CN109988824A - 一种检测nf1基因外显子基因突变的引物及方法、试剂盒 - Google Patents

一种检测nf1基因外显子基因突变的引物及方法、试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于检测NF1基因外显子基因突变的引物，包括：5对长片段PCR引物和18对巢式引物；所述5对长片段PCR引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～10所示；所述18对巢式引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.11～46所示。本发明还提供了包含上述引物的试剂盒以及采用上述引物检测NF1基因外显子基因突变的方法。本发明所公开的引物覆盖了NF1基因第9‑10，15‑29，32‑36号外显子区域，为NF1基因中主要的存在同源基因的区域，该引物用于检测NF1基因能够解决检测NF1基因该区域外显子突变的问题，且不受NF1基因的突变多样性以及基因组其他同源区域基因突变的影响，提供了一种可靠性高，方便快捷，成本低廉的方法。

Description

一种检测NF1基因外显子基因突变的引物及方法、试剂盒
技术领域
本发明属于分子生物学领域，特别是涉及检测NF1基因第9-10，15-29，32-36号全外显子基因突变的引物、方法和试剂盒。
背景技术
NF1基因位于染色体17q11.2，全长约350kb，包含58个组成型外显子和3个可变剪接外显子。研究表明，NF1基因突变与Ⅰ型神经纤维瘤病(Neurofibromatosis 1，NF-1)有一定关联。NF-1是一种常见的常染色体显性遗传病，外显率高，发病率约为1/3000。NF-1通常出现在儿童时期，出生时或之后不久便伴有明显的体征状态，患儿在儿童期后基本表现出全部临床症状。NF-1的临床表现极具多样性，并且许多症状的显现时间具有特征性。几乎所有NF-1患者在出生时或出生后最初几年均表现出多发性牛奶咖啡斑，3-5岁时通常出现腋窝或腹股沟区雀斑样色素沉着。约50％的NF-1患者可见簇状神经纤维瘤，多发生于皮下或体内，引起畸形，累及内脏组织器官及内分泌异常，神经纤维瘤随着年龄的增长而增加。多数患者骨骼生长异常和骨密度不足，导致骨骼畸形，主要表现为脊柱侧凸，脊柱发育不良，弓形小腿等症状。此外，NF-1患儿思维能力受损，智力下降，并存在特定的学习障碍。因此，检测NF1基因外显子基因突变对于研究Ⅰ型神经纤维瘤病(NF-1)具有重要意义，有助于临床上结合症状表现来研究和判断病情。
NF1基因的长度长，复杂程度高，尤其第9-10，15-29，32-36号外显子区域在基因组上存在多个同源区域(假基因)。通过对NF1基因的分段blast比对，得到同源区域的分布如图1所示。可以看出，这些同源区域分布广，很多区域在基因组上存在多个同源区域，基因序列与NF1基因序列高度相似，使用普通的探针捕获测序方法、Sanger测序法，均无法区分NF1基因序列和同源区域基因序列，难以满足研究需求。
目前用于NF1基因突变检测的主要方法有多重连接探针扩增技术(Multiplexligation-dependent probe amplification，MLPA)，高通量测序技术(Next generationsequencing，NGS)等。MLPA方法主要检测的是NF1基因的拷贝数变异，而NGS方法普遍使用商业化捕获探针等，无法有效的区分同源区域突变，从而限制了NF1基因突变的检出率，并存在假阳性检出的风险。此外，无论是MLPA或是NGS，都需配备价格昂贵的大型仪器设备，实验条件要求高，导致检测成本提升。
因此，本领域亟需提供一种可以有效的检测NF1基因全外显子序列，尤其是存在同源基因序列的区域的基因突变问题的检测方法，使检测结果分析不受NF1基因的突变多样性以及基因组其他同源区域突变的影响。
发明内容
本发明所要解决的技术问题之一在于，提供一组用于检测NF1基因外显子基因突变的引物。
本发明所要解决的技术问题之二在于，提供一种用于检测NF1基因外显子基因突变的方法。
为解决上述技术问题，一方面，本发明提供一组用于检测NF1基因外显子基因突变的引物，所述引物为5对长片段PCR引物，分别为：
扩增覆盖检测NF1基因第9-10号全外显子的对正、反向引物，其核苷酸序列为：
NF1-L1-F:TACTGACTCGGCAACATGTGTAA(如SEQ ID NO.1所示)，
NF1-L1-R:GATCTTAAAGGTCCTGCAATGCC(如SEQ ID NO.2所示)；
扩增覆盖检测NF1基因第15-26号全外显子的正、反向引物，其核苷酸序列为：
NF1-L2-F:TCCAGAGCTTCACAGTTTCTGCT(如SEQ ID NO.3所示)，
NF1-L2-R:CACCTATGGAGTGCATGAGACCA(如SEQ ID NO.4所示)；
扩增覆盖检测NF1基因第25-30号全外显子的正、反向引物，其核苷酸序列为：
NF1-L3-F:TCCTGATTCAAGCACCAGAGAC(如SEQ ID NO.5所示)，
NF1-L3-R:TACTATCCCTCCAGGCAGAACA(如SEQ ID NO.6所示)；
扩增覆盖检测NF1基因第28-29号全外显子的正、反向引物，其核苷酸序列为：
NF1-L4-F:TAAAGAATCAGTTAAGGGCCGGG(如SEQ ID NO.7所示)，
NF1-L4-R:CTCTTTTGTTGTCCCTGGGTTTC(如SEQ ID NO.8所示)；
扩增覆盖检测NF1基因第32-36号全外显子的正、反向引物，其核苷酸序列为：
NF1-L5-F:TCCTGAGGTGTCGATATTTTGGG(如SEQ ID NO.9所示)，
NF1-L5-R:GCAGCTACTAGATACCGACCATC(如SEQ ID NO.10所示)；
本发明还提供一组用于检测NF1基因外显子基因突变的引物，所述引物为18对巢式引物，分别为：
NF1-exon9-F:GTAAAACGACGGCCAGTAGCTTGTTTGGGAAGGACTGTT(如SEQ ID NO.11所示)，
NF1-exon9-R:CAGGAAACAGCTATGACGGTTCATTTCAGGCCCTAATTGC(如SEQ ID NO.12所示)；
NF1-exon10-F:GTAAAACGACGGCCAGTTCTTCTGGCAGCTGGATTTTACT(如SEQ ID NO.13所示)，
NF1-exon10-R:CAGGAAACAGCTATGACCAAATGAAGCCAAAAAGAACAGCA(如SEQ ID NO.14所示)；
NF1-exon15-F:GTAAAACGACGGCCAGTAGACTTTGTGGCAAGTGAGACA(如SEQ ID NO.15所示)，
NF1-exon15-R:CAGGAAACAGCTATGACTGTTAGGGTGACAAAATTTAGCACT(如SEQ IDNO.16所示)；
NF1-exon16-F:GTAAAACGACGGCCAGTTCTCTGCTGTGCATGTGGTTTA(如SEQ ID NO.17所示)，
NF1-exon16-R:CAGGAAACAGCTATGACTGCTGATTTGCCAGTCATTGTC(如SEQ ID NO.18所示)；
NF1-exon17-F:GTAAAACGACGGCCAGTAATCTCCTTCAAGTTGGGGCAT(如SEQ ID NO.19所示)，
NF1-exon17-R:CAGGAAACAGCTATGACCAACTCTGGGGCAGGAACTATT(如SEQ ID NO.20所示)；
NF1-exon18-F:GTAAAACGACGGCCAGTGTCTTCCACCCTTGACTCTCAG(如SEQ ID NO.21所示)，
NF1-exon18-R:CAGGAAACAGCTATGACGTGCTTTGAGGCAGACTGAGTA(如SEQ ID NO.22所示)；
NF1-exon19,20-F:GTAAAACGACGGCCAGTCAGGGCTCTAAGTGCAGTAACT(如SEQ IDNO.23所示)，
NF1-exon19,20-R:CAGGAAACAGCTATGACCTACTGGTACTTGCGATGTGGT(如SEQ IDNO.24所示)；
NF1-exon21-F:GTAAAACGACGGCCAGTAGGTTTAATTCATGCTTTGCACA(如SEQ ID NO.25所示)，
NF1-exon21-R:CAGGAAACAGCTATGACAGTTCCTAAGAGGCAAGCTGAC(如SEQ ID NO.26所示)；
NF1-exon22,23-F:GTAAAACGACGGCCAGTTCTGTCTTCTGGGCATTGATGG(如SEQ IDNO.27所示)，
NF1-exon22,23-R:CAGGAAACAGCTATGACTCCTCCTTTCTACCAATAACCGC(如SEQ IDNO.28所示)；
NF1-exon24-F:GTAAAACGACGGCCAGTCATGTTGCTTGTTCCCTTCTGG(如SEQ ID NO.29所示)，
NF1-exon24-R:CAGGAAACAGCTATGACGTCTCTGGTGCTTGAATCAGGA(如SEQ ID NO.30所示)；
NF1-exon25-F:GTAAAACGACGGCCAGTAATCCATGGGTGGTTGAATCCA(如SEQ ID NO.31所示)，
NF1-exon25-R:CAGGAAACAGCTATGACAGTGGTCCAAACAGCTTAGACA(如SEQ ID NO.32所示)；
NF1-exon26,27-F:GTAAAACGACGGCCAGTCCCTGGCTGATTATCGCGAG(如SEQ ID NO.33所示)，
NF1-exon26,27-R:CAGGAAACAGCTATGACGTGCCAACCACTTCCCTACA(如SEQ ID NO.34所示)；
NF1-exon28,29-F:GTAAAACGACGGCCAGTGCGTAGGCCTCTCTTAATAGCTT(如SEQ IDNO.35所示)，
NF1-exon28,29-R:CAGGAAACAGCTATGACAAATGCATGGAAAAAGGACAGGG(如SEQ IDNO.36所示)；
NF1-exon32-F:GTAAAACGACGGCCAGTACCCATCTCATCCATGAGGTTTT(如SEQ ID NO.37所示)，
NF1-exon32-R:CAGGAAACAGCTATGACAGGTAGTGTTTCTAACCTTCCCA(如SEQ ID NO.38所示)；
NF1-exon33-F:GTAAAACGACGGCCAGTTGGGAAGGTTAGAAACACTACCT(如SEQ ID NO.39所示)，
NF1-exon33-R:CAGGAAACAGCTATGACTCCTACTTCTTCCTTGTCCACAT(如SEQ ID NO.40所示)；
NF1-exon34-F:GTAAAACGACGGCCAGTCAAGCCATGTTGGAAAGAGAGTG(如SEQ ID NO.41所示)，
NF1-exon34-R:CAGGAAACAGCTATGACTCCTACGAATTGGCTGTTCTTCA(如SEQ ID NO.42所示)；
NF1-exon35-F:GTAAAACGACGGCCAGTGTGGACTGTGAAGCTAAGGGTAA(如SEQ ID NO.43所示)，
NF1-exon35-R:CAGGAAACAGCTATGACTGTTGTCTTCACTCCCTGGTAAG(如SEQ ID NO.44所示)；
NF1-exon36-F:GTAAAACGACGGCCAGTAGCAAGGCCTTTTTCATCCATTC(如SEQ ID NO.45所示)，
NF1-exon36-R:CAGGAAACAGCTATGACGCAGCTACTAGATACCGACCATC(如SEQ ID NO.46所示)。
本发明还提供一组用于检测NF1基因外显子基因突变的引物，包括：5对长片段PCR引物和18对巢式引物；
所述5对长片段PCR引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～10所示；
所述18对巢式引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.11～46所示。
进一步的，所述用于检测NF1基因外显子基因突变的引物，还包括：通用测序引物对M13，其核苷酸序列为：
M13F：GTAAAACGACGGCCAGT(如SEQ ID NO.47所示)，
M13R：CAGGAAACAGCTATGAC(如SEQ ID NO.48所示)。
本发明还提供一种用于检测NF1基因外显子基因突变的试剂盒，该试剂盒包含前述的5对长片段PCR引物和18对巢式引物。
进一步的，所述试剂盒包含还包括通用测序引物对M13。
进一步的，所述试剂盒还包含用于所述5对长片段PCR引物扩增的长片段PCR反应体系；所述长片段PCR反应体系包括DNA聚合酶、缓冲液、dNTP混合物。
其中，所述DNA聚合酶优选KOD FX Neo聚合酶。
在一种具体实施方式中，所述长片段PCR反应体系中包括：终浓度为1X的PCRbuffer for KOD FX Neo，终浓度为400μM的dNTP，终浓度为0.5U的KOD FX Neo聚合酶。
在一种具体实施方式中，所述长片段PCR反应体系中，5对长片段PCR引物NF1-L1、NF1-L2、NF1-L3、NF1-L4、NF1-L5的正、反向引物浓度比均为1:1。
在一种具体实施方式中，所述长片段PCR反应体系中，NF1-L1、NF1-L2、NF1-L3的正、反向引物终浓度均为0.15μM，NF1-L4、NF1-L5的正、反向引物终浓度均为0.3μM。
在一种具体的实施方式中，所述长片段PCR反应体系采用ddH20补齐至25μl。
进一步的，该试剂盒还包括用于所述18对巢式引物的巢式PCR反应体系；所述巢式PCR反应体系中的DNA聚合酶反应体系优选为DreamTaq Hot Start Green PCR Master Mix(2X)。
在一种具体实施方式中，所述巢式PCR反应体系中，18对巢式引物的正、反向引物的浓度比均为1:1。
在一种具体实施方式中，所述巢式PCR反应体系中，18对巢式引物的正、反向引物的终浓度均为0.2μM。
在一种具体的实施方式中，所述巢式PCR反应体系采用ddH20补齐至25μl。
为解决上述技术问题，另一方面，本发明还提供一种用于检测NF1基因外显子基因突变的方法，包括步骤：
(1)利用5对长片段PCR引物对DNA样本分别进行扩增，获得覆盖检测NF1基因第9-10，15-29，32-36号全外显子的扩增产物；所述5对长片段PCR引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.1～10所示；
(2)利用18对巢式PCR引物分别对步骤(1)中获得的扩增产物进一步扩增，获得包含检测NF1基因第9,10,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,32,33,34,35,36号外显子的扩增产物；所述18对巢式PCR引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.11～46所示；
(3)将步骤(2)获得的扩增产物分别进行正向或反向测序，获得所述扩增产物的基因序列；
(4)将步骤(3)获得的基因序列与野生型NF1基因序列进行比较，确定突变位点是否存在。
具体的，所述步骤(1)是在长片段PCR反应体系中进行扩增。长片段PCR反应体系包括DNA聚合酶，缓冲液，dNTP混合物。其中，DNA聚合酶优选Toyobo的KOD FX Neo聚合酶。
在一种具体实施方式中，所述长片段PCR反应体系中包括：终浓度为1X的PCRbuffer for KOD FX Neo，终浓度为400μM的dNTP，终浓度为0.5U的KOD FX Neo聚合酶。
在一种具体实施方式中，所述长片段PCR反应体系中，5对长片段PCR引物NF1-L1、NF1-L2、NF1-L3、NF1-L4、NF1-L5的正、反向引物浓度比均为1:1。
在一种具体实施方式中，所述长片段PCR反应体系中，NF1-L1、NF1-L2、NF1-L3的正、反向引物终浓度均为0.15μM，NF1-L4、NF1-L5的正、反向引物终浓度均为0.3μM。
在一种具体的实施方式中，所述长片段PCR反应体系采用ddH20补齐至25μl。
在一种具体实施方式中，所述长片段PCR反应体系的反应条件中，NF1-L1、NF1-L2、NF1-L3扩增的退火延伸的时间为约1min/kb(片段长度)，NF1-L4、NF1-L5扩增的退火延伸的时间为约30s/kb(片段长度)。
在一种具体实施方式中，长片段PCR产物电泳检测采用0.7％的琼脂糖凝胶，电泳条件120V，40min。
具体的，所述步骤(2)中，先将步骤(1)得到的扩增产物稀释后作为模板，再进行巢式PCR。在一种具体实施方式中，将长片段扩增产物稀释1000～10000倍；优选的，将长片段扩增产物稀释5000倍。使用25ng的DNA作为模板，进行长片段PCR时，反应体系中基因组的拷贝数约为300拷贝/μl，NF1基因中不同外显子对应的同源区域数不同，其中exon22的同源区域最多，可达10个，即约3000拷贝/μl，但长片段PCR产物取1μl经过5000倍稀释后，在巢式PCR反应体系中添加的该同源区域的拷贝数只有约0.6拷贝，其他外显子对应的同源区域拷贝数更低，可基本忽略所有同源区域扩增的可能性。
在一种具体实施方式中，所述步骤(2)中，巢式PCR扩增的反应条件为95℃预变性3min，然后进行30个循环，每个循环为95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，随后72℃延伸10min，最后置于4℃直至使用。
在一种具体实施方式中，所述步骤(2)中，巢式PCR扩增结束后，对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，凝胶浓度为2％，电泳条件设置为120V，30min。然后通过凝胶成像系统检测是否获得目标片段产物。经确认后的巢式PCR产物再按照常规方法进行步骤(3)Sanger测序。
具体的，所述步骤(3)中，进行正向或反向测序是采用Sanger测序。
优选的，所述步骤(2)中，18对巢式PCR引物中还加入了通用测序引物对M13，其核苷酸序列为：M13F：GTAAAACGACGGCCAGT(如SEQ ID NO.47所示)；M13R：CAGGAAACAGCTATGAC(如SEQ ID NO.48所示)。该通用测序引物对M13用于Sanger测序。在后续Sanger测试不需额外设计或提供测序引物，大大简化了操作流程。
利用NF1基因中具有特异性的序列，本发明设计了5对长片段PCR引物对，覆盖了大部分NF1基因的同源区域。长片段PCR所用引物序列、目标片段长度及覆盖目标区域如表1所示。反应体系中根据引物对扩增的片段长度不同，引物的浓度有所变化，扩增片段小于10kb，引物浓度使用0.3μM(终浓度)，当扩增10kb以上的长链片段时，将引物浓度设定为0.15μM(终浓度)可提高扩增产量。
表1：长片段PCR所有引物列表
本发明中，PCR扩增时巢式引物对会结合在长片段PCR产物内部，使得第二次PCR扩增片段短于第一次扩增。本发明设计的18对巢式引物中NF1-exon19,20，NF1-exon22,23，NF1-exon26,27，NF1-exon28,29这4对引物可同时扩增获得两个相连的全外显子，所有引物对都加入了sanger测序的通用测序引物M13，后续sanger测试不需额外设计或提供测序引物，大大简化了操作流程。其中，巢氏PCR所有引物序列、目标片段长度、覆盖目标区域及对应长片段引物名称如表2所示。
表2：巢氏PCR所有引物列表
NF1基因长度长，复杂程度高，在基因组上存在多个同源区域，使用一般方法检测突变时会受到这些区域的干扰。本发明所公开的引物覆盖了NF1基因第9-10，15-29，32-36号外显子区域，包括了NF1基因大部分存在同源基因的区域，该引物用于检测NF1基因能够解决检测NF1基因该区域外显子突变的问题，且不受NF1基因的突变多样性以及基因组其他同源区域基因突变的影响，提供了一种可靠性高，方便快捷，成本低廉的方法。
本发明通过长片段PCR引物及巢式PCR引物组合使用，可有针对性的对待检测的外显子进行准确突变分析，方法简便，准确度高，成本低廉，对实验人员及仪器设备的要求较低，适合于各种对NF1基因外显子的突变检测。
附图说明
图1为NF1基因的同源区域分布图。
图2为NF1-L2长片段PCR结果。
图3为NF1-L3长片段PCR结果。
图4为NF1-L1，NF1-L4，NF1-L5长片段PCR结果。
图5为样本1中NF1基因突变检测结果，样本为Chr17:29554233(GRCh37/hg19)位点T突变为G。
图6为样本2中NF1基因突变检测结果，样本为Chr17:29557361(GRCh37/hg19)位点插入突变GAGAGATGACCTCTCATTTTGCC。
图7为样本3中NF1基因突变检测结果，样本为Chr17:29586108(GRCh37/hg19)位点T缺失突变。
具体实施方式
下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
使用人细胞系DNA作为模板。
1.长片段PCR
表1：长片段PCR所用引物列表
长片段PCR扩增试剂选用KOD FX Neo DNA聚合酶(Toyobo KFX-201)。引物浓度根据不同引物的扩增产物长度不同有所调整，一般情况下，引物浓度使用0.3μM(终浓度)。扩增10kb以上的长链片段时，将引物浓度设定为0.15μM(终浓度)可提高扩增产量。所述引物浓度引物对NF1-L1、NF1-L2、NF1-L3使用0.15μM，NF1-L4、NF1-L5使用0.3μM。
PCR反应体系：
所述的长片段PCR扩增的反应条件为94℃预变性2min，然后进行30个循环，每个循环为94℃变性15s，退火/延伸68℃，时间根据不同引物的扩增产物长度不同有所调整，当扩增产物片段长度>10kb时，退火延伸的时间为约1min/kb(片段长度)，当扩增产物片段长度<10kb时，退火延伸的时间为约30s/kb(片段长度)，优化后方案为NF1-L1为12min，NF1-L2为12min，NF1-L3为17min，NF1-L4为2min30s，NF1-L5为5min，然后置于4℃直至使用。
扩增结束后，对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，凝胶浓度为0.7％，电泳条件设置为120V，40min。然后通过凝胶成像系统检测是否获得目标片段产物。附图2，附图3，附图4为长片段PCR产物电泳检测结果。
2.巢式PCR
表2：巢氏PCR所有引物列表
为了避免原始基因组的NF1序列同源区域对巢式PCR的影响，将长片段扩增产物稀释5000倍，取1μl作为巢式PCR模板。巢式PCR使用DreamTaq Hot Start Green PCR MasterMix(2X)(Thermo fisher K9021)。
反应体系：
所述的巢式PCR扩增的反应条件为95℃预变性3min，然后进行30个循环，每个循环为95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，随后72℃延伸10min，最后置于4℃直至使用。
扩增结束后，对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，凝胶浓度为2％，电泳条件设置为120V，30min。然后通过凝胶成像系统检测是否获得目标片段产物。
经确认后的巢式PCR产物按照常规方法进行Sanger测序，检测相关区域是否存在基因突变。
实施例2
使用本发明方法检测三例血液DNA样本NF1基因突变。这三例样本经过高通量测序分析显示NF1或其同源区域存在突变。样本1疑似Chr17:29554233(GRCh37/hg19)，T突变为G，该位点位于NF1内含子18-19的末2位。样本2疑似Chr17:29557361(GRCh37/hg19)，插入突变GAGAGATGACCTCTCATTTTGCC，该位点位于NF1外显子23。样本3疑似Chr17:29586108(GRCh37/hg19)，T缺失，该位点位于NF1外显子33。
由于高通量测序获得读长较短，常用于外显子测序的只有双端150bp读长，不能准确分辨同源区域，因此高通量检测到的位于同源区域的突变位点仍需另外一种方案进行确定。
采用本发明的方法，样本1选用长片段NF1-L2及巢氏引物NF1-exon19,20，样本2选用长片段NF1-L2及巢氏引物NF1-exon22,23，样本3选用NF1-L5及巢氏引物NF1-exon33。
附图5为样本1Sanger测序结果，如图中箭头所示位置，显示该样本存在T>G杂合突变，与NGS结果一致，证实该突变确实存在。
附图6为样本2Sanger测序结果，如图中箭头所示位置，显示该样本存在插入GGAGAGATGACCTCTCATTTTGCC杂合突变，插入位点后Sanger测序结果出现叠峰，该结果与NGS结果一致，证实该突变确实存在。
附图7为样本3Sanger测序结果，如图中箭头所示位置，显示该样本存在缺失T杂合突变，缺失位点后Sanger测序结果出现叠峰，该结果与NGS结果一致，证实该突变确实存在。
采用本发明的方法能够解决现有方法针对NF1基因的外显子测序不能准确分辨同源区域的缺陷。本发明的检测结果可靠性高，不受NF1基因的突变多样性以及基因组其他同源区域基因突变的影响。
综上所述，上述各实施例仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，皆应包含在本发明的保护范围内。
序列表
<110> 明码（上海）生物科技有限公司
<120> 一种检测NF1基因外显子基因突变的引物及方法、试剂盒
<130> CPC-NP-19-101330
<160> 48
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 引物()
<400> 1
tactgactcg gcaacatgtg taa 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 引物()
<400> 2
gatcttaaag gtcctgcaat gcc 23
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 引物()
<400> 3
tccagagctt cacagtttct gct 23
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 引物()
<400> 4
cacctatgga gtgcatgaga cca 23
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 引物()
<400> 5
tcctgattca agcaccagag ac 22
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 引物()
<400> 6
tactatccct ccaggcagaa ca 22
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 引物()
<400> 7
taaagaatca gttaagggcc ggg 23
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 引物()
<400> 8
ctcttttgtt gtccctgggt ttc 23
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 引物()
<400> 9
tcctgaggtg tcgatatttt ggg 23
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 引物()
<400> 10
gcagctacta gataccgacc atc 23
<210> 11
<211> 39
<212> DNA
<213> 引物()
<400> 11
gtaaaacgac ggccagtagc ttgtttggga aggactgtt 39
<210> 12
<211> 40
<212> DNA
<213> 引物()
<400> 12
caggaaacag ctatgacggt tcatttcagg ccctaattgc 40
<210> 13
<211> 40
<212> DNA
<213> 引物()
<400> 13
gtaaaacgac ggccagttct tctggcagct ggattttact 40
<210> 14
<211> 41
<212> DNA
<213> 引物()
<400> 14
caggaaacag ctatgaccaa atgaagccaa aaagaacagc a 41
<210> 15
<211> 39
<212> DNA
<213> 引物()
<400> 15
gtaaaacgac ggccagtaga ctttgtggca agtgagaca 39
<210> 16
<211> 42
<212> DNA
<213> 引物()
<400> 16
caggaaacag ctatgactgt tagggtgaca aaatttagca ct 42
<210> 17
<211> 39
<212> DNA
<213> 引物()
<400> 17
gtaaaacgac ggccagttct ctgctgtgca tgtggttta 39
<210> 18
<211> 39
<212> DNA
<213> 引物()
<400> 18
caggaaacag ctatgactgc tgatttgcca gtcattgtc 39
<210> 19
<211> 39
<212> DNA
<213> 引物()
<400> 19
gtaaaacgac ggccagtaat ctccttcaag ttggggcat 39
<210> 20
<211> 39
<212> DNA
<213> 引物()
<400> 20
caggaaacag ctatgaccaa ctctggggca ggaactatt 39
<210> 21
<211> 39
<212> DNA
<213> 引物()
<400> 21
gtaaaacgac ggccagtgtc ttccaccctt gactctcag 39
<210> 22
<211> 39
<212> DNA
<213> 引物()
<400> 22
caggaaacag ctatgacgtg ctttgaggca gactgagta 39
<210> 23
<211> 39
<212> DNA
<213> 引物()
<400> 23
gtaaaacgac ggccagtcag ggctctaagt gcagtaact 39
<210> 24
<211> 39
<212> DNA
<213> 引物()
<400> 24
caggaaacag ctatgaccta ctggtacttg cgatgtggt 39
<210> 25
<211> 40
<212> DNA
<213> 引物()
<400> 25
gtaaaacgac ggccagtagg tttaattcat gctttgcaca 40
<210> 26
<211> 39
<212> DNA
<213> 引物()
<400> 26
caggaaacag ctatgacagt tcctaagagg caagctgac 39
<210> 27
<211> 39
<212> DNA
<213> 引物()
<400> 27
gtaaaacgac ggccagttct gtcttctggg cattgatgg 39
<210> 28
<211> 40
<212> DNA
<213> 引物()
<400> 28
caggaaacag ctatgactcc tcctttctac caataaccgc 40
<210> 29
<211> 39
<212> DNA
<213> 引物()
<400> 29
gtaaaacgac ggccagtcat gttgcttgtt cccttctgg 39
<210> 30
<211> 39
<212> DNA
<213> 引物()
<400> 30
caggaaacag ctatgacgtc tctggtgctt gaatcagga 39
<210> 31
<211> 39
<212> DNA
<213> 引物()
<400> 31
gtaaaacgac ggccagtaat ccatgggtgg ttgaatcca 39
<210> 32
<211> 39
<212> DNA
<213> 引物()
<400> 32
caggaaacag ctatgacagt ggtccaaaca gcttagaca 39
<210> 33
<211> 37
<212> DNA
<213> 引物()
<400> 33
gtaaaacgac ggccagtccc tggctgatta tcgcgag 37
<210> 34
<211> 37
<212> DNA
<213> 引物()
<400> 34
caggaaacag ctatgacgtg ccaaccactt ccctaca 37
<210> 35
<211> 40
<212> DNA
<213> 引物()
<400> 35
gtaaaacgac ggccagtgcg taggcctctc ttaatagctt 40
<210> 36
<211> 40
<212> DNA
<213> 引物()
<400> 36
caggaaacag ctatgacaaa tgcatggaaa aaggacaggg 40
<210> 37
<211> 40
<212> DNA
<213> 引物()
<400> 37
gtaaaacgac ggccagtacc catctcatcc atgaggtttt 40
<210> 38
<211> 40
<212> DNA
<213> 引物()
<400> 38
caggaaacag ctatgacagg tagtgtttct aaccttccca 40
<210> 39
<211> 40
<212> DNA
<213> 引物()
<400> 39
gtaaaacgac ggccagttgg gaaggttaga aacactacct 40
<210> 40
<211> 40
<212> DNA
<213> 引物()
<400> 40
caggaaacag ctatgactcc tacttcttcc ttgtccacat 40
<210> 41
<211> 40
<212> DNA
<213> 引物()
<400> 41
gtaaaacgac ggccagtcaa gccatgttgg aaagagagtg 40
<210> 42
<211> 40
<212> DNA
<213> 引物()
<400> 42
caggaaacag ctatgactcc tacgaattgg ctgttcttca 40
<210> 43
<211> 40
<212> DNA
<213> 引物()
<400> 43
gtaaaacgac ggccagtgtg gactgtgaag ctaagggtaa 40
<210> 44
<211> 40
<212> DNA
<213> 引物()
<400> 44
caggaaacag ctatgactgt tgtcttcact ccctggtaag 40
<210> 45
<211> 40
<212> DNA
<213> 引物()
<400> 45
gtaaaacgac ggccagtagc aaggcctttt tcatccattc 40
<210> 46
<211> 40
<212> DNA
<213> 引物()
<400> 46
caggaaacag ctatgacgca gctactagat accgaccatc 40
<210> 47
<211> 17
<212> DNA
<213> 引物()
<400> 47
gtaaaacgac ggccagt 17
<210> 48
<211> 17
<212> DNA
<213> 引物()
<400> 48
caggaaacag ctatgac 17

Claims (19)

1.一组用于检测NF1基因外显子基因突变的引物，其特征在于，所述引物为5对长片段PCR引物；所述5对长片段PCR引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～10所示。
2.一组用于检测NF1基因外显子基因突变的引物，其特征在于，所述引物为18对巢式引物；所述18对巢式引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.11～46所示。
3.一组用于检测NF1基因外显子基因突变的引物，其特征在于，所述引物包括：5对长片段PCR引物和18对巢式引物；
所述5对长片段PCR引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～10所示；
所述18对巢式引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.11～46所示。
4.如权利要求3所述的引物，其特征在于，还包括：通用测序引物对M13，其核苷酸序列如SEQ ID NO.47～48所示。
5.一种用于检测NF1基因外显子基因突变的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含5对长片段PCR引物和18对巢式引物；
所述5对长片段PCR引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～10所示；
所述18对巢式引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.11～46所示。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括通用测序引物对M13，其核苷酸序列如SEQ ID NO.47～48所示。
7.如权利要求5或6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含用于所述5对长片段PCR引物扩增的长片段PCR反应体系；所述长片段PCR反应体系包括DNA聚合酶、缓冲液、dNTP混合物。
8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述DNA聚合酶为KOD FX Neo聚合酶。
9.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述长片段PCR反应体系中包括：终浓度为1X的PCR buffer for KOD FX Neo，终浓度为400μM的dNTP，终浓度为0.5U的KOD FX Neo聚合酶。
10.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述长片段PCR反应体系中，5对长片段PCR引物分别为NF1-L1、NF1-L2、NF1-L3、NF1-L4和NF1-L5；其中，NF1-L1、NF1-L2、NF1-L3的正、反向引物终浓度均为0.15μM，NF1-L4、NF1-L5的正、反向引物终浓度均为0.3μM。
11.如权利要求5或6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括用于所述18对巢式引物的巢式PCR反应体系；所述巢式PCR反应体系中的DNA聚合酶反应体系为DreamTaq HotStart Green PCR Master Mix(2X)。
12.如权利要求11所述的试剂盒，其特征在于，所述巢式PCR反应体系中，18对巢式引物的正、反向引物的终浓度均为0.2μM。
13.一种用于检测NF1基因外显子基因突变的方法，包括步骤：
(1)利用5对长片段PCR引物对DNA样本分别进行扩增，获得覆盖检测NF1基因第9-10，15-29，32-36号全外显子的扩增产物；所述5对长片段PCR引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～10所示；
(2)利用18对巢式PCR引物分别对步骤(1)中获得的扩增产物进一步扩增，获得包含检测NF1基因第9,10,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,32,33,34,35,36号外显子的扩增产物；所述18对巢式PCR引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.11～46所示；
(3)将步骤(2)获得的扩增产物分别进行正向或反向测序，获得所述扩增产物的基因序列；
(4)将步骤(3)获得的基因序列与野生型NF1基因序列进行比较，确定突变位点是否存在。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)是在长片段PCR反应体系中进行扩增，所述长片段PCR反应体系包括DNA聚合酶，缓冲液，dNTP混合物。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述DNA聚合酶为Toyobo的KOD FX Neo聚合酶。
16.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述长片段PCR反应体系中包括：终浓度为1X的PCR buffer for KOD FX Neo，终浓度为400μM的dNTP，终浓度为0.5U的KOD FX Neo聚合酶，NF1-L1、NF1-L2、NF1-L3的正、反向引物终浓度均为0.15μM，NF1-L4、NF1-L5的正、反向引物终浓度均为0.3μM。
17.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，先将步骤(1)得到的扩增产物稀释1000～10000倍后作为模板，再进行巢式PCR。
18.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，巢式PCR扩增的反应条件为95℃预变性3min，然后进行30个循环，每个循环为95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，随后72℃延伸10min，最后置于4℃直至使用。
19.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，进行正向或反向测序是采用Sanger测序。
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