CN100348615C - 抑制NF－κB和NFAT活化的基因及其编码的多肽 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种抑制人体细胞核因子NF-κB及NFAT活化的人类新基因NFIF1，其编码的多肽及其功能的检测方法和用途。通过对NCBI的nr数据库检索，获得人功能未知基因的cDNA序列，命名为NFIF1基因。利用PCR技术，从混合人组织cDNA文库中扩增得到NFIF1基因编码区的cDNA。进一步将NFIF1基因连入真核表达载体pcDNA3.1B。用双荧光素酶报告基因法检测NFIF1基因的功能，结果表明，NFIF1对NF-κB及NFAT的诱导活化有明显的抑制作用。本发明提供了人类新基因NFIF1的cDNA序列，并首次测得该基因的功能，NFIF1抑制NF-κB及NFAT活化的作用非常明显、稳定，可用于进一步研究其对NF-κB及NFAT的调控机制，以及制备预防和治疗炎症、过敏性疾病、自身免疫病和肿瘤以及调节淋巴细胞的活化、增殖和凋亡的药物。

Description

抑制NF-κB和NFAT活化的基因及其编码的多肽

技术领域

本发明涉及基因表达调控领域，具体是涉及抑制人体细胞核因子NF-κB和NFAT活化的基因，该基因的制备方法，含有该基因的表达载体，其编码的多肽，多肽的抗体，以及所述多肽、抗体在制备预防和治疗与人体细胞核因子NF-κB和NFAT相关的疾病，尤其炎症、过敏性疾病、自身免疫病和肿瘤的药物以及在开发调节淋巴细胞的活化、增殖和凋亡药物上的用途。

背景技术

NFAT和NF-κB蛋白是转录因子超家族的成员，虽然它们在很多种细胞中都有表达，但它们在调控淋巴细胞系的活化，增殖和活化诱导的细胞死亡中发挥关键的作用。NFAT和NF-κB有许多共性，包括相似的DNA结合区、抗原刺激后快速的核转位等。它们之间相互重叠同时又相互拮抗，它们在淋巴细胞内构成了精细的基因表达调控网络系统。NF-κB调控天然免疫应答和获得性免疫应答，而NFAT调控获得性免疫应答。NFAT和NF-κB功能上有明显差别，NFAT调控T/B细胞活化诱导的细胞死亡，而NF-κB蛋白常常在淋巴细胞和其它细胞中起很强的抗凋亡作用。NF-κB的抗凋亡活性是它们具有癌基因潜能，而NFAT的促凋亡活性使之成为淋巴细胞中的肿瘤抑制物。

NFAT和NF-κB蛋白有相似的DNA结合功能域(约300Aa)。NF-κB是Rel功能域，NFAT是RSD功能域。虽然RSD和Rel功能域只有20％的序列同源性，但它们在相同位置都有10个B片层和2个环形的结构，用以结合相似DNA序列和与其它转录分子如AP-1相互作用(Chen，Glover，Hogan，Rao，&Harrison，1998)。

细胞核因子NF-κB是人体最重要的转录因子之一，它参与诱导多种多样的细胞及病毒化基因的表达，在多种类型细胞的基因表达调节中起多效性作用。这些基因对炎症、免疫和凋亡信号进行应答而被激活，其中包括许多细胞因子、趋化因子、受体、粘附分子等。NF-κB也参与病毒启动子转录的起始，例如I型人类免疫缺陷病毒(HIV-1)。

哺乳动物的NF-κB包含5种蛋：p65(RelA)、p50(NF-κB-1)、RelB、c-Rel、p52(NF-κB-2、p50B)，它们在氨基末端区有300个氨基酸相似，称为Rel同源区。5种NF-κB蛋白质分子可以形成同源或异源二聚体，以不同的结合特异性与特定的DNA识别部位结合，具有不同的反式激活活性。

由于NF-κB的活化能够促进许多前炎症因子的转录表达，所以，NF-κB的过度活化会引起炎症的发生、过敏性疾病以及自身免疫病；由于NF-κB的活化能够促进细胞生长抑制凋亡，所以其在肿瘤的发生发展过程中起重要的作用；此外，NF-κB的活化能够阻断一些细胞的凋亡，所以其在调节细胞的生长分化方面也具有重要的功能。

TNFα(肿瘤坏死因子α)、PMA(十四酸波沸酯)、IL-1(白细胞介素-1)、LPS(脂多糖)均可以促进NF-κB活化；MEKK(有丝分裂原活化蛋白激酶的激酶的激酶)、TRAF(肿瘤坏死因子受体相关因子)等NF-κB信号通路正调节基因的表达也可以促进NF-κB活化；而IL-10(白细胞介素-10)、FK506(藤霉素)、糖皮质激素、阿司匹林等则能明显地抑制NF-κB的活化。

鉴于NF-κB在调节人体生理功能，以及在多种疾病的发生、发展中所起的重要作用(Burke J.R.Curr Opin Drug Discov Devel.20036(5)，720-8)，NF-κB的抑制剂和抑制基因在炎性疾病和肿瘤性疾病的治疗中必将有着重要应用。目前NF-κB活化调节领域已经成为基础医学、临床医学研究以及药物开发的一个焦点，例如I-KappaB-α、I-KappaB-β等与NF-κB活化有关的调节蛋白(美国专利5,597,898)。此外，NF-κB的许多负向调节物如抗白细胞介素-1的治疗，抗肿瘤坏死因子的治疗，激素治疗，阿斯匹林，非激素类抗炎药物等(参考综述文章Nature ReviewImmunology，2002，2：725；J Clin Invest，January 2001，Volume 107，Number 2，135-142)已被广泛应用于临床，但这些药物存在有特异性不强、抑制不够明显、不够稳定的缺点，而且往往有副作用。因此，有必要进一步探索抑制NF-κB活化的新的调控基因，并研究其在细胞内的表达对NF-κB活化的调节功能，从而为开发治疗炎症、过敏性疾病、自身免疫病以及肿瘤的药物提供必要的依据。

NFAT是一种多功能的转录分子，  它在大多数免疫细胞中表达，并在调控一系列细胞因子和细胞表面配体的表达中起核心作用，而这些细胞因子和细胞表面配体对调节免疫应答起关键作用。刺激免疫细胞的抗原受体，引发钙离子内流，产生活化的钙调磷酸酶(CaN)，它催化NFAT蛋白去磷酸化，从而激活NFAT并促进它们转入细胞核内，并与白介素2启动因子上的AP-1相关基因结合。因此NFAT与Ca²⁺-CaN依赖的信号通路密切相关。

NFAT家族有5个成员，NFAT1/p、NFAT2/c、NFAT3、NFAT4/x和NFAT5，其中前四种受钙调磷酸酶调节。多种淋巴瘤，包括何杰金氏淋巴瘤的R-S细胞以及弥散大B细胞淋巴瘤和Burkitt淋巴瘤，均表现出NFATc1表达水平的下降。逆转录病毒插入标签实验显示NFATc1以及NFAT5基因是非随机插入位点，认为这些基因参与了肿瘤发生过程。缺失NFATc2和/或NFATc3的基因鼠如果感染淋巴瘤SL3-3病毒将会导致加速T细胞肿瘤的发生，而且与野生型相比NFATc3缺失型小鼠死亡率高。这些说明NFAT转录因子对于平衡淋巴细胞的活化和消除是至关重要的，并且可避免由于淋巴细胞的消除缺陷或活化水平的变化引起的淋巴瘤发生。另外，NF-AT3是CaN依赖的信号传导途径最重要的下游步骤，NF-AT3经CaN去磷酸化后转位入核，发挥信号传递作用，NF-AT3被磷酸化后即可从核内转出，从而终止肥大信号的作用，因此NF-AT3的磷酸化亦是抑制CaN信号途径的手段之一，也可能成为阻止心肌肥厚的作用靶，从而可提供心脏特异性抑制药物，避免免疫抑制等并发症。

一方面，NFAT在免疫应答引起的基因转录过程中起着关键性的作用，它调控获得性免疫应答系统。一方面，NFAT在淋巴细胞的活化，增殖，和凋亡过程中起关键的作用，它促进活化诱导的T/B细胞死亡(AICD)，这种促凋亡活性使得它可作为淋巴系细胞的肿瘤抑制物，平衡淋巴细胞的活化和消除，避免由于淋巴细胞的消除缺陷或活化域值水平的变化引起的淋巴瘤发生。另一方面，在T细胞中，NFAT作为CaN的下游底物可介导Ca²⁺信号对基因表达的调节。在心肌中亦可能存在这样一种将细胞Ca²⁺信号与心脏基因转录活化偶联的潜在机制。在体外培养心肌细胞中，发现CaN、GATA4和NT-AT均为活化形式存在的条件下，可使B型利钠多肽(BNP)启动子的活化增加100倍(Molkentin JD，Lu JR，Antos CL，et al.Cell，1998)。而这条由Ca²⁺活化的、CaN依赖的信号通路可能在心肌肥大的发生发展中起到重要的作用。而且，CaN作为一种多功能信号酶参与多种细胞功能的调节，除了在免疫系统及心肌的作用外，在神经细胞的生长发育，突触可塑性的调节中起重要作用(Guerini等.1997)；在骨骼肌中，可参与肌纤维型转化的调节(Chin等.1998)。已有研究表明，CaN可能参与血管平滑肌细胞(VSMC)中Ca²⁺的调节。因此，NFAT的转录活性对于免疫系统及心肌肥大的发生发展等与CaN依赖的信号通路相关的调控有重要意义。

NFAT是环孢菌素A和FK-506等免疫抑制剂的主要靶标。它们主要通过抑制神经钙调磷酸酶，进而抑制T细胞核中的NFAT，使其基因不能转录和翻译，从而抑制了IL-2，3，4，8，IFN γ等细胞因子和IL-2受体及转铁蛋白的表达，并抑制IgE介导的变态反应。这些生物性免疫抑制剂是未来药物发展的重要趋势之一，具有广阔的应用前景。有些已被美国FDA批准上市，但多数处在试验阶段。抗IL-8单克隆抗体已用于银屑病，有一定疗效。应用IL-10/11，可抑制Th1细胞产生IL-2和IFN-γ，有助于Th1/Th2的平衡，对银屑病有效(Ellis CN，Barker NWN.Psoriasis.CurrProb Dermatol，2000，12：45-50)。而大部分这样的药物能够在非免疫细胞中抑制CaN，选择性差、毒副作用大，所以需要开发没有毒性作用，能直接靶向NFAT的试剂，从而有助于开发选择性强、安全有效的新型免疫调节剂。

发明内容

针对现有技术及现有药物或试剂的不足，本发明的目的是提供一种抑制人体细胞核因子NF-κB和NFAT活化的人类新基因NFIF1，并确定了其表达产物具有抑制NF-κB和NFAT活化的功能，且抑制NF-κB及NFAT活化的作用非常明显、稳定。另外，在细胞内外源高表达NFIF可以较明显导致某些细胞的凋亡。从而提供该基因在制备预防和治疗炎症、过敏性疾病、自身免疫病与肿瘤的药物组合物中以及调节淋巴细胞的活化、增殖和凋亡等免疫调节药物的用途。

本发明的技术方案包括以下内容：

1、其氨基酸序列如序列表中序列2所示的多肽(327个氨基酸)，或其保守性变异多肽，或其活性片段。

2、编码以上项1的多肽的基因。

3、以上项2的基因，特征在于具有序列表中序列1所示的核苷酸序列(NFIF1)，或其片段，或同源性95％以上，尤其99％以上的序列。

4、含有以上项2或3的基因或其片段的表达载体。

5、制备以上项1的多肽的方法，包括将以上项4的基因NFIF1或其片段的表达载体转化宿主细胞，培养，从培养物中分离出所述多肽。

6、一种遗传工程宿主细胞，其特征在于它是用以上项2所述的基因转化或转导的宿主细胞，或用以上项3所述的载体转化或转导的宿主细胞。

7、以上项1的多肽或项2的基因在制备预防和/或治疗与人体细胞核因子NF-κB有关的疾病的药物中的用途，或在制备调节淋巴细胞的活化和/或增殖和/或凋亡的药物或试剂中的用途。

8、根据以上项7的用途，其中所述疾病选自炎症、过敏性疾病、自身免疫病或肿瘤。

9、含有以上项1的多肽和药学上可接受的载体的药物组合物。

10、一种能与以上项1的多肽特异结合的抗体。

11、一种炎症性疾病或肿瘤的体外检测方法，特征在于利用以上项10的抗体检测来自宿主样品中的多肽的存在或水平。

本发明的多肽可以是重组多肽，合成多肽等，优选是重组多肽。本发明的多肽包括保守性变异多肽，或其活性片段，它们是指保留与此多肽相同的生物学功能或活性的多肽。

本发明的核苷酸序列或片段包括其互补链。本发明还涉及包括本发明的多核苷酸的载体，用本发明的载体制造的遗传工程宿主细胞和用重组技术生产的本发明的多肽产品。本发明的多核苷酸序列可以包括在用于表达多肽的众多表达载体中的任意一种中。适宜的载体例如包括细菌质粒、腺病毒，腺相关病毒等。表达载体可以是原核或真核表达载体。含有本发明的基因序列的载体可以用来转化适当宿主细胞以使宿主表达此多肽。

宿主细胞可以是高等真核细胞，如哺乳动物细胞，或者是原核细胞，例如大肠杆菌。

利用基因重组技术，从而可以大量生产本发明的多肽。

本发明的多肽具有抑制人体细胞核因子NF-κB和NFAT活化的作用，人体细胞核因子NF-κB活化与炎症、过敏性疾病、自身免疫病和肿瘤等多种疾病相关，而NFAT活化与淋巴细胞的活化、增殖及凋亡相关。因此本发明的多肽可有效用于预防或治疗这些疾病。

本发明的多肽可以单独或与合适的药用载体组合使用。这种组合物可以包含治疗有效量的多肽和药学可接受的载体或赋型剂，这样的载体包括但不限于：盐水，缓冲盐水，葡萄糖，水，甘醇，乙醇，或混合物，这些制剂应适合给药方式。

本发明的药物组合物可以以适当的方式给药，如通过局部、静脉内、腹腔内、肌内、皮下等途径给药。给药于患者的用量取决于许多因素，如给药方式，治疗者的身体条件和医生的经验。

本发明的多肽也可以通过在活体表达这些多肽来使用。例如患者的细胞可以通过在体外用编码本发明多肽的基因NFIF1进行基因工程操作，然后将工程细胞提供给患者，使工程细胞在体内高表达这种多肽，从而达到治疗的目的。

本发明的多肽，或保守变异多肽或片段，或表达它们的细胞可以作为抗原用来产生抗体，在临床上用于炎症性疾病、过敏性疾病、自身免疫病以及肿瘤的临床诊断、治疗、疗效评价等，还可用于NFIF1抑制NF-κB和NFAT活化分子机制的研究。所述抗体可以是单克隆抗体，或多克隆抗体，还包括嵌和、单链和人源化的抗体以及Fab片段，或Fab表达文库的产物。本发明多肽的抗体可通过将该多肽直接注射给动物来获得。制备单克隆和多克隆抗体的方法在本领域中是公知的，并且描述在众多文献中。该抗体可以用于检测本发明多肽的存在或水平，或用于检测基因。在炎症或肿瘤疾病中，通过检测该多肽的水平或存在，可以用于诊断这些疾病。

NFIF1基因在实验中所有用到的正常组织、胎儿组织、肿瘤组织都有表达，说明其为人体自身重要的NFκB和NFAT调控分子；在不同的组织中表达量高低有差别，说明其在不同的组织中发挥功能的程度不同。

附图说明

图1 pGEM-T Easy载体克隆NFIF1基因编码区cDNA示意图。其中的三角图标为插入NFIF1基因编码区cDNA片段处。

图2 NFIF1基因在人体组织中PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。图中：A为14种人体正常组织，其中依次为：A0空白对照、A1心、A2胰、A3睾丸、A4卵巢、A5前列腺、A6结肠、A7小肠、A8骨骼肌、A9胸腺、A10淋巴结、A11扁桃体、A12白细胞；B为6种人肿瘤组织，其中依次为：B0空白对照、B1肺癌、B2胰腺癌、B3卵巢癌、B4前列腺癌、B5结肠癌、B6乳腺癌；C为8种胎儿组织，其中依次为：C0空白对照、C1胎肺、C2胎心、C3胎肝、C4胎脾、C5胎肾、C6胎脑、C7胎骨骼肌、C8胎胸腺；M为分子量标记；图2中的2-1图和2-2图为NFIF1基因的PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图谱，2-3图为管家基因G3PDH的PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图谱。

图3真核表达载体pcDNA3.1B-NFIF1的构建示意图。

图4 pNF-κB-luc和pNFAT-luc荧光素酶基因报告质粒的结构图。其中上图为pNF-κB-luc荧光素酶基因报告质粒的结构图，下图为pNFAT-luc荧光素酶基因报告质粒的结构图。

图5 NFIF1抑制NF-κB活化及TNF诱导的NF-κB活化。用pcDNA3.1B和pNF-κB-luc共转染293T细胞、无刺激时的荧光素酶活性比值(萤火虫荧光素酶活性/水母荧光素酶活性)设定为1，其中左侧方柱为空白，右侧方柱为TNFα。

图6 NFIF1抑制NF-κB活化及PMA+离子霉素诱导的NF-κB活化。

图中：用pcDNA3.1B和pNF-κB-luc共转染293T细胞、无刺激时的荧光素酶活性比值设定为1，其中左侧方柱为P+I，右侧方柱为空白。

图7 NFIF1抑制MEKK诱导的NF-κB活化。pcDNA3.1B和pNF-κB-luc共转染293T细胞时的荧光素酶活性比值设定为1。其中左侧方柱为TNFα，中间方柱为P+I，右侧方柱为空白。

图8 NFIF1抑制NFAT活化及PMA+离子霉素诱导的NFAT活化。图中：用pcDNA3.1B和pNFAT-luc共转染293T细胞、无刺激时的荧光素酶活性比值设定为1。其中左侧方柱为P+I，右侧方柱为空白。图5-图8中的数据为三次重复试验所得的结果。

以下对本发明的实施方案进一步详细说明。

1、从人体组织分离出NFIF1基因的cDNA，测定其核苷酸序列，并进一步推测得到其编码的氨基酸序列。

本发明通过对NCBI的nr数据库进行人功能未知预测基因检索，获得人未知功能基因序列(Ref：XM_114657；Locus ID：203245；UniGene：Hs.373606)，该核苷酸序列如序列表中序列3所示。

进一步利用Human_est数据库通过BLASTn方法进行序列校正，校正的位点如下：

1)37位碱基由G校正为A；

2)562位碱基由T校正为C；

3)1283位碱基与1284位碱基之间插入45个碱基，预测此插入不改变OR F(开放阅读框)；

4)在该序列最后一个碱基后延伸405个碱基，预测此延伸不改变ORF；

校正后得到的序列如序列表中序列4所示。

另外，分析存在一条可变剪切体，预测此剪切体不改变ORF，其与原序列的不同位于3’非翻译区，序列如序列表中序列5所示。

该基因被命名为NFIF1。NFIF1基因染色体定位9q34.13，由3个外显子和2个内含子组成(其剪切体由2个外显子和1个内含子组成)。预测ORF全长984bp，编码327个氨基酸。

根据NFIF1基因序列，设计NFIF1基因特异引物，(5’引物：5′-gggggtgggtgaggggc-3′3’引物：5′-acccctgccctcactggatg-3′)从混合人组织cDNA文库(脑、肺、结肠、睾丸、Clometech，K14201-1、K1241-1)中通过PCR扩增得到NFIF1基因编码区cDNA片段。PCR扩增中采用TagDNA聚合酶，得到含有3’突出碱基A的扩增产物，经电泳鉴定后将其回收、纯化后插入含有3’突出碱基T的线性pGEM-T Easy载体(Promega，A1360)，  转化大肠杆菌DH5α，提取质粒，用ABI PRISM 3700 DNA分析仪(Perkin-Elmer/applied Biosystem)测序，获得NFIF1基因cDNA片段1091bp(其中984bp是开放读码区)。序列测定结果证实序列较正中562位碱基由T校正为C正确，而其它位点的校正由于不在PCR扩增范围内而未得到证实。测序结果如序列1所示。

pGEM-T Easy载体克隆NFIF1基因编码区cDNA的PCR扩增片段的示意图如图1所示。

根据测序结果分析出NFIF1基因编码蛋白质的氨基酸序列如序列2所示。

2、真核表达载体的构建

为了检测NFIF1对NF-κB和NFAT活化的抑制功能，首先构建含有NFIF1 cDNA的真核表达载体pcDNA3.1B-NFIF1(以下缩写为pcDB-NFIF1)。本发明采用真核表达载体pcDNA3.1/MycHis(-)B(Invitrogen，V85520，以下缩写为pcDB)与NFIF1基因重组构建真核表达载体。pcDB是设计用于重组蛋白在哺乳类动物细胞糸中高表达的载体，它含有人巨细胞病毒CMV启动子，可在哺乳类动物细胞糸中实现高表达。用EcoRI将上述插入pGEM-T Easy载体的NFIF1 cDNA切下，同时EcoRI酶切pcDB，两者连接后转化大肠杆菌DH5α，挑选转化子提取质粒，通过测序挑选正确的正向插入克隆，即得到含有NFIF1 cDNA的真核表达载体pcDB-NFIF1，图3为构建该真核表达载体的示意图。

3、检测NFIF1基因抑制NF-κB和NFAT活化的功能的方法

用pcDB-NFIF1和pNF-κB-luc(Stratagane，219077)，pRL-SV40(Promega，E2231)共转染人胚胎肾293T细胞(ATCC Number：CRL-11268)，采用双荧光素酶报告基因法，测定NFIF1 cDNA在293T细胞中的表达产物对TNFα、PMA(Sigma)+离子霉素(Calbiochem)和MEKK诱导的NF-κB活化以及对PMA(Sigma)+离子霉素(Calbiochem)诱导的NFAT活化的抑制作用。

本发明采用双荧光素酶报告基因法检测NFIF1基因对NF-κB活化的抑制功能，该方法采用的是体内信号转导途径顺式报导系统，其中所用的pNF-κB-luc报告质粒载有萤火虫荧光素酶基因，该基因的表达由合成的启动子所调控，其中包含基本的启动子元件(TATA box)，以及转录因子NF-κB的结合位点，pNF-κB-luc报告质粒的结构图如图4所示。当细胞内的NF-κB通过某种信号转导途径而被活化时，NF-κB便会结合于报告质粒pNF-κB-luc的增强子元件，从而启动报告基因萤火虫荧光素酶基因的转录，进一步胞内翻译成荧光素酶，导致细胞内荧光素酶数量增加，活性增强；相反，当细胞内的NF-κB活化受到抑制的时候，荧光素酶的表达量及活性就低。所以，通过检测荧光素酶的活性，便可以反映不同刺激物以及共转染的目的基因对细胞内NF-κB是否具有活化或者抑制活化的功能。pNFAT-luc报告质粒的使用原理类似于pNF-κB-luc报告质粒。pRL-SV40报告质粒载有水母荧光素酶基因，该基因的表达由猿猴病毒40(SV40)增强子/启动子所调控，转染哺乳动物细胞后可以产生较强的基本水平的水母荧光素酶的表达，且表达的活性不受NF-κB和NFAT活化与否的调节，所以在实验中用作内对照报告基因。

质粒pcDB-NFIF1和pNF-κB-luc，pRL-SV40共转染293T细胞，转染后24小时，用TNFα或PMA+离子霉素激活293T细胞，8小时后，裂解细胞，检测荧光素酶的活性。测得结果表明NFIF1基因在293T细胞内的表达产物对NF-κB的活化有抑制作用。说明NFIF1对NF-κB有负调节作用。

检测NFIF1基因抑制NFAT活化的功能的方法同上，只单用PMA+离子霉素激活293T细胞。测得结果表明NFIF1基因在293T细胞内的表达产物对NFAT的活化有抑制作用。说明NFIF1对NFAT有负调节作用。

本发明的优点：

1、提供了人类新基因NFIF1的cDNA序列及其编码多肽，并首次发现该基因转染具有抑制NF-κB活化的功能；

2、NFIF1具有同时抑制NF-κB和NFAT活化的作用，并且高效、稳定，表明NFIF1在细胞内有比较高的亲和力和效力；

3、NFIF1在机体多数正常细胞表达，说明其为自身重要的NFκB和NFAT调控分子。

4、基于上述的3个优点，本发明为进一步研究NFIF1与NF-κB和NFAT之间的调控关系，以及开发治疗炎症、过敏性疾病、自身免疫病和肿瘤以及调节淋巴细胞的活化、增殖和凋亡的新药物，为开创新的临床诊断、疗效评价及预后指标奠定必要的基础。

具体实施方案

实施例1、NFIF1基因cDNA的克隆

对NCBI的nr数据库进行人功能未知预测基因检索，获得人未知功能基因序列(Ref：XM_114657；Locus ID：203245；UniGene：Hs.373606)，该序列设定为序列3，并利用Human_est数据库通过BLASTn方法进行序列校正，最终得到的序列设定为序列4。根据序列序列4设计NFIF1基因特异引物：

5’引物：5’-GGGGGTGGGTGAGGGG-3’

3’引物：3’-ACCCCTGCCCTCACTGGATG-3’

用上述引物，以混合人组织cDNA文库(脑、肺、胰、睾丸、ClonetechK1420-1，K1241-1)为模板进行PCR扩增反应，反应条件如下：

反应体积50μl，其中含有：

混合人组织cDNA模板       2μl(其中脑、肺、结肠、睾丸各0.5μl)

引物                     5’引物、3’引物终浓度各0.2μM

dNTP                     终浓度各200μM

Taq DNA聚合酶            2.5U

10x Taq DNA聚合酶缓冲液  5μl

用双蒸水补足至50μl体积。

反应温度、时间：94℃，5分钟变性后，94℃变性30秒，63℃退火30秒，72℃延伸80秒，扩增30个循环，最后在72℃下延伸7分钟。

扩增产物为3’有碱基A的3’突出粘端片段，用QIA快速胶回收试剂盒(Qiagen，28704)按产品说明书进行纯化，然后与3’有碱基T的线性pGEM-T EASY载体(Promega，A1360)在16℃下连接过夜，使用2mm电极杯，2500V转化大肠杆菌DH5α，转化物在含氨苄青霉素的LB平板培养基上生长，挑选克隆，提取质粒，使用AbI PRISM 3700 DNA分析仪(Perkin-Elmer/Applied Biosystem)测序，获得NFIF1基因的cDNA1091bp，其中ORF全长984bp，编码327个氨基酸。

实施例2、RT-PCR法检测NFIF1基因在人体组织中的转录产物用NFIF1基因的特异引物：

5’引物：5’-TGTGTCCGTCGCCATGACAG-3’

3’引物：5’-TGGTTGAGTGGCAGGTGAGG-3’

分别以12种人体正常组织(心、胰、睾丸、卵巢、前列腺、结肠、小肠、骨骼肌、胸腺、淋巴结、扁桃体、白细胞)；6种人肿瘤组织(肺癌、胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌、结肠癌、乳腺癌)；和8种胎儿组积(胎肺、胎心、胎肝、胎脾、胎肾、胎脑、胎骨骼肌、胎胸腺)的cDNA文库(Clonetch，K1420-1，1241-1)为模板进行PCR扩增。

PCR扩增条件如下：

反应体积50μl，其中含有：

混合人组织cDNA模板         2μl  (其中脑、肺、结肠、睾丸各0.5μl)

引物                       5’引物、3’引物终浓度各0.2μM

dNTP                       终浓度各200μM

Taq DNA聚合酶              2.5U

10x Taq DNA聚合酶缓冲液    5μl

用双蒸水补足至50μl体积。

反应条件：

94℃，5分钟变性后，94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸30秒，扩增30个循环，最后在72℃下延伸7分钟。另外，用管家基因特异引物：5’引物：5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’，3’引物：5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’分别用上述同样的模板进行PCR扩增，作为内对照。PCR反应体系同前，反应条件如下：94℃，5分钟变性后，94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸30秒，扩增25个循环，最后在72℃下延伸7分钟。PCR反应结果如图2所示，扩增的结果表明，这些组织的细胞中都存在NFIF1基因的cDNA(参照图2)，说明NFIF1在这些组织的细胞中都产生了NFIF1基因的转录产物，有较广的表达图譜，在多种组织中参与转录因子的调节。

实施例3、NFIF1基因真核表达载体的构建

用EcoRI(Promega)将NFIF1基因的cDNA片段从pGEM-T Easy载体(Promega，A1360)上切下，同时用EcoRI酶切真核表达载体pcDNA3.1/mycHis(-)B(Invitrogen，V85520)，按照J.Sambrook等，分子克隆实验指南第二版所述方法，将酶切后的NFIF1与载体在16℃下连接过夜，转化大肠杆菌DH5α，转化物在含氨苄青霉素的LB平板培养基上生长，挑选生长的菌落，提取质粒，用EcoRI酶切，酶切产物用琼脂糖凝胶电泳鉴定，挑选有插入片段的阳性克隆，通过测序(使用ABI PRISM3700 DNA分析仪，同上)，选出正确的正向插入克隆，命名为pcDNA3.1B-NFIF1。

同时收集培养液，用SDS-PAGE分析沉淀蛋白，获得NFIF1多肽。

NFIF1蛋白分析结果显示：NFIF1蛋白序列如序列表序列2所示，分子量35.1kD，等电点6.82。跨膜区分析(TMHMM分析，http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM)显示无跨膜区。核定位信号分析无明显的核定位信号。亚细胞定位分析提示位于细胞核的可能性最大(细胞核：39.1％；线粒体：30.4％；细胞浆：17.4％；分泌系统小泡：8.7％；细胞骨架：4.3)。

实施例4、双荧光素酶报告基因法测定NFIF1对TNFα、PMA+离子霉素诱导NF-κB活化的抑制作用。

用目的基因pcDB-NFIF1和报告基因pNF-κB-luc，pRL-SV40共转染人胚胎肾293T细胞，通过分别检测两种荧光素酶活性来测定NF-κB的活性。共转染的方法为脂质体转染法，采用LipfectanineTM2000(Invitrogen，11668027)，按产品说明书所述进行。

转染操作步骤如下：

(1)细胞培养：将293T细胞(ATCC Number：CRL-11268)(2.0×104)用含10％胎牛血清的DMEM(Dulbecco′s modified Eagle′s medium)培养基(Hyclone，SH0022.02)铺在96孔细胞培养板(Costar，3599)上，在5％CO2，37℃的培养箱中培养16小时。

(2)制备DNA-LipfectamineTM2000复合物：用25μl不含血清的DMEM培养基稀释20ng pNF-KB-luc，2ngpRL-SV40和0-80ngpcDB-NFIF1，缓慢混合均匀；同样用25μl DMEM培养基稀释适当量的Lipfectamin^TM2000，缓慢混合均匀，在室温下保温5分钟后，与稀释的DNA缓慢混合，室温放置20分钟，以形成DNA-Lipofectamine 2000复合物。

(3)转染：将DNA-Lipofectamine 2000复合物缓慢滴入细胞培养板(50μl/孔)，轻微摇匀。5％CO2，37℃的培养箱中培养24小时。

24小时后用TNFα(肿瘤坏死因子α，IYX300-01A2，终浓度20ng/ml)或PMA(十四酸佛波酯，Calbiochem，524400，终浓度50ng/ml)+离子霉素(Calbiochem，407950，终浓度1nM)刺激细胞，或不加刺激物；8小时后弃去培养基，加入Reporter Lysis Buffer(Promega，E4030)，在-80℃下放置30分钟，取出后在室温自然融化，使细胞裂解，然后将细胞裂解液移入荧光板(Gronier，655075)，用Dual-Luciferase ReporterAssay System 10-Pack(Promaga，E1960)，通过Fluostar OPTIMA(BMGLabtechnologies)检测荧光素酶活性。

设定转染pcDB空载体、不加刺激物时细胞内的荧光素酶活性比值(萤火虫荧光素酶荧光强度/水母荧光素酶荧光强度表示)为1，其他条件下细胞内的荧光素酶活性比值以此为标准，用相对值表示。

结果：

(1)NFIF1对TNFα诱导NF-κB活化的抑制作用

参照图5，分别用0、10、20、40、80ng pcDNA3.1B-NFIF1和20ngpNF-B-luc共转染293T细胞，随着共转染中pcDNA3.1B-NFIF1用量的增加，用TNFα刺激的293T细胞中荧光素酶的活性明显地迅速下降，而未用TNFα刺激的293T细胞中荧光素酶的活性下降较为缓慢，表明NFIF1在293T细胞中的表达产物对TNFα诱导NF-κB活化有强的抑制作用。

(2)NFIF1对PMA+离子霉素诱导NF-κB活化的抑制作用

参照图6，分别用0、10、20、40、80ng pcDNA3.1B-NFIF1和20ng pNF-κB-luc共转染293T细胞，与TNFα诱导类似，随着共转染中pcDNA3.1B-NFIF1的用量的增加，用PMA+离子霉素诱导刺激的293T细胞中荧光素酶的活性明显地迅速下降，而未用PMA+离子霉素刺激的293T细胞中荧光素酶的活性下降平缓，同样表明NFIF1在293T细胞中的表达产物对PMA+离子霉素诱导NF-κB活化有强的抑制作用。

实施例5、双荧光素酶报告基因法测定NFIF1对MEKK诱导的NF-κB活化的抑制作用。除了用20ng pNF-κB-luc、2ngpRL-SV40、0-80ngpcDNA3.1B-NFIF1(不足80ng时用pcDNA3.1B载体补足)和20ngpFC-MEKK(Stratageme，219077)共转染293T细胞，以及转染24小时后直接裂解细胞以外，其余与实施例4相同。

结果：

参照图7，分别用0、10、20、40、80ng pcDNA3.1B-NFIF1和20ngpNF-κB-luc、2ngpRL-SV40以及20ng pFC-MEKK共转化293T细胞，NFIF1对MEKK诱导的NF-κB活化的抑制作用与对TNF、PMA+离子霉素诱导的相似，由此说明NFIF1对MEKK诱导的NF-κB活化有强的抑制作用。

根据以上实验结果，可以确定，当NF-κB的活化引起与某些疾病相关基因的转录表达活化时，NFIF1对NF-κB活化的抑制作用可以阻止该疾病的发生和发展。因此，本发明可以用于制备预防和治疗炎症、过敏性疾病、自身免疫病和肿瘤的药物。

实施例6、双荧光素酶报告基因法测定NFIF1对PMA+离子霉素诱导的NFAT活化的抑制作用。

除了用20ng pNFAT-luc代替pNF-κB-luc转染外，其余与实施例4中NFIF1对PMA+离子霉素诱导NF-κB活化的抑制作用实验相同。

结果：

参照图8，分别用0、10、20、40、80ng pcDNA3.1B-NFIF1和20ngPnfat-luc共转染293T细胞，随着共转染中pcDNA3.1B-NFIF1的用量的增加，用PMA+离子霉素诱导刺激的293T细胞中荧光素酶的活性明显地迅速下降，而未用PMA+离子霉素刺激的293T细胞中荧光素酶的活性下降平缓，同样表明NFIF1在293T细胞中的表达产物对PMA+离子霉素诱导NFAT活化有强的抑制作用。

因此，本发明可以用于调节淋巴细胞的活化、增殖和凋亡的新药物的开发。

实施例7、抗体制备

抗原选用原核细胞或真核细胞表达的NFIF1蛋白全长或部分肽段，也可以合成多肽作为抗原。

多克隆抗体的制备：免疫动物选用成年雄性新西兰兔或BALb/c小鼠，初次免疫用200ug(新西兰兔)或20ug(BALb/c小鼠)抗原与等体积弗氏完全佐剂(FCA)充分乳化后，于背部皮下多点注射。初次免疫后21、42、63天，用弗氏不完全佐剂(FIA)完全乳化的抗原蛋白，各加强免疫1次，用量同前。每次免疫后7～10天，ELISA方法检测血清效价，达到1×10-4时，放血分离血清.Western blot鉴定抗体特异性。

单克隆抗体制备：免疫BALb/c小鼠同前，取脾脏制成B细胞悬液，与对数生长期的骨髓瘤细胞SP2/0融合，通过HAT(H，次黄嘌呤；A，氨基喋呤；T，胸腺嘧啶核苷)选择性培养，获得杂交细胞系，再通过ELISA方法检测抗体效价，筛选出特定的杂交瘤细胞系，并得到单克隆抗体。

NFIF1抗体在临床上可以用于炎症性疾病、过敏性疾病、自身免疫病以及肿瘤的临床诊断、治疗、疗效评价等，还可用于NFIF1抑制NF-κB与NFAT活化分子机制的研究。

SEQUENCE LISTING

<110>北京大学  北京诺赛基因组研究中心有限公司

<120>一种抑制人体细胞核因子NF-κB和NFAT活化的基因及其编码的多肽和用途

<130>

<160>5

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1091

<212>DNA

<213>人

<220>

<221>CDS

<222>(98)..(1078)

<223>

<400>1

gggggtgggt gaggggcgag gctgaggaag aagagaaggg gaattggggc gcttgagggg   60

attataattt ctttaaaaag aggggagggg agaggccatg gcc gtc cca gcc aag    115

                             Met Ala Val Pro Ala Lys

                             1          5

aaa agg aag atg aac ttc tca gag cgg gag gtg gag atc atc gtg gag    163

Lys Arg Lys Met Asn Phe Ser Glu Arg Glu Val Glu Ile Ile Val Glu

        10            15             20

gag ctg gag ctg aag aag cac ctg ctg gtg aac cac ttc aac gcc ggg  211

Glu Leu Glu Leu Lys Lys His Leu Leu Val Asn His Phe Asn Ala Gly

     25            30             35

gta ccc ctg gcc gcc aag agt gcg gcc tgg cac ggc atc ctg aga agg  259

Val Pro Leu Ala Ala Lys Ser Ala Ala Trp His Gly Ile Leu Arg Arg

   40             45            50

gtc aac gcc gtg gcc acc tgc cgc aga gag ctg cct gag gtc aag aag  307

Val Asn Ala Val Ala Thr Cys Arg Arg Glu Leu Pro Glu Val Lys Lys

55             60            65            70

aag tgg tct gac ctc aag acc gag gtc cgt cgc aag gtt gcc cag gtc  355

Lys Trp Ser Asp Leu Lys Thr Glu Val Arg Arg Lys Val Ala Gln Val

           75            80             85

cgg gcc gcc gtg gag ggt ggt gag gcg ccg ggg ccc act gag gag gac  403

Arg Ala Ala Val Glu Gly Gly Glu Ala Pro Gly Pro Thr Glu Glu Asp

        90             95            100

gga gct ggg ggg cct ggg aca ggc ggt ggc agt ggc ggc ggt ggc cca  451

Gly Ala Gly Gly Pro Gly Thr Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Pro

     105            110           115

gct gta gcc cca gtg ctg ctg acc ccc atg caa caa cgt atc tgc aac  499

Ala Val Ala Pro Val Leu Leu Thr Pro Met Gln Gln Arg Ile Cys Asn

   120            125            130

ctg ctg ggc gag gcc acc atc atc agc ctg ccc agc acc aca gag atc  547

Leu Leu Gly Glu Ala Thr Ile Ile Ser Leu Pro Ser Thr Thr Glu Ile

135             140             145             150

cac cct gtg gcc ctc gga ccc tcg gcc acc gca gcc gca gcc acg gtc  595

His Pro Val Ala Leu Gly Pro Ser Ala Thr Ala Ala Ala Ala Thr Val

           155            160             165

acc ctg aca cag atc ccc aca gag acc acc tat cac acg ctg gag gag  643

Thr Leu Thr Gln Ile Pro Thr Glu Thr Thr Tyr His Thr Leu Glu Glu

        170             175            180

ggc gtg gtg gag tac tgc acg gct gag gcg ccc cca cct ctg cca cca  691

Gly Val Val Glu Tyr Cys Thr Ala Glu Ala Pro Pro Pro Leu Pro Pro

      185             190           195

gag acc cct gtg gac atg atg gcc cag cat gca gac acg tcg gtc aag  739

Glu Thr Pro Val Asp Met Met Ala Gln His Ala Asp Thr Ser Val Lys

   200            205           210

ccg caa gcg ctc aag agc cgc att gct ctc aac tcc gcc aag ctg ata  787

Pro Gln Ala Leu Lys Ser Arg Ile Ala Leu Asn Ser Ala Lys Leu Ile

215           220             225             230

cag gag cag cgg gtc acc aac ctg cat gtg aag gag atc gca cag cac  835

Gln Glu Gln Arg Val Thr Asn Leu His Val Lys Glu Ile Ala Gln His

          235            240            245

ctg gaa cag cag aac gac cta ctg cag atg atc cgc cgc tcc cag gaa  883

Leu Glu Gln Gln Asn Asp Leu Leu Gln Met Ile Arg Arg Ser Gln Glu

       250            255            260

gtg cag gcc tgt gcc cag gag cgc cag gcc cag gcc atg gag ggc aca  931

Val Gln Ala Cys Ala Gln Glu Arg Gln Ala Gln Ala Met Glu Gly Thr

      265           270           275

cag gct gcc ctg agc gtc ctc atc cag gtc ctc cgg cct atg atc aaa  979

Gln Ala Ala Leu Ser Val Leu Ile Gln Val Leu Arg Pro Met Ile Lys

   280             285            290

gat ttc cgc cgc tac ctg cag agc aac aca gct aac ccg gcc ccc gcc  1027

Asp Phe Arg Arg Tyr Leu Gln Ser Asn Thr Ala Asn Pro Ala Pro Ala

295           300            305            310

tct gac cct ggg cag gtg gcc cag aat ggg cag cca gac agc atc atc  1075

Ser Asp Pro Gly Gln Val Ala Gln Asn Gly Gln Pro Asp Ser Ile Ile

          315             320           325

cag tgagggcagg ggt                                               1091

Gln

<210>2

<211>327

<212>PRT

<213>人

<400>2

Met Ala Val Pro Ala Lys Lys Arg Lys Met Asn Phe Ser Glu Arg Glu

1          5              10            15

Val Glu Ile Ile Val Glu Glu Leu Glu Leu Lys Lys His Leu Leu Val

        20              25             30

Asn His Phe Asn Ala Gly Val Pro Leu Ala Ala Lys Ser Ala Ala Trp

     35             40              45

His Gly Ile Leu Arg Arg Val Asn Ala Val Ala Thr Cys Arg Arg Glu

   50             55            60

Leu Pro Glu Val Lys Lys Lys Trp Ser Asp Leu Lys Thr Glu Val Arg

65             70            75            80

Arg Lys Val Ala Gln Val Arg Ala Ala Val Glu Gly Gly Glu Ala Pro

          85             90             95

Gly Pro Thr Glu Glu Asp Gly Ala Gly Gly Pro Gly Thr Gly Gly Gly

        100            105            110

Ser Gly Gly Gly Gly Pro Ala Val Ala Pro Val Lgu Leu Thr Pro Met

      115           120             125

Gln Gln Arg Ile Cys Asn Leu Leu Gly Glu Ala Thr Ile Ile Ser Leu

   130             135          140

Pro Ser Thr Thr Glu Ile His Pro Val Ala Leu Gly Pro Ser Ala Thr

145             150            155            160

Ala Ala Ala Ala Thr Val Thr Leu Thr Gln Ile Pro Thr Glu Thr Thr

           165             170             175

Tyr His Thr Leu Glu Glu Gly Val Val Glu Tyr Cys Thr Ala Glu Ala

        180           185             190

Pro Pro Pro Leu Pro Pro Glu Thr Pro Val Asp Met Met Ala Gln His

      195           200             205

Ala Asp Thr Ser Val Lys Pro Gln Ala Leu Lys Ser Arg Ile Ala Leu

  210            215             220

Asn Ser Ala Lys Leu Ile Gln Glu Gln Arg Val Thr Asn Leu His Val

225           230             235             240

Lys Glu Ile Ala Gln His Leu Glu Gln Gln Asn Asp Leu Leu Gln Met

          245             250              255

Ile Arg Arg Ser Gln Glu Val Gln Ala Cys Ala Gln Glu Arg Gln Ala

        260             265            270

Gln Ala Met Glu Gly Thr Gln Ala Ala Leu Ser Val Leu Ile Gln Val

     275            280           285

Leu Arg Pro Met Ile Lys Asp Phe Arg Arg Tyr Leu Gln Ser Asn Thr

   290            295           300

Ala Asn Pro Ala Pro Ala Ser Asp Pro Gly Gln Val Ala Gln Asn Gly

305           310             315             320

Gln Pro Asp Ser Ile Ile Gln

          325

<210>3

<211>1416

<212>DNA

<213>人

<400>1

cattacgctg ctggctggca gcggccgggc cggtcggggc tgggccctac gcactttgcg   60

tagcgagggg ggttaccaaa ggcctagtgc ttggcctcga gcaagcctgg cctatcccct  120

gtagggggtg ggtgaggggc gaggctgagg aagaagagaa ggggaattgg ggcgcttgag  180

gggattataa tttctttaaa aagaggggag gggagaggcc atggccgtcc cagccaagaa  240

aaggaagatg aacttctcag agcgggaggt ggagatcatc gtggaggagc tggagctgaa  300

gaagcacctg ctggtgaacc acttcaacgc cggggtaccc ctggccgcca agagtgcggc  360

ctggcacggc atcctgagaa gggtcaacgc cgtggccacc tgccgcagag agctgcctga  420

ggtcaagaag aagtggtctg acctcaagac cgaggtccgt cgcaaggttg cccaggtccg  480

ggccgccgtg gagggtggtg aggcgccggg gcccactgag gaggacggag ctggggggcc  540

tgggacaggc ggtggcagtg gtggcggtgg cccagctgta gccccagtgc tgctgacccc    600

catgcaacaa cgtatctgca acctgctggg cgaggccacc atcatcagcc tgcccagcac    660

cacagagatc caccctgtgg ccctcggacc ctcggccacc gcagccgcag ccacggtcac    720

cctgacacag atccccacag agaccaccta tcacacgctg gaggagggcg tggtggagta    780

ctgcacggct gaggcgcccc cacctctgcc accagagacc cctgtggaca tgatggccca    840

gcatgcagac acgtcggtca agccgcaagc gctcaagagc cgcattgctc tcaactccgc    900

caagctgata caggagcagc gggtcaccaa cctgcatgtg aaggagatcg cacagcacct    960

ggaacagcag aacgacctac tgcagatgat ccgccgctcc caggaagtgc aggcctgtgc   1020

ccaggagcgc caggcccagg ccatggaggg cacacaggct gccctgagcg tcctcatcca   1080

ggtcctccgg cctatgatca aagatttccg ccgctacctg cagagcaaca cagctaaccc   1140

ggcccccgcc tctgaccctg ggcaggtggc ccagaatggg cagccagaca gcatcatcca   1200

gtgagggcag gggtcaggcc agccttctgc catgatggga tgaaaactcc atggacttac   1260

tcaccatcaa ttaccaaggc ccttgcctca gccacatatg accaatggtt acaactcagg   1320

gctccagacc tcagctaaaa agagaagacg ctgccctcct gggcacgaac gtttagaatg   1380

ctcaactcct ctattgtgac cacaggaagg tggccc                             1416

<210>4

<211>1866

<212>DNA

<213>人

<400>1

cattacgctg ctggctggca gcggccgggc cggtcgaggc tgggccctac gcactttgcg     60

tagcgagggg ggttaccaaa ggcctagtgc ttggcctcga gcaagcctgg cctatcccct    120

gtagggggtg ggtgaggggc gaggctgagg aagaagagaa ggggaattgg ggcgcttgag    180

gggattataa tttctttaaa aagaggggag gggagaggcc atggccgtcc cagccaagaa    240

aaggaagatg aacttctcag agcgggaggt ggagatcatc gtggaggagc tggagctgaa    300

gaagcacctg ctggtgaacc acttcaacgc cggggtaccc ctggccgcca agagtgcggc    360

ctggcacggc atcctgagaa gggtcaacgc cgtggccacc tgccgcagag agctgcctga    420

ggtcaagaag aagtggtctg acctcaagac cgaggtccgt cgcaaggttg cccaggtccg    480

ggccgccgtg gagggtggtg aggcgccggg gcccactgag gaggacggag ctggggggcc    540

tgggacaggc ggtggcagtg gcggcggtgg cccagctgta gccccagtgc tgctgacccc    600

catgcaacaa cgtatctgca acctgctggg cgaggccacc atcatcagcc tgcccagcac    660

cacagagatc caccctgtgg ccctcggacc ctcggccacc gcagccgcag ccacggtcac    720

cctgacacag atccccacag agaccaccta tcacacgctg gaggagggcg tggtggagta    780

ctgcacggct gaggcgcccc cacctctgcc accagagacc cctgtggaca tgatggccca    840

gcatgcagac acgtcggtca agccgcaagc gctcaagagc cgcattgctc tcaactccgc     900

caagctgata caggagcagc gggtcaccaa cctgcatgtg aaggagatcg cacagcacct     960

ggaacagcag aacgacctac tgcagatgat ccgccgctcc caggaagtgc aggcctgtgc    1020

ccaggagcgc caggcccagg ccatggaggg cacacaggct gccctgagcg tcctcatcca    1080

ggtcctccgg cctatgatca aagatttccg ccgctacctg cagagcaaca cagctaaccc    1140

ggcccccgcc tctgaccctg ggcaggtggc ccagaatggg cagccagaca gcatcatcca    1200

gtgagggcag gggtcaggcc agccttctgc catgatggga tgaaaactcc atggacttac    1260

tcaccatcaa ttaccaaggc ccttgcatct ccccagatcg tttcccaagt ttggcgattt    1320

gctgtcggtg cctcagccac atatgaccaa tggttacaac tcagggctcc agacctcagc    1380

taaaaagaga agacgctgcc ctcctgggca cgaacgttta gaatgctcaa ctcctctatt    1440

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Claims (10)

1、一种抑制NF-κB和NFAT活化的多肽，其氨基酸序列如序列表中序列2所示。

2、编码权利要求1的多肽的基因。

3、权利要求2的基因，特征在于所述基因的核苷酸序列如序列表中序列1所示。

4、含有权利要求2或3的基因的表达载体。

5、制备权利要求1的多肽的方法，包括将权利要求4的基因的表达载体转化宿主细胞，培养，从培养物中分离出所述多肽。

6、一种遗传工程宿主细胞，其特征在于它是用权利要求2所述的基因转化或转导的宿主细胞，或用权利要求3所述的载体转化或转导的宿主细胞。

7、权利要求1的多肽或权利要求2的基因在制备预防和/或治疗炎症、过敏性疾病、自身免疫病或肿瘤的药物中的用途。

8、权利要求1的多肽或权利要求2的基因在制备调节淋巴细胞的活化和/或增殖和/或凋亡的药物或试剂中的用途。

9、含有权利要求1的多肽和药学上可接受的载体的药物组合物。

10、一种能与权利要求1的多肽特异结合的抗体。

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