KR0139095B1 - 신규 사이토카인 - Google Patents

Abstract

인간 골수 간질 세포로부터 mRNA를 추출하여 cDNA를 작성하고, 클로닝 후에 포유류의 세포로 발현시켰다. 세포 배양 상청에 관하여 지방 세포화 억제 활성을 발견하여, 이 배양 상청으로부터 이 활성을 갖는 단백을 분리, 정제하였다. 환원 조건하에서의 SDS-PAGE 전기 영동에 의해 외견의 분자량 약 23,000을 나타내고, 에드만 분해법에 의해 N 말단의 아미노산 배열의 동정에 의해 N 말단에 프롤린 잔기를 갖는 단백인 것이 발견되었다. 이것과 앞서의 유전자 클로닝의 결과로부터 이 단백의 전 1차 구조가 결정되고, 지방 세포화 억제 활성 및 신규한 구조를 갖는 사이토카인인 것이 판명되었다.

본 발명에 의해 신규 지방 세포화 억제 인자를 재조합 DNA 기술을 사용하여 대량으로 얻을 수가 있게 되고, 각종 혈구 감소증 및 다른 질환에 대한 치료 및 진단이 가능케 되었다.

Description

[발명의 명칭]

신규 사이토카인

[발명의 상세한 설명]

[기술분야]

본 발명은 세포의 지방 세포화를 억제하는 활성, 지방 세포의 리포프로테인·리파제(LPL)를 억제하는 활성 및/또는 콜로니 자극 인자(colony stimulating factor, CSF)를 유도하는 활성을 갖는 신규한 단일의 단백질에 관한 것이며, 또한 이 단백질을 코딩하는 DNA, 이 DNA로 구성되는 재조합 DNA 발현벡터, 이 재조합 DNA 발현벡터로 형질전환시킨 숙주 및 이 단백질의 유효량을 함유하는 단백질 조성물에 관한 것이다.

[배경기술]

생체의 조혈에는 조혈간세포와 각종 조혈인자와 함께 조혈을 지지하는 골수간질세포 즉 조혈미소환경의 존재가 필요로 된다는 것이 현재 널리 알려져 있다. 인간에 있어서, 출생시에는 전 골수로 활발히 조혈이 행해지고 있으나, 성장에 수반하는 골수강의 확대에 비해 조혈의 필요가 없게 되면, 골수는 사지 말초로부터 점점 지방 세포로 점거된다. 조혈이 행해지고 있는 골수를 적색수, 지방으로 치환된 골수를 황색수라고 부른다. 출혈이나 용혈 등으로 조혈이 항진하면 황색수는 다시 조혈을 개시한다(가시무라 마꼬또(1988), 의학의 발자취 146. 264∼268).

조혈미소환경에서 조혈지지기능을 갖는 세포는 주로 전(前)지방세포이며, 그것이 지방세포로 분화하면 그의 능력을 상실해 버린다는 것이 알려져 있다(고따마 히로아끼(1986) 조직 배양 12. 191∼195).

예컨대, 마우스 골수형 전지방 세포주 PA6는, 조혈간세포의 증식을 지지하는 활성을 가지나, 이 세포가 지방세포로 분화되면 그의 능력이 저하된다(Kodama H.-A. et al.(1984), J. Cell, Physiol. 118, 233∼240). PA6 세포와 마우스 골수세포를 함께 배양하면, 아구콜로니, 거핵구콜로니, 마크로파지콜로니가 유도될 수 있다는 것이 알려져 있기 때문에(고따마 히로아끼, (1987), 실험의학, 5, 826∼830), 지방 세포화 억제 활성을 갖는 단백질은 골수의 전지방세포 및 지방세포에 작용되어서 그의 조혈지지능력, 즉, 백혈구, 마크로파지, 혈소판(거핵구에 유래) 등의 유도 능력을 항진시킨다.

또 마우스 골수 유래 전지방세포주 H-1/A는 CSF를 생산하고 있으나, 이 세포가 지방세포로 분화되면, CSF 생산량이 저하한다는 것이 보고되어 있다(Nakamara, M. et al. (1985), Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 179, 283∼287).

후술하는 바와 같이 본 발명의 지방세포와 억제인자는 H-1/A 세포에 작용하여 마크로파아지·콜로니 자극 인자(macrophage-colony stimalating factor, M-CSF)의 생산을 항진시키는 작용을 갖고 있다. M-CSF는 단구 및 마크로파아지에 대한 자극활성 외에 거핵구 증폭인자(megakaryocyte potentiator, Meg-POT)로서의 작용을 갖는다(Teramura, M. et al.(1990), Int. J. Cell Cloning, 8, 245∼252). 또한, M-CSF는 단구에 작용시켜서 단구로부터의 Meg-POT의 생산을 항진시키는 활성도 알려져 있다. 또한, 임상치료의 데이터는 M-CSF가 암화학 요법후의 호중구 감소증이나 혈소판 감소증으로부터의 회복을 촉진시키는 것을 나타내고 있다(모또기찌 가즈오, (1986), 암과 화학요법, 16, 3531∼3536).

따라서 본 발명의 지방세포와 억제인자는 골수 또는 말초의 전지방 세포 및 지방세포에 작용시켜, 그의 조혈지지기능을 항진시킨다.

본 발명 이전에 지방세포의 LPL을 억제하여 지방세포분화를 억제하는 단백질로서 종양 괴사 인자(tumor necrosis factor-α, TNF-α)(Pricem, S. R. et al.(1986) Arch. Biochem. Biophys, 251, 783∼746; kawakami, M. et al.(1987) J. Biochem. 101, 331∼338), 인터로이킨-1(interleukin-1, IL-1)(Beutler, B.A. and Cerami, A. (1985) J. Immunol. 135, 3969∼3971). 인터페론(interferon, IFN)(Keay, S. and Grossberg, S.E.(1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4099∼4103; Patton, J. S. et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 8313∼8317) 및 류케미아·인히비터리 펙터(Ieukemia inhibitory factor, LIF)(Mori, M. et al.(1989) Biochem. Biophys. Res. Commun. 160, 1085∼1092)가 알려져 있다. 이것들의 인자는 이미 cDNA가 클로닝되고 있고, 그의 전구조가 명백히 되어 있다.

본 발명의 우선일 이전에 원숭이의 인터로이킨 11의 프로체의 cDNA를 단리하여 발현시키고 배양액의 plasmacytoma자극 활성, megakaryocyte 콜로니 형성 활성을 발견한 보고가 있으나(Proc. Natl. Acad. Sci. USA vol, 87, pp. 7512∼7516, (1990)), 원숭이의 인터로이킨 11의 물리적 동정을 명확히 하고 있지 않으며, 인간의 인터로이킨 11에 관해서는 발현 및 활성의 확인을 하지 않았으므로, 본 발명과의 직접적인 관련성을 갖고 있지 않다.

[발명의 개시]

본 발명자들은, 세포의 지방세포화를 억제하는 활성, 지방세포의 리포프로테인·리파제(LPL)를 억제하는 활성 및 콜로니 자극 인자(colony stimualating factor, CSF)을 유도하는 활성(CSF 유도 활성)을 갖는 신규한 단일의 단백질을 발견하고, 이 단백질을 유전자 조작의 수법을 사용하여 대량으로 얻는 것을 가능케 하여, 본 발명을 완성하였다.

본 발명에 의한 지방 세포화 억제 인자를 대량으로 얻는 것이 가능케 되고, 각종 빈혈증 및 그외의 혈액질환의 치료 및 진단에 유효하게 적용할 수가 있도록 된다.

예컨대, 재생 불량성 빈혈, 독물이나 방사선에 의한 백혈구 감소증, 비루스·세균·기생충 등에 의한 감염증, 골수이식후의 혈구 감소증 및 항암제 등에 의한 화학요법후의 혈구감소중에 적용할 수 있다. 또한, 현재 널리 행해지고 있는 성분 수혈의 절약을 가져올 수 있다. 또한, 이것들의 면역기능증강효과 뿐만 아니라 병적인 비만의 예방 또는 치료제로서의 이용도 가능하다.본 발명에 있어서, 「혈구감소증」이란, 이들 모든 질환 및 그것에 부수하여 생기는 각종 면역 질환을 말하고, 「혈구 감소증 개선제」란, 혈구감소증의 예방, 치료에 유효한 효과를 갖는 약제를 총칭한다.

또한, 전지방세포의 지방세포에의 형태변화를 억제하는 활성, 지방 세포의 리포프로테인·리파제(LPL)를 억제하는 활성, 또는 전지방세포의 CSF 생산능률 유지·촉진하는 활성의 하나 또는 2개 이상을 「지방세포화 억제활성」이라고 부르고, 이러한 활성을 갖는 단백질을 「지방 세포화 억제 인자」라고 부른다.

본 발명은,

(1) 유전자 조작에 의해서 얻어지고, 인간유래의 다른 단백질을 실질적으로 함유하지 않으며, 이하의 성질을 가지며, 지방세포와 억제활성을 갖는 단백질;

① 12.5% 겔을 사용한 환원조건하에서의 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동에 있어서, 외견상 약 23,000의 분자량을 나타내고,

② 배열표의 배열번호 2에 표시되는 아미노산 배열 중, 아미노산 번호 1∼10까지의 N말단 아미노산 배열을 가지며,

③ (a) 컬럼으로서 CM 도요파르팩 650M(2.2×20cm, 도소(주)제)를 사용하고,

(b) 용리완충액으로서, A액 (10mM 붕산-NaOH(pH 9.0), 13mM KCl) 및 B액(300mM NaCl을 함유하는 A액)을 사용하고,

(c) 유속을 3ml/분으로 하고

(d) 농도 구배를, 50분에 걸쳐 100% A액으로부터 100% B액에의 직선 농도 구배로 하는 조건하에서 약양이온 교환 크로마토그래피에 있어서, NaCl 농도가 220mM로부터 290mM의 범위에서 용출된다.

(2) 유전자 조작에 의해서 얻어지고, 인간 유래의 다른 단백질을 실질적으로 함유하지 않으며, 배열표의 배열번호 2에 표시되는 아미노산 배열 중, 아미노산 배열 중, 아미노산 번호 1∼178까지의 아미노산 배열을 포함하는 지방 세포화 억제 활성을 갖는 단백질,

(3) 유전자 조작에 의해서 얻어지고, 인간 유래의 다른 단백질을 실질적으로 함유하지 않으며, 배열표의 배열 번호 2에 표시되는 아미노산 배열 중, 아미노산 번호 1∼178까지의 아미노산 배열로 이루어지는 지방세포화 억제활성을 갖는 단백질,

(4) N 말단에 수소원자 또는 Met를 갖는 (1), (2) 또는 (3)에 규정되는 단백질,

(5) (1), (2), (3) 또는 (4)에 규정되는 단백질을 코딩하는 DNA,

(6) 배열표의 배열번호 1에 표시되는 뉴클레오티드배열 중, 뉴클레오티드 번호 81로부터 614까지의 뉴클레오티드 배열 또는 그것과 같은 효력의 뉴클레오티드 배열로 이루어진 (1) 또는 (2)에 규정되는 단백질을 코딩하는 DNA.

(7) 배열표의 배열번호 1에 표시되는 뉴클레오티드 배열 중, 뉴클레오티드 번호 81로부터 614까지의 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 (1) 또는 (3)에 규정되는 단백질을 코딩하는 DNA.

(8) (5), (6) 또는 (7)에 규정되는 DNA의 5' 말단에 ATG를 갖는 DNA,

(9) (5), (6), (7) 또는 (8)에 규정되는 DNA로 이루어지고, 이 DNA가 발현 가능하고 또한 복제가능한 재조합 DNA 발현벡터,

(10) (9)에 규정되는 재조합 DNA 발현벡터로 형질전환시킨 숙주.

(11) (1), (2), (3) 또는 (4)에 규정되는 단백질을 코딩하고 있는 DNA로 이루어지고, 이 DNA가 발현가능하고 또한 복제가능한 재조합 DNA 발현벡터로 형질전환시킨 숙주를 배양하고, 그의 세포추출액 또는 그의 배양액으로부터 이 단백질을 회수하는 것으로 이루어지는 이 단백질의 제조법,

(12) (1), (2), (3) 및/또는 (4)에 규정되는 단백질의 치료학적 유효량을, 약학적으로 허용할 수 있는 담체 또는 부형제와 함께 함유하는 약학적 조성물,

(13) (1), (2), (3) 및/또는 (4)에 규정되는 단백질의 치료학적 유효량을, 약학적으로 허용할 수 있는 담체 또는 부형제와 함께 함유하는 혈구 감소증 개선제,

(14) (1), (2), (3) 및/또는 (4)에 규정되는 단백질의 치료학적 유효량을, 약학적으로 허용할 수 있는 담체 또는 부형제와 함께 함유하는 항비만제,

(15) (1), (2), (3) 및/또는 (4)에 규정되는 단백질의 치료학적 유효량을, 혈구 감소증의 환자에게 투여하는 전지방 세포로부터 지방 세포에의 분화를 억제하는 치료 또는 예방방법에 관한 것이다.

(16) (1), (2), (3) 및/또는 (4)에 규정되는 단백질의 치료학적 유효량을, 비만의 환자에게 투여하는 전지방 세포로부터 지방 세포에의 분화를 억제하는 치료 또는 예방방법에 관한 것이다.

본 발명의 단백질로서, 바람직하게는 (2) 또는 (3)에 규정되는 단백질이며, 더욱 바람직하게는 (3)에 규정되는 단백질이다.

또한 DNA로서는 바람직하게는 (2) 또는 (3)에 규정되는 단백질을 코딩하는 DNA이며, 더욱 바람직하게는 (3)에 규정되는 단백질을 코딩하는 DNA이다.

(1)에 규정하는 단백질을 다른 방법으로 기재하면,(17) 유전자 조직에 의해서 얻어지고 인간 유래의 다른 단백질을 실질적으로 함유하지 않으며, 이하의 성질을 가지며, 지방 세포화 억제 활성을 갖는 단백질 :

① 12.5% 겔을 사용한 환원조건하에서의 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동에 있어서, 외견상 약 23,000의 분자량을 나타내고,

② (N)-Pro Gly Pro Pro Pro Gly Pro Pro Arg Val의 N 말단 아미노산 배열을 가지며,

③ (a) 칼럼으로서 CM 도요파르팩 650M(2.2×20cm, 도소(주)제)를 사용하고, (b) 용리 완충액으로서, A액(10mM 붕산-NaOH(pH 9.0), 13mM KCL) 및 B액(300mM NaCl)을 함유하는 A액)을 사용하고,

(c) 유속을 3ml/분으로 하고,

(d) 농도 구배를 50분에 걸쳐 100% A액으로부터 100% B액에의 직선 농도 구배로 하는 조건하에서의 약양이온 교환 크로마토그래피에 있어서, NaCl 농도가 220mM로부터 290mM인 범위에서 용출되는 것이며, (2)에 규정하는 단백질을 다른 방법으로 기재하면,

(18) 유전자 조작에 의해서 얻어지고, 인간 유래의 다른 단백질을 실질적으로 함유하지 않으며, 이하의 일반식 (Ⅰ)으로 표시되는 아미노산 배열을 포함하는 지방 세포화 억제 활성을 갖는 단백질 :

(N) - Pro Gly Pro Pro Pro Gly Pro Pro Arg Val Ser Pro Asp Pro Arg

Ala Glu Leu Asp Ser Thr Val Leu Leu Thr Arg Ser Leu Leu Ala

Asp Thr Arg Gln Leu Ala Ala Gln Leu Arg Asp Lys Phe Pro Ala

Asp Gly Asp His Asn Leu Asp Ser Leu Pro Thr Leu Ala Met Ser

Ala Gly Ala Leu Gly Ala Leu Gln Leu Pro Gly Val Leu Thr Arg (Ⅰ)

Leu Arg Ala Asp Leu Leu Ser Tyr Leu Arg His Val Gin Trp leu

Arg Arg Ala Gly Gly Ser Ser Leu Lys Thr Leu Glu Pro Glu Leu

Gly Thr Leu Gln Ala Arg Leu Asp Arg Leu Leu Arg Arg Leu Gln

Leu Leu Met Ser Arg Leu Ala Leu Pro Gln Pro Pro Pro Asp Pro

Pro Ala Pro Pro Leu Ala Pro Pro Ser Ser Ala Trp Gly Gly Ile

Arg Ala Ala His Ala Ile Leu Gly Gly Leu His Leu Thr Leu Asp

Trp Ala Val Arg Gly Leu Leu Leu Leu Lys Thr Arg Leu-(C)

이며,

(3)에 규정하는 단백질을 다른 방법으로 기재하면,

(19) 유전자 조작에 의해서 얻어지고, 인간 유래의 다른 단백질을 실질적으로 함유하지 않으며, 이하의 일반식(Ⅰ)으로 표시되는 아미노산 배열로 이루어지는, 지방세포화 억제 활성을 갖는 단백질 :

(N) - Pro Gly Pro Pro Pro Gly Pro Pro Arg Val Ser Pro Asp Pro Arg

Ala Glu Leu Asp Ser Thr Val Leu Leu Thr Arg Ser Leu Leu Ala

Asp Thr Arg Gln Leu Ala Ala Gln Leu Arg Asp Lys Phe Pro Ala

Asp Gly Asp His Asn Leu Asp Ser Leu Pro Thr Leu Ala Met Ser

Ala Gly Ala Leu Gly Ala Leu Gln Leu Pro Gly Val Leu Thr Arg (Ⅰ)

Leu Arg Ala Asp Leu Leu Ser Tyr Leu Arg His Val Gin Trp leu

Arg Arg Ala Gly Gly Ser Ser Leu Lys Thr Leu Glu Pro Glu Leu

Gly Thr Leu Gln Ala Arg Leu Asp Arg Leu Leu Arg Arg Leu Gln

Leu Leu Met Ser Arg Leu Ala Leu Pro Gln Pro Pro Pro Asp Pro

Pro Ala Pro Pro Leu Ala Pro Pro Ser Ser Ala Trp Gly Gly Ile

Arg Ala Ala His Ala Ile Leu Gly Gly Leu His Leu Thr Leu Asp

Trp Ala Val Arg Gly Leu Leu Leu Leu Lys Thr Arg Leu-(C)

이다.

(6)에 규정하는 DNA를 다른 방법으로 기재하면, (20) 이하의 일반식(Ⅱ)으로 표시되는 뉴클레오티드 배열 또는 그것과 같은 효력의 뉴클레오티드 배열을 이루어지는 (17) 또는 (18)에 규정되는 단백질을 코딩하는 DNA :

(5')-CCT GGG CCA CCA CCT GGC

CCC CCT CGA GTT TCC CCA GAC CCT CGG GCC GAG CTG GAC AGC ACC GTG

CTC CTG ACC CAC TCT CTC CTG GCG GAC ACG CGG CAG CTG GCT GCA CAG

CTG AGG GAC AAA TTC CCA CGT GAC GGG GAC CAC AAC CTG GAT TCC CTG

CCC ACC CTG GCC ATG AGT GCG GGG GCA CTG GGA GCT CTA CAG CTC CCA

GGT GTG CTG ACA AGG CTG CGA GCG GAC CTA CTG TCC TAC CTG CGG CAC

GTG CAG TGG CTG CGC CGG GCA GGT GGC TCT TCC CTG AAG ACC CTG GAG

(Ⅱ)

CCC GAG CTG GGC ACC CTG CAG GCC CGA CTG GAC CGG CTG CTG CGC CGG

CTG CAG CTC CTG ATG TCC CGC CTG GCC CTG CCC CAG CCA CCC CCC GAC

CCG CCG GCG CCC CCG CTG GCG CCC CCC TCC TCA GCC TGG GGG GGC ATC

AGG GCC GCC CAC GCC TAC CTG GGG GGG CTG CAC CTG ACA CTT GAC TGG

GCC GTG AGG GGA CTG CTG CTG CTG AAG ACT CGG CTG-(3')

이며,

(7)에 규정하는 DNA를 다른 방법으로 기재하면, (21) 이하의 일반식(Ⅱ)으로 표시되는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 (17) 또는 (19)에 규정되는 단백질을 코딩하는 DNA :

(5')-CCT GGG CCA CCA CCT GGC

CCC CCT CGA GTT TCC CCA GAC CCT CGG GCC GAG CTG GAC AGC ACC GTG

CTC CTG ACC CAC TCT CTC CTG GCG GAC ACG CGG CAG CTG GCT GCA CAG

CTG AGG GAC AAA TTC CCA CGT GAC GGG GAC CAC AAC CTG GAT TCC CTG

CCC ACC CTG GCC ATG AGT GCG GGG GCA CTG GGA GCT CTA CAG CTC CCA

GGT GTG CTG ACA AGG CTG CGA GCG GAC CTA CTG TCC TAC CTG CGG CAC

GTG CAG TGG CTG CGC CGG GCA GGT GGC TCT TCC CTG AAG ACC CTG GAG

(Ⅰ)

CCC GAG CTG GGC ACC CTG CAG GCC CGA CTG GAC CGG CTG CTG CGC CGG

CTG CAG CTC CTG ATG TCC CGC CTG GCC CTG CCC CAG CCA CCC CCC GAC

CCG CCG GCG CCC CCG CTG GCG CCC CCC TCC TCA GCC TGG GGG GGC ATC

AGG GCC GCC CAC GCC TAC CTG GGG GGG CTG CAC CTG ACA CTT GAC TGG

GCC GTG AGG GGA CTG CTG CTG CTG AAG ACT CGG CTG-(3')

이다.

본 발명의 DNA는 예컨대 지방 세포화 억제 활성을 갖는 단백을 생산하는 능력을 갖는 포유 동물 세포등으로부터 이 단백질을 코딩하는 mRNA를 조제한 후, 공지된 방법에 의해 2개 사슬 cDNA로 변환함으로써 얻어진다.

상기 mRNA의 공급원으로 되는 동물 세포는 본 발명에 있어서는 인간 골수 간질 유래의 세포주 KM-102(Harigays, K. and Handa, H.(1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 3477∼3480)가 적합하나, 종양 세포주에 한하지 않고, 포유 동물로부터 분리할 수 있는 세포 및 조직 또는 수립한 다른 세포주라도 좋다.

mRNA의 추출에 있어서는, 구아니딘 티오시아네이트·호트·페놀번, 구아니딘·티오시아네이트-구아니딘·염산법 등도 채용할 수 있으나 구아니딘·티오시아네이트·염화 세슘법이 적합하다.

진핵 세포의 세포질에 존재하면 mRNA의 대부분은 그의 3' 말단에 폴리 A배열을 갖는다는 것이 알려져 있으나, 이 특징을 이용하여 올리고 (dt) 셀룰로오스의 컬럼에 mRNA을 흡착시켜서 다음에 이것을 용출하여 정제한다. 또 자당 밀도 구배 원심법 등에 의해 mRNA를 더욱 분획할 수도 있다.

상기와 같이 하여 얻어진 mRNA가 지방 세포화 억제 활성을 갖는 단백을 코딩하는 것이라는 것을 확인하기 위해서는, mRNA를 단백으로 번역시켜 생리활성을 조사하거나, 이 단백질에 특이적인 항체를 사용하여 그의 단백질을 동정하는 등의 방법으로 행하면 된다. 예컨대, 아프리카 손톱개구리(Xenopus laevis)의 난모세포에 mRNA을 주입하여 번역시키거나(Gurdon J. B et al.(1972) Nature 233, 177∼182), 혹은 토끼 망상 적혈구계나, 소맥배아계를 이용한 번역반응이 행해지고 있다(Schleif, R. F. and Wensink, P. C.(1981) : Practical Methods in Molecular Biology, Springer-Verlag, NY.).

지방 세포화 억제 활성의 검정은, 전지방 세포, 예를 들면 마우스 3T3-L1 세포주 등을 사용한 지방세포에의 형태 변화를 억제하는 활성 및 LPL 활성 측정법에 의해 실시할 수 있다(Beutler, B. A. et al.(1985) J. Immunol. 135, 3972∼3977).

상술한 바와 같은 방법으로 얻은 mRNA를 주형으로 하여 역전사 효소를 사용하여 1개 사슬 cDNA를 합성시킨 후, 이 1개 사슬 cDNA로부터 2개 사슬 cDNA를 합성하지만, 그 방법으로서는 Sl 뉴클레아제법(Efstratiadis, A. et al.(1976) Cell 7, 279∼288), Land법 (Land, H. et al. (1981) Nucleic Acids Res. 9, 2251∼2266), O. Joon Yoo법(Yoo, O. J. et al.(1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 1049∼1053) 등도 채용할 수 있으나, 본 발명의 목적에는 ckayama-Berg법 (Okayama, H. and Berg, P.(1982) Mol. Cell. Biol. 2, 161∼170)이 적합하다.

다음에 얻어진 재조합 플라스미드를 대장균, 예컨대 DH5 α주에 도입하여 형질전환시켜서, 테트라사이클린 내성 또는 암피실린 내성을 지표로 하여 재조합체를 선택할 수가 있다. 숙주 세포의 형질전환은 예컨대 숙주 세포가 대장균의 경우에는 Hanahan의 방법(Hanahan, D.(1983) J. Mol. Biol. 166, 557∼580), 즉 CaCl₂나 MgCl₂또는 RbCl을 공존시켜서 조제한 컴피턴트 세포에 이 재조합 DNA체를 가하는 방법에 의해 실시할 수가 있다. 그리고 벡터로서는 플라스미드 이외에도 라무다계 등의 파지 벡터도 사용할 수가 있다.

상기에 의해 얻어지는 형질전환주로부터 목적하는 지방 세포화 억제인자의 DNA를 갖는 주를 선택하는 방법으로서는 예컨대 이하에 표시한 각종 방법을 채용할 수가 있다.

(1) 합성 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하는 스크리닝법목적 단백의 아미노산 배열의 전부 또는 일부가 해명되고 있는(이 배열은, 복수개 연속된 특이적 배열이라면, 목적 단백의 어느 영역의 것이라도 좋다) 경우, 이 아미노산에 대응하는 올리고뉴클레오티드를 합성하고, (이 경우 코돈 사용 빈도를 사용하여 도입한 뉴클레오디트 배열 또는 생각할 수 있는 뉴클레오티드 배열을 조합한 복수개의 뉴클레오티드 배열의 어느쪽이라도 좋고, 또 후자의 경우, 이노신을 함유시켜서, 그의 종류를 줄일 수도 있다), 이것은 트로브(32P 또는 35S로 표시한다)로서, 형질전환주의 DNA를 변성고정시킨 니트로셀룰로오스 필터와 하이드리다이즈시켜 얻어진 포지티브주를 검색하여 이것을 선택한다.

(2) 폴리머라제 연쇄 반응에 의해 제작한 프로브를 사용하는 스크리닝법

목적 단백의 아미노산 배열의 전부 또는 일부가 해명되고 있는 경우, 이 아미노산의 일부에 대응하는 센스 스트랜드와 안티센스 스트랜드의 올리고뉴클레오티드를 합성하고 이것들을 조합하여 폴리머라제 연쇄반응(Saiki, R. K. et al(1988) Science 239, 487∼491)을 실시하고, 목적의 지방세포화 억제인자를 코딩하는 DNA 단편을 증폭한다. 여기서 사용되는 주형 DNA 로서는 지방 세포화 억제 인자를 생산하는 세포의 mRNA로부터 역전사 반응에 의해서 합성한 cDNA, 또는 게놈 DNA를 사용할 수가 있다. 이와 같이하여 조재한 DNA 단편을³²P 또는³⁵S 로 표시하고, 이것을 프로브로서 사용하여 콜로니 하이브리다이제이션 또는 플라크 하이브리다이제이션을 행함으로써 목적의 클론을 선택한다.

(3) 다른 동물 세포로 지방 세포화 억제 인자를 생산시켜서 스크리닝하는 방법

형질전환주를 배양하여 유전자를 증폭시키고 그의 유전자를 동물 세포에 트랜스팩트하고(이 경우, 자기복제 가능하며 전사 프로모터 영역을 포함하는 플라스미드 또는 동물 세포의 염색체에 삽입될 수 있는 플라스미드의 어느 것이라도 좋다), 유전자에 코딩된 단백을 생산시켜 그의 배양 상청 또는 세포 추출물의 지방 세포화 억제 활성을 측정하거나 또는 지방세포와 억제인자에 대한 항체를 사용하여 지방 세포화 억제인자를 검출함으로써 원래의 형질 전환주로부터 목적하는 지방 세포화 억제 인자를 코딩하는 cDNA를 갖는 주를 선택하다.

(4) 지방 세포화 억제 인자에 대한 항체를 사용하여 선택하는 방법

미리 cDNA를 발현벡터에 삽입하여 형질전환주내에서 단백을 생산시키고, 지방 세포화 억제 인자에 대한 항체 및 이 항체에 대한 2차 항체를 사용하여 소망의 지방 세포화 억제 인자 생산주를 검출하여 목적의 주를 선택한다.

(5) 셀렉티브·하이브리다이제이션·트랜스레이션의 계를 사용하는 방법

형질 전환부로부터 얻어지는 cDNA를 니트로셀룰로오스 필터 등에 블롯팅하고, 지방 세포화 억제 인자 생산 세포로부터의 mRNA를 하이브리다이즈시킨후, cDNA에 결합한 mRNA를 해리시켜서 회수한다. 회수된 mRNA를 단백 번역계, 예컨대 아프리카 손톱 개구리의 난모세포에의 주입이나, 토끼 망상 적혈구 라이제이트나 소맥 배아 등의 무세포계에서 단백으로 번역시키고, 그 단백의 지방 세포화 억제 활성을 조사하거나 또는 지방 세포화 억제 인자에 대한 항체를 사용하여 검출하여, 목적하는 주를 선택한다.

그리고 실시예에서 후술하듯이 상기한 각종 방법을 적용하기 전에 사이토카인류의 mRNA에 공통하여 존재하는 AuuuA 모티브(Shaw, G. and kamen R.(1986) Cell 46, 659∼667)를 참고로 하여 설계한 합성 올리고뉴클레오티드·프로브를 사용하여 1차 스크리닝을 실시한 후, 선택된 양서주에 관하여, 상술한 (3)의 방법, 즉, 다른 동물세포로 지방 세포화 억제 활성을 생산시켜서 스크리닝하는 방법을 적용함으로써 목적의 주를 선택하는 것도 가능하다.

얻어진 목적의 형질 전환주로부터 지방 세포화 억제인자를 코딩하는 DNA를 채취하는 방법은 공지의 방법(Maniatis, T. et al.(1982) : Molecular Cloning-A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y.)에 따라 실시할 수 있다. 예컨대 세포로부터 플라스미드 DNA에 상당하는 분획을 분리하고, 이 플라스미드 DNA로부터 cDNA 영역을 잘라냄으로써 실시할 수 있다.

이와 같이하여 얻어지는 DNA의 배열결정은 예컨대 막삼-길버트의 화학 수식법(Maxam, A. M. and Gilbert, W.(1980) : Methods in Enzymology 65, 499∼559)나 M13파지를 사용하는 디데옥시뉴클레오티드쇄 종결법(Messing, J. and Vieira, J.(1982) Gene 19, 269∼276) 등에 의해 실시할 수가 있다.

이와 같이 해서 클론화된 지방 세포화 억제인자를 코딩하는 유전자를 함유하는 단편은 적당한 벡터 DNA에 재차 삽입함으로써 다른 원핵 생물 또는 진핵 생물의 숙주 세포를 형질전환시킬 수가 있다. 또, 이것들의 벡터에 적당한 프로모터 및 형질 발현에 관계되는 배열을 도입함으로써 각각의 숙주 세포에 있어서 유전자를 발현시키는 것이 가능하다.

원핵세포의 숙주로서는, 예컨대 대장균(Escherichia coli)나 고초균(Bacillus subtilis) 등을 들 수 있다. 목적하는 유전자를 이것들의 숙주 세포내에 형질 발현시키는데 숙주에 적합할 수 있는 종 유래의 리플리콘 즉, 복제기점 및 조절 배열을 포함하고 있는 플라스미드 벡터로 숙주 세포를 형질 전환시키면 된다. 또 벡터는 형질전환세포에 표현형질(표현형)의 선택성을 부여할 수 있는 배열을 갖는 것이 바람직하다.

예컨대 대장균으로서는 E. coli K12 주 등이 잘 사용되고, 벡터로서는 일반적으로 pBR 322나 pUC 계의 플라스미드가 잘 사용되나, 이것에 한정되지 않으며, 공지의 각종의 균주 및 벡터가 어느 것이라도 이용될 수 있다. 프로모터로서는 대장균에 있어서는 트립토판(trp) 프로모터, 락토스(lac) 프로모터, 트립토판, 락토스(tac) 프로모터, 리포프로테인(lpp) 프로모터, 박테리오파지 유래의 람다(λ) P_L프로모터 폴리펩티드 쇄신장 인자 Tu(tufB) 프로모터 등을 들 수 있고, 어느 프로모터도 본 발명의 지방 세포화 억제 인자의 생산에 사용할 수가 있다.

고초균으로서는 예컨대 207-25 주가 바람직하고, 벡터로서는 pTUB 228(Ohmura, k. et al. (1984) J. Biochem. 95. 87-93) 등이 사용되나, 이것에 한정되는 것은 아니다. 프로모터로서는, 고초균의 α-아밀라제 유전자의 조절배열이 잘 사용되고, 또 필요에 따라 α-아밀라제의 시그날 펩티드 배열을 코딩하는 DNA 배열을 연결함으로써, 균체외에서의 분비 발현도 가능케 된다.

진핵 생물의 숙주 세포에는 척추동물, 곤충, 효모 등의 세포가 포함되고, 척추동물세포로서는 예컨대 원숭이의 세포인 COS세포(Gluzman, Y.(1981) Cell 23, 175∼182)나 차이니즈·햄스타 난소세포(CHO)의 디히드로엽산 리덕라제 결손주(Urlaub, G. and Chasin. L. A(1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77. 4216∼4220)등이 잘 사용되고 있으나, 이것들에 한정되는 것은 아니다.

척추동물세포의 발현 벡터로서는 통상 발현하려고 하는 유전자의 상류에 위치하는 프로모터, RNA의 스프라이스 부위, 폴리아데닐화 부위 및 전사 종결 배열 등을 갖는 것을 사용할 수 있고, 이것은 또 필요에 따라 복제기점을 가져도 좋다. 이 발현벡터의 예로서는, SV40의 초기 프로모터를 갖는 pSV2 dhfr(Subramani, s. et al.(1981) Mol. Cell. Biol. 1, 854∼864) 등을 예시할 수 있으나, 이것에 한정되지 않는다.

또 진핵 미생물로서는 효모가 일반적으로 잘 사용되고 있으며, 그 중에서도 사카로 마이세스속 효모, 예컨대 Sacharomyces cerevisiae가 바람직하다.

이 효모 등의 진행 미생물이 발현벡터로서는, 예컨대 알콜 탈수소효소 유전자의 프로모터(Bennetzen, J. L. and Hall, B. D. (1982) J. Biol. 257, 3018∼3025)나 산성 포스파타제 유전자의 프로모터(Miyanohara, A. et al, (1983) Proc. Natl. Acad. Sci, USA 80, 1∼5) 등을 바람직하게 이용할 수 있다.

숙주 세포로서, COS 세포를 사용할 경우를 예로 들면, 발현벡터로서는 SV 40 복제기점을 가지며, COS 세포에 있어서 자율 증식이 가능하며, 또 전사 프로모터, 전사 종결 시그날 및 RNA 스플라이스 부위를 구비한 것을 사용할 수가 있다. 이 발현벡터 DEAE-덱스트란법(Lathman, H. and agunusson, G.(1983) Nucleic Acids Res. 11, 1295∼1308), 인산 칼슘-DNA 공침전법(Grabam, F. L. and van der Ed, A. J.(1973) Virology 52, 456∼457) 및 전기 파슬 천공법(Neumann, E. et al, (1982) EMBO J. 1, 841∼845) 등에 의해 COS 세포에 취입시킬 수가 있고, 이렇게 해서 소망의 형질전환세포를 얻을 수가 있다. 또 숙주세포로서 CHO 세포를 사용할 경우에는 발현벡터와 함께, G418 내성 마커로서 기능하는 neo 유전자를 발현할 수 있는 벡터, 예컨대 pRSV neo(Sambrook, J. et al.(1989) : Molecular Cloning-A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory, NY)나 pSV2 neo(Southern, P. J. and Barg, p.(1982) J. Mol. Appl. Genet, 1, 327∼341) 등을 코·트랜스팩트하고, G418 내성의 콜로니를 선택함으로써 지방 세포화 억제 인자를 안정되게 생산하는 형질 전환 세포를 얻을 수가 있다.

상기에서 얻어지는 소망의 형질전환체는 상법에 따라 배양할 수가 있고, 이 배양에 의해 세포내 또는 세포밖에 지방 세포화 억제 인가가 생산된다. 이 배양에 사용되는 배지로서는 채용한 숙주 세포에 따라서 관용되는 각종의 것을 적절하게 선택할 수 있고, 예컨대 상기 COS 세포라면 RPMI-1640 배지나 달베코 수정 이글 최소 필수 배지(DMEM) 등의 배지에 필요에 따라 소태아 혈청(FBS) 등의 혈청성분을 첨가한 것을 사용할 수 있다.

상기에 의해 형질전환체의 세포내 또는 세포 밖에 생산되는 지방 세포화 억제 인자는 이 지방 세포화 억제 인자의 물리적 성질이나 화학적 성질 등을 이용한 각종의 공지의 분리 조작법에 의해, 그것들로부터 분리, 정제할 수가 있다. 이 방법으로서는 구체적으로는 예컨대 통상의 단백침전제에 의한 처리, 한외여과, 분자체 크로마토그래피(겔여과), 흡착크로마토그래피, 이온 교환체 크로마토그래피, 어피니티 크로마토그래피, 고속액체 크로마토그래피(HPLC) 등의 각종 액체 크로마토그래피, 투석법, 이것들의 조합등을 예시할 수 있다.

상기 방법에 의해 용이하게 고수율, 고순도로 소망의 지방 세포화 억제인자를 공업적 규모로 제조할 수 있다. 이와 같이 해서 얻어지는 본 발명의 재조합 지방세포화 억제인자의 여러성질은 하기 실시예에 상세히 설명하는 바와 같으며, 이 인자는 그것이 같은 생물활성으로부터 상기한 각종의 분야에서 유용하다.

이와 같이 해서 본 발명 DNA를 이용하여 유전자 공학적 수법에 의해 얻어지는 물질이 지방세포화 억제 활성을 발현하기 위해서는, 반드시 배열표의 배열번호 2에 표시되는 전구체(아미노산 번호 -21∼+178의 아미노산으로 이루어지는 단백질)의 아미노산 배열의 전부를 갖는 것일 필요는 없고 예컨대 그의 부분 배열이며, 그것이 지방세포화 억제 활성을 나타내는 한, 그것들의 아미노산 배열도 또 본 발명의 단백에 포함된다. 또 이 단백을 코딩하는 DNA로 본 발명에 포함된다.

이와 같은 지방세포화 억제활성을 나타내는 단백으로서는, 배열표의 배열번호 2에 표시되는 아미노산 배열의 아미노산 번호 1의 Pro를 N 말단으로 하는 178개의 아미노산으로 이루어지는 단백, 즉 성숙지방 세포화 억제인자라고 생각되는 단백을 예시할 수 있다. 이 단백은, 환원조건하의 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기 영동에 있어서, 외견상 약 23,000의 분자량을 나타낸다.

또 이 성숙지방 세포화 억제인자를 코딩하는 DNA도 본 발명에 있어서의 DNA로서 예시할 수가 있다. 또 적합하기로는 이러한 DNA는 배열표의 배열번호 1에 표시되는 뉴클레오티드 배열의 81번째로부터 614번째까지의 뉴클레오티드 배열에 표시되는 DNA이다.

일반적으로 진핵 생물의 유전자는 인터페론 유전자 등으로 알려져 있듯이, 다형현상(polymorphism)을 나타낸다고 생각되고(예컨대, Nishi, T. et. al.,(1985) J. Biochem. 97, 153∼159를 참조), 이 다형현상에 의해서 1개 또는 그 이상의 아미노산이 치환되는 경우도 있고, 뉴클레오티드 배열의 변화는 있더라도 아미노산은 전혀 변하지 않는 경우도 있다.

배열표의 배열번호 2로 표시되는 아미노산 배열의 아미노산 번호 -21∼+178로 이루어지는 전구체 지방 세포화 억제인자 및 배열번호 2로 표시되는 아미노산 배열의 아미노산 번호 +1∼+178로 이루어지는 성숙 지방 세포화 억제인자의 아미노산 배열중의 1 또는 2 이상의 부위에 있어서, 1 또는 2 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입 또는 치환되어 있는 단백질이라도 지방세포화 억제인자 활성을 갖는 일이 있다. 이것들의 단백질을 본 발명에 있어서는 지방세포와 억제인자의 동일한 효과를 갖는 물질이라고 부른다.

예컨대 인터로이킨 2(IL-2) 유전자의 시스테인에 상당하는 뉴클레오티드 배열을 세린에 상당하는 뉴클레오티드 배열로 변환시켜 얻어진 단백이 IL-2 활성을 유지한다는 것도 이미 공지로 되어 있다. (Wang, A. et al.(1984) Science 224, 1431∼1433). 그 때문에 그것들의 천연에 존재하거나 혹은 인공 합성된 단백이 지방 세포화 억제 활성을 갖는 한 그것들의 단백은 모두 본 발명에 포함된다.

또 이것들의 단백질을 코딩하는 같은 효력의 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 DNA도 모두 본 발명에 포함된다.

이와 같은 각종의 본 발명의 DNA는, 상기 지방 세포화 억제 인자의 정보에 의거하여 예컨대 포스파이트·트리에스테르법(Hunkapiller, M. et al.(1984) Nature 310, 105∼111) 등의 상법에 따라 핵한의 화학 합성에 의해 제조할 수도 있다.

그리고 소망 아미노산에 대한 코돈은 그 자체 공지이며, 그의 선택도 임의로 좋고, 예컨대, 이용하는 숙주의 코돈 사용빈도를 고려하여 상법에 따라 결정할 수 있다(Grantham, R. et al. (1981) Nucleic Acids Res. 9. r43∼r74).

또 이들 뉴클레오티드 배열의 코돈의 일부 변형은 상법에 따라 소망의 변형을 코딩하는 합성 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머를 이용한 사이트스펙시픽·뮤타제네시스(site specific mutagenesis)(Mark. D. F. et al.(1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 5662∼5666) 등에 따를 수가 있다.

[발명을 실시하기 위한 최선의 형태]

이하 실시예 및 제제예를 들어 본 발명을 상세히 설명하나, 이들은 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다. 그리고 그 전에 지방 세포화 억제활성의 측정법에 대해 참고예로 설명한다.

[참고예]

본 발명에서 사용된 지방 세포화 억제 인자의 활성 측정 방법은 다음과 같다. 측정에 사용한 세포는 마우스 배성 섬유 아세포주 3T3-L1(Green, H. and Kehinde, O, (1974) Cell 1, 113∼116)이며, American Cell Type Culture Collection(ATCC)으로부터 구입하였다. 세포의 배양은 모두 10% CO2-90% 대기의 가습 혼합기 중, 37℃에서 행하였다. 세포의 계대 배양은 배지 A(10% 비동화 FBS(하이크론사제) 및 10mM 헤페스(pH 7.2, HEPES, 시그마사제)를 함유하는 DMEM(4.5g/l의 글루코스를 함유, 기브코사제)를 사용하여 행하였다. 3T3-L1 세포의 지방 세포로의 분화 유도는 Rubin들의 방법(Rubin, C. S. et al.(1978) J. Biol. Chem. 253, 7570∼7578)을

참고로 해서 행하였다.

3T3-L1 세포의 지방 세포로의 형태 변환 억제 작용의 측정법

3T3-L1 세포를 배지 A에 1.0×10⁴Cells/ml의 밀도로 현탁하고, 이것을 웰 멀티 클러스터 디쉬(코스터사제)에 1웰당 0.5ml씩 분주하여 배양하였다. 배양 3일후에는 세포는 콘플루언트(confluent)에 달한다. 그후에 배지를 신선한 배지 A로 교환하여 다시 2일간 배양한 후, 배지를 지방 세포화 유도용 배지인 배지 B(10mM HEPES(pH 7.2), 3% 비동화 FBS, 5㎍/ml 소 인슐린(시그마사제), 8㎍/ml d피티온(시그마사제), 4㎍/ml 판토텐사(시그마사제), 1.0μM 덱사메타존(시그마사제) 및 0.5mM 이소부틸메틸크산틴(알드리치사제)을 함유하는 DMEM(4.5g/l의 글루코스를 함유)로 교환하였다.

이때 동시에 샘플을 첨가하였다. 그후, 2일마다 신선한 배지 B로 교환하고 샘플도 첨가하였다. 배지 B와 샘플을 첨가하기 시작하고 나서 4∼7일째에 배지를 지방세포 유지 배지인 배지 C(5% 비동화 FBS, 10mM HEPES(pH 7.2) 및 100mg/ml 소 인슐린을 함유하는 DMEM(4.5g/l의 글루코스를 함유)로 교환하였다.

배지 C속에서 2일간 배양후, 세포를 5% 포름 알데히드로 고정하고 오일 레드 O와 헤마톡실린을 사용하여 세포내에 축적된 지방립(粒)과 세포핵을 각각 염색하였다. 현미경 사진을 촬영후, 사진으로부터 적색으로 염색된 지방립을 축적하고 있는 세포의 수와 헤마톡실린으로 염색된 유핵 세포의 수를 세어서 하기의 계산식으로부터 지방 세포화율을 산출하였다.

지방 세포화율(%)100×지방립 축적 세포수/유핵 세포수

그리고 세포의 고정법, 오일 레드 O 염색 및 헤마톡실린 염색은 실험서(미도모 요시오, 다까야마 쇼지로 '임상 검사 강좌' 12권 「병리학」(1982), 이시야꾸 출판)에 따라 행하였다.

[LPL 억제 작용의 측정법]

Beutler들의 방법(Beutler, B. A. et al. (1985) J. Immunol. 135, 3972∼3977)을 참고로하여 하기와 같이 행하였다. 「3T3-L1 세포의 지방세포로의 형태변화 억제작용의 측정법」의 항에서 제시한 방법을 사용하여 지방세포화한 3T3-L1 세포를 조제하였다. 단 지방세포로의 분화 유도 중에는 샘플은 가하지 않는다. 다음에 배지를 신선한 배지 C로 교환하고 샘플을 첨가하였다. 18시간 배양후에 배지를 제거하고 세포를 PBS(-)(phosphate buffered saline, 니쓰이 세이야꾸(주)제)로 2회 세정하였다. 다음에 배지 D(5% 비동화 FBS, 10mM HEPES(pH 7.2), 100ng/ml 소 인슐린 및 10U/ml 헤파린 나트륨(노보인더스트리사제)을 함유하는 DMEM(4.5g/l의 글루코스를 함유)을 각 웰당 300㎕씩 가하여 1시간 배양한 후, 이 배양 상청을 100㎕ 취하여 LPL 활성의 측정에 사용하였다. LPL 억제작용의 측정은 1샘플에 대해 트리프리게이트로 행하여 평균치를 구하였다.

LPL 활성의 측정법은 Nilsson-Ehle과 Schotz의 방법(Nilsson-Ehle, P. and Schotz, M.C.(1976) J. Lipid Res. 17, 563∼541)에 따랐다.

상기와 같이 하여 조제한 100㎕의 배양 상청을 동량의 기질 용액(13μM 글리세롤 트리[9, 10(n)-³H] 올레인산(51.8KBeq/μmol, 아마샴사제), 1.3mg/ml L-α-포스파티딜콜린 디스테아로일(시그마사제), 20mg/ml 소혈청 알부민(시그마사제), 135mM 트리스하이드로 클로라이드(Tris-HCl, pH 8.1, 시그마사제), 16.5% (v/v)글리세롤, 16.5% (v/v) 비동화 FBS)와 혼합하여 37℃에서 120분간 반응시켰다. 1.05ml의 0.1M 탄산칼륨-붕산 완충액(pH 10.5)과 3.25ml의 메탄올 : 클로로포름 : 헵탄 = 141 : 125 : 100(v/v)을 가하여 반응을 정시시키고 강하게 교반한 후, 3,000×g로 15분간 원심분리하였다.

물-메탄올층의 3H 카운트를 액체 신틸레이션 카운터로 측정하였다. LPL 활성의 1 단위는 1μmol의 지방산을 1분간에 생성하는 활성으로서 정의하였다. 또한 기질 용액 속의 13μM 글리세롤 트리[9,10(n)-³H] 올레인산은 아마샴사제의 글리세롤·트리[9,10(n)-3H]올레인산(37.0GBeq/mol)을 트리올레인(시그마사제)로 희석한 후, 실리카겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제함으로써 조제하였다.

[실시예 1]

[KM-102 세포로부터 폴리(A)+RNA의 추출]

KM-102 세포를 직경 15cm의 플라스틱제 배양 디쉬 36개로 10% FBS를 함유하는 이스코프의 수정 최소 필수 배지(베링거 만하임사제)로 배양하여 콘플루언트에 달하기까지 증식시킨 후, 폴리볼, 밀리스테이트, 아세테이드(PMA)와 칼슘 이오노포아 A23187을 각각 10mg/ml와 0.2μM이 되도록 첨가하여 배양을 계속하고, 3, 6, 14시간 배양후에 12개씩의 세포를 구아니딘 티오시아네이트 용액(4M의 구아니딘 티오시아네이트, 1% 사르코실, 20mM의 에틸렌 디아민 4초산(EDTA), 25mM의 시트르산 나트륨(pH 7.0), 100mM의 2-메트캅토에탄올, 0.1%의 안티폼 A)로 용해하여 용액을 회수하였다.

폴리(A)⁺RNA의 단리는 본질적으로 Molecular Cloning-A Laboratory Manual (Maniatis, T. et al.(1982) pp. 196-198)에 디스플레이재되어 있는 대로 실시하였다. 구체적으로는 이하의 절차로 행하였다.

회수한 세포 용해액은 각각 21G의 주사침을 장전한 10ml들이의 주사통을 사용해서 수회 흡입 배출을 되풀이하였다. 히다찌고끼(주) 제RPS-40T 로터 버킷에서 맞는 폴리아로머제의 원심 튜브에 3ml의 5.78M CsCl-0.1M EDTA(pH 7.5)를 먼저 가해두고, 그 위에 상기 세포 용해액을 중층하여 튜브를 채웠다. 이것을 30,000rpm. 20℃에서 18시간 원심한 후, 얻어진 펠릿을 400㎕의 증류수에 녹이고 에탄올 침전을 행하였다. 얻어진 펠릿을 다시 400㎕의 증류수에 용해한 후, 동량의 클로포름-1-부탄올(4 : 1)을 가하여 교반하고 원심분리에 의해 수층을 회수하였다. 이것을 재차 에탄올 침전한 후, 600㎕의 증류수에 용해하여 전 RNA를 얻었다. PMA-A23187 자극 3시간, 6시간, 14시간의 각 샘플로부터 각각 약 4.5mg의 전 RNA가 얻어졌다.

이와 같이 하여 얻어진 3종류의 전 RNA를 600㎍씩 혼합하여 올리고(dT) 셀룰로스컬럼 크로마토그래피를 행함으로써 폴리(A)⁺RNA를 정제하였다.

즉 RNA를 흡착 완충액(0.5M NaCl, 20mM Tris-HCl(pH 7.5), 1mM EDTA, 0.1% 도데실 황산 나트륨(SDS)에 용해하고 65℃에서 5분간 가열한 후, 동용액으로 충전된 올리고(dT) 셀룰로스 컬럼(파르마시아사제, Type 7)에 공여하고, 용출용액(10mM Tris-HCl(pH 7.5) 1mM EDTA, 0.05% SDS)으로 폴리(A)+RNA를 용출하여 회수하였다. 이와 같은 조작에 의해 100㎍의 폴리(A)⁺RNA를 얻었다.

[실시예 2]

[cDNA 라이브러리의 구성]

cDNA 라이브러리의 구성은 Okayama-Barg법에 따라 행하였다. 즉, 5㎍의 폴리(A)⁺RNA 및 24 유니트의 역전자 효소를 20㎕의 반응액(50mM Tris-HCl(pH 8.3), 8mM MgCl₂, 30mM KCl, 0.3mM 디티오트레이톨(DTT), 2mM dATP, 2mMdG TP, 2mM dCTP, 2mM dCTTP, 10μCl[α-32 P]dC TP, 1.4㎍ 벡터프라이머 DNA (3'-Oligo(dT)-tailed pc DV-1, 파르마시아사제) 중에서 42℃, 60분간 반응시켰다.

2㎕의 0.25M EDTA와 1㎕의 10% SDS를 가하여 반응을 멈추게 한후, 20㎕의 페놀-클로로포름(1 : 1)로 단백질 제거를 행하였다. 원심분리후 회수한 수층에 20㎕의 4M 초산 암모늄과 80㎕의 에탄올을 가하여 -70℃, 15분간 냉각하였다. 이어서 원심분리에 의해 침전을 모아 75% 에탄올로 침전물을 세척한 후, 감압 건조하였다.

다음에 건조된 침전을 15㎕의 터미널 트랜스퍼라제 반응후 (140mM 카코딜산 칼륨, 30mM의 Tris-HCl(pH 6.8), 1mM CoCl₂, 0.5mM DTT, 0.2㎍ poly A, 100mM dCTP)에 용해시켰다. 이 반응액을 37℃에서 3분간 보온한 후, 18 유니트의 터미널 디옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제를 가하여 5분간 반응시켰다. 다음에 1㎕의 0.25M EDTA 및 0.5㎕의 10% SDS를 가하고 반응을 멈추게 한 후, 페놀-클로로포름으로 단백질 제거를 행하였다.

반응액을 원심분리한 후 수층을 회수하고 15㎕의 4M 초산 암모늄, 60㎕의 에탄올을 가하여 잘 혼합하였다. -70℃에서 15분간 냉각한 후, 원심분리하여 침전물을 모았다.

이 침전물을 10㎕의 제한 효소용 완충액(50mM NaCl, 10mM Tris-HCl(pH 7.5), 10mM MgCl₂, 1mM DTT)에 녹이고 2.5 유니트의 제한 효소 Hind3을 가하여 37℃에서 약 1시간 소화하였다.

다음에 페놀-클로로포름으로 단백질 제거를 행한 후, 에탄올 침전을 행하였다. -70℃에서 15분간 냉각한 후, 원심분리에 의해 침전물을 모으고 10㎕의 TE 완충액(10mM Tris-HCl(pH 7.5), 1mM EDTA)에 녹였다. 이 용액의 1㎕를 올리고(dG) 부착 링커 DNA(3'-Oligo(dG) tailed pL-1 Hind3 linker, 파르마시아 사제) 10ng를 가한 반응액(10mM Tris-HCl(pH 7.5), 1mM EDTA, 100mM NaCl에 가하여 65℃에서 5분간 가열하고, 이어서 42℃에서 30분간 보온하였다.

빙수 중에서 반응액을 냉각한 후, 10㎕의 10배 리가제 완충액(10mM ATP, 660mM Tris-HCl(pH 7.5), 66mM MgCl₂, 100mM DTT), 78㎕의 증류수, 8 유니트의 T4 DNA 리가제를 가하여 12℃에서 하룻밤 보온하였다.

다음에 10㎕의 1M KCl, 1 유니트의 리보뉴클레아제 H, 33 유니트의 DNA 폴리머라제 I, 4 유니트의 T4 DNA 리가제, 0.5㎕의 뉴클레오티드 용액(20mM dATP, 20mM dGTP, 20mM dCTP, 20mM dTTP), 0.1㎕의 50㎍/㎕의 농도의 소혈청 알부민(BSA)를 가하고 12℃에서 1시간, 25℃에서 1시간 보온하였다. 이 반응액을 증류수로 5배로 희석한 후, 즉시 Hanahan의 방법(Hanahan, D.(1983) J. Mol. Biol. 166, 557∼580)에 의해 대장균 DH5α주를 형질 전환하여 KM-102 세포 cDNA 라이브러리를 구성하였다.

[실시예 3]

[올리고뉴클레오티드 프로브의 구성]

사이토카인류의 mRNA의 3'-비번역 영역에 보존되어 있는 AUUUA 배열에 의거하여 ATT-3으로 이름지은 15 염기의 올리고뉴클레오티드5'-TAAATAAATAAATAAA-3'를 화학 합성하

였다. 합성은 어플라이드 바이오 시스템사제의 자동 DNA 합성기 380B를 사용하고, 그 매뉴얼에 따라 행하였다. 이 방법은 Caruthers들이 기재한 원리(Matteucci, M. D. and Caruthers, M. H. (1981) J. Am. Chem. Soc. 103, 3185∼3191)에 의거하고 있으며, 포스포아미다이트법이라 칭하고 있다. 15개의 뉴클레오티드를 합성한 후, 그것을 지지체로부터 개열(開裂)시켜 탈보호를 행하고, 얻어진 용액을 동결 건조함으로써 올리고뉴클레오티드를 분말상으로 하였다. 이것을 증류수에 용해하고 사용할때까지 -20℃에서 동결 보존하였다.

[실시예 4]

[cDNA 라이브러리의 스크리닝]

상술한 KM-102 세포의 cDNA 라이브러리중, 6,500주의 재조합균 DNA를 Grunstein, M.와 Hogness, D. S.의 방법(Grunstein, M. and Hogness, D. S.(1975) Proc. Natl. Acad, Sci. USA 72, 3961∼3965)에 의해 니트로셀룰로스 필터 상에 고정하였다. 다음에 프로브(ATT-3)을 상법(Molecular Cloning-A Laboratory Manual을 참조)에 따라 32P로 5' 말단 표지한 후, 콜로니 하이브리다이제이션을 행하였다. 6×SSC(1×SSC의 조성은 150mM NaCl, 15mM 시트르산 3나트륨), 1×Denhardt용액, 0.25% SDS, 0.05% 피롤린산 나트륨, 100㎍/ml의 변성 연어 정자 DNA를 함유하는 용액 속에서 37℃, 3시간 프레하이브리다이제이션을 행한 후, 32P로 방사 표지화한 프로브(ATT-3)을 함유한 6XSSC, 1X Denhardt 용액, 17㎍/ml의 효모 tRNA, 0.05% 필로린산 나트륨의 반응액 속에서 31℃, 하룻밤 하이브리다이제이션을 행하였다. 반응 종료 후, 니트로 셀룰로스 필터를 실온하에서 0.05% 피롤린산 나트륨을 함유하는 6X SSC 용액으로 2시간 세정한 후, 오토라디오그래피를 행하였다. 그 결과, 33개의 양성 크론이 얻어졌다. 이들 클론에 대하여 상법에 의해 플라스미드 DNA를 추출한 뒤, 무작위로 수가 클론을 선택하여 cDNA의 부분적인 뉴클레오티드배열을 디데옥시법에 의해 결정하였다. 그리고 그들 배열에 대해 퍼스널 컴퓨터를 사용하여 EMBL 또는 GenBank 데이터 베이스에 등록되어 있는 뉴클레오티드 배열과의 상동성을 검색하였다. 그 결과, ATT-3 프로브가 하이브리다이즈한 영역은 Alu 반복배열(Schmid, C. W. and Jelinek, W. R.(1982) Science 216, 1065∼1070)의 일부 멤버에 상동성이 있다는 것이 명백해졌다.

그래서 사람의 게놈 DNA로부터 조제한 Alu 반복 배열을 함유한 DNA 단편을 32P로 표시하고, 이것을 프로브에 사용하여 상기 클론의 콜로니 하이브리다이제이션을 행하였더니, 12 클론이 Alu 반복 배열을 가지는 것이 명백해졌다. 나머지 21 클론에 대해 cDNA 인서트의 길이를 조사했던 바 50으로부터 3,600 염기에 걸쳐 있어 가지 각색이었다. 상기 21 클론의 cDNA의 제한효소 멥핑을 행한 후, 부분적으로 뉴클레오티드 배열을 결정하였다. 그들 뉴클레오티드 배열에 대해 데이터 베이스와의 상동성 검색을 행하여 데이터 베이스에 등록되어 있지 않은 신규의 배열을 가진 클론을 선택하였다.

이들 플라스미드에는 SV 40의 초기 프로모터 및 복제 개시점이 함유되어 있어, cDNA를 COS-1 세포로 발현시키는데 적합하다. 그래서 상기와 같이하여 선택된 클론에 대해 플라스미드 DNA를 COS-1 세포에 도입하였다.

COS-1 세포의 트랜스팩션은 (주)시마즈 세이사꾸쇼제의 유전자 도입장치 GTE-1을 사용하고 전기천공법에 의해 행하였다. 즉 우선 COS-1 세포를 세미콘플루언트가 될때까지 증식시킨 플라스크로부터 트립신-EDTA 처리에 의해 세포를 회수하고, PBS(-) 완충액(닛스이 세이야꾸(주)제)로 2회 세정하였다.

다음에 그 세포를 PBS(-) 완충액으로 6×10⁷세포/ml에 현탁하였다. 한편, 염화 세슘법으로 조제한 각 플라스미드 DNA를 PBS(-) 완충액으로 20㎍/ml로 조제하였다. 상기 세포 현탁액이 DNA 용액을 20㎕씩 혼합하고, 이것을 전극 간격 2mm의 체임버에 넣어 600V-30μsec 의 펄스를 1초 간격으로 2회 주었다. 그 체임버를 4℃에서 약 5분간 냉각한 후, 그 속의 세포-DNA 혼액을 10% FBS를 함유하는 DMEM 10ml에 가하고 페트리 디쉬(petri dish)에 옮기어 37℃에서 하룻밤 5% CO₂하에 배양하였다. 그후, 배양 상청을 제거하고 무혈청 배지(DMEM)로 세포를 세정하여 DMEM 10ml를 가하고 3일간 배양하였다. 이와 같이하여 얻어진 세포 배양물로부터 배양 상청을 회수하고, 이 상청에 대해 상술한 지방 세포로의 형태변화 억제 활성을 측정하였다.

그 결과, 클론 #20-2의 플라스미드(pcD-20-2)로 트랜스팩트한 COS-1 세포의 배양 상청에만 지방세포로의 형태 변환 억제활성이 검출되었다. 지방 세포로의 형태변화 억제 활성의 데이터의 일례를 표 1에 나타낸다.

[표-1]

pUC-CAT는 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제 유전자를 pUC 벡터에 짜넣은 플라스미드이며, 동물세포로 기능할 수 있는 프로모터를 갖지 않는 네거티브 컨트롤용의 플라스미드이다. 트랜스팩션은 pcD-20-2와 마찬가지의 조작에 의해 행하였다. 표-1에 나타낸 바와 같이 pcD-20-2로 트랜스팩트한 COS-1 세포의 배양 상청에는 3T3-L1 세포의 지방세포로의 변화를 저해하는 활성이 검출되었다. 또 지방세포로 분화 유도시킨 3T3-L1 세포에 대해서는 그 LPL을 강하게 억제하였다(표-2 참조). 표중의 수치는 무혈청 DMEM 만을 가했을때(블랭크)의 LPL 활성을 100%로 했을때의 상대치(%)를 표시한다.

[표-2]

이렇게 해서 pcD-20-2에 삽입되어 있는 cDNA의 제한 효소지도를 제작하였다(제1도 참조). 다음에 cDNA의 전염기 배열을 디데옥시법에 의해 결정하였던 바, 배열표의 배열 번호 1에 나타낸 염기 배열이 얻어졌다. pcD-20-2에 삽입되어 있는 cDNA는 1065 염기와 폴리(A) 테일(A가 41 잔기)로 되고, 메티오닌으로 시작되는 199개의 아미노산으로 된 오픈 리딩 프레임(ORF)을 함유하는 것이 명백해졌다. 얻어진 뉴클레오티드 배열에 대해서는 EMBL 및 GenBank 유전자 데이터 베이스를 검색하였으나 기지의 배열과의 상동성은 보이지 않았다. 또 ORF에 코딩되는 아미노산 배열에 대해 NBRF 및 SWISS 플로팅 데이터 베이스를 검색하였으나 기지의 배열과의 상동성은 보이지 않아, pcD-20-2에 삽입되어 있는 cDNA에 포함되는 ORF는 신규의 폴리펩티드를 코딩하는 것이 명백해졌다. 이 ORF에 코딩되는 아미노산 배열을 배열표의 배열번호 2에 나타낸다.

메티오닌으로 시작되는 N 말단 영역에서는 여러가지 분비 단백에만 볼 수 있는 소수성의 강한 아미노산이 줄짓는 영역(시그널 펩티드)이 존재하고 있으며, 이 단백이 분비 단백이라는 것이 시사되었다.

[실시예 5]

[펩티드 합성과 항 펩티드 항혈청의 조제]

pcD-20-2에 삽입되어 있는 cDNA의 ORF에 의해 코딩되는 신규 폴리 펩티드가 분비 단백인 것을 확인하는 목적 및 후술하는 지방 세포화 억제인자의 정제과정에서의 본 인자의 검출을 할 목적으로 N 말단의 메티오닌으로부터 세어서 27∼41번째의 아미노산 배열에 대응하는 펩티드(NH2-Gly-Pro-Pro-Arg-Val-Ser-Pro-Asp-Pro-Arg-Ala-Glu-Leu-Asp-Ser-COOH)를 합성하고, 이것을 항원에 사용하여 토끼를 면적하고 항혈청을 조제하였다. 펩티드의 합성은 tBOC-amino acid 고상법(Merrifield d. R. B. (1963) J. Am. Chem. Soc. 85, 2149∼2154)에 따라 어플라이드 바이오 시스템즈사제의 펩티드 신세사이저-430A를 사용하여 자동 합성용 표준 프로그램에 의해 행하였다. 탈보호, 탈 resin 후, 펩티드를 음이온 교환컬럼으로 정제하였다. 주 피크 패턴의 확인은 역상 컬럼을 사용한 HPCL에 의해 행하였다.

다음에 이것을 동결 건조에 의해 농축하여 역상 컬럼을 HPLC로 피크를 분취하였다. 이것을 다시 동결 건조에 의해 농축하고, HPLC 분석과 아미노산 조성 분석을 하였다. 아미노산 조성은 워터즈사제의 아미노산 자동분석장치 Pico Tag System을 사용하여 분석하였다.

얻어진 펩티드에 캐리어 단백으로서 키홀 린페드 헤모시아닌(KLH)을 글루타르 알데히드(GAD)법 (Konopka, J. B. et al.(1984) J. Virol, 51, 223∼232)에 의해 연결시켜 토끼의 면역을 위한 항원으로 하였다. 항원과 완전 프로인트 어쥬번트(FCA)를 충분히 현탁하고 토끼의 배부에 피내 투여하여 면역하였다. 약 2주간 간격으로 3회 면역하고 전 채혈을 하였다. 토끼 혈청속의 항체가의 측정은 엔자임·링크트 이뮤노소르벤트어세이(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)법에 의해 하였다. 얻어진 항혈청으로부터 파르마시아사제의 Protein A-Sepharose 6MB 컬럼에 의해 IgG 분획을 조제하고, 이것을 1차 항체로서 사용하기로 하였다.

[실시예 6]

[COS-1 세포에서의 지방세포화 억제 인자의 생산 및 그 정제]

ⅰ) 고 발현 벡터의 구축과 COS-1 세포에서의 발현

pcD-20-2를 BamH1로 소화하고 cDNA 인서트를 함유하는 1240bp의 단편을 단리 정제하였다. 한편 고발현 벡터 pcDL-SR α296(Takebe, Y. et al.(1988) Mol. Cell. Biol. 8, 466∼472)을 BamH1으로 소화하여 SRα프로모터를 함유한 3.4kb의 단편을 조제하고, 이것에다 상기 cDNA을 함유한 BamH1 단편을 T4DNA 리가제를 사용한 반응에 의해 연결하였다. 이 DNA로 대장균 DH5 α를 형질전환하고, 얻어진 형질 전환주에 대해 그것이 보유하는 플라스미드의 해석을 하여 cDNA의 전사방향이 SRα 포로모터의 방향과 동일한 주를 선택하고, 이 플라스미드를 pSRα-20-2라 명명하였다(제2도 참조).

그리고 SRα 프로모터는 SV40 초기 프로모터와 HTLV-1의 롱 터미널 리피크(LTR)의 R-45 배열로 되며, SV 40 초기 프로모터 보다도 10∼100배 강한 프로모터 활성을 나타낸다.

다음에 얻어진 플라스미드 pSRα-20-2FH COS-1 세포를 트랜스팩트하고, 그 배양 상청속에 지방세포화 억제인자가 분비되고 있는 것을 실시예 5에서 얻은 항체를 사용해서 확인하였다. COS-1 세포의 트랜스팩션은 상술한 전기 천공법 또는 DEAE-덱스트란 법(Luthmean, H. and Magnusson, G.(1983) Nucleic Acids Res, 11, 1295∼1308)에 따라 행하였다. cDNA를 함유하지 않는 네거티브 컨트롤 플라스미드 pcDL-SR α296 및 지방세포화 억제인자의 발현 플라스미드 pSRα-20-2로 트랜스팩트하여 얻은 COS-1 세포의 무혈청 배양상청 160㎕을 각각 트리클로로포산(TCA) 처리하여 단백을 침전시켜, 원심분리에 의해 침전물을 얻었다. 이 침전물 빙냉한 아세톤으로 세정하고 풍냉후, SDS-폴리아크릴 아미드 겔 전기 영동(SDS-PAGE)용의 2-메르캅토 에탄올을 함유한 샘플 완충액에 용해하고, 12.5% 겔을 사용하여 환원 조건하에서의 SDS-PAGE를 행하였다. 영동후의 단백 밴드의 검출은 나카라이테스크사의 실베스트 스테인을 사용하여 은 염색법으로 행하였다(제3도의 좌측 패널을 참조). pSRα-20-2로 트랜스팩트한 COS-1 세포의 배양 상청에서 화살표의 위치(분자량 : 약 23,000)의 특이한 단일 밴드가 검출되었다.

또한 마찬가지로 해서 전기 영동한 폴리아크릴 아미드겔로부터 단백 밴드를 Towbin들의 방법(Towbin, H. et al. (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 4350∼4354)에 따라 게르벤브란 전사장치(마리솔사제, KS-8441)를 사용하여 니트로셀룰로스 막에 블롯팅한 후, 실시예 5에서 조제한 1차 항체를 사용하여 웨스턴 블롯해석을 행하였다. 웨스턴 블롯팅의 반응조작은 Bio-Rad사의 Immun-Blot(GAR-HRP) Assay Kit를 사용하여 메이커의 지시서에 준한 방법으로 행하였다(제3도의 우측 패널을 참조). 은 염색으로 검출된 특이적 밴드(분자량 약 23,000)만이 항 펩티드 항체와 반응하여, pSD-20-2에 삽입되어 있는 cDNA의 ORF에 의해 코딩되는 단백이 분비 단백이라는 것이 확인되었다.

계속해서 pSDα-20-2로 트랜스팩트한 COS-1 세포의 배양 상청을 사용하여 지방 세포로의 형태변화 억제 활성을 검토하였다. 이 활성 데이터의 일례를 표-3에 나타낸다.

[표-3]

cDNA 인서트를 갖지 않는 네거티브 컨트롤의 플라스미드 pCDL-SR α 296으로 트랜스팩트한 COS-1 세포 배양 상청에는 지방세포로의 형태변화 억제활성은 보이지 않았으나, pSRα-20-2의 경우에는 현저한 활성이 검출되었다.

또 지방세포로 분화 유도시킨 3T3-L1 세포에 대해서는 그 LPL 활성을 강하게 억제하였다(표-4 참조). 표-3 및 표-4에 나타낸 억제 활성은 pSD-20-2를 사용한 경우의 억제활성(표-1 및 표-2) 보다 훨씬 강하게 되어 있었다.

[표-4]

ⅱ) 정제 및 N 말단 아미노산 배열 분석을 상기와 같이 해서 pSRα-20-2로 COS-1 세포를 트랜스팩트하고, 얻어진 무혈청 배양 상청 7L을 20배량의 투석 완충액(10mM 붕산-NaOH(pH 9.0), 13mM KCl)에 대하여 4℃에서 15시간 투석을 행한 후, 파르마시아사제의 FPLC를 사용한 약 양이온 교호나 크로마토그래피를 이하의 조건에 의해 실시하였다.

컬럼 : CM 도요파르팩 650M(2.2×20cm 도소(주)-제)

용융 완충액 : A액=10mM 붕산-NaOH(pH 9.0), 13mM KCl

B액=300mM NaCl을 함유하는 A액

유속 : 3ml/분

프랙션 용적 : 3ml/튜브

농도구배 : 100% A액으로부터 100% B액으로 직선 농도 구배(50분간) 얻어진 프랙션의 각각에 대하여 실시예 5에서 제작한 항 펩티드 항체를 사용한 웨스턴 블롯팅을 행하여 지방 세포 억제인자를 함유하는 프랙션(No. 35∼45)을 고정하였다. 지방 세포화 억제 인자를 가장 많이 함유하는 260mM NaCl로 용출되는 피크 프랙션(NO. 41)의 전량을 TCA 침전처리에 의해 농축하고, 환원 조건하에서 12.5% 겔을 사용한 SDS-PAGE에 공여하였다.

전기 영동 후, 폴리아크릴 아미드 겔로부터 단백 밴드를 전사 완충액(0.02% SDS, 20% 메탄올, 25mM 트리스-붕산(pH 9.5) 속에서 게르멘 브란 전사장치(마리솔사제, KS-8441)를 사용하여 4℃, 15시간, 0.8㎃/㎠의 조건하에서 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF)막 (미리포어사제, 1mmobilon)에 전사하였다. 전사후의 막을 25mM NaCl을 함유한 10mM 붕산 나트륨 완충액(pH 8.0)에 5분간, 이어서 순수로 5분간 진탕하여 세정하고 그후, 풍건하였다. 다음에 이 막으로부터 지방세포화 억제인자가 전사된 부분을 잘라내어 기상(氣相) 프로테인 시퀀서(어플라이드 바이오 시스템즈사제, 475A형)로 N 말단으로부터 10 아미노산 잔기까지의 배열을 결정하였다.

각 반응 사이클에서 얻어지는 페닐티오 히단토일(PHT)-아미노산은 역상 HPLC(어플라이드 바이오 시스템즈사제, 120A형)으로 분리 동정하였다. 상기로부터 결정된 아미노산 배열은 다음과 같았다.

Pro-Gly-Pro-Pro-Pro-Gly-Pro-Pro-Arg-Val-

이 결과로부터 사람 지방 세포화 억제인자는 199개의 아미노산으로 된 전구체가 생합성된 후, N 말단의 21개의 아미노산을 된 시그널 펩티드가 잘려나가 Pro 잔기로부터 시작되는 성숙체가 세포밖으로 분비되어 오는 것이 제시되었다.

[실시예 7]

[순화지방 세포화 억제인자의 생물 활성]

pSRα-20-2로 COS-1 세포를 트랜스팩트하여 얻어진 무혈청 배양 상청으로부터 공지의 방법에 따라 약양이온 교환 크로마토그래피, 소수크로마토그래피 및 겔 여과 컬럼 크로마토그래피 등을 조합시켜 지방세포화 억제인자를 정제하였던 바, SDS-PAGE 해석으로 단일의 밴드로서 검출되었다. 이 순화지방 세포화 억제인자를 사용하여 지방세포로의 형태변화 억제작용 및 LPL 억제작용을 조사한 결과, 저명한 활성이 검출되었다.

따라서 본 발명에서의 지방 세포화 억제인자는 단일의 단백이며, 그것이 지방 세포화 억제인자 활성을 가지는 것으로 결론 지워졌다.

[실시예 8]

[CHO 세포에서의 지방세포화 억제 인자의 분비 생산]

pSRα-20-2와 pRSV_neo를 5대 1의 DNA비를 사용하여 대수 증식기에 있는 CHO 세포를 인산 칼슘-DNA공 침전법에 의해 코 트랜스팩트하였다. 형질전환주의 선택은 400㎍/ml의 G418(기브코오리엔탈사제)과 10% FBS를 함유하는 Ham F12 배지(닛스이 세이야꾸(주)제)로 9일간 배양함으로써 행하였다. 얻어진 내성 콜로니중 15주를 선택한 후, 클로닝링을 사용하여 24웰 플레이트에 옮기어 배양을 계속하였다. 콘플루언트에 달한 세포를 각형 플라스크에 옮기어 계대(繼代)한 후, 이들 15주의 지방 세포화 억제인자의 생산능을 상술의 웨스턴 블롯팅법으로 지방 세포화 억제 인자의 양을 조사하였다. 지방 세포 억제 인자의 분비 생산량은 4주(株) 사이에 큰 차는 없고 안정하고 있었다. 또한 이때 얻어진 배양 상청을 사용하여 3T3-L1 세포의 LPL 활성에 미치는 영향을 조사한 결과, 4주가 모두 그 배양상청에는 LPL을 억제하는 활성이 검출되었다. 다음에 상기 중의 1주에 대해 무혈청 배지(CHO-1 컴플리트 미디어 시스템, Ventrex 사제)에서의 배양을 행하였다.

무혈청 배지에서 2일간 배양한 후, 트랩신-EDTA 처리에 의한 계대를 행하고, 다시 3일간 배양을 계속하였다. 그 후, 배양 상청을 회수하여 웨스턴 블롯팅법을 조사하였던 바, 지방 세포화 억제 인자가 안정하게 생산되고 있음이 확인되었다.

[실시예 9]

[마우스 골수 전 지방 세포주 H-1/A의 지방 세포로의 형태변화 억제작용]

마우스 골수 전 지방 세포주 H-1/A(Nauamura, M. et al.(1985) Proc. Soc. Exp. Biol, Med. 179, 283∼287)을 배지 E(비동화 FBS(하이클론사제)를 10% 함유하는 피셔배지(기브코사제)에 2.0×10^-4cells/ml의 밀도로 현탁하였다. 이것을 셀타이트 C-1 플레이트 48F (스미또모 베이클라이트(주)제)에 1웰당 0.5ml씩 분주하고, 5% CO₂-95% 대기의 가습 혼합기 속 33℃에서 배양하였다. 3일 후에 배지를 지방 세포화를 유도하기 위한 배지 F(1μM 하이드로코르티존(시그마사제)을 함유하는 배지 E)로 교환하고, 동시에 플라스미드 pSRα-20-2로 트랜스팩트한 COS-1 세포 배양 상청, 플라스미드 pcDL-SR α296으로 트랜스팩트한 COS-1 세포 배양 상청, 또는 혈청을 함유하지 않는 DMEM을 첨가하였다. 이후, 4일마다 신선한 배지 F로 교환하고, COS-1 세포 배양 상청 및 DMEM 배지를 첨가하였다. 배지 F를 첨가하고 나서 26일째에 세포를 5% 프롬알데히드로 고정후, 세포내에 축적된 지방립과 세포핵을 각각 오일일 레드 0와 헤마톡실린을 사용하여 염색하고, 3T3-L1 세포의 지방 세포로의 형태변화 억제작용의 측정법과 마찬가지 방법을 사용하여 지방 세포화율을 산출하였다. 표-5에 나타낸 바와 같이 pSR α-20-2로 트랜스팩트한 COS-1 세포 배양 상청에는 H-1/A 세포의 지방 세포로의 형태변화를 강하게 억제하는 작용이 검출되었다. 또 pSRα-20-2로 트랜스팩트한 COS-1 세포 배양 상청으로부터 정제한 순화 지방 세포화 억제 인자도 H-1/A 세포의 지방 세포로의 형태 변화를 저명하게 억제하였다.

[표-5]

[실시예 10]

[골수 유래 전 지방 세포주 H-1/A에 대한 CSF 유도작용]

H-1/A 세포를 배지 E에 1.0×10⁴cells/ml의 밀도로 현탁하고 6웰 클러스터디쉬(코스터사제)에 3ml씩 분주하였다. 이것을 5% CO₂-95% 대기의 가습 혼합기 속에서 33℃로 배양하였다. 배양 6일 후, 배지를 신선한 배지 E로 교환하였다. 이때 플라스미드 pSRα-20-2로 트랜스팩트한 COS-1 세포 배양 상청, 플라스미드 pcDL-SRα296로 트랜스팩트한 COS-1 세포 배양 상청, 또는 혈청을 함유하지 않은 DEME 배지를 첨가하고 5시간 배양하였다.

다음에 이 세포를 혈청을 포함하지 않는 피셔 배지로 3회 세정후, 신선한 배지 E를 각 웰에 3nl씩 첨가하여 14시간 배양하고 각각의 배양 상청을 체취하였다. 얻어진 배양 상청은 포아사이즈 0.22㎛의 마이렉스 GV 필터(니혼 밀리보아 고교(주)제)를 사용하여 여과한 후, 콜로니 자극 활성 시험은 Kubota들의 방법(Kubota, K, et al.(1981), Cancer Res, 41, 3052∼3057)을 참고로 하여 행하였다. 웅성 C3H He/N 마우스(니혼 찰스 리버(주)로부터 구입)의 대퇴골 세포를 0.3%의 박트아가(디프코사제), 20%의 FBS, 10%의 H-1/A 세포 배양 상청을 첨가한 RPMI 1640배지(기브코사제)에 1.0×10⁵cells/ml의 밀도로 현탁하고, 이것을 1ml씩 35mm×10mm의 플라스틱 디쉬(락크스사제)에 분주하여 5% CO₂-95% 대기의 가습 혼합기 속에서 37℃로 7일간 배양후, 디쉬에 형성한 콜로니수를 측정하였다.

pSRα-20-2로 트랜스팩트한 COS-1 세포 방향 상청을 첨가한 배지 E로 처리한 H-1/A 세포의 배양 상청은 pcDL-SRα296으로 트랜스팩트한 COS-1 세포 배양 상청, 또는 무혈청 DMEM을 첨가한 배지 E로 처리한 H-1/A 세포의 배양 상청에 비해, 뜻밖에 높은 콜로니 활성을 나타내었다(p0.01). 이 결과를 표-6에 나타낸다.

[표-6]

5.0×10⁶개의 H-1/A세포를 50ml의 배지 E에 현탁하고 액셀프라스코(코스터사제) 속에서 5일간 배양하였다. 다음에 배양액을 신선한 배지 E로 교환하고, 동시에 pSRα-20-2로 트랜스팩트한 COS-1 세포 배양 상청, pcDL-SR α296으로 트랜스팩트한 COS-1 세포 배양 상청, 또는 무혈청 DMEM을 첨가하였다. 이것을 18시간 배양한 후, 실시예 1과 마찬가지의 방법으로 세포로부터 전 RNA를 회수하였다. 각각 20㎍의 전 RNA를 사용하여 M-CSF 의 mRNA량을 노던 하이브리다이제이션법(Thomas, P.S.(1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 5201∼5205)에 따라 해석하였다. 프로브로서 폴리머라제 연쇄반응에 의해 조제한 마우스 M-CSF cDNA-(Ladner, M.B. et al.(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 6706∼6710)를 멀트프라임 DNA 표지 시스템(아미샴사제)을 사용하여 32P 표지하여 사용하였다. 하이브리다이즈한 32P 표지 프로브량은 아미지 애널라이저(후지샤시 필름(주)제)를 사용하여 정량하였다. 32P 표지 프로브는 약 2.5kb와 약 4.5kb인 크기의 RNA에 하이브리다이즈하였다. 이들 사이즈의 RNA에 하이브리다이즈한 프로브의 총량을 비교하였던 바, pSRα-20-2로 트랜스팩트한 COS-1 세포 배양 상청을 5% 첨가한 배지 E로 처리한 H-1/A 세포에서는, pcDL-SRα296으로 트랜스팩트한 COS-1 세포 배양 상청을 5% 첨가한 배지 E로 처리한 경우에 비해 단위 전 RNA당의 M-CSF mRNA가 증가하고 있었다(표-7 참조).

[표-7]

[실시예 11]

[지방 세포로 분화할 H-1/A 세포에 대한 CSF 유도 작용]

5.0×10⁶개의 H-1/A 세포를 50ml의 배지 F에 현탁하고 액셀프라스코 중에서, 33℃, 12일간 배양했다. 이 배양 기간중, 4일에 1회, 배양액을 신선한 배지 F로 교환했다. 다음에, 배양액을 배지 E로 교환하고, 3일간 배양을 계속했다. 그 결과, 40% 이상의 세포에 유적의 축적이 관찰되고, 지방 세포에의 분화가 인정되었다. 이 배양액을 pSRα-20-2으로 트랜스팩트한 COS-1 세포 배양 상청, pcDL-SRα296으로 트랜스팩트한 COS-1 세포 배양 상청, 또는 무혈청 DMEM를 5g 첨가한 배지 E로 교환하고, 18시간 배양을 실시했다. 배양후, 배양액을 제거하고, 세포를 PBS(-)로 2회 세정하고, 최종농도 10U/ml의 헤파린 나트륨을 첨가한 배지 F를 25ml 가하고, 35℃에서 15분간 배양했다. 이 배양 상청중의 LPL 활성을 측정한 바, pSRα-20-2로 트랜스팩트한 COS-1 세포 배양 상청을 첨가한 경우에만 저명한 LPL의 억제가 인정되었다(표-8 참조).

[표-8]

이어서, 상기와 같이 조제한 세포에서, 실시예 1과 동일한 방법으로 전 RNA를 회수했다. 이 RNA를 사용하여, 실시예 10과 동일한 방법으로 M-CSF mRNA량을 해석했다. 단, 전 RNA는 각각 10㎍씩 사용했다. pSRα-20-2으로 트랜스팩트한 COS-1 세포 배양 상청을 5% 첨가한 배지 E로 처리한 H-1/A 세포에서는, pcDL-SRα296으로 트랜스팩트한 COS-1 세포 배양 상청을 5% 첨가한 배지 F로 처리한 경우에 비해서, 단위 전 RNA당의 M-CSF mRNA량이 현저하게 증가되어 있었다(표-9 참조).

[표-9]

[제제예 1]

[지방 세포화 억제 인자-50% 함유 장용성 과립]

실시예 8에서 얻어진 후에, 정제된 지방 세포화 억제 인자를 70부(중량부, 이하 동일), 유당 10부, 미결정성 셀룰로우스 20부를 체취하고, 유발로 충분히 혼합한 후에, 적량의 물을 가하여 연합했다. 이 연합물을 공경 1.2mm의 스크린을 장치한 원통 과립기로 압출하고, 조립하고, 다시 말메라이저를 통해서 과립을 제작했다. 이 과립을 통기 건조기에 걸고 40℃, 2시간 건조했다. 얻어진 건조과립을 35메시의 체로쳐서 분급하고, 35메시 보다 큰 과립을 사용하여 장용성 과립을 제작했다. 우선, 상법에 따라서 5% 히드록시프로필메틸셀룰로우스의 메틸렌 클로라이드, 에탄올 동량 용액을 제작하고, 이 용액 100부를, 상기 건조 과립 100부에 코딩팬 중에서 스프레이 코팅을 실시했다. 이어서, 상법에 따라서 제작한 10% 히드록시프로필메틸셀룰로우스 프탈레이트(신에쓰화학 공업(주)제 HP-55), 1.5% 스테아린산, 50% 아세톤, 38.5% 에탄올의 용액 300부를, 상기와 동일하게 하여 스프레이 코팅을 실시했다. 이와 같이하여 얻어진 코팅과립을 통기 건조기에 걸고 40℃, 1시간 건조하여, 지방 세포화 억제인자의 장용성 제제로 했다. 이것은 지방 세포화 억제 인자 50%를 함유한다.

[제제예 2]

[캡슐제]

상기의 지방 세포화 억제 인자를 50% 함유하는 장용성 과립 200mg을 3호 캡슐에 충전하고, 1캡슐 당지방 세포화 억제 인자 100mg을 함유하는 경캡슐제를 제작했다.

[제제예 3]

[주사제]

물 또는 이 이외의 제제학적으로 허용할 수 있는 액에 용해한 무균성 용액 또는 현탁액의 앰플로서 사용될 수 있고, 또 무균 분말 제제(지방 세포화 억제 인자 용액을 동결건조하는 것이 바람직하다)를 앰플에 충전해 놓고, 동시에 제제학적으로 허용할 수 있는 액으로 희석해도 좋다.

[산업상의 이용 가능성]

본 발명의 지방 세포화 억제 인자는, 재생불량성 빈혈, 독물 및 방사선에 의한 백혈구 감소증, 비루스, 세균, 기생충 등에 의한 감염증, 골수 이식후의 혈구 감소증 및 난치성 범혈구 감소증 등의 질환 및 이에 부수하여 생기는 각종 면역 질환의 처치에 있어서, 단독 또는 다른 치료약과의 병용 투여로 사용된다. 또한, 지방 세포화 억제 인자는, 병적인 비만의 예방 또는 치료에 있어서, 단독 또는 다른 치료약과의 병용투여로 사용된다.

상기의 증상을 처치하기 위하여 사용하는 본 발명의 혈구 감소증 개선제 조성물 또는 항 비반제 조성물은, 의학적으로 허용되는 담체와 치료상 유효한 양의 지방 세포화 억제 인자와의 혼합물로 구성된다. 본 조성물은, 여러가지의 형태로 투여할 수 있고, 이들의 투여 형태로서는, 정제, 캡슐제, 과립제, 산제, 시럽제 등에 의한 경구투여 또는 주사제, 점적제, 좌약 등에 의한 비경구 투여를 들 수 있다.

주사제 또는 점적제로서 투여되는 경우에, 본 발명의 치료 조성물은 발열물질을 함유하지 않고, 비경구적으로 허용 가능한 수용액의 양태이다.

pH, 등장성 및 안정성을 고려하여 조제되는 상기의 비경구적으로 허용될 수 있는 단백질 용액의 조제는 당업자의 기술범위내에 있다.

상기 증상의 처치에 있어서의 투여량 및 투여법은, 본 약제의 작용에 영향을 미칠 수 있는 요인, 예를 들면, 환자의 증상, 체중, 성별, 연령, 식이, 모종의 감염의 정도, 투여 시간 및 기타의 임상상 영향을 주는 요인을 고려하여 진찰하는 의사에 의하여 결정할 수 있다.

통상, 경구 투여에서는 성인에 대해서 1일 약 0.01mg 내지 1000mg이고, 이들을 1회 또는 수회에 나누어서 투여할 수 있다. 또, 비경구 투여에서는, 1회당 0.01mg 내지 100mg을 피하주사, 근육주사, 또는 정맥주사로 투여할 수 있다.

본 발명의 적혈감소증 개선제 조성물은, 다른 적당한 조혈인자, 예를 들면, IL-1∼10, LIF, 스템 셀 팩터(stem cell factor), GM-CSF, G-CSF, W-CSF, Meg-CSF, TNF, IFN 에리트로포이에틴(erythropoietin)과 병용하여 사용할 수 있다. 이 경우에, 다른 조혈 인자는 본 발명의 혈구 감소증 개선제 조성물중의 1성분으로서 가해서 사용할 수 있지만, 따로따로의 조성물로서 동일 환자에게 투여할 수도 있다. 상기의 병용은, 또다른 조혈인자 단독으로의 처치의 활성 또는 효과를 증진시킬 수 있다.

또 본 발명의 항비만제 조성물은, 또다른 적당한 항비만 약, 예를 들면 식욕 억제제, 장관 흡수 억제제, 소화 효소 저해제, 대사항진 호르몬제, 지방 합성 저해제, 인슐린 분비 억제제와 병용하여 사용할 수 있고, 또한 식사요법, 운동요법과도 병용하여 사용될 수 있다. 이 경우 또다른 항비만 약 단독으로의 처치의 활성 또는 효과 및 또다른 항비반 요법 단독으로의 처치의 효과를 증진시킬 수 있다.

본 발명에서 사용되는 혈구 감소증 개선제 또는 항비반제는 모두 생체유래의 것 또는, 유전자 재조합체의 것이기 때문에, 이들의 독성은 낮다. DDY계 웅성 성숙 마우스(체중 약 20g)에게 경구투여하여, 5일간 관찰한 결과, 본 발명의 단백은 어느것이나 500mg/㎏ 이하에서는 독성을 나타내지 않았다.

「배열표」

배열 번호 : 1

배열의 길이 : 1065

배열의 형 : 핵산

사슬의 수 : 2개 사슬

토폴로지 : 직쇄상

배열의 종류 : cDNA to mRNA

하이포세티칼 : No

안티센스 : No

[기원]

생물명 : 호모 사피엔스(Homo sapiens)

셀라인 : KM-102

[배열의 특징]

18-614E CDS

81-614E mat-peptide

18-80E sig-peptide

[배열]

배열번호 : 2

배열의 길이 : 199

배열의 형 : 아미노산

토폴로지 : 직쇄상

배열의 종류 : 단백질

하이포세티칼 : No

[기원]

생물명 : 호모 사피엔스(Homo sapiens)

셀라인 : KM-102

[배열의 특징]

-21- -1 E sig peptide

-1 -178E mat-peptide

[배열]

Met Asn Cys Val Cys Arg Leu Val Leu Val Val Leu Ser Leu Trp Pro

-21 -20 -15 -10

Asp Thr Ala Val Ala Pro Gly Pro Pro Pro Gly Pro Pro Arg Val Ser

-5 1 5 10

Pro Asp Pro Arg Ala Glu Leu Asp Ser Thr Val Le Leu Thr Arg Ser

15 20 25

Leu Leu Ala Asp Thr Arg Gln Leu Ala Ala Gln Leu Arg Asp Lys Pre

15 35 40

Pro Ala Asp Gly Asp His Asn Leu Asp Ser Leu Pro Thr Leu Ala Met

45 50 55

Ser Ala Gly Ala Leu Gly Ala Leu Gln Leu Pro Gly Val Leu Thr Arg

60 65 70 75

Leu Arg Ala Asp Leu Leu Ser Tyr Leu Arg His Val Gln Trp Leu Arg

80 85 90

Arg Ala Gly Gly Ser Ser Leu Lys Thr Leu Glu Pro lu Leu Gly Thr

95 100 105

Leu Gln Ala Arg Leu Asp Arg Leu Leu Arg Arg Leu Gln Leu Leu Met

110 115 120

Ser Arg Leu Ala Leu Pro Gln Pro Pro Pro Asp Pro Pro Ala Pro Pro

120 130 135

Leu Ala Pro Pro Ser Ser Ala Trp Gly Gly Ile Arg Ala Ala His Ala

140 145 150 155

Ile Leu Gly Gly Leu His Leu Thr Leu Asp Trp Ala Val Arg Gly Leu

160 165 170

Leu Leu Leu Lys Thr Arg Leu

175

[도면의 간단한 설명]

제1도는 지방 세포화 억제 인자를 코딩하는 cDNA의 제한효소지도이다. ORF는 오픈·리딩·프레임을 나타낸다.

제2도는 본 명세서 실시예 6에 따르는 지방 세포화 억제 인자 발현 플라스미드 구축의 개량도를 나타낸다.

제3도는 pcDL-SR α296 및 pSR α-20-2로 트랜스펙트한 COS-1 세포 배양 상청중의 전단백질의 환원조건하에서의 SDS-PAGE 해석상과 항펩티드 항체를 사용한 웨스턴·브롯 해석상을 나타낸다.

Claims (7)

1. 유전자 조작에 의해서 얻어지고, 인간 유래의 다른 단백질을 실질적으로 함유하지 않으며, 이하 ① 내지 ③의 성질을 갖고, 하기 식(Ⅰ)로 표시되는 아미노산 배열을 포함하는 지방 세포화 억제 활성을 갖는 단백질 :

   ① 12.5% 겔을 사용한 환원 조건하에서 SDS 폴리아크릴 아미드겔 전기 영동에 있어서 외견상 23,000의 분자량을 나타내고,

   ② 배열표의 배열번호 2에 플라즈마시되는 아미노산 배열중 아미노산 번호 1∼10까지의 N 말단 아미노산 배열을 가지며,

   ③ (a) 컬럼으로서 CM 도요파르팩 650M(2.2×20cm, 도소(주)제)를 사용하고,(b) 용리완충액으로서, A액(10mM 붕산-NaOH(pH 9.0), 13mM KCl) 및 B액(300mM NaCl을 함유하는 A액)을 사용하고, (c) 유속을 3ml/분으로 하고,

   (d) 농도 구배를, 50분에 걸쳐 100% A액으로부터 100% B액에의 직선 농도 구배로 하는 조건하에서 약양이온 교환 크로마토그래피에 있어서, NaCl 농도가 220mM로부터 290mM의 범위에서 용출된다.

   (N) - Pro Gly Pro Pro Pro Gly Pro Pro Arg Val Ser Pro Asp Pro Arg

   Ala Glu Leu Asp Ser Thr Val Leu Leu Thr Arg Ser Leu Leu Ala

   Asp Thr Arg Gln Leu Ala Ala Gln Leu Arg Asp Lys Phe Pro Ala

   Asp Gly Asp His Asn Leu Asp Ser Leu Pro Thr Leu Ala Met Ser

   Ala Gly Ala Leu Gly Ala Leu Gln Leu Pro Gly Val Leu Thr Arg (Ⅰ)

   Leu Arg Ala Asp Leu Leu Ser Tyr Leu Arg His Val Gin Trp leu

   Arg Arg Ala Gly Gly Ser Ser Leu Lys Thr Leu Glu Pro Glu Leu

   Gly Thr Leu Gln Ala Arg Leu Asp Arg Leu Leu Arg Arg Leu Gln

   Trp Ala Val Arg Gly Leu Leu Leu Leu Lys Thr Arg Leu-(C)
2. 제1항에 있어서, N 말단에 수소원자 또는 Met를 갖는 단백질.
3. 하기식(Ⅱ)로 표시되는 뉴클레오티드 배열 또는 그것과 효과가 동일한 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 제1항에 규정되는 단백질을 코딩하는 DNA :

   (5')-CCT GGG CCA CCA CCT GGC

   CCC CCT CGA GTT TCC CCA GAC CCT CGG GCC GAG CTG GAC AGC ACC GTG

   CTC CTG ACC CAC TCT CTC CTG GCG GAC ACG CGG CAG CTG GCT GCA CAG

   CTG AGG GAC AAA TTC CCA CGT GAC GGG GAC CAC AAC CTG GAT TCC CTG

   CCC ACC CTG GCC ATG AGT GCG GGG GCA CTG GGA GCT CTA CAG CTC CCA

   GGT GTG CTG ACA AGG CTG CGA GCG GAC CTA CTG TCC TAC CTG CGG CAC

   GTG CAG TGG CTG CGC CGG GCA GGT GGC TCT TCC CTG AAG ACC CTG GAG

   (Ⅱ)

   CCC GAG CTG GGC ACC CTG CAG GCC CGA CTG GAC CGG CTG CTG CGC CGG

   CTG CAG CTC CTG ATG TCC CGC CTG GCC CTG CCC CAG CCA CCC CCC GAC

   CCG CCG GCG CCC CCG CTG GCG CCC CCC TCC TCA GCC TGG GGG GGC ATC

   AGG GCC GCC CAC GCC TAC CTG GGG GGG CTG CAC CTG ACA CTT GAC TGG

   GCC GTG AGG GGA CTG CTG CTG CTG AAG ACT CGG CTG-(3')
4. 제3항에 규정되는 DNA의 5' 말단에 ATG를 갖는 DNA.
5. 제1항에 규정되는 단백질의 치료학적 유효량을, 약학적으로 허용할 수 있는 담체 또는 부형제와 함께 함유하는 약학적 조성물.
6. 제1항에 규정되는 단백질의 치료학적 유효량을, 약학적으로 허용할 수 있는 담체 또는 부형제와 함께 함유하는 혈구 감소증 개선제.
7. 제1항에 규정되는 단백질의 치료학적 유효량을, 약학적으로 허용할 수 있는 담체 또는 부형제와 함께 함유하는 항비만제.