CN101190944A - 人类新细胞因子及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新的人类分泌性细胞因子NS128，涉及其编码的氨基酸序列或其片段的多核苷酸，含有所述多核苷酸的基因工程载体和宿主细胞。同时，本发明涉及了该细胞因子的氨基酸序列或其片段的多肽及多肽的生产方法，以及抑制该细胞因子表达的小干扰RNA。本发明还涉及含有所述多核苷酸或其药物可接受的盐，或所述多肽或其药物可接受的盐的药物组合物。本发明还涉及了该细胞因子的多核苷酸或多肽或小干扰RNA在制备预防和/或治疗肿瘤、感染、造血功能障碍、自身免疫病等的药物中的应用，尤其是MAPK信号途径相关的肿瘤、炎症及神经系统疾病等，具有临床应用价值。本发明还涉及体外检测所述多核苷酸或多肽的表达水平是否变化的方法。本发明还涉及与所述多肽或其活性片段特异性结合的单克隆或多克隆抗体。

Description

人类新细胞因子及其用途

技术领域

本发明涉及分子生物学、基因工程学、肿瘤学、细胞生物学领域。具体地，本发明涉及一种新的细胞因子的多核苷酸及多肽、含有所述多核苷酸的载体或宿主细胞、及所述多肽的制备方法和用途。本发明还涉及抑制该细胞因子表达的小干扰RNA。本发明还涉及该细胞因子或小干扰RNA在制备预防和/或治疗肿瘤、感染、造血功能障碍、自身免疫病等的药物中的应用，尤其是MAPK信号途径相关的肿瘤、炎症及神经系统疾病等。

背景技术

细胞因子是由机体的免疫细胞和非免疫细胞合成和分泌小分子的多肽类因子，它们调节多种细胞生理功能(Fundamental Immunology，Forth Edition，1999：pp741-774，Lippincott-RavenPublishers，Philadelphia)。细胞因子作为小分子的分泌性多肽类因子，包括淋巴细胞产生的淋巴因子和单核巨噬细胞产生的单核因子等。目前已知白细胞介素(interleukin，IL)、干扰素(interferon，IFN)、集落刺激因子(colony stimulating factor，CSF)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)、转化生长因子(transforming growth foctor，TGF-β)等均是免疫细胞产生的细胞因子，它们在免疫系统中起着非常重要的调控作用，在异常情况下也会导致病理反应。细胞因子不仅作用于免疫系统和造血系统，还广泛作用于神经、内分泌系统，对细胞间相互作用，细胞的增殖分化和效应功能有重要的调节作用。细胞因子发挥广泛多样的生物学功能是依赖于与靶细胞膜表面的细胞因子受体相结合并将信号传递到细胞内部而实现的(Cell 1989 May 19；57(4)：521-4；Curr OpinImmunol 1994 Aug；6(4)：631-635)。

目前发现并正式命名的细胞因子有数十种，每种细胞均有其独特的、起主要作用的生物学活性。尽管种类繁多、产生细胞和作用细胞多样、生物学活性广泛、发挥作用的机制不同，但众多的细胞因子具有以下共同的特性：

1、天然细胞因子是由细胞产生的；2、细胞因子的产生和作用具有多向性(pleiotropism)；3、细胞因子的合成和分泌过程是一种自我调控的过程；4、为低分子量的分泌型蛋白质常被糖基化；5、细胞因子需与靶细胞上的高亲和力受体特异结合后才发挥生物学效应；6、生物学效应极强；7、单一细胞因子可具有多种生物学活性，但多种细胞因子也常具有某些相同或相似的生物学活性；8、主要参与免疫反应和炎症反应，影响反应的强度和持续时间的长短，涉及到感染免疫、肿瘤免疫、自身免疫、移植免疫等诸多方面；9、以非特异性方式发挥生物学作用且不受MHC限制；10、某种细胞因子对靶细胞作用的强弱取决于细胞因子的局部浓度，靶细胞本身的类型，自分泌方式(即作用于自身产生细胞)和旁分泌方式(paracrine，即作用于邻近的靶细胞)；11、天然细胞因子大多是在近距离发挥局部作用；12、细胞因子的作用并不是孤立存在的，它们之间通过合成分泌的相互调节，受体表达的相互调控、生物学效应的相互影响而组成细胞因子网络(addidveeffect)，也可以取得协同效应(synergy)，甚至取得两种细胞因子单用时所不具有的新的独特的效应。

细胞因子具有非常广泛的生物学活性，包括促进靶细胞的增殖和分化，增强抗感染和细胞杀伤效应，促进或抑制其它细胞因子和膜表面分子的表达，促进炎症过程，影响细胞代谢等。

1、免疫细胞的调节剂：免疫细胞之间存在错综复杂的调节关系，细胞因子是传递这种调节信号必不可少的信息分子。许多免疫细胞还可通过分泌细胞因子产生自身调节单核巨噬细胞的功能。许多免疫细胞还可通过分泌细胞因子产生自身调节作用。通过研究细胞因子的免疫网络调节，可以更好地理解完整的免疫系统调节机制，并且有助于指导细胞因子作为生物应答调节剂(biological response modifier，BRM)应用于临床治疗免疫性疾病。

2、免疫效应分子：在免疫细胞针对抗原(特别是细胞性抗原)行使免疫效应功能时，细胞因子是其中重要效应分子之一。例如TNFα和TNFβ可直接造成肿瘤细胞的凋亡(apoptosis)；干扰素α、β、γ可干扰各种病毒在细胞内的复制，从而防止病毒扩散；LIF可直接作用于某些髓性白血病细胞，使其分化为单核细胞，丧失恶性增殖特性。另有一些细胞因子通过激活效应细胞而发挥其功能，如IL-2和IL-12刺激NK细胞与TC细胞的杀肿瘤细胞活性。与抗体和补体等其它免疫效应分子相比，细胞因子的免疫效应功能更强，因而在抗肿瘤、抗细胞内寄生感染、移植排斥等功能中起重要作用。

3、造血细胞刺激剂：从多能造血干细胞到成熟免疫细胞的分化发育漫长道路中，几乎每一阶段都需要有细胞因子的参与。目前的研究表明，CSF和IL-3是作用于粒细胞系造血细胞，M-CSF作用于单核系造血细胞，此外Epo作用于红系造血细胞，IL-7作用于淋巴系造血细胞，IL-6、IL-11作用于巨核造血细胞等等。由此构成了细胞因子对造血系统的庞大控制网络。某种细胞因子缺陷就可能导致相应细胞的缺陷，如肾性贫血病人的发病就是肾产生Epo的缺陷所致，正因如此，应用Epo治疗这一疾病收到非常好的效果。目前多种刺激造血的细胞因子已成功地用于临床血液病，有非常好的发展前景。

4、炎症反应的促进剂：炎症是机体对外来刺激产生的一种病理反应过程，在这一过程中，一些细胞因子起到重要的促进作用，如IL-1、IL-6、IL-8及TNFα等可促进炎症细胞的聚集、活化和炎症介质的释放，可直接刺激发热中枢引起全身发烧，IL-8同时还可趋化中性粒细胞到炎症部位，加重炎症症状。在许多炎症性疾病中都可检测到上述细胞因子的水平升高。用某些细胞因子给动物注射，可直接诱导某些炎症现象，这些实验充分证明细胞因子在炎症过程中的重要作用。基于上述理论研究结果，目前已开始利用细胞因子抑制剂治疗炎症性疾病，例如利用IL-1的受体拮抗剂(IL-lreceptor antagonist，IL-lra)和抗TNFα抗体治疗败血性休克、类风湿关节炎等，已收到初步疗效。

5、其它：许多细胞因子除参与免疫系统的调节效应功能外，还参与非免疫系统的一些功能。例如IL-8具有促进新生血管形成的作用；M-CSF可降低血胆固醇IL-1刺激破骨细胞、软骨细胞的生长；IL-6促进肝细胞产生急性期蛋白等。这些作用为免疫系统与其它系统之间的相互调节提供了新的证据。

目前利用基因工程技术生产的重组细胞因子做为生物应答调节剂(BRM)治疗肿瘤、造血障碍、感染等已收到良好的疗效，成为新一代的药物。重组细胞因子做为药物具有很多优越之处。例如细胞因子为人体自身成分，可调节机体的生理过程和提高免疫功能，很低剂量即可发挥作用，因而疗效显着，副作用小，是一种全新的生物制剂，已成为某些疑难病症不可缺少的治疗手段。目前已批准生产的细胞因子药物包括干扰素α、β、γ，Epo，GM-CSF，G-CSF，IL-2，正在进行临床试验的包括IL-1、3、4、6、11，M-CSF，SCF，TGF-β等。这些细胞因子的主要适应症包括肿瘤、感染(如肝炎、AIDS)、造血功能障碍、创伤、炎症等。细胞因子抑制剂的新药及临床研究也在近年来获得快速的发展，同时，细胞因子检测也是判断机体免疫功能的一个重要指标，具有重要的实验室研究价值，在临床上有诸多实用价值、包括许多疾病的诊断、病程观察、疗效判断及细胞因子治疗监测等。

研究细胞因子有助于阐明分子水平的免疫调节机制，有助于疾病的预防、诊断和治疗，特别是利用细胞因子治疗肿瘤、感染、造血功能障碍、自身免疫病等，已收到初步疗效，具有非常广阔的应用前景。因而，发现新的细胞因子，进行功能和应用研究是国际的热点领域，具有重要的理论意义和实用价值。

丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)是介导细胞反应的重要信号系统，普遍存在于多种生物，包括酵母和哺乳动物细胞，具有高度的保守性。MAPK信号转导通路涉及了很多的细胞生理过程，例如基因的表达，细胞的存活，增殖以及细胞凋亡等，具有重要的意义。MAPK信号联级反应由MAPKKK，MAPKK，MAPK三个密切相关的激酶组成。MAPK至少包含ERK-1/2，JNK1/2/3，p38α/β/γ/δ和ERK5四个类型，分别与不同的细胞生理过程相关。当受胞外信号刺激(如生长因子，紫外射线，环境胁迫，细胞因子，炎症因子等)后，MAPK进一步激活其下游的效应因子，如转录因子等，发挥相应的效应。并行的MAPKs信号通路之间存在复杂的协调作用，既可相互区别、又能相互调节。

MAPK信号转导通路的异常与肿瘤、炎症的发生密切相关。例如在人的结肠癌、乳腺癌和肺癌等多种肿瘤中，均可以检测到ERK表达水平增高。持续活化的ERK通路可以促进正常细胞向肿瘤表型转化，而抑制ERK信号转导通路，在体外能够使肿瘤细胞恢复到非转化的表型。由于MAPK信号是一个联级过程，所以从理论上，干预该途径中的任何一种激酶都有可能阻止肿瘤的生长或者炎症的进程，所以MAPK信号的各级分子都有可能成为治疗肿瘤或炎症分子的靶标。例如，ISIS5132是一个由20个碱基组成的针对RafmRNA3’非翻译区的反义核苷酸，可以特异性的下调RafmRNA的表达，抑制肿瘤细胞的增殖。在II期临床实验中，33％的结肠癌患者病情稳定期超过3个月。同样的，MEK磷酸化水平在结肠癌、绒毛状腺癌和管状腺瘤中升高，而在正常的结肠粘膜细胞中几乎检测不到MEK的磷酸化。采用MEK的口服抑制剂PD184352，通过抑制MEK1/2而特异性的抑制ERK1/2的磷酸化，可以抑制结肠癌细胞的生长。MEK抑制剂在结肠癌的临床治疗方面具有广阔的应用前景。

炎性肠炎病(IBD)是一种慢性肠道炎症性疾病，促炎因子和抗炎因子的失衡是该病发生和发展的原因。IBD治疗目前以5-氨基水杨酸和糖皮质激素为主，但这两类药物不仅疗效不尽如人意，且毒副作用大，影响了其临床应用，开发疗效确切且副作用小的药物成为目前治疗的热点。在IBD患者炎症部位的肠粘膜中的P38、JNK和ERK活性均明显高于对照组，其中以P38α活性升高最为明显。特异性P38抑制剂目前研究较多的是以SB203580为代表的人工合成的吡啶咪唑类制剂，结构与腺嘌呤类似，可竞争性抑制ATP与磷酸化的P38α和P38β上ATP结合位点结合，从而抑制P38的活性。此外，SB203580还可抑制磷酸化的P38从胞核至胞浆的转位，抑制P38对胞浆内底物的活化。在动物实验中，SB203580能够明显抑制IBD的发生。所以P38信号通路抑制剂可以作为治疗IBD的新药物靶标。

MAPK信号途径还与神经系统疾病如癫痫、阿尔茨海默病、帕金森病等相关联，广泛参与了多种神经系统疾病发生发展的过程。

因此进一步研究MAPK信号转导通路具体的机制，发现其参与分子，进行功能和应用研究，对指导临床治疗MAPK信号途径相关的肿瘤、炎症及神经系统疾病等可提供新的理论依据和支持。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种新的人细胞因子NS128；

本发明的另一目的在于提供了上述新的人细胞因子的编码核苷酸；

本发明的另一目的在于提供了上述细胞因子的载体和宿主细胞；

本发明的另一目的在于提供了上述新的人细胞因子的制备方法；

本发明的另一目的在于提供了上述的多核苷酸片段；

本发明的另一目的在于提供了一种多肽；

本发明的另一目的在于提供了抑制上述新的人细胞因子表达的小干扰RNA；

本发明的另一目的在于提供一种药物组合物，该药物组合物含有本发明的多核苷酸、载体、宿主细胞、多肽、或小干扰RNA或其药物可接受的盐，以及一种或一种以上药物可接受的盐或药学上可接受的载体或赋型物；

本发明的另一目的在于提供了上述细胞因子或其编码多核苷酸或抑制该细胞因子表达的小干扰RNA在制备预防和/或治疗肿瘤、感染、造血功能障碍、自身免疫病等的药物中的应用，尤其是MAPK信号途径相关的肿瘤、炎症及神经系统疾病等；

本发明的另一目的在于提供检测待测样品中的上述多核苷酸或多肽的表达水平是否变化的方法；

本发明的另一目的在于提供一种单克隆或多克隆抗体，其与上述的多肽或其具有抗原性的片段特异性结合。

本发明的上述目的是通过如下技术方案来实现的：

在本发明的第一方面提供了一种分离的人细胞因子，该细胞因子包含与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列有至少70％同源性的多肽序列。较佳地，该细胞因子含有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列。

在本发明的第二方面提供了一种分离的多核苷酸，其序列选自下组：

(a)编码如权利要求1所述多肽的多核苷酸；

(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。

较佳地，该多核苷酸编码具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽。

较佳地，该多核苷酸的序列具有SEQ ID NO：1的编码区序列或全长序列。

如SEQ ID NO：2所述的氨基酸序列为NS128的氨基酸序列，定位于22q13.2。NS128基因编码一个229个氨基酸的蛋白质，分子量23.6kD，等电点9.4。该蛋白最大的特点是具有分泌肽序列，Signal P分析有明显的信号肽，为N端的22个氨基酸，且具有两个糖基化位点，TMHMM分析无跨膜区。

在本发明的第三方面提供了一种基因工程载体，它含有上述编码核苷酸。

在本发明的第四方面提供了一种遗传工程化的宿主细胞，它含有上述载体，经上述基因工程载体转化、转染或转导得到。

在本发明的第五方面提供了一种制备上述分离的人细胞因子的方法，该方法依次包括如下步骤：

(a)将编码具有人细胞因子活性的多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成该细胞因子表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO：1中的105-794位核苷酸序列有至少70％同源性；

(b)将步骤(a)中的表达载体转入宿主细胞，形成细胞因子的重组细胞；

(c)在适合表达细胞因子多肽的条件下，培养步骤(b)中的重组细胞；

(d)分离出具有细胞因子活性的多肽。

较佳地，该制备人细胞因子的方法中所述核苷酸序列为SEQ ID NO：1中的105-794位的核苷酸。

在本发明的第六方面提供了一种多肽，该多肽包含：

(a)如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，或如SEQ ID NO：2的21-36位和/或213-228位氨基酸所示的多肽；

(b)与(a)具有至少70％同源性的多肽，该多肽的功能与(a)的功能相同。

在本发明的第七方面提供了能够抑制上述细胞因子表达的小干扰RNA，该RNA序列选自si-1：5′-CCAGACAGGCGUCUUCAAC-3′和si-2：5′-CUUCCAGAACCCAUUUAAA-3′两条序列中的任意一条。

在本发明的第八方面提供了一种药物组合物，该药物组合物含有本发明的多核苷酸、载体、宿主细胞、多肽、或小干扰RNA或其药物可接受的盐，以及一种或一种以上药物可接受的盐或药学上可接受的载体或赋型物。

在本发明的第九方面提供了上述细胞因子或者其编码核苷酸或者抑制其表达的小干扰RNA在制备预防和/或治疗肿瘤、感染、造血功能障碍、自身免疫病等的药物中的应用，尤其是MAPK信号途径相关的肿瘤、炎症及神经系统疾病等。所述核苷酸序列为SEQ ID NO：1中的105-794位核苷酸。

在本发明的第十方面提供了检测待测样品中的上述多核苷酸或多肽的表达水平是否变化的方法。

在本发明的第十一方面提供了一种单克隆或多克隆抗体，其与上述的多肽或其具有抗原性的片段特异性结合。

本发明的其它方面由于本文的技术的公开，对本领域技术人员而言是显而易见的。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多核苷酸或多肽如果从天然状态中与共同存在的其它物质分开，则为分离纯化的。这样的多核苷酸可能是某一载体的一部分，也可能这样的多核苷酸或多肽是某一组合物的一部分，既然载体或组合物不是它们的天然环境的成分，这些多核苷酸或多肽仍然是分离的。

如本文所用，“相似性”是指核苷酸或多肽序列比对过程中用来描述检测序列和目标序列之间相同DNA碱基或氨基酸残基顺序所占比例的高低，是一种直接的数量关系，通过部分相同或相似的百分比来度量核苷酸序列或者多肽序列之间相似的程度，此相似性百分比可以通过本领域已有的比对方法来计算，例子有两两序列间的比对方法FASTA程序(Pearson，W.R.and Lipman，D.J.1988.Improved tools for biological sequence comparison.Proc.Natl.Acad.Sci.85：2444-2448)，BLAST程序(Altschul，S.F.，et al.1990 Basic local alignment search tool.J.Mol.Biol.215：403-410)等，或多序列比对方法CLUSTALW(CORPET，F.1998Multiple sequence alignment withhierarchical clustering.Nucleic Acids Res.，16：10881-10890)等。同源序列是指从某一共同祖先经趋异进化而形成的不同序列，根据相似性百分比可以判断比对序列间的同源性。当基因或蛋白质间相似程度很高时，表示它们具有一段共同的进化历程，从而判断它们会具有相似的生物学功能。当具有至少50％的相似程度时，比较容易推测检测序列和目标序列可能是同源序列。较佳地，具有至少70％的相似程度；更佳地，具有至少85％的相似程度；最佳地，具有至少90％的相似程度。而当相似性程度低于20％时，就难以确定或者根本无法确定其是否具有同源性。

本发明的多核苷酸包括其互补链可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。本发明所述的反义链可以为如SEQ m NO：1所示的序列的互补序列。本领域普通技术人员已知，反义链或者其一部分(反义寡核苷酸)可用于抑制细胞内本发明NS128的表达。本发明的NS128的核苷酸序列可以来自任何物种，特别是哺乳动物，包括牛、羊、猪、鼠、马，优选人类。

如本文所用，“编码一种新的人类分泌性细胞因子多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码序列和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，它编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。该多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明还涉及与本发明所述多核苷酸序列的互补序列杂交且两个序列间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与此多核苷酸序列的互补序列可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在95％以上，更好的是在97％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与本发明所述的多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明的多核苷酸序列能用本领域已有的方法获得。这些技术包括但不局限于：(1)通过杂交技术分离DNA序列；(2)人工化学合成DNA序列；(3)通过构建cDNA文库大规模获得所需的多核苷酸；(4)PCR扩增技术。

第一种方法是先构建基因组文库或者cDNA文库，然后通过分子杂交等技术从基因组文库或cDNA文库中筛选出目的基因或序列。当生物基因组比较小时，此方法较易成功；当生物基因组很大时，构建其完整的基因组文库较困难，再从庞大的文库中去克隆目的基因的工程量也很大。

第二种方法是按设计好的序列一次合成100-200bp长的DNA片段，再用这些合成的片段组合连接成完整的基因。这种合成长的基因序列的方法的价格十分昂贵。此方法主要用于合成作为引物、接头等的核酸片段。

第三种方法是用本领域通常的方法构建cDNA文库，多次测序后，结合生物信息学分析技术(Ota et al.Nat Genet.2004 Jan；36(1)：40-5)，大规模获得目的cDNA克隆。生物信息学分析技术包括但不限于用BLAST或BLAT与已有的公共数据库比对，如refseq数据库等；用Phred算法评估测序质量；用计算转录起始密码子ATG的出现概率的ATGpr算法筛选全长cDNA序列等。

第四种方法用PCR技术扩增DNA/RNA的方法(Saiki，et al.Science 1985；230：1350-1354)。用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。本发明优选应用的方法是两步法通量化RT-PCR技术在混合cDNA文库中扩增得到大量的cDNA克隆。混合cDNA文库包括现有的cDNA文库和肿瘤文库。

本发明的基因，或者各种DNA片段等核苷酸序列的测定可用常规方法，如双脱氧链终止法(Sanger et al.PNAS，1977，74：5463-5467)；也可用商业测序试剂盒等。为了获得全长的cDNA序列，测序需要反复进行。有时需要测定多个克隆的cDNA序列，才能拼接成全长的cDNA序列。

本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽、半合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(如细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。本发明的多肽可以是糖基化的，也可以是非糖基化的。本发明的多肽可以包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还包括人类分泌性细胞因子并具有影响MAPK通路功能的多核苷酸编码的人蛋白多肽的片段、衍生物和类似物。术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持与本发明的天然的人类分泌性细胞因子并具有影响MAPK通路功能的人蛋白多肽相同的生物学功能或活性的多肽。本领域普通技术人员已知，本发明所述的多肽或其片段可以同其它的多肽或其片段形成融合多肽。其它多肽或其片段一般是已知的，有些可以以载体形式购买得到，或者可以按常规方法合成或从已知生物体中克隆得到。本发明的基因，或者各种DNA片段的核苷酸序列可以用常规方法，如双脱氧链终止法(Sanger等人，PNAS，1977，74：5463-5467)测定。这类核苷酸序列测定也可用商业测序试剂盒等。本发明的多肽片段、衍生物和类似物可以是：(a)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优先保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(b)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(c)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物)融合所形成的多肽，或(d)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列)。

本发明NS128多肽可按照Steward和Young(Steward，J.M.和Young，J.D.，Solid PhasePeptideSynthesis，2nd Ed.，Pierce Chemical Company，Rockford，III.，(1984))描述的方法用AppliedBiosystem合成仪或PioneerTM肤合成仪按固相化学技术合成，或者可使用衍生于本发明的DNA构建体的mRNA，在无细胞翻译系统中产生所需的多肽。也可按常规的生物工程方法由宿主细胞中的重组DNA序列编码产生多肽产物(Science，1984；224：1431)，包括以下步骤：

(1)用本发明的多核苷酸(或其变异体)，或用含有此多核苷酸的表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2)在合适的培养基中培养步骤(1)得到的宿主细胞；

(3)从培养基或细胞中分离、纯化所需的蛋白多肽。

本发明中的多核苷酸和多肽优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。

本发明也涉及包含本发明所述多核苷酸或其片段的基因工程载体。本发明中的多核苷酸序列可以插入到重组表达载体中。所述基因工程载体可以是普通载体、表达载体等。其中普通载体主要用于各种基因组文库和cDNA文库的建立，它们通常含有两个或两个以上的标记基因，其中一个基因用于选择转化体(transfonnant)，另一基因则是用于检查载体中是否有外源DNA插入。表达载体主要用于研究基因的表达或是用于大量生产一些有用的转录产物或蛋白质，有的也可用于cDNA文库的建立。这类载体除具有普通型载体的特征外，表达载体中应含有适当的启动子、核糖体结合位点、终止子等。为了便于表达产物在细胞中定位，在多肽编码序列上游可加入适当的前导序列。合适载体和启动子的选择为本领域普通技术人员周知。本领域普通技术人员周知用于构建含有本发明的多核苷酸以及合适的转录及翻译调控组件之载体的方法。具体地说，术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒，如腺病毒、逆转录病毒，或者其它载体。在本发明中适用的载体可以是原核表达载体，也可以是真核表达载体。适用于原核细胞的市售表达载体一般均带有可选择标志和细胞复制原点，带有lad、T7(Rosenberg，et al.Gene，1987，56：125)、λPL和trP等细菌启动子，以及已知克隆载体pBR322(ATCC 37017)的其它遗传组件。这样的市售载体包括pGEM(Promega)和pKK223-3(Phannacia)可根据所选用的适当启动子和待表达的结构基因序列来选择衍生于pBR322的适当载体。GST原核表达系统也可用于本发明。适用于真核细胞的载体带有真核细胞启动子如CMV、SV40等，这样的载体包括pMT-hILr3(马大龙，狄春辉，庞健等(1991)高技术通讯11：26-29)，pQE-9(Qiagen)、pD10、pNHI 8A(Stratagene)、pKK233-3、pDR540、pRrr5(Pharmacia)，以及pcDNA^TM3.1/myc-hisB(-)(Invitrogen)、pCI、pWLNEO、pSG(Stratagene)、pSVL(Pharnlacia)、pcDNA3.1/V5-His-TOPO(Invitrogen，以下缩写为pcDT)。本发明优选pcDT，它可以直接与PCR产物连接来构建真核表达载体，大大提高了规模化生产的效率。只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以应用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制组件。用本领域的技术人员熟知的方法来构建含有本发明所述多核苷酸序列和转录/翻译控制信号的表达载体即可。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组DNA技术等(Sambrook，et al.Molecular Cloning，a Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory.New York，1989)。

本发明的多核苷酸序列可有效地连接到表达载体中的适当的启动子上来指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体的P_L启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其它一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。表达载体优选的包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性、或真核细胞培养用的绿色荧光蛋白(GFP)、新霉素抗性及二氢叶酸还原酶。

本发明还涉及用上述载体或者本发明的多核苷酸经基因工程产生的适于表达本发明多肽宿主细胞。本发明的载体和多核苷酸可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达人类分泌性细胞因子并具有抑制MAPK通路功能的蛋白质。该宿主包括但不限于：原核宿主，诸如大肠杆菌、芽孢杆菌属、链霉菌属等；真核宿主，诸如：酵母属、曲霉属、昆虫细胞，诸如果蝇S2和草地夜蛾Sf9；植物细胞；动物细胞，如CHO、COS(猴肾成纤维细胞系，Gluzman(Cell 23：175，1981))或Bowes黑素瘤细胞、293T、HeLa细胞及其它的能表达相容载体的细胞系。

本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常有10-300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。例子有：在复制起始点下游的100-270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点下游的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。

本领域的普通技术人员都知道如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞及将含有本发明的多核苷酸的构建体导入上述宿主细胞的方法，包括但不限于：氯化钙介导的转化、磷酸钙转染、DEAE-15葡聚糖介导的转染、电穿孔、显微注射、粒子轰击法或基因枪方法(Sambrook，J.(1989)，Molecular Cloning，a Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press)，在适当的培养条件与培养基中培养经转化的宿主菌株或细胞，使其生长到恰当的细胞密度之后，用适当的方法(例如温度转变或化学药品诱导)诱导所选择的启动子，并将细胞再培养一段时间。针对不同的宿主菌株或细胞以及所表达的目的多肽的性质选择相应的培养条件和培养基在本领域技术人员知识范围之内。当宿主细胞为原核细胞如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收集，用CaCl₂法处理，所用步骤是本领域众所周知的。可供选择的是MgCl₂处理，也可用电穿孔的方法处理。当宿主是真核细胞时，可选择以下转染方法：磷酸钙共沉淀法、常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。获得的转化子可以用常规方法培养，来表达本发明的多核苷酸所编码的多肽。根据所选的宿主细胞选择合适的常规培养基，在适于宿主细胞生长的条件下培养。在本发明的实施例中使用的宿主细胞例如：大肠杆菌BL21，HeLa细胞(ATCC CCL-2)和293T细胞(ATCC CRL-11268)等。

本发明还提供一种生产多肽的方法：在适于表达的条件下，培养含有编码本发明多肽的多核普酸或其片段的宿主细胞；从所述细胞培养物中获得多核苷酸编码的多肽。上述方法中的重组多肽可包被于细胞内、细胞外或在细胞膜上表达或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组多肽。具体地说，在转化宿主细胞并在被转化的宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用适当的方法(如温度变动或化学特质诱导)诱导启动子，然后继续培养。培养完成后，可用离心法收集细胞，并用任何已知的方法，这些方法是本领域技术人员所熟知的，如冻融法、超声处理法、渗透破菌、溶菌酶溶解法或机械破碎法破碎细胞。可以用各种已知的方法从宿主细胞培养物中回收和纯化本发明的多肽或其片段或融合多肽，这些方法包括硫酸铁或乙醇沉淀法、酸萃取法、超离心、超滤法、离子交换层析法、磷酸纤维层析法、疏水相互作用层析法、凝胶过滤法、亲和层析法、高效液相层析和其它各种液相层析技术或这些方法的结合。

本发明还涉及与本发明多核苷酸的任何一部分同源的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含有15个核苷酸，较好的是至少30个核苷酸，更好的是至少50个核苷酸，最好的是至少100个核苷酸。此核酸片段通常是在本发明的核苷酸序列信息的基础上化学合成的DNA序列。上述核酸片段可以用于PCR扩增技术(如作为引物)以确定和/或分离编码人类分泌性细胞因子并具有抑制MAPK通路功能的多核苷酸；也可以作为杂交所用的探针。也可以用于RNA干扰技术。本发明的多核苷酸的一部分或全部也可作为探针固定在微阵列(Microarray)或DNA芯片上，用于分析组织中基因的差异表达和基因诊断。探针的标记可用放射性同位素，荧光素或酶(如碱性磷酸酶)等。至于这些片段是否编码多肽或编码的多肽是否具有本发明的多肽的功能，对于检测、杂交和/或抑制表达这些用途来说并不是特别重要。

本发明提供一种药物组合物，其含有本发明治疗有效量的多核苷酸、载体、宿主细胞或多肽或其药物可接受的盐；和必要时药学上可接受的载体或赋型剂。在所述药物组合物中，可以含有本发明治疗有效量的多核苷酸或其功能片段(与其具有相同功能的片段)、含有其的载体、含有其的宿主细胞或多肽，也可以以所述多核苷酸或多肽的药物可接受的盐形式使用。“药物可接受的盐”指适于与人或动物的组织接触，而无过多的毒性、刺激、变态反应等的盐。本发明的药物可接受的盐是本领域药剂学常规组分。这种盐可以在本发明多肽的最终分离和纯化的过程中制备，也可以将多肽与适当的有机或无机酸或碱反应单独制备。药学上可接受的载体或赋型剂指无毒固态、半固态或液态填充剂、稀释剂、包囊材料或其它制剂辅料，如水、葡萄糖、乙醇、盐类、缓冲液、甘油及它们的组合。药物组合物可以以方便的方式给药，如通过局部、静脉内、腹膜内、肌内、皮下、鼻内或皮内的给药途径。给药于患者的用量取决于许多因素，如给药方式、待治疗者的健康条件和诊断医生的判断。

本发明的多肽也可以通过在活体表达这些多肽来使用。例如患者的细胞可以通过在体外用编码本发明多肽的基因进行基因工程操作，然后将工程细胞提供给患者，使工程细胞在体内高表达这种多肽，从而达到治疗的目的。

抑制本发明多肽mRNA的寡聚核苷酸(包括反义RNA和DNA)以及核酸也在本发明的范围之内。反义RNA和DNA以及核酸可用本领域已有的方法合成。为了增加核酸分子的稳定性，可用多种方法对其进行修饰，如增加两侧的序列长度，核糖核苷间的连接用磷酸硫酯键或肽键。

发明还提供一种体外检测来自待测者的样品中本发明所述的多核苷酸或多肽的表达水平是否变化的方法，该方法包括：检测待测样品中所述多核苷酸或多肽的表达水平；将待测样品中所述多核普酸或多肽的表达水平与正常样品的多核苷酸或多肽的表达水平进行比较；确定待测样品中多核普酸或多肽的表达水平是否变化。

所述正常样品可以从已知未患病的正常人的细胞获得，该细胞应与待测样品细胞的组织来源一致；正常样品的多核苷酸的表达水平可以是从所述正常人的细胞获得的具有统计学意义的多核苷酸的表达水平。其中所述检测待测样品中多核苷酸水平的方法可以为上述任何检测方法，优选利用RT-PCR检测所述多核苷酸在核酸水平的表达水平；或利用特异性单克隆或多克隆抗体检测所述多核苷酸在蛋白质水平的表达水平，例如免疫组织化学检测。所述待测样品可以从来自受试者的细胞获得，如来自血液、尿、唾液、冒液、头发，活组织检查和尸体解剖材料的细胞。优选为待测者的辜丸组织样品或血液样品。在本发明的具体实施例中，利用抗NS128多克隆抗体，在包含18种组织的组织芯片中检测了NS128的表达情况，免疫组织化学的结果提示在胃、睾丸、前列腺和肾等正常组织和肿瘤组织均有阳性表达。

本发明还提供对本发明NS128多肽或其片段具有特异性的多克隆和单克隆抗体。这里所述的“特异性”是指抗体能结合于本发明的NS128基因产物或片段。优选那些能与本发明的NS128的基因产物结合但不识别并不与其它非相关抗原分子结合的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制本发明NS128基因产物的抗体，也包括那些并不影响本发明NS128多肽功能的抗体。上述抗体不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab片段和Fab表达文库产生的抗体；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人，美国专利No.4,946,778)；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。本发明的多肽的抗体可用本领域公知的抗体制备方法来生产。例子有；单克隆抗体可用杂交瘤技术生产(Kohler and Milstein.Nature，1975，256：495-497)。多克隆抗体的生产可用本发明的多肽免疫动物，如家兔、小鼠、大鼠等。在本发明的一个实施方案中(参见实施例八)，以抗原性较强的NS128 N端和C端氨基酸(SEQ ID NO：2的氨基酸序列21-36和213-228)为例，制备多克隆抗体，经ELISA法检测抗体效价，Western blot鉴定抗体特异性，证实得到效价高、特异性好的抗体，可将该抗体进一步用于NS128的表达谱分析和功能研究。多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂。将人恒定区和非人源的可变区结合的嵌合抗体可用已有的技术产生(Morrison et al.PNAS，1985，81：6851)。单链抗体也可用已有的技术生产(U.S.Pat No.4946778)。本发明的各类抗体可以利用本发明的多肽及其片段、衍生物、类似物或表达它们的细胞作为抗原，通过常规免疫技术获得，这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与本发明NS128多肽的基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的多肽或多肽，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。

本发明还公开了该细胞因子的多核苷酸或多肽或小干扰RNA在制备预防和/或治疗肿瘤、感染、造血功能障碍、自身免疫病等的药物中的应用，尤其是MAPK信号途径相关的肿瘤、炎症及神经系统疾病等。

发明人利用pcDB-NS128真核细胞转染上清及重组人NS128蛋白进行功能研究，RT-PCR实验显示在淋巴细胞不同活化状态下NS128mRNA表达水平有所变化，提示NS128在免疫调节中发挥一定的作用。外周血计数、MTT及淋巴细胞转化实验可以看出NS128对淋巴细胞增殖有一定影响作用，并可能在T淋巴细胞发育和B淋巴细胞成熟过程发挥一定的作用，并且促进T淋巴细胞的活化。ELISA、Western Blot及免疫组化实验检测到NS128基因在大部分实验中所用到的正常组织、胎儿组织、肿瘤组织都有表达，说明其为人体自身重要的一个细胞因子；在不同的组织中表达量高低有差别，说明其在不同的组织中发挥功能的程度不同。特别是在外周血淋巴细胞(PBL)培养上清中的表达与PBL密切相关，进一步提示NS128在免疫系统中发挥重要作用，可能介导T、B淋巴细胞的发育、活化以及免疫调节过程，同时可能影响巨噬细胞抗细菌免疫的功能，。同时，报告基因检测及Western Blot实验表明NS128参与MAPK信号转导通路，抑制JNK和ERK相关的信号转导途径，并有可能在MAPK信号途径相关的肿瘤、炎症及神经系统疾病等中发挥重要作用。

本发明的NS128是一分泌蛋白，可由生殖系统和造血系统细胞、白细胞等多种细胞产生，并在免疫系统中发挥重要调控作用。因此，NS128具备了细胞因子的结构和功能特点，可能作为一个细胞因子发挥其重要功能。在制备预防和/或治疗肿瘤、感染、造血功能障碍、自身免疫病，尤其是MAPK信号途径相关的肿瘤、炎症及神经系统疾病等方面具有潜在的临床应用价值。

附图说明

图1为pGEM-T Easy载体克隆NS128基因的示意图，其中三角图标为插入NS128基因cDNA片段处。

图2A为pFR-luc荧光素酶基因报告质粒的结构图；图2B为pFA2-Elk1反式作用因子报告质粒的结构图；图2C为pRL-TK报告质粒结构图。

图3为构建NS128的真核表达载体pcDNA3.1/mycHis(-)B-NS128的示意图。

图4A为pcDB-NS128、pcDB在293T细胞的荧光素酶活性的分析结果；图4B为pcDB-NS128、pcDB在HeLa细胞的荧光素酶活性的分析结果。

图5为NS128基因的Northern blot分析。

图6为NS128基因的RT-PCR分析。其中pos，为质粒的阳性对照；293，人胚胎肾细胞系；293T，转化大T抗原的人胚胎肾细胞系；Jurkat，人T淋巴瘤细胞系；MDA，人乳腺癌细胞系；MCF7，人乳腺癌细胞系；HL60，人白血病细胞系，Raji，人B淋巴瘤细胞系；HepG2，人肝癌细胞系；HT29，人大肠癌细胞系；A549，人肺腺癌细胞系；HeLa，人宫颈癌细胞系；HeLa S3，人宫颈癌细胞系。

图7为HeLa细胞转染siRNA后RT-PCR分析；

图8为HeLa细胞转染siRNA后pEGFP-N1-NS128蛋白表达效率的流式细胞仪分析。

图9为细胞周期检测结果。

图10为细胞计数结果。

图11A为p-ERK和ERK在293T细胞内的检测结果；图11B为p-JNK和JNK在293T细胞内的检测结果。

图12为NS128分泌肽的氨基酸序列，阴影部分显示。

图13为NS128在其它物种中的同源物分析。

图14为pcDB-ΔNS128(A)、pEGFP-N1-ΔNS128(B)和pEGFP-C3-ΔNS128(C)的真核细胞表达质粒结构图。

图15为pcDB-NS128(A)、pEGFP-N1-NS128(B)和pEGFP-C3-NS128(C)的真核细胞表达质粒结构图。

图16为Western Blot检测NS128蛋白的超表达情况。

图17为NS128的N端测序验证结果。

图18为pcDB-NS12g、pcDB-NS128(tag)和pcDB的荧光素酶活性的分析结果。

图19为NS128在外周血cDNA文库中的RT-PCR结果。

图20为外周血细胞计数统计结果：WBC为白细胞，LY为淋巴细胞，MO为单核细胞，GR为粒细胞。

图21为脾称重结果和淋巴细胞增殖实验结果。

图22为CD19和CD25分子的流式细胞仪检测结果。

图23为ELISA检测NS128在外周血淋巴细胞(PBL)培养上清中的表达。

图24为Western Blot检测NS128在外周血淋巴细胞(PBL)培养上清中的表达。

具体实施方式

下面通过具体的实施例并结合附图对本发明作进一步详细的描述。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法通常按照常规条件进行，如《分子克隆实验指南》(2002年第三版[美]萨姆布鲁克等箸，科学出版社)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例一、NS128基因的cDNA的克隆

通过生物信息学分析，发现UniGene：Hs.474991，其对应基因为FLJ22349，Ref：NM_024821，GeneID：79879，为一未知功能人类新基因，利用Human_est数据库通过BLASTn方法进行序列校正无误，最终得到的序列设定为SEQ ID NO：1。根据该序列设计NS128基因全长阅读框架的特异引物：

正向引物5’-CTGCTCGCACAGGACTCGG-3’

反向引物5’-CAGATCCCAGTCTGAGTTATAGCCC-3’

用上述引物，以人正常肺组织cDNA文库(Clontech：K1420-1)为模板进行PCR扩增反应，反应条件如下：

反应体积50μl，其中含有：

反应温度、时间：94℃，变性5分钟；然后94℃变性30秒，54℃退火30秒，72℃延伸1分钟，扩增30个循环；最后在72℃下延伸10分钟。

扩增产物为3’有碱基A的3’突出粘端片段，用QIAquick胶回收试剂盒(Qiagen，28706)按产品说明书进行纯化，然后与3’有碱基T的线性pGEM-TEASY载体(Promega，A1360)在16℃下连接8小时，使用2mm电极杯，2500V转化大肠杆菌DH5α，转化物在含氨苄青霉素的LB平板培养基上生长，挑选克隆，提取质粒，使用AbI PRISM 3700 DNA分析仪(Perkin-Elmer/Applied Biosystem)测序，获得NS128基因的cDNA 758bp，其中ORF全长690bp，编码229个氨基酸。将含有序列SEQ ID NO：1的NS128的cDNA基因的pGEM-T EASY载体命名为pGEM-T-NS128(图1)。

实施例二、NS128对反式作用因子Elk1抑制作用的检测

本实施例采用双荧光素酶报告基因法检测NS128基因对反式作用因子Elk1抑制作用功能，该方法采用的是体内信号转导途径反式报告系统，其中所用的pFR-luc报告质粒载有萤火虫荧光素酶基因，该基因的表达由合成的启动子所调控，其中包含基本的启动子组件(TATA box)，以及GAL4的上游活化区(UAS)，pFA2-Elk1质粒含有GAL4的DNA结合部位和转录因子Elk1的结合位点，pFR-luc、pFA2-Elk1和pRL-TK报告质粒的结构图如图2A、2B和2C所示。当细胞内的Elk1通过某种信号转导途径而被活化时，Elk1便会结合于报告质粒pFA2-Elk1的增强子组件，从而启动报告基因萤火虫荧光素酶基因的转录，进一步胞内翻译成荧光素酶，导致细胞内荧光素酶数量增加，活性增强；相反，当细胞内的Elk1活化受到抑制的时候，荧光素酶的表达量及活性就低。所以，通过检测荧光素酶的活性，便可以反映不同刺激物以及共转染的目的基因对细胞内Elk1是否具有活化或者抑制活化的功能。pRL-TK报告质粒载有水母荧光素酶基因，该基因的表达由TK增强子/启动子所调控，转染哺乳动物细胞后可以产生较强的基本水平的水母荧光素酶的表达，且表达的活性不受Elk1活化与否的调节，所以在实验中用作内对照报告基因。

为了检测NS128对Elk1的抑制功能，首先构建含有NS128 cDNA的真核表达载体：pcDNA3.1B-NS128(以下缩写为pcDB-NS128)。采用真核表达载体pcDNA3.1/MycHis(-)B(Invitrogen，V85520，以下缩写为pcDB)与NS128基因重组构建真核表达载体pcDB-NS128。pcDB是设计用于重组蛋白在哺乳类动物细胞系中高表达的载体，它含有人巨细胞病毒CMV启动子，可在哺乳类动物细胞系中实现高表达。

1、NS128基因真核表达质粒的构建

用EcoRI(Promega)将NS128的cDNA基因片段从pGEM-T-NS128载体上切下，同时用EcoRI酶切真核表达载体pcDNA3.1/mycHis(-)B(Invitrogen，V85520)(图3)，将酶切后的NS128的cDNA基因片段与载体在16℃下连接8小时，转化大肠杆菌DH5α，转化物在含氨苄青霉素的LB平板培养基上生长，挑选生长的菌落，提取质粒，用EcoRI酶切，酶切产物用琼脂糖凝胶电泳鉴定，挑选有插入690bp片段的阳性克隆，通过测序(使用ABI PRISM 3700DNA分析仪，同上)，选出正确的正向插入序列1的NS128的cDNA基因质粒，命名为pcDB-NS128(此真核表达质粒不带有c-myc和his标签)。

2、双荧光素酶报告基因法测定NS128对反式作用因子Elk1抑制作用

用目的基因pcDB-NS128和报告基因pFA2-Elk1(Stratagene，219005)、pFR-luc(Stratagene，219005)，pRL-TK(Promega，E2231)共转染293T和HeLa细胞，通过分别检测两种萤光素酶活性来测定Elk1的活性。共转染的方法分别为阳离子转染法和电穿孔转染法，采用(Invitrogen，11668027)，按产品说明书所述进行。

阳离子转染操作步骤如下：

(1)细胞培养：将293T细胞(SV40T抗原转化HEK293所得细胞系，为Dr.Tadashi Matsuda馈赠)(2.0×10⁴个)用含10％胎牛血清的DMEM(Dulbecco′s modified Eagle′s medium)培养基(Hyclone，SH0022.02)铺在96孔细胞培养板(Costar，3599)上，在5％CO₂，37℃的培养箱中培养24小时。

(2)制备DNA-vigofect复合物：用5μl PBS稀释45ng pFA2-Elk1和5ng pFR-luc，5ng pRL-TK和50ng pcDB-NS128，缓慢混合均匀；同样用5μl PBS稀释0.05μl VigoFect，缓慢混合均匀，在室温下放置5分钟后，与稀释的DNA缓慢混合，室温放置15分钟，以形成DNA-VigoFect复合物。

(3)转染：将DNA-VigoFect复合物缓慢滴入细胞培养板(10μl/孔)，轻微摇匀。5％CO₂，37℃的培养箱中培养36小时。

电穿孔转染操作步骤如下：

(1)细胞培养：将HeLa细胞(ATCC Number：CCL-2)用含10％胎牛血清的DMEM(Dulbecco′smodified Eagle′s medium)培养基(Hyclone，SH0022.02)以4.0×10⁵个/10mm平皿传代，在5％CO₂，37℃的培养箱中培养24小时。

(2)转染：消化HeLa细胞，用无血清RPMI 1640培养基洗细胞2遍，调整细胞浓度为2-5×10⁶/ml，取细胞300μl/样品，加4.5μg pFA2-Elk1和0.5μg pFR-luc，0.5μg pRL-TK和5μgpcDB-NS128，混匀后移入2mm电转杯，电击条件120v，20ms；转染后室温放置10分钟，吸出并重悬于2-5ml含10％胎牛血清的DMEM培养基中，铺于24孔细胞培养板，细胞浓度为5×10⁴个培养6-8小时细胞贴壁后更换新鲜的培养基。

36小时后分别在培养基中加入PMA(终浓度为50ng/ml)和离子霉素(终浓度为20μM)刺激293T和HeLa细胞，4小时后弃去培养基，加入Reporter Lysis Buffer(Promega，E4030)，在-80℃下放置30分钟，取出后在室温自然融化，使细胞裂解，然后将细胞裂解液移入荧光板(Gronier，655075)，用Dual-Luciferase Reporter Assay System 10-Pack(Promaga，E1960)，通过Fluostar OPTIMA(BMG Labtechnologies)检测萤光素酶活性。

设定转染空载体pcDNA3.1/mycHis(-)B细胞内的荧光素酶活性比值(萤火虫荧光素酶荧光强度/水母荧光素酶荧光强度表示)为1，其它条件下细胞内的荧光素酶活性比值以此为标准，用相对值表示。结果如图4A和4B所示，表明转染NS128之后，未刺激组NS128抑制效应不明显，而刺激组荧光素酶活性比值达到0.52，刺激阳性对照MEKK为9.087，说明NS128能在报告基因水平上抑制Elk1。图中的数据为三次重复试验所得的结果，pcDB表示转染空载体pcDNA3.1/mycHis(-)B的细胞，MEKK为转染MEKK的细胞，NS128为转染pcDB-NS128的细胞。

实施例三、检测NS128在细胞系和组织中的表达水平

为了证明NS128在细胞系和组织中的mRNA表达水平，本实施例提取了细胞系和组织中的mRNA，利用RT-PCR和Northern Blot来检测。

1、Northern Blot检测组织中mRNA表达水平

用NS128特异性上游引物5’-CTGCTCGCACAGGACTCGG-3’和下游引物5’-CTCAGACTGGGATCTGGAG-3’，PCR扩增NS128 ORF，琼脂糖凝胶电泳回收纯化后，使用随机引物标记试剂盒标记荧光素，作为探针。同样PCR扩增并标记GAPDH探针。使用Trizol(Invitrogen)从人的脑、心、睾丸、胎盘、肌肉、肺正常组织提取总RNA。每种组织取样20μg，电泳分离后转至尼龙膜。经预杂交后，加入上述探针65℃杂交过夜。使用洗液I(300mmol/L NaCl，2×SSC，0.1％SDS)室温洗涤3次，每次30分钟。再用洗液II(0.2×SSC，0.1％SDS)50℃洗涤3次，每次15分钟。之后将膜与碱性磷酸酶标记的抗荧光素抗体孵育，再经底物显色后采集图象。

2、RT-PCR检测细胞系和正常组织及肿瘤组织中mRNA表达水平

收集12种细胞，提取总RNA。每个样品取2μg，用Reverse transcript^TM kit(Invitrogen)逆转录合成单链cDNA文库。使用上游特异性的引物(5’-CTGCTCGCACAGGACTCGG-3’)与下游特异性的引物(5’-CTCAGACTGGGATCTGGAG-3’)，进行PCR扩增，扩增条件为94℃(5分钟)→94℃(30秒)，59℃(30秒)，72℃(30秒)，扩增8个循环，→94℃(30秒)，57℃(30秒)，72℃(30秒)，扩增8个循环→94℃(30秒)，55℃(30秒)，72℃(30秒)，扩增32个循环→72℃(7分钟)。使用5’引物(5’-TGAAGGTCGGAGTCAACGGA TTTGGT-3’)与3’引物(5’-CATGTGGGCCATGAGGTCCACCAC-3’)扩增GAPDH作为内参，扩增条件为94℃(5分钟)→94℃(40秒)，58℃(40秒)，72℃(40秒)，扩增20个循环→72℃(7分钟)。同时使用购买的clontech正常组织和肿瘤组织的cDNA文库进行NS128PCR扩增。

实验结果如图5和图6所示，NS128基因在实验中大部分用到的细胞及正常组织、胎儿组织、肿瘤组织都有表达，说明其为人体自身重要的一个细胞因子；在不同的组织中表达量高低有差别(睾丸、胎盘、白细胞等正常组织及肾脏等肿瘤组织高表达)，说明其在不同的组织中发挥功能的程度不同。

实施例四、NS128转染HeLa细胞和293T细胞的功能实验

1、筛选有效的NS128siRNA

由上海吉凯公司帮助设计并化学合成3对针对NS128基因的siRNA，分别编号si-1(5′-CCAGACAGGCGUCUUCAAC-3′)，si-2(5′-CUUCCAGAACCCAUUUAAA-3′)，和si-3(5’-AGAGAACGCCGAAAGAAA-3′)。这三条siRNA的序列都位于NS128基因的ORF内。使用siNonsilence(5′-uucuccgaacgugucacgu-3′)作无义对照。首先通过RTR-PCR检测RNA水平的抑制效率，siRNA转染HeLa细胞后40小时收获细胞，弃去细胞培养基，加入trizol提取细胞RNA，逆转录合成单链cDNA文库，进行NS128RT-PCR扩增，如图7所示，si-1的抑制效果很好，si-2也有抑制作用，但是效果不如si-1，而si-3无抑制效果。

接下来通过共转染siRNA与pEGFP-N1-NS128质粒，从蛋白质水平检测抑制效率，实验中使用针对GFP分子的siGFP(5′-gcaagcugacccugaaguuc-3′)作为阳性对照。HeLa细胞转染后48小时收获，并通过流式细胞术检测NS128-GFP蛋白的表达效率。如图8所示，M1为NS128-GFP阳性细胞，结果si-1的抑制效果好，si-2也有抑制作用，但是效果不如si-1；si-3没有明显的抑制作用。

2、NS128转化HeIa细胞的体外实验

Hela细胞系是人宫颈癌细胞系，将NS128转染HeLa细胞后观察细胞的表型变化。

(1)细胞周期检测实验

Hela细胞电穿孔转染方法同实施例二。电穿孔前处理细胞的步骤同前，加入质粒10μg和siRNA20μM，混匀后移入2mm电转杯，电击条件120v，20ms；转染后室温放置10分钟，吸出并重悬于2-5ml DMEM培养基中，铺于12孔细胞培养板，细胞浓度为4.0×10⁵个，培养6-8小时细胞贴壁后更换新鲜的培养基，在5％CO₂，37℃的培养箱中培养。分别于24、48、72小时收集细胞。弃去细胞培养基，用冰预冷的1×PBS洗一遍，加入0.25％胰酶+EDTA消化细胞，用冰预冷的1×PBS吹下消化好的细胞，将细胞收集到流式管中，于4℃，1200g离心3分钟。去除上清，用冰预冷1×PBS洗两遍，每次于4℃，1200g离心3分钟，最后去除洗液，在细胞中加入冰预冷的600μl 1×PBS悬起细胞，在振荡器上逐滴加入无水乙醇1.4ml至终浓度为70％乙醇，用封口膜封住流式管口，置于4℃固定过夜。收集细胞周期前用冰预冷1×PBS洗两遍，每次于4℃，1200g离心3分钟，最后去除洗液，在细胞中加入冰预冷的200μl 1×PBS悬起细胞，并加入10μl的RNA酶(终浓度为10μM)置于37℃，30分钟消化RNA，用200目筛网过滤细胞，去除成团细胞以防阻塞流式细胞仪。进行流式细胞术分析前加入终浓度为1μg/ml的碘化丙啶。收获2×10⁴个细胞，然后用软件进行细胞周期的数据分析。结果如图9所示，表明转染NS128基因与转染对照质粒pcDB的细胞细胞周期无明显变化；而转染NS128 siRNA的细胞在48小时S期细胞明显高于转染siNonsilence的S期细胞。

(2)细胞计数实验

Hela细胞电穿孔转染方法同细胞周期检测实验，分别收集24孔板的8小时(即细胞贴壁换液时为0时间点，保证细胞铺板时的一致性)、40小时和72小时的细胞，分别留取各组细胞上清，用冰预冷的1×PBS洗一遍，加入0.25％胰酶+EDTA消化细胞，用冰预冷的1×PBS吹下消化好的细胞，将细胞收集到计数杯中，保证细胞收集体积一致，上机用细胞计数仪检测。结果如图10所示，表明转入NS128基因后在48小细胞生长稍快于转染对照质粒pcDB的细胞生长速度；而转染NS128 siRNA的细胞在48小时细胞生长速度也稍快于转染siNonsilence的细胞生长速度，而在72小时各组间无明显差异。

3、NS128转染293T细胞的信号转导途径检测

293T细胞和HeLa细胞转染方法同以上实验。36小时后分别在培养基中加入PMA(终浓度为50ng/ML)和离子霉素(终浓度为20μM)刺激293T细胞，分别刺激15分钟和30分钟，同时设立未刺激组即0时间点，收取各实验组蛋白。MAPK/JNK和P38信号通路检测用紫外照射，能量为80mJ刺激，分别收取0、15、30分钟时间点。

细胞总蛋白的提取：将留取上清后的细胞置于冰上，用冰预冷的1×PBS洗一遍，加入0.25％胰酶+EDTA消化细胞，用冰预冷的1×PBS吹下消化好的细胞，将细胞收集到1.5mL离心管中，于4℃，2000g离心3分钟。去除上清，用冰预冷1×PBS洗两遍，每次于4℃，2000g离心3分钟，最后去除干净上清，在沉淀中加入细胞磷酸化裂解液(Cell Signaling)(蛋白酶抑制剂Cocktail现用现加)，冰上放置30分钟，4℃，15000g离心15分钟，上清转入新管，存于-80℃备用。

蛋白定量：细胞提取的蛋白按照BCATM Protein Assay Kit(Pierce，23227)说明书提供的方法进行蛋白定量。

Western Blot：每组细胞蛋白取30μg，每组细胞培养上清取30μl，加入蛋白上样缓冲液(北京宝赛生物技术有限公司)，于100℃水浴煮5分钟。12.5％PAGE电泳，100mV电转1小时，TBST液平衡，用5％BSA(牛血清白蛋白)室温封闭1小时，分别加入兔抗人pERK抗体(Cell signaling，1∶1000)、兔抗人ERK(Cell signalin1，1∶1000)和兔抗人pJNK抗体(Cell signaling，1∶1000)、兔抗人JNK(Cell signaling，1∶1000)作为一抗，，4℃过夜，TBST洗三次，每次10分钟，4℃反应过夜；用TBST充分洗膜3-5次，每次10分钟；然后加入相应的IRDye^TM 800标记的二抗(1∶10000)，室温避光反应1小时；再用TBST充分洗膜3次，每次10分钟；最后使用OdysseyInfrared Imager在800nm波长下检测信号，HeLa细胞和293T细胞内检测结果一致。

结果如图11所示，图11A中，上排为293T细胞中抗p-ERK抗体检测的结果，下排为ERK检测的结果；NS128组较pcDB组出现抑制作用，NS128siRNA组较siNon组出现增强效果；图11B中，上排为293T细胞中抗p-JNK抗体检测的结果，下排为JNK检测的结果，结果与pERK和ERK的结果一致，而NS128对P38信号通路未出现明显作用。

实施例五、检测分泌蛋白NS128的分析及检测验证

1、NS128的生物信息学分析

(1)NS128的蛋白质性质与结构分析：NS128基因编码一个229个氨基酸的蛋白质，其氨基酸序列如序列2所示，分子量23.6kD，等电点9.4，序列如SEQ ID NO：2所示。该蛋白最大的特点是具有分泌肽序列，Signal P分析有明显的信号肽，为N端的22个氨基酸(图12阴影部分氨基酸)，且具有两个糖基化位点，TMHMM分析无跨膜区。

(2)NS128在其它物种中的同源物分析：通过BLASTp比对，可以检索到的NS128在小鼠(Mus musculus)、大鼠(Rattus norvegicus)、狗(Canis familiaris)、家牛(Bos taurus)、黑猩猩(Pan troglodytes)、非洲蛙(Xenopus tropcalis)等物种中存在同源物，如图13说明NM128是一个比较保守的分子。并可利用NS128真核表达质粒进行小鼠动物实验。

2、真核细胞表达质粒的构建

(1)pcDB-ΔNS128、pEGFP-N1-ΔNS128和pEGFP-C3-ΔNS128真核细胞表达质粒的构建(图14A、B、C)：pcDB-ΔNS128使用带EcoRI酶切位点和起始密码子的5’引物(5’-gaa ttc atg tcc ctggac cca AGC-3’)与带有BamH I酶切位点但不带终止密码子的3’引物(5’-AGTAACTCAGACTGGG ATC TGg gat cc-3’)，pEGFP-N1-ΔNS128和pEGFP-C3-ΔNS128使用带HindIII酶切位点和起始密码子的5’引物(5’-AAG CTTATG TCC CTG GAC CCAAGC-3’)，与带有BamH I酶切位点但不带终止密码子的3’引物(5’-G GAT CCA GTA ACT CAG ACT GGG ATC TG-3’)，以pcDB-NS128为模板进行PCR扩增，产物经琼脂糖凝胶电泳回收纯化后连入pZero T载体，连接产物转化大肠杆菌XL-1Blue，PCR筛选阳性克隆，并测序验证无误。再使用分别用EcoR I、BamHI和HindIII、BamH I酶切构建好的pZero T-ΔNS128质粒，释放ΔNS128片段，电泳，回收纯化后，分别连接至EcoR I和BamH I酶切的pcDB载体以及HindIII和BamH I酶切的pEGFP-N1/C3载体中，连接产物转化大肠杆菌XL-1Blue，PCR筛选正向插入克隆，测序验证，pcDB-ΔNS128为带有c-myc和his标签但无信号肽的截短体。

(2)pcDB-NS128(tag)、pEGFP-N1-NS128和pEGFP-C3-NS128真核细胞表达质粒的构建(图15A、B、C)：pcDB-NS128(tag)使用带EcoRI酶切位点和起始密码子的5’引物(5’-GAATTC ATG GAC CTT CTT CAA TTC-3’)，与带有BamH I酶切位点但不带终止密码子的3’引物(5’-A GTA ACT CAG ACT GGG ATC TGg gat cc-3’)，pEGFP-N1-NS128和pEGFP-C3-NS128使用带HindIII酶切位点和起始密码子的5’引物(5’-AAG CTTATG TCC CTG GAC CCAAGC-3’)，与带有BamH I酶切位点但不带终止密码子的3’引物(5’-G GAT CCA GTA ACT CAG ACT GGGATC TG-3’)，以pcDB-NS128为模板进行PCR扩增，产物经琼脂糖凝胶电泳回收纯化后连入pZeroT载体，连接产物转化大肠杆菌XL-1Blue，PCR筛选阳性克隆，并测序验证无误。再使用分别用EcoR I、BamH I和HindIII、BamH I酶切构建好的pZero T-NS128质粒，释放NS128片段，电泳，回收纯化后，分别连接至EcoRI和BamH I酶切的pcDB载体以及HindIII和BamH I酶切的pEGFP-N1/C3载体中，连接产物转化大肠杆菌XL-1Blue，PCR筛选正向插入克隆，测序验证，pcDB-NS 128为带有c-myc和his标签并且具有信号肽的表达载体。

(3)细胞培养、转染

用目的基因pcDB-NS128、pcDB-ΔNS128、pcDB-NS128(tag)和阴性对照真核表达质粒pcDB以及pEGFP-N1-ΔNS128、pEGFP-C3-ΔNS128、pEGFP-N1-NS128、pEGFP-C3-NS128和阴性对照真核表达质粒pEGFP-C3、pEGFP-N1分别转染293T和HeLa细胞，共转染的方法分别为阳离子转染法和电穿孔转染法，具体操作步骤见实施例二。

阳离子转染293T细胞：将293T细胞(2.0×10⁵个)用含10％胎牛血清的DMEM培养基铺在12孔细胞培养板上，在5％CO₂，37℃的培养箱中培养24小时后；制备DNA-vigofect复合物：用100μlPBS稀释5μg相应的目的质粒和对照质粒，缓慢混合均匀；同样用100μl PBS稀释2μlVigoFect，缓慢混合均匀，在室温下放置5分钟后，与稀释的DNA缓慢混合，室温放置15分钟，以形成DNA-VigoFect复合物；将DNA-VigoFect复合物缓慢滴入细胞培养板(200μl/孔)，轻微摇匀。5％CO₂，37℃的培养箱中培养36小时。

电穿孔转染HeLa细胞：HeLa细胞常规传代培养于含10％胎牛血清的DMEM培养基中，并置于37℃，5％CO₂孵箱中培养。用0.25％胰酶+EDTA消化细胞，用无血清RPMI 1640培养基洗细胞2遍，调整细胞浓度为2-5×10⁶/ml，取细胞300μl/样品，加质粒10μg，混匀后移入2mm电转杯，电击条件120v，20ms；转染后室温放置10分钟，吸出并重悬于2-5ml DMEM培养基中，铺于12孔细胞培养板，细胞浓度为4.0×10⁵个，培养6-8小时细胞贴壁后更换新鲜的培养基，在5％CO₂，37℃的培养箱中培养36小时。

(4)获取细胞培养上清以及提取细胞蛋白和Western Blot检测NS128蛋白的超表达情况293T细胞和Hela细胞培养上清的收集：36小时后，细胞融合率约达到90％时，收集各实验组细胞培养上清，于4℃，800g离心5分钟，目的是去除细胞培养上清的细胞，弃沉淀，再于4℃，15000g离心15分钟，去除上清中的小颗粒物质，留取处理后的细胞培养上清。

293T细胞和HeLa细胞总蛋白的提取：将留取上清后的细胞置于冰上，用冰预冷的1×PBS洗一遍，加入0.25％胰酶加EDTA消化细胞，用冰预冷的1×PBS吹下消化好的细胞，将细胞收集到1.5mL离心管中，于4℃，2000g离心3分钟。去除上清，用冰预冷1×PBS洗两遍，每次于4℃，2000g离心3分钟，最后去除干净上清，在沉淀中加入细胞裂解液RIPA裂解液(20mMTris-HCl，pH 7.4，150mM NaCl，1mM EDTA，1mM EGTA，1％Triton X-100，蛋白酶抑制剂Cockttail)，冰上放置30分钟，4℃，15000g离心15分钟，上清转入新管，存于-80℃备用。

蛋白定量：细胞提取的蛋白按照BCA^TMProtein Assay Kit(Pierce，23227)说明书提供的方法进行蛋白定量。

Western Blot：每组细胞蛋白取30μg，每组细胞培养上清取30μl，加入蛋白上样缓冲液(北京宝赛生物技术有限公司)，于100℃水浴煮5分钟。12.5％PAGE电泳，100mV电转1小时，TBST液平衡，用5％牛奶室温封闭3小时，分别加入单克隆抗c-myc标签抗体(Sigma，1∶1000)、单克隆抗-beta-actin(Sigma，1∶3000)作为一抗，，4℃过夜，TBST洗三次，每次10分钟，4℃反应过夜；用TBST充分洗膜3-5次，每次10分钟；然后加入相应的IRDye^TM 800标记的二抗(1∶10000)，室温避光反应1小时；再用TBST充分洗膜3次，每次10分钟；最后使用OdysseyInfrared Imager在800nm波长下检测信号，以及直接加入直标的IRDye^TM 800标记的抗GFP的抗体(1∶10000)室温避光反应1小时；也用TBST充分洗膜3次，每次10分钟；最后也同样使用Odyssey Infrared Imager在800nm波长下检测信号。

结果如图16所示，表明NS128蛋白在细胞培养上清中有表达，而且出现蛋白信号肽切割后出现修饰所致蛋白分子量偏大。上排为HeLa细胞中抗GFP抗体检测的结果，其下方为anti-beta-actin检测beta-actin的结果。下排为抗c-myc标签抗体检测的结果，其下方为anti-beta-actin检测beta-actin的结果。293T细胞中的结果和HeLa细胞中检测结果一致。提示NS128蛋白可能为分泌蛋白，需进行蛋白质测序验证。

(5)蛋白质N端测序验证NS128为分泌蛋白

HeLa细胞电穿孔转染方法同实施例二。电穿孔前处理细胞的步骤同前，3×10⁶加入pcDB-NS128(tag)质粒15μg，混匀后移入2mm电转杯，电击条件120v，20ms；转染后室温放置10分钟，吸出并重悬于7ml DMEM培养基中，铺于10cm细胞培养皿，细胞浓度为3.0×10⁶个，培养5小时细胞贴壁后，用常温的1×PBS洗涤细胞三次，更换新鲜的无血清培养基(但含有低蛋白的培养细胞因子)，在5％CO₂，37℃的培养箱中培养。36小时后收集细胞培养上清，于4℃，800g离心5分钟，目的是去除细胞培养上清的细胞，弃沉淀，再于4℃，18000g离心20分钟，去除上清中的小颗粒物质，留取处理后的细胞培养上清。

用Ni²⁺柱料纯化上述处理后的细胞培养上清：先将上清经过0.45μm滤器过滤后，在上清中加入咪唑(10mM)/β-巯基乙醇(10mM)/NaCl(300mM)，再与柱料结合，流速控制在10滴每分钟，再用平衡缓冲液【咪唑(20mM)/β-巯基乙醇(10mM)/NaCl(300mM)in 1×PBS(PH7.4)】冲洗柱料，以洗去未结合的杂蛋白，至分光光度计测量值回至基线后，用柱料相同体积的洗脱液【咪唑(500mM)/β-巯基乙醇(10mM)/NaCl(300mM)in 1×PBS(PH7.4)】洗脱结合蛋白，收集洗脱液，取30μl，加入蛋白上样缓冲液(北京宝赛生物技术有限公司)，于100℃水浴煮5分钟。12.5％PAGE，1.5mm玻璃板电泳，进行电泳前先预电泳电泳2小时，目的是防止蛋白质可能在电泳过程中被胶内杂质封闭N末端，100mV电泳2小时后，进行电转，建议用CAPS缓冲液，而不使用Tris-甘氨酸缓冲液，以防止甘氨酸对蛋白酶切影响，并使用PVDF膜，而不能使用NC膜。转膜后，用Goomassie R-250染色5分钟，用脱色液(含有50％甲醇)脱色5分钟，背景颜色很快脱去，用超纯水漂洗干净后，在滤纸上晾干，夹在滤纸间保存在密闭塑料袋中，送往上海基康有限公司进行测序。测序结果(图17)显示NS128在第23位AA进行切割，1-22个AA为NS128的N端信号肽。

实施例六、双荧光素酶报告基因法测定NS128分泌上清对反式作用因子Elk1抑制作用第一天，用目的基因pcDB-NS128、pcDB-NS128(tag)和pcDB用阳离子转染法转染293T细胞，第二天相同时间，用报告基因pFA2-Elk1、pFR-luc，pRL-TK共转染293T细胞，10个小时后，给第二天转染的293T细胞进行细胞换液，换第一天转染目的基因的293T细胞培养上清，再过36小时，分别在培养基中加入PMA(终浓度为50ng/ML)和离子霉素(终浓度为20μM)刺激293T细胞，4小时后弃去培养基，加入Reporter Lysis Buffer(Promega，E4030)，在-80℃下放置30分钟，取出后在室温自然融化，使细胞裂解，然后将细胞裂解液移入荧光板(Gronier，655075)，用Dual-Luciferase Reporter Assay Systm 10-Pack(Promaga，E1960)，通过FluostarOPTIMA(BMG Labtechnologies)检测荧光素酶活性。分析方法同实施例二的方法。图18显示为pcDB-NS128、pcDB-NS128(tag)和pcDB的荧光素酶活性的分析结果。可以看出相比于pcDB，pcDB-NS128和pcDB-NS128(tag)的分泌上清可明显抑制Elk1的活性。

实施例七、分析NS128与免疫系统的关系

1、RT-PCR检测在淋巴细胞不同活化状态下中NS128mRNA表达水平

分析NS128为分泌蛋白，可能作为细胞因子发挥作用，为了证明NS128在免疫细胞中的mRNA表达水平，本实施例分离了外周血的T细胞，并用PHA刺激不同时间后提取了免疫细胞中的mRNA，利用RT-PCR来检测。同时使用购买的clontech外周血的cDNA文库进行NS128PCR扩增。RT-PCR条件同实施例三。结果如图19所示，CD8阳性T细胞活化时NS128表达逐渐增强，但随着活化时间延长，NS128表达又有所下降。DC细胞活化时NS128表达上调，而CD19活化时NS128表达下调，提示NS128在免疫调节中发挥一定的作用，还需要进一步的实验进行验证。

2、NS128对小鼠免疫系统的影响

用Qiagen公司的试剂盒大量提取质粒pcDB、pcDB-NS128，各取100μg质粒溶于100μl的0.9％NaCl中，设立0.9％NaCl组，pcDB组和pcDB-NS128组，质粒均经过高速离心除菌处理，尾静脉注射Balb/c小鼠，100μg/只，各组均设立5只小鼠。期间观察各组小鼠状态，未见明显表型差异。8天后，各组小鼠均被处死，进行相应实验。

(1)外周血计数

小鼠眼球后取外周血1ml，加入肝素抗凝，混匀后取20μl外周血进行计数，应用血细胞计数仪进行检测，取各组血细胞平均数进行统计学分析，有统计学差异。如图20所示，pcDB-NS128组小鼠白细胞明显增加，而淋巴细胞出现一定程度下降，而单核细胞和粒细胞出现相应程度增加，表明NS128对淋巴细胞增殖有一定影响作用。

(2)淋巴细胞增殖实验

取各组小鼠全脾和胸腺组织，并对脾进行称重，记录其重量并观察脾和胸腺形态，NS128-pcDB组小鼠脾略大于其它组，余未见其它异常。分别将1/3脾和胸腺组织进行研磨(其余脾和胸腺组织分别固定于10％甲醛和冻于-70℃，以备后用)，获取脾细胞悬液和胸腺细胞悬液，用15ml无血清1640培养基洗涤细胞一次，1500rpm离心5分钟，弃上清，脾细胞加入ACK裂解液1ml，为裂解红细胞，室温裂解1分钟，立即加入15ml无血清1640培养基终止反应，2000rpm离心3分钟，弃上清，加入15ml无血清1640培养基洗涤细胞两次并进行细胞计数后铺板。胸腺细胞离心后弃上清，用含10％胎牛血清的1640培养基洗涤细胞一次，1500rpm离心5分钟，并进行细胞计数后铺板。计数后的脾细胞和胸腺细胞分别铺于96孔细胞培养板，100μl/孔，细胞浓度为1×10⁷个/ml，同时加入10μg/ml PHA(植物血凝素)刺激。分别于0、24、48、72和96小时进行MTT检测。MTT结果显示pcDB-NS128组较其它两组淋巴细胞增殖明显，因为胸腺均为T淋巴细胞，所以PHA刺激后T淋巴细胞在48小时出现明显的增殖加快，而脾内既含有T淋巴细胞又含有B淋巴细胞，所以PHA刺激后T淋巴细胞增殖较其它两组在72小时才出现一定程度的差异(图21)。此结果提示NS128可能影响T淋巴细胞的增殖。

(3)淋巴细胞转化实验

将上述原代培养的脾细胞和胸腺细胞同时铺于24孔细胞培养板，500μl/孔，细胞浓度为1×10⁷个/ml，同时加入50μg/ml PHA(植物血凝素)刺激。分别于0、24和48小时对淋巴细胞进行表面分子CD25、CD69分子的检测。并且在0小时进行CD4、CD8和CD19分子的检测以作为实验对照。具体步骤为：分别在不同时间点收取细胞，用预冷PBS洗涤细胞3次，直接加入PE标记抗小鼠CD4抗体、FITC标记抗小鼠CD8抗体、PE标记抗小鼠CD25抗体、PE标记抗小鼠CD69抗体(均为BD公司工作液)，室温反应30分钟后，PBS洗涤细胞三次，流式细胞仪检测，同时用大鼠抗小鼠CD19单抗(Santa cruz，1∶100)检测B细胞，室温反应1小时，PBS洗涤细胞三次，再加入FITC标记抗大鼠抗体(中杉金桥，1∶100)室温反应30分钟后，PBS洗涤细胞三次，流式细胞仪进行检测。结果如图22A和B所示，pcDB-NS128组较其它两组CD19分子表达出现下调，CD4、CD8分子表达未见差异；而CD25分子在PcDB-NS128组原代培养胸腺细胞中表达下调，而在脾细胞中却表达上调，促进T淋巴细胞活化，CD69分子表达情况与CD25分子相同(结果未显示)，可能因为胸腺组织中存在不同发育阶段的T淋巴细胞，而脾组织中存在成熟阶段的T淋巴细胞，由此可推断NS128分子可能在T淋巴细胞发育和B淋巴细胞成熟过程发挥一定的作用，并且促进T淋巴细胞活化。

实施例八、检测NS128在正常组织和肿瘤组织以及免疫系统中的表达水平

为了证明NS128蛋白在肿瘤和正常组织间的表达差异以及在免疫系统中的表达情况，本实施例获取了组织芯片和体外培养外周血淋巴细胞和DC细胞，利用兔抗-NS128多克隆抗体，通过ELISA、Western Blot和免疫组化来检测。

1、NS128蛋白的表达

用引物Sense：5-GAA TTC CAT CCC TGG ACC CAAG-3和Antisense：5-CTC GAG A CTCAGA CTG GGA TCT GG-3以pcDB-NS128为模板PCR扩增得到相应不含有N端信号肽的片段，分别以EcoRI，XhoI(TAKARA)酶切PCR产物和原核表达载体PGEX-4T-2(Amersham)，回收酶切产物，连接得到含有NS128基因的PGEX-NS128融合蛋白表达载体(NS128蛋白的N端融合有GST尾巴)，载体序列经测序验证正确。具体酶切，回收，连接过程同实施例二中NS128基因真核表达载体的构建。将获得的质粒转化大肠杆菌菌株BL21，37℃，300rpm培养，用IPTG(Sigma)1mM诱导表达3小时，裂解细菌，蛋白用GST纯化柱(Amersham)纯化，获得纯化的融合蛋白大于1mg，以其作为抗原。

2、NS128兔源多克隆抗体的制备

免疫动物选用成年雄性新西兰兔，初次免疫用200ug抗原(0.1ml)与等体积弗氏完全佐剂(FCA)充分乳化后，于背部皮下多点注射。初次免疫后21、42天，用弗氏不完全佐剂(FIA)完全乳化的抗原蛋白，各加强免疫一次，用量同前。因兔被免疫时免疫功能下降，第二次免疫后4天感染死亡，，放血分离血清。血清用CNBR耦联NS128C端多肽纯化获得抗体，Western blot鉴定抗体特异性结果表明抗体能特异性识别外源性表达，同时也能识别内源性表达蛋白，因此得到NS128特异的多克隆抗体。

3、检测NS128在肿瘤和正常组织以及免疫系统中的表达水平

(1)ELISA检测NS128在外周血淋巴细胞(PBL)培养上清中的表达

从北京血站获得2U的浓缩白细胞，共50ml，用无血清1640稀释至200ml，混匀后分别加入30ml至15ml预先平衡至室温的淋巴细胞分层液中，缓慢逐滴加入，160g离心20分钟，去除血小板上清后，再350g离心20分钟，吸取白细胞层，用无血清1640培养基充分洗涤3次，每次1500rpm5分钟离心，弃上清，计数后铺于6孔细胞培养板，2ml/孔，细胞浓度为4×10⁶个/ml，同时加入50μg/ml PHA(植物血凝素)刺激。分别于0、8、24、48、72、96小时收取PBL培养上清，进行包被ELISA板，4℃过夜包被，用PBST洗涤三次，加入1％BSA 37℃封闭2小时，加入兔抗NS128抗体检测，37℃孵育2小时，PBST洗三次，再加入HRP标记抗兔二抗，37℃孵育40分钟，PBST洗三次，TMB显色10分钟后，2M硫酸终止反应。同时利用不同时间点的PBL培养上清，取PBL培养上清取30μl，加入蛋白上样缓冲液(北京宝赛生物技术有限公司)，于100℃水浴煮5分钟。12.5％PAGE电泳，100mV电转1小时，TBST液平衡，用5％牛奶室温封闭3小时，分别加入兔抗NS128多克隆抗体作为一抗，，4℃过夜，TBST洗三次，每次10分钟，4℃反应过夜；用TBST充分洗膜3-5次，每次10分钟；然后加入抗兔的IRDyeTM 800标记的二抗(1∶10000)，室温避光反应1小时；再用TBST充分洗膜3次，每次10分钟；最后使用Odyssey Infrared Imager在800nm波长下检测信号

结果如图23和图24所示。用PHA刺激的PBL中NS128能分泌至PBL上清中，并且随着时间表达逐渐上调，直至96小时表达很强，提示PBL活化与NS128密切相关，进一步提示NS128可能与T淋巴细胞活化密切相关。

(2)免疫组化检测NS128在肿瘤组织和正常组织中的表达

从友谊医院购买组织芯片，二甲苯脱蜡，室温30分钟，各两次，梯度酒精水化，每次3分钟，蒸馏水洗涤一次，PBS洗涤一次，高压锅进行抗原修复2分钟，自然冷却至室温，PBS洗2次，加入3％H₂O₂室温反应10分钟，去除内源性过氧化物酶，PBS洗2次，羊血清室温封闭半小时，加入兔抗NS128抗体，37℃孵育1小时，PBS洗三次，DAKO放大系统检测结果。结果如表1所示，NS128在正常组织中表达高于肿瘤组织，尤其NS128在男性生殖系统中的表达特点可能为其以后的功能有一定的提示。

表1、NS128在多组织芯片中免疫组化的检测结果

	正常组织	良性肿瘤组织	恶性肿瘤组织
				乳腺	阴性，仅极少数细胞胞浆呈颗粒状阳性反应，分泌液阳性(2)	部分上皮细胞呈弱阳性反应(6)	阴性，仅部分上皮细胞呈阳性反应(5)
胃	强阳性，(2)		阴性(3)
				肝	阳性(4)	弱阳性(4)	阴性(1)
肠	弱阳性(2)		阴性(3)
				肺	阴性(3)	阴性，但在渗出液中为弱阳性(1)	阴性(4)
食道			弱阳性(3)
				肾	阳性，但仅肾小管上皮细胞阳性，而肾小球呈阴性(2)		阳性(3)
子宫	弱阳性(5)	阴性(1)	阴性，仅个别癌细胞呈阳性反应(2)
				卵巢	阴性(1)		弱阳性，分泌液为阳性(2)
睾丸	阳性，各层生精细胞均呈阳性，而精子呈阴性(2)	阳性(2)
				前列腺	阳性(1)		弱阳性(1)
胰腺	弱阳性(1)		弱阳性(2)
				淋巴系统(T&淋巴瘤B)			阴性，仅梭形B淋巴细胞为弱阳性(4)

平滑肌		阴性(2)	弱阳性(2)
				横纹肌		阳性(2)	阴性(2)
纤维组织	阴性(1)		阴性，但浸润的免疫细胞呈强阳性反应(3)
				脂肪组织	弱阳性(1)	阴性(2)	弱阳性(2)
神经系统			弱阳性(2)

NS128基因在实验中所有用到的正常组织、胎儿组织、肿瘤组织都有表达，说明其为人体自身重要的一个分泌蛋白；在不同的组织中表达量高低有差别，说明其在不同的组织中发挥功能的程度不同。

以上实施例说明，NS128在免疫系统中发挥重要作用，可能介导T、B淋巴细胞的发育、活化以及免疫调节过程，同时可能影响巨噬细胞抗细菌免疫的功能，并因为NS128为一个分泌蛋白，可能作为一个细胞因子发挥其重要功能。

序列表

<110>北京诺赛基因组研究中心有限公司；北京大学

<120>人类新细胞因子及其用途

<130>

<160>2

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>1280

<212>DNA

<213>智人(homo sapiens)

<220>

<221>CDS

<222>(105)..(794)

<400>1

agttgctttg ctgttagcct gttggacctt cgagcctagc tgctcgcaca ggactcggcc   60

acctgccctt cctgcaccga ctggccagct caagaggttt ggat atg gac ctt ctt   116

                                                    MetAsp Leu Leu

                                                    1

caa ttc ctg gcc ttc ctc ttt gtc ctg ctt ttg tct ggg atg gga gcc    164

Gln Phe Leu Ala Phe Leu Phe Val Leu Leu Leu Ser Gly Met Gly Ala

5                   10                  15                  20

aca ggc acc ttg agg acc tcc ctg gac cca agc ctg gag atc tac aag    212

Thr Gly Thr Leu Arg Thr Ser Leu Asp Pro Ser Leu Glu Ile Tyr Lys

                25                  30                  35

aag atg ttt gag gtg aag cgg cgg gag cag ctg ttg gca ctg aag aac    260

Lys Met Phe Glu Val Lys Arg Arg Glu Gln Leu Leu Ala Leu Lys Asn

            40                  45                  50

ctg gca cag ctg aac gac atc cac cag cag tac aag atc ctt gat gtc    308

Leu Ala Gln Leu Asn Asp Ile His Gln Gln Tyr Lys Ile Leu Asp Val

        55                  60                  65

atg ctc aag ggg ctc ttt aag gtg ctg gag gac tcc cgg aca gtg ctc    356

Met Leu Lys Gly Leu Phe Lys Val Leu Glu Asp Ser Arg Thr Val Leu

    70                  75                  80

acc gct gct gat gtg ctc cca gat ggg ccc ttc ccc cag gac gag aag    404

Thr Ala Ala Asp Val Leu Pro Asp Gly Pro Phe Pro Gln Asp Glu Lys

85                  90                  95                  100

ctg aag gat gct ttc tcc cac gtg gtg gag aac acg gcc ttc ttc ggc    452

Leu Lys Asp Ala Phe Ser His Val Val Glu Asn Thr Ala Phe Phe Gly

                105                 110                 115

gat gtg gtg ctg cgc ttc ccg agg att gtg cac tat tac ttt gac cac    500

Asp Val Val Leu Arg Phe Pro Arg Ile Val His Tyr Tyr Phe Asp His

            120                 125                 130

aac tcc aac tgg aac ctc ctc atc cgc tgg ggt atc agt ttc tgc aac    548

Asn Ser Asn Trp Asn Leu Leu Ile Arg Trp Gly Ile Ser Phe Cys Asn

        135                 140                 145

cag aca ggc gtc ttc aac cag ggg ccc cac tcg ccc atc ctc agc ctg    596

Gln Thr Gly Val Phe Asn Gln Gly Pro His Ser Pro Ile Leu Ser Leu

    150                 155                 160

atg gcc cag gag ctg ggg atc agt gag aaa gac tcc aac ttc cag aac    644

Met Ala Gln Glu Leu Gly Ile Ser Glu Lys Asp Ser Asn Phe Gln Asn

165                 170                 175                 180

cca ttt aaa atc gac cgc aca gag ttc att ccc agc act gac cct ttc    692

Pro Phe Lys Ile Asp Arg Thr Glu Phe Ile Pro Ser Thr Asp Pro Phe

                185                 190                 195

cag aag gcc ctg aga gaa gaa gag aaa cgc cga aag aaa gag gag aag    740

Gln Lys Ala Leu Arg Glu Glu Glu Lys Arg Arg Lys Lys Glu Glu Lys

            200                 205                 210

cgg aag gag atc cga aaa ggc cca agg atc tcc aga tcc cag tct gag    788

Arg Lys Glu Ile Arg Lys Gly Pro Arg Ile Ser Arg Ser Gln Ser Glu

        215                 220                 225

tta tag ccctggagca gctcagggct cagggggcca caaggaggca ggtcgggagg     844

Leu

aagaagaggt ggaggtgtgg ttgtggtgga gagcaccagc tagccccttc cagaagggga  904

ggccacattt gcccggcccc ctggagctgg gtctgagccc cagctgaagg gactgagcct   964

cagatggctg gattttctct caggggcctc ctgctgaagg ggccttcaga ggattttatg  1024

ctggaaatat gaccctgtgc agactgctgg gggaggcagg aggatgcctg cctggaccct  1084

gttggtggct gaagacctct ggccagctgg cttccgccct tggtggggaa gcagcagaac  1144

taggttctga gccacgggtc agggtgccac cctgctgctg gccccactgt gtcacagagc  1204

tgcctggcac aggtcccagc ccctctgcag agacacaata aaagccagca gaccctttga  1264

aaaaaaaaaa aaaaaa                                                  1280

<210>2

<211>229

<212>PRT

<213>智人(homo sapiens)

<400>2

Met Asp Leu Leu Gln Phe Leu Ala Phe Leu Phe Val Leu Leu Leu Ser

1               5                   10              15

Gly Met Gly Ala Thr Gly Thr Leu Arg Thr Ser Leu Asp Pro Ser Leu

            20                  25              30

Glu Ile Tyr Lys Lys Met Phe Glu VaL Lys Arg Arg Glu Gln Leu Leu

        35                  40                  45

Ala Leu Lys Asn Leu Ala Gln Leu Asn Asp Ile His Gln Gln Tyr Lys

    50                  55                  60

Ile Leu Asp Val Met Leu Lys Gly Leu Phe Lys Val Leu Glu Asp Ser

65                  70                  75                  80

Arg Thr Val Leu Thr Ala Ala Asp Val Leu Pro Asp Gly Pro Phe Pro

                85                  90                  95

Gln Asp Glu Lys Leu Lys Asp Ala Phe Ser His Val Val Glu Asn Thr

            100                 105                 110

Ala Phe Phe Gly Asp Val Val Leu Arg Phe Pro Arg Ile Val His Tyr

        115                 120                 125

Tyr Phe Asp His Asn Ser Asn Trp Asn Leu Leu Ile Arg Trp Gly Ile

    130                 135                 140

Set Phe Cys Asn Gln Thr Gly Val Phe Asn Gln Gly Pro His Ser Pro

145                 150                 155                 160

Ile Leu Ser Leu Met Ala Gln Glu Leu Gly Ile Ser Glu Lys Asp Ser

                165                 170                 175

Asn Phe Gln Asn Pro Phe Lys Ile Asp Arg Thr Glu Phe Ile Pro Ser

            180                 185                 190

Thr Asp Pro Phe Gln Lys Ala Leu Arg Glu Glu Glu Lys Arg Arg Lys

        195                 200                 205

Lys Glu Glu Lys Arg Lys Glu Ile Arg Lys Gly Pro Arg Ile Ser Arg

   210                 215                 220

Ser Gln Ser Glu Leu

225

Claims (15)

1.一种分离的人细胞因子，其特征在于，所述细胞因子包含与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列有至少70％同源性的多肽序列。

2.如权利要求1所述的一种分离的人细胞因子，其特征在于，所述细胞因子含有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列。

3.一种分离的多核苷酸，其特征在于，它所包含的核苷酸序列选自下组：

(a)编码如权利要求1所述多肽的多核苷酸；

(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。

4.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸编码具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽。

5.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸的序列具有SEQ ID NO：1的编码区序列或全长序列。

6.一种基因工程载体，其特征在于，它含有权利要求3所述的多核苷酸。

7.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求6所述的载体，经权利要求6所述的基因工程载体转化、转染或转导得到。

8.一种制备权利要求1所述的分离的人细胞因子的方法，其特征在于，该方法依次包括如下步骤：

(a)将编码具有人细胞因子活性的多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成该细胞因子表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO：1中的105-794位核苷酸序列有至少70％同源性；

(b)将步骤(a)中的表达载体转入宿主细胞，形成细胞因子的重组细胞；

(c)在适合表达细胞因子多肽的条件下，培养步骤(b)中的重组细胞；

(d)分离出具有细胞因子活性的多肽。

9.如权利要求3所述的一种制备人细胞因子的方法，其特征在于，所述核苷酸序列为SEQ IDNO：1中的105-794位的核苷酸。

10.一种多肽，该多肽包含：

(a)如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，或如SEQ ID NO：2的21-36位和/或213-228位氨基酸所示的多肽；

(b)与(a)具有至少70％同源性的多肽，该多肽的功能与(a)的功能相同。

11.抑制权利要求1所述的细胞因子表达的小干扰RNA，其特征在于该RNA序列选自si-1：5′-CCAGACAGGCGUCUUCAAC-3′和si-2：5′-CUUCCAGAACCCAUUUAAA-3′两条序列中的任意一条核苷酸序列。

12.一种药物组合物，它的活性成分包含权利要求1或2所述的细胞因子、权利要求3或4所述的多核苷酸或其药物可接受的盐、权利要求6所述的载体、全力要求7所述的宿主细胞、权利要求10所述的多肽、或权利要求11所述的小干扰RNA或其药物可接受的盐，以及一种或一种以上药物可接受的盐或药学上可接受的载体或赋型物。

13.权利要求1或2所述的细胞因子、或者权利要求3或4所述的多核苷酸、或者权利要求10所述的多肽、或者权利要求11所述小干扰RNA在制备预防和/或治疗肿瘤、感染、造血功能障碍、自身免疫病等的药物中的应用，尤其是MAPK信号途径相关的肿瘤、炎症及神经系统疾病等。

14.一种体外检测来自待测者的样品中权利要求3或4所述的多核苷酸或如权利要求10所述的多肽的表达水平是否变化的方法，该方法包括：

(a)检测待测样品中所述多核苷酸或多肽的表达水平；

(b)将待测样品中所述多核苷酸或多肽的表达水平与正常样品的多核苷酸或多肽的表达水平进行比较；

(c)确定待测样品中多核苷酸或多肽的表达水平是否变化。

15.一种单克隆或多克隆抗体，其特征在于，所述抗体是能与权利要求10所述的多肽特异性结合。

Images