JPH0592997A

JPH0592997A - 新規サイトカイン

Info

Publication number: JPH0592997A
Application number: JP3290121A
Authority: JP
Inventors: Ichiro Kawashima; 一郎川島; Jun Okuma; 潤大隈; Kenji Miyadai; 健司宮台; Hiroshi Takiguchi; 洋滝口
Original assignee: Sankyo Co Ltd
Current assignee: Sankyo Co Ltd
Priority date: 1990-11-08
Filing date: 1991-11-06
Publication date: 1993-04-16
Anticipated expiration: 2013-05-18
Also published as: EP0556395B1; CA2095840A1; WO1992008735A1; EP0556395A4; ES2206440T3; HK1017817A1; HU9301330D0; DE69133321T2; ATE250935T1; EP0556395A1; DE69133321D1; KR930702525A; HUT66624A; KR0139095B1; DK0556395T3; HU217803B; JP2752819B2

Abstract

(57)【要約】【目的】ヒト骨髄間質細胞よりｍＲＮＡを抽出してｃＤ
ＮＡを作成し、クロ−ニング後に哺乳類の細胞で発現せ
しめた。細胞培養上清について脂肪細胞化抑制活性を見
出し、該培養上清よりこの活性を有する蛋白を分離・精
製した。【構成】還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によ
り見かけの分子量約２３、０００を示し、エドマン分解
法によるＮ末端のアミノ酸配列の同定によりＮ末端にプ
ロリン残基を有する蛋白であることが見出された。これ
と先の遺伝子クロ−ニングの結果より、該蛋白の全一次
構造が決定され、脂肪細胞化抑制活性および新規な構造
を有するサイトカインであることが判明した。【効果】本発明により新規脂肪細胞化抑制因子を組換え
ＤＮＡ技術を用いて大量に得ることが可能になり、各種
血球減少症および他の疾患に対する治療および診断が可
能になる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、細胞の脂肪細胞化を抑
制する活性、脂肪細胞のリポプロテイン・リパーゼ(LP
L) を抑制する活性、及び／又は、コロニ−刺激因子（c
olony stimulating factor, CSF）を誘導する活性を有
する新規な単一の蛋白質に関し、且つ、該蛋白質をコー
ドするDNA 、該DNA から成る組換えDNA 発現ベクター、
該組換えDNA 発現ベクタ−で形質転換せしめた宿主、及
び、該蛋白質の有効量を含有する蛋白質組成物に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】生体の造血には、造血幹細胞と各種造血
因子とともに、造血を支持する骨髄間質細胞すなわち造
血微小環境の存在が必要とされることが現在では広く知
られている。ヒトにおいて、出生時には全骨髄で活発に
造血が行なわれているが、成長に伴う骨髄腔の拡大によ
り造血の必要がなくなると、骨髄は四肢末梢からしだい
に脂肪細胞で占められるようになる。造血が行なわれて
いる骨髄を赤色髄、脂肪に置換された骨髄を黄色髄と呼
ぶ。出血や溶血などで造血が亢進すると黄色髄は再び造
血を開始する（柏村真(1988)、医学のあゆみ146,264-26
8)。

【０００３】造血微小環境で造血支持機能を有する細胞
は主に前脂肪細胞であり、それが脂肪細胞に分化すると
その能力を失ってしまうことが知られている（小玉博明
(1986)組織培養12,191-195) 。

【０００４】例えば、マウス骨髄型前脂肪細胞株 PA6
は、造血幹細胞の増殖を支持する活性を有するが、この
細胞が脂肪細胞に分化するとその能力が低下する（Koda
ma,H.-A. et al., (1984), J. Cell. Physiol. 118, 23
3- 240 ）。PA6 細胞とマウス骨髄細胞を共培養する
と、芽球コロニ−、巨核球コロニ−、マクロファ−ジコ
ロニ−が誘導され得ることが知られていることから（小
玉博明、(1987)、実験医学、5、 826-830）、脂肪細胞
化抑制活性を有する蛋白質は、骨髄の前脂肪細胞及び脂
肪細胞に働きかけてその造血支持能力、すなわち、白血
球、マクロファ−ジ、血小板（巨核球に由来）などの誘
導能力を昂進させる。

【０００５】また、マウス骨髄由来前脂肪細胞株 H-1/A
は、CSF を産生しているが、この細胞が脂肪細胞に分
化すると、CSF 産生量が低下することが報告されている
（Nakamura, M. et al. (1985), Proc.Soc.Exp.Biol.M
ed., 179, 283-287 ）。

【０００６】後述するように、本発明の脂肪細胞化抑制
因子は、H-1/A 細胞に作用してマクロファ−ジ・コロニ
−刺激因子（macrophage- colony stimulating factor,
M-CSF ）の産生を昂進させる作用を有している。M-CSF
は、単球及びマクロファ−ジに対する刺激活性の他に
巨核球増幅因子（megakaryocyte potentiator, Meg-PO
T）としての作用を有する（Teramura, M. et al. (199
0), Int. J. Cell Cloning, 8, 245-252 ）。また、M-
CSF は、単球に働きかけて、単球からのMeg-POTの産生
を昂進させる活性も知られている。さらに臨床治療のデ
ータは、M- CSFが癌化学療法後の好中球減少症や血小板
減少症からの回復を促進させることを示している（元吉
和夫、(1986)、癌と化学療法、16、 3531-3536 ）。

【０００７】したがって、本発明の脂肪細胞化抑制因子
は、骨髄または末梢の前脂肪細胞および脂肪細胞に働き
かけ、その造血支持能を亢進させる。

【０００８】本発明以前に、脂肪細胞のLPL を抑制し、
脂肪細胞分化を抑制する蛋白質として腫瘍壊死因子(tum
or necrosis factor- α,TNF- α) (Price,S.R.et al.
(1986)Arch.Biochem.Biophys.251,738-746;Kawakami,M.
et al.(1987)J.Biochem.101,331-338)、インターロイキ
ン-1(interleukin-1,IL-1)(Beutler,B.A.and Cerami,A.
(1985)J.Immunol.135,3969-3971)、インターフェロン(i
nterferon,IFN)(Keay,S.and Grossberg,S.E.(1980)Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA 77,4099- 4103;Patton,J.S.et a
l.(1986)Proc.Natl.Acad. Sci.USA 83,8313-8317) およ
びリューケミア・インヒビトリー・ファクター(leukemi
a inhibitory factor,LIF)(Mori,M. et al.(1989)Bio
chem. Biophys.Res.Commun.160,1085-1092) が知られて
いる。これらの因子は、既にcDNAがクローニングされて
おり、その全構造が明らかにされている。

【０００９】また、本発明の優先日以前に、サルのイン
タ−ロイキン11のプロ体の cＤＮＡを単離して発現さ
せ、培養液のplasmacytoma刺激活性、megakaryocyte コ
ロニ−形成活性を見出した報告がなされているが（Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA vol.87,pp.7512-7516,(1990)
）、サルのインタ−ロイキン11の物質的同定を明確に
しておらず、ヒトのインタ−ロイキン11については、発
現及び活性の確認を行なっていないので、本発明とは、
直接の関連性を有しない。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、主とし
て細胞の脂肪細胞化を抑制する活性、脂肪細胞のリポプ
ロテイン・リパーゼ(LPL) を抑制する活性、及び、コロ
ニ−刺激因子（colonystimulating factor, CSF ）を誘
導する活性（CSF 誘導活性）を有する新規な単一の蛋白
質を見出し、該蛋白質を遺伝子操作の手法を用いて大量
に得ることを可能にして、本発明を完成した。

【００１１】本発明により脂肪細胞化抑制因子を大量に
得ることが可能になり、各種貧血症およびその他の血液
疾患の治療および診断に有効に適用することができるよ
うになる。例えば、再生不良性貧血、毒物や放射線によ
る白血球減少症、ウイルス・細菌・寄生虫などによる感
染症、骨髄移植後の血球減少症、および抗癌剤などによ
る化学療法後の血球減少症に適用できる。また、現在広
く行なわれている成分輸血の節約をもたらし得る。さら
に、これら免疫機能増強効果のみならず、病的な肥満の
予防または治療剤としての利用も可能である。

【００１２】本発明において「血球減少症」とは、これ
らすべての疾患およびそれに付随して生ずる各種免疫疾
患をいい、「血球減少症改善剤」とは、血球減少症の予
防・治療に有効な効果を有する薬剤を総称する。

【００１３】また、前脂肪細胞の脂肪細胞への形態変化
を抑制する活性、脂肪細胞のリポプロテイン・リパーゼ
(LPL) を抑制する活性、又は、前脂肪細胞のCSF 産生能
を維持・促進する活性の一つ又は二つ以上を「脂肪細胞
化抑制活性」と呼び、かかる活性を有する蛋白質を「脂
肪細胞化抑制因子」と呼ぶ。

【００１４】［発明の構成］

【００１５】

【課題を解決するための手段】本発明は、 (1) 遺伝子操作によって得られ、ヒト由来の他の蛋白質
を実質的に含有せず、以下の性質を有し、脂肪細胞化抑
制活性を有する蛋白質： 12.5% ゲルを用いた還元条件下でのSDS ポリアクリル
アミドゲル電気泳動において、見かけ上約 23,000 の分
子量を示し、配列表の配列番号2 に示されるアミノ酸配列のうち、
アミノ酸番号1〜10までのN 末端アミノ酸配列を有し、 (a) カラムとして CM トヨパ−ルパック 650M （2.2
x 20 cm 、東ソ−（株）製）を用い、(b) 溶離緩衝液と
して、A 液（10 mM ホウ酸-NaOH(pH 9.0)、 13 mM KCl）
及びB 液（300 mM NaCl を含む A 液）を用い、(c)
流速を、3 ml/ 分とし、(d) 濃度勾配を、50分間にわた
る、 100% A液より 100% B 液への直線濃度勾配とする
条件下での弱陽イオン交換クロマトグラフィ−におい
て、NaCl濃度が220 mMから290 mMの範囲で溶出する、 (2) 遺伝子操作によって得られ、ヒト由来の他の蛋白質
を実質的に含有せず、配列表の配列番号2 に示されるア
ミノ酸配列のうち、アミノ酸番号1 〜178 までのアミノ
酸配列から成る、脂肪細胞化抑制活性を有する蛋白質、
又は、該蛋白質の一つ若しくは二つ以上の部位におい
て、一つ若しくは二つ以上のアミノ酸残基が欠失、挿入
若しくは置換されている該蛋白質の同効物、 (3) 遺伝子操作によって得られ、ヒト由来の他の蛋白質
を実質的に含有せず、配列表の配列番号2 に示されるア
ミノ酸配列のうち、アミノ酸番号1 〜178 までのアミノ
酸配列から成る、脂肪細胞化抑制活性を有する蛋白質、 (4) N末端に水素原子又はMet を有する、(1) 、(2) 又
は(3) 記載の蛋白質、 (5) (1)、(2) 、(3) 又は(4) 記載の蛋白質をコ−ドす
るDNA 、 (6) 配列表の配列番号1 に示されるヌクレオチド配列の
うち、ヌクレオチド番号81から 614 までのヌクレオチ
ド配列又はそれと同効のヌクレオチド配列から成る、
(1) 又は(2) 記載の蛋白質をコ−ドするDNA 、 (7) 配列表の配列番号1 に示されるヌクレオチド配列の
うち、ヌクレオチド番号81から 614 までのヌクレオチ
ド配列から成る、(1) 又は(3) 記載の蛋白質をコ−ドす
るDNA 、 (8) (5) 、(6) 又は(7) 記載のDNA の5'末端にATG を有
するDNA 、 (9) (5) 、(6) 、(7) 又は(8) 記載のDNA から成り、該
DNA が発現可能かつ複製可能である、組換えDNA 発現ベ
クタ−、 (10)(9) 記載の組換えDNA 発現ベクタ−で形質転換せし
めた宿主、 (11) (1)、(2) 、(3) 又は(4) 記載の蛋白質をコードし
ているDNA から成り、該DNA が発現可能かつ複製可能で
ある、組換えDNA 発現ベクターで形質転換せしめた宿主
を培養し、その細胞抽出液またはその培養液から該蛋白
質を回収することから成る該蛋白質の製造法、 (12)(1) 、(2) 、(3) 及び／又は(4) 記載の蛋白質を有
効成分とする血球減少症改善剤、 (13)(1) 、(2) 、(3) 及び／又は(4) 記載の蛋白質を有
効成分とする抗肥満剤に関する。

【００１６】本発明の蛋白質としては、好適には(2) 又
は(3) に記載の蛋白質であり、さらに好適には(3) に記
載の蛋白質である。

【００１７】また、DNA としては、好適には(2) 又は
(3)に記載の蛋白質をコ−ドするDNAであり、さらに好適
には(3) に記載の蛋白質をコ−ドするDNA である。

【００１８】本発明のDNA は例えば脂肪細胞化抑制活性
を有する蛋白を産生する能力を有する哺乳動物細胞等か
ら該蛋白質をコードするmRNAを調製した後、既知の方法
により２本鎖cDNAに変換することによって得られる。前
記mRNAの供給源となる動物細胞は、本発明においては、
ヒト骨髄間質由来の細胞株KM-102(Harigaya,K.and Hand
a,H.(1985)Proc.Natl.Acad. Sci.USA 82,3477-3480) が
好適であるが、腫瘍細胞株に限らず、哺乳動物から分離
できる細胞および組織、あるいは樹立した他の細胞株で
もよい。

【００１９】mRNAの抽出にあたっては、グアニジン・チ
オシアネート・ホット・フェノール法、グアニジン・チ
オシアネート−グアニジン・塩酸法なども採用し得る
が、グアニジン・チオシアネート・塩化セシウム法が好
適である。

【００２０】真核細胞の細胞質に存在するmRNAの多く
は、その3'末端にポリA 配列をもつことが知られている
ので、この特徴を利用してオリゴ(dT)セルロースのカラ
ムにmRNAを吸着させて、次にこれを溶出して精製する。
さらに、ショ糖密度勾配遠心法等によりmRNAを更に分画
することもできる。

【００２１】上記の如くして得られたmRNAが脂肪細胞化
抑制活性をもつ蛋白をコードするものであることを確認
するためには、mRNAを蛋白に翻訳させ生理活性を調べる
か、該蛋白質に特異的な抗体を用いてその蛋白を同定す
る等の方法で行なえばよい。例えば、アフリカツメガエ
ル(Xenopus laevis)の卵母細胞にmRNAを注入して翻訳さ
せたり(Gurdon,J.B.et al.(1972)Nature 233,177- 18
2) 、あるいはウサギ網状赤血球系や小麦胚芽系を利用
した翻訳反応が行なわれている(Schleif, R.F.and Wens
ink,P.C.(1981): “Practical Methods in Molecular B
iology”, Springer-Verlag,NY.)。

【００２２】脂肪細胞化抑制活性の検定は前脂肪細胞、
例えばマウス3T3-L1細胞株などを用いた脂肪細胞への形
態変化を抑制する活性およびLPL活性測定法により実施
できる(Beutler,B.A.et al.(1985)J.Immunol.135, 3972
-3977)。

【００２３】前述の如き方法で得たmRNAを鋳型として逆
転写酵素を用いて１本鎖cDNAを合成した後、この１本鎖
cDNAから２本鎖cDNAを合成するが、その方法としてはS1
ヌクレアーゼ法(Efstratiadis,A.et al.(1976)Cell 7,2
79-288) 、Land法(Land,H.etal.(1981)Nucleic Acids R
es.9,2251-2266),O.Joon Yoo 法(Yoo,O.J.et al.(1983)
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79,1049-1053) なども採用し
得るが、本発明の目的にはOkayama-Berg法(Okayama,H.a
ndBerg,P.(1982)Mol.Cell.Biol.2,161-170) が好適であ
る。

【００２４】次に、得られた組換えプラスミドを大腸
菌、例えばDH5 α株に導入して形質転換させて、テトラ
サイクリン耐性あるいはアンピシリン耐性を指標として
組換体を選択することができる。宿主細胞の形質転換
は、例えば宿主細胞が大腸菌の場合にはHanahan の方法
(Hanahan,D.(1983)J.Mol.Biol.166,557-580)、すなわち
CaCl₂ やMgCl₂ またはRbClを共存させて調製したコンピ
テント細胞に該組換えDNA 体を加える方法により実施す
ることができる。なお、ベクターとしてはプラスミド以
外にもラムダ系などのファージベクターも用いることが
できる。

【００２５】上記により得られる形質転換株から、目的
の脂肪細胞化抑制因子のDNA を有する株を選択する方法
としては、例えば以下に示す各種方法を採用できる。

【００２６】(1) 合成オリゴヌクレオチドプローブを用
いるスクリーニング法目的蛋白のアミノ酸配列の全部または一部が解明されて
いる（該配列は、複数個連続した特異的配列であれば、
目的蛋白のどの領域のものでもよい）場合、該アミノ酸
に対応するオリゴヌクレオチドを合成し（この場合コド
ン使用頻度を用いて導いたヌクレオチド配列または考え
られるヌクレオチド配列を組合せた複数個のヌクレオチ
ド配列のどちらでもよく、また後者の場合、イノシンを
含ませてその種類を減らすこともできる）、これをプロ
ーブ(³²P又は³⁵S で標識する）として、形質転換株のDN
A を変性固定したニトロセルロースフィルターとハイブ
リダイズさせ、得られたポジティブ株を検索して、これ
を選択する。

【００２７】(2) ポリメラーゼ連鎖反応により作製した
プローブを用いるスクリーニング法目的蛋白のアミノ酸配列の全部または一部が解明されて
いる場合、該アミノ酸の一部に対応するセンスストラン
ドとアンチセンスストランドのオリゴヌクレオチドを合
成し、これらを組合せてポリメラーゼ連鎖反応(Saiki,
R.K.et al.(1988) Science 239,487-491)を行ない、目
的の脂肪細胞化抑制因子をコードするDNA断片を増幅す
る。ここで用いる鋳型DNA としては、脂肪細胞化抑制因
子を産生する細胞のmRNAより逆転写反応にて合成したcD
NA、またはゲノムDNA を用いることができる。このよう
にして調製したDNA 断片を³²P または³⁵S で標識し、こ
れをプローブとして用いてコロニーハイブリダイゼーシ
ョンまたはプラークハイブリダイゼーションを行なうこ
とにより目的のクローンを選択する。

【００２８】(3) 他の動物細胞で脂肪細胞化抑制因子を
産生させてスクリーニングする方法形質転換株を培養し、遺伝子を増幅させ、その遺伝子を
動物細胞にトランスフェクトし（この場合、自己複製可
能で転写プロモーター領域を含むプラスミドもしくは動
物細胞の染色体に組み込まれ得るようなプラスミドのい
ずれでもよい）、遺伝子にコードされた蛋白を産生さ
せ、その培養上清もしくは細胞抽出物の脂肪細胞化抑制
活性を測定するか、または脂肪細胞化抑制因子に対する
抗体を用いて脂肪細胞化抑制因子を検出することによ
り、元の形質転換株より目的の脂肪細胞化抑制因子をコ
ードするcDNAを有する株を選択する。

【００２９】(4) 脂肪細胞化抑制因子に対する抗体を用
いて選択する方法あらかじめ、cDNAを発現ベクターに組込み、形質転換株
内で蛋白を産生させ、脂肪細胞化抑制因子に対する抗体
および該抗体に対する２次抗体を用いて、所望の脂肪細
胞化抑制因子産生株を検出し、目的の株を選択する。

【００３０】(5) セレクティブ・ハイブリダイゼーショ
ン・トランスレーションの系を用いる方法形質転換株から得られるcDNAを、ニトロセルロースフィ
ルター等にブロットし、脂肪細胞化抑制因子産生細胞か
らのmRNAをハイブリダイズさせた後、cDNAに結合したmR
NAを解離させ、回収する。回収されたmRNAを蛋白翻訳
系、例えばアフリカツメガエルの卵母細胞への注入や、
ウサギ網状赤血球ライゼートや小麦胚芽等の無細胞系で
蛋白に翻訳させ、その蛋白の脂肪細胞化抑制活性を調べ
るか、または脂肪細胞化抑制因子に対する抗体を用いて
検出して、目的の株を選択する。

【００３１】なお実施例で後述するように、上記の各種
方法を適用する前に、サイトカイン類のmRNAに共通して
存在するAUUUA モチーフ(Shaw,G.and.Kamen,R.(1986)Ce
ll 46,659-667)を参考にして設計した合成オリゴヌクレ
オチド・プローブを用いて１次スクリーニングを行なっ
た後、選択された陽性株について、上述した(3) の方
法、すなわち、他の動物細胞で脂肪細胞化抑制活性を産
生させてスクリーニングする方法を適用することにより
目的の株を選択することも可能である。

【００３２】得られた目的の形質転換株より脂肪細胞化
抑制因子をコードするDNA を採取する方法は、公知の方
法(Maniatis,T.et al.(1982): “Molecular Cloning-AL
aboratory Manual ”Cold Spring Harbor Laboratory,N
Y) に従い実施できる。例えば細胞よりプラスミドDNA
に相当する画分を分離し、該プラスミドDNA よりcDNA領
域を切り出すことにより行ない得る。

【００３３】このようにして得られるDNA の配列決定
は、例えばマキサム−ギルバートの化学修飾法(Maxam,
A.M.and Gilbert,W.(1980):“Methods in Enzymology"
65,499-559)やM13 ファージを用いるジデオキシヌクレ
オチド鎖終結法(Messing,J.and Vieira,J.(1982)Gene 1
9,269-276)等により行なうことができる。

【００３４】このようにしてクローン化された脂肪細胞
化抑制因子をコードする遺伝子を含む断片は、適当なベ
クターDNA に再び組込むことにより、他の原核生物また
は真核生物の宿主細胞を形質転換させることができる。
さらに、これらのベクターに適当なプロモーターおよび
形質発現にかかわる配列を導入することにより、それぞ
れの宿主細胞において遺伝子を発現させることが可能で
ある。

【００３５】原核細胞の宿主としては、例えば大腸菌(E
scherichia coli)や枯草菌(Bacillus subtilis) 等が挙
げられる。目的の遺伝子をこれらの宿主細胞内で形質発
現させるには、宿主と適合し得る種由来のレプリコン、
すなわち複製起点および調節配列を含んでいるプラスミ
ドベクターで宿主細胞を形質転換させればよい。またベ
クターは形質転換細胞に表現形質（表現型）の選択性を
付与することができる配列を持つものが望ましい。

【００３６】例えば大腸菌としてはE.coli K12株等がよ
く用いられ、ベクターとしては一般にpBR322やpUC 系の
プラスミドがよく用いられるが、これに限定されず、公
知の各種の菌株およびベクターがいずれも利用できる。
プロモーターとしては、大腸菌においてはトリプトファ
ン(trp) プロモーター、ラクトース(lac) プロモータ
ー、トリプトファン・ラクトース(tac) プロモーター、
リポプロテイン(lpp) プロモーター、バクテリオファー
ジ由来のラムダ（λ）P_Lプロモーター、ポリペプチド鎖
伸長因子Tu(tufB)プロモーター等が挙げられ、どのプロ
モーターも本発明の脂肪細胞化抑制因子の産生に使用す
ることができる。枯草菌としては、例えば207-25株が
好ましく、ベクターとしてはpTUB228(Ohmura,K.et al.
(1984)J.Biochem.95,87-93)等が用いられるが、これに
限定されるものではない。プロモーターとしては、枯草
菌のα−アミラーゼ遺伝子の調節配列がよく用いられ、
さらに必要によりα−アミラーゼのシグナルペプチド配
列をコードするDNA 配列を連結することにより、菌体外
での分泌発現も可能となる。

【００３７】真核生物の宿主細胞には、脊椎動物、昆
虫、酵母等の細胞が含まれ、脊椎動物細胞としては、例
えばサルの細胞であるCOS 細胞(Gluzman,Y. (1981)Cell
23,175-182)やチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞(CH
O) のジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損株(Urlaub,G.and C
hasin,L.A.(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77,4216-422
0)等がよく用いられているが、これらに限定されるわけ
ではない。

【００３８】脊椎動物細胞の発現ベクターとしては、通
常発現しようとする遺伝子の上流に位置するプロモータ
ー、RNA のスプライス部位、ポリアデニル化部位および
転写終結配列等を有するものを使用でき、これはさらに
必要により複製起点を有してもよい。該発現ベクターの
例としては、SV40の初期プロモーターを有するpSV2dhfr
(Subramani,S. et al.(1981)Mol.Cell.Biol.1,854-864)
等を例示できるが、これに限定されない。

【００３９】また真核微生物としては酵母が一般によく
用いられており、その中でもサッカロミセス属酵母、例
えばSaccharomyces cerevisiaeが好ましい。該酵母等の
真核微生物の発現ベクターとしては、例えばアルコール
脱水素酵素遺伝子のプロモーター(Bennetzen,J.L.and H
all,B.D.(1982)J.Biol. Chem.257,3018-3025) や酸性ホ
スファターゼ遺伝子のプロモーター(Miyanohara,A.et a
l.(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80,1-5)等を好ましく
利用できる。

【００４０】宿主細胞として、COS 細胞を用いる場合を
例に挙げると、発現ベクターとしては、SV40複製起点を
有し、COS 細胞において自律増殖が可能であり、さらに
転写プロモーター、転写終結シグナルおよびRNA スプラ
イス部位を備えたものを用いることができる。該発現ベ
クターはDEAE- デキストラン法(Luthman,H.and Magnuss
on,G.(1983) Nucleic Acids Res.11,1295-1308) 、リン
酸カルシウム-DNA共沈殿法(Graham,F.L.and van der E
d,A.J.(1973)Virology 52,456-457) および電気パスル
穿孔法(Neumann,E.et al.(1982)EMBO J.1,841-845)等に
よりCOS 細胞に取込ませることができ、かくして所望の
形質転換細胞を得ることができる。また、宿主細胞とし
てCHO 細胞を用いる場合には、発現ベクターと共に、G4
18耐性マーカーとして機能するneo 遺伝子を発現し得る
ベクター、例えばpRSVneo(Sambrook,J.et al.(1989):
“Molecular Cloning-A Laboratory Manual ”Cold Spr
ing Harbor Laboratory,NY) やpSV2-neo(Southern,P.J.
and Berg,P.(1982)J.Mol.Appl.Genet.1,327-341)等をコ
・トランスフェクトし、G418耐性のコロニーを選択する
ことにより脂肪細胞化抑制因子を安定に産生する形質転
換細胞を得ることができる。

【００４１】上記で得られる所望の形質転換体は、常法
に従い培養することができ、該培養により細胞内または
細胞外に脂肪細胞化抑制因子が生産される。該培養に用
いられる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用
される各種のものを適宜選択でき、例えば上記COS 細胞
であればRPMI-1640 培地やダルベッコ修正イーグル最小
必須培地(DMEM)等の培地に必要に応じ牛胎児血清(FBS)
等の血清成分を添加したものを使用できる。

【００４２】上記により、形質転換体の細胞内または細
胞外に生産される脂肪細胞化抑制因子は、該脂肪細胞化
抑制因子の物理的性質や化学的性質等を利用した各種の
公知の分離操作法により、それらより分離・精製するこ
とができる。該方法としては、具体的には例えば通常の
蛋白沈殿剤による処理、限外濾過、分子ふるいクロマト
グラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イ
オン交換体クロマトグラフィー、アフィニティクロマト
グラフィー、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)等の各
種液体クロマトグラフィー、透析法、これらの組合せ等
を例示できる。上記方法により、容易に高収率、高純度
で所望の脂肪細胞化抑制因子を工業的規模で製造でき
る。このようにして得られる本発明の組換え脂肪細胞化
抑制因子の諸性質は下記実施例に詳述する通りであり、
この因子はそれが有する生物活性より、前記した各種の
分野で有用である。

【００４３】

【作用】このようにして本発明DNA を利用して遺伝子工
学的手法により得られる物質が、脂肪細胞化抑制活性を
発現するためには、必ずしも配列表の配列番号2 に示さ
れる前駆体（アミノ酸番号-21 〜+178のアミノ酸から成
る蛋白質）のアミノ酸配列の全てを有するものである必
要はなく、例えばその部分配列であって、それが脂肪細
胞化抑制活性を示す限り、それらのアミノ酸配列もまた
本発明の蛋白に包含される。また該蛋白をコードするDN
A も本発明に含まれる。

【００４４】このような脂肪細胞化抑制活性を示す蛋白
としては、配列表の配列番号2 に示されるアミノ酸配列
のアミノ酸番号1 のPro をN 末端とする178 個のアミノ
酸から成る蛋白、すなわち成熟脂肪細胞化抑制因子と考
えられる蛋白を例示できる。なお、この蛋白は、還元条
件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にお
いて、見かけ上約 23,000の分子量を示す。

【００４５】また、該成熟脂肪細胞化抑制因子をコード
するDNA も本発明におけるDNA として例示することがで
きる。さらに好適には、かかるDNA は、配列表の配列番
号1に示されるヌクレオチド配列の81番目から614 番目
までのヌクレオチド配列に表わされるDNA である。

【００４６】一般に真核生物の遺伝子はインターフェロ
ン遺伝子等で知られているように、多型現象(polymorph
ism)を示すと考えられ（例えば、Nishi,T.et al.(1985)
J.Biochem.97,153-159を参照）、この多型現象によって
1 個またはそれ以上のアミノ酸が置換される場合もあれ
ば、ヌクレオチド配列の変化はあってもアミノ酸は全く
変わらない場合もある。

【００４７】配列表の配列番号2 で示されるアミノ酸配
列のアミノ酸番号-21 〜+178から成る前駆体脂肪細胞化
抑制因子、及び、配列番号2 で示されるアミノ酸配列の
アミノ酸番号+1〜+178から成る成熟脂肪細胞化抑制因子
のアミノ酸配列の中の、一つ若しくは二つ以上の部位に
おいて、一つ若しくは二つ以上のアミノ酸残基が失欠、
挿入若しくは置換されている蛋白質でも脂肪細胞化抑制
因子活性を有することがある。これらの蛋白質を本発明
においては、脂肪細胞化抑制因子の同効物と呼ぶ。

【００４８】例えば、インターロイキン2(IL-2) 遺伝子
のシステインに相当するヌクレオチド配列をセリンに相
当するヌクレオチド配列に変換して得られた蛋白がIL-2
活性を保持することも既に公知となっている(Wang,A.et
al.(1984)Science 224,1431-1433)。それゆえ、それ等
天然に存在するかあるいは人工合成された蛋白が脂肪細
胞化抑制活性を有する限りそれ等の蛋白は全て本発明に
含まれる。

【００４９】また、これらの蛋白質をコ−ドする、同効
のヌクレオチド配列からなるDNA もすべて本発明に含ま
れる。

【００５０】このような各種の本発明のDNA は、上記脂
肪細胞化抑制因子の情報に基づいて、例えばホスファイ
ト・トリエステル法(Hunkapiller,M. et al.(1984)Natu
re 310,105-111) 等の常法に従い、核酸の化学合成によ
り製造することもできる。

【００５１】なお、所望アミノ酸に対するコドンはそれ
自体公知であり、その選択も任意でよく、例えば利用す
る宿主のコドン使用頻度を考慮して常法に従い決定でき
る(Grantham,R.et al.(1981)Nucleic Acids Res.9 r43-
r74)。さらに、これらヌクレオチド配列のコドンの一部
改変は、常法に従い、所望の改変をコードする合成オリ
ゴヌクレオチドから成るプライマーを利用したサイトス
ペシフィック・ミュータジェネシス(site specific mut
agenesis) (Mark,D.F.et al.(1984)Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA81,5662-5666) 等に従うことができる。

【００５２】本発明の脂肪細胞化抑制因子は、再生不良
性貧血、毒物や放射線による白血球減少症、ウイルス・
細菌・寄生虫などによる感染症、骨髄移植後の血球減少
症、および難治性汎血球減少症などの疾患並びにそれに
付随して生ずる各種免疫疾患の処置において、単独又は
他の治療薬との併用投与で用いられる。さらに、脂肪細
胞化抑制因子は、病的な肥満の予防又は治療において、
単独又は他の治療薬との併用投与で用いられる。

【００５３】上記の症状を処置するために用いる本発明
の血球減少症改善剤組成物又は抗肥満剤組成物は、医学
的に許容される担体と治療上有効な量の脂肪細胞化抑制
因子との混合物から成る。本組成物は、種々の形態で投
与することができ、それらの投与形態としては、錠剤、
カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等による経口投
与、または、注射剤、点滴剤、坐薬などによる非経口投
与をあげることができる。

【００５４】注射剤又は点滴剤として投与される場合、
本発明の治療組成物は発熱物質を含まず、非経口的に許
容可能な水溶液の態様である。pH、等張性、及び安定性
を考慮して調製される上記の非経口的に許容されうる蛋
白質溶液の調剤は、当業者の技術範囲内にある。

【００５５】上記症状の処置における投与量及び投与法
は、本薬剤の作用に影響を及ぼし得る要因、例えば、患
者の症状、体重、性、年令、食餌、何らかの感染の重
度、投与の時間及びその他の臨床上影響を与える要因を
考慮して診察する医師によって決定されうる。通常、経
口投与では成人に対して１日約 0.01mg 乃至 1000 mg
であり、これらを１回又は数回に分けて投与することが
できる。また、非経口投与では、１回約 0.01 mg 乃至
100 mg を皮下注射、筋肉注射、又は静脈注射によって
投与することができる。

【００５６】本発明の血球減少症改善剤組成物は、他の
適当な造血因子、例えば、IL- 1 〜10、LIF 、ステム・
セル・ファクタ−（stem cell factor）、GM-CSF、G-CS
F 、M-CSF 、Meg-CSF 、TNF 、IFN 、エリスロポエチン
（erythropoietin）と併用して用いられ得る。この場
合、他の造血因子は本発明の血球減少症改善剤組成物中
の１成分として加えて用いることができるが、別々の組
成物として同じ患者に投与することもできる。上記の併
用は、他の造血因子単独での処置の活性又は効果を増進
しうる。

【００５７】また、本発明の抗肥満剤組成物は、他の適
当な抗肥満薬、例えば、食欲抑制剤、腸管吸収抑制剤、
消化酵素阻害剤、代謝昂進ホルモン剤、脂肪合成阻害
剤、インスリン分泌抑制剤と併用して用いることがで
き、さらに食事療法、運動療法とも併用して用いられ得
る。この場合他の抗肥満薬単独での処置の活性又は効
果、ならびに他の抗肥満療法単独での処置の効果を増進
し得る。

【００５８】本発明で使用される血球減少症改善剤又は
抗肥満剤は、いずれも生体由来のものまたは、遺伝子組
換え体であるので、それらの毒性は低い。DDY 系雄性成
熟マウス（体重約20g)に経口投与して、5 日間観察した
結果、本発明の蛋白のいずれもが500mg/kg以下では毒性
を示さなかった。

【００５９】

【実施例】以下実施例及び製剤例を挙げて本発明を詳細
に説明するが、これらは本発明の範囲を制限するもので
はない。なお、その前に脂肪細胞化抑制活性の測定法に
ついて参考例で説明する。

【００６０】（参考例）本発明において用いられた脂肪
細胞化抑制因子の活性測定方法は次の通りである。測定
に用いた細胞はマウス胚性繊維芽細胞株3T3-L1(Green,
H. and Kehinde,O.(1974)Cell 1,113-116) であり、Ame
rican Cell Type Culture Collection (ATCC)から購入
した。細胞の培養はすべて10%CO₂-90%大気の加湿混合気
中、37℃で行なった。細胞の継代培養は培地A(10% 非働
化FBS （ハイクロン社製）および10mMヘペス(pH7.2,HEP
ES, シグマ社製）を含有するDMEM(4.5g/l のグルコース
を含有、ギブコ社製））を用いて行なった。3T3-L1細胞
の脂肪細胞への分化誘導は、Rubin らの方法(Rubin,C.
S. et al.(1978)J.Biol.Chem.253,7570-7578)を参考に
して行なった。

【００６１】3T3-L1細胞の脂肪細胞への形態変化の抑制
作用の測定法 3T3-L1細胞を培地A に1.0 ×10⁴cells/ml の密度で懸濁
し、これを48ウエル・マルチクラスター・ディッシュ
（コースター社製）に1 ウエルあたり0.5ml ずつ分注
し、培養を行なった。培養3 日後には、細胞はコンフル
エントに達する。その後、培地を新鮮な培地A に交換
し、さらに2 日間培養を行なった後、培地を脂肪細胞化
誘導用培地である培地B(10mM HEPES(pH7.2) 、3%非働化
FBS 、5 μg/mlウシ・インスリン（シグマ社製）、8 μ
g/ml d- ビオチン（シグマ社製）、4 μg/mlパントテン
酸（シグマ社製）、1.0 μM デキサメタゾン（シグマ社
製）および0.5 mMイソブチルメチルキサンチン（アルド
リッチ社製）を含有するDMEM(4.5g/l のグルコースを含
有））に交換した。この時、同時にサンプルを添加し
た。その後、2 日ごとに新鮮な培地B に交換し、サンプ
ルも添加しなおした。培地Bとサンプルを添加し始めて
から4 〜7 日目に培地を脂肪細胞維持培地である培地C
(5%非働化FBS,10mM HEPES(pH7.2) および100ng/mlウシ
・インスリンを含有するDMEM(4.5g/l のグルコースを含
有））に交換した。

【００６２】培地C 中で 2日間培養後、細胞を5%ホルム
アルデヒドで固定し、オイルレッドO とヘマトキシリン
を用いて細胞内に蓄積された脂肪粒と細胞核をそれぞれ
染色した。顕微鏡写真を撮影後、写真より赤色に染色さ
れた脂肪粒を蓄積している細胞の数と、ヘマトキシリン
で染色された有核細胞の数を数え、下記の計算式から脂
肪細胞化率を算出した。

【００６３】脂肪細胞化率(%)= 100 ×脂肪粒蓄積細胞
数／有核細胞数なお、細胞の固定法、オイルレッドO 染色およびヘマト
キシリン染色は実験書（三友善夫、高山昇二郎‘臨床検
査講座’12巻「病理学」(1982)、医歯薬出版）に従って
行なった。

【００６４】LPL 抑制作用の測定法 Beutler らの方法(Beutler,B.A.et al.(1985) J.Immuno
l.135,3972-3977)を参考にして以下のように行なった。
「3T3-L1細胞の脂肪細胞への形態変化の抑制作用の測定
法」の項に示した方法を用いて脂肪細胞化した3T3-L1細
胞を調製した。但し、脂肪細胞への分化誘導中にはサン
プルは加えない。次に培地を新鮮な培地C に交換し、サ
ンプルを添加した。18時間培養後、培地を除き、細胞を
PBS(-)(phosphate buffered saline、日水製薬( 株)
製）で2 回洗浄した。次に培地D(5% 非働化FBS,10mM HE
PES (pH7.2),100 ng/mlウシ・インスリンおよび10 U/ml
ヘパリンナトリウム（ノボインダストリー社製）を含有
するDMEM(4.5 g/lのグルコースを含有））を各ウエル30
0 μl ずつ加えて1 時間培養したのち、この培養上清を
100 μl 取り、LPL 活性の測定に用いた。LPL 抑制作用
の測定は、1 サンプルにつきトリプリケートで行ない、
平均値を求めた。

【００６５】LPL 活性の測定法は、Nilsson-EhleとScho
tzの方法(Nilsson-Ehle,P.andSchotz,M.C.(1976)J. Lip
id Res.17,536-541) に従った。上記のようにして調製
した100 μl の培養上清を等量の基質溶液(13 μM グリ
セロール・トリ[9,10(n)-³H]オレイン酸(51.8 KBeq/ μ
mol 、アマシャム社製）、1.3 mg/ml L-α- ホスファチ
ジルコリン・ジステアロイル（シグマ社製）、20 mg/ml
ウシ血清アルブミン（シグマ社製）、135mM トリスハイ
ドロクロライド(Tris-HCl、pH8.1 、シグマ社製）、16.5
% (v/v) グリセロール、16.5% (v/v) 非働化FBS)と混合
し、37℃で120 分間反応させた。1.05mlの0.1M炭酸カリ
ウム−ほう酸緩衝液(pH10.5)と3.25mlのメタノール：ク
ロロホルム：ヘプタン=141:125:100(v/v) を加えて反応
を停止させ、強く撹拌した後、3,000 x g で15分間遠心
した。水−メタノール層の³Hカウントを液体シンチレー
ションカウンターにて測定した。 LPL 活性の1 単位
は、1 μmol の脂肪酸を1 分間に生成する活性として定
義した。なお、基質溶液中の13μM グルセロール・トリ
[9,10(n)-³H]オレイン酸は、アマシャム社製のグリセロ
ール・トリ[9,10(n)-³H]オレイン酸(37.0 GBeq/mol) を
トリオレイン（シグマ社製）で希釈した後、シリカゲル
カラムクロマトグラフィーにより精製することにより調
製した。

【００６６】実施例1.KM-102細胞からのポリ(A)⁺RNA の
抽出 KM-102細胞を直径15cmのプラスチック製培養ディッシュ
36枚で10%FBSを含有するイスコフの修正最小必須培地
（ベーリンガー・マンハイム社製）にて培養し、コンフ
ルエントに達するまで増殖させた後、ホルボール・ミリ
ステート・アセテート(PMA) とカルシウム・イオノフォ
アA23187をそれぞれ10 ng/mlと0.2 μMになるように添
加し、培養を続け、3、 6、 14時間培養後に12枚ずつの細
胞をグアニジンチオシアネート溶液(4 Mのグアニジンチ
オシアネート、1%サルコシル、20 mM のエチレンジアミ
ン四酢酸(EDTA)、25 mM のクエン酸ナトリウム(pH7.0)、
100 mMの2-メルカプトエタノール、0.1%のアンチフォー
ムA)で溶解し、溶液を回収した。

【００６７】ポリ(A)⁺RNA の単離は本質的に“Molecula
r Cloning-A Laboratory Manual ”(Maniatis,T.et al.
(1982)pp.196-198) に記載されているようにして実施し
た。具体的には以下の手順で行なった。

【００６８】回収した細胞溶解液は、各々21G の注射針
を装てんした10ml容の注射筒を用いて数回吸入排出を繰
返した。日立工機（株）製RPS-40T ローター・バケット
に合うポリアロマー製の遠心チューブに3ml の5.7M CsC
l-0.1M EDTA(pH7.5)を先に加えておき、その上に上記細
胞溶解液を重層してチューブを満たした。これを30,000
r.p.m.20 ℃で18時間遠心した後、得られたペレットを
400 μl の蒸留水に溶かし、エタノール沈殿を行なっ
た。得られたペレットを再び400 μl の蒸留水に溶解し
た後、等量のクロロホルム−1-ブタノール(4:1) を加え
撹拌し、遠心分離により水層を回収した。これを再度エ
タール沈殿した後、600 μlの蒸留水に溶解し、全RNA
を得た。PMA-A23187刺激3 時間、6 時間、14時間の各サ
ンプルより各々約4.5mgの全RNA が得られた。

【００６９】このようにして得られた3 種類の全RNA を
600μg ずつ混合し、オリゴ(dT)セルロースカラム・ク
ロマトグラフィーを行なうことにより、ポリ(A)⁺RNA を
精製した。すなわち全RNA を吸着緩衝液(0.5 M NaCl,20
mM Tris-HCl(pH7.5) 、1 mMEDTA,0.1%ドデシル硫酸ナ
トリウム(SDS))に溶解し、65℃で5 分間加熱した後、同
溶液にて充てんされたオリゴ(dT)セルロースカラム（フ
ァルマシア社製、Type7)に供与し、溶出溶液(10mM Tris
-HCl(pH7.5),1mM EDTA,0.05%SDS)でポリ(A)⁺RNA を溶出
し、回収した。このような操作により100 μg のポリ
(A)⁺RNA を得た。実施例2.cDNAライブラリーの作製 cDNAライブラリーの作製はOkayama-Berg法に従って行な
った。すなわち、5 μg のポリ(A)⁺RNA 及び24ユニット
の逆転写酵素を20μl の反応液(50mM Tris-HCl(pH8.3),
8mM MgCl₂,30mM KCl, 0.3mM ジチオスレイトール(DTT),
2mM dATP,2mMdGTP,2mM dCTP,2mM dTTP,10 μCi[ α-
³²P]dCTP,1.4 μg ベクタープライマーDNA(3'-oligo(d
T)- tailed pcDV-1 、ファルマシア社製）中で42℃、60
分間反応させた。

【００７０】2 μl の0.25M EDTAと1 μl の10% SDS を
加えて反応を止めた後、20μl のフェノール−クロロホ
ルム(1:1) で除蛋白を行なった。遠心後回収した水層に
20μl の4M酢酸アンモニウムと80μl のエタノールを加
え、-70 ℃、15分間冷却した。ついで、遠心分離により
沈殿を集め、75% エタノールで沈殿を洗った後、減圧乾
燥した。

【００７１】次に乾燥された沈殿を15μl のターミナル
トランスフェラーゼ反応後(140mMカコジル酸カリウム、
30mMのTris-HCl(pH6.8),1mM CoCl₂,0.5mM DTT,0.2 μg
polyA,100mM dCTP) に溶かした。この反応液を37℃で3
分間保温した後、18ユニットのターミナルデオキシヌク
レオチジルトランスフェラーゼを加え、5 分間反応させ
た。次に、1 μl の0.25M EDTA及び0.5 μl の10% SDS
を加え、反応を止めた後、フェノール−クロロホルムで
除蛋白を行なった。反応液を遠心後、水層を回収し、15
μl の4M酢酸アンモニウム、60μl のエタノールを加え
よく混合した。-70 ℃で15分間冷却した後、遠心して沈
殿を集めた。

【００７２】この沈殿を10μl の制限酵素用緩衝液(50m
M NaCl,10mM Tris-HCl(pH7.5),10mM MgCl₂,1mM DTT) に
溶かし、2.5 ユニットの制限酵素Hind3 を加え、37℃で
約1 時間消化した。次に、フェノール−クロロホルムで
除蛋白後、エタノール沈殿を行なった。-70 ℃で15分間
冷却した後、遠心によって沈殿を集め、10μl のTE緩衝
液(10mM Tris- HCl(pH7.5), 1mM EDTA)に溶かした。こ
の溶液の1 μl を、オリゴ(dG)付きリンカーDNA(3'-oli
go(dG)tailed pL-1 Hind3linker、ファルマシア社製）1
0ngを加えた反応液(10mM Tris- HCl(pH7.5),1mM EDTA,1
00mM NaCl)に加え、65℃で5 分間加熱し、ついで42℃で
30分間保温した。氷水中で反応液を冷却した後、10μl
の10倍リガーゼ緩衝液(10mM ATP,660mM Tris- HCl(pH7.
5),66 mM MgCl₂,100mM DTT)、78μl の蒸留水、8 ユニ
ットのT4 DNAリガーゼを加え、12℃で一晩保温した。

【００７３】次に、10μl の1M KCl、1 ユニットのリボ
ヌクレアーゼH 、33ユニットのDNAポリメラーゼＩ、4
ユニットのT4 DNAリガーゼ、0.5 μl のヌクレオチド溶
液(20mM dATP,20mM dGTP,20mM dCTP, 20mM dTTP)、0.1
μl の50μg/μl の濃度の牛血清アルブミン(BSA) を加
え、12℃で1 時間、ついで25℃で1 時間保温した。この
反応液を蒸留水で5 倍に希釈した後、ただちにHanahan
の方法(Hanahan, D.(1983)J.Mol.Biol.166,557-580) に
よって、大腸菌DH5 α株を形質転換し、KM-102 細胞cDN
Aライブラリーを作製した。

【００７４】実施例3.オリゴヌクレオチド・プローブの
作製サイトカイン類のmRNAの3'非翻訳領域に保存されている
AUUUA 配列に基づき、ATT-3 と名付けた15塩基のオリゴ
ヌクレオチド5'-TAAATAAATAAATAA-3' を化学合成した。
合成はアプライドバイオシステムズ社製の自動DNA 合成
機380Bを用いて、そのマニュアルに従って行なった。こ
の方法はCaruthersらの記載した原理(Matteucci,M.D.an
d Caruthers,M.H.(1981)J.Am.Chem.Soc.103,3185- 319
1)に基づいており、ホスホアミダイト法と称されてい
る。15個のヌクレオチドを合成した後、それを支持体か
ら開裂させ脱保護を行ない、得られた溶液を凍結乾燥す
ることによりオリゴヌクレオチドを粉沫状にした。これ
を蒸留水に溶解し、使用するまで-20 ℃で凍結保存し
た。

【００７５】実施例4.cDNAライブラリーのスクリーニン
グ上述のKM-102細胞のcDNAライブラリーのうち、6,500株
の組換え菌のDNA をGrunstein,M.とHogness,D.S.の方法
(Grunstein,M.and Hogness, D.S. (1975)Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA 72,3961-3965) によってニトロセルロースフ
ィルター上に固定した。次にプローブ(ATT-3) を常法(
“Molecular Cloning-A Laboratory Manual ”を参照）
に従って³²P で 5' 末端標識した後、コロニーハイブリ
ダイゼーションを行なった。6 X SSC(1 X SSC の組成
は、150mM NaCl,15mM クエン酸三ナトリウム）、1 X De
nhardt溶液、0.25% SDS 、0.05% ピロリン酸ナトリウ
ム、100 μg/mlの変性サケ精子DNA を含む溶液中で37
℃、3 時間、プレハイブリダイゼーションを行なった
後、³²P で放射標識化したプローブ(ATT-3) を含む6 X
SSC,1 X Denhardt溶液、17μg/mlの酵母tRNA、0.05% ピ
ロリン酸ナトリウムの反応液中で31℃、一夜ハイブリダ
イゼーションを行なった。反応終了後、ニトロセルロー
スフィルターを室温下で、0.05% ピロリン酸ナトリウム
を含む6X SSC 溶液で2 時間洗浄した後、オートラジオ
グラフィーを行なった。その結果、33個の陽性クローン
が得られた。これらのクローンについて常法によりプラ
スミドDNA を抽出したのち、無作為に数クローンを選び
cDNAの部分的なヌクレオチド配列をジデオキシ法により
決定した。そして、それらの配列についてパーソナルコ
ンピューターを用いてEMBLまたはGenBank データベース
に登録されているヌクレオチド配列との相同性を検索し
た。その結果、ATT-3 プローブがハイブリダイズした領
域はAlu 反復配列（Schmid,C.W. and Jelinek, W.R.(19
82) Science 216, 1065-1070 ）の一部のメンバーに相
同性があることが明らかになった。

【００７６】そこで、ヒトのゲノムDNA より調製したAl
u 反復配列を含むDNA 断片を³²P で標識し、これをプロ
ーブに用いて上記33クローンのコロニーハイブリダイゼ
ーションを行なったところ、12クローンがAlu 反復配列
を有することが明らかになった。残りの21クローンにつ
いてcDNAインサートの長さを調べたところ50から3,600
塩基にわたっており、さまざまであった。上記21クロー
ンのcDNAの制限酵素マッピングを行なった後、部分的に
ヌクレオチド配列を決定した。それらのヌクレオチド配
列についてデータベースとの相同性検索を行ない、デー
タベースに登録されていない新規な配列を有するクロー
ンを選択した。

【００７７】これらのプラスミドにはSV40の初期プロモ
ーターおよび複製開始点が含まれており、cDNAをCOS-1
細胞で発現させるのに適している。そこで上記のように
して選択されたクローンについて、プラスミドDNA をCO
S-1 細胞に導入した。COS-1細胞のトランスフェクショ
ンは（株）島津製作所製の遺伝子導入装置GTE-1 を用い
て、電気穿孔法により行なった。すなわちまずCOS-1 細
胞をセミコンフルエントになるまで増殖させたフラスコ
よりトリプシン-EDTA 処理により細胞を回収し、PBS(-)
緩衝液（日水製薬（株）製）で2 回洗浄した。次にその
細胞をPBS (-)緩衝液で6 ×10⁷ 細胞/ml に懸濁した。
一方、塩化セシウム法で調製した各プラスミドDNA をPB
S(-)緩衝液で200 μg/mlに調製した。上記細胞懸濁液と
DNA 溶液を20μl ずつ混合し、これを電極間隔2mm のチ
ャンバーに入れ、600V- 30μsecのパルスを1 秒間隔で2
回与えた。そのチャンバーを4 ℃で約5 分間冷却した
後、中の細胞-DNA混液を10%FBSを含むDMEM 10 mlに加
え、シャーレに移して37℃で一夜5%CO₂ 下に培養した。
その後、培養上清を除き、無血清培地(DMEM)で細胞を洗
浄し、DMEM10mlを加えて3 日間培養した。このようにし
て得られた細胞培養物より培養上清を回収し、この上清
について前述した脂肪細胞への形態変化の抑制活性を測
定した。

【００７８】その結果、クローン^#20-2 のプラスミド(p
cD- 20-2) でトランスフェクトしたCOS-1 細胞の培養上
清にのみ脂肪細胞への形態変化の抑制活性が検出され
た。脂肪細胞への形態変化の抑制活性のデータの一例を
表-1に示す。

【００７９】

【表１】 pUC-CAT は、クロラムフェニコール・アセチルトランス
フェラーゼ遺伝子をpUC ベクターに組込んだプラスミド
であり、動物細胞で機能し得るプロモーターを有しない
ネガティブ・コントロール用のプラスミドである。トラ
ンスフェクションはpcD-20-2と同様の操作により行なっ
た。表-1に示されるように、pcD-20-2でトランスフェク
トしたCOS-1 細胞の培養上清には3T3-L1細胞の脂肪細胞
への変化を阻害する活性が検出された。また、脂肪細胞
へと分化誘導させた3T3-L1細胞に対しては、そのLPL を
強く抑制した（表-2参照）。表中の数値は、無血清DMEM
のみを加えたとき（ブランク）のLPL 活性を100%とした
時の相対値(%) を表わす。

【００８０】

【表２】そこで、pcD-20-2に挿入されているcDNAの制限酵素地図
を作製した（図１参照）。次に、cDNAの全ヌクレオチド
配列をジデオキシ法により決定したところ、配列表の配
列番号1 に示すヌクレオチド配列が得られた。pcD-20-2
に挿入されているcDNAは、1065塩基とポリ(A) テイル(A
が41残基）から成り、メチオニンで始まる199 個のアミ
ノ酸から成るオープン・リーディング・フレーム(ORF)
を含むことが明らかになった。得られたヌクレオチド配
列についてEMBLおよびGenBank 遺伝子データベースを検
索したが、既知の配列とは相同性は認められなかった。
また、ORF にコードされるアミノ酸配列についてNBRFお
よびSWISS プロテインデータベースを検索したが、既知
の配列との相同性は認められず、pcD-20-2に挿入されて
いるcDNAに含まれるORF は新規なポリペプチドをコード
することが明らかになった。このORF にコードされるア
ミノ酸配列を配列表の配列番号2 に示す。

【００８１】メチオニンで始まるN 末端領域には、種々
の分泌蛋白にみられる疎水性の強いアミノ酸が並ぶ領域
（シグナルペプチド）が存在しており、この蛋白が分泌
蛋白であることが示唆された。

【００８２】実施例5.ペプチド合成と抗ペプチド抗血清
の調製 pcD-20-2に挿入されているcDNAのORF によりコードされ
る新規ポリペプチドが分泌蛋白であることを確認する目
的および後述する脂肪細胞化抑制因子の精製過程での本
因子の検出を行なう目的で、N 末端のメチオニンから数
えて27〜41番目のアミノ酸配列に対応するペプチド(NH₂
-Gly-Pro- Pro-Arg-Val-Ser-Pro-Asp-Pro-Arg-Ala-Glu-
Leu-Asp-Ser-COOH) を合成し、これを抗原に用いてウサ
ギを免疫して抗血清を調製した。ペプチドの合成は、tB
OC-amino acid 固相法(Merrifield,R.B.(1963)J.Am.Che
m.Soc.85,2149-2154) に従い、アプライドバイオシステ
ムズ社製のペプチド・シンセサイザー430Aを用いて自動
合成用標準プログラムにより行なった。脱保護、脱resi
n 後、ペプチドを陰イオン交換カラムで精製した。主ピ
ークパターンの確認は逆相カラムを用いたHPLCにより行
なった。次に、これを凍結乾燥により濃縮し、逆相カラ
ムを用いたHPLCでピークを分取した。これを再び凍結乾
燥により濃縮し、HPLC分析とアミノ酸組成分析を行なっ
た。アミノ酸組成は、ウォーターズ社製のアミノ酸自動
分析装置Pico Tag System を用いて分析した。

【００８３】得られたペプチドにキャリアー蛋白として
キーホール・リンペット・ヘモシアニン(KLH) をグルタ
ルアルデヒド(GAD) 法(Konopka,J.B.et al. (1984)J.Vi
rol.51,223-232) により連結させ、ウサギの免疫のため
の抗原とした。抗原と完全フロイント・アジュバント(F
CA) を十分に懸濁し、ウサギの背部皮内に投与して免疫
した。約2 週間おきに3 回免疫し、全採血を行なった。
ウサギ血清中の抗体価の測定は、エンザイム・リンクト
・イムノソーベント・アッセイ(enzyme-linkedimmunoso
rbent assay,ELISA) 法により行なった。得られた抗血
清からファルマシア社製のProtein A-Sepharose 6MBカ
ラムによりIgG 画分を調製し、これを1次抗体として用
いることにした。

【００８４】実施例6.COS-1 細胞での脂肪細胞化抑制因
子の生産およびその精製 i)高発現ベクターの構築とCOS-1 細胞での発現 pcD-20-2をBamH1 で消化し、cDNAインサートを含む1240
bpの断片を単離、精製した。一方、高発現ベクターpcDL
-SR α296(Takebe,Y.et al. (1988)Mol.Cell.Biol.8,46
6-472) をBamH1 で消化し、SRαプロモーターを含む3.4
kb の断片を調製し、これに上記cDNAを含むBamH1 断片
をT4 DNAリガーゼを用いた反応により連結した。このDN
A で大腸菌DH5 αを形質転換し、得られた形質転換株に
ついてそれが保有するプラスミドの解析を行ない、cDNA
の転写方向がSRαプロモーターの方向と同一の株を選択
し、このプラスミドをpSR α-20-2 と命名した（図２参
照）。

【００８５】なお、SRαプロモーターは、SV40初期プロ
モーターとHTLV-1のロング・ターミナル・リピート(LT
R) のR-U5配列から成り、SV40初期プロモーターよりも1
0〜100倍強いプロモーター活性を示す。

【００８６】次に、得られたプラスミドpSR α-20-2 で
COS-1 細胞をトランスフェクトし、その培養上清中に脂
肪細胞化抑制因子が分泌されていることを実施例5 で得
た抗体を用いて確認した。COS-1 細胞のトランスフェク
ションは前述の電気穿孔法またはDEAE- デキストラン法
(Luthman,H.and Magnusson,G.(1983) Nucleic AcidsRe
s.11,1295-1308)に従って行なった。cDNAを含まないネ
ガティブ・コントロール・プラスミドpcDL-SR α296 お
よび脂肪細胞化抑制因子の発現プラスミドpSRα-20-2
でトランスフェクトして得たCOS-1 細胞の無血清培養上
清160 μl をそれぞれトリクロロ酢酸(TCA) 処理して蛋
白を沈殿させ、遠心分離により沈殿を得た。この沈殿を
氷冷したアセトンで洗浄し、風乾後、SDS-ポリアクリル
アミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)用の2-メルカプトエタノ
−ルを含むサンプル緩衝液に溶解し、12.5% ゲルを用い
て還元条件下でのSDS-PAGEを行なった。泳動後の蛋白バ
ンドの検出は、ナカライテスク社のシルベストステイン
を用いて銀染色法で行なった（図３の左側パネルを参
照）。pSR α-20-2 でトランスフェクトしたCOS-1 細胞
の培養上清において、矢印の位置（分子量：約23,000）
に特異的な単一のバンドが検出された。

【００８７】また、同様にして電気泳動したポリアクリ
ルアミドゲルから蛋白バンドをTowbinらの方法(Towbin,
H.et al.(1979)Proc.Natl.Acad.Sci.USA76,4350-4354)
に従って、ゲルメンブラン転写装置（マリソル社製、KS
-8441)を用いてニトロセルロース膜にブロッティングし
たのち、実施例5 で調製した1 次抗体を用いてウエスタ
ンブロット解析を行なった。ウエスタンブロッティング
の反応操作はBio-Rad社のImmun-Blot(GAR-HRP)Assay Ki
tを用いて、メーカーの指示書に準じた方法で行なった
（図３の右側パネルを参照）。銀染色で検出された特異
的バンド（分子量約23,000）のみが抗ペプチド抗体と反
応し、pcD-20-2に挿入されているcDNAのORF によりコー
ドされる蛋白が分泌蛋白であることが確かめられた。つ
づいてpSR α-20-2 でトランスフェクトしたCOS-1 細胞
の培養上清を用いて脂肪細胞への形態変化の抑制活性を
検討した。この活性データの一例を表-3に示す。

【００８８】

【表３】 cDNAインサートを有しないネガティブ・コントロールの
プラスミドpcDL-SR α296 でトランスフェクトしたCOS-
1 細胞培養上清には脂肪細胞への形態変化の抑制活性は
認められないが、pSR α-20-2 の場合に著明な活性が検
出された。また、脂肪細胞へと分化誘導させた3T3-L1細
胞に対しては、そのLPL 活性を強く抑制した。（表-4参
照）。表-3および表-4に示される抑制活性は、pcD-20-2
を用いた場合の抑制活性（表-1および表-2) より著しく
強くなっていた。

【００８９】

【表４】 ii) 精製およびN 末端アミノ酸配列分析上記のようにしてpSR α-20-2 でCOS-1 細胞をトランス
フェクトし、得られた無血清培養上清7 L を20倍量の透
析緩衝液(10mM ホウ酸-NaOH (pH9.0),13mM KCl) に対し
て、4 ℃で15時間透析を行なった後、ファルマシア社製
のFPLCを用いた弱陽イオン交換クロマトグラフィーを以
下の条件により実施した。

【００９０】カラム：CMトヨパールパック650M (2.2×20cm、東ソー（株）製）溶離緩衝液：A 液=10mM ホウ酸-NaOH(pH9.0),13mM KCl B 液=300mM NaCl を含む A液流速：3ml/分フラクション容積：3ml/チューブ濃度勾配：100% A液より100% B液への直線濃度勾配（50
分間）得られたフラクションの各々について、実施例5 におい
て作製した抗ペプチド抗体を用いたウエスタンブロッテ
ィングを行ない、脂肪細胞化抑制因子を含有するフラク
ション(No.35〜45) を同定した。脂肪細胞化抑制因子を
最も多く含む260mM NaClで溶出されてくるピークフラク
ション(No.41) の全量をTCA 沈殿処理により濃縮し、還
元条件下で12.5% ゲルを用いたSDS-PAGEに供した。電気
泳動後、ポリアクリルアミドゲルから蛋白バンドを転写
緩衝液(0.02% SDS,20%メタノール、25mMトリス−ホウ酸
(pH9.5))中で、ゲルメンブラン転写装置（マリソル社
製、KS-8441)を用いて、4 ℃、15時間、0.8mA/cm² の条
件下でポリビニリデン・ジフルオライド(PVDF)膜（ミリ
ポア社製、Immobilon)に転写した。転写後の膜を25mM N
aCl を含む10mMホウ酸ナトリウム緩衝液(pH8.0) に5 分
間、つづいて純水にて5 分間振盪して洗浄を行ない、そ
の後、風乾した。次に、この膜から脂肪細胞化抑制因子
が転写された部分を切り抜き、気相プロテインシークエ
ンサー（アプライドバイオシステムズ社製、475A型）に
て、N 末端より10アミノ酸残基までの配列を決定した。

【００９１】各反応サイクルで得られるフェニルチオヒ
ダントイン(PHT)-アミノ酸は逆相HPLC（アプライドバイ
オシステムズ社製、120A型）にて分離同定した。上記に
より決定されたアミノ酸配列は、次の通りであった。

【００９２】Pro-Gly-Pro-Pro-Pro-Gly-Pro-Pro-Arg-Va
l- この結果より、ヒト脂肪細胞化抑制因子は199 個のアミ
ノ酸から成る前駆体が生合成された後、N 末端の21個の
アミノ酸から成るシグナルペプチドが切落とされて、Pr
o 残基から始まる成熟体が細胞外に分泌されてくること
が示された。

【００９３】実施例7.純化脂肪細胞化抑制因子の生物活
性 pSR α-20-2 でCOS-1 細胞をトランスフェクトして得ら
れた無血清培養上清より、公知の方法に従って弱陽イオ
ン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィーお
よびゲル濾過カラムクロマトグラフィー等を組合わせて
脂肪細胞化抑制因子を精製したところ、SDS-PAGE解析で
単一のバンドとして検出された。この純化脂肪細胞化抑
制因子を用いて、脂肪細胞への形態変化の抑制作用およ
びLPL 抑制作用を調べた結果、著明な活性が検出され
た。

【００９４】したがって、本発明における脂肪細胞化抑
制因子は単一の蛋白であり、それが脂肪細胞化抑制因子
活性を有することが結論付けられた。

【００９５】実施例8.CHO 細胞での脂肪細胞化抑制因子
の分泌生産 pSR α-20-2 とpRSVneo を5 対1 のDNA 比で用いて、対
数増殖期にあるCHO 細胞をリン酸カルシウム-DNA共沈殿
法によりコ・トランスフェクトした。形質転換株の選択
は、400 μg/mlのG418（ギブコーオリエンタル社製）と
10%FBSを含有するHamF12培地（日水製薬（株）製）で9
日間培養することにより行なった。得られた耐性コロニ
ーのうち15株を選択した後、クローニングリングを用い
て24ウエル・プレートに移して培養を続けた。コンフル
エントに達した細胞を角型フラスコに移して継代した
後、これら15株の脂肪細胞化抑制因子の産生能を前述の
ウエスタン・ブロッティング法にて調べた。その結果よ
り、脂肪細胞化抑制因子の産生量の最も多い株を1 株選
び、96ウエル・プレートを用いた限界希釈法にて培養を
行ない、単一細胞より増殖したクローンを4 株選択し
た。これら4 株の細胞を培養ディッシュに移し、コンフ
ルエントになるまで培養を行なった後、培養上清につい
てウエスタンブロッティング法で脂肪細胞化抑制因子の
量を調べた。脂肪細胞化抑制因子の分泌生産量は、4 株
間で大きな差はなく安定していた。また、このとき得ら
れた培養上清を用いて3T3-L1細胞のLPL 活性に及ぼす影
響を調べた結果、4 株ともその培養上清にはLPL を抑制
する活性が検出された。次に、上記4 株中の1 株につい
て、無血清培地(CHO-1コンプリート・メディア・システ
ム、Ventrex 社製）での培養を行なった。無血清培地で
2 日間培養した後、トリプシン-EDTA 処理による継代を
行ない、さらに3 日間培養を続けた。その後、培養上清
を回収してウエスタンブロッティング法で調べたとこ
ろ、脂肪細胞化抑制因子が安定して生産されていること
が確認された。

【００９６】実施例9.マウス骨髄前脂肪細胞株Ｈ−１／
Ａの脂肪細胞への形態変化の抑制作用マウス骨髄前脂肪細胞株Ｈ−１／Ａ(Nakamura, M. et a
l. (1985) Proc. Soc.Exp. Biol. Med. 179, 283-287)
を培地E （非働化FBS （ハイクロン社製）を10% 含有す
るフィシャ−培地（ギブコ社製））に 2.0x 10⁴ cells
/ml の密度で懸濁した。これを、セルタイトC-1 プレ
−ト48F （住友ベ−クライト（株）製）に１ウェル当た
り0.5 ml ずつ分注し、5% CO₂ - 95%大気の加湿混合気
中 33 ℃で培養を行なった。3 日後に培地を、脂肪細胞
化を誘導するための培地F （1 μM ハイドロコルチゾン
（シグマ社製）を含有する培地E ）に交換し、同時にプ
ラスミド pSR α-20-2 でトランスフェクトした COS-1
細胞培養上清、プラスミドpcDL-SR α296 でトランスフ
ェクトしたCOS-1 細胞培養上清、もしくは血清を含有し
ないDMEM培地を添加した。以後、4 日ごとに新鮮な培地
F に交換し、COS-1 細胞培養上清およびDMEM培地を添加
しなおした。培地F を添加してから26日目に細胞を5%
ホルムアルデヒドで固定後、細胞内に蓄積された脂肪粒
と細胞核をそれぞれオイルレッド０とヘマトキシリンを
用いて染色し、3T3-L1細胞の脂肪細胞への形態変化の抑
制作用の測定法と同様の方法を用いて脂肪細胞化率を算
出した。表-5に示されるように、 pSR α-20-2 でトラ
ンスフェクトしたCOS-1 細胞培養上清には、H-1/A 細胞
の脂肪細胞への形態変化を強く抑制する作用が検出され
た。また、 pSR α-20-2 でトランスフェクトしたCOS-
1 細胞培養上清から精製した純化脂肪細胞化抑制因子も
H-1/A 細胞の脂肪細胞への形態変化を著明に抑制した。

【００９７】

【表５】実施例10. 骨髄由来前脂肪細胞株 H-1/A に対する CSF
誘導作用 H-1/A 細胞を培地E に 1.0 x 10⁴cells/ml の密度で懸
濁し、6 ウェル・クラスタ−ディッシュ（コ−スタ−社
製）に 3 ml ずつ分注した。これを 5% CO₂-95% 大気の
加湿混合気中 33 ℃で培養した。培養 6日後、培地を新
鮮な培地E に交換した。このときプラスミド pSRα-20-
2 でトランスフェクトした COS-1 細胞培養上清、プラ
スミド pcDL-SRα296 でトランスフェクトした COS-1
細胞培養上清、若しくは、血清を含有しない DEME 培地
を添加し、5 時間培養した。次に、この細胞を血清を含
まないフィッシャ−培地で 3回洗浄後、新鮮な培地E を
各ウェル 3 ml ずつ添加して、14 時間培養を行ない、
各々の培養上清を採取した。得られた培養上清は、ポア
サイズ 0.22 μm のマイレクスGVフィルタ−（日本ミリ
ポア工業（株）製）を用いて濾過したのち、コロニ−刺
激活性試験に供した。コロニ−刺激活性試験は、Kubota
らの方法（Kubota, K. et al. (1981), Cancer Res. 4
1, 3052-3057 ）を参考にして行なった。雌性 C3HHe/N
マウス（日本チャ−ルス・リバ−（株）より購入）の大
腿骨髄細胞を 0.3% のバクトアガ−（ディフコ社
製）、20% の FBS 、10% の H-1/A 細胞培養上清を添
加した RPMI 1640培地（ギブコ社製）に、1.0 x 10⁵ ce
lls/ml の密度で懸濁し、これを 1 ml ずつ 35 mm x 1
0 mm のプラスチックディッシュ（ラックス社製）に分
注して 5% CO₂-95% 大気の加湿混合気中、37℃で 7日間
培養後、ディッシュに形成したコロニ−数を測定した。

【００９８】pSRα-20-2 でトランスフェクトした COS-
1 細胞培養上清を添加した培地E で処理した H-1/A
細胞の培養上清は、 pcDL-SRα296 でトランスフェクト
したCOS-1 細胞培養上清、若しくは、無血清 DMEM を添
加した培地 Eで処理した H-1/A 細胞の培養上清に比べ
て、有意に高いコロニ−活性を示した（p<0.01）。この
結果を表-6に示す。

【００９９】

【表６】 5.0 x 10⁶ 個の H-1/A 細胞を 50 ml の培地 E に懸
濁し、アクセルフラスコ（コ−スタ−社製）中で 5日間
培養した。次に、培養液を新鮮な培地 E に交換し、同
時に pSRα-20-2 でトランスフェクトした COS-1細胞培
養上清、pcDL- SRα296 でトランスフェクトした COS-1
細胞培養上清、若しくは、無血清DMEMを添加した。こ
れを18時間培養したのち、実施例1 と同様の方法で、細
胞から全ＲＮＡを回収した。各々 20 μg の全ＲＮＡを
用いて、M-CSF の mＲＮＡ量をノザ−ン・ハイブリダイ
ゼ−ション法（Thomas, P.S. (1980) Proc.Natl.Acad.S
ci.USA 77, 5201-5205 ）に従って解析した。プロ−ブ
としてポリメラ−ゼ連鎖反応によって調製したマウス M
-CSF cＤＮＡ（Ladner, M.B. et al. (1988)Proc.Natl.
Acad.Sci.USA, 85, 6706-6710 ）をマルチプライムＤＮ
Ａ標識システム（アマシャム社製）を用いて³²Ｐ標識し
て使用した。ハイブリダイズした³²Ｐ標識プロ−ブ量
は、イメ−ジアナライザ−（富士写真フィルム（株）
製）を用いて定量した。³²Ｐ標識プロ−ブは、約 2.5 k
b と約 4.5 kb の大きさのＲＮＡにハイブリダイズし
た。これらのサイズのＲＮＡにハイブリダイズしたプロ
−ブの総量を比較したところ、 pSRα-20-2 でトランス
フェクトした COS-1 細胞培養上清を 5% 添加した培地
E で処理した H-1/A 細胞では、pcDL- SRα296 でト
ランスフェクトした COS-1 細胞培養上清を 5% 添加し
た培地 E で処理した場合に比べて、単位全ＲＮＡ当た
りの M-CSF mＲＮＡが増加していた（表-7参照）。

【０１００】

【表７】実施例11. 脂肪細胞へ分化誘導を行なった H-1/A 細胞
に対する CSF 誘導作用 5.0 x 10⁶ 個のH-1/A 細胞を 50 mlの培地F に懸濁し、
アクセルフラスコ中で33℃、12日間培養した。この培養
期間中、4 日に1 度、培養液を新鮮な培地 Fに交換し
た。次に、培養液を培地 E に交換し、3 日間培養を続
けた。その結果、40% 以上の細胞に油滴の蓄積が観察さ
れ、脂肪細胞への分化が認められた。この培養液を、 p
SRα-20-2 でトランスフェクトした COS-1 細胞培養上
清、pcDL- SRα296 でトランスフェクトした COS-1 細
胞培養上清、若しくは無血清ＤＭＥＭを５％添加した培
地 E に交換し、18時間培養を行なった。培養後、培養
液を除き、細胞をPBS(-)で 2回洗浄し、終濃度 10 U/ml
のヘパリンナトリウムを添加した培地 E を25 ml 加
え、33℃で15分間培養した。この培養上清中の LPL 活
性を測定したところ、 pSRα-20-2 でトランスフェクト
した COS-1 細胞培養上清を添加した場合にのみ著明な
LPLの抑制が認められた（表-8参照）。

【０１０１】

【表８】続いて、上記のように調製した細胞から、実施例1 と同
様の方法で全ＲＮＡを回収した。このＲＮＡを用いて、
実施例10と同様の方法で M-CSF mＲＮＡ量を解析し
た。但し、全RNA は各々 10 μg ずつ用いた。pSR α-2
0-2 でトランスフェクトした COS-1 細胞培養上清を5%
添加した培地E で処理したH-1/A 細胞では、pcDL- SRα
296 でトランスフェクトした COS-1 細胞培養上清を5%
添加した培地 Eで処理した場合に比べて、単位全ＲＮＡ
あたりのM-CSF mＲＮＡ量が著明に増加していた（表-9
参照）。

【０１０２】

【表９】製剤例1.脂肪細胞化抑制因子−50% 含有腸溶性顆粒実施例8 で得られた後に精製された脂肪細胞化抑制因子
を70部（重量部、以下同じ）、乳糖10部、微結晶性セル
ロース20部を採取し、乳鉢で十分混合した後、適量の水
を加えて練合した。この練合物を孔径1.2mm のスクリー
ンを装置した円筒顆粒機で押し出し、造粒し、さらにマ
ルメライザーを通して顆粒を作製した。この顆粒を通気
乾燥機にかけて、40℃、2 時間乾燥し、得られた乾燥顆
粒を35メッシュの篩にかけて分級し、35メッシュより大
きい顆粒を用いて腸溶性顆粒を作製した。まず、常法に
従って5%ヒドロキシプロピルメチルセルローズのメチレ
ンクロライド、エタノール等量溶液を作製し、この溶液
100 部を、上記乾燥顆粒100 部に、コーティング・パン
中でスプレー・コーティングを施した。つづいて、常法
にしたがって作製した10% ヒドロキシプロピルメチルセ
ルローズフタレート（信越化学工業（株）製HP-55)、1.
5%ステアリン酸、50% アセトン、38.5% エタノールの溶
液300 部を、上記と同様にしてスプレー・コーティング
を行なった。このようにして得られたコーティング顆粒
を通気乾燥機にかけて40℃、1 時間乾燥して、脂肪細胞
化抑制因子の腸溶性製剤とした。これは、脂肪細胞化抑
制因子50% を含有する。

【０１０３】製剤例2 カプセル剤上記の脂肪細胞化抑制因子を50% 含有する腸溶性顆粒20
0mg を3 号カプセルに充填し、1 カプセル当り脂肪細胞
化抑制因子 100mgを含有する硬カプセル剤を作製した。

【０１０４】製剤例3 注射剤水もしくはそれ以外の製剤学的に許容しうる液に溶解し
た無菌性溶液または懸濁液のアンプルとして使用に供さ
れ、また無菌粉末製剤（脂肪細胞化抑制因子溶液を凍結
乾燥するのが好ましい）をアンプルに充填しておき、同
時に製剤学的に許容しうる液で希釈してもよい。

【０１０５】［発明の効果］

【０１０６】

【発明の効果】本発明の脂肪細胞化抑制因子は、再生不
良性貧血、毒物や放射線による白血球減少症、ウイルス
・細菌・寄生虫などによる感染症、骨髄移植後の血球減
少症、および難治性汎血球減少症などの疾患並びにそれ
に付随して生ずる各種免疫疾患の処置において、単独又
は他の治療薬との併用投与で用いられる。さらに、脂肪
細胞化抑制因子は、病的な肥満の予防又は治療におい
て、単独又は他の治療薬との併用投与で用いられる。

【０１０７】

【配列表】配列番号：１配列の長さ：1065 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジ−：直鎖状配列の種類： cDNA to mRNA ハイポセティカル：No アンチセンス：No 起源生物名：ホモサピエンス（Homo sapiens）セルライン：ＫＭ−１０２配列の特徴１８−６１４ＥＣＤＳ８１−６１４Ｅｍａｔ＿ｐｅｐｔｉｄｅ１８−８０Ｅｓｉｇ＿ｐｅｐｔｉｄｅ配列 CCTGGCCCTG TGGGGAC ATG AAC TGT GTT TGC CGC CTG GTC CTG GTC GTG 50 Met Asn Cys Val Cys Arg Leu Val Leu Val Val -21 -20 -15 CTG AGC CTG TGG CCA GAT ACA GCT GTC GCC CCT GGG CCA CCA CCT GGC 98 Leu Ser Leu Trp Pro Asp Thr Ala Val Ala Pro Gly Pro Pro Pro Gly -10 -5 1 5 CCC CCT CGA GTT TCC CCA GAC CCT CGG GCC GAG CTG GAC AGC ACC GTG 146 Pro Pro Arg Val Ser Pro Asp Pro Arg Ala Glu Leu Asp Ser Thr Val 10 15 20 CTC CTG ACC CGC TCT CTC CTG GCG GAC ACG CGG CAG CTG GCT GCA CAG 194 Leu Leu Thr Arg Ser Leu Leu Ala Asp Thr Arg Gln Leu Ala Ala Gln 25 30 35 CTG AGG GAC AAA TTC CCA GCT GAC GGG GAC CAC AAC CTG GAT TCC CTG 242 Leu Arg Asp Lys Phe Pro Ala Asp Gly Asp His Asn Leu Asp Ser Leu 40 45 50 CCC ACC CTG GCC ATG AGT GCG GGG GCA CTG GGA GCT CTA CAG CTC CCA 290 Pro Thr Leu Ala Met Ser Ala Gly Ala Leu Gly Ala Leu Gln Leu Pro 55 60 65 70 GGT GTG CTG ACA AGG CTG CGA GCG GAC CTA CTG TCC TAC CTG CGG CAC 338 Gly Val Leu Thr Arg Leu Arg Ala Asp Leu Leu Ser Tyr Leu Arg His 75 80 85 GTG CAG TGG CTG CGC CGG GCA GGT GGC TCT TCC CTG AAG ACC CTG GAG 386 Val Gln Trp Leu Arg Arg Ala Gly Gly Ser Ser Leu Lys Thr Leu Glu 90 95 100 CCC GAG CTG GGC ACC CTG CAG GCC CGA CTG GAC CGG CTG CTG CGC CGG 434 Pro Glu Leu Gly Thr Leu Gln Ala Arg Leu Asp Arg Leu Leu Arg Arg 105 110 115 CTG CAG CTC CTG ATG TCC CGC CTG GCC CTG CCC CAG CCA CCC CCG GAC 482 Leu Gln Leu Leu Met Ser Arg Leu Ala Leu Pro Gln Pro Pro Pro Asp 120 125 130 CCG CCG GCG CCC CCG CTG GCG CCC CCC TCC TCA GCC TGG GGG GGC ATC 530 Pro Pro Ala Pro Pro Leu Ala Pro Pro Ser Ser Ala Trp Gly Gly Ile 135 140 145 150 AGG GCC GCC CAC GCC ATC CTG GGG GGG CTG CAC CTG ACA CTT GAC TGG 578 Arg Ala Ala His Ala Ile Leu Gly Gly Leu His Leu Thr Leu Asp Trp 155 160 165 GCC GTG AGG GGA CTG CTG CTG CTG AAG ACT CGG CTG TGACCCGGGG 624 Ala Val Arg Gly Leu Leu Leu Leu Lys Thr Arg Leu 170 175 CCCAAAGCCA CCACCGTCCT TCCAAAGCCA GATCTTATTT ATTTATTTAT TTCAGTACTG 684 GGGGCGAAAC AGCCAGGTGA TCCCCCCGCC ATTATCTCCC CCTAGTTAGA GACAGTCCTT 744 CCGTGAGGCC TGGGGGACAT CTGTGCCTTA TTTATACTTA TTTATTTCAG GAGCAGGGGT 804 GGGAGGCAGG TGGACTCCTG GGTCCCCGAG GAGGAGGGGA CTGGGGTCCC GGATTCTTGG 864 GTCTCCAAGA AGTCTGTCCA CAGACTTCTG CCCTGGCTCT TCCCCATCTA GGCCTGGGCA 924 GGAACATATA TTATTTATTT AAGCAATTAC TTTTCATGTT GGGGTGGGGA CGGAGGGGAA 984 AGGGAAGCCT GGGTTTTTGT ACAAAAATGT GAGAAACCTT TGTGAGACAG AGAACAGGGA 1044 ATTAAATGTG TCATACATAT C 1065 配列番号：２配列の長さ：199 配列の型：アミノ酸トポロジ−：直鎖状配列の種類：タンパク質ハイポセティカル：Ｎｏ起源生物名：ホモサピエンス（Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ）セルライン：KM-102 配列の特徴 -21--1 E sig peptide 1-178 E mat peptide 配列 Met Asn Cys Val Cys Arg Leu Val Leu Val Val Leu Ser Leu Trp Pro -21 -20 -15 -10 Asp Thr Ala Val Ala Pro Gly Pro Pro Pro Gly Pro Pro Arg Val Ser -5 1 5 10 Pro Asp Pro Arg Ala Glu Leu Asp Ser Thr Val Leu Leu Thr Arg Ser 15 20 25 Leu Leu Ala Asp Thr Arg Gln Leu Ala Ala Gln Leu Arg Asp Lys Phe 30 35 40 Pro Ala Asp Gly Asp His Asn Leu Asp Ser Leu Pro Thr Leu Ala Met 45 50 55 Ser Ala Gly Ala Leu Gly Ala Leu Gln Leu Pro Gly Val Leu Thr Arg 60 65 70 75 Leu Arg Ala Asp Leu Leu Ser Tyr Leu Arg His Val Gln Trp Leu Arg 80 85 90 Arg Ala Gly Gly Ser Ser Leu Lys Thr Leu Glu Pro Glu Leu Gly Thr 95 100 105 Leu Gln Ala Arg Leu Asp Arg Leu Leu Arg Arg Leu Gln Leu Leu Met 110 115 120 Ser Arg Leu Ala Leu Pro Gln Pro Pro Pro Asp Pro Pro Ala Pro Pro 125 130 135 Leu Ala Pro Pro Ser Ser Ala Trp Gly Gly Ile Arg Ala Ala His Ala 140 145 150 155 Ile Leu Gly Gly Leu His Leu Thr Leu Asp Trp Ala Val Arg Gly Leu 160 165 170 Leu Leu Leu Lys Thr Arg Leu 175

【図面の簡単な説明】

【図１】脂肪細胞化抑制因子をコ−ドするcDNAの制限酵
素地図

【符合の説明】

ORF はオ−プン・リーディング・フレームを表わす。

【図２】本明細書実施例6 に従う脂肪細胞化抑制因子発
現プラスミド構築の概略図

【図３】pcDL-SR α 296 および pSR α-20-2 でトラ
ンスフェクトした COS-1細胞培養上清中の全蛋白質の還
元条件下でのSDS- PAGE 解析像及び抗ペプチド抗体を用
いたウェスタン・ブロット解析像

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｎ 15/19 ＺＮＡ 15/85 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 8214−4Ｂ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者滝口洋東京都品川区広町１丁目２番58号三共株式会社内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】遺伝子操作によって得られ、ヒト由来の他
の蛋白質を実質的に含有せず、以下の性質を有し、脂肪
細胞化抑制活性を有する蛋白質： 12.5% ゲルを用いた還元条件下でのSDS ポリアクリル
アミドゲル電気泳動において、見かけ上約 23,000 の分
子量を示し、配列表の配列番号2 に示されるアミノ酸配列のうち、
アミノ酸番号1〜10までのN 末端アミノ酸配列を有し、 (a) カラムとして CM トヨパ−ルパック 650M （2.2
x 20 cm 、東ソ−（株）製）を用い、 (b) 溶離緩衝液として、A 液（10 mM ホウ酸-NaOH(pH
9.0)、 13 mM KCl）及びB 液（300mM NaCl を含む A
液）を用い、 (c) 流速を、3 ml/ 分とし、 (d) 濃度勾配を、50分間にわたる、 100% A液より 100
% B 液への直線濃度勾配とする条件下での弱陽イオン交
換クロマトグラフィ−において、NaCl濃度が220 mMから
290 mMの範囲で溶出する。
【請求項２】遺伝子操作によって得られ、ヒト由来の他
の蛋白質を実質的に含有せず、配列表の配列番号2 に示
されるアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号1 〜178 まで
のアミノ酸配列から成る、脂肪細胞化抑制活性を有する
蛋白質、又は、該蛋白質の一つ若しくは二つ以上の部位
において、一つ若しくは二つ以上のアミノ酸残基が欠
失、挿入若しくは置換されている該蛋白質の同効物。
【請求項３】遺伝子操作によって得られ、ヒト由来の他
の蛋白質を実質的に含有せず、配列表の配列番号2 に示
されるアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号1 〜178 まで
のアミノ酸配列から成る、脂肪細胞化抑制活性を有する
蛋白質。
【請求項４】N末端に水素原子又はMet を有する、請求
項１、２、又は３記載の蛋白質。
【請求項５】請求項１、２、３又は４記載の蛋白質をコ
−ドするDNA 。
【請求項６】配列表の配列番号1 に示されるヌクレオチ
ド配列のうち、ヌクレオチド番号81から 614 までのヌ
クレオチド配列又はそれと同効のヌクレオチド配列から
成る、請求項１又は２記載の蛋白質をコ−ドするDNA 。
【請求項７】配列表の配列番号1 に示されるヌクレオチ
ド配列のうち、ヌクレオチド番号81から614 までのヌク
レオチド配列から成る、請求項１又は３記載の蛋白質を
コ−ドするDNA 。
【請求項８】請求項５、６、又は７記載のDNA の5'末端
にATG を有するDNA 。
【請求項９】請求項５、６、７又は８記載のDNA から成
り、該DNAが発現可能かつ複製可能である、組換えDNA
発現ベクタ−。
【請求項１０】請求項９記載の組換えDNA 発現ベクタ−
で形質転換せしめた宿主。
【請求項１１】請求項１、２、３又は４記載の蛋白質を
コードしているDNAから成り、該DNAが発現可能かつ複製
可能である、組換えDNA 発現ベクターで形質転換せしめ
た宿主を培養し、その細胞抽出液またはその培養液から
該蛋白質を回収することから成る該蛋白質の製造法。
【請求項１２】請求項１、２、３及び／又は４記載の蛋
白質を有効成分とする血球減少症改善剤。
【請求項１３】請求項１、２、３及び／又は４記載の蛋
白質を有効成分とする抗肥満剤。［発明の目的］