JPH06100462A - 血小板増加剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】血小板増加剤を提供する。 【構成】ヘパリンバインディング・セクレトリー・トラ
ンスフォーミング・ファクター−１（ｈｓｔ−１）ある
いはそのムテインを含有してなる血小板増加剤。 【効果】本発明のＨＳＴ−１あるいはそのムテインを含
む血小板増加剤は、血小板減少症や、癌治療の際の血小
板減少に対してその治療薬として有利に用いることがで
きる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はヘパリンバインディング
・セクレトリー・トランスフォーミング・ファクター−
１（ｈｓｔ−１）、あるいはそのムテインを含む血小板
増加剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】血小板は、血管の破れで起こる出血が自
然に停まる止血過程中に起る血栓形成および血液凝固の
促進に重要な働きを行っている。ヒトにおいて、この血
小板は、骨髄幹細胞から、巨核球前駆細胞を経て分化し
て生ずる巨核球より血流中に放出される。血小板の減少
は血小板減少症，あるいは癌治療の際の制癌剤投与や放
射線照射などでひきおこされ，重篤な結果をもたらして
きた。しかし現在まで何ら有効な血小板増加剤は見出さ
れていない。一方、ヘパリンバインディング・セクレト
リー・トランスフォーミング・ファクター−１遺伝子
（ｈｓｔ−１遺伝子）は、ヒト胃癌組織より単離された
トランスフォーミング遺伝子であり〔Ｈ．Ｓａｋａｍｏ
ｔｏら、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・
アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．）８３：３９９７
（１９８８）〕、その遺伝子産物は細胞成長因子の１つ
である線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）と構造および生物
活性が似ていることが判明している〔Ｔ．Ｙｏｓｈｉｄ
ａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．
Ｓ．Ａ．８４：７３０５（１９８７），Ｋ．Ｍｉｙａｇ
ａｗａら、オンコジーン（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ）３，３８
３（１９８８）〕。またｈｓｔ−１遺伝子は、胃癌のみ
ならず大腸癌、肝癌、エイズ患者のカポジ肉腫より分離
されており〔Ｔ．Ｋｏｄａら、ジャパン・ジャーナル・
オブ・キャンサー・リサーチ（Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅ
ｒ Ｒｅｓ．（Ｇａｎｎ））７８：３２５（１９８
７），Ｈ．Ｎａｋａｇａｗａら、Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃ
ｅｒＲｅｓ．（Ｇａｎｎ）７８：６５１（１９８７），
Ｙ．Ｙｕａｓａら、Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅ
ｓ．（Ｇａｎｎ）７８：１０３５（１９８７），Ｐ．Ｄ
ｅｌｌｉ Ｂｏｖｉら、セル（Ｃｅｌｌ） ５０：７２
９（１９８７）〕、この遺伝子は塩基性ＦＧＦ、酸性Ｆ
ＧＦ、ｉｎｔ−２遺伝子などと共にＦＧＦファミリーを
形成すると考えられている。上記カポジ肉腫より分離さ
れたｈｓｔ−１と同じ遺伝子を有しｈｓｔ−１と同等の
活性を示すものはＫ−ＦＧＦとも呼ばれている。ｈｓｔ
−１遺伝子の塩基配列は既に報告されており〔Ｍ．Ｔａ
ｉｒａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
Ｕ．Ｓ．Ａ．８４：２９８０（１９８７），Ｔ．Ｙｏｓ
ｈｉｄａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
Ｕ．Ｓ．Ａ．８４：７３０５（１９８７）〕、同報告に
はこれから推測される遺伝子産物、ｈｓｔ−１の組成ア
ミノ酸も示されている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】上記のように現在まで
何ら有効な血小板増加剤は見出されておらず、そしてま
たｈｓｔ−１の性質、生物活性についてはまだ未知な点
が多い。したがって、有効な血小板増加剤の提供が望ま
れていたのである。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは有効な血小
板増加作用を示す因子を細胞が産生する物質、あるいは
既知のサイトカイン類等について広く探索してきたが、
組み換えＤＮＡ技術により作成したｈｓｔ−１、および
それと同様の活性を有するｈｓｔ−１ムテインが巨核球
の増殖促進活性（ＭＫ−ＣＳＦ活性）を示し、末梢の血
小板数を増加させることを見出した。さらにこれらの知
見に基づいて研究した結果、本発明に到達した。即ち、
本発明は（１）ヘパリンバインディング・セクレトリー
・トランスフォーミング・ファクター−１（ｈｓｔ−
１）蛋白質の有効量を含有してなる血小板増加剤、
（２）該蛋白質が欠失型ムテインである上記（１）記載
の血小板増加剤、（３）該ムテインが配列番号１のＮ末
端から少なくとも１個のアミノ酸を欠失しているムテイ
ンである上記（２）記載の血小板増加剤、（４）該ムテ
インが配列番号１のＮ末端から４７個までの全部または
一部のアミノ酸を欠失しているムテインである上記
（２）記載の血小板増加剤、（５）該ムテインが配列番
号１のＮ末端から２７個までの全部または一部のアミノ
酸を欠失しているムテインである上記（２）記載の血小
板増加剤、（６）該ムテインが配列番号１のＮ末端から
連続した２７個のアミノ酸を欠失しているムテインであ
る上記（２）記載の血小板増加剤、（７）他の治療剤と
組合せて用いるための、上記（１）記載の血小板増加
剤、（８）他の治療剤が制癌剤である、上記（７）記載
の血小板増加剤、（９）制癌剤がアルキル化剤、代謝拮
抗剤、抗生物質、植物アルカロイドおよびホルモン剤か
らなる群から選ばれるものである上記（８）記載の血小
板増加剤、および（１０）制癌剤がナイトロジェンマス
タードＮ−オキシド，シクロホスファミド，メルファラ
ン，カルボコン，ブスルファン，塩酸ニムスチン，ラニ
ムスチン，ダカルバジン，フルオロウラシル，テガフー
ル，シタラビン，塩酸アンシタビン，ブロクスウリジ
ン，ドキシフルリジン，メルカプトプリン，チオイノシ
ン，メトトレキサート，マイトマイシン，ブレオマイシ
ン，塩酸ダウノルビシン，塩酸ドキソルビシン，塩酸ピ
ラルビシン，塩酸アクラルビシン，ネオカルチノスタシ
ン，アクチノマイシンＤ，硫酸ビンクリスチン，硫酸ビ
ンブラスチン，硫酸ビンデシン，エトポシド，クエン酸
タモキシフェン，塩酸プロカルバジン，ミトブロニトー
ル，塩酸ミトキサントンおよびシスプラチンからなる群
から選ばれるものである上記（８）記載の血小板増加剤
である。

【０００５】ｈｓｔ−１は、前記のＴａｉｒａら、Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８
４：２９８０−２９８４（１９８７）においては、２０
６個のアミノ酸配列からなるペプチドとして示されてい
る。該アミノ酸配列を図１（配列番号：１）に示す。し
かしながら、Ｄｅｌｌｉ Ｂｏｖｉらは、（モレキュラ
ー・アンド・セルラー・バイオロジー（Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ），
８，２９３３−２９４１（１９８８）において、サルＣ
ＯＳ−１細胞で発現させる（目的物をＫ−ＦＧＦと称し
ている。）と、Ｎ末から３０個あるいは３１個のアミノ
酸が脱離されたものが得られることを示している。した
がって、ｈｓｔ−１の成熟タンパクとしては、上記２０
６個のアミノ酸配列のＮ末から３１個のアミノ酸が脱離
されたアミノ酸配列〔図２（配列番号：２）に示す。〕
を有するものとするのが最も妥当であると考えられる。
またムテインとしては少なくとも１個のアミノ酸の欠
失、置換や付加、あるいは糖鎖、脂質、アセチル基など
が付加した誘導体であってもよく、ｈｓｔ−１活性を有
するものであれば本発明のムテインに含まれる。本発明
のｈｓｔ−１の生物活性の測定は、たとえば、佐々田ら
の方法（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：５８８−５
９４（１９８８））に従い、マウスＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３
細胞のＤＮＡ合成誘起を〔³Ｈ〕チミジンの取り込みを
指標として測定することにより、多田らの方法（ジャー
ナル・オブ・イムノロジカル・メソッズ（Ｊｏｕｒｎａ
ｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ），９３，１５７（１９８６））に従い、血管内皮細
胞の増殖促進を測定することにより、またはＡｕｅｒｂ
ａｃｈの方法〔ディヴェロプメンタル・バイオロジー
（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ），４
１，３９１（１９７４）〕に従い、ニワトリ胚類尿膜上
の血管新生を測定することにより、行なうことができ
る。

【０００６】また、ＭＫ−ＣＳＦ活性の測定は、たとえ
ば石橋らの方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ，８６：５９５３〜５９５７（１９８
９））に従って、マウス骨髄細胞を培養し、巨核球数を
測定することにより行なうことができる。ムテインがｈ
ｓｔ−１の有する活性の少なくとも１つを示す限り、ｈ
ｓｔムテインの範畴に入り、なかでもＭＫ−ＣＳＦ活性
を示すものが好ましい。このムテインは成熟ｈｓｔ−１
の活性強度の少なくとも２０％を有することが必要であ
り、少なくとも５０％有することが好ましく、更には少
なくとも７０％有することが好ましい。本発明の欠失型
ムテインとしては、ｈｓｔ−１の構成アミノ酸のうちＮ
末端から少なくとも１個のアミノ酸が欠失しており、ｈ
ｓｔ−１活性を有するものが挙げられる。該欠失型ムテ
インとしては、配列番号１のＮ末端から４７個までの全
部または一部のアミノ酸が欠失したものがあげられ、通
常はｈｓｔ−１の連続した構成アミノ酸がＮ末端より１
ないし４７個欠失しているものが好ましく、さらに、Ｎ
末端より１ないし４３個欠失しているものが好ましく、
中でもＮ末端より１ないし２７個欠失しているものが好
ましい。その一例として特開平３−２１８３９３号に記
載のＮ末端より連続した２７個のアミノ酸を欠失したｈ
ｓｔ−１ムテインＮ２７などが挙げられる。また本発明
の欠失型ムテインは少なくとも１個の構成アミノ酸が欠
失され、さらに少なくとも１個のアミノ酸が置換されて
いるものであってもよい。本発明に用いられるｈｓｔ−
１、あるいはそのムテインの製造法としてはｈｓｔ−
１、あるいはそのムテインをコードするＤＮＡを組み込
んだ発現ベクターを、動物細胞、昆虫細胞、あるいは微
生物に感染させ、産生させる方法が好ましい。本発明の
ｈｓｔ−１あるいはそのムテインをコードする塩基配列
を有するＤＮＡを含有する発現型ベクターは、例えば、
（イ）ｈｓｔ−１蛋白質をコードするＲＮＡを分離し、
（ロ）該ＲＮＡから単鎖の相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を、
次いで二重鎖ＤＮＡを合成し、（ハ）該相補ＤＮＡをプ
ラスミドに組み込み、（ニ）得られた組み換えプラスミ
ドで宿主を形質転換し、（ホ）得られた形質転換体を培
養後、形質転換体から適当な方法、例えばＤＮＡブロー
ブを用いたコロニーハイブリダイゼーション法、により
目的とするＤＮＡを含有するプラスミドを単離し、
（ヘ）そのプラスミドから目的とするクローン化ＤＮＡ
を切り出し、（ト）該クローン化ＤＮＡ上に目的に叶う
欠失を生じさせ、（チ）場合によりＡＴＧコドンを含む
オリゴヌクレオチドを結合させ、（リ）該ＤＮＡを宿主
細胞に適したビークル中のプロモーターの下流に連結す
る、ことにより製造することができる。宿主に応じた好
ましいプロモーターは当業者により容易に選択すること
ができる。ｈｓｔ−１をコードするＲＮＡは、ヒトの種
々の癌細胞、例えば、胃癌、大腸癌、肝癌、カポジ肉
腫、ヒト胚細胞性腫瘍、ヒトｈｓｔ−１遺伝子によるＮ
ＩＨ３Ｔ３トランスフォーマントなどから得ることがで
きる。ヒトの癌からＲＮＡを調製する方法としては、グ
アニジンチオシアネート法〔Ｊ．Ｍ．Ｃｈｉｒｇｗｉｎ
ら、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ），１８ ５２９４（１９７８）〕などが挙げられ
る。このようにして得られたＲＮＡを鋳型としてｃＤＮ
Ａを合成し、例えばＷａｔｓｏｎとＪａｃｋｓｏｎの方
法（Ｗａｔｓｏｎ，Ｃ．Ｊ．ａｎｄ Ｊａｃｋｓｏｎ．
Ｊ．Ｆ．，ＤＮＡクローニング・ア・プラクティカル・
アプローチ（ＤＮＡＣｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｐｒａｃｔｉ
ｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ）ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ．Ｏｘ
ｆｏｒｄ．ｐ７９．，１９８５）に従って例えばλファ
ージベクター λｇｔ１０（Ｈｕｙｎｈ，Ｔ．Ｖ．ら、
ＤＮＡクローニング・ア・プラクティカル・アプロー
チ、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ．Ｏｘｆｏｒｄ．ｐ４９，１９
８５）に組み込み、これを大腸菌、例えばＣ６００，Ｈ
ｆｌＡ（Ｈｕｙｎｈ，Ｔ．Ｖ．ら、同上）に感染させ、
ｃＤＮＡライブラリーを作成することができる。また該
ｃＤＮＡは、報告されている配列に基づき化学合成によ
ってもつくることができる。このようにして得られたｃ
ＤＮＡライブラリーより、自体公知の方法、例えばブラ
ーク・ハイブリダイゼーション法（Ｍａｎｉａｔｉｓ
ら、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ）Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏ
ｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ｐ３２０，１９８２）およ
びＤＮＡ塩基配列決定法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７４，５６０（１９７７），
ニュークレイック アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）９，３０９（１９
８１）〕を用い、求めるファージクローンを選出する。

【０００７】次に、該ファージクローンを集め、例えば
Ｄａｖｉｓらの方法（Ｄａｖｉｓら、アドバンスト・バ
クチリアル・ジェネティクス（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂａ
ｃｔｅｒｉａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），Ｃｏｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ １９
８０）により、ファージＤＮＡを抽出して、そのｃＤＮ
Ａ部分を制限酵素を用いて切り出し、これをプラスミド
例えばｐＵＣ１３等に組み込み直して、使用するのも好
都合である。上記クローン化されたｈｓｔ−１をコード
する塩基配列を含有するＤＮＡを有するプラスミドはそ
のまま、または所望により制限酵素で切り出す。クロー
ン化された遺伝子は、発現に適したビークル（ベクタ
ー）中のプロモーターの下流に連結して発現型ベクター
を得ることができる。本発明に用いられるｈｓｔ−１ム
テインを製造するためには、従来の組換えＤＮＡ技術に
加え、特定部位指向性変異誘発技術（Ｓｉｔｅ−ｄｉｒ
ｅｃｔｅｄｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）が採用される。該
技術は周知であり、アール・エフ・レイサー（Ｌａｔｈ
ｅｒ．Ｒ．Ｆ．）及びジェイ・ピー・レコック（Ｌｅｃ
ｏｑ．Ｊ．Ｐ．）、ジェネティック・エンジニアリング
（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）、アカデ
ミックプレス社（１９８３年）第３１−５０頁に示され
ている。オリゴヌクレオチドに指示された変異誘発はエ
ム・スミス（Ｓｍｉｔｈ．Ｍ．）及びエス・ギラム（Ｇ
ｉｌｌａｍ．Ｓ．）、ジェネティック・エンジニアリン
グ：原理と方法、プレナムプレス社（１９８１年）３巻
１−３２頁に示されている。ｈｓｔ−１構成アミノ酸
が欠失しているムテインを得る目的の場合における変異
ｈｓｔ−１遺伝子を作る方法としては、三つの場合が考
えられる。ひとつはｈｓｔ−１のアミノ末端を欠失させ
る場合、二つめはｈｓｔ−１の中央部分を欠失させる場
合、三つにはｈｓｔ−１のカルボキシル末端を欠失させ
る場合である。アミノ末端を欠失させる場合には欠失さ
せようとするアミノ酸配列のカルボキシル末端をコード
する遺伝子のコドンをＭｅｔをコードするＡＴＧに特定
部位指向性変異法を用いて変更し、さらにそのコドンの
５′末端側に適当な制限酵素の認識部位を生成せしめ、
プロモーターとの連結（ｌｉｇａｔｉｏｎ）を容易にさ
せるか、あるいは制限酵素でアミノ末端を欠失させた遺
伝子にＡＴＧをもつオリゴヌクレオチドを読み取り枠を
合わせて結合させる。アミノ酸配列をその中央部分で欠
失させる場合には欠失させたい配列をコードする遺伝子
の５′および３′末端側にユニークな制限酵素の認識部
位を特定部位指向性変異法を用いて生成し、この部位を
酵素によって消化して抜きとり、再連結によって遺伝子
をもとにつなげば目的のアミノ酸を欠失したｈｓｔ−１
をコードする遺伝子ができ上がる。このとき制限酵素消
化により読み取り枠がずれないようにすることは云うま
でもない。カルボキシル末端側のアミノ酸配列を欠失さ
せる場合には、欠失させたい配列のアミノ末端側のアミ
ノ酸をコードする遺伝子のコドンを特定部位指向性変異
によってストップコドンに変更すればよい。

【０００８】クローン化された遺伝子は、発現に適した
ビークル（ベクター）中のプロモーターの下流に連結し
て発現型組換えベクターを得ることができる。組換えベ
クターを作成するためのビークル（ベクター）として
は、たとえば大腸菌由来のプラスミドｐＢＲ３２２，
〔ジーン（ｇｅｎｅ），２，９５（１９７７）〕，ｐＢ
Ｒ３２５〔ジーン、４，１２１（１９７８）〕，ｐＵＣ
１２〔ジーン、１９，２５９（１９８２）〕，ｐＵＣ１
３〔ジーン、１９，２５９（１９８２）〕、枯草菌由来
のｐＵＢ１１０〔バイオケミカル・バイオフィジカル・
リサーチ・コミュニケーション（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ
ｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｇｉｃａｌ Ｒｅｓｅｒｃｈ
Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ），１１２，６６７８
（１９８３）〕，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プ
ラスミド（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、あるいはλ
ファージなどのバクテリオファージおよびレトロウイル
ス、ワクシニアウイルスなどの動物ウイルスなどがあげ
られる。該遺伝子はその５′末端に翻訳開始コドンとし
てのＡＴＧを有し、また３′末端には翻訳終止コドンと
してのＴＡＡ，ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよ
い。さらに該遺伝子を発現させるにはその上流にプロモ
ーターを接続する。この発現で用いられるプロモーター
としては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切な
プロモーターであればいかなるものでもよい。また、形
質転換する際の宿主がエシェリヒア属菌である場合は、
ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプ
ロモーター、λｐＬプロモーター、ｌｐｐプロモータ
ー、Ｔ７プロモーターなどが、宿主がバチルス属菌であ
る場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモータ
ー、ｐｅｎＰプロモーターなど、宿主が酵母である場合
は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡ
Ｐプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。
とりわけ宿主がエシェリヒア属菌でプロモーターがｔｒ
ｐプロモーターまたはＴ７プロモーターであることが好
ましい。宿主が動物細胞である場合には、ＳＶ４０由来
のプロモーター、レトロウイルスのプロモーターなどが
挙げられ、とりわけＳＶ４０由来のプロモーターが好ま
しい。このようにして構築されたＤＮＡを含有するベク
ターを用いて、形質転換体を製造する。宿主としては、
たとえばエシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、動物
細胞などが挙げられる。上記エシェリヒア属菌の例とし
ては、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ）Ｋ１２ＤＨＩ〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．６０，１６０（１９６
８）〕，Ｍ１０３〔ヌクレイック・アシッズ・リサー
チ，（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃ
ｈ）９，３０９（１９８１）〕，ＪＡ２２１〔ジャーナ
ル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊｏｕｒｎａ
ｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）１２
０，５１７（１９７８）〕，ＨＢ１０１〔ジャーナル・
オブ・モレキュラー・バイオロジー、４１，４５９（１
９６９）〕，Ｃ６００〔ジェネティックス（Ｇｅｎｅｔ
ｉｃｓ），３９，４４０（１９５４）〕などが挙げられ
る。上記バチルス属菌としては、たとえばバチルス・サ
チルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＭＩ１１
４〔（ジーン、２４，２５５（１９８３）〕，２０７−
２１〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊｏｕ
ｒｎａｌ ｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）９５，８７
（１９８４）〕などが挙げられる。上記酵母としては、
たとえばサッカロマイセス セレビシアエ（Ｓａｃｃｈ
ａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｃｉａｅ）ＡＨ２２
Ｒ，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄなどが挙げられ
る。動物細胞としては、株化したもの（ｃｅｌｌ ｌｉ
ｎｅ）が好ましく、たとえばサル細胞ＣＯＳ−７〔セル
（ｃｅｌｌ），２３，１５７（１９８１）〕，ｖｅｒ
ｏ，チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ、マウスＬ細
胞、ヒトＦＬ細胞などが挙げられる。

【０００９】上記エシェリヒア属菌を形質転換するに
は、たとえばＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
Ｕ．Ｓ．Ａ．６９，２１１０（１９７２）、ジーン、１
７，１０７（１９８２）などに記載の方法に従って行な
われる。バチルス属菌を形質転換するには、たとえばモ
レキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス
（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅ
ｔｉｃｓ），１６８，１１１（１９７９）などの記載の
方法に従って行なわれる。酵母を形質転換するには、た
とえばＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．
Ｓ．Ａ．７５，１９２９（１９７８）に記載の方法に従
って行なわれる。動物細胞を形質転換するには、たとえ
ばヴィロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）５２，４５６（１
９７３）に記載の方法に従って行なわれる。このように
して、ｈｓｔ−１の欠失型ムテインｃＤＮＡを含有する
ベクターで形質転換された形質転換体が得られる。宿主
がエシェリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を
培養する際、培養に使用される培地としては液体培地が
適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要な炭
素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。炭素
源としては、たとえばグルコース、デキストリン、可溶
性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、たとえばアンモ
ニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチーブ・リカー・ペプ
トン・カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液
などの無機または有機物質、無機物としてはたとえば塩
化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシ
ウムなどがあげられる。また、酵母エキス、ビタミン
類、成長促進因子などを添加してもよい。上記培養に用
いる培地のｐＨは約６〜８であることが望ましい。エシ
ェリヒア属菌を培養する際の培地としては、例えばグル
コース、カザミノ酸を含むＭ９培地〔Ｍｉｌｌｅｒ、ジ
ャーナル・オブ・エクスペリメンツ・イン・モレキュラ
ー・ジェネティックス（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐ
ｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎ
ｅｔｉｃｓ），４３１−４３３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙ
ｏｒｋ １９７２）〕が好ましい。ここに必要によりプ
ロモーターを効率よく働かせるために、たとえば３β−
インドリル アクリル酸のような製剤を加えることがで
きる。宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１
５〜４３℃で約３〜２４時間行い、必要により、通気や
撹拌を加えることもできる。宿主がバチルス属菌の場
合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行な
い、必要により通気や撹拌を加えることもできる。宿主
が酵母である形質転換体を培養する際、培地としては、
たとえばバークホールダー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ）最
小培地〔Ｂｏｓｔｉａｎ，Ｋ．Ｌ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７７，４５０５
（１９８０）〕が挙げられる。培地のｐＨは約５〜８に
調整するのが好ましい。培養は通常約２０℃〜３５℃で
約２４〜７２時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加え
る。宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培
地としては、ＭＥＭ培地〔サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ）１２２，５０１（１９５２）〕，ＤＭＥＭ培地〔ヴ
ィロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ），８，３９６（１９５
９）〕，ＲＰＭＩ１６４０培地〔ジャーナル・オブ・ザ
・アメリカン・メディカル・アソシエーション（Ｔｈｅ
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ
ＭｅｄｉｃａｌＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）１９９，５１
９（１９６７）〕，１９９培地〔プロシーディング・オ
ブ・ザ・ソサイエティー・フォー・ザ・バイオロジカル
・メディスン（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ
Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａ
ｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）７３，１（１９５０）〕などが
挙げられる。これにさらに約５〜２０％の胎児牛血清を
添加しても良い。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。
培養は通常約３０〜４０℃、培養時間は約１５〜６０時
間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。

【００１０】上記培養物からｈｓｔ−１あるいはそのム
テインを分離精製するには、例えば下記の方法により行
うことができる。ｈｓｔ−１あるいはそのムテインを培
養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、
公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを塩酸グア
ニジンなどの蛋白質変性剤を含む緩衝液に懸濁して菌体
外に目的の蛋白を溶出させる方法、フレンチプレス、超
音波、リゾチームおよび（または）凍結融解によって菌
体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離によりｈｓｔ
−１の欠失型ムテインを得る方法などが適宜用い得る。
とりわけ、リゾチームと超音波処理を併用する方法が好
ましい。上澄液からｈｓｔ−１あるいはそのムテインを
精製するには、自体公知の分離・精製法を適切に組み合
わせて行なうことができる。これらの公知の分離、精製
法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する
方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分
子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィ
ーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロ
マトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆
相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用
する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用す
る方法などが挙げられる。さらに具体的には、上記上澄
液をＤＥＡＥセルロースなどを担体としたイオン交換ク
ロマトグラフィーにかけることにより、夾雑する核酸や
酸性蛋白質等を除くことができる。たとえば、中性付近
のトリスなどの緩衝液で平衡化したＤＥＡＥセルロース
カラムに上澄液をかけ、素通り画分を集めることは有効
である。また、さらにＣＭセルロースなどを担体とした
イオン交換クロマトグラフィーにかけることにより、ｈ
ｓｔ−１の欠失型ムテインを担体に吸着させ、塩溶液を
用いてこれを溶出させることにより精製することができ
る。ＣＭセファデックス等の酸性樹脂のカラムクロマト
グラフィーにより、菌体抽出液から直接、ｈｓｔ−１の
欠失型ムテインを精製することができる。たとえば、上
清液を、弱酸性緩衝液（例、リン酸緩衝液）で平衡化し
たＣＭ−セファデックスカラムにかけることにより、効
率良く行なうことができる。カラムを同じ緩衝液で洗浄
後、カラムを、塩（例、ＮａＣｌ）をさらに含有する緩
衝液を用いて溶出することにより、ｈｓｔ−１あるいは
そのムテインを溶出させることができる。これらの溶出
液は透析後、凍結乾燥することができる。また、ヘパリ
ン−セファロースを担体としたアフィニティークロマト
グラフィー法を、ｈｓｔ−１あるいはそのムテインの精
製法として、大腸菌抽出液中のｈｓｔ−１あるいはその
ムテインにも適用すると好都合である。たとえば中性付
近のトリス、リン酸などの緩衝液で平衡化したヘパリン
・セファロースカラムに、溶出液をかけ、十分洗った
後、食塩などの直線勾配溶出を行うことによりｈｓｔ−
１あるいはそのムテインを精製することができる。特
に、高速液体クロマトグラフィー用に開発されたヘパリ
ンカラム（たとえばＳｈｏｄｅｘ ＡＦ−ｐａｋ ＨＲ
・８９４、昭和電工製など）は有効である。上記ヘパリ
ンセファロースカラムと同様に、中性付近の緩衝液でサ
ンプルをかけ、十分洗ったのちＮａＣｌなどの直線勾配
溶出を行う。このカラム工程をくり返し行うことにより
高度に精製された標品を得ることができる。ｈｓｔ−１
あるいはそのムテインはほぼ均一な標品として回収する
ことができる。この様にして得られた標品は透析、凍結
乾燥を行い、乾燥粉末とすることもできる。さらに、担
体として血清アルブミンなどを添加して保存すること
は、標品の容器への吸着を防ぐことができ好適である。
また、精製過程、あるいは保存過程での微量の還元剤の
共存は、該標品の酸化を防ぐのに好適である。還元剤と
してはβ−メルカプトエタノール、ジチオスレイトー
ル、グルタチオンなどが挙げられる。このようにして、
実質的にパイロジエンもエンドトキシンも含まない、実
質的に純粋なｈｓｔ−１あるいは、そのムテインが得ら
れる。このような実質的にパイロジエンもエンドトキシ
ンも含まない生成物とは、例えばリムルス試験において
負に反応するものをいう。本発明の実質的に純粋なｈｓ
ｔ−１あるいはそのムテインとしては、蛋白質含量とし
てｈｓｔ−１あるいはそのムテインが９５％（ｗ／ｗ）
以上であるもの、さらに好ましくはｈｓｔ−１あるいは
そのムテインが９８％（ｗ／ｗ）以上であるものが挙げ
られる。該ポリペプチドはそのＮ末端にＭｅｔを有して
いてもよい。

【００１１】かくして生成するｈｓｔ−１あるいはその
ムテインの活性は、公知のＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞の増
殖促進効果などにより測定することができる。またＭＫ
−ＣＳＦ活性はマウス骨髄細胞を培養し、巨核球数を計
測することにより測定することができる。かくして得ら
れたｈｓｔ−１あるいはそのムテインは血小板増加剤と
して、そのまま粉末として、または他の薬理学的に許容
をされうる担体，賦形剤（例、ヒト血清アルブミン、ソ
ルビトールなどの安定化剤など），希釈剤とともに医薬
組成物（例、注射剤，錠剤，カプセル剤，液剤，軟膏）
として、温血哺乳動物（例、ヒト，マウス，ラット，ハ
ムスター，ウサギ，犬，ネコ）に対して非経口的または
経口的に安全に投与することができる。とりわけ注射剤
として非経口的に投与するのが好ましい。

【００１２】また、他の血小板増加剤や、白血球増剤
（Ｇ−ＣＳＦ，Ｍ−ＣＳＦ，ＣＭ−ＣＳＦ，ＩＬ−３な
ど）、あるいは免疫賦活剤，赤血球増加剤（エリスロポ
エチンなど）などと混合、併用することも可能である。
該製剤としては、たとえば、注射剤，注射投与に用いる
ための溶液もしくは凍結乾燥品などの形態にするのが好
ましい。また、目的に応じて徐放剤を調製することもで
きる。医薬組成物としての製剤化にあたっては、公知の
製剤学的製造法に準じ、所望により製剤学的に許容され
得る添加剤、希釈剤、賦形剤などを用いる。たとえば、
注射用水溶液剤とする場合は、水性溶剤（例、蒸留
水），水溶性溶剤（例、生理的食塩水，リンゲル液），
油性溶剤（例、ゴマ油，オリーブ油）等の溶剤，または
所望により溶解補助剤（例、サリチル酸ナトリウム，酢
酸ナトリウム），緩衝液（例、クエン酸ナトリウム，グ
リセリン），等張化剤（例、ブドウ糖，転化糖），安定
剤（例、ヒト血清アルブミン，ポリエチレングリコー
ル），保存剤（例、ベンジンアルコール，フェノー
ル），無痛化剤（例、塩化ベンザルコニウム，塩酸プロ
カイン）等の添加剤を用いて、常套手段により製造され
る。また、たとえば固型状注射用製剤とするには希釈剤
（例、蒸留水，生理的食塩水，ブドウ糖），賦形剤
（例、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ），アルギ
ン酸ナトリウム），保存剤（例、ベンジンアルコール，
塩化ベンザルコニウム，フェノール），無痛化剤（ブド
ウ糖，グルコン酸カルシウム，塩酸プロカイン）等を混
合し、常套手段により、固型状注射用製剤に製造するこ
とができる。

【００１３】さらに、製剤化にあたっては、ブドウ糖な
どの単糖類や、アミノ酸，各種塩類，ヒト血清アルブミ
ンなどを添加しても良く、その他に等張化剤、ｐＨ調節
剤，無痛化剤，防腐剤などを加えて安定で有効な製剤を
調製することができる。本発明の血小板増加剤の投与量
としては、たとえば投与ルート、症状などを考慮して、
体重あたり１日量約１ｎｇ〜１０００μｇ／ｋｇ、好ま
しくは１ｎｇ〜１００μｇ／ｋｇ、さらに好ましくは
０．１μｇ〜１００μｇ／ｋｇの中から適当量（有効
量）を選んで必要に応じ、数回に分けて投与される。本
発明の血小板増加剤を非経口的に投与するには、たとえ
ば、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、骨髄腔内投
与、および経粘膜投与などが挙げられる。経粘膜投与の
経路としては、経鼻、口腔内、直腸などが挙げられる。
特に静脈内投与、あるいは皮下投与が好ましい。投与は
１日１回投与でも、数回に分けてもよく、さらには持続
注入でも良い。また間歇的にたとえば、３日に１回、あ
るいは１週間に１回程度投与してもよい。また、徐放製
剤に成形して投与してもよく、該徐放製剤としては、マ
イクロカプセル、埋め込み剤などが例示される。特に、
徐放剤に成形したものを、皮下に埋め込むことにより、
長時間にわたり主薬の効果を発揮せしめるようにするの
が好ましい。

【００１４】本発明の血小板増加剤の投与により抹消血
中の血小板数を増加させることができる。癌の化学療法
では、ほとんどの化学療法剤の投与によって血小板減少
が引きおこされ、充分量の化学療法剤の投与をさまたげ
ている。放射線治療も同様である。血小板の減少は薬剤
投与後３〜１５日に観察される。本発明の血小板増加剤
は投与後、５〜１０日に血小板の増加作用を現わすの
で、化学療法剤の投与後すぐに、また血小板の減少を観
察してから投与し、血小板数の回復をはかることができ
る。また、化学療法剤の投与前より本発明の血小板増加
剤を投与しておいて、前もって血小板数を増加させてお
くこともよい効果をもたらす。本発明の血小板増加剤は
血小板を増加させ、化学療法剤処理によって減少した血
小板数を回復させ、治療の効果をあげるとともに患者の
危険な状態を回復させることができる。すなわち制癌補
助剤として用いることができる。

【００１５】これら制癌剤としては、例えばアルキル化
剤（例えばナイトロジェンマスタードＮ・オキシド，シ
クロフォスファミド，メルファラン，カルボコン，ブス
ルファン，塩酸ニムスチン，ラニムスチン，ダカルバジ
ンなど）、代謝拮抗剤（例えばフルオロウラシル，テガ
フール，シタラビン，塩酸アンシタビン，ブロクスウリ
ジン，ドキシフルリジン，メルカプトプリン，チオイノ
シン，メトトレキサートなど）、抗生物質（例えばマイ
トマイシン，ブレオマイシン，塩酸ダウノルビシン，塩
酸ドキソルビシン，塩酸ピラルビシン，塩酸アクラルビ
シン，ネオカルチノスタシン，アクチノマイシンＤな
ど）植物アルカロイド（例えば硫酸ビンクリスチン，硫
酸ビンブラスチン，硫酸ビンデシン，エトポシドなど）
ホルモン剤（例えばクエン酸タモキシフェンなど）その
他（塩酸プロカルバジン，ミトブロニトール，塩酸ミト
キサントン，シスプラチンなど）が挙げられる。本発明
の血小板増加剤は、血小板減少症の治療に用いることが
できる。たとえば、癌治療の際の制癌剤投与や放射線照
射などによって血小板の減少がみられたとき、本発明の
血小板増加剤を投与し血小板を増加させ、上記の癌治療
を続行させることができる。すなわち、本製剤を制癌補
助剤として用いることができる。

【００１６】本発明明細書および図面において、塩基や
アミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵ
Ｂ Ｃｏｍｍｉｓｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ［ｃ
ｎ］Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによる略号あるいは当該
分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下
記する。また、アミノ酸に関し光学異性体がありうる場
合は、特に明示しなければＬ−体を示すものとする。 ＤＮＡ ：デオキシリボ核酸 ｃＤＮＡ ：相補的デオキシリボ核酸 Ａ ：アデニン Ｔ ：チミン Ｇ ：グアニン Ｃ ：シトシン ＲＮＡ ：リボ核酸 ｄＡＴＰ ：デオキシアデノシン三リン酸 ｄＴＴＰ ：デオキシチミジン三リン酸 ｄＧＴＰ ：デオキシグアノシン三リン酸 ｄＣＴＰ ：デオキシシチジン三リン酸 ＡＴＰ ：アデノシン三リン酸 Ｔｄｒ ：チミジン ＥＤＴＡ ：エチレンジアミン四酢酸 ＳＤＳ ：ドデシル硫酸ナトリウム Ｇｌｙ ：グリシン Ａｌａ ：アラニン Ｖａｌ ：バリン Ｌｅｕ ：ロイシン Ｉｌｅ ：イソロイシン Ｓｅｒ ：セリン Ｔｈｒ ：スレオニン Ｃｙｓ ：システイン Ｍｅｔ ：メチオニン Ｇｌｕ ：グルタミン酸 Ａｓｐ ：アスパラギン酸 Ｌｙｓ ：リジン Ａｒｇ ：アルギニン Ｈｉｓ ：ヒスチジン Ｐｈｅ ：フェニールアラニン Ｔｙｒ ：チロシン Ｔｒｐ ：トリプトファン Ｐｒｏ ：プロリン Ａｓｎ ：アスパラギン Ｇｌｎ ：グルタミン 後述の参考例で得られた形質転換体は、財団法人発酵研
究所（ＩＦＯ）に寄託され、また、通商産業省工業技術
院生命工業技術研究所（ＮＩＢＨ）（旧通商産業省工業
技術院微生物工業技術研究所）にブタベスト条約に基づ
く寄託として寄託されている。受託番号および受託日を
次の表１に示す。 表 １ 形質転換体 ＩＦＯ ＮＩＢＨ Ｅ．coli MM294(DE3)/ IFO 14952 FERM BP-2621 pLysS. pTB1051 （1989年９月21日）（1989年10月４日） （実施例１（ｂ）） 以下に参考例および実施例を挙げて本発明をさらに具体
的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものでは
ない。

【００１７】以下の参考例で得られたＮ末端よりアミノ
酸番号２７までが欠矢したムテインをｈｓｔ−１ムテイ
ンＮ２７と称し、そのアミノ酸配列を図３（配列番号：
３）に示す。 参考例１ ａ）発現プラスミドの構築 ヒトｈｓｔ−１ｃＤＮＡを含むプラスミドｐＫＯｃ５
（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ，Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８
４，２９８０−２９８４（１９８７）をＨｉｎｄIIIで
切断し、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩ Ｋｌｅ
ｎｏｗ断片反応により平滑化した。ここにＢａｍＨＩリ
ンカーをＴ４リガーゼ反応により連結したのち、Ｂａｍ
ＨＩ−ＳｔｙＩで切断して０．４９ｋｂＤＮＡ断片を得
た。合成オリゴヌクレオチド５′ＴＡＴＧＣＣＧＧＴＧ
ＧＣＡＧＣＧＣＡＧＣＣ３′（配列番号：４）および
５′ＣＴＴＧＧＧＣＴＧＣＧＣＴＧＣＣＡＣＣＧＧＣＡ
３′（配列番号：５）を上記０．４９ｋｂＤＮＡの５′
末端側に連結して得られた０．５１ｋｂＮｄｅＩ−Ｂａ
ｍＨＩ ＤＮＡ断片（開始コドンＡＴＧ，ヒトｈｓｔ−
１ ｃＤＮＡのヌクレオチドＮｏ．４１３〜９１６を含
む）を、Ｔ７ファージのφ１０プロモーターを有する大
腸菌用発現ベクターｐＥＴ３ｃ（Ｃｅｎｅ ５６，１２
５−１３５（１９８７）のＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ間に組
み込んでｐＴＢ１０５１を得た（図４）。 ｂ）ｃＤＮＡの大腸菌での発現 大腸菌ＭＭ２９４株にＴ７ファージのＲＮＡポリメラー
ゼ遺伝子を組み込んだλファージＤＥ３（Ｓｔｕｄｉｅ
ｒ，Ｆ．Ｗ．らＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８９：１１３
−１３０（１９８６））を溶原化させ、さらにＴ７ファ
ージのリゾチーム遺伝子をもつプラスミドｐＬｙｓＳ
（Ｓｔｕｄｉｅｒ，Ｆ．Ｗ．らＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．
１８９：１１３−１３０（１９８６））を導入し、大腸
菌ＭＭ２９４（ＤＥ３）／ｐＬｙｓＳ株を作製した。上
記（ａ）で得られたプラスミドｐＴＢ１０５１を、この
大腸菌ＭＭ２９４（ＤＥ３）／ｐＬｙｓＳ株に導入し、
大腸菌ＭＭ２９４（ＤＥ３）／ｐＬｙｓＳ．ｐＴＢ１０
５１（ＩＦＯ １４９５２．ＦＥＲＭ ＢＰ−２６２
１）を作製した。この菌を１０μｇ／ｍｌクロラムフェ
ニコール、３５μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬ培地で
培養し、Ｋｌｅｔｔ値が約１２０の時点で、イソプロピ
ルβ−Ｄチオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を最終濃
度が０．４ｍＭになるように加え更に４時間培養を継続
した。菌体を遠心により集め、氷冷したフォスフェート
バッファードセライン（ＰＢＳ）で洗った後、再集菌し
使用時まで−２０℃に保存した。 ｃ）組換え型ｈｓｔ−１ムテインの精製 １０リッター培養から集めた菌体を２５０ｍｌの氷冷１
０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１０ｍＭ
ＥＤＴＡ、０．５Ｍ ＮａＣｌ、１０％ショ糖、１ｍＭ
ＰＭＳＦに懸濁し、卵白リゾチームを０．５ｍｇ／ｍ
ｌとなるように添加した。１時間氷中に放置後３７℃で
５分間インキュベートし、氷冷下で超音波処理（２０秒
間，２回）を行い、遠心（ＳＯＲＶＡＬＬ，１８Ｋｒｐ
ｍ，３０ｍｉｎ，４℃）して上清を得、これを菌体抽出
液とした。菌体抽出液２５０ｍｌを２０ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ ｐＨ７．６，０．５ＭＮａＣｌ溶液で平衡化
したＱセファロース（ファルマシア）カラム（径５×５
ｃｍ）に通し、抽出液中の核酸成分を除去した。カラム
からの素通り液および２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐ
Ｈ７．６，０．５Ｍ ＮａＣｌ溶液でのカラム洗液を合
わせて集めた（Ｑセファロース素通り画分４５０ｍ
ｌ）。この画分をヘパリンカラムＳｈｏｄｅｘ ＡＦ−
ｐｎＫ ＨＲ−２０９４、（２ｃｍＩＤ×２５ｃｍ，昭
和電工製）を装着した高速液体クロマトグラフィー装置
（ギルソン社）にかけた。カラムを、２０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．６溶液、次いで２０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．６，０．５Ｍ ＮａＣｌ溶液で洗
った後、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．６、バ
ッファー中、０．５Ｍから２ＭのＮａＣｌの直線勾配溶
出（ｌｉｎｅａｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｅｌｕｔｉｏ
ｎ，１８０ｍｉｎ，流速６．０ｍｌ／ｍｉｎ）を行っ
た。溶出パターンを図５に示す。図５において、縦軸は
ＯＤ₂₈₀の吸収値、およびグラジエント中のＮａＣｌ濃
度を示している。横軸はフラクション番号を示してお
り、ｔｉｍｅ０でグラジエント溶出を開始した。０．７
５分毎の画分を分散した。これらの蛋白質の比活性、及
びｈｓｔ−１ムテイン回収量を第２表に示した。また、
ピークを与えた各フラクションのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１
２．５％ポリアクリルアミドゲル）を図６に示した。 表 ２ 蛋白質(mg) hst-1活性（mgbFGF当量） 粗抽出液 ２５３０ ３．８ Ｑセファロース素通り画分 ２２４０ ５．２ヘパリンカラム溶出画分(47-60) ６．５ − −：未測定 ｄ）逆相Ｃ４ＨＰＬＣ ヘパリンＨＰＬＣカラムからの溶出画分＃５６の約半量
（タンパク３００μｇ）を逆相Ｃ４カラム（ＹＹＤＡ
Ｃ）にアプライし、０．１％ＴＦＡ存在下に０％から９
０％アセトニトリルの直線的濃度勾配をかけ溶出パター
ンを調べた。流速１ｍｌ／ｍｉｎ、勾配時間６０分で行
った（図７）。３６〜３７分に検出されたピーク画分の
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２．５％ポリアクリルアミドゲ
ル）をヘパリンカラムからの溶出画分５６と共に図８に
示す。なお、図８において、１は分子量マーカー（５０
ｎｇ）の、２はヘパリンＨＰＬＣカラムより溶出された
フラクション５６（５０ｎｇ）の、３はヘパリンＨＰＬ
Ｃカラムより溶出されたフラクション５６（１００ｎ
ｇ）の、４は逆相ＨＰＬＣ溶出画分（５０ｎｇ）の、５
は逆相ＨＰＬＣ溶出画分（１００ｎｇ）の１２．５％ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動のパターンをそれぞれ示
す。また、これらの蛋白の比活性は組換え型ヒトｂＦＧ
Ｆ（ｒｈｂＦＧＦ）（ヨーロッパ特許公開第２３７，９
６６号公報）を１．００とした場合０．４３と測定され
た。これら精製過程の比活性の変化、およびｈｓｔ−１
ムテインＮ２７の回収量を表３に示した。なお、表３に
おいて、比活性は、ウシ脳下垂体由来ＦＧＦ（宝酒造
製）の活性を１とした。このようにして、図３に示すア
ミノ酸配列を有するｈｓｔ−１ムテインＮ２７を得た。 表 ３ 蛋白質(mg) 比活性 回収率（％） 菌体粗抽出液 ２５３０ ０．０１３ １００ Ｑセファロースカラム ２１５２ ０．０１４ ９１ 素通り画分ヘパリンカラム溶出画分 １１ ０．５４ １８ ｅ）生物活性 ｈｓｔ−１ムテインの活性は佐々田らの方法（Ｓａｓａ
ｄａら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，８：５８８−
５９４（１９８８））に従い、マウスＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ
３細胞のＤＮＡ合成誘起を［³ Ｈ］チミジンの取り込み
を指標として測定した。結果を上述の表２に示した。

【００１８】

【実施例】

実施例１ ｈｓｔ−１ムテインＮ２７のＭＫ−ＣＳＦ活性 ＢＡＬＢ／ｃマウス（メス、７週令）の大腿骨より骨髄
細胞を採取し、１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含む
ＩＭＤＭ培地（Ｆｌｏｗ社）にて２×１０⁵ 個／ｍｌに
懸濁し、プラスチックシャーレ上で３７℃４５分間イン
キュベートした。非付着性細胞を集め、血清を除去する
ためにＩＭＤＭ培地で洗浄した。これら非付着性骨髄細
胞（１×１０⁵ 個／ｍｌ）をＮｅｕｔｒｉｄｏｍａ−ｓ
ｐ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社）を含
むＩＭＤＭ培地に懸濁し、９６穴平底プレート（ヌンク
社）に２００μｌずつ播種した。このとき、種々の濃度
のｈｓｔ−１ムテインＮ２７を添加した。３７℃で７日
間培養後、５％グルタルアルデヒド（和光純薬）を５０
μｌ添加し、２０００ｒｐｍで５分間遠心して細胞を固
定した。０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で簡単に
洗浄し、アセチルコリンエステラーゼ染色を行った。す
なち、ヨウ化アセチルチオコリン（シグマ社）３０ｍｇ
を０．１Ｍリン酸緩衝液４５ｍｌに溶解後、３０ｍＭ硫
酸銅６ｍｌ、０．１Ｍクエン酸ナトリウム３ｍｌ、５ｍ
Ｍフェリシアン化カリウム６ｍｌを加えたものを用時調
製し、各ウェルに２００μｌずつ添加し、室温で６時間
染色した。０．１Ｍリン酸緩衝液で洗浄後、倒立顕微鏡
で検鏡し、巨核球系細胞の数を数えた。図９に示す様
に、ｈｓｔ−１ムテインＮ２７はマウス骨髄中の巨核球
系前駆細胞を容量依存的に増殖させた。

【００１９】実施例２ ｈｓｔ−１ムテインＮ２７投与による末梢血血小板の産
生亢進 ｈｓｔ−１ムテインＮ２７を、ウシ血清アルブミン〔Ｂ
ＳＡ（アーマー社）１００μｇ／ｍｌを含有する生理食
塩水（大塚製薬）〕中に、５００μｇ／ｍｌの濃度とな
るように溶解し、本発明の製剤を調製した。本製剤の１
００μｌを１日３回２日間ＢＡＬＢ／ｃマウス（メス、
７週令；チャールズリバー）に皮下投与した。コントロ
ールとして１００μｇ／ｍｌ ＢＳＡを含有する生理食
塩水を投与した。第１回投与後１０日目に採血を行い、
末梢血中の血小板数を、多目的自動血球計数装置（Ｓｙ
ｓｍｅｘ）にて測定した。その結果、ｈｓｔ−１ムテイ
ンＮ２７投与群で末梢血中の血小板数が明らかに増加し
ていた（図１０）。従って、ｈｓｔ−１ムテインＮ２７
は、ｉｎ ｖｉｖｏで血小板を増加させる活性を有し、
血小板増加剤として利用し得る。

【００２０】実施例３ 参考例１で調製されたｈｓｔ−ムテインを５０ｍＭクエ
ン酸緩衝液ｐＨ５．０に１晩透析した後５００μｇ／ｍ
ｌの濃度に調製する。この溶液をフィルターロ過により
除菌、滅菌してバイアルに１ｍｌずつ分注して注射用製
剤とする。この製剤は−８０℃に保存することにより、
１年間にわたり安定である。

【００２１】

【発明の効果】本発明のｈｓｔ−１あるいはそのムテイ
ンを含む血小板増加剤は、血小板減少症や、癌治療の際
の血小板減少に対してその治療薬として有利に用いるこ
とができる。

【００２２】

【００２３】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：206 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：たんぱく質 配列 Met Ser Gly Pro Gly Thr Ala Ala Val Ala Leu Leu Pro Ala Val Leu 1 5 10 15 Leu Ala Leu Leu Ala Pro Trp Ala Gly Arg Gly Gly Ala Ala Ala Pro 20 25 30 Thr Ala Pro Asn Gly Thr Leu Glu Ala Glu Leu Glu Arg Arg Trp Glu 35 40 45 Ser Leu Val Ala Leu Ser Leu Ala Arg Leu Pro Val Ala Ala Gln Pro 50 55 60 Lys Glu Ala Ala Val Gln Ser Gly Ala Gly Asp Tyr Leu Leu Gly Ile 65 70 75 80 Lys Arg Leu Arg Arg Leu Tyr Cys Asn Val Gly Ile Gly Phe His Leu 85 90 95 Gln Ala Leu Pro Asp Gly Arg Ile Gly Gly Ala His Ala Asp Thr Arg 100 105 110 Asp Ser Leu Leu Glu Leu Ser Pro Val Glu Arg Gly Val Val Ser Ile 115 120 125 Phe Gly Val Ala Ser Arg Phe Phe Val Ala Met Ser Ser Lys Gly Lys 130 135 140 Leu Tyr Gly Ser Pro Phe Phe Thr Asp Glu Cys Thr Phe Lys Glu Ile 145 150 155 160 Leu Leu Pro Asn Asn Tyr Asn Ala Tyr Glu Ser Tyr Lys Tyr Pro Gly 165 170 175 Met Phe Ile Ala Leu Ser Lys Asn Gly Lys Thr Lys Lys Gly Asn Arg 180 185 190 Val Ser Pro Thr Met Lys Val Thr His Phe Leu Pro Arg Leu 195 200 205。

【００２４】配列番号：2 配列の長さ：175 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：たんぱく質 配列 Pro Thr Ala Pro Asn Gly Thr Leu Glu Ala Glu Leu Glu Arg Arg Trp 1 5 10 15 Glu Ser Leu Val Ala Leu Ser Leu Ala Arg Leu Pro Val Ala Ala Gln 20 25 30 Pro Lys Glu Ala Ala Val Gln Ser Gly Ala Gly Asp Tyr Leu Leu Gly 35 40 45 Ile Lys Arg Leu Arg Arg Leu Tyr Cys Asn Val Gly Ile Gly Phe His 50 55 60 Leu Gln Ala Leu Pro Asp Gly Arg Ile Gly Gly Ala His Ala Asp Thr 65 70 75 80 Arg Asp Ser Leu Leu Glu Leu Ser Pro Val Glu Arg Gly Val Val Ser 85 90 95 Ile Phe Gly Val Ala Ser Arg Phe Phe Val Ala Met Ser Ser Lys Gly 100 105 110 Lys Leu Tyr Gly Ser Pro Phe Phe Thr Asp Glu Cys Thr Phe Lys Glu 115 120 125 Ile Leu Leu Pro Asn Asn Tyr Asn Ala Tyr Glu Ser Tyr Lys Tyr Pro 130 135 140 Gly Met Phe Ile Ala Leu Ser Lys Asn Gly Lys Thr Lys Lys Gly Asn 145 150 155 160 Arg Val Ser Pro Thr Met Lys Val Thr His Phe Leu Pro Arg Leu 165 170 175。

【００２５】配列番号：3 配列の長さ：148 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：たんぱく質 配列 Pro Val Ala Ala Gln Pro Lys Glu Ala Ala Val Gln Ser Gly Ala Gly 1 5 10 15 Asp Tyr Leu Leu Gly Ile Lys Arg Leu Arg Arg Leu Tyr Cys Asn Val 20 25 30 Gly Ile Gly Phe His Leu Gln Ala Leu Pro Asp Gly Arg Ile Gly Gly 35 40 45 Ala His Ala Asp Thr Arg Asp Ser Leu Leu Glu Leu Ser Pro Val Glu 50 55 60 Arg Gly Val Val Ser Ile Phe Gly Val Ala Ser Arg Phe Phe Val Ala 65 70 75 80 Met Ser Ser Lys Gly Lys Leu Tyr Gly Ser Pro Phe Phe Thr Asp Glu 85 90 95 Cys Thr Phe Lys Glu Ile Leu Leu Pro Asn Asn Tyr Asn Ala Tyr Glu 100 105 110 Ser Tyr Lys Tyr Pro Gly Met Phe Ile Ala Leu Ser Lys Asn Gly Lys 115 120 125 Thr Lys Lys Gly Asn Arg Val Ser Pro Thr Met Lys Val Thr His Phe 130 135 140 Leu Pro Arg Leu 145。

【００２６】配列番号：4 配列の長さ： 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TATGCCGGTG GCAGCGCAGC C 21。

【００２７】配列番号：5 配列の長さ： 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CTTGGGCTGC GCTGCCACCG GCA 23。

【図面の簡単な説明】

【図１】ｈｓｔ−１ｃＤＮＡのオープンリーディングフ
レームを構成するリーダー配列を含むｈｓｔ−１のコー
ディング領域より予想されるアミノ酸配列を示す。

【図２】ｈｓｔ−１の成熟タンパクのアミノ酸配列を示
す。

【図３】参考例１で得られた、ｈｓｔ−１ムテインＮ２
７のアミノ酸配列を示す。

【図４】参考例１で得られた、プラスミドｐＴＢ１０５
１の構築図を示す。

【図５】参考例１で得られた、溶出パターンを示す。

【図６】参考例１で得られた、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの泳動
パターンを示す。

【図７】参考例１で得られた、溶出パターンを示す。

【図８】参考例１で得られた、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの泳動
パターンを示す。

【図９】実施例１で得られたｈｓｔ−１ムテインＮ２７
のＭＫ・ＣＳＦ活性を示す。

【図１０】実施例２で得られたｈｓｔ−１ムテインＮ２
７のマウスの血小板増加作用を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ａ６１Ｋ 45/00 37:02） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヘパリンバインディング・セクレトリー
   ・トランスフォーミング・ファクター−１蛋白質の有効
   量を含有してなる血小板増加剤。
2. 【請求項２】 該蛋白質が欠失型ムテインである請求項
   １記載の血小板増加剤。
3. 【請求項３】 該ムテインが配列番号１のＮ末端から少
   なくとも１個のアミノ酸を欠失しているムテインである
   請求項２記載の血小板増加剤。
4. 【請求項４】 該ムテインが配列番号１のＮ末端から４
   ７個までの全部または一部のアミノ酸を欠失しているム
   テインである請求項２記載の血小板増加剤。
5. 【請求項５】 該ムテインが配列番号１のＮ末端から２
   ７個までの全部または一部のアミノ酸を欠失しているム
   テインである請求項２記載の血小板増加剤。
6. 【請求項６】 該ムテインが配列番号１のＮ末端から連
   続した２７個のアミノ酸を欠失しているムテインである
   請求項２記載の血小板増加剤。
7. 【請求項７】 ヘパリンバインディング・セクレトリー
   ・トランスフォーミング・ファクター−１蛋白質と他の
   治療剤とを組合せてなる、請求項１記載の血小板増加
   剤。
8. 【請求項８】 他の治療剤が制癌剤である、請求項７記
   載の血小板増加剤。
9. 【請求項９】 制癌剤がアルキル化剤、代謝拮抗剤、抗
   生物質、植物アルカロイドおよびホルモン剤からなる群
   から選ばれるものである請求項８記載の血小板増加剤。
10. 【請求項１０】 制癌剤がナイトロジェンマスタードＮ
    −オキシド，シクロホスファミド，メルファラン，カル
    ボコン，ブスルファン，塩酸ニムスチン，ラニムスチ
    ン，ダカルバジン，フルオロウラシル，テガフール，シ
    タラビン，塩酸アンシタビン，ブロクスウリジン，ドキ
    シフルリジン，メルカプトプリン，チオイノシン，メト
    トレキサート，マイトマイシン，ブレオマイシン，塩酸
    ダウノルビシン，塩酸ドキソルビシン，塩酸ピラルビシ
    ン，塩酸アクラルビシン，ネオカルチノスタシン，アク
    チノマイシンＤ，硫酸ビンクリスチン，硫酸ビンブラス
    チン，硫酸ビンデシン，エトポシド，クエン酸タモキシ
    フェン，塩酸プロカルバジン，ミトブロニトール，塩酸
    ミトキサントンおよびシスプラチンからなる群から選ば
    れるものである請求項８記載の血小板増加剤。