KR101778202B1

KR101778202B1 - 안정성이 증가된 인간 섬유아세포 성장인자-2 변이체 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101778202B1
Application number: KR1020150078930A
Authority: KR
Inventors: 신항철; 오종광
Original assignee: (주)피앤피바이오팜
Priority date: 2015-06-04
Filing date: 2015-06-04
Publication date: 2017-09-13
Also published as: JP6665281B2; US11207257B2; JP2018522580A; KR20160142984A; US20200188267A1; WO2016195157A1

Abstract

본 발명은 고안정성 염기성 섬유아세포 성장인자 변이체 및 이의 용도에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 서열번호 1의 아미노산 서열 내 2개 이상의 아미노산이 세린으로 치환되고, 1개 이상의 아미노산이 시스테인으로 치환된, 고안정성 염기성 섬유아세포 성장인자(basic fibroblast growth factor, bFGF) 변이체(mutant), 상기 bFGF 변이체를 코딩하는 DNA 염기 서열, 상기 DNA 염기 서열을 포함하는 발현벡터, 상기 발현벡터에 의해 형질전환된 형질전환체, 상기 bFGF 변이체 생산 방법, 및 bFGF 변이체를 유효성분으로 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명에 의하면, 본 발명의 bFGF 변이체는 열 안정성과 수용액 상태에서의 안정성이 우수하여 유통과 보관 과정 중에서도 기존의 천연형 bFGF 제품과 다르게 활성을 잃지 않는 기능성화장품 및 피부 염증 치료제의 생산이 가능하다.

Description

안정성이 증가된 인간 섬유아세포 성장인자-2 변이체 및 이의 용도{A human basic fibroblast factor-2 mutant with high stability and use of the same}

본 발명은 고안정성 염기성 섬유아세포 성장인자 변이체 및 이의 용도에 관한 것이다.

삭제

성장인자는 세포의 성장, 증식, 분화를 조절하는 중요한 역할을 수행한다. 따라서 우리 몸은 상처, 수술 등 내적 및 외적 요인에 의한 피부의 손상과 노화에 대해 자연적으로 수리하는 시스템이 존재하며 여기서 중요한 역할을 담당하는것이 성장인자들이다. 각 조직의 기능을 유지하기 위해 각종 성장인자들이 생성되어 일정농도로 유지되면서 기능을 수행하고 있다. 나이가 들어감에 따라 피부 등 각 조직에서 성장인자들의 농도는 낮아지며, 세포의 재생 및 분열 기능이 약화되어 주름이 형성되고 탄력이 감소하는 등 노화가 진행된다.
그 중 bFGF(Basic Fibroblast Growth Factor, FGF-2)는 154개의 아미노산으로 구성되어 있으며, 분자량 17,123 달톤(Dalton)의 폴리펩타이드로 구성되어 있다. 이는 발생, 혈관생성 그리고 상처치유에 중요한 역할을 한다. bFGF는 마이토젠(Mitogen, 유사분열물질)과 화학 주성인자로써, 상처 치유, 혈관 생성, 그리고 신경계의 성장에서 강력한 매개체이다.
그러나, 이러한 혈액 및 조직에 존재하는 성장 인자들의 경우 그 체내 반감기가 수 분 정도로 아주 짧은 것으로 알려져 있으며, 특히 bFGF의 경우 그 구조상에 이황화결합을 형성하지 않는 4개의 시스테인 잔기를 가짐으로 인하여 단백질 안정성이 낮은 문제점을 갖고 있다.
또한, bFGF와 같은 단백질 치료제의 생물학적 이용도는 짧은 혈액 내 반감기 및 단백질 분해요소에 대한 감수성에 의해 종종 제한되어, 최대 임상 효능을 방해한다. bFGF의 효과를 더욱 획기적으로 개선하기 위해서는 체내에서의 안정성 외에도 체외에서의 물리 화학적 안정성을 향상 시켜야 의약외품 및 크림 등의 화장품의 제조, 보관, 유통과정에 사용이 증가할 것이다.
따라서, 보다 안정하면서도 활성이 잘 유지되는 신규 bFGF 변이체의 개발이 필요하다.
[선행 특허 문헌]

대한민국 특허공개번호 제1020090083062호

삭제

본 발명자들은 고안정성 bFGF 변이체(mutant)를 개발하기 위하여 예의 노력하였다. 그 결과, bFGF 단백질의 안정성을 증가시키고, 이합체화(dimerization)를 방지하기 위하여, 단백질의 아미노산 서열에 변형을 주는 방식의 분자설계 방식을 적용하여, 열안정성과 수용액 상태에서의 안정성이 우수한 효과를 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 bFGF 변이체 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 bFGF 변이체를 코딩하는 DNA 염기 서열을 제공 하는 데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 DNA 염기 서열을 포함하는 발현벡터를 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 발현벡터에 의해 형질 전환된 형질전환체를 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은bFGF 변이체(mutant) 생산 방법을 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 고안정성 bFGF 변이체를 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 화장료 조성물을 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 고안정성 bFGF 변이체를 유효성분으로 포함하는 피부 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 데 있다.

삭제

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열 내 2개 이상의 아미노산이 세린으로 치환되고, 1개 이상의 아미노산이 시스테인으로 치환되고, 표면의 아미노산 1개가 타이로신으로 치환된 bFGF 변이체를 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 bFGF는 분자량 약 18 kDa에 달하는 염기성 단백질(pI 9.58)로서 뇌하수체에서 주로 분비되며 다양한 중배엽 유래 세포의 성장을 촉진하는 것으로 알려져 있다. 또한, 이는 혈관 내막 세포 및 평활근 세포의 성장을 촉진하는 단백질로서 외상치료 및 맥관 형성에 탁월한 효능을 나타내고, 콜라겐과 엘라스틴의 합성을 증가시킴으로써 피부의 탄력을 유지하며, 정상적인 세포의 성장을 돕고 상처로부터의 회복을 촉진하고, 그 치유작용을 수행하는 것으로 알려져 있다.
본 발명의 변이체는, bFGF의 3차 구조와 종간의 상동성 정렬(homology alignment) 방법 및 컴퓨터를 이용한 단백질 분자 모델링을 통해, bFGF의 활성부위와 관련 없는 부위를 선정하고, 변이실험을 통해 제조된 변이체로서, bFGF와 다른 bFGF가 이황화결합을 형성하는 시스테인 아미노산 잔기가 유사한 구조의 세린 잔기로 치환되어 표면의 이황화결합으로 인한 침전에 대하여 안정성이 증가된다. 또한 bFGF 내 루프에서 가까운 잔기 1개를 시스테인으로 치환시켜 이황화결합을 추가적으로 생성시킴으로써 루프 엔트로피(loop entropy)를 감소시키는 방법으로 안정성이 증가된 것을 특징으로 한다. 또한, bFGF 내에 히스티딘 잔기를 타이로신으로 치환함으로써 수소결합 및 반데르발스결합(van der waals interaction) 을 증가시켜 단백질의 구멍(cavity) 구조를 안정시키는 방법으로 안정성이 증가된 것을 특징으로 한다.
본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 상기 세린으로 치환된 아미노산은 서열번호 1의 아미노산 서열에서 69 번째 시스테인 및 87 번째 시스테인이다.
본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 상기 시스테인으로 치환된 아미노산은, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 26 번째 라이신; 서열번호 1의 아미노산 서열에서 34 번째 아이소루신; 서열번호 1의 아미노산 서열에서 40 번째 발린; 서열번호1의 아미노산 서열에서 50 번째 히스티딘; 서열번호 1의 아미노산 서열에서 52 번째 라이신; 서열번호 1의 아미노산 서열에서 75 번째 알라닌; 서열번호 1의 아미노산 서열에서 76 번째 메사이오닌; 서열번호 1의 아미노산 서열에서 117 번째 알라닌; 서열번호 1의 아미노산 서열에서 67 번째 글라이신; 서열번호 1의 아미노산 서열에서 68 번째 발린; 서열번호 1의 아미노산 서열에서 70 번째 알라닌; 서열번호 1의 아미노산 서열에서 82 번째 루이신; 서열번호 1의 아미노산 서열에서 84 번째 알라닌; 서열번호 1의 아미노산 서열에서 108 번째 세린; 서열번호 1의 아미노산 서열에서 136 번째 알라닌; 서열번호 1의 아미노산 서열에서 137 번째 아이소루신; 서열번호 1의 아미노산 서열에서 138 번째 루이신; 및 서열번호 1의 아미노산 서열에서 144 번째 알라닌으로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상이고, 보다 바람직하게는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 40 번째 발린; 서열번호 1의 아미노산 서열에서 50 번째 히스티딘; 서열번호 1의 아미노산 서열에서 52 번째 라이신; 서열번호 1의 아미노산서열에서 75 번째 알라닌; 서열번호 1의 아미노산 서열에서 76 번째 메사이오닌; 서열번호 1의 아미노산 서열에서 117 번째 알라닌으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상이며, 가장 바람직하게는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 75 번째 알라닌이다.
추가적인 변이체로 75 번째 알라닌을 시스테인으로 치환한 변이체에 단백질 표면에 노출 되어진 잔기인 히스티딘 50 번 잔기를 타이로신으로 치환한 변이체가 가장 바람직한 변이체이다.
즉, 본 발명의 bFGF 변이체는 천연형 인간 bFGF 아미노산 서열(서열번호 1)의 69 번째 및 87 번째 아미노산 잔기인 시스테인이 모두 세린으로 치환되고, 50 번째 히스티딘의 타이로신으로 치환되고, 75 번째 아미노산 잔기인 알라닌이 시스테인으로 추가 치환되어, 분자 내 이황화 결합을 형성하고 나머지 아미노산 서열은 천연형의 아미노산 서열과 동일한 인간 bFGF 변이체를 제공한다. 본 발명의 bFGF 변이체는 단백질 활성은 유지하면서 열에 대한 안정성이 천연형에 비해 증가한다. 하기 실험예 1 내지 3에서 보는 바와 같이 bFGF 변이체는 천연형과 동등한 활성을 지니고 있으며, 열에 대한 안정성이 역시 현저히 증가되었음을 알 수 있다. bFGF 변이체 중에서 69 번과 87 번 아미노산을 세린으로 치환하고, 75 번 아미노산을 시스테인으로 치환한 후 이황화결합을 유도한 본 발명의 K75는 대조군인 천연형 bFGF, 69 번과 87 번 아미노산을 세린으로 치환한 bFGF 변이체, 75 번 아미노산을 시스테인으로 치환한 bFGF 변이체에 비하여 열안정성이 향상되었다. 또한 상기 K75의 50 번 히스티딘이 타이로신으로 치환된 HsbFGF 의 경우 대조군인 천연형 및 K75 보다 뛰어난 열안정성의 향상을 나타내었다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 bFGF 변이체를 코딩하는 DNA염기 서열(서열번호 2) 및 이를 포함하는 발현벡터를 제공한다.
본 발명의 발현벡터는 일반적인 발현용 벡터에 bFGF의 유전자를 삽입하여 제조될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 발현용 벡터로 pET21a 벡터를 사용하였으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니며 일반적으로 사용할 수 있는 모든 세포 발현용 벡터를 사용할 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 pET21a 벡터에 bFGF 유전자를 삽입한 벡터를 제조하고, 이를 "pSSB-bFGF"라 명명하였다(도 1b).
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 발현벡터에 의해 형질전환된 숙주세포인 형질전환체를 제공한다.
본 발명의 bFGF 변이체는 부위특이 돌연변이 유도법 등에 의해 제조한 bFGF 변이체를 코딩하는 유전자를 함유하는 벡터로 숙주세포를 형질 전환시켜 bFGF 변이체를 발현시키는 방법으로 제조할 수 있으며, 또한 화학적 아미노산 합성 방법에 의해 제조될 수 있다.
bFGF 변이체를 코딩하는 DNA는 천연형 bFGF의 상기 치환되는 부위의 아미노산을 코딩하는 DNA이다. bFGF 변이체를 코딩하는 DNA 서열로서 바람직한 것은 69 번째와 87 번째 코돈이 세린을 코딩하는 코돈으로 치환되고, 75 번째 코돈이 시스테인을 코딩하는 코돈으로 치환된 것이다. 또한 상기 K75의 50 번 히스티딘이 타이로신으로 치환된 HsbFGF 의 경우 대조군인 천연형 및 K75 보다 뛰어난 열안정성을 나타내었다. 한편, 코돈의 퇴화(degeneracy)에 의해 하나의 아미노산을 코딩하는 코돈이 다수 존재하기 때문에 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 DNA라도 그 뉴클레오티드 서열이 다를 수 있음은 주지된 사실이다.
이와 같은 bFGF 변이체을 코딩하는 DNA는 화학적으로 합성하거나 천연형 bFGF cDNA를 제조하여 이를 바탕으로 부위특이 돌연변이 유도법 등의 방법을 사용하여 제조할 수도 있다.
상기 제조된 본 발명의 bFGF 변이체를 코딩하는 DNA는 당 분야에 잘 공지된 적당한 원핵 또는 진핵 발현 시스템 중 어느 하나를 사용하여 이를 발현시킬 수 있다(Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Habor Laboratory, Cold Spring Habor Laboratory Press, USA, 1989).
발현은 당화되지 않은 bFGF 변이체의 경우 바람직하게는 대장균, 예를 들어, 대장균 BL21(DE3), 대장균 JM109(DE3), 대장균 NM522 등에서 수행되며, 대장균에서의 발현을 위해 사용될 수 있는 적당한 벡터들은 샘브룩 등의 문헌(상동) 및 피어스(Fiers)등의 논문("Proceed. 8th Int. Biotechnology Symposium", Soc. Frac, de Microbiol., Paris,(Durand et al., eds.), pp. 680-697, 1988)에 언급되어 있다. 상술한 벡터에 의한 숙주세포의 형질전환은 통상적인 방법 중 어느 하나에 의해 수행될 수 있다(Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 1989;Ito et al., J. Bacteriol. 153:263, 1983).
대장균을 형질 전환시킬 경우, DNA를 흡수할 수 있는 콤피턴트 세포(competent cell)를 준비하고, 이어서 공지된 방법 등에 따라 처리할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 고안정성 bFGF 변이체 생산 방법을 제공한다:
(a) 상기 형질전환체를 배양하는 단계; 및
(b) 상기 단계 (a)에서 얻은 배양액으로부터 변이체를 분리하는 단계.
본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 상기 방법의 (b) 단계는,
(c) 상기 형질전환체를 세포 파쇄하고 응집체를 분리하는 단계;
(d) 상기 분리된 응집체를 제거하는 단계;
(e) 상기 응집체가 제거된 상층액을 이온교환수지 크로마토그래피를 이용하여 분리정제 하는 단계; 및
(f) 상기 이온교환 수지 후 고안정성 염기성 섬유아세포 성장인자 변이체를 헤파린 친화 크로마토그래피를 이용하여 분리 정제하는 단계를 포함한다.
일반적으로, 목적 발현 벡터를 함유하는 숙주 미생물은 목적 단백질의 생산을 최대화하는 범위에서 그들의 최적 성장 조건에서 배양된다. 예를 들면, 엠피실린 저항 유전자를 선택 표지로 함유하는 벡터로 형질 전환된 대장균 BL21(DE3) 세포는 엠피실린이 함유된 LB 배지에서 37 ℃로 배양한다.
형질 전환된 숙주세포를 배양한 후 생산된 bFGF 변이체의 회수 및 정제는 당해 분야에 공지된 여러 방법 또는 그들을 조합하여 사용함으로써 수행할 수 있다.
예를 들면, 형질 전환된 대장균 세포에서 발현된 bFGF 변이체는 세포 배양물로부터 또는 세포의 파쇄 후에 단백질 화학계에 공지된 적합한 방법에 의해 추출함으로써 회수될 수 있다.
바람직하게는, bFGF 변이체를 정제하기 위해, 재조합 대장균 세포의 배양액을 원심 분리하여 세포를 수확하고, 수확한 세포를 리소자임이 첨가된 완충용액에 현탁시키고 초음파로 파쇄한다. 세포 파쇄액을 원심분리하여 불용성 과립형태의 응집체를 분리하고, 상기 분리된 응집체를 제거한다. 상기 응집체가 제거된 상층액을 이온교환수지 크로마토그래피를 이용하여 분리정제하고, 이온교환 수지 후 헤파린 친화 크로마토그래피를 이용하여 분리 정제하여 결과물인 고안정성 bFGF 변이체를 획득한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 고안정성 bFGF 변이체를 유효성분으로 포함하는 피부 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
하기의 실시예에서 입증된 바와 같이, 본 발명의 고안정성 bFGF 변이체는 천연 bFGF와 동일한 활성을 갖고, 매우 우수한 열안정성 및 수용액에서의 안정성을 갖는다. 따라서, 본 발명의 조성물은 피부 질환의 예방 또는 치료에 매우 유효하다.
바람직하게는, 본 발명의 조성물은 피부 염증, 급ㆍ만성 습진, 접촉성 피부염, 아토피성 피부염, 지루성 피부염, 만성 단순태선, 간찰진, 박탈 피부염, 구진상 두드러기, 건선, 일광 피부염 및 여드름과 같은 피부 질환의 예방 또는 치료에 이용된다.
또한, 본 발명의 조성물은 창상 치료용 조성물을 제공할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 조성물은 폐쇄창(closed wound) 및 개방창(open wound)의 치료에 이용된다. 폐쇄창의 예는 좌상(contusion or bruise)을 포함하고,개방창의 예는 찰과상(abrasion), 열상(laceration), 결출상(avulsion), 관통상(penetrated wound) 및 총상(gun shot wound)을 포함한다.
본 발명의 조성물은 (a) 상술한 본 발명의 bFGF 변이체의 약학적 유효량; 및
(b) 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학적 조성물이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "약학적 유효량"은 상술한 bFGF 변이체의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.
본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토오스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구, 바람직하게는 비경구로 투여 할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥 내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 국소 투여, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학적 조성물의 바람직한 1일 투여량은 0.001-100 ㎎/㎏이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다 용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제, 캅셀제 또는 젤(예컨대, 하이드로젤) 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 고안정성 bFGF 변이체를 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
하기의 실시예에서 입증된 바와 같이, 본 발명의 고안정성 bFGF 변이체는 천연 bFGF와 동일한 활성을 갖고, 매우 우수한 열안정성 및 수용액에서의 안정성을 갖는다. 따라서, 본 발명의 조성물은 피부 상태의 개선에 매우 유효하다.
바람직하게는, 본 발명의 조성물은 주름개선, 피부탄력 개선, 피부노화 방지, 탈모 방지 또는 발모촉진, 피부보습 개선, 검버섯 제거 또는 여드름 치료와 같은 피부 상태의 개선에 이용된다.
본 발명의 조성물은 (a) 상술한 본 발명의 bFGF 변이체의 화장품학적 유효량(cosmetically effective amount); 및 (b) 화장품학적으로 허용되는 담체를 포함 하는 화장료 조성물이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "화장품학적 유효량"은 상술한 본 발명의 조성물의 피부 개선 효능을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.
본 발명의 화장품 조성물은 당 업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.
본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토오스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소 결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등 이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 화장품 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분으로서의 bFGF 변이체 와 담체 성분 이외에, 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제를 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물들은 상술한 본 발명의 고안정성 bFGF 변이체를 유효성분으로 포함하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.

본 발명에 의하면, 본 발명의 bFGF 변이체는 열 안정성과 수용액 상태에서의 안정성이 우수하여 유통과 보관 과정 중에서도 기존의 천연형 bFGF 제품과 다르게 활성을 잃지 않는 기능성화장품의 생산 및 피부창상 피복제등으로 활용이 가능하다.

도 1은 플라스미드 pSSB-bFGF의 조립에 관한 개요를 보여준다.
도 2a는 천연형 bFGF(lane 2~4)와 bFGF 변이체(K75)(lane5~7)의 세포 파쇄 이후의 SDS-PAGE 결과를 보여준다: M(size marker), T(세포파쇄 후 현탁액), S(세포 파쇄 후 상층액), P(세포파쇄 후 불용성 응집체).
도 2b는 bFGF 변이체(K75)의 정제결과를 보여주는 SDS-PAGE결과이다.
도 3은 천연형 bFGF와 bFGF 변이체(K75)의 열안정성의 지표인 Tm(melting temperature)의 차이를 CD 결과를 통해 보여준다.
도 4는 천연형 bFGF와 bFGF 변이체(K75)의 활성 비교결과를 보여준다.
도 5는 천연형 bFGF와 bFGF 변이체(K75)를 인체의 상태와 가장 유사한 PBS(phosphate buffer saline)상태에서 25 ℃ 온도로 20일간 인큐베이션한 후의 안정성 비교결과를 보여준다.
도 6는 천연형 bFGF(A)와 bFGF 변이체(K75)(B)의 최종 정제 후 SDS-PAGE 를 이용한 분석이다.
도 7는 천연형 bFGF와 bFGF 변이체(K75) 및 HsbFGF의 열안정성의 지표인 Tm(Melting temperature)의 차이를 CD 결과를 통해 보여준다.
도 8는 bFGF 변이체(K75) 및 HsbFGF를 인체의 상태와 가장 유사한 PBS 상태에서 50 ℃로 일주일간 인큐베이션한 후의 안정성 비교결과를 보여준다.
도 9는 천연형 bFGF 와 bFGF 변이체(K75) 및 HsbFGF를 인체의 상태와 가장 유사한 PBS상태에서 60 ℃로 5 일간 인큐베이션한 후의 안정성 비교결과를 보여준다.
도 10는 천연형 bFGF 와 bFGF 변이체(K75) 및 HsbFGF를 인체의 상태와 가장 유사한 PBS상태에서 60 ℃ 온도로 5 일간 인큐베이션한 후 HPLC 정량 비교한 결과를 보여준다.
도 11는 천연형 bFGF와 본 발명의 bFGF 변이체들 의 bFGF 활성 비교결과를 보여준다.

삭제

이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실험방법 및 재료

DNA 컨스트럭션(construction)
단백질 발현 벡터인 pET21a(도 1a)와 발현용 대장균 균주로는 BL21(DE3),
Rosetta(DE3)을 Novagen에서 구입하였으며 클로닝용 대장균 균주는 Top10을 사용하였다. 유전자 재조합 시 사용된 제한효소는 모두 NEB(New England Biolabs)의 제품이며, 리가제는 Roche사의 T4 DNA 리가제이다. PCR시 사용된 Ex taq DNA 중합효소는 Takara사의 제품이며, 점 돌연변이에 사용된 pfu Ultra™HF DNA 중합효소는 Agilent사의 제품이다. DNA gel extraction kit, plasmid mini prep kit는 (주)코스모진텍의 제품이다. 또한, 프라이머들은 (주)코스모진텍에서 제작하였으며, DNA 시퀀싱도 (주)코스모진텍에 의뢰하여 수행하였다.

삭제

단백질 발현(Protein expression)
발현 유도체인 IPTG(isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside)와 항생제로 쓰인 앰피실린과 클로람페니콜은 모두 Sigma에서 구입하였다. 대장균 배양 LB배지를 만들 때 사용한 bacto tryptone, yeast extract는 BD(Becton Dicknson)사에서 구입하였으며, NaCl은 덕산 제품을 사용하였다.

삭제

단백질 정제(Protein purification)
정제과정에 사용되는 시약은 최대한 순도가 높은 제품을 사용하였으며, 정제 과정에서 사용한 시약은 모노나트륨인산염(Sigma), 디소듐포스페이트(Sigma), 염화나트륨(Sigma) 이다. FPLC에서 사용된 column은 SP-세파로오즈, 헤파린 affinity column이다.
FPLC(Fast protein liquid chromatography)

삭제

FPLC는 GE UPC-800을 사용하였다.

삭제

CD(Circular dichroism )

CD는 Jasco사의 J-810 spectropolarimeter를 사용하였다.

상동성 모델링 (Homology modeling)

Homology modeling은 Modeller(Andrej Sali)를 이용하였다.
에너지 최소화(Energy minimization)
에너지 최소화는 Chimera에 포함된 Amber 99FF force filed를 사용하였다.

삭제

이황화결합 예측(Disulfide predict)
이황화결합의 형성 예측은 YASARA Web server를 이용하였다.

삭제

이황화결합 거리 측정
이황화결합이 가능한 거리를 측정해주는 plotting program은 Protein
contact map visualization (Andreas Viklund.)을 이용하였다.

단백질의 구조

PDB에 등록된 4FGF, 1BLA 1BLD를 사용하였다.

벡터 시스템(Vector system)

변이체 bFGF을 생산하기 위한 발현 벡터로 pET21a vector(Novagen)을 사용하였다. 천연형 bFGF 유전자는 (주)PnP Biopharm에서 얻었으며 이를 하기 프라이머를 사용하여 PCR(polymerase chain reaction)을 통해 천연형을 증폭시켰다. 이렇게 얻은 PCR 산물을 pET21a 벡터에 제한효소인 NdeI, XhoI을 처리한 후 삽입하여 접합시켰다.

점 돌연변이(Point mutation)
bFGF의 안정성을 증가시키기 위하여 단백질의 구조(PDB:4FGF)와 분자모델방법을 통하여 변화시킬 아미노산 부분을 찾았고, 하기 프라이머(하기 실시예4)를 사용하여 pfu Ultra™ DNA 중합효소를 이용하여 Quikchange mutagenesis 방법을 이용하여 증폭시켰다. 사용한 천연형 bFGF 주형을 제거하기 위하여 DpnI 반응을 진행하여 Top10에 형질전환(transformation)시켰고, 시퀀싱을 통하여 변이체를 확인하였다.

삭제

천연형 및 변이체 bFGF의 발현
bFGF가 삽입된 재조합 벡터를 대장균 BL21(DE3)에 열 충격 방법으로 형질전환시켰다. 이 대장균 균주를 50 ug/ml 앰피실린을 포함하는 500ml LB 배지에 접종하여 O.D₆₀₀값이 0.6이 될 때까지 37 ℃에서 키웠다. 그 후 0.5 mM IPTG(isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside)를 넣어 4시간 배양한 후 O.D₆₀₀값이 2.0 이상이 되면 8000 rpm에서 10 분 동안 원심 분리하여 세포를 취했다.

삭제

세포 파쇄
bFGF 단백질을 발현시킨 대장균에서 단백질을 얻기 위해 세포를 파쇄 하였다. harvest한 세포를 20 mM 인산염완충액(pH7.0)에 현탁하여 4 ℃에서 sonicator로 파쇄 하였다. 이 후, 13000 rpm으로 15분간 4 ℃에서 원심 분리하여 불용성 물질(inclusion body)을 제거한 후 상층액을 취해 SDS-PAGE로 확인하였다.

삭제

형질전환체(transformation)의 정제
초음파처리를 통해 파쇄된 세포 용해액을 4 ℃에서 13000 rpm으로 15 분간 원심 분리하였다. 상층액을 취해서 0.45 um 필터를 이용하여 필터링을 하고 이 용액을 FPLC SP칼럼과 헤파린 컬럼을 이용하여 정제하였다. 이때 정제 조건은 20 mM 인산염완충액(pH 7.0)에 100mM NaCl 용액 A와 20 mM 인산염완충액(pH 7.0)에 1M NaCl B를 SP칼럼에 2 ml/분의 속도로 0 % A에서 100% B까지 직선 구배로 흘려주어 용출시킨 후 약 18 kDa 크기의 bFGF 단백질을 포함하는 분획을 모았다. 이후 20 mM 인산염완충액(pH 7.0)에 500 mM NaCl용액 A와 20 mM 인산염완충액(pH 7.0)에 2 M NaCl B를 heparin affinity 칼럼에 2 ml/분의 속도로 0 % A에서100 % B까지 직선 구배로 흘려주어 용출시킨 후 약 18 kDa 크기의 bFGF 단백질을 포함하는 분획을 모았다. 이때 bFGF를 포함하는 분획을 SDS-PAGE 분석법으로 확인 후에 정량을 진행하였다.

삭제

분자 모델링(Molecular modeling)
PDB에 등록된 단백질의 구조인 1BLA(NMR)을 이용하여 이황화결합이 가능 후보군을 설정하였다. Protein contact map visualization 프로그램을 이용하여 두 개의 아미노산의 C-alpha 탄소의 거리가 7Å 이하, C-beta 탄소의 거리가 5Å인 잔기를 plot 을 이용하여 분석하였다. 이후 Yasara energy minimization server를 이용하여 이황화결합의 생성유무를 분석 하였고 chimera의 AMBER force filed FF99를 이용하여 에너지 최소화를 진행하였다. 이후 생성된 단백질의 구조를 천연형의 bFGF와 정렬하여 RMSD를 측정 0.5이하인 값을 갖는 구조를 찾아내었다.

삭제

CD(Circular dichroism)
천연형 bFGF와 변이체의 구조분석 및 Tm 측정을 위하여 각각의 bFGF를 20 mM 인산염완충액(pH 7.05)에 녹여 최종농도가 0.2 mg/ml이 되도록 일정하게 녹인 후. 0.1 cm cell에 넣어 190 nm ~ 250 nm 영역으로 band width 1 nm, response 0.25 sec, data pitch 0.1 nm, scanning speed 20 nm/min, cell length 1 cm, accumulation 8번, 온도는 20 ℃ 조건으로 구조를 분석하였다. 또한, 온도 안정도를 분석하기 위하여 20 ℃와 95 ℃에서의 205 nm 파장에서 0.1 cm cell에 0.2 mg/ml 농도로 온도 안정도 분석을 진행하였다. 분석 조건은 1 ℃/min의 조건으로 20 ℃ ~95 ℃까지 측정하였다.
이황화결합이 가능한 잔기번호와 예측결과를 표 1에 나타내었다.

삭제

세포 증식 분석(Cell proliferation assay)
만들어진 천연형 bFGF와 변이체가 실제로 활성을 나타내는지 확인하기 위하여 세포 증식 능력을 이용한 실험을 (주)제네웰에 의뢰하여 진행하였다. 실험에 사용한 NIH-3T3 cell은 10 % 열-불활성화된 소태아혈청(fetal bovine serum), 100 units/ml의 페니실린, 100 mg/ml의 스트렙토마이신이 포함된 DMEM complete배지을 이용하였다. 96 well culture plate에 2x10³cells/well의 NIH-3T3 cell을 분주(seeding)하였다. 24시간 배양된 NIH-3T3 cell은 serum-free DMEM 배지로 기아(starvation) 후에 0.5 % FBS가 포함된 DMEM 배지에 샘플 용액을 각각의 농도 별로 처리하고, 72 시간 배양하였다. 배양 후 10 ul의 MTT[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide] 용액을 첨가하고 2시간 반응시킨 후 100 ul의 DMSO로 formazan crystal을 용해시켰다. 흡광도는 분광광도계를 이용해 540 nm 파장에서 측정하였다. 약제에 대한 감수성은 약제를 처리하지 않은 well(대조군)의 흡광도에 대한 약제처리 well에서의 백분율로 비교하였다.

삭제

인큐베이션 테스트(Incubation test)
실온에서 보관정도를 확인하기 위하여 천연형 bFGF와 변이체의 인큐베이션 테스트를 진행하였다. 1X PBS(pH 7.3)에서 각각의 천연형 FGF-2와 변이체들을 0.5 mg/ml로 녹인 후 37 ℃, 50 ℃ 와 60 ℃ 항온수조에서 인큐베이션 테스트를 하였다. 각각의 시료들을 24시간 단위로 채취하여 13000 rpm으로 15분간 4 ℃에서 원심 분리하여 상층액만 얻어 Nano drop을 통한 정량 및 HPLC 분석을 진행하였다.

삭제

<실시예 1: 사람 bFGF cDNA를 포함하는 pSSB-bFGF 플라스미드의 구축>

사람 단핵세포 cDNA 라이브러리를 주형으로 하고 프라이머를 사용하여 중합효소연쇄 반응에 의해 bFGF를 코딩 하는 DNA를 준비하였다. 사용한 프라이머의 염기 서열은 다음과 같다:

센스프라이머 5'-GGCGGGCATATGCCCGCCTTGCCCGAGG-3'(서열번호 3) 및

안티센스프라이머 3'-TGATGAGGATCCTCATCAGCTCTTAGCAGACAT-5'(서열번호 4).
도 1b의 bFGF 부분을 상기에 명시된 프라이머를 이용하여 증폭하였고, 증폭된 DNA 절편 1 ug을 50 ul TE(pH8.0) 용액에 녹인 후 2 단위의 Nde I(NEB사)과 2단위의 Bam H I(NEB사)과 섞은 후, 37℃에서 2시간 동안 반응시켜 5'-말단에 Nde I 제한효소 부위와 3'-말단에 Bam H I 제한효소 부위를 갖도록 하였다. DNA 정제 키트(GeneAll사)를 사용하여 DNA만을 정제한 후, 이 DNA 절편 20 ng을 동일한 방법으로 NdeI과 BamHI 으로 각각 처리하여 준비한 20 ng의 pET21a(+) 플라스미드 (Novagen사)와 함께 10 ul의 TE(pH 8.0) 용액에 섞은 후, 1 단위의 T4 DNA리가제 (NEB사)를 첨가하여 16 ℃에서 4시간 동안 반응시켜 접합시켰다. 이렇게 만들어진 플라스미드를 pSSB-bFGF이라고 명명하였다.

삭제

<실시예 2: 사람 bFGF의 대장균 형질 전환체의 제조>
발현 플라스미드 pSSB-bFGF로 대장균 BL21(DE3)에 열 충격으로 형질전환시켰다. 형질전환 후 고체 배지에 생기는, 앰피실린에 저항성이 있는 콜로니를 선별하여 10 ml의 LB배지(LB/앰피실린)에 접종하였다. 37 ℃에서 12시간 동안 배양한 후 제조한 균주를 100 % glycerol와 1:1로 섞어 -70 ℃에 스탁을 보관하였다.

삭제

<실시예 3: 사람 bFGF의 정제>
실시예 2에서 만든 재조합 균주를 10 ml의 LB배지(LB/앰피실린)에 접종한 후 12시간 이상 배양하였다. 그 후 500 ml의 LB배지(LB/앰피실린)에 옮겨 600 nm에서 흡광도가 O.D 0.4~0.5일 때 IPTG(isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside)를 최종 농도가 0.5 mM이 되도록 넣었다. 37 ℃에서 4시간 동안 200 rpm 속도로 진탕 배양한 후 8000 rpm에서 10분간 원심 분리하여 대장균 펠렛(pellet)을 얻었다. 이 펠렛을 25 ml의 20 mM 인산염완충액(pH 7.0)에 현탁시킨 후 초음파 처리방법으로 세포를 파쇄하였다.
초음파처리를 통해 파쇄된 세포 용해액을 4 ℃에서 13000 rpm으로 15분간 원심 분리하였다. 상층액을 취해서 0.45 um 필터를 이용하여 필터링을 하고 이 용액을 FPLC(Fast performance liquid chromatography)와 SP칼럼과 헤파린 컬럼을 이용하여 정제하였다. 이때 정제 조건은 20 mM 인산염완충액(pH 7.0)에 100 mM NaCl 용액 A와 조건은 20 mM 인산염완충액(pH 7.0)에 2 M NaCl 용액B를 SP 칼럼에 2 ml/분의 속도로 0 % A에서 50 % B까지 직선 구배로 흘려주어 용출시킨 후 약 18 kDa 크기의 bFGF 단백질을 포함하는 분획을 모았다. 이후 20 mM 인산염완충액(pH 7.0)에 100mM NaCl 용액 A와 20 mM 인산염완충액(pH 7.0)에 2M NaCl B를 SP 칼럼에 2 ml/분의 속도로 50 % A에서 100% B까지직선 구배로 흘려주어 용출시킨 후 약 18 kDa 크기의 bFGF 단백질을 포함하는 분획을 모았다. 이때 bFGF를 포함하는 분획을 SDS-PAGE 분석법으로 확인 후에 정량을 진행하였고 10mg의 bFGF를 획득하였다.

삭제

<실시예 4: pSSB-bFGF 변이체 플라스미드의 구축>

천연형의 pSSB-bFGF 플라스미드를 주형으로 pfuUltra™HF DNA 중합효소를 이용하여 각각의 변이체들에 해당하는 두 상보적인 프라이머를 이용하여 PCR에 의해 pSSB-bFGF 변이체 플라스미드들을 만들었다. 그리고 DpnI을 이용하여 주형이었던 천연형의 pSSB-bFGF 플라스미드를 절단 한 후 대장균 Top10에 열 충격으로 형질전환 시켰다. 형질전환 후 고체 배지에 생기는 앰피실린에 저항성이 있는 콜로니를 선별하여 10 ml의 LB배지(LB/앰피실린)에 접종하였다. 37 ℃에서 16시간동안 배양한 후 DNA prep을 실시하고 얻어진 DNA를 시퀀싱을 통하여 pSSB-bFGF 변이체 플라스미드를 확인하였다. 이때 사용한 프라이머의 염기서열은 다음과 같다:

69 번째 시스테인의 코돈인 TGT가 세린의 코돈인 TCT로 치환시 센스프라이머 5'-TCT ATC AAA GGA GTG TCT GCT AAC CGT TAC CTG-3'(서열번호 5) 및 안티센스프라이머 3'-CAG GTA ACG GTT AGC AGA CAC TCC TTT GAT AGA-5'(서열번호 6);

87 번째 시스테인의 코돈인 TGT가 세린의 코돈인 TCT로 치환시 센스프라이머 5'-TTA CTG GCT TCT AAA TCT GTT ACG GAT GAG TGT-3'(서열번호 7) 및 안티센스프라이머 3'-ACA CTC ATC CGT AAC AGA TTT AGA AGC CAG TAA-5'(서열번호 8);

75 번째 알라닌의 코돈인 GCT가 시스테인의 코돈인 TGC로 치환시 센스프라이머 5'-GCT AAC CGT TAC CTG TGC ATG AAG GAA GAT GGA-3'(서열번호 9) 및 안티센스프라이머 3'-TCC ATC TTC CTT CAT GCA CAG GTA ACG GTT AGC-5'(서열번호 10);

26 번째 라이신의 코돈인 AAA가 시스테인의 코돈인 TGC로 치환시 센스프라이머 5'-AAG CGG CTG TAC TGC TGC AAC GGG GGC TTC TTC-3'(서열번호 11) 및 안티센스프라이머 3'-GAA GAA GCC CCC GTT GCA GCA GTA CAG CCG CTT-5'(서열번호 12);

34 번째 아이소루신의 코돈인 ATC가 시스테인의 코돈인 TGC로 치환시 센스프라이머 5'-GGC TTC TTC CTG CGC TGC CAC CCC GAC GGC CGA-3'(서열번호 13) 및 안티센스프라이머 3'-TCG GCC GTC GGG GTG GCA GCG CAG GAA GAA GCC-5'(서열번호 14);

40 번째 발린의 코돈인 GTT가 시스테인의 코돈인 TGC로 치환시 센스프라이머 5'-CAC CCC GAC GGC CGA TGC GAC GGG GTC CGG GAG-3'(서열번호 15) 및 안티센스프라이머 3'-CTC CCG GAC CCC GTC GCA TCG GCC GTC GGG GTG-5'(서열번호 16);

50 번째 히스티딘의 CAC가 시스테인의 코돈인 TGC로 치환시 센스프라이머 5'-GAG AAG AGC GAC CCT TGC ATC AAG CTA CAA CTT-3'(서열번호 17) 및 안티센스프라이머 3'-AAG TTG TAG CTT GAT GCA AGG GTC GCT CTT CTC-5'(서열번호 18);

52 번째 라이신의 코돈인 AAG가 시스테인의 코돈인 TGC로 치환시 센스프라이머 5'-AGC GAC CCT CAC ATC TGC CTA CAA CTT CAA GCA-3'(서열번호 19) 및 안티센스프라이머 3'-TGC TTG AAG TTG TAG GCA GAT GTG AGG GTC GCT-5'(서열번호 20);

76 번째 메사이오닌의 코돈인 ATG가 시스테인의 코돈인 TGC로 치환시 센스프라이머 5'-AAC CGT TAC CTG GCT TGC AAG GAA GAT GGA AGA-3'(서열번호 21) 및 안티센스프라이머 3'-TCT TCC ATC TTC CTT GCA AGC CAG GTA ACG GTT-5'(서열번호 22);

117 번째 알라닌의 코돈인 GCA가 시스테인의 코돈인 TGC로 치환시 센스프라이머 5'-ACC AGT TGG TAT GTG TGC CTG AAG CGA ACT GGG-3'(서열번호 23) 및 안티센스프라이머 3'-CCC AGT TCG CTT CAG GCA CAC ATA CCA ACT GGT-5'(서열번호 24);

67 번째 글라이신의 코돈인 GGA가 시스테인의 코돈인 TGC로 치환시 센스프라이머 5'-GTT GTG TCT ATC AAA TGC GTG TCT GCT AAC CGT-3'(서열번호 25) 및 안티센스프라이머 3'-ACG GTT AGC AGA CAC GCA TTT GAT AGA CAC AAC-5'(서열번호 26);

68 번째 발린의 코돈인 GTG가 시스테인의 코돈인 TGC로 치환 센스프라이머 5'-GTG TCT ATC AAA GGA TGC TCT GCT AAC CGT TAC-3'(서열번호 27) 및 안티센스프라이머 3'-GTA ACG GTT AGC AGA GCA TCC TTT GAT AGA CAC-5'(서열번호 28);

70 번째 알라닌의 코돈인 GCT가 시스테인의 코돈인 TGC로 치환시 센스프라이머 5'-ATC AAA GGA GTG TCT TGC AAC CGT TAC CTG GCT-3'(서열번호 29) 및 안티센스프라이머 3'-AGC CAG GTA ACG GTT GCA AGA CAC TCC TTT GAT-5'(서열번호 30);

82 번째 루이신의 코돈인 TTA가 시스테인의 코돈인 TGC로 치환시 센스프라이머 5'-AAG GAA GAT GGA AGA TGC CTG GCT TCT AAA TCT-3'(서열번호 31) 및 안티센스프라이머 3'-AGA TTT AGA AGC CAG GCA TCT TCC ATC TTC CTT-5'(서열번호 32);

84 번째 알라닌의 코돈인 GCT가 시스테인의 코돈인 TGC로 치환시 센스프라이머 5'-GAT GGA AGA TTA CTG TGC TCT AAA TCT GTT ACG-3'(서열번호 33) 및 안티센스프라이머 3'-CGT AAC AGA TTT AGA GCA CAG TAA TCT TCC ATC-5'(서열번호 34);

108 번째 세린의 코돈인 TCA가 시스테인의 코돈인 TGC로 치환시 센스프라이머 5'-TAC AAT ACT TAC CGG TGC AGG AAA TAC ACC AGT-3'(서열번호 35) 및 안티센스프라이머 3'-ACT GGT GTA TTT CCT GCA CCG GTA AGT ATT GTA-5'(서열번호 36);

136번째 알라닌의 코돈인 GCT가 시스테인의 코돈인 TGC로 치환시 센스프라이머 5'-GGA CCT GGG CAG AAA TGC ATA CTT TTT CTT CCA-3'(서열번호 37) 및 안티센스프라이머 3'-TGG AAG AAA AAG TAT GCA TTT CTG CCC AGG TCC-5'(서열번호 38);

137 번째 아이소루신의 코돈인 ATA가 시스테인의 코돈인 TGC로 치환시 센스프라이머 5'-CCT GGG CAG AAA GCT TGC CTT TTT CTT CCA ATG-3'(서열번호 39) 및 안티센스프라이머 3'-CAT TGG AAG AAA AAG GCA AGC TTT CTG CCC AGG-5'(서열번호 40);

138 번째 루이신의 코돈인 CTT가 시스테인의 코돈인 TGC로 치환시 센스프라이머 5'-GGG CAG AAA GCT ATA TGC TTT CTT CCA ATG TCT-3'(서열번호 41) 및 안티센스프라이머 3'-AGA CAT TGG AAG AAA GCA TAT AGC TTT CTG CCC-5'(서열번호 42); 및

144 번째 알라닌의 코돈인 GCT가 시스테인의 코돈인 TGC로 치환시 센스프라이머 5'-TTT CTT CCA ATG TCT TGC AAG AGC TGA TGA-3'(서열번호 43) 및 안티센스프라이머 3'-TCA TCA GCT CTT GCA AGA CAT TGG AAG AAA-5'(서열번호 44).

50번째 히스티딘의 코돈인 CAC가 타이로신의 코돈인 TAT로 치환시 센스프라이머 5'-GAG AAG AGC GAC CCT TAT ATC AAG CTA CAA CTT -3'(서열번호 45) 및 안티센스프라이머 3'-AAG TTG TAG CTT GAT ATA AGG GTC GCT CTT CTC-5'(서열번호 46).

<실시예 5: bFGF 변이체의 생산 및 정제>
상기 bFGF 변이체의 발현 플라스미드 각각으로 실시예 2에서와 동일한 방법으로 대장균 BL21(DE3)에 형질 전환시켜 재조합 균주를 만들고 LB배지(LB/앰피실린) 500 ml에 배양하여 실시예 3에서와 동일한 방법으로 정제하여 각각 약 18 kDa 크기의 bFGF를 얻었다. 이 때 얻은 변이체의 양은 변이체에 따라 그 차이가 있었으며 변이체에 따라 약 4~12 mg의 bFGF를 얻을 수 있었으며 순도는 98% 이상이었다.
상기 각 bFGF 변이체는 다음과 같다:
서열번호 1의 69 번째 및 87 번째 시스테인이 세린으로 치환되고, 34 번째 아이소루신 및 67 번째 글라이신이 시스테인으로 치환된 변이체;
서열번호 1의 69 번째 및 87 번째 시스테인이 세린으로 치환되고, 34 번째 아이소루신 및 70 번째 알라닌이 시스테인으로 치환된 변이체;
서열번호 1의 69 번째 및 87 번째 시스테인이 세린으로 치환되고, 34 번째 아이소루신 및 84 번째 알라닌이 시스테인으로 치환된 변이체;
서열번호 1의 69 번째 및 87 번째 시스테인이 세린으로 치환되고, 40 번째 발린 및 82 번째 루이신이 시스테인으로 치환된 변이체;
서열번호 1의 69 번째 및 87 번째 시스테인이 세린으로 치환되고, 40 번째 발린 및 84 번째 알라닌이 시스테인으로 치환된 변이체;
서열번호 1의 69 번째 및 87 번째 시스테인이 세린으로 치환되고, 50 번째 히스티딘 및 69 번째 시스테인이 시스테인으로 치환된 변이체;
서열번호 1의 69 번째 및 87 번째 시스테인이 세린으로 치환되고, 52 번째 라이신 및 68 번째 발린이 시스테인으로 치환된 변이체;
서열번호 1의 69 번째 및 87 번째 시스테인이 세린으로 치환되고, 76 번째 메사이오닌 및 108 번째 세린이 시스테인으로 치환된 변이체;
서열번호 1의 69 번째 및 87 번째 시스테인이 세린으로 치환되고, 117 번째 알라닌 및 136 번째 알라닌이 시스테인으로 치환된 변이체;
서열번호 1의 69 번째 및 87 번째 시스테인이 세린으로 치환되고, 117 번째 알라닌 및 137 번째 아이소루신이 시스테인으로 치환된 변이체;
서열번호 1의 69 번째 및 87 번째 시스테인이 세린으로 치환되고, 75 번째 알라닌이 시스테인으로 치환된 변이체;
서열번호 1의 69 번째 및 87 번째 시스테인이 세린으로 치환되고, 26 번째 라이신 및 87 번째 시스테인이 시스테인으로 치환된 변이체;
서열번호 1의 69 번째 및 87 번째 시스테인이 세린으로 치환되고, 138 번째 루이신이 시스테인으로 치환된 변이체;
서열번호 1의 69 번째 및 87 번째 시스테인이 세린으로 치환되고, 52 번째 라이신 및 144 번째 알라닌이 시스테인으로 치환된 변이체;
서열번호 1의 69 번째 및 87 번째 시스테인이 세린으로 치환되고, 75 번째 알라닌이 시스테인으로 치환고, 50 번째 히스티딘이 타이로신으로 치환된 변이체;
천연형과 변이체의 정제는 SP 와 헤파린 친화 컬럼을 통해 정제가 가능하다. 두 종 모두 SP 컬럼에서 약 400 mM NaCl 농도에서 용출되었고 헤파린 컬럼의 경우 1.5 M NaCl에서 용출되었다. 최종 헤파린 친화 컬럼 정제를 진행한 후 SDS-PAGE 분석을 하였다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 천연형의 경우 다이머(dimer)와 트리머(trimer)가 관찰되는 반면, 변이체의 경우 모노머(monomer) 사이즈에 단일 밴드 형태로 존재하는 것을 확인할 수 있었다. 이는 활성이 없는 다이머, 트리머가 완벽하게 제거되고 모노머 상태로 존재한다는 것으로 설명할 수 있다.

삭제

도 6에 최종 정제 이후 천연형(A)와 변이체(B)의 SDS-PAGE 결과를 나타내었다.

<실험예 1: 천연형과 변이체 bFGF의 CD(circular dichroism)을 이용한 구조 분석>
J-810 spectropolarimeter(JASCO)를 사용하여 CD 분석을 통하여 실시예 5의 정제된 bFGF 변이체의 구조와 열 안정성을 측정하였다. 천연형 bFGF은 실시예 3에서 정제된 bFGF를 사용하였다. 구조분석을 위하여 각각의 bFGF를 20 mM 인산염완충액(pH 7.0)에 녹여 최종농도가 0.1 mg/ml이 되도록 일정하게 만든다. 그리고 0.1 cm cell에 넣어 190 nm ~ 250 nm 영역으로 band width 1 nm, response 0.25 sec, data pitch 0.1 nm, scanning speed 20 nm/min, cell length 1cm, accumulation 8 번, 온도는 20 ℃ 조건으로 구조를 분석하였다.
열 안정도를 분석하기 위하여 Tm(melting temperature)는 20℃와 95 ℃에서의 far-UV를 비교 분석하여 208 nm 파장을 결정하였으며 0.1 cm cell에 0.1 mg/ml 농 도로 진행하였다. 조건은 1 ℃/min의 조건으로 20 ℃ ~ 95 ℃까지 측정하였다. 그 결과는 표 2에 나타내었다.

삭제

변이체 bFGF명칭	구조변화 (Tm)	변이체 bFGF명칭	구조변화(Tm)	변이체 bFGF명칭	구조변화(Tm)
천연형 bFGF (서열번호 1)	- (57.5℃)	변이체 A34-67	감소 (48℃)	변이체 B34-70	변화 없음
변이체 C34-84	변화 없음	변이체 D40-82	변화 없음	변이체 E40-84	변화 없음
변이체 F50-69(서열번호 8)	변화 없음	변이체 G52-68(서열번호 9)	변화 없음	변이체 H76-108	변화 없음
변이체 I117-136	변화 없음	변이체 J117-137	변화 없음	변이체 K75	변화 (62℃)
변이체 L26-87	변화 없음	변이체 M138	변화 없음	변이체 N52-144	변화 없음
변이체 K75+H50Y	(65℃)

표 2는 천연형 bFGF와 bFGF 변이체에 대한 구조 변화 정도와 열 안정성 측정 실험인 CD 분석 중 208 nm의 파장에서 온도 별 풀림 구조비율(fraction unfolded)을 측정한 결과를 나타낸 값이다. 접힘-풀림 현상이 일어날 때에는 208 nm 부근의 구간에서 구조의 변화를 보이게 되는데 이를 이용하여 20~95 ℃범위 내에서 Tm을 측정하여 정확한 Tm값을 분석하였다.

상기 bFGF 변이체들은, 서열번호 1의 69 번째 및 87 번째 시스테인을 세린으로 치환한 후, 추가적으로 각 해당 위치의 잔기를 시스테인으로 치환하여 분자내 이황화결합을 유도시킨 변이체들이다.

그 결과, 구조변화에선 대부분이 천연형 bFGF와 동일한 구조를 나타내 변화가 거의 없었으며 이황화결합을 추가한 변이체들에서 특별한 구조를 가지지 않았다. 열 안정도를 나타내는 Tm은 58℃인 천연형 bFGF와 비교하여 거의 대부분이 bFGF 변이체와 동일하였고, 그 중 K75 변이체에서 62℃까지 열 안정성이 향상된 것을 확인할 수 있었다. 이는 아미노산을 1개를 시스테인으로 치환시켜 이황화결합을 인위적으로 추가시킴으로써 열 안정성이 증가되었음을 의미한다.

한편, 본 발명의 특정 위치인 서열번호 1의 69 번째 및 87 번째 시스테인이 세린으로 치환되고, 75 번째 알라닌이 시스테인으로 추가적인 치환된 K75 변이체의 현저성을 확인하기 위하여, 서열번호 1의 천연형 bFGF, 서열번호 1의 69 번째 및 87 번째 시스테인만이 세린으로 치환된 bFGF 변이체(Cys→Ser 변이체), 서열번호 1의 75 번째 알라닌만이 시스테인으로 치환된 bFGF 변이체(천연형 + disulfide bond) 및 K75 변이체(Cys→Ser 변이체 + disulfide bond, 서열번호 1의 69 번째 및 87 번째 시스테인이 세린으로 치환되고, 75 번째 알라닌이 시스테인으로 치환된 bFGF 변이체)의 열 안정성을 비교 확인하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 천연형 bFGF의 Tm은 약 57.5도, Cys→Ser 변이체의 Tm은 58 ℃, 천연형 + disulfide bond의 Tm은 61.5 ℃, K75 변이체 (Cys→Ser 변이체 + disulfide bond)의 Tm은 62 ℃로 확인되었으며, 이는 K75 변이체의 열역학적 안정성이 증가되었음을 의미한다.

삭제

이에 추가하여 서열번호 1의 69 번째 및 87 번째 시스테인이 세린으로 치환되고, 75 번째 알라닌이 시스테인으로 추가적인 치환된 K75 변이체에 50 번째 히스티딘이 타이로신으로 치환된 HsbFGF를 제작하여 열 안정도를 비교하였다. 이는 표면에 존재하는 아미노산을 1개를 타이로신으로 치환시켜 단백질 내부 cavity의 안정화와 수소결합과 반데르발스결합를 새롭게 형성하여 열 안정성을 보다 증가시키려는 의도이다.

그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 천연형 bFGF의 Tm은 약 57.5도, K75 변이체 (Cys→Ser 변이체 + disulfide bond)의 Tm은 62 ℃로 확인되었으며, HsbFGF(K75 + His→Tyr) Tm은 65 ℃로 변이체의 열역학적 안정성이 보다 증가되었음을 의미한다.

<실험예 2: 천연형과 변이체 bFGF의 세포증식검정>

만들어진 천연형 bFGF와 변이체 중 용해도와 CD를 이용한 구조와 Tm 의 결과 분석을 통하여 좋은 결과를 bFGF을 선정하여 세포증식검정을 실시하였다. 세포증식검정은 (주)제네웰에 의뢰하여 bFGF에 민감한 피부세포인 NIH-3T3 세포주를 가지고 수행하였다. 실험 방법으로는 NIH-3T3 cell을 10 % 열 불활성화된 소태아혈청, 100 units/ml의 penicillin, 100 mg/ml의 스트렙토마이신이 포함된 DMEM complete배지을 이용하였다. 96 well culture plate에 2x10³ cells/well의 NIH-3T3 cell을 seeding 하였다. 24시간 배양된 NIH-3T3 cell은 serum-free DMEM 배지로 starvation 후 0.5 % FBS가 포함된 DMEM 배지에 샘플 용액을 각각의 농도 별로 처리하고, 72 시간 배양하였다. 배양 후 10 ul의 MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide] 용액을 첨가하고 2시간 반응시킨 후 100 ul의 DMSO로 formazan crystal을 용해시켰다. 흡광도는 분광광도계를 이용해 540 nm 파장에서 측정하였다. 약제에 대한 감수성은 약제를 처리하지 않은 well(대조군)의 흡광도에 대한 약제처리 well에서의 백분율로 비교하였다. 도 4,11에서 보는 바와 같이 bFGF 변이체가 천연형 bFGF와 유사한 세포증식능력을 보이고 있다.

<실험예 3: 천연형과 변이체 bFGF의 인큐베이션에 따른 단백질의 정량 분석>

천연형 bFGF와 변이체들[서열번호 1의 69 번째 및 87 번째 시스테인만이 세린으로 치환된 bFGF 변이체(Cys→Ser 변이체), 서열번호 1의 75 번째 알라닌만이 시스테인으로 치환된 bFGF 변이체(천연형 + disulfide bond) 및 K75 변이체(Cys→Ser 변이체 + disulfide bond, 서열번호 1의 69 번째 및 87 번째 시스테인이 세린으로 치환되고, 75 번째 알라닌이 시스테인으로 치환된 bFGF 변이체)의 안정성을 확인하기 위하여, 37 ℃ 단기간 인큐베이션 테스트를 진행하였다. 인체의 상태와 가장 유사한 PBS(phosphate buffer saline)상태에서 천연형 bFGF와 변이체들을 0.5 mg/ml로 녹인 후 37 ℃인 water bath에서 인큐베이션을 하였다. 48시간, 7일, 10일 단위로 sampling 하여 13000 rpm으로 15분간 4 ℃에서 원심 분리하여 상층액만 얻어 Nano drop을 이용하여 단백질을 정량하였다. 시간이 지날수록 천연형 bFGF 와 변이체들의 농도를 정량하였을 때, 천연형 bFGF가 변이체에 비하여 더 심한 감소를 보였다. 상기 결과를 표 3에 나타내었다.

bFGF명칭	Day 0	After 48h	After one week	After 10days
천연형	100	56	26	16
CYS→SER 변이체	100	88	80	62
천연형 + disulfide	100	92	78	64
K75(CYS→SER 변이체 + disulfide)	100	90	88	80

또한, 상기 결과들을 토대로, 열 안정성이 증가된 K75 변이체를 이용하여 인체의 상태와 가장 유사한 PBS(Phosphate buffer saline)상태에서 천연형 bFGF와 비교하여 K75 변이체가 장기간 보존 안정성을 갖는지의 여부를 확인하였다. 먼저, PBS 상태에 천연형 bFGF와 K75 변이체를 같은 농도로 녹인 후 20일간 25 ℃에서 인큐베이션시켰다. 그리고 원심 분리하여 상층액 만을 가지고 HPLC를 이용하여 정량분석하였다.

그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 인큐베이션 중 K75 변이체가 천연형 bFGF에 비하여 안정도가 월등히 높았으며, 이는 본 발명의 K75 변이체의 우수성을 보여주는 결과이다.

<실험예 4: 천연형과 변이체 bFGF들의 50 ℃와 60 ℃ 인큐베이션에 따른 HPLC 분석>

천연형 bFGF와 K75 변이체 및 HsbFGF 변이체의 안정성을 확인하기 위하여, 50 ℃에서 일주일간, 60 ℃ 5일간 인큐베이션 테스트를 진행하였다. PBS에서 각각의 천연형 bFGF와 변이체들을 0.5 mg/ml로 녹인 후 50 ℃, 60 ℃인 water bath에서 인큐베이션을 하였다. 날짜별로 시료를 채취하여 13000 rpm으로 15분간 4 ℃에서 원심 분리하여 상층액만 얻은 후 HPLC 및 UV 분광광도계를 이용하여 시료를 분석하였다.
그 결과, 도 8 에 나타낸 바와 같이 UV spectrometer 을 이용한 정량에서, 5일 후부터 천연형 bFGF 는 정량을 할 수 없었고. K75 변이체의 경우 7일 후 38 %, hsbFGF의 경우 72 %가 유지되는 것을 볼 수 있었다.
또한 도 9 에 나와있듯이 60 ℃ UV 분광광도계를 이용한 정량에서 천연형 bFGF의 경우 3일 후부터는 거의 확인할 수 없었으며 K75의 경우 5일 후 22 %, HsbFGF의 경우 5일 후 40 %가 유지되는 것을 볼 수 있었다
도 10에 나와 있는 결과를 이용 HPLC의 분석에서 7일 후 천연형 bFGF의 경우 HPLC로 정량 할 수 없었으며 K75의 경우 30 %, HsbFGF의 경우 60 %이상 유지되는 것을 확인할 수 있었다.

삭제

<110> PnP Biopharm Co., Ltd. <120> A human basic fibroblast factor-2 mutant with high stability and use of the same <130> HY150654 <160> 46 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 146 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Pro Ala Leu Pro Glu Asp Gly Gly Ser Gly Ala Phe Pro Pro Gly His 1 5 10 15 Phe Lys Asp Pro Lys Arg Leu Tyr Cys Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu 20 25 30 Arg Ile His Pro Asp Gly Arg Val Asp Gly Val Arg Glu Lys Ser Asp 35 40 45 Pro His Ile Lys Leu Gln Leu Gln Ala Glu Glu Arg Gly Val Val Ser 50 55 60 Ile Lys Gly Val Cys Ala Asn Arg Tyr Leu Ala Met Lys Glu Asp Gly 65 70 75 80 Arg Leu Leu Ala Ser Lys Cys Val Thr Asp Glu Cys Phe Phe Phe Glu 85 90 95 Arg Leu Glu Ser Asn Asn Tyr Asn Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Thr 100 105 110 Ser Trp Tyr Val Ala Leu Lys Arg Thr Gly Gln Tyr Lys Leu Gly Ser 115 120 125 Lys Thr Gly Pro Gly Gln Lys Ala Ile Leu Phe Leu Pro Met Ser Ala 130 135 140 Lys Ser 145 <210> 2 <211> 438 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 cccgccttgc ccgaggatgg cggcagcggc gccttcccgc ccggccactt caaggacccc 60 aagcggctgt actgcaaaaa cgggggcttc ttcctgcgca tccaccccga cggccgagtt 120 gacggggtcc gggagaagag cgaccctcac atcaagctac aacttcaagc agaagagaga 180 ggagttgtgt ctatcaaagg agtgtgtgct aaccgttacc tggctatgaa ggaagatgga 240 agattactgg cttctaaatg tgttacggat gagtgtttct tttttgaacg attggaatct 300 aataactaca atacttaccg gtcaaggaaa tacaccagtt ggtatgtggc actgaagcga 360 actgggcagt ataaacttgg atccaaaaca ggacctgggc agaaagctat actttttctt 420 ccaatgtctg ctaagagc 438 <210> 3 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 ggcgggcata tgcccgcctt gcccgagg 28 <210> 4 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 tgatgaggat cctcatcagc tcttagcaga cat 33 <210> 5 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 tctatcaaag gagtgtctgc taaccgttac ctg 33 <210> 6 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 caggtaacgg ttagcagaca ctcctttgat aga 33 <210> 7 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 ttactggctt ctaaatctgt tacggatgag tgt 33 <210> 8 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 acactcatcc gtaacagatt tagaagccag taa 33 <210> 9 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 gctaaccgtt acctgtgcat gaaggaagat gga 33 <210> 10 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 tccatcttcc ttcatgcaca ggtaacggtt agc 33 <210> 11 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 aagcggctgt actgctgcaa cgggggcttc ttc 33 <210> 12 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 gaagaagccc ccgttgcagc agtacagccg ctt 33 <210> 13 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 ggcttcttcc tgcgctgcca ccccgacggc cga 33 <210> 14 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 tcggccgtcg gggtggcagc gcaggaagaa gcc 33 <210> 15 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 caccccgacg gccgatgcga cggggtccgg gag 33 <210> 16 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 ctcccggacc ccgtcgcatc ggccgtcggg gtg 33 <210> 17 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 gagaagagcg acccttgcat caagctacaa ctt 33 <210> 18 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 aagttgtagc ttgatgcaag ggtcgctctt ctc 33 <210> 19 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 agcgaccctc acatctgcct acaacttcaa gca 33 <210> 20 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 tgcttgaagt tgtaggcaga tgtgagggtc gct 33 <210> 21 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 aaccgttacc tggcttgcaa ggaagatgga aga 33 <210> 22 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 tcttccatct tccttgcaag ccaggtaacg gtt 33 <210> 23 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 accagttggt atgtgtgcct gaagcgaact ggg 33 <210> 24 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 24 cccagttcgc ttcaggcaca cataccaact ggt 33 <210> 25 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 25 gttgtgtcta tcaaatgcgt gtctgctaac cgt 33 <210> 26 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 26 acggttagca gacacgcatt tgatagacac aac 33 <210> 27 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 27 gtgtctatca aaggatgctc tgctaaccgt tac 33 <210> 28 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 28 gtaacggtta gcagagcatc ctttgataga cac 33 <210> 29 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 29 atcaaaggag tgtcttgcaa ccgttacctg gct 33 <210> 30 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 30 agccaggtaa cggttgcaag acactccttt gat 33 <210> 31 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 31 aaggaagatg gaagatgcct ggcttctaaa tct 33 <210> 32 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 32 agatttagaa gccaggcatc ttccatcttc ctt 33 <210> 33 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 33 gatggaagat tactgtgctc taaatctgtt acg 33 <210> 34 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 34 cgtaacagat ttagagcaca gtaatcttcc atc 33 <210> 35 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 35 tacaatactt accggtgcag gaaatacacc agt 33 <210> 36 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 36 actggtgtat ttcctgcacc ggtaagtatt gta 33 <210> 37 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 37 ggacctgggc agaaatgcat actttttctt cca 33 <210> 38 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 38 tggaagaaaa agtatgcatt tctgcccagg tcc 33 <210> 39 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 39 cctgggcaga aagcttgcct ttttcttcca atg 33 <210> 40 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 40 cattggaaga aaaaggcaag ctttctgccc agg 33 <210> 41 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 41 gggcagaaag ctatatgctt tcttccaatg tct 33 <210> 42 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 42 agacattgga agaaagcata tagctttctg ccc 33 <210> 43 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 43 tttcttccaa tgtcttgcaa gagctgatga 30 <210> 44 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 44 tcatcagctc ttgcaagaca ttggaagaaa 30 <210> 45 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 45 gagaagagcg acccttatat caagctacaa ctt 33 <210> 46 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 46 aagttgtagc ttgatataag ggtcgctctt ctc 33

Claims

서열번호 1의 69 번째 및 87 번째 시스테인이 세린으로 치환되고, 75 번째 알라닌이 시스테인으로 치환되고, 50 번째 히스티딘이 타이로신으로 치환된 고안정성 염기성 섬유아세포 성장인자(basic fibroblast growth factor, bFGF) 변이체(mutant).
삭제
삭제
삭제
제 1 항의 변이체를 코딩하는 유전자.
삭제
제 5 항의 유전자를 포함하는 발현벡터.
제 7 항의 발현벡터에 의해 형질전환된 형질전환체.
다음 단계를 포함하는 고안정성 염기성 섬유아세포 성장인자(basic fibroblast growth factor, bFGF) 변이체(mutant) 생산 방법:
(a) 제 8 항의 형질전환체를 배양하는 단계; 및
(b) 상기 단계 (a)에서 얻은 배양액으로부터 변이체를 분리하는 단계.
제 9 항에 있어서, 상기 (b) 단계는,
(c) 상기 형질전환체를 세포 파쇄하고 응집체를 분리하는 단계;
(d) 상기 분리된 응집체를 제거하는 단계;
(e) 상기 응집체가 제거된 상청액을 이온교환수지 크로마토그래피를 이용하여 분리정제 하는 단계; 및
(f) 이온교환 수지 후 고안정성 염기성 섬유아세포 성장인자 변이체를 헤파린 친화 크로마토그래피를 이용하여 분리 정제하는 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항의 고안정성 bFGF 변이체를 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 화장료 조성물.
삭제