JPH06500688A - 神経線維腫遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 神経線維腫遺伝子 本発明は国立衛生腕（Ｎ　Ｉ　Ｈ）助成金Ｎ５２３４１０及びＮ５２３４２７の 下、一部政府の援助によりなされたものである。

関連出願 本願はコリンズら（Ｃｏｌｌｉｎｓ　ｅｔ　ａｔ、）により、１９９０年６月２ ９日に出願したｒ神経線維腫遺伝子ＣＮｅｕｒａｆｉｂｒｏｍａｔｏｓｉｓ　Ｇ ｅｎｅ＞　Ｊという名称の米国出願筒５４７．０９０号の部分継続出願である。

発明の分野 本発明は、一般にフォンレックリングハウゼン（ＶｏｎＲｅｃｋｌｉｎｇｈａｕ ｓｅｎ）神経線維腫症（ＮＦＩ）疾患過程に関与する遺伝子に関するものであり 、より具体的には、その遺伝子に対応する核酸配列の同定、単離及びクローニン グに関するものである。本発明はさらにＮＦＩ遺伝子産物及び配列ならびにそれ により生じた抗体に関するものである。本発明はまた、ＮＦＩのスクリーニング 法及びＮＦＩ診断法、ならびに従来の治療法と組換え技術を利用した遺伝子療法 にも関する。

発明の背景 フォンレックリングハウゼン神経線維腫症（ＮＦＩ）（しばしば「エレファント マン病」１といわれる）は、総人口の３０００人に約１人が罹患する最も良く見 られる常染色体支配のヒトの病気の−っである。この病気はまず第一に神経冠由 来の組織（ｎｅｕｒａｌ　ｃｒｅｓｔ−ｄｅｒｉｖｅｄｔｉｓｓｕｅ）に影響を 及ぼし、カフェオレ斑、年齢とともに大きさと数が増加する神経線維層、学習不 能、精神遅延、卒中及び悪化の危険性の増大によって特徴付けられる。

病気の発現はその症候や重篤さにおいて極めて変化し得るものであり、自発的な 突然変異率は著しく高く、新しい変異を表すすべての場合の約３０〜５０％を占 める。

ＮＦＩの臨床的診断を存命中に早期に行うことは、症候の多様さやその出現の遅 れのために比較的困難である。

ＮＦＩ遺伝子の直接的クローニングは、ＮＦＩ組織中において異常な状態が一貫 していないために行うことができないが、これができれば遺伝子産物について十 分な情報が得られるであろう。残った選択は、遺伝子の位置クローニングであり 、これは機能的性質よりもむしろ染色体地図上の位置を利用するものである。こ のアプローチを用いて、遺伝子連鎖分析（ｇｅｎｅｔｉｃ　ｌｉｎｋａｇｅａｎ ａｌｙｓｉｓ）によってＮＦＩ遺伝子を第１７染色体の中央’　ＮＩＨの一団は 、しかし、最近になって「エレファントマン」ジエイ・メリック（Ｊ、　Ｍｅｒ ｒｉｋ）は実際は神経線維腫症てはなく、プロテウス症候群として知られている 極めて稀な病気にかかっていた、と結論づけた。

長腕に帰属した。続いて共同して多重点マツピングを行い、その遺伝子の位置を 、１７ｑ１１．２の約３センチモルガンにまで狭めた。体細胞ハイブリッド技術 、連鎖クローン及びパルスフィールドゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）を組合せて、バ ランスのとれた転座ｔ（１；１７）及びｔ　（１７，２２）（第１７染色体上テ 約６０ｋｂ離レタフレークポイントを有する）を持った二人の血縁でないＮＦｌ 患者に適用したところ、遺伝子の位置は、染色体バンド１７ｑ１１．２の数百キ ロ塩基にまでさらに狭まった。

コリンズら（Ｃｏｆｆ１ｎｓ、　Ｆ、　Ｓ、　ｅｔ　ａｌ、　）　、Ｔｒｅｎｄ ｓ　１ｎＧｅｎｅｔｉｃｓ　５　：　２１７−２２１　（１９８９）参照。

最初のＮＦＩ遺伝子の候補がマウス中でネズミ白血病のレトロウィルス積層部位 として同定された。Ｂｕｃｈｂｅｒｇ。

Ａ、Ｍ、　ら、　Ｏｎｃｏｇｅｎｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　２　：　ｌ　４　９　 （１９８８）参照。しかし、現在は、ＮＦＩブレークポイントの間の地図を作る ヒト相同染色体ＥＶ１２Ａ（以前はＥＶＩ２と呼ばれた）は、前述のＮＦ１転座 によってさえぎられることはなく、この遺伝子中にはＮＦＩの原因として同定さ れた異常性は存在しないということかわかっている。

同様にＥＶＩ２Ｂ（以前はＮＦＩ−ｃ２と呼ばれた）（これは染色体歩行とジャ ンピング（ｊｕｍｐｉｎｇ）により、本発明の過程で新たに同定された遺伝子で あり、ＮＦＩブレークポイントの間の地図をなすのであるカリも、ＮＦ１転座に よってさえぎられることはなく、ＮＦＩ患者にいかなる異常性をも表さなかった 。従って、ＮＦＩ遺伝子はまだ同定されてはいなかったということか明らかとな ったのである。

最近、ＮＦＩに罹った個体に突然変異を示す位置クローニングによって、ある遺 伝子か同定された。Ｃａｗｔｈｏｎ。

Ｒ９ら、Ｃｅ１ｌ　６２：１９３−２０１　（１９９０）；Ｖｉｓｋｏｃｈｉｌ 、　Ｄ、ら、Ｃｅ１ｌ　６２：１８７−１９２　（１９９０）　；　Ｗａｌｌａ ｃｅ、　Ｍ、　Ｒ，ら、５ｃｉｅｎｃｅ　２４９　：　ｆ　８１−１８６　（１ ９９０）。さらにクローニングと部分配列分析を行い、遺伝子産物は酵母のＩＲ ＡＩ及びＩＲＡ２タンパク及び哺乳類ＧＴＰアーゼ活性化タンパク（ＧＡＰ）の 触媒ドメインに約３０％の類似性を示すドメインを含むことを証明した。Ｂｕｃ ｈｂｅｒｇ、　Ａ、ら、Ｎａｔｕｒｅ　３４７：２９１−２９４　（１９９０） ；Ｘｕ、Ｇ、ら、Ｃｅ１ｌ　６２：５９９−６０５　（１９９０）。ＧＡＰは活 性型ＧＴＰ結合ｒａｓ　ｐ　２１の不活性型ＧＤＰ結合形態への変換を触媒する 細胞質ゾルタンパクである。Ｔｒａｈｅｙ、　Ｍ、　ら、５ｃｉｅｎｃｅ　２３ ８：５４２−５４５　（１９８７）、続いて、ＮＦＩ遺伝子産物のＧＡＰ関連ド メインもヒトや酵母ＲＡＳ　Ｒ２１と相互作用し、その活性を下方制御し得るこ とが示された。Ｂａ１ｌｅｓｔｅｒ、　Ｒ，ら、Ｃｅ１ｌ　６３　：　８５１− ８５９　（１９９０）　；　Ｍａｒｔｉｎ、　Ｇ、　Ａ、ら、Ｃｅ１ｌ　６３： ３４３−３４９　（１９９０）；Ｘｕ、Ｇ、ら、Ｃｅ１ｌ　６７、０９０号に含 まれているＮＦＩのｃＤＮＡクローニングについて本願出願人か先に行った報告 は、ノーザンブロットにより約１３ｋｂとされる転写体の部分フラグメントに基 づいたものであった。Ｗａｌｌａｃｅ、　Ｍ、　Ｒ，ら、５ｃｉｅｎｃｅ　２４ ９：１８１−１８６　（１９９０）、ＮＦ１遺伝子の全コード領域は今、クロー ニングされ、シーケンスされており、その遺伝子産物は同定され、それに対する 抗体も生成されており、これらが本明細書中に記載され、請求されているのであ る。

発明の概要 フォンレックリングハウゼン神経線維腫症（ＮＦＩ遺伝子）に関与する遺伝子の 全コード領域、及び、約１３ｋｂの至る所で発現された大きな転写物（ＮＦ　Ｉ 　ＬＴ）が同定され、ｃＤＮＡは図６．１２及び配列リストに示したように、ク ローニングされ、シーケンスされている。

その配列を分析したところ、２８１８アミノ酸の読み取り枠（Ｏｐｅｎ　ｒｅａ ｄｉｎｇ　ｆｒａｍｅ）が明らかとなったが、あるいはスプライシングされた産 物が様々な大きさのタンパク産物をコードしているのかもしれない。この遺伝子 は第１７染色体上で最小２７０ｋｂに及び、ｃｐＧに富んだ島にそのプロモータ ーを有している。ＮＦＩ配列は高度に保存されており、ＧＴＰアーゼ活性化タン パクファミリー（ＧＡＰ）との相同性を示す。遺伝子は両ＮＦ１転座によってさ えぎられることはなく、新しい突然変異ＮＦｌ耐性に変わり、そしてその中には 以前の候補遺伝子ＥＶ　ｌ　２Ａ　（ＥＶ　１２）及びＥＶＩ　２Ｂ　（ＮＦ　 Ｌ−ｃ２）を含んでいる。ＮＦＩ遺伝子産物を特異的に認識する抗体は融合タン パクと合成タンパクの両方に対して生じている。免疫沈殿とウェスタンプロット によりＮＦＩ遺伝子産物を最初にキャラクタリゼーションしたところ、約２５０ 　ｋＤａの独特なタンパクであることがわかった。

このタンパクは様々なヒトの組織やセルライン中に見出され、ラットやマウスの 組織中にも存在する。

遺伝子とその対応する遺伝子産物の同定とシーケンシングにより、核配プローブ とＮＦＩ遺伝子産物に対する抗体とを、本発明の範囲内で様々なハイブリダイゼ ーションと免疫学的検定法に使用して、正常又は欠陥のＮＦｌ遺伝子又は遺伝子 産物の存在をスクリーニングすることができる。遺伝子機能のレベルを測定する ための機能検定も診断のために、あるいは治療をモニターするために使用するこ とができる。本発明の主題に沿ったこのようなスクリーニングと診断のための検 定キットも提供する゛。

遺伝子及び組換え技術又はそれと機能的な等価物を用いて産生を増幅し得る正常 のＮＦＩタンパクを補充することによる患者療法も可能である。また、遺伝子欠 陥をｉｎ　５ｉｔｕで直したり、または組換え体もしくは他の媒体を用いて正常 な遺伝子産物を表現することのできるＤＮＡ配列を患者に運ぶことによる遺伝子 治療を通して、ＮＦｌを治療したり制御してもよい。神経系の非ＮＦＩ腫瘍の治 療と神経組織の成長促進も意図している。

本発明の他の特徴と利点は、以下の記載と添付の請求の範囲から、添付図面を参 照して明らかとなるであろう。

図面の簡単な説明 図１はキロ塩基のスケールで描いたＮＦＩ領域の模式図２ＡはｃＤＮＡクローン Ｂ３Ａ及びＰ５のサザンプロットである。

図２８はｃＤＮＡクローンＰ５及びＢ３Ａを含むＮＦＩＬＴ　ｃＤＮＡの一部の 模式地図である。

図３はＰ５プローブの５′末端を用いたヒト、マウス及びハイブリッドのＤＮＡ のサザンプロットであり、ＮＦＩＬＴがｔ（１７：２２）限界点にわたっている 。

図４ＡはＰ５プローブを用いた様々なヒト組織のノーザンプロットである。

図４８はＰ５プローブを用いた二つの独立したメラノーマ細胞系のノーザンプロ ットである。

１Ｎ４ｃはプライマーＡとＢを用いた様々なヒト組織と細胞系におけるＲＮＡ発 現のＰＣＲ解析である。

図４ＤはマウスＮＦＩＬＴ　ＲＮＡを増幅しないプライマー〇とＤを用いたマウ ス−ヒトハイブリッド及び親細胞系由来ＲＮＡからのＰＣＲ結果である。

図５Ａ−ＤはプローブＰ５を用いた新しい突然変異ＮＦ１患者のＤＮＡ、その両 親及び正常人のＤＮＡのサザンプロットであり、患者中に０．５　ｋｂの挿入が あることを示している。

図６はＮＦＩＬＴ　ｃＤＮＡの部分ヌクレオチド配列をその対応アミノ酸配列と ともに示す。

図７はＮＦＩＬＴの模式的な部分エクソン地図である。

図８はＮＦＩ遺伝子中のｃＤＮＡ歩行（ｃＤＮＡ　ｗａｌｋ）を表す模式図であ る。

図９はＮＦ１転写物の５′部位のｃＤＮＡ配列である。

図１０はヒトの脳の前頭葉令ＲＮＡとメラノーマ細胞ｍＲＮＡのプライマー伸張 （ｐｒｉ’ｍｅｒ　ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ　ｏｆｆ）のＰＡＧＥ分析である。

図１１はｃＤＮＡクローン中に見出される代替５′末端を提示する。

図１２はシーケンシングされたクローンの読み取り枠から考えられるＮＦＩ遺伝 子産物の完全アミノ酸配列である。

図１３は第１７染色体のゲノム地図上のＮＦ１転写物の範囲を示す。

図１４は融合タンパクと合成ペプチドの位置を示したＮＦＩ遺伝子産物の地図で ある。

図１５はｐＭＡＬ、ｃ融合タンパクの発現を示す５ＤＳ−ＰＡＧＥ結果である。

図１６は（Ａ）免疫沈殿後の５ＤＳ−ＰＡＧＥ結果と（Ｂ）ペプチド抗血清Ｈと Ｄが２５０　ｋＤａタンパクを認識することを説明するウェスタンプロット分析 である。

図１７はペプチド抗血清りか独立に生成した融合タンパクを認識することを説明 するウェスタンプロットである。

図１８はｐＭＡＬ、Ｂ３Ａ融合タンパクとペプチド抗血清Ｈがペプチド抗血清り により沈殿した同じタンパクを認識することを説明する５ＤＳ−アＡＧＥ結果で ある。

図１９はｐＭＡＬ、Ｂ３Ａ融合タンパクと抗血清が様様な成体マウス組織中のＮ ＦＩタンパクを検出することを説明する５ＤＳ−ＰＡＧＥ結果である。　。

発明の詳細な説明 ＮＦＩ（具体例１での確認に先立ってＮＥ７１ＬＴという）を同定し、その゛＝ ニード域をクローニングしシーケンシングした。ＮＦ１遺伝子とその対応アミノ 酸配列の部分及び完全コード配列を図６．１２と添付した配列リストに示した。

配列の分析は、２８１８個のアミノ酸の読み取り枠を明らか１こしたが、あるい はスプライシングされた産物が様々な大きさのタンパク産物をコードしているの かもしれない。遺伝子は第１７染色体上で最小２７０ｋｂに及び、そのプライマ ーをＣｐＧに富んだ島に育している。ＮＦＩ配列は高度に保存され、ＧＴＰアー ゼ活性化タンパクファミリー（ＧＡＰ）に対して相同性を示す。

推定されている遺伝子（ＮＦ　Ｉ　ＬＴ）がＮＦＩに関与する遺伝子、即ちＮＦ Ｉ遺伝子であるという結論は、以下に詳述する幾つかの系の証拠に基づいたもの である。

まず、この遺伝子はＤＮＡとＲＮＡレベルで示されるように、ｔ（１７＋２２） ブレークポイントによって明瞭に分裂した。ＤＣＲ１ヒト−マウスハイブリッド のＲＮＡ分析により、ＮＦ　Ｉ　ＬＴ遺伝子が同様にｔ（１：１７）ＮＦ１転座 によって機能的に分裂することが示された。さらに強固な証拠となったのは、新 しい突然変異ＮＦ１患者中の０．５　ｋｂの挿入の同定であった。この挿入は前 に提案された遺伝子ＥＶ　１２Ａ　（ＥＶ　１２）　、！−ＥＶ　ｔ２Ｂ　（Ｎ Ｆ　ｌ−ｃ　２）から少なくとも１０ｋｂ離れた所に位置していた。これらの候 補遺伝子もまたＮＦＩ患者における異常性を示すことはなく、明らかにアンチセ ンスストランド上のＮＦ　ＩＬＴのイントロン中に位置している。ＮＦ　Ｉ　Ｌ Ｔの大きな転写体の大きさも、約１０−’／対立遺伝子／世代という高突然変異 率に一致していた。

ＮＦＩ遺伝子産物の正常機能をさらに明瞭にし、そして遺伝子中の変化が神経線 維腫症を引き起こすための病態生理学的基礎を決定するために、ＮＦＩタンパク 産物を認識する特異的抗体を作り出すことが望ましかった。

相似の例として、デュヘンネ（Ｄｕｃｈｅｎｎｅ）堅筋ジストロフィー（ＤＭＤ ）における分子病理学の理解がＤＭＤ遺伝子産物、シストロフィンに対する抗体 の開発によって大いに向上したことが挙げられる。Ｈｏｆｆｍａｎ、’　Ｅ、　 Ｐ、ら、Ｃｅ１ｌ　６３：８３５−８４１　（１９９０）、これらの抗体が産生 されると、細胞内でタンパクの位置を決め、タンパクの変化とＤＮＡ中の異常性 とを相関づけることか可能となった。Ｂｏｎｉｌｌａ、　Ｅ、ら、Ｃｅ１ｌ　５ ４　：　４４７−４５２　（１９８８）及びＬｉｄｏｖ、　Ｈ，Ｇ、　Ｗ、ら、 Ｎａｔｕｒｅ３４８ニア２５−７２８　（１９９０）、Ｂｅｃｋｅｒ型及びＤｕ Ｃｈｅｎｎｅ型筋ジストロフィーの間の区別は、今ではタンパクレベルでつける ことができ、患者の評価のための信頼性のある診断ツールを提供している。Ｈｏ ｆｆｍａｎ、　Ｅ、　Ｐ。

ら、Ｎｅｗ　ＥｎｇｌａｎｄＪ、　Ｍｅｄ、３１８：　１３６３−１３６８（１ ９８８）。

ＮＦＩ遺伝子産物を研究するために、融合タンパクと合成ペプチドの両方に対し て抗体が産生された。二種の抗ペプチド抗血清と一種の融合タンパク抗血清を用 いた初期キャラクタリゼーションを行ったところ、免疫沈殿法とウェスタンプロ ットの両方により約２５０　ｋＤａの独特なタンパクであることが示された。こ のタンパクは検査したすべての組織と細胞系において見出され、ヒト、ラット及 びマウスの組織において検出される。これらの抗体が特異的にＮＦＩタンパクを 認識することを示すために、合成ペプチド抗血清が作られる元になる配列を含ん だ付加的な融合タンパクを産生した。両ペプチド抗血清ともにそれぞれの融合タ ンパクを認識した。ペプチド抗血清を用いた免疫沈殿法が、他のペプチド抗血清 か融合タンパク抗血清のいずれかを用いた免疫プロットにより検出された同一タ ンパクを認識するために示された。

ウェスタンプロットによる成人組織のホモジエネートを試験したところ、空間的 に性質の異なるエピトープを認識する抗血清を用いて、すべての組織中でＮＦＩ タンパクが存在することが示された。

ｒ、ＮＦＩＬＴ転写物の単離とキャラクタリゼーション二つの独特な手法を利用 してＮＦＩＬＴを定義づけるｃＤＮＡクローンを引き出した。染色体ジャンピン グにより得られたクローンＥＨＩのジャンプ端（ｅｎｄ−ｏｆ−ｊｕｍｐ）を用 いた初期の実験は、ｔ（ｔ７；２２）ブレークポイントに対してまさにテロメリ ツクに存在するシングルコピー１．４ｋｂ　ＥｃｏＲｒ−Ｈｉｎｄ　ＩＩＩサブ フラグメントが種間にわたって保存されており、それ故にその領域での転写物を 捜すにあたって有用なプローブとなる可能性がある。このプローブは、ペンシル バニア大学医学センターのマリオン−スコツト（Ｍａｒｉｏｎ　５ｃｏｔｔ）と カート−フィッシュベック（Ｋｕｒｔ　Ｆｉｓｃｈｂｅｃｋ）によりヒトコーダ エキーナ（ｈｕｍａｎ　ｃａｕｄａ　ｅｑｕｉｎａ）ＲＮ　Ａから構築されるヒ ト末梢神経ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために使用された。この ライブラリーは一部はオリゴｄＴから合成か開始され、一部はランダムに開始さ れ、λＺＡＰ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、　ＣＡ）のＥｃｏ ＲＩ部位の中にクローンされた挿入を有している。７００．０００個のクローン か、ＸＬＩ−Ｂｌｕｅ細胞に置かれ、Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、ら、Ｍｏ１ｅｃ ｕｌａｒ　Ｃｒａｎｉｎｇ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌに記 載された方法でスクリーニングされた。Ｃｏ１ｃｌ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏ ｒ　：Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　（ １９８２）　ｏこのｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングしてクローンＰ５を 単離した。これは以下に述へる［Ｊ２Ａのサザンブロットに示されるように１． ７　ｋｂの挿入を育している。

別のアプローチとして、ＹＡＣクローンＡｌ　１３Ｄ７、この領域からのクロー ンの重複コンティグの一部、を用いて転写物をめた。このＹＡＣは全ブレークポ イント領域を含んでいるので、このプローブでのｃＤＮＡライブラリーの直接ス クリーニングは、技術的に難かしいとはいえ、発現された転写物の全セットを与 えるものと期待される。ＹＡＣゲノムＤＮＡのフィールトーインバージョンゲル 電気泳動を、酵母染色体から２７０ｋｂＹＡＣを分離する条件下（４°Ｃで１６ ０ボルト、６５時間印加、前方傾斜６−４８秒、逆傾斜２−１６秒）で１．０％ 低溶解アガロースゲルで行つた。ＹＡＣをゲルから切り出し、消化緩衝液で平衡 化させ、Ｉｆｉｎｃ　Ｉｔで消化した。

ＴＥての再平衡化の後、アガロースを３体積部の水で希釈し、６８°Ｃて溶解さ せた。Ｆｅｉｎｂｅｒｇ、　Ａ、　Ｐ、　ら、ＡｎａｌＢｉｏｃｈｅｍ、ｌ　３ ７　：　２６６　（１９８４）に従って、ＹＡＣの放射線標識を希釈した低溶解 アガロース中で行ったが、最終体積５００μｌては０．５ｍＣ１を用いた。スピ ンカラムを用いて取り込まなかった計数を除いた後、プローブを６５°Ｃで１５ 分間０．　Ｉ　Ｍ　ＮａＣｌ中て最終濃度１ｍｇ／ｍｌとして、ヒト胎盤ＤＮＡ とともに前アニールした。ニトロセルロースフィルター上でのファージリフトを 、６ＸＳＳＣ１２Ｘ　Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ、１＋ｎＭ　ＥＤＴＡ、０．５％Ｓ ＤＳ中て一晩、府ハイブリダイゼーションした。ハイブリダイゼーションは４８ 時間同じ溶液で行った。フィルターノ洗浄を、最終的１ｃ０．２Ｘ　ＳＳＣ，０ ，１％ＳＤＳ、６５℃となるまで厳重に行った。Ｂｏｎｔｈｒｏｎ、　Ｄ、　Ｊ 。

ら、Ｊ、　Ｃ１１ｎ、　ｒｎｖｅｓｔ、７６　：　８９４　（１９８５）により 記載されたＢリンパ芽球ｃＤＮＡライブラリーから上述の手順により、クローン Ｂ３Ａを単離した。これは０．８ｋｂの挿入を含んでいた。続いて分析したとこ ろ、Ｐ５と８３Ａとは以下に述べる図２Ａのサザンプロットに示したようにオー バーラツプしていることがわかった。

さて、図１に関しては、キロ塩基のスケールで描かれたＮＦＩ領域の模式図が示 されている。第１７染色体上のオリエンテーションが示されており、転座ブレー クポイントか矢印で示されている。示された二つの不明なプローブは１７Ｌｌと ＩＦＩＯてあり、Ｆｏｕｎｔａｉｎ、　Ｊ、　Ｗ。

ら、５ｃｉｅｎｃｅ　２４４　：１０８５　（１９８９）及び０’Ｃｏｎｎｅ］ ｌ、Ｐ、　ら、　５ｃｉｅｎｃｅ　２　４　４　：　１　０　８　７　（１９８ ９）に記載されている。前述の候補遺伝子ＥＶ１２Ａ（ＥＶ　１２）及びＥＶ１ ２Ｂ　（ＮＦＩ−ｃ２）が地図の線上に示されており、矢印の先は転写の方向を 指している。ジャンプクローンＥＨＩは弧で示されている。２７０ｋｂのＹＡＣ Ａ１１３Ｄ７はこの領域をカバーするコンティグの一部であり、コスミドＩＦＩ 　Ｏ由来のプローブでＹＡＣライブラリーをスクリーニングすることにより、ワ シントン大学の医学遺伝学センター（ｔｈｅ　Ｃｅｎｔｅｒｆｏｒ　Ｇｅｎｅｔ ｉｃｓ　ｉｎ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）から得た。

図２に関しては、図２ＡはｃＤＮＡクローンＰ５とＢ３Ａのサザンプロットマッ ピングで示している。ＹＡＣクローンＡｔ　１３Ｄ７からのゲノムＤＮＡをＥｃ ｏＲＩで消化し、ゲル電気泳動で分離し、シーンスクリーン（ＧｅｎｅＳｃｒｅ ｅｎ）に移した。ハイブリダイゼーションと洗浄条件は以前にＤｒｕｍｍ、　Ｍ 、　Ｌ、ら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　２　：　３４６　（１９８８）に記載された通 りである。フィルターをハイブリダイゼーションの合い間にはぎながら、クロー ンＢ３Ａ（レーンｌ）とＰ５（レーン２）で続けてプローブした。

各り０−ンはＹＡＣ中の特異的なＥｃｏＲＩ断片をマツピングしており、その大 きさがキロ塩基で示しである。図２Ａに示すように、クローンＰ５は１．７　ｋ ｂの挿入を含み、クローンＢ３Ａとオーバーラツプしている。

図２Ｂに関しては、ＮＦＩＬＴ　ｃＤＮＡの一部の模式的地図が、ｃＤＮＡクロ ーンＰ５と８３Ａと同様に、読み取り枠と３′非翻訳領域の範囲を示している。

ＮＦＩＬＴ遺伝子座が一つ又は両方の転座ブレークポイントによりさえぎられる かどうかを決定するために、Ｐ５の５′末端を転座ハイブリッドのサザンプロッ トに対するプローブとして用いた。Ｓｃｈｍｉｄｔ、　Ｍ、　Ａ、ら、Ｊ。

Ｍｅｄ、　Ｇｅｎｅｔ、２８　：　７７１　（１９８７）　；　Ｌｅｄｂｅｔｔ ｅｒ。

Ｄ、　Ｃ，ら、Ａｍ、　Ｊ、　Ｈｕｍ、　Ｇｅｎｅｔ、　４４　：　２０　（１ ９８９）　：　Ｍｅｎｏ口、Ａ、Ｇ、ら、　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　５　：　２４　 ５　（２９８９）　：　Ｃｏ１１ｉｎｓ、Ｆ、　Ｓ、ら、Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　 Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　５　：２１７（１９８９）参照。これらのハイブリットはブ レークポイントに対してテロメリツクな第１７染色体配列を含み、ｔ（１；１７ ）ブレーク（ハイブリッドＤＣＲ１）がｔ（１７；２２）ブレーク（ハイブリッ ドＮＦＩ３）に対し６０ｋｂ動原体側に（６０ｋｂ　ｃｅｎｔｒｏｍｅｒｉｃ　 ｔ。

ｔｈｅ　ｔ（１７；２２）　ｂｒｅａｋ）生じている。

図３に関しては、このサザンプロットのために、マウス、正常ヒト及びハイブリ ッドＤＮＡをＥｃｏＲＩて消化し、ハイボンドＮ（Ｈｙｂｏｎｄ　Ｎ）に移し、 Ｗａｌｌａｃｅ、　Ｍ、　Ｒ，ら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＲｅｓＳ１７　：　 ｌ　６６５　（１９８９）によって以前記載されたようにハイブリダイゼーショ ンした。

最終的な洗浄は６５℃、２０分間ＩＸ　５ＳＣ１０，１％ＳＤＳであった。プロ ーブはＰ５ブルースクリプトサブクローン（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　５ｕｂｃｌ ｏｎｅ）から０．８　ｋｂ　５　’末端断片であり、ベクターポリリンカーから 図２Ｂに示すＢｓｔＥ　Ｉｔにまで及んでいる。図３においては、ＭはマウスＤ ＮＡを表し、Ｈは正常ヒトＤＮＡを表し、１７はハイブリッドＭＨ２２−６、即 ちＴｕｉｎｅｎら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓｌ　：　３７４　（１９８７）により記載 された唯一のヒト材料としてヒト第１７染色体を含むマウス細胞系由来のＤＮＡ を表し、ＤＣＲ１はｔ（１；１７）のｄｅｒ（１）を含むマウスハイブリッドを 表し、そしてＮＦ　ｌ　３はｔ（１７，２２）のｄｅｒ（２２）を含むハイブリ ッドを表す。

図３の結果はＰ５５′末端プローブが１５と４．　Ｏｋｂの二種のヒトＥｃｏＲ Ｉ断片を検出することを示す。８．０と２、５　ｋｂの二つのバンドはマウスＤ ＮＡで見られ、この転写物か強く保存されることを示している。転座ハイブリッ ドにおいて、ＤＣＲｌは両方のヒトのバンドを含んではいるか、ＮＦＩ３は４． 　Ｏｋｂバンラド欠いている。このことは、ＮＦ　Ｉ　ＬＴの一部はこれらのブ レークポイントの間に存在することを示している。

図３に提示されたサザンプロットはＰ５の部分ｃＤＮＡクローンかＮＦＩ患者に おいてはｔ（１７：２２）転座ブレークポイントを越えて拡かってはいるものの 、これに続く実験によって、それは不正確であることが示された。即ち、全Ｐ５ クローンは実際はこのブレークポイントに対しテロメリツクな位置に存在するの である。図３のｄｅｒ（２２）染色体からの４．　Ｏｋｂ　ＥｃｏＲ［ゲノム断 片が外見上存在しないのは、転座がこの４．　Ｏｋｂの間隔以内で起こり、生成 したブレークポイント断片がたまたまプロットのこのレーン内の他のヒトゲノム バンドと正確に同じ大きさく１５ｋｂ）であるという事実によるのである。

本願出願人か続いて行った付加的なｃＤＮＡクローニング作業により、ｔ（１７ ；２２）ブレークはＰ５の５′末端＠ｌ６８１ｂｐの位置（Ｃａｗｔｈｏｎ、　 Ｒ，Ｍ、ら、Ｃｅ１１６２　：１９３　（１９９０）の番号付はシステムによれ ばエクソン４と５の間）てＮＦＩＬＴ　ｃＤＮＡをさえぎることか示された。こ の証拠はＷａｌｌａｃｅ、　Ｍ、　Ｒ，ら、５ｃｉｅｎｃｅ　２５０　：１７４ ９　（１９９０）の図１に説明されており、これはエクソン４とエクソン５につ いてＰＣＲプライマーで増幅したゲノムＤＮＡを用いて行ったサザンプロットを 示している。ＰＣＲプライマー配列はエクソンに隣接したイントロン中に位置し 、Ｃａｗｔｈｏ口、ＲｏＭ、ら、Ｃｅ１ｌ　６２：１９３　（１９９０）に記さ れている。

ＤＮＡ源は正常ヒト、ｔ　（１７，２２）ＮＦ１転座からのｄｅｒ（２２）染色 体を含むＮＦ　１３マウスヒト／Ｎイブリ・ノド、マウスてあり、頁の対照は水 であった。

Ｃ，ＲＮＡ分析 ＮＦＩＬＴ　ｃＤＮＡの転写物の大きさを決定するために、クローンＰ５を用い て様々な組織からＲＮＡのノーザンプロットを探究した。［Ｊ４ＡとＢに示しで あるように、約１３ｋｂの転写物か脳、神経線維腫及び腎臓の組織ならびに二つ のメラノーマ細胞系において可視化された。類似の大きさのハイブリダイゼーシ ョンシグナルはいくつかの他の組織からＲＮＡにおいて見ることができたか、バ ンドは分離が良くなく、おそらく大きな転写物の分解によるのであろう。ＲＮＡ 試料間の分解に差かあるために、バンド強度から様々な組織中ての発現の相対的 レベルを判断することはてきなかった。

様々な正常及び病態組織中てのＮＦＩＬＴの発現の）くターンを調へるために、 Ｇｉｂｂｓ、　Ｒ，Ａ、ら、ＰＮＡＳ　（ＵＳＡ）８６：１９１９　（１９８９ ）に記載されたＲＮＡポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）分析を、翻訳領域からの プライマーを用いて数多くの組織について行った。図４０に示したように、ＮＦ ＩＬＴの発現は広範な種類のヒト組織において明白であり、これらの組織として は、ノーザンプロットにシグナルを与えるものだけてなく、不死化したＢ　−Ｉ Ｊンパ芽球（ＷＢＣ）（ＮＦＩ及び非ＮＦｌともに）、ＮＦＩ皮膚線維芽細胞、 牌臓、肺、筋肉、胸腺腫、神経芽細胞腫、ＮＦＩ神経線維肉腫細胞系、結腸癌細 胞系、及び乳癌も含まれる。他の実験では、結腸、甲状腺、上皮小体腺腫、リン パ腫、子宮内膜癌、Ｋ５６２赤血白血病細胞及び正常皮膚線維芽細胞においても 発現が検出された。固形組織試料の白血球汚染はＰＣＲシグナルの原因となりう るか、様々な細胞系からのＲＮＡが発現を示すという事実は、ＮＦＩＬＴが広く 発現されているらしいということを示している。

上記の実験で用いたプライマーはマウスＲＮＡにおいて同様の大きさのバンドを 増幅し、この翻訳された領域か保存されていることを示した。細胞遺伝子学的転 位を有したＮＦＩ患者由来の三つのハイブリッド細胞系で、ＮＦＩＬＴ遺伝子か 不活性化されているかとうかを決定するために、３′非翻訳領域からの一つのＰ ＣＲプライマーも、この領域は種間であまり保存されないだろうと予想して、実 験に含めた。この実験に含めた三つのハイブリッド細胞系は、ＤＣＲｌとＮＦ１ ３（上述した）及びｄｅｌ（１７）であった。この最後のハイブリッドは、第１ ７染色体の隣接長腕の一部か欠損しているＮＦＩ患者由米の欠損第１７染色体を 含んでいる。図４Ｄに示すように、期待した産物はＢ−リンパ芽球（ＷＢＣ）と ヒトの脳には見られたが、マウスの線維芽細胞ＲＮＡには見られなかった。正常 のヒト第１７染色体を含むハイブリットはまさにヒトＮＦＩＬＴを発現するか、 ＮＦ１転座転座ノブイブリッドｅｌ（１７）ハイブリッドのいずれかては何の産 物も見られなかった。これは、これらの転位か発現を廃止することを示している 。

■■、新しい突然変異ＮＦＩ患者のＤＮＡ異常ＮＦＩ患者の突然変異を同定する ことは、候補遺伝子の中からその遺伝子を正確に同定するために決定的なもので ある。新しい突然変異ＮＦＩ患者は特に有用なものであるか、これは患者らのＤ ＮＡと彼らの両親のそれとを比較すれば、原因となる突然変異と多形現象との間 の区別かより容易につけることかできる。パルス電界ゲル研究か幾つかのグルー プによってＮＦＬ領域のプローブを用いて行われたが、大きな転位を示さなかっ たので（Ｆｏｕｎｔａｉｎ、Ｊ、Ｗ、　ら、　５ｃｉｅｎｃｅ　２４４　：１０ ８５　（１９８９）　；　Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌ］、　Ｐ、ら、５ｃｉｅｎｃｅ　２ ４４　：　ｌ　０８７（１９８９））、患者ＤＮＡをＮＦＩＬＴを用いたサザン プロットレベルで調へた。ＮＦＩを有する３５人の個体からのＤＮＡをプローブ Ｐ５で分析し、オートラジオグラムの異常バンド又はバンド強度の明らかな差を 調へた。

唯一の患者はこの検定で相違を示した。このＮＦｌ新突然変異患者は３１才の白 人男性で、カフェオレ斑も腋のそばかす（ａｘｉｌｌａｒｙ　ｆｒｅｃｋｌｉｎ ｇ）も示してはいないか、巨大頭蓋、Ｌｉ５ｃｈ小節、及び多重頚部神経根＠瘍 （組織学的に神経線維腫であることが示されている）を存し、外科的削除を必要 とする。彼は数年前に単一の皮膚神経線維腫を取り除いており、耳の神経腫の証 拠は存していない。彼の両親を入念に調へたか、ＮＦＩ又はＮＦ２の特徴は見ら れなかった。図５Ａ−Ｄはこの患者（レーン２）と彼の両親（レーンｌと３）由 来のＤＮＡのサザンプロットを示し、４種の酵素とプローブＰ５を用いた。

ＥｃｏＲ［（図５Ａ）では、患者は正常なパターンを有していたが、ただ４．０ 　ｋｂの対立遺伝子が予想よりも薄く、また彼は、４．　Ｏｋｂバンラド大体同 じ強度の４．５　ｋｂの異常断片を示した。この４．５　ｋｂバンラド両親には 存在しなかった。同様に、他の３種の酵素を用いて、予想より約０．５ｋｂ大き い異常断片か見られた。Ｐｓｔｌについては、関与した１２ｋｂ断片は、前にｔ （１７；２２）ブレークポイントを含むことか示されたのと同じものであった。

これらの異常バンドは他の３４人のＮＦＩ患者（そのうちの１２人は新しい突然 変異を表している）や２７人の罹患していない個人には見られなかった。確認の ため、家族の試料を集めたか、同じ結果か得られた。家族はＮａｋａｍｕｒａ、 Ｙ、ら、５ｃｉｅｎｃｅ　２３５　：　１６１６　（１９８７）に記載された３ 種の高度に多形のＶＮＴＲプローブｐＹＮＺ２２、ｐＹＮＨ２４及びｐＥＫＭＤ Ａ２を用いて調べたが、不正確な父系を示すものはなかった。

まとめると、このデータの示すところは、この患者はＮＦＩＬＴのエクソンに近 接して、又はその内部に、約０、５　ｋｂの挿入であると思われる新規な突然変 異を持っているということである。この新しい突然変異は、ｔ（１７：２２）ブ レークポイントか遺伝子をさえぎることを示す証拠、及びＮＦ　Ｉ　ＬＴ発現が ｔ（１；１７）ハイブリッドＤＣＲ１では見られないことを示すＰＣＲデータに 沿えば、ＮＦＩＬＴかＮＦＩ遺伝子であることを示しＰ５と８３Ａの完全なシー ケンシングにより、５０７ｂｐのオーバーラツプが明らかになり、併合した配列 は図６に示すように２０１２ｂｐであった。単一の読み取り枠がＰ５の始めから ほとんど全配列にわたって同定されたが、これはＢ３Ａが３′末端に位置し、転 写が末端小粒に向けて起こることを示す。Ｂ３Ａの３′末端では、末端から１８ １　ｂｐＯ所に停止コドンが存在する。しかし、ポリアゾニレ−ジョンシグナル やポリ（Ａ）テイルは明らかてはなく、これは、３′非翻訳領域の一部は欠失し ていることを意味する。このＤＮＡ及びタンパク配列と、Ｇｅｎｂａｎｋ　（Ｂ ｕｒｋｓ、Ｃ，ら、　Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍｏｌ、ｌ　８　３　：　３　（１９ ９０）参照）のエントリーならびにＮＢＲＦ及び５ＷＩＳＳ−ＰＲＯＴデータベ ース（Ｂａｒｋｅｒ、　Ｗ、　Ｃ，ら、Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙ＋ｎｏ１．１８３ 　：　３１　（１９９０）及びＫａｈｎ、　Ｐ。

ら、Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　１８３　：　２３　（１９９０）参照）と を比較したが、既知の配列との有意の類似性は見られなかった。アミノ酸配列の 水治法プロット（ｈＹｄｒｏｐａｔｈｙｐｌｏｔ）により、主として親水性のポ リペプチドであることがわかった。Ｋｙｌｅ、　Ｊ、ら、Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｒｉ ａｌ、ｌ　５７　：　１０５（１９８２）参照。他にも分析を行ったが、二つの 可能性のあるＮ−グリコジル化部位と三つの可能性のある核局在シグナル（図６ に記載）を除いては、他の認識し得るモチーフは現れなかった。

図７に関しては、ＮＦＩの仮定ゲノム構造が模式的に表現されている。ＮＦＩＬ Ｔ　ｃＤＮＡの２．　Ｏｋｂクローン部分は少なくとも６個のエクソンを含んで いる。クローンされた転写物の５′エクソンはＮＦ１転座ブレークポイントの間 、ｔ（１７；２２）の１２ｋｂ以内に存在する。サザンプロットのＮＦ　Ｉ　Ｌ ＴプローブＰ５と８３Ａにより検出されたゲノム断片の大きさと数は、２．　Ｏ ｋｂのクローニングされたｃＤＮＡはゲノムＤＮＡの少なくとも３３ｋｂにわた っていることを示した。従って、残りの５′エクソンがすべて転座ブレークポイ ントの間には存在しそうもなかった。

ＣｐＧの島はしばしば遺伝子、特にハウスキーピング遺伝子の５′末端に存在す るという観察に基づけば、次の５’　ｃｐｃの島がＮＦＩのプロモータ一部位で ある可能性があった。この島は図１に示すＮｏｔｌ連結クローン１７Ｌｌ中で以 前にクローニングされており、Ｗａｌｌａｃｅ。

Ｍ、　Ｒ，ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　Ｉ　７　：　１６６５ 　（１９８９）に記載されている。それはｔ（１；１７）ブレークポイントに対 し約１５０ｋｂ動原体側に存在し、種間にわたり強い保存性を示している。具体 例２に詳述するひき続いての研究は、それがＮＦＩ遺伝子のプロモーターを含ん でいることを証明している。ＮＦＩ遺伝子の残りはｃＤＮＡ歩行、ＹＡＣ技術に よってクローニングされ、ゲノムの上流配列を具体例２に記載されているように 調５種の異なるｃＤＮＡライブラリーをｃＤＮＡ歩行に使用した。ライブラリー は胎児の筋肉、胎児の脳、成人の脳（後頭葉極及び髄質）及び内皮細胞を含んで いた。

ヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリー（オリゴ（ｄＴ）及びランダムプライマー）は Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、　ＣＡ　（＃９３６２０６）から 得た。ヒト胎児筋肉ライブラリー（オリゴ（ｄＴ）プライマー）は、Ｆ、　Ｂｏ ｙｃｅの寄贈であり、Ｋｏｅｎｉｇ、　Ｍ、ら、Ｃｅ１ｌ　５０：５０９−５１ ７　（１９８７）に記載されている。成人ヒト後頭葉極ｃＤＮＡライブラリー（ ランダム及びオリゴ（ｄＴ）プライマー）はＣ１ｏｎｔｅｃｈ、　Ｐａ１ｏ　Ａ ｌｔｏ、　ＣＡ（＃ＨＬ　１０９１　ａ　）から得た。成人ヒト髄質（ランダム 及びオリゴ（ｄＴ）プライマー）はＣ１ｏｎｔｅｃｈ　（＃ＨＬ　１０８９　ａ ）から得た。内皮細胞ライブラリー（ランダムプライマー）は　Ｄ。

Ｇｉｎｓｂｕｒｇの寄贈によるものである。Ｇｉｎｓｂｕｒｇ、　Ｄ、ら、５ｃ ｉｅｎｃｅ　２２８　：　１４０１−１４０６　（１９８５）　。末梢神経ｃＤ ＮＡから単離されたクローンＰ５及びＢリンパ球ライブラリーからの８３Ａは、 本明細書で前述し、１ｊｒａｌｌａｃｅ　Ｍ、　Ｒ−ら、５ｃｉｅｎｃｅ　２４ ９　：　１８１−１８６（１９９０）に記載されたように単離した。ＮＦ１転写 物は至る所で発現されるので（Ｂｕｃｈｂｅｒｇ、　Ａ、ら、Ｎａｔｕｒｅ３４ ７　：　２９１−２９４　（１９９０）　；　Ｗａｌｌａｃｅ、　Ｍ、　Ｒ。

ら、５ｃｉｅｎｃｅ　２４９：１８１−１８６　（１９９０））、ｃＤＮＡ歩行 を、陽性を見つける機会を最大にするために、前述の多重ｃＤＮＡライブラリー で進めた。歩行は最大量の５’ｃＤＮＡ挿入を用いて陽性のファージクローンを 単離することにより進めた。

典型的には、各ライブラリーのｓｏｏ、ｏθＯ個のプラークを培地に取り、６　 Ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃ、２Ｘ　Ｄｅｎｈａｒｄｔｓ溶液、１　ｍＭ　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ及 び０．５％ＳＤＳからなる水性ハイブリダイゼーションを６５℃で用いて、Ｂｅ ｎｔｏｎ、　Ｗ、　Ｄ。

ら、５ｃｉｅｎｃｅ　１９６　：　１８０−１８２　（１９７７）に記載したよ うにスクリーニングした。洗浄は２Ｘ、ＩＸ。

必要なら０．２Ｘ　ＳＳＣ，０，１％ＳＤＳで６５℃で行った。陽性クローンは 、ＥｃｏＲｒを用いる制限マツピングと前に単離した挿入を用いるサザンプロッ ト分析によって特徴付けられた。

ファージクローンはＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中にサブク ローニングされ、又は胎児脳ライブラリーの場合はλＺＡＰインストラクション 毎にプラスミドとしてレスキューされた。そして末端をシーケンシングしてクロ ーンの位置を転写物地図につないだ。各歩行についてこのサイクルを繰り返した 。あるライブラリー中の表現不十分の領域は他のライブラリー中に交差すること によって克服した。クローン中で表現された全転写物は何度もシーケンシングさ れ、両ストランドとも、過去に発表されていない配列についてはすべて少なくと も一回はシーケンシングした。

図８はＮＦＩ遺伝子の３′末端からｃＤＮＡ歩行を表す模式図である。読み取り 枠はＡＴＧとＴＧＡコドンによって結合した広い領域によって表され、Ｂａ１ｌ ｅｓｔｅｒ、　Ａ。

ら、Ｃｅ１ｌ　６３：８５１−８５９（１９９０）の相補性研究に使用したＧＡ ＰＭ連ドメイドメインが示されている。クローンを転写物の模式図の下にリスト した。直線は確実な転写物を表し、ぎざぎざの線は共クローニング結果を表す。

εｃｏＲＥ部位は垂直線で表されている。クローンＢ３ＡとＰ５は本明細書中に 、そして、Ｗａｌｌａｃｅ。

Ｍ、　Ｒ，ら、５ｃｉｅｎｃｅ　２４９　＋　１８１−１８６　（１９９０）に すでに記載されている。クローンＡＥ２５、ＫＥ−２及びＧＥ−２は内皮細胞ｃ ＤＮＡライブラリーから単離したＯＧｉｎｓｂｕｒｇ、　Ｄ、ら、５ｃｉｅｎｃ ｅ　２２８　：　１４０１−１４０６　（１９８５）。クローンＨＦ６ＢＳＦＢ ５Ｄ、ＨＦ７ＢＳＥＦ３、ＥＦ８、ＦＦＩ、ＥＦ２、ＦＦ１３及びＨＦ３Ａは胎 児脳ｃＤＮＡライブラリー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、＃９３６２０６）から単離 した。クローンＣＡＴ２は同じライブラリーからの全ファージ溶解物からＰＣＲ により、そのライブラリーから単離した。

Ｂａ１ｌｅｓｔｅｒ、Ｒ，ら、Ｃｅ１ｌ　６３：８５１−８５９　（１９９０） 参照。クローンＡＭ２０はヒト脳（髄質）ｃＤＮＡライブラリー（Ｃ１ｏｎｔｅ ｃｈ、　＃ＨＬ　１０９１　ａ）から単離した。クローンＧＭ９ＡはＫｏｅｎｉ ｇ、　Ｍ、ら、Ｃｅ１ｌ　５０：５０９−５１７　（１９８７）の胎児筋肉ｃＤ ＮＡライブラリーから単離した。

ｃＤＮＡ歩行が終りに近づくと、転写物の極めてＧＣリッチな領域が５′末端で 見つかり、これは異常に高濃度のジヌクレオチドＣｐＧと、いくつかの稀な切断 制限エンドヌクレアーゼ部位を含んでいた。これらの部位のいくつかはＮｏｔ　 １連結クローン１７Ｌｆを用いて、この領域のパルスフィールド地図の上に既に 位置付けされていた。Ｆｏｕｎｔａｉｎ、　Ｊ、　Ｗ、ら、Ａｍｅｒ、　Ｊ、　 Ｈｕｍ、　Ｇｅｎｅｔ、　４４：５８−６７　（１９８９）。このクローンはフ ロー分類した第１７染色体由来のＤＮＡから構簗されたＮｏｔ　１連結ライブラ リーから単離しくＷａｌＩａｃｅ、　Ｍ、　Ｒ，ら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ 、　Ｒｅｓ、１７　：　１６６５−１６７７　（１９８９）　）　、ゲノムＮｏ ｔ　１部位の両サイドを固める配列を含んでいる。プローブのテロメリツク側の 半分はＮＦＩ遺伝子内の転座ブレークポイントを検出するために用いた。Ｆｏｕ ｎｔａｉｎ、Ｊ、　Ｗ、ら、５ｃｉｅｎｃｅ　２４４　：　１０８５−１０８７ 　（１９ｓ９）。１７Ｌ１に対するプローブとしてＣｐＧリッチなｃＤＮＡを用 いたサザンプロットは、得られた最大量の５′配列が実はこのクローン（１７Ｌ ＩＢ）の動原体側の半分、即ち３′停止コドンから約３００ｋｂの所に置かれて いることを証明した。

内皮細胞ｃＤＮＡライブラリーから単離した最も多量の５′クローン、ＫＥ−２ は、ＮＦ１転写物の５′部分のｃＤＮＡ配列を描く図９に示すような枠内停止コ ドンを含んでいた。図９の配列は以前に公表されたことはなく、以前に公表され た配列が始まるところで終っている。

Ｗａｌｌａｃｅ、　Ｍ、　Ｒ，ら、　５ｃｉｅｎｃｅ　２　４　９　：　１　８ 　１　−　１　８　６（１９９０）　；　Ｃａｗｔｈｏｎ、　Ｒ，ら、Ｃｅ１ｌ 　６２　：　Ｉ　９３−２０１　（１９９０）；　Ｘｕ、Ｇ、ら、Ｃｅ目　６３ 　：　８３５−８４１（１９９０）。配列はクローンＫＥ−２、ＧＥ−２，０Ｍ ９Ａ、ＥＦ２、ＦＦ１３及びＨＦ３Ａから編集した。両ストランドとも少な（と も−回はシーケンシングして配列を完了した。ヌクレオチドとそのアミノ酸配列 を左欄に番号付けした。開始コドンはアンダーラインを引き、上流の枠内停止コ ドンは四角で囲んである。

プライマー伸長法（図１０）に用いたオリゴヌクレオチドの位置は矢印で示しで ある。最初のイントロンの位置は三角形で指示されており、代替の配列が分岐す る位置である（図１１）。

停止コドンから下流では、最初のＡＴＧか適当な翻訳の開示の規８７１に適合す る。Ｋｏｚａｋ、　Ｍ、　、Ｃｅ１ｌ　４４　：　２０３−２９２　（１９８６ ）参照。オーバーラツプする配列か３種の異なる組織からｃＤＮＡクローン中に 見出された（胎児筋肉、胎児脳及び内皮細胞）。我々はこの人ＴＧコドンが信す るに足る開始コドンを表し、約３２７キロダルトンの予想分子量をもった総数２ ８１８アミノ酸のタンパクを与えるものであると提案する。

Ｉ■、プライマー伸張法 この転写物の５′末端の実質的部分がクローニングされていないままなのかどう かを決定するために、ヒトの脳（前頭葉）とメラノーマ細胞系ＳＫ−ＭＥＬ−２ ３ポリＡ＋ＲＮＡを用いて、プライマー伸張法を行った。全ＲＮＡは新鮮なヒト の脳（前頭葉）とメラノーマ細胞系ＳＫ−ＭＥＬ−２３から単離した（　Ｃａｒ ｅｙ、　Ｔ、　Ｅ、ら、ＰＮＡＳ　（ＵＳＡ）７３　：　３２７８−３２８２　 （１９７６））、これはＳａｍｂｒｏｏｋ、　Ｊ、ら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ ｌｏｎｉｎｇ　：　ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ第２版、Ｃｏ１ｄ　 Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　：Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａ ｂｏｒａｔｏｒｙ　（１９８９）に記載のようにして行った。ポリアデニル化Ｒ ＮＡはメラノーマ全ＲＮＡからＦａｓｔ　Ｔｒａｃｋ　ｍ　ＲＮ　Ａ単離キット （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ　Ｃａｒｐ、、サンディエゴ、ＧＡ）を用いて単離した 。プライマー伸長については、オリゴマー（５’　ＡＧＡＧＧＣＡＡＧＧＡＧＡ ＧＧＧＴＣＴＧＴＧ）を合成し、３２Ｐで賦活し、脳（全ＲＮＡ）メラノーマ（ ポリＡ＋ＲＮＡ）から伸長した。Ｂｏｏｒｓｔｅｉｎ、　Ｗ、　Ｒ，ら、ＲＮＡ のプライマー伸長分析；　Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　１８０　：　３４７ −３６９、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、サンディエゴ（１９８９）。選択した 逆転写プライマーは図９に示す位置での提案されたエクソンＩ内の、提案された 開始コドンの５′であった。産物を６％変性ポリアクリルアミドゲルで分析した 。図１０はこの分析の結果を示す。

図ＩＯに示したように、３８０〜４１０ｂｐの大きさにわたる一連の４つのバン ドが脳ＲＮＡからの伸長において見られる。３００ｂｐの第二の顕著なバンドも 見られる。

メラノーマＲＮＡからのプライマー伸長は４００と４１Ｏｂｐに上の２つのバン ドを示しているが、ａｏｏｂｐの下のバンドは示していない。このプライマーの ５′部位から１１９ｂｐの所でクローニングとシーケンシングを行ったところ、 多くとも２９１ｂｐがクローニングされずに残っただけであることが示された。

クローニングされた配列内には、提案されたＡＴＧ開始コドンが存在し、上流側 には枠内停止コドンが存在する。これらの結果は転写物の全コード領域がクロー ニングされシーケンシングされていることを示す。

ＩＩｌ、クローンの配列分析 プラスミドクローンの二本鎖シーケンシングをインストラクシーｓン毎に５ｅｑ ｕｅｎａｓｅ　Ｖｅｒｓｉｏｎ　２．０　（Ｕ、　Ｓ。

Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、クリーブランド、ＯＲ＞を用いて行った。

配列分析はＰｕ５ｔｅｌｌ及びＣｙｂｏｒｇ配列分析プログラムを用いて行った 。アミノ酸配列の分析はＧＣＧＣシタク分析パッケージで行った。

Ｎｏｔ　Ｉ連結クローン１７Ｌ１　（１７ＬＩＢ）の動源体側半分のシーケンス は、ヌクレオチド１〜２７０からの５’ｃＤＮＡ配列はゲノムのこの領域中、単 一の連続的エクソン内に存在することを証明した。これはこの転写物のエクソン １がクローニングされており、５′未翻訳の大多数の配列を含んでいることを示 している。もし別のエクソンが上流側に存在するのであれば、それは完全に非コ ードの配列を含むであろう。転写開始部位とプロモーター領域はおそらく半連結 クローン１ＴＬＩＢ中に存在する。

Ａ、５′末端交互配列 最大量の５′クローンを越えて伸長したｃＤＮＡクローンをスクリーニングする 途中で、二種の交互配列が発見され、図１１に示した。配列番号ｌと３は胎児脳 ＣＤＮＡライブラリーから単離したクローンに由来するものであり、各々単一の 単離体により表される（図８には示していない）。配列番号２は３つの異なる組 織由来のＣＤＮＡライブラリーからのクローンと一致し、図９に示す５′末端を 含んでいる。最初のスプライス部位の位置は、エクソン２を右に、３つの異なる エクソン１配列を左に分離する太線で示しである。配列番号■はＰＣＨにより、 スプライスされないメツセージであることが示されており、共通ＡＧとラリアー ト配列には下線を付しである。配列番号２はｍＲＮＡの最も顕著な種を表し、適 当な共通開始コドンを持っている。Ｋｏｚａｋ、　Ｍ、、　Ｃｅ１１４４：２８ ３−２９２　（１９８６）。配列番号３は四角で囲んだ枠内停止コドンを持って いる。

両交互配列とも２７０の位置、つまり最初のイントロン−エクソン境界の位置で 始まり、胎児脳ＣＤＮＡライブラリーからの一本鎖ｃＤＮＡにより表される。配 列ｌは完全なスプライス部位アクセプター共通配列、２０塩基のピリミジンスト レッチ、及びラリアート形成共通配列を含んでいるので、スプライスされないメ ツセージであるｏ　５ｈａｒｐ、　Ｐ、　Ａ、、　５ｃｉｅｎｃｅ　２３５　＋ 　７６６−７７１（１９８７）。これは、スプライス部位にわたって広がるプラ イマーをデザインし、これらのプライマーがゲノムＤＮＡを用いる正確な大きさ の断片を増幅するだろうということを示すことにより確認された。この配列が確 実なｍＲＮＡを表すのであれば、スプライス部位からちょうど２０トリブレツト 上流側にある枠内停止コドンを含んでいる。

第二の異常クローンは正確に同じ位置で分岐しているが、異なる配列、配列３、 を育しており、従って５′末端で代替スプライス産物でなければならない。それ は分岐点かられずか１５トリブレツト上流の所に枠内停止コドンを含み、その新 配列中にはメチオニンコドンはない。

このクローンはまた、一端にＡｌｕ繰返しを含んでいる点で異常であり、部分的 にのみスプライスされるのかもしれない。しかし、それが確実な５′末端配列を 表すのであれば、より小さなタンパク産物をコードしているのであろうし、おそ らくスプライス部位から５８コドン下流にある隣のＡＴＧで翻訳を始めるのであ ろう。

Ｂ、　配列の３′末端 ポリＡテイルはどのｃＤＮＡクローン中にも見つからなかったので、ＮＦ１転写 物の３′末端は完結していない。前に配列分析をしたときは停止コドンの適切な 位置が示された。Ｗａｌｌａｃｅ、　Ｍ−Ｒ，ら、５ｃｉｅｎｃｅ　２４９　： 　１８１−１８６　（１９９０）　；　Ｘｕ、　Ｇ、ら、Ｃｅ１１６２：５９９ −６０８　（１９９０）参照。ここから下流側は配列は極めてＡリッチであり、 ＣＤＮＡライブラリーの構築の間、オリゴｄＴで始まることのできる幾つかの領 域を育している。ＮＦ１転写物はノーザンプロットでの移動により１３ｋｂであ ると見積もられている。Ｗａｌｌａｃｅ、　Ｍ。

Ｒｏら、５ｃｉｅｎｃｅ　２４９：１８１−１８６　（１９９０）。

これまでのところ、我々はこのメツセージの９ｋｂにわたってクローニングとシ ーケンシングを行ってきた。プライマー伸長法の結果（図１０）は、この転写物 からの大多数のクローニングされていない配列は非常に長い（およそ４ｋｂ）３ ’非翻訳領域から生じていることを示している。あるいは、ノーザンプロットの この領域での大きさの評価は難かしいので、我々が見積もった転写物の大きさは 不正確かもしれない。

この−次転写物の他の交互プロセシングされた形態が少なくとも二種発見されて いる。転写物の３′末端付近の付加的な１８個ノアミノ酸（ＡＳＬＰＣ３ＮＳＡ ＶＰＭＯＬＦＰＨＱ）　ｔ−コードする５４ｂｐの挿入はすでに記載されている 。

Ｃａｗｔｈｏｎ、　Ｒ，ら、Ｃｅ１ｌ　６２：１９３−２０１（１９９０）　； 　Ｘｕ、　Ｇ、ら、Ｃｅ１ｌ　６２：５９９−６０８　（１９９０）　；　Ｃａ ｗｔｈｏｎ、　Ｒ，ら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　７　：　５５５−５６５（１９９０ ）。ＧＡＰ関連ドメインの最も保存された領域の一つの内部の付加的な２１個の アミノ酸（ＡＴＣＨＳＬＬＮＫＡＴＶＫＥＫＫＥＮＫＫＳ）をコードｔ６６３ｂ ｐ（７）挿入が発見されている。

Ｃ９完全配列 図１２はｃＤＮＡ歩行からのシーケンシングされたクローンの読み取り枠から引 き出した一次ＮＦ１転写物の完全アミノ酸配列を示す。四角で囲った領域はＧＡ Ｐファミリーのタンパクの間で最もよく保存されている４ブロツクの相同性を示 している。Ｗａｎｇ、　Ｙ、ら、ＣｅｌｌＲｅｇｕｌａｔｉｏｎ　２：４５３− ４６５　（１９９１）、代替スプライシングされたエクソンの位置とそれらの配 列が示されている。ＧＡＰには保存するＳＨ２又はＳＨ３ドメイン（ｓｒｃ相同 ドメイン）は存在しない。タンパクは明確な膜スパニング領域（ｍｅｍｂｒａｎ ｅ　ｓｐａｎｎｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ）を示さず、識別力のある分析により細胞 質ゾルであることが予想されている。Ｋｌｅｉｎ、　Ｐ、ら、Ｂｉｏｃｈｉｍ、 　Ｂｉｏｐｈｙｓ。

ＡＣｔａ　８１５：４６８−４７６　（１９８５）、可能性のあるロイシンジッ パ−が存在しアミノ酸残基１８３４で始まっているが、この領域は繰返しの中央 のプロリンの存在によりαヘリックス配置にあるとは予想されない。

６Ｎの可能性のあるｃＡＭＰ依存性のプロティンキナーゼリン酸化部位及び一つ の可能性のあるチロシンリン酸化部位が存在する。この配列は最近公表されたＢ ｃｒ関連ＧＡＰファミリーに対して有意の相同性を示してはいないが、ｎ−キマ エリン、ＧＡＰｒｈａ　（Ｄｉｅｋｍａｎｎ、　Ｄ、　ら、Ｎａｔｕｒｅ　３５ １　：４００−４０２　（ｆ９９１））そしておそらくウシ脳ホスファチジルイ ノシトール３−キナーゼのｐ８５を含んでいる。０ｔｓｕ、　Ｍ、ら、Ｃｅ１１ ６５：９１−１０４　（１９９１）。

図１２をもう一度参照すれば、図１２中の四角で囲った領域は、星印でマークし た不変残基をもったＧＡＧファミリーのタンパクの中でも最も統計的に有意の領 域に対応する。細線でアンダーラインをした残基は可能性のあるｃＡＭＰ依存性 のプロティンキナーゼ認識部位である。二重線を引いた残基は可能性のあるチロ シンリン酸化認識配列を表す。代替ススブライシングされた産物を表す２１個の アミノ酸の挿入の位置は黒い三角形で示しである。代替スプライシングされた産 物を表す１８個のアミノ酸の挿入（ＡＳＬＰＣＳＮＳＡＶＦＭＱＬＦＰＨＱ）　 （７）位置ハ白抜キノ三角形で示しである。Ｘｕ、　Ｇ、ら、Ｃｅ１ｌ　６２　 ：　５９９−６０８（１９９０）。

我々は前に発表した配列（Ｘｕ、　Ｇ、ら、Ｃｅ１１６２：５９９−６０８　（ １９９０））と矛盾する三つの領域のヌクレオチド配列を見出した。二つはアミ ノ酸配列に変化かあった。我々のクローン中の残基番号４９６はＡＴＡイソロイ シンコドンよりもむしろＡＴＧメチオニンコドンを示す。残基１１８３の別の配 列変化は前に発表したＣＴＣよりもむしろＣＴＧロイシンコドンを示す。我々の クローンはまた、残基番号１５５５の後に余分のＣＡＴヒスチジンコドンを欠い ていた。我々の気付いた後者の二つの変化は、ＣＨＡＰ関連ドメイン領域のＰＣ Ｒクローンの配列からのＭａｒｔｉｎ、　Ｇ、　Ａ、ら、Ｃｅ１１６３：８４３ −８４９　（１９９０）のそれと一致する。

Ｄ、ＹＡＣマツピング ＮＦＩ遺伝子の大きさは、遺伝子を取り囲む６００ｋｂにわたる酵母人工染色体 （ＹＡＣ）コンティグにｃＤＮＡクローンをマツピングすることにより決定した 。５′末端は連結クローン１７ＬＩＢ内のＮｏｔ１部位に対し、動源体側にあり （Ｆｏｕｎｔａｉｎ、　Ｊ、　Ｗ、ら、Ａｍｅｒ、　Ｊ、　Ｈｕｍ。

Ｇｅｎｅｔ、４４　：　５８−６７　（１９８９）　；　Ｆｏｕｎｔａｉｎ、　 Ｊ。

Ｗ、ら、５ｃｉｅｎｃｅ　２４４　：１０８５−１０８７　（１９８９）　；　 Ｗａｌｌａｃｅ、　Ｍ、　Ｒ，ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１ ７　：１６６５−１６６７　（１９８９））、最初のイントロンはＮｏｔ１部位 かられずか８１塩基対の所で始まっている。

それはｔ（１；１７）転座ブレークポイントの位置を通り、ｔ（１７；２２）転 座ブレークポイントを越えて広かっている。Ｆｏｕｎｔａｉｎ、　Ｊ、　Ｗ、ら 、５ｃｉｅｎｃｅ　２４４　：１０８５−１０８７　（１９８９）　；　Ｏ’Ｃ ｏｎｎｅＩＩ、　Ｐ、ら、５ｃｉｅｎｃｅ　２４４　：１０８７−１０８８　（ １９８９）、転写物は末端小粒に向かって最短２７０　ｋｂ、　Ｎｒｕ１部位を 越えて広がっている。この部位はメチル化されていないＹＡＣクローンにのみ見 られ、従ってゲノムＤＮＡ中でメチル化されなければならない。単離された最大 量の３′クローンはＭｌｕ１部位（これもＹＡＣクローンにのみ存在する）を越 えて広がることはなく、３１０ｋｂという最大遺伝子サイズとなっている。それ 故遺伝子は２７０から３１０ｋｂにわたるものである。これは、まだクローニン グされていない３′非翻訳領域の残りが単一のエクソン中に存在するものと仮定 している。遺伝子のイントロン−エクソン境界のすべてかキャラクタライズされ た訳ではないが、ゲノムサザンプロット上のバンドの数により、３０エクソンを 超過するだろうと見積もられる。前に記載された３種の包埋遺伝子（ＥＶ１２Ａ 、ＥＶ１２Ｂ及びＯＭｇｐ）は対向するストランドから転写され、単一イントロ ン内に含まれている。Ｃａｗｔｈｏｎ、　Ｒ−ら、Ｃｅ１１６２　：１９３−２ ０１　（１９９０）　；Ｃａｗｔｈｏｎ、　Ｒ，ら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　７　： 　５５５−５６５　（１９９０）　；０’Ｃｏｎｎｅ１１．　Ｐ、ら、５ｃｉｅ ｎｃｅ　２４４：１０８７−１０８８　（１９９０）　；　Ｍｉｋｏｌ、　Ｄ、 　Ｄ、ら、Ｊ、　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ。

１１０＋４７１−４７９（１９９０）；　Ｘｕ、Ｇ、ら、Ｃｅ１ｌ　６２：５９ ９−６０８　（１９９０）；　Ｘｕ、Ｇ、ら、Ｃｅ１ｌ　８３　：　８３５−８ ４１　（１９９０）　；　Ｖｉｓｋｏｃｈｉｌ。

Ｄ、ら、Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｊｏｌ、　Ｉ　１　（印刷中）（１９９１） 参照。

図１３はＹＡＣコンティグに対するｃＤＮＡクローンをマツピングすることによ り生じたデータを詳述したものである。制限部位のコードは、Ｎｏｔ　１につい てはＮ１Ｎｒｕ　［についてはＵ、　Ｍｒｕ　［についてはＭである。四角で囲 った部位はゲノムＤＮＡ中のメチル化不十分なＣｐＧ島の位置を表す。

Ｅ、ＮＦｌ遺伝子産物の議論：腫瘍抑制モデルＮＦＩ遺伝子の３′末端の初期部 分配列は、遺伝子産物の機能についての手がかりを提供しうる配列相同性につい てほとんど明らかにはしなかった。Ｃａｗｔｈｏｎ、　Ｒ，ら、Ｃｅ１ｌ　６２ 　：　１９３−２０１　（１９９０）　；Ｃａｗｔｈｏｎ、　Ｒ。

ら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　７　：　５５５−５６５　（１９９０）　；Ｗａｌｌａ ｃｅ、　Ｍ、　Ｒ，ら、５ｃｉｅｎｃｅ　２４９　：　１８１−１８６（１９９ ０）。さらにクローニングと配列分析を行ったところ、哺乳類ＧＡＰタンパクな らびに酵母ＩＲＡＩ及びＩＲＡ２遺伝子産物に相同性を表し、これらはｒａｓが ＧＴＰを加水分解して不活性ｒａｓ−Ｇ　Ｄ　Ｐになる速度を加速することによ って、それぞれの宿主中のｐ　２１　ｒａｓタンパクの活性を調節する。Ｂａ１ ｌｅｓｔｅｒ、　Ｒ，ら、Ｃｅ１ｌ　６３　：　８５１−８５９　（１９９０） 　：　Ｂｕｃｈｂｅｒｇ、　Ａ、ら、Ｎａｔｕｒｅ　３４７　：　２９１−２９ ４　（１９９０）　：　Ｘｕ、　Ｇ。

ら、Ｃｅ１ｌ　６２　：　５９９−６０８　（１９９０）　；　Ｘｕ、　Ｇ。

ら、Ｃｅ１ｌ　６３：８３５−８４１　（１９９０）、これによりＮＦＩの機能 が少し見えてきた。ＧＡＰのように、ＮＦＩはｒａｓ（又はｒａｓ関連タンパク ）のための上流側の調節タンパクであり、その正常な機能はマイトジェンシグナ ル形質導入に関与するｒａｓファミリーの一員を下方調節するのであろう。この モデルは、ＮＦＩの提案されたＧＡＰ関連ドメインが酵母中のＩＲＡ機能のロス を補充し、かつインビボ及びインビトロでｒａｓ　−Ｇ　Ｔ　Ｐアーゼ活性を刺 激し得ることが示される場合には、さらに支持されるａ　Ｂａ１ｌｅｓｔｅｒ、 　Ｒ，Ｍ、ら、Ｃｅ１ｌ　６３　：　８５１−８５９　（１９９０）　；　Ｍａ ｒｔｉｎ、　Ｇ、　Ａ、ら、Ｃｅ１１６３：８３５−８４１　（１９９０）　； 　Ｘｕ、　Ｇ、ら、Ｃｅ１ｌ　６３　：　８３５−８４１　（１９９０）。

ｒａｓ、−ＮＦＩ相互作用の交互モデルは、ＮＦＩはそれよりもｒａｓに対して 下流のエフェクターでありうるということを仮定している。下流モデルは関連Ｇ ＡＰについても提案されている。Ａｄａｒｉ、　Ｈ，ら、５ｃｉｅｎｃｅ　２４ ０　：５１８−５２１　（１９８８）　；　Ｃａ１ｅｓ、　Ｃ，ら、Ｎａｔｕｒ ｅ３３２　：　５４８−５５１　（１９８８）　；　Ｈａｌｌ、　Ａ、。

Ｃｅ１ｌ　６１　：　９２１−９２３　（１９９０）　；　Ｙａｔａｎｉ、　Ａ 。

ら、Ｃｅ１ｌ　６１ニア６９−７７６　（１９９０）、このモデルではＮＦＩタ ンパクは、シグナル形質導入カスケードの下流のメンバーとして、活性型ｒａｓ のターゲットなのであろう。このモデルは次の観察に基づいて支持される。ＧＡ ＰとＮＦＩは両方とも、エフェクタードメインによりｒａｓ　ｐ　２１と相互作 用すると考えられる。推定ｒａｓエフェクタードメインの突然変異はｒａｓの形 質転換能を不活化し、ＮＦＩのＧＡＰ関連ドメインのＧＴＰアーゼ活性化を妨げ る（Ｍａｒｔｊｎ、　Ｇ、　Ａ、ら、Ｃｅ１１６３　：　８４３−８４９　（１ ９９０）；Ｘｕ、Ｇ、ら、Ｃｅ１ｌ、８３５−８４１（１９９０））。しかしな から、これらの研究は全長タンパクでの再現性を要する。また、ｒａｓの温度感 受性エエクタードメイン突然変異体を用いた最近の研究はＧＡＰによるＧＴＰア ーゼ活性の刺激とＮＦＩＧＡＰドメインとそれらのｒａｓエフェクターとしての 役割の間の分離を示していることにも注意すべきである。Ｄｅ　Ｃ１ｕｅ、Ｊ、 Ｅ、ら、Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　１１　：　３１３２−３１２８（ １９９１）。この結果はＮＦＩまたはＧＡＰと区別されるｒａｓエフェクター分 子と一致している。

それにもかかわらず、下流エフェクターモデルは神経外胚葉起源のある細胞のｒ ａｓの役割を説明することかできる点で魅力的なものである。ネズミの好クロー ム性細胞腫細胞系ＰＣ１２においては、活性化されたｒａｓが分化を誘導し、増 殖を遮断する。Ｂａｒ−３ａｇｉ、　Ｄ、ら、Ｃｅ１１４２　：　８４１−８４ ８　（１９８５）　；　Ｎｏｄａ、　Ｍ、ら、Ｎａｔｕｒｅ３１８ニア３−７５ 　（１９８５）。これらの細胞内のｒａｓの阻害は、神経成長因子により正常に 誘導される神経の分化遮断する。Ｈａｇａｇ、　Ｎ、ら、Ｎａｔｕｒｅ３１９　 ：　６８０−６８２　（１９８６）　：５ｚｅｂｅｒｅｎｙｉ、Ｊ、ら、Ｍｏｌ 。

Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、１０　：　５３２４−５３３２　（１９９０）。

活性化されたｒａｓはまたネズミのシュワン細胞に導入されると細胞周期の停止 を誘導することも示されている。

Ｒｉｄｌｅｙ、Ａ、Ｊ、　ら、　ＥＭＢＯＪ、　７　二　１６３５−１６４５（ １９８８）。これは、シュワン細胞か神経線維層と神経線維肉腫の形成へと他の 細胞種をかりたてる最初の細胞であるかもしれないので、重要なことである。

Ｒａｔｎｅｒ、Ｎ、　ら、　Ａｎｎ、Ｎｅｕｒｏｌ、２７：４９６−５０１　（ １９９０）　：　５ｈｅｅｌａ、　Ｓ、ら、Ｊ、　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、１１ １　：　６４５−６５３　（１９９０）、それ故、ＮＦＩはｒａｓのターゲット （エフェクター）であるなら、シュワン細胞におけるＮＦ１ｍ能のロスは正常な 分化を遮断し、その結果制御できない増殖か起こるのである。

これら二つのモデル、即ち上流開園タンパク又は下流エフェクターモデルのいず れかは、ＮＦＩが腫瘍抑制遺伝子であることと一致しており、表現型は遺伝子の 両肘立形質のロスの結果であることと一致する。Ｋｎｕｄｓｏｎ。

Ａ、Ｇ、、　ＣａｎｃｅｒＲｅｓ、４５：ｌ４３７−１４４３　（１９８５）。

ＮＦ腫瘍の以前の研究は１７（１１１，２におけるＮＦｌの異形接合性の矛盾の ないロスを常に示してはいなかった。５ｋｕｓｅ、　Ｇ、　Ｒ，ら、Ｇｅｎｅｓ 　Ｃｈｒｏｍ、　Ｃａｎｃｅｒ　１　：　３６−４１　（１９８９）　；Ｍｅｎ ｏｎ、　Ａ、　Ｇ、ら、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）８７　：　５４３５−５４３９　（ １９９０）；Ｇｌｏｖｅｒ、　Ｔ、　Ｗ、ら、Ｇｅｎｅｓ、　Ｃｈｒｏｍ、　Ｃ ａｎｃｅｒ３　：　６２−７０（１９９１）。しかし、これら解釈は１７ｐの頻 繁なロスにより難かしいものとなったが、これは明らかに９５３遺伝子のロスが この異常において腫瘍の進展で演する主要な役割を反映している。Ｎｉｇｒｏ、 　Ｊ、　Ｍ、ら、Ｎａｔｕｒｅ３４２ニア０５−７０８　（１９８９）、より最 近の分析によれば、１７ｑだけが関与する異形接合性のロスは少なくとも幾つか の腫瘍については証明できることが示されたｏ　５ｋｕｓｅ、　Ｇ、　Ｒ，、５ ｃｉｅｎｃｅ　２５０　：　１７４９（１９９０）　；　Ｌａｇｉｕｓ及びＧｌ ｏｖｅｒ、個人的情報；　Ｐｏｎｄｅｒ。

個人的情報。異形接合性のロスを示さない腫瘍においては、第二の対立遺伝子の 突然変異は独立して得られた突然変異であり得るとするのがもっともらしい。

ＮＦＩ遺伝子が腫瘍抑制遺伝子である証拠は、Ａｎｄｅｒｓｅｎ、Ｌ、Ｂ、ら、 Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ、Ｃｅ１ｌ　Ｇｅｎｅｔ、　５３　：　２０６−２１０　（ １９９０）に記載されたＮＦＩにときどき見られる珍しい染色体異常により強固 なものとなる。

この患者は１７ｑの中央に近い領域の切除によりミニ染色体の形成を示すが、こ れは培養で成長した体細胞の約６％が失われている。一つの対立遺伝子が失われ るとともに、体細胞のこの分画は効率的にＮＦＩ遺伝子の半接合となる。ひき続 いて起こる体細胞の突然変異は、第二の突然変異と神経線維腫の発達を説明する ことができる。

第二の偶然の突然変異はＮＦＩ遺伝子内ではないということもあり得る。良性の 神経線維腫の発達の途中で関与する幾つかの他の遺伝子内での突然変異は、未だ 明確にされていない別の遺伝子座にあるのであろう。これは、神経線維腫の形成 をひき起こすのに１への遺伝子用量で十分であることを要求する。このシナリオ では悪性神経線維肉腫は両方のＮＦＩ対立遺伝子が突然変異を受けることを必要 とする。

ＮＦＩタンパク産物の完全シーケンシングはＧＡＰとは対照的にＳＨ２とＳＨ３ ドメインの欠如を説明している。腫瘍遺伝子ＳｒＣの非触媒領域に相同であるた め、これらのドメインはシグナル形質導入に関与するホスホチロシンタンパクと の相互作用を支配すると考えられる。

Ｋｏｃｈ、　Ｃ，Ａ、ら、５ｃｉｅｎｃｅ　２５２　：　６６８−６７４　（１ ９９１）。ＮＦｌ中にこれらが存在しないことは、ＮＦｌとＧＡＰが細胞内で相 互変換ができず、おそら＜ＮＦｌは活性化成長因子レセプターによるチロシンリ ン酸化により直接調節されているのではない、ということを意味する。チロシン 及びセリン／トレオニンジン酸化の可能性のある部位は、ＮＦＩタンパクがセリ ンとトレオニン上でリン酸化される証拠があるので、中間体で活性化されたレセ プターとＮＦＩがＮＦＬ活性の調節に関与するということを意味する（　Ｄｏｗ ｎｗａｒｄ、個人的情報）。

この中間体の候補として可能性のあるものは、神経成長因子によるチロシンリン 酸化により活性化され、それ自身セリン／トレオニンプロティンキナーゼである ＥＲＫファミリーのメンバーの一つであってもよい。

Ｂｏｕｌｔｏｎ、Ｔ、　Ｇ、ら、Ｃｅ１１６５：６６３−８７５　（１９９１） 。確かに、ＧＡＰを与える小さな部分に対して産物が大きなサイズであるという ことは、他のドメインがこのタンパクのｒａｓ　−ＧＴＰアーゼ活性の調節に関 与しているか、又は全く異なる機能を発揮していることを示している。酵母ＩＲ ＡＩ及びＩＲＡ２との配列相同性はＧＡＰ触媒ドメインを越えて両末端に向けて 広がっているという事実は、ＧＡＰファミリーのこれらのメンバーとより強い機 能的相同性があることを示す。統計的解析もＮＦＩがＩＲＡＩよりもＩＲＡ２に より近密に関連していることを示している。ＮＦＩ産物を３つのドメイン、即ち 、未知の機能をもったアミノ末端、ＧＡＰ関連中間ドメイン、及びＩＲＡＩ及び ＩＲＡ２遺伝子産物に関連したカルボキシ末端、からなるものとして考えるのも 有用であろう。残念なことにＩＲＡ遺伝子産物のこれらのドメインの機能はこの 単純な真核細胞においてすられかってはいない。ＮＦＩについては、分化へと導 く経路における他の因子、例えば低親和性神経成長因子レセプター及びｔｒｋ腫 瘍遺伝子産物、又はこれらとＮＦＩとの間を仲介する因子、との相互作用は、こ れらのまだ明らかにされていない領域に位置決定がされるかもしれない。

これらの他のドメインでの相互作用も、至る所で発現する遺伝子中の突然変異が 胚神経冠由来の細胞中で広くその特性を表す理由に関して、究極的に手がかりを 提供するであろう。

代替スプライシングされた転写物がＮＦＬ機能においてそのユニークな役割をど のように演じるかは現在のところ不明ではあるが、幾つかの組織では、その発現 は相互に排他的なものではない。これらの代替形態は疾病の広範な臨床的顕在化 においである役割を演じるのかもしれない。代替スプライシングされたエクソン の幾つかの生殖系列突然変異は、より異常なＮＦＩ表現型の幾つかを起こすかも しれない。

大きなＮＦ１転写物と３００ｋｂの遺伝子サイズは突然変異の大きなターゲット を表している。ＮＦＩの表現型か機能突然変異のロスの結果であると仮定すれば 、原因となる突然変異はコードと調節領域全体に分散していることもありうる。

これまで調査した患者では、これは事実のようである。Ｃａｗｆｈｏｎ、　Ｒ， ら、Ｃｅ１１６２　：　ｌ　９３−２０１　（１９９０）　；　Ｖｉｓｋｏｃｈ Ｎら、個人的情報。遺伝子単独の大きさは、しかしながら、高い突然変異率を十 分に説明することはできない。せいぜいターゲットサイズとして可能性のあるも のは、他の遺伝子よりわずかに１０のファクターだけ大きいにすぎないのに対し 、突然変異率は単一の遺伝子座で通常見られるよりも約１００倍も高く、大部分 の新しい突然変異が父方の起源なのである。Ｊａｄａｙｅｌ、　Ｄ、ら、Ｎａｔ ｕｒｅ３４３　：　５５８−５５９（１９９０）。父方の生殖系列ＤＮＡがゲノ ム捺印Ｃｇｅｎｏｍｉｃ　ｉｍｐｒｉｎｔｉｎｇ）に関連したメチル化パターン のために、より突然変異を受け易いのかどうかは今後決定すべきものである。

ベプ−ｙ−ＦＤ　（ＣＱＶＱＫＱＲＳＡＧＳＦＫＲＮＳＩＫＫ［Ｖ；残基２７９ ８−２８１８）及びＨ（ＣＮＰＲＫＱＧＰＥＴＱＧＳＴＡＥＬ　［Ｇ　；残基５ ｏ９−５２８）を合成し、カップリング比１３：１でかさ貝ヘモシアニン（ｋｅ ｙｈｏｌｅ　Ｉｊｍｐｅｔ　ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）に共役させた。

合成した各ペプチドをアミノ酸組成の分析により立証した。融合タンパクは、読 み取り枠が維持されるように適当なｃＤＮＡ断片をｐＭＡＬＣベクターＣＮｅｗ 　ＥｎｇｌａｎｄＢｉｏＬａｂｓ）にサブクローニングして産生させた。ｐＭＡ Ｌ。

Ｂ３Ａは７３個のアミノ酸読み取り枠と天然の終止コドンを含むＮＦｌｃＤＮＡ の２１９ｎｔ　ＰｓｔＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片（残基２７４６−２８１９）であ る（Ｍａｒｃｈｕｋ。

Ｄ、Ａ、ら、提出原稿）。ｐＭＡＬ、ＨＦ３Ａ、ＰはＨｐａｌ−Ｐｓｔｌ断片（ 残基６５−３７１）てあり、ｐ　ＭＡＬ、ＨＦ３Ａ、ＸはＮＦ　１　ｃＤＮＡの ３５２３ｎｔＨｐａｌ−Ｘｈｏｔ断片（残基６５−１２４０）である。融合タン パク構成は宿主ＢＬ２１　（ＤＩＥ３）細胞に形質転換する前に制限酵素分析に より立証した。これらの細胞はＬｕｒｉａブロスてＯＤ、。。０．６になるまで 増殖させ、０゜４ｍＭイソプロピル−６−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）中 で３時間誘導した。細胞をＬａｅｍｍｌｉ緩衝液中で１０分間煮沸することによ り溶解してＳＤＳポリアクリルアミドゲルで分析した。５ｔｕｄｉｅｒ、　Ｆ、 　Ｗ、ら、Ｍｅｔｈ。

Ｅｎｚｙｍｏｌ、１８５　：　６０−６９　（１９９０）。

ミドゲル薄片に埋め込んだ、５００マイクログラムの精製ペプチド又は２５０マ イクログラムの融合タンパクのいずれかを雌のウサギ（４ｋｇ）に最初に注射し 、４週から６週ごとに不完全フロイント補助液中の同量の抗原を追加した。前免 疫及び免疫血清を耳細靜脈穿刺により集め、凝血させ、２５００ｒｐｍで１５分 間遠心分離した。

チメリゾールを最終濃度０．０１９ｄで保存剤として添加し、抗血清を一２０℃ で貯蔵した。

Ｃ１放射標識と細胞溶解 ２ＸＩＯＪｌｌの細胞を成長培地で一晩インキユベートし、次いで１ミリリツト ルあたり０．２５ミリキユリーの標識グレードの２５Ｓ−メチオニン（Ａｍｅｒ ｓｈａｍ）を含む２ｍｌのメチオニンフリーの培地で一晩細胞をインキュベート することにより３ｓＳ−メチオニンで標識した。細胞をリン酸緩衝食塩水（ｐＨ ８）で一度洗浄し、変性ＲＩＰＡ緩衝液（１５０ｍＭ　ＮａＣ１，５０ｍＭ　Ｔ ｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ７，５，１％Ｎｏｎ１ｄｅｔ　Ｐ−４０，０，２５％デオ キシコール酸ナトリウム、２ｍＭ　ＥＧＴＡ、１ｍＭフェニルメタンスルホニル フロリド、１ｍＭロイペプチン及び０．１ｍＭアブロニチン）中に４°Ｃで２０ 〜３０分間溶解した。次に溶解物を１４゜０００　ｒｐｍで１０−１５分間遠心 分離により清澄にした。

Ｈａｒｌｏｗ、　Ｅ、ら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ 　Ｍａｎｕａｌ。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　ニューヨーク、４２１−４７０頁（ １９８８）。

全細胞溶解物を同様にして調製した。細胞を変性ＲＩＰＡ緩衝液中で、ＩＯ’Ｊ Ｉ胞／の１溶解緩衝液の密度にまで、４℃で２０分間溶解し、次いで清澄にした 。マウス！Ｉｉ織ホモジェネートを摘出したばかりの器官から、Ｄｏｕｎｃｅ組 織グラインダーを用いる大量ホモジェネーションにより調製し、４°Ｃｌ２Ｏ分 間の変性ＲＩＰＡ緩衝液での溶解に先立ち２０ゲージの針で貫通を繰り返した。

次に溶解物を１４．０００ｒｐｍで１０−１５分間遠心分離により清澄にした。

タンパクの量はＢｉｏｒａｄ　ＰｒｏｔｅｉｎＡｓｓａｙにより、製造者の特定 したプロトコルに従って決酵素連結免疫吸着剤検定法（ＥＬｒＳＡ）を西洋ワサ ビパーオキシダーゼ共役ヤギ抗ウサギ抗体（ＢｅｔｈｅｓｄａＲｅｓｅａｒｃｈ 　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ベセスダ、ＭＤ）を製造者の明細に従って行った 。ウサギ血清はすべて、免疫性抗原、ＫＬＨ及び無関係な抗原に対してＥＬＩＳ Ａでテストした。ＥＬＩＳＡプレートは、抗原、ＫＬＨ及びＩｇＧ陽性対照で一 晩コートし、その後ＰＢＳ中２％ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）でブロック した。抗血清を１＝５０からｌ：８０．ｏｏｏの希釈範囲にわたり９０分間添加 した。

ヤギ抗ウサギ西洋ワサビパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）共役体（１ｇ０重及び軽； 　Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）をＰＢＳで 洗浄後１時間添加した。ＥＬＩＳＡはクエン酸緩衝液（０，０５Ｍクエン酸、Ｏ ，１ＭＮａＨｉＰＯａ　、　ｐＨ５，０）と０．０３％過酸化水素中、０−フ二 二しンージアミン（Ｚｙｍｅｄ）で発色させた。結果はＤｙｎａｔｅｃｈ　ＭＲ ６５０９６ウエルプレートリーダーで４９０ｎｍの光学密度で分析した。

細胞を先のセクションで記載したように溶解し、マイクロヒュージで１４，００ ０ｇで１５分間遠心分離で清澄にし、次にウサギ抗血清とともにセ氏４度で２時 間インキュベートした。セファロ−スタンバクＡビーズ（ファルマシアＣＬ４Ｂ ）を添加し、規則的に攪拌しながら、さらに２時間インキュベートした。免疫沈 殿は緩衝液ｌ（１０ｍＭ　ＮａＰＯ４，ｐＦＩ７．６　；　１００ｍＭ　ＮａＣ １；　１ｍＭＥＤＴＡ、Ｉ　９６ＴｒｉｔｏｎＸ　−１００；　０．５％デオキ シコール酸ナトリウム：０．１％５ＤＳ）で１回、緩衝液２Ｃ２０ｍＭＴｒｉｓ −）ｆｃＩ　、ｐＨ８，３；　２５０ｍＭ　ＮａＣｌ　：　１％Ｎｏｎｊｄｅｔ 　Ｐ−４０，０，１％５ＤＳ）で２回、そしてもう２回緩衝液１で洗浄した後に Ｌａｅｍｍｌｊ緩衝液を添加した。次いで試料を５分間煮沸し、分析のためにＳ ＤＳポリアクリルアミドゲルの上にのせた。Ｈａｒｌｏｗ、　Ｅ、ら、Ａｎｔｉ ｂｏｄｉｅｓ：　ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒ ｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク、４２１−４７０頁（１９８８）。

Ｅ、５ＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンプロット分析試料を標準５ＤＳ−ポリアク リルアミドゲル電気泳動（Ｌｏｅｍｍｉ　１．肌に、、　Ｎａｔｕｒｅ　２２７ 　：　６８０−６８５　（１９７０））により分離し、変性Ｔｏｗｂｉｎ　）ラ ンスファー緩衝液（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、　３８０ｍＭグリシン；１８ ）中、１０％メタノールで２５０−７５０ミリアンペアで一晩トランスファーし た。ニトロセルロース（Ｇｅｌｍａｎ、　Ａｎ口Ａｒｂｏｒ　、　Ｍ　１　）又 はポリビニレンフルオリド（ＰＶＤＦ）インモビロン（ミリボア）膜を用いて製 造者の明細に従ってウェスタントランスファーを行った。フィルタ−はＰＢＳで 洗浄し、Ｐｏｎｃｅａｕ−３で染色した。

ウェスタンプロット分析を、製造者の推薦に従い、アルカリホスファターゼ（Ａ Ｐ）か西洋ワサビノく一オキシダーゼ（ＨＲＰ）のいずれかで共役した二次抗体 を用％ｚで行った。フィルターを５％オボアルブミンーＴＢＳＴで一晩ブロック し、その後にウェスタンプロット分析を行った。全抗体をＴ　Ｂ　Ｓ　Ｔ　（２ ０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、　ｐＨ７，５，１５０ｍＭ　ＮａＣ１，０，０５％ ツイーン）中２％オボアルブミン（シグマ、セントルイス、ＭＯ，グレードＩＶ ）で希釈した。膜を室温で１〜２時間、抗ペプチド血清でインキュベートし、Ｔ ＢＳＴで４回洗浄し、室温で１時間、適当な二次ＡＰ又はＨＲＰ共役抗体でイン キュベートし、次いでＴＢＳＴで４回洗浄した。発色は５−ブロモ−４−クロロ −３−インドリルを、ニトロブルーテトラゾリウム（ＡＰ法：シグマ）又は４− クロロ−１−ナフトール（シグマ）と０．０３％過酸化水素（ＨＲＰ法）ととも に用いて行った。

Ｆ、　抗体の精製 我々の研究室では３種の技術を使って全血清からマウス又はウサギ抗体を精製し てきたが、これらの技術は上述の抗血清を精製するためにも適用できる。最初の 方法はタンパクＡ−セファロースカラムの使用を含む。このカラムは支配的にＩ ｇＧクラスの免疫グロブリンを結合し、次いで０．１ＭグリシンＰＨ２−３を用 いてカラムから溶出させることができる。タンパクＡカラム精製の後、抗体はＩ ｇＧクラスが支配的であり、アフィニティー精製により、さらに精製することが できる。第二の技術はペプチド−セファロースカラムを使用することによる抗体 のアフィニティー精製を含む。ウサギ又はマウスで免疫原としてもともと使用さ れるペプチドは活性化セファロースビーズにカップリングし、広範囲にわたって 洗浄した。ウサギ又はマウスからの血清をこれらのカラムに適用し、前述のよう に溶出させた。得られた溶出液は免疫原として使用したペプチドに反応する抗体 のみを含むはずである。あるいはまた、融合タンパクを免疫原として使用する場 合は、免疫性融合タンパクは５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により全 Ｅ、　ｃｏｌｉ細胞タンパクから分離し、その後にニトロセルロース膜にトラン スファーした。融合タンパクはＰｏｎｃｅａｕ　−３染色によりニトロセルロー ス膜上で目に見えるようにし、次いで免疫吸着のために切り出す。融合タンパク に対して向けられた抗体はこれらニトロセルロース片に吸着させた後、グリシン 緩衝液中に溶出させた。得られた溶出液は融合タンパク免疫原を認識する抗体の みを含んでいる。

ｐＭＡＬ、ｃ発現ベクターを用いて生じさせた融合タンパクは５ＤＳ−ＰＡＧＥ により分析し、望ましい融合タンパクが発現されたかどうかを決定した。細胞抽 出液は、材料と方法の部で記載したように調製し、７．５％５ＤＳ−ＰＡＣ；Ｅ て分離した。融合タンパクはＣｏｏｍａｓｓｉｅＢｌｕｅ染色て検出した。ｐＭ ＡＬ、ＨＦ３Ａ、ＸＳｐＭＡＬ、ＨＦ３Ａ、Ｐ及びｐＭＡＬ、Ｂ３Ａの過剰発現 が図１５に示されている。（Ａ）マルトース結合タンパクを発現する２５マイク ロリツトルのｐ〜ｆＡＬベクターのみ、（Ｂ）２５マイクロリツトルのｐＭＡＬ 、Ｂ３Ａ、（Ｃ）５０マイクロリツトルのｐＭＡＬ、ＨＦ３Ａ、Ｐ及び（Ｄ）５ ０マイクロリツトルのｐＭＡＬ、ＨＦ３Ａ、Ｘ融合タンパクか０．２５〜２．０ 　ｍｇ／　ｍｌにわたる収率て過剰発現されている。分子量サイズの標準は第ル −ンで走らせた。

融合タンパクは矢印で示しである。細菌細胞溶解液の１マイクロリツトルあたり の融合タンパクの収率は融合タンパクの大きさにより変化した。ｐＭＡＬ、ｃベ クター単独とｐＭＡＬ、Ｂ３Ａが典型的に１−２　ｍｇ／ｍｌの融合を与えたか 、ｐＭＡＬ、ＨＦ５Ａシリーズは０．２５−０゜５ｍｇ／ｍｌの融合タンパクを 与えた。

Ｂ、　抗血清は２５０　ｋＤａタンパクを認識するペプチドＤとＨならびにｐＭ ＡＬ、Ｂ３Ａ融合タンパクに対するウサギで生じた抗血清は、２５０　ｋＤａ種 として移動するユニークなタンパクを同定した。図１６　（Ａ）で示した結果を 得た免疫沈殿は次のようにして行った。

ＨｅＬａ細胞を３５８−メチオニンで一晩放射標識し、溶解物をＨ及びＤペプチ ド抗血清で免疫沈殿させた。５００マイクロリツトルの溶解物を８マイクロリツ トルの血清でインキュベートし、その後に３５〜４０マイクロリフドルの５０％ タンパク−ＡセファロースＣＬ−４Ｂビーズを添加した。沈殿物を７．５％５Ｄ Ｓ−ＰＡＧＥにより分離し、２５％イソプロパツールｌＯ％酢酸で固定し、乾燥 して一７０℃で３日間コダックフイルムで露光した。

図１６（Ａ）のレーレンは以下のものを含んでいた。レーン１、前免疫Ｄペプチ ド血清；レーン２、免疫Ｄペプチド血清；レーン３、前免疫Ｈペプチド血清；レ ーン４、免疫Ｈペプチド血清。分子サイズ標準は左マージンに示しである。

図１６　（Ｂ）に示すウェスタンプロットは次のようにして調製した。ＨｅＬａ 細胞を溶解し、７．５％５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ＰＶＤＦ膜にトランス ファーした後、１　：　１０００の希釈でｐＭＡＬ、Ｂ３Ａ融合タンパクとＨペ プチドを用いてウェスタンプロット分析を行った。

アルカリホスファターゼ共役ヤギ抗ウサギ抗体（Ｃａｐｐｅｉｌ）を１：３００ ０の希釈で用いた。図１６ＣＢ）のレーンは以下のものを含んでいた。レーン１ 、前免疫Ｈペプチド血清：レーン２、免疫Ｈペプチド血清；レーン３、前免疫ｐ ＭＡＬ、Ｂ３Ａ融合タンパク血清；レーン４、免疫ｐＭＡＬ、Ｂ３Ａ融合タンパ ク血清。矢印は２５０ｋＤａＮＦＩＧＲＰを指す。分子サイズ標準は左マージン に示しである。

図１６に示すように、免疫Ｈペプチド抗血清は、［３−メチオニン放射標識組織 培養細胞（図１６Ａル−ン４）の免疫沈殿、ならびに、インモビロン又はニトロ セルロースフィルター上にトランスファーした全細胞溶解物に対するウェスタン イムノプロット（［ｇ１６Ｂ、レーン２）。２５０　ｋＤａタンパクを検出する 。−貫しては見られない他のタンパクのバンドもあるよってある。この゛時点で は我々はこれらの他のタンパクがタンパクの分解産物、タンパクの代替形態又は 共移動種を表す可能性を排除することはできない。Ｈ及びＤタンパク抗血清をそ れぞれのペプチドとインキュベートすると免疫沈殿と２５０ｋＤａタンパクのウ ェスタンプロット検出がなくなるが、他のタンパクのバンドは残っているという 事実は、これらの付加的なタンパクはＮＦＩ遺伝子産物には関連していないとい う結論を支持するものである。

Ｄペプチドに対して生じた抗血清も同様に免疫沈殿と放射標識細胞により２５０ 　ｋＤａに移動するユニークなタンパクを検出する（図１６Ａ、レーン２）。し かし、この抗血清を用いたウェスタンイムノプロットは再現性をもってユニーク なタンパクを同定するものではない。

ｐＭＡＬ、Ｂ３Ａ融合タンパクに対して生じた抗血清はウェスタンプロットによ り２５０　ｋＤａに移動するユニークなタンパクを検出する（図１６Ｂ、レーン ４）。この２５０　ｋＤａタンパクは、脳、シュワン細胞、線維芽細胞、リンパ 球、肝細胞、浄血白血病細胞系及びメラノーマ細胞系を含む、検査したすべての 組織で同定された。それはまた、ヒト、マウス及びラットの細胞でも同定された 。

今日までに試験された細胞系のうち、このタンパクを発現しないものはなかった 。また、検査した様々な細胞系の間に主要な定量的な変化は見られない。

Ｃ１抗血清は独立に発生した融合タンパクを認識する現実に同定されたタンパク かＮＦＩ遺伝子産物を表すことを証明するために、ペプチドを合成するために使 用したアミノ酸配列を含む融合タンパクに対する上記の抗血清を試験した。３種 の融合タンパクが、ＮＦｌｃＤＮへの一部分を融合タンパクベクター、ｐＭＡＬ 、Ｃ中に連結することにより発生した。図１４の融合タンパクと合成ペプチド地 図に示すように、これらの融合のうち二つ（ｐＭＡＬ、ＨＦ３Ａ）は差別的なセ ットを表し、その一つはＨペプチドエピトープ（ｐＭＡＬ、ＨＦ３Ａ。

Ｘ）を含み、他方は含んでいない（ｐＭＡＬ、ＨＦ３Ａ。

Ｐ）。触媒ドメインは残基１１２５と１５３７の間の４１２個のアミノ酸として 定義されている。他の融合タンパク、ｐＭＡＬ、Ｂ３Ａ、はＤペプチドエピトー プを含んでいる。

図１４に見ることができるように、Ｄペプチド血清はｐＭＡＬ、Ｂ３Ａ融合タン パクを認識する。ｐＭＡＬ。

Ｂ３Ａプラスミドを含むＢＬ２１　（ＤＥ３）細胞はＩＰＴＧ中で３時間誘導さ れ、溶解物を調製した。５０マイクロリツトルの全細胞溶解物を各レーンに加え 、７．５％Ｓ　Ｄ　Ｓ　−Ｐ　Ａ　Ｇ　Ｅ　＋：より分離し、ソノ後でＰＶＤＦ 膜にトランスファーした。ウェスタンプロット分析はＤ抗血清の１　：　５００ ０希釈を用いて行い、アルカリホスファターゼ法を用いて発色させた。免疫Ｄペ プチド血清（レーン２）はｐＭＡＬ、Ｂ３Ａ融合タンパクを認識するが、府免疫 のもの（レーン１）は認識しない。融合タンパクの移動は右パネルにＰｏｎｃｅ ａｕ−３染色により検出して示した（矢印）。

同様に、Ｈペプチド抗血清は、ｐＭＡＬ、ＨＦ３Ａ。

Ｘ融合タンパクを認識するが、ウェスタンプロットによりＨベブチドエピトーブ を欠＜ｐＭＡＬ、ＨＦ３Ａ、Ｐ　゛融合タンパクは認識しない（データは示して いない）。

Ｄ、　抗血清は同じ２５０　ｋＤａタンパクを認識するＤペプチド、Ｈペプチド 及びｐＭＡＬ、Ｂ３Ａ融合タンパク抗血清により認識されるタンパクが同じタン パクを表すことを確認するために、マウス脳溶解物をＨペプチド抗血清を用いて 免疫沈殿させ、ｐＭＡＬ、Ｂ３Ａ融合タンパク抗血清を用いるウェスタンプロッ ト分析のためにインモビロンにトランスファーした。ｌ１ｌ１８に見られるよう に、免疫ｐＭＡＬ、Ｂ３Ａ融合タンパク抗血清はＨペプチド抗血清により沈殿し た同じタンパク種を認識し、ＨペプチドとｐＭＡＬ、Ｂ３Ａ融合タンパク抗血清 はＤペプチド抗血清で沈殿した同じタンパクを認識する。マウス脳溶解物を免疫 Ｄペプチド血清で沈殿させ（抗血清の１＝６０希釈）、７．５％５ＤＳ−ＰＡＧ Ｅで分離し、ＰＶＤＦ膜にトランス’７　ｙ−後、Ｐｏｎｃｅａｕ−Ｓ染色で可 視化した。この免疫Ｈペプチド（レーン１）とｐＭＡＬ、Ｂ３Ａ融合タンパク（ レーン２）血清（１：１ｏｏｏ希釈）は、アルカリホスファターゼ検出法を用い たウェスタンプロット分析により沈殿物中に見られる２　５０　ｋＤａタンパク を検出した。前免疫血清は２５０ｋＤａタンパクを認識しなかった（レーン３） 。Ｈペプチド抗血清をｌＯマイクログラムの精製Ｈペプチドで、４°Ｃで２時間 ブレインキュベートしたところ、免疫沈殿したタンパクの認識が阻害された（レ ーン４）。分子サイズ標準は左マージンに示されている。

ε、　成体マウス組織で発現されたＮＦ１タンパク成体マウス組織でのＮＦＩタ ンパクの発現を、安楽死させたばかりの成体雌のマウスからの組織をホモジエナ イズすることにより調べた。全組織抽出物の等価量（１００マイクログラム）を ７．５％５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動により分離し、ＰＶＤＦ 膜にトランスファーＬ／、Ｐｏｎｃｅａｕ−３で染色してウェスタンプロットに 先立ち、総プロティンを等価量取っていることを立証した。ｐＭＡＬ、Ｂ３Ａ融 合タンパク抗血清（１：　１００希釈）を用いて、２５０ｋＤＡ　ＮＦ　Ｉタン パクを、図１９の矢印で示したように、脳、肺、牌、腎、筋肉及び結腸で検出し た。分子サイズは左マージンに示しである。

同様の結果がＨペプチド抗血清を用いて得られた。ウェスタンプロットにより調 べた様々な組織の間の差は明らかであるか、定量的比較を排除する実験で検出さ れた量的変化はマイマーなものである。

フすンレックリングハウゼン神経線維腫症（ＮＦＩ）は神経冠由来組織を含む疾 病であるが、ＮＦ　１ｍＲＮＡはあまねく発現されるらしい。Ｗａｌｌａｃｅ、 　Ｍ、　Ｒ，ら、５ｃｉｅｎｃｅ　２４９　：　ｌ　８１−１８６　（１９９０ ）　、組織特異性のレベルは、組織特異性発現か、ＮＦＩ遺伝子と他のシグナル 形質導入タンパクとの組織特異性相互作用かのいずれかを反映しているのかもし れない。ＮＦＩタンパクの濃度は神経冠由来組織において有意に大きいか、又は それは組織特異的に後翻訳的に修飾される（リン酸化、ミリスチル化等）可能性 がある。逆に、組織特異性はＮＦＩタンパクと、神経冠で支配的に発現される他 のシグナル形質導入分子との会合を反映しているのかもしれない。可能性のある 候補は、神経成長因子レセプター（Ｋｌｅｉｎ、　Ｒ，ら、Ｃｅ１ｌ　６５：１ ８９−１９７（１９９１））、ｔｒｋ原腫瘍遺伝子（［（ｅｍｐｓｔｅａｄ、　 Ｂ、　Ｌ、ら、Ｎａｔｕｒｅ３５０　：３７８−６８３　（１９９１））、ＥＲ Ｋｌ　（Ｂｏｕｌｔｏｎ、　Ｔ、　Ｇ、ら、Ｃｅ１ｌ　６５：６６３−６７５（ １９９１）　）　、及びＡＰ　２　（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ、　Ｐ、　Ｊ、ら、Ｇｅ ｎｅｓ　ａｎｄ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　５　：　１０５−１１９　（１９９ １））。

ＮＦＩタンパクは、ｍＲＮＡのように、至る所で発現されるらしく、マウスとラ ットにおいて種保存性を示す。

それは脳、肺、腎、肝、牌、筋肉及び結腸において二つの異なる抗血清を用いる ウェスタンプロットにより検出し得る。これらの発見は、マウスの肝、腎及び脳 におけるＮＦｌｍＲＮＡを証明するノーザンプロットデータと完全に一致する。

Ｂｕｃｈｂｅｒｇ、　Ａ、　Ｍ、ら、Ｎａｔｕｒｅ３４７　：２９Ｉ−２９４（ １９９０）。このタンパクはその予想されるアミノ酸配列のコンピューター解析 に基づけば、非常に親水性であり、細胞質中に存在する可能性が最も高い。この タンパクはまた、４〜８時間の代謝標識では免疫沈殿により評価できる量の放射 標識タンパクを検出できないのに対し、１２〜１８時間の標識ではタンパクを検 出した点からすると、比較的ゆっくりとしたターンオーバー速度を有している。

ＮＦＩｃＤＮＡの読み取り枠は、２８１８個のアミノ酸のタンパクと３２７　ｋ Ｄａの分子量を予測する。

Ｍａｒｃｈｕｋ、　Ｄ、　Ａ、ら、提出した原稿。観察された大きさの不一致は 嚢胞性線維症トランスメンプランコンダクタンス調節タンパクに見られるような 異常な移動の結果であるかもしれない。このタンパクは予想では１８５　ｋＤａ の大きさであるにもかかわらず１４０ｋＤａのタンパクとして移動するのである 。あるいは、この差は、前タンパク種のプロセシングのような、後翻訳修飾を反 映しているともいえる。カルボキシ末端残基を認識するＤペプチド及びりＭＡＬ 、Ｂ３Ａ融合タンパク抗血清は、より多くのアミノ末端Ｈペプチド抗血清と同じ ２５０　ｋＤａのタンパクを同定するので、これは必然的にアミノ末端配列の開 裂を含むであろう。ＮＦ　１ｍＲＮＡのアミノ末端部分での交互スプライシング の証拠は存在するが、これらの交互形態か現実にユニークなプロティン種に翻訳 されることを証明するには、より詳細な実験を待たねばならない。Ｈ及びＤペプ チド抗血清が独立に発生した融合タンパクをオーバーラツプするエピトープで認 識し、免疫沈殿とウェスタンプコツトにより同じタンパクを認識するという事実 は、同定されたタンパクか確実なＮＦＩ遺伝子産物であるという強固な証拠であ る。さらに、触媒ドメインエピトープに対して向けられた抗血清を用いて、我々 の抗血清により同定されたＮＦＩタンパクか後に他の人々により同定されたタン パク産物と同一であることを証明した。前に議論したように、ＮＦＩ遺伝子産物 の小部分と、ＧＴＰアーゼ活性を存する一群のタンパクの触媒ドメインとの間の 相同性は、ＮＦＩ遺伝子産物がまたｒａｓとも相互作用することを示唆する。Ｔ ａｎａｋａ、　Ｋ、ら、Ｃｅ１ｌ　６０　：　８０３−８０７　（１９９０）　 ；Ｈａｌｌ、　Ａ、。

Ｃｅ１ｌ　６１：９２１−９２３（１９９０）、以前の実験によれば、ＮＦＩ触 媒ドメイン（全長ｃＤＮＡ予想のアミノ酸配列の残基１１２５−１５３７）は１ ｒａｌ−１ｉｒａ２−酵母株の野生表現型を回復させる点において、酵母ＩＲＡ Ｉ及びＩＲＡ２に代わることができ、かつ野生型の転換を触媒することができる が、突然変異体はｒａｓ−ＧＴＰをｒａｓ　−ＧＤＰに転換することはできない ことが示されている。Ｂａ１ｌｅｓｔｅｒ、　Ｒ，Ｍ、ら、Ｃｅ１１６３：８５ １−８５９　（１９９０）；Ｘｕ、Ｇ、ら、Ｃｅ１１６３：８３５−８４１　（ １９９０）。

今後ＮＦＩタンパクは、そのタンパクについて知られていることを強調するため 、かつＮＦ１転写因子、神経フィラメントタンパク及びアルツハイマー症の神経 原線維のからみとの混合を避けるために、ＮＦＩ−ＧＡＰ−関連タンパク（ＮＦ 　Ｉ　ＧＲＰ）と呼ぶことを提案する。

ここで請求する発明の範囲内において、また、遺伝子産物という語は、ＮＦ　Ｉ 　ＧＲＰタンパクの、修飾されていない翻訳形態と、すべての後翻訳的に修飾さ れた形態（たとえば、グリコジル化、リン酸化、開裂等）との両方を含む意味で あると認識されるであろう。

応用 前に議論したように、ＮＦＩは高い頻度と高い突然変異率をもった疾病である。

特に無症候性であることの多い新生児や幼児において、ＮＦＩをスクリーニング することは、本発明の主要な応用の一つである。ＮＦＬ遺伝子は至る所で発現さ れるので、患者の被験試料は様々な組織や血液から得ることかできる。ＮＦ　Ｉ 　ＤＮＡ、ＲＮＡ又はタンパクは羊水中で評価することもてきるので、ＮＦＩ試 験は一群の胎児テストに含めることもてきる。

ＮＦＩは優性疾病なので、ＮＦＩに関し異型接合体である人は５０％以下のレベ ルでＮＦＩの発現を減少できるであろう。ＮＦ１転写物と遺伝子産物の定量試験 もまた、本発明の範囲内であることが意図されている。

ＮＦＩをスクリーニングし診断するための核酸及びタンパクに基づく方法はすべ て本発明の範囲内であると意図されている。たとえば、ＮＦＩ遺伝子の配列を知 れば、ＤＮＡやＲＮＡプローブを構築し、従来技術を用いて組織や血液中のゲノ ムＤＮＡとのハイブリダイゼーションにより、ＮＦＩ突然変異を検出するために 使用することができる。ＲＮＡやｃＤＮＡプローブを同様に、ＮＦＬ突然変異や 発現の定量的変化をスクリーニングするために調べることができる。様々なプロ ーブの混合物、すなわち「プローブカクテルＪもまた複数の突然変異を調べるた め用いることができる。

核酸ベースの試験に関しては、ゲノムＤＮＡが特異的な配列を検出するために直 接使用してもよく、あるいは分析に先立ち、ＰＣＲを用いることにより、インビ トロで酵素的に増幅してもよい（Ｓａｉｋｉら、５ｃｉｅｎｃｅ　２３０：１３ ５０−１３５３　（１９８５）；５ａｉｋｉ　ら、Ｎａｔｕｒｅ３２４：１６３ −１６６　（１９８６））、この主題の最近の総説がＣａ５ｋｅｙ、　５ｃｉｅ ｎｃｅ　２３６　：　１２２３−１２２８　（１９８９）及びＬａｎｄｅｒｇｒ ｅｎら、５ｃｉｅｎｃｅ　２４２　：　２２９−２３７　（１９８９）により提 出されている。

特異的ＤＮＡ配列の検出は以下のような方法で行ってもよい。たとえば、特異的 なオリゴヌクレオチドを用いたハイブリダイゼーション（Ｗａｌｌａｃｅら、Ｃ ｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｕｒ　Ｓｙｍｐ、　Ｑｕａｎｔ、　Ｂｉｏｌ　 ５１　：　２５７−２６１　（１９８６））、直接ＤＮＡシーケンシング（Ｃｈ ｕｒｃｈら、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）８１：１９９１−１９９５（１９８８））、制 限酵素の使用（Ｆｌａｖｅｌｌ　ら、Ｃｅ１ｌ１５：２５　（１９７８）　；Ｇ ｅｅｖｅｒら、ＰＮＡＳ　（ＵＳＡ）７８　：５０１　（１９８１））、変性試 薬含存ゲル中での電気泳動易動度に基づいた識別化（Ｍｙｅｒｓら、Ｃｏ１ｄ　 ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｕｒ　Ｓｙｍ、Ｑｕａｎｔ、　Ｂｉｏｌ、５　１　：　 ２　７　５　−　２　８　４　（１９８６））、ＲＮアーゼ保護（Ｍｙｅｒｓ、 　Ｒ，Ｍ、ら、５ｃｉｅｎｃｅ２３０−１２４２　（１９８５））、化学的開裂 （Ｃｏｔｔｏｎら、　ＰＮＡＳ　（ＵＳＡ）　８　５　二　４３９７−４４０１ 　（１９８５））、及びリガーゼ媒介検出手法（Ｌａｎｄｅｒｇｒｅｎら、５ｃ ｉｅｎｃｅ　２４１　：１０７７　（１９８８））。

タンパクベースの試験に関しては、標準的な免疫学的技術、本明細書で述べたよ うな融合タンパク又は合成ペプチドを用いて、ＮＦＩ遺伝子産物に対して抗体を 発生させることができる。モノクローナル抗体も、今では、Ｗａｌｄｍａｎｎ、 　Ｔ、　Ａ、、　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｉｎＤｉａｇ ｎｏｓｉｓ　ａｎｄ　Ｔｈｅｒａｐｙ、　５ｃｉｅｎｃｅ２５２　：　ｌ　６５ ７−１６６１（１９９１）及びＨａｒｌｏｗ、　Ｅ、ら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ 　：　ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　：　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　 Ｉ（ａｒｂｏｒニューヨーク（１９８８）に記載されているような従来技術を用 いて製造することができる。また、抗体断片、即ちＦａｂ　’断片が同様に使用 できる。被験試料を抗体と接触させ、遺伝子産物への結合を検出する免疫検定法 （たとえばＥＬＩＳＡ）は、ＮＦＩ遺伝子産物の存在と量を決定する迅速かつ効 率的な方法を提供し得る。

ＮＦＩ遺伝子産物とその機能のキャラクタリゼーションとともに、機能的検定法 もＮＦＩ診断とスクリーニングのために、及び治療をモニターするために使用す ることもできる。たとえば、ＮＦＩ遺伝子や産物を直接スクリーニングするより も、遺伝子機能のレベルを決定するための酵素試験が使用される。この種の試験 はチー病（Ｔａｙ−Ｓａｃｈｓ）のような他の疾病及び症候に利用されている。

ＮＦＩの場合には、ＮＦＩタンパクを、たとえばｒａｓタンパクをそのＧＴＰ型 からＧＤＰＷに転換することを触媒する能力について、評価することができる。

Ｂａ１ｌｅｓｔｅｒ、　Ｒ，Ｍ、ら、Ｃｅ１１６３：８５１−８５９　（１９９ ）　；　Ｍａｒｔｉｎ、　Ｇ、　Ａ、ら、Ｃｅ１１６３　：　８３５−８４９（ １９９０）参照。

ＮＦＩ遺伝子とその遺伝子産物の同定も、治療的意味を育している。従来の置換 療法では、遺伝子産物又はその機能的等漬物が患者に治療的有効量で与えられて いる。

ＮＦＬタンパクはＤｅｕｔｃｈｒｅｒ、　Ｍ、（編者）　、Ｇｕｉｄｅ　ｔ。

Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、　Ｍｅｔｈ、　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍ ｏｌ、第１８２巻（１９９０）に記載されているような従来技術を用いて精製す ることができる。十分な量の治療用の遺伝子産物又はタンパクか、たとえば培養 細胞系又は合成製造により得ることかできる。遺伝子産物を刺激又は置き換える 薬物療法も使用することかできる。デリバリ−担体とスキームは投与される特別 のタンパク又は薬物に特異的に調整することかできる。

治療は欠陥のあるタンパクの機能の調整という形をとることもでき、あるいはＮ ＦＩが生理学的な異常を補正するために参加する経路中の別のタンパクかステッ プを修飾することによる。たとえば、ＮＦＩは活性化ｒａｓタンパクの効果に対 しブレーキとして作用するらしいので、（ＮＦＩ患者の腫瘍で起こると考えられ ているように）ＮＦＩの不在下においては、ｒａｓを下方調整することは有用な アプローチてあろう。これを遂行する一つの方法はファーネシルトランスフエラ ーゼのインヒビターの使用によるものである。Ｇｉｂｂｓ、　Ｊ、　Ｂ、、Ｃｅ １１６５　：　１−４（１９９１）参照。

ＮＦＩ機能の調整は、ＮＦＩタンパク構造又は機能の様々な局面と相互作用する ようにデザインすることのできる治療剤又は薬物の使用により行うことかできる 。たとえば、ある薬物又は抗体はタンパクの構造的折りたたみに結合して欠陥の ある構造を修正することができる。

あるいは、ある薬物は特異的な機能の残基に結合し、基質又はコファクターとの 親和性を増加させるだろう。薬物又は薬剤の効果は、欠陥ＮＦＩタンパクが発現 される細胞系でインビトロで調整をモニターするスクリーニングプログラムによ り同定することかできる。あるいは、ＮＦＩタンパクの構造と機能の相関につい ての知識から、及び様々なＮＦＩ突然変異タンパクの特異的欠陥についての知識 から、ＮＦＩ活性を調整するよう、薬物をデザインすることかできる。Ｃａｐｓ ｅｙら、ＧｅｎｅｔｉｃａｌｌｙＥｎｇｉｎｅｅｒｅｄ　Ｈｕｍａｎ　Ｔｈｅｒ ａｐｅｕｔｉｃ　Ｄｒｕｇｓ、　５ｔｏｃｋｔｏｎ　Ｐｒｅｓｓ。

ニューヨーク（１９８８）参照。

遺伝子を患者の細胞又はベクターに運ぶ組換技術を用いる遺伝子治療は患者にイ ンビボで遺伝子産物を供給するが、これもまた本発明の範囲内として意図されて いる。

レトロウィルスは、高い感染効率と安定な組込みと発現を有する、体細胞遺伝子 治療における実験用の好ましいベクターと考えられている（　０ｒｋｉｎら、Ｐ ｒｏｇ、　Ｍｅｄ。

Ｇｅｎｅｔ、７：　１３０　（１９８８））、たとえば、ＮＦＩ遺伝子ｃＤＮＡ はレトロウィルスベクター中にクローニングし、その内生プロモーターかレトロ ウィルスＬＴＲ（ｌｏｎｇ　ｔｅｒｍｉｒａｌ　ｒｅｐｅａｔ）のいずれかから ドライブすることができる。使用できる他のデリバリ−システムとしては、アゾ ン随伴ウィルス（ＡＡＶ）　（ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、６２ ：１９６３　（１９８８）、’７クチニアウイルス（Ｍｏｓｓら、Ａｎｎｕ、　 Ｒｅｖ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、５　＋　３０５　（１９８７））、ウシパピローマ ウィルス（ｒａｓｍｕｓｓｅｎら、Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　１３９　： 　６４２　（１９８７）　）又はニブシュタイン−バーウィルスのようなヘルペ スウィルスのメンバー（Ｍａｒｇｏｌｓｋｅｅら、Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｊ ｏｌ、　８　：　２９３７（１９８８））が包含される。最後に、ＮＦＩ遺伝遺 伝子犬陥は神経組織の自由な増殖を起こすので、遺伝子と遺伝子産物の同定は、 神経系の非ＮＦＩ腫瘍の治療を展開していくに際し有用であろう。ＮＦＩ遺伝子 産物は腫瘍抑制剤として機能するようなので、その産物の供給を増大すれば、こ のような腫瘍に対し存益な効果をもたらすだろう。逆に神経組織の増殖が増大し た方が有利な場合は、ＮＦＩ産物の産生を減少させる戦略をとることが有益であ ろう。

前述の議論は単に本発明の具体例を例示的に開示し述べたものにすぎない。当業 者であれば、このような議論から、そして添付の図面と請求の範囲から、様々な 変更、修飾及びバリエーションか、以下の請求の範囲に定義される本発明の精神 と範囲から離れることなくなし得ることを容易に認識するであろう。

配列リスト （１）一般情報： （ｉ）出願人：コリンスＭ、Ｄ、、フランシスＳ。

ワラスＰｈ、　Ｄ、マーガレットＲ。

マーチャフＰｈ、　Ｄ、ダグラスＡ。

アンダーセンＭ、Ｄ、、ローンＢ。

グツトマンＭ、Ｄ、、デビットＨ１ （ｉｉ）発明の名称：神経線維腫遺伝子（ｉｉｉ）配列の数：２ （ｉｖ）連絡住所： （Ａ）アドレス：ハーネス、ディツキ−アンドピアス（Ｂ）街：Ｐ、　０．　Ｂ ｏｘ　８２８（Ｃ）市：ブルームフィールドヒルズ （Ｄ）州：ミシガン （Ｅ）国：米国 （Ｆ）郵便番号：４８３０３ （Ｖ）コンピューター読み取りフオーム（Ａ）媒体のタイプ：フロッピーディス ク（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭＰＣコンパチブノしくＣ）才ベレーティングシ ステム二ＰＣ−ＤＯ３／ＭＳ−ＤＯＳ（Ｄ）ソフトウェア：パテントインリリー ス＃１．０、バージョン＃１．２５ （ｖｉ）本出願データ： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （Ｃ）分類： （ｖｉｉ）先願データ： （Ａ）出願番号：ＵＳ０７１５４７，０９０（Ｂ）出願日：１９９０年６月２９ 日 （ｖｉｉｉ）弁護士／弁理士情報： （Ａ）氏名ニレワク、アンチ （Ｂ）登録番号：３３．００６ （Ｃ）参照／ドケット番号：２１１５５５３ＰＣＡ（ｉｘ）電話回線通信情報： （Ａ）電話：３１３−６４１−１６００（Ｂ）テレファクス：３１３−６４１− ０２７０（２）配列識別番号ｌの情報 （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：　８９３７塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）　Ｈの数二二本鎖 （Ｄ）トポロジー二線形 （ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ （ｉｉｉ）仮定：なし くｉｖ）アンチ−センスＳなし くｖｉ）起源 （Ａ）器官、ホモサピエンス （ｖｉｉ）直接の起源 （Ａ）ライブラリー２５種のｃＤＮＡライブラリーからのクローンのコンポジッ ト （Ｂ）クローン：ＮＦＩ遺伝子の１２種以上のｃＤＮＡクローンのコンポジット （ｖｉｉｉ）ゲノム中の位置 （Ａ）染色体／セグメント：第１７染色体（Ｂ）地図の位置：１７ｑ１１．２ （ｉｘ）特徴： （Ａ）名称／キー：　ＣＤ５ ＣＢ）位！：１９０．．８６４６ （Ｘ）刊行物情報： （Ａ）著者：マーチャク、ダグラスＡ。

サウリノ、アンＭ。

タバッコル、ロクサンヌ スワルーブ、マニュ ワラス、マーガレットＲ。

グツトマン、デビットＨ０ ボグスキ、マーク （Ｂ）タイトル二タイブｌ神経線維腫遺伝子のｃＤＮＡクローニング：ＮＦ１遺 伝子産物の完全配列 （Ｃ）雑誌ニジェノミクス（Ｇｅｎｏｏ＋１ｃｓ）ＣＤ）巻：１１ （ε）イシュー：４ ＣＦ）頁：９３１−９４０ ＣＧ）日付：１９９１年１２月 （Ｋ）配列識別番号ｌ中の関連残基：１から８９３７まで （ｘ）刊行物情報： （Ａ）著者：ワラス、マーガレットＲ。

マーチャク、ダグラスＡ。

ＣＢ）タイトル二タイブ１神経線維腫遺伝子：訂正（Ｃ）雑誌：サイエンス （Ｄ）巻：２５０ （Ｆ）頁：ｌ７４９−１７４９ ＣＧ）日付：１９９０年１２月２１日 （Ｘ）刊行物情報： （Ａ）著者：ワラス、マーガレットＲ。

マーチャク、ダグラスＡ。

アンダーセン、ローンＢ。

レッチャー、ロクサンヌ フｔウンテン、ジエーン （Ｂ）タイトル二タイブｌ神経線維腫遺伝子：３人のＮＦＩ患者で分裂した大き な転写物の同定（Ｃ）雑誌：サイエンス （Ｄ）巻：２４９ （Ｆ）頁：ｌ８ｌ−ｆ８Ｇ （Ｇ）日付：１９９０年７月１３日 （ｘｉ）　配列記載：配列識別番号ｌ ｍＡＡｃＴｆｉＡＧ　ＡＡＡＴ　８９３７（２）配列識別番号２の情報 （ｉ）配列特性 （Ａ）長さ：２８１８個のアミノ酸 （Ｂ）タイプ：アミノ酸 （Ｃ）トポロジー二線形 （ｉｉ）分子種：タンパク （ｉｉｉ）配列記載：配列識別番号２ Ｍｅｔ＾１ａ＾ｌａ　Ｈｌｓ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｔｒｐ　Ｖａ ｌ　Ｇｌｎ　Ａｌａ　Ｖａｔ　Ｖａ１Ｓｅｒ＾１Ｐｈｅ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ｇｌ ｎ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｉｌｅ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　Ｇｉｎ　Ａｓ ｎ　Ｔｈｒ　Ｈｌｓ　ＴｈｒＧ７ｕ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　１１ｅ 　Ｐｈｅ　Ｌａｕ　Ｌｅｕ　Ｖａｔ　Ｇｉｎ　Ｓｅｒ　Ｍｅｔ　ＶａｌＶａｌ　 ＡｓｐＬｅｕ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｌ＠ｕ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｓ ｅｒ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｐｈａ　Ｓｅｒ＾ｒｇ　Ｇｌｙ　Ｓ＠ｒＧｉｎ　Ｐｒｏ Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｍｅｔ　Ｉｌｅ　Ａｓｐ　Ｃｙｓ　 Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ｐｈｅ＾ｓｎ　Ｓ＠ｒ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｔ ｈｒ　Ｐｈｅ　Ｈａｓ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ＾＄１％　Ｓｅｒ　Ｌ ａｕ　ｌ１ｌｓ＾１Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　Ｈｌｓ　Ｓｅｒ　Ｖａｌεｌｕ　Ｌ＠ｕ　 Ａｒｇ＾ｓｎ　？４ｅｔ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｈ１ｓＬ ｙｓ　Ａｌａ　Ｖａｔ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　Ｇ１ｙ＾ｌａ　１４１ｓ　Ｐ ｒｏ　Ａｌａ　ＩＩｓ　Ａｒｇ　Ｍｅｔ＾１ａＰｒ。

Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　 Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｐｈａ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　ＬｙｓＰｒｏ　Ｔｈｒ　Ａ ｓｐ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　ＬｙＳ　Ｔｙｒ　Ｌ ｅｕ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　ＭｅｔＬｙｓ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｇｌ ｕ　Ｔｈｒ　Ｇｌｎ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｉｌ ｅ　Ｔｈｒ　ＧｌｙＴｒｐ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ 　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｔｒｐ　Ｇｌｕ　Ｉｌｅ　Ｓ＠ｒ　Ｓｅｒ　Ｇ１ｎ Ｍｅｔ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｔｙｒ　ＩＩｓ　Ｃｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　 Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｈ４ｓ　Ｇｉｎ　Ｍｅｔ　Ｌｅｕ　５ｅｒＳｅｒ　Ｔｈｒ　Ｇ ｌｕ　１１ｅ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｔｒｐ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ｉｌｅ　Ｌ ｅｕ　Ｉｌｅ　Ｃｙｓ　Ａｒｇ　Ａｓｎ＾ｒ９＾ｒ９＾ｓｐ　Ａｓｐ　Ｌａｕ　 Ｓｅｒ　Ｐｈａ　Ｃｙｓ　Ｇｉｎ　Ｇｌｕ　＄４ｅｔ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ａｒｇ 　Ａｓｎ　ＬｙｓＸＯ２５１０３０１０３５１０４０ ＾１ａ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　 Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｇｌｎ＾ｌａ　５ｅｒＧｌｕ　Ｇｌｙ　Ａｓ ｐ　Ｇｌｙ　Ｖａｔ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｎｅｔ　Ｇｌｕ＾ｌａ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ 　Ｇｌｎ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　ＬｅｕＡｓｐ　Ｇｌｎ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　ＬＪｕ　 Ｐｒｏ　ＩＩｓ＾１ａＭｅｔ＾１ａＬｅｕ＾ｌａ　Ａｓｎ　Ｖａｔ　Ｖａｔ　Ｐ ｒ。

Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　 Ｈｌｓ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ａｓｐ　ＴｈｒＨ１ｓ　Ｔｒｐ　Ｓ ｅｒ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｐ ｈｅ　Ｇｌｕ　Ｇ７ｕ　Ｐｈｅ　ＭｅｔＰｈｅ　Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ＾１ａ Ａｒｇ＾ｒｇ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　１１ｅ　Ａｓｎ　Ｇ ｌｙ　ＡｓｐＬｅｕ　Ｌｅｕ　ｌｉｅ　Ｔｙｒ　Ｈａｓ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｌｅ ｕ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｔｙｒ　Ｔｙｒ＾１ａＬｙｓＰｒｏ　Ｔ ｙｒ　Ｇｌｕ　Ｉｌｅ　Ｖａｉ　Ｖａｔ＾ｓｐ　Ｌａｕ　Ｔｈｒ　１４１ｓ　Ｔ ｈｒ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ａｓ、ｎ　Ａｒ■ Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｔｒｐ　 Ｐｈ＠Ｖａ１Ｖａｔ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　ＰｈｇＶａｔ＾ｒｇ　Ｇｌｕ　 Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　Ｈｉｓ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　 Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ）１１ｓ　Ｉｌｅ　Ｇｌｕ　Ｈｉｓ　Ｇｌｕ　 Ｇｌｎ　Ｇｌｎ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏに１＾１ａ　Ｔｈｒ　Ｌ＠ｕ＾ｌａ　 ＬａｕＧｌｕ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｖａｔ　Ｐｈｅ　Ｈｌｓ　Ａ ｓｎ＾ｌａ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ＾ｌａ　Ｈｌｓ　ＬｙｓＴｙｒ　Ｌｅｕ　 Ｐｈｅ　Ｈｌｓ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｖｉｌ　Ａｌａ　 Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　５ｅｒＣｙｓ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ｓｅｒ　Ｇ ｌｎ　Ｌａｕ　Ｈｌｓ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｇ ｌｎ　Ｖａｔ　ＬｅｕＴｙｒ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ｓｅ ｒ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｐｈ ｅ２１６５　２１７０　、　２１７５ Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ＾ｌａ　Ｇｉｎ　Ａｒｇ　Ｐｈｅ＾ｌａ　Ｐｈｅ　Ｇｌ ｎ　Ｔｙｒ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｓ＠ｒ　Ｌ＠ｕ　Ｇ１ｎＧｌｙ　Ｇｌｎ　Ｉｌｅ 　Ｌｙｓ　Ｇｌｎ　ＩＩｓ　ｌｉｅ　Ａｒｇ　Ｘｉ＠Ｌｅｕ　Ｓａｒ　Ｌｙｓ＾ ｌａ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　５ｅｒＮｅｔ　Ａｓｐ　ｔ’ｓ　Ｐｈｅ　Ｖａｔ　Ｇｌ ｙ　Ｌｅｕ＾ｓｎ　Ｆ’ｈｅ　Ａｓｒｗ　Ｓｅｒ＾ｓｎ　Ｐｈｅ＾ｓｎ　Ｐｈｅ ＾１ａＬ＊ｕ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｈｌｓ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｔ ｙｒ　Ａｒｇ　Ｎｌｓ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ”Ｐｒｏ　＾ｌａ　１１ｅＶａｔ＾口＾ ｒｇ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　ＩＩｓ　Ｌａｕ　Ｈｌｓ　Ｔｈｒ　Ｌｓｕ　Ｌ ｅｕ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ＾５ｎＬｙｓ　Ｈｌｓ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ｃｙｓ 　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ｇｉｎ　Ｓｅｒ 　Ｖａｔ＾１ａ７ｙｒ　Ｌｅｕ＾１ａ＾ｌａ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ 　Ｓ＠ｒ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ＾ｒｇ　Ｓｅｒ＾ｉ　ＣｙｓＳｅｒ　Ｌｅｕ 　Ｌｙｓ　Ｈｌｓ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｌａｕ　Ｔｈｒ 　Ａｓｐ　Ｉｌｅ　Ｓｓｒ　Ｍｅｔ　Ｇｌｕ＾ｓｎ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｍｅｔ　 Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　Ｉｌｅ　Ｈｌｓ　Ｈｌｓ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　 Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ＾ｒｇ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｇ ｌｎ　Ｐｒｏ　Ｔｒｐ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｇ ｌｕＧｌｙ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　＾１ａ＾】ａ　丁ｈｒ　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ 　ＶａＩ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ２４ＥＪ５　２４ ９０　２（９５ に１＾ｒｇ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｍｅｔ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｍｅｔ　Ｇｌ ｙ　Ｇｌｎ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ＾１ａ＾５ｎＴｈｒ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌ ａｕ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ａｓｐ　Ｈ ｌｓ　Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　５ｅｒ＾ｓｐ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ＾ｌａ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ 　Ａｒｇ　Ｇｉｎ　Ｇｌｕ　Ｍｅｔ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ｔｈｒ 　ＴｈｒＰｒｏ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　１ｉｌｅｔ　Ａｒｇ＾ｒｇ　Ｖａ１＾１ａ　 Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　Ｎｅｔ　Ｇｌｕ　ＴｈｒＧｌｎ　Ａ ｒｇ　Ｉｌｅ　５ｅｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｇｌｒｓ　Ｇｌｎ　Ｈｌｓ　Ｐｒｏ　 Ｈｌｓ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　５ｅ■ ＶａＩＳｅｒ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　ＶａＩ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｇ ｌｕ　Ｇｌｕ　Ｖａｔ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｐｒ。

Ｌｙｓ　Ｉｌｅ　Ｇｌｎ＾ｌａ　Ｌｅｕ　Ｌ＠ｕ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｖａｔ　Ｌ 仙＾１ａ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　ＶａＴ　ｉ、ｙｓ　ＴｙｒＴｈｒ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ 　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　Ａｓｐ　Ｇｌｎ　Ａｒｇ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ｇｌｕ 　Ｔｙｒ　Ｌａｕ＾ｌａ　ＧｌｕＡｓｐ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　ｌｉｅ　Ａｓｎ　Ｔ ｈｒ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｃｙｓ　Ｇｉｎ　ｊＬｓｐ　Ｐｒｏ　 Ａｓｎ　Ｌｅ■ Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｉｌｅ　Ｈｉｓ　Ｇｌｙ　Ｉｌ＠Ｖａｌ　Ｇｌｎ　Ｓ ｅｒ　Ｖａｉｌ　Ｖａｔ　Ｔｙｒ　Ｈｉｓ　Ｇｌｕε１ｕＴｙｒ　Ｌｅｕ　Ｐｒ ｏ　Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｇｌ ｕ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ１１ｅ　Ｖａｔ ６．５ −４．。

・　・　２．３ ｅ　＠ＩＩ　１．３ ＠’＠　−−２，５ １８Ｓ− 二＝＝匡＝；、４Ｄ。

ｃｏＲ１ 拳 ｓｇｉ　Ｉに ＝＝＝＝＝、５Ｂ− ＥｃｏＲＶ 二＝匡＝＝・二〇。

翫 ｓｔ　１ 一二＝＝＝＝、　５　Ｄ− Ｔ　ｍｐｃ、；ｃＨｇｖｃ；；ｔ；ｖｃｐｔ；ｅｅＨｔ６を冨ｅ；ｔｃｃｃＨｃ ；ｃ値門ｔｅｔｔｃ↓１６Ｓ叩〒Ｔ：ＴＡ？ＴＡニヤＣｒ：f ニ＝＝＝＝＝・巴− ”°　嘲− 二＝：＝＝＝、二二。

ｐＭＡＬ、ｃｍ合タンパクの発現を示す５ＤＳ−ＰＡＧＥ結果二＝＝＃、１二。

Ａ ｌ　２３４

Claims (43)

【特許請求の範囲】
1. １．配列識別番号３で実質的に示される核酸配列。
2. ２．請求項１の配列に実質的に相補的な核酸配列。
3. ３．請求項１の配列の転写物。
4. ４．配列識別番号４で実質的に示されるアミノ酸配列。
5. ５．請求項４のアミノ酸配列の少なくとも一部分に対して生じた抗体又はその断 片。
6. ６．配列識別番号３の核酸配列の少なくとも一つのセグメントを含む核酸プロー ブ。
7. ７．請求項５のプローブの相補的配列。
8. ８．セグメントが少なくとも８個の核酸を含む請求項６のプローブ。
9. ９．プローブＰ５の配列に実質的に対応する核酸配列。
10. １０．請求項９の核酸配列に実質的に相補的な核酸配列。
11. １１．プローブＢ３Ａの配列に実質的に対応する核酸配列。
12. １２．請求項１１の核酸配列に実質的に相補的な核酸配列。
13. １３．実質的に純粋なＮＦ１転写物。
14. １４．請求項１３の転写物のためのＤＮＡ鋳型配列。
15. １５．請求項１４の鋳薄型配列に実質的に相補的なＤＮＡ配列。
16. １６．請求項１３の転写物から翻訳されたアミノ酸配列。
17. １７．転写物がヒトのインビボ起源のものではない請求項１３の転写物。
18. １８．ＮＦＩについて患者をスクリーニングする方法であって、 ａ．配列識別番号３の核酸配列の少なくとも一つのセグメントを含むプローブを 提供し、 ｂ．ＮＦＩが正常に表現されるタイプの患者の血液又は組織の試料を得、 ｃ．試料中の核酸の相補的配列に対するプローブのハイブリダイゼーションに好 適な条件下で試料を接触させ、 ｄ．ハイブリダイゼーションを検出するための手段を提供し；そして ｅ．ハイブリダイゼーションを検出する、段階を含む上記方法。
19. １９．さらに、 ｆ．相補的配列に対するプローブのハイプリダイゼーションを定量するための手 段を提供し、そしてｇ．ハイブリダイゼーションを定量する、段階を含む請求項 １８の方法。
20. ２０．ＮＦＩについて患者をスクリーニングする方法であって、 ａ．ＮＦＩ遺伝子産物に対する抗体又はその断片を提供し、 ｂ．ＮＦＩが正常に発現するタイプの患者の血液又は組織の試料を得、 ｃ．試料中のＮＦＩ遺伝子産物に対する抗体又は断片の結合に好適な条件下で試 料を接触させ、ｄ．結合を検出するための手段を提供し、そしてｅ，結合を検出 する、 段階を含む上記方法。
21. ２１．さらに、 ｆ．遺伝子産物に対する抗体又は断片の結合を定量するための手段を提供し、そ して ｇ．結合を定量する、 段階を含む請求項２０の方法。
22. ２２．配列識別番号１で実質的に示される核酸配列。
23. ２３．請求項２２の配列に実質的に相補的な核酸配列。
24. ２４．請求項２２の配列の転写物。
25. ２５．配列識別番号２で実質的に示されるアミノ酸配列。
26. ２６．請求項２５のアミノ酸配列の少なくとも一部分に対して生じた抗体。
27. ２７．配列識別番号１の核酸配列の少なくとも一つのセグメントを含む核酸プロ ーブ。
28. ２８．請求項２７のプローブの相補的配列。
29. ２９．セグメントが少なくとも８個の核酸を含む請求項２７のプローブ。
30. ３０．ＮＦＩについて患者をスクリーニングする方法であって、 ａ．配列識別番号１の核酸配列の少なくとも一つのセグメントを含むプローブを 提供し、 ｂ．ＮＦＩが正常に発現するタイプの患者の血液又は組織の試料を得、 ｃ．試料中の核酸の相補的配列に対するプローブのハイブリダイゼーションに好 適な条件下で試料を接触させ、 ｄ．ハイプリダイゼーションを検出するための手段を提供し、そして ｅ．ハイプリダイゼーションを検出する、段階を含む上記方法。
31. ３１．さらに、 ｆ．相補的配列に対するプローブのハイブリダイゼーションを定量するための手 段を提供し、そしてｇ．ハイプリダイゼーションを定量する、段階を含む請求項 ３０の方法。
32. ３２．ＮＦＩについて患者をスクリーニングする方法であって、 ａ．配列識別番号２のアミノ酸配列の少なくとも一部分に対する抗体又はその断 片を提供し、ｂ．ＮＦＩが正常に発現するタイプの患者の血液又は組織の試料を 得、 ｃ．試料中のＮＦＩ遺伝子産物に対する抗体又は断片の結合に好適な条件下で試 料を接触させ、ｄ．結合を検出する手段を提供し、そしてｅ．結合を検出する、 段階を含む上記方法。
33. ３３．実質的に純粋なＮＦＩ遺伝子産物。
34. ３４．請求項３３の産物に対する抗体。
35. ３５．約２８１８個のアミノ酸の長さを有する請求項３３の産物。
36. ３６．約２５０ｋＤａの分子量を有する請求項３３の産物。
37. ３７．産物がインビボ起源のものではない請求項３３の産物。
38. ３８．以下の特性を示す実質的に純粋なタンパク：ａ．Ｈペプチド抗血清、Ｄペ プチド抗血清及びｐＭＡＬ．ｃ融合タンパク抗血清による免疫認識、ｂ．Ｈペ プチド、Ｄペプチド又はｐＭＡＬ．ｃ融合タンパク抗血清を用いた免疫沈殿又は ウェスタンプロットにより決定された約２５０ｋＤａの分子量、及びｃ．親水性 。
39. ３９．ＮＦＩ遺伝子機能を検出する方法であって、ａ．ＮＦＩが正常に発現する タイプの血液又は組織の試料を得、 ｂ．ＮＦＩ遺伝子産物が正常に相互作用して検出可能な結果物を産生する基質を 提供し、 ｃ．相互作用が起こるのに好適な条件下で試料を基質とともにインキュベートし 、 ｄ．結果物を検出するための手段を提供し、そして、ｅ．結果物を検出する、 段階を含む上記方法。
40. ４０．さらに、 ｆ．結果物の濃度を測定するための手段を提供し、そして ｇ．緒果物の濃度を測定する、 段階を含む請求項３９の方法。
41. ４１．ＮＦＩをスクリーニングするための検定キットであって、 ａ．配列識別番号１の少なくとも８個の核酸のセグメントを含む核酸プローブ、 ｂ．相補的核酸配列に対するプローブのハイプリダイゼーションのための試薬、 そして ｃ．ハイブリダイゼーションを検出するための手段、を含む上記キット。
42. ４２．ＮＦＩをスクリーニングするための検定キットであって、 ａ．ＮＦＩ遺伝子産物に対する抗体又はその断片、ｂ．ＮＦＩ遺伝子産物に対す る抗体又は断片の結合のための試薬、そして ｃ．結合を検出するための手段、 を含む上記キット。
43. ４３．ＮＦＩ遺伝子機能を検出するための検定キットであって、 ａ．ＮＦＩ遺伝子産物が正常に相互作用して検出可能な産物を産生する基賛、 ｂ．基質がＮＦＩ遺伝子産物と相互作用するための試薬、そして ｃ．検出可能な産物を検出するための手段、を含む上記キツト。