JP4872327B2 - 改質されたインターロイキン−11とその製造方法 - Google Patents
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Description
本発明のIL-11においては糖鎖付加によって高次構造が大きく変化しない部位か、N末あるいはC末近傍に糖鎖が結合しているのが好ましい。
(1)糖鎖の付加を受けることができるペプチドをコードするcDNAとIL-11をコードするcDNAを連結する工程
(2)当該連結cDNAを発現ベクターに組み込む工程
(3)当該発現ベクターを糖鎖付加経路を有する宿主細胞に導入する工程
(4)当該宿主細胞において、糖鎖付加を受けることができるペプチドを介して糖鎖を付加したIL-11を発現させる工程
(5)当該宿主細胞において発現された糖鎖を付加したIL-11を単離・精製する工程
本発明に係る改質されたインターロイキン-11(以下、改質されたIL-11)は、IL-11の所定の領域に糖鎖が付加、好ましくは共有結合によって付加され、IL-11が本来有する生理活性が向上したものである。本発明において、改質されたとは、IL-11が本来的に有する生物活性が向上したことを意味する。また、改質されたとは、生体内における分解酵素からの保護作用と親水性の付与による生体安定性が増強されることも意味する。
まず、分泌シグナルおよび糖鎖の付加を受けることが知られているペプチドをコードするオリゴヌクレオチドを合成し、あるいはPCR反応によって増幅し、これをIL-11をコードするプラスミドの所望の位置(例えば5‘末端)に組み込む。分泌シグナルおよび糖鎖の付加を受けることが知られているペプチドとしては、典型的な分泌型糖蛋白質のアミノ末端を利用することができる。IL-11蛋白質をコードするプラスミドはIL-11蛋白質をコードするDNAを適当なプラスミドに組み込むことにより調製することができる。このIL-11蛋白質をコードするDNAを組み込むプラスミドとしては、宿主内で複製保持されるものであれば、いずれも使用することができるが、例えば大腸菌由来のpBR322, pUC18,およびこれらを基に構築されたpET-3cなどを挙げることができる。
ヒトIL-11をコードする遺伝子断片をPCRにより増幅し、BstX1リンカーを付加した。これをBstX1制限酵素処理により切断したプラスミドベクターSRα BX3とライゲーションさせた。得られたプラスミドを用いてコンピテントセルJM109を形質転換し、アンピシリンによるスクリーニングを経てpSRα hIL-11を得た(図1)。なお、本例で使用したヒトIL-11をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号1に、当該遺伝子によりコードされるヒトIL-11のアミノ酸配列を配列番号2に示す。
実施例1で得られたプラスミドpSRαhIL-11、pSRαN(NAS)hIL-11およびpSRαC(NAS)hIL-11を用いてCOS7細胞を形質転換し、発現パターンを調べた。6穴プレートを用いてCOS7細胞をダルベッコーMEMにウシ胎児血清10%を含む培養液を用いて80%コンフルエントになるように細胞を接種し、翌日、無血清培地Opti-MEM-1(GIBCO)に培地交換し、対照プラスミド、pSRαhIL-11、pSRαN(NAS)hIL-11若しくはpSRαC(NAS)hIL-115μgを15μLのリポフェクション試薬(Lipofectoamine 2000, Invitrogen)と共に各ウエルに添加し、4時間後に2mLの無血清Opti MEM-1あるいは1%ウシ胎児血清を含むOpti MEM-1に培地交換した。2日毎に培地交換を繰り返し、培養液をハーベストしてELISAキット(R&D Systems)で発現量を測定した。結果を表1に示した。
実施例1で得られたプラスミドpSRαhIL-11、pSRαN(NAS)hIL-11およびpSRαC(NAS)hIL-11の各種動物細胞での各種IL-11蛋白質の発現を調べた。6穴プレートを用い、COS7、KB、293細胞はダルベッコーMEMを用いて、CHOdhfr(-)細胞は核酸物質を含有したαMEMを用いて、それぞれウシ胎児血清10%を添加して80%コンフルエントになるように接種した。翌日、これら細胞のウエルを2種類に分け、無血清培地Opti-MEM-1(GIBCO)(グルコース含量1g/L)とさらに3g/Lのグルコースを添加したOpti-MEM1に培地交換し、対照プラスミドおよびN末あるいはC末にN型糖鎖結合サイトを導入したプラスミドDNAのそれぞれ5μgを15μLのリポフェクション試薬(Lipofectoamine 2000, Invitrogen)と共に各ウエルに添加した。4時間後に2mLの無血清Opti MEM-1に培地交換し、3日めに培養上清をハーベストし、ELISAキット(R&D Systems)を用いて発現量を測定比較した。結果を表2に示した。
本例では、実施例3で調製した各種細胞で発現したIL-11および糖鎖付加型IL-11を検出した。先ず、各種細胞の培養上清をタンパク質サンプルとし、SDS-PAGEにかけたのちウエスタンブロッティングを行い、ゲルからPVDFメンブレンに転写した。メンブレンを1μg/mLの一次抗体(SIGMA Anti-IL-11 cat.#I5270)、0.2μg/mLの二次抗体(VECTOR PEROXIDASE ANTI-GOAT IgG(H+L) cat.#PI-9500)によりIL-11標識し、ECL plus Western Blotting Detection Reagents(Amersham Biosciences cat.#RPN2132)を用いて化学発色させた。Tyhoon9400(Amersham Biosciences)によって解析を行なった。
COS7細胞で発現されたIL-11および糖鎖付加型IL-11をタンパク質サンプルとし、これをSDS-PAGEにかけたのちウエスタンブロッティングを行い、ゲルからPVDFメンブレンに転写した。メンブレンを、ECL glycoprotein detection system(Amersham Biociences cat.#RPN2190)により糖タンパク質標識し、ECL plus Western Blotting Detection Reagents(Amersham Biosciences cat.#RPN2132)を用いて化学発色させた。Tyhoon9400 (Amersham Biosciences)によって解析を行なった。
本実施例では、pSRαhIL-11、pSRαN(NAS)hIL-11を導入した各種細胞由来IL-11蛋白質のマウスプラズマサイトーマ(T1165)に対する増殖活性を24穴プレートを用いて調べた。マウスプラズマサイトーマ細胞株T1165は、IL-11およびIL-6特異的に増殖することが知られている細胞である。
本実施例では、pSRαhIL-11、pSRαN(NAS)hIL-11をCOS7細胞に導入し、得られたIL-11蛋白質のマウスプラズマサイトーマ細胞(T1165)に対する増殖促進活性のタイムコースを調べた。RPMI1640培地にウシ胎児血清10%と10ng/mLの精製hIL-11を添加した培養液で培養したT1165細胞を、IL-11不含の培養液で洗浄後、ウエル当たり約1万個接種した。各種IL-11の10ng/mLを細胞に処理し5日間の増殖パターンを比較した。細胞数はコールターカウンター(コールター社)を用い、それぞれ日数ごとに4ウエルをカウントし、平均値および標準誤差を求めた(図5)。
実施例1で構築したベクターpSRα-hIL-11およびV5-Histidine 配列を有したベクターpcDNA6/V5-His-B-hIL-11を改変し、新たにN型糖鎖付加配列としてNASの3アミノ酸、あるいはO型糖鎖付加配列としてAAATPAPGの8アミノ酸をIL-11の配列の各所に融合させた融合蛋白質を設計し、表3に示したような発現ベクターを構築した。
実施例8で構築された改変ベクターを実施例2に示した方法に従ってCOS-7およびCHOdhfr-細胞に導入し一過性発現させ、これらの細胞から各ベクター由来のIL-11の改変体16種を得た。改変ベクターとそれら由来の蛋白質の名称を表4に示した。得られた蛋白質の確認のために、実施例4に示された方法に従って改変体のウエスタンブロッテイング解析を行った結果を図6に示した。
実施例9で得られたIL-11改変体の細胞増殖促進活性をマウスプラズマサイトーマ(T1165)を用いて野生型(W)蛋白質と比較検討した。24穴プレートにウエル当たり1万個の細胞を接種し、実施例6に示した方法に従って細胞を培養した。4日後の細胞数をコールターカウンターで測定し、図7に結果を示した。
本実施例では、pcDNA6/V5-His-B-IL-11、pcDNA6/V5-His-B-N-NAS-hIL-11、pcDNA6/V5-His-B-N-2NAS-hIL-11、pcDNA6/V5-His-N-3NAS-hIL-11の各種プラスミドをCOS7細胞に導入し、得られたN末に1-3個のN型糖鎖を導入したIL-11蛋白質の細胞増殖促進活性をマウスプラズマサイトーマ細胞(T1165)を用いて比較検討した。これらプラスミドを実施例3に示した方法で細胞に導入し、Histidineタグが付加された各種IL-11を得た。Histidineタグの付加による生物活性の低下はないことが確認されている。T1165細胞をIL-11不含の培養液で洗浄し、24穴プレートにウエル当たり1万個の細胞を接種した。各ウエルに0.001-10 ng/mLの濃度の各種IL-11を加え、4日間培養を行った。増殖した細胞数をコールターカウンター(コールター社)を用い、各濃度毎に4ウエルをカウントし、平均値と標準誤差を求め、図8のグラフに示した。また、これらIL-11による細胞増殖活性のED50値を求め、表5に示した。各種IL-11添加細胞数からIL-11不含の細胞数を引き、IL-11不含の細胞数を0%、細胞数の最大値を100%にして50%の増殖を示すIL-11の濃度をED50値として示した。
本実施例では、改質されたIL-11を構成的に産生するCHO細胞株を樹立し、マイクロキャリアー培養法を用いて培養し、精製用原液の大量調製を行った結果を示した。
本実施例では、糖鎖付加型IL-11改変体 (N-NAS)の精製を行うにあたり、操作性、回収率の優れた初段クロマトグラフィーに用いる担体をスクリーニングした結果を示した。担体として陽イオン交換担体(HiTrap SP HP, Amersham Bioscience), ハイドロキシアパタイト担体(Bio-Gel HTP Hydroxyapatite, Bio-Rad)、シリカ担体(Micro Bead Silica Gel 5D 100-200 mesh, Fuji-Davison Chemical)、ブルーセファロース担体(Blue Sepharose 6 Fast Flow, Amersham)、ヘパリン担体(Heparin Sepharose CL-6B, Pharmacia)、金属キレート担体などの検討を行った。表6に陽イオン交換体、シリカ担体、ブルーセファロース担体、ハイドロキシアパタイト担体についての結果をまとめた。
本実施例では、糖鎖付加型IL-11の精製法として確立したハイドロキシアパタイト担体およびシリカ担体あるいはブルーセファロース担体を用いた精製法について示した。実施例12に示した方法に従い精製用原液を調製した。精製原液をハイドロキシアパタイトカラム(Bio-Gel HTP Hydroxyapatite, Bio-Rad)にアプライし、フロースルーを集め、2段目のシリカ担体(Micro Bead Silica Gel 5D, Fuji Davison Chemical)あるいはブルーセファロース担体(Blue Sepharose 6 Fast Flow, Amersham)にアプライし、それぞれ20mMPB, PBS(-)で洗浄後、15mMHCl-50%EG, 20mMPB-1MnaCl-50%EGで溶出した。表7および表8にハイドロキシアパタイト/シリカ、ハイドロキシアパタイト/ブルーセファロースによる精製の結果をまとめた。また、各精製画分についてSDS-PAGE電気泳動を行い、銀染色およびウエスタンブロッテイングを行った結果を図10及び11に示した。図10および図11の結果から、上記いずれの精製フローによっても銀染色で糖鎖付きIL-11が単一バンドに精製されることが判明した。
本実施例では、野生型IL-11の精製法として確立したイオン交換クロマトグラフィーおよびゲル濾過を用いた精製法について示した。実施例11に示した方法に従いCHOdhfr-細胞にIL-11(wild)発現ベクターおよびdhfr発現ベクターを導入し、構成的に野生型IL-11を産生する細胞株を得た。マイクロキャリアー培養法を用いて精製用培養上清を集めた。培養上清400 mLをNMWL 10,000の限外濾過フィルターを用いて25 mlに濃縮し、リン酸バッファ(30 mM, pH 7.2)で10倍希釈した(バッファ置換)。
SPカラム画分4(図12(A)及び(B)におけるレーン8)をゲル濾過カラム(Amersham Biosciences HiLoad 26/60 Superdex 75)を用いて5 mlずつ分画した。各画分について、ドットブロッティングによってIL-11の存在を調べた(図省略)。
Claims (15)
- 配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるヒトインターロイキン-11における22番目(プロリン)、114番目(アラニン)及び160番目(ロイシン)からなる群から選ばれる少なくとも1つのアミノ酸残基のC末端側に糖鎖の付加を受けることができるペプチドが導入され、当該ペプチドに糖鎖を付加させることにより改質されたインターロイキン-11。
- 上記糖鎖が1ないし複数個である請求項1記載の改質されたインターロイキン-11。
- 上記糖鎖が複数個である請求項1記載の改質されたインターロイキン-11。
- 上記糖鎖がN型糖鎖である請求項1記載の改質されたインターロイキン-11。
- 上記糖鎖がO型糖鎖である請求項1記載の改質されたインターロイキン-11。
- 上記糖鎖がNおよびO型糖鎖の組み合わせよりなる請求項1記載の改質されたインターロイキン-11。
- 糖鎖の付加を受けることができるペプチドをコードする遺伝子を、配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるヒトインターロイキン-11をコードする遺伝子における22番目(プロリン)、114番目(アラニン)及び160番目(ロイシン)からなる群から選ばれる少なくとも1つのアミノ酸残基をコードするコドンの下流に組み込んだプラスミドを細胞に導入し、当該細胞が産生する、糖鎖が付加されたインターロイキン-11を単離することを特徴とする改質されたインターロイキン-11の製造方法。
- 上記細胞が枯草菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞である請求項7記載の改質されたインターロイキン-11の製造方法。
- 上記細胞が糖鎖生合成系酵素をコードする遺伝子を組み込んだベクターを含むことを特徴とする請求項7又は8記載の改質されたインターロイキン-11の製造方法。
- 上記糖鎖生合成酵素がヒト型である請求項9記載の改質されたインターロイキン-11の製造方法。
- 上記動物細胞が哺乳類細胞である請求項8記載の改質されたインターロイキン-11の製造方法。
- 上記哺乳類細胞がヒト細胞である請求項11記載の改質されたインターロイキン-11の製造方法。
- 細胞が産生する糖鎖が付加されたインターロイキン-11を単離するためにハイドロキシアパタイトを用いたクロマトグラフィーにより精製することを特徴とする請求項7記載の改質されたインターロイキン-11の製造方法。
- シリカ担体、ブルーセファロース担体、陽イオン交換担体、ゲル濾過担体を用いるクロマトグラフィーを組み合わせて精製する事を特徴とする請求項7〜13のいずれか1項記載の改質されたインターロイキン-11の製造方法。
- 請求項1〜6のいずれか1項記載の改質されたインターロイキン-11を有効成分として含有する医薬組成物。
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