DE69133321T2 - Neuartige cytokine - Google Patents

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Description

  • [Technisches Gebiet]
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues einzelnes Protein, das in der Lage ist, die Differenzierung von Zellen zu Fettzellen und die Lipoproteinlipase (LPL) in den Fettzellen zu unterdrücken und/oder den koloniestimulierenden Faktor (CSF) zu induzieren. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenso eine DNA, die für dieses Proteine codiert, einen Expressionsvektor für rekombinante DNA, der diese DNA enthält, eine Wirtszelle, die mit dem Expressionsvektor für die rekombinante DNA transformiert ist, und eine Proteinzusammensetzung, die eine wirksame Menge dieses Proteins enthält.
  • [Hintergrund]
  • Es ist allgemein bekannt, dass, zusätzlich zu den hämatopoetischen Stammzellen und verschiedenen hämatopoetischen Faktoren, die Existenz von Stromazellen aus dem Knochenmark die Blutbildung unterstützen, oder anders ausgedrückt eine hämatopoetische Mikroumgebung für die Blutbildung in einem lebenden Körper erforderlich ist. Mit der Geburt findet beim Menschen überall im Körper rege Blutbildung im Knochenmark statt. Ist jedoch, sobald der Mensch heranwächst, die Blutbildung nicht mehr in dem Umfang notwendig, wird, beginnend bei dem Extremitäten der Gliedmaßen, das Knochenmark aufgrund der Vergrößerung des Markraums teilweise durch Fettzellen besetzt. Knochenmark, in dem Blutbildung stattfindet, wird als rotes Knochenmark bezeichnet, während Knochenmark, welches durch Fettzellen ersetzt wurde, als gelbes Knochenmark bezeichnet wird. Wird, ausgelöst durch Bluten oder Hämolyse, die Blutbildung angetrieben, so wird sie in dem gelben Kno chenmark wieder aufgenommen [Kashiwamura, M. (1988), "IGAKU NO AYUMI (History of Medicine)", 146, 264–268].
  • Zellen, die in der hämatopoetischen Mikroumgebung eine hämatopoetische Funktion haben, sind hauptsächlich Vorläufer-Fettzellen. Es ist bekannt, dass, wenn sich diese Zellen zu Fettzellen differenzieren, sie diese Funktion verlieren [Kodama, H. (1986), "SOSHIKI BAIYO (Tissue Culture)", 12, 191– 195].
  • Zum Beispiel ist die Vorläufer-Fettzellen-Zellinie PA6 aus dem Knochenmark der Maus imstande, die Proliferation der hämatopoetischen Stammzellen zu unterstützen. Differenzieren sich jedoch diese Zellen zu Fettzellen, verringert sich diese Aktivität [Kodama, H. et al. (1984), J. Cell. Physiol. 118, 233–240]. Es ist bekannt, dass Stammzellen, Megakaryozyten- und Makrophagenkolonien induziert werden können, wenn PA6-Zellen und Zellen aus dem Knochenmark der Maus zusammen kultiviert werden [Kodama, H. (1987), "JIKKEN IGAKU" (Experimental Medicine)", 5, 826–830]. Somit wirkt ein Protein, das die Blutbildung unterdrücken kann, auf die Vorläufer-Fettzellen und die Fettzellen des Knochenmarks, um ihre hämatopoetischen Fähigkeit oder anders ausgedrückt ihre Fähigkeit, Leukozyten, Makrophagen und Thrombozyten (aus Megakaryozyten) zu induzieren, zu fördern.
  • Außerdem wird berichtet, dass sich die in der Vorläufer-Fettzellen-Zellinie H-1/A aus Mausknochenmark gebildete CSF Menge verringert, wenn diese Zellen zu Fettzellen differenzieren [Nakamura, M. et al. (1985), Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 179, 283–287].
  • Wie nachfolgend beschrieben wird, wirkt die erfindungsgemäße inhibitorische Aktivität gegen Fettbildung auf die H-1/A-Zellen, wobei die Bildung des Makrophagenkolonien stimmulierenden Faktors (M-CSF) beschleunigt wird. Zusätzlich zur stimulierenden Aktivität gegen Monozyten und Makrophagen kann der M-CSF ebenso als Megakareozytenverstärker (Meg-POT) wirken [Teramura, M. et al. (1990), Int. J. Cell Cloning, 8, 245–252]. Es ist ebenso bekannt, dass der M-CSF auf Monozyten wirken kann, um deren Bildung des Meg-POT zu beschleunigen. Außerdem deuten Daten aus der klinischen Therapie darauf hin, dass der M-CSF die Genesung von Neutropenie und Thrombozytopenie nach der Krebschemotherapie unterstützen kann [Motoyoshi, K. (1986), "GAN TO KAGAKURYOHO (Cancer and Chemotherapy)", 16, 3531–3536].
  • Somit wirkt der erfindungsgemäße inhibitorische Faktor gegen Fettbildung auf das Knochenmark oder die peripheren Vorläufer-Fettzellen und Fettzellen, um ihre Fähigkeit, die Blutbildung zu unterstützen, zu verbessern.
  • Beispiele von Proteinen, die vor der vorliegenden Erfindung bekannt waren und die die Fettzell-Differenzierung und LPL in Fettzellen unterdrücken, umfassen den Tumor-Nekrose-Faktor-α (TNF-α) [Price, S. R. et al. (1986), Arch. Biochem.
  • Biophys., 251, 738–746 and Kawakami, M. et al. (1987), J. Biochem., 101, 331–338], Interleukin-1 (1L-1) [Beutler, B. A. and Cerami, A. (1985), J. Immunol., 135, 3969–3971], Interferone (IFN) [Keay, S. and Grossberg, S. E. (1980), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4099–4103, and Patton, J. S. et al. (1986), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 8313–8317] und den Leukämie-hemmenden Faktor (LIF) [Mori, M. et al. (1989), Biochem. Biophys. Res. Commun., 160, 1085–1092]. Die cDNAs dieser Faktoren wurden bereits geklont und ihre vollständigen Sequenzen bestimmt.
  • Außerdem wurde vor dem Prioritätstag der vorliegenden Erfindung ein Bericht veröffentlicht, der die Isolierung und die Expression der cDNA des Vorläufers des Affeninterleukins-11 zusammen mit der Entdeckung seiner Plasmozytom-Wachstums-stimulierenden Aktivität und Megakaryozyt-koloniebildenden Aktivität in der Kultur des menschlichen Interleukin-11 beschreibt.
  • US 07/441,110 (fallengelassen) und US 07/526,474 (veröffentlicht als US-A-52/5895) offenbaren beide Interleukin-11-Vorläufersequenzen, aber keine voll entwickelte IL-11-Sequenz.
  • Die Erfinder haben ein neues einzelnes Protein entdeckt, das hauptsächlich in der Lage ist die Differenzierung von Zellen zu Fettzellen und die Lipoproteinlipase (LPL) in Fettzellen zu unterdrücken und den koloniestimulierenden-Faktor (CSF) (CSF induzierender Faktor) zu induzieren, und haben es ermöglicht, große Mengen dieses Proteins unter Verwendung von Genmanipulationstechniken zu erhalten.
  • Die verschiedenen Aktivitäten umfassen: Unterdrückung der morphologischen Differenzierung von Vorläufer-Fettzellen zu Fettzellen, Unterdrückung der Lipoproteinlipase (LPL) in Fettzellen und Erhalten und Fördern der Fähigkeit der Vorläufer-Fettzellen CSF zu bilden, wobei sie alleine oder zusammen als "inhibitorische Aktivität gegen Fettbildung" bezeichnet werden können, und ein Protein, das eine derartige Aktivität aufweist, kann als "inhibitorischer Faktor gegen Fettbildung" bezeichnet werden.
  • Die vorliegende Erfindung erlaubt das Sammeln einer großen Anzahl an inhibitorischen Faktoren gegen Fettbildung. Der Faktor. als solches kann wirkungsvoll bei der Behandlung und Diagnose verschiedener Arten von Blutarmut und anderen Blutkrankheiten verwendet werden. Zum Beispiel kann der Faktor bei aplastischer Anämie, Leukopenie, die durch Toxine oder Bestrahlung verursacht wird, Infektionen, die durch Viren, Bakterien und Parasiten verursacht werden, Zytopenie, die nach einer Knochenmarkstransplantation auftritt, und Zytopenie, die durch Chemotherapie mit krebswachstumshemmenden Mitteln verursacht wird, angewendet werden. Zusätzlich kann der Faktor ebenso die Konservierung von Bluttransfusionskomponenten, wie sie im breiten Rahmen durchgeführt wird, ermöglichen. Außerdem kann dieser Faktor zusätzlich zu diesen Immunokompetenz-verbessernden Effekten bei der Vorbeugung der krankhaften Fettsucht oder als therapeutisches Arzneimittel für Krankheiten verwendet werden.
  • "Zytopenie", wie es erfindungsgemäß verwendet wird, gehört zu all diesen Krankheiten sowie zu verschiedenen dazugehörigen Immunkrankheiten. "Zytopenie Verbesserer" wird als allgemeiner Name für solche Arzneimittel verwendet, die bei der Vorbeugung und Behandlung von Zytopenie wirksam sind.
  • In einem ersten erfindungsgemäßen Aspekt wird ein Protein bereitgestellt, das keine anderen Proteine aus dem Menschen enthält und aus der Aminosäuresequenz der Aminosäuren Nr. 1 bis 178 der SEQ ID Nr. 2 des Sequenzprotokolls besteht, oder worin ein oder mehrere der Aminosäurereste an einer oder meh reren Stellen des Proteins deletiert sind, oder worin ein oder mehrere Aminosäurereste an einer Stelle des Proteins substituiert sind, wobei das Protein ein 178-mer oder Teil davon ist, wobei das Protein oder der Teil davon inhibitorische Aktivität gegen Fettbildung besitzt.
  • Stärker bevorzugt stellt die vorliegende Erfindung ein Protein bereit, das keine anderen Proteine aus dem Menschen enthält und aus der Aminosäuresequenz 1 bis 178 der SEQ ID Nr. 2 des Sequenzprotokolls besteht und inhibitorische Aktivität gegen Fettbildung besitzt.
  • Weiterhin stellt die vorliegende Erfindung eine DNA bereit, welche für das erfindungsgemäße Protein, speziell das bevorzugte Protein, kodiert. Weiterhin wird eine DNA bereitgestellt, die für Proteine kodiert und welche aus der Nukleotidsequenz der Nukleotide Nr. 81 bis 614 der SEQ ID Nr. 1 des Sequenzprotokolls besteht.
  • Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin einen Expressionsvektor für rekombinante DNA bereit, welcher DNA, wie oben definiert, enthält, worin die DNA exprimiert und repliziert werden kann, sowie eine Wirtszelle, die mit solch einem Vektor transformiert ist.
  • Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zur Herstellung eines Proteins bereit, welches umfasst: Kultivieren einer Wirtszelle, welche durch den oben definierten Vektor transformiert ist, und Gewinnen des Proteins aus dem Zellextrakt oder der Kulturlösung.
  • Es wird ebenso eine Arzneimittelzusammensetzung bereitgestellt, die eine therapeutisch wirksame Menge des erfindungsgemäßen Proteins zusammen mit einem pharmazeutisch geeigneten Träger oder Vehikel enthält.
  • Speziell bevorzugt wird eine verbesserte Zusammensetzung gegen Zytopenie, die eine therapeutisch wirksame Menge des erfindungsgemäßen Proteins zusammen mit einem pharmazeutisch geeigneten Träger oder Vehikel enthält.
  • Ebenso wird ein Arzneimittel gegen Fettleibigkeit bevorzugt, das eine therapeutisch wirksame Menge des erfindungsgemäßen Proteins zusammen mit einem pharmazeutisch geeigneten Träger oder Vehikel enthält.
  • Zusätzlich stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Proteins, wie oben definiert, zur Herstellung eines Arzneimittels gegen Zytopenie und/oder Fettleibigkeit bereit.
  • Wie oben beschrieben, besteht die N-terminale Aminosäuresequenz des erfindungsgemäßen Proteins aus den Aminosäuren 1 bis 10 der SEQ ID Nr. 2, das heißt
    (N)-Pro Gly Pro Pro Pro Gly Pro Pro Arg Val
  • Die Aminosäuresequenz (Aminosäuren 1 bis 178 der SEQ ID Nr. 2), auf die oben Bezug genommen wird, ist wie folgt:
  • Figure 00070001
  • Figure 00080001
  • Die Nukleotidsequenz (81-614 der SEQ ID Nr. 1), auf die oben Bezug genommen wird, ist wie folgt:
  • Figure 00080002
  • Die erfindungsgemäße DNA wird zum Beispiel durch Herstellen einer mRNA, welche für ein Protein kodiert, das inhibitorische Aktivitiät gegen Fettbildung besitzt, aus Säugetierzellen, die das Protein produzieren können, und anschließender reversen Transkription der mRNA in doppelsträngige cDNA mittels bekannter Verfahren, erhalten. Die Zelllinie KM-102 aus dem Stroma des menschlichen Knochenmarks [Harigaya, K. and Handa, H. (1985), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 3477– 3480] ist eine bevorzugte Quelle für mRNA aus tierischen Zellen, aber andere Tumorzellstämme, Zellen und Gewebe, die aus Säugetieren isoliert werden können, oder andere bekannte Zelllinien können ebenso verwendet werden.
  • Das Guanidin-Thiocyanat Verfahren mit heißem Phenol und das Guanidin-Thiocyanat-Guanidin-Hydrochloridsäure-Verfahren können bei der Extraktion der mRNA verwendet werden, aber das Guanidin-Thiocyanat-Cäsiumchlorid-Verfahren wird bevorzugt.
  • Der Hauptanteil der mRNA, welche in dem Cytoplasma der eukaryotischen Zellen vorkommt, hat einen 3'-poly(A)Terminus, so dass die mRNA auf einer Oligo(dT)-Cellulosesäule unter Ausnutzung dieser Eigenschaft absorbiert werden kann und die mRNA kann durch Elution gereinigt werden. Diese mRNA kann durch Verfahren, wie die Saccharose-Dichtegradientzentrifugation, weiter fraktioniert werden.
  • Um zu bestätigen, dass das Protein, für welches die oben erhaltene mRNA kodiert, eine inhibitorische Aktivität gegen Fettbildung aufweist, kann die mRNA translatiert werden. Das resultierende Protein kann auf physiologische Aktivität getestet werden oder unter Verwendung eines Antikörpers, der spezifisch für das Protein ist, identifiziert werden. Die Translation zu dem Protein kann zum Beispiel durch Injizieren von mRNA in den afrikanischen Baumfrosch (Xenopus laevis) Oocytes erreicht werden [Gurdon, J. B. et al. (1972), Nature, 233, 177–182]. Weitere Translationssysteme umfassen das Retikulozyten Lysat aus dem Kaninchen und das Lysat aus Weizenkeimen [Schleif, R. F. and Wensink, P. C. (1981), "Practical Methods in Molecular Biology", Springer-Verlag, NY].
  • Die inhibitorische Aktivität gegen Fettbildung kann durch Messen der Fähigkeit des Proteins, die Differenzierung von Vorläufer-Fettzellen zu Fettzellen zu unterdrücken, wobei zum Beispiel die Mauszellenlinie 3T3-L1 verwendet wird, oder Messen der LPL-Aktivität getestet werden [Beutler, B. A. et al. (1985), J. Immunol., 135, 3972–3977].
  • Einzelstrang-cDNA kann aus der so erhaltenen mRNA durch eine Reverse Transkriptase synthetisiert werden und eine Doppelstrang-cDNA kann unter Verwendung der Einzelstrang-cDNA als Templat synthetisiert werden. Geeignete Verfahren, welche für die Synthese verwendet werden können, umfassen: das Verfahren mit Nuklease S1 [Efstratiadis, A. et al. (1976), Cell, 7, 279–288], das Land-Verfahren [Land; H. et al. (1981), Nucleic Acids Res., 9, 2251–2266] und das O. Joon Yoo-Verfahren [Yoo, O. J. et al. (1983), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 1049– 1053]. Jedoch ist das für die erfindungsgemäßen Zwecke bevorzugte Verfahren das nach Okayama-Berg [Okayama, H. and Berg, P. (1982), Mol. Cell. Biol., 2, 161–170].
  • Die resultierenden rekombinanten Plasmide können dann in Escherichia coli, zum Beispiel den DH5-α-Stamm, eingebracht werden, um einen transformierten Wirt zu erhalten. Die gewünschten Rekombinanten können unter Ausnutzung der Tetracyclinresistenz oder der Ampicillinresistenz als Index ausgewählt werden. Zum Beispiel kann in dem Fall, in dem Escherichia coli die Wirtszelle ist, die Transformation unter Verwendung des Hanahan-Verfahrens [Hanahan, D. (1983), J. Mol. Biol., 166, 557–580] durchgeführt werden. Genauer gesagt, kann die Transformation durch Einbringen der rekombinanten DNA in kompetente Zellen, welche mit CaCl2, MgCl2 oder RbCl präpariert sind, durchgeführt werden. Im Übrigen kann zum Beispiel der λ-Phage ebenso anstelle der Plasmide als Vektor verwendet werden.
  • Die nachfolgend beschriebenen verschiedenen Verfahren können zur Auswahl eines Stamms, der die DNA trägt, die für den gewünschten inhibitorischen Faktor gegen Fettbildung kodiert, aus den transformierten Wirten angewendet werden.
  • (1) Screening-Verfahren unter Verwendung synthetischer Oligonukleotidsonden
  • Eine Oligonukleotidsonde, bei der die Aminosäuresequenz des gewünschten Proteins ermittelt wurde, kann entweder als Ganzes oder teilweise synthetisiert werden (der Teil kann jeglichem Bereich des gewünschten Proteins entsprechen, falls die Sequenz aus einer Vielzahl von aufeinanderfolgenden spezifischen Sequenzen besteht) und das für einen Teil oder die bekannte Sequenz kodiert. Die Nukleotidsequenz kann basierend auf der Frequenz der Codonverwendung erstellt werden oder eine Vielzahl an Sonden kann synthetisiert werden, wobei jede eine unterschiedliche Sequenz aufweist, die für dieselbe Aminosäuresequenz kodiert. Im letzten Fall kann die Anzahl der Sequenzen durch Einbringen von Inosin in die Sequenz minimiert werden.
  • Das resultierende Oligonukleotid kann als Sonde verwendet werden (mit 32P oder 35S markiert), um mit der denaturierten DNA des transformierten Strangs zu hybridisieren, nachdem die DNA auf einem Nitrocellulosefilter immobilisiert wurde, und anschließnedes Screening und Selektieren der resultierenden positiven Stränge.
  • (2) Screening unter Verwendung einer Sonde, die durch die Polymerase-Kettenreaktion hergestellt wurde
  • In dem Fall, in dem die Aminosäuresequenz des Zielproteins vollständig oder teilweise ermittelt wurde, können Oligonukleotide des Sinnstrangs und des Anti-Sinnstrangs, die einem Teil der Aminosäuresequenz entsprechen, synthetisiert werden. Eine Polymerase-Kettenreaktion [Saiki, R. K. et al. (1988), Science, 239, 487–491] kann unter Verwendung dieser Oligonukleotide zum Amplifizieren des DNA-Fragments, das für den gewünschten inhibitorischen Faktor gegen Fettbildung kodiert, durchgeführt werden. In diesem Verfahren kann eine cDNA, welche aus der Genom-DNA oder durch Reverse Transkription aus der mRNA der Zellen, die den inhibitorischen Faktor gegen Fettbildung herstellen, synthetisiert wird, als Templat-DNA verwendet werden. Nach Markieren des so hergestellten DNA-Fragments mit 32P oder 35S wird der gewünschte Klon durch Hybridisierung oder. Plaque-Hybridisierung der Kolonie unter Verwendung des markierten DNA-Fragments als Sonde ausgewählt.
  • (3) Screening durch Herstellen des inhibitorischen Faktors gegen Fettbildung unter Verwendung weiterer Tierzellen
  • Stämme mit einer cDNA, die für den gewünschten inhibitorischen Faktor gegen Fettbildung kodiert, können durch Kultivieren des transformierten Stamms, Amplifizieren des Gens, Transferierendes Gens in Tierzellen (in diesem Fall entweder ein selbstreplizierbares Plasmid, das eine Promotorregion für die Transkription enthält, oder ein Plasmid, das in ein Tierzellchromosom integriert werden kann), Exprimieren des Proteins, wofür das Gen kodiert, und entweder Messen der inhibi torischen Aktivität gegen Fettbildung der überstehenden Kulturlösung oder des Zellextrakts oder Detektieren des inhibitorischen Faktors gegen Fettbildung unter Verwendung eines Antikörpers für diesen Faktor, aus den Zellstämmen ausgewählt werden, die ursprünglich transformiert wurden.
  • (4) Selektion unter Verwendung eines Antikörpers für den inhibitorischen Faktor gegen Fettbildung
  • Der gewünschte Stamm wird zuerst durch Einbringen einer cDNA in einen Expressionsvektor, Synthese des Proteins in der Transformante und Detektion der Transformante, die den gewünschten inhibitorischen Faktor gegen Fettbildung produziert, unter Verwendung eines Antikörpers für den inhibitorischen Faktor gegen Fettbildung und eines sekundären Antikörpers für diesen Antikörper ausgewählt.
  • (5) Verwendung eines selektiven Hybridiserungs-Translationssystems
  • Bei diesem Verfahren wird mRNA aus Zellen, die den inhibitorischen Faktor gegen Fettbildung produzieren, zur cDNA, welche aus der Transformanten erhalten wird, hybridisiert, wobei die cDNA auf einen Nitrozellulosefilter oder dergleichen fixiert wurde. Anschließend wurde die gebundene mRNA abgespaltet und wiedergewonnen. Die wiedergewonnene mRNA wird dann entweder in ein Proteintranslationssystem, wie vom afrikanischen Baumfrosch Oocytus, injiziert oder unter Verwendung eines zellfreien Systems, wie ein Retikulozyten Lysat aus dem Kaninchen oder ein Lysat aus Weizenkeimen, in ein Protein translatiert, um die inhibitorische Aktivität gegen Fettbildung des Proteins zu untersuchen oder unter Verwendung eines Antikörpers für den Faktor den inhibitorischen Faktor gegen Fettbildung zu detektieren.
  • Wie in den folgenden Beispielen beschrieben wird, kann die gewünschte Transformante ebenso durch Anwenden des obigen Verfahrens (3) auf die ausgewählten positiven Transformanten ebenso angewendet werden, bevor die obigen Verfahren angewendet werden, nachdem ein erstes Screening unter Verwendung einer synthetischen Oligonukleotidsonde, welche nach dem AUUUA-Motiv [Shaw, G. and Kamen, R. (1986), Cell, 46, 659–667], welches in den mRNAs von Cytokinen vorkommt, erstellt wird. Genauer gesagt kann der inhibitorische Faktor gegen Fettbildung in weiteren Tierzellen und anschließendem Screening hergestellt werden.
  • Die DNA, welche für den inhibitorischen Faktor gegen Fettbildung kodiert, kann nach bekannten Techniken [vgl. Maniatis, T. et al. (1982), "Molecular Cloning – A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, NY] aus der so erhaltenen Transformante erhalten werden. Zum Beispiel kann eine Plasmid-DNA aus den Zellen und anschließend die cDNA aus der Plasmid-DNA isoliert werden.
  • Die Sequenz der in dieser Weise erhaltenen DNA kann zum Beispiel durch chemische Modifikation nach dem Maxam-Gilbert-Verfahren [Maxam, A. M. and Gilbert, W. (1980), „Methods in Enzymology", 65, 499–559] oder des Didesoxynukleotid-Kettenabbruch-Verfahrens unter Verwendung der M13-Phage [Messing, J. and Vieira, J. (1982), Gene, 19, 269–276] bestimmt werden.
  • Das resultierende Fragment, welches das Gen enthält, das für den inhibitorischen Faktor gegen Fettbildung kodiert, kann dann noch einmal zu einer geeigneten Vektor-DNA geklont werden, um dadurch Wirtszellen anderer Prokaryoten oder Eukaryoten zu transformieren. Außerdem kann das Gen durch Einbringen eines geeigneten Promotors und einer geeigneten Sequenz, die in die Genexpression involviert ist, in diese Vektoren in den entsprechenden Wirtszellen exprimiert werden.
  • Beispiele prokaryotischer Wirtszellen umfassen zum Beispiel Escherichia coli und Bacillus subtilis. Um das Gen von Interesse in diesen Wirtszellen zu exprimieren, können die Wirtszellen mit einem Replikon, das aus einer Spezies stammt, die mit der Wirtszelle kompatibel ist, oder anders ausgedrückt, mit einem Plasmidvektor, der einen Replikationsursprung und eine Regulatorsequenz enthält, transformiert werden. Zusätzlich ist es wünschenswert, dass der Vektor eine Sequenz hat, die transformierte Zellen mit einem wählbaren Expressionscharakter (Phenotyp) versieht.
  • Zum Beispiel wird häufig als Wirt der E. coli K12-Stamm verwendet, während gewöhnlich pBR322- und pUC-Plasmide als Vektor verwendet werden. Jedoch ist die vorliegende Erfindung nicht auf deren Verwendung beschränkt und jede der bekannten verschiedenen Arten von Bakterienstämmen und Vektoren können verwendet werden. Beispiele von Promotoren umfassen den Tryptophan (trp)-, Lactose (lac)-, Tryptophan-Lactose (tac), Lipoprotein (lpp)-, Lambda (lambda) pL-Promotor des Bakteriophagen Lambda und den Tu- (tufB-) Promoter des Faktors für die Polypeptidkettenverlängerung in Escherichia coli. Jeder dieser Promotoren kann bei der Herstellung des erfindungsgemäßen inhibitorischen Faktors gegen Fettbildung verwendet werden.
  • Wird Bacillus subtilis als Wirtszelle verwendet, ist der 207– 25-Stamm der bevorzugte Stamm und pTUB228 [Ohmura, K. et al. (1984), J. Biochem., 95, 87–93] usw. wird als Vektor verwendet. Jedoch ist die vorliegende Erfindung nicht auf diese beschränkt. Die Regulatorsequenz des α-Amylase-Gens aus Bacillus subtilis wird häufig als Promotor verwendet. Die Sekretion aus dem Bakterium kann durch Verwenden einer DNA-Sequenz, welche für die Signalpeptidsequenz der α-Amylase kodiert, falls notwendig, erreicht werden.
  • Eukaryotische Wirtszellen umfassen Vertebrat-, Insekten- und Hefezellen. Während COS-Zellen aus Affenzellen [Gluzman, Y. (1981), Cell, 23, 175–182] und aus dem Stamm aus chinesischen Hamsterovarienzellen (CHO), der keine Dihydrofolat-Reduktase aufweist [Urlaub, G. and Chasin, L. A. (1980), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216–4220] und dergleichen, wo es notwendig ist, vertebrate Zellen zu verwenden, häufig verwendet werden, ist die vorliegende Erfindung nicht darauf beschränkt.
  • Vektoren mit einem Promotor, welcher strangaufwärts des zu exprimierenden Gens lokalisiert ist, einer Stelle für das RNA-Splicing, einer Stelle für die Polyadenylierung oder einer Transkriptions-Terminierungssequenz und dergleichen können für den Expressionsvektor der Vertebratzelle verwendet werden. Derartige Vektoren können, falls notwendig, ebenso einen Replikatiansursprung erhalten. Der Expressionsvektor wird durch pSV2dhfr, welches einen frühen SV40-Promotor [Subramani, S. et al. (1981), Mol. Cell. Biol., 1, 854–864] hat, beispielhaft dargestellt. Jedoch ist die vorliegende Erfindung nicht auf diesen Expressionsvektor beschränkt.
  • Eine Hefe wird typischerweise als eukaryotischer Wirt verwendet. Speziell bevorzugt sind Saccharomyces, wie Saccharomyces cerevisiae. Expressionsvektoren für eukaryotische Mikroorganismen, wie Hefe, verwenden vorzugsweise zum Beispiel den Promotor des Alkoholdehydrogenasegens [Bennetzen, J. L. and Hall, B. D. (1982), J. Biol. Chem., 257, 3018–3025] oder den Promotor des sauren Phosphatase-Gens [Miyanohara, A. et al. (1983), Proc: Natl. Acad. Sci. USA, 80, 1–5].
  • COS-Zellen sind ein geeignetes Beispiel für Wirtszellen. Ein geeigneter Vektor für COS-Zellen ist selbständig in COS-Zellen replizierbar und hat einen SV40-Replikationsursprung, einen Transkriptionspromotor, ein Signal zur Transkriptionsterminierung und eine RNA-Splicing-Stelle. Die Transformation der COS-Zellen durch den Vektor kann durch das Verfahren mit DEAE-Dextran [Luthman, H. and Magnusson, G. (1983), Nucleic Acids Res., 11, 1295–1308], das Verfahren der Calcium- phosphat-DNA-Copräzipitation [Graham, F. L. and van der Ed, A. J. (1973), Virology, 52, 456–457], oder das Verfahren der Elektroporation [Neumann, E. et al. (1982), EMBO J., 1, 841– 845] erreicht werden.
  • Werden die CHO-Zellen verwendet, können transformierte Zellen, die den inhibitorischen Faktor gegen Fettbildung stabil herstellen, durch Cotransfektieren des Expressionsvektors zusammen mit einem wählbaren Vektor, der ein Neogen, welches als G418 Resistenzmarker dient, wie pRSVneo [Sambrook, J. et al. (1989), "Molecular Cloning – A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, NY] oder pSV2-neo [Southern, P. J. and Berg, P. (1982), J. Mol. Appl. Genet., 1, 327–341], und anschließendes Selektieren der G418 resistenten Kolonien erhalten werden.
  • Die so erhaltene erwünschte Transformante kann durch herkömmliche Verfahren kultiviert werden und der inhibitorische Faktor gegen Fettbildung kann entweder innerhalb oder außerhalb der Zellenproduziert werden. Das verwendete Kulturmedium kann in geeigneter Weise aus verschiedenen gewöhnlich verwendeten Arten entsprechend den eingesetzten Wirtszellen ausgewählt werden. Beispiele der Medien für COS-Zellen umfassen RPMI-1640-Medium und Dulbecco's Modified Eagle's Minimal Essential Medium (DMEM), zu dem, soweit notwendig, eine Serumkomponente, wie fötales Kälberserum (FBS) zugegeben wurde.
  • Somit kann der entweder innerhalb oder außerhalb der Transformante produzierte inhibitorische Faktor gegen Fettbildung isoliert und durch verschiedene Arten bekannter Isolationsmöglichkeiten gereinigt werden, wobei die physikalischen und chemischen Eigenschaften und dergleichen des inhibitorischen Faktors gegen Fettbildung in Betracht gezogen werden. Praktische Ausführungsformen der Verfahren umfassen Behandlung durch gewöhnliche Proteinfällungsmittel, Ultrafiltration, verschiedene Arten von Flüssigchromatographie, wie Molekularsiebchromatographie (Gelfiltration), Adsorptionschromatographie, Ionenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie und Hochdruckflüssigchromatographie (HPLC), Dialyse oder Kombinationen von diesen Verfahren.
  • Gemäß den obigen Verfahren kann der gewünschte inhibitorische Faktor gegen Fettbildung einfach in einem industriellen Maßstab sowohl in hoher Ausbeute als auch in hoher Reinheit hergestellt werden. Die verschiedenen physikalischen Eigenschaften des erfindungsgemäßen rekombinanten inhibitorischen Fak tors gegen Fettbildung, der in dieser Weise erhalten wird, wird durch die folgenden Beispiele genauer beschrieben.
  • Der inhibitorische Faktor gegen Fettbildung ist in verschiedenen Gebieten (oben beschrieben) durch den Vorteil seiner biologischen Aktivitäten nützlich.
  • Ein Protein, welches inhibitorische Aktivität gegen Fettbildung ausbildet, besteht aus 178 Aminosäuren mit Pro (Aminosäure Nr. 1 der Aminosäuresequenz der Sequenz Nr. 2 der Sequenzliste) an seinem N-terminalen Ende, oder anders ausgedrückt, dieses Protein wird als ausgereifter inhibitorischer Faktor gegen Fettbildung angesehen. Dieses Protein hat in der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese unter reduzierenden Bedingungen ein offensichtliches Molekulargewicht von etwa 23.000.
  • Zusätzlich dient eine DNA, die für den ausgereiften inhibitorischen Faktor gegen Fettbildung kodiert, ebenso als erfindungsgemäße DNA. Spezieller ist die DNA eine DNA, die aus den Nukleotidnummern 81–614 der Nukleotidsequenz der Sequenznummer 1 der Sequenzliste besteht.
  • Im Allgemeinen wird angenommen, dass die Gene von Eukaryoten Polymorphismus aufweisen, wie es beim Interferon-Genbekannt ist [vgl. Nishi, T. et al. (1985), J. Biochem., 97, 153–159]. Werden als Ergebnis dieses Polymorphismus' ein oder mehrere Nukleotide substituiert, ist es gelegentlich möglich, außer einer Veränderung in der Nukleotidsequenz, den Polymorphismus für alle verschiedenen Aminosäuren zu erhalten.
  • Proteine, die dem ausgereiften inhibitorischen Faktor gegen Fettbildung (Aminosäuren Nummern +1 bis +178 der Aminosäuresequenz der Sequenznummer 2) entsprechen, und worin eine oder mehrere Aminosäurereste an mindestens einer Stelle deletiert sind oder worin einer der Aminosäurereste an einer Stelle des Proteins substituiert ist, können ebenso inhibitorische Faktoraktivität gegen Fettbildung ausbilden. Diese Proteine werden im Folgenden als Äquivalente des inhibitorischen Faktors gegen Fettbildung bezeichnet.
  • Zum Beispiel ist es bekannt, dass das Cysteincodon des Interleukin-2-(IL-2)Gens in ein Serincodon umgewandelt werden kann, und dass das resultierende Protein seine IL-2-Aktivität behält [Wang, A. et al. (1984), Science, 224, 1431–1433]. Daher werden alle Proteine, entweder natürlichen oder synthetischen Ursprungs, und worin inhibitorische Aktivität gegen Fettbildung weiterhin ausgebildet ist, von der vorliegenden Erfindung umfasst.
  • Zusätzlich werden ebenso DNAs, die für diese Proteine kodieren, von der vorliegenden Erfindung umfasst.
  • Die verschiedenen Arten der erfindungsgemäßen DNAs können durch herkömmliche Verfahren, wie das Phosphit-Triester-Verfahren [Hunkapiller, M. et al. (1984), Nature, 310, 105– 111] auf der Grundlage der Sequenzdaten für den inhibitorischen Faktor gegen Fettbildung chemisch synthetisiert werden.
  • Verschiedene Codons für die gewünschten Aminosäuren sind bekannt. Geeignete Codons können entsprechend ausgewählt oder gemäß den herkömmlich verwendeten Verfahren bestimmt werden [s. Grantham, R. et al. (1981), Nucleic Acids Res., 9, r43– r74], wobei zum Beispiel die Frequenz des Codons, das in dem betreffenden Wirt Verwendung findet, berücksichtigt wird. Das teilweise Verändern des Codons dieser Nukleotidsequenzen kann durch gewöhnliche Verfahren, wie stellenspezifische Mutagenese [Mark, D. F. et al. (1984), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 5662–5666] unter Verwendung eines synthetischen Oligonukleotidprimers, der für die gewünschte Mutation kodiert, durchgeführt werden.
  • Der erfindungsgemäße inhibitorische Faktor gegen Fettbildung kann entweder alleine oder zusammen mit anderen therapeutischen Arzneimitteln für die Behandlung von alpastischer Anämie, Leukopenie, welche durch Toxine oder Bestrahlung hervorgerufen wird, Infektionen, welche durch Viren, Bakterien und Parasiten hervorgerufen werden, Zytopenie nach erfolgter Knochenmarkstransplantation, refraktäre Panzytopenie und andere indirekte immunologische Störungen verabreicht werden. Der inhibitorische Faktor gegen Fettbildung kann ebenso alleine oder in Kombination mit anderen therapeutischen Arzneimitteln bei der Prävention und Behandlung von krankhafter Fettleibigkeit verwendet werden.
  • Die erfindungsgemäßen Zytopenie Verbesserer und/oder die Zusammensetzungen gegen Fettleibigkeit umfassen ein Gemisch aus einem medizinisch geeigneten Träger und einer therapeutisch wirksamen Menge des inhibitorischen Faktors gegen Fettbildung. Die Zusammensetzung kann in verschiedenen Formen verabreicht werden, zum Beispiel Tabletten, Kapseln, Granulaten, Pulvern oder ein Sirup für die orale Verabreichung, und Injektionen, Tropfinfusionen oder Zäpfchen für die parenterale Verabreichung.
  • Erfolgt der Weg der Verabreichung durch Injektion oder Infusion, liegt die erfindungsgemäße therapeutische Zusammensetzung als nicht-pyrogene, parenteral verträgliche wässrige Lösung vor. Arzneimittel einer parenteral verträglichen Proteinlösung unter Berücksichtigung des pH-Werts, der Isotonizität und Stabilität liegen im technologischen Bereich eines Fachmanns.
  • Die Dosierung und die Form der Verabreichung bei der Behandlung der obigen körperlichen Zustände können durch einen Arzt bestimmt werden, wobei die Faktoren, die einen Effekt auf die Wirkung des Arzneimittels haben, wie der Gesundheitszustand des Patienten, das Körpergewicht, das Geschlecht, das Alter, das Gewicht, der Einfluss anderer Infektionen, die Verabreichungsdauer und andere klinisch relevante Faktoren, berücksichtigt werden. Normalerweise können für die orale Verabreichung einem Erwachsenen etwa 0,01 bis 1.000 mg pro Tag, entweder auf einmal oder in unterteilten Dosen, verabreicht werden. Für die nicht orale Verabreichung können etwa 0,01 bis 100 mg auf einmal entweder subkutan, intramuskulär oder intravenös injiziert werden.
  • Die erfindungsgemäße Zytopenie verbessernde Zusammensetzung kann in Kombination mit anderen hämatopoetischen Faktoren, wie IL1-, IL-10, LIF, Stammzellenfaktor, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, MEG-CSF, TNF, IFN und Erithropoetin, verwendet werden. Während andere hämatopoetische Faktoren als eine der Komponenten der erfindungsgemäßen Zytopenie verbessernden Zusammensetzung zugemischt werden können, können sie ebenso als getrennte Zusammensetzung dem Patienten verabreicht werden. Außerdem kann die Verwendung der erfindungsgemäßen Zusammen setzungen die Aktivität oder den Effekt der Behandlung weiterer hämatopoetischer Faktoren verbessern.
  • Die erfindungsgemäße Zusammensetzung gegen Fettleibigkeit kann in Kombination mit anderen Arzneimitteln gegen Fettleibigkeit, wie Appetitzügler, Inhibitoren der intestinalen Absorption, Verdauungsenzyminhibitoren, hormonelle Arzneimittel zur Beschleunigung des Metabolismus, Inhibitoren der Fettsynthese und Inhibitoren der Insulinsekretion, verwendet werden. Weiterhin kann sie in Kombination mit systematischer Nahrungszufuhr und Übungstherapie verwendet werden. In solchen Fällen kann die Verwendung der Zusammensetzung gegen Fettleibigkeit die Aktivität oder Wirksamkeit der Behandlung weiterer Arzneimittel gegen Fettleibigkeit sowie die Wirksamkeit der Behandlung anderer Therapien gegen Fettleibigkeit unterstützen.
  • Da die erfindungsgemäßen Zytopenie Verbesserer oder Arzneimittel gegen Fettleibigkeit biologischen Ursprungs sind oder aus genetischen Rekombinanten stammen, weisen sie eine geringe Toxizität auf. Die erfindungsgemäßen Proteine werden erwachsenen männlichen DDY-Stamm-Mäusen (mit einem Körpergewicht von etwa 20 g) mit 500 mg/kg oder weniger über 5 Tage per os verabreicht. Keines der erfindungsgemäßen Proteine wies Toxizität auf.
  • In den folgenden Beispielen wird auf die begleitenden Zeichnungen Bezug genommen, wobei:
  • 1 die Restriktionsenzym-Karte der cDNA, welche für den inhibitorischen Faktor gegen Fettbildung kodiert, worin ORF das Open Reading Frame darstellt;
  • 2 systematisch den Aufbau eines Plasmids zeigt, das den inhibitorischen Faktor gegen Fettbildung gemäß dem begleitenden Beispiel 6 exprimiert; und
  • 3 ein SDS-PAGE-Chromatogramm und unter Verwendung eines Antipeptid-Antikörpers unter reduzierenden Bedingungen für das Gesamtprotein, das in der überstehenden Kulturlösung der COS-1-Zellen, die mit pcDL-SR α 296 und pSR α-20-2 transfektiert sind, enthalten ist, einen Western-Blot zeigt.
  • Die vorliegende Erfindung wird speziell durch die nicht beschränkenden Beispiele, einem Vergleichsbeispiel und einem Herstellungsbeispiel nachfolgend beschrieben. Die zum Messen der verschiedenen Aktivitäten des inhibitorischen Faktores gegen Fettbildung angewandten Verfahren werden in dem begleitenden Vergleichsbeispiel beschrieben.
  • Vergleichsbeispiel
  • Hemmung der Fettbildung
  • Die inhibitorische Aktivität gegen Fettbildung. wurde wie folgt bestimmt. Die bei der Messung verwendeten Zellen waren die embryonische Fibroblastzelllinie 3T3-L1 aus Mäusen [Green, H. and Kehinde, O. (1974), Cell, 1, 113–116], die von der amerikanischen Zelltypenkultursammlung (ATCC) erhalten wurde. Die Zellen wurden unter Verwendung des Mediums A (DMEM 4,5 g/l Glukose, hergestellt durch Gibco), welches 10% inaktiviertes FBS (hergestellt durch Hyclone) und 10 mM HEPES (pH-Wert 7,2, hergestellt durch Sigma) enthält, bei 37°C in Anwesenheit eines angefeuchteten Gasgemisches aus 10% CO2 und 90% Luft kultiviert. Die Differenzierung der Zellen zu Fettzellen wurde gemäß dem durch Rubin beschriebenen Verfahren [Rubin, C. S. et al. (1978), J. Biol. Chem., 253, 7570– 7578] eingeleitet.
  • Bestimmung der Unterdrückungsaktivität auf die Differenzierung der 3T3-L1-Zellen zu Fettzellen
  • 3T3L1-Zellen wurden durch Suspendieren der Zellen in dem Medium A (oben definiert) mit einer Dichte von 1,0 × 104 Zellen/mL kultiviert. 0,5 mL der Zellsuspension wurde in jede Vertiefung einer Microtiterschale mit 48 Vertiefungen (Costas) pipettiert. Nach 3 Tagen wuchsen die Zellen zusammen. Das Medium wurde dann durch frisches Medium A und nach Kultivieren für weitere zwei Tage durch das Medium B [DMEM (4.5 g/l Glukose), welches 10 mM HEPES (pH-Wert 7.2), 3% inaktiviertes FBS, 5 μg/mL of Kälberinsulin (Sigma), 8 μg/mL d-Biotin (Sigma), 4 μg/mL of Pantothensäure (Sigma), 1.0 μM Dexamethason (Sigma) und 0.5 mM Isobutylmethylxanthin (Aldrich) enthält] ersetzt, um die fettbildende Differenzierung einzuleiten. Die Proben des inhibitorischen Faktors gegen Fettbildung wurden zu diesem Zeitpunkt zugegeben. Anschließend wurde alle zwei Tage das Medium durch frisches Medium B ersetzt und erneut die Probe zugegeben. Am vierten bis siebten Tag, nachdem das Medium B und die Probe zum ersten Mal zugegeben wurden, wurde das Medium durch das Medium C ersetzt [DMEM (enthaltend 4.5 g/l Glukose), welches 5% inaktiviertes FBS, 10 mM HEPES (pH-Wert 7.2) und 100 ng/mL Kälberinsulin enthält], um Fettzellen zu erhalten.
  • Nach Kultivieren für zwei Tage im Medium C wurden die Zellen mit 5%igem Formaldehyd fixiert. Die Fetttropfen, welche sich innerhalb der Zellen angesammelt hatten, und die Zellkerne wurden mit Oil Red O bzw. Hämatoxylin angefärbt. Nach einer mikroskopischen Aufnahme, wurde die Anzahl der Zellen, worin sich rotgefärbte Fetttropfen angesammelt hatten, aus dieser bestimmt, zusammen mit der Anzahl der Zellen, deren Kerne mit Hämatoxylin angefärbt wurden. Die Rate der fettbildenden Differenzierung wurde unter Verwendung der unten gezeigten Formel berechnet. Fettbildende Differenzierungsrate (%) = 100 × Anzahl der Zellen, welche Fetttropfen enthalten,/Anzahl der kernhaltigen Zellen.
  • Die Zellfixierung, die Anfärbung mit Oli Red O und Hämatoxylin, wurde gemäß der experimentellen Vorschrift „Mitomo, Y. and Takayama S., "RINSHOKENSAKOZA (Clinical Testing Seminar)", Vol. 12, "Pathology" (1982), Ishiyaku Publishing" durchgeführt.
  • Analyse der LPL-Unterdrückungsaktivität
  • Die Analyse wurde hauptsächlich gemäß dem durch Beutler beschriebenen Verfahren [Beutler, B. A. et al. (1985), J. Immunol., 135, 3972–3977] durchgeführt. 3T3-L1 Fettzellen, welche mit Fettzellen transformiert waren, wurden gemäß dem oben beschriebenen Verfahren hergestellt (Bestimmung der Unterdrückungsaktivität auf die Differenzierung der 3T3-L1 Zellen zu Fettzellen), mit der Ausnahme, dass keine Probe zugegeben wurde, wenn die Differenzierung zu Fettzellen eingeleitet wurde. Das Medium wurde dann durch frisches Medium C ersetzt und die Probe zugegeben. Nach Kultivieren für 18 Stunden wurde das Medium entfernt und die Zellen zweimal mit PPS (–) (phosphatgepufferte physiologische Kochsalzlösung, Nissui Seiyaku) gewaschen. Als nächstes wurden 300 μl des Mediums D [DMEM (4.5 g/l Glukose), welches 5%iges inaktiviertes FBS, 10 mM HEPES (pH-Wert 7,2), 100 ng/mL Kälberinsulin und 10 U/mL Natriumheparin (Nobo Industries) enthält] jeder Vertiefung zugegeben. Nach Kultivieren für 1 Stunde wurden 100 μl der überstehenden Kulturlösung gesammelt und zum Messen der LPL-Aktivität verwendet. Die Messung der LPL-Unterdrückungsaktivität wurde dreimal für jede Probe durchgeführt und der Durchschnitt der drei Messwerte berechnet.
  • Die Messung der LPL-Aktivität wurde nach dem Verfahren von Nilsson-Ehle und Schotz [Nilsson-Ehle, P. and Schotz, M. C. (1976), J. Lipid Res., 17, 536–541] durchgeführt: 100 mL der überstehenden Kultur, die wie oben beschrieben hergestellt wurde, wurde mit einem gleichen Volumen an Substratlösung (13 μM Glycerol-tri[9,10(n)-3H]oleinsäure (51,8 KBeq/μmol, Amersham), und wie unten beschrieben hergestellt] 1,3 mg/mL L-α-Distearoylphosphatidylcholin (Sigma), 20 mg/mL Kälberserumalbumin (Sigma), 135 mM Tris-Hydrochlorid (Tris-HCl, pH-Wert 8,1, Sigma), 16,5% (v/v.) Glycerol und 16,5% (v/v) inaktiviertes FBS}, gemischt und für 120 Minuten bei 37°C umgesetzt. Die Umsetzung wurde durch Zugabe von 1,05 mL 0,1 M Kaliumkarbonatborsäurepuffer (pH-Wert 10,5) und 3,25 mL Methanol : Chloroform : Heptan = 141 : 125 : 100 (v/v) gestoppt. Nach heftigem Rühren wurde das Reaktionsgemisch bei 3.000 × g für 15 Minuten zentrifugiert. Die 3H-Zahl der Wasser-Methanol-Phase wurde unter Verwendung eines Flüssigscintillationszählers gemessen. Eine Einheit LPL-Aktivität wurde als die Menge an Aktivität definiert, welche 1 μM Fett säure in 1 Minute herstellt. Glycerol-tri[9,10(n)-3H]oleinsäure (in der Substratlösung verwendet) wurde durch Verdünnen von Glycerol-tri[9,10(n)-3H]oleinsäure (Amersham, 37,0 GBeq/mol) mit Triolein (Sigma), und anschließendem Reinigen mittels Kieselgelsäulenchromatographie hergestellt.
  • Beispiel 1
  • Isolierung der Poly(A+)RNA aus KM-102-Zellen
  • KM-102-Zellen wurden in 36 Plastikkulturschalen (15 cm Durchmesser) mit Iscove's Modified Minimal Essential Medium (hergestellt durch Boehringer-Mannheim), welches 10% FBS enthält, kultiviert. Nachdem die Zellen zusammenwuchsen, wurden Phorbolmyristatacetat (PMA) und das Calciumionophor A23187 in Konzentrationen von 10 ng/mL bzw. 0.2 μM zugegeben. Die Kultivierung wurde fortgesetzt und die Zellen aus 12 Platten wurden nach 3, 6 bzw. 14 Stunden auf einmal mit Guanidin-Thiocyanatlösung [4 M Guanidin-Thiocyanat, 1% Sarcosil, 20 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), 25 mM Natriumcitrat (pH-Wert 7,0), 100 mM 2-Mercaptoethanol und 0.1% Antischaum A] lysiert und die Lösung wiedergewonnen.
  • Die Isolierung der Poly(A+)RNA wurde hauptsächlich, wie in "Molecular Cloning – A Laboratory Manual" [Maniatis, T. et al. (1982), pp. 196–198] beschrieben, durchgeführt. Genauer gesagt wurde die Isolierung, wie unten beschrieben, durchgeführt.
  • Die wiedergewonnenen Lösung der lysierten Zellen wurden wiederholt aufgenommen und unter Verwendung von 10 mL Spritzen, welche mit 21G-Nadeln ausgestattet waren, entnommen. Polyalo mar-Zentrifugenröhrchen, welche mit dem RPS-40T Rotorträger, hergestellt durch Hitachi Koki, kompatibel sind, wurden mit 3 mL 5,7 M CsCl-0,1 M EDTA (pH-Wert 7,5) bestückt und mit den Lösungen der lysierten Zellen überschichtet, bis die Röhrchen gefüllt waren. Nach Zentrifugieren dieser Lösungen für 18 Minuten bei 20°C und 30.000 rpm, wurden die resultierenden Pellets in 400 μl destilliertem Wasser gelöst und anschließend wurde mit Ethanol gefällt. Die resultierenden Pellets wurden dann erneut in 400 μl destilliertem Wasser gelöst und hierzu ein gleiches Volumen aus Chloroform : 1-Butanol (4 : 1) gegeben und anschließend gerührt. Die wässrige Phase wurde nach dem Abtrennen durch Zentrifugation wiedergewonnen. Nach Ausfällen aus der wässrigen Phase mit Ethanol, wurden die erhaltenen Pellets in 600 μl destilliertem Wasser gelöst, um die Gesamt-RNA zu erhalten. Etwa 4,5 mg jeder Gesamt-RNA wurde aus jeder Probe nach 3, 6 und 14 Stunden Stimulation mit PMA-A23178 erhalten.
  • 600 μg jeder der drei Chargen der oben erhaltenen Gesamt-RNA wurden gemischt und das Gemisch zur Reinigung der Poly(A+)-RNA mittels Oligo(dT)-Zellulose chromatographiert. Genauer gesagt wurde nach Auflösen der Gesamt-RNA in einem Adsorptionspuffer [0,5 M NaCl, 20 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 1 mM EDTA und 0,1% Natriumdodecylsulfat (SDS)] und Erwärmen auf 65°C für 5 Minuten die resultierende Lösung auf eine Säule mit Oligo(dT)-Zellulose (Pharmacia, Typ 7) aufgetragen und mit derselben Lösung gefüllt. Die Poly(A+)RNA wurde durch Elution mit einem Eluenten [10 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 1 mM EDTA and 0,05% SDS] wiedergewonnen, wobei 100 μg der Poly(A+)RNA erhalten wurden.
  • Beispiel 2
  • Erstellen einer cDNA-Bibliothek
  • Das Erstellen einer cDNA-Bibliothek wurde nach dem Okayama-Berg-Verfahren durchgeführt. Genauer gesagt wurden 5 μg der Poly(A+)-RNA und 24 Einheiten der reversen Transkriptase in einem Reaktionsgemisch {50 mM Tris-HCl (pH-Wert 8,3), 8 mM MgCl2, 30 mM KCl, 0,3 mM Dithiothreitol (DTT), 2 mM dATP, 2 mM dGTP, 2 mM dCTP, 2 mM dTTP, 10 μCi[α-32P]dCTP und 1,4 μg Vektorprimer DNA [pcDV-1 mit einem 3'-Oligo(dT)-Terminus, Pharmacia]} bei 42°C für 60 Minuten umgesetzt.
  • Nachdem die Umsetzung durch Zugabe von 2 μl 0,25 M EDTA und 1 μl 10% SDS gestoppt wurde, wurde das Protein durch Behandlung mit 20 μl Phenol-Chloroform (1 : 1) entfernt. Der wässrigen Phase, welche durch Zentrifugation gesammelt wurde, wurden 20 μl 4 M Ammoniumacetat und 80 μl Ethanol zugegeben und anschließend wurde für 15 Minuten auf –70°C abgekühlt. Der Niederschlag wurde dann durch Zentrifugation gesammelt und mit 75%igem Ethanol gewaschen, anschließend unter reduzierten Druck getrocknet.
  • Der getrocknete Niederschlag wurde dann in 15 μl eines Reaktionsgemisches einer terminalen Transferase [140 mM Kaliumcacodylat, 30 mM Tris-HCl (pH-Wert 6,8), 1 mM CoCl2, 0,5 mM DTT, 0,2 μg PolyA and 100 mM dCTP] gelöst. Das Reaktionsgemisch wurde für 3 Minuten auf 37°C gehalten, nachdem 18 Einheiten der terminalen Desoxynucleotidyl-Transferase zugegeben wurden und für 5 Minuten umgesetzt. Das Protein wurde dann durch Behandlung mit Phenol-Chloroform entfernt, nachdem die Umsetzung durch Zugabe von 1 μl 0,25 M EDTA und 0,5 μm 10% SDS gestoppt wurde. Nach Zentrifugation des Reaktionsgemi sches wurde die wässrige Phase wiedergewonnen und hierzu 15 μl 4 M Ammoniumacetat und 60 μl Ethanol gegeben und anschließend kräftig gemischt. Nach Abkühlen des Gemisches für die Dauer von 15 Minuten auf –70°C wurde der so gebildete Niederschlag durch Zentrifugation gesammelt.
  • Dieser Niederschlag wurde dann in 10 μl Restriktionsenzympuffer [50 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 10 mM MgCl2 und 1 mM DTT] gelöst, 2,5 Einheiten des Restriktionsenzyms HindIII zugegeben und der Niederschlag für etwa 1 Stunde bei 37°C aufgeschlossen.
  • Die Proteine wurden dann durch Behandlung mit Phenol-Chloroform entfernt und dann wurde mit Ethanol gefällt. Nachdem das Reaktionsgemisch für die Dauer von 15 Minuten auf –70°C abgekühlt wurde, wurde der Niederschlag durch Zentrifugation gesammelt und in 10 μl TE-Puffer [10 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5) und 1 mM EDTA gelöst. 1 μl dieser Lösung wurde zu 9 μl eines Reaktionsgemisches [10 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 1 mM EDTA und 100 mM NaCl], dem 10 ng Linker-DNA, mit einem Oligo(dG)-Terminus [pL-1 HindIII-Linker mit einem 3'-Oligo(dG)-Terminus, Pharmacia] zugegeben war, zugegeben und anschließend für 5 Minuten bei 65°C erwärmt. Das Reaktionsgemisch wurde für 30 Minuten bei 42°C stehen gelassen. Das Reaktionsgemisch wurde dann in Eiswasser abgekühlt, wonach 10 μl 10 × Ligasepuffer [10 mM ATP, 660 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 66 mM MgCl2 und 100 mM DTT], 78 μl destilliertes Wasser und 8 Einheiten der T4 DNA-Ligase zugegeben und das Gemisch über Nacht bei 12°C stehen gelassen wurde.
  • 10 μl 1 M KCl, 1 Einheit Ribonuclease H, 33 Einheiten DNA-Polymerase I, 4 Einheiten T4 DNA-Ligase, 0,5 μl einer Nukleo tidlösung (20 mM dATP, 20 mM dGTP, 20 mM dCTP und 20 mM dTTP) und 0,1 μl Kälberserumalbumin (50 μg/μL) wurden dann zugegeben und das Gemisch für 1 Stunde bei 12°C und dann für 1 Stunde bei 25°C gehalten. Nachdem das Reaktionsgemisch fünf Mal mit destilliertem Wasser verdünnt wurde, wurde Escherichia coli DH5-α sofort nach dem durch Hanahan beschriebenen Verfahren [Hanahan, D. (1983), J. Mol. Biol., 166, 557–580] transformiert, wobei eine KM-102 Zell-cDNA-Bibliothek bereitgestellt wurde.
  • Beispiel 3
  • Herstellung der Oligonucleotidsonde
  • Das 15-mer 5'-TAAATAAATAAATAA-3', das als ATT-3 bezeichnet wird, wurde auf der Grundlage der AUUUA-Sequenz, welche in der 3'-nichttranslatierten Region der Cytokin-mRNA konserviert ist, chemisch synthetisiert. Die Synthese wurde unter Verwendung eines 380B DNA-Syntheseautomaten (Applied Biosystems) nach dem in dem Manual beschriebenen Verfahren synthetisiert. Dieses Verfahren basiert auf dem durch Caruthers et al. [Metteucci, M. D. and Caruthers, M. H. (1981), J. Am. Chem. Soc., 103, 3185–3191] beschriebenen Prinzip und ist als Phosphoramitid-Verfahren bekannt. Nachdem die 15 Nukleotide synthetisiert waren, wurden sie durch Abspalten vom Trägerharz freigegeben und das resultierende Gemisch gefriergetrocknet, um ein Oligonukleotidpulver bereitzustellen. Das Pulver wurde dann in destilliertem Wasser gelöst und bis zur Verwendung bei –20°C gefroren und gelagert.
  • Beispiel 4
  • Screening der cDNA Bibliothek
  • 6500 Stämme rekombinanter DNAs aus der in Beispiel 3 erstellten cDNA-Bibliothek wurden auf einem Nitrocellulosefilter nach dem Verfahren von Grunstein, M. und Hogness, D. S. [Grunstein, M. and Hogness, D. S. (1975), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72, 3961–3965] fixiert. Das 5'-Ende der Sonde (ATT-3) wurde durch herkömmliche Verfahren mit 32P markiert (siehe "Molecular Cloning – A Laboratory Manual"), wonach Koloniehybridisierung durchgeführt wurde. Die Prähybrisierung wurde bei 37°C für 3 Stunden in einer Lösung durchgeführt, welche 6 × SSC (1 × SSC = 150 mM NaCl und 15 mM Trinatriumcitrat), 1 × Denhardt'sche Lösung, 0,25% SDS, 0,05% Natriumpyrophosphat und 100 μg/mL denaturierte Lachssamen-DNA enthielt, durchgeführt. Bei 37°C über Nacht in einem Reaktionsgemisch aus 6 × SSC, welches die 32P radiomarkierte Sonde (ATT-3), 1 × Denhardt'sche Lösung, 17 μg/mL Hefe-tRNA und 0,05% Natriumpyrophosphat enthielt, wurde hybridisiert.
  • Nachdem die Umsetzung erfolgt war, wurde der Nitrocellullosefilter mit 6 × SSC-Lösung, welche 0,05% Natriumpyrophosphat enthielt, bei Raumtemperatur für 2 Stunden gewaschen und anschließend einer Autoradiographie unterworfen. Als Ergebnis wurden 33 positive Klone erhalten. Nach erfolgter Isolierung der Plasmid-DNA aus diesen Klonen durch herkömmliche Arbeitsweisen wurden einige Klone zufällig ausgewählt und ein Teil der Nukleotidsequenz der resultierenden cDNA wurde durch die Didesoxymethode bestimmt. Dann wurde mit Nukleotidsequenzen, die in der EMBL oder der GenBank Datenbank registriert sind, mittels eines PC auf Homologie überprüft. Somit wurde bestimmt, dass die Region, welche mit der ATT-3-Sonde hybridi sierte, mit den Mitgliedern der Alu-Wiederholungssequenz Wiederholung [Schmid, C. W. and Jelinek, W. R. (1982), Science, 216, 1065–1070] homolog war.
  • Wurde ein DNA-Fragment, das die Alu-Wiederholungssequenz enthielt, die aus der menschlichen Genom-DNA hergestellt wurde, mit 32P markiert und als Sonde zur Durchführung einer Koloniehybridisierung der oben erwähnten 33 Klone verwendet, konnte herausgefunden werden, dass 12 der Klone die Alu-Wiederholungssequenz aufwiesen. Die Länge der eingesetzten cDNA wurde für die restlichen 21 Klone bestimmt und es wurde herausgefunden, dass die Einschübe zwischen 50 bis 3.600 Basen enthielten. Nachdem die cDNA der 21 Klone mit Restriktionsenzymen kartiert wurde, wurden die Nukleotidsequenzen der cDNA teilweise bestimmt. Die oben erwähnten Datenbanken wurden auf homologe Sequenzen untersucht und Klone, die in diesen Datenbanken nicht registrierte neue Sequenzen aufwiesen, wurden gesammelt.
  • Da diese Plasmide einen frühen SV40-Promotor und einen Replikationsursprng enthalten, wurden sie zum Exprimieren der cDNA in COS-1-Zellen verwendet. Daher wurde Plasmid-DNA für die Klone, welche, wie oben erwähnt, ausgewählt wurden, in die COS-1-Zellen eingebracht. Die Transfektion der COS-1-Zellen wurde durch Elektroporation unter Verwendung der Shimadzu GTE-1-Genimplantiereinheit durchgeführt.
  • Genauer gesagt wurden COS-1-Zellen in einem Kolben bis zu einem halb zusammengewachsenen Zustand kultiviert, die Zellen durch Behandlung mit Trypsin-EDTA gesammelt und zweimal mit PBS(–)-Puffer (Nissui Seiyaku) gewaschen. Dann wurden die Zellen in einem PBS(–)-Puffer mit 6 × 107 Zellen/mL suspen diert. Andererseits wurde jede der Plasmid-DNA, welche durch das Cäsium-Chlorid-Verfahren hergestellt wurde, mit PBS(–)-Puffer auf 200 μg/mL eingestellt. 20 μl jeder der oben erwähnten Zellsuspension und DNA-Lösung wurden gemischt und in einer Kammer mit einem Elektrodenabstand von 2 mm platziert. 30 μsec-Pulse mit 600 V wurden zweimal in einem 1-Sekunden-Intervall angewandt. Nach Abkühlen der Kammer auf 4°C für etwa 5 Minuten wurde das Zell-DNA-Gemisch in der Kammer zu 100 mL DMEM, welches 10% FBS enthielt, gegeben. Das resultierende Gemisch wurde in eine Platte übertragen und in Gegenwart von 5% CO2 bei 37°C über Nacht kultiviert. Dann wurde die überstehende Kulturlösung entfernt, die Zellen mit serumfrei- em Medium (DMEM) gewaschen und 10 mL DMEM zugegeben und anschließend für drei Tage kultiviert. Die überstehende Lösung wurde von der erhaltenen Zellkultur wiedergewonnen und auf Unterdrückungsaktivität auf die Differenzierung der 3T3-L1-Zellen zu Fettzellen analysiert, wie es im Vergleichsbeispiel beschrieben wurde.
  • Die inhibitorische Aktivität gegen Fettbildung wurde nur für die überstehende Kulturlösung der COS-1-Zellen, welche mit dem Plasmid (als pcD-20-2 bezeichnet) des Klons, der die Nr. 20-2 erhielten, transfektiert waren, bestimmt. Die Daten der Transformation der inhibitorischen Aktivität gegen Fettbildung sind in Tabelle 1 gezeigt.
  • Tabelle 1
    Figure 00360001
  • pPUC-CAT ist ein Plasmid, welches durch Einbringen eines Chloramphenicol-Acetyl-Transferase-Gens in einen pUC-Vektor erhalten wird, und kann als Negativkontrolle verwendet werden, da es keinen Promotor enthält, der in Säugetierzellen funktioniert. Die Transfektion wurde in derselben Weise wie für pcD20-2 durchgeführt. Wie in Tabelle 1 gezeigt, konnte die inhibitorische Aktivität auf die Differenzierung der 3T3-L1-Zellen zu Fettzellen in der überstehenden Kulturlösung der COS-1-Zellen, die mit pcD-20-2 transfektiert waren, detektiert werden. Zusätzlich wurde in den 3T3-L1-Zellen, die zur Differenzierung zu Fettzellen angeregt. wurden (Tabelle 2), die LPL-Aktivität stark unterdrückt. Die Werte in der Tabelle stellen einen relativen Wert (%) dar, bezogen auf 100% LPL-Aktivität (blank), wobei die 100% auftreten, wenn nur serumfreies DMEM zugegeben wurde.
  • Tabelle 2
    Figure 00370001
  • Eine Restriktionsenzym-Karte des cDNA-Einschubs der pcD-20-2 wurde erstellt (1). Die vollständige Nukleotidsequenz der cDNA wurde dann durch das Didesoxyverfahren bestimmt und die Nukleotidsequenz, die in der Sequenznummer 1 (SEQ ID Nr. 1) der Sequenzliste dargestellt ist, wurde erhalten. Es wurde herausgefunden, dass der cDNA-Einschub der pcD-20-2 aus 1065 Basen mit einem Poly(A)-Terminus (41 A-Reste) bestand. Es wurde ebenso herausgefunden, dass die cDNA ein Open Reading Frame (ORF), das aus 199 Aminosäuren, die mit Methionin beginnen, besteht. Wurde die resultierende Nukleotidsequenz mit den Sequenzen in den EMBL und GenBank Datenbanken verglichen, wurde keine Homologie mit einer bekannten Sequenz gefunden. Die Aminosäuresequenz, welche durch das ORF kodiert wird, wurde ebenso mit den NBRF und SWISS prot Datenbanken verglichen und eine Homologie mit einer bekannten Sequenz nicht beobachtet. Es wurde daher angenommen, dass das ORF des cDNA-Einschubs der pcD-20-2 für ein neues Polypeptid kodiert. Die Aminosäuresequenz, welche durch das ORF kodiert wird, wird in der Sequenznummer 2 (SEQ ID Nr. 2) der Sequenzliste angezeigt.
  • Ein Bereich, der stark hydrophobe Aminosäuren (ein Signalpeptid) enthält, der in verschieden Sekretionsproteinen beobachtet wird, tritt im N-terminalen Bereich der Aminosäuresequenz auf und beginnt mit Methionin. Dadurch wurde vorgeschlagen, dass das Protein ein Sekretionsprotein ist.
  • Beispiel 5
  • Peptidsynthese und Herstellung des Antipeptid-Antiserums
  • Das Peptid, das der Aminosäuresequenz 27 bis 41, ausgehend von dem Methionin am N-terminalen Ende, (NH2-Gly-Pro-Pro-Arg-Val-Ser-Pro-Asp-Pro-Arg-Ala-Glu-Leu-Asp-Ser-COOH) entspricht, wurde synthetisiert, um zu bestätigen, dass das neue Peptid, das durch das ORF des cDNA-Einschubs des pcD-20-2 kodiert wird, ein Sekretionsprotein ist und auch, um den inhibitorischen Faktor gegen Fettbildung während. der Reinigung des Faktors, wie später beschrieben, zu detektieren. Das so synthetisierte Peptid wurde dann als Antigen verwendet, um einen Hasen zu immunisieren und ein Antiserum herzustellen. Genauer wurde die Peptidsynthese nach der tBOC-Aminosäure-Festphasen-Verfahren [Merrifield, R. B. (1963), J. Am. Chem. Soc., 85, 2149–2154) und anschließend durch ein automatisches Standardsyntheseprogramm unter Verwendung des Peptidsynthesizers 430A, hergestellt durch Applied Biosystems, durchgeführt. Nach Abspalten der Schutzgruppen und Abspalten vom.
  • Harz wurde das Peptid auf einer Ionenaustauschersäule gereinigt. Das Hauptsignalmuster wurde mittels HPLC unter Verwendung einer Umkehrphasensäule bestätigt.
  • Nach Auf konzentrieren des Peptids durch Gefriertrocknen wurden die Signale separiert und mittels HPLC unter Verwendung einer Umkehrphasensäule gesammelt. Nach Auf konzentrieren des Proteins durch Gefriertrocknen wurde eine HPLC-Analyse durchgeführt und die Aminosäurezusammensetzung analysiert. Die Aminosäurezusammensetzung wurde unter Verwendung eines Pico Tag Systems, einen automatischen Aminosäureanalysator, hergestellt durch Waters, analysiert.
  • Keyhole-Limpet-Hämocyanin (KLH), welches als Trägerprotein dient, wurde durch das Glutaraldehyd(GAD)-Verfahren an das resultierende Peptid gekoppelt [Konopka, J. B. et al. (1984), J. Virol., 51, 223–232] und als Antigen zur Immunisierung von Hasen verwendet. Das Antigen wurde homogen in Freund's komplettes Adjuvans (VDA) suspendiert und ein Hase durch subdermales Verabreichen der Suspension in den Rücken immunisiert. Das gesamte Blut wurde nach Verabreichen der Suspension dreimal in einem 2-Wochen-Intervall gesammelt. Der Antikörpertiter in dem Hasenserum wurde durch einen Enzym-Immunoassay (ELISA) gemessen. Aus dem resultiernden Antiserum wurde unter Verwendung einer Protein-A-Sepharose-6MB-Säule, hergestellt durch Pharmacia, eine IgG-Fraktion hergestellt. Diese wurde dann als primärer Antikörper verwendet.
  • Beispiel 6
  • Herstellung und Reinigung des inhibitorischen Faktors gegen Fettbildung in COS-1-Zellen
  • i) Herstellung eines Expressionsvektors („high expression vector") und Expression in COS-1-Zellen
  • Nach Aufschließen des pcD-20-2 mit BamH1 wurde das 1240 bp-Fragment, das den cDNA-Einschub enthält, isoliert und gereinigt. Zwischenzeitlich wurde nach Aufschließen des „High Expression"-Vektors pcDL-SR α296 [Takebe, Y. et al. (1988), Mol. Cell. Biol., 8, 466–472], ebenso mit BamH1, das 3,4 kb Fragment, das den SR α Promotor enthält, hergestellt, woran das cDNA Bam H1-Fragment in einer Umsetzung unter Verwendung der T4 DNA-Ligase gebunden wurde. Die resultierende DNA wurde dann verwendet, um Escherichia coli DH5 α zu transformieren und das Plasmid in der resultierenden Transformante analysiert. Ein Stamm, worin die Richtung der cDNA-Transkription gleich der des SR α Promotors ist, wurde ausgewählt und das Plasmid pSR α-20-2 (2) genannt.
  • Der SR α Promotor umfasst einen frühen SV40-Promotor und die R-U5-Sequenz des Long Terminal Repeat (LTR) des HTLV-1 und weist eine 10 bis 100-fach höhere Promotoraktivität auf als die des frühen SV40-Promotors alleine.
  • COS-1-Zellen wurden dann mit dem resultierenden pSR α-20-2-Plasmid tranfektiert, um zu bestätigen, dass unter Verwendung des in Beispiel 5 erhaltenen Antikörpers, der inhibitiorische Faktor gegen Fettbildung in die überstehende Kulturlösung sekretiert wird. Die Transfektion der COS-1-Zellen erfolgte entweder durch das Elektroporationsverfahren oder durch das DEAE-Dextranverfahren [Luthman, H. and Magnusson, G. (1983), Nucleic Acids Res., 11, 1295–1308]. 160 μl der serumfreien überstehenden Kulturlösung, die jeweils aus: COS-1-Zellen, die mit dem Negativkontrollplasmid transfektiert waren, COS-1-Zellen, die mit dem pcDL-SR α 296, das keine cDNA enthält, transfektiert waren, und COS-1-Zellen, die mit dem pSR α 20-2 transfektiert waren und den inhibitorischen Faktor gegen Fettbildung exprimieren, erhalten wurden, wurden mit Trichloressigsäure (TCA) zum Ausfällen des Proteins behandelt und der Niederschlag dann durch Abtrennung mittels Zentrifugation erhalten. Nachdem der Niederschlag unter Verwendung von eisgekühltem Aceton gewaschen und dann luftgetrocknet wurde, wurde er in einem Probenpuffer, der 2-Mercaptoethanol enthält, gelöst und einer reduzierenden SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) unter Verwendung eines 12,5%igen Gels unterworfen. Die Detektion der Proteinbanden nach der Elektrophorese erfolgte durch Anfärben mit Silber mittels „Silbest Stain", hergestellt durch Nacalai Tesque, (linke Darstellung in 3). Eine einzelne Bande mit einem spezifischen Muster wurde an der Position detektiert, die durch den Pfeil angezeigt wird (Molekulargewicht: etwa 23.000), in der überstehenden Kulturlösung der COS-1-Zellen, die mit dem pSR α-20-2 transfektiert waren.
  • Zusätzlich wurde unter Verwendung des in Beispiel 5 hergestellten primären Antikörpers eine Analyse mittels Western-Blotting durchgeführt, nachdem die Proteinbanden, welche durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese erhalten wurden, unter Verwendung eines Gelmembran-Blotters (hergestellt durch Marysol, KS-8441) auf eine Nitrocellulosemembran aufgebracht wa ren, gemäß dem Verfahren nach Towbin et al. [Towbin, H. et al. (1979), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 4350–4354]. Das Western-Blotting erfolgte unter Verwendung des Immun-Blot (GAR-HRP) Assay Kits, hergestellt durch Bio-Rad, nach den Anweisungen des Herstellers (Abbildung auf der rechten Seite in 3). Nur die spezifische Bande, die durch Anfärben mit Silber detektiert wurde (Molekulargewicht: etwa 23.000), reagierten mit dem Antipeptid-Antikörper, wobdurch bestätigt wurde, dass das Protein, welches durch das ORF des cDNA-Einschubs des pcD-20-2 kodiert wird, ein Sekretionsprotein ist.
  • Dann wurde eine Studie über die differenzierungsinhibitorische Aktivität gegen Fettbildung der überstehenden Kulturlösung aus COS-1-Zellen, welche mit dem pSR α-20-2 transfektiert waren, durchgeführt. Die Daten der Aktivität sind in Tabelle 3 gezeigt.
  • Tabelle 3
    Figure 00420001
  • Obwohl die differenzierungsinhibitorische Aktivität gegen Fettbildung in der überstehenden Kulturlösung der COS-1-Zellen, welche mit dem pcDL-SR α296 (Negativkontrolle, die keinen cDNA-Einschub enthalten) transfektiert waren, nicht beobachtet wurde, wurde eine deutliche Aktivität im Falle des pSR α-20-2 detektiert. Zusätzlich wurde die LPL-Aktivität in 3T3-L1-Zellen, die zur Differenzierung zu Fettzellen angeregt wurden, stark unterdrückt (Tabelle 4). Die in den Tabellen 3 und 4 angezeigten inhibitorischen Aktivitäten waren deutlich stärker verglichen mit dem Fall, in dem pcD-20-2 verwendet wurde (Tabelle 1 und Tabelle 2).
  • Tabelle 4
    Figure 00430001
  • ii) Reinigung und N-terminale Aminosäuresequenzanalyse
  • 7 L serumfreie überstehende Kulturlösung, die durch Transfektion der COS-1-Zellen mit pSR α-20-2, wie oben beschrieben, erhalten wurde, wurde mit einem 20-fachen Volumen an Dialysepuffer [10 mM Borsäure-NaOH (pH-Wert 9,0) und 13 mM KCL]. für 15 Stunden bei 4°C dialysiert, wonach schwachkationische Austauscherchromatographie mittles FPLC, hergestellt durch Pharmacia, unter den unten angegebenen Bedingungen durchgeführt wurde:
    Säule: CM-Toyopearl Pack 650 M (2,2 × 20 cm, hergestellt durch Tosoh)
    Elustionspufferlösung:
    Lösung A: 10 mM Borsäure-NaOH (pH-Wert 9,0), 13 mM KCl
    Lösung B: Lösung A, die 300 mM NaCl enthält
    Flußrate: 3 mL/Min.
    Fraktionsvolumen: 3 mL/Röhrchen
    Konzentrationsgradient: linearer Konzentrationsgradient von 100% Lösung A bis 100% Lösung B über eine Dauer von 50 Minuten
  • Jeder der erhaltenen Fraktionen wurde unter Verwendung des Antipeptid-Antikörpers, der in Beispiel 5 hergestellt wurde, mittels Western-Blotting analysiert, um die Fraktionen, die den inhibitorischen Faktor gegen Fettbildung enthalten, zu identifizieren (Nummern 35 bis 45). Die Gesamtmenge der Hauptfraktion (Nr. 41), die die größte Menge des inhibitorischen Faktors gegen. Fettbildung enthält, wurde mit 260 mM NaCl eluiert, durch TCR-Fällung auf konzentriert und unter Verwendung eines 12,5%igen Gels mittels reduzierender SDS-PAGE analysiert. Nach Elektrophorese wurden die Proteinbanden des Polyacrylamidgels unter Verwendung eines Gelmembran-Blotters (Marysol, KS-8441) in einem Transferpuffer [0,02% SDS, 20% Methanol und 25 mM tris-Borate (pH-Wert 9,5)] bei 4°C für 15 Stunden auf eine Polyvinylidendifluorid(PVDF)-Membran (Millipore, Immobilon®) geblottet und mit einem Strom von 0,8 mA/cm2 behandelt. Die geblottete Membran wurde für 5 Minuten mit 10 mM Natriumboratpuffer (pH-Wert 8,0), der 25 mM NaCl enthielt, gewaschen und dann unter Schütteln für 5 Minuten mit destilliertem Wasser gewaschen, wonach die Membran luftgetrocknet wurde. Als nächstes wurde der Teil, zu dem der inhibitorische Faktor gegen Fettbildung transferiert wurde, aus der Membran entnommen und unter Verwendung eines Gasphasenproteinsequenzers (hergestellt durch Applied Biosystems, Model 475A) wurde die Sequenz bis 10 Aminosäurereste vom N-terminalen Ende bestimmt.
  • Die Phenylthiohydantoin(PHT)-Aminosäuren, die in den entsprechenden Reaktionszyklen erhalten wurden, wurden abgetrennt und mittels Umkehrphasen-HPLC identifiziert (Applied Biosystems, Model 120A). Die Aminosäuresequenz, die durch die oben erwähnte Arbeitsweise bestimmt wurde, ist unten gezeigt und entspricht den Aminosäuren 1 bis 10 der SEQ ID Nr. 2.
    Pro-Gly-Pro-Pro-Pro-Gly-Pro-Pro-Arg-Val-
  • Dies zeigt an, dass der menschliche inhibitorische Faktor gegen Fettbildung, der mit einem Prolinrest beginnt, aus der Zelle in ausgereifter Form sekretiert wird, nachdem nach der Biosynthese eines aus 199 Aminosäuren bestehenden Vorläufers das Signalpeptid, das aus 21 Aminosäuren zusammengesetzt ist, vom N-terminalen Ende abgeschnitten wird.
  • Beispiel 7
  • Biologische Aktivität des gereinigten inhibitorischen Faktors gegen Fettbildung
  • Der inhibitorische Faktor gegen Fettbildung wurde nach bekannten Verfahren aus der serumfreien überstehenden Kulturlösung gereinigt, die durch Transfektion der COS-1-Zellen mit pSR α-20-2 erhalten wurde, wobei schwachkationische Austauschchromatographie, hydrophobe Chromatographie und Gelfiltrationssäulenchromatographie usw., kombiniert und der Faktor in Form einer einzelnen Bande mittles SDS-PAGE-Analyse detektiert wurde. Als Ergebnis der Untersuchung der differenzungsinhibitorischen Aktivität gegen Fettbildung und der Aktivität zur Unterdrückung von LPL unter Verwendung dieses gereinigten inhibitorischen Faktors gegen Fettbildung eine deutliche Aktivität detektiert.
  • Folglich wurde angenommen, dass der erfindungsgemäße inhibitorische Faktor gegen Fettbildung aus einem einzelnen Protein resultiert, welches inhibitorische Faktoraktivität gegen Fettbildung besitzt.
  • Beispiel 8
  • Sekretionsproduktion des transformationsinhibitorischen Faktors gegen Fettbildung in CHO-Zellen
  • CHO-Zellen in einer logarithmischen Wachstumsphase wurden mit pSR α-20-2 und pSRVneo mit einem DNA-Verhältnis von 5 : 1 unter Verwendung des Calciumphosphat-DNA-Copräzipitations-Verfahrens cotransfektiert. Durch Kultivieren mit HamF12-Medium (Nissui Seiyaku), welches 400 μg/mL G418 (Gibco Oriental) und 10% FBS enthält, für 9 Tage, wurden transformierte Stämme ausgewählt. Nachdem 15 Stämme aus den resultierenden resistenten Kolonien ausgewählt wurden, wurden die Kolonien in eine 24-Loch-Platte unter Verwendung eines Klonrings transferiert und die Kultivierung fortgesetzt. Die Zellen, die einen zusammengewachsenen Zustand erreichten, wurden in rechteckige Kolben transferiert und subkultiviert und mittels des oben beschriebenen Western-Blotting die Produktion des inhibitorischen Faktors gegen Fettbildung für die 15 Stämme analysiert.
  • Die Klone, die die höchste Produktion des inhibitorischen. Faktors gegen Fettbildung aufzeigten, wurden ausgewählt und dann durch eine limitierende Verdünnungstechnik unter Verwendung einer 96-Loch-Platte kultiviert. Vier Klone, die aus diesen einzelnen Zellen hervorgehen, wurden ausgewählt. Die vier Stämme der Zellen wurden in Kulturplatten transferiert und bis zu einen zusammengewachsenen Zustand kultiviert, anschließend wurde die Menge des inhibitorischen Faktors gegen Fettbildung mittels Western-Blotting für jede übersehende Kulturlösung analysiert. Die Menge der Prodeuktion des inhibitorischen Faktors gegen Fettbildung durch Sekretion war stabil und es wurde kein großer Unterschied zwischen den vier Stämmen hinsichtlich der Menge beobachtet. Zusätzlich wurden die Wirkungen der oben erhaltenen überstehenden Kulturlösung auf die LPL-Aktivität der 3T3-L1-Zellen untersucht und die Aktivität der Unterdrückung der LPL wurde in der überstehenden Kulturlösung aller vier Klone detektiert. Als nächstes wurde einer der vier Stämme in einem serumfreien Medium kultiviert (vollständiges CHO-1-Mediumsystem, hergestellt durch Ventrex). Nachdem der Stamm in dem serumfreien Medium für zwei Tage kultiviert wurde, wurde durch Behandlung mit Trypsin-EDTA subkultiviert und anschließend für weitere drei Tage kultiviert. Die überstehende Kulturlösung wurde dann entfernt und mittels Western-Blotting untersucht, wobei bestätigt wurde, dass der inhibitorische Faktor gegen Fettbildung stabil produziert wurde.
  • Beispiel 9
  • Inhibitorische Aktivität auf die Differenzierung des Knochenmarks von Mäusen zu Fettzellen, erhalten aus der präadipocyten Zelllinie H-1/A
  • Mausknochenmark, erhalten aus der präadipocyten Zelllinie H-1/A [Nakamura, M. et al. (1985), Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 179, 283–287] wurde mit einer Dicht von 2,0 × 104 Zellen/mL in dem Medium [Fischer's Medium (Gibco), enthaltend 10 inaktiviertes FBS (Hyclone)] suspendiert. Diese Zellsuspension wurde anschließend in eine Zelldichte C-1-Platte 48F (Sumitomo Bakelite) mit 0,5 mL/Vertiefung pipettiert und bei 33°C in einem angefeuchteten Gasgemisch aus 5% CO2 und 95% Luft kultiviert. Drei Tage später wurde das Medium durch das Medium F [Medium E, enthaltend ein μM Hydrocortison (Sigma)] ersetzt, um die Differenzierung zu Fettzellen zu induzieren. Zur selben Zeit wurde eine überstehende Kulturlösung aus COS-1-Zellen, die mit dem pSR α-20-2-Plasmid transfektiert waren, eine überstehende Kulturlösung der COS-1-Zellen, die mit dem pcDL-SR α296 transfektiert waren, oder serumfreies DMEM-Medium zugegeben. Das Medium wurde alle vier Tage durch frisches Medium F ersetzt und überstehende COS-1-Zellkulturlösung oder DMEM-Medium wurden zugegeben. Die Zellen wurden mit 5%igem Formaldehyd am 26. Tag nach der Zugabe des Mediums F fixiert und die Fetttropfen, die sich in den Zellen und. den Zellkernen angesammelt hatten, wurden unter Verwendung von Oil Red O bzw. Hämatoxilin angefärbt. Die Rate der Differenzierung zu Fettzellen wurde unter Verwendung der selben Methode, wie für die Messung der inhibitorischen Aktivität auf die Differenzierung der 3T3-L1-Zellen zu Fettzellen verwendet wurde, berechnet. Wie in Tabelle 5 gezeigt, wurde eine starke inhibitorische Aktivität in der überstehenden Kulturlösung der COS-1-Zellen, welche mit pSR α-20-2 transfektiert waren, auf die Differenzierung der H-1/A-Zellen zu Fettzellen detektiert. Der inhibitorische Faktor gegen Fettbildung, der von der überstehenden Kulturlösung der COS-1-Zellen, die mit pSR α-20-2 transfektiert waren, gereinigt wurde, hemmte ebenso deutlich die Differenzierung der H-1/A-Zellen zu Fettzellen.
  • Tabelle 5
    Figure 00490001
  • Beispiel 10
  • CSF-induzierende Wirkung auf das Knochemark, erhalten aus der präadipocyten Zellinie H-1/A
  • H-1/A-Zellen wurden mit einer Dichte von 1,0 × 104 Zellen/mL in dem Medium E suspendiert und mit 3 mL pro Vertiefung in eine Microtiterschale mit 6 Vertiefungen (hergestellt von Co- star) pipettiert. Die Zellen wurden bei 33°C in einem angefeuchteten Gasgemisch bei 5% CO2 und 95% Luft kultiviert. Nachdem die Zellen für 6 Tage kultiviert wurden, wurde das Medim durch frisches Medium E ersetzt. Zu diesem Zeitpunkt wurde eine überstehende Kulturlösung aus COS-1-Zellen, die mit pSR α-20-2-Plasmid transfektiert waren, eine überstehende Kulturlösung der COS-1-Zellen, die mit pcDL-SR α 62-Plasmid transfektiert waren, oder serumfreies DMEM-Medium zugegeben und für weitere 5 Stunden kultiviert.
  • Nach Kultivieren wurden die Zellen dreimal mit serumfreiem Fischer's Medium gewaschen und 3 mL frisches Medium E wurden in jede Vertiefung gegeben und die Kultivierung für weitere 14 Stunden fortgesetzt. Anschließend wurde die überstehende Kulturlösung aus jeder Vertiefung gesammelt. Die so erhaltene überstehende Kulturlösung wurde unter Verwendung eines Millex GV-Filters mit einer Porengröße von 0,22 μm (Nippon Millipore Industries) filtriert und anschließend das Filtrat für einen Koloniestimulierungsaktivitätstest verwendet. Dieser Test wurde nach dem Verfahren nach Kubota et al. [Kubota, K. et al. (1981), Cancer Res., 41, 3052–3057] durchgeführt. Knochenmarkzellen aus dem Oberschenkel von weiblichen C3H He/N-Mäusen (bereitgestellt von der Japan Charles River) wurden mit einer Dichte von 1,0 × 105 Zellen/mL in dem RPMI 1640-Medium (Gibco), dem 0,3% Bactoagar (Difco), 20% FBS und 10% H-1/a überstehende Zellkulturlösung zugegeben wurden, suspendiert. 1 mL-Portionen dieser Suspension wurden jeweils in 35 × 10 mL Plastikplatten (Lux) pipettiert. Nachdem die Zellen für sieben Tage bei 37°C in einem angefeuchteten Gasgemisch bei 5% CO2 und 95% Luft kultiviert wurden, wurden die in jeder Platte gebildeten Kolonien bestimmt.
  • Die überstehende Kulturlösung der H-1/A-Zellen, die mit dem Medium E behandelt waren, dem die überstehende Kulturlösung der COS-1-Zellen, die mit pSR α-20-2 transfektiert waren, zugegeben wurde, zeigten deutlich höhere koloniestimulierende Aktivität (p < 0,01) gegenüber der überstehenden Kulturlösung der H-1/A-Zellen, die mit dem Medium E behandelt waren, dem die überstehende Kulturlösung der COS-1-Zellen, die mit pcDL-SR α 296 transfektiert waren, oder serumfreies DMEM zugegeben wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 zusammengefasst.
  • Tabelle 6
    Figure 00510001
  • 5,0 × 106 H-1/A-Zellen wurden in 50 mL Medium E suspendiert und in einem Accel-Kolben (Costar) für 5 Tage kultiviert. Als nächstes wurde das Medium durch frisches Medium E ersetzt und gleichzeitig eine überstehende Kulturlösung aus COS-1-Zellen, die mit pSR α-20-2 transfektiert waren, eine überstehenden Kulturlösung aus COS-1-Zellen, die mit pcDL-SR α 296 transfektiert waren, oder serumfreies DMEM zugegeben. Nachdem das Gemisch für 18 Stunden kultiviert wurde, wurde die Gesamt-RNA aus den Zellen in derselben Weise, wie in Beispiel 1, isoliert. Die Menge der M-CSF mRNA wurde durch Northern-Hybridisierung [Thomas, P. S. (1980), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 5201–5205] unter Verwendung von 20 g der Gesamt-RNA analysiert. Maus-M-CSF cDNA, die durch Polymerase-Kettenreaktion hergestellt wurde [Ladner, M. B. et al. (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 6706–6710], wurde mit 32P mittels des Multiprime DNA Labelling Systems (Amersham) mar kiert und als Sonde verwendet. Die Menge der hybridisierten 32P-markierten Sonde wurde mittels eines Imaga-Analyzers (Fuji Photo Film) bestimmt. Die 32P-markierte Sonde wurde mit einer RNA, die eine Größe von etwa 2,5 kb und etwa 4,5 kb hatte, hybridisiert. Wurden die Gesamtmengen der Sonde, die mit diesen RNA-Größen hybridisierte, miteinander verglichen, wurde herausgefunden, dass die Menge der M-CSF mRNA pro Einheit der Gesamt-RNA in H-1/A-Zellen, die mit dem Medium E behandelt waren, dem 5% überstehende Kulturlösung aus COS-1-Zellen, die mit pSR alpha-20-2 transfekiert waren, zugegeben wurde, zunahm, verglichen mit H-1/A-Zellen, die mit dem Medium E behandelt waren, dem 5% überstehende Kulturlösung von COS-1-Zellen zugegeben wurde, die mit pcDL-SR α296 transfektiert waren (Tabelle 7).
  • Tabelle 7
    Figure 00520001
  • Beispiel 11
  • CSF-induzierende Wirkung auf H-1/A-Zellen, die zu Fettzellen differenziert waren
  • 5,0 × 106 H-1/A-Zellen wurden in 50 mL Medium F suspendiert und für 12 Tage in einem Accel-Kolben bei 33°C kultiviert. Während des Kultivierens wurde alle vier Tage das Medium durch frisches Medium F ersetzt. Danach wurde das Medium durch Medium E ersetzt und die Kultivierung wurde für weitere drei. Tage fortgesetzt. Als Ergebnis wurde beobachtet, dass sich in mindestens 40% der Zellen Öltröpfchen angesammelt hatten, wodurch die Differenzierung zu Fettzellen angezeigt wurde. Das Medium wurde anschließend durch Medium E ersetzt, dem jeweils 5% der überstehenden Kulturlösung aus COS-1-Zellen, die mit pSR α-20-2 transfektiert waren, der überstehenden Kulturlösung aus COS-1-Zellen, die mit pcDL-SR α296 kultiviert waren, oder dem serumfreies DMEM zugegeben wurde, und die Kultivierung für 18 Stunden fortgesetzt. Nach der Kultivierung wurde das Medium entfernt und die Zellen zweimal mit PBS(–) gewaschen, anschließend wurden 25 mL Medium E zugegeben, dem Natriumheparin bis zu einer Endkonzentration von 10 U/mL zugegeben war. Dieses Gemisch wurde für 15 Minuten bei 33°C kultiviert. Wurde die LPL-Aktivität der überstehen- den Kulturlösung gemessen, wurde eine deutliche LPL-Unterdrückung nur beobachtet, wo überstehende Kulturlösung aus COS-1-Zellen, die mit pSR α-20-2 transfekiert waren, zugegeben wurde (Tabelle 8).
  • Tabelle 8
    Figure 00530001
  • Anschließend wurde die Gesamt-RNA in der selben Weise, wie in Beispiel 1, aus den oben hergestellten Zellen isoliert. Die Menge der M-CSF mRNA wurde in der selben Weise, wie in Beispiel 10, analysiert, mit der Ausnahme, dass in jedem Fall 10 μg der Gesamt-RNA verwendet wurden. H-1/A-Zellen, die mit dem Medium E behandelt waren, dem 5% überstehende Kulturlösung aus COS-1-Zellen zugegeben wurde, die mit pSR α-20-2 transfektiert waren, zeigten einen deutlichen Anstieg in der Menge der M-CSF mRNA pro Einheit der Gesamt-RNA, verglichen mit H-1/A-Zellen, die mit dem Medium E behandelt waren, dem 5% überstehende Kulturlösung aus COS-1-Zellen zugegeben war, die mit pcDL-SR α296 transfektiet waren (Tabelle 9).
  • Tabelle 9
    Figure 00540001
  • Herstellungsbeispiel 1
  • Darmlösliche Granulatpräparation, enthaltend 50% des inhibitorischen Faktors gegen Fettbildung
  • 70 Teile (Gewichtsteile, selbiges gilt im Folgenden) des in Beispiel 8 erhaltenen, gereinigten inhibitorischen Faktors gegen Fettbildung, 10 Teile Lactose und 20 Teile mikrokristalliner Cellulose wurden gewogen und in einem Mörtel kräftig gemischt und anschließend mit einer geeigneten Menge Wasser geknetet. Das geknetete Gemisch wurde durch einen zylindrischen Granulierer, die mit einem Sieb ausgestattet rischen Granulierer, die mit einem Sieb ausgestattet war, das eine Porengröße von 1,2 mm hatte, extrudiert, wobei Granulate. geformt wurden. Die Granulate wurden durch eine Vorrichtung zur Herstellung von kugelförmigen Applikationsformen („MARUMERIZER") geschickt, um eine granulierte Präparation zu erhalten. Nach Trocknung diese Granulate bei 40°C für 2 Stunden in einem Umlufttrockner, wurden die erhaltenen trockenen Granulate über ein 35 Mesh-Sieb klassifiziert. Die Granulate größer als 35 Mesh wurden zur Herstellung der darmlöslichen Granulate verwendet. Als erstes wurde eine Lösung von 5% Hydroxypropylmethylcellulose, in gleichen Mengen Methylenchlorid und Ethanol nach herkömmlichen Vorgehensweisen hergestellt und 100 Teile der oben erwähnten trockenen Granulate mit 100 Teilen dieser Lösung in einer Beschichtungspfanne sprühbeschichtet. Als nächstes wurden die so behandelten Granulate in derselben Weise, wie oben beschrieben, mit 300 Teilen einer Lösung aus 10% Hydroxypropylmehtylcellulosephthalat (Shin-Etsu Chemical, HP-55), 1,5% Stearinsäure, 50% A- ceton und 38,5% Methanol, welche gemäß herkömmlichen Arbeitsweisen hergestellt wurde, beschichtet. Die beschichteten Granulate, welche in dieser Weise erhalten wurden, wurden für eine Stunde bei 40°C in einem Umlufttrockner getrocknet, wobei eine enterische Präparation des inhibitorischen Faktors gegen Fettbildung gebildet wurde. Dieese Granulate enthalten 50% inhibitorischen Faktor gegen Fettbildung.
  • Herstellungsbeispiel 2
  • Kapseln
  • 200 mg der darmlöslichen Granulate, die im Herstellungsbeispiel 1 hergestellt wurden, wurden in Nr. 3 Kapseln gefüllt, wobei harte Kapseln hergestellt wurden, die 100 mg des inhibitorische Faktors gegen Fettbildung pro Kapsel enthalten.
  • Herstellungsbeispiel 3
  • Injektion
  • Der inhibitorische Faktor gegen Fettbildung kann in Form einer Ampulle verwendet werden, die eine sterile Lösung des Faktors enthält, der in Wasser oder anderen pharmazeutisch geeigneten Flüssigkeiten gelöst oder suspendiert ist. Andererseits kann eine Ampulle, die eine sterile pulverförmige Präparation enthält (vorzugsweise einen gefriergetrockneten inhibitorischen Faktor gegen Fettbildung), bei Verwendung mit einer pharmazeutisch geeigneten Flüssigkeit verdünnt werden.
  • [Sequenzliste]
    Figure 00570001
  • Figure 00580001
  • Figure 00590001
  • Figure 00600001
  • Figure 00610001

Claims (10)

  1. Protein, das keine anderen Proteine aus dem Menschen enthält und aus der Aminosäuresequenz der Aminosäuren Nr. 1 bis 178 der SEQ ID Nr. 2 des Sequenzprotokolls besteht, oder worin ein oder mehrere der Aminosäurereste an einer oder mehreren Stellen des Proteins deletiert sind oder worin ein oder mehrere Aminosäurereste an einer Stelle des Proteins substituiert sind, wobei das Protein ein 178-mer oder Teil davon ist, wobei das Protein oder der Teil davon inhibitorische Aktivität gegen Fettbildung besitzt.
  2. Protein nach Anspruch 1, das aus der Aminosäuresequenz der Aminosäuren Nr. 1 bis 178 der SEQ ID Nr. 2 des Sequenzprotokolls besteht und inhibitorische Aktivität gegen Fettbildung besitzt.
  3. DNA, welche für ein Protein nach einem der Ansprüche 1 oder 2 kodiert.
  4. DNA, welche für ein Protein nach einem der Ansprüche 1 oder 2 kodiert und aus einer Nukleotidsequenz der Nukleotide Nr. 81 bis 614 der SEQ ID Nr. 1 des Sequenzprotokolls besteht.
  5. Expressionsvektor für rekombinante DNA, der DNA nach Anspruch 3 oder 4 enthält, worin die DNA exprimiert und repliziert werden kann.
  6. Wirtszelle, die mit einem Vektor nach Anspruch 5 transformiert ist.
  7. Verfahren zur Herstellung eines Proteins, welches umfasst: Kultivieren einer Wirtszelle nach Anspruch 6 und Gewinnen des Proteins aus dem Zellextrakt oder der Kulturlösung.
  8. Arzneimittelzusammensetzung, die eine therapeutisch wirksame Menge eines Proteins nach Anspruch 1 oder 2 zusammen mit einem pharmazeutisch geeigneten Träger oder Vehikel enthält.
  9. Verwendung eines Proteins nach Anspruch 1 oder 2 zur Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung oder Prophylaxe von Cytopaenie.
  10. Verwendung eines Proteins nach Anspruch 1 oder 2 zur Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung oder Prophylaxe von Fettleibigkeit.
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