところ、bＦＧＦまたはその活性誘導体を構成す
るアミノ酸のうち少なくとも１つのアミノ酸がシステイ
ンに置換されたムテインは、安定性が向上していること
を見い出し、この知見に基づいてさらに研究した結果、
本発明を完成した。
【００１０】本発明は、（１）bＦＧＦまたはその活性
誘導体を構成するアミノ酸のうち 少なくとも１つのア
ミノ酸がシステインに置換されたムテイン，（２）上記
（１）のムテインをコードする塩基配列を有する組換え
ＤＮＡ，（３）上記（２）の組換えＤＮＡを含むベクタ
ー，（４）上記（３）のベクターを保持する形質転換
体，（５）上記（４）の形質転換体を培地に培養するこ
とを特徴とする上記（１）のムテインの製造法，および
（６）上記（１）のムテインを酸化反応に付すことによ
り、上記（１）のムテインの分子内の２つのシステイン
の間でＳ−Ｓ結合を形成せしめたムテインの製造法であ
る。
【００１１】本発明の上記(１)のムテインとしては、
(７)置換により導入されたシステインがもう一方のシス
テインと相互にＳ−Ｓ結合形成可能な位置にあるムテイ
ンが好ましい。該（７）のムテインとしては、当該もう
一方のシステインがbＦＧＦを構成するシステインであ
るムテインが挙げられる。この場合の当該もう一方のシ
ステインとしては、ヒトやウシのｂＦＧＦの場合には第
２５位または第９２位のシステインが好ましい。また、
ヒトやウシのｂＦＧＦの場合には、当該もう一方のシス
テインが第２５位のときは、置換により導入されたシス
テインとしては第１１８位または第１３９位が好まし
く、当該もう一方のシステインが第９２位のときは、置
換により導入されたシステインとしては第７５位または
第８５位が好ましい。 該（７）のムテインとしては、
偶数個のシステインが１組毎にＳ−Ｓ結合形成可能な位
置に置換により導入されたムテインが挙げられる。この
ような場合のＳ−Ｓ結合形成可能な位置関係としては、
例えばヒトやウシのbＦＧＦの場合には、たとえば、２
０位−５２位；２１位−１４２位；２７位−１３５位；
３３位−５０位；４９位−６９位；８１位−１２６位が
挙げられる。上記偶数個としては、８個までの偶数個が
好ましく、４個までの偶数個がさらに好ましい。なお、
Ｓ−Ｓ結合を形成しないムテインを置換により導入した
場合を除外するものではない。さらに、本発明のムテイ
ンとしては、分子内の２つのシステインの間でＳ−Ｓ結
合を形成せしめたものが好ましい。
【００１２】本発明でいうbＦＧＦとしては、哺乳動物
由来のものが挙げられる。該哺乳動物としては、ヒト，
サル，ブタ，ウシ，ヒツジ，ウマなどが挙げられる。ま
た、該ＦＧＦとして、脳や下垂体などの既にその存在が
明らかにされている各種臓器から抽出されるものが挙げ
られる。また、該ＦＧＦとしては、組換えＤＮＡ技術に
より得られるものが挙げられる（フエブス・レターズ，
第２１３巻，１８９−１９４頁（１９８７年）；ヨーロ
ッパ特許出願公開第２３７，９６６号公報）。bＦＧＦ
の活性誘導体としては、bＦＧＦのムテインであって、b
ＦＧＦと同様の作用を有するものが挙げられる。該ＦＧ
Ｆムテインとしては、本来元のペプチドあるいは蛋白質
のアミノ酸配列が変異したものであり、したがって該変
異としては、アミノ酸の付加，構成アミノ酸の欠損，他
のアミノ酸への置換が挙げられる。該bＦＧＦのムテイ
ンとしては、たとえばバイオケミカル・アンド・バイオ
フイジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Bioche
mical and Biophyscal Research Communications）第１
５１巻，第７０１〜７０８頁（１９８８年），ヨーロッ
パ特許出願公開（以下、ＥＰと略称することもある。）
第２８１,８２２号公報，ＥＰ−３２６,９０７号公報，
ＥＰ−３９４,９５１号公報，ＥＰ−２９８,７２８号公
報，ＰＣＴ ＷＯ８９／０４８３２号公報などに記載さ
れたムテインが挙げられる。
【００１３】本発明のムテインを製造するためには、従
来の組換えＤＮＡ技術に加え、特定部位指向性変異誘発
技術（Sitedirected mutagenesis）が採用される。該技
術は周知であり、アール・エフ・レイサー（Lather，R.
F. ）及びジェイ・ピー・レコック（Lecoq，J. P.
），ジェネティック・エンジニアリング（Genetic Eng
ineering）、アカデミックプレス社（１９８３年）第３
１−５０頁、に示されている。オリゴヌクレオチドに指
示された変異誘発はエム・スミス（Smith，M. ）及びエ
ス・ギラム（Gillam，S. ）、ジェネティック・エンジ
ニアリング：原理と方法、プレナムプレス社（１９８１
年）３巻 １−３２頁に示されている。本発明のムテイ
ンをコードする構造遺伝子を製造するためには、たとえ
ば、（a）bＦＧＦの構造遺伝子の１本鎖からなる１本鎖
ＤＮＡを突然変異オリゴヌクレオチドプライマーと雑種
形成させる、（b）ＤＮＡポリメラーゼによりプライマ
ーを伸長させ、突然変異性ヘテロ二量体（heteroduple
x）を形成させる、及び（c）この突然変異性ヘテロ二量
体を複製する、などの方法が挙げられる。オリゴヌクレ
オチドプライマーの大きさは、突然変異を導入すべき遺
伝子領域へのプライマーの安定な雑種形成に必要な条件
により、また現在利用可能なオリゴヌクレオチド合成法
の限界によって決まる。オリゴヌクレオチドで指示され
る突然変異誘発に使用するオリゴヌクレオチドを設計す
るに当たって、考慮すべき因子（例えば全体の大きさ、
突然変異サイトを迂回する部分の大きさ）は、エム・ス
ミス及びエス・ギラム（前掲）によって記述されてい
る。概して、オリゴヌクレオチドの全長は、突然変異サ
イトでの安定でユニークな雑種形成を最適化するような
長さであり、突然変異サイトから５′及び３′末端まで
の伸長部分（extensions）は、ＤＮＡポリメラーゼのエ
キソヌクレアーゼ活性による突然変異の編集をさけるの
に十分な大きさとする。本発明に従って突然変異誘発に
使用されるオリゴヌクレオチドは、通常、約１２個ない
し約２４個の塩基、好ましくは約１４個ないし約２０個
の塩基、更に好ましくは約１４個ないし約１８個の塩基
を含有する。これらは通常、変更されるコドンの少なく
とも約３個の塩基３′側を含有する。
【００１４】たとえば、構成アミノ酸がロイシンであっ
て、これをシステインに置換したムテインを得る目的の
場合には、ロイシンのコドンをシステインのコドンに変
更させる合成ヌクレオチドプライマーを用いて、部位指
向性変異誘発を行うことにより、変更bＦＧＦ遺伝子を
つくればよい。たとえば、ヒトbＦＧＦのロイシン（１
１８位）をシステインに変えるために、プライマーをＦ
ＧＦ遺伝子のセンス鎖と雑種形成させる。たとえば、好
ましいヌクレオチドプライマーとしては５'−ＣＡＧＴ
ＴＣＧＴＴＴＧ ＣＡＴＧＣＣＡＣＡＴＡＣ−３′（配列
表：配列番号２）が挙げられる（下線は変更されたコド
ンを示す）。フェニルアラニン（１３９位）をシステイ
ンに変えるときの好ましいプライマーとしては５'−Ｃ
ＡＴＴＧＧＡＡＧＡＣＡＡＡＧＴＡＴＡＧＣ−３′（配
列表：配列番号３）が挙げられる。（下線は変更された
コドンを示す）。アラニン（７５位）をシステインに変
えるときの好ましいプライマーとしては５'−ＴＴＣＣ
ＴＴＣＡＴＡＣＡＣＡＧＧＴＡＡＣＧＡ−３′（配列
表：配列番号４）が挙げられる。（下線は変更されたコ
ドンを示す）。セリン（８５位）をシステインに変える
ときの好ましいプライマーとしては５'−ＡＡＣＡＧＡ
ＣＴＴＧＣＡＴＧＣＴＡＧＴＡＡＴＣＴ−３′（配列
表：配列番号５）が挙げられる （下線は変更されたコ
ドンを示す）。
【００１５】プライマーは、bＦＧＦ遺伝子の１本鎖が
クローン化されたＭ１３〔Yanisch−Perror，C.，Vieir
a，J. Messing，ジーン（Gene），３３ １０３−１１
９（１９８５），Messing J. メソッズ・イン・エンジ
ーモロジー（Methods in Enzymology），１０１ ２０
−７８（１９８３）〕，fd〔R. Ｈerrman et al. モレ
キュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティック（Mol.
Gen. Genet.），１７７２３１（１９８０）〕，又はφ
×１７４〔M. Smith and S. Gillam，ジェネティック・
エンジニアリング（Genetic Engineering），Plenum Pr
ess，Vol．３，ppl−３２（１９８１）〕のような１本
鎖ファージあるいは、pＵＣ１１８、pＵＣ１１９［J. V
ieira, J. Messing, メソッズ・イン・エンザイモロジ
ー（Methodsin Enzymology），１５３，３−１１（１９
８７）］といったファージとプラスミドのキメラベクタ
ーへ雑種形成される。ファージが遺伝子のセンス鎖、ア
ンチセンス鎖のいずれでも運搬できることは認められ
る。ファージがアンチセンス鎖を運搬する時には、別の
アミノ酸を暗号づけたトリプレットを決定するこのコド
ンとの不一致以外にもプライマーは突然変異させるコド
ンを含有するセンス鎖の領域とコドンの縮退のために同
一でない場合があってもよい。同様にファージがセンス
鎖を運搬する時には、欠損させるコドンと対合をつくる
トリプレット中の適当な不一致以外は、突然変異させる
コドンを含有するセンス鎖の領域に対して相補的でない
場合があってもよい。雑種形成に使用される条件はエム
・スミス及びエス・ギラム（前掲）によって記述されて
いる。温度は通常、約０℃ないし７０℃、もっと一般的
には約１０℃ないし５０℃の範囲にある。雑種形成後、
プライマーは大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔ４ＤＮＡ
ポリメラーゼ、逆転写酵素又は他の適当なＤＮＡポリメ
ラーゼとの反応によってファージＤＮＡ上で伸長され
る。生ずるdsＤＮＡは、Ｔ４ＤＮＡリガーゼのようなＤ
ＮＡリガーゼでの処理によって閉鎖環dsＤＮＡへ変換さ
れる。１本鎖領域を含有するＤＮＡ分子はＳ１エンドヌ
クレアーゼ処理によって破壊できる。生ずる突然変異成
形ヘテロ二量体は、被感染能力をもつ宿主生物又は細胞
を形質転換するのに使用される。宿主によるヘテロ二量
体の複製では、双方の鎖から子孫ができる。複製に続い
て、突然変異株の鎖の子孫から突然変異株遺伝子を単離
し、適当なベクターへ挿入し、このベクターを適当な宿
主生物又は細胞の形質転換に使用する。
【００１６】次に、突然変異化された遺伝子を運搬する
ファージＤＮＡを単離し、プラスミドへ組み込む。ＤＮ
Ａを組み込むプラスミドとしては、たとえば大腸菌由来
のpＢＲ３２２［ジーン（gene），２，９５（１９７
７）］，pＢＲ３２５［ジーン，４，１２１（１９７
８）］，pＵＣ１２［ジーン，１９，２５９（１９８
２）］，pＵＣ１３［ジーン，１９，２５９（１９８
２）］、枯草菌由来のpＵＢ１１０［バイオケミカ ル・
バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーション（Ｂ
iochemical andＢiophysical Ｒesearch Ｃommunicatio
n），１１２，６７８（１９８３）］などが 挙げられる
が、その他のものであっても、宿主内で複製保持される
ものであれば、いずれをも用いることができる。プラス
ミドに組み込む方法としては、たとえば、Ｔ．Ｍaniati
s ら，モレキュラー・クローニング（Ｍolecular Ｃlon
ing）コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー
（Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌaboratory），第２３９頁
（１９８２）に記載の方法などが挙げられる。
【００１７】クローン化された遺伝子は、発現に適した
ビークル（ベクター）中のプロモーターの下流に連結し
て発現型ベクターを得ることができる。ベクターとして
は、上記の大腸菌由来のプラスミド（例、pＢＲ３２
２，pＢＲ３２５，pＵＣ１２， pＵＣ１３），枯草菌由
来プラスミド（例、pＵＢ１１０，pＴＰ５，pＣ１９
４），酵母由来プラスミド（例、pＳＨ１９，pＳＨ１
５），あるいはλファージなどのバクテリオファージお
よびレトロウイルス，ワクシニアウイルスなどの動物ウ
イルスなどがあげられる。該遺伝子はその５′末端に翻
訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３′末端には
翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを
有していてもよい。さらに該遺伝子を発現させるにはそ
の上流にプロモーターを接続する。本発明で用いられる
プロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対
応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよ
い。また、形質転換する際の宿主がエシェリキア属菌で
ある場合は、trpプロモーター，lacプロモーター，rec
Ａプロモーター，λＰＬプロモーター，lppプロモータ
ー，ファージＴ７φ１０プロモーターなどが、宿主がバ
チルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター，ＳＰ
Ｏ２プロモーター，penＰプロモーターなど、宿主が酵
母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター，ＰＧＫプロモ
ーター，ＧＡＰプロモーター，ＡＤＨプロモーターなど
が好ましい。とりわけ宿主がエシェリキア属菌でプロモ
ーターがtrpプロモーターまたはλＰＬプロモーターま
たはファ ージＴ７φ１０プロモーターであることが好
ましい。宿主が動物細胞である場合には、ＳＶ４０由来
のプロモーター、レトロウイルスのプロモーターなどが
挙げられ、とりわけＳＶ４０由来のプロモーターが好ま
しい。
【００１８】このようにして構築されたムテインをコー
ドする塩基配列を有する組換えＤＮＡをを含むベクター
を用いて、該ベクターを保持する形質転換体を製造す
る。宿主としては、たとえばエシェリキア属菌，バチル
ス属菌，酵母，動物細胞などが挙げられる。上記エシェ
リキア属菌の例としては、エシェリキア・コリ（Ｅsche
richia coli）Ｋ１２ＤＨ１［Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓ
ci．ＵＳＡ，６０，１６０（１９６８）］，ＪＭ１０３
［ヌクレイック・アシッズ・リサーチ，（Ｎucleic Ａc
idsＲesearch）９，３０９（１９８１）］，ＪＡ２２１
［ジャーナル・オブ・モレキュラー・ハ゛イオロシ゛ー(Journal of Ｍol
ecular Ｂiology）１２０，５１７（１９７８）］，Ｈ
Ｂ１０１［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロ
ジー，４１，４５９（１９６９）]，Ｃ６００［ジェネ
ティックス（Ｇenetics），３９，４４０（１９５
４）］，ＭＭ２９４［Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．Ｕ
ＳＡ ７３，４１７４（１９７６）］，ＭＭ２９４（Ｄ
Ｅ３）／pＬysＳ［特開平３−４３０８８］などが挙げ
られる。上記バチルス属菌としては、たとえばバチルス
・サチルス（Ｂacillus subtilis）ＭＩ １１４［（ジ
ーン，２４，２５５（１９８３）］，２０７−２１［ジ
ャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊournal of Ｂ
iochemistry）９５，８７（１９８４）］などが挙げら
れる。上記酵母としては、たとえばサッカロマイセス
セレビシアエ(Ｓaccharomyces cerevisiae)ＡＨ２２
Ｒ-,ＮＡ８７−１１Ａ,ＤＫＤ−５Ｄなどが挙げられる。
動物細胞としては、たとえばサル細胞ＣＯＳ−７，Ｖer
o，チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ，マウスＬ細
胞，ヒトＦＬ細胞などが挙げられる。
【００１９】上記エシェリキア属菌を形質転換するに
は、たとえばＰroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ，６
９，２１１０（１９７２），ジーン，１７，１０７（１
９８２）などに記載の方法に従って行なわれる。バチル
ス属菌を形質転換するには、たとえばモレキュラー・ア
ンド・ジェネラル・ジェネティックス（Ｍolecular ＆
Ｇeneral Ｇenetics），１６８，１１１（１９７９）な
どに記載の方法に従って行なわれる。酵母を形質転換す
るには、たとえばＰroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ
７ ５；１９２９（１９７８）に記載の方法に従って行
なわれる。動物細胞を形質転換するには、たとえばヴィ
ロロジー（Ｖirology）５２，４５６（１９７３）に記
載の方法に従って行なわれる。このようにして、ムテイ
ンをコードする塩基配列を有する組換えＤＮＡを含むベ
クターを保持する形質転換体が得られる。
【００２０】該形質転換体を培地に培養することによ
り、ムテインを産生させる。宿主がエシェリキア属菌，
バチルス属菌である形質転換体を培養する際、培養に使
用される培地としては液体培地が適当であり、その中に
は該形質転換体の生育に必要な炭素源，窒素源，無機物
その他が含有せしめられる。炭素源としては、たとえば
グルコース，デキストリン，可溶性澱粉，ショ糖など、
窒素源としては、たとえばアンモニウム塩類，硝酸塩
類，コーンスチープ・リカー，ペプトン，カゼイン，肉
エキス，大豆粕，バレイショ抽出液などの無機または有
機物質，無機物としてはたとえば塩化カルシウム，リン
酸二水素ナトリウム，塩化マグネシウムなどがあげられ
る。また、酵母，ビタミン類，生長促進因子などを添加
してもよい。培地のpＨは約６〜８が望ましい。エシェ
リキア属菌を培養する際の培地としては、例えばグルコ
ース、カザミノ酸を含むＭ９培地［Ｍiller，ジャーナ
ル・オブ・エクスペリメンツ・イン・モレキュラー・ジ
ェネティックス（Ｊournal of Ｅxperiments in Ｍolec
ular Ｇenetics），４３１−４３３，Ｃold Ｓpring Ｈ
arbor Ｌaboratory，Ｎew Ｙork１９７２）］が好まし
い。ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせる
ために、たとえば３β−インドリル アクリル酸やイソ
プロピルβＤ−チオガラクトピラノシドのような薬剤を
加えることができる。宿主がエシェリキア属菌の場合、
培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行い、必要
により、通気や撹拌を加えることもできる。宿主がバチ
ルス属菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２
４時間行ない、必要により通気や撹拌を加えることもで
きる。
【００２１】宿主が酵母である形質転換体を培養する
際、培地としては、たとえばバークホールダー（Ｂurkh
older）最小培地［Ｂostian，Ｋ．Ｌ．ら，Ｐroc．Ｎat
l．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ，７７，４５０５（１９８
０）］が挙げられる。培地のpＨは約５〜８に調整する
のが好ましい。培養は通常約２０℃〜３５℃で約２４〜
７２時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。宿主
が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地として
は、たとえば約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培
地［サイエンス（Ｓcience）１２２，５０１（１９５
２）］，ＤＭＥＭ培地［ヴィロロジー（Ｖirology），
８，３９６（１９５９）］，ＲＰＭＩ１６４０培地［ジ
ャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル・アソシ
エーション（Ｔhe Ｊournal of the Ａmerican Ｍedica
l Ａssociation）１９９，５１９（１９６７）］，１９
９培地［プロシーディング・オブ・ザ・ソサイエティ・
フォー・ザ・バイオロジカル・メディスン（Ｐroceedin
g of the Ｓociety for the Ｂiologcal Ｍedicine）７
３，１（１９５０）］などが挙げられる。pＨは約６〜
８であるのが好ましい。培養は通常約３０〜４０℃、培
養時間は約１５〜６０時間行い、必要に応じて通気や撹
拌を加える。
【００２２】上記培養物からムテインを分離精製するに
は、例えば下記の方法により行うことができる。まず、
培養菌体あるいは細胞を破壊し内容物を抽出する。これ
には、フレンチプレス，超音波，リゾチーム，凍結融
解，ガラスビーズなどを用いる多数の方法があるが、ど
の方法でもよい。とりわけリゾチームと超音波を併用す
る方法が好ましい。菌体、あるいは細胞を破壊する際
に、緩衝液中にジチオスレイトールなどの還元剤を添加
すると、目的とするムテインの回収率が上がることがあ
る。還元剤の濃度は１mＭから１００mＭ程度がよい。た
だし、リゾチームを用いる場合は、リゾチームを作用さ
せた後に添加する。
【００２３】次に、上記細胞抽出液を、遠心分離により
上清と沈澱に分ける。上清にムテインが回収されている
場合は、たとえば、M. Iwane らの文献［Biochem. Biop
hys.Res. Commun. １４６，４７０−４７７（１９８
７）］に記載の方法と同様な方法により、有効に精製で
きる。ムテインが沈澱に回収される場合は、この沈澱を
塩酸グアニジンなどの蛋白質変性剤を含む溶液で溶解し
た後に、透析または希釈により変性剤の濃度を下げれ
ば、生理活性を有するムテインを得ることができる。沈
澱から回収したムテインは、必要に応じて精製操作を加
えることにより、上清から回収されたムテインと同様に
高純度で高活性な製品となる。
【００２４】精製過程、あるいは保存過程での微量な還
元剤の共存は、該製品の酸化を防ぐのに好適である場合
がある。しかし、アミノ酸置換により新たに導入された
Ｃys残基がbＦＧＦの立体構造から予想される通りのＳ
−Ｓ結合を形成するためには、精製過程のいずれかの段
階で還元剤を除くか、あるいは始めから添加せずに精製
する。回収率および純度の点から、細胞を破壊する際と
精製の初期段階は還元剤を添加し、精製の途中で還元剤
を除くのが好ましい。該ムテインは、還元剤の非存在下
では、新たに導入したＣys残基間、または新たに導入し
たＣys残基と既存のＣys残基の間で、一部自発的にＳ−
Ｓ結合を形成するため、精製過程で還元剤を除いた最終
精製製品は一般に、Ｓ−Ｓ結合を形成したムテイン（酸
化型ムテイン）とＳ−Ｓ結合を持たないムテイン（還元
型ムテイン）の混合物である。多くの場合、還元型ムテ
インも、野生型bＦＧＦと同程度の生物活性を有してい
るが、下記のような方法で積極的にＳ−Ｓ結合を形成せ
しめることにより、ほとんどが酸化型ムテインである製
品を作ることができ、発明の目的が達成される。
【００２５】分子内の２つのシステインの間でＳ−Ｓ結
合を形成せしめる方法としては、空気酸化による方法や
グルタチオン酸化還元緩衝液を用いる方法［V. P. Saxe
na,D. B. Wetlaufer；バイオケミストリー（Biochemist
ry）９：５０１５（１９７０）］が挙げられるが、特に
後者が好ましい。ムテインを含む溶液と適切な濃度のグ
ルタチオン酸化還元緩衝液を混合して適切な温度で静置
すると、還元型ムテインは速やかに酸化型に移行する。
具体的には、酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧと略記）と
還元型グルタチオン（ＧＳＨと略記）の最終濃度の和が
０.１mＭから１００mＭで、ＧＳＳＧとＧＳＨの濃度比
が０.０５から５の範囲で、pＨは７か ら９が好まし
く、少量のＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を共存
させてもよい。温度は個々のムテインにより適切な温度
に差があるが、４℃から４０℃の間が良い。また、１Ｍ
から３Ｍ程度の尿素を共存させると目的とするＳ−Ｓ結
合が効率よく形成されることがある。反応を止めるに
は、pＨを６付近に下げるか、 透析やゲル濾過によりグ
ルタチオンを除けばよい。上記空気酸化による方法とし
ては、たとえばトリス塩酸などの適切な緩衝液でムテイ
ンを含む溶液のｐＨを７から１０、より好ましくは８か
ら９の間に調節し、溶液が空気と接する状態で静置すれ
ばよい。その際０．１μＭから１ｍＭの金属イオン（た
とえば銅）を共存させること、Ｓ−Ｓ結合形成に要する
時間を短縮することができる。また、溶液中に空気また
は酸素を導いて、静かに泡を立てることも有効である。
温度は、ムテインが変性しない温度ならばどのような温
度でもよく、好ましくは０℃から４０℃の間である。上
記のＳ−Ｓ結合を形成させる操作は、ムテインの精製操
作のどの段階で行なっても良く、ムテインの純度、およ
び濃度には制約はない。
【００２６】本発明のムテインは線維芽細胞の増殖を促
進させる作用，血管内皮細胞の増殖を促進させる作用，
血管を新生させる作用を有し、安定性が高く、毒性は低
いので火傷，創傷，術後組織などの治癒促進剤，あるい
は血管新生作用による血栓症や動脈硬化症などの治療薬
として用いることができる。また、細胞培養を促進させ
るための試薬として用いることができる。本発明のムテ
インを医薬として用いるには、そのまま粉末として、ま
たは他の薬理学的に許容されうる担体，賦形剤，希釈剤
とともに医薬組成物（例、注射剤，錠剤，カプセル剤，
液剤，軟膏）として、温血動物（例、ヒト，マウス，ラ
ット，ハムスター，ウサギ，犬，ネコ）に対して非経口
的または経口的に安全に投与することができる。注射剤
の製剤化はたとえば生理食塩水またはブドウ糖やその他
の補助薬を含む水溶液を用い、常法に従って行なわれ
る。錠剤，カプセル剤等の医薬組成物も常法に従って調
製しうる。本発明のムテインを上記した医薬として用い
る場合には、たとえば上記した温血動物に、投与ルー
ト，症状などを考慮して、１日量約１ngないし１００μ
g/kgの中から適当量を選んで投与される。また、本発明
のムテインを細胞培養を促進させるための試薬として用
いる場合、培地１リットルあたり約０.０１〜１０μg、
さらに好ましくは約０.１〜１０μgとなるように培地に
加えることが好ましい。
【００２７】本発明明細書および図面において、塩基や
アミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵ
Ｂ Ｃommision on Ｂiochemical Ｎomenclatureによる
略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくもので
あり、その例を下記する。また、アミノ酸に関し光学異
性体がありうる場合は、特に明示しなければＬ−体を示
すものとする。また、略号を次に示す。 ＤＮＡ ：デオキシリボ核酸 cＤＮＡ ：相補的デオキシリボ核酸 Ａ ：アデニン Ｔ ：チミン Ｇ ：グアニン Ｃ ：シトシン ＲＮＡ ：リボ核酸 dＡＴＰ ：デオキシアデノシン三リン酸 dＴＴＰ ：デオキシチミジン三リン酸 dＧＴＰ ：デオキシグアノシン三リン酸 dＣＴＰ ：デオキシシチジン三リン酸 ＡＴＰ ：アデノシン三リン酸 Ｔdr ：チミジン Ｇ，Ｇly ：グリシン Ａ，Ａla ：アラニン Ｖ，Ｖal ：バリン Ｌ，Ｌeu ：ロイシン Ｉ，Ｉle ：イソロイシン Ｓ，Ｓer ：セリン Ｔ，Ｔhr ：スレオニン Ｃ，Ｃys ：システイン Ｍ，Ｍet ：メチオニン Ｅ，Ｇlu ：グルタミン酸 Ｄ，Ａsp ：アスパラギン酸 Ｋ，Ｌys ：リジン Ｒ，Ａrg ：アルギニン Ｈ，Ｈis ：ヒスチジン Ｆ，Ｐhe ：フェニールアラニン Ｙ，Ｔyr ：チロシン Ｗ，Ｔrp ：トリプトファン Ｐ，Ｐro ：プロリン Ｎ，Ａsn ：アスパラギン Ｑ，Ｇln ：グルタミン ＥＤＴＡ ：エチレンジアミン四酢酸 ＳＤＳ ：ドデシル硫酸ナトリウム ＰＡＧＥ ：ポリアクリルアミド電気泳動 ＤＭＥＭ ：ダルベッコ変法イーグル培地 Ｔris ：トリスヒドロキシメチルアミノメタン ＨＰＬＣ ：高速液体クロマトグラフィー なお、本願にあっては、ヒトbＦＧＦのアミノ酸配列に
おけるアミノ酸の番号は、〔図１〕（配列表：配列番号
６）に示されるアミノ酸配列のＮ末端のＰroを１と数え
るものとする。また、ウシｂＦＧＦ（Proc. Natl. Aco
d. Sci. USA ８ ２, ６５０７（１９８５）） のアミノ
酸配列におけるアミノ酸の番号は、Ｎ末端のＰroを１と
数えるものとする。
【００２８】以下に示す実施例において製造された形質
転換体のうち、受託番号の付されているものは、財団法
人発酵研究所（ＩＦＯ）および通商産業省工業技術院微
生物工業技術研究所（ＦＲＩ）に寄託されている。それ
らの受託番号および受託日を次の表１に示す。なお、表
１において、ＦＥＲＭ ＢＰ番号で示されている寄託
は、ブダペスト条約に基づく寄託を示す。
【表１】 ─────────────────────────────────── 形質転換体 ＩＦＯ ＦＲＩ ─────────────────────────────────── E. coli K12MM294(DE3)/pLysS, IFO 15084 FERM BP-3372 pBFM2 (実施例２) (平成2年8月28日) (平成3年4月20日) E. coli MM294(DE3)/pLysS, IFO 15276 FERM BP-3802 pBFM4 (実施例４) (平成4年3月10日) (平成4年3月18日) E. coli K12MM294(DE3)/pLysS, IFO 15085 FERM BP-3371 pBFM5 (実施例５) (平成2年8月28日) (平成3年4月20日) ───────────────────────────────────
【００２９】実施例１ 特定部位指向性変異誘発を行う
ための、ＮdeＩサイトを有するプラスミドpＵＣＮ２３
の構築 （１）hbＦＧＦムテインＣＳ２３のcＤＮＡのプラスミ
ドベクターpＵＣ１１８Ｂへの組込み：ヒトbＦＧＦの６
９位および８７位のＣysがＳerに置換されたヒトbＦＧ
ＦムテインＣＳ２３［M. Senoら，バイオケミカル・ア
ンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーショ
ンズ，１５１，７０１−７０８（１９８８）］（以下、
「ＣＳ２３」と略称することもある。）のcＤＮＡが組
み込まれたファージベクターＭ１３mp８から、制限酵素
ＥcoＲＩとＰstＩで消化することによりＣＳ２３のcＤ
ＮＡを含む０.５キロベースペアのＤＮＡ断片を得た。
次に、一本鎖調製用プラスミドベクターpＵＣ１１８の
マルチクローニングサイトにあるＨind III部位を部位
指向性変異誘発によりＢgl II部位に変異させたベクタ
ーpＵＣ１１８Ｂ［pＵＣ１１８ＢはpＴＢ８９１として
特開平２−２０９８９４号公報に記載。］をＥcoＲＩと
ＰstＩにより消化し、上述のＣＳ２３遺伝子を含むＤＮ
Ａ断片と混ぜ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより連結した。連
結したＤＮＡを用いて大腸菌ＭＶ１１８４を形質転換
し、Ｘgalを指示種とするプレート上に播き、正しくＣ
Ｓ２３遺伝子がpＵＣ１１８Ｂに挿入された組換えプラ
スミドpＵＣＢ２３を含む白色のコロニーを選択した。
こうして得られたクローンは、ヘルパーファージＫＯ７
を感染させることにより、hbＦＧＦムテインＣＳ２３を
コードするＤＮＡのプラス鎖を含む、一本鎖状pＵＣＢ
２３をファージ粒子の形で培地に放出する。この一本鎖
ＤＮＡを精製して、部位指向性変異誘発の鋳型として用
いた。なお、ここで用いた大腸菌ＭＶ１１８４，ヘルパ
ーファージＫＯ７は、J. Vieira, J. Messing, メソッ
ズ・イン・エンザイモロジー（Methods in Enzymolog
y），１５３，３−１１（１９８７）に記載されてい
る。
【００３０】（２）制限酵素ＥcoＲＩ部位のＮdeＩへの
変換 大腸菌菌体内で外来遺伝子を大量に発現させる系とし
て、ファージＴ７のＲＮＡポリメラーゼを利用する方法
が有効であることが知られている［F. W. Studier，B.
A. Moffatt，ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオ
ロジー（J. Mol.Biol.），１８９，１１３−１３０（１
９８６）］。この方法に用いられている発現用プラスミ
ドpＥＴ３cに目的とする遺伝子を挿入するためには、そ
の遺伝子の上流側に制限酵素ＮdeＩ部位があると便利で
ある。（１）で得られたpＵＣＢ ２３のＣＳ２３遺伝子
の翻訳開始コドンのすぐ上流にあるＥcoＲＩ部位をＮde
Ｉに変換するためにオリゴヌクレオチド１： ５'−ＴＧＣＴＧＧＣＡＴＡＴＧＡＴＴＣＧＴＡＡＴＣ−３′ ＮdeＩ （配列表：配列番号１）を合成した（２（ａ））。この
オリゴヌクレオチド５０ピコモルを１mＭ ＡＴ Ｐ，５
０mＭトリスヒドロキシメチルアミノメタン塩酸塩pＨ
８.０，１０mＭ ＭgＣl2，５mＭジチオスレイトール
（ＤＴＴ），および１０単位Ｔ４キナーゼ存在下に、３
７℃３０分間静置して５′ＯＨ末端をリン酸化した。こ
のうち４ピコモルを用い上記（１）で調製したＣＳ２３
遺伝子を含む一本鎖pＵＣＢ２３ ５μgを鋳型として、
アマシャム社製，オリゴヌクレオチド・デイレクテッド
・インビトロ・ミュータジェネシス・システム・バージ
ョン２（部位指向性変異誘発のためのキット）を使って
変異の導入を行った。得られた２本鎖環状ＤＮＡで大腸
菌ＭＶ１１８４を形質転換して多数のクローンを得た。
そのうちのいくつかを２倍濃度ＹＴ培地３mlにて３７℃
１５時間培養した後、プラスミドＤＮＡを精製し、制限
酵素ＥcoＲＩとＢamＨＩで消化しても断片が生成せず、
ＮdeＩとＢamＨＩで消化すると断片が生成するクローン
を選択した。こうして、pＵＣＢ２３のＥco ＲＩ部位が
ＮdeＩ部位に変換されたプラスミドpＵＣＮ２３が得ら
れた（図３および図４）。
【００３１】実施例２ （ムテインＢＦＭ２をコードす
る遺伝子の製造とその大腸菌における発現） ヒトbＦＧＦおよびhbＦＧＦムテインＣＳ２３の立体構
造を詳しく観察した結果、２５位のＣys残基の側鎖の近
傍には１１８位のＬeu残基の側鎖があることがわかっ
た。したがって、１１８位のＬeuをＣysに置換すること
により、２５位のＣysとの間にジスルフィド結合を形成
させ得ると考えた。１１８位のＬeuをＣysに変換したム
テインをＢＦＭ２と名付け、以下にその遺伝子の製造法
ならびに、大腸菌での発現について記す。 （１）ムテインＢＦＭ２をコードする遺伝子の製造 まず、１１８位のＬeuのコドンをＣysのコドンに変換す
るためにオリゴヌクレオチド２： ５'−ＣＡＧＴＴＣＧＴＴＴＧＣＡＴＧＣＣＡＣＡＴＡＣ−３′ ＳphＩ （配列表：配列番号２）を合成した（図２(ｂ)）。Ｔ４
キナーゼ処理により５′ＯＨ末端をリン酸化した上記合
成オリゴヌクレオチド（４ピコモル）と、実施例１
（２）で作製した一本鎖状のpＵＣＮ２３（５μg）を用
いて、実施例１に記述した部位指向性変異誘発キットに
より、変異を導入したプラスミドを得た。このプラスミ
ドで常法により大腸菌ＭＶ１１８４を形質転換し、１５
０μg／mlのアンピシリンを含む２倍 ＹＴ培地寒天プレ
ートに播いて３７℃１５時間培養し、多数のコロニーを
得た。そのうち６つのコロニーから少量の菌体を取って
０.３mlの２倍ＹＴ培地で約５ 時間培養した。この培養
液３０μｌとヘルパーファージＫＯ７を含む溶液３０μ
ｌを混合して３７℃に１時間静置し、３mlの２倍ＹＴ培
地を加えて一晩培養した。培養液を遠心操作で上清と菌
体に分け、菌体からはプラスミドをアルカリ法で粗精製
し、上清からは、常法によりファージ粒子として存在す
る一本鎖ＤＮＡを回収した。前述のオリゴヌクレオチド
２には、鋳型となるhbＦＧＦムテインＣＳ２３をコード
する遺伝子中に存在しなかった制限酵素ＳphＩ認識部位
が含まれている。したがって正しく変異が導入されたプ
ラスミドにＳphＩを作用させると、変異により新たに生
じたＳphＩ部位とpＵＣ１１８Ｂのマルチクローニング
部位に始めから存在するＳphＩ部位の２ケ所で切断さ
れ、１２１塩基対の断片が生じるはずである。前述の６
つのコロニーから得たプラスミドをＳphＩで消化し、ア
ガロースゲル電気泳動で分析したところ、２つのクロー
ンで正しい大きさの断片が見られた。さらに、この２つ
のクローンの一本鎖状プラスミドを鋳型として、ジデオ
キシ法により塩基配列を分析した結果、目的とする変異
が導入されていることを確認した。こうして得られたＢ
ＦＭ２をコードする遺伝子を含むプラスミドをpＵＣＢ
ＦＭ２と称する（図５）。
【００３２】（２）大腸菌での発現用プラスミドpＢＦ
Ｍ２の構築 （１）で得られたpＵＣＢＦＭ２を制限酵素ＮdeＩおよ
びＢgl IIで消化して、ムテインＢＦＭ２をコードする
約０.５kbpの断片を得た。これをアガロースゲル電気泳
動で精製した後、前もって制限酵素ＮdeＩとＢamＨＩで
消化しておいた発現用プラスミドベクターpＥＴ３c［F.
W. Stadier らメソッズ・イン・エンザイモロジー（Me
thods in Enzymology），１９５，６０−８９（１９９
０）］に、Ｔ４リガーゼにより結合させた。この際、ム
テインをコードするＤＮＡ断片のＢgl II消化によって
生じた粘着末端と、pＥＴ３cのＢamＨＩ消化によって生
じた粘着末端とは、完全に相補的な配列になっており、
リガーゼ処理により目的とする環状ＤＮＡが生じること
になる。ただし、Ｂgl II部位とＢamＨＩ部位が結合し
た後では、もはやどちらの酵素でも切断できなくなるこ
とに注意する。こうして得られた発現用プラスミドをp
ＢＦＭ２と称する（図６）。大腸菌ＭＭ２９４株に、Ｔ
７ファージのＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を組み込んだλ
ファージＤＥ３［Studier, F. W. ら, J. Mol. Biol：
１８９，１１３−１３０（１９８６）］を溶原化させ、
さらにＴ７ファージのリゾチーム遺伝子をもつプラスミ
ド pＬysＳ( Studier, F. W. ら, Mol. Biol. １８９，
１１３−１３０(１９８６))を導入し、大腸菌( Escheri
chia coli )ＭＭ２９４(ＤＥ３)／pＬysＳ 株を作成し
た。該プラスミドｐＢＦＭ２を用いて大腸菌ＭＭ２９４
（ＤＥ３）／pＬysＳを形質転換することにより、図７
（配列表：配列番号７）に示すムテインをコードする遺
伝子を含有するプラスミドを持つ大腸菌ＭＭ２９４（Ｄ
Ｅ３）／pＬysＳ，pＢＦＭ２（ＩＦＯ １５０８４，Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−３３７２）を得た。
【００３３】（３）ムテインＢＦＭ２の発現 前記菌体ＭＭ２９４（ＤＥ３）／pＬysＳ，pＢＦＭ２
を、３５μg／mlのアンピシリンと１０μg／mlのクロラ
ムフェニコールを含むＬＢ培地３ml中で一晩培養し、そ
のうち２.５mlを５０mlのＬＢ培地（３５μg／mlアンピ
シリン，１０μg／mlクロラムフェニコールを含む）に
加えて３７℃２時間培養した。Ｋlett値が１３０になっ
た時にイソプロピルβＤ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴ
Ｇ）を０.３mＭになるように添加し、さらに３時間培養
した。ＩＰＴＧを加える前と添加後３時間培養した培養
液の一部をとって、遠心操作により菌体を集め、これを
還元条件下のドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルア
ミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で分析すると、ＩＰ
ＴＧ添加により、ムテインＢＦＭ２の発現が誘導されて
いることがわかった。また、イムノブロッティングによ
り、発現したタンパク質は、抗bＦＧＦ抗体［M. Seno
ら，ハイブリドーマ（Hybridoma）８，２０９−２２１
（１９８９）］と特異的に結合することが確認された。
【００３４】（４）菌体抽出液のＦＧＦ活性 上記（２）でムテインを発現させた菌体を、１０％ショ
糖、２０mＭ Ｔris・ＨＣl（pＨ７.４），１０mＭ Ｅ
ＤＴＡ ０.２Ｍ ＮaＣl，１mＭフェニルメチルスルフ
ォニルフルオライド（ＰＭＳＦ）を含む０℃の緩衝液に
懸濁した。そこへ終濃度が０.１mg／mlになるようにリ
ゾチームを加え、０℃で３０分から４５分静置し、３０
秒間超音波処理した。この溶液を遠心力約２０,０００g
で３０分間遠心して上清を得、菌体抽出液とした。マウ
スＢＡＬＢ／c３Ｔ３細胞を５％仔牛血清を含むＤＭＥ
Ｍ培地０.２mlで９６穴マイクロタイタープレート（平
底）に１穴あたり２×１０3個となるように播種して培
養し、翌日培地を０.５％仔牛血清を含むＤＭＥＭに交
換した。３日間培養した後、前述の菌体抽出液を０．５
％ＢＳＡを含むＤＭＥＭで５０から５００倍に前希釈し
たものをさらに５倍ずつ段階的に希釈し、各々１０μｌ
を細胞培養液に添加した。さらに１８時間培養した後に
3Ｈ−Ｔdr（５Ｃi／mmol，０.５mＣi／ml ＲＣＣ Ａme
rsham）を各穴に２μｌずつ加えた。６時間後に培 養液
をリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で完全に置換して細胞を洗
い、そのＰＢＳを吸い取った後で、５％ＳＤＳ溶液１０
０μｌを加えた。３７℃で一晩静置して完全に細胞を溶
かし、これを液体シンチレーションカウンターで測定す
ることにより、細胞に取り込まれた3Ｈ−Ｔdrの量を見
積り、ＦＧＦの細胞増殖活性の指標とした。スタンダー
ドとしては、主にウシ下垂体由来ＦＧＦ（宝酒造(株)
製）を使用した。その結果、大腸菌ＭＭ２９４（ＤＥ
３）／pＬysＳ，pＢＦＭ２の抽出液は、ＦＧＦ活性を示
した。このようにして、ヒトbＦＧＦの６９位Ｃysと８
７位ＣysがＳerに、さらに、１１８位ＬeuがＣysに置換
された、図７に示すアミノ酸配列を有するムテインが得
られた。
【００３５】実施例３ （ムテインＢＦＭ３をコードす
る遺伝子の製造とその大腸菌における発現） ヒトbＦＧＦおよびヒトbＦＧＦムテインＣＳ２３の立体
構造を詳しく観察した結果、２５位のＣys残基の側鎖の
近傍には１３９位のＰhe残基の側鎖があることがわかっ
た。したがって、１３９位のＰheをＣysに置換すること
により、２５位のＣysとの間にジスルフィド結合を形成
させ得ると考えた。１３９位のＰheをＣysに変換したム
テインをＢＦＭ３と名付け、以下にその遺伝子の製造法
ならびに、大腸菌での発現について記す。 （１）ムテインＢＦＭ３をコードする遺伝子の製造 まず、１３９位のＰheのコドンをＣysのコドンに変換す
るために、オリゴヌクレオチド３： ５'−ＣＡＴＴＧＧＡＡＧＡＣＡＡＡＧＴＡＴＡＧＣ−３′ （配列表：配列番号３）を合成した（図２（ｃ））。Ｔ
４キナーゼ処理により５′ＯＨ末端をリン酸化した上記
合成オリゴヌクレオチド（４ピコモル）と、実施例１
（２）で作製した一本鎖状のpＵＣＮ２３（５μg）を用
いて、実施例１に記述した部位指向性変異誘発キットに
より、変異を導入したプラスミドを得た。このプラスミ
ドで常法により大腸菌ＭＶ１１８４を形質転換し、１５
０μg／mlのアンピシリンを含む２倍 ＹＴ培地寒天プレ
ートに播いて３７℃１５時間培養し、多数のコロニーを
得た。そのうち３つのコロニーから少量の菌体を取って
０.３mlの２倍ＹＴ培地で約５ 時間培養した。この培養
液３０μｌとヘルパーファージＫＯ７を含む溶液３０μ
ｌを混合して３７℃に１時間静置し、３mlの２倍ＹＴ培
地を加えて一晩培養した。培養液を遠心操作で上清と菌
体に分け、菌体からはプラスミドをアルカリ法で粗精製
し、上清からは、常法によりファージ粒子として存在す
る一本鎖ＤＮＡを回収した。この一本鎖状プラスミドを
鋳型として、ジデオキシ法により塩基配列を分析した結
果、目的とする変異が導入されているクローン１個を同
定した。こうして得られたＢＦＭ３をコードする遺伝子
を含むプラスミドをpＵＣＢＦＭ３と称する（図８）。
【００３６】（２）大腸菌での発現用プラスミドpＢＦ
Ｍ３の構築 （１）で得られたpＵＣＢＦＭ３を制限酵素ＮdeＩおよ
びＢgl IIで消化して、ムテインＢＦＭ３をコードする
約０.５kbpの断片を得た。これをアガロースゲル電気泳
動で精製した後、前もって制限酵素ＮdeＩとＢamＨＩで
消化しておいた発現用プラスミドベクターpＥＴ３c［F.
W. Stadier らメソッズ・イン・エンザイモロジー（Me
thods in Enzymology），１９５，６０−８９（１９９
０）］に、Ｔ４リガーゼにより結合させた。この際、ム
テインをコードするＤＮＡ断片のＢgl II消化によって
生じた粘着末端と、pＥＴ３cのＢamＨＩ消化によって生
じた粘着末端とは、完全に相補的な配列になっており、
リガーゼ処理により目的とする環状ＤＮＡが生じること
になる。ただし、Ｂgl II部位とＢamＨＩ部位が結合し
た後では、もはやどちらの酵素でも切断できなくなるこ
とに注意する。こうして得られた発現用プラスミドをp
ＢＦＭ３と称する（図９）。このプラスミドpＢＦＭ３
を用いて大腸菌ＭＭ２９４（ＤＥ３）／pＬysＳを形質
転換することにより、図１０（配列表：配列番号８）に
示すムテインをコードする遺伝子を含有するプラスミド
を持つ大腸菌ＭＭ２９４（ＤＥ３）／pＬysＳ，pＢＦＭ
３を得た。
【００３７】（３）ムテインＢＦＭ３の発現 前記菌体ＭＭ２９４（ＤＥ３）／pＬysＳ，pＢＦＭ３
を、３５μg／mlのアンピシリンと１０μg／mlのクロラ
ムフェニコールを含むＬＢ培地３ml中で一晩培養し、そ
のうち２.５mlを５０mlのＬＢ培地（３５μg／mlアンピ
シリン，１０μg／mlクロラムフェニコールを含む）に
加えて３７℃２時間培養した。Ｋlett値が１３０になっ
た時にイソプロピルβＤ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴ
Ｇ）を０.３mＭになるように添加し、さらに３時間培養
した。ＩＰＴＧを加える前と添加後３時間培養した培養
液の一部をとって、遠心操作により菌体を集め、これを
還元条件下のドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルア
ミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で分析すると、ＩＰ
ＴＧ添加により、ムテインＢＦＭ３の発現が誘導されて
いることがわかった（図１７）。また、イムノブロッテ
ィングにより、発現したタンパク質は、抗bＦＧＦ抗体
［M. Seno ら，ハイブリドーマ（Hybridoma）８，２０
９−２２１（１９８９）］と特異的に結合することが確
認された（図１８）。
【００３８】（４）菌体抽出液のＦＧＦ活性 上記（２）のようにしてムテインを発現させた菌体か
ら、実施例２（３）に記載の方法で菌体抽出液を調製
し、さらに実施例２（４）に記載の方法でＦＧＦ活性を
測定した。その結果 E. coli ＭＭ２９４（ＤＥ３）／p
ＬysＳ，pＢＦＭ３の菌体抽出液はＦＧＦ活性を示し
た。このようにして、ヒトbＦＧＦの６９位Ｃysと８７
位ＣysがそれぞれＳerに、１３９位ＰheがＣysに置換さ
れた図１０に示すムテインが得られた。
【００３９】実施例４ （ムテインＢＦＭ４をコードす
る遺伝子の製造とその大腸菌における発現） ヒトbＦＧＦおよびヒトbＦＧＦムテインＣＳ２３の立体
構造を詳しく観察した結果、９２位のＣys残基の側鎖の
近傍には７５位のＡla残基の側鎖があることがわかっ
た。したがって、７５位のＡlaをＣysに置換することに
より、９２位のＣysとの間にジスルフィド結合を形成さ
せ得ると考えた。７５位のＡlaをＣysに変換したムテイ
ンをＢＦＭ４と名付け、以下にその遺伝子の製造法なら
びに、大腸菌での発現について記す。 （１）ムテインＢＦＭ４をコードする遺伝子の製造 まず、７５位のＡlaのコドンをＣysのコドンに変換する
ために、オリゴヌクレオチド４： ５'−ＴＴＣＣＴＴＣＡＴＡＣＡＣＡＧＧＴＡＡＣＧＡ−３′ （配列表：配列番号４）を合成した（図２（ｄ））。Ｔ
４キナーゼ処理により５′ＯＨ末端をリン酸化した上記
合成オリゴヌクレオチド（４ピコモル）と、実施例１
（２）で作製した一本鎖状のpＵＣＮ２３（５μg）を用
いて、実施例１に記述した部位指向性変異誘発キットに
より、変異を導入したプラスミドを得た。このプラスミ
ドで常法により大腸菌ＭＶ１１８４を形質転換し、１５
０μg／mlのアンピシリンを含む２倍 ＹＴ培地寒天プレ
ートに播いて３７℃１５時間培養し、多数のコロニーを
得た。そのうち６つのコロニーから少量の菌体を取って
０.３mlの２倍ＹＴ培地で約５ 時間培養した。この培養
液３０μｌとヘルパーファージＫＯ７を含む溶液３０μ
ｌを混合して３７℃に１時間静置し、３mlの２倍ＹＴ培
地を加えて一晩培養した。培養液を遠心操作で上清と菌
体に分け、菌体からはプラスミドをアルカリ法で粗精製
し、上清からは、常法によりファージ粒子として存在す
る一本鎖ＤＮＡを回収した。この一本鎖状プラスミドを
鋳型として、ジデオキシ法により塩基配列を分析した結
果、目的とする変異が導入されている３つのクローンを
同定した。こうして得られたＢＦＭ４をコードする遺伝
子を含むプラスミドをpＵＣＢＦＭ４と称する（図１
１）。
【００４０】（２）大腸菌での発現用プラスミドpＢＦ
Ｍ４の構築 （１）で得られたpＵＣＢＦＭ４を制限酵素ＮdeＩおよ
びＢgl IIで消化して、ムテインＢＦＭ４をコードする
約０.５kbpの断片を得た。これをアガロースゲル電気泳
動で精製した後、前もって制限酵素ＮdeＩとＢamＨＩで
消化しておいた発現用プラスミドベクターpＥＴ３c［F.
W. Stadier らメソッズ・イン・エンザイモロジー（Me
thods in Enzymology），１９５，６０−８９（１９９
０）］に、Ｔ４リガーゼにより結合させた。この際、ム
テインをコードするＤＮＡ断片のＢgl II消化によって
生じた粘着末端と、pＥＴ３cのＢamＨＩ消化によって生
じた粘着末端とは、完全に相補的な配列になっており、
リガーゼ処理により目的とする環状ＤＮＡが生じること
になる。ただし、Ｂgl II部位とＢamＨＩ部位が結合し
た後では、もはやどちらの酵素でも切断できなくなるこ
とに注意する。こうして得られた発現用プラスミドをp
ＢＦＭ４と称する（図１２）。このプラスミドpＢＦＭ
４を用いて大腸菌ＭＭ２９４（ＤＥ３）／pＬysＳを形
質転換することにより、図１３（配列表：配列番号９）
に示すムテインをコードする遺伝子を含有するプラスミ
ドを持つ大腸菌ＭＭ２９４（ＤＥ３）／pＬysＳ，pＢＦ
Ｍ４（ＩＦＯ １５２７６，ＦＥＲＭ ＢＰ−３８０
２）を得た。
【００４１】（３）ムテインＢＦＭ４の発現 前記大腸菌ＭＭ２９４（ＤＥ３）／pＬysＳ，pＢＦＭ４
を、３５μg／mlのアン ピシリンと１０μg／mlのクロ
ラムフェニコールを含むＬＢ培地３ml中で一晩培養し、
そのうち２.５mlを５０mlのＬＢ培地（３５μg／mlアン
ピシリン，１０μg／mlクロラムフェニコールを含む）
に加えて３７℃２時間培養した。Ｋlett値が１３０にな
った時にイソプロピルβＤ−ガラクトピラノシド（ＩＰ
ＴＧ）を０.３mＭになるように添加し、さらに３時間培
養した。ＩＰＴＧを加える前と添加後３時間培養した培
養液の一部をとって、遠心操作により菌体を集め、これ
を還元条件下のドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリル
アミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で分析すると、Ｉ
ＰＴＧ添加により、ムテインＢＦＭ４の発現が誘導され
ていることがわかった（図１７）。また、イムノブロッ
ティングにより、発現したタンパク質は、抗bＦＧＦ抗
体［M. Seno ら，ハイブリドーマ（Hybridoma）８，２
０９−２２１（１９８９）］と特異的に結合することが
確認された（図１８）。
【００４２】（４）菌体抽出液のＦＧＦ活性 （２）のようにしてムテインを発現させた菌体から、実
施例２（３）に記載の方法で菌体抽出液を調製し、さら
に実施例２（４）に記載の方法でＦＧＦ活性を測定し
た。その結果 E. coli ＭＭ２９４（ＤＥ３）／pＬys
Ｓ，pＢＦＭ４の菌体抽出液はＦＧＦ活性を示した。こ
のようにして、ヒトbＦＧＦの６９位Ｃysと８７位Ｃys
がそれぞれＳerに、７５位ＡlaがＣysに置換された第１
２図に示すようなムテインが得られた。
【００４３】実施例５ （ムテインＢＦＭ５をコードす
る遺伝子の製造とその大腸菌における発現） ヒトbＦＧＦおよびヒトbＦＧＦムテインＣＳ２３の立体
構造を詳しく観察した結果、９２位のＣys残基の側鎖の
近傍には８５位のＳer残基の側鎖があることがわかかっ
た。したがって、８５位のＳerをＣysに置換することに
より、９２位のＣysとの間にジスルフィド結合を形成さ
せ得ると考えた。８５位のＳerをＣysに変換したムテイ
ンをＢＦＭ５と名付け、以下にその遺伝子の製造法なら
びに、大腸菌での発現について記す。 （１）ムテインＢＦＭ５をコードする遺伝子の製造 まず、８５位のＳerのコドンをＣysのコドンに変換する
ために、オリゴヌクレオチド５： ５'−ＡＡＣＡＧＡＣＴＴＧＣＡＴＧＣＴＡＧＴＡＡＴＣＴ−３′ ＳphＩ （配列表：配列番号５）を合成した（図２（ｅ））。Ｔ
４キナーゼ処理により５′ＯＨ末端をリン酸化した上記
合成オリゴヌクレオチド（４ピコモル）と、実施例１
（２）で作製した一本鎖状のpＵＣＮ２３（５μg）を用
いて、実施例１に記述した部位指向性変異誘発キットに
より、変異を導入したプラスミドを得た。このプラスミ
ドで常法により大腸菌ＭＶ１１８４を形質転換し、１５
０μg／mlのアンピシリンを含む２倍 ＹＴ培地寒天プレ
ートに播いて３７℃１５時間培養し、多数のコロニーを
得た。そのうち６つのコロニーから少量の菌体を取って
０.3mlの２倍ＹＴ培地で約５ 時間培養した。この培養
液３０μｌとヘルパーファージＫＯ７を含む溶液３０μ
ｌを混合して３７℃に１時間静置し、３mlの２倍ＹＴ培
地を加えて一晩培養した。培養液を遠心操作で上清と菌
体に分け、菌体からはプラスミドをアルカリ法で粗精製
し、上清からは、常法によりファージ粒子として存在す
る一本鎖ＤＮＡを回収した。前述のオリゴヌクレオチド
５には、鋳型となるムテインＣＳ２３をコードする遺伝
子中に存在しなかった制限酵素ＳphＩ認識部位が含まれ
ている。したがって正しく変異が導入されたプラスミド
にＳphＩを作用させると、変異により新たに生じたＳph
Ｉ部位とpＵＣ１１８Ｂのマルチクローニング部位に始
めから存在するＳphＩ部位の２ケ所で切断され、２２０
塩基対の断片が生じるはずである。前述の６つのコロニ
ーから得たプラスミドをＳphＩで消化し、アガロースゲ
ル電気泳動で分析したところ、２つのクローンで正しい
位置に断片が見られた。さらに、この２つのクローンの
一本鎖状プラスミドを鋳型として、ジデオキシ法により
塩基配列を分析した結果、目的とする変異が導入されて
いることを確認した。こうして得られたＢＦＭ５をコー
ドする遺伝子を含むプラスミドをpＵＣＢＦＭ５と称す
る（図１４）。
【００４４】（２）大腸菌での発現用プラスミドpＢＦ
Ｍ５の構築 （１）で得られたpＵＣＢＦＭ５を制限酵素ＮdeＩおよ
びＢgl IIで消化して、ムテインＢＦＭ５をコードする
約０.５kbpの断片を得た。これをアガロースゲル電気泳
動で精製した後、前もって制限酵素ＮdeＩとＢamＨＩで
消化しておいた発現用プラスミドベクターpＥＴ３c［F.
W. Stadier らメソッズ・イン・エンザイモロジー（Me
thods in Enzymology），１９５，６０−８９（１９９
０）］に、Ｔ４リガーゼにより結合させた。この際、ム
テインをコードするＤＮＡ断片のＢgl II消化によって
生じた粘着末端と、pＥＴ３cのＢamＨＩ消化によって生
じた粘着末端とは、完全に相補的な配列になっており、
リガーゼ処理により目的とする環状ＤＮＡが生じること
になる。ただし、Ｂgl II部位とＢamＨＩ部位が結合し
た後では、もはやどちらの酵素でも切断できなくなるこ
とに注意する。こうして得られた発現用プラスミドをｐ
ＢＦＭ５と称する（図１５）。このプラスミドpＢＦＭ
５を用いて大腸菌ＭＭ２９４（ＤＥ３）／pＬysＳを形
質転換することにより、図１６（配列表：配列番号１
０）に示すムテインをコードする遺伝子を含有するプラ
スミドを持つ大腸菌ＭＭ２９４（ＤＥ３）／pＬysＳ，p
ＢＦＭ５（ＩＦＯ １５０８５，ＦＥＲＭ ＢＰ−３３
７１）を得た。
【００４５】（３）ムテインＢＦＭ５の発現 前記大腸菌ＭＭ２９４（ＤＥ３）／pＬysＳ，pＢＦＭ５
を、３５μg／mlのアン ピシリンと１０μg／mlのクロ
ラムフェニコールを含むＬＢ培地３ml中で一晩培養し、
そのうち２.５mlを５０mlのＬＢ培地（３５μg／mlアン
ピシリン，１０μg／mlクロラムフェニコールを含む）
に加えて３７℃２時間培養した。Ｋlett値 が１３０に
なった時にイソプロピルβＤ−ガラクトピラノシド（Ｉ
ＰＴＧ）を０.３mＭになるように添加し、さらに３時間
培養した。ＩＰＴＧを加える前と添加後３時間培養した
培養液の一部をとって、遠心操作により菌体を集め、こ
れを還元条件下のドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリ
ルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で分析すると、
ＩＰＴＧ添加により、ムテインＢＦＭ５の発現が誘導さ
れていることがわかった（図１７）。また、イムノブロ
ッティングにより、発現したタンパク質は、抗bＦＧＦ
抗体［M. Seno ら，ハイブリドーマ（Hybridoma）８，
２０９−２２１（１９８９）］と特異的に結合すること
が確認された（図１８）。
【００４６】（４）菌体抽出液のＦＧＦ活性 （２）のようにしてムテインを発現させた菌体から、実
施例２（３）に記載の方法で菌体抽出液を調製し、さら
に実施例２（４）に記載の方法でＦＧＦ活性を測定し
た。その結果 E. coli ＭＭ２９４（ＤＥ３）／pＬys
Ｓ，pＢＦＭ５の菌体抽出液はＦＧＦ活性を示した。こ
のようにして、ヒトbＦＧＦの６９位Ｃysと８７位Ｃys
がＳerに、８５位ＳerがＣysに置換された、図１６に示
すムテインが得られた。
【００４７】実施例６ （ムテインＢＦＭ５の精製） （１）産生菌の培養 実施例５で得られたムテインＢＦＭ５を発現する大腸菌
ＭＭ２９４（ＤＥ３）／pＬysＳ，pＢＦＭ５を、５０μ
g／mlアンピシリン，１０μg／mlクロラムフェニコール
を含むＬＢ培地５０mlに播種し、３０℃で一晩培養し
た。この培養液を、５０μg／mlアンピシリン，１０μg
／mlクロラムフェニコールを含むＬＢ培地１リットルに
加え、３０℃で約２時間振とう培養した。Klett値が約
１３０に達した時にイソプロピルβ−Ｄ−ガラクトピラ
ノシド（ＩＰＴＧ）を終濃度が０.１mＭになるように添
加した。さらに３０℃で３時間培養した後に、培養液を
遠心力約３０００ｇで１０分間遠心分離し、約５ｇの湿
菌体を得た。
【００４８】（２）ムテインの精製 （１）で得られた約５ｇの湿菌体を氷冷下、２０mＭ
Ｔris・ＨＣl（pＨ７.４），１０％（W/V）シュークロ
ース，１０mＭ ＥＤＴＡ，０.２Ｍ ＮaＣl，１mＭフ
ェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）を含
む緩衝液３０mlに再懸濁し、卵白リゾチームを終濃度が
０.１mg／mlになるように加えた。かくはん後、０℃に
１時間静置し、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）を終濃度
が１０mＭになるように加えた。０℃に保ったまま超音
波処理をして溶液の粘度を下げ、遠心力約２０,０００
ｇで４０分間遠心分離して３０mlの上清を得た。これ
を、 あらかじめ２０mＭ Ｔris・ＨＣl（pＨ７.４）の
緩衝液で平衡化しておいたＱ ＡＥ−Toyopearl（東ソー
（株））カラム（２０ml）に通し、素通りした溶液と、
２０mＭ Ｔris・ＨＣl（pＨ７.４）１５mlでカラムを
洗った時に溶出される溶 液を集めた。この時、徐々に
沈殿が生じたため、遠心力約２０,０００ｇで３０ 分遠
心分離して４５mlの上清を得た。この上清を２０mＭ
Ｔris・ＨＣlで平衡 化したＣＭ−Toyopearl（東ソー
（株））カラム（４０ml）に添加し、カラム担 体にム
テインを吸着させた。０.１Ｍ ＮaＣl，２０mＭ Ｔri
s・ＨＣl（pＨ７.４），２mＭ ＤＴＴを含む緩衝液約
１３０mlでカラムを洗った後、１.０Ｍ ＮaＣl，２０m
Ｍ Ｔris・ＨＣl（pＨ７.４），５mＭ ＤＴＴを含む
緩衝液で溶出した。溶出体積１５mlから４５mlまでの画
分を集め、これに２０mＭ Ｔris・ＨＣl（pＨ７.４）
３０mlを加えて塩濃度を下げた後に、ヘパリン新和性ク
ロマト グラフィーに供した。用いたカラムは、昭和電
工（株）製 Shodex AFpak ＨＲ −８９４で、これをあ
らかじめ２０ml Ｔris・ＨＣl pＨ７.４で平衡化して
おき、サンプルを通した後、０.５Ｍ ＮaＣl，２０mＭ
Ｔris・ＨＣl（pＨ７.４）で洗い、０.５Ｍから２.０
ＭまでのＮaＣl濃度勾配で溶出した。ムテインはＮaＣl
濃度、約１.３Ｍで単一なピークとして溶出された。こ
れを限外濾過膜を用 いて濃縮した後、Sephadex Ｇ−２
５（ファルマシア社製）を用いるゲル濾過法 により、
緩衝液を２０mＭクエン酸ナトリウム（pＨ６.５）に交
換して最終製品 とした。２８０nmでの分子吸光係数を
１３９００と仮定すると、最終製品の濃度は０.９４１m
g／ml，収量は９.８８mgであった。この製品は、ドデシ
ル硫酸ナトリウムを用いるポリアクリルアミド電気泳動
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で単一なバンドを示し（図１
９）、実施例２（３）に記した３Ｔ３細胞増殖活性測定
法では、ウシ脳下垂体由来のbＦＧＦと同等の比活性を
有していた。また、この製品を塩 酸加水分解および過
ぎ酸による酸化後の塩酸加水分解を行って、アミノ酸分
析に供したところ、表２に示すように、図１６の塩基配
列から予想される正しいアミノ酸組成値と一致した。
【００４９】
【表２】 上記分析は、ムテインを４％チオグリコール酸を含む６
Ｎ塩酸中で１１０℃，２４時間および４８時間加水分解
を行った。システインは、過ぎ酸酸化によりシステイン
酸として定量した。セリンとスレオニンは、２４時間と
４８時間の値から０時間に外挿して求めた値を示した。
【００５０】実施例７ （ムテインＢＦＭ４の精製） （１）生産菌の培養 実施例４で得られた大腸菌ＭＭ２９４（ＤＥ３）／pＬy
sＳ，pＢＦＭ４を、実施例６（１）に記載の方法に従っ
て培養、及びＢＦＭ４の発現誘導を行った。１リットル
の培養液から遠心分離により約５グラムの湿菌体を得
た。 （２）ムテインの精製 （１）で得られた湿菌体を実施例６（２）に記載の方法
と同様の方法で処理し、最終的に９.９７ミリグラムの
精製ＢＦＭ４を得た。この製品はＳＤＳ−ＰＡＧＥで単
一なバンドを示し（図２０−Ａ）、実施例２（４）に記
した生物活性測定法では、ウシ下垂体由来のbＦＧＦを
スタンダードとして１２１％±２８％の比活性を有して
いた。図２０−Ａにおいて、レーン１は、分子量マーカ
ー（上から９７.４ｋ，６６.２ｋ，４５.０ｋ，３１.０
ｋ，２１.５ｋ，１４.４ｋ）の、レーン２は、ＱＡＥ−
Toyopearl カラム素通り画分４.５μｌの、レーン３
は、ＣＭ−Toyopearl カラム溶出液３倍希釈後に１０μ
ｌの、レーン４は、ＣＭ−Toyopearl カラム溶出液３倍
希釈後３.５μｌの、レーン５は、最終製品１.０μｌの
結果をそれぞれ示す。また、この製品を塩酸加水分解及
び過ぎ酸による酸化後の塩酸加水分解を行ってアミノ酸
分析に供し、その結果を後述の表３に、「酸化処理前」
の欄に示す。この製品は、表３に示すように、塩基配列
から予想される正しいアミノ酸組成値とほぼ一致した。
【００５１】実施例８ （ムテインＢＦＭ４の酸化） 実施例７で得られたムテインＢＦＭ４の精製品に含まれ
るＳＨ基の量を、５,５'−dithiobis−（２−nitrobenz
oic acid）を用いる方法（J. Sedlak and R.H. Lindsa
y, Anal. Biochem. ２５，１９２−２０５(１９６８)）
で分析した結果、６Ｍ塩酸グアニジン存在下ではムテイ
ン１分子当り２.８個のＳＨ基が検出された。したがっ
て、アミノ酸配列中に存在する３つのシステイン残基
は、どれもＳ−Ｓ結合を形成していないと考えられた。
そこで、グルタチオン酸化還元緩衝液を用いて積極的に
Ｓ−Ｓ結合を形成させることを試みた。以下、３つのシ
ステイン残基のＳＨ基がすべて還元状態にある分子を還
元型ＢＦＭ４、７５位システインと９２位システインの
間に分子内Ｓ−Ｓ結合が形成された分子を酸化型ＢＦＭ
４と称することにする。検討の結果、効率よくＳ−Ｓ結
合を形成させるには、終濃度で約０.３mg／ml還元型Ｂ
ＦＭ４、１mＭ 酸化型グルタチオン、０.２mＭ 還元型
グルタチオン、１mＭ ＥＤＴＡ、２Ｍ 尿素、１００mＭ
Ｔris・ＨＣl（pＨ８.０）を含む水溶液を空気中の酸
素をなるべく避けながら調製し、１５℃で約２４時間静
置すると良いことがわかった。還元型ＢＦＭ４と酸化型
ＢＦＭ４は逆相ＨＰＬＣで別々に溶出されるため、酸化
反応の経過を分析することは容易であった。しかし、逆
相ＨＰＬＣで溶出されたＢＦＭ４は部分的に活性を失っ
ているため、この方法を酸化型ＢＦＭ４の精製の手段と
して利用できなかった。酸化処理前後でのＢＦＭ４の逆
相ＨＰＬＣ溶出パターンを図２１(Ａ)および(Ｂ)に示
す。用いたカラムは、東ソー(株)製ＴＳＫgel ＯＤＳ−
１２０Ｔ（φ４.６×２５０mm）で、移動相には０.１％
トリフルオロ酢酸水溶液と、０.１％トリフルオロ酢酸
を含むアセトニトリルを用いた。溶出はアセトニトリル
の濃度を３０％から３８％まで１６分間で上昇させるこ
とにより行った。試料は２３０nmの吸光度で検出した。
酸化処理終了後、少量のクエン酸を加えてpＨを６.５に
調節し、セファデックスＧ−２５を用いるゲル濾過法で
緩衝液を５０mＭクエン酸ナトリウム（pＨ６.５）に交
換した。最後に、限外濾過膜（Diaflo ＹＭ５，Amicon
社製）による濃縮を行い、濃度を０.７８mg／mlとし
た。
【００５２】このような酸化処理を行ったＢＦＭ４は、
ＳＨ基の定量の結果１分子当り１.０個のＳＨ基を含む
ことがわかった。また、非還元条件のＳＤＳ−ＰＡＧＥ
では、分子間でＳ−Ｓ結合が形成された二量体に相当す
るバンドは、ほとんど見られなかった（図２０−Ｂ）。
図２０−Ｂにおいて、レーン１は分子量マーカー（上か
ら９７.４ｋ，６６.２ｋ，４５.０ｋ，３１.０ｋ，２
１.５ｋ，１４.４ｋ）の、レーン２は酸化処理前のＢＦ
Ｍ４ １.０μg の、レーン３は酸化処理後のＢＦＭ４
１.０μg の結果をそれぞれ示す。また、非還元ＳＤＳ
−ＰＡＧＥは、２−メルカプトエタノールを含まないLa
emmliの緩衝液とサンプルを混合し、室温で１０分間静
置した後に通常のＳＤＳ−ＰＡＧＥと同様に泳動を行っ
た。また、上記で得られた酸化型ＢＦＭ４のアミノ酸分
析値を、表３の「酸化処理後」の欄に示す。表３に示す
ように酸化処理前後でアミノ酸組成に変化がないことか
ら、酸化型ＢＦＭ４はグルタチオンの付加などの望まし
くない修飾が起きていないことがわかった。実施例２
（４）に記載のバイオアッセイで、酸化型ＢＦＭ４の比
活性は、ウシ下垂体由来bＦＧＦを基準にすると１１５
％±１３％であった。
【００５３】このようにして、活性を保ったまま分子内
にＳ−Ｓ結合を有するbＦＧＦムテイン、酸化型ＢＦＭ
４が得られた。
【表３】 アミノ酸分析は、サンプルを４％チオグリコール酸を含
む６Ｎ塩酸中で１１０℃，２４時間加水分解した後に行
った。システインは、過ぎ酸酸化によりシステイン酸と
して定量した。
【００５４】実施例９ （酸化型ＢＦＭ４の酸に対する
安定性） 野生型の配列をもつヒトbＦＧＦ（以下hbＦＧＦと記
す）、そのムテインであるhbＦＧＦムテインＣＳ２３お
よび酸化型ＢＦＭ４の酸性条件下における安定性を比較
するため以下の実験を行った。組換え型hbＦＧＦは、文
献［M. Iwane ら、Biochem. Biophys, Res. Commun.１
４６，４０７−４７７(１９８７)］に記載の方法にした
がって調製し、１mＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）を
含む５０mＭクエン酸ナトリウム緩衝液（pＨ６.５）中
に、濃度０.５７mg／mlで溶解した状態のものを用い
た。hbＦＧＦムテインＣＳ２３は文献［M. Seno ら，Bi
ochem. Biophys. Res. Commun. １５１，７０１−７０
８(１９８８)］に記載の方法で調製し、５０mＭクエン
酸ナトリウム緩衝液（pＨ６.５）中に、濃度１.００mg
／mlで溶解した状態のものを用いた。酸化型ＢＦＭ４
は、実施例８で調製したものを用いた。hbＦＧＦ、hbＦ
ＧＦムテインＣＳ２３、酸化型ＢＦＭ４をそれぞれ終濃
度が１０μg／mlとなるように酸性緩衝液Ａ（５mＭ Ｇl
y・ＨＣl（pＨ２.０），１６５mＭ ＮaＣl）で、氷冷下
に希釈した。これらの溶液３００μｌずつを、１.５ml
のポリプロピレン製マイクロテストチューブにとり、３
７℃に静置した。１５分、３０分、６０分、１２０分後
に、これらのチューブから、１０μｌずつサンプリング
し、直ちに０.１％ＢＳＡを含むＤＭＥＭ（０℃）で１
００倍希釈することにより酸を中和した。中和後の溶液
はそのままバイオアッセイに供した。これとは別に、酸
性緩衝液Ａの代わりに０.１％ＢＳＡを含むＤＭＥＭで
三種のタンパク質を同様に希釈した溶液を調製し、実施
例２（４）に記載した方法によるバイオアッセイに供し
た。これらの結果を０分での活性とみなし、これを１０
０％として酸処理後のサンプルの残存活性を求め、結果
を図２２に示す。図２２において、△を黒くぬった印は
酸化型ＢＦＭ４の結果を、○はhbＦＧＦムテインＣＳ２
３の結果を、●はhbＦＧＦの結果をそれぞれ示す。これ
により、酸化型ＢＦＭ４は、hbＦＧＦに比較して酸処理
に対して大幅に安定化されていることが明らかになっ
た。また、酸化型ＢＦＭ４は、hbＦＧＦムテインＣＳ２
３よりも酸に対してさらに安定化されていることが明ら
かとなった。
【００５５】実施例１０ （酸化型ＢＦＭ４の熱に対す
る安定性） 中性pＨにおける酸化型ＢＦＭ４の熱安定性を、hbＦＧ
Ｆ、hbＦＧＦムテインＣＳ２３と比較するため、以下の
実験を行った。材料として用いたhbＦＧＦ、hbＦＧＦム
テインＣＳ２３、酸化型ＢＦＭ４は、実施例９で用いた
ものと同じである。これらを終濃度が１０μl／mlにな
るように氷冷下ＰＢＳ（phosphate buffered saline, p
Ｈ７.４）で希釈した。これらの溶液３００μｌずつを
１.５mlのポリプロピレン製マイクロテストチューブに
とって、５０℃に静置した。０分、３０分、６０分、１
２０分、１８０分後に、これらのチューブから１０μｌ
ずつサンプリングし、０.１％ＢＳＡを含むＤＭＥＭ
（０℃）で１００倍希釈してバイオアッセイに供した。
０分における活性値を１００％として熱処理後の各サン
プルの残存活性を求め、図２３に示す結果が得られた。
図２３において、△を黒くぬった印は酸化型ＢＦＭ４の
結果を、○はhbＦＧＦムテインＣＳ２３の結果を、●は
hbＦＧＦの結果をそれぞれ示す。これにより、酸化型Ｂ
ＦＭ４は、hbＦＧＦやhbＦＧＦムテインＣＳ２３と比べ
て、熱に対しても安定であることが明らかになった。
【００５６】
【発明の効果】本発明のbＦＧＦまたはその活性誘導体
を構成するアミノ酸のうち少なくとも１つのアミノ酸が
システインに置換されたムテインは、酸，熱などに対す
る安定性が向上されているので、医薬として有利に使用
することができる。このように、本発明のムテインは安
定性が高いので、より低濃度で使用でき、保存性が良
く、剤形、投与方法の自由度が大きい、という特徴を有
する。
【００５７】
【配列表】
配列番号：１ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ ハイポセティカル配列：Ｎo アンチセンス：Ｙes 配列の特徴 特徴を示す記号：mutation 存在位置：１１．．１２ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 TGCTGGCATA TGATTCGTAA TC 22
【００５８】配列番号：２ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ ハイポセティカル配列：Ｎo アンチセンス：Ｙes 配列の特徴 特徴を示す記号：mutation 存在位置：１１．．１３ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 CAGTTCGTTT GCATGCCACA TAC 23
【００５９】配列番号：３ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ ハイポセティカル配列：Ｎo アンチセンス：Ｙes 配列の特徴 特徴を示す記号：mutation 存在位置：１１ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 CATTGGAAGA CAAAGTATAG C 21
【００６０】配列番号：４ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 ハイポセティカル配列：Ｎo アンチセンス：Ｙes 配列の特徴 特徴を示す記号：mutation 存在位置：１１．．１２ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 TTCCTTCATA CACAGGTAAC GA 22
【００６１】配列番号：５ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ ハイポセティカル配列：Ｎo アンチセンス：Ｙes 配列の特徴 特徴を示す記号：mutation 存在位置：１０，１１，１３ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 AACAGACTTG CATGCTAGTA ATCT 24
【００６２】配列番号：６ 配列の長さ：４４４ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cＤＮＡ to mＲＮＡ ハイポセティカル配列：Ｎo アンチセンス：Ｎo 起源 ヒト 配列の特徴 特徴を示す記号：ＣＤＳ 存在位置：１．．４４４ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列の特徴 特徴を示す記号：mat peptide 存在位置：４．．４４１ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 ATG CCA GCA TTG CCC GAG GAT GGC GGC AGC GGC GCC TTC CCG CCC GGC 48 Pro Ala Leu Pro Glu Asp Gly Gly Ser Gly Ala Phe Pro Pro Gly 1 5 10 15 CAC TTC AAG GAC CCC AAG CGG CTG TAC TGC AAA AAC GGG GGC TTC TTC 96 His Phe Lys Asp Pro Lys Arg Leu Tyr Cys Lys Asn Gly Gly Phe Phe 20 25 30 CTG CGC ATC CAC CCC GAC GGC CGA GTT GAC GGG GTC CGG GAG AAG AGC 144 Leu Arg Ile His Pro Asp Gly Arg Val Asp Gly Val Arg Glu Lys Ser 35 40 45 GAC CCT CAC ATC AAG CTA CAA CTT CAA GCA GAA GAG AGA GGA GTT GTG 192 Asp Pro His Ile Lys Leu Gln Leu Gln Ala Glu Glu Arg Gly Val Val 50 55 60 TCT ATC AAA GGA GTG TGT GCT AAC CGT TAC CTG GCT ATG AAG GAA GAT 240 Ser Ile Lys Gly Val Cys Ala Asn Arg Tyr Leu Ala Met Lys Glu Asp 65 70 75 GGA AGA TTA CTG GCT TCT AAA TGT GTT ACG GAT GAG TGT TTC TTT TTT 288 Gly Arg Leu Leu Ala Ser Lys Cys Val Thr Asp Glu Cys Phe Phe Phe 80 85 90 95 GAA CGA TTG GAA TCT AAT AAC TAC AAT ACT TAC CGG TCA AGG AAA TAC 336 Glu Arg Leu Glu Ser Asn Asn Tyr Asn Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr 100 105 110 ACC AGT TGG TAT GTG GCA CTG AAA CGA ACT GGG CAG TAT AAA CTT GGA 384 Thr Ser Trp Tyr Val Ala Leu Lys Arg Thr Gly Gln Tyr Lys Leu Gly 115 120 125 TCC AAA ACA GGA CCT GGG CAG AAA GCT ATA CTT TTT CTT CCA ATG TCT 432 Ser Lys Thr Gly Pro Gly Gln Lys Ala Ile Leu Phe Leu Pro Met Ser 130 135 140 GCT AAG AGC TGA 444 Ala Lys Ser trm 145
【００６３】配列番号：７ 配列の長さ：４４４ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cＤＮＡ to mＲＮＡ ハイポセティカル配列：Ｎo アンチセンス：Ｎo 配列の特徴 特徴を示す記号：ＣＤＳ 存在位置：４４４ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列の特徴 特徴を示す記号：mutation 存在位置：208, 210, 216, 255, 264, 266, 358, 359,
360 特徴を決定した方法：Ｅ 配列の特徴 特徴を示す記号：mat peptide 存在位置：４．．４４１ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 ATG CCA GCA TTG CCC GAG GAT GGC GGC AGC GGC GCC TTC CCG CCC GGC 48 Pro Ala Leu Pro Glu Asp Gly Gly Ser Gly Ala Phe Pro Pro Gly 1 5 10 15 CAC TTC AAG GAC CCC AAG CGG CTG TAC TGC AAA AAC GGG GGC TTC TTC 96 His Phe Lys Asp Pro Lys Arg Leu Tyr Cys Lys Asn Gly Gly Phe Phe 20 25 30 CTG CGC ATC CAC CCC GAC GGC CGA GTT GAC GGG GTC CGG GAG AAG AGC 144 Leu Arg Ile His Pro Asp Gly Arg Val Asp Gly Val Arg Glu Lys Ser 35 40 45 GAC CCT CAC ATC AAG CTA CAA CTT CAA GCA GAA GAG AGA GGA GTT GTG 192 Asp Pro His Ile Lys Leu Gln Leu Gln Ala Glu Glu Arg Gly Val Val 50 55 60 TCT ATC AAA GGA GTG AGC GCT AAT CGT TAC CTG GCT ATG AAG GAA GAT 240 Ser Ile Lys Gly Val Ser Ala Asn Arg Tyr Leu Ala Met Lys Glu Asp 65 70 75 GGA AGA TTA CTA GCT TCT AAG TCT GTT ACG GAT GAG TGT TTC TTT TTT 288 Gly Arg Leu Leu Ala Ser Lys Ser Val Thr Asp Glu Cys Phe Phe Phe 80 85 90 95 GAA CGA TTG GAA TCT AAT AAC TAC AAT ACT TAC CGG TCA AGG AAA TAC 336 Glu Arg Leu Glu Ser Asn Asn Tyr Asn Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr 100 105 110 ACC AGT TGG TAT GTG GCA TGC AAA CGA ACT GGG CAG TAT AAA CTT GGA 384 Thr Ser Trp Tyr Val Ala Cys Lys Arg Thr Gly Gln Tyr Lys Leu Gly 115 120 125 TCC AAA ACA GGA CCT GGG CAG AAA GCT ATA CTT TTT CTT CCA ATG TCT 432 Ser Lys Thr Gly Pro Gly Gln Lys Ala Ile Leu Phe Leu Pro Met Ser 130 135 140 GCT AAG AGC TGA 444 Ala Lys Ser trm 145
【００６４】配列番号：８ 配列の長さ：４４４ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cＤＮＡ to mＲＮＡ ハイポセティカル配列：Ｎo アンチセンス：Ｎo 配列の特徴 特徴を示す記号：ＣＤＳ 存在位置：１．．４４４ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列の特徴 特徴を示す記号：mutation 存在位置：208, 210, 216, 255, 264, 266, 421, 422,
423 特徴を決定した方法：Ｅ 配列の特徴 特徴を示す記号：mat peptide 存在位置：４．．４４１ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 ATG CCA GCA TTG CCC GAG GAT GGC GGC AGC GGC GCC TTC CCG CCC GGC 48 Pro Ala Leu Pro Glu Asp Gly Gly Ser Gly Ala Phe Pro Pro Gly 1 5 10 15 CAC TTC AAG GAC CCC AAG CGG CTG TAC TGC AAA AAC GGG GGC TTC TTC 96 His Phe Lys Asp Pro Lys Arg Leu Tyr Cys Lys Asn Gly Gly Phe Phe 20 25 30 CTG CGC ATC CAC CCC GAC GGC CGA GTT GAC GGG GTC CGG GAG AAG AGC 144 Leu Arg Ile His Pro Asp Gly Arg Val Asp Gly Val Arg Glu Lys Ser 35 40 45 GAC CCT CAC ATC AAG CTA CAA CTT CAA GCA GAA GAG AGA GGA GTT GTG 192 Asp Pro His Ile Lys Leu Gln Leu Gln Ala Glu Glu Arg Gly Val Val 50 55 60 TCT ATC AAA GGA GTG AGC GCT AAT CGT TAC CTG GCT ATG AAG GAA GAT 240 Ser Ile Lys Gly Val Ser Ala Asn Arg Tyr Leu Ala Met Lys Glu Asp 65 70 75 GGA AGA TTA CTA GCT TCT AAG TCT GTT ACG GAT GAG TGT TTC TTT TTT 288 Gly Arg Leu Leu Ala Ser Lys Ser Val Thr Asp Glu Cys Phe Phe Phe 80 85 90 95 GAA CGA TTG GAA TCT AAT AAC TAC AAT ACT TAC CGG TCA AGG AAA TAC 336 Glu Arg Leu Glu Ser Asn Asn Tyr Asn Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr 100 105 110 ACC AGT TGG TAT GTG GCA CTG AAA CGA ACT GGG CAG TAT AAA CTT GGA 384 Thr Ser Trp Tyr Val Ala Leu Lys Arg Thr Gly Gln Tyr Lys Leu Gly 115 120 125 TCC AAA ACA GGA CCT GGG CAG AAA GCT ATA CTT TGT CTT CCA ATG TCT 432 Ser Lys Thr Gly Pro Gly Gln Lys Ala Ile Leu Cys Leu Pro Met Ser 130 135 140 GCT AAG AGC TGA 444 Ala Lys Ser trm 145
【００６５】配列番号：９ 配列の長さ：４４４ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cＤＮＡ to mＲＮＡ ハイポセティカル配列：Ｎo アンチセンス：Ｎo 配列の特徴 特徴を示す記号：ＣＤＳ 存在位置：１．．４４４ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列の特徴 特徴を示す記号：mutation 存在位置：208, 210, 216, 226, 227, 255, 264, 266 特徴を決定した方法：Ｅ 配列の特徴 特徴を示す記号：mat peptide 存在位置：４．．４４１ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 ATG CCA GCA TTG CCC GAG GAT GGC GGC AGC GGC GCC TTC CCG CCC GGC 48 Pro Ala Leu Pro Glu Asp Gly Gly Ser Gly Ala Phe Pro Pro Gly 1 5 10 15 CAC TTC AAG GAC CCC AAG CGG CTG TAC TGC AAA AAC GGG GGC TTC TTC 96 His Phe Lys Asp Pro Lys Arg Leu Tyr Cys Lys Asn Gly Gly Phe Phe 20 25 30 CTG CGC ATC CAC CCC GAC GGC CGA GTT GAC GGG GTC CGG GAG AAG AGC 144 Leu Arg Ile His Pro Asp Gly Arg Val Asp Gly Val Arg Glu Lys Ser 35 40 45 GAC CCT CAC ATC AAG CTA CAA CTT CAA GCA GAA GAG AGA GGA GTT GTG 192 Asp Pro His Ile Lys Leu Gln Leu Gln Ala Glu Glu Arg Gly Val Val 50 55 60 TCT ATC AAA GGA GTG AGC GCT AAT CGT TAC CTG TGT ATG AAG GAA GAT 240 Ser Ile Lys Gly Val Ser Ala Asn Arg Tyr Leu Cys Met Lys Glu Asp 65 70 75 GGA AGA TTA CTA GCT TCT AAG TCT GTT ACG GAT GAG TGT TTC TTT TTT 288 Gly Arg Leu Leu Ala Ser Lys Ser Val Thr Asp Glu Cys Phe Phe Phe 80 85 90 95 GAA CGA TTG GAA TCT AAT AAC TAC AAT ACT TAC CGG TCA AGG AAA TAC 336 Glu Arg Leu Glu Ser Asn Asn Tyr Asn Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr 100 105 110 ACC AGT TGG TAT GTG GCA CTG AAA CGA ACT GGG CAG TAT AAA CTT GGA 384 Thr Ser Trp Tyr Val Ala Leu Lys Arg Thr Gly Gln Tyr Lys Leu Gly 115 120 125 TCC AAA ACA GGA CCT GGG CAG AAA GCT ATA CTT TTT CTT CCA ATG TCT 432 Ser Lys Thr Gly Pro Gly Gln Lys Ala Ile Leu Phe Leu Pro Met Ser 130 135 140 GCT AAG AGC TGA 444 Ala Lys Ser trm 145
【００６６】配列番号：１０ 配列の長さ：４４４ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cＤＮＡ to mＲＮＡ ハイポセティカル配列：Ｎo アンチセンス：Ｎo 配列の特徴 特徴を示す記号：ＣＤＳ 存在位置：１．．４４４ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列の特徴 特徴を示す記号：mutation 存在位置：208, 210, 216, 255, 258, 260, 261, 264,
266 特徴を決定した方法：Ｅ 配列の特徴 特徴を示す記号：mat peptide 存在位置：４．．４４１ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 ATG CCA GCA TTG CCC GAG GAT GGC GGC AGC GGC GCC TTC CCG CCC GGC 48 Pro Ala Leu Pro Glu Asp Gly Gly Ser Gly Ala Phe Pro Pro Gly 1 5 10 15 CAC TTC AAG GAC CCC AAG CGG CTG TAC TGC AAA AAC GGG GGC TTC TTC 96 His Phe Lys Asp Pro Lys Arg Leu Tyr Cys Lys Asn Gly Gly Phe Phe 20 25 30 CTG CGC ATC CAC CCC GAC GGC CGA GTT GAC GGG GTC CGG GAG AAG AGC 144 Leu Arg Ile His Pro Asp Gly Arg Val Asp Gly Val Arg Glu Lys Ser 35 40 45 GAC CCT CAC ATC AAG CTA CAA CTT CAA GCA GAA GAG AGA GGA GTT GTG 192 Asp Pro His Ile Lys Leu Gln Leu Gln Ala Glu Glu Arg Gly Val Val 50 55 60 TCT ATC AAA GGA GTG AGC GCT AAT CGT TAC CTG GCT ATG AAG GAA GAT 240 Ser Ile Lys Gly Val Ser Ala Asn Arg Tyr Leu Ala Met Lys Glu Asp 65 70 75 GGA AGA TTA CTA GCA TGC AAG TCT GTT ACG GAT GAG TGT TTC TTT TTT 288 Gly Arg Leu Leu Ala Cys Lys Ser Val Thr Asp Glu Cys Phe Phe Phe 80 85 90 95 GAA CGA TTG GAA TCT AAT AAC TAC AAT ACT TAC CGG TCA AGG AAA TAC 336 Glu Arg Leu Glu Ser Asn Asn Tyr Asn Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr 100 105 110 ACC AGT TGG TAT GTG GCA CTG AAA CGA ACT GGG CAG TAT AAA CTT GGA 384 Thr Ser Trp Tyr Val Ala Leu Lys Arg Thr Gly Gln Tyr Lys Leu Gly 115 120 125 TCC AAA ACA GGA CCT GGG CAG AAA GCT ATA CTT TTT CTT CCA ATG TCT 432 Ser Lys Thr Gly Pro Gly Gln Lys Ala Ile Leu Phe Leu Pro Met Ser 130 135 140 GCT AAG AGC TGA 444 Ala Lys Ser trm 145
【図面の簡単な説明】
【図１】天然型ヒトbＦＧＦをコードする塩基配列の一
例、およびヒトbＦＧＦのアミノ酸配列を示す。
【図２】実施例１，２，３，４および５で用いられた特
異的部位指向性変異誘発のプライマーを、対応する部位
の変異前の配列（上段に示す。）とともに示す。
【図３】実施例１におけるプラスミドpＵＣＢ２３の構
築図を示す。
【図４】実施例１におけるプラスミドpＵＣＮ２３の構
築図を示す。
【図５】実施例２におけるプラスミドpＵＣＢＦＭ２の
構築図を示す。
【図６】実施例２におけるプラスミドpＢＦＭ２の構築
図を示す。
【図７】実施例２おけるプラスミドpＢＦＭ２が保持す
るヒトbＦＧＦムテインＢＦＭ２をコードする塩基配列
と、対応するアミノ酸配列を示す。下線は、天然型と異
なる塩基を、上線は天然型と異なるアミノ酸残基を示
す。
【図８】実施例３におけるプラスミドpＵＣＢＦＭ３の
構築図を示す。
【図９】実施例３におけるプラスミドpＢＦＭ３の構築
図を示す。
【図１０】実施例３におけるプラスミドpＢＦＭ３が保
持するヒトbＦＧＦムテインＢＦＭ３をコードする塩基
配列と、対応するアミノ酸配列を示す。下線は、天然型
と異なる塩基を、上線は天然型と異なるアミノ酸残基を
示す。
【図１１】実施例４におけるプラスミドpＵＣＢＦＭ４
の構築図を示す。
【図１２】実施例４におけるプラスミドpＢＦＭ４の構
築図を示す。
【図１３】実施例４におけるプラスミドpＢＦＭ４が保
持するヒトbＦＧＦムテインＢＦＭ４をコードする塩基
配列と、対応するアミノ酸配列を示す。下線は、天然型
と異なる塩基を、上線は天然型と異なるアミノ酸残基を
示す。
【図１４】実施例５におけるプラスミドpＵＣＢＦＭ５
の構築図を示す。
【図１５】実施例５におけるプラスミドpＢＦＭ５の構
築図を示す。
【図１６】実施例５におけるプラスミドpＢＦＭ５が保
持するヒトbＦＧＦムテインＢＦＭ５をコードする塩基
配列と、対応するアミノ酸配列を示す。下線は、天然型
と異なる塩基を、上線は天然型と異なるアミノ酸残基を
示す。
【図１７】実施例２（２），３（２），４（２），５
（２）において、ムテインを発現する前と発現させた後
のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。ここにおいて、レー
ン１は分子量マーカーを、レーン２はＢＦＭ２，ＩＰＴ
Ｇ添加前を、レーン３はＢＦＭ２，ＩＰＴＧ添加後３時
間を、レーン４はＢＦＭ３，ＩＰＴＧ添加前を、レーン
５はＢＦＭ３，ＩＰＴＧ添加後３時間を、レーン６はＢ
ＦＭ４，ＩＰＴＧ添加前を、レーン７はＢＦＭ４，ＩＰ
ＴＧ添加後３時間を、レーン８はＢＦＭ５，ＩＰＴＧ添
加前を、レーン９はＢＦＭ５，ＩＰＴＧ添加後３時間
を、レーン１０は精製ムテインＣＳ２３をそれぞれ示
す。
【図１８】実施例２（２），３（２），４（２），５
（２）において、ムテインを発現させた菌体のＳＤＳ−
ＰＡＧＥと、イムノブロッティングの結果を示す。ここ
においてＡは、クーマシーブリリアントブルーによる蛋
白染色を、Ｂはイムノブロッティングをそれぞれ示す。
また、レーン１は分子量マーカーを、レーン２はＢＦＭ
２を、レーン３はＢＦＭ３を、レーン４はＢＦＭ４を、
レーン５はＢＦＭ５を、レーン６は精製ムテインＣＳ２
３をそれぞれ示す。
【図１９】実施例６におけるＢＦＭ５精製過程のサンプ
ルのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。ここにおいて、レ
ーン１はＱＡＥ−Toyopearlカラム素通り画分４.５μｌ
を、レーン２はＣＭ−Toyopearlカラム溶出液２倍希釈
後１０μｌを、レーン３はＣＭ−Toyopearlカラム溶出
液２倍希釈後３.５μｌを、レーン４は最終精製標品１.
１μｌ（１.０μg）を、レーン５は精製ムテインＣＳ２
３をそれぞれ示す。
【図２０】(Ａ)は、実施例７で得られた、ＢＦＭ４の精
製過程のサンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。
(Ｂ)は、実施例８で得られた酸化処理前（還元型）のＢ
ＦＭ４と、酸化処理後（酸化型）ＢＦＭ４の非還元ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥの結果を示す。
【図２１】(Ａ)は、実施例８で得られた、酸化処理前の
ＢＦＭ４を逆相ＨＰＬＣで分析した際の溶出パターンを
示す。(Ｂ)は、実施例８で得られた、酸化処理後のＢＦ
Ｍ４を逆相ＨＰＬＣで分析した際の溶出パターンを示
す。
【図２２】実施例９で得られた、pＨ２、３７℃での酸
化型ＢＦＭ４の安定性の結果を示す。
【図２３】実施例１０で得られた、pＨ７.４、５０℃で
の酸化型ＢＦＭ４の安定性の結果を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 38/22 Ａ６１Ｐ 17/02 Ａ６１Ｐ 7/02 43/00 １０７ 9/10 １０１ (Ｃ１２Ｎ 1/21 17/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） 43/00 １０７ (Ｃ１２Ｐ 21/02 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） 37/24 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C07K 14/50 ZNA C12N 1/21 C12N 15/09 C12N 15/16 C12N 15/70 C12P 21/02 A61K 38/00 A61K 38/22 A61P 7/02 A61P 9/10 101 A61P 17/02 A61P 43/00 107 C12N 1/21 C12R 1:19

Claims (9)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】配列番号：６で表わされるアミノ酸配列を
    有するヒト塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）また
    は配列番号：６で表わされるアミノ酸配列の第６９位お
    よび第８７位のＣｙｓがＳｅｒに置換されたアミノ酸配
    列を有するヒトｂＦＧＦムテインＣＳ２３を構成するア
    ミノ酸のうち第７５位のアミノ酸がシステインに置換さ
    れ、第９２位のシステインと相互にＳ−Ｓ結合形成可能
    なムテイン。
  2. 【請求項２】配列番号：６で表わされるアミノ酸配列を
    有するヒト塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）また
    は配列番号：６で表わされるアミノ酸配列の第６９位お
    よび第８７位のＣｙｓがＳｅｒに置換されたアミノ酸配
    列を有するヒトｂＦＧＦムテインＣＳ２３を構成するア
    ミノ酸のうち偶数個のシステインが１組毎に２０位−５
    ２位、２１位−１４２位、２７位−１３５位、３３位−
    ５０位、４９位−６９位または８１位−１２６位に置換
    により導入されたムテイン。
  3. 【請求項３】分子内の２つのシステインの間でＳ−Ｓ結
    合を形成せしめた請求項１または２記載のムテイン。
  4. 【請求項４】配列番号：７〜配列番号：１０のいずれか
    の配列番号で表わされるアミノ酸配列を有する、塩基性
    線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）のムテイン。
  5. 【請求項５】請求項１〜４のいずれかに記載のムテイン
    をコードする塩基配列を有する組換えＤＮＡ。
  6. 【請求項６】請求項５記載の組換えＤＮＡを含むベクタ
    ー。
  7. 【請求項７】請求項６記載のベクターを保持する形質転
    換体。
  8. 【請求項８】請求項７記載の形質転換体を培地に培養す
    ることを特徴とする請求項１〜４載のムテインの製造
    法。
  9. 【請求項９】請求項１〜４記載のムテインを酸化反応に
    付することを特徴とする請求項３記載のムテインの製造
    法。
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Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5817485A (en) * 1994-03-08 1998-10-06 Human Genome Sciences, Inc. Nucleic acids and cells for recombinant production of fibroblast growth factor-10
US6117455A (en) * 1994-09-30 2000-09-12 Takeda Chemical Industries, Ltd. Sustained-release microcapsule of amorphous water-soluble pharmaceutical active agent
EP0785948B1 (en) * 1994-10-13 2003-04-16 Amgen Inc., Analogs of keratinocyte growth factor
KR100374310B1 (ko) * 1995-02-14 2003-05-22 주식회사 엘지생명과학 변형된인간염기성섬유아세포성장인자및이의생산방법
US6110893A (en) * 1995-06-05 2000-08-29 Human Genome Sciences, Inc. Fibroblast growth factor 11
CA2218329A1 (en) * 1995-06-05 1996-12-12 Human Genome Sciences, Inc. Fibroblast growth factor-11
US6605441B1 (en) 1995-06-05 2003-08-12 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies against fibroblast growth factor 11
US5908400A (en) * 1996-06-20 1999-06-01 Hisamitsu Pharmaceutical Co., Inc. Device structure for iontophoresis
US6743422B1 (en) 1996-10-15 2004-06-01 Amgen, Inc. Keratinocyte growth factor-2 products
US6274712B1 (en) 1997-12-23 2001-08-14 3-Dimensional Pharmaceuticals, Inc. Analogs of human basic fibroblast growth factor mutated at one or more of the positions glutamute 89, aspartate 101 or leucine 137
AU2376000A (en) * 1999-12-22 2001-07-03 3-Dimensional Pharmaceuticals, Inc. Analogs of human basic fibroblast growth factor
US20030199024A1 (en) * 2002-04-19 2003-10-23 Hansen Ted H. Single chain trimers of class I MHC molecules
KR101778202B1 (ko) 2015-06-04 2017-09-13 (주)피앤피바이오팜 안정성이 증가된 인간 섬유아세포 성장인자-2 변이체 및 이의 용도
KR101841482B1 (ko) * 2016-02-25 2018-03-23 (주)피앤피바이오팜 안정성이 증가된 인간 섬유아세포 성장인자-9 변이체 및 이의 용도
KR101891678B1 (ko) * 2016-07-21 2018-08-27 (주)피앤피바이오팜 변형된 n-말단 아미노산 부위를 가지는 고안정성 섬유아세포 성장인자 변이체 및 그의 용도

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4588585A (en) * 1982-10-19 1986-05-13 Cetus Corporation Human recombinant cysteine depleted interferon-β muteins
US4518584A (en) * 1983-04-15 1985-05-21 Cetus Corporation Human recombinant interleukin-2 muteins
US5155214A (en) * 1984-03-05 1992-10-13 The Salk Institute For Biological Studies Basic fibroblast growth factor
US4959314A (en) * 1984-11-09 1990-09-25 Cetus Corporation Cysteine-depleted muteins of biologically active proteins
WO1989000198A1 (en) * 1987-07-07 1989-01-12 Biotechnology Research Associates, J.V. Recombinant fibroblast growth factors
DK122687A (da) * 1986-03-14 1987-09-15 Takeda Chemical Industries Ltd Polypeptid, dna og anvendelse deraf
JP2526965B2 (ja) * 1987-02-24 1996-08-21 武田薬品工業株式会社 ムテイン，ｄｎａおよびその用途
US4853871A (en) * 1987-04-06 1989-08-01 Genex Corporation Computer-based method for designing stablized proteins
KR890701607A (ko) * 1987-11-24 1989-12-21 원본미기재 섬유아세포 성장 인자의 유사체
GB8821795D0 (en) * 1988-09-16 1988-10-19 Erba Carlo Spa New derivatives of human/bovine basic fibroplast growth factor
US5130418A (en) * 1989-05-02 1992-07-14 California Biotechnology Inc. Method to stabilize basic fibroblast growth factor

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