JP2002508179A

JP2002508179A - ポリペプチド、ポリヌクレオチド及びその用途

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Publication number: JP2002508179A
Application number: JP2000539133A
Authority: JP
Inventors: ショア・セス・ローレンス; ショア・アナ・マリア
Original assignee: University of Dundee
Current assignee: University of Dundee
Priority date: 1997-12-16
Filing date: 1998-12-15
Publication date: 2002-03-19
Anticipated expiration: 2018-12-15
Also published as: AU1571299A; WO1999031233A1; GB9726539D0; EP1042466A1; US7811789B2; EP1042466B1; JP5099943B2; DE69840550D1; US20080187962A1; US7351810B1; WO1999031233A8

Abstract

(57)【要約】遊走刺激因子（ＭＳＦ）、またはその変体、断片、派生物または融合体、またはその変体、断片または派生物の融合体をコードする組換ポリヌクレオチド。ＭＳＦとフィブロネクチンを判別でき、ＭＳＦまたはフィブロネクチンをコードする組換ポリヌクレオチドを判別できる試薬は開示されている。これらの試薬は、例えば、癌を診断することにおいて有効であると信じられている。ＭＳＦ、またはその変体、断片、派生物または融合体、またはその変体の断片または派生物は、細胞遊走を調節することと創傷治癒とにおいて有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】

本発明はポリペプチドとポリヌクレオチドとその用途、特には遊走刺激因子（
ＭＳＦ）に関する。

【０００２】

【背景の技術】

ＭＳＦは、これまでに次のような報告において示されている。ショー等(１９８８）Ｊ．ＣｅｌｌＳｃｉ. ９０：３９１−３９９において、正常な成人細胞
によっては作られないオートクリン遊走刺激因子を胎児と癌患者の線維芽細胞が
生成することを示している。ショー等（１９８８）Ｊ．ＣｅｌｌＳｃｉ. ９０
：４０１−４０７において、癌患者からの線維芽細胞が胎児と成人の両方に特徴
的な表現型の混合物を提示したことを示している。ショー等（１９８９）Ｉｎ
Ｖｉｔｒｏ２５：７３７−７４６において、胎児と成人癌患者の線維芽細胞によ
って生成された遊走刺激因子（ＭＳＦ）の活性機能を記載しており、またそれが
ヒアルロン酸合成に影響があることを示した。グレイ等（１９８９）Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（米国）８６：２４３８−２４４２において、胎
児及び癌患者の線維芽細胞による遊走刺激因子の精製が示されたが、アミノ酸配
列情報までは提供されていない。それによると、ＭＳＦは分子量が７０ｋＤａで
あると推測されている。ショー及びショー（１９９０）ＣａｎｃｅｒＩｎｖｅ
ｓｔｉｇ．８：６６５−６６７において、遊走刺激活性（ＭＳＦ）の特異性と癌
病原体におけるその役割の証明とが提供されている。ピカード等（１９９１）Ｌ
ａｎｃｅｔ３３７：１３０−１３３において、乳癌患者の血清中に遊走刺激活性
が存在することを示している。エリス等（１９９２）Ｊ．ＣｅｌｌＳｃｉ．１
０２：４４７−４５６において、線維芽細胞の遊走とヒアルロン酸合成における
トランスフォーミング成長因子β１とＭＳＦとのアンタゴニスト的な影響につい
て記載しており、かつ創傷治癒へのつながりの可能性を議論している。ピカード
等（１９９２）Ｅｘｐ．Ｍｏｌ．Ｐａｔｈ．５７：８−２１は、創傷治癒におけ
る遊走刺激因子の検証を示している。アーウィン等（１９９４）Ｊ．Ｃｅｌｌ
Ｓｃｉ．１０７：１３３３−１３４６において、歯茎の線維芽細胞による胎児様
の表現型特性の発現における内部及び対外的異種性を記載しており、創傷治癒の
ための潜在的な重要性についても論じている。ショー等（１９９４）ＩｎｔＪＣａｎｃｅｒ．５９：２５−３２において、乳癌線維芽細胞における異種発現
が記載されており、また肉腫に近接する組織学的に正常な組織からの線維芽細胞
における機能的な変異性についても論じられている。ショー等（１９９１）「細
胞運動性因子（Ｉゴールドバーグ）」ｐｐ．１２７−１４６、Ｂｉｒｋｈａｕ
ｓｅｒＰｒｅｓｓ，Ｂａｓｅｌは、遊走刺激因子（ＭＳＦ）の生成における線
維芽細胞間の異種性を記載しており、また癌の病原性に対する機能についても論
じている。ショー等「細胞行動：粘着と運動性」（Ｇ．エバンス、Ｃ．ウィリー
、Ｒ．ワーム）生物シンポジウム学会、Ｎｏ．４７，ｐｐ．２３４−２５１の中
で、フィブロネクチンのゼラチン結合ドメインにたいするＭＳＦの潜在的機構的
相同性の活動の潜在的様式及び健康及び疾患における機能について記載している
。そこにおいて少量の部分的のアミノ酸が提示されている。しかし、この配列は
フィブロネクチンと似ており、また現在の仕事においてクローンされ配列決定さ
れているＭＳＦには存在しないものである（以下参照）。胎児の線維芽細胞調整
培地から単離されたＭＳＦ活性は、３つのタンパク質から構成され、１つは明ら
かに分子量が１１９ｋＤａであり、２つは分子量が４３及び３３ｋＤａである。
実際には、ＭＳＦはフィブロネクチンのタンパク的分解生成物であり得るとも推
測された。ショー（１９９５）「癌における上皮（mesenchymal）の相互作用」（ＩゴールドバーグとＥローゼン）．ｐｐ２７３−２９６．Ｂｉｒｋｈａｕ
ｓｅｒＰｒｅｓｓ，Ｂａｓｅｌにおいて、腫瘍の進行促進物質としての線維芽
細胞の小集団と遊走遊走因子の潜在的役割とを記載している。また、ショー等（
１９９４）「乳房の腫瘍形成と悪性の進行」ＫｌｕｗｅｒＡｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓディクソン．Ｒとリップマン．Ｍの中でもＭＳＦにつ
いて議論されている。

【０００３】このように、ＭＳＦは大多数の乳癌患者が保持する線維芽細胞によって生成さ
れているが、正常な大人の体ではつくられないと信じられている。それゆえ例え
ば循環血液内、血清または尿の中においてＭＳＦのレベルの測定することは、癌
であるかまたはその疑いあるかの同定において有用であるかもしれないし、癌の
結果を予測するのにも有用であるかもしれない。ＭＳＦ誘導線維芽細胞は、多く
の一般的な上皮腫瘍の患者に存在し、例えばメラノーマや軟線維のサルコーマと
同様に乳房、肺及び大腸のカルチノーマに存在している。

【０００４】特にＭＳＦの測定レベルを乳癌保持者もしくはその可能性がある患者を特定す
る時に用いてもよいし、あるいは癌の結果を予測するのに用いてもよいと信じら
れている。

【０００５】加えて、ＭＳＦは創傷液の試料の多くに存在するので創傷治癒において有用で
あると信じられている。創傷治癒応答の間における線維芽細胞の創傷部位への直
接遊走および粒状繊維におけるヒアルロン酸の転移増加は、ＭＳＦがそれに関係
していることと矛盾しない（ＭＳＦは高分子量種のヒアルロン酸の合成を刺激す
る）。

【０００６】ＭＳＦに対して発現した抗体はフィブロネクチンに結合するので、ＭＳＦはフ
ィブロネクチンと関係することが知られている。

【０００７】フィブロネクチンは広く分布する糖タンパク質であり、組織（３００μｇ／ｍ
ｌ）内または他の体液内においてほとんどの細胞外マトリックスに高い濃度で存
在している。フィブロネクチンは優れた粘着タンパク質であり、遊走を含む細胞
外マトリックスにおける細胞間相互作用の多用な側面を仲介している。その本来
の機能は、成長と創傷治癒の際の細胞遊走において、細胞の成長と分化及び血栓
症の制御と見られる。

【０００８】ＭＳＦは構造的にフィブロネクチンと関係があることは明らかなのだが、ＭＳ
Ｆはフィブロネクチンの分解物なのか破壊された生成物なのかが明らかになって
いないという事実によって、ＭＳＦの理解の進歩が妨害されてきた。

【０００９】我々は、現在発見されているＭＳＦがフィブロネクチンの破壊されたものでは
ないが、それは全く予期せず発現し、種々のフィブロネクチンの「ミニ」継ぎ目
となるということを発見してきた。そのＭＳＦのアミノ酸配列は、本明細書の冒
頭で明らかにしたとおり、フィブロネクチンにおける類似性の無い予測外の部位
において発現している。これはこれまで利用不可能であったが利用可能となりつ
つある測定、同定及び局在化するための方法をつながった。本明細書において初
めて明らかにされたＭＳＦをコードするポリヌクレオチドの有用性は、ＭＳＦ及
び有用なその変体を生成する方法を利用可能にし、かつＭＳＦを特異的に同定し
、測定しかつ局在化する方法をも利用可能にした。

【００１０】

【発明の実施の形態】

本発明における第１の側面は、［配列番号：１］で表されるアミノ酸配列を含
む組換ポリペプチド、またはその変体、断片または融合体、またはその変体、断
片または派生物の融合体を提供することである。

【００１１】図３，４は、ヒト遊走刺激因子（ＭＳＦ）をコードした配列を含むｐＭＳＦ１
αの挿入ｃＤＮＡによってコードされたアミノ酸配列を示している。好ましくは
、アミノ酸配列はほとんどのＮ末端メチオニンとほとんどのＣ末端停止コドン（
Ｘと記されている）の間の配列に基いているものがよい。図３，４に示した部位
１９から６６０間に標識されたｐＭＳＦ１αのアミノ酸配列（すなわちＭＬＲＧ
ＰＧ…と記されたところから始まりＬＧＹと記されたところまでコードしている
）、または断片の変体または融合体またはその派生物またはその変体の融合体ま
たは断片を含むポリペプチドをそのポリヌクレオチドがコードするならば好まし
い。

【００１２】明細書を通じて使われているＭＳＦという用語は、図３，４に示したｐＭＳＦ
１αに標識されるアミノ酸配列、特に部位１９から６６０間に与えられるアミノ
酸配列であるポリペプチドを含むものを意味するものであり、他のものを含めて
意味するものではない。

【００１３】この明細書を通じて、アミノ酸残基とは標準一文字標記または標準三文字標記
を意味する。

【００１４】本発明の組換ポリヌクレオチドは、フィブロネクチンをコードするまたはゼラ
チン結合ドメインのようなフィブロネクチンの断片であるポリヌクレオチドでは
ないと判断されるだろう。むしろ、その断片と変体と派生物は、部位をコードま
たはフィブロネクチンからＭＳＦを判別するＭＳＦの部位であるポリヌクレオチ
ドを含むものであり、それらは下記及び図３，４を参照することによってさらに
詳細に記載される。

【００１５】ポリヌクレオチドはＤＮＡまたはＲＮＡであることが好ましいが、ここではＤ
ＮＡであるとする。ポリヌクレオチドは、イントロンを含むかもしれないし含ま
ないかもしれない。ここではイントロンを含まないものとし、特にそのポリヌク
レオチドはｃＤＮＡであるとする。

【００１６】本発明のポリヌクレオチドは、図１，２に示す［配列番号：１２］で表される
配列のポリヌクレオチドを含むものである。したがって、本発明のポリヌクレオ
チドは［配列番号：１２］を含む。特に、もし本発明のポリヌクレオチドが図１
，２の部位５７から１９８２間の配列であるポリヌクレオチドを含んでいるとす
れば、これはヒトのＭＳＦの配列をコードすると信じられているので特に好まし
い。

【００１７】

【表１】 [配列番号：１２]

【００１８】本発明は、本発明の第１の側面の組換ポリヌクレオチドの断片を含むポリヌク
レオチドを含む。好ましくは、そのポリヌクレオチドが少なくとも１０ヌクレオ
チドの長さである断片を含むポリヌクレオチドであれば好ましく、さらに好まし
くは、長さは少なくとも１８ヌクレオチドがよい。そのようなポリヌクレオチド
はＰＣＲプライマーとして有用である。

【００１９】ポリヌクレオチドの「変体」は、（i）タンパク質の生成に使用可能であるかまたは本明細書に含まれるポリヌクレオチドによってコードされたタンパク質
に特異的に結合する抗体を調整することに使用可能であるタンパク質またはその
断片、または（ii）ポリヌクレオチドまたは（i）で定義したような型の変体に対応するアンチセンス配列である。例えば、異なるコドンは本来のコドン
によってコードするアミノ酸と同じものを置換することができる。置換コドンは
、異なるアミノ酸をコードするためのものであるかもしれないが、その活性また
はそのタンパク質の免疫抗原性の改良またはその他の活性の調節または免疫抗原
性に影響を与えないだろう。例えば、部位指定の突然変異体または他の技術は置
換、挿入及び欠損、および転位による単一または複合突然変異を起こせることが
、ボステインとショートル、「インビトロでの突然変異生成の戦略と応用」，Ｓ
ＣＩＥＮＣＥ，２２９：１９３−２１０（１９８５）によって示されておりそれ
は本明細書に一体に組み込まれている。そのような修飾されたヌクレオチドは本
明細書記載の周知の技術に含まれるものなので、そのような修飾されたヌクレオ
チドは本発明の請求項の範囲に含まれるものである。

【００２０】さらには、本発明のポリヌクレオチド配列（またはその断片）は高度に厳格な
条件下においてハイブリダイズする他のポリヌクレオチド配列を含むことは当然
、当業者に認識されるだろう。そのようなポリヌクレオチドはいくらかのゲノム
ＤＮＡを含んでいる。従って、そのポリヌクレオチドの発明は、本発明の方法に
おけるポリヌクレオチドによって少なくとも５５パーセント、そしてさらに好ま
しくは少なくとも７０パーセント、最も好ましくは９０パーセントの相同性を示
す以下に説明された方法または他の有用性のある少なくともいくつかに使用可能
なポリペプチドをコードした哺乳類のポリヌクレオチドを提供する。それは特に
この実施例において、フィブロネクチンからＭＳＦを判別する１つまたは複数の
部位をコードするポリペプチドであるとする。

【００２１】ＭＳＦはヒト以外の哺乳類においても存在すると信じられている。本発明は、
ラット、マウス、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウサギその他の哺乳類種のＭＳＦをコー
ドするポリヌクレオチドを含んでいる。相同性率は、例えば、ウィスコンシン大学遺伝子コンピュータグループのＧＡ
Ｐプログラムによって決定できる。

【００２２】ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ、ＲＮＡ−ＲＮＡのハイブリダイゼーション
は、０．１×ＳＳＣと６×ＳＳＣとの間で、５５度から７０度の温度における水
溶液中で実行される。高い温度または低濃度ＳＳＣはより厳格なハイブリダイゼ
ーションの条件となることがこの技術分野ではよく知られている。「高度に厳格
」とは、２×ＳＳＣで６５度を含めている。１×ＳＳＣは０．１５Ｍ塩化ナトリ
ウム／０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム塩である。高度に厳格な条件下でハイブ
リダイズしたポリヌクレオチドは請求項の範囲に含まれている。

【００２３】ポリヌクレオチドの「変体」は、また２つのポリヌクレオチドの全体的な相同
性はないだろうが、本発明のポリヌクレオチドの同等の範囲において、それは高
い相同性（少なくとも８０パーセントで好ましくは９０又は９５パーセント）を
有する関連する短い（例えば２０から５０ヌクレオチド）ポリヌクレオチドを含
む。

【００２４】ポリペプチドの「変体」には、挿入、削除、置換、それ以外の保護的なものま
たは非保護的なものを含んでおり、そのような変換はそのＭＳＦの活動を実質的
に変化させることはない。

【００２５】変体とポリヌクレオチドの変体とポリペプチドは、自然変体を含み、対立遺伝
子変体と自然発生の突然変異体を含む。

【００２６】例えば、ピカード等（１９９１）ＴｈｅＬａｎｃｅｔ３３７号，１３０−１
３３で示しているように、ＭＳＦは成人の肌の刺激に基くバイオアッセイで分析
されるだろう。ＭＳＦに対する特異性は、抗ＭＳＦポリクローナル抗体（本明細
で示した）による遊走刺激活性の中和によって示されるかも知れない。ＭＳＦは
ＥＬＩＳＡ及びそのような免疫学的技術を使って分析されても良い。

【００２７】「同類置換」という言葉において、我々はＧｌｙ，Ａｌａ；Ｖａｌ，Ｉｌｅ，
Ｌｅｕ；Ａｓｐ，Ｇｌｕ；Ａｓｎ，Ｇｌｎ；Ｓｅｒ，Ｔｈｒ；Ｌｙｓ，Ａｒｇ；
とＰｈｅ，Ｔｙｒのような組み合わせを含めている。

【００２８】そのような変体にはタンパク質工学の方法と部位指定突然変異生成の方法が使
われることを当業者にはよく知られているだろう。

【００２９】好ましくは、変体またはＭＳＦをコードするポリヌクレオチドの変体は、同じ
条件下における自然のＭＳＦの活性において、少なくとも３０パーセント、好ま
しくは少なくとも５０パーセント、そしてさらに好ましくは７０パーセントが望
ましい。

【００３０】「ＭＳＦの断片」という言葉において、我々は活性を維持するまたは例えば抗
体の培養または結合分析等の他の方法において有用なあらゆる断片を含めている
が、フィブロネクチンの断片であり得るＭＳＦの断片は含まない。

【００３１】「ＭＳＦの融合体」という言葉において、我々は他のすべてのポリペプチドに
融合されたＭＳＦを含めている。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラー
ゼ（ＧＳＴ）またはＭＳＦの精製を容易にするためのタンパク質Ａ、またはＭＳ
Ｆ融合体においていくつかの好ましい特異性をもたらす他のいくつかのポリペプ
チドに融合するようなポリペプチドにプロテインキナーゼが融合されるだろう。
ＭＳＦのすべての変体、断片または派生物の融合体は、本発明の範囲に含まれて
いる。

【００３２】発明の更なる側面は、ＭＳＦをコードする組換ポリヌクレオチド、またはその
変体、断片、派生物またはＭＳＦの融合体、または変体、断片または派生物の融
合体を含んでいる複製可能なベクターを提供する。

【００３３】多様な方法が、ポリヌクレオチド特にＤＮＡを例えば相補結合末端を介してベ
クターに結合させるために改良されてきた。例えば、相補ホモポリマー系はベク
ターＤＮＡに組み込まれたＤＮＡセグメントに加えられる。そのベクターとＤＮ
Ａセグメントは組換ＤＮＡ分子を形成するための相補結合末端の間の水素結合に
よって結合する。

【００３４】人工リンカーは、ＤＮＡセグメントとベクターを結合させる選択的方法によっ
て生成される１つまたはそれ以上の制限部位を含んでいる。初期段階で示された
エンドヌクレアーゼ制限分解によって発生したＤＮＡセグメントは、バクテリオ
ファージＴ４ＤＮＡポリメラーゼまたはエッシュリヒアコリＤＮＡポリメラー
ゼ I 、すなわち３'-５'-エキソヌクレアーゼ活性で３'-１本鎖末端を除去し、ポリメラーゼ活性で３'末端を埋める酵素によって処理される。

【００３５】これらの活性の組み合わせにより平滑末端ＤＮＡセグメントを生じる。その平
滑末端セグメントは、バクテリオファージＴ４ＤＮＡリガーゼのような、平滑末
端ＤＮＡ分子の連鎖反応を触媒できる酵素の過剰量中で、十分に多い量のリンカ
ー分子と共にインキュベートされる。その結果、反応物の生成はＤＮＡセグメン
トをポリメリックリンカー配列の末端に運ぶことになる。これらのＤＮＡセグメ
ントはその際適当な制限酵素によって切断され、それらのＤＮＡセグメントと融
合する末端が生成する酵素で発現ベクターに結合される。

【００３６】多様な制限エンドヌクレアーゼ部位を含んでいる合成リンカーは、Ｉｎｔｅｒ
ｎａｔｉｏｎａｌＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＩｎｃ，ＮｅｗＨａｖ
ｅｎ，ＣＮ，米国を含む多くの提供者により商業上利用可能である。

【００３７】本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを修飾する好ましい手段は、サイキ
等（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２３９，４８７−４９１に示されるように、ポリ
メラーゼチェインリアクションを使うことである。この方法は、例えば適当な制
限部位を生成することによって、ＤＮＡを好ましいベクターに入れる誘導をする
もことが望ましい。また技術的に良く知られたような他の方法を、ＤＮＡを修飾
するために使用しても良い。

【００３８】この方法において、酵素的に増幅されるＤＮＡは、増幅されたＤＮＡに自らが
統合された２つの特異的プライマーによって側面を固められている。その特異的
なプライマーは、技術分野において使用方法が知られている発現ベクターをクロ
ーニングするために使用できる制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含んでいるも
のが望ましい。

【００３９】ＤＮＡ（またはレトロウイルスベクターの場合はＲＮＡ）は、本発明に示され
たものを含むポリペプチドを生成するための最適な宿主において発現される。そ
のポリペプチドをコードするＤＮＡは既知の技術に従って用いられることが望ま
しく、好ましくは本明細書に含まれる指示の観点に限定されて本発明のポリペプ
チドの発現と生成のための適切な宿主細胞に転位する時に使われる発現ベクター
を構成する。そのような技術はＵＳＰ４，４４０，８５９、１９８４年４月３日
発表、ラター等、ＵＳＰ４，５３０，９０１、１９８５年６月２３日発表、ウェ
イスマン、ＵＳＰ４，５８２，８００、１９８６年４月１５日発表、クロウル、
ＵＳＰ４，６７７，０６３、１９８７年５月３０日発表、マーク等、ＵＳＰ４，
６７８，７５１、１９８７年６月７日発表、ゴデル、ＵＳＰ４，７０４，３６２
、１９８７年１１月３日発表、イタクラ等、ＵＳＰ４，７１０，４６３、１９８
７年１２月１日発表、ミュレイ、ＵＳＰ４，７５７，００６、１９８８年６月１
２日発表、トールジュニア等、ＵＳＰ４，７６６，０７５、１９８８年８月２３
日発表、ゴデル等、そして、ＵＳＰ４，８１０，６４８、１９８９年３月７日発
表、ストーカー、これらの全ては引用文献として本明細書に一体として組み込ま
れている。

【００４０】本発明の化合物を構成するポリペプチドをコードするＤＮＡ（あるいはレトロ
ウイルスベクターの場合、ＲＮＡ）は、適切な宿主に導入するための多種多様な
他のＤＮＡ配列に結合されてもよい。コンパニオンＤＮＡは宿主の性質、宿主へ
のＤＮＡの導入方法、およびエピソーマル的に維持される状態または組み込まれ
た状態が好ましいかどうかに依存する。

【００４１】一般に、ＤＮＡは、プラスミドのような発現に関して適したオリエンテーショ
ンおよび正しいリーディングフレームを備えた発現ベクターに挿入される。必要
であれば、ＤＮＡは好ましい宿主によって認識される適切な転写および翻訳調節
操作ヌクレオチド配列に結合されても良いが、そのような操作は、通常、発現ベ
クターを用いることで有効になる。そして、ベクターは標準的な技術をもって宿
主に導入される。一般に、ベクターによって宿主全てが形質転換されるわけでは
ない。それゆえ、形質転換された宿主細胞を選択する必要がある。一つの選択技
術として、何らかの必要な調節要素をもちあわせ、形質転換された細胞において
抗生物質耐性のような選択特性をコードするＤＮＡ配列を発現ベクター中に組み
込むことが考えられる。

【００４２】いずれにしてもそのような選択特性を保持する遺伝子は他のベクターにも存在
し、好ましい宿主細胞を共形質転換するのに用いられる。

【００４３】本発明の組換ＤＮＡによって形質転換されている宿主細胞はそれから十分な時
間、かつ前記ポリペプチドの発現を可能にする本明細書の記載内容を考慮した当
業者に知られる条件下で培養され、その後、回収される。

【００４４】細菌（例えば、エッシェリヒアコリおよびバチラスサブチリス）、酵母（
例えば、サッカロマイセスセレビジア）、糸状菌（例えば、アスペルギラス）
、植物細胞、動物細胞、昆虫細胞を含めた多くの発現システムが知られている。

【００４５】前述のベクターは、たとえベクターが他の細胞タイプ、非原核生物の細胞タイ
プを用いた発現に使用されるとしても、原核生物で増殖するためのＣｏｌＥ１
ｏｒｉのような原核生物のレプリコンを典型的には含んでいる。ベクターはまた
、そこで形質転換されるエッシェリヒアコリのような細菌宿主において遺伝子
の発現（転写および翻訳）を方向付けできる原核生物のプロモーターのような適
切なプロモーターも含むことができる。

【００４６】プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼの結合を許容するとともに転写開始を許
容するＤＮＡ配列によって形成される発現調節要素となる。模範的な細菌宿主に
適合するプロモーター配列は、本発明のＤＮＡセグメントの挿入に有効な制限部
位をもつプラスミドベクターに典型的に備えられている。

【００４７】典型的な原核のベクタープラスミドはｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２
およびＢｉｏｒａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ，米
国）から入手可能なｐＢＲ３２９およびＰｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗ
ａｙ，ＮＪ，米国から入手可能なｐＴｒｃ９９ＡおよびｐＫＫ２２３−３である
。

【００４８】典型的な哺乳動物細胞のベクタープラスミドは、Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓ
ｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，米国から入手可能なｐＳＶＬである。このプラスミドは
クローン化された遺伝子の発現を駆動するため、ＳＶ４０後期プロモーターを使
用し、ＣＯＳ−１細胞のようなＴ抗原合成細胞で高レベルの発現が確認される。

【００４９】誘発性の哺乳動物の発現ベクターの例はｐＭＳＧであり、これもまたＰｈａｒ
ｍａｃｉａから入手可能である。このベクターにおいては、クローン化された遺
伝子の発現を駆動するため、マウスの乳腫瘍ウイルスの長末端反復のグルココル
チノイド誘発性プロモーターを使用する。

【００５０】有効な酵母プラスミドベクターは、ｐＲＳ４０３−４０６およびｐＲＳ４１３−４１６であり、一般にＳｔｒａｔａｇｅｎｅＣｌｏｎｉｎｇＳｙｓｔｅ
ｍｓ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ９２０３７，米国から入手可能である。プラス
ミドｐＲＳ４０３、ｐＲＳ４０４、ｐＲＳ４０５およびｐＲＳ４０６は、酵母組
込みプラスミド（ＹＩｐｓ）であり、酵母を選択するための標識ＨＩＳ、ＴＲＰ
、ＬＥＵおよびＵＲＡを組み込んでいる。プラスミドｐＲＳ４１３−４１６は、
酵母動原体プラスミド（Ｙｃｐｓ）である。

【００５１】種々の宿主細胞を用いた技術において、他のベクターおよび発現系がよく知ら
れている。

【００５２】本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドベクター構築物で形質転換された宿
主細胞に関する。宿主細胞は原核生物あるいは真核生物のいずれかとなりうる。
細菌細胞は、好ましくは原核生物の宿主細胞を用い、典型的には、例えばＢｅｔ
ｈｅｓｄａＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓＩｎｃ．，Ｂｅｔ
ｈｅｓｄａ，ＭＤ，米国から入手可能なエッシェリヒアコリＤＨ５株やおよび
Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，米国（ＮｏＡＴＣＣ３１３４３）のＡｍｅｒｉｃ
ａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手
可能なＲＲ１株のようなエッシェリヒアコリの株である。好ましい真核生物の
宿主細胞は、酵母細胞、昆虫細胞や哺乳類の細胞、好ましくはマウス、ラット、
サルまたはヒトの線維芽細胞および腎臓細胞系のような脊椎動物細胞を含む。酵
母宿主細胞は、一般にＳｔｒａｔａｇｅｎｅＣｌｏｎｉｎｇＳｙｓｔｅｍｓ
，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ９２０３７，米国から入手可能なＹＰＨ４９９、Ｙ
ＰＨ５００およびＹＰＨ５０１を含む。好ましい哺乳動物の宿主細胞は、ＣＣＬ６１としてＡＴＣＣから入手可能なチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細
胞、ＣＲＬ１６５８としてＡＴＣＣから入手可能なＮＩＨＳｗｉｓｓマウス
胚細胞ＮＩＨ／３Ｔ３、ヒトの胚の腎臓細胞であるＣＲＬ１６５０および２９３
細胞としてＡＴＣＣから入手可能なサル腎臓由来のＣＯＳ−１細胞を含む。好ま
しい昆虫細胞は、バキュロウイルス発現ベクターにより遺伝子導入されうるＳｆ
９細胞である。

【００５３】本発明のＤＮＡ構築物を用いた適切な細胞宿主の形質転換は、使用されるベク
ターのタイプに典型的に依存するよく知られた方法によって達成される。原核生
物の宿主細胞の形質転換に関しては、例えば、コーヘン等（１９７２）Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．米国６９，２１１０およびサンブルーク等（１
９８９）ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭ
ａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，
ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮＹ．を参照してもらいたい。酵母細
菌の形質転換はシャーマン等（１９８６）ＭｅｔｈｏｄｓＩｎＹｅａｓｔ
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐ
ｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨ
ａｒｂｏｒ，ＮＹ．に記載されている。ベグス（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ２７
５，１０４−１０９の方法もまた有用である。脊椎動物に関して言えば、そのよ
うな細胞に遺伝子導入するのに有効な試薬、例えばカルシウムフォスフェートお
よびＤＥＡＥデキストリンまたはリポソーム調剤はＳｔｒａｔａｇｅｎｅＣｌ
ｏｎｉｎｇＳｙｓｔｅｍｓ、またはＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＩ
ｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ２０８７７，米国から入手可能であ
る。

【００５４】電気穿孔法もまた、細胞の形質転換および／または細胞への遺伝子導入をする
のに有効であり、酵母細胞、細菌細胞、昆虫細胞や脊椎動物細胞を形質転換する
技術においてよく知られている。

【００５５】例えば、多くの細菌種が、本明細書に一体として組み込まれているルチャンス
キー等（１９８８）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２，６３７−６４６に記載さ
れている方法によって形質転換されてもよい。大多数の形質転換体は、２５μＦ
Ｄでｃｍ当たり６２５０Ｖの条件で２．５×ＰＥＢに懸濁されるＤＮＡ細胞混合
物の前述した電気穿孔法に続いて回収される。

【００５６】電気穿孔法による酵母の形質転換の方法は、ベッカー＆グアレンテ（１９９０
）ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．１９４，１８２に記載されている。

【００５７】うまく形質転換された細胞、すなわち本発明のＤＮＡ構築物を含む細胞はよく
知られる技術によって同定される。例えば、本発明の発現構築物の導入に起因す
る細胞は、本発明のポリペプチドを合成するようになる。細胞は回収および溶菌
され、それら細胞のＤＮＡの中に、サザン（１９７５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．
９８，５０３あるいはベレント等（１９８５）Ｂｉｏｔｅｃｈ．３，２０８に記
載されるような方法を用いて、前記ＤＮＡが存在するか試験される。いずれにし
ても、上清中のタンパク質の存在が後述する抗体を用いて確かめられる。

【００５８】組換ＤＮＡの存在を直接分析するのに加えて、組換ＤＮＡによりタンパク質が
発現されている場合、よく知られる免疫学的な方法によって形質転換が成功して
いるかどうか確かめられる。例えば、発現ベクターによりうまく形質転換された
細胞は適切な抗原性をしめすタンパク質を合成する。

【００５９】形質転換されている懸濁された細胞の試料は回収され、適した抗体を用いてタ
ンパク質が分析される。

【００６０】このように、形質転換された宿主細胞そのものに加えて、本発明はまた、栄養
培地におけるそれら細胞の培養をも意図し、好ましくはモノクローナル（クロー
ン的に均一な）培養、またはモノクローナル培養から派生する培養も意図する。

【００６１】更なる本発明の目的は、ＭＳＦまたはその変体、派生物、断片または融合体ま
たは変体、断片または派生物の融合体の生成の方法を提供し、前記ＭＳＦまたは
変体または断片または派生物または融合体をコードする組換ポリヌクレオチドま
たは複製可能なベクターを含む宿主細胞を培養する事と前記ＭＳＦまたはその変
体、派生物、断片または融合体を単離する事と前記宿主細胞からの融合体または
変体、断片または派生物を単離する事を含む方法を提供することである。

【００６２】宿主細胞を培養する事および組換タンパク質を単離する事の方法は技術的によ
く知られている。宿主細胞に依存するが、合成されるＭＳＦは天然から単離され
るものとは異なると認識される。例えば酵母または細菌細胞のような任意の宿主
細胞はどちらかが、天然から単離されるＭＳＦとは何故か異なって翻訳後修飾さ
れるＭＳＦ形成の合成において引き起こされる翻訳後修飾系を保持し、または異
なる天然から単離されるＭＳＦとは何故か異なって翻訳後修飾されるＭＳＦ形成
の合成において引き起こされる翻訳後修飾系を保持している。

【００６３】組換ＭＳＦは昆虫細胞のような真核生物系において合成されることが好ましい
。

【００６４】本発明の更なる目的は、本明細書に開示されている方法により入手可能なＭＳ
Ｆまたはその変体、断片、派生物または融合体またはその変体、断片または派生
物の融合体を提供することである。

【００６５】本発明の更なる目的は、［配列番号：１］のアミノ酸配列を含むポリペプチド
またはその変体、断片、融合体または派生物またはその変体、断片または派生物
の融合体を提供することである。

【００６６】このように、本発明のポリペプチドは［配列番号：１］を含む。

【００６７】好ましくは、前記ポリペプチドは図３，４に示される標識されたｐＭＳＦ１α
部位１９から６６０間のアミノ酸配列、またはその変体、断片、融合体または派
生物またはその変体、断片または派生物の融合体を含む。

【００６８】本発明のポリペプチドは、フィブロネクチンまたはゼラチン結合ドメインのよ
うなフィブロネクチンの断片ではないと認識されるだろう。好ましくは、断片、
変体および派生物は、ＭＳＦとフィブロネクチンとを判別する部分であって、か
つ以下および図３，４を参照することによってより詳細に記載されているＭＳＦ
の一部分または部分を含むものである。

【００６９】好ましくは、本発明のポリペプチドは遊走刺激因子活性を有するものである。

【００７０】更なる本発明の目的は、ＭＳＦを選択する能力を備える（およびフィブロネク
チンと交差反応しない）抗体およびフィブロネクチンを選択する能力を備える（
およびＭＳＦと交差反応しない）抗体を提供することである。

【００７１】「選択する能力」という言葉において、我々は他のポリペプチド（すなわちＭ
ＳＦ対フィブロネクチン）より少なくとも１０倍以上強く；好ましくは少なくと
も５０倍以上強く、そしてさらに好ましくは少なくとも１００倍以上強くポリペ
プチドに結合する抗体を含んでいる。

【００７２】そのような抗体は、本明細書に開示されるＭＳＦとフィブロネクチン間のアミ
ノ酸配列の違いに関する情報を用い、技術的によく知られている方法によって作
製されてもよい。特に、前記抗体はポリクローナルであってもモノクローナルで
あってもよい。

【００７３】前記したような反応性を有する適切なモノクローナル抗体は、例えば"ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａｍａｎｕａｌｏｆｔｅｃｈｎ
ｉｑｕｅｓ"，Ｈゾラ（ＣＲＣＰｒｅｓｓ，１９８８）および"Ｍｏｎｏｃｌ
ｏｎａｌＨｙｂｒｉｄｏｍａＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ
ａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ"，ＳＧＲヒューレル（ＣＲＣＰｒｅｓｓ，１９８２）に開示されている知られた技術により作製されてもよい。ポリ
クローナル抗体は、多特異性または単一特異性をもって合成されてもよい。それ
ら抗体は単一特異性であることが好ましい。

【００７４】一つの実施例は、フィブロネクチンと反応するのではなく、アミノ酸配列が［
配列番号：１］で表されるポリペプチドまたはその天然変体と反応する抗体を提
供することである。

【００７５】更なる実施例は、フィブロネクチンと反応するのではなく、アミノ酸配列が図
３，４に示される標識されたｐＭＳＦ１α部位１９から６６０間の配列となるポ
リペプチドまたはその天然変体と反応する抗体を提供することである。

【００７６】更なる実施例は、フィブロネクチンに存在するエピトープと反応するのではな
く、アミノ酸配列が図３，４に示される標識されたｐＭＳＦ１αとなるポリペプ
チドまたはその天然変体に存在するエピトープと反応する抗体を提供することで
ある。

【００７７】更なる実施例は、フィブロネクチンに存在するエピトープと反応するのではな
く、アミノ酸配列が［配列番号：１］で表される配列の部位１９から６６０間の
配列となるポリペプチドまたはその天然変体に存在するエピトープと反応する抗
体を提供することである。

【００７８】もし、前記抗体がＭＳＦに存在する[配列番号：２]ＩＳＫＹＩＬＲＷＲＰＶＳＩＰＰＲＮＬＧＹ；または[配列番号：３]ＱＱＷＥＲＴＹＬＧＮＡＬＶＣＴＣＹ
ＧＧＳＲ；または[配列番号：４]ＰＣＶＬＰＦＴＹＮＤＲＴＤＳＴＴＳＮＹＥＱ
ＤＱ；または[配列番号：５]ＴＤＨＴＶＬＶＱＴＲＧＧＮＳＮＧＡＬＣＨ；また
は[配列番号：６]ＶＧＮＧＲＧＥＷＴＣＩＡＹＳＱＬＲＤＱＣＩのペプチドのい
ずれかを含む分子と反応するならば、特に好ましい。下線の引かれたアミノ酸は
、ＭＳＦとフィブロネクチンで異なるアミノ酸を示す。

【００７９】これらペプチドは、抗体を用いたＭＳＦとフィブロネクチンの判別に有効と思
われる図３，４に示されるようなＭＳＦとフィブロネクチン間のアミノ酸配列の
異なる領域を含み、隣接している。

【００８０】更なる実施例は、アミノ酸配列が図３，４に示される標識されたｐＭＳＦ１α
となるポリペプチドまたはその天然変体と反応するのではなく、フィブロネクチ
ンと反応する抗体を提供することである。

【００８１】更なる実施例は、アミノ酸配列が図３，４に示される標識されたｐＭＳＦ１α
部位１９から６６０間の配列となるポリペプチドまたはその天然変体と反応する
のではなく、フィブロネクチンと反応する抗体を提供することである。

【００８２】更なる実施例は、アミノ酸配列が［配列番号：１］で表されるポリペプチドま
たはその天然変体に存在するのではなく、フィブロネクチンに存在するエピトー
プと反応する抗体を提供することである。

【００８３】更なる実施例は、アミノ酸配列が図３，４で示される標識されたｐＭＳＦ１α
の部位１９と部位６６０間の配列となるポリペプチドまたはその天然変体に存在
するのではなく、フィブロネクチンに存在するエピトープと反応する抗体を提供
することである。

【００８４】もし、前記抗体が[配列番号：７]ＱＱＷＥＲＴＹＬＧＮＶＬＶＣＴＣＹＧＧＳ
Ｒまたは[配列番号：８]ＥＰＣＶＬＰＦＴＹＮＧＲＴＦＹＳＣＴＴＥＧＲＱＤＧＨＬＷＣＳＴＴＳＮＹＥＱＤＱまたは[配列番号：９]ＣＴＤＨＴＶＬＶＱＴＱＧ
ＧＮＳＮＧＡＬＣＨまたは[配列番号：１０]ＶＧＮＧＲＧＥＷＴＣＹＡＹＳＱＬ
ＲＤＱＣＩまたは[配列番号：１１]ＩＳＫＹＩＬＲＷＲＰＫＮＳＶＧＲＷＫＥＡまたは図３，４に示されるようなフィブロネクチンにおいて、部位６４８より前
方で派生されるペプチドのいずれかを含む分子と反応するならば、特に好ましい
。下線の引かれたアミノ酸は、フィブロネクチンとＭＳＦで異なるアミノ酸を示
す。

【００８５】これらペプチド自身が抗体として有効であるが、選択能力を備える抗体はＭＳ
Ｆとフィブロネクチンとで異なる領域を含むこれらペプチドより小さな断片を用
いて構成されてもよい。

【００８６】ペプチドが合成される前後で、ペプチドのひとつあるいはそれ以上のアミノ酸
残基が化学的に修飾されても、ペプチドの機能、すなわち生体内での特異的な抗
体を合成する機能は本質的には変わらないままのものとして用いられてよい。そ
のような修飾は、酸あるいは塩基、特に生理的に受け入れられる有機あるいは無
機の酸と塩基による塩の形成、末端カルボキシル基のエステルまたはアミドの形
成、およびＮ−ｔ−ブトキシカルボニルのようなアミノ酸保護基の付着を含む。
そのような修飾はインビボの代謝からペプチドを保護する。ペプチドには単コピ
ーとして、あるいは多重コピーとして、例えば縦列反復が存在してもよい。その
ような縦列あるいは多重反復があれば、抗原自身が担体の使用を防止するには十
分である。Ｎ末端とＣ末端が互いに結合されることによりループが形成されるこ
と、または抗原性を増大させるためおよび／または形成されるべきジスルフィド
結合を許容させるため、ひとつあるいはそれ以上のＣｙｓ残基を末端に付け加え
ることはペプチドにとって有利に働く。ペプチドが担体、好ましくはポリペプチ
ドと共有結合する場合、その配置が非常に好ましいので、本発明のペプチドはそ
のときループを形成する。

【００８７】最近の免疫学的理論によれば、どんな免疫原性の調剤にも免疫系を刺激する、
または免疫系の刺激性を高めるために担体の機能は備えられるとされている。最
良の担体はＴ細胞エピトープである（あるいは、抗原といっしょに創造する）。
前記ペプチドは、例えば架橋による血清アルブミン、ミオグロビン、細菌由来ト
キソイド、キーホルツタノハガイ（Keyhole limpet）ヘモシアニンのような分離担体に関する。Ｔ細胞の免疫応答を誘発するごく最近改良された担体として
は、Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｔｈｙ−Ｔｈ
ｒ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ、β−ガラクトシダーゼおよびインターロイキン−１の１６
３−１７１ペプチドのようなＴ細胞エピトープと思われるＢ型肝炎抗原（ヌクレ
オキャプシドタンパク質とも言われる）を含んでいる。後者の化合物は、担体と
して、あるいはアジュバンドとして、あるいはその両方として様々にみなされて
もよい。いずれにしても、本発明の同じあるいは異なるペプチドいくつかのコピ
ーは、お互いに架橋されてもよい。この場合、そのような分離担体は無いが、担
体機能はそのような架橋により提供されてもよい。適する架橋剤はＳｉｇｍａま
たはＰｉｅｃｅのカタログにおいて例えばグルタルアルデヒド、カルボジイミド
およびスクシニジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボ
キシレートのような試薬を含み、（もし存在するなら）後者の試薬においてはＣ
末端システイン残基の−ＳＨ基を利用する。

【００８８】適切な宿主中において適切なヌクレオチド配列を発現させることによってペプ
チドを調整した場合、そのペプチドを運搬体として働くペプチド配列との融合体
生成物として発現することが有効かもしれない。Ｋａｂｉｇｅｎの「エコシステ
ム」は、そのような装置の例である。

【００８９】本発明のペプチドはおそらく、２重効果をもたらす他の抗原に結合しているか
もしれない。

【００９０】本発明のさらなる側面は、［配列番号：１］記載のアミノ酸配列であるポリペ
プチドまたはその天然変体に反応する抗体及びフィブロネクチンと反応しない抗
体を生成する方法を提供する。この方法は、適切には動物をフィブロネクチンか
らＭＳＦを判別するペプチドにより免疫化すること、及びＭＳＦには結合するが
フィブロネクチンに実質的には結合しない抗体を選択することを含む。適切なペ
プチドは上述の通り開示されている。

【００９１】本発明のさらなる側面は、フィブロネクチンに対しては反応するが、［配列番
号：１］記載のアミノ酸配列のポリペプチドまたはその天然変体に対しては反応
しない抗体を生成する方法を提供する。この方法は、適切にはＭＳＦからフィブ
ロネクチンを判別するペプチドで動物を免疫化すること及びフィブロネクチンに
は結合するが実質的にはＭＳＦに結合しない抗体を選択することを含む。適切な
ペプチドは上述の通り開示されている。

【００９２】抗体技術の進歩により、抗体を生成するために動物を免疫化することはおそら
く必要ではないことが理解されるだろう。ファージディスプレイライブラリーの
ような合成システムが使われても良い。そのようなシステムがこの発明の方法の
範囲内に含まれる。

【００９３】本発明がなされる以前は、ＭＳＦとフィブロネクチンとが十分な構造上の違い
を有することまたはそれらの相違点とは何かが知られていなかったので、ＭＳＦ
とフィブロネクチンとを判別するのに便利な抗体を生成するためにＭＳＦとフィ
ブロネクチンとのアミノ酸配列における違いを使用することは不可能であった。
以下により詳しく議論されるように、そのような抗体は癌の診断に有用である。
しかも、ＭＳＦとフィブロネクチンとを判別するそのような抗体が研究試薬とし
ても有用であるということが理解されるだろう。適切には、本発明の抗体は検出
可能に標識されている、例えばそれらが直接的または間接的に検出されても良い
ような方法で標識されて構わない。便宜上、抗体は放射活性部分または染色部分
または蛍光部分によって標識されて良く、それらは酵素に結合されていても良い
。典型的には、酵素は非染色（または、非蛍光）基質を染色（または、蛍光）生
成物に変換することができるものである。抗体はビオチン（または、ストレプト
アビジン）によって標識されて良く、放射活性部分または染色部分または蛍光部
分またはそのようなもので標識されたストレプトアビジン（または、ビオチン）
を使って間接的に検出されても良い。また、それらは上記のタイプの酵素に結合
されていても良い。

【００９４】ＭＳＦとフィブロネクチンのアミノ酸配列に基づいて、特異的抗体を生成可能
とするペプチドが生成されることが特に好ましい。

【００９５】このため、本発明のさらなる側面は、もし適切ならば動物の免疫化につづいて
、［配列番号：１］の配列であるポリペプチドまたはその天然変体に対しては反
応するがフィブロネクチンに対しては反応しない抗体を発現させることができる
分子を提供する。

【００９６】このため、本発明のさらなる側面は、もし適切ならば動物の免疫化につづいて
、フィブロネクチンに対しては反応するが［配列番号：１］の配列で表されるポ
リペプチドまたはその天然変体に対しては反応しない抗体を発現させることがで
きる分子を提供する。

【００９７】この分子は、好ましくはペプチドであるが所望の抗体を発現するあらゆる分子
でも良い。好ましくはペプチドであるこの分子は、技術上良く知られた方法を使
って薬学的組成物として便宜的に調剤されても良い。

【００９８】上述されたペプチドは、本発明のこれらの側面の一部を形成する。

【００９９】ペプチドは、ルー等（１９８１）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．４６，３４３３及び
ここにおける引用文献として開示されるようなＦｍｏｃ-ｐｏｌｙａｍｉｄｅ法によって合成されてもよい。一時的Ｎ-アミノ基保護は９-フルオレニルメトキシ
カルボニル（Ｆｍｏｃ）基によって行うことができる。この高度に塩基性不安定
な保護基の繰り返し開裂は、Ｎ，Ｎ‐ジメチルホルムアミド中の２０％ピペリジ
ンを使うことによって影響を受ける。側鎖の官能基性は、ブチルエーテル（セリ
ン、トレオニン及びチロシンの場合）、ブチルエステル（グルタミン酸及びアス
パラギン酸の場合）、ブトキシカルボニル派生物（リシン及びヒスチジンの場合
）、トリチル派生物（システインの場合）、４‐メトキシ‐２，３，６‐トリメ
チルベンゼンスルホニル派生物（アルギニンの場合）として保護されて良い。Ｃ
末端がグルタミンまたはアスパラギンであれば、側鎖アミノ酸官能規制を保護す
るために４‐４’‐ジメトキシベンジドリル基が使用される。固相支持体は、ジ
メチルアクリルイミド（バックボーンモノマー）、ビスアクリロイルエチレンジ
アミン（架橋体）及びアクリロイルサルコジンメチルエステル（官能性化試薬）
の三種類のモノマーを成分とするポリジメチル‐アクリルアミドポリマーを基盤
としている。使用されるペプチド‐樹脂間開裂可能結合試薬は、酸性不安定な４
‐ヒドロキシメチル‐フェノキシアセティック酸派生物である。全てのアミノ酸
派生物は、それらの前もって形成されている対称的無水物派生物として付加され
る。ただし、例外としてアスパラギンとグルタミンは逆転Ｎ，Ｎ‐ジシクロヘキ
シル‐カルボジイミド／１‐ヒドロキシベンゾトリアゾール中開カップリング手
法を使って付加される。全てのカップリング及び脱保護反応を、ニンヒドリン、
トリニトロベンゼンスルホン酸またはイソチン試験法を使って監視する。合成の
完了時において、５０％の捕集剤混合物を含有する９５％トリフルオロ酢酸で処
理することによって側鎖保護基の付随的な除去とともに、ペプチドを樹脂支持体
から開裂する。一般に使用される捕集剤は、エタンジチオール、フェノール、ア
ニソール及び水である。それについての正確な選択は合成されるペプチド成分ア
ミノ酸に依存している。粗製ペプチドとなるようにジエチルエーテルとともにす
りつぶしたあとに、トリフルオロ酢酸を真空エバポレーションによって除去する
。全ての存在する捕集剤を、水層の凍結乾燥において捕集剤の無い組成ペプチド
を生成する簡単な抽出手法によって除去する。ペプチド合成のための試薬はほと
んどが、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ‐Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ（ＵＫ）Ｌｔｄ，Ｎｏ
ｔｔｉｎｇｈａｍＮＧ７２ＱＪ，英国から利用可能である。精製は、サイズ
排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー及び（原理的には）逆
相高性能液体クロマトグラフィーのような技術の何れか１つまたはそれらの組み
合わせによって達成されても良い。ペプチドの分析は、薄層クロマトグラフィー
、逆相高性能液体クロマトグラフィー、酸加水分解後のアミノ酸分析及び高速分
子分裂（ＦＡＢ）質量スペクトル分析を使用して実行しても良い。

【０１００】現在は、ＭＳＦとフィブロネクチンとを判別できるポリヌクレオチドを生成す
ることが可能である。そのようなポリヌクレオチドは癌の診断及び予後において
有効であると信じられている。

【０１０１】本発明のさらなる側面は、［配列番号：１］で表される配列のポリペプチドを
コードするポリヌクレオチド及びその天然変体及びフィブロネクチンをコードす
るポリヌクレオチドを判別することができるポリヌクレオチドを提供する。

【０１０２】本発明のさらなる側面は、フィブロネクチンにはハイブリダイズできるが、[ 配列番号：１]で表される配列のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはその天然変体にはハイブリダイズできないポリヌクレオチドを提供する。

【０１０３】本発明のさらなる側面は、[配列番号：１]で表される配列のポリペプチドをコ
ードするポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはその天然変体にハイ
ブリダイズすることができるが、フィブロネクチンをコードするポリヌクレオチ
ドにはハイブリダイズすることができないポリヌクレオチドを提供する。

【０１０４】そのようなポリヌクレオチドは、図１，２，３及び４及び既知のフィブロネク
チンの配列（コーンブリット等、（１９８５）ＥＭＢＯＪ．４，１７５５‐１
７５９）を参考にすることによって設計することができる。そのようなポリヌク
レオチドは、化学合成のような良く知られた方法によってまたは特異なプライマ
ー及びテンプレートを使ったポリメラーゼチェインリアクションのようなＤＮＡ
増幅技術によって合成されても良い。ポリヌクレオチドは、前述のようなＭＳＦ
とフィブロネクチンとをコードするポリヌクレオチドを判別することができるな
らば、ＤＮＡであろうとＲＮＡであろうとまたはペプチド核酸のような合成核酸
であろうと構わないあらゆるポリヌクレオチドで良い。このポリヌクレオチドが
ハイブリダイゼーションプローブとしてまたは核酸増幅システムのためのプライ
マーとして用いることができるオリゴヌクレオチドであれば特に好ましい。その
為、本発明のこの側面のポリヌクレオチドは長さが少なくとも１０ヌクレオチド
、より好ましくは少なくとも１４ヌクレオチドそして更により好ましくは少なく
とも１８ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドであろう。

【０１０５】このポリヌクレオチドがＭＳＦをコードするｍＲＮＡ（またはｃＤＮＡ）には
ハイブリダイズするが、フィブロネクチンをコードするｍＲＮＡ（またはｃＤＮ
Ａ）にはハイブリダイズしないことが特に好ましい。

【０１０６】このポリヌクレオチドがフィブロネクチンをコードするｍＲＮＡ（またはｃＤ
ＮＡ）にはハイブリダイズするが、ＭＳＦをコードするｍＲＮＡ（またはｃＤＮ
Ａ）にはハイブリダイズしないことが特に好ましい。ＭＳＦｃＤＮＡのヌクレオ
チド配列はここに開示されている。フィブロネクチンヌクレオチド配列は知られ
ている（例えば、コーンブリット等、（１９８５）ＥＭＢＯＪ．４，１７５５
‐１７５９を参照）。当業者であれば容易に、この情報に基づいてＭＳＦとフィ
ブロネクチンとのｍＲＮＡとｃＤＮＡとを判別することができるプローブを設計
することができる。ＭＳＦとフィブロネクチンとの違いは、ＭＳＦにおける１型
IIフィブロネクチン繰り返しモジュールからの４５塩基対の欠損、及びＭＳＦに
存在する独特の尾部を含む。

【０１０７】好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは検出可能に標識されている。例えば
、それらが直接または間接的に検出されてもよいような方法でそれらは標識され
て構わない。便宜上は、ポリヌクレオチドは放射性部分または染色部分または蛍
光部分またはその他の適切な検出可能な部分で標識される。ポリヌクレオチドは
酵素に結合されても良い。または、それらはビオチン（または、ストレプトアビ
ジン）に結合されて、本発明の抗体のために記載されたのと類似の方法において
検出されて良い。

【０１０８】本発明のさらなる側面は、癌を診断する方法を提供する。その方法は、診断さ
れるヒト由来の試料において[配列番号：１]で表される配列のポリペプチドまた
はその天然変体または断片の存在を、フィブロネクチンからそのポリペプチドを
分別できる試薬を使って検出することを含む。

【０１０９】本発明のさらなる側面は、癌に対する感受性を決定する方法を提供する。この
方法は、試験されるヒトから得られた試料において、［配列番号：１］に表され
るペプチドまたはその天然変体または断片の存在を、フィブロネクチンからその
ポリペプチドを分離できる試薬を使って検出することを含む。

【０１１０】本発明のさらなる側面は、癌患者に対してあり得る結果を決定する方法を提供
する。その方法は患者由来の試料において、［配列番号：１］に表されるペプチ
ドまたはその天然変体または断片の存在を、フィブロネクチンからそのポリペプ
チドを分離できる試薬を使って検出することを含む。

【０１１１】好ましくは、フィブロネクチンからＭＳＦを分離できる試薬はここにおいて開
示されるような抗体である。試料中の特異的なポリペプチドを検出するための抗
体の使用は良く知られている。例えば、それらは酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳ
Ａ）において使用されて良く、またそれらは組織病理学的分析において使用され
ても良い。ＭＳＦの存在は癌の高い危険性を指摘していると信じられている。

【０１１２】ＭＳＦは、便宜的には血清または尿のような適切な体液中において、または組
織抽出物中において、または患者由来の細胞をインビボで培養するために使用さ
れた培地中において測定されても良い。

【０１１３】ＭＳＦの測定は、これまでに議論されたように多くの癌において有用であると
信じられている。抗体は、免疫局在化により組織切片中におけるＭＳＦを検出す
るために使用されても良い。ＭＳＦ生成線維芽細胞の亜細胞は、通常の成人中に
存在する（アーウィン等（１９９４）Ｊ．ＣｅｌｌＳｃｉｅｎｃｅ１０７，１３
３３‐１３６４；ショール等（１９９４）ｐｐ２７７‐２９８Ｍａｍｍａｒｙ
ＴｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓａｎｄＭａｌｉｇｎａｎｔＰｒｏｇｒｅｓ
ｓｉｏｎにおいて，ディクソン，Ｒ及びリップマン，Ｍ．（編集者）、１９９４
、ＫｌｕｗｅｒＡｃａｄｅｍｉｃＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ。

【０１１４】癌に対する診断または予後、または感受性の決定においてここで記載される方
法を用いて測定されるＭＳＦポリペプチドに限らず、適切な試料中においてＭＳ
ＦｍＲＮＡを検出することは望ましいかもしれないし、またＭＳＦの生成に関
係するフィブロネクチン遺伝子におけるあらゆる変化を検出することも望ましい
かもしれないことが理解されるだろう。ＭＳＦｃＤＮＡまたはフィブロネクチン
遺伝子における突然変異は、技術的に良く知られた方法を使って検出されても良
い。

【０１１５】そのため、本発明のさらなる側面は、癌に対する感受性を決定する方法を提供
する。この方法は、試験されるヒトから得られた試料中において、[配列番号：１]で表される配列のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはその天然変体または断片を、フィブロネクチンをコードするポリヌクレオチドからこの
ポリヌクレオチドを判別することができる試薬を使って検出することを含む。

【０１１６】本発明のさらなる側面は、癌患者に対するあり得る結果を決定する方法を提供
する。この方法は、患者由来の試料中において、［配列番号：１］で表される配
列のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはその天然変体または断片
を、フィブロネクチンをコードするポリヌクレオチドからこのポリヌクレオチド
を判別することができる試薬を使って検出することを含む。

【０１１７】好ましくは、フィブロネクチンをコードするポリヌクレオチドからＭＳＦをコ
ードするポリヌクレオチドを判別することができる試薬は、ここに開示されるよ
うな適切なポリヌクレオチドである。試料中の特異的核酸を検出する方法は学術
的に良く知られている。例えば、ｍＲＮＡを検出するｉｎｓｉｔｕハイブリダ
イゼーション法を使っても良く、ノーザンブロット法を使っても良い。ドットブ
ロット、スロットブロット及びサザンブロットを使用しても良い。

【０１１８】このため、上述の方法において使用された試薬は、癌の診断のための試薬の製
造において使用されても構わない。

【０１１９】（特に、ＭＳＦまたはＭＳＦをコードする核酸を認識するが、フィブロネクチ
ンまたはフィブロネクチンをコードする核酸は認識しない）ＭＳＦとフィブロネ
クチンとを判別できる本発明の抗体及びポリヌクレオチドは、前述の抗体または
ポリヌクレオチド及びその抗体またはポリヌクレオチドを標識するための手段の
ような他の試薬を含有する診断キットに有効に実装できる。

【０１２０】本発明は例えば化学防御及び薬物療法といった多くの診療への応用を含む。

【０１２１】化学防御は、不適切なＭＳＦ生産による癌の危険があると思われる個体におけ
る、ＭＳＦ活性及び／または不適切なＭＳＦ発現の抑制の中和を含む。しかも、
ＭＳＦの阻害因子を投与することも望ましい。ＭＳＦに対する抗体は、阻害因子
として働いても良い。

【０１２２】薬物療法は、不適切なＭＳＦ生産部位に結合するサイトトキシンを標的とする
ための抗ＭＳＦ抗体の使用と、上述のようなＭＳＦ阻害因子の使用とを含む。

【０１２３】抗体標的サイトトキシンは学術的に良く知られている。それは、リシンまたは
毒薬のような直接的細胞毒性部分に結合された抗体、非毒性プロドラッグから毒
性ドラッグに変化できる酵素のような間接的細胞毒性部分に結合された抗体とを
含む。後者の場合、抗体結合酵素に加えてプロドラッグが患者に投与されても良
い。

【０１２４】傷の体液中のＭＳＦを測定することは、この情報を瘢痕の予想を含むその後の
治療過程の効用を予測する条件と関連させても良いので有用である。傷の体液中
のＭＳＦの量は、例えば本発明のＭＳＦ選択的抗体を使って、測定されても良い
。

【０１２５】ＭＳＦの不適切な発現は、慢性関節リュウマチのような炎症に特徴づけられる
いくつかの病理学的な条件の特徴かもしれない。例えば関節液等の関連する体液
中におけるＭＳＦの測定は、診療的には有用であるかもしれない。この文脈にお
いて関連する他の病理学的条件は、繊維症及び歯周病を含む。

【０１２６】ＭＳＦは、細胞、特に線維芽細胞の遊走に関係していると信じられている。特
に、細胞の遊走は創傷内において起こるのであろう。

【０１２７】そのため、本発明のさらなる側面は、細胞遊走を調節する方法を提供する。こ
の方法は、本発明のポリペプチドの効果的な量を細胞遊走の調節が必要とされて
いる部位に投与することを含む。

【０１２８】典型的には、遊走が調節されている細胞は線維芽細胞である。典型的には、Ｍ
ＳＦは、線維芽細胞のような細胞の遊走を刺激する。好ましくは、細胞遊走の調
節が必要とされている部位は、ウマ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ及びその
ようなものの体のような哺乳類の体内である。最も好ましくは、その部位はヒト
の体内である。体内の部位は創傷部位であれば好ましい。

【０１２９】本発明のさらなる側面は、創傷を治療する方法を提供する。この方法は、創傷
の局所に本発明のポリペプチドの効果的な量を投与することを含む。

【０１３０】本発明は、瘢痕が生じ得ると思われる局所的部位にここにおいて記載されたよ
うなＭＳＦポリペプチドまたは適切な断片または変体の効果的な量を投与するこ
とによって、瘢痕となることを防ぐ方法を提供する。瘢痕となることを防ぐこと
または低下させることは、創傷治癒過程の一部となるだろう。ここにおいて記載
されるようなＭＳＦポリペプチドまたは適切な断片または変体は、それがヒアル
ロン酸形成を低下させるので、瘢痕となることを防ぐことまたは低下させること
において有用であると信じられている。

【０１３１】投与されたペプチドが真核生物宿主において発現された組み換えポリペプチド
であれば好ましい。

【０１３２】ＭＳＦポリペプチドは、あらゆる適切な手段により細胞遊走部位または創傷治
癒部位に投与されて良い。便宜的には、ポリペプチドは局所的に投与される。ペ
プチドがコラーゲンメッシュのような用いられる包帯に取りこまれているならば
特に好ましい。

【０１３３】本発明のポリペプチドの組み込みに適切な包帯は、学術的に良く知られている
。その多くは商業的に利用可能である。

【０１３４】他の調剤は、ＭＳＦの局所的な使用のために作成された軟膏、ペースト、ゲル
及びクリーム（または同様のもの）への組込みを含むだろう。

【０１３５】調剤は、便宜的には単位投与形態においてであって良いし、製剤業の技術分野
において良く知られたあらゆる方法によって調整されても良い。そのような方法
は、活性成分（本発明のポリペプチド）を一つまたはそれ以上の補助成分からな
る運搬体と関連付けるステップを含む。一般的に調剤は、活性成分を液体運搬体
または微細に分割された固体運搬体またはその両方と一律にかつ個人的に関連付
け、最終的に必要ならば生成物を成形することによって調整される。

【０１３６】経口投与に適した本発明に従った調剤は、カプセル、カシェットまたはタブレ
ットのような断続的単位として出されるかもしれない。そのそれぞれは、予め決
められた量の活性試薬を、粉末または顆粒として、または水生液体または非水溶
性液体中の溶液または懸濁液として、またはｏｉｌ‐ｉｎ‐ｗａｔｅｒ液体乳化
物またはｗａｔｅｒ‐ｉｎ‐ｏｉｌ液体乳化物として含有する。活性成分は、巨
丸剤、舐剤またはペーストとしてであっても良い。

【０１３７】口内の局所投与に適した調剤は、通常スクロース及びアカシアまたはトラガカ
ンスといった香料ベース中に活性成分を含むロゼンジ、ゼラチン及びグリセリン
またはスクロースまたはアカシアのような不活性ベース中に活性成分を含むトロ
ーチ及び適切な液体運搬対中に活性成分を含むうがい薬を含む。

【０１３８】特に上述された成分に加えて、本発明の調剤は、疑義あるも調剤のタイプに関
連する技術分野において従来からある他の試薬を含んでも良い。例えば経口投与
に適したそれらの試薬は香味試薬を含んでも良い。

【０１３９】遺伝子治療技術への応用には、ＭＳＦ発現を操作する手段を提供するかもしれ
ない。

【０１４０】本発明のポリペプチドのあらゆる適切な量が投与されても良い。「適切な量」
という言葉によって、我々は所望の生物学的応答を与え、かつ毒性またはそのよ
うなあらゆる甚大な好ましくない効果を導くことの無い量を含めている。例えば
１μｇ未満といった少量のＭＳＦが効果的かもしれない。皮膚の創傷のような特
定の創傷が、本発明の方法によって治療されるならば好ましい。

【０１４１】本発明は、以下の図及び実施例を参照することにより更に詳細に記述されるで
あろう。ここにおいて、図１，２は、ＭＳＦｃＤＮＡを含有するクローンｐＭＳＦ１α
中への挿入２．１ｋｂ全ヌクレオチド配列を示している。開始及び終止コドンに
下線が引かれている。

【０１４２】図３，４には、図１，２に示されるｃＤＮＡ配列の翻訳とフィブロネクチンの
ゼラチン結合ドメインの配列を有するペプチド配列が配置されている。ＭＳＦの
開始と終結部位は、垂直線と矢印によって特定されている。

【０１４３】図５は、そのドメインにかかるＭＳＦ（ｐＭＳＦ１αクローン中にコードされ
るような）ペプチド配列を示す。ｐＭＳＦ１αの配列は、そのドメイン（コーン
ブリット等（１９８５）ＥＮＢＯＪ．４，１７５５‐１７５９からフィブロネク
チンの分析を参照されたい）に関してグループ化されて示されている。残基は番
号づけられてまたギャップ（＾によって示される）の導入により相同性を最大化
するために並べ替えられた。相同型内の相同残基はボックス（Ａ）で表されてい
る。終止コドンはアスタリスク（＊）によって表されている。欠失アミノ酸は点
線（‐）によって表されている。ＩＧＤＳ配列には下線が引かれている。

【０１４４】図６は、フィブロネクチンとＭＳＦの図による比較を示している。

【０１４５】図７は、ドメイン内のＩＧＤ含有配列（すなわち、ＩＧＤＴ，ＩＧＤＳ及びＩ
ＧＤＱ）部位を示している図によるＭＳＦのモデルを示している。

【０１４６】例１：ＭＳＦをコードするクローンであるｐＭＳＦ１αのクローニング及び配
列分析ｃＤＮＡライブラリーを、ヒト胎児線維芽細胞セルラインであるＭＲＣ５‐Ｓ
Ｖ２から抽出されたｍＲＮＡを使って、ベクターガンマＺａｐII中に構築した。

【０１４７】１．２ｋｂの断片を増幅するためのポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣ
Ｒ）において、フィブロネクチンのゼラチン結合ドメイン（ＧＢＤ）由来のペプ
チド配列に基づいたプライマーを、ベクタープライマーとともに使用した。配列
分析によると、ほとんどの断片に対してＧＢＤに対する強い相同性を示した。明
らかな相違には４５塩基対の内部欠損及び１７５塩基対の３’末端の独特の配列
を含む。

【０１４８】３’ユニーク配列は、ジゴキシゲニン標識システムを使った、ライブラリーを
スクリーニングするためのプローブとして使用された。クローンされた挿入部位
を含有するｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（商標）ファージミドのインビボでの切り出
し後に、陽性溶菌斑が第２及び第３のスクリーニングのために採取された。

【０１４９】ｐＭＳＦ１αと名づけられた２．１ｋｂの挿入を有するプラスミドが、先進プ
ライミングアプローチを使ったサンガージオキシ法によって配列決定された。そ
の配列は、Ｄａｒｅｓｂｕｒｙ／ＳｅｑｎｅｔシリーズプログラムのＦｒａｇｍ
ｅｎｔＡｓｓｅｍｂｌｙＳｙｓｔｅｍを使って、単一の内容に組み立てられ
た。

【０１５０】２．１ｋｂ断片の全ヌクレオチド配列を図１，２に示す。

【０１５１】フィブロネクチンのゲラチン結合ドメインの配列を有するペプチド配列のこの
配列及び配置の翻訳は、Ｆａｓｔａプログラム（Ｄａｒｅｓｂｕｒｙ／Ｓｅｑｎ
ｅｔ）を使って完成され、図３，４に示されている。

【０１５２】図５は、そのドメインに関してグループ化されたｐＭＳＦ１αのペプチド配列
を示している。

【０１５３】ＭＳＦをコードする他のｃＤＮＡクローンは、容易に手に入るだろうし、また
技術的に良く知られた方法及び図１，２の配列から得られるプローブ、特にフィ
ブロネクチンからＭＳＦを判別するプローブを使って配列決定されるだろう。

【０１５４】例２：通常の胸部細胞ではなく、乳癌の断片中のＭＳＦ分泌線維芽細胞の存在
の実証ＭＳＦの独特のＣ末端に対する独特のコーディング領域に基づいたリボプロー
ブを使ったｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーションが、通常の胸部細胞ではなく
、乳癌の断片中のＭＳＦ分泌線維芽細胞の存在を実証した。

【０１５５】適切なリボプローブは、ＭＳＦ１α（部位１９５３‐２１４７）の独特な全ヌ
クレオチド配列を含有し、それは１０塩基上流までは含有していても良いしかつ
フィブロネクチン配列（部位１９４３‐２１５２）の内に含まれる。これは、よ
り長いプローブの使用を可能にするにもかかわらず、ＭＳＦ１αにたいする高い
特異性を確実なものとする。独特の配列（部位１９７４‐２１４７）の主要部分
を含有するジゴキセゲニン標識されたリボプローブが使用される。この領域は、
便利な制限部位の部位に基づいて選択される。

【０１５６】例３：ＭＳＦに特異的であるがフィブロネクチンと交差反応することは無いモ
ノクローナル抗体現在利用可能な標準的な方法のいくつかを使用して、モノクローナル抗体を引
き出した。その免疫原は、ＭＳＦの１０アミノ酸の独特なテイルに基づく合成ペ
プチドまたは［配列番号：２］ＩＳＫＹＩＬＲＷＲＰＶＳＩＰＰＲＮＬＧＹまた
は［配列番号：３］ＱＱＷＥＲＴＹＬＧＮＡＬＶＣＴＣＹＧＧＳＲまたは［配列
番号：４］ＥＰＣＶＬＰＦＴＹＮＤＲＴＤＳＴＴＳＮＹＥＱＤＱまたは［配列番
号：５］ＣＴＤＨＴＶＬＶＱＴＲＧＧＮＳＮＧＡＬＣＨまたは［配列番号：６］
ＶＧＮＧＲＧＥＷＴＣＩＡＹＳＱＬＲＤＱＣＩで表されるペプチド配列に基づく
ものである。

【０１５７】例４：ゲノムＰＣＲ及びＦＩＳＨ研究目的：（i）フィブロネクチンとの関係、及び（ii）染色体上の配座に関係するゲノムＭＳＦ遺伝子配列に間する情報を得ること。

【０１５８】背景：クローンされたＭＳＦｃＤＮＡの５’上流非翻訳配列はフィブロネクチ
ンと相同的である。それはフィブロネクチン遺伝子との緊密な関係を強く主張す
る（注記：選択圧が無いので、上流非翻訳領域などは２つの遺伝子間で相同であ
ることは実質的にあり得ない。この推論は、１０アミノ酸をコードするＭＳＦｃ
ＤＮＡの３’末端の「独特性」と明らかに衝突するし、いくつかの停止コドンを
含有する隣接する非翻訳領域を有する。）

【０１５９】方法及び結果：２つのＰＣＲ反応が確立された：一つは、フィブロネクチン（
ＦＮ）／ＭＳＦの末端５’非翻訳領域におけるものであり、他方は１７５塩基対
の独特の配列を方向付けたＭＳＦの末端３’領域におけるものである。Ｑｉａｇ
ｅｎ血液キットを使用して精製されたＤＮＡを使って反応を行った。結果として
得られたアプリコンの配列分析は、１７５塩基対の「独特」の配列がフィブロネ
クチン配列と隣接しているということを明らかにした。

【０１６０】３’末端の独特の配列のゲノムにおける位置に関する初期情報を得るために、
実験を行った。上述の２ＰＣＲアプローチを使ってヒトＰＡＣライブラリー（Ｈ
ＧＭＰから得られた）由来のクローンを選択することによってこの実験を行った
。両ＰＣＲ反応から生成物の生成において、第２及び第３のスクリーニングによ
り同定を行った。このクローンはほぼ７０から１１０ｋｂのサイズであった。

【０１６１】単離されたクローンは次に制限分解の対象とされた（ＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩ
により）。その断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中にサブクローンし、我々の２Ｐ
ＣＲアプローチを使って分析した。２つの陽性クローンが同定された：クローン
Ｂ３（２）は２０ｋｂであり、５’及び３’末端フラグメントの両方を生成でき
る。これによって、それが全ＭＳＦ遺伝子配列を含むものであるということを示
している。その他のクローンであるＫ５（５）は７ｋｂであり、３’末端の独特
の配列を含むのみである。

【０１６２】我々は、ヒトゲノムのＦＩＳＨ分析において両クローンを使ってきた。我々の
データは、明らかにＭＳＦが第２染色体の領域ｑ３５にマッピングされることを
示している。注記：これは、第２染色体ｑ３４から３６に座位するフィブロネク
チン遺伝子内に有している。

【０１６３】結果：ＦＩＳＨ分析は、明らかにＭＳＦの独特の配列をコードする遺伝子がフ
ィブロネクチン遺伝子内に含まれていることを示している。これらの結果は、Ｍ
ＳＦがフィブロネクチンの新規な小さなスプライシング変体であることを示して
いる。ゲノムフィブロネクチン遺伝子はとても大きく、かつまだ十分には配列決
定されていない。我々が知る限りでは、これはこの独特の配列に関する最初のレ
ポートである。これまでに同定されたすべてのフィブロネクチンのアイソフォー
ム（それらはＭＳＦにおける７０ｋＤａに対して２２０ｋＤａ以上である）にお
ける独特の配列の不存在は、それがそれらの分子からスプライシングされたもの
であることを示している。

【０１６４】この情報はいくつかの理由に関連している。第１に、これまでに記載されたフ
ィブロネクチンの全てのスプライスされた変体は、たった７０ｋＤａの分子量の
ＭＳＦに対して２２０ｋＤａの範囲の分子量を有している。この小さなサイズは
、全体として予想外であり、我々にＭＳＦをフィブロネクチンの新規なミニスプ
ライス変体と思われる。第２に、全ての既知のフィブロネクチンのスプライス変
体は、IIIＣＳ領域の可変領域または全３型繰り返しの（あらゆる既知のスプライス部位を含まないＭＳＦの終端の相当離れた下流において起こる全ての）含有
／欠損に関係している。最後に、ＭＳＦの３’末端配列は同定されていないので
、上記情報がゲノムＤＮＡから得られるまではＭＳＦが本当にフィブロネクチン
のスプライス変体であることを予測することは不可能であった。

【０１６５】例５：組換えＭＳＦ発現目的：３Ｔ３細胞において組換えヒトＭＳＦ（ｒｈＭＳＦ）を発現すること

【０１６６】方法及び結果：Ｌｉｐｆｅｃｔａｍｉｎｅ／Ｐｌｕｓシステム（Ｇｉｂｃｏ）
を製造による説明書に基いて使用して、３Ｔ３細胞を形質転換した。使用された
プラスミドはｐｃＤＮＡ３．１／ｈｉｓＢ／ｌａｃＺである。融合タンパク質が
ｈｉｓテイルとともに発現されるように、挿入配列はヒトＭＳＦｃＤＮＡ配列に
融合されたｈｉｓテイルをコードする配列を含んでいた。これは、発現タンパク
質の精製を促進した。形質転換体は、４１８を含有する培地中においてそれらの
選択成長により単離された。形質転換体によって生成された１リットルの調整培
地を回収した。遊走刺激活性を有する全ての断片が、０−２０％硫酸アンモニウ
ム沈殿を行うことによって得られた。そのペレットを緩衝溶液中に再懸濁した。
ｈｉｓ標識されたｒｈＭＳＦは、ＰｒｏＢｏｎｄｃｏｌｕｍｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏ
ｇｅｎ）カラムを通して精製された。それら全ては、製造者による説明書に基い
て行われた。ほぼ２５０μグラムのｒｈＭＳＦが初期物質から回収された。その
精製されたタンパク質はＳＤＳＰＡＧＥにおいてほぼ７０ｋＤａの位置に一本の
バンドとなった。このタンパク質は、標的の成人の線維芽細胞の遊走を刺激し、
１ｐｇ／ｍｌから１０ｎｇ／ｍｌの濃度範囲において活性であった（すなわち、
胎児線維芽細胞調整培地から精製されたＭＳＦの投与応答に関するこれまでに出
版された情報との正確な一致において）。

【０１６７】例６：坑ＭＳＦ抗体生成物目的：ＭＳＦに対するポリクローナル抗体を生成すること

【０１６８】方法：ＭＳＦのＣ末端に基いた１５マーの合成ペプチドで、ウサギを免疫化し
た：注記：これは全部で１０アミノ酸の独特の配列と隣接するフィブロネクチン
の５アミノ配列とを含んでいる。この合成ペプチドはキーホールツタノハガイヘ
モシアニン（ＫＬＨ）運搬体に共有結合されており、以下の手法で２匹のウサギ
を免疫化するのに使われた：１０ｍｇの第１の注射から３週間後に、５ｍｇの第
２の注射をした。第１の注射から６週間後に血清が回収された。生成されたＩｇ
Ｇがドット及びウェスタンブロットの両方において合成ペプチドを認識するため
に示された。

【０１６９】結果：我々は、ウェスタンブロット及び免疫組織化学の両方に対して抗体を使
用した。前者の利用は、（１）抗体によってｒｈＭＳＦが認識されることが確か
め、（２）成人ではなく胎児の線維芽細胞が抗体によって認識されかつＰＡＧＥ
ゲルからの流出時に遊走刺激活性を発現する７０ｋＤａの分子を生産することを
実証した。

【０１７０】１０アミノ酸の「独特」のＭＳＦＣ末端配列を組み込んでいる合成ペプチドに
対して、ポリクローナル坑体が生成された。この抗体はその独特の合成ペプチド
（５ｎｇ以下）及びドットブロットにおいてＭＳＦ（１０ｎｇ以下）を認識する
。したがって、それは４μｇまでの濃度ではフィブロネクチン又はＢＳＡを認識
しない。この抗体は、ＭＳＦの組織分布を調べるために使用された。これらの実
験は、ＭＳＦが胎児の皮膚の基質において存在するが成人の皮膚においては検出
できないことを示している。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の遺伝子配列を示す図である。

【図２】図１に示す遺伝子配列の続きを示す図である。

【図３】ＭＳＦ−１αとフィブロネクチンのペプチド配列を示す図である。

【図４】図３に示すＭＳＦ−１αとフィブロネクチンのペプチド配列の続きを示す図で
ある。

【図５】ドメイン内のＩＧＤ含有配列（すなわち、ＩＧＤＴ，ＩＧＤＳ及びＩＧＤＱ）
部位を示す図である。

【図６】ドメイン内のＩＧＤ含有配列（すなわち、ＩＧＤＴ，ＩＧＤＳ及びＩＧＤＱ）
部位を示す図である。

【図７】ドメイン内のＩＧＤ含有配列（すなわち、ＩＧＤＴ，ＩＧＤＳ及びＩＧＤＱ）
部位を示す図である。

【配列表】

<110> University of Dundee <120> Polypeptides, polynucleotides and uses thereof <130> DUNWp20111pc <160> 27 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210>１ <211> 660 <212> PRT <213> h. sapiens <400> Asn Leu Val Ala Thr Cys Leu Pro Val Arg Ala Ser Leu Pro His Arg 1 5 10 15 Leu Asn Met Leu Arg Gly Pro Gly Pro Gly Leu Leu Leu Leu Ala Val 20 25 30 Gln Cys Leu Gly Thr Ala Val Pro Ser Thr Gly Ala Ser Lys Ser Lys 35 40 45 Arg Gln Ala Gln Gln Met Val Gln Pro Gln Ser Pro Val Ala Val Ser 50 55 60 Gln Ser Lys Pro Gly Cys Tyr Asp Asn Gly Lys His Tyr Gln Ile Asn 65 70 75 80 Gln Gln Trp Glu Arg Thr Tyr Leu Gly Asn Ala Leu Val Cys Thr Cys 85 90 95 Tyr Gly Gly Ser Arg Gly Phe Asn Cys Glu Ser Lys Pro Glu Ala Glu 100 105 110 Glu Thr Cys Phe Asp Lys Tyr Thr Gly Asn Thr Tyr Arg Val Gly Asp 115 120 125 Thr Tyr Glu Arg Pro Lys Asp Ser Met Ile Trp Asp Cys Thr Cys Ile 130 135 140 Gly Ala Gly Arg Gly Arg Ile Ser Cys Thr Ile Ala Asn Arg Cys His 145 150 155 160 Glu Gly Gly Gln Ser Tyr Lys Ile Gly Asp Thr Trp Arg Arg Pro His 165 170 175 Glu Thr Gly Gly Tyr Met Leu Glu Cys Val Cys Leu Gly Asn Gly Lys 180 185 190 Gly Glu Trp Thr Cys Lys Pro Ile Ala Glu Lys Cys Phe Asp His Ala 195 200 205 Ala Gly Thr Ser Tyr Val Val Gly Glu Thr Trp Glu Lys Pro Tyr Gln 210 215 220 Gly Trp Met Met Val Asp Cys Thr Cys Leu Gly Glu Gly Ser Gly Arg 225 230 235 240 Ile Thr Cys Thr Ser Arg Asn Arg Cys Asn Asp Gln Asp Thr Arg Thr 245 250 255 Ser Tyr Arg Ile Gly Asp Thr Trp Ser Lys Lys Asp Asn Arg Gly Asn 260 265 270 Leu Leu Gln Cys Ile Cys Thr Gly Asn Gly Arg Gly Glu Trp Lys Cys 275 280 285 Glu Arg His Thr Ser Val Gln Thr Thr Ser Ser Gly Ser Gly Pro Phe 290 295 300 Thr Asp Val Arg Ala Ala Val Tyr Gln Pro Gln Pro His Pro Gln Pro 305 310 315 320 Pro Pro Tyr Gly His Cys Val Thr Asp Ser Gly Val Val Tyr Ser Val 325 330 335 Gly Met Gln Trp Leu Lys Thr Gln Gly Asn Lys Gln Met Leu Cys Thr 340 345 350 Cys Leu Gly Asn Gly Val Ser Cys Gln Glu Thr Ala Val Thr Gln Thr 355 360 365 Tyr Gly Gly Asn Ser Asn Gly Glu Pro Cys Val Leu Pro Phe Thr Tyr 370 375 380 Asn Asp Arg Thr Asp Ser Thr Thr Ser Asn Tyr Glu Gln Asp Gln Lys 385 390 395 400 Tyr Ser Phe Cys Thr Asp His Thr Val Leu Val Gln Thr Arg Gly Gly 405 410 415 Asn Ser Asn Gly Ala Leu Cys His Phe Pro Phe Leu Tyr Asn Asn His 420 425 430 Asn Tyr Thr Asp Cys Thr Ser Glu Gly Arg Arg Asp Asn Met Lys Trp 435 440 445 Cys Gly Thr Thr Gln Asn Tyr Asp Ala Asp Gln Lys Phe Gly Phe Cys 450 455 460 Pro Met Ala Ala His Glu Glu Ile Cys Thr Thr Asn Glu Gly Val Met 465 470 475 480 Tyr Arg Ile Gly Asp Gln Trp Asp Lys Gln His Asp Met Gly His Met 485 490 495 Met Arg Cys Thr Cys Val Gly Asn Gly Arg Gly Glu Trp Thr Cys Ile 500 505 510 Ala Tyr Ser Gln Leu Arg Asp Gln Cys Ile Val Asp Asp Ile Thr Tyr 515 520 525 Asn Val Asn Asp Thr Phe His Lys Arg His Glu Glu Gly His Met Leu 530 535 540 Asn Cys Thr Cys Phe Gly Gln Gly Arg Gly Arg Trp Lys Cys Asp Pro 545 550 555 560 Val Asp Gln Cys Gln Asp Ser Glu Thr Gly Thr Phe Tyr Gln Ile Gly 565 570 575 Asp Ser Trp Glu Lys Tyr Val His Gly Val Arg Tyr Gln Cys Tyr Cys 580 585 590 Tyr Gly Arg Gly Ile Gly Glu Trp His Cys Gln Pro Leu Gln Thr Tyr 595 600 605 Pro Ser Ser Ser Gly Pro Val Glu Val Phe Ile Thr Glu Thr Pro Ser 610 615 620 Gln Pro Asn Ser His Pro Ile Gln Trp Asn Ala Pro Gln Pro Ser His 625 630 635 640 Ile Ser Lys Tyr Ile Leu Arg Trp Arg Pro Val Ser Ile Pro Pro Arg 645 650 655 Asn Leu Gly Tyr 660 <210> 2 <211> 20 <212> PRT <213> h. sapiens <400> ＩＳＫＹＩＬＲＷＲＰＶＳＩＰＰＲＮＬＧＹ <210> 3 <211> 21 <212> PRT <213> h. sapiens <400> ＱＱＷＥＲＴＹＬＧＮＡＬＶＣＴＣＹＧＧＳＲ <210> 4 <211> 24 <212> PRT <213> h. sapiens <400> ＥＰＣＶＬＰＦＴＹＮＤＲＴＤＳＴＴＳＮＹＥＱＤＱ <210> 5 <211> 21 <212> PRT <213> h. sapiens <400> ＣＴＤＨＴＶＬＶＱＴＲＧＧＮＳＮＧＡＬＣＨ <210> 6 <211> 21 <212> PRT <213> h. sapiens <400> ＶＧＮＧＲＧＥＷＴＣＩＡＹＳＱＬＲＤＱＣＩ <210> 7 <211> 21 <212> PRT <213> h. sapiens <400> ＱＱＷＥＲＴＹＬＧＮＶＬＶＣＴＣＹＧＧＳＲ <210> 8 <211> 39 <212> PRT <213> h. sapiens <400> ＥＰＣＶＬＰＦＴＹＮＧＲＴＦＹＳＣＴＴＥＧＲＱＤＧＨＬＷＣＳＴＴＳＮＹＥ
ＱＤＱ <210> 9 <211> 21 <212> PRT <213> h. sapiens <400> ＣＴＤＨＴＶＬＶＱＴＱＧＧＮＳＮＧＡＬＣＨ <210> 10 <211> 21 <212> PRT <213> h. sapiens <400> ＶＧＮＧＲＧＥＷＴＣＹＡＹＳＱＬＲＤＱＣＩ <210> 2 <211> 20 <212> PRT <213> h. sapiens <400> ＩＳＫＹＩＬＲＷＲＰＫＮＳＶＧＲＷＫＥＡ <210> 12 <211> 2147 <212> DNA <213> h. sapiens <400> caaacttggt ggcaacttgc ctcccggtgc gggcgtctct cccccaccgt ctcaacatgc 60 ttaggggtcc ggggcccggg ctgctgctgc tggccgtcca gtgcctgggg acagcggtgc 120 cctccacggg agcctcgaag agcaagaggc aggctcagca aatggttcag ccccagtccc 180 cggtggctgt cagtcaaagc aagcccggtt gttatgacaa tggaaaacac tatcagataa 240 atcaacagtg ggagcggacc tacctaggca atgcgttggt ttgtacttgt tatggaggaa 300 gccgaggttt taactgcgag agtaaacctg aagctgaaga gacttgcttt gacaagtaca 360 ctgggaacac ttaccgagtg ggtgacactt atgagcgtcc taaagactcc atgatctggg 420 actgtacctg catcggggct gggcgaggga gaataagctg taccatcgca aaccgctgcc 480 atgaaggggg tcagtcctac aagattggtg acacctggag gagaccacat gagactggtg 540 gttacatgtt agagtgtgtg tgtcttggta atggaaaagg agaatggacc tgcaagccca 600 tagctgagaa gtgttttgat catgctgctg ggacttccta tgtggtcgga gaaacgtggg 660 agaagcccta ccaaggctgg atgatggtag attgtacttg cctgggagaa ggcagcggac 720 gcatcacttg cacttctaga aatagatgca acgatcagga cacaaggaca tcctatagaa 780 ttggagacac ctggagcaag aaggataatc gaggaaacct gctccagtgc atctgcacag 840 gcaacggccg aggagagtgg aagtgtgaga ggcacacctc tgtgcagacc acatcgagcg 900 gatctggccc cttcaccgat gttcgtgcag ctgtttacca accgcagcct cacccccagc 960 ctcctcccta tggccactgt gtcacagaca gtggtgtggt ctactctgtg gggatgcagt 1020 ggctgaagac acaaggaaat aagcaaatgc tttgcacgtg cctgggcaac ggagtcagct 1080 gccaagagac agctgtaacc cagacttacg gtggcaactc aaatggagag ccatgtgtct 1140 taccattcac ctacaacgac aggacggaca gcacaacttc gaattatgag caggaccaga 1200 aatactcttt ctgcacagac cacactgttt tggttcagac tcgaggagga aattccaatg 1260 gtgccttgtg ccacttcccc ttcctataca acaaccacaa ttacactgat tgcacttctg 1320 agggcagaag agacaacatg aagtggtgtg ggaccacaca gaactatgat gccgaccaga 1380 agtttgggtt ctgccccatg gctgcccacg aggaaatctg cacaaccaat gaaggggtca 1440 tgtaccgcat tggagatcag tgggataagc agcatgacat gggtcacatg atgaggtgca 1500 cgtgtgttgg gaatggtcgt ggggaatgga catgcattgc ctactcgcag cttcgagatc 1560 agtgcattgt tgatgacatc acttacaatg tgaacgacac attccacaag cgtcatgaag 1620 aggggcacat gctgaactgt acatgcttcg gtcagggtcg gggcaggtgg aagtgtgatc 1680 ccgtcgacca atgccaggat tcagagactg ggacgtttta tcaaattgga gattcatggg 1740 agaagtatgt gcatggtgtc agataccagt gctactgcta tggccgtggc attggggagt 1800 ggcattgcca acctttacag acctatccaa gctcaagtgg tcctgtcgaa gtatttatca 1860 ctgagactcc gagtcagccc aactcccacc ccatccagtg gaatgcacca cagccatctc 1920 acatttccaa gtacattctc aggtggagac ctgtgagtat cccacccaga aaccttggat 1980 actgagtctc ctaatcttat caattctgat ggtttctttt tttcccagct tttgagccaa 2040 caactctgat taactattcc tatagcattt actatatttg tttagtgaac aaacaatatg 2100 tggtcaatta aattgacttg tagactgaaa aaaaaaaaaa aaaaaaa 2147

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/574 Ａ４Ｈ０４５Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＣ１２Ｑ 1/68 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｇ０１Ｎ 33/574 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者ショア・アナ・マリアイギリス、ディーディー１４エイチアール、ダンディー、ユニバーシティーオブダンディー、ザデンタルスクール、ユニットオブセルアンドモレキュラーバイオロジーＦターム(参考） 4B024 AA01 AA12 BA80 CA01 CA03 CA04 CA09 CA12 DA02 EA04 GA13 GA18 HA14 HA15 4B063 QA01 QA07 QA18 QA19 QQ08 QQ42 QQ52 QR32 QR56 QS03 QS34 QS36 QX02 4B064 AG26 AG27 CC24 DA14 4B065 AA91X AA93Y AB01 BA05 CA24 CA44 CA46 4C084 AA07 BA02 BA08 BA18 BA19 BA22 CA18 DA04 NA14 ZA892 ZB262 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 BA17 BA18 BA19 BA41 CA40 DA76 EA20 EA51 FA74 GA06 GA26 【要約の続き】

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】［配列番号：１］で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチ
ドまたはその変体、断片、派生物または融合体、またはその変体、断片、派生物
の融合体をコードする組換ポリヌクレオチド。［配列番号：１］
【請求項２】図３，４に示される標識されたｐＭＳＦ１α部位１９から６
６０間のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはその変体、断片、融合体または
派生物、またはその変体、断片または派生物の融合体をコードする請求項１に記
載のポリヌクレオチド。
【請求項３】イントロンを含まない請求項１または２に記載のポリヌクレ
オチド。
【請求項４】図１，２に示される配列で表されるポリヌクレオチドを含む
先行する請求項のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】図１，２に示される部位５７から１９８２間のポリヌクレオ
チドを含む先行する請求項のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】遊走刺激因子活性を有するポリペプチドをコードする先行す
る請求項のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】請求項１から６のいずれかで定義されるようなポリヌクレオ
チドを含む複製可能なベクター。
【請求項８】請求項１から７のいずれかで定義されるような組換ポリヌク
レオチドまたは複製可能なベクターを含む宿主細胞。
【請求項９】［配列番号：１］で表されるアミノ酸配列を有するポリペプ
チドまたはその変体、断片、融合体または派生物、またはその変体、断片または
派生物の融合体の生成の方法であって、その変体、断片、派生物または融合体を
発現する請求項８で定義されるような宿主細胞の培養をすることとその宿主細胞
の培養からそのポリペプチドまたは変体、断片、派生物または融合体を単離する
ことを含む方法。
【請求項１０】［配列番号：１］のアミノ酸配列またはその変体、断片、
融合体または派生物、またはその変体、断片または派生物の融合体を含むポリペ
プチド。
【請求項１１】図３，４に示される標識されたｐＭＳＦ１α部位１９から
６６０間のアミノ酸配列、またはその変体、断片または融合体、またはその変体
または断片の融合体を含む請求項１０に記載のポリペプチド。
【請求項１２】請求項９の方法により入手可能なポリペプチド。
【請求項１３】遊走刺激因子活性を有する請求項１０から１２のいずれか
に記載のポリペプチド。
【請求項１４】フィブロネクチンとは反応しないが、［配列番号：１］で
表される配列のポリペプチドまたはその天然変体とは反応する抗体。
【請求項１５】フィブロネクチンとは反応しないが、図３，４に示される
標識されたｐＭＳＦ１α部位１９から６６０間の配列のポリペプチドまたはその
天然変体とは反応する抗体。
【請求項１６】フィブロネクチンに存在するエピトープではないが、［配
列番号：１］で表される配列のポリペプチドまたはその天然変体には存在するエ
ピトープと反応する抗体。
【請求項１７】フィブロネクチンに存在するエピトープではないが、アミ
ノ酸配列が図３，４に示される標識されたｐＭＳＦ１α部位１９から６６０間の
ポリペプチドまたはその天然変体には存在するエピトープと反応する抗体。
【請求項１８】［配列番号：２］ＩＳＫＹＩＬＲＷＲＰＶＳＩＰＰＲＮＬ
ＧＹまたは［配列番号：３］ＱＱＷＥＲＴＹＬＧＮＡＬＶＣＴＣＹＧＧＳＲまた
は［配列番号：４］ＥＰＣＶＬＰＦＴＹＮＤＲＴＤＳＴＴＳＮＹＥＱＤＱまたは
［配列番号：５］ＣＴＤＨＴＶＬＶＱＴＲＧＧＮＳＮＧＡＬＣＨまたは［配列番
号：６］ＶＧＮＧＲＧＥＷＴＣＩＡＹＳＱＬＲＤＱＣＩのペプチドのいずれかを
含む分子と反応する請求項１４から１７のいずれかに記載の抗体。
【請求項１９】アミノ酸配列が［配列番号：１］で表されるポリペプチド
またはその天然変体とは反応しないが、フィブロネクチンとは反応する抗体。
【請求項２０】アミノ酸配列が図３，４に示される標識されたｐＭＳＦ１
α部位１９から６６０間のポリペプチドまたはその天然変体とは反応しないが、
フィブロネクチンとは反応する抗体。
【請求項２１】アミノ酸配列が［配列番号：１］で表されるポリペプチド
またはその天然変体には存在しないが、フィブロネクチンには存在するエピトー
プと反応する抗体。
【請求項２２】アミノ酸配列が図３、４に示される標識されたｐＭＳＦ１
α部位１９から６６０間のポリペプチドまたはその天然変体には存在しないが、
フィブロネクチンには存在するエピトープと反応する抗体。
【請求項２３】［配列番号：７］ＱＱＷＥＲＴＹＬＧＮＶＬＶＣＴＣＹＧ
ＧＳＲ、［配列番号：８］ＥＰＣＶＬＰＦＴＹＮＧＲＴＦＹＳＣＴＴＥＧＲＱＤ
ＧＨＬＷＣＳＴＴＳＮＹＥＱＤＱ、［配列番号：９］ＣＴＤＨＴＶＬＶＱＴＱＧ
ＧＮＳＮＧＡＬＣＨ、［配列番号：１０］ＶＧＮＧＲＧＥＷＴＣＹＡＹＳＱＬＲ
ＤＱＣＩ、［配列番号：１１］ＩＳＫＹＩＬＲＷＲＰＫＮＳＶＧＲＷＫＥＡまた
は図３，４に示されるフィブロネクチンにおいて部位６４８から派生するペプチ
ドのいずれかを含む分子と反応する請求項１９から２２のいずれかに記載の抗体
。
【請求項２４】モノクローナル抗体である請求項１４から２４のいずれか
に記載の抗体。
【請求項２５】適切にフィブロネクチンとＭＳＦとを判別するペプチドで
動物を免疫化することとＭＳＦに結合するが実質的にはフィブロネクチンには結
合しない抗体を選択することとを含む、［配列番号：１］で表されるアミノ酸配
列のポリペプチド又はその天然変体に対しては反応するがフィブロネクチンに対
しては反応しない抗体を生成する方法。
【請求項２６】適切にフィブロネクチンとＭＳＦとを判別するペプチドで
動物を免疫化することとＭＳＦに結合するが実質的にはフィブロネクチンには結
合しない抗体を選択することとを含む、フィブロネクチンに対しては反応するが
［配列番号：１］で表されるアミノ酸配列のポリペプチド又はその天然変体に対
しては反応しない抗体を生成する方法。
【請求項２７】［配列番号：１］で表される配列のポリペプチド又はその
天然変体に対しては反応するがフィブロネクチンに対しては反応しない抗体を、
適当ならば動物の免疫化の後に、発現させることができる分子。
【請求項２８】フィブロネクチンに対しては反応するが［配列番号：１］
で表される配列のポリペプチド又はその天然変体に対しては反応しない抗体を、
適当ならば動物の免疫化の後に、発現させることができる分子。
【請求項２９】ＭＳＦ中に見られる［配列番号：２］、［配列番号：３］
、［配列番号：４］、［配列番号：５］または［配列番号：６］の配列のいずれ
か一つを含むペプチドである請求項２７記載の分子。
【請求項３０】図３，４に示されるようなフィブロネクチン内の部位６４
８より先から得られるペプチド［配列番号：７］、［配列番号：８］、［配列番
号：９］、［配列番号：１０］または［配列番号：１１］の配列のいずれか一つ
を含むペプチドである請求項２７記載の分子。
【請求項３１】［配列番号：１］で表される配列のポリペプチドまはその
天然変体をコードするポリヌクレオチド及びフィブロネクチンをコードするポリ
ヌクレオチドを判別することができるポリヌクレオチド。
【請求項３２】フィブロネクチンをコードするポリヌクレオチドにはハイ
ブリダイズできるが［配列番号：１］で表される配列のポリペプチドまたはその
天然変体をコードするポリヌクレオチドにはハイブリダイズできないポリヌクレ
オチド。
【請求項３３】［配列番号：１］で表される配列のポリペプチドまたはそ
の天然変体をコードするポリヌクレオチドにはハイブリダイズできるがフィブロ
ネクチンをコードするポリヌクレオチドにはハイブリダイズできないポリヌクレ
オチド。
【請求項３４】このポリヌクレオチドはオリゴヌクレオチドである請求項
３１から３３のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
【請求項３５】フィブロネクチンをコードするポリヌクレオチド、または
前記またはその天然変体のようなこのポリペプチドをコードするポリヌクレオチ
ドはｍＲＮＡまたはｃＤＮＡである請求項３１から３４のいずれかに記載のポリ
ヌクレオチド。
【請求項３６】このポリペプチドとフィブロネクチンとを判別できる試薬
を使って、［配列番号：１］で表される配列のポリペプチドまたはその天然変体
または断片の存在をその診断されるヒト由来の試料において検出することを含む
癌の診断方法。
【請求項３７】このポリペプチドとフィブロネクチンとを判別できる試薬
を使って、［配列番号：１］で表される配列のポリペプチドまたはその天然変体
または断片の存在をその試験されるヒト由来の試料において検出することを含む
癌に対する感受性を決定する方法。
【請求項３８】このポリペプチドとフィブロネクチンとを判別できる試薬
を使って、［配列番号：１］で表される配列のポリペプチドまたはその天然変体
または断片の存在をその患者由来の試料において検出することを含む癌患者のあ
り得る結果を決定する方法。
【請求項３９】このポリペプチドとフィブロネクチンを判別できるこの試
薬は請求項１４から１８のいずれか記載の抗体である請求項３６から３８のいず
れか記載の方法。
【請求項４０】このポリヌクレオチドとフィブロネクチンをコードするポ
リヌクレオチドとを判別できる試薬を使って、［配列番号：１］で表される配列
のポリペプチドまたはその天然変体をコードするポリペプチドをその診断される
ヒト由来の試料において検出することを含む癌の診断方法。
【請求項４１】このポリポリヌクレオチドとフィブロネクチンをコードす
るポリヌクレオチドとを判別できる試薬を使って、［配列番号：１］で表される
配列のポリペプチドまたはその天然変体の存在をその試験されるヒト由来の試料
において検出することを含む癌に対する感受性を決定する方法。
【請求項４２】このポリヌクレオチドとフィブロネクチンをコードするポ
リヌクレオチドとを判別できる試薬を使って、［配列番号：１］で表される配列
のポリペプチドまたはその天然変体をコードするポリヌクレオチドの存在をその
患者由来の試料において検出することを含む癌患者のあり得る結果を決定する方
法。
【請求項４３】このポリヌクレオチドとフィブロネクチンをコードするポ
リヌクレオチドとを判別できるこの試薬は請求項３１から３３のいずれか記載の
ポリヌクレオチドである請求項４０から４２のいずれか記載の方法。
【請求項４４】この癌は乳癌である請求項３６から４３のいずれかに記載
の方法。
【請求項４５】癌の診断のための試薬の製造における［配列番号：１］で
表される配列のポリペプチドまたはその天然変体とフィブロネクチンとを判別で
きる試薬の用途。
【請求項４６】診断試薬としての請求項４５に定義されるような試薬の用
途。
【請求項４７】請求項１０から１３のいずれかに記載のポリペプチドの効
果的な量を細胞遊走の調節が必要とされる部位に投与することを含む細胞遊走を
調節する方法。
【請求項４８】この細胞は線維芽細胞または上皮細胞である請求項４７記
載の方法。
【請求項４９】この部位は哺乳動物の体内である請求項４７または４８記
載の方法。
【請求項５０】この部位はヒトの体内である請求項４９記載の方法。
【請求項５１】細胞遊走を調節するための試薬の製造における請求項１０
から１３いずれかに記載のポリペプチドの用途。
【請求項５２】細胞遊走を調節することのための請求項１０から１３のい
ずれかに記載のポリペプチドの用途。
【請求項５３】請求項１０から１３のいずれかに記載のポリペプチドの効
果的な量を創傷の部位に投与することを含む創傷治癒の方法。
【請求項５４】創傷を治癒するための薬剤の製造における請求項１０から
１３のいずれかに記載のポリペプチドの用途。
【請求項５５】創傷を治癒するための請求項１０から１３のいずれかに記
載のポリペプチドの用途。
【請求項５６】請求項１０から１３のいずれかに記載のポリペプチドと薬
学的に許容可能な運搬体とを含む薬学的組成物。
【請求項５７】医薬における用途のための請求項１０から１３のいずれか
に記載のポリペプチド。
【請求項５８】請求項１０から１３いずれかに記載のポリペプチドの効果
的な量を瘢痕化を防止する部位に投与することを含む瘢痕化を防止する方法。