JPH09508267A

JPH09508267A - 自然抵抗性結合マクロファージタンパク質およびその使用法

Info

Publication number: JPH09508267A
Application number: JP7519407A
Authority: JP
Inventors: ハワードバートン，チャールズ; ケイティホワイト，ジャックリーン; メアリーブラックウェル，ジェニファー
Original assignee: ザウェルカムトラストリミテッドアズトラスティートゥーザウェルカムトラスト
Priority date: 1994-01-19
Filing date: 1995-01-19
Publication date: 1997-08-26
Also published as: AU1422595A; US5869247A; EP0740700A1; WO1995020044A1; CA2181544A1

Abstract

(57)【要約】動物の主要な食細胞であるマクロファージは微生物を結合し摂取する。自然抵抗性結合マクロファージタンパク質がＮ−末端領域にＳｒｃホモロジ−３結合ドメインを含むように提供される。マクロファージにこのタンパク質が存在する場合、このタンパク質は微生物に対する耐性を調節することができる。

Description

【発明の詳細な説明】自然抵抗性結合マクロファージタンパク質およびその使用法発明の分野本発明は、自然抵抗性結合マクロファージタンパク質をコード化するヌクレオチド配列と、そのタンパク質生成物と、それに対するヌクレオチドのプローブおよびヌクレオチドプライマーと、タンパク質のポリペプチドフラグメントと、関連抗体とに関する。発明の背景マクロファージは、動植物の主要な食細胞であり、免疫系に重要な役割を果たす。マクロファージは、免疫系によって外来物質と認識された粒子と結合し摂取する。このような粒子には、微生物を含む。３種類の微生物Salmonella typhimurium、Leishmania donovani、Mycrobacter ium bovis(BCG)はすべて、マクロファージの細胞内病原体である。３つの科学者のグループは個別に、これらマクロファージ各々に対する耐性と感受性を調節することができる遺伝子を以前に同定していた。この遺伝子は、それぞれIty、Lsh 、Bcgと称された。後の研究によって、科学者はIty／Lsh／Bcgは単一の遺伝子であり、マクロファージレベルで発現すると結論するに至った（参考文献１）。最近、Vidalら（参考文献２）は、Lsh／Ity／Bcgの最も候補になりそうなマウス遺伝子をクローン化した。この遺伝子は、自然抵抗性結合マクロファージタンパク質（Nramp）遺伝子と呼ばれている。NrampのcDNA は、プレＢ細胞cDNAライブラリーから単離され、配列決定された。タンパク質生成物のアミノ酸配列は、ヌクレオチド配列から導出されたものであり、53kDaタンパク質を予測するものである。この導出されたアミノ酸配列に基づき、Vidal らは、Nrampには微生物を含むマクロファージの細胞内液胞膜を通過して硝酸塩を輸送する作用があると提唱した。この液胞の酸環境では、硝酸塩は亜硝酸塩から毒性の酸化窒素に変換されるため、微生物の殺傷を促進することができる。本発明者らは、マクロファージ発現Nramp cDNAを単離し、配列決定をした。Vi dalらの説に反し、本発明者らはN-末端の付加的なアミノ酸配列をコード化する領域を含む異なるヌクレオチド配列を発見した。驚くべきことに、その付加的なアミノ酸配列には、信号伝達経路に不可欠なタンパク質−タンパク質反応に応答するため、Nrampが耐病性マクロファージに信号を送出する膜内外の初期増幅を、チロシンキナーゼのSH3ドメインまたはその他の分子に結合することによって調節するよう動機をつくる構造的特徴が含まれている。発明の大要本発明は、ある態様では、N-末端領域にSH3ドメインを含む自然抵抗性結合マクロファージタンパク質を提供する。マクロファージにこのタンパク質が存在する場合、病原性微生物に対する耐性を調節することができる。 SH3（Src相同体３）ドメインは、信号伝達に必要な特異的タンパク質−タンパク質相互作用を仲介すると考えられており、種々のタンパク質の関連配列として同定されている（参考文献４および５）。本発明に係る一態様では、SH3結合ドメインは、SH3結合モチーフPGPAPQPXPXR，特に、PGPAPQPAPCRを含む。このモチーフは、マウスから獲得可能なタンパク質に含まれるている。本発明に係る別の態様では、SH3結合ドメインは、SH3結合モチーフPXSPTSPXPXXAPPRXT，特に、PTS PTSPGPQQAPPRET．を含む。このモチーフは、ヒトから獲得可能なタンパク質に含まれている。一般に、SH3結合ドメインはプロリンに富んでおり、セリンが豊富なこともある。さらに、マウスから獲得可能なSH3結合ドメインは、ポリペプチドセグメント( S,A)PP(R,K)XSRPXXXS(I,V)XSXをSH3結合モチーフのN-末端終端に含むことが好ましい。特に、このポリペプチドセグメントは、SPPRLSRPSYGSISSL．である。さらに、ヒトから獲得可能なSH3結合ドメインは、ポリペプチドセグメントGPQRLSGSSYGSI SS．を含むことが好ましい。 N-末端領域のさらに好ましい特徴は、タンパク質キナーゼＣ(PKC)をリン酸化するために１つ以上の共通配列が存在することである。N-末端領域は、SH3結合ドメインに隣接する２つのタンパク質キナーゼＣ部位を有することが好ましい。一般に、N-末端領域は、64個のアミノ酸を含む。マウスタンパク質およびヒトタンパク質の完全なアミノ酸配列は、図９に示した。突然変異または欠失は、タンパク質の活性に実質的に影響しないことを条件に、各配列に存在すると考えられる。別の態様では、本発明は、上述の自然抵抗性結合マクロファージタンパク質をコード化するヌクレオチド配列を提供する。ヌクレオチド配列がDNA配列である場合、これは、イントロンと、エキソンまたはmRNAから逆転写によって得られた cDNAとを含むゲノム配列であり得る。マウスから獲得可能なタンパク質のSH3結合ドメインは、好ましくは、CCTGGCCCAGCACCTCAGCCAGCGCCTTGCCGGを含むDNA配列によってコード化され、さらに、上流領域AGCCCCCCGAGGCTGAGCAGGCCCAGTTATGGCT CCATTTCCAGCCTG．を含んでいても良い。特にゲノムDNA配列の5’末端は図４に示し、以下で詳細に説明する。cDNA配列も、図２に示したように提供される。ヒトから獲得可能なタンパク質のSH3結合ドメインは、CCG ACC AGC CCG ACC AGC CCA GGG CCA CAG CAA GCA CCT CCC AGA GAG ACCを含むDNA配列によってコード化されることが好ましく、上流領域GGT CCC CAA AGG CTA AGC GGG TCC AGC TAT GGT TCC ATC TCC AGC．を含んでいても良い。当業者には、上述の具体的なヌクレオチド配列の種々の修飾および欠失によっても、機能的タンパク質生成物が生じることは容易に理解できよう。遺伝子コードの縮重のために、特定の配列内の大多数のサイレント突然変異によって、同一のアミノ酸配列が生じることは明白であろう。 cDNA配列は、英国ロンドンのCentral Public Health LaboratoryのNational C ollection of Type Culturesの登録番号NTC 12855pに基づくプラスミドBabeλ8. 1の一部として、析出している。このプラスミドを用いて形質転換されたE.Coli DH5αの培養から構成される析出物は、1994年1月14日が析出日として定められた。一般に、レトロウイルスベクターを使用することは、造血細胞への遺伝子導入には良い方法であり、他の方法よりも、遺伝子の単コピーを受容細胞に安定して導入したり、標的細胞への遺伝子導入を効率よくできるなどの利益がある。ベクター構成物は、標準的な分子生物学的技術を非複製コンピテントウイルスのゲノムに用いて、問題の遺伝子を結合することによって生成さられる。生成ベクター構成物は、ウイルスのゲノムを複製しそれを感染性偽ウイルス粒子に充填することができる細胞系（充填細胞系）に導入される。この充填細胞系によってコード化されるウイルスエンベロープタンパク質によって、結果として生じる偽ウイルス粒子は、広範な宿主域に感染することができる（両栄養的）か、または、齧歯類細胞に限り感染することができる（環境栄養的）。本発明では、pBabeプラスミドを適切なレトロウイルスベクターとして用いた。このプラスミドについて、さらに詳細に説明する（参考文献６）。プラスミド pBabeλ8.1は、GP+86環境栄養的充填細胞（参考文献７）や抗生物質抵抗性を付与する連鎖標識遺伝子に選択された組換えクローンなどの適切な充填細胞に導入することができる。次に、抗生物質抵抗性クローンが機能的疑似ウイルス粒子を分泌し受容細胞に感染する能力を試験することができる。発現の欠如が観察されるか、非機能的コピーが存在する場合には、Nrampを伝達する遺伝子の選択レトロウイルス構成物を遺伝子療法の基剤として使用し、遺伝子の機能的コピーを作成することができる。遺伝子導入の最も適当な方法は、循環から単離された骨髄細胞または始原細胞を使用することによるものである。遺伝子は、患者から除去されたこれらの幹細胞にレトロウイルス的に導入することができる。次に幹細胞は、骨髄／リンパ細胞系を遺伝子の機能的コピーを含む細胞と再共生させるために、患者に再導入する。別の態様では、本発明は、上述のヌクレオチド配列の一部をハイブリッド形成することができるヌクレオチドのプローブまたはプライマー、好ましくはSH3結合ドメインまたはその上流を含むN-末端領域コード化する上述の配列の少なくとも一部を提供する。プローブは一本鎖または二本鎖であり得、遺伝子のコピーまたはその一部から組換えＤＮＡ技術によって、あるいは、オリゴヌクレオチドプローブに至るような合成経路によって作成することができる。ポリメラーゼ連鎖反応の作用に対するものなどのプライマーは、一本鎖であり、好ましくは、少なくとも18ヌクレオチド分の長さがある。この配列に基づくプローブとプライマーは、DNAレベルとRNAレベルの両方で診断に用いることができ、こうしたプローブやプライマーは本文で提供される配列情報を用いて容易に作成することができる。上述のcDNAは、それ自体遺伝子にとって有用なプローブである。本発明者らは、上述のマウス遺伝子のcDNA配列を対応するヒト遺伝子のプローブとして首尾良く使用できることを発見した。プローブまたはプライマーは、遺伝子欠失または骨髄系もしくはリンパ系の細胞の遺伝子発現を検出するなど診断的な利用が考えられる。また、発現してはいるが結果的には二次機能的または非機能的なタンパク質であると考えられる遺伝子座の多形を検出することもできる。診断すべき遺伝的欠失は、コード配列すなわち遺伝子のプロモーターまたは3'未翻訳調節領域に見られるので、ゲノム配列およびcDNA配列に作用する遺伝子が有用であると思われる。ヒトNRAMP遺伝子の5'領域の特異配列とハイブリッド形成し、そのヒト遺伝子のプロモーター領域の一部を増幅させることができるプライマー対も提供する。プロモーター領域は、ポリgt部位をt(gt)₅ac(gt)₅ac(gt)_ngの立体配置で、ただしn=0または整数として、含むことが好ましい。プロモーター領域は、さらに転写部位に加えて、任意に、インターフェロンＹ応答要素、NFKB部位、AP-1部位、Ｗ要素、PV.1コアモチーフおよびPEA3部位の一つ以上を含むこともできる。各々の部位、要素またはモチーフは、図１１で指定された順番で存在することが好ましい。ポリgt部位の多形が、特にgt繰返し体の第３のクラスターに位置し、ｎが繰返し体の数と等しい場合、一般には４から12の場合には、そのヒト遺伝子の発現が低減または欠損しているとする診断材料になり得るので、この領域のPCRを増幅することができるプライマーは、特に重要である。プロモーター領域に作用するプロモーター、好ましくはプロモーター領域に作用する対立遺伝子特異プローブ、例えば、対立遺伝子特異オリゴヌクレオチドなども提供する。好ましい態様では、ヒトタンパク質は各々がイントロン境界領域に隣接する15 エキソンによってコード化される。これらのエキソンは表３に示したものが好ましい。個々のエキソンおよび／またはその隣接イントロン境界領域の一部とハイブリッド形成することができるプローブまたはプライマーも提供する。好ましくは、プライマー対は、各エキソンのイントロン境界とハイブリッド形成し、各々のエキソンを増幅できるものが提供される。特に、プライマー対は、表３に示すイントロン領域のいずれかで、とりわけ、下線をつけた領域とハイブリッド形成することがきる。ヒト遺伝子のエキソンのいずれかの多形は、欠損遺伝子生成物の診断材料となるので、エキソンをPCR増幅させ電気泳動的技法を用いて多形などを同定するプライマーは、特に重要である。より具体的には、ヒトエキソン２をPCR増幅することができるヒトエキソン２のイントロン境界領域5'および3'は、このエキソン内でコード化された推定SH3結合領域の３アミノ酸に関与する多形を検出する場合に極めて重要である。NRAMP遺伝子の機能に対するこの領域の重要性は、本発明に関わる重要な構成要素の一つである。アンチセンスオリゴヌクレオチドを上述のヌクレオチド配列を用いて生成することもできる。アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて、遺伝子の発現を妨害することができ、これによって潜在的に重要な局所療法を自己免疫不全またはがんに行うことができる。以下に詳細に説明するように、この遺伝子からのタンパク質生成物は、ポリトピックな膜タンパク質であると予測される。このタンパク質に対する抗体が種々の細胞母集団中のタンパク質生成物の発現の診断レベルでは重要な材料であるが、膜に遮断されないタンパク質のそうした部分しか完全なまたは天然のタンパク質配座の抗体に接近できそうにない。従って、本発明に係る別の態様では、少なくとも膜によって隠蔽されない構造ドメインの少なくとも一部を含むタンパク質のポリペプチドフラグメントを提供する。好ましくは、ポリペプチドは、少なくとも一部のN-末端領域を含む。潜在的に重要な２つの構造ドメインは、第１の膜に架かるドメインに近位でアミノ酸1-82を含むN-末端細胞質ドメインと、最後の膜に架かるドメインに遠位でアミノ酸414-415を含むC-末端細胞質ドメインである。実際には、それらの細胞質領域を含む融合タンパク質は、PCRによって、例えば、Nrampから得られた適切な配列を結合するグルタチオン-S-トランスフェラーゼ遺伝子下流を用いて、処理することができる。pGEX系の原核発現ベクターは、Nramp配列を結合することができる特に有用なタイプのベクターである。これは標準的な手続であり、より詳しい情報は文献８に見られる。別の態様では、本発明は自然抵抗性結合マクロファージタンパク質に対する抗体、またはそれから得られたポリペプチドフラグメントに対する抗体、特に、上述の接近可能なポリペプチドドメインの１つに対する抗体を提供する。このため、Nramp融合タンパク質を抗原として使用し、ウサギまたはラットに接種し、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を産生させることができる。特に、タンパク質のN-末端領域（DKSPPRLSRPSYGSISS；，PQPAPCRETYLSEKIPIP およびGTFSLRKLWAFTGPGFLMSIAFL，DPGNIESDLQ）とC-末端領域（WTCCIAHGATFLTHS SHKHFLYGL）内に含まれる特異的アミノ酸配列中のエピトープを認識する抗体は、マウスとヒトの両方のタンパク質を認識するので、研究目的にもヒトの診断用材料としても利用することができる。上述の診断に加え、モノクローナル抗体を中和することで、遺伝子の発現から生じる自己免疫やがんなどの副作用が認められた場合に、遺伝子の機能を阻止することができる。遺伝子生成物の存在不在を問わず、病気の状態によっては利益的な効果も有害な効果ももたらす。感染症では、特に骨髄細胞系の細胞内病原体に関係する場合、機能的遺伝子生成物がなければ、その疾患に対し慢性感受性になる。骨髄細胞系またはリンパ細胞系の自己免疫不全またはがんの場合、機能的遺伝子生成物の過剰な発現とその結果としておこるマクロファージの活動亢進は、疾患の表現型の一因となり得る。本文に述べる診断方法と治療剤は、感染、特定の自己免疫不全、骨髄系または細胞系のがんに異型反応を呈する患者に有用であると考えられる。 NRAMP遺伝子の欠失ががんに関連する別の状況は、他の細胞系のがんが活性化したマクロファージによって、呼吸バースト反応で生成される過酸化水素、TNF- αまたは酸化窒素に対して感受性があるために、破壊される場合である。こうしたマクロファージの機能すべては、NRAMPによって調節される。この場合、幹細胞遺伝子導入による矯正的な遺伝子療法が適切であろう。図面の簡単な説明本発明を添付の図面を参考にのみ用いて、例を挙げて詳細に説明する。図１は、本発明に係るNrampλ8.1cDNAクローンの制限地図をVidalらの制限地図と比較した図である。図２は、本発明に係るマクロファージ-λ8.1Nrampの配列を示す図である。図３は、λ8.1のヌクレオチド配列31-456に対応するゲノム遺伝子をVidalらの対応するDNAと比較した図である。図４は、ヌクレオチド1911までのゲノムＤＮＡの5'配列を示す図である。図５（ａ）は、ノーザンプロットハイブリッド形成の結果を示す図である。図５（ｂ）は、B10.L-Lshマクロファージから全RNA上にプライマーを伸長した結果を示す図である。図６は、マクロファージ発現NrampのN-末端終端の64アミノ酸配列を用いたアミノ酸データベースサーチ（２９）の結果である。図７は、ヒトNrampのエキソン２のヌクレオチドおよび誘導アミノ酸配列を示す図である。図８は、ヒトNRAMPのN-末端配列を用いたアミノ酸データベースサーチの結果を示す図である。図９は、ヒトNRAMPの誘導アミノ酸配列と、マウスNrampクローンλ8.1［55］と、酵母ミトコンドリアタンパク質に対するClustal V多重配列アラインメントの結果を示す図である。図１０（ａ）は、ヒトNRAMPエキソン２に対するアミノ酸データベースサーチの結果を示す図である。図１０（ｂ）は、ヒトNRAMP、マウスNramp、SMF1およびSMF2に対するClustal V多重配列アラインメントと、Oryza sativa（イネ、登録番号d15268）遺伝子およびArabidopsis thaliana（登録番号z30530）遺伝子の発現配列標識［60］を示す図であるが、各々の読み枠は１と２である。図１１は、転写開始部位の440bpの推定プロモーター領域のヒトNRAMP5'末端を示す図である。図１２は、5'ジヌクレオチド繰返し体多形の（ａ）対立遺伝子２および３または（ｂ）対立遺伝子１、２、３で２家族を区分し、変性ポリアシルアミドゲル電気泳動によって分離された多形性PCR生成物のオートラジオグラフを示す図である。好ましい態様の説明実験および結果の詳細マクロファージcDNAライブラリから得たNrampクローンの配列分析マクロファージNrampクローンをλUniZap（Stratagene）で調製した活性化（4 時間刺激、25U/mlインターフェロン-γ、10ng/ml Salm onera typhimurium LPS）マウス（B10,L-Lsh^r）マクロファージcDNAライブラリから単離した。クローンは公表された（参考文献２）配列のヌクレオチド1410-1 812bpに対応するRTPCRによって生成されたプローブをもちいてフィルタープラークハイブリッド形成によって単離した。プラーク精製に続き、10⁶組換え体をセンスNrampプライマーおよびアンチセンスNrampプライマーとT3ベクターアームプライマーおよびT4ベクターアームプライマーを組み合わせたPCRによって分析した。これによって、公表された配列に関するクローンのマッピングができた。20 /35は、1.0-1.5kbであることがわかったので、それ以上は分析しなかった。残りは、2.1-2.3kbであり、完全な長さのNrampコード配列をコード化した。クローンは、最初に制限地図を作成し、４つを選択し最も長いクローンλ8.1を含む配列を決定した（シークエナーゼII）。ゲノム配列決定マクロファージDNA配列から、PCRプライマーを生成し酵母人工染色体（YACクローンC9C28、Princetonライブラリー）とマウスゲノムcDNAの両方から2kb領域のDNAを増幅した。生成物をpCRベクター（Invitrogen）でクローン化し、cDNA配列に相補的なオリゴヌクレオチドを用いて少なくとも各々の２つのクローンから得た二本鎖プラスミドDNAに基づいて配列（シークエナーゼII）を決定した。スプライシング部位をゲノムDNA配列とcDNA配列を比較して同定した。Nramp発現のノーザンブロットおよびプライマー伸長分析。バナジルリボヌクレオシド錯体の存在下単離された細胞質の全RNAを利用し、グリオキサールを用いた変性ゲル電気泳動とノーザンブロッティングを行うか直接プライマー伸長分析のためにRT反応を行った。ハイブリッド形成は、エキソン３（結果を参照）のゲノムフラグメント（bp1-1482）5から単離されたプローブを用いて行った。BamHIを用いた制限消化によって、公表された（参考文献２）c DNAのλ8.1特異（＝ゲノム配列のbp1-587、図２ｂ）領域または推定5'未翻訳配列（＝ゲノム配列のbp588-1482、図２ｂ）を覆う２つのプローブが生成した。プライマー伸長法の場合、λ8.1様RNAに特異的であるよう設計されたオリゴヌクレオチド（TCT GCG CTG GGA ATG GGG；ゲノム配列のbp538-521）または推定5'の場合は公表された配列のUTR(TGC AAG CAG ATC GGG TCA；、ゲノム配列のbp1482-14 65）をポリヌクレオチドキナーゼで標識した。伸長反応は、25単位のAMV逆転者酵素を用いて42℃で行い、ゲル充填緩衝剤を添加することによって終結し、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動に続き、配列ラダーに対してサイズを計測した。図１については、マウスNrampの耐性対立遺伝子を含む活性マクロファージライブラリから単離されたcDNAクローンを制限地図化し、配列決定をしたところ、２つのサイレント突然変異（359bp、C：965bp、T）を除き、公表された（参考文献２）配列のコード領域と一致することがわかった。公表されたクローンとマクロファージクローンλ8.1の配列一致領域は、ATG(d)コドンと公表されたクローンの主要ORF（黒色バー）を含むが、これは波線内に示されている。Sma l（S）とPvull（P）の切除部位の位置は、5'末端のクローン間のダイバージェンスを示す。λ8.1の5'領域に同定された新規の配列には、より近位のATG（P）コドンと公表されたNrampと比較して付加的な64個のN-末端残基をコード化する伸長ORF（白色バー）を含んでいた。図２は、マクロファージλ8.1の配列を示す図である。λ8.1に特異的なヌクレオチド配列には下線が引かれている。λ8.1によってコード化された64個のN-末端残基は、Vidalらによって同定された5'の遠位開始コドン（＝65の位置のMet）に存在する。この付加的な64アミノ酸配列は、耐性で感受性のあるマウスにおいて一致（データは示さず）し、Ser10/64、Pro10/64、塩基7/64残基に富んでおり、Ser３、37、52上に３つの共通PKCリン酸化部位（S/T-X-R/k）を含む。上述したように（参考文献２）、推定N-結合グリコシル化部位は、残基311と325の位置に存在する。疎水性の潜在的な膜に架かる領域には下線が引かれている。データベースサーチによって3'UTRのB-2 alu様反復要素（枠内）が明らかになったが、これは完全な長さのλ8.1クローンがマウスゲノムDNAとハイブリッド形成した場合には複雑な信号を出す。図３から、マクロファージNrampのN-末端細胞質ドメインは、２つのユニークなエキソンと２つの共通エキソンによってコード化されることは明らかであろう。λ8.1のヌクレオチド31-456に対応し公表された（参考文献２）クローンとのダイバージェンスポイントに架かるゲノムDNA領域を単離し、配列決定し２つのクローンを生成する機構を明らかにした。マクロファージNrampの付加的な配列は、cDNA配列（図１）に隣接する２つのユニークなエキソン（１および２、黒色バー）と、λ8.1と公表されたクローンに共通なエキソン（３および４、白色バー）によってコード化される。第３のエキソンに隣接する5'は、公表されたクローンに見られる推定 5'UTR（白色バー）である。予測スプライシングパターン（点線）は地図の上（ λ8.1）と下（公表されたプレＢ細胞クローン）に示されている。配列決定用ゲルの読み（矢印）は、cDNA配列から得た特異的Nrampプライマーの他、ゲノム配列に特異的な新しいプライマーを用いて決定されたことも示す。図４は、λ8.1のダイバージェンスポイントと公表された（参考文献２）配列に架かるゲノムDNA配列を示す。エキソンのヌクレオチド配列は大文字で示し、上述に示された予測アミノ酸配列は一文字で記した。イントロン配列は小文字で示した。公表された配列から得られた5'UTRは、第３のエキソンに隣接しているが、上線で協調した。コドン（ATG＝Met）は、これが終点に位置する場合、公表された配列の開始コドンを示す。マウスゲノム配列の5'領域（bp1-587）にユニークな配列を含むプローブも、ヒト2q35の相同領域とハイブリッド形成することが知られるサブクローン化ヒトYAC（クローンAM11/D3/14、ICRFライブラリー）から単離したゲノムλクローンにハイブリッドとハイブリッド形成する。図５は、付加的な64アミノ酸をコード化するNramp転写物はマクロファージに発現されるNrampの唯一の形態であることを示す。図５（ａ）は、マクロファージ内で発現されるNrampの本質を同定するために、ノーザンプロットハイブリッド形成を残りのマクロファージから単離された全 RNAか、インターフェロン-γ（レーン2、6、10、14）、LPS（レーン3、7、11、1 5）もしくはインターフェロンとLPSの組合せ（4、8、12、16）を用いて活性化されたマクロファージを用いて行ったことを示す。λ8.1の5'配列（レーン1-4）にユニークな特異的プローブまたは公表された（参考文献２）の配列（レーン5-8 ）のより遠位の推定5'UTRに特異的なプローブを使用し、構成性発現GAPDH（レーン9-16）を用いて再度探査された同じプロットについて比較した。ハイブリッド形成するRNAは、より遠位のプローブをハイブリッド形成されたプロット上にRNA の２倍ほど充填したにも関わらず、λ8.1特異配列を用いてしか検出することができなかった。結果は、C57BL/10ScSnマウスから得られた骨髄誘導マクロファージから抽出されたRNAについて示す。スロットプロット分析（図示せず）によって、λ8.1特異プローブは感受性マクロファージと耐性マクロファージの両方から得られたRNAとハイブリッド形成したことが確認された。サザンプロット分析（図示せず）によって、両方のプローブがC57/10ScSh(Lsh^S)とB10.L-LSh^rの両方から得られたマウスゲノムDNAのEcoRlフラグメントの3500bpおよび500bpとハイブリッド形成することが確認された。図５（ｂ）は、マクロファージRNAで発現されたNramp転写物の5' 末端を識別するために、プライマー伸長法をB10.L-Lsh^rマクロファージから得られた10μgの全RNAを用いて、公表された（参考文献２）配列（レーン１）の推定未翻訳領域またはλ8.1（レーン２）にユニークな5'配列に特異的なオリゴヌクレオチドを用いて行ったことを示す図である。プライマーの5'端からのヌクレオチドの数を示した。tRNAとの対照反応では、どちらかのプライマーを有する生成物は得られなかった。これらの実験により、公表されたcDNAcの推定5'未翻訳領域を維持するRNA転写物は、残りのマクロファージや活性化マクロファージには存在しないが、λ8.1配列に対応する転写物は近位ATGコドンの5'に21bpと22bp（ダブレット）をマッピングする転写開始部位と一致していたことが確認された。同様の結果は、C57BL/10Scsh（Lsh^s）から得られたRNAを鋳型として使用して得られた。図６は，マクロファージNrampがN-末端SH3結合ドメイン構造をコード化することを示す。マクロファージ発現Nrampにユニークな64アミノ酸配列を用いたアミノ酸データベースサーチ（参考文献２９）によって、特にプロリンに富んだ配列と配列適合数が一致した。多重配列アラインメントによって、この領域上の共通モチーフすなわちPGPAPQPXPXR（黒色垂直バー）を生成することができた。信号伝達に関与する３分子について適合することがわかった。すなわち、その３分子とは、病巣付着キナーゼ（参考文献２０）（26残基中50％の一致）、Drosphila dynamine shibireタンパク質（参考文献１７）（20残基中55％の一致）、アデニル酸シクラーゼ刺激β-1-アドレナリン性受容体（参考文献１９）（21残基中57％）である。プロリン、セリンに富んだドメインは、dynamineの機能的SH3結合ドメインとして同定された（参考文献１７、３）。９つの最も適合したものを各々整列し、４つ以上が一致した場合には残基を枠に囲んだ。また、配列一致を示す領域に隣接するS3およびS37上の２つのPKC部位（あやめをつけた垂直バー）も示す。チロシン残基（星印）は配列のこの部分の保存を示す共通モチーフのいずれかの側に見られる。図７は、ゲノム配列分析から得られたヒトNRAMPのエキソン２のヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列を示す図である。マウスNrampのエキソン２は、推定SH3結合ドメインを信号伝達分子の数にアミノ酸を一致させてコード化する。ヒトNRAMP遺伝子の同じ領域の構造を特徴づけるために、2q35とハイブリッド形成する酵母人工染色体をEMBL3にサブクローン化し、結果として生じるライブラリーをマウスプローブを用いてこのエキソンを含むクローンを同定して交差種ハイブリッド形成によってスクリーニングした。エキソン２を横断するゲノム配列が得られ（図７）、マウス配列で同定されたようにGT AG境界と同じスプライス供与部位とスプライス受容部位を持っていた。図８は、ヒトNRAMPに対するN-末端配列がSH3結合ドメイン構造をコード化することを示す図である。推定アミノ酸配列の分析によって、ヒトり遺伝子のこのエキソンは、マウスの 45コドンと比較して、48コドンをコード化し、マウス推定アミノ酸配列の多くの特徴を持っていた（図８）。これらには、PKCによってリン酸化するための遠位共通配列を含む。両方のチロシン（Ｙ）残基は維持され、マウスNrampとして同じ位置を共有し、ヒトエキソン２配列はセリン（Ｓマウスの9/45と比較して9/48 ）、プロリン（マウスの10/45に比較して10/48）、塩基（マウスの5/45に比較して5/48）残基に富んでいる。これらの重要な残基の中で、6/9 S、6/10 P、4/5塩基残基は、マウスとヒトのエキソン２内で位置が一致してい。プロリンの間隔はヒト遺伝子のSH3結合ドメインに対する共通配列では、マウスの１３５７９の位置に比較して、１４７９ 13 14の位置であり、微妙に異なる。この領域上のヒト共通モチーフは、PXSPTSPXPXXAPPRXT．である。ヒトエキソン２の３コドン挿入によって、このプロリンに富んだドメインの5'セグメントが形成される。この挿入領域には、ほぼ完全な３倍の９ヌクレオチド繰返し体から構成される異常なヌクレオチド配列があり、幾分不安定であり機能に影響し得るヒトの多形原（参考文献３２）の典型を示す。ヒト遺伝子配列内の余分な３コドンセグメントの存在によって、データベースをスクリーニングしているときに、複数の付加的なアミノ酸配列が一致した。これらには、細胞骨格相互作用または信号伝達経路に関与する複数のタンパク質すなわち、微小管結合タンパク質、アデニリル結合タンパク質、ホスホリパーゼＣ β3、ホスファチジルイノシトール 3-キナーゼ調節サブユニットp85α （Pl3キナーゼ p85α、アンキリン、zyxinが含まれる。コンピュータ支援分析マクロファージ発現NRAMPの予測されたN-末端アミノ酸配列の水治療法プロフィールを、KyteおよびDoolittleのアルゴリズムおよび水治療法値を用いてコンピュータ支援分析によって得た。アミノ酸配列の比較は、CRC Resource Centre にオンラインのFASTAプログラムを用いて行った。結果および論点マクロファージ誘導Nramp cDNAクローンの配列分析。活性化マクロファージライブラリーをスクリーニングし、15の完全な長さのNr amp cDNAを生成したが、そのうち14は5'末端配列の公表された（参考文献２）Nr ampとは異なっていた。最も長いマクロファージ誘導cDNA（図１、λ8.1）は、Nr ampよりも186bp短かった。以前に予測されたタンパク質に対して完全な長さのコード領域を含んでおり、公表された開始コドンの5'に隣接した未翻訳配列の領域（bp 209-263）については枠内に停止コドンはなく、100％一致した。ただし、 λ8.1のヌクレオチド1-208は、公表された配列とは一致しなかった。より近位の ATGコドンは、λ8.1の72bpで同定されたが、36bpの枠内停止コドンだけ先行していた。この近位翻訳開始コドンに続くのは、192bpのORF（64アミノ酸）であり、以前に報告されたORFに至る。以前の試験は、近位開始コドンは分析されるすべての遺伝子の90％で利用されることを示している（参考文献１５）。また、近位開始コドンと遠位開始コドンおよび隣接配列は一致（TCCTCATGA）し、最適な（参考文献１６）（CC^A/_G CCATGG）共通配列を有しての一致はわずか２つしか示されていないので、遠位開始コドンが好ましいという証拠は全くまい。このため、なぜ遠位開始コドンを使用するのかに答える理論的な理由はない。 Nrampの5'領域に対するゲノム配列。２つのRNA遺伝子を生成し、その結果２つのタイプのNrampクローンを生成することができる機構が存在するか否かを判定するため、ダイバージェンスポイントに架かるゲノムDNA領域をλ8.1のヌクレオチド31-456bpに対応して特徴付けた（図２）。この領域は、395、900、241bpの３つのイントロンによって点在させた４エキソンによって、GTおよびAG境界に一致するスプライス供給部位とスプライス受容部位すべてを用いてコード化する。λ 8.1のN-末端ドメインの64アミノ酸の最初の47アミノ酸は、このクローンにユニークな２つの近位エキソンによってコード化される。残りの17アミノ酸は、エキソン３によってコード化されるが、エキソン３、４はλ8.1と公表された（参考文献２）Nramp cDNAの両方に共通である。公表されたクローンから得られた5'UT R配列は、第３のエキソンに隣接し第３のエキソンの一部を含む900bpイントロンに見られ、単一の遺伝子が両方の形態をコード化することを示していた。この第３のエキソンは、特にそれがλ8.1のタンパク質配列をコード化するが、公表されたNramp配列の場合にはコード配列と非コード配列の両方を含む点で特に異常である。内部スプライス受容部位と二重プロモーター制御に関連した選択的スプライシングに関与する複雑な機構を考案し両形態についての起源を説明することもできるが、公表された（参考文献２）cDNAクローンのほうが近位端に900bpのフラグメントを含んでいるように思われる。これは、ここで単離されたマクロファージ誘導Nramp クローンは、ゲノムDNA（図示せず）で同定された第１のNrampイントロンと一致することを示した配列を含むことが発見されたという観察結果に一致する。一種類のNrampだけしかマクロファージには発現しない。最も長いポリペプチドをコード化するRNAがマクロファージで発現される形態であるとの仮定を確認するために、複数の異なる実験方法を採用した（図３）。鋳型としてマクロファージRNAを利用し、λ8.1の5'領域にユニークなオリゴヌクレオチドを用いてプライマー伸長をしたところ、感受性マウスと耐性マウスの両方に生成物が生じた。全く対照的に、公表された（参考文献２）Nrampの推定5'UTR内でオリゴヌクレオチドを用いた場合には、何も生成物は生じなかった。λ8.1にユニークな5'領域を対象とするプローブも、感受性マウスおよび耐性マウスから得られたマクロファージのノーザンプロットとスロットプロットと十分にハイブリッド形成したが、公表されたクローンの推定5'UTRを対象とするプローブはハイブリッド形成を示さなかった。このため、マクロファージに存在するRNA転写物は１種類しかないことは、λ8.1の予測されたポリペプチド配列に一致するということであり、この種のNramp遺伝子は宿主耐性に応答することを示唆する。マクロファージ発現NrampのN-末端で予測される構造および配列一致性。どのようにマクロファージ発現NrampがLsh/Ity/Bcg遺伝子機能に関係し得るかを判断するために、水治療法（参考文献１４）プロットとアミノ酸データベースサーチを新たに同定された64アミノ酸ドメインについて行った。前者（図示せず）は、新しい配列が親水性であり、N-末端の細胞質ドメインまで延長することを示した。このプロリン、セリンおよび塩基に富んだアミノ酸ドメインに関するアミノ酸データベースサーチによって、（公表されたNrampで同定された２つに加えて）３つのPKC部位が同定され、複数の関係しないタンパク質との適合数も確認された（図４）。最も興味深い適合は、（ｉ）ほ乳類のdynamin（dephosphin）に関連し、ラット脳のシナプスホスホプロテインとして作用する（参考文献１８）Dros ophiliaのdynamin shibireタンパク質（参考文献１７）、（ii）アデニル酸シクラーゼ刺激物質およびＧタンパク質結合β-1-アドレナリン受容体のプロリンに富んだ第３の細胞質ドメイン（参考文献１９）、および（iii）インテグリン依存リン酸化（参考文献２１）によって修飾することができる病巣付着キナーゼ（参考文献２０）を用いた場合であった。dyanminのC-末端ドメインと一致する領域は、陰イオン性リン脂質、微小管およびSrc相同（SH3）ドメインを結合する場合に関与していた（参考文献２２）。SH3ドメイン（参考文献３、４）は、異なるチロシンキナーシゼ（TK）内ではあるが触媒ドメインの外側にある関連配列として確認され、非受容体TK、ホスホリパーゼC-γやその他の細胞骨格の構造的タンパク質などの複数のタンパク質に認められる。SH3ドメインの機能（参考文献４）は、SH2の機能ほど十分に特徴づけられていないが、信号伝達（参考文献３）に必須の特異的なタンパク質−タンパク質相互作用を仲介すると思われる。IL-2Rβ（参考文献２５）受容体とエリトロポイエチン（参考文献２６）受容体は、例えば、受容体機能に欠かせないリン酸化を仲介するTkと結合するセリンとプロリンに富んだ細胞内ドメインを示す。膜結合TkのSrc系統の仲間には、Hck、Fgrなどが挙げられ、マクロファージにも含まれている（参考文献２７）。どちらも、開始／活性信号に反応する分化速度を示し、Nramp仲介信号伝達経路に関与し得る。特に、Hckは最近マウスマクロファージ（参考文献２８）のTNF-α生成のために信号伝達に関与することが示され、発明者らが証明したステップ（参考文献１１）は、酸化窒素生成促進とLsh耐性マクロファージの抗微生物活性の過程として極めて重要である。最近の試験では、発明者らはインテグリン、細胞外マトリックスタンパク質への結合を仲介する細胞表面の分子、および、TKを介する信号と耐性マクロファージの相互作用は、耐性ではあるが感受性はないマクロファージ（参考文献９）の TNF-α生成促進を十分刺激することも証明した。一般に、Nrampの複数のPKCリン酸化部位は、本文で確認された新しいSH3結合ドメインと一緒になって、Nrampはマクロファージ開始／活性のための伝達信号を制御することによって耐性を仲介するという注目せざるを得ない証拠を提示する。ヒトNRAMPのN-末端配列分析は、マウスNrampを用いて、推定SH3タンパク質についての一連のタンパク質との配列一致は、細胞骨格相互作用または信号伝達経路に関与したことを示す所見を裏付けるものであった。これらの中でP13キナーゼp85α（参考文献１０）は特に興味深いが、この理由は、それがリン酸化タンパク質チロシンキナーゼにSH2ドメイン（参考文献１２）に結合することによって機能し、原形質膜へのp110触媒単位の結合を仲介するアダプターとして作用するからである。P13-キナーゼp85αもSH3ドメインを有する。アンキリンＢ（参考文献１３）は、内在性膜タンパク質を細胞骨格要素、zyxi n（参考文献２３）、付着性プラークタンパク質および付着関連遺伝子発現を仲介する信号伝達経路に可能な成分に連結する分子である。全般的に、この証拠は、マウス遺伝子の推定SH3結合ドメインに基づき、このドメインが信号伝達に重要なタンパク質−タンパク質相互作用および／または分子の輸送機能を調節するタンパク質相互作用（例、チロシン上のリン酸化を仲介するチロシンキナーゼの結合）に重要であるとの発明者らの初期の結論を支持するものである。Nramp遺伝子導入試験複数のNrampレトロウイルスベクター構成物を作成したが、これらはすべてpBa beプラスミドに基づくものであった。これらには、上述で予測されたタンパク質をコード化するDNAとともに、N-末端の近位72アミノ酸をコード化するC-末端欠失構成物を含む。前者の構成物は、リン酸カルシウムを媒介とし、gp+86環境栄養性充填細胞およびピユーロマイシンに抵抗する結合標識遺伝子に選択された組換えクローンに共沈させて導入した。これらの抵抗性クローンのいくつかについて、（ｉ）RNAスロットプロッティングおよびNrampプローブを用いたハイブリッド形成によって機能的な偽ウイルス粒子を分泌できるかについて、また、（ii）受容細胞に感染し抗生物質的耐性を付与することができるかについて試験した。最も高い滴定ラインから得られた感染性粒子は、in vivoの遺伝子導入に使うことができる。これと同じ構成物をマウス細胞形系（RAW 264）に導入したところ、ベクター由来Nramp遺伝子のものとは異なる対立遺伝子変異型（「Lsh感受性」）を発現した。複数のクローンは、PCRによってモニタリングした後、対立遺伝子特異オリゴヌクレオチドハイブリッド形成を行ったように、Nrampの両方の形態を発現することが確認された。機能的実験を行い、Nrampが疾患耐性遺伝子Ity/Lsh/Bcgであることを、Ity/Lsh/Bcg遺伝子と以前に結合させた耐性対立遺伝子がマクロファージ活性表現型を付与することを証明することによって証明した。以下に具体的に説明する。表１は、Nramp耐性対立遺伝子が、対照の感受性トランスフェクションクローンと比較し、基線PMA-誘導呼吸バースト反応を促進することを示す。休止中のPM A-誘導呼吸バーストは、マクロファージを細菌性リポ多糖（LPS）で処理したところ、感受性トランスフェクタントでは完全に消滅したが、耐性トランスフェクタントでは消滅しなかった。呼吸バースト生成物は、抗微生物的で腫瘍破壊性の活性を仲介する。表２は、Nramp耐性対立遺伝子が、LPSおよびインターフェロンによる開始／活性化後に、亜硝酸塩の放出を促進することを示すものである。亜硝酸塩は、耐性マクロファージの誘導可能な酸化窒素シンターゼ遺伝子の上流を調節した発現によって生成された酸化窒素の安定した最終生成物である。酸化窒素は、抗微生物的で腫瘍破壊性の活性も仲介し、マウス耐性マクロファージの抗リーシュマニア性で抗マイコバクテリア性の活性のための最終的なエフェクター機構であることは特に知られている。表３は、Nramp対立遺伝子がLPSおよびIFNγを用いた開始／活性後、L-アルギニン摂取を促進したことを示す。L-アルギニンは、耐性マクロファージのKCの上流調節発現のための信号伝達に関与する酸化窒索を生成するために、また、マクロファージの殺菌作用のための最終エフェクター機構に基質を提供する。 NrampがIty/Lsh/Bcgの機能に予め関係する遺伝子の３つの個別の多相遺伝的な効果に影響することを示すことで、NrampがIty/Lsh/Bcgである明確な証拠となる。マウス／ヒトのNramp／NRAMPと酵母ミトコンドリアタンパク質SM F1とSMF2の間に観察される類似性については、別の実験を行って、これらのNram p調節多相遺伝的効果がミトコンドリア誘導反応酸素中間体（ROI）の生成によって仲介される細胞内の信号伝達に依存するか否かを決定した。表４は、呼吸バーストおよびL-アルギニン摂取がミトコンドリア電子輸送阻害剤ロテノン（0-40μM、錯体Ｉ→ユビキノンを阻害）またはテノイルトリフルオロアセトン（TTFA、0-400μM、錯体II→ユビキノンを阻害）の存在下では阻害される。阻害剤の濃度は、従来の試験に基づき（参考文献６１）、アポトーシスに関するミトコンドリア誘導ROIの役割と繊維芽細胞のTNFaの遺伝子誘導効果を試験したが、RAW264.7-誘導トランスフェクタントには毒性効果が観察されなかった。これらの所見は、ミトコンドリアの機能を調節する際のNrampの役割と信号伝達のための反応性酸素中間体の生成を示唆する。このため、Nrampがマクロファージ活性化のために細胞内の信号送出に影響を与えるには、（ｉ）ミトコンドリアからの反応性酸素中間体の生成に影響することによって、また、（ii）酸化窒素の生成を促進することによっての２つの方法がある。Nramp遺伝子機能のこうした試験は、Nrampが抗微生物のためのマクロファージ開始／活性を調節することを証明する10年間の機能的研究と、細胞信号送出現象におけるその役割による遺伝子の多数の多面的効果とをまとめるものである。Nramp遺伝子の機能として推定SH3結合ドメインで最も重要なことは、開始／活性化信号に反応してその機能を調節することである。Nrampタンパク質および抗体産生水治療法プロットに基づき、発明者らは膜に隠蔽されてないために完全な／自然のタンパク質配座内に到達できそうな２つの構造的ドメインを選択した。これら２つのドメイン（N-末端アミノ酸1-82、C-末端アミノ酸514-548）に対するオリゴヌクレオチドプライマーは、pGEX系の原核発現ベクターの適切な読み枠にクローン化すべき生成物を増幅することができる制限部位を用いて生成した。Nram p配列は、グルタチオンアガロースを用いてアフィニティークロクトグラフィーによって細菌ライゼートから容易に精製することができる融合タンパク質の高レベルの発現を誘導することができる誘導tacプロモーターの制御下で、Scistosom a Japonicumからグルタチオン-S-トランスフェラーゼ遺伝子の下流に結合される。結合タンパク質は、自然配座を維持し抗原性を改善するような穏やかな状況下でマトリックスから放出され得る。この方式を利用し、N-末端領域とC-末端領域からそれぞれ適切に8.2kdおよび3.4kdのNrampタンパク質を生成し、RIBIアジュバントを有する抗原として使用し、ポリクローナル抗体の産生のためにウサギに、モノクローナル抗体の産生のためにラットに接種した。産生抗体がマウスおよびヒトのNramp/NRAMPタンパク質の両方に特異的であることを確認するため、こうした抗体は、融合タンパク質の産生に使用されるこれらのN-末端領域およびC- 末端領域に及ぶ配列情報に基づいて調製されたペプチドに対してスクリーニングまたはアフィニティー精製をすることが望ましい。特に、ペブチドDKSP PRLSRPSYGSISS；と、PQPAPCRETYLSEKIPIP；と、N-末端領域内のGTFSLRKLWAFTGPG FLMSIAFLDPGNIESDLQと、C-末端領域のWTCCIAHGATFLTHSSHKHFLYGLについてすべきである。ヒトNRAMP遺伝子（参考文献６２）のゲノム体制および配列 NRAMPOのゲノム配列。ヒト酵母人工染色体（YAC）AM11/D3/14（参考文献３０）は、ICRFライブラリーから（UK Human Gene Mapping Project HGMP Resource Ce ntre，Huxton Hill，Cambridge CB10 1RQ，UKから入手できる）VILIプローブ（参考文献３１）を用いてスクリーニングし完全なヒトNRAMP配列（参考文献３２）を含有ことによって得られる物であるが、これをλEMBL3（Stratagene Ltd，C ambridge，UK）にサブクローン化し完全な長さのマウスNramp cDNAλ8.1（参考文献５５）を用いてスクリーニングした。２つの重複クローンλ3とλ3.1は、完全な長さのNRAMP配列をふくんでおり、これをPstIを用いて消化し、pBluescript II SK（Stratagene Ltd）にサブクローン化し、完全な長さのマウスcDNAプローブ（参考文献５５）を用いて再度スクリーニングした。エキソンの正のクローンは、配列分析用に選択されたが、同定されたエキソンの間のPCRによって調製されたフラグメントを配列決定することによって充填されたギャップを含んでいた。エキソンはマウスのcDNA配列（参考文献２、５５）またはヒトcDNA配列を用いてヒトのゲノム配列を比較することによって同定された。ヒトcDNA配列は、逆転写（RT）と、ヒト単球由来THP1細胞系（参考文献３３）から調製されたRNAのPCR増幅によって得られた。適切な場合には、PCR生成物を少なくとも２つの独立クローンから得た配列分析用のpCRベクター（Invitrogen Corporation，Abingdon UK）にクローン化した。3'領域に対応するクローンは、マウスcDNAを用いるスクリーニングによっては当初単離されていなかった。フラグメントは、ポリdTアダプター感作THP1 cDNAから得られたcDNA（RACE、（参考文献３４））の3'急速増幅によって精製された。cDNAは、エキソン１３（GTGCTGCCCATCCTCACG、GAGTTTGCCAATGGCCTG）から選択された２つの巣化したプライマーと組み合わせたアダプタープライマーを用いて増幅した。適切なゲノムクローンをエキソン１３とRACE生成物の3'末端から設計されたプライマー（GGACGAGAAGGGAACTAG）を用いて、λ３とYAC AM11/D3/14の両方から得たフラグメントを増幅させて調製した。RNAの5'末端は、遮断アンカープライマーを任意の六量体感作逆転写THP RNAの3'末端にRNAのリガーゼ依存結合することに関与する5'RACEによってマッピングされた。アンカープライマーと２つのNRAMP 特異巣化アンチセンスプライマー（AAGAAGGTGTCCACAATGGTG，CGGTTTTGTGTCTGGGA T）を用いる増幅によって、単一のNRAMP生成物が生じた。この生成物は、クローン化されたTAと３クローンを配列分析し、転写開始部位とマウスcDNAプローブとハイブリッド形成できなかった最も近位の配列とを決定した。これによって、5' の隣接領域の分析はさらに容易になったが、その配列は5'RACE生成物と相同の配列を含む1.6kb PstIフラグメントから得られた。配列データの分析。ヌクレオチドとアミノ酸配列の比較は、CRC Resource Centr e，UKにオンラインのBESTFITプログラムを使用して行った。マウスおよびヒトNR AMPのアミノ酸配列を、多重配列アラインメントプログラムClustal V（参考文献３６）を用いて、酵母SMF1およびSMF2（参考文献３５）を用いて整列させた。ヒトNRAMPのエキソン４−６に渡る定方向周期配列決定プライマー（GACAGGCAAGGACTTGGGTとAAGAAGGTGTCCACAATGGTG）を、末梢血単核細胞から精製したRNAを用いて、ヒトNRAMPのエキソン４とエキソン６の間の200bp 生成物をRT/PCR増幅するために設計した。この生成物は、感受性突然変異を伝達するマウスNrampの領域に架かる。PCR生成物をQiagen PCR精製キット（Hybaid L td，Teddington．UK）を用いて精製し、内部配列決定プライマー（CATCTCTACTAC CCCAAGGTGC）を併用しCircumVent Thermal Cycle Dideoxy DNA配列決定キット（ New England Biolabs，CP Laboratoriesm Bisop's Stortford，UK）を用いて定方向周期配列決定による分析を行った。定方向周期配列分析は19名に行い、その内訳は、内蔵リーシュマニア症８例と、同じ家族から選んだ未感染９例と、非風土病の英国人対照２例であった。風土病の試料はブラジル（感染４例、未感染５例）とスーダン（感染４例、未感染４例）から得た。ヒトゲノムＤＮＡを用いての5'gt繰返し体のプライマー設計およびPCR分析。780 -794bpのPCR生成物を転写開始部位（GAGGGGTCTTG GAACTCCA）の-365bp5'およびイントロン１（CACCTTCTCCGGCAGCCC）プライマー内に位置するプライマーを使用してゲノムＤＮＡから増幅した。この生成物を再増幅し、5'プライマーと末端標識（γ³²PdATR、ICN Biomedicals Ltd，Thame，UK ）内部逆プライマーTACCCCATGACCACACCCを用いて108-122bp生成物を作成した。この生成物は、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分解し、配列決定ラダーを用いてサイズを計測した。異なる対立遺伝子形態に対するPCR生成物は、上述のように直接配列決定した。家族連鎖試験。ブラジルで発明者らの研究部位から得た（参考文献３７）らい病、結核、内蔵リーシュマニア症の一連の複数症例の36家族によって、ヒトNRAMP の5'プロモーター領域の多形性gt繰返し体と以前にマッピングした2q34-q35標識（参考文献３２、３７）の間の連鎖を求めた。２点連鎖分析をNRAMPと標識（TNP 1，IL8RB，VIL1、DES）について、CRC Resource CentreへのオンラインLINKAGE を用いて行った。NRAMP対立遺伝子の頻度は、ブラジル人の研究部位から得た遺伝的に独立した72個体の試料から算出した。結果図９は、Clustal V多重配列アラインメントはヒトNRAMP、マウスクローンλ8. 1（参考文献５５）、酵母ミトコンドリアタンパク質SMF1およびSMF2（参考文献３５）に対して予想されるアミノ酸配列について示す図である。４つのタンパク質について3/4または4/4の一致率を示す残基は太く示す。NRAMP配列の場合、エキソン境界は配列の上に示し、PKCはタンパク質キナーゼＣリン酸化に対する共通部位（S/T-X-R/K）を示し、＝＝＝N-結合グリコシル化に対する共通部位を示し、予測的な膜に架かるドメイン（参考文献２）は上線を引き、配列に番号を付した。★は４つのタンパク質すでに渡って保存されるシステイン残基であり、．は同類置換を示す。図１０（ａ）は、エキソン２に対するアミノ酸データベースサーチの結果であり、配列適合数がNRAMPのPro/Serに豊富な推定SH3結合ドメインと一致することを示し、＋は保存アミノ酸を示す図である。４つ以上の一致を示す残基は、太字で示されている。多重配列アラインメントによって、二重下線で示されたように、この領域上に共通モチーフを生成することができた。S40上のPKCと、共通モチーフのいずれかの側のチロシン残基（★）も示す。図１０（ｂ）では、ヒトNRAM P、マウスNramp、SMF1およびSMF2に対するClustal V多重配列アラインメントと、Oryza sativa（イネ、登録番号d15268）遺伝子とArabidoposis thaliana（登録番号z30530）遺伝子の発現配列標識（参考文献）と、それぞれの読み枠１および２を示す。６つのタンパク質に渡って4/6以上の一致率を示す残基は、太字で示した。NRAMPに対して膜に架かるドメイン６および７には上線を引き、配列に番号を付した。20アミノ酸が保存された輸送モチーフ（参考文献２）は、二重上線で示した。６つのタンパク質はすべて、輸送モチーフ全体の7/20（11/20）の一致率（類似性）を示した。★は、６つのタンパク質すべてに渡って保存されたシステイン残基を示す。．は、同類置換を示す。図１１は、転写開始部位のNRAMP配列5'の440bpの推定プロモーター領域を示す図である。転写開始部位は、図示のように、148bp5'のATG開始コドンに位置する。検査によって同定された推定プロモーター領域の要素（配列上方に示した）には、ジヌクレオチド繰返し体t(gt)₅ac(gt)₅ac(gt)₅gを形成する可能なZ-DNAと、６つのインターフェロン-γ応答要素と、３つのW-要素と、３つのNFκB部位と、骨髄特異PU.1転写因子に対する９つのプリンに富んだGGAAコアモチーフ（アンチセンス鎖上に２つ）が挙げられ、そのコアモチーフのうち２つは不完全にAPI様部位に結合し、PEA-3共通モチーフを形成している。熱ショック転写因子（HSTF ）モチーフ（NGAANまたはNTTCN）の列も440bp配列（標識せず）に渡って見られる。図１２は、２家族が5'ジヌクレオチド繰返し体多形の（ａ）対立遺伝子２および３または（ｂ）対立遺伝子１、２および３について分類した図である。２家族の下の写真は、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離された多形性 PCR生成物（それぞれの対立遺伝子１乃至３について122bp、120bp、118bp）のオートラジオグラフである。各写真の左から右へのレーンは、家系図に示されたように個体（ａ）I-2、II-1 ，II-2、II-3、II-4、II-5、II-6、III-1、III-1、III-2、III-3と、（ｂ）I-1 ，I-2、II-2、III-1、III-3、III-4、III-5、III-6を示す。個体I-1は家族（ａ）については示されていない。ヒトNRAMP遺伝子の配列とゲノム体制。完全な長さのcDNAを用いるハイブリッド形成によって単離されたエキソン陽性クローンの配列決定によって、マウス１誘導Nramp遺伝子のヒト2q相同体（NRAMP ）の完全な配列（登録番号X82105およびX82016に基づくEMBLを用いて析出）を識別することができた。領域440bp5'の転写開始部位から終始コドンまでのエキソン配列分析によって、完全なエキソン−イントロン体制を解明することができた（表５および表６）。ヒトNRAMPは、15エキソンによってコード化され、548アミノ酸マウスマクロファージイソ型（参考文献５５）と対照的に、550アミノ酸を含む（図９）。この550アミノ酸ポリペプチドは、弱い（1/6）Kozak（参考文献１６）共通に関連し、エキソン１内の翻訳コドンから開始する。次に、M68に見られるより遠位のコドンは、2/6のKozakが共通している。ただし、発明者らは、マウスマクロファージ形態のように（参考文献５５）、より近位の開始コドンを使用を使用することを提案する。これは、残基51-67に対して直接作用する（100 ％）配列保存によって強化されるので、機能に対する配列の維持が必要であることが示唆される。マウス遺伝子（54 8）とヒト遺伝子（550）遺伝子のサイズの不一致は、PTS重複を引き起こすエキソン２内に、ブラジル人家系（参考文献３２）および英国人家系（データ未公表）の変異型を表す非重複形態を有する３つの付加的な残基を含むことに原因がある。さらに、ヒトの遺伝子は保存が悪い最後のエキソン内にマウス遺伝子に比較して一個のアミノ酸が欠失している。マウスNrampと一致するアミノ酸は全体で8 6％（同類置換は９２％）だった。最高（100％）の配列一致を示すエキソンには、エキソン４、６、７が挙げられ、エキソン１１は98％の一致率を示す。これらのエキソンはTM1すなわち最初の細胞外ドメインと、TM2およびTM3と、保存された輸送モチーフをコード化する。TM2は、マウス感受性関連突然変異（参考文献２、５６）を含み、十分に保存され、このドメインがアミノ酸置換を許容することができない重要な機能的役割を果たすことが示唆されることは、興味深いことである。NRAMPは、マウスNrampと、２つの酵母ミトコンドリア膜タンパク質すなわちSMF1およびSMF2と一緒に、多重配列アラインメントプログラムClustal Vを用いて整列させた（図９）。SMF1とSMF2は、相互に49％の一致率（70％の類似率）、ヒトNRAMPとの一致率（類似率）はそれぞれ30％（57％）と29％（53％）である。これは発明者らがマウスNrampについて報告した（参考文献５７）の30％（58％）と30％（57％）の一致率（類似率）に匹敵する。４つのタンパク質のなかで最も注目すべき配列一致領域は、疎水領域内で著明に見られるが、高い一致率はエキソン３、４、５、６にも見られ、エキソン１１から得た保存輸送モチーフについても認められた。エキソン６内では、YAC由来アミノ酸のヒトの配列は、残基172の位置でGlyを示し、これはマウス配列のコドン169のGly→Asp感受性突然変異の部分に対応した。２つのSMF遺伝子は、同様のGlyをコード化しないが、マウスの感受性対立遺伝子に見られる負に帯電した残基を導入しない残基をコード化する。以前と同様に（参考文献５５，３２）、配列データベースのその他のタンパク質（図１０）との適合は、推定SH3結合ドメインを含むエキソン２上に観察され、さらに、保存された結合タンパク質依存モチーフ（参考文献２）を含むエキソン１１の領域についても観察された。後者は、マウス／ヒトNRAMP、酵母タンパク質と、Oryza Sativa（イネ）およびAravidopsis thalianaから得られた２つの発現配列標識とにおいて、高度に保存された。SMF1とSMF2は、エキソン２のプロリン／セリンに富んだ配列については高い一致率を示さなかったが、PKC依存リン酸化に対する共通（S/T-X-R/K）配列（SMF1では1、SMF2では2）を有していた。ヒトN RAMPは、マウス遺伝子の３つに比較して、２つの共通部位（エキソン２および３の場合、図９）をこの領域に含む。SMF2の遠位部位の位置は、ヒトNRAMP部位２／マウスNramp部位３と精確に一致するが、SMF1の部位は、８残基上流に位置する。一対のシステイン残基は、４つの遺伝子すべてに保存される。すなわち、（ｉ）第１の細胞外ループドメインと、（２）ヒト遺伝子とマウス遺伝子のN-結合グリコシル化のための２つの部位も含む第３の細胞外ドメインとに保存される。荷電残基は、SMF1の第１の貫膜ドメインのLys→Ser置換を除き、貫膜に架かるドメイン１、２、３、４および７（図９）内の４タンパク質すべてに渡って保存される。内蔵リーシュマニア症患者および対照のマウス突然変異の分析。マウス疾患感受性Gly→Asp突然変異に相同な突然変異がヒトに起こるか否かを決定するために、PT/PCRと定方向周期配列決定を内蔵リーシュマニア症患者から得たRNAとブラジルおよびスーダン人から得た対照について行った。すべての19 のヒトの試料は、個体の感染の有無に関わらず、この位置でGlyをコード化した。ヒトNrampの5'プロモーター領域の分析 λ8.1からサブクローン化された1654bpのPstIは、エキソン１および２を含み、転写開始部位（図１１）の440bpの配列5'も含んでいた。転写開始部位は、ATG 開始コドンの148bp5'に位置した。一連の予測されるプロモーター領域にも、5' の転写開始部位が存在し、そこには-317乃至-274bpの5'の転写開始部位に位置するジヌクレオチド繰返し体t(gt)₅ac(gt)₅ac(gt)₉gを形成する可能なZ-DNAを含む。ジヌクレオチドの繰返し体を形成するいずれかの側には、誘導可能なプロモーター要素共通配列に一連の適合が見られる。これらには、以下を含む。すなわち、６つのインターフェロンγ反応要素、共通配列CT^G/_T ^G/_TANN^C/_T（参考文献４１、４２）に対して8/8の適合を示す1×3'→5'、7/8の適合を示す3×5'→3'、7/8 の適合を示す2×3'→5'と、３つのW-要素（H-、E-、W-、S-またはZ-ボックスとしても知られる）、共通配列^A/_TGNA^C/_AC^C/_T ^G/_T（参考文献４１）に対して8/8の適合を示す1×3'→5'、7/8の適合をする2×3'→5'、共通配列TGACTCA（参考文献４３）に6/7適合するAP1部位と、３つのNFκB結合部位、2×5'→3'および1×3' →5'、各々は共通配列GGG^G/_A ^C/A/_TT^C/_T ^C/_TCC （参考文献４４）に7/10適合している。骨髄特異PU.1転写因子（参考文献４５、４６）に対する９つのプリンに富んだGGAAコアモチーフ（アンチセンス鎖上に２つ）も、この領域に架かっているのが見られ、そのうち２つは不完全なAP1様部位と結合しPEA3モチーフを作成し、別の２つは並列している。熱ショック転写因子（HSTF）モチーフNGAANまたはNTTTCNの列も存在するが、それらの順序および相は現在の機能的要素とは一致しない。TATA、GC、およびCCAATのボックスは、4 40bp5'隣接配列内には見られなかった。 5'プロモータ領域の多形性繰返し体のマッピング。 YAC-誘導NRAMP配列の5'のgt繰返し体の存在は、多形がヒトの母集団サンプルに存在するか否かを判定するために、この領域の分析をさらに勧める刺激となった。４つの対立遺伝子がブラジル人家族（図１２）に存在した。４つの対立遺伝子とは、対立遺伝子１＝122bp、対立遺伝子２＝120bp、対立遺伝子３＝118bp、対立遺伝子４＝108bpである。定方向配列分析によって、多形はgt繰返し体の最も大きなクラスターに位置することが確認された。このため、対立遺伝子１＝t( gt)₅ac(gt)₅ac(gt)₁₁g、対立遺伝子２＝t(gt)₅ac(gt)₅ac(gt)₁₀g、対立遺伝子３＝t(gt)₅ac(gt)₅ac(gt)₉gと対立遺伝子４＝t(gt)₅ac(gt)₅ac(gt)₄である。72名の遺伝的に独立したブラジル人に対して求められた遺伝子頻度は、0.021（対立遺伝子１）、0.326（対立遺伝子２）、0.646（対立遺伝子３）、0.007（対立遺伝子４）であり、全体の異型接合スコアは0.476である。連鎖分析の結果、nRAMP と４つの標識TNP1（近位）、IL8RB，VIL1、DES（遠位）との連鎖に対するLODスコア（表７）は正（＞３）であり、IL8RBに近位のNRAMP130kbに定める物理的マッピングデータ（参考文献３２）に一致し、この特定の多形は、ヒトの6q27に相同なマウスの領域にマッピングする関連配列（参考文献４９）よりはむしろNRAMPの2q35コピーに存在することが確認された。論点本文に提示されたゲノム配列分析結果は、染色体2q35に位置するヒトNRAMP遺伝子は、12kbのゲノム配列を有し、15エキソンを含むことを証明するものである。15のエキソンのヌクレオチド配列決定から推定されるアミノ酸配列は、マウス Nrampのように、Nrampが保存輸送モチーフ（参考文献２）と推定SH3結合ドメイン（参考文献５５）を含むポリトピックな細胞膜内タンパク質をコード化することを示す。20アミノ酸輸送モチーフについて、高い配列識別率（7/20残基、同類置換の場合11/20）は、NRAMP（Nramp）、２つの酵母タンパク質SMF1/2、イネおよびArabisopsisから得られた発現配列標識の間で観察され、これは系統発生的に異なる生物の間で機能的に重要である。興味深いことに、これらの一致率は、マウスNrampとAspergillus nidulansの硝酸塩輸送体の間で報告されたもの（4/2 0一致率、6/20の類似率）よりも高く、このため、Vidalら（参考文献２）はNram pは硝酸塩を感染マクロファージのファゴリソームに直接誘導する機能があるとの仮説を導いた。NRAMPの輸送モチーフと酵母ミトコンドリアタンパク質の間で本文に観察される高い一致率は、酵母とヒト／マウス遺伝子の間の注目すべき全般的な類似性とともに、Nrampは酵母ミトコンドリア遺伝子に機能的に相同であり得ることが示唆される。この酵母遺伝子は、ミトコンドリアへのタンパク質依存のタンパク質移入を、恐らくは転移（参考文献３５）のレベルで促進するプロセッシングに影響する疎水性分子をコード化する。従って、酵母突然変異体を用いた相補的実験は、Nramp機能の分子機構についてさらに明らかにすることができるかも知れない。NRAMP（Nramp）とSMF1/2との配列類似性は、プロリン／セリンに富んだ推定SH3結合ドメインに関しては乏しい。これは、恐らく、これらが信号伝達および／または細胞骨格付着（参考文献５５）に関与するがそれ以外では関連しない種々のタンパク質に存在するモジュール構造であるとは思われない。このため、このモジュールモチーフは、マクロファージ制限機能に関連したNRAMP分子に対する新たな添加であると考えられるので、我々はその他のより遍在的に発現されるNRAMP様分子が存在するであろうことを期待することができる。別のNramp-関連配列は、すでにマウス（参考文献４９）にマッピングされているが、他にも発見することができるであろう。ヒトNRAMP遺伝子を分析する場合の発明者らの主要な興味は、マイコバクテリア感染（結核とらい病）およびリーシュマニア感染に対してマルチケースの家族をスクリーニングする基礎を提供することであった。第１のステップでは、発明者らは小グループの内蔵リーシュマニア症患者とその子孫について調査し、マウスの感受性関連突然変異（参考文献２、５６）に類似する突然変異を発見することができるか否かを判定した。予測していたとおりに、第２の膜に架かるドメインをコード化するエキソン６は、マウスとヒトの配列の間で、酵母遺伝子を用いた場合と同様に、高度に保存されており、これは機能的に重要なドメインであることが示唆される。定方向周期配列決定によって試験された19のヒトの試料におけるこの領域内には、突然変異は見つからなかった。同様に、推定SH 3結合ドメインにおいて発明者らに同定された多形変異型は、非常に低い頻度で存在するので、これも、最近進化論の用語に取り入れられてはいるが、その機能に極めて重要であり、非同類置換には許容されないと思われるマクロファージ発現NRAMP分子の領域である可能性が示唆される。本文で同定される440bpのプロモーター領域は、NRAMP遺伝子のマクロファージ制限発現に関連して特に興味深く、分子に対する構造的変化を生じるというよりは、発現に影響すると思われる多形を分析する異なる方法を提供する。PU.1およびPEA3/AP1様反応要素の同定は、造血制限遺伝子の発現に一致する（参考文献４７、５０、５１）。初期の試験（参考文献２、５５）は、マウスNrampは、マクロファージに構造的に発現すると提案したが、ヒトの配列に同定された誘導プロモーター領域の要素からは、発現はマクロファージ開始／活性化刺激物によって調節できることが示された。特に、インターフェロンγおよびW-要素は、他の遺伝子（MHCクラスII、（参考文献４１）、FcγRI（参考文献４２）、マクロファージに誘導可能なiNOS（参考文献５２））に共通する。Ap1とNFκBの部位も他のマクロファージ発現タンパク質（組織因子（参考文献４３）、iNOS（参考文献５２））のプロモーター領域に存在し、LPSおよびTNSの誘導性に必要であり、NFκBの活性（参考文献４３）を安定化させ維持する作用をするAp1にも必要である。多くの機能的な観察結果（参考文献１、57-59に検討されている）を想定し、Ity/Lsh/Bcg(候補的Nramp）表現型がインターフェロンγ/Lp sマクロファージ活性化経路に非常に緊密に組み入れられることを示すと、異なるマクロファージ副次集団のNRAMPの組織特異発現に対するこれらの要素の機能的関連性を決定することが重要になってくる。これは、特に、Lsh遺伝子表現型、異なるマクロファージ副次集団（参考文献５３および５４）に示差的に発現すること、細胞外マトリックスとの相互作用は共通遺伝子的な耐性マウスおよび感受性マウス（参考文献９）から得た骨髄誘導マクロファージのTNFαの異なるレベルを顕在化することを示す従来の観察結果に特に関連する。それらの順序および相は、問題の機能的要素とは一致しなかったが、HSTF要素がヒトNRAMP要素のプロモーター領域で発見されたことは興味深いことであった。これらは、酵母SM F1遺伝子およびSMF2遺伝子のミトコンドリア的活性／発現に関連する先祖の要素を示すのかも知れない。ヒトNrampの5'フランク領域の別の興味深い特徴は、ジヌクレオチド繰返し体t (gt)₅ac(gt)₅ac(gt)ngを形成する推定Z-DNAの存在であった。異なるクラスの結合タンパク質は、Z-配座で排他的にDNAと反応する真核に存在し、正および負の信号送信を調節する役割はDNAのこの形態の特徴であった（参考文献３９で検討）。この繰返し体単位の多形がヒトゲノムDNA試料で観察されたことは特に興味をそそるものであった。繰返し体を形成する推定Z-DNAがその他の領域反応要素がいずれかの側に隣接するという事実は、転写調節物質としての役割に基づかない場合でも、少なくとも反応要素の近位に影響をするので、この多形は遺伝子発現に機能的に重要であることが示唆される。本文で試験したブラジル系母集団のヘテロ接合レベル（0.476）によって、これはNRAMPとその他の2qマーカーの遺伝連鎖分析に有用なマーカーとなった。ただし、対立遺伝子の数はその他の繰返し体（マイクロサテライトなど）多形と比較し、この繰返し体の多形変異型をさらに生成することは、進化的な面から許容できないことが示唆された。従って、この多形は、NRAMPと疾患との関係をさらに分析することで機能的に関連してくるものと思われる。表５および表６ YAC誘導クローンのゲノム配列分析によって同定されたヒトNRAMPの15エキソンに関するイントロン（４つの隣接するヌクレオチド）／エキソン（アミノ酸）境界とサイズ（bp）。マウスNrampとのアミノ酸配列の一致率を各エキソンについて示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ホワイト，ジャックリーンケイティアメリカ合衆国，マサチューセッツ州ケンブリッジ，＃１エクセターパーク１ (72)発明者ブラックウェル，ジェニファーメアリーイギリス国，ロンドンイーエヌ６１アールエル，ポッターズバー，クエーカーズレーン 19

Claims

【特許請求の範囲】１．N-末端領域にSH3結合ドメインを含む自然抵抗性結合マクロファージタンパク質。２．N-末端領域にさらに１つ以上のタンパク質キナーゼＣ部位を含むことを特徴とする請求の範囲第１項記載のタンパク質。３．N-末端領域が前記SH3結合ドメインに隣接する２つのタンパク質キナーゼＣ部位を有することを特徴とする請求の範囲第１項記載のタンパク質。４．前記SH3結合ドメインは、SH3結合ドメインモチーフPGPAPQPXPXRを含むことを特徴とする請求の範囲第１乃至３項のいずれか記載のタンパク質。５．前記SH3結合モチーフがPGPAPQPAPCRであることを特徴とする請求の範囲第４項記載のタンパク質。６．前記SH3結合ドメインが、SH3結合モチーフのN-末端終端にポリペプチドセグメント(S,A)PP(R,K)XSRPXXXS(I,V)XSXをさらに含むことを特徴とする請求の範囲第４項または第５項いずれか記載のタンパク質。７．前記ポリペプチドセグメントがSPPRLSRPSYGSISSLであることを特徴とする請求の範囲第６項記載のタンパク質。８．図９に示すマウスアミノ酸配列を含み、実質的には自己の活性に影響しない突然変異または欠失を任意に有することを特徴とする自然抵抗性結合マクロファージタンパク質。９．前記SH3結合ドメインは、SH3結合モチーフPXSPTSPXPXXAPPRXTを含むことを特徴とする請求の範囲第１項乃至第３項のいずれか記載のタンパク質。１０．前記SH3結合モチーフがPTSPTSPGPQQAPPRETであることを特徴とする請求の範囲第９項記載のタンパク質。１１．前記SH3結合ドメインは、前記SH3モチーフのN-末端終端にさらにポリペプチドセグメントGPQRLSGSSYGSISSを含むことを特徴とする請求の範囲第１２項または第１０項記載のタンパク質。１２．図９に示されるヒトアミノ酸配列を含み、自己の活性に実質的に影響しない突然変異または欠失を任意に有する自然抵抗性結合マクロファージタンパク質。１３．タンパク質をコード化する請求の範囲第１項乃至第１３項のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列。１４．前記タンパク質の前記SH3結合ドメインがCCTGGCCCAGCACCTCAGCCAGCGCCTTG CCGGを含む配列によってコード化されることを特徴とする請求の範囲第１項乃至第８項のいずれか１つに記載のタンパク質をコード化するヌクレオチド配列。１５．前記SH3結合ドメインをコード化する前記配列はさらに上流領域AGCCCCCCG AGGCTGAGCAGGCCCAGTTATGGCTCCATTTCCAGCCTGをさらに含むことを特徴とする請求の範囲第１４項記載のタンパク質をコード化するヌクレオチド配列。１６．前記タンパク質の前記SH3結合ドメインがCCG ACC AGC CCG ACC AGC CCA G GG CCA CAG CAA GCA CCT CCC AGA GAG ACCを含む配列によってコード化されることを特徴とする請求の範囲第１項から第３項または第９項から第１２項のいずれか１つに記載のタンパク質をコード化するヌクレオチド配列。１７．前記SH3結合ドメインをコード化する前記配列は、さらに上流領域GGT CCC CAA AGG CTA AGC GGG TCC AGC TAT GGT TCC ATC TCC AGCを含むことを特徴とする請求の範囲第１６項記載のヌクレオチド配列。１８．DNA配列であることを特徴とする請求の範囲第１３項から第１７項までのいずれか１つに記載のヌクレオチド配列。１９．cDNA配列であることを特徴とする請求の範囲第１８項記載のヌクレオチド配列。２０．自然抵抗性結合マクロファージタンパク質をコード化し、図２に示されたヌクレオチド配列を含み、任意に該タンパク質の活性に影響を与えない突然変異または欠失を任意に含むことを特徴とするcDNA。２１．自然抵抗性結合マクロファージタンパク質をコード化し、該タンパク質の活性に実質的に影響しない突然変異または欠失を任意に有し、以下の配列すなわち、を含むことを特徴とするＤＮＡ。２２．表３に示す１つ以上のエキソンを含み、各エキソンはイントロン境界領域に隣接し、請求の範囲第１項乃至第３項または第９項乃至第１２項記載のタンパク質をコード化するDNA配列。２３．プロモーター領域がポリgt部位を含む請求の範囲第１３項乃至第２２項いずれか１つに記載のヌクレオチド配列のプロモーター領域を含むヌクレオチド配列。２４．前記ポリgt部位は、一般式t(gt)₅ac(gt)₅ac(gt)_ngであり、式中ｎ＝０または整数であることを特徴とする請求の範囲第２３項記載のヌクレオチド配列。２５．RNAであることを特徴とするヌクレオチド配列。２６．請求の範囲第２０項に記載のcDNAを取り込むプラスミドpBabeλ8.1。２７．請求の範囲第２０項または第１９項に記載のヌクレオチド配列を取り込むウイルスベクター構成物。２８．請求の範囲第２３項または第２４項に記載のヌクレオチド配列の5’領域に特異的な配列とハイブリッド形成することができ、少なくともその一部を増幅させることができるヌクレオチドプライマー対。２９．増幅すべきヌクレオチド配列の一部がポリgt部位であることを特徴とする請求の範囲第２８項記載のヌクレオチドプライマー対。３０．請求の範囲第１３項乃至第２４項のいずれか１つに巨細のヌクレオチド配列の一部とハイブリッド形成することができ、ヌクレオチド配列は、前記SH3結合ドメインを含むかその上流であるタンパク質のN-末端領域をコード化することを特徴とするヌクレオチドプライマー対。３１．請求の範囲第２２項で定義したエキソンまたはそのイントロン境界とハイブリッド形成することができ、少なくとも前記エキソンの一部を増幅することができるヌクレオチドプライマー対。３２．前記エキソンがヒトNRAMP遺伝子のエキソン２であることを特徴とする請求の範囲第３１項記載のヌクレオチドプライマー対。３３．増幅すべき前記エキソンの一部がSH3結合ドメインをコード化する配列を含むことを特徴とする請求の範囲第３２項記載のヌクレオチドプライマー対。３４．請求の範囲第１３項から第２４項記載のいずれか１つのヌクレオチド配列のすくなくとも一部とハイブリッド形成し、ヌクレオチド配列は前記SH3結合ドメインを含むかその上流であるタンパク質のN-末端領域をコード化することを特徴とするヌクレオチドプローブ。３５．cDNA配列を含むことを特徴とする請求の範囲第３４項記載のヌクレオチドプローブ。３６．請求の範囲第２３項または第２４項記載のヌクレオチド配列とハイブリッド形成するか、請求の範囲第２２項記載のDNA配列の少なくとも一部とハイブリッド形成することができることを特徴とするヌクレオチドプローブ。３７．対立遺伝子特異プローブまたはオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする請求の範囲第３４項または第３６項記載のヌクレオチドプローブ。３８．N-末端領域の少なくとも一部を含む請求の範囲第１項乃至第１２項のいずれか１つに記載のタンパク質のポリペプチドフラグメント。３９．から選択されたアミノ酸配列を含む請求の範囲第１項から第１２項までのいずれか１つに記載のタンパク質のポリペプチドフラグメント。４０．請求の範囲第１項乃至第１２項までのいずれか１つに記載のタンパク質に対する抗体。４１．請求の範囲第３８項または第３９項までのポリペプチドフラグメントに対する抗体。４２．モノクローナル抗体である請求の範囲第４０項または第４１項に記載の抗体。４３．診断試験においてNRAMP遺伝子の多形を検出するために、請求の範囲第２８項乃至第３３項のいずれか１つに記載のプライマー対を使用する方法。４４．診断試験においてNRAMP遺伝子の多形を検出するために請求の範囲第３４項乃至第３７項のいずれか１つに記載のプローブを使用する方法。