JPH05306297A - 新規なハイブリド形質転換成長因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、新規なハイブリドＴＧＦ−β、生物学的に活
性なダイマーのハイブリド蛋白質の製造方法、及びこれ
を含んで成る医薬組成物に関する。この方法により製造
されるハイブリドＴＧＦ−βは種々の療法的用途、例え
ば創傷の治癒の促進及び加速のため、癌の治療のため、
骨髄保護剤として、心臓保護のメディエーターとして、
抗−炎症もしくは免疫抑制剤として、又は哺乳類細胞培
養物の増殖制御剤として有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は新規な組換えハイブリド
形質転換成長因子−β（ＴＧＦ−β）、該組換え蛋白質
の製造方法及び生物学的に活性なダイマーハイブリド蛋
白質の製造方法、並びにこれらを含有する医薬組成分に
関する。

【０００２】

【従来の技術】形質転換成長因子−β（ＴＧＦ−β）は
最初にヒト血小板、ヒト胎盤及びウシの腎臓から均一に
精製され、そして分子量２５，０００のホモダイマー蛋
白質として同定された。まずＥＧＦ又はＴＧＦ−αと共
に相乗的に作用して、形質転換されていないＮＲＫの足
場非依存性（ａｎｃｈｏｒａｇｅ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅ
ｎｔ）増殖を誘導するその能力により特徴付けられ、最
近、ＴＧＦ−βは広範囲の正常細胞及び新生物細胞の両
者に対して多くの制御効果を示すことが示され、細胞活
性の多機能制御因子としてのこの蛋白質の重要性が示さ
れた。

【０００３】ＴＧＦ−βは遊走、細胞増殖及び成長を刺
激することができ、又はこれらの過程を効果的に阻害
し、あるいは他の作用、例えばアジポゲネシス（ａｄｉ
ｐｏｇｅｎｅｓｉｓ）、筋形成（ｍｙｏｇｅｎｅｓｉ
ｓ）、軟骨形成（ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｅｓｉｓ）、骨
形成（ｏｓｔｅｏｇｅｎｅｓｉｓ）及び免疫細胞機能の
調節、走化性の刺激、又は細胞もしくは組織型に依存す
る分化の誘導もしくは阻害、並びに他の成長因子の存在
又は不存在等を示す。ＴＧＦ−βの作用の多くはストレ
ス及び傷害に対する細胞又は組織の応答、並びに生ずる
損傷の修復に関連する。

【０００４】炎症の後、ＴＧＦ−βは肉芽組織（ｇｒａ
ｎｕｌａｔｉｏｎ ｔｉｓｓｕｅ）の形成に主要な役割
を演じ、フィブロネクチン、コラーゲン及び幾つかのプ
ロテアーゼ阻害物質のごとき細胞外マトリクスの形成に
関連する遺伝子の発現を増加させ、そしてフィブロブラ
ストによるコラーゲン−マトリクス収縮を刺激し、結合
組織の収縮における役割の可能性が示唆される。

【０００５】６４〜８２％の同一性を有するＴＧＦ−β
の５種類の別個のアイソホーム（ｉｓｏｆｏｒｍ）が知
られている。今まで、ＴＧＦ−β１，ＴＧＦ−β２及び
ＴＧＦ−β３と称するＴＧＦ−βの３種類の別個のタイ
プが哺乳類組織中で発現されることが証明されている。
ＦＧＦ−β４はニワトリのみに、そしてＴＧＦ−β５は
カエルのみに記載されている。ＴＧＦ−β１，ＴＧＦ−
β２及びＴＧＦ−β３はクローン化されそして配列分析
により特徴付けられている。

【０００６】これらは、シグナル配列、潜伏関連蛋白質
（Ｌａｔｅｎｃｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅ
ｉｎ；ＬＡＰ）及び１１２アミノ酸長のＴＧＦ−β配列
から成る３９０〜４１２アミノ酸長の不活性前駆体とし
て合成される。これらの成熟した生物学的活性形におい
て、ＴＧＦ−βはそれぞれ１１２アミノ酸から成る２本
のポリペプチド鎖の酸及び熱安定性ジスルフィド連結ホ
モダイマーである。

【０００７】ヒト、ネズミ及びサルの完全アミノ酸配列
は、１個のアミノ酸残基のみを異にする顕著な配列保存
性を示す。ヒトＴＧＦ−β１、ヒトＴＧＦ−β２及びヒ
トＴＧＦ−β３のアミノ酸配列の比較が示すところによ
れば、これら３種の蛋白質はその成熟形において約７０
〜８０％の配列同一性を示す。ヘテロダイマーＴＧＦ−
β１，２がウシの血小板から単離されており、そしてＴ
ＧＦ−β２の１つのサブユニットにジスルフィド連結し
たＴＧＦ−β１の１つのサブユニットから成る。

【０００８】臨床研究又は期待される療法的使用のため
に必要な量を提供するためには天然源（血小板）は不適
当である。従って、最近、組換え技術によってＦＧＦ−
βを製造する試みが行われている。しかしながら、その
生物学的活性を維持しながら組換えＴＧＦ−βを合成す
ることは極めて困難である。ＴＧＦ−β１，ＴＧＦ−β
２及びＴＧＦ−β３はそれぞれ９個のシステイン残基を
含有し、その内の少なくとも幾つかは、生物学的に活性
なダイマー分子の複雑な三次構造をもたらす鎖内又は鎖
間ジスルフィド結合の形成に関与している。

【０００９】ＴＧＦ−βの異種性発現は、正しい一次構
造を有するが、正しい二次及び三次構造を生成するよう
に適切にフォルディングされずそれ故に生物学的活性を
欠く生成物をもたらすであろう。今日、ＴＧＦ−βの二
次及び三次構造は知られていない。天然ＴＧＦ−β分子
の複雑さを考慮して、高等生物由来の細胞中で各ＴＧＦ
−β遺伝子を発現させることが得策であると一般に考え
られている。しかしながら、真核生物系でのＴＧＦ−β
の前駆体形（３９０〜４１４アミノ酸）をコードする全
長ＤＮＡの発現の後、生物学的に活性な正しくフォルデ
ィングされた物質の収量は満足できるものから程遠い。

【００１０】メトトレキセート（Ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａ
ｔｅ；ＭＴＸ）により増幅されたＣＨＯ細胞中でのＴＧ
Ｆ−β１，ＴＧＦ−β２及びＴＧＦ−β３非常に低いレ
ベルの発現、例えば２０μＭのＭＴＸ濃度における６μ
ｇ／mlのＴＧＦ−β１の発現（Ｇｅｎｔｒｙ Ｌ．Ｅ
ら、（１９８７），Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．
７：３４１８−３４２７）、１０μＭ及び５０μＭのＭ
ＩＸ濃度における５μｇ／mlのＴＧＦ−β２の発現（Ｍ
ａｄｉｓｅｎ，Ｌら（１９９０）ＧｒｏｕｔｈＦａｃｔ
ｏｒｓ ３：１２９−１３８）、並びに１．６mMのＭＴ
Ｘ濃度における２μｇ／ml（Ｇｒａｙｃａｒ，Ｊ．Ｌ．
ら（１９８９）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．３：１
９７７−１９８６）及び２０mMのＭＴＸ濃度における３
０ng／ml（Ｔｏｎ Ｄｉｊｋｅ，Ｐら（１９９０）Ａｎ
ｎａｌｓ ｏｆ ｔｈｅ ＮｅｗＹｏｒｋ Ａｃａｄｅ
ｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ５９３：２６−４２）
のＴＧＦ−β３の発現、が記載されている。生物活性の
検出のために酸性化が必要なため、３つの場合すべてに
おいて、ＴＧＦ−βは潜在形（ｌａｔｅｎｔ ｆｏｒ
ｍ）で分泌される。

【００１１】ＥＰ−Ａ−０，４３３，２２５は、変性さ
れた又は不活性な形からの生物学的に活性なダイマーＴ
ＧＦ−β−様蛋白質の製造のための微生物的方法を記載
している。モノマー形が再生（ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ）に
かけられる場合、かなりの量のＴＧＦ−βを得ることが
できる。

【００１２】異なるＴＧＦ−βアイソホームは異なる系
において異なる力価及び／又は活性を有する。例えば、 ○ アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉ
ｓ）での中胚葉の誘導において、ＴＧＦ−β３はＴＧＦ
−β２より１０倍活性が高い。ＴＧＦ−β１はこの測定
において不活性である。 ○ ウシ大動脈内皮細胞中でのＤＮＡ合成の阻害におい
て、ＴＧＦ−β１はＴＧＦ−β２より１０〜１００倍活
性が高い。

【００１３】○ ＡＫＲ−２Ｂ繊維芽細胞の増殖の刺激
及びＣＣＬ６４ミンク肺上皮細胞中でのＤＮＡ合成の阻
害において、ＴＧＦ−β２及びＴＧＦ−β３はＴＧＦ−
β１に比べて顕著に活性が高い。乳癌セルラインＭＣＦ
−７の増殖の阻害において、ＴＧＦ−β１はＴＧＦ−β
２に比べて顕著に活性が高い。マウス及びヒトの表皮ケ
ラチン細胞（ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ）中でのＤＮＡ
合成阻害において、ＴＧＦ−β３はＴＧＦ−β１又はＴ
ＧＦ−β２に比べて顕著に活性が高い。 ○ 生体内での骨形成の刺激において、ＴＧＦ−β２は
ＴＧＦ−β１に比べて顕著に活性が高い。

【００１４】親分子に比べて変化した又は混合された活
性を有し、そして幾つかの生物学的系において改良され
た活性及び／又は新規なもしくは有利な性質を示すハイ
ブリドＴＧＦ−β分子が必要である。

【００１５】

【発明の目的】本発明の目的は、新規なハイブリドＴＧ
Ｆ−β分子、それをコードする組換ＤＮＡ分子、該組換
えＤＮＡ分子を含んで成るハイブリドベクター、該組換
えＤＮＡ分子の増加及び／又は発現のために適当な形質
転換された宿主、並びに該宿主、ＤＮＡ分子及びハイブ
リドＴＧＦ−β分子の製造方法を提供することである。

【００１６】

【具体的な説明】本発明は新規なハイブリドＴＧＦ−β
分子、好ましくは生物学的ＴＧＦ−β活性を有するそれ
に関する。本発明の目的のため「生物学的活性」とは次
のいずれかとして定義される。 （ａ）正常Ｂａｌｂ／ｃ３Ｔ３繊維芽細胞に対する細胞
遊走促進活性。これは、ＴＧＦ−β−様蛋白質を含有す
る無血清媒体の存在下での前記細胞の「傷つけられた」
単層培養物に遊走する（ｍｉｇｒａｔｅ）細胞の数を、
ＴＧＦ−β−様蛋白質の非存在下で遊走する細胞の数と
比較して計数することにより測定することができる；

【００１７】（ｂ）正常Ｂａｌｂ／ｃ３Ｔ３繊維芽細胞
に対する増殖促進活性。これは、細胞ＤＮＡ合成及び細
胞分裂に対するＴＧＦ−β−様蛋白質の刺激効果により
決定される； （ｃ）Ａ３７５メラノーマ細胞の増殖阻害。これは未処
理細胞の数に比べて、所定の培養期間中にＴＧＦ−β−
様蛋白質により処理された細胞の数を反映する比色測定
により測定される； （ｄ）未処理の対照傷と比較しての、ＴＧＦ−β−様蛋
白質の多数局所適用後の老マウスにおける、上皮再生の
過程による、部分的深さの熱傷の治癒の促進；

【００１８】（ｅ）未処理の対照傷と比較しての、ＴＧ
Ｆ−β−様蛋白質の１回局所適用後の成ラットにおけ
る、生検体の引張り強さ測定及び組織学的分析により測
定される、全深切開傷の治癒の促進；あるいは、 （ｆ）未処理の対照チャンバーと比較しての、ＴＧＦ−
β−様蛋白質の多数局所注射後の成ラットにおける、ポ
ーラス状傷−チャンバー中及びその周囲における、繊維
顆粒組織（ｆｉｂｒｏｕｓ ｇｒａｎｕｌａｔｉｏｎ
ｔｉｓｓｕｅ）の形成の増加及び該組織の血管化（ｖａ
ｓｃｕｌａｒｉｔｙ）の増加。

【００１９】前記新規なハイブリドＴＧＦ−β分子の物
質的特徴は、これらが２以上の、好ましくは２，４，５
又は６の、さらに好ましくは２の部分から成り、これら
の部分は、２以上の、好ましくは２又は３の、さらに好
ましくは２つの後に定義されるＦＧＦ−βアイソホーム
の成熟部分に存在する配列の連続する６個以上のアミノ
酸のストレッチから成る。すべての場合において、ハイ
ブリド分子中のアミノ酸残基のストレッチは、異なるＴ
ＧＦ−βアイソホームの一次アミノ酸配列中の対応する
位置に存在する同じ長さの連続するストレッチに対応す
る。

【００２０】「ＦＧＦ−β−アイソホーム」なる用語
は、哺乳類、例えばヒト又は他の動物、例えばサル、ネ
ズミ、ブタ、ウマもしくはウシ由来のＴＧＦ−β１，Ｔ
ＧＦ−β２及びＴＧＦ−β３、並びにニワトリのＦＧＦ
−β４及びカエルのＴＧＦ−β５を包含することが意図
される。さらに好ましくは、これは、配列番号：１〜３
に示されるアミノ酸配列を有するヒトＴＧＦ−β１、ヒ
トＴＧＦ−β２及びヒトＴＧＦ−β３を含む。

【００２１】本発明のハイブリド蛋白質の好ましいタイ
プは２つの部分を含んで成り、これらの部分のそれぞれ
は異なるＴＧＦ−βアイソホームからの連続するアミノ
酸のストレッチから成る。さらに好ましいハイブリドＴ
ＧＦ−β分子は、ＴＧＦ−β１のＮ−末端部分とＴＧＦ
−２βのＣ−末端部分、ＴＧＦ−β２のＮ−末端部分と
ＴＧＦ−β１のＣ−末端部分、ＴＧＦ−β１のＮ−末端
部分とＴＧＦ−β３のＣ−末端部分、ＴＧＦ−β３のＮ
−末端部分とＴＧＦ−β１のＣ−末端部分、ＴＧＦ−β
２のＮ−末端部分とＴＧＦ−β３のＣ−末端部分、又は
ＴＧＦ−β３のＮ−末端部分とＴＧＦ−β２のＣ−末端
部分から成るものである。最も好ましくは、これらのハ
イブリド部分は、配列番号：１〜３で示されるＴＧＦ−
β１，ＴＧＦ−β２及び／又はＴＧＦ−β３の部分から
構成される。

【００２２】親ＴＧＦ−βアイソホームに由来するアミ
ノ酸ストレッチ間の好ましいヒンジ部は、アミノ酸５６
と５７、７９と８０、９０と９１、２２と２３、又は４
４と４５の間にある（番号は、Ｎ−末端から始まるヒト
ＴＧＦ−βのアミノ酸番号である）。従って、本発明の
好ましいハイブリドは、該ハイブリドのＮ−末端部分を
提供するＴＧＦ−βアイソホームの５６，７９，９０，
２２又は４４ Ｎ−末端アミノ酸と、それぞれ該ハイブ
リド分子のＣ−末端部分を提供するＴＧＦ−βアイソホ
ームの５６，３３，２２，９０又は６８ Ｃ−末端未ア
ミノ酸とから構成される。

【００２３】配列番号：１〜３に示されるＴＧＦ−β
１，ＴＧＦ−β２及び／又はＴＧＦ−β３の部分から構
成されるハイブリドＴＧＦ−β分子の好ましい形態は、
アミノ酸４４と４５の間にヒンジ点を有し、そしてＴＧ
Ｆ−β１の４４個のＮ−末端アミノ酸とＴＧＦ−β２の
６８個のＮ−末端アミノ酸、ＴＧＦ−β２の４４個のＮ
−末端アミノ酸とＴＧＦ−β１の６８個のＣ−末端アミ
ノ酸、ＴＧＦ−β１の４４個のＮ−末端アミノ酸とＴＧ
Ｆ−β３の６８個のＣ−末端アミノ酸、ＴＧＦ−β３の
４４個のＮ−末端アミノ酸とＴＧＦ−β１の６８個のＣ
−末端アミノ酸、ＴＧＦ−β２の４４個のＮ−末端アミ
ノ酸とＴＧＦ−β３の６８個のＣ−末端アミノ酸、又は
さらに好ましくはＴＧＦ−β３の４４個のＮ−末端アミ
ノ酸とＴＧＦ−β２の６８個のＣ−末端アミノ酸から成
るハイブリド蛋白質である。

【００２４】これらのハイブリドは、それぞれ TGF−β
1(44／45) β2, TGF−β2(44／45)β1, TGF−β1(44／4
5) β3, TGF−β3(44／45) β1 、及び TGF−β2(44／4
5)β3 と命名される。従って、さらに好ましい形態は T
GF−β3(44／45) β2 と命名される。これらのハイブリ
ドのアミノ酸配列及びそれらをコードするＤＮＡ配列を
配列表（配列番号：４〜９）に示す。

【００２５】配列表の配列番号：１〜３に示されるＴＧ
Ｆ−β１，ＴＧＦ−β２及び／又はＴＧＦ−β３配列の
部分から構成されるハイブリドＴＧＦ−β分子の好まし
い形態はまた、ＴＧＦ−β１のＮ−末端の半分とＴＧＦ
−β２のＣ−末端の半分、すなわちＴＧＦ−β１の５６
個のＮ−末端アミノ酸とＴＧＦ−β２の５６個のＣ−末
端アミノ酸、ＴＧＦ−２βのＮ−末端の半分とＴＧＦ−
β１のＣ−末端の半分、ＴＧＦ−β１のＮ−末端の半分
とＴＧＦ−β３のＣ−末端の半分、ＴＧＦ−β３のＮ−
末端の半分とＴＧＦ−β１のＣ−末端の半分、ＴＧＦ−
β２のＮ−末端の半分とＴＧＦ−β３のＣ−末端の半
分、又はＴＧＦ−β３のＮ−末端の半分とＴＧＦ−β２
のＣ−末端の半分とから成るハイブリドである。

【００２６】これらのハイブリドはそれぞれ、 TGF−β
1(56／57) β2, TGF−β2(56／57)β1, TGF−β1(56／5
7) β3, TGF −β2(56／57) β1, TGF−β2(56／57)
β3、及び TGF−β3(56／57) β2 と命名される。同様
に、配列表の配列番号：１〜３に示されるＴＧＦ−β
１，ＴＧＦ−β２及び／又はＴＧＦ−β３の配列の部分
から構成されるハイブリドＴＧＦ−β分子の好ましい形
態はアミノ酸７９と８０との間にヒンジ点を有するハイ
ブリドである。前に説明した命名法に従えば、これらは
TGF−β1(79／80) β2, TGF−β2(79／80) β1, TGF−
β1(79／80) β3, TGF−β3(79／80) β1, TGF−β3(79
／80)β2 、及び FGF−β2(79／80) β3 と命名され
る。

【００２７】同様に、配列表の配列番号：１〜３に示さ
れるＴＧＦ−β１，ＴＧＦ−β２及び／又はＴＧＦ−β
３配列の部分から構成されるハイブリドＴＧＦ−β分子
は、ハイブリド TGF−β1(90／91）β2, TGF−β2(90／
91) β1, TGF−β1(90／91)β3, TGF−β3(90／91) β
1, TGF−β3(90／91) β2 、及び TGF−β2(90／91)β3
であり、いずれもアミノ酸９０と９１の間にヒンジ点
を有する。

【００２８】同様に、配列表の配列番号：１〜３に示さ
れるＴＧＦ−β１，ＴＧＦ−β２及び／又はＴＧＦ−β
３配列の部分から構成されるハイブリドＴＧＦ−β分子
の好ましい形態は、ハイブリド TGF−β1(22／23) β2,
TGF−β2(22／23) β1, TGF−β1(22／23) β3, FGF−
β3(22／23) β1, TGF−β3(22／23) β2 、及び TGF−
β2(22／23) β3 であり、いずれもアミノ酸２２と２３
の間にヒンジ点を有する。好ましいハイブリドのアミノ
酸配列及びそれらをコードするヌクレオチド配列は、配
列番号：１〜３に示される親ＴＧＦ−β１，−β２及び
−β３のアミノ酸配列並びに対応するＤＮＡ配列から容
易に推定され得る。本発明はまた、本発明のハイブリド
ＴＧＦ−β分子をコードする組換えＤＮＡ分子に関す
る。好ましいＤＮＡ分子は、好ましいハイブリド蛋白質
をコードするものである。

【００２９】上に特定したＴＧＦ−βアイソホームをコ
ードするヌクレオチド配列は文献から知られ、又は通常
の規則に従って該蛋白質のアミノ酸配列から推定するこ
とができる。親ＴＧＦ−βアイソホーム分子をコードす
る核酸配列から出発して、所望のハイブリド分子をコー
ドするＤＮＡ分子を推定し、そしてポリメラーゼ連鎖反
応（ＰＣＲ）技法、ＤＮＡ制限酵素、合成オリゴヌクレ
オチド、ＤＮＡリガーゼ及びＤＮＡ増幅技法等を含む既
知の常法に従って作製することができる。あるいは、コ
ード配列は、当業界において知られている化学的方法を
用いて全体として又は部分的に合成することができる。

【００３０】ＴＧＦ−βアイソホーム、例えばヒトＴＧ
Ｆ−β１，−２及び−３、すなわち本発明の好ましいハ
イブリドの親分子をコードするＤＮＡは、常法、例えば
ｃＤＮＡ技法の適用によりヒト細胞源から、当業界にお
いて得られるベクターから、あるいはＤＮＡの化学合成
により得られる。本発明のハイブリドＴＧＦ−β分子を
コードする組換えＤＮＡ分子はまた、それらがコードす
るアミノ酸配列を変えることなく無制限の数のヌクレオ
チドが他のヌクレオチドにより置き換えられるという意
味で、遺伝的コードの意味で縮重するＤＮＡ配列を含
む。この様な縮重ＤＮＡ配列は、異なる制限酵素パター
ンの生成のため、又は特定の宿主における好ましいコド
ンの使用のため有用である。

【００３１】本発明はまた、本発明のハイブリドＴＧＦ
−β分子をコードするＤＮＡ配列を含んで成るハイブリ
ドベクターに関する。本発明のハイブリドベクターは、
染色体外要素として又は宿主染色体への組込みにより、
本発明のハイブリドをコードするＤＮＡの複製及び場合
によっては発現を提供する。幾つかの可能性あるベクタ
ー系が利用可能であり、そして選択されるベクターは形
質転換のために予想される宿主細胞に依存する。

【００３２】本発明のハイブリドベクターは、宿主中で
の該ベクターの複製を可能にする複製起点、又は機能的
に同等な配列、例えば酵母から自律複製配列ＡＲＳにリ
ンクした、本発明のハイブリドＴＧＦ−β分子をコード
するＤＮＡを含んで成る。他のタイプのベクター、すな
わち発現ベクターは、形質転換された細胞でのハイブリ
ドＴＧＦ−β蛋白質の効果的な発現を保証する発現制御
配列、例えばプロモーター、及び宿主中でのベクターの
複製を可能にする複製起点、又は機能的に同等な配列に
リンクした、本発明のハイブリドＴＧＦ−β分子をコー
ドするＤＮＡ配列を含んで成る。

【００３３】しかしながら、本発明のベクターがいわゆ
る組込みベクター（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ ｖｅｃｔ
ｏｒ）である場合、すなわち形質転換後にそれが宿主の
染色体に組込まれ、そして染色体の部分として複製され
る場合、それは複製起点又は機能的に同等な配列を含む
必要がない。適当なハイブリドベクターは、遺伝子工学
の分野において有用な任意のベクターから、例えばウイ
ルス、ファージ、コスミド、プラスミド又は染色体ＤＮ
Ａから誘導することができる。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）
株でのハイブリドＴＧＦ−β蛋白質の発現のために有用
なベクターの例は、バクテリオファージ、例えばバクテ
リオファージλもしくはＭ１３の誘導体、又はプラスミ
ド、例えばプラスミドｐＢＲ３２２及びその誘導体ｐＰ
ＬＭｕである。酵母株におけるハイブリドＴＧＦ−β蛋
白質の発現のために適当なベクターの例は、２μを基礎
にしたプラスミドである。

【００３４】高等真核細胞中での発現のために適当なベ
クターは、昆虫バキュロウイルス（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒ
ｕｓ）又は他のウイルス、例えばＳＶ４０、ヘルペスウ
イルス、パピローマウイルス、レトロウイルス等を基礎
とするベクターである。適当なベクターは、発現プラス
ミドにより形質転換された微生物の表現型形質による選
択及び同定を可能にするマーカー遺伝子を含有すること
ができる。好ましいマーカー遺伝子は微生物に例えば重
金属、抗生物質、例えばアンピシリン又はテトラサイク
リンに対する耐性を付与する。

【００３５】大腸菌におけるハイブリドＴＧＦ−β蛋白
質の発現を制御するために幾つかのプロモーターを使用
することができる。強く発現される遺伝子のプロモータ
ーが特に使用される適当なプロモーターは大腸菌ｌａ
ｃ，ｔａｃ，ｔｒｐ及びｌｐｐプロモーター、さらにフ
ァージλＮ又はファージλｐＬプロモーター等である。

【００３６】サッカロミセス・セレビシエー（Ｓａｃｃ
ｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における
複製及び発現のために適当なベクターは酵母複製起点及
び酵母用選択遺伝子マーカーを含有する。酵母複製起
点、例えば染色体性自律複製セグメント（ａｒｓ）を含
有するハイブリドベクターは、形質転換後酵母細胞中に
染色体外に維持され、そして有糸分裂の間の自律的に複
製される。さらに、酵母２μプラスミドＤＮＡに対して
相同な配列を含有するハイブリドベクターを使用するこ
とができる。

【００３７】この様なプラスミドは、細胞内にすでに存
在する２μプラスミドに組換えにより組込まれ、又は自
律複製する。酵母のための適当なマーカーは特に、宿主
に抗生物質耐性を付与するもの、又は栄養要求性酵母変
異株の場合には宿主の欠損を補完する遺伝子である。対
応する遺伝子は例えば抗生物質シクロヘキシミドに対す
る耐性を付与し、又は栄養要求性酵母宿主に原栄養性、
例えばＵＲＡ３，ＬＥＵ２，ＨＩＳ３又はＴＲＰＩ遺伝
子を提供する。

【００３８】酵母における発現のために適当なプロモー
ターは、例えばＡＤＨＩ，ＡＤＨII又はＰＨ０５遺伝子
のそれであり、さらにまた解糖に関与するプロモータ
ー、例えばＰＧＫ又はＧＡＰプロモーターである。場合
によっては、ハイブリドＴＧＦ−β蛋白質の分泌を可能
にするシグナル配列を発現ベクターに含めることができ
る。適当なシグナル配列は、例えば酵母酸性ホスファタ
ーゼ（ＰＨ０５）又は酵母インベルターゼ遺伝子に由来
する。

【００３９】本発明はまた、前に又は例において定義さ
れる本発明のＤＮＡ分子の製造方法に関する。これらは
常法に従って、例えば制限酵素、リガーゼ、ホスファタ
ーゼもしくはポリメラーゼにより、又はポリメラーゼ連
鎖反応（ＰＣＲ）技法の適用により、又は常法の化学的
合成により、又は天然源もしくは形質転換された宿主か
らの所望のＤＮＡ分子の単離により、例えば所望のＤＮ
Ａ分子の複製をもたらすベクターにより形質転換された
宿主を培養しそして該宿主から常法によりＤＮＡ分子を
単離すること、例えばフェノール及び／又はクロロホル
ムによる抽出、を含んで成る方法により製造される。

【００４０】発現制御配列に適当なリーディングフレー
ム内に連結された、ハイブリドＴＧＦ−β蛋白質をコー
ドするヌクレオチド配列を含んで成る微生物宿主は、当
業界においてよく知られている組換ＤＮＡ技法により製
造することができ、この方法は、 ○ 適当な発現制御配列による発現制御のもとに、ハイ
ブリドＴＧＦ−β蛋白質をコードするＤＮＡ配列を含ん
で成るハイブリドベクターを調製し、 ○ 該ハイブリドベクターにより該微生物宿主を形質転
換し、そして ○ 形質転換されていない宿主細胞から形質転換された
微生物宿主細胞を選択する、ことを含んで成る。適当な
ベクターの選択は、形質転換のために供される微生物宿
主細胞により決定される。

【００４１】本発明の実施のために適当な微生物宿主は
酵母株、例えばサッカロミセス・セレビシエー（Ｓａｃ
ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、又は
細菌、例えばバシルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｕｂｔｉｌｉｓ）もしくは好ましくは大腸菌（Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）である。形質転換され
た微生物宿主は、資化性炭素源、窒素源及び無機塩類を
含有する液体培地中で、当業界において知られている方
法を用いて培養される。

【００４２】種々の炭素源が適当である。好ましい炭素
源の例は資化性炭水化物、例えばグルコース、マルトー
ス、マンニトール、フラクトースもしくはラクトース、
又は酢酸塩、例えば酢酸ナトリウムであり、これらは単
独で又は適当な混合物として使用される。適当な窒素源
には、例えばアミノ酸、例えばカザミノ酸、ペプチド及
び蛋白質、並びにこれらの分解生成物、例えばトリプト
ン、ペプトン又は肉エキス、さらに酵母エキス、マルト
エキス、コーンスチープリカー、並びにアンモニウム
塩、例えば塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム又は硝
酸アンモニウムが含まれ、これらは単独で、又は適当な
混合物として使用することができる。使用し得る無機塩
には、例えばナトリウム、カリウム、マグネシウム及び
カルシウムの硫酸塩、塩化物、リン酸塩及び炭酸塩が含
まれる。さらに、栄養培地は増殖促進物質を含有するこ
とができる。増殖を促進する物質には、例えば微量元
素、例えば鉄、亜鉛、マンガン等、又は個々のアミノ酸
が含まれる。

【００４３】ＴＧＦ−β−様蛋白質のモノマー型は組換
ＤＮＡ技法により、又は当業界において良く知られてい
る方法により合成的に製造することができる。ダイマー
形は、２つのジスルフィド連結されたポリペプチド鎖か
ら成る生物学的に活性な成熟分子である。このダイマー
形は、当業界においてよく知られている適当な発現系、
例えばＣＨＯ細胞中で直接に、又は好ましくは微生物宿
主、好ましくは大腸菌中でモノマーを発現させ、そして
このモノマーを再生（ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ）にかけるこ
とにより製造することができる。

【００４４】従って、本発明はダイマーの生物学的に活
性なハイブリドＴＧＦ−β蛋白質の製造方法に関し、こ
の方法においては、ハイブリドＴＧＦ−β蛋白質、好ま
しくは前に定義したハイブリドの１つのモノマー形が、
（ａ）発現制御配列に適切なリーディングフレーム内に
該蛋白質が発現されるように連結された、ハイブリドＴ
ＧＦ−β蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含んで
成る微生物宿主を培養し、そして（ｂ）ハイブリドＴＧ
Ｆ−β蛋白質を変性したモノマーの可溶性形として回収
する、ことにより製造される。

【００４５】モノマーハイブリドＴＧＦ−β蛋白質は微
生物細胞から当業界においてよく知られた方法により回
収される。これらの方法は細胞の溶解又は機械的破砕に
よる所望の蛋白質の放出、及びそれに続いての、例えば
沈澱及び／又はクロマトグラフィーによる宿主細胞蛋白
質からのハイブリドＴＧＦ−β蛋白質の分離を含む。モ
ノマーハイブリドＴＧＦ−β蛋白質が微生物宿主中で不
溶性凝集体（封入体）として生産される場合、それは再
生（ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ）条件にかけられる前に可溶化
されなければならい。従って、本発明はさらに、（ａ）
ハイブリドＴＧＦ−β蛋白質を含有する水不溶性蛋白質
画分を宿主細胞から単離し、そして（ｂ）ハイブリドＴ
ＧＦ−β蛋白質を可溶化する、段階によりモノマーハイ
ブリドＴＧＦ−β蛋白質を製造する方法に関する。

【００４６】モノマーの可溶化及び変性は、不溶性の形
でモノマーハイブリドＴＧＦ−β蛋白質を含有する粗蛋
白質懸濁液の約１〜約４のpH、好ましくは約pH２．０へ
の、場合によってはＤＴＴのごとき還元剤の存在下での
酸性化により、あるいは前記のように塩基性pH又は上昇
した温度での約４〜９Ｍの濃度のチャオトロープ剤（ｃ
ｈａｏｔｒｏｐｉｃ ａｇｅｎｔ）、好ましくはグアニ
ジンＨＣｌ又は最も好ましくは尿素の添加により達成さ
れる。可溶化されたモノマーは可溶化チャオトロープ
（ｃｈａｏｔｒｏｐｅ）から透析により精製することが
でき、そして透析中に沈澱が生ずる場合には、さらに遠
心分離により精製することができる。可溶化されたモノ
マーは、生物学的に活性なダイマー生成物を得るために
再生（ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ）のために使用される。

【００４７】再生は当業界において知られている再生方
法を用いて行われる（ヨーロッパ特許公開ＥＰ−Ａ−
０，４３３，２２５）。この様な再生方法においては、
モノマーの変性されたＴＧＦ−βハイブリド蛋白質の生
物学的に活性なジスルフィド連続されたダイマー形への
イン−ビトロ再生が、モノマー変性ＴＧＦ−βハイブリ
ド蛋白質の溶液と再生緩衝液との混合により達成され
る。再生緩衝液は緩衝塩、例えばＴｒｉｓ／ＨＣｌ、追
加の塩、例えばＮａＣｌ、場合によってはキレート剤、
例えばＥＤＴＡ、スルヒドリル／ジスルフィド酸化還元
系、例えば還元形及び酸化形のグルタチオン、並びに前
記モノマー、再生中間体及びダイマーを溶解の形で維持
しながらモノマーＴＧＦ−βハイブリド蛋白質を生物学
的活性と関連する空間配置に再生することを可能にする
可溶化剤から成る。

【００４８】好ましい可溶化剤は、ツゥイッターイオン
（ｚｗｉｔｔｅｒｉｏｎ）洗剤３−（３−クロラミドプ
ロピル）ジメチル−アンモニオ−１−プロパンスルホネ
ート（ＣＨＡＰＳ）もしくは３−（３−クロラミドプロ
ピル）ジメチル−アンモニオ−２−ヒドロキシ−１−プ
ロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳＯ）、又は類似の溶解
特性を有する他の洗剤である。ＣＨＡＰＳが最も好まし
い。再生緩衝液中に含まれる化学物質の好ましいpH、温
度及び濃度は、緩衝塩約１０mM〜約１Ｍ、最も好ましく
は約１００mM；追加の塩約１０mM〜約２Ｍ、最も好まし
くは約１Ｍ；キレート化剤約０．１〜約１００mM、最も
好ましくは約２mM；スルヒドリル／ジスルフィド酸化還
元剤約０．１〜約１０mMで、モル比約１００：１〜約
１：１００、最も好ましくは約２．５mMの還元グルタチ
オン及び約１mMの酸化グルタチオン；化溶化剤約１０〜
約１００mM、最も好ましくは約３０mM；pH約７〜約１
０、最も好ましくは８〜９；温度約０℃〜３７℃、最も
好ましくは約４℃である。

【００４９】再生の後、生物学的に活性なダイマーを精
製して不純物、特に微生物宿主細胞中での組換え蛋白質
の生産の後に調製物中に存在するかも知れないパイロジ
エン及びエンドトキシンを除去する。ダイマーの分離は
クロマトグラフィー、例えばサイジングゲルクロマトグ
ラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー又はイオ
ン交換クロマトグラフィーにより、例えばＭｏｎｏ Ｓ
カラム上で、逆相ＨＰＬＣにより行われる。

【００５０】本発明はさらに、本発明の方法に従って製
造されたダイマーの生物学的に活性なハイブリドＴＧＦ
−β蛋白質に関する。これらのハイブリドＴＧＦ−β蛋
白質は種々の療法的態様で使用することができる。本発
明はまた、本発明に従って製造されたダイマーの生物学
的に活性なハイブリドＴＧＦ−β蛋白質又はその医薬と
して許容される塩の有効量を含んで成る単位投与形の医
薬組成物に関する。

【００５１】この組成物は注入溶液、又は非経口投与、
例えば筋肉内もしくは静脈内投与、又は経口投与、もし
くは特に局所投与のための調製物である。溶液は好まし
くは、例えば、活性成分を単独で又は医薬として許容さ
れるキャリヤーと共に含んで成る凍結乾燥された調製物
から使用前に調製することができる等張性水溶液又は懸
濁液である。これらは常法に従って製造され、そして活
性成分のほかに生理的塩溶液、安定剤、例えばヒト血清
アルブミン、アミノ酸、例えばアルキニン又はグリシ
ン、及び炭水化物、例えばグルコース、マンモース、デ
キストラン又はヒドロキシメチル澱粉を含有することが
できる。pHは緩衝液、例えばリン酸塩、コハク酸塩又は
アミノ酸により約４．５〜７に調整することができる。
通常、バイアルが溶液で満たされ、そして長期貯のため
に凍結乾燥される。

【００５２】組成物は常用の助剤、例えば防腐剤、安定
剤、湿潤剤及び／又は乳化剤、溶解剤、浸透圧調整塩及
び／又は緩衝剤を含有する。所望により他の薬理学的に
価値ある物質を含有してもよい本発明の医薬組成物は、
それ自体既知の方法で、例えば常用の混合、溶解、凍結
乾燥及び／又は殺菌法により製造され、約１ng〜１００
μｇ／ｇ組成物、特に約１０ng〜１０μｇ／ｇの、そし
て凍結乾燥物の場合には１００％までの活性成分を含有
する。

【００５３】ハイブリドＴＧＦ−β蛋白質は、それらが
一方においてある種の細胞タイプすなわち繊維芽細胞の
増殖を刺激し、そして他方において他の細胞型、すなわ
ち腫瘍細胞及び免疫系の細胞の増殖を阻害する点におい
て二重性を有する。

【００５４】本発明に従って製造されたダイマーの生物
学的に活性なハイブリドＴＧＦ−β蛋白質は、場合によ
ってはそれらの塩の形、例えば特定の非毒性の医薬とし
て許容される酸付加塩の形、場合によっては医薬製剤の
形であり、有効量において適用される。「有効量」と
は、有意な治癒を生じさせる量、例えば所望の細胞の増
殖を刺激しそして正常細胞には非毒性の量である。この
量はイン−ビトロ増殖実験により決定することができ
る。ハイブリドＴＧＦ−β蛋白質の二重性質のため、
「有効量」はまた、腫瘍細胞及び免疫系の細胞の増殖を
有意な程度に阻害する量である。ヒトへの使用又は獣医
的使用が意図される場合、処置されるべき特定の組織、
適用の態様、疾患の重症度、並びに処置されるべき患者
の年令及び一般状態によって調整されなければならな
い。一般に、成人に対する一回投与量又は日用量は、増
殖刺激及び阻害効果の両者について、約０．０１〜２０
μｇの範囲である。

【００５５】本発明の医薬組成物は、動物、特に哺乳
類、特にヒトの治療のために、そして特にヒトの創傷の
治癒のために使用される。床ずれ（じゅく瘡性潰瘍）は
病院の患者、特に老人患者及び車いすの患者においてし
ばしば起こるので、それらの治療又は予防が好ましい用
途である。老人の場合、治癒過程が遅く、そしてこの患
者群は創傷の発生頻度が高い（及び糖尿病潰瘍のみなら
ず、外傷及び火傷等）ので、治癒が遅いか又は治癒が全
く起らない。

【００５６】獣医そして特にヒトの医療のために、本発
明の組成物の２つのタイプの使用が提案される。第一
の、そして好ましい適用は、皮表面創傷の治癒の促進の
ための、そして特に創傷治癒過程が顕著に遅い老人にお
ける局所適用である。処置され得る創傷のタイプについ
ては限界はなく、そしてこれは、限定的ではないが、表
面潰瘍、例えばじゅく瘡性潰瘍（床ずれ）、糖尿病潰
瘍、歯科潰瘍、口内潰瘍、静脈瘤潰瘍、及び血友病表面
潰瘍；火傷（特に二度及び三度）；外科切開（歯科外科
及び美容整形外科を含む）；事故創傷（切開、貫通、裂
傷及び他の外傷を含む）；並びに療法的に誘導される傷
（放射能療法の間に生ずるものを含む）が含まれる。

【００５７】局所投与される場合、組成物は他の成分、
例えば助剤、担体、溶解剤、及び知られている他のいず
れか、又はまだ知られていない二次成長因子を含むこと
ができる。これらの成分は投与のために医薬として及び
生理的に許容されなければならず、そして組成分の活性
成分の活性を低下せしたり毒性にしたりしてはならない
点を除き、それらの性質には特に制限がない。本発明の
組成物が表面潰瘍、火傷、外科創傷又は事故創傷に適用
される場合、組成物は好ましくは粉末、ゲル、軟こう、
膏薬、又は洗浄液の形であり、あるいはそれらは経皮パ
ッチ、膏薬又は包帯に、好ましくは液体又は半液体の形
で含浸されてもよく、あるいはそれらは歯磨き又はチュ
ーインガムもしくは樹脂に導入されてもよい。

【００５８】第二の適用は手術後の内部創傷の、又は手
術できないかもしくはその必要がない内部器官の組織へ
の傷害の治癒のための適用である。やはり、処置される
べき組織及び創傷のタイプには制限がなく、そしてそれ
らには（限定的ではなく）内部器官及び組織への深部外
科切開；骨及び軟膏（骨折の後）；胃、十二指腸及び他
の腸の潰瘍が含まれる。全身適用される場合、本発明の
組成物は経腸投与のための液体、丸薬、錠剤又は甘味入
れ錠剤として、あるいは非経口注射のための液体の形で
製剤化することができる。

【００５９】手術後の内部切開部の処置のため、それら
は洗浄液の形、好ましくは生理的に許容される塩溶液と
組合わせたものであることができる。やはり、本発明の
活性成分は他の成分、例えば助剤、担体、溶解剤及び他
の既知のいずれか、又はまだ知られていない二次成長因
子と組合わせることができる。これらは投与のために医
薬として及び生理的に許容されなければならず、そして
これらの組成物の活性成分の活性を低下せしたり毒性に
したりしてはならない点を除き、これらの成分の性質に
ついて制限は存在しない。

【００６０】創傷の治癒のため、適用されるべき活性成
分の量は、創傷のタイプ、重症度及び位置、そしてさら
に処置されるべき患者の年令及び一般的状態により調整
されなければならない。一般に１cm² の創傷当り０．１
μｇ〜２０μｇのハイブリドＴＧＦ−β蛋白質の一回投
与量又は日用量ですでに有意な治癒効果を有する。内的
使用のため、体液中にハイブリドＴＧＦ−β蛋白質が希
釈されるから、投与方法に依存してさらに高投与量が適
用されるべきである。

【００６１】本発明に従って製造されたハイブリドＴＧ
Ｆ−β蛋白質の更なる用途は骨及び組織の修復のため、
哺乳類における癌の治療のため、抗−炎症又は免疫抑制
剤として、哺乳類細胞培養における増殖調節剤として、
又は骨髄保護剤もしくは心臓保護の中介剤としての使用
である。本発明の最も好ましい態様は次の実施例に記載
するものである。

【００６２】

【実施例】次の例は本発明を例示するが本発明をそれに
限定するものではない。例１． ハイブリドＴＧＦ−βのｃＤＮＡの作製 後に言及するＴＧＦ−β１，ＴＧＦ−β２及びＴＧＦ−
β３の配列は配列番号：１〜４に示されている。ハイブ
リドｃＤＮＡの作製のために使用される種々のオリゴマ
ーはＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＤＮＡ合
成機で合成され、すべて配列表に記載されている。

【００６３】ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を使
用して、まずＴＧＦ−β１，ＴＧＦ−β２及びＴＧＦ−
β３のｃＤＮＡを増幅し、そして種々の一対の組合わせ
において連結して、対応する TGF−β1(44／45) β2, T
GF−β2(44／45) β1, TGF−β1(44／45) β3, TGF−β
3(44／45) β1, TGF−β2(44／45) β3 及び TGF−β3
(44／45) β2 ハイブリドｃＤＮＡｓ（配列番号：４〜
９）並びに TGF−β1(56／57) β2, TGF−β2(56／57)
β1, TGF−β1(56／57) β3, TGF−β3(56／57)β1, TG
F−β2(56／57) β3, TGF−β3(56／57) β2, TGF−β1
(79／80) β2, TGF−β2(79／80) β1, TGF−β1(79／8
0) β3, TGF−β3(79／80) β1, TGF−β2(79／80) β
3, TGF−β3(79／80) β2, TGF−β1(90／91) β2, TGF
−β2(90／91) β1, TGF−β1(90／91) β3, TGF−β3
(90／91) β1, TGF−β2(90／91) β3, TGF−β3(90／9
1) β2, TGF−β1(22／23) β2, TGF−β2(22／23) β
1, TGF−β1(22／23) β3, TGF−β3(22／23) β1, TGF
−β2(22／23) β3 、及び TGF−β3(22／23) β2 を後
記のようにして生成せしめる。

【００６４】すべてのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
は５０ngの対応するＴＧＦ−β１，ＴＧＦ−β２又はＴ
ＧＦ−β３鋳型を用いて行われる。増幅は、１０mM Ｔ
ＲＩＳ／ＨＣｌ（pH８．３５）、５０mM ＫＣｌ、１．
５mM ＭｇＣｌ₂ 、０．０５％（ｗ／ｖ）ＮＰ４０、
０．０５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０並びに２００μＭ
ずつのｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰを含
む１００μｌの反応混合物中２×２μｇの対応するオリ
ゴマーの存在下で、５ユニットのベント（Ｖｅｎｔ）ポ
リメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ
ｓ）を用いて行われる。Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｎｅｒ Ｃ
ｅｔｕｓ Ｈｅａｔｉｎｇ Ｂｌｏｃｋを用いる次の温
度：９３℃／０．１分間、４５℃／０．２分間、７３℃
／１．５時間、のもとに３０ラウンドの増幅を行う。

【００６５】上記のＴＧＦ−βハイブリド分子のそれぞ
れをコードするすべてのＤＮＡ分子の作製のため、ｃＤ
ＮＡの修飾されたヌクレオチド配列（配列番号：１〜
３）に対応する次のオリゴマーを使用する。 ＴＧＦ−β１：オリゴマー１及び２；配列番号１０及び
１１、 ＴＧＦ−β２：オリゴマー３及び４；配列番号１２及び
１３、 ＴＧＦ−β３：オリゴマー５及び６；配列番号１４及び
１５。 これらのオリゴヌクレオチドは、各蛋白質の成熟型（１
１２アミノ酸）をコードする領域を挟む５′配列（オリ
ゴマー１，３及び５）及び３′配列（オリゴマー２，４
及び６）を代表する。さらに、それぞれＴＧＦ−β１，
ＴＧＦ−β２及びＴＧＦ−β３分子中の高度に保存され
たコード領域中のヌクレオチド配列に対応するオリゴマ
ー７〜３６（配列番号：１６〜４５）も合成される。

【００６６】すべてがアミノ酸４４と４５の間にヒンジ
点を有する TGF−β1(44／45) β2,TGF−β2(44／45)
β1, TGF−β1(44／45) β3, TGF−β3(44／45) β1, T
GF−β2(44／45) β3 、及び TGF−β3(44／45) β2 を
コードするＤＮＡ分子の作製のため、それぞれ配列番
号：１６，１７，２０，２１，１８及び１９に対応する
オリゴマー７，８，１１，１２，９及び１０を、オリゴ
マー１〜６のほかに使用する。

【００６７】オリゴマー１及び８を用いて、ＴＧＦ−β
１成熟形蛋白質のＮ−末端の最初の４４アミノ酸のコー
ド領域を含む１４６bp長の断片が、ＴＧＦ−β１ ｃＤ
ＮＡ鋳型からの第一ＰＣＲ反応において増幅される。同
様にして、ハイブリドＴＧＦ−β ｃＤＮＡの第二成分
が、オリゴマー７及び１４を用いる第二ＰＣＲ反応にお
いて生成し、ＴＧＦ−β２成熟形蛋白質のＣ−末端の最
後の６８アミノ酸のコード領域を含むＴＧＦ−β２ ｃ
ＤＮＡ鋳型からの２４１bp長の断片の増幅がもたらされ
る。ＰＣＲ反応混合物をフェノール／クロロホルム抽出
し、そしてエタノール沈澱する。次に、増幅生成物を１
０mM ＴＲＩＳ／ＨＣｌ（pH７．５）、１mM ＥＤＴＡ
中に溶解し、そしてＡ−１５ｍ Ｂｉｏｇｅｌカラム
（ＢｉｏＲａｄ）上でゲル濾過する。第三ＰＣＲにおい
て、オリゴマー１及び４を用いて、これらの増幅生成物
をプールしてハイブリドＴＧＦ−β１（４４／４５）β
２のｃＤＮＡの生成のための鋳型を形成する。

【００６８】同様にして、上記の方法に準ずる３回のＰ
ＣＲ反応において、但し下記の表に示すオリゴマー及び
鋳型を用いて、 TGF−β1(44／45) β3, TGF−β2(44／
45)β1, TGF−β2(44／45) β3, TGF−β3(44／45) β1
及び TGF−β3(44／45) β2 を生成せしめる。

【００６９】

【表１】

【００７０】すべてがアミノ酸２２と２３との間にヒン
ジ点を有するハイブリド TGF−β1(22／23) β2, TGF−
β2(22／23) β1, TGF−β1(22／23) β3, TGF−β3(22
／23) β1, TGF−β2(22／23) β3 、及び TGF−β3(22
／23) β2 を作製するため、オリゴマー１〜６、及びさ
らに、修飾されたヌクレオチド配列に対応する次のオリ
ゴヌクレオチドを使用する。 ＴＧＦ−β１：オリゴ１３及び１４（配列番号：２２及
び２３） ＴＧＦ−β２：オリゴ１５及び１６（配列番号：２４及
び２５） ＴＧＦ−β３：オリゴ１７及び１８（配列番号：２６及
び２７） 前記の方法に従って、但し下記のオリゴマー及び鋳型
（鋳型ｃＤＮＡ）を用いて３回のＰＣＲ反応においてハ
イブリドを生成させる。

【００７１】

【表２】

【００７２】すべてがアミノ酸５６と５７との間にヒン
ジ点を有するハイブリド TGF−β1(56／57) β2, TGF−
β2(56／57) β1, TGF−β1(56／57) β3, TGF−β3(56
／57) β1, TGF−β2(56／57) β3 、及び TGF−β3(56
／57) β2 の作製のため、オリゴマー１〜６、及びさら
に、修飾されたヌクレオチド配列に対応する次のオリゴ
ヌクレオチドを使用する。 ＴＧＦ−β１：オリゴ１９及び２０（配列番号：２８及
び２９） ＴＧＦ−β２：オリゴ２１及び２２（配列番号：３０及
び３１） ＴＧＦ−β３：オリゴ２３及び２４（配列番号：３２及
び３３） 前記の方法に従って、但し次の表のオリゴマー及び鋳型
（鋳型ｃＤＮＡ）を使用して、３回のＰＣＲ反応におい
てハイブリドを生成させる。

【００７３】

【表３】

【００７４】すべてがアミノ酸７９と８０との間にヒン
ジ点を有するハイブリド TGF−β1(79／80) β2, TGF−
β2(79／80) β1, TGF−β1(79／80) β3, TGF−β3(79
／80) β1, TGF−β2(79／80) β3 、及び TGF−β3(79
／80) β2 を作製するため、オリゴヌクレオチド１〜
６、及びさらに、修飾されたヌクレオチドに対応する次
のオリゴヌクレオチドを使用する。 ＴＧＦ−β１：オリゴ２５及び２６（配列番号：３４及
び３５） ＴＧＦ−β２：オリゴ２７及び２８（配列番号：３６及
び３７） ＴＧＦ−β３：オリゴ２９及び３０（配列番号：３８及
び３９） 前記の方法に従って、但し下記の表に示すオリゴマー及
び鋳型（鋳型ｃＤＮＡ）を用いて、３回のＰＣＲ反応に
おいてハイブリドを生成せしめる。

【００７５】

【表４】

【００７６】すべてがアミノ酸９０と９１との間にヒン
ジ点を有するハイブリド TGF−β1(90／91) β2, TGF−
β2(90／91) β1, TGF−β1(90／91) β3, TGF−β3(90
／91) β1, TGF−β2(90／91) β3 、及び TGF−β3(90
／91) β2 を作製するため、オリゴマー１〜６、及びさ
らに、修飾されたヌクレオチド配列に対応する次のオリ
ゴヌクレオチドを使用する。 ＴＧＦ−β１：オリゴ３１及び３２（配列番号：４０及
び４１） ＴＧＦ−β２：オリゴ３３及び３４（配列番号：４２及
び４３） ＴＧＦ−β３：オリゴ３５及び３６（配列番号：４４及
び４５） 前記の方法に従って、但し下記の表に示すオリゴマー及
び鋳型（鋳型ｃＤＮＡ）を用いて、３回のＰＣＲ反応に
おいてハイブリドを生成せしめる。

【００７７】

【表５】

【００７８】各場合において、第三ＰＣＲ反応混合物を
フェノール／クロロホルム抽出し、そしてエタノール沈
澱せしめる。次に沈澱物を供給者（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅ
ｒｌ）の指示に従ってＮｃｏＩ及びＳａｌＩにより完全
消化する。ハイブリドＴＧＦ−βのｃＤＮＡ分子をＮＡ
−４５０ＥＡＥペーパー（Ｓｃｈｌｅｉｏｈｅｒ ＆Ｓ
ｃｈｕｅｌｌ）を用いて電気泳動（Ｕｌｔｒａｐｕｒｅ
ＢＲＬ）により精製する。ＤＮＡをペーパーから５０
mM ＴＲＩＳ／ＨＣｌ（pH７．５）、５mMＥＤＴＡ、１
Ｍ ＮａＣｌ中に溶出し、そして次にフェノール／クロ
ロホルム抽出し、そしてエタノール沈澱せしめる。生ず
るハイブリドＴＧＦ−βのＤＮＡペレットを７０％エタ
ノールにより洗浄し、１０mM ＴＲＩＳ／ＨＣｌ（pH
７．５）、１mM ＥＤＴＡに再懸濁し、そして次にＮｃ
ｏＩ及びＳａｌＩ部位を介してプラスミドｐＧＥＭ−５
ｚｆ（＋）（Ｐｒｏｍｅｇａ）にサブクローニングす
る。

【００７９】アミノ酸４４と４５との間にヒンジ点を有
するハイブリドをコードするＤＮＡの調製から得られた
構成物を、pGKM.D98(TGF−β1(44／45) β2), pGKM.D5
71(TGF−β2(44／45) β1), pGKM.D99(TGF−β1(44／4
5) β3), pGKM.D584(TGF−β3(44／45) β1), pGKM.D
580(TGF−β2(44／45) β3)及び pGKM.D619(TGF−β3(4
4／45) β2)と称し、そしてコンピテント大腸菌ＪＭ１
０９細胞（例２を参照のこと）を形質転換するのに使用
する。ハイブリド TGF−β1(44／45) β2, TGF−β2(44
／45) β1, TGF−β1(44／45) β3, TGF−β3(44／45)
β1, TGF−β2(44／45) β3 及び TGF−β3(44／45) β
2 をコードする正しい挿入部を担持するクローンをそれ
ぞれ大腸菌 (E. coli) JM109 pGKM.D98(TGF−β1(44／
45) β2)、大腸菌 (E. coli) JM109 pGKM.D571 (TGF−
β2(44／45) β1)、大腸菌 (E. coli) JM109 pGKM.D99
(TGF−β1(44／45) β3)、大腸菌 (E. coli) JM109 pG
KM.D584 (TGF−β3(44／45) β1)、大腸菌 (E. coli)
JM109 pGKM.D580 (TGF−β2(44／45) β3)及び大腸菌
(E. coli) JM109 pGKM.D619 (TGF−β3(44／45) β2)
と称する。

【００８０】同様に、アミノ酸５６と５７との間にヒン
ジ点を有するハイブリドをコードするＤＮＡの調製から
得られる構成物をpGKM.D98(TGF−β1(56／57) β2), p
GKM.D571(TGF−β2(56／57) β1), pGKM.D99(TGF−β1
(56／57) β3), pGKM.D584(TGF−β3(56／57) β1),
pGKM.D580(TGF−β2(56／57) β3)、及び pGKM.D619(TG
F−β3(56／57) β2)と称し、そしてコンピテント大腸
菌ＪＭ１０９細胞（例２を参照のこと）を形質転換する
ために用いる。ハイブリド TGF−β1(56／57) β2, TGF
−β2(56／57) β1, TGF−β1(56／57) β3, TGF−β3
(56／57) β1, TGF−β2(56／57) β3 及び TGF−β3(5
6／57) β2 をコードする正しい挿入部を担持するクロ
ーンを、それぞれ大腸菌 (E. coli) JM109 pGKM.D98(T
GF−β1(56／57) β2)、大腸菌 (E. coli) JM109 pGK
M.D571 (TGF−β2(56／57) β1)、大腸菌 (E. coli) J
M109 pGKM.D99(TGF−β1(56／57) β3)、大腸菌 (E. c
oli) JM109 pGKM.D584 (TGF−β3(56／57) β1)、大腸
菌 (E. coli) JM109 pGKM.D580(TGF−β2(56／57) β
3)、及び大腸菌 (E. coli) JM109 pGKM.D619 (TGF−β
3(56／57) β2)と称する。

【００８１】同様に、アミノ酸７９と８０との間にヒン
ジ点を有するハイブリドをコードするＤＮＡの調製物か
ら得られる構成物をpGKM.D98(TGF−β1(79／80) β2),
pGKM.D571(TGF−β2(79／80) β1), pGKM.D99(TGF−β
1(79／80) β3), pGKM.D584(TGF−β3(79／80) β1),
pGKM.D580(TGF−β2(79／80) β3)、及び pGKM.D619(T
GF−β3(79／80) β2)と称し、そしてコンピテント大腸
菌ＪＭ１０９細胞（例２を参照のこと）を形質転換する
ために用いる。ハイブリド TGF−β1(79／80)β2, TGF
−β2(79／80) β1, TGF−β1(79／80) β3, TGF−β3
(79／80) β1, TGF−β2(79／80) β3 及び TGF−β3(7
9／80) β2 をコードする正しい挿入部を担持するクロ
ーンを、それぞれ大腸菌 (E. coli) JM109 pGKM.D98(T
GF−β1(79／80) β2)、大腸菌 (E. coli) JM109 pGK
M.D571 (TGF−β2(79／80) β1)、大腸菌 (E. coli) J
M109 pGKM.D99(TGF−β1(79／80) β3)、大腸菌 (E. c
oli)JM109 pGKM.D584 (TGF−β3(79／80) β1)、大腸菌
(E. coli) JM109 pGKM.D580 (TGF−β2(79／80) β
3)、及び大腸菌 (E. coli) JM109 pGKM.D619 (TGF−β
3(79／80) β2)と称する。

【００８２】同様に、アミノ酸９０と９１との間にヒン
ジ点を有するハイブリドをコードするＤＮＡの調製物か
ら得られる構成物をpGKM.D98(TGF−β1(90／91) β2),
pGKM.D571(TGF−β2(90／91) β1), pGKM.D99(TGF−β
1(90／91) β3), pGKM.D584(TGF−β3(90／91) β1),
pGKM.D580(TGF−β2(90／91) β3)及び pGKM.D619(TGF
−β3(90／91) β2)と称し、そしてコンピテント大腸菌
ＪＭ１０９細胞（例２を参照のこと）を形質転換するた
めに用いる。ハイブリド TGF−β1(90／91) β2, TGF−
β2(90／91) β1, TGF−β1(90／91) β3, TGF−β3(90
／91) β1, TGF−β2(90／91) β3 及び TGF−β3(90／
91) β2 をコードする正しい挿入部を担持するクローン
を、それぞれ大腸菌 (E. coli) JM109 pGKM.D98(TGF−
β1(90／91) β2)、大腸菌 (E. coli) JM109 pGKM.D57
1 (TGF−β2(90／91) β1)、大腸菌 (E. coli) JM109
pGKM.D99(TGF−β1(90／91) β3)、大腸菌 (E. coli)
JM109 pGKM.D584 (TGF−β3(90／91) β1)、大腸菌 (E.
coli) JM109 pGKM.D580(TGF−β2(90／91) β3)及び
大腸菌 (E. coli) JM109 pGKM.D619 (TGF−β3(90／9
1) β2)と称する。

【００８３】同様に、アミノ酸２２と２３との間にヒン
ジ点を有するハイブリドをコードするＤＮＡの調製物か
ら得られる構成物をpGKM.D98(TGF−β1(22／23) β2),
pGKM.D571(TGF−β2(22／23) β1), pGKM.D99(TGF−β
1(22／23) β3), pGKM.D584(TGF−β3(22／23) β1),
pGKM.D580(TGF−β2(22／23) β3)及び pGKM.D619(TGF
−β3(22／23) β2)と称し、そしてコンピテント大腸菌
ＪＭ１０９（例２を参照のこと）を形質転換するために
用いる。ハイブリド TGF−β1(22／23) β2, TGF−β2
(22／23) β1, TGF−β1(22／23) β3, TGF−β3(22／2
3) β1, TGF−β2(22／23) β3 及び TGF−β3(22／23)
β2 をコードする正しい挿入部を担持するクローン
を、それぞれ大腸菌 (E. coli) JM109 pGKM.D98(TGF−
β1(22／23)β2)、大腸菌 (E. coli) JM109 pGKM.D571
(TGF−β2(22／23) β1)、大腸菌 (E. coli) JM109 p
GKM.D99(TGF−β1(22／23) β3)、大腸菌 (E. coli) J
M109pGKM.D584 (TGF−β3(22／23) β1)、大腸菌 (E.
coli) JM109 pGKM.D580 (TGF−β2(22／23) β3)及び大
腸菌 (E. coli) JM109 pGKM.D619 (TGF−β3(22／23)
β2)と称する。

【００８４】例２． ハイブリドＴＧＦ−βのｃＤＮＡ
の配列決定 オリゴマー７，８，９，１０，１１及び１２、標準ＳＰ
６及びＴ７プライマー（Ｐｒｏｍｅｇａ）並びにＳｅｑ
ｕｅｎｓｅキット（Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ
ｓ）を用い、Ｓａｎｇｅｒ法〔ＰＮＡＳ ７４：５４６
３（１９７７）に従って、二本鎖配列決定により種々の
ハイブリドＴＧＦ−βのｃＤＮＡの同一性を確認する。
成熟 TGF−β1(44／45) β2, TGF−β1(44／45) β3, T
GF−β2(44／45) β1, TGF−β2(44／45) β3, TGF−β
3(44／45) β1 及び TGF−β3(44／45) β2 ハイブリド
の１１２アミノ酸をカバーするヌクレオチド配列及びＮ
−末端の追加のメチオニン残基をそれぞれ配列番号４，
５，６，７，８及び９に示す（開始コドンＡＴＧは示し
てない）。

【００８５】例３． 大腸菌中でのハイブリドＴＧＦ−
βの発現 ３Ａ．一般的方法 細菌株（大腸菌Ｋ１２） ＬＣ１３７：ｈｔｐＲ_am，ｌｏｎ_R9，ｌａｃ_am，ｍａｌ
_am，ｔｒｐ_am，ｐｈｏ _am，ｒｓｐＬ，ｔｓｘ::Ｔｎ１
０，ｓｕｐＣ_ts（Ｇｏｆｆ，Ｓ．Ａ．ら（１９８４）Ｐ
ＮＡＳ ８１，６６４７−６６５１）。プラスミド ｐＰＬＭｕ（Ｂｕｅｌｌ Ｇ．ら（１９８５）Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１３，１９２３−１９３
８）。このプラスミドはバクテリオファージλＰ _L プロ
モーター及びファージＭｕ ｎｅｒ遺伝子リボゾーム結
合部位を有する（Ｖａｎ Ｌｅｅｒｄａｍ，Ｅ．ら（１
９８２）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １２３，１９−２８）。 ｐｃＩ₈₅₇ ：熱感受性λＣＩ₈₅₇ レプレッサーをコード
しており、そしてカナマイシン耐性を与えるプラスミド
（Ｒｅｍａｕｌｔ，Ｅ．ら（１９８３）Ｇｅｎｅ ２
２，１０３−１１３）。

【００８６】ＳＤＳゲル電気泳動 ＳＤＳゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）及び蛋白質の
染色をすでに記載されている様にして（Ｌａｅｍｍｌ
ｉ，Ｕ．Ｋ．（１９７０），Ｎａｔｕｒｅ ２２７，６
８０−６８５）、ＢＩＯＲＡＤからのＭｉｎｉｐｒｏｔ
ｅｉｎIIセル及び１mm厚さの１８％ポリアクリルアミド
ゲルを用いて行う。熱誘導 ２０mlの培養管中、４０μｇずつのアンピシリン及びカ
ナマイシン（ＬＢ／ａｍｐ／ｋａｎ）を含有するＬＢ培
地（Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８２），Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ
ｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒ
ｋ）７mlに１ケのコロニーを接種し、そして振とうしな
がら３０℃にて一夜インキュベートする。この一夜培養
物５mlを１００mlのエルレンマイヤーフラスコ中１５ml
のＬＢ／ａｍｐ／ｋａｎに加える。

【００８７】このフラスコを４２℃の水浴振とう機に移
す。移す前に２mlのサンプルを接種し（未−誘導条
件）、そして移した後（誘導条件）１時間毎に１mlのサ
ンプルを接種する。細胞を遠心分離（エッペンドルフ管
中１０，０００rpm にて５分間）することによりペレッ
ト化し、そして上清を捨てる。ペレットをＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥのために１００μｌのサンプル緩衝液に再懸濁し、
そして９５℃にて１０分間加熱する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
のため５mlのアリコートを付加する。

【００８８】コンピテント細胞の調製 コンピテント大腸菌細胞を、通常の塩化カルシウム法に
より、Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８２），Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒ
ｋ、に記載されているようにして調製する。

【００８９】３Ｂ． 発現ベクターの作製及びハイブリ
ドＴＧＦ−βの発現 大腸菌ＪＭ１０９を、対応する TGF−β1(44／45) β2,
TGF−β2(44／45) β1, TGF−β1(44／45) β3, TGF−
β3(44／45) β1, TGF−β2(44／45) β3 及びTGF−β3
(44／45) β2 ハイブリドＤＮＡを含むｐＧＥＭ−５ｚ
ｆ（＋）ベクターにより形質転換する。大腸菌細胞をＬ
Ｂ培地中で増殖せしめ、そしてプラスミドＤＮＡを調製
する。各場合において、５μｇのプラスミドハイブリド
ＴＧＦ−β ＤＮＡを５０μｌ制限緩衝液中でＮｃｏＩ
及びＳａｌＩにより、供給者（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）
の推奨に従って完全に切断する。

【００９０】５μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム、１００mM
ＭｇＣｌ₂ 、５mM ＥＤＴＡ、及び１５０μｌのエタノ
ールの添加によりＤＮＡを沈澱せしめる。−７０℃にて
１５分間インキュベートした後、Ｓｏｒｖａｌｌ遠心分
離機にてＳＳ−３４ローター中で、１３，０００×ｇに
て１５分間の遠心分離によりＤＮＡを沈澱せしめる。上
清を捨て、ペレットを、０．２５％のブロムフェノール
ブルー及び０．２５％のキシレンシアノールを含有する
８０μｌの０．０８９Ｍ ＴＲＩＳ−硼酸塩、０．０８
９Ｍ硼酸及び０．００２Ｍ ＥＤＴＡ（ＴＢＥ緩衝液）
に再懸濁する。

【００９１】４×２０μｌのサンプルを、０．５μｇ／
mlの臭化エチジウムを含有するＴＢＥ緩衝液中で１％ア
ガロースゲルを通して５０Ｖにて、ブロムフェノールブ
ルーマーカーが１０cm長及び０．８cm厚さのゲルの底部
に達するまで電気泳動する。それぞれ成熟 TGF−β1(44
／45) β2, TGF−β2(44／45) β1, TGF−β1(44／45)
β3, TGF−β3(44／45) β1, TGF−β2(44／45) β3 及
び TGF−β3(44／45)β2 ハイブリドをコードするＤＮ
Ａ断片を短波長Ｕ．Ｖ光のもとで可視化し、カミソリの
刃で切断し、そしてＳｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈ
ｕｅｌｌ Ｂｉｏｔｒａｐ Ａｐｐａｒａｔｕｓ中でゲ
ル片から２００mAにて１５時間電気溶出する。溶出され
たＤＮＡ断片を沈澱させ（上記参照のこと）、そして２
０μｌのＴＥに再懸濁する。

【００９２】５μｌのプラスミドｐＰＬＭｕをＮｃｏＩ
及びＳａｌＩによる消化によって線状化し、そして上記
のようにして断片ＤＮＡについてゲル精製する。１００
ngの線状化されそして精製された断片ＤＮＡを、１ユニ
ットのＤＮＡリガーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）を含有
する連結緩衝液（７０mM ＴＲＩＳ−ＨＣｌ、pH７．
５、１０mM ＭｇＣｌ₂ 、５mM ＤＴＴ（アデノシント
リホスフェート）２０μｌ中で４℃にて１５分間インキ
ュベートする。

【００９３】１０μｌの連結混合物を、プラスミドｐｃ
Ｉ８５７を担持する冷（４℃）マンピテント大腸菌ＬＣ
１３７細胞２００μｌに加える。３０分後、４２℃の水
浴にて１．５分間のインキュベーションにより細胞にヒ
ートショックを与える。２mlのＬＢ培地を加え、培養物
を３０℃にて６０分間振とうする。２００μｌのアリコ
ートを、アンピシリン及びカナマイシンを含有するＬＢ
プレート上にプレートし、そして３０℃にて２２時間イ
ンキュベートする。単一コロニーを培養し、そしてプラ
スミドＤＮＡを分析する。

【００９４】TGF−β1(44／45) β2, TGF−β2(44／45)
β1, TGF−β1(44／45) β3, TGF−β3(44／45) β1,
TGF−β2(44／45) β3 及び TGF−β3(44／45) β2 を
コードするＤＮＡ断片をｐＰＬＭｕにサブクローニング
して、それぞれプラスミド pPLMu.TGF−β1(44／45) β
2, pPLMu.TGF−β2(44／45) β1, pPLMu.TGF−β1(44／
45) β3, pPLMu.TGF−β3(44／45) β1, pPLMu.TGF−β
2(44／45) β3 及び pPLMu.TGF−β3(44／45) β2 を得
る。これらの構成物を含有する、クローンを、それぞれ
大腸菌 (E. coli)LC137／ pPLMu.TGF−β1(44／45) β
2 、大腸菌 (E. coli)LC137／ pPLMu.TGF−β2(44／45)
β1 、大腸菌 (E. coli)LC137／ pPLMu.TGF−β1(44／
45) β3 、大腸菌 (E. coli)LC137／ pPLMu.TGF−β3
(44／45) β1 、大腸菌 (E. coli)LC137／ pPLMu.TGF
−β2(44／45) β3 及び大腸菌 (E. coli)LC137／ pPL
Mu.TGF−β3(44／45) β2 と称する。

【００９５】同様にして、 TGF−β1(56／57) β2, TGF
−β2(56／57) β1, TGF−β1(56／57) β3, TGF−β3
(56／57) β1, TGF−β2(56／57) β3 及び TGF−β3(5
6／57) β2 をコードするＤＮＡ断片をｐＰＬＭｕにサ
ブクローニングして、それぞれプラスミド pPLMu.TGF−
β1(56／57) β2, pPLMu.TGF−β2(56／57) β1, pPLM
u.TGF−β1(56／57) β3, pPLMu.TGF−β3(56／57) β
1, pPLMu.TGF−β2(56／57) β3 及び pPLMu.TGF−β3
(56／57) β2 を作製し、そして形質転換された宿主大
腸菌 (E. coli)LC137／ pPLMu.TGF−β1(56／57) β2
、大腸菌 (E. coli)LC137／ pPLMu.TGF−β2(56／57)
β1 、大腸菌 (E. coli)LC137／ pPLMu.TGF−β1(56
／57) β3 、大腸菌 (E. coli)LC137／ pPLMu.TGF−β
3(56／57) β1 、大腸菌 (E. coli)LC137／ pPLMu.TGF
−β2(56／57) β3 及び大腸菌 (E. coli)LC137／ pPL
Mu.TGF−β3(56／57) β2 を調製する。

【００９６】同様にして、 TGF−β1(79／80) β2, TGF
−β2(79／80) β1, TGF−β1(79／80) β3, TGF−β3
(79／80) β1, TGF−β2(79／80) β3 及び TGF−β3(7
9／80) β2 をコードするＤＮＡ断片をｐＰＬＭｕにサ
ブクローニングして、それぞれプラスミド pPLMu.TGF−
β1(79／80) β2, pPLMu.TGF−β2(79／80) β1, pPLM
u.TGF−β1(79／80) β3, pPLMu.TGF−β3(79／80) β
1, pPLMu.TGF−β2(79／80) β3 及び pPLMu.TGF−β3
(79／80) β2 を作製し、そして形質転換された宿主大
腸菌 (E. coli)LC137／ pPLMu.TGF−β1(79／80) β2
、大腸菌 (E. coli)LC137／ pPLMu.TGF−β2(79／80)
β1 、大腸菌 (E. coli)LC137／ pPLMu.TGF−β1(79
／80) β3 、大腸菌 (E. coli)LC137／ pPLMu.TGF−β
3(79／80) β1 、大腸菌 (E. coli)LC137／ pPLMu.TGF
−β2(79／80) β3 及び大腸菌 (E. coli)LC137／ pPL
Mu.TGF−β3(79／80) β2 を調製する。

【００９７】同様にして、 TGF−β1(90／91) β2, TGF
−β2(90／91) β1, TGF−β1(90／91) β3, TGF−β3
(90／91) β1, TGF−β2(90／91) β3 及び TGF−β3(9
0／91) β2 をコードするＤＮＡ断片をｐＰＬＭｕにサ
ブクローニングして、それぞれプラスミド pPLMu.TGF−
β1(90／91) β2, pPLMu.TGF−β2(90／91) β1, pPLM
u.TGF−β1(90／91) β3, pPLMu.TGF−β3(90／91) β
1, pPLMu.TGF−β2(90／91) β3 及び pPLMu.TGF−β3
(90／91) β2 を作製し、そして形質転換された宿主大
腸菌 (E. coli)LC137／ pPLMu.TGF−β1(90／91) β2
、大腸菌 (E. coli)LC137／ pPLMu.TGF−β2(90／91)
β1 、大腸菌 (E. coli)LC137／ pPLMu.TGF−β1(90
／91) β3 、大腸菌 (E. coli)LC137／ pPLMu.TGF−β
3(90／91) β1 、大腸菌 (E. coli)LC137／ pPLMu.TGF
−β2(90／91) β3 及び大腸菌 (E. coli)LC137／ pPL
Mu.TGF−β3(90／91) β2 を調製する。

【００９８】同様にして、 TGF−β1(22／23) β2, TGF
−β2(22／23) β1, TGF−β1(22／23) β3, TGF−β3
(22／23) β1, TGF−β2(22／23) β3 及び TGF−β3(2
2／23) β2 をコードするＤＮＡ断片をｐＰＬＭｕにサ
ブクローニングして、それぞれプラスミド pPLMu.TGF−
β1(22／23) β2, pPLMu.TGF−β2(22／23) β1, pPLM
u.TGF−β1(22／23) β3, pPLMu.TGF−β3(22／23) β
1, pPLMu.TGF−β2(22／23) β3 及び pPLMu.TGF−β3
(22／23) β2 を作製し、そして形質転換された宿主大
腸菌 (E. coli)LC137／ pPLMu.TGF−β1(22／23) β2
、大腸菌 (E. coli)LC137／ pPLMu.TGF−β2(22／23)
β1 、大腸菌 (E. coli)LC137／ pPLMu.TGF−β1(22
／23) β3 、大腸菌 (E. coli)LC137／ pPLMu.TGF−β
3(22／23) β1 、大腸菌 (E. coli)LC137／ pPLMu.TGF
−β2(22／23) β3 及び大腸菌 (E. coli)LC137／ pPL
Mu.TGF−β3(22／23) β2 を調製する。

【００９９】大腸菌 (E. coli)LC137／ pPLMu.TGF−β
1(44／45) β2 、大腸菌 (E. coli)LC137／ pPLMu.TGF
−β2(44／45) β1 、大腸菌 (E. coli)LC137／ pPLM
u.TGF−β1(44／45) β3 、大腸菌 (E. coli)LC137／
pPLMu.TGF−β3(44／45) β1、大腸菌 (E. coli)LC137
／ pPLMu.TGF−β2(44／45) β3 及び大腸菌 (E. col
i)LC137／ pPLMu.TGF−β3(44／45) β2 を熱誘導し
（例３．Ａを参照のこと）、そして発現された蛋白質を
ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析する。 TGF−β1(44／45)
β2, TGF−β2(44／45) β1, TGF−β1(44／45) β3, T
GF−β3(44／45) β1, TGF−β2(44／45) β3 及び TGF
−β3(44／45) β2 はすべて、熱誘導の２時間後に熱誘
導された蛋白質として現われ、約１２，０００Ｄの見か
け分子量をもって泳動する。

【０１００】同様にして、大腸菌 (E. coli)LC137／ p
PLMu.TGF−β1(56／57) β2 、大腸菌 (E. coli)LC137
／ pPLMu.TGF−β2(56／57) β1 、大腸菌 (E. coli)L
C137／ pPLMu.TGF−β1(56／57) β3 、大腸菌 (E. co
li)LC137／ pPLMu.TGF−β3(56／57) β1 、大腸菌 (E.
coli)LC137／ pPLMu.TGF−β2(56／57) β3 及び大腸
菌 (E. coli)LC137／ pPLMu.TGF−β3(56／57) β2 を
熱誘導し（例３．Ａを参照のこと）、そして発現された
蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析する。 TGF−β1
(56／57) β2, TGF−β2(56／57) β1, TGF−β1(56／5
7) β3, TGF−β3(56／57) β1, TGF−β2(56／57) β3
及び TGF−β3(56／57) β2 はすべて、熱誘導の２時
間後に熱誘導された蛋白質として現われ、約１２，００
０Ｄの見かけ分子量をもって泳動する。

【０１０１】同様にして、大腸菌 (E. coli)LC137／ p
PLMu.TGF−β1(79／80) β2 、大腸菌 (E. coli)LC137
／ pPLMu.TGF−β2(79／80) β1 、大腸菌 (E. coli)L
C137／ pPLMu.TGF−β1(79／80) β3 、大腸菌 (E. co
li)LC137／ pPLMu.TGF−β3(79／80) β1 、大腸菌 (E.
coli)LC137／ pPLMu.TGF−β2(79／80) β3 及び大腸
菌 (E. coli)LC137／ pPLMu.TGF−β3(79／80) β2 を
熱誘導し（例３．Ａを参照のこと）、そして発現された
蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析する。 TGF−β1
(79／80) β2, TGF−β2(79／80) β1, TGF−β1(79／8
0) β3, TGF−β3(79／80) β1, TGF−β2(79／80) β3
及び TGF−β3(79／80) β2 はすべて、熱誘導の２時
間後に熱誘導された蛋白質として現われ、約１２，００
０Ｄの見かけ分子量をもって泳動する。

【０１０２】同様にして、大腸菌 (E. coli)LC137／ p
PLMu.TGF−β1(90／91) β2 、大腸菌 (E. coli)LC137
／ pPLMu.TGF−β2(90／91) β1 、大腸菌 (E. coli)L
C137／ pPLMu.TGF−β1(90／91) β3 、大腸菌 (E. co
li)LC137／ pPLMu.TGF−β3(90／91) β1 、大腸菌 (E.
coli)LC137／ pPLMu.TGF−β2(90／91) β3 及び大腸
菌 (E. coli)LC137／ pPLMu.TGF−β3(90／91) β2 を
熱誘導し（例３．Ａを参照のこと）、そして発現された
蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析する。 TGF−β1
(90／91) β2, TGF−β2(90／91) β1, TGF−β1(90／9
1) β3, TGF−β3(90／91) β1, TGF−β2(90／91) β3
及び TGF−β3(90／91) β2 はすべて、熱誘導の２時
間後に熱誘導された蛋白質として現われ、約１２，００
０Ｄの見かけ分子量をもって泳動する。

【０１０３】同様にして、大腸菌 (E. coli)LC137／ p
PLMu.TGF−β1(22／23) β2 、大腸菌 (E. coli)LC137
／ pPLMu.TGF−β2(22／23) β1 、大腸菌 (E. coli)L
C137／ pPLMu.TGF−β1(22／23) β3 、大腸菌 (E. co
li)LC137／ pPLMu.TGF−β3(22／23) β1 、大腸菌 (E.
coli)LC137／ pPLMu.TGF−β2(22／23) β3 及び大腸
菌 (E. coli)LC137／ pPLMu.TGF−β3(22／23) β2 を
熱誘導し（例３．Ａを参照のこと）、そして発現された
蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析する。 TGF−β1
(22／23) β2, TGF−β2(22／23) β1, TGF−β1(22／2
3) β3, TGF−β3(22／23) β1, TGF−β2(22／23) β3
及び TGF−β3(22／23) β2 はすべて、熱誘導の２時
間後に熱誘導された蛋白質として現われ、約１２，００
０Ｄの見かけ分子量をもって泳動する。

【０１０４】３Ｃ． 形質転換体の発酵 ４０mg／Ｌのアンピシリン及びカナマイシンを含有する
ＬＢ培地７５０mlを含む２Ｌエルレンマイヤーフラスコ
中の大腸菌 (E. coli)LC137／ pPLMu.TGF−β1(44／4
5) β2 、大腸菌 (E. coli)LC137／ pPLMu.TGF−β2(4
4／45) β1 、大腸菌 (E. coli)LC137／ pPLMu.TGF−
β1(44／45) β3 、大腸菌 (E. coli)LC137／ pPLMu.T
GF−β3(44／45) β1 、大腸菌 (E. coli)LC137／ pPL
Mu.TGF−β2(44／45) β3 及び大腸菌 (E. coli)LC137
／ pPLMu.TGF−β3(44／45) β2 の一夜培養物を３０℃
にて増殖せしめる。３００mlの一夜培養物を２Ｌエルレ
ンマイヤー中の前記の抗生物質を含有するＬＢ培地７５
０mlに加え、そして６５℃の水浴中で約３．５分間振と
うすることにより４２℃に加熱する。次に、フラスコを
４２℃の振とう機に移し、そして３時間インキュベート
する。フラスコを氷水浴中で１２℃に冷却し、そしてＧ
ＳＡローター（ｓｏｒｖａｌｌ）中８，０００rpm にて
１０分間の遠心分離の後、細胞を集める。

【０１０５】同様にして、大腸菌 (E. coli)LC137／ p
PLMu.TGF−β1(56／57) β2 、大腸菌 (E. coli)LC137
／ pPLMu.TGF−β2(56／57) β1 、大腸菌 (E. coli)L
C137／ pPLMu.TGF−β1(56／57) β3 、大腸菌 (E. co
li)LC137／ pPLMu.TGF−β3(56／57) β1 、大腸菌 (E.
coli)LC137／ pPLMu.TGF−β2(56／57) β3 、及び大
腸菌 (E. coli)LC137／ pPLMu.TGF−β3(56／57) β2
を用いてハイブリド蛋白質を製造する。同様にして、大
腸菌 (E. coli)LC137／ pPLMu.TGF−β1(79／80) β2
、大腸菌 (E. coli)LC137／ pPLMu.TGF−β2(79／80)
β1 、大腸菌 (E. coli)LC137／ pPLMu.TGF−β1(79
／80) β3 、大腸菌 (E. coli)LC137／ pPLMu.TGF−β
3(79／80) β1 、大腸菌 (E. coli)LC137／ pPLMu.TGF
−β2(79／80) β3 、及び大腸菌 (E. coli)LC137／ p
PLMu.TGF−β3(79／80) β2 を用いてハイブリド蛋白質
を製造する。

【０１０６】同様にして、大腸菌 (E. coli)LC137／ p
PLMu.TGF−β1(90／91) β2 、大腸菌 (E. coli)LC137
／ pPLMu.TGF−β2(90／91) β1 、大腸菌 (E. coli)L
C137／ pPLMu.TGF−β1(90／91) β3 、大腸菌 (E. co
li)LC137／ pPLMu.TGF−β3(90／91) β1 、大腸菌 (E.
coli)LC137／ pPLMu.TGF−β2(90／91) β3 、及び大
腸菌 (E. coli)LC137／ pPLMu.TGF−β3(90／91) β2
を用いてハイブリド蛋白質を製造する。同様にして、大
腸菌 (E. coli)LC137／ pPLMu.TGF−β1(22／23) β2
、大腸菌 (E. coli)LC137／ pPLMu.TGF−β2(22／23)
β1 、大腸菌 (E. coli)LC137／ pPLMu.TGF−β1(22
／23) β3 、大腸菌 (E. coli)LC137／ pPLMu.TGF−β
3(22／23) β1 、大腸菌 (E. coli)LC137／ pPLMu.TGF
−β2(22／23) β3 、及び大腸菌 (E. coli)LC137／ p
PLMu.TGF−β3(22／23) β2 を用いてハイブリド蛋白質
を製造する。

【０１０７】例４． サッカロミセス・セレビシエー
（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａ
ｅ）におけるＴＧＦ−β１／β２，ＴＧＦ−β２／β
１，ＴＧＦ−β１／β３，ＴＧＦ−β３／β１，ＴＧＦ
−β２／β３及びＴＧＦ−β３／β２の発現 成熟 TGF−β1(44／45) β2, TGF−β2(44／45) β1, T
GF−β1(44／45) β3,TGF−β3(44／45) β1, TGF−β2
(44／45) β3 及び TGF−β3(44／45) β2 のコード配
列を、酵母酸性ホスファターゼ（ＰＨ０５）の誘導性プ
ロモーターの制御のもとに、サッカロミセス・セレビシ
エー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉ
ａｅ）中で発現させる。これらは、それぞれプラスミド
pPLMu.TGF−β1(44／45) β2, pPLMu.TGF−β2(44／4
5) β1, pPLMu.TGF−β1(44／45)β3, pPLMu.TGF−β3
(44／45) β1, pPLMu.TGF−β2(44／45) β3 及び pPLM
u.TGF−β3(44／45) β2 から得られる。発現ベクター
は２段階で作製される。

【０１０８】Ａ．プラスミドｐＪＤＢ２０７／ＰＨ０５
−ＲＩＴ−１２の作製。 Ｂ．プラスミドpJDB207R／PH05− TGF−β1(44／45) β
2, pJDB207R／PH05−TGF−β2(44／45) β1, pJDB207
R／PH05− TGF−β1(44／45) β3, pJDB207R／PH05−
TGF−β3(44／45) β1, pJDB207R／PH05− TGF−β2(4
4／45) β3 及びpJDB207R／PH05− TGF−β3(44／45)
β2 の作製。Ａ）は酵素ベクター及びＰＨ０５転写ター
ミネーターを提供し、そしてＢ）は、ＰＨ０５プロモー
ターの制御のもとに、それぞれ成熟 TGF−β1(44／45)
β2, TGF−β2(44／45) β1, TGF−β1(44／45) β3, T
GF−β3(44／45) β1, TGF−β2(44／45) β3 及び TGF
−β3(44／45) β2 をコードする挿入部を有する発現カ
セットを提供する。

【０１０９】Ａ．プラスミドｐＪＤＢ２０７／ＰＨ０５
−ＲＩＴ−１２の作製 プラスミドｐ３１Ｒ／ＳＳ−ＴＰＡΔ２（ＤＳＭ ４２
９５）を制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ及びＸｈｏ
Ｉで消化する。４．２kbベクター断片を分取用アガロー
スゲル電気泳動により単離する。４種類のオリゴヌクレ
オチドＩ−１（配列番号：４６）、Ｉ−２（配列番号：
４７）、Ｉ−３（配列番号：４８）及びＩ−４（配列番
号：４９）をＤＮＡ合成機（モデル３８０Ｂ、Ａｐｐｌ
ｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）により合成し、そして８
Ｍ尿素を含む１２％ポリアクリルアミドゲル上で精製す
る。

【０１１０】１０μｌの０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
（pH８）中１０pmole ずつの４種類のオリゴデオキシリ
ボヌクレオチドＩ−１，Ｉ−２，Ｉ−３及びＩ−４の溶
液を水浴中で９５℃にて５分間インキュベートする。水
浴を５時間にわたって徐々に３０℃に冷却することによ
り相補的オリゴヌクレオチドをアニールする。このアニ
ールされた混合物に２μｌずつの０．１Ｍ ＭｇＣ
ｌ₂ 、０．１Ｍ ＮａＣｌ、３０mM ＤＴＴ、４mM Ａ
ＴＰ及び８Ｕのポリヌクレオチドキナーゼ（Ｂｏｅｈｒ
ｉｎｇｅｒ）を加える。キナーゼ反応を３７℃にて１時
間行う。

【０１１１】アニールされキナーゼ処理されたオリゴヌ
クレオチド、及び６０pmole のｐ３１Ｒ／ＳＳ−ＴＰＡ
Δ２の４．２kb ＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩベクター断片を
Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより連結する。このリガーゼ処理
混合物を用いてコンピテント大腸菌ＨＢ１０１細胞を形
質転換する。Ａｍｐ^R コロニーを拾い上げ、プラスミド
ＤＮＡを調製し、ＲｃｏＲＩ及びＸｈｏＩにより消化
し、ＥｃｏＲＩ末端において放射能標識し、そしてＨａ
ｅIIIで切断され放射能標識されたｐＢＲ３２２をマー
カーとして用いて、８Ｍ尿素を含有する６％ポリアクリ
ルアミドゲル上で分析する。正しいバンドのサイズを有
するクローンの１つをＬＢ中で増殖せしめ、プラスミド
を単離し、そしてｐ３１ＲＩＴ−１２と称する。

【０１１２】プラスミドｐ３１ＲＩＴ−１２を制限エン
ドヌクレオチドＳａｌＩにより線状化する。エチジウム
ブロミドの存在下でのＨｉｎｄIII による部分消化が、
２７３bpのＳａｌＩ／ＢａｍＨＩ ｐＢＲ３２２配列、
５３４bpの酵母酸性ホスファターゼＰＨ０５のプロモー
ター、酵母インベルターゼシグナル配列（１９アミノ酸
をコードする）及びＰＨ０５転写ターミネーターを含ん
で成る１kbのＳａｌＩ／ＨｉｎｄIII 断片をもたらす。
このｐ３１ＲＩＴの１kb ＳａｌＩ／ＨｉｎｄIII 断片
を、ＳａｌＩ及びＨｉｎｄIII により切断された酵母−
大腸菌シャトルベクターｐＪＤＢ２０７（ＤＳＭ ６７
８２）にクローニングする。１kb挿入部を含有する生ず
るプラスミドをｐＪＤＢ２０７／ＰＨ０５−ＲＩＴ−１
２と称する。

【０１１３】Ｂ．プラスミドｐＪＤＢ２０７Ｒ／ＰＨ０
５−ＴＧＦ−β１（４４／４５）β２の作製 プラスミドｐＰＬＭｕ．ＴＧＦ−β１（４４／４５）β
２をＮｃｏＩで切断する。粘着末端をＫｌｅｎｏｗ Ｄ
ＮＡポリメラーゼとの反応によりフィル−インする。Ｅ
ｃｏＲＩリンカー（５′−ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＣＧＧ；
Ｂｉｏｌａｂｓ）を添加し、そして混合物を連結する。
生ずる環状プラスミドをｐＧＫＭＡ６６８（ＴＧＦ−β
１（４４／４５）β２）と称し、ＥｃｏＲＩ及びＳａｌ
Ｉで切断する。０．４kb ＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩ断片を
アガロースゲルから単離し、精製し、そして２５μｇ／
mlの濃度で無菌水に再懸濁する。この断片は、成熟ＴＧ
Ｆ−β１（４４／４５）β２のアミノ酸ＡｌａＩを定め
るコドンＧＣＴとフレームが整合するＡＴＧを有するＴ
ＧＦ−β１（４４／４５）β２の成熟コード配列を含有
する。

【０１１４】ＰＨ０５プロモーターをプラスミドｐ３１
ＲＩＴ１２（上記参照のこと）から５３４bpのＢａｍＨ
Ｉ／ＥｃｏＲＩ断片上に単離する。大きな６．８kb Ｂ
ａｍＨＩ／ＸｈｏＩ断片を単離する。ＰＨ０５転写ター
ミネーターは断片上に残る。ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ
ＰＨ０５プロモーター断片、ＴＧＦ−β２をコードする
ＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩ断片、及びＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ
ベクター断片を連結する。ｐＪＤＢ２０７に反時計方向
にクローニングされたＰＨ０５プロモーターの制御のも
とにＴＧＦ−β２遺伝子を有する１つの正しいクローン
をｐＪＤＢ２０７Ｒ／ＰＨ０５−ＴＧＦ−β１（４４／
４５）β２と称する。

【０１１５】同様にして、成熟 TGF−β2(44／45) β1,
TGF−β1(44／45) β3, TGF−β3(44／45) β1, TGF−
β2(44／45) β3 、及び TGF−β3(44／45) β2 をＳ．
セレビシエー（Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）において
発現せしめる。ＴＧＦ−β１及びＴＧＦ−β３のコード
配列を含むプラスミドが前に特定されている。これらの
プラスミドのＮｃｏＩにより消化、ＥｃｏＲＩリンカー
の添加及び連結の後、得られる環状プラスミドをＥｃｏ
ＲＩ及びＳａｌＩにより切断する。ＥｃｏＲＩ／Ｓａｌ
Ｉ断片を前記のようにしてｐＪＤＢ２０７にクローニン
グする。得られるプラスミドをpJDB207R／PH05− TGF−
β2(44／45) β1, pJDB207R／PH05− TGF−β1(44／4
5) β3, pJDB207R／PH05− TGF−β3(44／45) β1, p
JDB207R／PH05− TGF−β2(44／45) β3 及びpJDB207R
／PH05− TGF−β3(44／45) β2 と称する。

【０１１６】同様にして、発現ベクターpJDB207R／PH05
− TGF−β1(56／57) β2, pJDB207R／PH05− TGF−β
2(56／57) β1, pJDB207R／PH05− TGF−β1(56／57)
β3,pJDB207R／PH05− TGF−β3(56／57) β1, pJDB20
7R／PH05− TGF−β2(56／57) β3 、及びpJDB207R／PH
05− TGF−β3(56／57) β2 を、それぞれ pPLMu.TGF−
β1(56／57) β2, pPLMu.TGF−β2(56／57) β1, pPLM
u.TGF−β1(56／57)β3, pPLMu.TGF−β3(56／57) β1,
pPLMu.TGF−β2(56／57) β3 、及び pPLMu.TGF−β3
(56／57) β2 から調製して、それぞれ成熟 TGF−β1(5
6／57) β2, TGF−β2(56／57) β1, TGF−β1(56／57)
β3, TGF−β3(56／57) β1, TGF−β2(56／57) β3
及び TGF−β3(56／57) β2 のコード配列を発現せしめ
る。

【０１１７】同様にして、発現ベクターpJDB207R／PH05
− TGF−β1(79／80) β2, pJDB207R／PH05− TGF−β
2(79／80) β1, pJDB207R／PH05− TGF−β1(79／80)
β3,pJDB207R／PH05− TGF−β3(79／80) β1, pJDB20
7R／PH05− TGF−β2(79／80) β3 及びpJDB207R／PH05
− TGF−β3(79／80) β2 を、それぞれ pPLMu.TGF−β
1(79／80) β2, pPLMu.TGF−β2(79／80) β1, pPLMu.T
GF−β1(79／80) β3, pPLMu.TGF−β3(79／80) β1, p
PLMu.TGF−β2(79／80) β3 及び pPLMu.TGF−β3(79／
80) β2 から調製して、それぞれ成熟 TGF−β1(79／8
0) β2, TGF−β2(79／80) β1, TGF−β1(79／80) β
3, TGF−β3(79／80) β1, TGF−β2(79／80) β3 及び
TGF−β3(79／80) β2 のコード配列を発現せしめる。

【０１１８】同様にして、発現ベクターpJDB207R／PH05
− TGF−β1(90／91) β2, pJDB207R／PH05− TGF−β
2(90／91) β1, pJDB207R／PH05− TGF−β1(90／91)
β3,pJDB207R／PH05− TGF−β3(90／91) β1, pJDB20
7R／PH05− TGF−β2(90／91) β3 及びpJDB207R／PH05
− TGF−β3(90／91) β2 を、それぞれ pPLMu.TGF−β
1(90／91) β2, pPLMu.TGF−β2(90／91) β1, pPLMu.T
GF−β1(90／91) β3, pPLMu.TGF−β3(90／91) β1, p
PLMu.TGF−β2(90／91) β3 及び pPLMu.TGF−β3(90／
91) β2 から調製して、それぞれ成熟 TGF−β1(90／9
1) β2, TGF−β2(90／91) β1, TGF−β1(90／91) β
3, TGF−β3(90／91) β1, TGF−β2(90／91) β3 及び
TGF−β3(90／91) β2 のコード配列を発現せしめる。

【０１１９】同様にして、発現ベクターpJDB207R／PH05
− TGF−β1(22／23) β2, pJDB207R／PH05− TGF−β
2(22／23) β1, pJDB207R／PH05− TGF−β1(22／23)
β3,pJDB207R／PH05− TGF−β3(22／23) β1, pJDB20
7R／PH05− TGF−β2(22／23) β3 及びpJDB207R／PH05
− TGF−β3(22／23) β2 を、それぞれ pPLMu.TGF−β
1(22／23) β2, pPLMu.TGF−β2(22／23) β1, pPLMu.T
GF−β1(22／23) β3, pPLMu.TGF−β3(22／23) β1, p
PLMu.TGF−β2(22／23) β3 及び pPLMu.TGF−β3(22／
23) β2 から調製して、それぞれ成熟 TGF−β1(22／2
3) β2, TGF−β2(22／23) β1, TGF−β1(22／23) β
3, TGF−β3(22／23) β1, TGF−β2(22／23) β3 及び
TGF−β3(22／23) β2 のコード配列を発現せしめる。

【０１２０】Ｃ．Ｓ．セレビシエー（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉ
ｓｉａｅ）ＧＲＦ１８株の形質転換サッカロミセス・セ
レビシエー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅ）ＧＲＦ１８（ＭＡＴα，ｈｉｓ３−１１，
ｈｉｓ３−１５，ｌｅｕ２−３，ｌｅｕ２−１１２，ｃ
ａｎ^R ，ＤＳＭ３６６５）を、Ｈｉｎｎｅｎ Ａ．ら、
（１９７８）ＰＮＡＳ ７５，１９２９に記載されてい
る方法に従って、プラスミドpJDB207R／PH05− TGF−β
1(44／45) β2, pJDB207R／PH05− TGF−β2(44／45)
β1, pJDB207R／PH05− TGF−β1(44／45) β3, pJDB
207R／PH05−TGF−β3(44／45) β1, pJDB207R／PH05
− TGF−β2(44／45) β3 又はpJDB207R／PH05− TGF−
β3(44／45) β2 により形質転換する。

【０１２１】形質転換された酵母細胞を、ロイシンを欠
く酵母最少培地プレート上で選択する。形質転換された
酵母シングルコロニーを選択し、 サッカロミセス・セレビシエー（Saccharomyces cerevi
siae） GRF18／pJDB207R／PH05− TGF−β1(44／45) β2 、 サッカロミセス・セレビシエー（Saccharomyces cerevi
siae） GRF18／pJDB207R／PH05− TGF−β2(44／45) β1 、 サッカロミセス・セレビシエー（Saccharomyces cerevi
siae） GRF18／pJDB207R／PH05− TGF−β1(44／45) β3 、 サッカロミセス・セレビシエー（Saccharomyces cerevi
siae） GRF18／pJDB207R／PH05− TGF−β3(44／45) β1 、 サッカロミセス・セレビシエー（Saccharomyces cerevi
siae） GRF18／pJDB207R／PH05− TGF−β2(44／45) β3 、及
び サッカロミセス・セレビシエー（Saccharomyces cerevi
siae） GRF18／pJDB207R／PH05− TGF−β3(44／45) β2 と称する。

【０１２２】同様にして、サッカロミセス・セレビシエ
ー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａ
ｅ）ＧＲＦ１８（ＭＡＴα，ｈｉｓ３−１１，ｈｉｓ３
−１５，ｌｅｕ２−３，ｌｅｕ２−１１２，ｃａｎ^R ，
ＤＳＭ３６６５）を、プラスミドpJDB207R／PH05− TGF
−β1(56／57) β2, pJDB207R／PH05− TGF−β2(56／
57) β1, pJDB207R／PH05− TGF−β1(56／57) β3,
pJDB207R／PH05− TGF−β3(56／57) β1, pJDB207R／
PH05− TGF−β2(56／57) β3 又はpJDB207R／PH05− T
GF−β3(56／57) β2 により形質転換する。形質転換さ
れた酵母細胞を、ロイシンを欠く酵母最少培地プレート
上で選択する。形質転換された酵母シングルコロニーを
選択し、 サッカロミセス・セレビシエー（Saccharomyces cerevi
siae） GRF18／pJDB207R／PH05− TGF−β1(56／57) β2 、 サッカロミセス・セレビシエー（Saccharomyces cerevi
siae） GRF18／pJDB207R／PH05− TGF−β2(56／57) β1 、 サッカロミセス・セレビシエー（Saccharomyces cerevi
siae） GRF18／pJDB207R／PH05− TGF−β1(56／57) β3 、 サッカロミセス・セレビシエー（Saccharomyces cerevi
siae） GRF18／pJDB207R／PH05− TGF−β3(56／57) β1 、 サッカロミセス・セレビシエー（Saccharomyces cerevi
siae） GRF18／pJDB207R／PH05− TGF−β2(56／57) β3 、及
び サッカロミセス・セレビシエー（Saccharomyces cerevi
siae） GRF18／pJDB207R／PH05− TGF−β3(56／57) β2 と称する。

【０１２３】同様にして、サッカロミセス・セレビシエ
ー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａ
ｅ）ＧＲＦ１８（ＭＡＴα，ｈｉｓ３−１１，ｈｉｓ３
−１５，ｌｅｕ２−３，ｌｅｕ２−１１２，ｃａｎ^R ，
ＤＳＭ３６６５）を、プラスミドpJDB207R／PH05− TGF
−β1(79／80) β2, pJDB207R／PH05− TGF−β2(79／
80) β1, pJDB207R／PH05− TGF−β1(79／80) β3,
pJDB207R／PH05− TGF−β3(79／80) β1, pJDB207R／
PH05− TGF−β2(79／80) β3 又はpJDB207R／PH05− T
GF−β3(79／80) β2 により形質転換する。形質転換さ
れた酵母細胞を、ロイシンを欠く酵母最少培地プレート
上で選択する。

【０１２４】形質転換された酵母シングルコロニーを選
択し、 サッカロミセス・セレビシエー（Saccharomyces cerevi
siae） GRF18／pJDB207R／PH05− TGF−β1(79／80) β2 、 サッカロミセス・セレビシエー（Saccharomyces cerevi
siae） GRF18／pJDB207R／PH05− TGF−β2(79／80) β1 、 サッカロミセス・セレビシエー（Saccharomyces cerevi
siae） GRF18／pJDB207R／PH05− TGF−β1(79／80) β3 、 サッカロミセス・セレビシエー（Saccharomyces cerevi
siae） GRF18／pJDB207R／PH05− TGF−β3(79／80) β1 、 サッカロミセス・セレビシエー（Saccharomyces cerevi
siae） GRF18／pJDB207R／PH05− TGF−β2(79／80) β3 、及
び サッカロミセス・セレビシエー（Saccharomyces cerevi
siae） GRF18／pJDB207R／PH05− TGF−β3(79／80) β2 と称する。

【０１２５】同様にして、サッカロミセス・セレビシエ
ー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａ
ｅ）ＧＲＦ１８（ＭＡＴα，ｈｉｓ３−１１，ｈｉｓ３
−１５，ｌｅｕ２−３，ｌｅｕ２−１１２，ｃａｎ^R ，
ＤＳＭ３６６５）を、プラスミドpJDB207R／PH05− TGF
−β1(90／91) β2, pJDB207R／PH05− TGF−β2(90／
91) β1, pJDB207R／PH05− TGF−β1(90／91) β3,
pJDB207R／PH05− TGF−β3(90／91) β1, pJDB207R／
PH05− TGF−β2(90／91) β3 又はpJDB207R／PH05− T
GF−β3(90／91) β2 で形質転換する。形質転換された
酵母細胞を、ロイシンを欠く酵母最少培地プレート上で
選択する。

【０１２６】形質転換された酵母シングルコロニーを選
択し、 サッカロミセス・セレビシエー（Saccharomyces cerevi
siae） GRF18／pJDB207R／PH05− TGF−β1(90／91) β2 、 サッカロミセス・セレビシエー（Saccharomyces cerevi
siae） GRF18／pJDB207R／PH05− TGF−β2(90／91) β1 、 サッカロミセス・セレビシエー（Saccharomyces cerevi
siae） GRF18／pJDB207R／PH05− TGF−β1(90／91) β3 、 サッカロミセス・セレビシエー（Saccharomyces cerevi
siae） GRF18／pJDB207R／PH05− TGF−β3(90／91) β1 、 サッカロミセス・セレビシエー（Saccharomyces cerevi
siae） GRF18／pJDB207R／PH05− TGF−β2(90／91) β3 及
び、 サッカロミセス・セレビシエー（Saccharomyces cerevi
siae） GRF18／pJDB207R／PH05− TGF−β3(90／91) β2 と称する。

【０１２７】同様にして、サッカロミセス・セレビシエ
ー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａ
ｅ）（ＭＡＴα，ｈｉｓ３−１１，ｈｉｓ３−１５，ｌ
ｅｕ２−３，ｌｅｕ２−１１２，ｃａｎ^R ，ＤＳＭ３６
６５）を、プラスミドpJDB207R／PH05− TGF−β1(22／
23) β2, pJDB207R／PH05− TGF−β2(22／23) β1,pJ
DB207R／PH05− TGF−β1(22／23) β3, pJDB207R／PH
05− TGF−β3(22／23) β1, pJDB207R／PH05− TGF−
β2(22／23) β3 又はpJDB207R／PH05− TGF−β3(22／
23) β2 で形質転換する。形質転換された酵母細胞を、
ロイシンを欠く酵母最少培地プレート上で選択する。

【０１２８】形質転換された酵母シングルコロニーを選
択し、 サッカロミセス・セレビシエー（Saccharomyces cerevi
siae） GRF18／pJDB207R／PH05− TGF−β1(22／23) β2 、 サッカロミセス・セレビシエー（Saccharomyces cerevi
siae） GRF18／pJDB207R／PH05− TGF−β2(22／23) β1 、 サッカロミセス・セレビシエー（Saccharomyces cerevi
siae） GRF18／pJDB207R／PH05− TGF−β1(22／23) β3 、 サッカロミセス・セレビシエー（Saccharomyces cerevi
siae） GRF18／pJDB207R／PH05− TGF−β3(22／23) β1 、 サッカロミセス・セレビシエー（Saccharomyces cerevi
siae） GRF18／pJDB207R／PH05− TGF−β2(22／23) β3 、及
び サッカロミセス・セレビシエー（Saccharomyces cerevi
siae） GRF18／pJDB207R／PH05− TGF−β3(22／23) β2 と称する。

【０１２９】Ｄ．Ｓ．セレビシエー（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉ
ｓｉａｅ）形質転換体の発酵及び細胞抽出液の調製 前記の酵母形質転換体は、ＰＨ０５プロモーターにより
制御される発現カセットを有するプラスミドを含有し、
そしてそれ故にＴＧＦ−βハイブリド分子の発現のため
にプロモーターの抑制解除を必要とする。（ＮＨ₄)₂ Ｓ
Ｏ₄ の代りの１０ｇ／ＬのＬ−アスパラギン、１ｇ／Ｌ
のＬ−ヒスチジン及び２０ｇ／Ｌのグルコースを含有す
るほかにアミノ酸を含有しないＤｉｆｃｏ Ｙｅａｓｔ
Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅの処方に従う酵母高Ｐｉ
最少培地中で、形質転換体を別々に引き続く２回の前培
養（１０ml及び５０ml）において増殖せしめる。第二前
培養の細胞を０．９％ ＮａＣｌ中で洗浄し、そしてす
べての細胞を用いて、０．０３ｇ／ＬのＫＨ₂ ＰＯ₄ 、
１０ｇ／ＬのＬ−アスパラギン、１ｇ／ＬのＬ−ヒスチ
ジン及び２０ｇ／Ｌのグルコースを含むほかアミノ酸を
含まないＤｉｆｃｏ Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ
Ｂａｓｅ培地の処方に従って調製した低Ｐｉ最少培地１
００mlに接種する。培養物を１８０rpm にて３０℃で攪
拌する。

【０１３０】１０mlの培養物からの細胞を、３０００rp
m での遠心分離により５時間、２４時間及び４８時間に
おいて集める。細胞ペレットを細胞溶解緩衝液〔６６mM
リン酸カリウム（pH７．４）、４mM Ｚｗｉｔｔｅｒｇ
ｅｎ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）〕に再懸濁する。８ｇの
ガラスビーズ（直径０．５〜０．７５mm）を加え、そし
て懸濁液を冷Ｖｏｒｔｅｘ Ｍｉｘｅｒ中で２分間ずつ
４〜５回激しく振とうする。細胞抽出物をデカントして
ガラスビーズを除去する。抽出物中の細胞破片を３００
０rpm 、４℃にて５分間遠心分離することにより沈降せ
しめる。上清とペレットとを分離し、そして−２０℃に
て貯蔵する。

【０１３１】例５． ダイマーの生物学的に活性なハイ
ブリドＴＧＦ−β蛋白質の製造 ダイマーの生物学的に活性なＴＧＦ−β１（４４／４
５）β２ハイブリドの製造のための下記の方法を同様
に、他のダイマーの生物学的に活性なＴＧＦ−βハイブ
リド蛋白質の回収のために用いることができる。大腸菌
（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｃ１３７／ｐＰＬＭｕ．ＴＧＦ−β１
（４４／４５）β２細胞を上記のようにして発酵させ、
そして下記のようにして封入体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ
ｂａｄｙ）を調製する。細胞の破砕及び封入体の回収は
４℃にて行う。

【０１３２】約１８ｇの湿細胞を６０mlの０．１Ｍ Ｔ
ＲＩＳ／ＨＣｌ、１０mM ＥＤＴＡ、１mM ＰＭＳＦ
（フェニルメチルスルホニルフルオリド）（pH８．３）
（破砕緩衝液）に懸濁する。細胞を、製造者の指示に従
ってＦｒｅｎｃｈｐｒｅｓｓ（ＳＬＭ Ｉｎｓｔｉｔｕ
ｔｓ，Ｉｎｃ．）に２回通し、そして破砕緩衝液により
体積を２００mlにする。懸濁液を１５，０００×ｇにて
２０分間遠心分離する。得られるペレットを、１Ｍ Ｎ
ａＣｌを含有する破砕緩衝液１００mlに懸濁し、そして
上記のようにして１０分間遠心分離する。ペレットを、
１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（Ｐｉｅｒｃｅ）を含
有する１００mlの破砕緩衝液に懸濁し、そして再度上記
のようにして１０分間遠心分離する。

【０１３３】次に、０．３ｇの洗浄したペレットを１０
mlの２０mM Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、１mM ＥＤＴＡ、１mM
ＰＥＳＦ、０．１％ ＤＴＴ（pH８．０）に懸濁し、
そしてマグネチックスターラーにより室温にて１時間攪
拌し、そしてテフロン組織ホモジナイザーによりホモジ
ナイズし、そして固定角ローターＡ．８２４を有するＣ
ｅｎｔｒｉｃｏｎ Ｈ−４０１遠心機（Ｃｏｎｔｒｏｎ
Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）中で、１５℃及び１２，０
００rpm にて６０分間遠心分離する。透明な上清の酢酸
を、ＹＭ０５フィルターを有するＡｍｉｃｏｎ ８０１
０攪拌セル中で、攪拌及び１０mM ＨＣｌによる溶液の
希釈を繰り返すことにより１０mM ＨＣｌと交換する。

【０１３４】１０mM ＨＣｌ中のこの様にして可溶化さ
れたモノマーＴＧＦ−β１（４４／４５）β２ハイブリ
ドの個々のアリコートを真空乾燥し、そしてＳＤＳポリ
アクリルアミドゲル電気泳動により還元条件下で、クマ
シーブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｌｕｅ）Ｒ−２５
０により染色された１５％ポリアクリルアミドスラブゲ
ル上で分析する。約１２，０００のバンドが得られる。
可溶化されたＴＧＦ−β１（４４／４５）β２ハイブリ
ドの他のアリコートを真空蒸発せしめ、２０μｌの酢酸
に溶解し、そして気相シーケンサーモデル４７０Ａ（Ａ
ｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）中でアミノ酸配
列分析にかける。こうして得られたＮ−末端アミノ酸配
列はＴＧＦ−β１のアミノ末端（配列番号：１）に対応
する。

【０１３５】上記のようにして得られたＴＧＦ−β１
（４４／４５）β２の溶液６ml、すなわち１．６mgのＴ
ＧＦ−β１（４４／４５）β２を、０．１４ｇのＣＨＡ
ＰＳ（Ｓｉｇｍａ Ｃ３０２３ Ｌｏｔ ８０Ｈ５０１
８）と混合し、そして４℃に前冷却する。次に、この溶
液を、２Ｍ ＮａＣｌ、０．２Ｍ Ｔｒｉｓ、３０mMＣ
ＨＡＰＳ、４mM ＥＤＴＡ、５mM還元グルタチオンを含
む緩衝液Ｉ（pH８．５）（４℃に前冷却したもの）７．
５mlに徐々に加える。この混合物を室温にて１時間攪拌
する。次に、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ、１０mM酸化グルタチ
オンを含む緩衝液II（pH８．０）（４℃に前冷却したも
の）１．５mlを徐々に加える。この混合物を４℃に維持
することにより、ハイブリドＴＧＦ−β１（４４／４
５）β２を生物学的に活性なダイマー形に再生（ｒｅｆ
ｏｌｄ）させる。

【０１３６】２６０時間後、再生（ｒｅｆｏｌｄｉｎ
ｇ）工程を４Ｎ ＨＣｌをpH２．５まで加えることによ
り停止する。サンプルを、ＹＭ０５膜を有するＡｍｉｃ
ｏｎ８０１０攪拌セル上で１０mM ＨＣｌに対して透析
し、そして５mlに濃縮し、そして次にＭＳＥ机上遠心分
離機（モデルｃｅｎｔａｕｒ２）中で３５００rpm にて
５分間遠心分離する。透明溶液を１ml／分の流速で、Ｌ
ＣＣユニット及び２８０nmの波長でのＵＶ−ＭII Ｄｅ
ｔｅｃｔｏｒ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を有するＦＰＬＣ
クロマトグラフィー系（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に連結し
た、緩衝液Ａ（２０mM酢酸ナトリウム、３０％イソプロ
パノール、pH４．０）中で平衡化したＭｏｎｏＳ ＨＲ
５／５カラムに適用する。

【０１３７】平衡条件での注入時から始まり、そして５
０％の緩衝液Ａ（２０mM酢酸ナトリウム、３０％イソプ
ロパノール、pH４．０）及び５０％の緩衝液Ｂ（１Ｍ
ＮａＣｌを含む緩衝液Ａに相対する）で終る３０分間に
わたる直線グラジエントを用いる。ダイマーの活性なＴ
ＧＦ−β１（４４／４５）β２はグラジエントの開始後
約８分間で溶出し、それを集め、そしてＨｅｒａｅｕｓ
Ｃｈｒｉｓｔ Ｂｉｏｆｕｇｅ Ａ中Ｍｉｌｌｉｐｏ
ｒｅ Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ ＭＣユニット（５０００NM
VL）を用いて１０，０００rpm にて１mlに濃縮する。

【０１３８】ＴＧＦ−β１（４４／４５）β２を、Ｖｙ
ｄａｃ Ｃ４２１４ＴＰ５４１５カラム（０．４６cm×
１５cm）、Ｄａｔａ ａｎｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａ
ｐｈｙ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｓｔａｔｉｏｎ（Ｗａｔｅｒ
ｓ ８４０）により制御される２台のポンプ（Ｗａｔｅ
ｒｓ ５１０）及び２１６nmでのＵＶ検出器（Ａｐｐｌ
ｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、モデル７８３）から成
る系を用いてＲＰ−ＨＰＬＣによりさらに精製する。カ
ラムは８０％の溶剤Ａ（水中０．１％ ＴＦＡ）、２０
％の溶剤Ｂ（アセトニトリル中０．０８％ ＴＦＡ）中
で平衡化される。注入時における２０％溶剤Ｂから４０
％溶剤Ｂへの４０分間の直線グラジエントが適用され
る。３０．２５分の保持時間を有するピークを集め、そ
して後記のようにして生物活性について分析する。

【０１３９】例６． ダイマーの生物学的に活性なハイ
ブリドＴＧＦ−β蛋白質のイン−ビトロ活性試験 Ａ．ＢＡＬＢ／ｃ−３Ｔ３細胞遊走試験 精製されたＴＧＦ−βハイブリドをすでに記載されてい
る測定法（Ｂｕｅｒｋ，Ｒ．Ｒ．（１９７３）Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７０：３６
９−３７２）において試験する。この方法により、ハイ
ブリドＴＧＦ−βの存在下又は非存在下で無血清培地中
に維持された培養物中の傷ついた培養物中の単層から２
２時間で遊走したＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞の数を測定す
る。

【０１４０】Ｂ．ＡＫＲ−２Ｂ細胞ＤＮＡ合成刺激測定 精製されたＴＧＦ−βハイブリドをすでに記載されてい
る測定法（Ｇｒａｙｃａｒ，Ｊ．Ｌ．ら（１９８９）Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ３：
１９７７−１９８６）において試験した。この試験にお
いては、ハイブリドＴＧＦ−βの存在下での、５％ウシ
胎児血清を含有するＭｃＣｏｙの５Ａ培地中に維持され
たＡＫＲ−２Ｂ細胞における、６６時間の培養期間中最
後の１６時間にわたる〔 ³Ｈ〕−チミジンの取込みのレ
ベルの上昇が測定される。

【０１４１】Ｃ．ＣＣＬ−６４細胞ＤＮＡ合成阻害測定 精製されたＴＧＦ−βハイブリドを、すでに記載されて
いる測定法（Ｇｒａｙｃａｒ，Ｊ．Ｌ．ら（１９８９）
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ
３：１９７７−１９８６）の変法において試験する。こ
の測定法においては、ハイブリドＴＧＦ−βの存在下で
の、５％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地中に維持され
たＣＣＬ−６４細胞の培養物中で、６６時間の培養期間
中最後の１６時間にわたっての〔 ³Ｈ〕−チミジンの取
込みのレベルの低下が測定される。

【０１４２】生物学的データー 本発明のハイブリドＴＧＦ−β分子の選択された代表に
ついて、例６Ａ又は６Ｂに従って、次の生物学的データ
ーが得られる。 ──────────────────────────────── ハイブリド 生物活性 試験法 TGF−β1(44／45) β2 110Ｕ／μｇ 例６Ａ TGF−β2(44／45) β1 1Ｕ／μｇ 例６Ａ TGF−β1(44／45) β3 3100Ｕ／μｇ 例６Ｃ TGF−β3(44／45) β1 49Ｕ／μｇ 例６Ｃ TGF−β2(44／45) β3 430Ｕ／μｇ 例６Ｃ TGF−β3(44／45) β2 33000Ｕ／μｇ 例６Ｃ ────────────────────────────────

【０１４３】微生物の寄託 下記の微生物がＤｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ
ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ（ＤＳＭ），
Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ Ｗｅｇ １ｂ，Ｄ−３３００
Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ（ＦＲＧ）に寄託されてい
る。 ────────────────────────────────── 微 生 物 寄 託 日 受託番号 E. coli LC 137／pPLMu.hTGF−β1 1989年11月28日 DSM 5656 E. coli LC 137／pPLMu.hTGF−β2 1989年11月28日 DSM 5657 E. coli LC 137／pPLMu.hTGF−β3 1989年11月28日 DSM 5658 Saccharomyces cerevisiae GRF 18 1986年３月４日 DSM 3665 E.coli HB 101 ／p31R／SS− TPAΔ2 1987年10月23日 DSM 4295 E.coli HB 101 ／pJDB207 1991年11月７日 DSM 6782 ──────────────────────────────────

【０１４４】

【配列表】

配列番号：１ 配列の型：ヌクレオチド及び対応するポリペプチド 配列の長さ：３３９塩基対 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 起源：ヒトｃＤＮＡ 直接の起源：E.coli LC137/pPLMu.hTGF-β１(DSM5656) 特徴：TGF-β１の１〜336 コード領域 配列： GCC CTG GAC ACC AAC TAT TGC TTC AGC TCC ACG GAG AAG AAC TGC 45 Ala Leu Asp Thr Asn Tyr Cys Phe Ser Ser Thr Glu Lys Asn Cys 5 10 15 TGC GTG CGG CAG CTG TAC ATT GAC TTC CGC AAG GAC CTC GGC TGG 90 Cys Val Arg Gln Leu Tyr Ile Asp Phe Arg Lys Asp Leu Gly Trp 20 25 30 AAG TGG ATC CAC GAG CCC AAG GGC TAC CAT GCC AAC TTC TGC CTC 135 Lys Trp Ile His Glu Pro Lys Gly Tyr His Ala Asn Phe Cys Leu 35 40 45 GGG CCC TGC CCC TAC ATT TGG AGC CTG GAC ACG CAG TAC AGC AAG 180 Gly Pro Cys Pro Tyr Ile Trp Ser Leu Asp Thr Gln Tyr Ser Lys 50 55 60 GTC CTG GCC CTG TAC AAC CAG CAT AAC CCG GGC GCC TCG GCG GCG 225 Val Leu Ala Leu Tyr Asn Gln His Asn Pro Gly Ala Ser Ala Ala 65 70 75 CCG TGC TGC GTG CCG CAG GCG CTG GAG CCG CTG CCC ATC GTG TAC 270 Pro Cys Cys Val Pro Gln Ala Leu Glu Pro Leu Pro Ile Val Tyr 80 85 90 TAC GTG GGC CGC AAG CCC AAG GTG GAG CAG CTG TCC AAC ATG ATC 315 Tyr Val Gly Arg Lys Pro Lys Val Glu Gln Leu Ser Asn Met Ile 95 100 105 GTG CGC TCC TGC AAG TGC AGC TGA 339 Val Arg Ser Cys Lys Cys Ser 110

【０１４５】配列番号：２ 配列の型：ヌクレオチド及び対応するポリペプチド 配列の長さ：３３９塩基対 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 起源：ヒトｃＤＮＡ 直接の起源：E.coli LC137/pPLMu.hTGF-β２(DSM5657) 特徴：TGF-β２の１〜336 コード領域 配列： GCT TTG GAT GCG GCC TAT TGC TTT AGA AAT GTG CAG GAT AAT TGC 45 Ala Leu Asp Ala Ala Tyr Cys Phe Arg Asn Val Gln Asp Asn Cys 5 10 15 TGC CTA CGT CCA CTT TAC ATT GAT TTC AAG AGG GAT CTA GGG TGG 90 Cys Leu Arg Pro Leu Tyr Ile Asp Phe Lys Arg Asp Leu Gly Trp 20 25 30 AAA TGG ATA CAC GAA CCC AAA GGG TAC AAT GCC AAC TTC TGT GCT 135 Lys Trp Ile His Glu Pro Lys Gly Tyr Asn Ala Asn Phe Cys Ala 35 40 45 GGA GCA TGC CCG TAT TTA TGG AGT TCA GAC ACT CAG CAC AGC AGG 180 Gly Ala Cys Pro Tyr Leu Trp Ser Ser Asp Thr Gln His Ser Arg 50 55 60 GTC CTG AGC TTA TAT AAT ACC ATA AAT CCA GAA GCA TCT GCT TCT 225 Val Leu Ser Leu Tyr Asn Thr Ile Asn Pro Glu Ala Ser Ala Ser 65 70 75 CCT TGC TGC GTG TCC CAA GAT TTA GAA CCT CTA ACC ATT CTC TAC 270 Pro Cys Cys Val Ser Gln Asp Leu Glu Pro Leu Thr Ile Leu Tyr 80 85 90 TAC ATT GGC AAA ACA CCC AAG ATT GAA CAG CTT TCT AAT ATG ATT 315 Tyr Ile Gly Lys Thr Pro Lys Ile Glu Gln Leu Ser Asn Met Ile 95 100 105 GTA AAG TCT TGC AAA TGC AGC TAA 339 Val Lys Ser Cys Lys Cys Ser 110

【０１４６】配列番号：３ 配列の型：ヌクレオチド及び対応するポリペプチド 配列の長さ：３３９塩基対 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 起源：ヒトｃＤＮＡ 直接の起源：E.coli LC137/pPLMu.hTGF-β３(DSM5658) 特徴：TGF-β３の１〜336 コード領域 配列： GCT TTG GAC ACC AAT TAC TGC TTC CGC AAC TTG GAG GAG AAC TGC 45 Ala Leu Asp Thr Asn Tyr Cys Phe Arg Asn Leu Glu Glu Asn Cys 5 10 15 TGT GTG CGC CCC CTC TAC ATT GAC TTC CGA CAG GAT CTG GGC TGG 90 Cys Val Arg Pro Leu Tyr Ile Asp Phe Arg Gln Asp Leu Gly Trp 20 25 30 AAG TGG GTC CAT GAA CCT AAG GGC TAC TAT GCC AAC TTC TGC TCA 135 Lys Trp Val His Glu Pro Lys Gly Tyr Tyr Ala Asn Phe Cys Ser 35 40 45 GGC CCT TGC CCA TAC CTC CGC AGT GCA GAC ACA ACC CAC AGC ACG 180 Gly Pro Cys Pro Tyr Leu Arg Ser Ala Asp Thr Thr His Ser Thr 50 55 60 GTG CTG GGA CTG TAC AAC ACT CTG AAC CCT GAA GCA TCT GCC TCG 225 Val Leu Gly Leu Tyr Asn Thr Leu Asn Pro Glu Ala Ser Ala Ser 65 70 75 CCT TGC TGC GTG CCC CAG GAC CTG GAG CCC CTG ACC ATC CTG TAC 270 Pro Cys Cys Val Pro Gln Asp Leu Glu Pro Leu Thr Ile Leu Tyr 80 85 90 TAT GTT GGG AGG ACC CCC AAA GTG GAG CAG CTC TCC AAC ATG GTG 315 Tyr Val Gly Arg Thr Pro Lys Val Glu Gln Leu Ser Asn Met Val 95 100 105 GTG AAG TCT TGT AAA TGT AGC TGA 339 Val Lys Ser Cys Lys Cys Ser 110

【０１４７】配列番号：４ 配列の型：ヌクレオチド及び対応するポリペプチド 配列の長さ：３３６塩基対 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 起源：ヒトｃＤＮＡ 直接の起源：E.coli LC137/pPLMu.TGF−β1(44/45)β２ 特徴：TGF-β1(44/45)β2 ハイブリドの１〜336 コード
領域 配列： GCC CTG GAC ACC AAC TAT TGC TTC AGC TCC ACG GAG AAG AAC TGC 45 Ala Leu Asp Thr Asn Tyr Cys Phe Ser Ser Thr Glu Lys Asn Cys 5 10 15 TGC GTG CGG CAG CTG TAC ATT GAC TTC CGC AAG GAC CTC GGC TGG 90 Cys Val Arg Gln Leu Tyr Ile Asp Phe Arg Lys Asp Leu Gly Trp 20 25 30 AAG TGG ATC CAC GAG CCC AAG GGC TAC CAT GCC AAC TTC TGT GCT 135 Lys Trp Ile His Glu Pro Lys Gly Tyr His Ala Asn Phe Cys Ala 35 40 45 GGA GCA TGC CCG TAT TTA TGG AGT TCA GAC ACT CAG CAC AGC AGG 180 Gly Ala Cys Pro Tyr Leu Trp Ser Ser Asp Thr Gln His Ser Arg 50 55 60 GTC CTG AGC TTA TAT AAT ACC ATA AAT CCA GAA GCA TCT GCT TCT 225 Val Leu Ser Leu Tyr Asn Thr Ile Asn Pro Glu Ala Ser Ala Ser 65 70 75 CCT TGC TGC GTG TCC CAA GAT TTA GAA CCT CTA ACC ATT CTC TAC 270 Pro Cys Cys Val Ser Gln Asp Leu Glu Pro Leu Thr Ile Leu Tyr 80 85 90 TAC ATT GGC AAA ACA CCC AAG ATT GAA CAG CTT TCT AAT ATG ATT 315 Tyr Ile Gly Lys Thr Pro Lys Ile Glu Gln Leu Ser Asn Met Ile 95 100 105 GTA AAG TCT TGC AAA TGC AGC 336 Val Lys Ser Cys Lys Cys Ser 110

【０１４８】配列番号：５ 配列の型：ヌクレオチド及び対応するポリペプチド 配列の長さ：３３６塩基対 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 起源：ヒトｃＤＮＡ 直接の起源：E.coli LC137/pPLMu.TGF−β1(44/45)β３ 特徴：TGF-β1(44/45)β３ハイブリドの１〜336 コード
領域 配列： GCC CTG GAC ACC AAC TAT TGC TTC AGC TCC ACG GAG AAG AAC TGC 45 Ala Leu Asp Thr Asn Tyr Cys Phe Ser Ser Thr Glu Lys Asn Cys 5 10 15 TGC GTG CGG CAG CTG TAC ATT GAC TTC CGC AAG GAC CTC GGC TGG 90 Cys Val Arg Gln Leu Tyr Ile Asp Phe Arg Lys Asp Leu Gly Trp 20 25 30 AAG TGG ATC CAC GAG CCC AAG GGC TAC CAT GCC AAC TTC TGC TCA 135 Lys Trp Ile His Glu Pro Lys Gly Tyr His Ala Asn Phe Cys Ser 35 40 45 GGC CCT TGC CCA TAC CTC CGC AGT GCA GAC ACA ACC CAC AGC ACG 180 Gly Pro Cys Pro Tyr Leu Arg Ser Ala Asp Thr Thr His Ser Thr 50 55 60 GTG CTG GGA CTG TAC AAC ACT CTG AAC CCT GAA GCA TCT GCC TCG 225 Val Leu Gly Leu Tyr Asn Thr Leu Asn Pro Glu Ala Ser Ala Ser 65 70 75 CCT TGC TGC GTG CCC CAG GAC CTG GAG CCC CTG ACC ATC CTG TAC 270 Pro Cys Cys Val Pro Gln Asp Leu Glu Pro Leu Thr Ile Leu Tyr 80 85 90 TAT GTT GGG AGG ACC CCC AAA GTG GAG CAG CTC TCC AAC ATG GTG 315 Tyr Val Gly Arg Thr Pro Lys Val Glu Gln Leu Ser Asn Met Val 95 100 105 GTG AAG TCT TGT AAA TGT AGC 336 Val Lys Ser Cys Lys Cys Ser 110

【０１４９】配列番号：６ 配列の型：ヌクレオチド及び対応するポリペプチド 配列の長さ：３３６塩基対 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 起源：ヒトｃＤＮＡ 直接の起源：E.coli LC137/pPLMu.TGF−β2(44/45)β１ 特徴：TGF-β2(44/45)β１ハイブリドの１〜336 コード
領域 配列： GCT TTG GAT GCG GCC TAT TGC TTT AGA AAT GTG CAG GAT AAT TGC 45 Ala Leu Asp Ala Ala Tyr Cys Phe Arg Asn Val Gln Asp Asn Cys 5 10 15 TGC CTA CGT CCA CTT TAC ATT GAT TTC AAG AGG GAT CTA GGG TGG 90 Cys Leu Arg Pro Leu Tyr Ile Asp Phe Lys Arg Asp Leu Gly Trp 20 25 30 AAA TGG ATA CAC GAA CCC AAA GGG TAC AAT GCC AAC TTC TGC CTC 135 Lys Trp Ile His Glu Pro Lys Gly Tyr Asn Ala Asn Phe Cys Leu 35 40 45 GGG CCC TGC CCC TAC ATT TGG AGC CTG GAC ACG CAG TAC AGC AAG 180 Gly Pro Cys Pro Tyr Ile Trp Ser Leu Asp Thr Gln Tyr Ser Lys 50 55 60 GTC CTG GCC CTG TAC AAC CAG CAT AAC CCG GGC GCC TCG GCG GCG 225 Val Leu Ala Leu Tyr Asn Gln His Asn Pro Gly Ala Ser Ala Ala 65 70 75 CCG TGC TGC GTG CCG CAG GCG CTG GAG CCG CTG CCC ATC GTG TAC 270 Pro Cys Cys Val Pro Gln Ala Leu Glu Pro Leu Pro Ile Val Tyr 80 85 90 TAC GTG GGC CGC AAG CCC AAG GTG GAG CAG CTG TCC AAC ATG ATC 315 Tyr Val Gly Arg Lys Pro Lys Val Glu Gln Leu Ser Asn Met Ile 95 100 105 GTG CGC TCC TGC AAG TGC AGC 336 Val Arg Ser Cys Lys Cys Ser 110

【０１５０】配列番号：７ 配列の型：ヌクレオチド及び対応するポリペプチド 配列の長さ：３３６塩基対 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 起源：ヒトｃＤＮＡ 直接の起源：E.coli LC137/pPLMu.TGF−β2(44/45)β３ 特徴：TGF-β2(44/45)β３ハイブリドの１〜336 コード
領域 配列： GCT TTG GAT GCG GCC TAT TGC TTT AGA AAT GTG CAG GAT AAT TGC 45 Ala Leu Asp Ala Ala Tyr Cys Phe Arg Asn Val Gln Asp Asn Cys 5 10 15 TGC CTA CGT CCA CTT TAC ATT GAT TTC AAG AGG GAT CTA GGG TGG 90 Cys Leu Arg Pro Leu Tyr Ile Asp Phe Lys Arg Asp Leu Gly Trp 20 25 30 AAA TGG ATA CAC GAA CCC AAA GGG TAC AAT GCC AAC TTC TGC TCA 135 Lys Trp Ile His Glu Pro Lys Gly Tyr Asn Ala Asn Phe Cys Ser 35 40 45 GGC CCT TGC CCA TAC CTC CGC AGT GCA GAC ACA ACC CAC AGC ACG 180 Gly Pro Cys Pro Tyr Leu Arg Ser Ala Asp Thr Thr His Ser Thr 50 55 60 GTG CTG GGA CTG TAC AAC ACT CTG AAC CCT GAA GCA TCT GCC TCG 225 Val Leu Gly Leu Tyr Asn Thr Leu Asn Pro Glu Ala Ser Ala Ser 65 70 75 CCT TGC TGC GTG CCC CAG GAC CTG GAG CCC CTG ACC ATC CTG TAC 270 Pro Cys Cys Val Pro Gln Asp Leu Glu Pro Leu Thr Ile Leu Tyr 80 85 90 TAT GTT GGG AGG ACC CCC AAA GTG GAG CAG CTC TCC AAC ATG GTG 315 Tyr Val Gly Arg Thr Pro Lys Val Glu Gln Leu Ser Asn Met Val 95 100 105 GTG AAG TCT TGT AAA TGT AGC 336 Val Lys Ser Cys Lys Cys Ser 110

【０１５１】配列番号：８ 配列の型：ヌクレオチド及び対応するポリペプチド 配列の長さ：３３６塩基対 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 起源：ヒトｃＤＮＡ 直接の起源：E.coli LC137/pPLMu.TGF−β3(44/45)β１ 特徴：TGF-β3(44/45)β１ハイブリドの１〜336 コード
領域 配列： GCT TTG GAC ACC AAT TAC TGC TTC CGC AAC TTG GAG GAG AAC TGC 45 Ala Leu Asp Thr Asn Tyr Cys Phe Arg Asn Leu Glu Glu Asn Cys 5 10 15 TGT GTG CGC CCC CTC TAC ATT GAC TTC CGA CAG GAT CTG GGC TGG 90 Cys Val Arg Pro Leu Tyr Ile Asp Phe Arg Gln Asp Leu Gly Trp 20 25 30 AAG TGG GTC CAT GAA CCT AAG GGC TAC TAT GCC AAC TTC TGC CTC 135 Lys Trp Val His Glu Pro Lys Gly Tyr Tyr Ala Asn Phe Cys Leu 35 40 45 GGG CCC TGC CCC TAC ATT TGG AGC CTG GAC ACG CAG TAC AGC AAG 180 Gly Pro Cys Pro Tyr Ile Trp Ser Leu Asp Thr Gln Tyr Ser Lys 50 55 60 GTG CTG GCC CTG TAC AAC CAG CAT AAC CCG GGC GCC TCG GCG GCG 225 Val Leu Ala Leu Tyr Asn Gln His Asn Pro Gly Ala Ser Ala Ala 65 70 75 CCG TGC TGC GTG CCG CAG GCG CTG GAG CCG CTG CCC ATC GTG TAC 270 Pro Cys Cys Val Pro Gln Ala Leu Glu Pro Leu Pro Ile Val Tyr 80 85 90 TAC GTG GGC CGC AAG CCC AAG GTG GAG CAG CTG TCC AAC ATG ATC 315 Tyr Val Gly Arg Lys Pro Lys Val Glu Gln Leu Ser Asn Met Ile 95 100 105 GTG CGC TCC TGC AAG TGC AGC 336 Val Arg Ser Cys Lys Cys Ser 110

【０１５２】配列番号：９ 配列の型：ヌクレオチド及び対応するポリペプチド 配列の長さ：３３６塩基対 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 起源：ヒトｃＤＮＡ 直接の起源：E.coli LC137/pPLMu.TGF−β3(44/45)β２ 特徴：TGF-β3(44/45)β２ハイブリドの１〜336 コード
領域 配列： GCT TTG GAC ACC AAT TAC TGC TTC CGC AAC TTG GAG GAG AAC TGC 45 Ala Leu Asp Thr Asn Tyr Cys Phe Arg Asn Leu Glu Glu Asn Cys 5 10 15 TGT GTG CGC CCC CTC TAC ATT GAC TTC CGA CAG GAT CTG GGC TGG 90 Cys Val Arg Pro Leu Tyr Ile Asp Phe Arg Gln Asp Leu Gly Trp 20 25 30 AAG TGG GTC CAT GAA CCT AAG GGC TAC TAT GCC AAC TTC TGT GCT 135 Lys Trp Val His Glu Pro Lys Gly Tyr Tyr Ala Asn Phe Cys Ala 35 40 45 GGA GCA TGC CCG TAT TTA TGG AGT TCA GAC ACT CAG CAC AGC AGG 180 Gly Ala Cys Pro Tyr Leu Trp Ser Ser Asp Thr Gln His Ser Arg 50 55 60 GTC CTG AGC TTA TAT AAT ACC ATA AAT CCA GAA GCA TCT GCT TCT 225 Val Leu Ser Leu Tyr Asn Thr Ile Asn Pro Glu Ala Ser Ala Ser 65 70 75 CCT TGC TGC GTG TCC CAA GAT TTA GAA CCT CTA ACC ATT CTC TAC 270 Pro Cys Cys Val Ser Gln Asp Leu Glu Pro Leu Thr Ile Leu Tyr 80 85 90 TAC ATT GGC AAA ACA CCC AAG ATT GAA CAG CTT TCT AAT ATG ATT 315 Tyr Ile Gly Lys Thr Pro Lys Ile Glu Gln Leu Ser Asn Met Ile 95 100 105 GTA AAG TCT TGC AAA TGC AGC 336 Val Lys Ser Cys Lys Cys Ser 110

【０１５３】配列番号：１０ 配列の型：ヌクレオチド 配列の長さ：２９塩基 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 起源：合成オリゴヌクレオチド 特徴：Oligo No.1 ; TGF−β１センス鎖であり、NcoI部
位を含み、そして成熟ペプチドをコードする配列の５′
末端を代表する。 配列： TCCCGGCACA CCATGGCCCT GGACACCAA 29

【０１５４】配列番号：１１ 配列の型：ヌクレオチド 配列の長さ：２７塩基 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 起源：合成オリゴヌクレオチド 特徴：Oligo No.2 ; TGF−β１アンチセンス鎖であり、
SalI部位を含み、そして成熟ペプチドをコードする配列
の３′末端を代表する。 配列： CGGGGCGTCG ACTCAGCTGC ACTTGCA 27

【０１５５】配列番号：１２ 配列の型：ヌクレオチド 配列の長さ：３０塩基 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 起源：合成オリゴヌクレオチド 特徴：Oligo No.3 ; TGF−β２センス鎖であり、NcoI部
位を含み、そして成熟ペプチドをコードする配列の５′
末端を代表する。 配列： CGGCGGAAGA CCATGGCTTT GGATGCGGCC 30

【０１５６】配列番号：１３ 配列の型：ヌクレオチド 配列の長さ：２７塩基 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 起源：合成オリゴヌクレオチド 特徴：Oligo No.4 ; TGF−β２アンチセンス鎖であり、
SalI部位を含み、そして成熟ペプチドをコードする配列
の３′末端を代表する。 配列： TTTCCAGTCG ACTTAGCTGC ATTTGCA 27

【０１５７】配列番号：１４ 配列の型：ヌクレオチド 配列の長さ：２９塩基 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 起源：合成オリゴヌクレオチド 特徴：Oligo No.5 ; TGF−β３センス鎖であり、NcoI部
位を含み、そして成熟ペプチドをコードする配列の５′
末端を代表する。 配列： CAGAGGAAGA CCATGGCTTT GGACACCAA 29

【０１５８】配列番号：１５ 配列の型：ヌクレオチド 配列の長さ：２７塩基 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 起源：合成オリゴヌクレオチド 特徴：Oligo No.6 ; TGF−β３アンチセンス鎖であり、
SalI部位を含み、そして成熟ペプチドをコードする配列
の３′末端を代表する。 配列： GCACGTGTCG ACTCAGCTAC ATTTACA 27

【０１５９】配列番号：１６ 配列の型：ヌクレオチド 配列の長さ：２１塩基 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 起源：合成オリゴヌクレオチド 特徴：Oligo No.7 ; TGF−β１センス鎖、ヌクレオチド
111-131. 配列： GGGCTACCAT GCCAACTTCT G 21

【０１６０】配列番号：１７ 配列の型：ヌクレオチド 配列の長さ：２１塩基 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 起源：合成オリゴヌクレオチド 特徴：Oligo No.8 ; TGF−β１アンチセンス鎖、ヌクレ
オチド111-131. 配列： CAGAAGTTGG CATGGTAGCC C 21

【０１６１】配列番号：１８ 配列の型：ヌクレオチド 配列の長さ：２１塩基 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 起源：合成オリゴヌクレオチド 特徴：Oligo No.9 ; TGF−β３センス鎖、ヌクレオチド
111-131. 配列： GGGCTACTAT GCCAACTTCT G 21

【０１６２】配列番号：１９ 配列の型：ヌクレオチド 配列の長さ：２１塩基 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 起源：合成オリゴヌクレオチド 特徴：Oligo No.10 ; TGF-β３アンチセンス鎖、ヌクレ
オチド111-131. 配列： CAGAAGTTGG CATAGTAGCC C 21

【０１６３】配列番号：２０ 配列の型：ヌクレオチド 配列の長さ：２１塩基 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 起源：合成オリゴヌクレオチド 特徴：Oligo No.11 ; TGF-β２センス鎖、ヌクレオチド
111-131. 配列： AGGGTACAAT GCCAACTTCT G 21

【０１６４】配列番号：２１ 配列の型：ヌクレオチド 配列の長さ：２１塩基 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 起源：合成オリゴヌクレオチド 特徴：Oligo No.12 ; TGF-β２アンチセンス鎖、ヌクレ
オチド111-131. 配列： CAGAAGTTGG CATTGTACCC T 21

【０１６５】配列番号：２２ 配列の型：ヌクレオチド 配列の長さ：２１塩基 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 起源：合成オリゴヌクレオチド 特徴：Oligo No.13 ; TGF-β１センス鎖、ヌクレオチド
48-68. 配列： CGTGCGGCAG CTGTACATTG A 21

【０１６６】配列番号：２３ 配列の型：ヌクレオチド 配列の長さ：２１塩基 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 起源：合成オリゴヌクレオチド 特徴：Oligo No.14 ; TGF-β１アンチセンス鎖、ヌクレ
オチド68-48. 配列： TCAATGTACA GCTGCCGCAC G 21

【０１６７】配列番号：２４ 配列の型：ヌクレオチド 配列の長さ：２１塩基 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 起源：合成オリゴヌクレオチド 特徴：Oligo No.15 ; TGF-β２センス鎖、ヌクレオチド
48-68. 配列： CCTACGTCCA CTTTACATTG A 21

【０１６８】配列番号：２５ 配列の型：ヌクレオチド 配列の長さ：２１塩基 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 起源：合成オリゴヌクレオチド 特徴：Oligo No.16 ; TGF-β２アンチセンス鎖、ヌクレ
オチド68-48. 配列： TCAATGTAAA GTGGACGTAG G 21

【０１６９】配列番号：２６ 配列の型：ヌクレオチド 配列の長さ：２１塩基 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 起源：合成オリゴヌクレオチド 特徴：Oligo No.17 ; TGF-β３センス鎖、ヌクレオチド
48-68. 配列： TGTGCGCCCC CTCTACATTG A 21

【０１７０】配列番号：２７ 配列の型：ヌクレオチド 配列の長さ：２１塩基 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 起源：合成オリゴヌクレオチド 特徴：Oligo No.18 ; TGF-β３アンチセンス鎖、ヌクレ
オチド68-48. 配列： TCAATGTAGA GGGGGCGCAC A 21

【０１７１】配列番号：２８ 配列の型：ヌクレオチド 配列の長さ：２６塩基 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 起源：合成オリゴヌクレオチド 特徴：Oligo No.19 ; TGF-β１センス鎖、ヌクレオチド
142-167. 配列： TGCCCCTACA TTTGGAGCCT GGACAC 26

【０１７２】配列番号：２９ 配列の型：ヌクレオチド 配列の長さ：２６塩基 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 起源：合成オリゴヌクレオチド 特徴：Oligo No.20 ; TGF-β１アンチセンス鎖、ヌクレ
オチド167-142. 配列： GTGTCCAGGC TCCAAATGTA GGGGCA 26

【０１７３】配列番号：３０ 配列の型：ヌクレオチド 配列の長さ：２６塩基 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 起源：合成オリゴヌクレオチド 特徴：Oligo No.21 ; TGF-β２センス鎖、ヌクレオチド
142-167. 配列： TGCCCGTATT TATGGAGTTC AGACAC 26

【０１７４】配列番号：３１ 配列の型：ヌクレオチド 配列の長さ：２６塩基 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 起源：合成オリゴヌクレオチド 特徴：Oligo No.22 ; TGF-β２アンチセンス鎖、ヌクレ
オチド167-142. 配列： GTGTCTGAAC TCCATAAATA CGGGCA 26

【０１７５】配列番号：３２ 配列の型：ヌクレオチド 配列の長さ：２６塩基 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 起源：合成オリゴヌクレオチド 特徴：Oligo No.23 ; TGF-β３センス鎖、ヌクレオチド
142-167. 配列： TGCCCATACC TCTGTAGTGC AGACAC 26

【０１７６】配列番号：３３ 配列の型：ヌクレオチド 配列の長さ：２６塩基 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 起源：合成オリゴヌクレオチド 特徴：Oligo No.24 ; TGF-β３アンチセンス鎖、ヌクレ
オチド167-142. 配列： GTGTCTGAAC TGCGGAGGTA TGGTCA 26

【０１７７】配列番号：３４ 配列の型：ヌクレオチド 配列の長さ：２１塩基 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 起源：合成オリゴヌクレオチド 特徴：Oligo No.25 ; TGF-β１センス鎖、ヌクレオチド
217-237. 配列： TCGGCGGCGC CGTGCTGCGT G 21

【０１７８】配列番号：３５ 配列の型：ヌクレオチド 配列の長さ：２１塩基 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 起源：合成オリゴヌクレオチド 特徴：Oligo No.26 ; TGF-β１アンチセンス鎖、ヌクレ
オチド237-217. 配列： CACGCAGCAC GGCGCCGCCG A 21

【０１７９】配列番号：３６ 配列の型：ヌクレオチド 配列の長さ：２１塩基 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 起源：合成オリゴヌクレオチド 特徴：Oligo No.27 ; TGF-β２センス鎖、ヌクレオチド
217-237. 配列： TCTGCTTCTC CTTGCTGCGT G 21

【０１８０】配列番号：３７ 配列の型：ヌクレオチド 配列の長さ：２１塩基 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 起源：合成オリゴヌクレオチド 特徴：Oligo No.28 ; TGF-β２アンチセンス鎖、ヌクレ
オチド237-217. 配列： CACGCAGCAA GGAGAAGCAG A 21

【０１８１】配列番号：３８ 配列の型：ヌクレオチド 配列の長さ：２１塩基 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 起源：合成オリゴヌクレオチド 特徴：Oligo No.29 ; TGF-β３センス鎖、ヌクレオチド
217-237. 配列： TCTGCCTCGC CTTGCTGCGT G 21

【０１８２】配列番号：３９ 配列の型：ヌクレオチド 配列の長さ：２１塩基 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 起源：合成オリゴヌクレオチド 特徴：Oligo No.30 ; TGF-β３アンチセンス鎖、ヌクレ
オチド237-217. 配列： CACGCAGCAA GGCGAGGCAG A 21

【０１８３】配列番号：４０ 配列の型：ヌクレオチド 配列の長さ：２１塩基 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 起源：合成オリゴヌクレオチド 特徴：Oligo No.31 ; TGF-β１センス鎖、ヌクレオチド
252-272. 配列： GCCGCTGCCC ATCGTGTACT A 21

【０１８４】配列番号：４１ 配列の型：ヌクレオチド 配列の長さ：２１塩基 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 起源：合成オリゴヌクレオチド 特徴：Oligo No.32 ; TGF-β１アンチセンス鎖、ヌクレ
オチド272-252. 配列： TAGTACACGA TGGGCAGCGG C 21

【０１８５】配列番号：４２ 配列の型：ヌクレオチド 配列の長さ：２１塩基 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 起源：合成オリゴヌクレオチド 特徴：Oligo No.33 ; TGF-β２センス鎖、ヌクレオチド
252-272. 配列： ACCTCTAACC ATTCTCTACT A 21

【０１８６】配列番号：４３ 配列の型：ヌクレオチド 配列の長さ：２１塩基 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 起源：合成オリゴヌクレオチド 特徴：Oligo No.34 ; TGF-β２アンチセンス鎖、ヌクレ
オチド272-252. 配列： TAGTAGAGAA TGGTTAGAGG T 21

【０１８７】配列番号：４４ 配列の型：ヌクレオチド 配列の長さ：２１塩基 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 起源：合成オリゴヌクレオチド 特徴：Oligo No.35 ; TGF-β３センス鎖、ヌクレオチド
252-272. 配列： GCCCTGACCA TCCTGTACT A 21

【０１８８】配列番号：４５ 配列の型：ヌクレオチド 配列の長さ：２１塩基 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 起源：合成オリゴヌクレオチド 特徴：Oligo No.36 ; TGF-β３アンチセンス鎖、ヌクレ
オチド272-252. 配列： TAGTACAGGA TGGTCAGGGG C 21

【０１８９】配列番号：４６ 配列の型：ヌクレオチド 配列の長さ：３４塩基 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 起源：合成オリゴヌクレオチド 特徴：オリゴヌクレオチドI-1 ; インベルターゼシグナ
ル配列の部分をコードする。 配列： AATTCATGCT TTTGCAAGCT TTCCTTTTCC TTTT 34

【０１９０】配列番号：４７ 配列の型：ヌクレオチド 配列の長さ：３５塩基 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 起源：合成オリゴヌクレオチド 特徴：オリゴヌクレオチドI-2 ; オリゴヌクレオチドI-
1 に相補的 配列： CAGCCAAAAG GAAAAGGAAA GCTTGCAAAA GCATG 35

【０１９１】配列番号：４８ 配列の型：ヌクレオチド 配列の長さ：３８塩基 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 起源：合成オリゴヌクレオチド 特徴：オリゴヌクレオチドI-3 ; インベルターゼシグナ
ル配列の部分をコードする。 配列： GGCTGGTTTT GCAGCCAAAA TATCTGCATC TTAGCGTC 38

【０１９２】配列番号：４９ 配列の型：ヌクレオチド 配列の長さ：３７塩基 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 起源：合成オリゴヌクレオチド 特徴：オリゴヌクレオチドI-4 ; オリゴヌクレオチドI-
3 に相補的 配列： TCGAGACGCT AAGATGCAGA TATTTTGGCT GCAAAAC 37

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 1/21 7236−4Ｂ 15/18 ＺＮＡ 15/62 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｈ 8214−4Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:865） (72)発明者 デビット コックス スイス国，4204 ヒンメルリート ハウプ トシュトラーセ 245 (72)発明者 ニコ セルレッティ スイス国，4103 ボットミンゲンルティシ ュトラーセ 11 (72)発明者 ヨーヘン クーラ ドイツ連邦共和国，7806 バッハハイム, ヨハン−シルシュトラーセ ３

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 成熟形質転換成長因子−β（ＴＧＦ−
   β）アイソホーム（ｉｓｏｆｏｒｍ）中に存在する配列
   の連続する６個以上のアミノ酸から成る部分２個以上か
   ら成るハイブリドＴＧＦ−β分子。
2. 【請求項２】 ２，３，４，５又は６個の部分から成る
   請求項１に記載のハイブリドＴＧＦ−β分子。
3. 【請求項３】 ２個の部分から成る請求項１に記載のハ
   イブリドＴＧＦ−β分子。
4. 【請求項４】 配列表の配列番号：１〜３に示されるア
   ミノ酸配列を有するそれぞれＴＧＦ−βアイソホームヒ
   トＴＧＦ−β１、ヒトＴＧＦ−β２及びヒトＴＧＦ−β
   ３の部分から成る請求項３に記載のハイブリドＴＧＦ−
   β分子。
5. 【請求項５】 アミノ酸４４と４５、５６と５７、７９
   と８０、９０と９１、及び２２と２３の間のヒンジ点か
   ら成る群から選択されたヒンジ点を、異なる親ＴＧＦ−
   βアイソホーム由来の部分間に有する、請求項１に記載
   のハイブリドＴＧＦ−β分子。
6. 【請求項６】 ＴＧＦ−β１のＮ−末端部分とＴＧＦ−
   β２のＣ−末端部分とから成るハイブリド、ＴＧＦ−β
   ２のＮ−末端部分とＴＧＦ−β１のＣ−末端部分とから
   成るハイブリド、ＴＧＦ−β１のＮ−末端部分とＴＧＦ
   −β３のＣ−末端部分とから成るハイブリド、ＴＧＦ−
   β３のＮ−末端部分とＴＧＦ−β１のＣ−末端部分とか
   ら成るハイブリド、ＴＧＦ−β２のＮ−末端部分とＴＧ
   Ｆ−β３のＣ−末端部分とから成るハイブリド、及びＴ
   ＧＦ−β３のＮ−末端部分とＴＧＦ−β２のＣ−末端部
   分とから成るハイブリドから成る群から選択される、請
   求項１に記載のハイブリドＴＧＦ−β分子。
7. 【請求項７】 ハイブリド TGF−β1(44／45) β2, TGF
   −β2(44／45) β1,TGF−β1(44／45) β3, TGF−β3(4
   4／45) β1, TGF−β2(44／45) β3, TGF−β3(44／45)
   β2, TGF−β1(56／57) β2, TGF−β2(56／57) β1,
   TGF−β1(56／57) β3, TGF−β3(56／57) β1, TGF−
   β2(56／57) β3, TGF−β3(56／57)β2, TGF−β1(79
   ／80) β2, TGF−β2(79／80) β1, TGF−β1(79／80)
   β3, TGF−β3(79／80) β1, TGF−β3(79／80) β2, T
   GF−β2(79／80) β3, TGF−β1(90／91) β2, TGF−β
   2(90／91) β1, TGF−β1(90／91) β3, TGF−β3(90／
   91) β1, TGF−β3(90／91) β2, TGF−β2(90／91) β
   3, TGF−β1(22／23) β2, TGF−β2(22／23) β1, TGF
   −β1(22／23) β3, TGF−β3(22／23) β1, TGF−β3
   (22／23) β2 、及び TGF−β2(22／23) β3 から成る
   群から選択される、請求項１に記載のハイブリドＴＧＦ
   −β分子。
8. 【請求項８】 配列番号：４〜９にそれぞれ示されるハ
   イブリド TGF−β1(44／45) β2, TGF−β2(44／45) β
   1, TGF−β1(44／45) β3, TGF−β3(44／45) β1 、及
   び TGF−β2(44／45) β3, TGF−β3(44／45) β2 から
   成る群から選択される、請求項１に記載のハイブリドＴ
   ＧＦ−β分子。
9. 【請求項９】 配列番号：９に示されるＴＧＦ−β３
   （４４／４５）β１である請求項１に記載のハイブリド
   ＴＧＦ−β分子。
10. 【請求項１０】 請求項１に記載のハイブリドＴＧＦ−
    β分子をコードする組換えＤＮＡ分子。
11. 【請求項１１】 ハイブリドＴＧＦ−β分子の製造のた
    めの発現ベクターである請求項１０に記載の組換えＤＮ
    Ａ分子。
12. 【請求項１２】 請求項１０に記載のＤＮＡ分子の製造
    方法。
13. 【請求項１３】 請求項１０に記載のＤＮＡ分子により
    形質転換された宿主。
14. 【請求項１４】 請求項１に記載のハイブリドＴＧＦ−
    β分子の製造方法。
15. 【請求項１５】 請求項１に記載のハイブリドＴＧＦ−
    β分子を含んで成る医薬組成物。