CN116083560B - 一种用于着床前胚胎nf1基因检测的试剂盒、系统及其应用方法 - Google Patents

一种用于着床前胚胎nf1基因检测的试剂盒、系统及其应用方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了用于着床前胚胎NF1基因检测的试剂盒及其应用，该试剂盒包括设计的n个引物对中的一个或更多个引物对，所述n为大于2的自然数，其中第2对引物的上游引物位于第1对引物的下游引物的上游或与之重叠，依此类推，第n对引物的上游引物位于第n‑1对引物的下游引物的下游或与之重叠，即所述n个引物对扩增的序列涵盖了NF1基因所有外显子的完整CDS区，且所述n个引物对的每个引物对的上游引物和下游引物分别设计在NF1基因无假基因的不同外显子区域着床前胚胎NF1基因检测的方法；以及用于着床前胚胎基因检测的试剂盒、系统及其应用方法。

Description

一种用于着床前胚胎NF1基因检测的试剂盒、系统及其应用 方法
技术领域
本发明涉及生物医疗领域，具体涉及一种用于着床前胚胎NF1基因检测的试剂盒、系统及其应用方法。
背景技术
Ⅰ型神经纤维瘤病(neurofibromatosis type 1,NF1)传统上称为vonRecklinghausen病，是一种累及神经系统的常染色体显性遗传疾病，导致常见的肿瘤易感性综合征。其全球发病率约为1/3 000，约50％的患者为家族性遗传突变，其余为散发型突变。Ⅰ型神经纤维瘤病是由染色体17q11.2上的NF1基因变异导致引起的。NF1基因编码一种称为神经纤维蛋白的GTP酶激活蛋白，NF1基因变异导致神经纤维蛋白的失活进而易于肿瘤形成。NF1在基因组中跨越超过275kb，包含57个组成型外显子和至少三个交替剪接的外显子。此外，人类基因组中还存在15个与NF1基因高度同源的假基因。因此，NF1基因的检测在成人中存在一定困难。
NF1是一种儿童期后，呈完全显性的遗传病，没有无症状携带者。典型的临床症状包括咖啡牛奶斑(cafe-au-lait macules,CALMs)、多发性神经纤维瘤、腋窝或腹股沟雀斑等。患者病变以神经纤维瘤为特征性表型，其中皮肤型神经纤维瘤数量大，丛状神经纤维瘤累及主干神经，恶变后的恶性外周神经鞘瘤生存期极短。同时NF1患者伴有多系统累及，疾病致畸率、致残率高，手术难以完整切除，目前尚无有效治疗手段。
对于该疾病家庭来说，单基因病胚胎着床前遗传学检测(preimplantationgenetic testing for monogenic defects,PGT-M)是一种有效的方式，能够阻断NF1基因变异向后代传递。目前PGT-M主要是在囊胚期经过活检获得微量的遗传分析材料，由于所得材料的DNA在皮克级别，相较于成人通过外周血基因组DNA检测，胚胎活检获得的细胞数量少，在全基因组扩增过程中存在脱扣的可能，一般需经过全基因组扩增(whole-genomeamplification,WGA)后再进行后续诊断分析。要么过于昂贵，例如单细胞测序，要么现有方法无法进行，所以也需要一种廉价、易操作的方法，可以对着床前胚胎进行基因检测的方法和系统。
针对NF1的PGT-M检测方法主要包括：1.直接位点的检测；2.依靠家系进行连锁分析进而明确胚胎是否携带变异。在直接位点检测方面，用于胚胎遗传学检测的细胞数目仅有5个左右，经全基因扩增后，直接位点检测存在等位基因脱扣(allele drop-out,ADO)的风险。并且NF1存在15个高度同源的假基因，会对胚胎的诊断造成干扰加大了检测的难度的同时也存在误诊的风险。在连锁分析诊断方面，基于单核苷酸多态性(single nucleotidepolymorphism,SNP)或短串联重复序列(short tandem repeat,STR)的家系连锁分析可以准确对胚胎进行诊断。但对于约50％的新发变异患者来说，无法依靠家系成员进行连锁分析。目前常规诊断的方法，在Ⅰ型神经纤维瘤病的胚胎遗传学检测方面，存在一定的局限性以及检测失败甚至误诊的风险。
发明内容
为了解决前述的问题，本发明提供一种用于着床前胚胎NF1基因检测的试剂盒及其应用。
第一方面，本发明提供一种用于着床前胚胎NF1基因检测的试剂盒，其特征在于，包括设计的n个引物对中的一个或更多个引物对，所述n为大于2的自然数，其中第2对引物的上游引物位于第1对引物的下游引物的上游或与之重叠，依此类推，第n对引物的上游引物位于第n-1对引物的下游引物的下游或与之重叠，即所述n个引物对扩增的序列涵盖了NF1基因所有外显子的完整CDS区，且所述n个引物对的每个引物对的上游引物和下游引物分别设计在NF1基因无假基因的不同外显子区域。
在一些实施例中，用于着床前胚胎NF1基因检测的试剂盒，其包括以下4个引物对中的一对或更多对，4个引物对具体如下：
1).引物对1
覆盖外显子1-7，扩增片段长度900bp
上游引物：ACCCTCTCCTTGCCTCTT(SEQ ID No：1)
下游引物：TGCTTTACGTTTGGTGCTTTC(SEQ ID No：2)
2).引物对2
覆盖外显子8-29，扩增片段长度3382bp
上游引物：GGTTGCGCAGTTAGCAGTTAT(SEQ ID No：3)
下游引物：CTCAAGGCTCTCTGATGGTTCTA(SEQ ID No：4)
3).引物对3
覆盖外显子30-40，扩增片段长度2329bp
上游引物：GCTTTGAAGTGGATCCTACCA(SEQ ID No：5)
下游引物：GGACCTGTGGCTACTAAGAAAG(SEQ ID No：6)
4).引物对4
覆盖外显子41-57，扩增片段长度2674bp
上游引物：GAAGCCTTGGGCAGATTACA(SEQ ID No：7)
下游引物：CATCTGGCAACATGGCAAAC(SEQ ID No：8)。
优选地，该试剂盒具有4个引物对，4个引物对可以独立包装，即一次可以使用一个引物对，也可以使用多个引物对，进一步优选地，使用全部4个引物对。
在另一些实施例中，用于着床前胚胎NF1基因检测的试剂盒，其包括以下3个引物对中的一对或更多对，3个引物对具体如下：
1).引物对5覆盖外显子1-21，扩增片段长度3121bp
上游引物5：CAGACCCTCTCCTTGCCTCTT(SEQ ID No：9)
下游引物5：TCCCAAGCACACGAACATAC(SEQ ID No：10)
2).引物对6覆盖外显子22-40，扩增片段长度3362bp
上游引物6：GGATCGGCTGTTGTCCTTAAT(SEQ ID No：11)
下游引物6：CTACAGCAGTATCTGCCATCAC(SEQ ID No：12)
3).引物对7覆盖外显子41-57，扩增片段长度2674
上游引物7：GAAGCCTTGGGCAGATTACA(SEQ ID No：13)
下游引物7：CATCTGGCAACATGGCAAAC(SEQ ID No：14)
优选地，该试剂盒具有3个引物对3个引物对可以独立包装，即一次可以使用一个引物对，也可以使用多个引物对，进一步优选地，使用全部3个引物对。
第二方面，本发明提供了前述试剂盒的应用方法，其包括以下步骤：
步骤1：收集样本，裂解细胞，制备cDNA模板,
步骤2：PCR扩增所述cDNA模板以及纯化经扩增的cDNA模板，
步骤3：使用所述cDNA模板和权利要求1所述试剂盒的三个引物对分别进行扩增，
步骤4：对得到的序列进行测序并与参考序列比对。
本发明的应用方法中，所述样本是囊胚期的外滋养层细胞。
可选的，所述裂解细胞是这样进行的：将所述外滋养层细胞置于mRNA反转所用的裂解液中，充分震荡30-60秒，然后72℃孵育3分钟，使细胞裂充分解，所述裂解液所含成分为RNA酶抑制剂、dNTP、Triton X-100、无核酸酶水。
可选的，所述制备cDNA模板是这样进行的：将所述裂解后的外滋养层细胞加入反转录体系，进行互补cDNA链的合成，所述反转录体系包括RNA酶抑制剂、dNTP、polyT引物、Triton X-100、SuperScript II逆转录酶、0.1M DTT、甜菜碱Betaine(5M)、MgCl2(1M)Superscript II第一链buffer(5×)、无核酸酶水、末端固定序列；进一步优选的，反转录程序为：25℃ 5min；42℃ 60min；50℃ 30min；70℃ 10min；4℃保存。
可选的，所述PCR扩增所述cDNA模板是这样进行的：向所述cDNA模板加入扩增混合液，所述扩增混合液包括Tag DNA合成酶、固定序列上游引物、固定序列下游引物、无核酸酶水；进一步优选的，扩增程序为：95℃ 3min；14至18个循环：98℃ 20s,66℃ 15s,72℃ for5min；72℃ 5min；4℃保存。
可选的，所述纯化经扩增的cDNA模板这样进行的：使用0.8×磁珠(Beckman)对扩增后获得的产物进行纯化，去除反转录和扩增过程中的引物序列等，以及200bp以下的小片段序列。
可选的，所述步骤3的PCR体系如下：PCR扩增试剂20μL(包含dNTP、DNA聚合酶、镁离子等)混合均匀；使用前述试剂盒中的任意一个，选择其中4个引物对或者3个引物对中的一个或更多个，每次使用引物对的数量可根据家系致病变异选择，上下游引物各1μL；cDNA模板2μL，ddH2O 17μL；进一步优选的PCR程序为：94℃ 5min；35个循环：94℃ 30s,57℃ 30s,72℃ 4min；72℃ 10min；4℃保存。
本发明的应用方法中，在步骤4将测序结果与参考基因组进行比对，如果一致，则不携带致病变异；如该位点为杂合，观察到致病变异等位基因，则携带致病变异。
第三方面，本发明提供了一种用于着床前胚胎NF1基因检测的系统，其包括：
样本预处理装置，所述样本预处理装置用于从外滋养层细胞获得核酸样本；
特定核酸序列扩增装置，所述特定核酸序列扩增装置与所述核酸提取装置相连，用于使用前述的NF1基因检测试剂盒对NF1基因的至少一部分进行扩增；
测序装置，所述测序装置与所述核酸序列确定装置相连，以便对所述扩增得到的产物进行测序分析。
进一步地，本发明的于着床前胚胎NF1基因检测的系统中，样本预处理装置包括：
细胞裂解单元，所述细胞裂解单元中使得所述外滋养层细胞得到充分裂解，暴露出其中的mRNA；
反转录单元，所述反转录单元通过将反转录试剂加入所述细胞裂解单元得到，用于对所述mRNA进行反转录反应，继而获得cDNA；
核酸扩增单元，所述核酸扩增单元中使用随机引物对所述所述cDNA进行扩增，得到所述核酸样本。
可选地，本发明的于着床前胚胎NF1基因检测的系统中，所述外滋养层细胞是囊胚期的外滋养层细胞。
可选地，本发明的于着床前胚胎NF1基因检测的系统中，所述细胞裂解单元中裂解细胞是这样进行的：
将所述外滋养层细胞置于裂解液中，充分震荡30-60秒，然后72℃孵育，使细胞裂充分解，所述裂解液包含RNA酶抑制剂、dNTP、Triton X-100、无核酸酶水。
可选地，本发明的于着床前胚胎NF1基因检测的系统中，所述样本预处理装置还包括纯化单元，得到所述核酸样本之前，在所述纯化单元中使用磁珠对所述核酸扩增单元得到的产物进行纯化。
第四方面，本发明提供了一种用于着床前胚胎NF1基因检测的方法，其包括以下步骤：
裂解外滋养层细胞获得mRNA，使用所述mRNA和反转录引物进行反转录，然后使用所述反转录得到的cDNA产物和随机引物进行扩增，得到核酸样本；
使用本发明第一方面的试剂盒与所述核酸样本进行目标序列的扩增；
对所述扩增得到的产物进行测序，然后进行分析。
第五方面，本发明提供一种从mRNA水平对着床前的胚胎进行目标基因序列检测的方法，其包括：
S1：裂解外滋养层细胞获得mRNA，使用polyT或针对所述目标基因序列设计的反转录引物进行逆转录，得到cDNA，然后使用随机引物对所述cDNA进行扩增，得到核酸样本；
S2：使用所述核酸样本和针对所述目标基因序列设计的扩增引物对进行扩增，得到经扩增的DNA样本；
S3：对S2的所述DNA样本进行测序，然后与参考基因组进行比对，得出结论。
优选地，所述目标基因为含有多个外显子的单基因疾病致病基因。
第六方面，本发明提供一种从mRNA水平对着床前的胚胎进行目标基因序列检测的试剂盒，该目标基因为含有多个外显子的单基因疾病致病基因，该试剂盒包括如下设计的n对引物，所述n为大于2的自然数，其中第2对引物的上游引物位于第1对引物的下游引物的上游或与之重叠，以此类推，第n对引物的上游引物位于第n-1对引物的下游引物的下游或与之重叠，即所述n个引物对扩增的序列涵盖了所述目标基因所有外显子的完整CDS区，且所述n个引物对的每个引物对的上游引物和下游引物分别设计在所述目标基因的不同外显子区域。
第七方面，本发明提供了一种对着床前的胚胎进行目标基因序列检测的系统，其包括：
样本预处理装置，所述样本预处理装置用于从外滋养层细胞获得核酸样本；
特定核酸序列扩增装置，所述特定核酸序列扩增装置与所述核酸提取装置相连，使用所述核酸样本和针对所述目标基因序列设计的扩增引物对进行扩增，得到经扩增的DNA样本；
以及
判断装置，所述判断装置与所述核酸序列确定装置相连，对所述cDNA样本进行测序，然后与参考基因组进行比对。
可选地，本发明的对着床前的胚胎进行目标基因序列检测的系统中，所述样本预处理装置包括：
细胞裂解单元，所述细胞裂解单元中使得所述外滋养层细胞得到充分裂解，暴露出其中的mRNA；
反转录单元，所述反转录单元通过将反转录试剂加入所述细胞裂解单元得到，用于对所述mRNA进行反转录反应，继而获得cDNA；
核酸扩增单元，所述核酸扩增单元中使用随机引物对所述所述cDNA进行扩增，得到所述核酸样本。
可选地，本发明的对着床前的胚胎进行目标基因序列检测的系统中，所述细胞裂解单元中裂解细胞是这样进行的：
将所述外滋养层细胞置于裂解液中，充分震荡30-60秒，然后72℃孵育，使细胞裂充分解，所述裂解液包含RNA酶抑制剂、dNTP、Triton X-100、无核酸酶水。
可选地，本发明的对着床前的胚胎进行目标基因序列检测的系统中，所述样本预处理装置还包括纯化单元，得到所述核酸样本之前，在所述纯化单元中使用磁珠对所述核酸扩增单元得到的产物进行纯化。
可选地，本发明的对着床前的胚胎进行目标基因序列检测的系统中，所述目标基因为含有多个外显子的单基因疾病致病基因，所述扩增引物包括如下设计的n对引物，所述n为大于2的自然数，其中第2对引物的上游引物位于第1对引物的下游引物的上游或与之重叠，以此类推，第n对引物的上游引物位于第n-1对引物的下游引物的下游或与之重叠，即所述n个引物对扩增的序列涵盖了所述目标基因所有外显子的完整CDS区，且所述n个引物对的每个引物对的上游引物和下游引物分别设计在所述目标基因的不同外显子区域。
本发明的优点至少包括以下：
1.提供了一种对着床前的胚胎进行NF1基因序列检测的引物设计方法，NF1是一个大基因，在基因组中跨越超过275kb，包含57个组成型外显子和至少三个交替剪接的外显子，还存在15个高度同源的假基因。在成人基因组水平NF1的基因检测尚存在一定的困难，在胚胎单细胞水平基因组只有2个拷贝，经过全基因组扩增后，检测难度更大，存在检测失败和脱扣的风险；而本发明提供的基于mRNA的检测方案可以克服这一缺陷，mRNA相对基因组来说复杂性降低，且拷贝数多，检测成功率高，脱扣风险低。
2.提供了一种对着床前的胚胎进行NF1基因序列检测的试剂盒，常规PGT会通过位点检测和家系连锁分析来进行双重诊断，以提高诊断精准性。但对于将近一半的NF1患者来说，其致病变异是新发变异，无家系成员来进行连锁分析诊断，只能依靠位点检测。对于这50％的患者来说，PGT-M的检测只能进行直接位点检测，面临着高失败率和高误诊风险。而本发明提供的基于mRNA的检测试剂盒，扩增难度下降，检测成功率高。
3.提供了一种对着床前的胚胎进行目标基因序列检测的试剂盒和引物设计方法，目标基因含有多个外显子的单基因疾病致病基因，n对引物对的设计满足以下条件，n为大于2的自然数，第2对引物的上游引物位于第1对引物的下游引物的上游或与之重叠，以此类推，第n对引物的上游引物位于第n-1对引物的下游引物的下游或与之重叠，即n个引物对扩增的序列涵盖了所述目标基因所有外显子的完整CDS区，且n个引物对的每个引物对的上游引物和下游引物分别设计在所述目标基因的不同外显子区域，从而实现了从mRNA进行基因序列扩增，避免假基因和内含子的阻碍，覆盖全部的CDS区。
4.提供了一种对着床前的胚胎进行目标基因序列检测的系统，该系统绕开了样本量过少的难点，对于在着床前表达的单基因致病基因通过mRNA进行后续测序，提供了一种高效的检测测系统，检测成功率高，脱扣风险低。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1.本发明实施例1的引物对设计示意图；
图2.实施例4的胚胎1样本NF1基因c.6426dupG位点Sanger测序结果；
图3.实施例4的胚胎2样本NF1基因c.6426dupG位点Sanger测序结果；
图4.实施例5的胚胎1样本NF1基因c.910C>T位点Sanger测序结果；
图5.实施例5的胚胎2样本NF1基因c.910C>T位点Sanger测序结果；
图6.实施例5的胚胎3样本NF1基因c.910C>T位点Sanger测序结果。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
NF1基因包含57个组成型外显子和至少三个交替剪接的外显子，此外，人类基因组中还存在15个与NF1基因高度同源的假基因，其假基因在染色体的分布如图1所示。
实施例1
本发明提供了一种NF1基因试剂盒，我们根据NF1基因中假基因的分布，选择无假基因的外显子区域，设计4对特异性针对NF1基因的引物，覆盖整个NF1基因外显子区域。
该试剂盒包括以下4个引物对中的一个或更多个，4个引物对具体如下：具体如下：
1).引物对1
覆盖外显子1-7，扩增片段长度900bp
上游引物1：ACCCTCTCCTTGCCTCTT(SEQ ID No：1)
下游引物1：TGCTTTACGTTTGGTGCTTTC(SEQ ID No：2)
2).引物对2
覆盖外显子8-29，扩增片段长度3382bp
上游引物2：GGTTGCGCAGTTAGCAGTTAT(SEQ ID No：3)
下游引物2：CTCAAGGCTCTCTGATGGTTCTA(SEQ ID No：4)
3).引物对3
覆盖外显子30-40，扩增片段长度2329bp
上游引物3：GCTTTGAAGTGGATCCTACCA(SEQ ID No：5)
下游引物3：GGACCTGTGGCTACTAAGAAAG(SEQ ID No：6)
4).引物对4
覆盖外显子41-57，扩增片段长度2674bp
上游引物4：GAAGCCTTGGGCAGATTACA(SEQ ID No：7)
下游引物4：CATCTGGCAACATGGCAAAC(SEQ ID No：8)。
实施例2
本发明提供了另一种NF1基因试剂盒，其包括以下3个引物对中的一个或更多个，3个引物对具体如下：
1).引物对5
上游引物5：CAGACCCTCTCCTTGCCTCTT(SEQ ID No：9)
下游引物5：TCCCAAGCACACGAACATAC(SEQ ID No：10)
2).引物对6
上游引物6：GGATCGGCTGTTGTCCTTAAT(SEQ ID No：11)
下游引物6：CTACAGCAGTATCTGCCATCAC(SEQ ID No：12)
3).引物对7
上游引物7：GAAGCCTTGGGCAGATTACA(SEQ ID No：13)
下游引物7：CATCTGGCAACATGGCAAAC(SEQ ID No：14)。
实施例3
实施例2的试剂盒的应用方法，即检测胚胎NF1基因的CDS区序列的方法，包括：
样本收集与cDNA合成
1.样本收集
通过卵胞浆内单精子注射的方式获得受精卵，培养至囊胚期，对囊胚进行外滋养层细胞活检，每个样本获得约3个细胞。将收集到的细胞置于mRNA反转所用的裂解液中，裂解液所含成分为RNA酶抑制剂、dNTP、Triton X-100、无核酸酶水，该裂解液为自配试剂，可稳定保存细胞于-80℃。
2.获得足够用于检测的cDNA
2.1细胞裂解
将收集到的样本充分震荡30-60秒，然后72℃孵育3分钟，使细胞裂充分解。
2.2互补cDNA链的合成
在2.1得到的裂解后的样本中加入反转录混合液，进行互补cDNA链的合成。该反转录体系为自配试剂，成分包括RNA酶抑制剂、dNTP、polyT引物、Triton X-100、SuperScriptII逆转录酶、0.1M DTT、甜菜碱Betaine(5M)、MgCl2(1M)Superscript II第一链buffer(5×)、无核酸酶水、末端固定序列。反转录程序为：25℃ 5min；42℃ 60min；50℃ 30min；70℃10min；4℃保存。
2.3PCR扩增获得cDNA
以2.2中合成的互补链为模板进行PCR扩增，得到足够的cDNA进行后续诊断。向2.2中所得产物中加入扩增混合液，成分包括Tag DNA合成酶、固定序列上游引物、固定序列下游引物、无核酸酶水。扩增程序为：95℃ 3min；18个循环：98℃ 20s,66℃ 15s,72℃ for5min；72℃ 5min；4℃保存。
2.4cDNA纯化
使用0.8×磁珠(Beckman)对扩增后获得的产物进行纯化，去除反转录和扩增过程中的引物序列等，以及200bp以下的小片段序列。
3.及NF1基因cDNA靶向扩增
使用实施例2中试剂盒的3个引物对和前述经纯化的cDNA，进行PCR靶向扩增。PCR体系如下：PCR扩增试剂20μL(包含dNTP、DNA聚合酶、镁离子等)混合均匀；上下游引物各1μL；cDNA模板2μL，ddH2O 17μL。PCR程序为：94℃5min；35个循环：94℃ 30s,57℃ 30s,72℃4min；72℃ 10min；4℃保存。产物送一代测序公司进行Sanger测序(生工/天一辉远)
4.致病变异Sanger测序分析
使用Chromas软件对测序结果进行分析，查看致病变异位点的具体情况。如与参考基因组一致，则不携带致病变异。如该位点为杂合，观察到致病变异等位基因，则携带致病变异。
实施例4
在一个体外实验中使用实施例1或2的试剂盒进行实施例3描述的方法：
该家系女方和女方父亲为I型神经纤维瘤患者，基因检测提示女方和女方父亲携带NF1基因c.6426dupG(外显子43)杂合突变。夫妻双方通过PGT-M进行I型神经纤维瘤疾病阻断。
1.囊胚外滋养层细胞样本获取
经卵胞浆内单精子显微注射后，共2枚受精卵发育至囊胚(胚胎1、胚胎2)，对这2枚胚胎进行囊胚外滋养层细胞活检，胚胎1获得4个囊胚外滋养层细胞，胚胎2获得3个囊胚外滋养层细胞。将收集到的胚胎1细胞样本和胚胎2细胞样本分别置于裂解液中(裂解液所含成分为RNA酶抑制剂、dNTP、Triton X-100、无核酸酶水，该裂解液为自配试剂)，收集到的样本保存于-80℃。
2.获得足够用于检测的cDNA
2.1细胞裂解
将胚胎1、胚胎2细胞样本充分震荡30-60秒，然后72℃孵育3分钟，使细胞裂充分解。
2.2互补cDNA链的合成
在2.1裂解后的胚胎1、胚胎2样本中分别加入反转混合液，进行互补cDNA链的合成。该反转体系为自配试剂，成分包括RNA酶抑制剂、dNTP、polyT引物、Triton X-100、SuperScript II逆转录酶、0.1M DTT、甜菜碱Betaine(5M)、MgCl2(1M)Superscript II第一链buffer(5×)、无核酸酶水、末端固定序列。反转程序为：25℃ 5min；42℃ 60min；50℃30min；70℃ 10min；4℃保存。
2.3PCR扩增获得cDNA
向2.2中所得的胚胎1、胚胎2样本中分别加入扩增混合液，成分包括Tag DNA合成酶、固定序列上游引物、固定序列下游引物、无核酸酶水。扩增程序为：95℃ 3min；18个循环：98℃ 20s,66℃ 15s,72℃ for 5min；72℃ 5min；4℃保存。
2.4cDNA纯化
使用0.8×磁珠(Beckman)对扩增后获得的胚胎1产物、胚胎2产物进行纯化，去除反转录和扩增过程中的引物序列等，以及200bp以下的小片段序列，获得cNDA样本。
3.NF1基因c.DNA靶向扩增
已知该家系变异c.6426dupG位于43号外显子，使用引物对4或引物对7对胚胎1、胚胎2cDNA样本进行PCR扩增。PCR体系如下：PCR扩增试剂20μL(包含dNTP、DNA聚合酶、镁离子等)混合均匀；上下游引物各1μL；2.4中所得胚胎1/胚胎2的cDNA模板2μL，ddH2O 17μL。PCR程序为：94℃ 5min；35个循环：94℃ 30s,57℃ 30s,72℃ 4min；72℃ 10min；4℃保存。产物送一代测序公司进行Sanger测序(生工/天一辉远)。
4.致病变异Sanger测序分析
使用Chromas软件对测序结果进行分析，查看是否携带NF1基因c.6426dupG突变。如图1所示，胚胎1该位点为G，前后序列无突变，与参考基因组一致。故诊断结果为胚胎1不携带该变异。如图2所示，胚胎2该位点为G，之后右侧序列出现双峰。与参考基因组相比，其中一条等位基因链在箭头所示位置插入一个G碱基，即胚胎2携带NF1基因c.6426dupG杂合突变。
实施例5
在又一个体外实验中使用实施例2的试剂盒进行实施例3描述的方法：
案例二家系情况：该家系女方和女方父亲为I型神经纤维瘤患者，基因检测提示女方和女方父亲携带NF1基因c.910C>T(外显子9)杂合突变。夫妻双方通过PGT-M进行I型神经纤维瘤疾病阻断。
1.囊胚外滋养层细胞样本获取
经卵胞浆内单精子显微注射后，共3枚受精卵发育至囊胚(胚胎1、胚胎2、胚胎3)，对这3枚胚胎进行囊胚外滋养层细胞活检，胚胎1获得5个囊胚外滋养层细胞，胚胎2获得3个囊胚外滋养层细胞，胚胎3获得4个囊胚外滋养层细胞。将收集到的胚胎1细胞样本、胚胎2细胞样本和胚胎3细胞样本分别置于裂解液中(裂解液所含成分为RNA酶抑制剂、dNTP、TritonX-100、无核酸酶水，该裂解液为自配试剂)，收集到的样本保存于-80℃。
2.获得足够用于检测的cDNA
2.1细胞裂解
将胚胎1、胚胎2、胚胎3细胞样本充分震荡30-60秒，然后72℃孵育3分钟，使细胞裂充分解。
2.2互补cDNA链的合成
在2.1裂解后的胚胎1、胚胎2、胚胎3样本中分别加入反转混合液，进行互补cDNA链的合成。该反转体系为自配试剂，成分包括RNA酶抑制剂、dNTP、polyT引物、Triton X-100、SuperScript II逆转录酶、0.1M DTT、甜菜碱Betaine(5M)、MgCl2(1M)Superscript II第一链buffer(5×)、无核酸酶水、末端固定序列。反转程序为：25℃ 5min；42℃ 60min；50℃30min；70℃ 10min；4℃保存。
2.3PCR扩增获得cDNA
向2.2中所得的胚胎1、胚胎2、胚胎3样本中分别加入扩增混合液，成分包括TagDNA合成酶、固定序列上游引物、固定序列下游引物、无核酸酶水。扩增程序为：95℃ 3min；18个循环：98℃ 20s,66℃ 15s,72℃ for 5min；72℃5min；4℃保存。
2.4cDNA纯化
使用0.8×磁珠(Beckman)对扩增后获得的胚胎1产物、胚胎2产物、胚胎3产物进行纯化，去除反转录和扩增过程中的引物序列等，以及200bp以下的小片段序列，获得cNDA样本。
3.NF1基因cDNA靶向扩增
该家系变异c.910C>T位于9号外显子，使用引物对2或引物对5对胚胎1、胚胎2、胚胎3cDNA样本进行PCR扩增。PCR体系如下：PCR扩增试剂20μL(包含dNTP、DNA聚合酶、镁离子等)混合均匀；上下游引物各1μL；2.4中所得胚胎1/胚胎2/胚胎3的cDNA模板2μL，ddH2O 17μL。PCR程序为：94℃ 5min；35个循环：94℃ 30s,57℃ 30s,72℃ 4min；72℃ 10min；4℃保存。产物送一代测序公司进行Sanger测序(生工/天一辉远)。
4.致病变异Sanger测序分析
使用Chromas软件对测序结果进行分析，查看是否携带NF1基因c.910C>T突变。如图3所示，胚胎1该位点为C，与参考基因组一致。故诊断结果为胚胎1不携带该变异。如图4所示，胚胎2该位点为杂合C/T，参考基因组该位点为C，故胚胎2携带NF1基因c.910C>T杂合突变。如图5所示，胚胎3该位点为C，与参考基因组一致。故诊断结果为胚胎1不携带该变异。

Claims (3)

1.一种用于从mRNA水平检测着床前胚胎NF1基因的试剂盒，其特征在于，包括设计的3个引物对或4个引物对，
所述4个引物对具体如下：
1）引物对1
上游引物1：ACCCTCTCCTTGCCTCTT（SEQ ID No：1）
下游引物1：TGCTTTACGTTTGGTGCTTTC（SEQ ID No：2）
2）引物对2
上游引物2：GGTTGCGCAGTTAGCAGTTAT（SEQ ID No：3）
下游引物2：CTCAAGGCTCTCTGATGGTTCTA（SEQ ID No：4）
3）引物对3
上游引物3：GCTTTGAAGTGGATCCTACCA（SEQ ID No：5）
下游引物3：GGACCTGTGGCTACTAAGAAAG（SEQ ID No：6）
4）引物对4
上游引物4：GAAGCCTTGGGCAGATTACA（SEQ ID No：7）
下游引物4：CATCTGGCAACATGGCAAAC（SEQ ID No：8）；
所述3个引物对具体如下：
1）引物对5
上游引物5：CAGACCCTCTCCTTGCCTCTT（SEQ ID No：9）
下游引物5：TCCCAAGCACACGAACATAC（SEQ ID No：10）
2）引物对6
上游引物6：GGATCGGCTGTTGTCCTTAAT（SEQ ID No：11）
下游引物6：CTACAGCAGTATCTGCCATCAC（SEQ ID No：12）
3）引物对7
上游引物7：GAAGCCTTGGGCAGATTACA（SEQ ID No：13）
下游引物7：CATCTGGCAACATGGCAAAC（SEQ ID No：14）。
2.一种用于着床前胚胎NF1基因检测的非疾病诊断目的的方法，其特征在于，包括以下步骤：
裂解外滋养层细胞获得mRNA，使用所述mRNA和反转录引物进行反转录，然后使用所述反转录得到的cDNA产物和随机引物进行扩增，得到核酸样本；
使用权利要求1所述的试剂盒与所述核酸样本进行目标序列的扩增；
对所述扩增得到的产物进行测序，然后进行分析。
3.权利要求1所述的试剂盒的非疾病诊断目的的应用方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：活检样本收集，裂解细胞，制备cDNA模板,
步骤2：PCR扩增对所述cDNA模板进行富集，以及纯化经扩增的cDNA模板，
步骤3：使用所述cDNA模板和权利要求1所述试剂盒的引物对进行扩增，
步骤4：对得到的序列进行测序并与参考序列比对。
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