JP2002509691A

JP2002509691A - 生物学的活性が改変された組換えタンパク質多量体の製造及び使用

Info

Publication number: JP2002509691A
Application number: JP2000502204A
Authority: JP
Inventors: シトコウスキー，アーサー，ジェイ．
Original assignee: ベスイスラエルディーコネスメディカルセンター
Priority date: 1997-07-10
Filing date: 1998-07-09
Publication date: 2002-04-02
Also published as: AU8383498A; CA2296071C; WO1999002710A1; EP1002106A1; US6187564B1; AU732857B2; CA2296071A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、ペプチドリンカーを有する又は有しない、タンパク質の非コード領域に変異を有する又は有しない組換え融合タンパク質に関する。融合タンパク質は、改変された構造的及び機能的特性及び生物学的活性を有する。融合タンパク質は、例えば、インビボ治療法として使用し得る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】関連出願本出願は、１９９７年７月１０日出願の米国出願第０８／８９０，９２９号の
一部継続出願である、１９９８年２月３日出願の米国出願第０９／０１８，１３
８号の一部継続出願であり、それらの教示は、参照によりすべて本明細書中に取
り込まれる。

【０００２】政府補助本発明は、米国海軍により与えられた契約番号第Ｎ０００１４−９０−Ｊ−１
８４７号の下、全部又は一部が政府補助によりなされた。政府は、本発明におい
て一定の権利を有する。

【０００３】発明の背景タンパク質を注射薬として用いる医療において遭遇する問題の1 つに、当該タ
ンパク質の治療有効循環濃度を維持するために、注射を頻繁に行わねばならない
ことがある。たとえば、エリトロポエチンは血漿中半減期が比較的短い（Spivak
, J.L.とHogans, B.B.、Blood, 73:90 (1989) ；McMahon, F.G. ら、Blood, 76:
1718 (1990) ）。したがって、治療有効血漿中濃度は急速に低下し、反復静脈内
投与を行わねばならない。かわりの投与経路として、皮下注射がある。この経路
は、投与部位からの吸収が遅いため、徐放効果が得られるが、血漿中濃度が有意
に低くなるため、同等の治療効果を挙げるためには、静脈内投与の場合に同様の
注射回数が必要になる。

【０００４】治療価値を有する天然タンパク質の生物学的活性を増大すべく、その修飾が試
みられることが多い。治療用タンパク質の生物学的活性を増大させるために、い
くつかの方法が用いられている。これらの方法は、治療剤のサイズを大きくする
ことに主眼を置いている場合が多い。たとえば、ポリエチレングリコール（ＰＥ
Ｇ）などの試薬と化学的コンジュゲート化を行うことにより、タンパク質のサイ
ズを増大させることができるKnusli, C.ら、Brit. J. Haematol. 82:654-663 (1
992)）。この方法は、「ＰＥＧ化」（PEGylation）として知られ、抗原性を低下
させる手段としてのみならず、生物学的活性を増大させる手段としても、いくつ
かのタンパク質製剤に対する適用例が報告されている。

【０００５】タンパク質のサイズを増大させるもう１つの方法として、別のタンパク質との
化学的架橋によるものがある。たとえば、タンパク質の抗原性を増大させるため
に、化学的架橋剤を用いて、免疫グロブリンや血清アルブミンなどの担体分子に
免疫原性タンパク質をコンジュゲート化させる。

【０００６】しかしながら、化合物や不活性分子をタンパク質にコンジュゲート化させると
、そのタンパク質の生物学的活性全体や選ばれた生物学的活性が有意に低下する
ことが多い。（Knusli, C.) ら、Brit. J. Haematol. 82:654-663 (1992)）。こ
れらのコンジュゲート化は、生じた修飾タンパク質が治療有効性を残存し、しか
も未修飾の野生型（すなわち天然）タンパク質が持っている所望の生物学的性質
を保持するように設計しなければならないSatake, R.ら、Biochem. Biophys. Ac
ta. 1038:125-129 (1990) ）。したがって、治療上活性なタンパク質を修飾して
、注射回数を低減させるかタンパク質の投与量を減らすようにその生物学的活性
を増大させることができれば、有利である。

【０００７】発明の概要本発明は、生物学的活性を増大させた修飾タンパク質又はポリペプチド、及び
これらの修飾タンパク質及びポリペプチドの製造方法ならびに使用に関する。

【０００８】増大させた生物学的活性は、たとえば二量体や三量体などのタンパク質多量体
を生ぜしめる融合タンパク質の製造に伴い生じる。タンパク質多量体を、本発明
のタンパク質、又は該タンパク質の生物学的活性断片、アナログ、変化体（ｖａ
ｒｉａｎｔｓ）、変異体、又は誘導体をコードするタンデム結合核酸を発現させ
ることによって、製造する。該タンパク質をコードする核酸を、本明細書の説明
に従い融合させる。本発明のタンパク質を、別のタンパク質に直接的に融合させ
てもよいし、たとえばペプチドリンカーなどのリンカーを介して融合させてもよ
い。次いで、タンデム融合した核酸配列を発現ベクターに挿入し、原核生物又は
真核生物いずれかのコンピテント細胞に導入して、生物学的活性を増大させた融
合タンパク質多量体を製造する。

【０００９】本明細書では、増大させた生物学的活性とは、血漿中半減期が延長した状態(
すなわち、天然タンパク質より循環半減期が長い) 、又は力価が高い状態( すな
わち、所定の生物学的活性レベルを得るのに必要な量が天然タンパク質より少な
い) をいう。本明細書では、生物学的活性は、標的細胞上の受容体に対する親和
性が増大していること、又は細胞シグナリングが増大していること( すなわちタ
ンパク質チロシンキナーゼ活性の上昇、受容体クラスタリング又は凝集の誘導、
受容体介在エンドサイトーシスの低減、タンパク質分解などの分解に対する感受
性の低減) 、又はタンパク質合成時の融合タンパク質又は本明細書で説明する融
合タンパク質をコードする転写物の安定性又は半減期の増大であるとも定義する
。増大させた生物学的活性は、たとえば力価が高くなり、循環半減期も延長した
修飾タンパク質など、上記活性を組み合わせたものも包含する。本発明のタンパ
ク質は生物学的活性が増大しているため、必要な投与回数が減るか、有効用量を
得るための投与量が減る。本明細書で説明する修飾により、さらに別の利点も生
じうる。たとえば、受容体又は結合リガンドに対する親和性の増大など、新たな
予想できない活性が生じ、そのような結合によって生成するシグナルの刺激が増
大しうる。次いで、治療過程を通して必要な修飾タンパク質の量は、未修飾タン
パク質を用いた場合の必要量より少なくて済む。

【００１０】これらに代えて、あるいはこれらに加えて、分泌速度を上昇させたり、宿主細
胞からのタンパク質合成時の融合タンパク質の安定性を増大させることで、たと
えばインビトロの方法により製造される融合タンパク質、又はインビボの治療目
的のために宿主細胞に導入される際の融合タンパク質の全体収量を増大させると
いう利点もある。

【００１１】本発明の対象であるタンパク質としては、治療活性を有するあらゆるタンパク
質が含まれる。具体的には、たとえば下記のものなどを含むサイトカイン、成長
因子、及びホルモンが本発明の対象となる：すなわち、インターフェロン- α、
インターフェロン- β、インターフェロン- γ、インターロイキン- １、インタ
ーロイキン- ２、インターロイキン- ３、インターロイキン- ４、インターロイ
キン- ５、インターロイキン- ６、インターロイキン- ７、インターロイキン-
８、インターロイキン- ９、インターロイキン- １０、インターロイキン- １１
、インターロイキン- １２、インターロイキン- １３、インターロイキン- １４
、インターロイキン- １５、インターロイキン- １６、エリトロポエチン、コロ
ニー刺激因子−１、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺
激因子、白血病阻害因子、腫瘍壊死因子、リンホトキシン、血小板由来増殖因子
、線維芽細胞成長因子、血管内皮細胞成長因子、表皮成長因子、トランスフォー
ミング成長因子- β、トランスフォーミング成長因子- α、トロンボポエチン、
幹細胞因子、オンコスタチンＭ、アンフィレギュリン、ミュラー管抑制物質、Ｂ
細胞増殖因子、マクロファージ遊走阻止因子、エンドスタチン、及びアンジオス
タチンなどが挙げられる。組換え技術によるタンパク質の製造、タンパク質精製
スキーム、及び生物学的活性の評価に関するさらなる参照文献を含む、これらの
タンパク質のうちの多くのものについての例示的記載や考察が、「ヒトサイトカ
イン：基礎研究及び医療研究のためのハンドブック（"Human Cytokines: Handbo
ok for Basic and Clinical Research")」, Aggarwal, B.B.及び Gutterman, J.
U.編, Blackwell Scientific Publications, Boston, MA, (1992) に見ることが
できるが、この教示は参照によりすべて本明細書に取り込まれる。

【００１２】より具体的には、本発明は、本明細書に定義されているような生物学的活性を
増大させた修飾エリトロポエチンに関する。本発明の生物学的活性を増大させた
修飾エリトロポエチンは、共有結合により融合させてエリトロポエチン多量体が
生じた２個以上のエリトロポエチン分子を含む融合タンパク質である。

【００１３】本発明はさらに、本明細書で説明する融合タンパク質多量体の製造方法、及び
使用、並びにその使用方法も対象とする。

【００１４】本発明は、生物学的活性を増大させた融合タンパク質を提供する。本発明の結
果として、本明細書で説明する融合タンパク質は、治療価値を向上させたタンパ
ク質を提供する。

【００１５】発明の詳細な説明本明細書で使用する場合、融合タンパク質という用語は、１つのタンパク質分
子が別のタンパク質分子と融合したものをいう。１つの態様においては、１つの
タンパク質分子のＣ末端を、別のタンパク質分子のＮ末端に融合させる。別の態
様においては、１つのタンパク質のＮ末端を、別のタンパク質分子のＣ末端に融
合させる。本発明の融合タンパク質は通常、リンカーペプチド配列が利用されて
いる構築物を含む。本発明の融合タンパク質は、Ｒ₁-Ｒ₂又はＲ₁-Ｌ- Ｒ₂の式
を有する（式中、Ｒ₁及びＲ₂は実質的に類似又は同一のタンパク質分子であり
、Ｌはリンカーであり、通常ペプチドである）。本発明の別の態様においては、
Ｒ₁とＲ₂は異なるタンパク質であり得る。Ｒ₁とＲ₂はまた、本明細書で説明
する融合タンパク質の単量体サブユニットと呼ぶこともある。２つ以上のタンパ
ク質分子を含む単一の融合タンパク質を生成するように、上記タンパク質分子を
別のタンパク質分子に融合させる。生成した融合タンパク質は、生物学的活性が
増大している。本発明の１つの態様においては、タンパク質分子はＥＰＯである
。

【００１６】融合タンパク質構築物は、各分子を列挙する方式により命名される。たとえば
、ＥＰＯ- Ｌ- ＥＰＯは、１つのペプチドリンカーによって結合させた２個のＥ
ＰＯ分子から成る融合タンパク質をいい、ＥＰＯ- Ｌ- ＥＰＯ- Ｌ- ＥＰＯは、
２つのペプチドリンカーによって結合させた３個のＥＰＯ分子から成る融合タン
パク質をいう。

【００１７】また、本発明は、本発明の融合タンパク質のタンパク質分子を独立的又は一体
的にコードする単離核酸構築物に関する。本明細書では、核酸構築物とは、核酸
配列のヘテロポリマーであると定義される。核酸配列は、ホスホジエステル結合
により連結されて核酸ヘテロポリマーを形成したヌクレオチド鎖をいうものとす
る。核酸配列は、２本鎖であってもよいし、１本鎖であってもよい。核酸配列は
、１つ以上のエキソンを含むことができ、イントロンが適宜含まれていてもよい
し含まれていなくてもよい。本発明の融合タンパク質をコードする核酸構築物を
作製する方法は、通常の分子生物学的手順であり、当該分野において公知である
（たとえばAubuselら、「Current Protocols in Molecular Biology」、John Wi
ley & Sons 社(1997)参照のこと）。上記以外の本発明の核酸構築物の組み合わせ又は修飾は、当業者にとって自明である。

【００１８】具体的には、ＥＰＯの融合タンパク質をコードする核酸構築物が挙げられる。
たとえば、ある核酸構築物は、ＥＰＯ二量体のアミノ末端部分（Ｒ１）をコード
する核酸が、５’非翻訳領域と開始コドンと、リーダー配列を含む前駆タンパク
質とを含む終止コドンを欠いており、１７アミノ酸ペプチドリンカーが後続して
いるＥＰＯ二量体（ＥＰＯ- Ｌ- ＥＰＯ；Ｆｉｇｕｒｅ１６Ａ〜１６Ｃの配列番
号：１６及び１７）をコードする。ＥＰＯ二量体のカルボキシル末端部分（Ｒ２
）をコードする核酸構築物は、成熟分泌ＥＰＯのコード領域と終止コドンと３’
非翻訳領域とを含む。ＣＯＳ１細胞中で発現される場合、ＥＰＯ- Ｌ- ＥＰＯを
コードするｍＲＮＡは、長さが２. ８ｋｂであり、分泌タンパク質二量体は、７
６ｋＤａであり、この分子量は２つの完全プロセシング化ＥＰＯタンパク質分子
とグリコシル化ＥＰＯタンパク質分子（それぞれ３７ｋＤａ) と１７アミノ酸ペ
プチドリンカー（１. ８ｋＤａ）にほぼ等しい（実施例２参照) 。本明細書で使
用する場合、ＥＰＯ- Ｌ- ＥＰＯ、ＥＰＯ−ＥＰＯ、及びＥＰＯ^wt- ＥＰＯ^wtは
、単量体ＥＰＯが野生型ＥＰＯ (ＥＰＯ^wt) であるエリトロポエチン二量体も同
等に示すのに使用される。

【００１９】常法である自体公知のKrystal のインビトロバイオアッセイ（Exp. Hematol.
11:649-660 (1983) ）及び二量体の複数回又は単回注射後のヘマトクリットを増
大させるインビボの能力で評価すると、ＥＰＯ^wt- Ｌ- ＥＰＯ^wt二量体は、単量
体ＥＰＯ^wtと比べて生物学的活性が増大している( 実施例５参照；Ｆｉｇｕｒｅ
１７Ａ〜１７Ｃ) 。ＥＰＯ^wt- ＥＰＯ^wtタンパク質二量体は、ＥＰＯ^wt単量体よ
り有意に大量に分泌された。Ｅｐｏ^wtは、６.3Ｕ/ ｍｌ（０. ０１８μｇ/ ｍｌ
）の濃度でＣＯＳ１細胞から分泌され、３５０Ｕ/ μｇの比活性を示したが、Ｅ
ｐｏ^wt/ Ｅｐｏ^wtは、１５１Ｕ/ ｍｌ（０. １５０μｇ/ ｍｌ）の濃度で分泌さ
れ、単量体ＥＰＯより約３倍高い１００７Ｕ/ μｇの比活性を示した( 実施例４
及び５参照) 。

【００２０】マウスにＥＰＯ^wt- ＥＰＯ^wtの単回皮下注射を行ったところ（３００Ｕ/ ｋｇ
）、７日後にヘマトクリットが上昇した( 実施例５、Ｆｉｇｕｒｅ１７Ａ〜１７
Ｃ) 。これらのインビボ及びインビトロのデータは、二量体ＥＰＯ分子の生物学
的活性が増大し、分泌が強化されるという予想されなかった性質が出現したこと
を明確に示しているが、このことは、インビトロの製造及びインビボの医薬組成
物に関して重要な意味を持ちうる。

【００２１】本発明の核酸構築物は、野生型タンパク質( たとえばＥＰＯ^wt) 又は変異体Ｅ
ＰＯ（たとえば単量体サブユニットのうち少なくとも１つのコード領域中で変異
が起きるもの）をコードしうる。変異は、たとえば、ＥＰＯの１０３位のアルギ
ニンがアラニンで置換されるＲ１０３Ａ変異であってよい。具体的には、ＥＰＯ ^R103A - ＥＰＯ^wt、ＥＰＯ^wt- ＥＰＯ^R103A、及びＥＰＯ^R103A- ＥＰＯ^R103A 変異体二量体が本発明の対象となる( 実施例７及び８) 。ＥＰＯのコード領域に
単一の点変異が起きると、野生型単量体ＥＰＯと比べて生物学的活性が増大した
二量体が生じる。変異体二量体であるＥＰＯ^R103A- ＥＰＯ^wt、ＥＰＯ^wt- ＥＰ
Ｏ^R103A、及びＥＰＯ^R103A- ＥＰＯ^R103Aの分泌は、ＥＰＯ^wt- ＥＰＯ^wt二量
体と比べて予想外に強化されていたことから、Ｒ１０３Ａ変異は、ＥＰＯ二量体
タンパク質の安定性を増大させうることが示唆される。

【００２２】本発明の融合タンパク質は、核酸構築物を用いた組換えＤＮＡ技術により、製
造することができる（実施例１及び７) 。本明細書で使用する場合、「組換え」
という用語は、あるタンパク質が、たとえば酵母（たとえばサッカロミセス（Sa
ccharomyces)) 、細菌（たとえば大腸菌又は枯草菌（Bacillus) ）、及び昆虫又
は哺乳類発現系を含む動物細胞を含む組換え体（たとえば真核又は原核宿主細胞
）発現系に由来することを意味する。ほとんどの細菌培養物中で発現されるタン
パク質は、グリカンを含まない。酵母中で発現されるタンパク質は、哺乳類細胞
中で発現されるタンパク質とは異なるグリコシル化パターンを有してもよい。

【００２３】本明細書で使用する場合、ヌクレオチド配列又は核酸配列という用語は、デオ
キシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）又はリボヌクレオチド（ＲＮＡ）のヘテロポリ
マーをいう。

【００２４】本発明において提供されるタンパク質をコードする核酸配列は、組換え転写ユ
ニット中で発現されうる合成核酸配列を提供するために、ｃＤＮＡ又はゲノムＤ
ＮＡのいずれかのＤＮＡ、又はＲＮＡと、短いオリゴヌクレオチドリンカーとか
ら構成されうる。

【００２５】ＤＮＡ又はＲＮＡを含む相同核酸は、ハイブリダイゼーション（たとえば高度
ストリンジェンシー条件又は中等度ストリンジェンシー条件下）によって検出及
び/ 又は単離することができる。ハイブリダイゼーションのための「ストリンジ
ェンシー条件」とは、ある特定の核酸が別の核酸に対して完全に相補的でありう
るか、その第１の核酸と第２の核酸が完全ではないある程度の相補性を共有しう
る場合、第１の核酸と第２の核酸のハイブリダイゼーションを可能ならしめる温
度及び緩衝液濃度の条件をいう技術用語である。たとえば、完全に相補的である
核酸を相補性が低い核酸と区別する程度の高度ストリンジェンシー条件を用いる
ことができる。核酸ハイブリダイゼーションのための「高度ストリンジェンシー
条件」及び「中等度ストリンジェンシー条件」については、たとえばAusubel, F
.M. ら, 「Current Protocols in Molecular Biology」(1995)などいくつかの技
術的なプロトコルの参照文献に説明されており、その教示は参照によりすべて本
明細書に取り込まれる。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定す
る厳密な条件は、ホルムアミドなどの脱安定化剤のイオン強度、温度、及び濃度
に依存するのみならず、核酸配列の長さ、塩基組成、ハイブリダイズする配列間
のミスマッチの割合、及び他の非同一配列内におけるその配列のサブセットの発
生頻度などの因子にも依存する。したがって、様々な形の組換えポリペプチドを
検出するための高度又は中等度ストリンジェンシー条件を決定することができる
。

【００２６】ハイブリダイゼーションが起きないストリンジェンシーのレベルからハイブリ
ダイゼーションが初めて認められるレベルまでハイブリダイゼーション条件を変
化させることにより、所定の配列を試料中で実質的に同様の同一性を有する配列
にハイブリダイズさせる（たとえば選択的に）条件を決定することができる。

【００２７】具体的条件については、Krause, M.H.とAaronson, S.A.、Methods in Enzymol
ogy, 200:546-556 (1991) に記載されている。また、「Current Protocols in M
olecular Biology」（上記）は、中等度又は低度ストリンジェンシー条件のため
の洗浄条件をどのように決定するかについて記載している。洗浄は、通常、ハイ
ブリッドの相補性の最低レベルを決定する条件設定がなされる工程である。一般
に、相同ハイブリダイゼーションだけが起きる最も低い温度から開始して、最終
洗浄温度が１℃下がるごとに（ＳＳＣ濃度は一定に維持）、ハイブリダイズする
配列間のミスマッチの最大程度が１％上昇する。一般に、ＳＳＣの濃度を２倍に
すると、Ｔｍが−１７℃上昇する。これらの指標を用いると、目標とするミスマ
ッチのレベルに応じて、高度、中等度、又は低度ストリンジェンシーのための洗
浄温度を決定することができる。たとえば、本発明においては、遺伝子の非コー
ド（５’及び３’非翻訳）領域が変化すると、遺伝子の野生型のバージョンを検
出するのに用いられる条件とは異なるストリンジェンシー条件を、修飾されるヌ
クレオチドの数に応じて低度〜中等度〜高度まで変化させる必要がある。それに
応じて、塩濃度と温度を適宜調節する。

【００２８】本明細書で使用する場合、組換え発現ベクターという用語は、本発明の融合タ
ンパク質をコードするＤＮＡを増幅するか発現させるために用いられる複製可能
なＤＮＡ構築物をいう。該組換え発現ベクターは、（１) たとえばプロモーター
やエンハンサーなどの遺伝子発現において調節の役割を有する１又は複数の遺伝
要素；（２）ｍＲＮＡに転写され、タンパク質に翻訳される構造配列又はコード
配列；及び（３）適当な転写配列、翻訳開始配列、及び翻訳終止配列の集合体か
ら成る転写ユニットを含んでいる。酵母発現系における使用を目的とする構造要
素は、宿主細胞による翻訳タンパク質の細胞外分泌を可能にするリーダー配列を
含んでいることが好ましい。あるいは、組換えタンパク質がリーダー配列又は輸
送配列なしに発現される場合、Ｎ末端メチオニン残基を含んでいてもよい。この
残基は、後で、任意に発現された組換えタンパク質から切り出して、最終産物を
得てもよい。

【００２９】融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列は、組換えＤＮＡ技術を用いて、タン
パク質をコードする別個のＤＮＡ断片を１つの適当な発現ベクター中に組み込む
ことにより、構築される。たとえば、あるタンパク質をコードするＤＮＡ分子の
３’末端を、同一又は実質的に同様のタンパク質をコードする別のＤＮＡ分子の
５’末端に連結させるが、当該配列のリーディングフレームは、その配列が単一
の生物学的活性融合タンパク質へとｍＲＮＡ翻訳され得る段階にあるものとする
。ＤＮＡ分子は、タンデム状態で連結される、すなわち次々に連続的に連結され
る。ＤＮＡのｍＲＮＡへの転写に応答する調節要素は、２つのＤＮＡ配列の第１
のものに保持され、第２のＤＮＡ配列へのリードスルーを防止する結合シグナル
すなわち終止コドンが除去される。逆に、調節要素は、第２のＤＮＡ配列から除
去され、翻訳を終止させるのに必要な終止コドンが保持される。

【００３０】本明細書で説明するように、好ましくは１又は複数のリンカー配列を介して、
タンパク質分子を連結させる手段が提供される。１又は複数のリンカー配列は、
各タンパク質分子が二次及び三次構造へと正しく折り重なるのを確実にするのに
十分な距離を隔てて、タンパク質分子を分離する。適当なリンカー配列は、（１
）生物学的活性が増大した融合タンパク質を生成するのに適したコンホメーショ
ンを有し、（２）タンパク質分子の生物学的機能を阻害しうる整った二次構造を
示さず、（３）ＥＰＯ分子の生物学的機能を阻害しうる疎水性や帯電性を最小限
度有しているものである。たとえば、適当なリンカーは、タンパク質成分が相互
作用して、生物学的活性が増大した融合タンパク質を生成する。リンカーコンホ
メーションは、生物学的活性を増大させるのに必要な融合体の最終コンホメーシ
ョンに応じて、可変してもよいし、固定してもよい。より固定したリンカーの具
体例としては、連結されたタンパク質成分の自由回転を起こさせないα−ヘリッ
クス構造を有するリンカーが挙げられる。可変するタンパク質領域中の代表的な
表面アミノ酸としては、グリシン（Ｇｌｙ) 、アスパラギン（Ａｓｎ) 、及びセ
リン（Ｓｅｒ) が挙げられる。グリシン（Ｇｌｙ) 、アスパラギン（Ａｓｎ) 、
及びセリン（Ｓｅｒ) を含むアミノ酸配列であれば、実質的にどのような組み合
わせのものであっても、リンカー配列に関する上記基準を満たすものと思われる
。スレオニン（Ｔｈｒ）やアラニン（Ａｌａ）など他の中性に近いアミノ酸も、
リンカー配列に使用してもよい。

【００３１】リンカー配列の長さは、融合タンパク質の生物学的活性に対して有意に影響を
及ぼすことなく、変化させることができる。一般に、たとえばＥＰＯなどのタン
パク質の分子は、アミノ酸約１０個ないし約２０個分の長さを有するリンカー配
列によって分離されるが、より長いリンカー配列を使用してもよく、たとえば全
長ポリペプチドがリンカーを構成してもよい。本発明の最も好ましい態様におい
ては、リンカー配列は、長さがアミノ酸約１５個分のものである。リンカー配列
は、実施例１に従い、自体公知の方法によって融合タンパク質に導入される。

【００３２】１つの態様においては、本明細書で説明する融合タンパク質は、治療活性を有
する野生型( たとえば天然) タンパク質から成る。本明細書で定義する治療活性
とは、融合タンパク質が哺乳動物に投与されたときに、その哺乳動物について治
療しようとする欠陥症又は病態をある程度軽減するか、除去する能力をいう。具
体的には、サイトカイン、成長因子、及びたとえば単数又は複数の適当な参照文
献を付記した下記パラグラフに挙げた特定のタンパク質を含むホルモンが本発明
の対象となる。本明細書に示すこれらの参照文献は、標準的な常法を用いるサイ
トカインの製造、精製、及び生物学的活性評価のための指針を提供する。本発明
のタンパク質多量体の作製に適したサイトカイン（たとえばＥＰＯ) のタンパク
質分子をコードする核酸配列は、当該分野において公知であり、たとえばＥＭＢ
Ｌ/ ＧｅｎＢａｎｋデータベースから容易に得ることができる。下記パラグラフ
中の参照文献はそれぞれ、その全内容が参照により本明細書に取り込まれる。

【００３３】インターフェロン−α: Henco, K.ら, J. Mol. Biol., 185: 227-260 (1985)
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【００３４】インターフェロン−β: "Human Cytokines: Handbook for Basic and Clinic
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【００３５】インターフェロン−γ: Gray, P.W. ら, Nature, 298:859-863 (1982)。 Rin
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【００７２】エンドスタチン: O'Reilly, M.S. ら, Cell, 88:277-285 (1997) 。

【００７３】アンジオスタチン： O'Reilly, M.S. ら, Cell, 79:315-328 (1994) 。

【００７４】本明細書で説明する天然タンパク質の生物学的活性断片、アナログ、変異体、
変化体又は誘導体を含む融合タンパク質も本発明に包含される。本明細書におい
ては、該天然タンパク質の生物学的活性断片、誘導体、アナログ、変化体、及び
変異体も、該天然タンパク質と実質的に同様のタンパク質であるものといえるが
、天然タンパク質の断片、アナログ、変異体、変化体、又は誘導体の生物学的活
性のレベルは、天然タンパク質（本明細書では、親タンパク質ということもある
）の活性と同一である必要はない。たとえば、サイトカインタンパク質の断片は
、天然サイトカインの活性の５０〜８０％しか示さないが、同一であるか互いに
異なるものであるかを問わず２つ以上のサイトカインが連結されて融合タンパク
質を形成するため、その融合タンパク質は、天然サイトカインの単量体と比べて
生物学的活性が増大する。生物学的活性を決定する試験法は、当業者にとって公
知であり、たとえば造血、血小板産生、受容体結合、血管新生、免疫刺激、又は
免疫抑制の程度を測定する方法が挙げられる。たとえば、エリトロポエチンの変
異体の生物学的活性は、米国特許第５，６１４，１８４号明細書及び５，５８０
，８５３号明細書に記載のインビトロ及びインビボのアッセイを用いて、測定す
ることができる。これらの教示は、参照によりすべて本明細書に取り込まれる。

【００７５】 Sytkowski ら、（米国特許第５，６１４，１８４号明細書(1997)）及び実施例
４で詳細に説明されているように、ＥＰＯ融合タンパク質の生物学的活性は、既
定のKrystal のインビトロバイオアッセイ（Exp. Hematol. 11:649-660 (1983）
を用いて、決定することができる。Krystal のアッセイは、無傷のマウス脾臓細
胞に及ぼすＥＰＯの影響を測定するものである。次いで，ＥＰＯ融合タンパク質
によって刺激された赤血球産生を、³Ｈ- チミジンの取り込みによりモニターし
、競合的放射免疫測定法( ＲＩＡ) 又は固相酵素免疫測定法( ＥＬＩＳＡ) によ
り定量する。ＥＰＯ融合タンパク質の比活性は、世界保健機関二級国際基準製剤
(the World Health Organization Second International Reference Preparatio
n)を基準とする国際単位を、ＲＩＡ又はＥＬＩＳＡにより測定されたタンパク質
のマイクログラム数で割った比率として示す。対照として、ＥＰＯ単量体のイン
ビトロ生物学的活性を、ＥＰＯ融合タンパク質と平行して測定する。ＥＰＯ- Ｅ
ＰＯ二量体は、単量体タンパク質と比べて、約８倍高い生物学的活性を示した。

【００７６】ＥＰＯ融合タンパク質の生物学的活性は、実施例５で説明するように、Sytkow
ski A.T.らの方法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:1184-1188 (1998)）に従い
、インビボアッセイを用いて評価することもできる。すなわち、ＥＰＯ多量体（
たとえば３００ＩＵ/ ｋｇ）をマウスに注射し、処置前( Ｐｒｅ) 又は処置後（
Ｐｏｓｔ）に得られた血液試料中のヘマトクリットを測定する。ＥＰＯ多量体は
、１日目、３日目、及び５日目に投与し、ヘマトクリットは８日目に測定する。
上記にさらに加えて、又は上記に代えて、１日目にマウスにＥＰＯ多量体の単回
注射を行い、注射後７日目、すなわちアッセイ８日目にヘマトクリットを測定す
ることもできる。

【００７７】Ｆｉｇｕｒｅ１７Ａ〜１７Ｃ及び実施例５に示すように、３００ＩＵ/ ｋｇの
二量体ＥＰＯ^wt- ＥＰＯ^wtを単回注射すると、野生型単量体を注射した動物と比
べて、平均ヘマトクリットが上昇する。したがって、ＥＰＯ- ＥＰＯ二量体処理
したマウスのヘマトクリットは、単量体処理した動物と異なり、８日目でも上昇
した状態のままであった。すなわち、二量体化エリトロポエチンの半減期とイン
ビボ活性が増大したことになる。本明細書で説明する融合タンパク質に関するこ
れらのインビボのデータは、活性が強化され、半減期が延長した生物学的に有効
な融合タンパク質の生成を証拠立てる上で、重要である。ＥＰＯ- ＥＰＯ二量体
に見られたインビトロ及びインビボ生物活性の上昇は、２個のＥＰＯ分子から予
想された活性より予想外に有意に大きい。実際、たとえば臨床現場におけるポリ
ペプチドの皮下投与回数を減らしても、治療効果を得ることができる。

【００７８】本発明はまた、天然のタンパク質のグリコシル化を伴う融合タンパク質とグリ
コシル化を伴わない融合タンパク質を提供する。非グリコシル化融合タンパク質
は、タンパク質分子をグリコシル化しない大腸菌などの宿主細胞中で、核酸構築
物から発現されうる。上記に代えて、又は上記以外に、オリゴヌクレオチド合成
やライゲーション又は部位特異的変異誘発法などの常法により、本発明の融合タ
ンパク質をコードする核酸構築物を、不活性化Ｎ−グリコシル化部位を有する変
異体アナログをコードするように、選択的に修飾することができる（実施例６参
照）。これらのアナログタンパク質は、酵母発現系を用いて、均一で還元された
炭水化物形態で収量よく製造することができる。真核生物のタンパク質中のＮ−
グリコシル化部位は、アミノ酸トリプレットＡｓｎ- Ａ₁- Ｚにより、キャラク
タライズすることができる（式中、Ａ₁はプロリン( Ｐｒｏ) を除くアミノ酸で
あり、Ｚはセリン (Ｓｅｒ) 又はトレオニン（Ｔｈｒ）である）。この配列にお
いては、アスパラギンが炭水化物の共有吸着のための側鎖アミノ基を提供する。
かかる部位は、別のアミノ酸をアスパラギン (Ａｓｎ) 又は残基Ｚに置換するか
、アスパラギン (Ａｓｎ) 又はＺを欠失させるか、Ａ₁とＺの間にＺ以外のアミ
ノ酸又はアスパラギン (Ａｓｎ) とＡ₁の間にアスパラギン (Ａｓｎ) 以外のア
ミノ酸を挿入することにより、除去することができる。

【００７９】野生型タンパク質分子以外に、少なくとも１個以上さらに別のグリコシル化部
位（たとえばＮ結合又はＯ結合のもの）を有するタンパク質分子を含む融合タン
パク質も本発明の対象である。該タンパク質分子は、たとえば循環半減期を増大
させたＮＥＳＰなどの新規赤血球産生刺激タンパク質分子であってもよい（Egri
e, J. ら、Blood 90:56a (1997) ；Furst, I. 、Nature Biotechnology 15:940
(1997)）。ＮＥＳＰの場合、たとえば６９位のロイシン又は１２５位のアラニン
（又は両者）をアスパラギン残基と置換することにより；もしくはそれに加えて
、又はそれに代わって、１２７位のアラニンをセリン残基と置換することにより
、本明細書の説明に従い、さらに別のＮ結合部位を得ることができる。同様に、
１２３位又は１２５位のアラニンがトレオニン残基又はセリン残基と置換されて
いるさらに別のＯ結合グリコシル化部位を作製することができる。グリコシル化
は、プロリン残基を、グリコシル化部位に関して−１及び／又は＋１の位置に配
置することにより、さらに強化することができる（たとえば１２５位のトレオニ
ン残基のグリコシル化は、プロリンが１２４位又は１２６位のいずれかに存在す
る場合に強化される）（Elliott, S. ら、Biochemistry 33:11237 (1994)）。さ
らに、上記グリコシル化部位の組み合わせはいずれも、本発明の範囲に含まれる
ものとする。

【００８０】融合タンパク質の変異により、誘導体やアナログを得ることができる。本明細
書でいう誘導体又はアナログは、欠失、挿入、及び/ 又は置換の原因となる１つ
以上のアミノ酸配列の違いを有するという点を除いて、野生型（又は天然タンパ
ク質）の全長配列と配列同一性又は類似性を共有するアミノ酸配列を含むポリペ
プチドである。本発明の融合タンパク質を含むタンパク質分子の誘導体又はアナ
ログの配列は、たとえばBasic Local Alignment Search Tool （ＢＬＡＳＴ）（
Altschul, S.F. et al. ，J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)）やＦＡＳＴＡ（
Pearson, W.R. et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444-2448 (1988)
）アルゴリズムなど、当該分野において公知のデータベース検索法を用いて、決
定することができる。

【００８１】タンパク質の生理活性同等アナログは、たとえば残基又は配列の様々な置換を
作成することにより、構築することができる。たとえば、システイン残基を欠失
させたり、他のアミノ酸と置換して、再生の際の不正確な分子内ジスルフィド架
橋形成を防止することができる。他の変異誘発アプローチでは、隣接する二塩基
アミノ酸残基を修飾して、ＫＥＸ２プロテアーゼ活性が存在する酵母系における
発現を強化させる。一般に、置換は保存的に行われるべきである；すなわち、最
も好ましい置換アミノ酸は、置換しようとする残基の物理化学的性質に似た性質
を有するアミノ酸である。同様に、欠失又は挿入方式を採用する場合、その欠失
又は挿入が生物学的活性に及ぼす可能性がある影響を考慮しなければならない。
遺伝コードの縮重のため、同じアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列も顕
著な変化が存在し得る。したがって、本発明の融合タンパク質、本明細書で説明
する融合タンパク質を含むタンパク質分子の生理活性同等アナログ又は誘導体を
コードする核酸構築物を改変し、同じアミノ酸をコードするコドンを生成させる
ことができる。たとえば、アミノ酸アラニンは、ヌクレオチドトリプレットＧＣ
Ａ又はＧＣＣ又はＧＣＧ又はＧＣＵによってコードされる。このことは、選ばれ
た宿主細胞にとって特定のコドンが好ましい組換え技術による融合タンパク質の
製造に有利に働きうる。

【００８２】アナログの発現のために構築されたヌクレオチド配列の変異は言うまでもなく
、コード配列のリーディングフレーム部分（ｐｈａｓｅ）を保存するものでなけ
ればならず、ハイブリダイズして、ｍＲＮＡの翻訳に悪影響を及ぼすループやヘ
アピンなどの二次ｍＲＮＡ構造を生成する可能性のある相補的領域を生じないこ
とが好ましい。あるいは、変異は、翻訳効率を高める二次構造を導入しうる。変
異部位はあらかじめ決めておくことができるが、変異自体の性質はあらかじめ決
めておく必要はない。たとえば、特定の部位における変異体の最適特性を選択す
るために、標的コドンにおいてランダム変異誘発を行い、発現された変異体を所
望の活性についてのスクリーニングに付してもよい。

【００８３】変異は、天然の配列断片へのライゲーションを可能にする制限酵素部位によっ
てフランキングされた変異体配列を含むオリゴヌクレオチドを合成することによ
り、特定の遺伝子座に導入することができる。ライゲーションの後で、生じた再
構築配列は、所望のアミノ酸挿入、置換、又は欠失を有するアナログをコードす
る。あるいは、オリゴヌクレオチド特異的部位特異的変異誘発法( 実施例６参照
のこと) を用いて、必要な置換、欠失、又は挿入に応じて改変させた特定のコド
ンを有する改変遺伝子を提供することができる。融合タンパク質を含むタンパク
質分子の活性部位又はそこから距離を隔てた場所におけるアミノ酸を含む、保存
及び/ 又は非保存アミノ酸を修飾することができる。本明細書で説明する改変を
作成する方法の具体例については、Walder et al. ，（Gene 42:133, 1986 ）；
Bauer et al.，（Gene 37:73, 1985）；Craik ，（BioTechniques, January 198
5, 12-19）；Smith et al.，（Genetic Engineering: Principles and Methods,
Plenum Press, 1981 ）；及び米国特許第４，５１８，５８４号明細書及び４，
７３７，４６２号明細書に開示されているが、これらについても参照により本明
細書中に取り込まれる。かかる技術は、慣用のもので、当該分野で認知されてお
り、当業者にとって公知である。一般に、本明細書で説明する改変を作成する市
販キットを利用することができる。

【００８４】変異は、融合タンパク質を含む１つ以上のタンパク質分子に存在することがで
きる。特に、本発明は、二量体のＥＰＯドメインの少なくとも１つにおいて、１
０３位のアルギニンがアラニンで置換されているＥＰＯのコード領域におけるＲ
１０３Ａ変異を含むＥＰＯ融合タンパク質の変異体を包含する( 実施例７参照の
こと）。かかる変異は、変異体二量体融合タンパク質をコードするｍＲＮＡの安
定性を増大させることで、融合タンパク質の分泌を増大させるため、本明細書で
説明する組換え法を用いた融合タンパク質の製造収量を増大させるための有用な
方法、ならびに有用なインビボ治療法を提供することができる。本発明の融合タ
ンパク質を含むＥＰＯタンパク質分子における他の変異も行うことができる。た
とえば、１０１位のグリシン残基をアラニンなど別のアミノ酸で置換すると、Ｅ
ＰＯ単量体の生物学的活性が増大するが、この変異も、ＥＰＯタンパク質分子に
導入することができる。

【００８５】本発明の融合タンパク質のタンパク質分子を含む他のＥＰＯ変異体は、たとえ
ば、Elliott et al.，（Biochemistry 33:11237 (1994)）に従い、製造すること
ができる。たとえば、Elliott et al.は、ＥＰＯの残基２１〜４４；５２〜９５
；１０９〜１４０；及び１６３〜１６６内における部位特異的変異誘発によって
は、生物学的活性が変化しないことを示している。したがって、これらの変異を
有するＥＰＯ変異体タンパク質分子を含む融合タンパク質は、本発明の範囲に含
まれる。

【００８６】生物学的活性が増大した（たとえばヘマトクリット値が上昇したり、タンパク
質又はｍＲＮＡ半減期が延長した）融合タンパク質（たとえばＥＰＯ^WT-Ｌ- ＥＰＯ^WT、ＥＰＯ^WT-Ｌ-ＥＰＯ^R103A、ＥＰＯ^R103A-ＥＰＯ^WT、ＥＰＯ^R103A-ＥＰＯ^R103A）及び本発明の融合タンパク質を含むタンパク質分子( たとえばＥＰＯ)
に基づくペプチドミメティックス（タンパク質分子ではないが、生物学的活性を仲介する構造特性を模倣する分子）も、本発明の範囲内に含まれる。たとえば
、本発明の融合タンパク質及びタンパク質分子と同じ官能基を有し、同様に標的
細胞と相互作用を示すか、生物学的活性を仲介する多糖を調製することができる
。ペプチドミメティックスは、たとえば標的細胞にすでに結合しているか、いず
れ結合するであろう環境中で、タンパク質分子の三次元構造を確立することによ
って、設計することができる。

【００８７】本発明のタンパク質分子は、天然アミノ酸（たとえばＬ- アミノ酸）、非天然
アミノ酸( たとえばＤ- アミノ酸) 、及び本明細書で説明するタンパク質分子ア
ナログ、誘導体、又はミメティックスなどタンパク質分子を生物学的に模倣する
小分子を含んでよい。本発明のタンパク質分子及びペプチドミメティックスは、
直鎖状又は環状コンホメーションのものであってよい。

【００８８】本発明のタンパク質分子及び融合タンパク質は、２０個の天然アミノ酸又はそ
の他の合成アミノ酸を含んでよい。本発明に包含される合成アミノ酸としては、
たとえばナフチルアラニン、Ｌ- ヒドロキシプロピルグリシン、Ｌ- ３，４- ジ
ヒドロキシフェニルアラニル、Ｌ- α- ヒドロキシリジル及びＤ- α- メチルア
ラニルなどのα- アミノ酸、Ｌ- α- メチル−アラニル、β- アナリンなどのβ
- アミノ酸、及びイソキノリルが挙げられる。

【００８９】Ｄ- アミノ酸及びその他の非天然合成アミノ酸も、本発明のタンパク質分子及
び融合タンパク質に組み込むことができる。かかるその他の非天然合成アミノ酸
としては、２０個の遺伝的にコード化されるアミノ酸（又はあらゆるＬ又はＤア
ミノ酸）の天然側鎖が他の側鎖、たとえばアルキル、低級アルキル、環状アルキ
ル、アミド、ヒドロキシ、カルボキシ、低級アルキルカルボン酸エステル、スル
ホン酸、低級アルキルスルホン酸エステル、又はリン酸又はそのエステルなどの
基で置換されているものが挙げられる。

【００９０】これらのペプチドミメティックスは、対応するタンパク質分子( たとえばＥＰ
Ｏ) 又は融合タンパク質（たとえばＥＰＯ^WT-Ｌ-ＥＰＯ^WT、ＥＰＯ^WT-Ｌ- ＥＰＯ^R103A、ＥＰＯ^R103A-ＥＰＯ^WT、ＥＰＯ^R103A-ＥＰＯ^R103A）の生物学的活性よ
り低いか、同等か、高い生物学的活性( たとえば造血刺激) を有するが、下記特
性；可溶性、安定性、及び加水分解又はタンパク質分解感受性の１つ以上のもの
について、対応するタンパク質より「生物学的有利性」を有しうる。

【００９１】ペプチドミメティックスを調製する方法としては、Ｎ末端アミノ基、Ｃ末端カ
ルボキシル基の修飾及び/ 又はペプチド中のアミノ結合の１つ以上のものの非ア
ミノ結合への変化が挙げられる。ペプチドを修飾して、ペプチドミメティックス
を製造する方法については、米国特許第５，６４３，８７３号明細書及び５，６
５４，２７６号明細書に開示されているが、これらの教示は参照により本明細書
中に取り込まれる。タンパク質分子及び融合タンパク質は、環状ペプチドミメテ
ィックスであってもよい。そのような環状試験物質は、公知の実験手法( たとえ
ば米国特許第５，６５４，２７６号明細書に開示されているもの；それらの教示
は、参照によりすべて本明細書中に取り込まれる) を用いて製造することができ
る。

【００９２】これらのペプチドミメティック化合物は、当該分野において公知かつ認知され
ている方法によって製造することができる。ペプチドミメティックスの適切な化
学合成経路の決定は、特定のタンパク質分子及び融合タンパク質によって決まり
、慣用の技術をもって一般に容易に認められる。

【００９３】たとえば、タンパク質分子中の塩基性アミノ酸のペプチドミメティックを設計
する場合、適当な窒素含有基としては、アミン、アンモニウム、グアニジン、及
びアミド又はホスホニウムが挙げられ；又はタンパク質分子中の酸性アミノ酸の
ペプチドミメティックを設計する場合、カルボキシル、低級アルキルカルボン酸
エステル、スルホン酸、低級アルキルスルホン酸エステル、又はリン酸又はその
エステルを使用することができる。ペプチド結合の窒素は、酸素又は硫黄で置換
して、ポリエステル骨格を形成させてもよい。同様に、ペプチド結合のカルボニ
ルは、スルホニル基又はスルホニル基で置換して、ポリアミドを形成させてもよ
い。タンパク質分子の逆アミド（reverse amides）を作成することもできる( た
とえば- ＮＨＣＯ- 基に１つ以上の- ＣＯＮＨ- 基を置換させる) 。また、ペプ
チド骨格は、ポリシラン骨格で置換することができる。

【００９４】別の態様においては、本明細書で説明する融合タンパク質は、野生型遺伝子の
５’及び/ 又は３’非コード領域を修飾することによって製造した変化体型タン
パク質を含む。以下、これらの分子を指す場合、組換え変化体タンパク質という
用語を用いる。これらの組換え変化体タンパク質は、生物学的活性を改変させた
ものであってよい。

【００９５】融合タンパク質を含む各タンパク質は、それ自体が、野生型タンパク質の活性
と比べて、改変された生物学的活性を有することができる。本明細書では、改変
された生物学的活性とは、野生型又は組換えタンパク質の活性とは異なる活性で
あると定義する。たとえば、ＥＰＯの活性は、赤血球前駆細胞の成長と分化を調
節することである。組換えＥＰＯ変化体タンパク質は、野生型ＥＰＯと比べて、
赤血球前駆細胞の成長と分化を調節する活性が増大していることがある。あるい
は、遺伝子の非コード領域（たとえば３’及び５’非翻訳領域）中に変異を有す
るＥＰＯ変化体タンパク質は、野生型ＥＰＯと比べて、生物学的活性が低下して
いる場合がある。

【００９６】遺伝子の非コード領域（たとえば５’非翻訳領域すなわちＵＴＲ）中の変異は
、たとえば、Schultz, D.E. et al.，J. Virol. 70:1041-1049, 1996；Kozak, M
. ，J. Mol. Biol. 235:95-110, 1994；及びKozak, M. ，J. Biol. Chem. 266:1
9867-19870, 1991のように、ＲＮＡ翻訳の違いを生じることがある。たとえば、
実施例４で詳細に説明するように、コンピューターモデリングを利用して、ＥＰ
Ｏ遺伝子の３’及び５’ＵＴＲ中のヌクレオチド変化に伴うＲＮＡ二次構造（た
とえばループや塩基対の自由エネルギー）の違いを予測することができる。５’
又は３’ＵＴＲ中の変異に伴うＥＰＯＲＮＡの二次構造変化を具体例として挙
げることができるが、本明細書で説明する本発明は、あらゆる適当なポリペプチ
ド変化体タンパク質の製造に用いることができるものと解される。本明細書で使
用する場合、変異という用語は、ポリペプチドをコードする核酸配列におけるあ
らゆる変化( たとえば点変異、１つ以上のヌクレオチドの付加、欠失、及び/ 又
は置換) をいう。

【００９７】二次構造は、いくつかのタンパク質の翻訳効率速度を決定する上で重要な要素
であることが示されている（Bettany, A.J. et al.，J. Biol. Chem. 267:16531
-16537, 1992；Kozak, M. ，J. Mol. Biol. 235:95-110, 1994）。翻訳速度が変
化すると、たとえばグリコシル化パターン、さらには生じたタンパク質が正しく
折りたたまれて、タンパク質の化学的性質、構造、及び機能の変化をもたらすと
いった翻訳後修飾に影響が及ぶことがある。本明細書で説明する組換え変化体タ
ンパク質は、遺伝子の５’及び３’非翻訳( 非コード) 領域中の変異により製造
される融合タンパク質を含むという点に特徴を有する。

【００９８】本発明はまた、哺乳動物、微生物、ウイルス、又は昆虫の遺伝子に由来する適
当な転写又は翻訳調節要素に作動可能に連結させた２つ以上の連結タンパク質を
コードするＤＮＡを含む融合タンパク質をコードする合成又はｃＤＮＡ由来ＤＮ
Ａ断片を含む組換え発現ベクターを提供する。以下詳細に説明するように、かか
る調節要素としては、転写プロモーター、転写を制御する任意のオペレーター配
列、適当なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、及び転写と翻訳の終
止を制御する配列が挙げられる。さらに、通常は複製起点によって付与される宿
主中で複製する能力、及び形質転換体を認知しやすくする選択遺伝子も組み込む
ことができる。作動可能に連結させたとは、融合タンパク質をコードするＤＮＡ
の発現が調節要素によって制御されるように、成分が連結されていることをいう
。一般に、作動可能に連結させたとは連続的であることを意味する。

【００９９】形質転換された宿主細胞は、感染的又は非感染的方法により融合タンパク質ベ
クターが導入された細胞である。通常、形質転換宿主細胞は、所望の融合タンパ
ク質を発現するが、ＤＮＡのクローニング又は増幅の目的で形質転換された細胞
は、タンパク質を発現しなくてもよい。真核細胞においては、発現された融合タ
ンパク質は、培養上清中に分泌されるのが普通である。原核細胞においては、融
合タンパク質は、ペリプラズムスペース内に、すなわち不溶性封入体として、発
現される。融合タンパク質の発現に適した宿主細胞としては、適当なプロモータ
ーの制御下にある原核生物、酵母、又は高等真核細胞が挙げられる。原核生物と
しては、たとえば大腸菌などのグラム陰性又はグラム陽性微生物が挙げられる。
高等真核細胞としては、以下に説明する哺乳動物起源の樹立細胞株が挙げられる
。無細胞翻訳系を利用して、本発明のＤＮＡ構築物由来のＲＮＡを用いた融合タ
ンパク質の製造を行うこともできる。細菌、真菌、酵母及び哺乳動物細胞宿主と
組み合わせて用いる適当なクローニング及び発現ベクターについては、Pouwels
et al.，「Cloning Vectors: A Laboratory Manual」, Elsevier, NY, 1985；Sa
mbrook et al. ，「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」, Second Editi
on (1989) ；及びAusubel, F.M. et al.，「Current Protocols in Molecular B
iology」, John Wiley & Sons, Inc. (1997)に記載されているが、それらは参照
によりすべて本明細書中に取り込まれる。かかる手法には、当業者は精通してい
るであろう。

【０１００】原核細胞発現ベクターは通常、たとえば抗生物質耐性を付与したり、独立栄養
要求性を提供するタンパク質をコードする遺伝子など１つ以上の表現型選択マー
カーと、宿主内の増幅を保証する宿主によって認識される複製起点を含む。形質
転換に適した原核生物宿主としては、大腸菌、枯草菌（Bacillus subtilis)、ネ
ズミチフス菌(Salmonella typhimurium)、及びシュードモナス（Pseudomonas ）
、ストレプトミセス（Streptomyces）、及びスタフィロコッカス（Staphylococc
us）に属する様々な種が挙げられるが、これら以外のものも、選択対象とするこ
とができる。

【０１０１】細菌と組み合わせて使用するのに有用な発現ベクターは、公知のクローニング
ベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）の遺伝要素を含む市販プラスミド
由来の選択可能マーカーと細菌複製起点とを含んでよい。そのような市販ベクタ
ーとしては、たとえばｐＫＫ２２３- ３（Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala,
Sweden ）及びｐＧＥＭ１（Promega Biotech, Madison, WI）が挙げられる。こ
れらのｐＢＲ３２２「骨格」部分を、適当なプロモーター及び発現させようとす
る構造配列と結合させる。大腸菌は通常、大腸菌の１種に由来するプラスミドで
あるｐＢＲ３２２の誘導体を用いて、形質転換される（Bolivar et al.，Gene 2
:95, 1977 ）。ｐＢＲ３２２は、アンピシリン及びテトラサイクリン耐性遺伝子
を含んでいるため、簡便な形質転換細胞同定手段が提供される。

【０１０２】組換え微生物発現ベクターにおいてよく用いられるプロモーターとしては、ブ
ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）及びラクトースプロモーター系（Chang et al.
，Nature 275:615, 1978；及びGoeddel et al.，Nature 281:544, 1979）、トリ
プトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Goeddel et al.，Nucleic Acids Res. 8
:4057, 1980 ）、及びｔａｃプロモーター（Sambrook et al. ，「Molecular Cl
oning: A Laboratory Manual」, 1989）が挙げられる。

【０１０３】組換え融合タンパク質はまた、好ましくはS.セレビシエ（cerevisiae ）などのサッカロミセス（Saccharomyces ）種に由来する酵母宿主中で発現させること
もできる。ピフィア（Pichia）やクライベロミセス（Kluyveromyces ）など他の
属の酵母も、利用することができる。酵母ベクターは一般に、酵母プラスミド由
来の複製起点、又は自己複製配列( ＡＲＳ) 、プロモーター、融合タンパク質を
コードするＤＮＡ、ポリアデニル化及び転写終止のための配列、及び選択遺伝子
を含む。酵母ベクターは、たとえば大腸菌のアンピシリン耐性遺伝子やトリプト
ファン中で生育する能力を欠く酵母の突然変異株に選択マーカを提供するS.セレ
ビシエｔｒｐ１遺伝子など、酵母と大腸菌の両者の形質転換を可能にする複製起
点及び選択可能マーカー、ならびに下流側の構造配列の転写を誘導する高度発現
酵母遺伝子由来プロモーターを含む。酵母宿主細胞ゲノム中にｔｒｐ１障害が存
在すると、トリプトファン非存在下での生育による形質転換検出のために効果的
な環境が提供される。

【０１０４】酵母ベクターに適したプロモーター配列としては、メタロチオネイン、３- ホ
スホグリセレートキナーゼ（Hitzeman et al. ，J. Biol. Chem. 255:2073, 198
0 ）、又はエノラーゼ、グリセルアルデヒド- ３- ホスフェートデヒドロゲナー
ゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ
、グルコース−６- ホスフェートイソメラーゼ、３- ホスホグリセレートムター
ゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイ
ソメラーゼ、及びグルコキナーゼなどその他の糖分解酵素(Hess et al.，J. Adv
. Enzyme Reg. 7:149, 1968 ；及びHolland et al.，Biochem. 17:4900, 1978）
のプロモーターが挙げられる。酵母発現における使用に適したベクター及びプロ
モーターについては、R. Hitzeman et al.，ＥＰＡ７３，６５７にさらに詳細に
記載されている。

【０１０５】好ましい酵母ベクターは、大腸菌における選択及び複製のためのｐＢＲ３２２
由来ＤＮＡ配列（Ａｍｐ遺伝子及び複製起点）を用いて構築することができ、異
種タンパク質の分泌をつかさどるグルコース抑制ＡＤＨ２プロモーター及びα-
因子リーダーを含む酵母ＤＮＡ配列を、プロモーターと発現しようとする構造遺
伝子の間に挿入することができる（Kurjan et al. ，Cell 30:933, 1982 ；及び
Bitter et al. ，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:5330, 1984）。リーダー配列
は、３’末端付近に１つ以上の有用な制限酵素部位を含むように修飾して、その
リーダー配列の外来遺伝子への融合を促進させてもよい。

【０１０６】適当な酵母形質転換プロトコルは、当業者にとって公知であり、具体的技術と
して、０. ６７％の酵母窒素ベース、０. ５％のカザミノ酸、２％のグルコース
、１０μｇ/ ｍｌのアラニンと２０μｇ/ ｍｌのウラシルから成る選択培地中で
Ｔｒｐ+ 形質転換体を選択することが、Hinnen et al. ，Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA 75:1929, 1978に記載されている。

【０１０７】ＡＤＨ２プロモーターを含むベクターによって形質転換された宿主株は、１％
の酵母抽出物、２％のペプトン及び８０μｇ/ ｍｌのアデニンと８０μｇ/ ｍｌ
のウラシルを加えた１％のグルコースとから成る強化培地中で培養し、発現させ
てよい。培地グルコースが消耗すると、ＡＤＨ２プロモーターの脱抑制が起きる
。濾過により、粗酵母上清を集め、４℃に保ち、さらに精製する。様々な哺乳動
物又は昆虫の培養細胞系を利用して、組換えタンパク質を発現させることができ
る。昆虫細胞中での異種タンパク質を製造するためのバキュロウイルス系につい
ては、Luckow and Summers，Bio/Technology 6:47, 1988 に概説されている。

【０１０８】適当な哺乳動物宿主細胞系の具体例としては、Gluzman ，（Cell 23:175, 198
1 ）に記載のあるサル腎臓細胞のＣＯＳ- ７系、及びたとえばＬ細胞、Ｃ１２７
細胞系、３Ｔ３細胞系、チャイニーズハムスター卵巣( ＣＨＯ) 細胞系、ＨｅＬ
ａ細胞系、及びＢＨＫ細胞系など、適当なベクターを発現しうるその他の細胞系
が挙げられる。哺乳動物発現ベクターは、複製起点、発現させようとする遺伝子
に連結させた適当なプロモーターとエンハンサー、及びその他の５’又は３’フ
ランキング非転写配列などの非転写要素と、必要なリボソーム結合部位、ポリ−
アデニル化部位、スプライスドナー及びアクセプター部位、及び転写終止配列な
どの５’から３’への非翻訳配列を含んでよい。

【０１０９】たとえば、ポリペプチド遺伝子の３’及び/ 又は５’ＵＴＲを修飾することに
よって創製した組換えポリペプチド変化体タンパク質をコードする変化体核酸分
子は、調節配列を含んでいることも好ましい。調節配列としては、プロモーター
配列、エンハンサー、リボソーム結合部位、及び転写結合部位など、転写と調節
を制御するすべてのシス作用要素が挙げられる。プロモーターの選択は通常、所
望のタンパク質発現経路によって決まる。たとえば、組換え真核細胞又は原核細
胞中でタンパク質を発現させようとする場合、選択されるプロモーターは、宿主
細胞によって認識される。使用に適したプロモーターとしては、構築物中に最初
に出現する結合部分のための天然のプロモーターが挙げられる。

【０１１０】核酸分子を含む要素は、たとえば上記参照文献の説明に従い、天然物から単離
してもよいし、天然の配列から修飾してもよいし、デノボで製造してもよい。次
いで，その要素を、和合性のあるクローニング部位又は制限酵素部位を利用及び
作成するなど、当該分野において公知の方法によって単離し、共に融合すること
ができる。

【０１１１】核酸分子は、発現される組換えポリペプチドの型に応じて異なる公知方法によ
り、任意に組換え宿主細胞に複製及び/ 又は統合しうる構築物中に挿入すること
ができる。宿主細胞は、真核細胞又は原核細胞であってよく、たとえばピフィア
発現系、酵母（サッカロミセス(Saccharomyces）など) 、細菌（エシェリキア（
Escherichia ）やバチルス（Bacillus）など）、昆虫（スポドプテラフルギペ
ルダ（Spodoptera frugiperda ））や哺乳動物細胞( ヒトの体細胞又は胚細胞、
チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＨｅＬａ細胞、ヒト２９３細胞、サル腎臓Ｃ
ＯＳ- ７細胞、新生ハムスター腎臓ＢＨＫ細胞、Ｃ１２７細胞など) を含む、動
物細胞又は組織が挙げられる。宿主細胞の選択は、起きる可能性のある翻訳後修
飾に影響する。たとえば、糖タンパク質は哺乳動物、昆虫、又は酵母細胞中で発
現させ得、一方、非グリコシル化タンパク質は細菌中で発現させることができる
。また、遺伝子の非コード領域における変異によって作成した組換えポリペプチ
ド変化体を発現させる場合、適当な宿主細胞の選択は異なっていてよい（Schult
z et al.，J. Virol. 70:1041-1049, 1996）。

【０１１２】核酸分子は、公知方法により、宿主細胞に組み込むか、挿入することができる
。細胞をトランスフェクト又は形質転換する方法として適当なものとしては、リ
ン酸カルシウム沈殿法、エレクトロポーレーション法、マイクロインジェクショ
ン法、感染法、リポフェクション法、及び直接取りこみ法が挙げられる。かかる
組換え宿主細胞の調製方法については、たとえばSambrook et al. ，「Molecula
r Cloning: A Laboratory Manual」 (1989) 及びAusubel et al.，「Current Pr
otocols in Molecular Biology」 (1995) などいくつかの技術書にさらに詳細な
記載がある。

【０１１３】次いで、宿主細胞を、組換えポリペプチドの発現と回収に適した条件下に保つ
。一般に、細胞は、その生育と１又は複数の遺伝子産物の発現に適した緩衝液及
び/ 又は生育培地又は栄養源中に保たれる。生育培地は当該分野において一般に
公知であり、炭素源、窒素源、及び硫黄源を含む。具体例としては、ダルベッコ
改変イーグル培地( ＤＭＥＭ) 、ＲＰＭＩ- １６４０、Ｍ１９９、及びグレース
の昆虫培地が挙げられる。緩衝液の選択は、本発明にとっては重要ではない。選
択可能なｐＨは通常、宿主細胞が忍容するか、その生育に最適なものである。

【０１１４】細胞は，適当な温度及び雰囲気条件下に保たれる。たとえば、好気性宿主細胞
は、好気的雰囲気条件下又はその他の生育に適した条件下に保たれる。温度も、
宿主細胞がプロセスを忍容するように選択すべきであり、たとえば約２７℃から
４０℃の間に設定することができる。

【０１１５】脊椎動物細胞の形質転換に使用する発現ベクターにおける転写及び翻訳制御配
列は、ウイルス源により提供してよい。たとえば、よく使用されるプロモーター
及びエンハンサーは、ポリオーマ、アデノウイルス２、シミアンウイルス４０（
ＳＶ４０）、及びヒトサイトメガロウイルスに由来する。ＳＶ４０ウイルスゲノ
ム、例えば、ＳＶ４０起点、初期及び後期プロモーター、エンハンサー、スプラ
イス、及びポリアデニル化部位に由来するＤＮＡ配列を用いて、異種ＤＮＡ配列
の発現に必要な他の遺伝要素を提供することができる。初期及び後期プロモータ
ーは、どちらもＳＶ４０ウイルス起点又は複製を含む断片としてウイルスから容
易に得られるという理由で、とくに有用である（Fiers et al.，Nature 273:113
, 1978）。ＨｉｎｄＩＩＩ部位からウイルス起点又は複製に存在するＢｇＩＩ部
位へ向けて伸びている約２５０ｂｐの配列が含まれていれば、より小型又は大型
のＳＶ４０断片も用いることができる。代表的ベクターは、Okayama and Berg，
（Mol. cell. Biol. 3:280, 1983）の開示に従い構築することができる。

【０１１６】哺乳動物ＤＮＡの発現に好ましい真核生物ベクターとしては、ともにｐＢＣ１
０２. Ｋ２２（ＡＴＣＣ６７，２５５）に由来する酵母発現ベクターであって、
大腸菌（Ａｐｒ遺伝子及び複製起点）及び酵母における選択及び複製のためのｐ
ＢＲ３２２由来ＤＮＡ配列を含んでいるｐＩＸＹ３２１とｐＩＸＹ３４４が挙げ
られる。

【０１１７】精製哺乳動物融合タンパク質又はアナログは適当な宿主/ ベクター系を培養し
て、本発明のＤＮＡの組換え翻訳産物を発現させ、次いで培養培地又は細胞抽出
物から精製することによって、作成する。たとえば、培養培地に組換えタンパク
質を分泌する系から得た上清を、たとえばアミコン（Amicon）又はミリポアペリ
コン（Millipore Pellicon）限外濾過装置などの市販のタンパク質濃縮フィルタ
ーを用いてまず濃縮することができる。該濃縮工程後に、濃縮物を適当な精製マ
トリックスにかけることができる。

【０１１８】３’及び５’ＵＴＲにおける修飾によって製造したものを含む、本明細書で説
明するプロセスによって製造した組換え分子は、公知の手段により単離精製する
ことができる。適当な精製及び単離プロセスの具体例は、一般に当該分野におい
て公知であり、硫安沈殿法、透析法、電気泳動法、限外濾過法、マイクロ濾過法
、ゲル濾過法、イオン交換又はイムノアフィニティークロマトグラフィーが挙げ
られるが、これらに限定されない。また、たとえば付加的メチル又はその他の芳
香族基を有するシリカゲルなど１つ以上の逆相高速液体クロマトグラフィー（Ｒ
Ｐ- ＨＰＬＣ）媒体を用いて、融合タンパク質組成物をさらに精製することがで
きる。上記精製工程の一部又はすべてを様々に組み合わせたものも、均一な組換
えタンパク質を提供するのに使用することができる。

【０１１９】培養細菌中で産生した組換えタンパク質は通常、細胞ペレットからの初回抽出
によって単離された後、１つ以上の濃縮、塩析、水性イオン交換又はサイズ排除
クロマトグラフィー工程に付される。最後に、高速液体クロマトグラフィー（Ｈ
ＰＬＣ）を用いて、最終精製工程を行う。組換え融合タンパク質の発現に使用す
る微生物細胞は、凍結解凍サイクル、超音波処理、機械的破砕法、又は細胞溶解
剤の使用など、あらゆる簡便な方法によって、破砕することができる。

【０１２０】分泌タンパク質として融合タンパク質を発現する酵母を発酵させると、精製が
大幅に簡略化される。大規模発酵から生じた分泌組換えタンパク質は、Urdal et
al.，（J. Chromatog. 296:171, 1984 ）に開示されている方法と同様にして精
製することができる。

【０１２１】組換え培養物中で合成された融合タンパク質は、培養物から融合タンパク質を
回収するために実施する精製工程に応じた量と性質で、タンパク質を含む、非ヒ
ト細胞成分の存在を特徴とする。これらの成分は通常、酵母、原核生物又は非ヒ
ト高等真核生物起源のものであり、スキャニングデンシトメトリー又はクロマト
グラフィー法により約５パーセント未満のオーダーであって、無害な汚染量で存
在することが好ましい。さらに、組換え細胞培養により、自然界でたとえば細胞
、細胞滲出物、又は体液中などそれぞれの起源物に含まれているがゆえに通常Ｅ
ＰＯと関連していることがあるタンパク質を含まない融合タンパク質の製造が可
能になる。

【０１２２】本発明はさらに、融合タンパク質と生理的に許容され得る担体とを含む医薬組
成物に関する。かかる担体は、公知の慣用のものであって、米国特許第５，５８
０，８５３号明細書に記載されているが、それらの教示は参照によりすべて本明
細書に取り込まれる。投与に適した医薬組成物は、有効量の融合タンパク質と生
理的に許容され得る担体とを含む。

【０１２３】本明細書で使用する場合、有効量とは、哺乳動物のための治療対象となってい
る病態をある程度軽減するか除去する量であるものと定義する。

【０１２４】担体は、使用する投与法及び濃度においてレシピエントに対して無毒のもので
ある。使用する処方は、選ばれる投与経路（たとえば溶液剤、乳剤、カプセル剤
）に応じて異なる。溶液剤又は乳剤の場合、適当な担体としては、生理的食塩水
や緩衝媒体など、たとえば水性又はアルコール性/ 水性の溶液、乳剤、又は懸濁
剤が挙げられる。非経口賦形剤としては、塩化ナトリウム溶液、リンゲル液デキ
ストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル液、又は不揮
発性油などが挙げられる。静脈内投与賦形剤としては、様々な添加剤、保存料、
又は液体、栄養分、又は電解質補給剤が挙げられる。一般には、「Remington's
Pharmaceutical Science」, 16th Edition, Mack, d. (1980) を参照のこと。吸
入の場合は、化合物を可溶化させ、適当な投与送達手段（たとえばアトマイザー
、ネビュライザー、又は加圧エアゾルディスペンサー）に充填することができる
。融合タンパク質は、単独で、一括して、又は他の薬物若しくは薬剤（たとえば
その他の化学療法剤、免疫系賦活剤）と組み合わせて、投与することができる。

【０１２５】融合タンパク質組成物を用いて、骨髄細胞などの造血前駆細胞の増殖、分化、
及び機能活性化を強化することができる。融合タンパク質組成物はまた、癌又は
細胞成長欠陥症の治療に用いることもできる。特に、融合タンパク質を含む組成
物を用いて、骨髄抑制患者の末梢血白血球数を増加させたり、循環顆粒球数を増
加させたりすることができる。この結果を得るためには、治療上有効量の融合タ
ンパク質組成物を、医薬品担体又は希釈剤とともに、哺乳動物、好ましくはヒト
に投与する。

【０１２６】本発明の組換えポリペプチド変化体タンパク質は、本明細書で説明するタンパ
ク質の欠陥又は異常に関連する疾患又は病態を有する個体への送達のための治療
剤として用いることができる。ポリペプチド遺伝子の非翻訳領域におけるヌクレ
オチドの保持及び/ 又は欠失により、治療用異種タンパク質を製造することがで
きる。本明細書では、異種タンパク質とは、天然には存在せず、一定の治療効果
を発揮するタンパク質であるものと定義する。

【０１２７】治療価値を有する組換えポリペプチドは当該分野において公知である。具体例
としては、Lin ，（米国特許第４，７０３，００８号明細書）；Sytkowski et a
l.，（米国特許第５，５８０，８５３号明細書）；Sytkowski ，（米国特許第５
，５８０，８５３号明細書）；及びPowell，（米国特許第５，６８８，６７９号
明細書）に記載の組換えＥＰＯが挙げられるが、それらの教示は参照により本明
細書に取り込まれる。組換えＥＰＯの治療上の利点としては、たとえばヘマトク
リット値の上昇や組換えタンパク質の比活性の上昇が挙げられる。生物学的活性
が増大した組換えＥＰＯタンパク質分子は、１０１位のグリシンをアラニンなど
別のアミノ酸残基で置換することによって作成することができる（Sytkowski et
al.，米国特許第５，６１４，１８４号明細書(1997)）。これらの参照文献を用
いて、当業者が、本発明の融合タンパク質を含むタンパク質分子をコードする核
酸構築物を製造する際の指針とすることができる。

【０１２８】たとえば、本明細書で説明する組換えＥＰＯ変化体タンパク質は、ＥＰＯが有
効であるあらゆる方法において利用することができ、とりわけ他の人工ＥＰＯタ
ンパク質が臨床上有効な作用を示していない方法（たとえば貧血患者における赤
血球増加）において利用することができる。患者へのＥＰＯ投与方法は、標的細
胞の場所で行われることが好ましい。したがって、投与は注射によることができ
る。他の投与方法( 非経口、経粘膜、全身、インプラント、腹腔内など) は一般
に当該分野において公知であり、ＥＰＯの場合、たとえば米国特許第５，６１４
，１８４号明細書の記載に従い、決定することができる。組換えＥＰＯタンパク
質は、生理的食塩水、滅菌水、リンゲル液、及び等張塩化ナトリウム溶液など薬
学的に許容され得る担体中で投与できることが好ましい。

【０１２９】ポリペプチド変化体タンパク質の活性は、たとえば薬理作用の違いにより試験
することができる。すなわち、組換えＥＰＯの活性は、治療効果として評価する
ことができる。たとえば、開示される方法によって製造した分泌精製ＥＰＯと他
の人工又は天然ＥＰＯとの薬理作用の違いとしては、次のものが挙げられる：１. ヒト治験において患者に投与された場合に、力価が増大又は低下する。必要
な初期用量ならびに維持用量に違いが生じうる。組換えＥＰＯ変化体タンパク質
につき、相対的力価係数を評価することができる。２. 患者に起こりうる副作用の低減又は増加は、ＥＰＯ変化体タンパク質の活性
の変化を反映することがある。たとえば、常に重症である透析患者など、ある種
のハイリスク患者の治療方針を決定する上できわめて重要でありうる血圧上昇又
は低下として、違いが出ることがある。３. ＥＰＯ変化体投与後の患者血清中の赤血球増加の効果発現までのタイムラグ
の違い。このタイムラグは、所望の治療効果が、他の型の組換えＥＰＯと比べて
、有意に早くなったり、遅くなったりするという結果をもたらす。タイムラグが
短くなるということは、患者に対する効果が早く出るため、望ましい治療効果で
ある。４. 患者が１つの型のＥＰＯを忍容し、別の型を忍容しない能力。患者が１つの
型のＥＰＯ変化体を忍容することができない場合、この不和合性は、治療上の違
いを示しうることになり、したがって、様々な型の組換えＥＰＯの構造的、生化
学的、及び生物学的修飾を反映しうる。５. 投与すべきＥＰＯの注射回数を減らしたり、減量したりできる患者のＥＰＯ
循環半減期の増大。半減期が延長することは、治療上有益であるばかりでなく、
慢性疾患患者の治療における医療費の低減にもつながる。

【０１３０】したがって、組換えポリペプチド変化体タンパク質の医薬品特性の違いは、治
療効果の違い( たとえばＥＰＯ変化体の場合、網状赤血球及び赤血球の産生、及
びヘモグロビン合成ならびに鉄取り込みの増大) をもたらしうる。たとえば、副
作用（患者の生命が脅かされたり、１つの型のＥＰＯの投与が不可能になる）を
無くしたり、大幅に減らしたりするＥＰＯタンパク質を投与することで、患者の
身体にかかる生体負荷の低減につながる力価の違いは、高血圧、心筋梗塞、又は
卒中のリスクが高いハイリスク患者（たとえば腎障害患者）においてとくに重要
である。

【０１３１】すなわち、組換えＥＰＯ遺伝子断片の５’及び/ 又は３’ＵＴＲ配列における
保持、欠失、点変異、又は置換は、最終的に、その遺伝子断片でトランスフェク
トされた宿主細胞によって発現されるタンパク質の最終構造と化学的性質に影響
を及ぼしうる。その結果、生じた発現タンパク質は様々な生物学的パラメータを
示しうるが、これらを、バイオアッセイを用いて、また、治療現場で、評価する
ことができる。

【０１３２】ここで、本発明を以下の具体例により、さらに説明するが、かかる具体例はい
ずれにも限定することを意味するものではない。

【０１３３】実施例１ＥＰＯ−ＥＰＯ二量体の構築ＥＰＯ−ＥＰＯ融合タンパク質（Ｆｉｇｕｒｅ１６Ａ〜１６Ｃ；配列番号：１
６及び１７）を、二本のＥＰＯｃＤＮＡ鎖を、以下のポリペプチド：ＡＧＧＧ
ＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＴ（配列番号：１８）（Ｆｉｇｕｒｅ１）をコードす
るＤＮＡ鎖に連結させることにより、構築した。野生型エリトロポエチンのヌク
レオチド配列は、Ｊａｃｏｂｓ，Ｋ．ら、Ｎａｔｕｒｅ３２３：８０６，１９
８５に記載されており、それは、参照によりそのすべてにおいて本明細書に取り
込まれる。連結するＤＮＡ鎖を、鋳型としてｐｓｖ２−ＥＰＯ（Ｆｉｇｕｒｅ２
）、及び適切に伸長させた３’末端を有する３’プライマー（Ｆｉｇｕｒｅ２）
を用いることにより、順次、目的の長さまで伸長させた。最初に配置されるＥＰ
ＯＤＮＡ鎖（Ｆｉｇｕｒｅ４）は、５’非翻訳領域、リーダー配列に１０個の
ヌクレオチド（Ｊａｃｏｂｓ，Ｋ．ら、Ｎａｔｕｒｅ３２３：８０６，１９８
５）、ＥＰＯｃＤＮＡコード配列を含み、終始コドンは含まない。３’末端に
付着した別のヌクレオチドは：ＧＣＣＧＧＣＧＧＴＧＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧ（配
列番号：１９）であった。リンカーの後のＥＰＯＤＮＡ鎖（ＥＰＯＢＤＮ
Ａ；Ｆｉｇｕｒｅ５）は、リーダー配列を含まないが、終始コドン及び３’非翻
訳領域の１７個のヌクレオチドを含む。ＮａｅＩ制限酵素部位の半分がＥＰＯ
ＡＤＮＡの３’末端に設計され、ＳｃａＩ制限酵素部位の半分がＥＰＯＢ
ＤＮＡの５’末端に設計された。

【０１３４】ＥＰＯＡ（Ｆｉｇｕｒｅ２）及びＥＰＯＢ（Ｆｉｇｕｒｅ３）ＤＮＡを、
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、及び鋳型としてヒトＥＰＯｃＤＮＡプラス
ミド、ｐｓｖ２−ＥＰＯ（Ｃｈｅｒｎ，Ｙ．Ｊ．ら、ＥｕｒＪＢｉｏｃｈｅ
ｍ２０２：２２５，１９９１）を用いることにより製造した。

【０１３５】ＥＰＯＡを製造するのに用いたプライマーは、以下の通りである：５’−Ａ
ＧＧＣＧＣＧＧＡＧＡＴＧＧＧＧＧＴＧＣＡＣ（配列番号：２０）（ＥｐＡ５
’）、３’−ＣＣＡＧＡＴＣＣＡＣＣＡＣＣＧＣＣＧＧＣＴＣＴＧＴＣＣＣＣＴ
ＧＴＣＣＴＧＣＡＧＧ（配列番号：２１）（ＥｐＡ３−３）、３’−ＣＧＣＣＡ
ＣＣＧＧＡＴＣＣＡＣＣＧＣＣＡＣＣＡＧＡＴＣＣＡＣＣＡＣＣＧＣＣＧＧＣ（
配列番号：２２）（ＥｐＡ３−４）及び３’−ＴＧＧＴＧＧＧＧＣＡＧＴＡＣＴ
ＧＣＣＧＣＣＧＣＣＡＣＣＧＧＡＴＣＣＡＣＣＧＣＣ（配列番号：２３）（Ｅｐ
Ａ３−５）。

【０１３６】ＥＰＯＢを製造するのに用いたプライマーは、以下の通りである：５’−Ｇ
ＣＧＧＣＡＧＴＡＣＴＧＣＣＣＣＡＣＣＡＣＧＣＣＴＣＡＴＣＴＧＴＧＡＣＡＧ
Ｃ（配列番号：２４）（ＥｐＢ５−１）及び３’−ＣＡＧＧＴＧＧＡＣＡＣＡＣ
ＣＴＧＧＴＣＡＴＣ（配列番号：２５）（ＥｐＢ３’）。

【０１３７】ＰＣＲ反応（５０μｌ）は、以下の成分を含んだ：０．５μＭの５’プライマ
ー又は３’プライマー；１０ｎｇのｐｓｖ２−ＥＰＯ；２００μＭのｄＡＴＰ、
ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ又はｄＴＴＰ；２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）；２
ｍＭＭｇＣｌ₂；１０ｍＭＫＣｌ；６ｍＭ（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄；０．１％Ｔ
ｒｉｔｏｎＸ−１００；１０μｇ／ｍｌのヌクレアーゼフリーＢＳＡ；及び２
．５ＵＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ
））。反応物に、鉱油（５０μｌ；分子生物学グレード、シグマ（Ｓｉｇｍａ）
）を重層し、９４℃で１分（変性）、５２℃で１分（アニーリング）及び７２℃
で１分（伸長）の２５サイクルに、パーキン・エルマー・ＤＮＡ・サーマル・サ
イクラー４８０（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＤＮＡＴｈｅｒｍａｌＣｙ
ｃｌｅｒ４８０）内で供した。

【０１３８】次いで、ＰＣＲ産物のＤＮＡ配列を決定した。まず、ＰＣＲ産物を、ＱＩＡＱ
ＵＩＣＫ（登録商標）ゲル・エキストラション・キット（ＱＩＡＱＵＩＣＫ^TM
ＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ）を用い、１％アガロースゲルで精製し
た。次いで、それらを、ｐＣＲ−ブラントにライゲートした。ここで、反応物は
、ベクターに対しモル比で１０〜１まで挿入物を含んだ。ライゲーション反応（
１０μｌ）は、ゲル精製ＰＣＲ産物、２５ｎｇのＰＣＲ−ブラント、１×ライゲ
ーション緩衝液及び４ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼ（ゼロ・ブラント（登録商標）
ＰＣＲクローニング・キット（ＺＥＲＯＢＬＵＮＴ^TM ＰＣＲＣｌｏｎ
ｉｎｇＫｉｔ）、インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を含んだ。イン
キュベーションは、１６℃で１時間行った。

【０１３９】発現に用いた細胞は、ＴＯＰ１０（登録商標）コンピテント・セル（ＴＯＰ１０^TM ＣｏｍｐｅｔｅｎｔＣｅｌｌｓ）（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒ
ｏｇｅｎ））であり、インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により確立され
た方法に従って形質転換した：２μｌのβ−メルカプトエタノールを、氷上の細
胞に加え、ピペットの先でゆっくりとかき混ぜて混合した後、先の段落に記載し
たライゲーション２μｌを加えた。次いで、この混合物を氷上で３０分間、続い
て正確に４５秒間、４２℃でインキュベートした。次いで、バイアルを氷上に２
分間載置した。２％トリプトン、０．５％酵母抽出物、１０ｍＭＮａＣｌ、２
．５ｍＭＫＣｌ１０ｍＭＭｇＣｌ₂、１０ｍＭＭｇＳＯ₄及び２０ｍＭ
グルコースを含む、予め温めておいた（３７℃）ＳＯＣ培地（２５０μｌ）を添
加し、細胞を３７℃で１時間振とうした。５０μｌの１：５に希釈した形質転換
細胞を、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ（ミラー変法（Ｍｉｌｌｅｒ
’ｓｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、シグマ（Ｓｉｇｍａ））寒天プレートに置
いた。該プレートを、３７℃で一晩インキュベートした。コロニーを取り出し、
５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む２．５ｍｌのＬＢにこれらのコロニーをイ
ノキュレートした。プラスミドＤＮＡを、プロメガ・ウィザード・プラス・ミニ
プレップス（登録商標）ＤＮＡピュリフィケイション・システム（Ｐｒｏｍｅｇ
ａ’ｓＷＩＺＡＲＤＰＬＵＳＭＩＮＩＰＲＥＰＳ^TM ＤＮＡＰｕｒｉｆ
ｉｃａｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍ）を用い、一夜培養物から調製した。クローンを
制限消化断片分析により分析した。

【０１４０】ｐＣＲブラント−ＥＰＯＡ及びｐＣＲブラント−ＥＰＯＢＤＮＡクロー
ンを、正しく挿入されるＤＮＡ及びリバース方向に向いた挿入物のための特有な
サイズの断片を与えるＢｇｌＩで消化した（Ｆｉｇｕｒｅ６及び７）。リバース
方向の挿入物を有するクローンを選別し、大量の（１００ｍｌのＬＢ／５０μｇ
／ｍｌのカナマイシンから）ＤＮＡプラスミドを、プロメガ・ウィザード・プラ
ス・マキシプレップス（登録商標）ＤＮＡピュリフィケイション・システム（Ｐ
ｒｏｍｅｇａ’ｓＷＩＺＡＲＤＰＬＵＳＭＡＸＩＰＲＥＰＳ^TM ＤＮＡ
ＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍ）を用いて調製した。「フォワード」
方向の挿入物を有するクローンも、目的のＥＰＯ−ＥＰＯＤＮＡを産生したで
あろう。

【０１４１】ＥＰＯＡＤＮＡを、ＥＰＯＢＤＮＡに、以下に記載の方法を用いて連
結した。ｐＣＲブラント−ＥＰＯＡ（−）を、ＳｃａＩ及びＸｈｏＩで消
化し、６７７ｂｐ断片ゲルを精製した（Ｆｉｇｕｒｅ８）。ｐＣＲブラント−Ｅ
ＰＯＢ（−）をＢａｍＨＩ及びＳｃａＩで消化し、５５７ｂｐ断片ゲルを精製
した（Ｆｉｇｕｒｅ９）。次いで、ＥＰＯＡ６７７ｂｐ断片を、ＥＰＯＢ
５７７ｂｐ断片に、ＥＰＯＡ６７７ｂｐ断片のＥＰＯＢ５７７ｂｐ断
片に対するモル比１：１でライゲートした。ライゲーションは、１６℃で一晩行
った。ライゲートされたＥＰＯＡ／ＥＰＯＢＤＮＡ断片を、ＱＩＡＱＵＩ
ＣＫ（登録商標）ゲル・エキストラション・キット（ＱＩＡＱＵＩＣＫ^TM Ｇｅ
ｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ）を用いて精製し、次いで、事前にＸｈｏＩ
及びＢａｍＨＩで消化し、ゲルを精製しておいたｐｃＤＮＡ２．１（−）にライ
ゲートした（Ｆｉｇｕｒｅ１０）。ライゲーション反応は、ＤＮＡ挿入物のｐｃ
ＤＮＡ３．１（−）に対するモル比５：１のものを含んだ。インキュベーション
は、１６℃で一晩行った。クローンを、アンピシリン耐性コロニーから、制限消
化分析により選び出し（Ｆｉｇｕｒｅ１１）、マイクログラムの量で調製して、
ＣＯＳ１細胞をトランスフェクトするのに使用した。

【０１４２】実施例２ＣＯＳ１細胞におけるＥＰＯ二量体の一過性発現ＣＯＳ１細胞を７０％のコンフルエンシーまで、ダルベッコ改変イーグル培地
、高グルコース（４．５ｇ／Ｌ；ギブコ（Ｇｉｂｃｏ））、１０％ウシ胎児血清
（ハイクローン（Ｈｙｃｌｏｎｅ））中で、１００Ｕのペニシリン、１００μｇ
のストレプトマイシン、組織培養培地１ｍｌ当たり２５０ｎｇのファンギゾン（
Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ）（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）の抗生物質−抗菌カクテル）の存
在下、３７℃で１０％ＣＯ₂で培養した。細胞を、０．０５％トリプシン、０．
５３ｍＭＥＤＴＡ（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ））を用いてトリプシン処理し、リン
酸緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ）／６ｍＭグルコース溶液で２回洗浄することに
より回収した。細胞を、上記ＰＢＳ／グルコース緩衝液に懸濁し、２×１０⁶細
胞／ｍｌの濃度とした。０．５ｍｌの細胞を、エレクトロポレーション・キュベ
ット（０．４ｃｍギャップ、バイオラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ））に置き、１０μ
ｇのｐｃＤＮＡ／ＥＰＯ−ＥＰＯを添加した。細胞を、以下の条件でエレクトロ
ポレートした：電圧＝０．３ｋＶ、電場強度＝０．７５ｋＶ／ｃｍ、キャパシタ
ー（ｃａｐａｃｉｔｏｒ）＝２５０μＦ、及びレジスター（ｒｅｓｉｓｔｏｒ）
＝なし（パルスコントローラーをΩに設定）。細胞を、３０ｍｌの予め温めてお
いたＤＭＥＭ、高グルコース、１０％ＦＢＳ中にプレーティングし、３７℃で７
２時間、１０％ＣＯ₂でインキュベートした。使用した対照は、１０μｇのｐｃ
ＤＮＡ−ＥＰＯ及び１０μｇのｐｃＤＮＡ３．１（−）であった。トランスフェ
クト細胞及び非トランスフェクト細胞を分析前に３日間培養した。

【０１４３】一過的にトランスフェクトしたＣＯＳ１細胞から全ＲＮＡを、トリゾール試薬
（ＴＲＩＺＯＬＲｅａｇｅｎｔ）（ギブコＢＲＬ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ））を用
いて製造者のプロトコルに従って調製した。全細胞性ＲＮＡを、５．５％ホルム
アルデヒド含有１．２％アガロースゲル上で分離し、ジーンスクリーン・プラス
（ＧｅｎｅＳｃｒｅｅｎＰｌｕｓ）フィルターに移した。フィルターを、ジゴ
キシゲニン（ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ）−ｄＵＴＰベーリンガー・マンハイム
で、製造業者により記載された方法に従って、プローブした。ＥＰＯ−Ｌ−ＥＰ
Ｏ融合タンパク質は、約２．８ｋｂの長さの転写物によりコードされていた。Ｅ
ＰＯ−Ｌ−ＥＰＯ転写物の相対量は、ノーザンブロット分析により評価すると、
ＥＰＯ単量体において観察されたものとほぼ同等であった。ＥＰＯ−Ｌ−ＥＰＯ
タンパク質の分泌は、少なくともＥＰＯの８倍高かったため（実施例３及び４参
照のこと）、ＥＰＯ−Ｌ−ＥＰＯタンパク質二量体は、合成中、ＥＰＯ単量体よ
りもかなり安定であるようである。

【０１４４】トランスフェクト細胞及び非トランスフェクト細胞由来のならし培地を収集し
、１３，８００×ｇで１０分間４℃で遠心分離した。各ならし培地のアリコート
（１ｍｌ）を、最小必須培地（ＭｉｎｉｍｕｍＥｓｓｅｎｔｉａｌＭｅｄｉ
ｕｍ）αに対し、培地を３回変えて一晩透析した。透析した試料をＥＰＯタンパ
ク質濃度の測定のためにアッセイし、インビトロ及びインビボＥＰＯ活性を評価
するのに使用した。

【０１４５】実施例３ＣＯＳ１細胞培養培地におけるＥＰＯタンパク質測定ＥＰＯ単量体及びトランスフェクトしたＣＯＳ１細胞により分泌されたＥＰＯ
−Ｌ−ＥＰＯ融合タンパク質を、ウエスタンブロッティング及び固相酵素免疫測
定法（ＥＬＩＳＡ）により、トランスフェクトしたＣＯＳ１細胞の透析した条件
培養培地中で、検出した。透析した試料中に存在するタンパク質を、ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥにより分離し、２５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１９２ｍＭグリシン、１０
％メタノールを含む緩衝液中で、電気泳動的に０．４５μｍニトロセルロース膜
に移した。次いで、膜を、蒸留水で２回簡単にリンスし、一晩、４℃で、２０ｍ
ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、０．５ＭＮａＣｌ、０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０（Ｔ
ＢＳＴ）、１０％脱脂乾燥乳、ｐＨ７．５中で、インキュベートした。膜を、Ｔ
ＢＳＴで２回リンスし、ＴＢＳＴで、１５分間１回及び５分間ずつ２回洗浄した
。次いで、膜を、２３℃で１時間、抗エリトロポエチンモノクロナール抗体ＡＥ
−７Ａ５（ゲンザイム（Ｇｅｎｚｙｍｅ）社、ケンブリッジ、マサチューセッツ
州）とともに、５％脱脂乾燥乳を含むＴＢＳＴ中、０．７μｇ／ｍｌの濃度でイ
ンキュベートした。リンス及び洗浄を上述のようにして行った後、２３℃で１時
間、５％脱脂乾燥乳を含むＴＢＳＴ中１：１０００に希釈した、ホースラディッ
シュペルオキシダーゼをコンジュゲートしたヤギ抗−マウスＩｇＧ（カッペル（
Ｃａｐｐｅｌ））とともにインキュベートした。リンス及び洗浄を、さらに２回
ＴＢＳＴ洗浄（各々５分）を行った以外は上述のようにして再度行った。抗原（
ＥＰＯ）−抗体複合体を、アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）ＥＣＬキットを用い
、化学発光検出により可視化した。ＥＰＯ−Ｌ−ＥＰＯ二量体は、ＣＯＳ１細胞
から、分子量７６ｋＤａの単一のタンパク質バンドとして分泌された。分泌され
たＥＰＯ二量体の分子量は、２つの十分なプロセシングを受け、グリコシル化さ
れたＥＰＯ単量体（３６ｋＤａ）及びポリペプチドリンカー（１．８ｋＤａ）の
分子量とほぼ同等であった。従って、二量体は、完全で、成熟し、十分なプロセ
シングを受けた２つのＥＰＯタンパク質分子から構成される。

【０１４６】 EPO ELISA アッセイ(Genzyme社、ケンブリッジ、MA) を用いて、トランスフェ
クトしたCOS1細胞のならし培地中に存在するEPO 単量体又はEPO 二量体の量を決
定した。以前に述べた日常的な方法に従い、組換え単量体EPO (rhuEPO)を用いて
標準曲線を計算した。例えば、Sytkowski ら、米国特許第5,614,184 号明細書(1
997)及びSytkowski ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:1184-1188(1998) を参
照のこと。

【０１４７】 EPO-L-EPO 融合タンパク質二量体は、COS1細胞から、0.15μg/mlの濃度、COS1
細胞が分泌するEPO 単量体タンパク質の量(0.018μg/ml) より約８倍高い、で分
泌された（表１、実施例４を参照）。上記のように、タンパク質の二量体は、タ
ンパク質合成の間、単量体タンパク質分子よりかなり安定であり得る。かかる特
性は、インビトロ生産及びインビボの治療目的に有利であり得る。

【０１４８】実施例４ EPO 二量体のインビトロ生物活性 EPO-L-EPO 二量体タンパク質のインビトロ活性を、本明細書及び米国特許第5,
580,853 号明細書、その全内容は参照により本明細書に組み込まれるが、それら
に記載のKrystal の方法(Exp. Hematol. 11:649-660(1983))に基づいて決定した
。以前に述べたように、Krystal バイオアッセイは、無傷なマウスの脾臓赤血球
細胞を用いて、赤血球細胞増殖についてのEPO 単量体又はEPO 融合タンパク質の
効果を測定する。組換えEPO を用いて、世界保健機関二級国際基準製剤に対する
標準曲線を作成した。各試料を、78％のα-MEM、20％の熱不活性化ウシ胎児血清
、1 ％のβ- メルカプトエタノール及び１％のペニシリン／ストレプトマイシン
／ファンギゾン(fungizone) を含有するアッセイ培地中に希釈した。アッセイは
、日常的なものであり、当業者によく知られたものである。

【０１４９】 pcDNA/EPO-EPOでトランスフェクトしたCOS1細胞のならし培地は、45〜72U/ml
のインビトロ生物活性を含有し、pcDNA-EPO でトランスフェクトしたCOS1細胞か
らの培地は5U/ml を含有した。pcDNA でトランスフェクトした細胞及びトランス
フェクトしていない細胞からのならし培地は、EPO 活性を示さなかった。

【０１５０】インビトロバイオアッセイ値（U/ml) をELISA で決定した場合のタンパク質濃
度（μg/ml）で割ることにより、EPO 二量体及び単量体の比活性（U/μg)を計算
した。表１に示すように、EPO ^wt-L-EPO^wt二量体の比活性は、EPO 単量体の比
活性が350U/ml であるのに比べ、1007U/mlであった。したがって、野性型EPO を
含む二量体タンパク質は、COS1細胞からより高い割合で分泌され、単量体の野性
型EPO と比較して生物学的活性及び比活性が、２つのユニットから構成される融
合タンパク質で予期される量の2 倍を超える量に増加した。

【０１５１】

【表１】

【０１５２】実施例５ EPO-EPO 二量体のインビボ活性 pcDNA/EPO-EPO でトランスフェクトしたCOS1細胞からのならし培地を用いてマ
ウス(B6C3F1 株、雌、18g 、ジャクソン研究室) に注射した。EPO-EPO を投与す
る前にこれらのマウスのヘマトクリットを測定した（処置前値）。マウスは、１
日目、３日目及び５日目に皮下注射され（１kgあたりEPO-EPO 300 IU) 、実験的
な摂生処理の８日目から７日後に処置後ヘマトクリットを測定した。マウス♯１
はヘマトクリットが4.5 ％増加し、マウス♯２は1.5 ％増加した。

【０１５３】他のより広範囲の一連の実験では、摂生処理の１日目にpcDNA/EPO-EPO(n=4 マ
ウス) 又はpcDNA/EPO(n=4 マウス) のいずれかでトランスフェクトしたCOS1細胞
からのならし培地をマウスに１回注射した。対照として、他のグループのマウス
（n=4 マウス) にCOS1細胞からのならし培地を１回投与した。処置後ヘマトクリ
ットを７日後又は摂生処理の８日目に測定し、処置前（０日目）の値と比較した
。

【０１５４】Ｆｉｇｕｒｅ17A 、17B 、及び17C に示すように、処置前の値と比較して、ヘ
マトクリットの実質的な増加がEPO-EPO 二量体を含有するならし培地を注射した
マウスでのみ観察された。EPO 単量体又は対照培養培地で処置されたマウスでは
、ヘマトクリットに何ら増加が見られなかった。これらのインビボのデータは、
EPO-EPO 二量体が延長された血漿半減期を有していることを示す。

【０１５５】実施例６融合タンパク質のオリゴヌクレオチド特異的変異誘発本発明の融合タンパク質、例えばEPO をコードする核酸構築物中の変異は、改
変部位(the Altered Sites) （登録商標）^TMインビトロ変異誘発システムキット
（マジソンのPromega 社、WI) に基づいて、オリゴヌクレオチド特異的変異誘発
を用いて調製され得る。改変部位^TMシステムは、分子生物学の分野の当業者に日
常的な実験的プロトコルに基づくものである。該キットは、独特の変異誘発ベク
ター及びオリゴヌクレオチド特異的変異体の選別のための単純で直接的な手順か
らなる。該システムは、二次変異誘発性オリゴヌクレオチドの使用に基づき、変
異DNA 鎖に抗生物質耐性を与える。該システムは、ファージミドベクターである
pSELECT-1 を使用し、これは抗生物質耐性に関する２つの遺伝子を含有する。こ
れらの遺伝子の１つは、テトラサイクリン耐性に関し、通常機能的である。もう
１つは、アンピシリン耐性に関し、不活性化されている。変異誘発反応の間に、
変異鎖にアンピシリン耐性を回復するオリゴヌクレオチドが提供される。変異誘
発性オリゴヌクレオチドと同時にこのオリゴヌクレオチドを一本鎖DNA(ssDNA)鋳
型にアニール化し、その後に変異鎖の合成及びライゲーションでその２つを繋ぐ
。そのDNA を修復マイナス株である大腸菌又は他の好適な宿主中に形質転換し、
その細胞をアンピシリン存在下で培養して、大量のクローンを得る。JM109 又は
同類の宿主における２回目の形質転換は、変異型及び野性型のプラスミドの適当
な分離を確実にし、高い割合で変異体を得る。

【０１５６】 pSELECT-1 プラスミドはファージミドであり、一本鎖DNA バクテリオファージ
の起点を含むキメラプラスミドと定義されている。このファージミドは、宿主細
胞をヘルパーファージR408又はM13KO7で感染させる際にssDNA を生産する。該ベ
クターは、SP6 及びT7 RNAポリメラーゼプロモーターでフランキングされたマル
チプルクローニング部位を有し、lacZα- ペプチドに挿入される。DNA 挿入物の
マルチプルクローニング部位へのクローニングは、α- ペプチドの不活性化を生
じる。指示プレート上で培養した場合、組換えプラスミドを有するコロニーは青
色のコロニーのバックグラウンド中で白色である。挿入DNA のいずれかの鎖から
の高特異的活性のRNA プローブを得るために、SP6 プロモーターやT7プロモータ
ーを用いてもよい。これらの部位は挿入物のシークエンシングのための都合のよ
いプライミング部位としても役立つ。pSELECT-1 ベクターは、アンピシリン及び
テトラサイクリン耐性の両方に関する遺伝子配列を保有する。しかし、Pst I 部
位を除去することでフレームシフトがこの耐性遺伝子に導入されるため、このプ
ラスミドはアンピシリン感受性である。したがって、このプラスミド及び組換え
体の増殖をテトラサイクリン選択下で行う。

【０１５７】 pSELECT-対照ベクターは、変異誘発反応に都合のよい白色／青色陽性対照を提
供する。このベクターは、ポリリンカー内のPst I 部位を除去することにより、
pSELECT-1 ベクターから誘導される。得られたlac α- ペプチド中のフレームシ
フトはβ- ガラクトシダーゼを不活性化し、指示プレート上に白色のコロニー表
現型を生じさせる。lacZ遺伝子中の欠失を補正し、コロニーの色を青色に回復さ
せる４塩基の挿入物を導入するために（システムで供給される）lacZ修復オリゴ
ヌクレオチドを用いてもよい。得られた青色コロニーの画分は変異誘発の効率を
示す。アンピシリン修復オリゴヌクレオチドと共同してlacZ修復オリゴヌクレオ
チドを使用してこの欠失を補正する場合、80〜90％のアンピシリン耐性コロニー
が青色となる。lacZ修復オリゴヌクレオチドのみを用いた場合、2 〜5 ％の変異
誘発の効率しか見られない。

【０１５８】変異誘発性オリゴヌクレオチドは、一本鎖標的DNA と相補的でなければならな
い。pSELECT-1 ファージミドにより生産されたssDNA は、lacZコード鎖に相補的
である。

【０１５９】オリゴヌクレオチドと鋳型の間の複合体の安定性は、オリゴヌクレオチドの塩
基組成とこれをアニールする条件により決定される。一般的には、中央にミスマ
ッチがある17〜20塩基オリゴヌクレオチドは、１塩基の変異に十分なものである
。これは、ミスマッチのいずれかの側に完全にマッチする、８〜10個のヌクレオ
チドを提供する。2 以上のミスマッチを含む変異について、ミスマッチのいずれ
かの側に完全にマッチする、12〜15個のヌクレオチドを与えるために25塩基又は
それより長いオリゴヌクレオチドが必要である。

【０１６０】日常的に、70℃で5 分間加熱した後、室温までゆっくりと冷却することでオリ
ゴヌクレオチドをアニール化する。

【０１６１】マルチプルクローニング部位を用いて、変異させるDNA をpSELECT-1 ベクター
中にクローン化する。次いで、ベクターDNA をJM109 、又は同類の宿主のコンピ
テント細胞中に形質転換して、15μg/mlテトラサイクリン、0.5mM IPTG、及び40
μg/ml X-Galを含有するLBプレート上で培養することで組換えコロニーを選別す
る。37℃で24時間インキュベーションした後、組換えプラスミドを含有するコロ
ニーは青色のコロニーのバックグラウンド中で白色を示す。

【０１６２】変異誘発反応用の一本鎖鋳型を生産するために、pSELECT 対照又は組換えpSEL
ECT-1 ファージミドを含有する個々のコロニーを培養し、下記のように培養物を
ヘルパーファージで感染する。生産される一本鎖DNA はlacZコード鎖に相補的で
あり、マルチプルクローニング部位の鎖に相補的である。２つのヘルパーファー
ジR408及びM13KO7を用いて、ssDNA 収率を最適化する最大の許容範囲を提供する
。

【０１６３】実施例７ EPO-EPO 変異二量体の構築と発現 EPO-EPO 融合タンパク質の片方又は両方のEPO ドメインが生物学的に活性であ
るかどうかを決定するため、変異EPO-EPO 二量体を構築した。103 位のアルギニ
ンがヒト組換え単量体EPO 中のアラニン残基で置換されている単独点変異(R103A
) はタンパク質の完全な不活性化を生じる(Grodberg ら、Eur. J. Biochem 218:
597-601(1993);及びMatthewsら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA93:9471-9476(199
6)) 。したがって、EPO-EPO 二量体の生物学的活性についての、EPO-EPO 二量体
の片方又は両方の単量体サブユニットにおけるR103A 変異の効果を決定した。前
記の部位特異的変異誘発技術を用いて、R103A 変異を含む点変異を行なってもよ
い。

【０１６４】二量体のN-末端、もしくはC-末端、又はN-末端とC-末端の両方のドメインをコ
ードするEPO 核酸構築物中でEPO 変異体(EPO^R103A )を作製した。実施例１に本
質的に記載したようなPCR 及びライゲーション反応条件を用いて、EPO 変異二量
体(EPO^R103A-EPO^wt; EPO ^wt-EPO^R103A; EPO ^R103A-EPO^R103A) を作製した。
また、変異二量体を用いてCOS1細胞を形質転換する類似の方法や生物学的活性の
評価のためのならし培地を調製する技術は、EPO ^wt-EPO^wt二量体について前記
のとおりとした。

【０１６５】実施例８ EPO-EPO 変異二量体の生物学的活性前記のように、単量体EPO における103 位のアルギニンからアラニン残基への
変異により、生物学的活性が完全に失われる。したがって、EPO-EPO 二量体(EPO ^R103A -EPO^wt又はEPO ^wt-EPO^R103A) の１つのドメインにおけるR103A 変異によ
り、EPO ^wt-EPO^wt二量体の約半分の生物学的活性を保持する融合タンパク質が
得られるということが予想された。さらに、両方のドメイン(Epo^R103A-Epo^R103 ^A ) の変異により融合タンパク質の完全な不活性化が生じることも予想された。

【０１６６】表１（実施例４を参照）に示すように、EPO ^R103A-EPO^wtとEPO ^wt-EPO^R103A 変異体は、非変異EPO ^wt-EPO^wt二量体より驚くべき高い濃度でCOS1細胞から分
泌された。EPO 二量体の片方のドメインの変異により、Krystal バイオアッセイ
を用いて測定した場合、予期しない高さのインビトロでの生物学的活性(EPO^R103 ^A -EPO^wtについては135 U/ml及びEPO ^wt-EPO^R103Aについては123 U/ml) を生じ
た。これらの値は、非変異EPO ^wt-EPO^wt(151 U/ml)よりほんの少しだけ低く、
単量体EPO(6.3 U/ml) のかなり上であった。したがって、融合タンパク質二量体
における１個のEPO 分子の不活性化は、予想されたように、EPO の１個のタンパ
ク質分子で観察されたレベルにまで生物学的活性を減少させない。EPO ^R103A-E
PO^wt変異二量体及びEPO ^wt-EPO^R103A変異二量体による強化された生物学的活性
の維持は、EPO ^wt/EPO^wtにおける２つのドメインのそれぞれがバイオアッセイ
に使用される脾臓細胞のような標的細胞上のEPO 受容体を活性化する可能性があ
ることを示す。

【０１６７】興味深いことに、EPO ^R103A-EPO^wt変異体とEPO ^wt-EPO^R103A変異体の比活性
は、それぞれ480 U/μg と516 U/μg で、本質的に非変異EPO ^wt-EPO^wt二量体
の比活性の半分であり、EPO ^wt-EPO^wt二量体中の２つのEPO ドメインが等しく
活性であることを示す。

【０１６８】ノーザンブロット分析は、二重EPO ^R103A/EPO^R103A変異体をコードするmRNA
が発現されることを示した。しかし、EPO ^R103A/EPO^R103A構築物で形質転換さ
れたCOS1細胞由来のならし培地中で生物学的活性や分泌された融合タンパク質は
検出されなかった。

【０１６９】実施例９組換えポリペプチド変化体タンパク質の生物学的活性の評価インビトロアッセイ及びインビボアッセイを用いて５’非翻訳領域、又は３’
非翻訳領域もしくは両方における変異を含む組換えポリペプチド変化体の生物学
的活性を決定する。

【０１７０】使用する前に組換えポリペプチド変化体タンパク質を十分に精製することが好
ましく、その分子がインビトロで使用され得るぐらいの純度は必ずしも不可欠で
なないが、タンパク質がインビボ治療の際に使用され得ることが特に好ましい。
１つの態様において、組換えポリペプチドは約50％（重量基準）の純度で単離さ
れ得、約80重量％又は約95重量％がより好ましい。インビトロアッセイ及びイン
ビボアッセイさらにはインビボ治療について本質的に純粋（例えば、約99重量％
又は均質) であるタンパク質を利用することが最も好ましい。

【０１７１】例えば、実施例６及び10で論じられている部位特異的変異誘発方法に基づいて
調製され得る組換えEPO 変化体タンパク質を、治療環境で使用する前にインビト
ロ及びインビボ活性について調べることができる。インビトロアッセイは、Krys
tal, G., Exp. Hematol.,11:649-660(1983) の手法に基づいて無傷のマウス脾臓
細胞アッセイにおける赤血球造血についてEPO 変化体タンパク質の効果を測定す
る。活性、例えば、インビトロ又はインビボについて、様々な組換えEPO 変化体
タンパク質を調べるため、造血、血小板産生又は受容体結合の程度についてタン
パク質（又はEPO タンパク質の混合物）を評価することができる。生物学的活性
を決定するための試験は、当業者によく知られている。例えば、EPO の生物学的
活性は、Sytkowski 及びGrodberg（米国特許第5,614,184 号明細書); Sytkowski
（米国特許第5,580,853 号明細書); 1998 年２月３日に出願された Sytkowski、
米国特許出願「増大した生物学的活性を有する修飾ポリペプチド」; 及びPowell
（米国特許第5,688,679 号明細書);これらの全内容は参照として本明細書に組み
込まれるが、それらに記載のように測定され得る。

【０１７２】実施例１０遺伝子の非コード領域の改変により調製したポリペプチド変化体典型的には、組換えタンパク質の変化体は、遺伝子のコード範囲内でのヌクレ
オチドの欠失、付加又は置換により作製される。しかしながら、遺伝子の非コー
ド領域、すなわち、５’及び３’非翻訳領域（ＵＴＲ）の改変により組換えタン
パク質の変化体を作製することも可能である。遺伝子のＵＴＲにおける、特に第
１イントロンにおけるのに加え、５’配列における修飾は、翻訳の調節；従って
、タンパク質の発現に影響する（Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｄ．Ｅ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ
．７０：１０４１−１０４９頁、１９９６；Ｋｏｚａｋ，Ｍ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂ
ｉｏｌ．２３５：９５−１１０頁、１９９４；Ｂｅｔｔａｎｙ，Ａ．Ｊ．ら、Ｊ
．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１６５３１−１６５３７頁、１９９２；Ｋｏｚ
ａｋ，Ｍ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１９８６７−１９８７０頁、１
９９１）。

【０１７３】ポリペプチド遺伝子の非コード配列における改変は、異なるｍＲＮＡの二次構
造（例えば、ループ及び塩基対の自由エネルギー）、翻訳効率；次いで、ポリペ
プチドの発現、分泌及び生物学的活性をもたらし得る。それゆえ、ポリペプチド
の異なる型は、ポリペプチドのコード領域の５’又は３’側のいずれかにフラン
キングする領域における修飾の結果として製造され得る。

【０１７４】Ｆｉｇｕｒｅ１２は、１又は複数の改変が組換えポリペプチド遺伝子の５’及
び／又は３’ＵＴＲにおいてなされた場合に生じ得る、ｍＲＮＡ構造並びに最終
的にはタンパク質構造及び機能における変化の概略図である。組換えポリペプチ
ドにおける変化体は、例えば、異なる制限酵素で生ずるゲノム配列の断片及び／
又はポリペプチドコード配列の５’及び／又は３’ＵＴＲにおける特定のヌクレ
オチド置換及び変異として製造し得る。本明細書に記載のオリゴヌクレオチド特
異的部位特異的変異誘発法は、組換えポリペプチド変化体タンパク質を提供する
のに使用され得る。

【０１７５】ポリペプチド遺伝子の非コード領域における修飾は、ｍＲＮＡ安定性、翻訳速
度、宿主細胞からの発現、タンパク質プロセシング、粗面小胞体からの輸送、グ
リコシル化の程度及びパターン、細胞からの分泌動力学及び輸送速度に影響を与
え得る。例えば、変化したグリコシル化パターンが生じ得、それは、ＥＰＯの場
合、生物学的活性に非常に重要である（Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，Ｋ．ら、Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：２０４３４−２０４３９、１９９１）。得られたタン
パク質は、組換えポリペプチドの化学的、構造的及び生物学的に異なる型を示し
得る。

【０１７６】ポリペプチド変化体のヌクレオチド配列は、標準の実験手法を用いてＤＮＡシ
ークエンシングにより確認し得る。ゲノムポリペプチドの特有の型は、５’及び
３’ＵＴＲにおける変異により製造し得、サザンブロッティングにより検出し得
る。同様に、異なるｍＲＮＡを、ノーザンブロッティングにより同定し得る。ハ
イブリダイゼーション条件における差異、すなわち、高度又は低度ストリンジェ
ンシーは、ＤＮＡ及びｍＲＮＡの多様性の指標となるであろう。異なるゲノム配
列は、組換えポリペプチドを十分に発現するのに、異なるプロモーター（例えば
、マウスメタロチオネイン又は３−ホスホグリセレート）、ベクター（例えば
、ウシパピローマウイルス）、及び／又は宿主細胞（例えば、ＣＨＯ、ＢＨＫ−
２１又はＣ１２７細胞）を必要とすることがあってよい。上記の実験方法に使用
し得る技法に、当業者は精通している。例えば、詳細なプロトコルは、Ｓａｍｂ
ｒｏｏｋら、「ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ，」（１９８９）及びＡｕｓｕｂｅｌら、「ＣｕｒｒｅｎｔＰ
ｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，」（１９９５
）；Ｐｏｗｅｌｌ，Ｊ．Ｓ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ８３：６４６５−６４６９頁、１９８６；及びＳｙｔｋｏｗｓｋｉとＧｒｏ
ｄｂｅｒｇ，（米国特許第５，６１４，１８４号明細書）；Ｓｙｔｋｏｗｓｋｉ
，（米国特許第５，５８０，８５３号明細書）；並びにＰｏｗｅｌｌ，（米国特
許第５，６８８，６７９号明細書）；に見出し得、それらの教示は、参照により
全て本明細書に取り込まれる。

【０１７７】ポリペプチド遺伝子の５’及び／又は３’ＵＴＲにおける変異は、ＲＮＡ構造
、全自由エネルギー、安定性及び／又は翻訳速度及び翻訳効率の改変をもたらす
（Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｄ．Ｅ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：１０４１−１０４９頁
、１９９６；Ｋｏｚａｋ，Ｍ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３５：９５−１１０
頁、１９９４；Ｂｅｔｔａｎｙ，Ａ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７
：１６５３１−１６５３７頁、１９９２；Ｋｏｚａｋ，Ｍ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．２６６：１９８６７−１９８７０頁、１９９１；Ｐｕｒｖｉｓ，Ｉ．Ｊ
．ら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１５：７９５１−６２頁、１９８
７）。ｍＲＮＡの二次構造は、翻訳の開始及び効率、従って、タンパク質合成に
おいて重要な役割を果たす。

【０１７８】ＰＣ／Ｇｅｎｅ（登録商標）ＲＮＡＦＯＬＤプログラム（ＩｎｔｅｌｌｉＧｅ
ｎｅｔｉｃｓ社）を用いたコンピューターモデリングを使用して、例えば、ＥＰ
Ｏ遺伝子（Ｆｉｇｕｒｅ１３−１５）の５’又は３’ＵＴＲにおける欠失後の、
ＲＮＡ二次構造、特に全自由エネルギーにおける差異を予測する。該プログラム
は、ＲＮＡの二次構造のエネルギーを計算するアルゴリズムを利用する。自動的
に、いずれのＤＮＡ配列も一本鎖ＲＮＡ配列に転写する。ｍＲＮＡは一本鎖なの
で、塩基の相補性により自ら折り畳まれ得、種々の「ループ」を生ずる。エネル
ギーは、塩基対又はループ構造の形成のために放出されなければならず、得られ
る二次構造の安定性は、放出されたエネルギーの量により決定される。それゆえ
、別の構造が−５０ｋｃａｌ／ｍｏｌ及び−１００ｋｃａｌ／ｍｏｌの形成の自
由エネルギーを有する場合、後者の構造は、本質的により形成されやすい。

【０１７９】例えば、ＥＰＯ遺伝子の５’ＵＴＲにおけるヌクレオチド４０１−６２４につ
いての二次ＲＮＡ構造の自由エネルギーは、−１６１．０ｋｃａｌ／ｍｏｌ（配
列番号：２）であると予測される。ヌクレオチド５０１−５５０の範囲における
５０ヌクレオチドの欠失は、−１２７．２ｋｃａｌ／ｍｏｌ（配列番号：３）の
全自由エネルギーをもたらし、一方、ヌクレオチド５５１−６００（配列番号：
４）における５０ヌクレオチドの欠失は、−１１８．９ｋｃａｌ／ｍｏｌの自由
エネルギーを有するＲＮＡ構造をもたらし、これは、ｍＲＮＡ二次構造を最終的
に規定する際には欠失のサイズ及び場所が重要であることを示している。５’Ｕ
ＴＲの４０１−６２４領域の異なる部分における、より大きな欠失は、多様な予
測エネルギー状態を有するＲＮＡ構造を生ずる（配列番号：５−７）。これらの
結果を、表２にまとめる。

【０１８０】

【表２】

【０１８１】同様に、例えば、ＥＰＯ遺伝子の３’ＵＴＲにおけるヌクレオチド２７７３−
２９７２についてのＲＮＡ二次構造の自由エネルギーは、−８１．４ｋｃａｌ／
ｍｏｌ（配列番号：８）と予測される。ヌクレオチド２９２３−２９７２（配列
番号：９）の範囲における５０ヌクレオチドの欠失は、−５３．５ｋｃａｌ／ｍ
ｏｌの全自由エネルギーをもたらし、一方、ヌクレオチド２８７３−２９７２（
配列番号：１０）における１００ヌクレオチドの欠失は、−３３．３ｋｃａｌ／
ｍｏｌの自由エネルギーを有するＲＮＡ構造をもたらす。３’ＵＴＲの２７７３
−２９７３領域の異なる部分における、より大きな欠失は、多様な予測エネルギ
ー状態を有するＲＮＡ構造を生ずる（配列番号：１１及び１２）。これらの結果
を表３にまとめる。

【０１８２】

【表３】

【０１８３】ｍＲＮＡの二次構造は、対応するコード領域の翻訳速度に影響する（Ｋｉｋｉ
ｎｉｓ，Ｚ．ら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２３：４１９０−４１
９５頁、１９９５；Ｋｏｚａｋ，Ｍ．、Ｍａｍｍ．Ｇｅｎｏｍｅ７：５６３−
５７４頁、１９９６；Ｂｅｔｔａｎｙ，Ａ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
２６７：１６５３１−１６５３７頁、１９９２；Ｋｏｚａｋ，Ｍ．、Ｊ．Ｍｏｌ
．Ｂｉｏｌ．２３５：９５−１１０頁、１９９４）。ｍＲＮＡにおける二次構造
ループは、リボソーム結合及び適当なタンパク質会合を容易にするため、ほぐさ
れなければならない（Ａｌｂｅｒｔｓ，Ｂ．ら、「ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏ
ｌｏｇｙｏｆｔｈｅＣｅｌｌ」、第３版、ＧａｒｌａｎｄＰｕｂｌｉｓ
ｈｉｎｇ社、ニューヨーク、ニューヨーク州、２２３−２９０頁、１９９４）。

【０１８４】形成されつつあるポリペプチド鎖は、ポリペプチド鎖の適当な折り畳みに影響
を及ぼし、タンパク質の小胞体の通過に影響し、それにより得られるタンパク質
のグリコシル化が改変され得る独特の方法で、シャペロンタンパク質、例えば、
ＢｉＰと相互作用し得る。最近のデータでは、ＢｉＰ様タンパク質は、不適切に
折り畳まれたタンパク質と結合するだけでなく、適切なタンパク質の折り畳みを
援護し、分泌性タンパク質の膜移動及びグリコシル化を容易にし得ることが示唆
されている（Ｋｎｉｔｔｌｅｒ，Ｍ．Ｒ．ら、ＥＭＢＯＪ．１１：１５７３−
１５８１頁、（１９９２）；Ｓａｎｄｅｒｓ，Ｓ．Ｌ．ら、Ｃｅｌｌ６９：３
５３−３６５頁、（１９９２））。グリコシル化パターンの改変は、分泌に影響
し得、ＥＰＯの場合、劇的に生物学的活性が変わる（Ｙａｍａｇｕｃｈｉ）Ｋ．
ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：２０４３４−２０４３９頁、１９９１）
。

【０１８５】ポリペプチド、例えばＥＰＯの三次元構造は、タンパク質主鎖及びオリゴ糖鎖
により顕著に影響される。炭水化物組成における改変（例えば、Ｎ又はＯ結合オ
リゴ糖残基の数及び／又は糖部分の型）は、ポリペプチド変化体タンパク質の生
物学的特性を異なるものにし得、従って、治療的効果を変え得る。それゆえ、５
’又は３’ＵＴＲにおける差異は、ｍＲＮＡ二次構造に影響を与え得、それは、
次いで、発現速度及びグリコシル化等の翻訳後修飾に影響し得る。ポリペプチド
の適当なグリコシル化は、成熟産物の適当な折り畳み及び分泌、それゆえ、その
生物学的及び薬理学的特性にとって最も重要であり得る。

【０１８６】組換えポリペプチド変化体タンパク質における本質的な構造的変化の指標は、
タンパク質主鎖の三次元構造及び炭水化物鎖の程度及びパターンにおける差異に
顕現され得る。例えば、得られたポリペプチド変化体の円二色性（ＣＤ）スペク
トル及び熱安定性により、異なる糖タンパク質のアルファヘリックス、ベータシ
ート、ベータターン及びランダムコイルの量を決定し得る。オリゴ糖鎖の構造は
、例えば、一次元及び二次元¹Ｈ−ＮＭＲ分光測定法に加え、酵素的及び化学的
脱グリコシル化、ガスクロマトグラフィー、メチル化分析、高速原子衝突質量分
析法を用いて、決定し得る。上記分析を行うための方法は、当業者にとって慣用
のものであり、いくつかの参照文献に詳細に記載されている。該参照文献として
は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、「ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏ
ｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ」（１９９５）；Ｎｉｍｔｚ
，Ｍ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１３：３９−５６頁、１９９３；及
びＮｉｍｔｚ，Ｍ．ら、ＦＥＢＳ３６５：２０３−２０８頁、１９９５が含ま
れ、それらの教示は、参照により全て本明細書中に取り込まれる。

【０１８７】さらに、組換えポリペプチド変化体タンパク質における構造的差異の評価は、
ポリペプチド特異的モノクローナル抗体による免疫沈降及び熱変性曲線を用いて
評価し得るであろう。ポリペプチド、例えばＥＰＯのこれら特性を測定するため
の実験技術は、Ｓｙｔｋｏｗｓｋｉ及びＧｒｏｄｂｅｒｇ（米国特許第５，６１
４，１８４号明細書）；Ｓｙｔｋｏｗｓｋｉ（米国特許第５，５８０，８５３号
明細書）；及びＰｏｗｅｌｌ（米国特許第５，６８８，６７９号明細書）；に記
載されており、それらの教示は、参照により全て本明細書中に取り込まれる。

【０１８８】均等物本発明を、その好ましい態様を参照して、特に示し記載したが、添付の請求の
範囲により規定される本発明の主旨及び範囲から逸脱することなく、本発明にお
いて、形及び詳細において種々の変化をなし得ることは、当業者に理解されるで
あろう。当業者は、慣用の実験法を用いることで、本明細書中に明確に記載した
本発明の特定の態様との多くの均等物を認識し、確認することができるであろう
。かかる均等物は、請求の範囲の範囲に包含されるものとする。

【図面の簡単な説明】

【図１】Ｆｉｇｕｒｅ1 は、リンカー配列を介して、ＥＰＯＢｃＤＮＡに結合させ
たＥＰＯＡｃＤＮＡから成るＥＰＯ- ＥＰＯ二量体ＤＮＡ構築物を示すダイ
ヤグラムである。

【図２】Ｆｉｇｕｒｅ２は、ＰＣＲを用いた、ＥＰＯＡＤＮＡの製造及び[ ｇｌｙ
- ｇｌｙ- ｇｌｙ- ｇｌｙ- ｓｅｒ]₃をコードする連結ＤＮＡ鎖の連続的延長を
示すダイヤグラムである。

【図３】Ｆｉｇｕｒｅ３は、ＰＣＲを用いた、ＥＰＯＢＤＮＡの製造を示すダイヤ
グラムである。

【図４】Ｆｉｇｕｒｅ４は、Ｆｉｇｕｒｅ２の工程ＩＩ〜ＩＶの各最終産物を示すダイ
ヤグラムである。

【図５】Ｆｉｇｕｒｅ５は、Ｆｉｇｕｒｅ３の最終産物を示すダイヤグラムである。

【図６】Ｆｉｇｕｒｅ６は、ｐＣＲブラント- ＥＰＯＡ^IVのＢｇｌＩによる制限消化
物を示すダイヤグラムである。

【図７】Ｆｉｇｕｒｅ７は、ｐＣＲブラント- ＥＰＯＢ^IのＢｇｌＩによる制限消化
物を示すダイヤグラムである。

【図８】Ｆｉｇｕｒｅ８は、ｐＣＲブラント- ＥＰＯＡ^IV（−）の制限消化物を示す
ダイヤグラムである。

【図９】Ｆｉｇｕｒｅ９は、ｐＣＲブラント- ＥＰＯＢ^I（−）の制限消化物を示す
ダイヤグラムである。

【図１０】Ｆｉｇｕｒｅ１０は、ｐｃＤＮＡ３. １（−）のＸｈｏＩ及びＢａｍＨＩ制限
消化物を示すダイヤグラムである。

【図１１】Ｆｉｇｕｒｅ１１は、ｐｃＤＮＡ３. １- ＥＰＯ- ＥＰＯの制限消化物を示す
ダイヤグラムである。

【図１２】Ｆｉｇｕｒｅ１２は、ｍＲＮＡ及びタンパク質の構造がどのようにちがうのか
、遺伝子の５’及び３’ＵＴＲの変化によって、タンパク質の機能がどのように
生じうるのかを説明する概略図である。

【図１３】Ｆｉｇｕｒｅ１3 Ａ〜Ｃは、ヒトＥＰＯ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号
：１）を示す。

【図１４】Ｆｉｇｕｒｅ１４Ａ〜Ｆは、ＥＰＯ遺伝子の５’非翻訳領域におけるヌクレオ
チド４０１〜６２４の核酸配列（配列番号：２）( Ｆｉｇｕｒｅ１４Ａ) 及び５
つの変化体配列（配列番号：３〜７）( Ｆｉｇｕｒｅ１４Ｂ〜Ｆ) を示す。

【図１５】Ｆｉｇｕｒｅ１５Ａ〜Ｅは、ＥＰＯ遺伝子の３’非翻訳領域におけるヌクレオ
チド２７７３〜２９７２の核酸配列（配列番号：８）( Ｆｉｇｕｒｅ１５Ａ) 及
び４つの変化体配列（配列番号：９〜１２）( Ｆｉｇｕｒｅ１５Ｂ〜Ｅ) を示す
。

【図１６】Ｆｉｇｕｒｅ１６Ａ、１６Ｂ及び１６Ｃは、エリトロポエチン二量体ＥＰＯ^wt - Ｌ- ＥＰＯ^wtの核酸配列（配列番号：１６）及び対応するアミノ酸配列（配列
番号：１７）を示す。アミノ酸１７個分の長さを有するポリペプチドリンカー（
Ｌ）が、上記２つのＥＰＯタンパク質分子を連結する。

【図１７】Ｆｉｇｕｒｅ１７Ａ、１７Ｂ及び１７Ｃは、３００ＩＵ/ ｋｇタンパク質の単
回投与前（Ｐｒｅ）及び７日後（Ｐｏｓｔ）に得られたヘマトクリットの変化で
測定した際の、エリトロポエチン二量体融合タンパク質（ＥＰＯ- ＥＰＯ）、エ
リトロポエチン単量体（ＥＰＯ）、及びトランスフェクトされていないＣＯＳ１
細胞( 対照) 由来の培地のインビボ有効性を示す図である。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１１年７月１４日（１９９９．７．１４）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】図面の簡単な説明

【補正方法】変更

【補正内容】

【図面の簡単な説明】

【図２】Ｆｉｇｕｒｅ２は、ＰＣＲを用いた、ＥＰＯＡＤＮＡの製造及び[ ｇｌｙ
- ｇｌｙ- ｇｌｙ- ｇｌｙ- ｓｅｒ]₃（配列番号：２７）をコードする連結ＤＮ
Ａ鎖の連続的延長を示すダイヤグラムである。

【図４】Ｆｉｇｕｒｅ４は、Ｆｉｇｕｒｅ２の工程ＩＩ（配列番号：１３）；工程ＩＩ
Ｉ（配列番号：１４）；及び工程ＩＶ（配列番号：１５）の各最終産物を示すダ
イヤグラムである。

【図５】Ｆｉｇｕｒｅ５は、Ｆｉｇｕｒｅ３の最終産物、ｇｃｇｇｃａｇｔａｃｔ（配
列番号：２６）を示すダイヤグラムである。

【手続補正書】

【提出日】平成１３年６月２７日（２００１．６．２７）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ０７Ｋ 19/00 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/15 15/00 ＺＮＡＡ 1/19 Ａ６１Ｋ 37/02 1/21 37/24 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷＦターム(参考） 4B024 AA01 BA21 DA02 HA01 4B065 AA90X CA24 CA44 4C084 AA02 AA03 AA06 AA07 BA41 BA44 CA53 DB56 NA05 ZA552 4H045 AA10 AA20 AA30 BA10 BA41 CA40 DA13 EA24 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】２つ以上のタンパク質分子を含有してなる、生物学的活性の
増大した融合タンパク質。
【請求項２】増加した分泌率を有する請求項１記載の融合タンパク質。
【請求項３】前記タンパク質分子がエリトロポエチンを含有してなるもの
である、請求項１記載の融合タンパク質。
【請求項４】配列番号：１６を含有してなる請求項３記載のエリトロポエ
チン融合タンパク質をコードする、単離された核酸。
【請求項５】アミノ酸配列、配列番号：１７を含有してなる、請求項３記
載のエリトロポエチン融合タンパク質。
【請求項６】前記タンパク質分子がぺプチドリンカーにより連結されたも
のである、請求項１又は２記載の融合タンパク質。
【請求項７】前記ぺプチドリンカーが、互いの関係においてタンパク質分
子の自由な回転を可能にするものである、請求項６記載の融合タンパク質。
【請求項８】前記ぺプチドリンカーが、約１０個のアミノ酸から約２０個
のアミノ酸の長さである、請求項６又は７記載の融合タンパク質。
【請求項９】前記ぺプチドリンカーが約１５個のアミノ酸の長さである、
請求項８記載の融合タンパク質。
【請求項１０】前記アミノ酸が、グリシン、セリン、アスパラギン、トレ
オニン及びアラニンからなる群より選ばれる、請求項６〜９記載の融合タンパク
質リンカー。
【請求項１１】２つ以上のタンパク質分子を含有してなる、生物学的活性
の増大した融合タンパク質をコードする核酸配列を含有してなる核酸。
【請求項１２】請求項１１記載の前記核酸を含有してなるベクター。
【請求項１３】請求項１２記載のベクターでトランスフェクトされた宿主
細胞。
【請求項１４】請求項１〜１０いずれか記載の融合タンパク質及び薬学的
に許容され得る担体を含有してなる組成物。
【請求項１５】融合タンパク質を製造するのに好適な培地中で、請求項１
３記載の細胞を培養する工程を含む、融合タンパク質の製造方法。
【請求項１６】請求項１〜１０いずれか記載の融合タンパク質又は請求項
１１記載の核酸によりコードされる融合タンパク質の治療上有効量を哺乳類に投
与する工程を含む、かかる治療を必要とする哺乳類における病態又は欠陥の治療
又は予防方法。
【請求項１７】請求項３記載（又は、請求項３の従属項としての請求項４
〜１０いずれか記載）の前記融合タンパク質の治療上有効量を哺乳類に投与する
工程を含む、哺乳類における貧血の治療又は予防方法。
【請求項１８】２つ以上の分子を含有してなる融合タンパク質をコードす
る単離された核酸であって、該融合タンパク質は改変された生物学的活性を有す
るものであり、該核酸は該核酸の非コード領域に１つ以上の変異を有するもので
ある、単離された核酸。
【請求項１９】変異が５’非コード領域にある請求項１８記載の核酸。
【請求項２０】エリトロポエチン融合タンパク質をコードし、配列番号：
３；配列番号：４；配列番号：５；配列番号：６及び配列番号：７からなる群よ
り選ばれる核酸を含有してなる、請求項１９記載の核酸。
【請求項２１】請求項１８〜２１いずれか記載の核酸によりコードされる
融合タンパク質の治療上有効量を哺乳類に投与する工程を含む、かかる治療を必
要とする哺乳類における病態又は欠陥の治療又は予防方法。
【請求項２２】請求項１９〜２０記載の核酸によりコードされる融合タン
パク質及び薬学的に許容され得る担体を含有してなる組成物。
【請求項２３】請求項２０記載の核酸によりコードされる融合タンパク質
の治療上有効量を哺乳類に投与する工程を含む、哺乳類における貧血の治療又は
予防方法。
【請求項２４】変異が３’非コード領域にある請求項１８記載の核酸。
【請求項２５】ＥＰＯ融合タンパク質をコードし、配列番号：９；配列番
号：１０；配列番号：１１；及び配列番号：１２からなる群より選ばれる核酸を
含有してなる、請求項２４記載の核酸。
【請求項２６】請求項２４及び２５記載の核酸によりコードされる融合タ
ンパク質の治療上有効量を哺乳類に投与する工程を含む、かかる治療を必要とす
る哺乳類における病態又は欠陥の治療又は予防方法。
【請求項２７】請求項２４又は２５記載の融合タンパク質及び薬学的に許
容され得る担体を含有してなる組成物。
【請求項２８】請求項２５記載の核酸によりコードされる融合タンパク質
の治療上有効量を哺乳類に投与する工程を含む、哺乳類における貧血の治療又は
予防方法。
【請求項２９】変異が５’非コード領域及び３’非コード領域の両方にあ
る、請求項１８記載の核酸。
【請求項３０】ＥＰＯ融合タンパク質をコードし、配列番号：３；配列番
号：４；配列番号：５；配列番号：６；配列番号：７；配列番号：９；配列番号
：１０；配列番号：１１；及び配列番号：１２からなる群より選ばれる核酸を含
有してなる、請求項２９記載の核酸。
【請求項３１】請求項２９記載の核酸によりコードされる融合タンパク質
の治療上有効量を哺乳類に投与する工程を含む、かかる治療を必要とする哺乳類
における病態又は欠陥の治療又は予防方法。
【請求項３２】請求項２９記載の融合タンパク質及び薬学的に許容され得
る担体を含有してなる組成物。
【請求項３３】請求項３０記載の核酸によりコードされる融合タンパク質
の治療上有効量を哺乳類に投与する工程を含む、哺乳類における貧血の治療又は
予防方法。
【請求項３４】少なくとも１つのタンパク質分子が１つ以上の変異を有す
るものである、２つ以上のタンパク質分子を含有してなる生物学的活性の増大し
た融合タンパク質。
【請求項３５】前記タンパク質分子がエリトロポエチンを含有してなる、
請求項３４記載の融合タンパク質。
【請求項３６】エリトロポエチン分子の少なくとも１つが、１０３位のア
ルギニン残基がアラニンと置き換わる変異を有するものである、請求項３５記載
のエリトロポエチン融合タンパク質。
【請求項３７】請求項３４記載の融合タンパク質をコードする核酸。
【請求項３８】請求項３６記載の融合タンパク質をコードする核酸。
【請求項３９】請求項３６記載のエリトロポエチン融合タンパク質の治療
上有効量を哺乳類に投与する工程を含む、哺乳類における貧血の治療又は予防方
法。
【請求項４０】請求項３６記載の融合タンパク質及び薬学的に許容され得
る担体を含有してなる組成物。
【請求項４１】治療又は予防、例えば、かかる治療を必要とする哺乳類に
おける病態又は欠陥の治療又は予防に使用するための、請求項１〜１０いずれか
記載の融合タンパク質又は請求項１１、１８〜２０、２４〜２５及び２９〜３０
いずれか記載の核酸によりコードされる融合物。
【請求項４２】治療又は予防、例えば、かかる治療を必要とする哺乳類に
おける病態又は欠陥の治療又は予防に使用する薬物の製造のための、請求項１〜
１０いずれか記載の融合タンパク質又は請求項１１、１８〜２０、２４〜２５及
び２９〜３０いずれか記載の核酸によりコードされる融合タンパク質の使用。
【請求項４３】組成物の必須成分として、請求項１〜１０いずれか記載の
融合タンパク質又は請求項１１、１８〜２０、２４〜２５及び２９〜３０いずれ
か記載の核酸によりコードされる融合タンパク質の使用を特徴とする、（例えば
、かかる治療を必要とする哺乳類における病態又は欠陥の治療又は予防のための
）治療用又は予防用組成物の製造方法。
【請求項４４】融合タンパク質がエリトロポエチンを含有してなり、治療
又は予防が貧血の治療又は予防である、請求項４１記載の融合タンパク質、請求
項４２記載の使用又は請求項４３記載の方法。