CN117778562A - 一种ube3b突变基因、检测试剂盒、方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因检测技术领域，具体涉及一种UBE3B突变基因、检测试剂盒、方法；本方法包括取胎儿羊水样本及其父母的血液样本，进行DNA提取；设计UBE3B:c.1283‑6T>G和UBE3B:c.649_653del位点的引物；进行PCR扩增；将PCR扩增后的产物进行纯化，再进行Sanger测序，判断UBE3B:c.1283‑6T>G和UBE3B:c.649_653del位点是否发生变异，2个变异是否分别遗传自父母一方；本发明通过设计引物，对UBE3B:c.1283‑6T>G和UBE3B:c.649_653del位点进行突变检测，通过对胎儿羊水样本及其父母进行基因检测，判断胎儿患Kaufman眼脑面综合征的几率，实现对胎儿患Kaufman眼脑面综合征的产前诊断。
Description
技术领域
本发明属于医学诊断试剂技术领域，具体涉及一种UBE3B突变基因、检测试剂盒、方法。
背景技术
Kaufman眼脑面综合征(Kaufman Oculo-cerebro-facial Syndrome，KOS)是一种罕见的遗传性疾病，Kaufman眼脑面综合征呈常染色体隐性遗传，是一种影响机体多系统的遗传性疾病。临床特征主要表现为：严重的智力障碍、发育迟缓、小头畸形、小颌畸形、肌张力减退、上睑下垂、内眦赘皮、斜视、耳廓畸形、听力损失、肾脏和外生殖器发育畸形等，可伴有低促肾上腺皮质激素水平和胆固醇水平异常等。脑部MRI可见胼胝体发育不全或未发育。Kaufman眼脑面综合征具有高度异质性的临床表型，与Goldenhar综合征、Coffin-Siris综合征等疾病具有表型的重叠性，仅通过临床表型很难鉴别诊断。
目前Kaufman眼脑面综合征的诊断建立在具有发育迟缓/智力残疾和双等位基因UBE3B致病变异的先证者中，UBE3B致病性变异的杂合子，则患者的每个未出生的弟妹在受孕时有25％的可能会患病，有50％的机会成为无症状携带者，并将致病基因继续遗传下去，并且有25％的机会不遗传任父亲和母亲致病变异。一旦在患病的家庭成员中鉴定出UBE3B致病性变异，就可以对有风险的亲属进行携带者基因检测，对高风险妊娠进行产前检测，以及进行植入前基因检测。
UBE3B编码蛋白质泛素-蛋白质连接酶E3B，一种线粒体相关蛋白，包含一个N端IQ结构域和一个C端HECT结构域。该蛋白质较长同工型的C末端HECT结构域可能是泛素转移的催化位点，并与E2结合酶形成复合物。这种蛋白质的较短同种型缺乏C末端HECT结构域，如果产生，不太可能与E2酶相互作用。
UBE3B在中枢神经系统、消化道和呼吸系统以及皮肤和其他软组织的多个细胞谱系中高度表达。在大脑中，UBE3B与突触后密度分数相关，并以细胞自主方式调节树突分支[Ambrozkiewicz et al 2020]。
在患有Kaufman眼脑面综合征的个体中发现的UBE3B致病变异是HECT结构域高度保守的氨基酸残基中的错义替换，或预计会导致无义介导的mRNA衰变和/或蛋白质截短的移码和无义变异。这些变体可能会抑制所有E3连接酶活性[Basel-Vanagaite et al 2012,Basel-Vanagaite et al 2014,Ambrozkiewicz et al 2020]。
UBE3B有五种转录变体：两种编码更长的转录本(NM_130466.3、NM_183415.2)，包含28个外显子并编码1,068个氨基酸的蛋白质亚型(～123kd)；三个编码较短的转录变体(NM_001270449.1、NM_001270451.1、NM_001270450.1)，它们包含九个外显子，预计编码一个244个氨基酸的蛋白质。
但目前国内尚没有关于检测UBE3B基因突变，作为在产前诊断Kaufman眼脑面综合征携带者标准的案例报道，更没有相应的产前检测手段。
发明内容
有鉴于此，本发明的第一个目的在于提供检测引发Kaufman眼脑面综合征的突变基因的试剂在制备Kaufman眼脑面综合征检测的试剂盒中的应用，助力UBE3B基因突变的筛查和Kaufman眼脑面综合征携带者的诊断，并为其药物筛选、药效评价及靶向治疗提供新的技术支持。
检测引发Kaufman眼脑面综合征的突变基因的试剂在制备Kaufman眼脑面综合征检测的试剂盒中的应用，所述突变基因携带两个突变位点分别为：
UBE3B基因的第13号内含子的第1283位碱基的上游第6位碱基由T突变为G，具体信息为：UBE3B:NM_130466.4:intron13:c.1283-6T>G；野生型UBE3B基因如SEQ ID NO.5所示，突变位点UBE3B:NM_130466.4:intron13:c.1283-6T>G位于自该核苷酸序列第14号外显子区(30391..30536)的第1个碱基(第14号外显子编码区的第1283位)为基准向上游数第6个碱基；
UBE3B基因转录本的第9号外显子缺失第649～653位碱基后，使UBE3B基因转录本的第9号外显子编码蛋白的第217位氨基酸由亮氨酸移码突变为赖氨酸，且编码蛋白的氨基酸序列在第272位发生提前终止，具体信息为：UBE3B:NM_130466.4:exon9:c.649_653del:p.L217Kfs*55。
野生型UBE3B基因转录本UBE3B:NM_130466.4的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，移码突变位点UBE3B:NM_130466.4:exon9:c.649_653位于自SEQ ID NO.6所示的5’UTR末端终点后第649～653位碱基。
本发明的第二个目的在于提供一种UBE3B基因突变检测试剂盒，所述试剂盒包括用于扩增所述突变基因携带的两个突变位点的引物对。
所述试剂盒包括用于扩增所述突变基因携带的两个突变位点的引物对和Taq DNA聚合酶。
优选的，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-4所示。
所述试剂盒还包括dNTPs、Taq酶、Mg2+和PCR反应缓冲液。
本发明的第三个目的在于提供所述突变基因的检测方法，所述方法包括：
1)提取样本基因组DNA；
2)通过PCR扩增UBE3B基因组序列和UBE3B基因第9号外显子区域；
3)DNA测序；
4)将待检测样本DNA测序结果与正常人基因组DNA转录本序列比对，判断UBE3B基因转录本的第13号内含子区是否存在c.1283-6T>G的单核苷酸碱基突变，将待检测样本DNA测序结果与UBE3B基因转录本序列比对，判断UBE3B基因转录本的第9号外显子的第649～653位碱基是否缺失；
所述检测方法不用于疾病的诊断和治疗目的。
优选的，所述PCR的反应条件为：95℃变性5min，以95℃30s,57℃30s,72℃90s循环35次；72℃5min。
本发明分析碱基突变导致的编码氨基酸及蛋白活性、基因功能的改变，为UBE3B基因的分离和功能分析以及UBE3B基因相关基因的遗传学和进化分析提供参考，同时，为建造Kaufman眼脑面综合征遗传模型提供基因工程技术帮助。本发明的上述的方法可以应用在筛选或制备用于诊断和/或治疗Kaufman眼脑面综合征的药物中。
附图说明
图1为患者家系UBE3B:c.1283-6T>G位点碱基的二代测序结果图；
图2为患者家系UBE3B:c.649_653del位点碱基的二代测序结果图；
图3为患者家系UBE3B:c.1283-6T>G位点碱基的一代测序结果图；
图4为患者家系UBE3B:c.649_653del位点碱基的一代测序结果图；
图5一名家系外正常人的UBE3B:c.1283-6T>G位点碱基的二代测序结果图；
图6一名家系外正常人的UBE3B:c.1283-6T>G位点碱基的二代测序结果图；
图7一名家系外正常人的UBE3B:c.1283-6T>G位点碱基的一代测序结果图；
图8一名家系外正常人的UBE3B:c.649_653del位点碱基的二代测序结果图；
图9一名家系外正常人的UBE3B:c.649_653del位点碱基的二代测序结果图；
图10一名家系外正常人的UBE3B:c.649_653del位点碱基的一代测序结果图；
图11为NM__130466.4:c.649_653del:p.L217Kfs*55在gnomAD数据库中上下游位置的变异情况；
图12为NM_130466.4:c.1283-6T>G在gnomAD数据库中上下游位置的变异情况；
图13遗传变异分类标准；
图14遗传变异分类联合标准规则；
图15患者UBE3B:c.1283-6T>G位点碱基的一代测序结果图；
图16患者UBE3B:c.649_653del位点碱基的一代测序结果图；
图17患者家系UBE3B:c.1283-6T>G位点碱基的一代测序结果图
图18患者家系UBE3B:c.649_653del位点碱基的一代测序结果图。
具体实施方式
本发明提供了一种Kaufman眼脑面综合征的突变基因，所述突变基因包括在UBE3B:NM_130466.4:intron13:c.1283-6T>G和UBE3B:NM_130466.4:exon9:c.649_653del:p.L217Kfs*55位点发生复合杂合突变。
UBE3B:NM_130466.4:intron13:c.1283-6T>G指野生型UBE3B基因(GenBank号：NM_130466.4)的第14号外显子第1个碱基为基准向上游数第6个碱基由T突变为G)，UBE3B:NM_130466.4:exon9:c.649_653del:p.L217Kfs*55指野生型UBE3B基因(GenBank号：NM_130466.4)转录本的第9号外显子的第649～653位碱基删除，导致UBE3B基因转录本的第9号外显子编码的突变体蛋白与野生型UBE3B基因转录本的第9号外显子编码的蛋白相比，第217位亮氨酸(L)移码突变为赖氨酸(K)，使UBE3B基因转录本的第9号外显子编码蛋白的氨基酸序列在第272位发生提前终止)。
本发明所述新型突变基因利用外显子测序筛选与Kaufman眼脑面综合征高度相关的致病基因突变，为了避免假阳性结果出现，之后通过Sanger测序进行验证，最终获得了所述新型突变基因。在本发明中，将待检测样本DNA测序结果与UBE3B基因野生型序列进行比对，如果发现样本DNA的UBE3B:NM_130466.4:intron13:c.1283-6T>G位点的基因型是“T/G”，将待检测样本DNA测序结果与UBE3B基因转录本序列比对，UBE3B:NM_130466.4:exon9:c.649_653del:p.L217Kfs*55位点的基因型是“UBE3B基因转录本的第9号外显子的第649～653位碱基缺失”，则判断UBE3B基因存在复合杂合突变，个体为患者；若“UBE3B:NM_130466.4:intron13:c.1283-6T>G位点的基因型是T/G；UBE3B基因转录本的第9号外显子的第649～653位碱基未缺失”或“UBE3B:NM_130466.4:intron13:c.1283-6T>G位点的基因型是T/T；UBE3B基因转录本的第9号外显子的第649～653位碱基缺失”，则判断UBE3B基因存在单个杂合突变，个体是携带者；若“UBE3B:NM_130466.4:intron13:c.1283-6T>G位点的基因型是T/T；UBE3B基因转录本的第9号外显子的第649～653位碱基未缺失”，则判断UBE3B基因为野生型，个体是正常人。
本发明还提供了一种由上述突变基因引发的Kaufman眼脑面综合征的检测试剂，所述检测试剂包括针对所述基因突变的位点设计的特异性扩增引物。
本发明所述特异性扩增引物，见表1，优选包括：
表1特异性扩增引物
本发明还提供了一种Kaufman眼脑面综合征的检测试剂盒，包括上述检测试剂。
本发明所述试剂盒，优选还包括PCR扩增反应的试剂。本发明所述PCR扩增反应的试剂，优选包括dNTP、PCR缓冲液、镁离子和Tap聚合酶。
本发明还提供了上述检测试剂或上述检测试剂盒在制备Kaufman眼脑面综合征的诊断试剂中的应用。
本发明还提供了检测UBE3B基因是否存在上述基因突变的方法，优选包括一下步骤：
1)提取样本基因组DNA；
2)扩增UBE3B基因组序列和UBE3B基因第9号外显子区域；
3)DNA测序；
4)将待检测样本DNA测序结果与正常人基因组DNA序列比对，如果发现样本DNA的UBE3B:NM_130466.4:intron13:c.1283-6T>G位点的基因型是“T/G”，将待检测样本DNA测序结果与UBE3B基因转录本序列比对，如果发现UBE3B:NM_130466.4:exon9:c.649_653del:p.L217Kfs*55位点的基因型是“UBE3B基因转录本的第9号外显子的第649～653位碱基缺失”，则判断UBE3B基因存在复合杂合突变，个体为患者；若“UBE3B:NM_130466.4:intron13:c.1283-6T>G位点的基因型是T/G；UBE3B基因转录本的第9号外显子的第649～653位碱基未缺失”或“UBE3B:NM_130466.4:intron13:c.1283-6T>G位点的基因型是T/T；UBE3B基因转录本的第9号外显子的第649～653位碱基缺失”，则判断UBE3B基因存在单个杂合突变，个体是携带者；若“UBE3B:NM_130466.4:intron13:c.1283-6T>G位点的基因型是T/T；UBE3B基因转录本的第9号外显子的第649～653位碱基未缺失”，则判断UBE3B基因为野生型，个体是正常人。
在本发明中，所述扩增UBE3B基因序列的体系，以25μL计，优选包括：2xTaq PCRMsaterMix 12.5μL、hg38-UBE3B-109503017-F和hg38-UBE3B-109503017-R(或hg38-UBE3B-109491059-F和hg38-UBE3B-109491059-R)分别1.0μL、与磁珠结合的DNA 100ng、ddH2O补足至25μL。在本发明中，扩增程序优选为：95℃变性5min，以95℃30s,57℃30s,72℃90s循环35次；72℃5min。
在本发明中，所述扩增UBE3B基因序列的体系，以102μL计，优选包括：2×KAPAHiFiHotStartReadyMix 25.0μL、Ilumina 2.0μL、P5/P7 Primer Mix(25μM/μL)25.0μL、与磁珠结合的DNA(1μg/μL)50μL。在本发明中，扩增程序优选为：98℃45s；(98℃15s，65℃30s，72℃30s)11个循环；72℃1min。
本发明对所述DNA测序的方法并没有特殊限定，优选利用本领域的常规测序手段进行测序即可，如sanger测序。
具体的，扩增UBE3B基因序列，扩增UBE3B基因序列产物经2％琼脂糖凝胶电泳检测确认为单一条带。将PCR扩增产物纯化后，进行sanger测序。
本发明所述诊断试剂的检测样本优选包括血液或羊水，本发明所述诊断试剂的使用方法优选与上述相同，在此不再赘述。
下面结合实施例对本发明提供的一种新的UBE3B突变基因及其诊断试剂进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。在本发明中，术语“诊断”包括疾病风险的预测、疾病发病与否的诊断、还包括对疾病预后的评估；术语“突变”是指野生型的多核苷酸序列发生改变，成为变异体，变异体可以是天然发生的或非天然发生的；“引物”指用于在PCR反应中扩增靶标核酸的多核苷酸片段，其通常为寡核苷酸，例如含有至少5个碱基，例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个或者更多个碱基的多核苷酸片段。引物不必与待扩增的目的基因或其互补链完全互补，只要其能够特异性扩增目的基因。在本发明中，术语“特异性扩增”是指引物能够通过PCR反应扩增目的基因，而不扩增其他基因。例如，特异性扩增UBE3B基因是指，在PCR反应中引物只扩增UBE3B基因，而不扩增其他基因。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
1.样本获取
发明人于2021年12月超声发现胎儿蛛网膜下腔间隙增宽，小下颌，双耳廓发育不良、右侧明显，膀胱后方两个无回声区(考虑为生殖系统畸形)，羊水过多。胎儿核磁共振发现：胎儿下颌内收，脑外间隙增宽；左侧眼球形态不规则，左侧晶状体显示欠清；生殖系统畸形：阴道积液伴阴道纵膈，诊断胎儿为Kaufman眼脑面综合征患者，Kaufman眼脑面综合征家系部分成员的临床信息见表2。
表2
2.全外显子测序
采集胎儿羊水样本送北京贝瑞和康医学检验实验室有限公司进行全外显子测序，通过全外显子测序验证所述UBE3B:c.1283-6T>G和UBE3B:c.649_653del位点碱基是否变异。
2.1DNA提取
采集胎儿羊水样本，进行DNA提取。使用Nanodrop one超微量分光光度仪(ThermoFisher，美国)检测DNA纯度和浓度，OD260/OD280的比值应为1.8～2.0，浓度应为50～100ng/μL，保存于-20℃备用。
2.2文库构建
1)样品打断：用非接触式超声破碎仪UCD-200(Diagenode)将样品DNA打碎成200
bp左右的片段；
2)末端修复加‘A’：在冰上向200μL离心管中加入10×F Buffer 2.5μL、F Mix5μL、纯化的DNA 50ng，最后加水补足至25μL。充分混匀、离心后置于已经设置好的PCR仪中，并按如下步骤运行程序：4℃1min；32℃26min；65℃30min；4℃∞。
3)接头连接及产物纯化：向上一步得到的反应产物中加入5μL的5μM Truseq UDI接头。配制20μL连接反应体系：5×L Buffer 10μL、L mix 5μL、无酶水5μL。将配制好的20μL连接反应体系加入含接头的样品溶液中，用移液器吹打混匀后瞬时离心，置于PCR仪中20℃反应15min。将0.8×CLEANNGS微珠置于室温30min使其预热至室温，加入40μL充分混匀的CLEANNGS微珠至连接产物中，充分混匀。室温孵育5min并瞬时离心后置于磁力架上吸附，弃上清。用200μL 80％乙醇洗涤微珠，用磁力架回收微珠，弃去上清，重复此洗涤步骤一次。将离心管置于磁力架上开盖干燥10min，加入27μL DNase and RNase-freewater充分悬浮微珠后用磁力架收集微珠，转移24μL上清至新的PCR管中。
4)文库扩增及产物纯化：将2×KAPA HiFiHotStartReadyMix和AmplificationPrimer Mix组分置冰上融化。待其融化后短暂涡旋混匀。冰上配制PCR反应体系：DNASolution from last step 24μL、2×KAPA HiFiHotStartReadyMix 25μL、P5/P7 PrimerMix(25μM)1μL。将配制好的溶液吸取26μL加入3)中的PCR管中，移液器轻柔吹打混匀6～8次，离心后置于已经设置好的PCR仪中，并按如下步骤运行程序：98℃45s；98℃15s，65℃30s，72℃30s，12个循环；72℃1min。
5)使用Nanodrop one和琼脂糖凝胶电泳对文库进行质检，并按如下标准鉴定文库质量等级，质量合格进行下一步实验。Qubit浓度标准：预文库浓度≥15ng/μL。文库特征要求：文库大小在在250～420bp，无明显拖尾，无双条带则为建库成功。
2.3杂交及产物纯化
每个文库取200ng Pre-PCR产物(4×800ng)进行杂交，将800ng TruSeq Pre-PCR产物、5μL Cot-1 DNA(1μg/μL)、2μL xGen Universial Blockers-TS Mix混匀，封口膜封口，10μL枪头打5个孔，DNA浓缩仪60℃至干粉。配制溶液：8.5μL Nimblegen×Hybridization buffer(vial 5)、3.4μL NimblegenHybridization component A(vial6)、1.1μL无酶水。将配制好的溶液加入干粉中。室温充分溶解干粉(约10min)，将上述悬液转移至0.2mL PCR管中，置于PCR仪95℃(热盖105℃)10min 30s，待程序还剩30s结束时，暂停PCR仪并加入4μL 96rxn xGen Exome Research Panel，保持PCR管在PCR仪上，迅速充分涡旋，瞬时离心，置于另一台PCR中65℃(热盖75℃)4h，65℃∞进行杂交反应。
在上述体系中加入65℃预处理的1×wash bufferⅠ100μL，中速涡旋，将混合液转移至低吸附的1.5mL EP管中，涡旋，置于磁力架弃上清；加185μL 65℃预处理的1×stringent wash buffer快速混匀，65℃孵育5min，上架弃上清；再加185μL 65℃预处理的1×stringent wash buffer快速混匀，65℃孵育5min，上架弃上清；加入190μL室温放置的1×wash bufferⅠ，中速涡旋2min，上架弃上清；加入190μL室温放置的1×wash bufferⅡ，中速涡旋1min，上架弃上清；加入190μL室温放置的1×wash bufferⅢ，中速涡旋30s，上架弃上清；加入DNase and RNase free water 23μL。
2.4PCR捕获
PCR捕获mix体系为：25μL 2×KAPA HiFiHotStartReadyMix、2μL Ilumina P5/P7Primer Mix(25μM)、50μL捕获DNA(带beads)。PCR反应程序设置如下：98℃45s；(98℃15s，65℃30s，72℃30s)11个循环；72℃1min。
2.5上机测序
使用Novaseq6000平台(Illumina,San Diego,USA)对基因组DNA进行测序。测序采用边合成边测序的方法，将四种碱基分别标记四种不同荧光，每个碱基末端被保护基团封闭，单次反应只能加入一个碱基，经扫描，读取该次反应色，该保护基团被出去，下一个反应再进行，得出碱基的精准序列。
2.6结果
判断UBE3B:c.1283-6T>G和UBE3B:c.649_653del位点碱基是否变异情况。UBE3B:c.1283-6T>G位点碱基的二代测序结果图如图1所示，父亲0-136的UBE3B:NM_130466.4:intron13:c.1283-6T>G位点的基因型是“T/G”、母亲0-178的UBE3B:NM_130466.4:intron13:c.1283-6T>G位点的基因型是“T/T”、胎儿0-140的UBE3B:NM_130466.4:intron13:c.1283-6T>G位点的基因型是“T/G”。UBE3B:c.1283-6T>G位点碱基的一代测序结果图如图3所示，FUO表示父亲，MUO表示母亲，H表示胎儿。
UBE3B:c.649_653del位点碱基的二代测序结果图如图2所示，父亲0-192的UBE3B:NM_130466.4:exon9:c.649_653del:基因型是UBE3B基因转录本的第9号外显子的第649～653位碱基未缺失、母亲0-143的UBE3B:NM_130466.4:exon9:c.649_653del:基因型是UBE3B基因转录本的第9号外显子的第649～653位碱基缺失、胎儿0-207的UBE3B:NM_130466.4:exon9:c.649_653del:基因型是UBE3B基因转录本的第9号外显子的第649～653位碱基未缺失。UBE3B:c.649_653del位点碱基的一代测序结果图如图4所示，FUO表示父亲，MUO表示母亲，H表示胎儿。
实施例2Sanger测序验证
对于外显子组测序结果进一步利用Sanger测序法，对UBE3B:c.1283-6T>G和UBE3B:c.649_653del位点进行验证。分别对两名家系外正常人进行UBE3B:c.1283-6T>G和UBE3B:c.649_653del位点基因型检测。
具体方法步骤如下：
1、DNA提取
按照实施例1的方法提基因组DNA。
2、检测用引物
针对UBE3B:c.1283-6T>G位点，引物信息如下：
hg38-UBE3B-109503017-F：TGCCTTGAATTGAGTGAGTTGC
hg38-UBE3B-109503017-R：ACCCGTTTACCCCCGACA
产物长度212bp
针对UBE3B:c.649_653del位点，引物信息如下：
hg38-UBE3B-109491059-F：TGCCTGGCTCACAATACAGTTTT
hg38-UBE3B-109491059-R：GCTATGGTTTCTTACTCACCGT
产物长度199bp
3、两名家系外人员突变位点PCR扩增
PCR扩增体系如表3
表3PCR扩增体系：
PCR扩增条件：
95℃变性5min，以95℃30s,57℃30s,72℃90s循环35次，72℃延伸5min.PCR产物经2％琼脂糖凝胶电泳检测确认为单一条带。将PCR扩增产物纯化后，再进行Sanger测序，在NCBI数据中与UBE3B基因野生型序列进行比对，判断UBE3B:c.1283-6T>G和UBE3B:c.649_653del位点碱基是否发生变异。
4、结果分析
图5和图6的High-throughput sequencing测序结果分别显示，两名家系外正常人的UBE3B:c.1283-6T>G位点的基因型是“T/T”。图7为UBE3B:c.1283-6T>G位点碱基的一代测序结果。
图8和图9的High-throughput sequencing测序结果分别显示，两名家系外正常人的UBE3B:c.649_653del位点的基因型是UBE3B基因转录本的第9号外显子的第649～653位碱基未缺失。图10为UBE3B:c.649_653del位点碱基的一代测序结果。
检索2023年4月前发表的文献，发现本例患儿UBE3B基因变异位点为未报道过的新发变异，查询gnomAD数据库(https://gnomad.broadinstitute.org/)，验证了本例发现的UBE3B基因中两种突变位点，不同时存在于已知的非致病性UBE3B基因突变中(不导致考夫曼眼-脑-面综合征的突变)。
其中NM_130466.4:c.649_653del:p.L217Kfs*55在gnomAD数据库中未见收录，NM__130466.4:c.649_653del:p.L217Kfs*55在gnomAD数据库中上下游位置的变异情况如图11所示。其中NM_130466.4:c.1283-6T>G在gnomAD数据库中未见收录，NM_130466.4:c.1283-6T>G在gnomAD数据库中上下游位置的变异情况如图12所示，
图11和图12显示了该基因所有转录本中每个变异体最严重后果的HGVS后果和VEP注释。最严重的后果发生在非标准文字记录中的病例用t表示，其中各突变的ClinicalSignificanse临床标志均为良性。
根据如图13所示的美国医学遗传学与基因组学学会遗传变异分类标准与指南中公布的如图14所示的遗传变异分类联合标准规则，由于“Loss of function of the E3ubiquitin-protein ligase UBE3B causes Kaufman oculocerebrofacial syndrome”证明了KOS是由UBE3B功能丧失(LOF)引起的，并进一步证明了蛋白质泛素化失调对发育和生长的影响，且UBE3B:c.1283-6T>G和UBE3B:c.649_653del均为无功能变异。判定UBE3B基因UBE3B:c.1283-6T>G和UBE3B:c.649_653del均为致病性变异(PVS1+PM2)。结合患儿临床表征及全外显子检测结果，诊断KOS明确。
实施例3
(0-192/0-136和0-143/0-178)家系再次妊娠后于2023年6月产检，超声发现胎儿蛛网膜下腔间隙增宽，小下颌，双耳廓发育不良、右侧明显，膀胱后方两个无回声区(考虑为生殖系统畸形)，羊水过多。胎儿核磁共振发现：胎儿下颌内收，脑外间隙增宽；左侧眼球形态不规则，左侧晶状体显示欠清；生殖系统畸形：阴道积液伴阴道纵膈，诊断胎儿为Kaufman眼脑面综合征患者。
取羊水利用Sanger测序法对胎儿的UBE3B:c.1283-6T>G和UBE3B:c.649_653del位点进行验证，结果如图15显示UBE3B:c.1283-6T>G位点的基因型是“T/G”，结果如图16，反向测序显示UBE3B:c.649_653del位点的基因型是UBE3B基因转录本的第9号外显子的第649～653位碱基未缺失。
实施例4
2023年7月(0-192/0-136和0-143/0-178)家系采用人工体外授精获得8枚胚胎，胚胎细胞遗传物质经全基因组扩增之后采用SNP-array分析UBE3B:c.1283-6T>G和UBE3B:c.649_653del位点的变异情况，结果如表4所示。
表4
UBE3B:c.649_653del位点的反向测序结果如图17，UBE3B:c.1283-6T>G的测序结果如图18。
选取UBE3B:c.1283-6T>G和UBE3B:c.649_653del位点无异常的胚胎移植到母体发育5个月后进行超声检查，未发现胎儿有Kaufman眼脑面综合征患者特征。
Claims (7)
1.检测引发Kaufman眼脑面综合征的突变基因的试剂在制备Kaufman眼脑面综合征检测的试剂盒中的应用，所述突变基因携带两个突变位点分别为：
UBE3B基因的第13号内含子的第1283位碱基的上游第6位碱基由T突变为G，具体信息为：UBE3B:NM_130466.4:intron13:c.1283-6T>G；
UBE3B基因转录本的第9号外显子缺失第649～653位碱基后，使UBE3B基因转录本的第9号外显子编码蛋白的第217位氨基酸由亮氨酸移码突变为赖氨酸，且编码蛋白的氨基酸序列在第272位发生提前终止，具体信息为：UBE3B:NM_130466.4:exon9:c.649_653del:p.L217Kfs*55。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂盒包括用于扩增所述突变基因携带的两个突变位点的引物对。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂盒包括用于扩增所述突变基因携带的两个突变位点的引物对和Taq DNA聚合酶。
4.如权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述引物对的核苷酸序列如SEQ IDNO.1-4所示。
5.如权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述试剂盒还包括dNTPs、Taq酶、Mg2+和PCR反应缓冲液。
6.如权利要求2或3所述突变基因的检测方法，其特征在于，所述方法包括：
1)提取样本基因组DNA；
2)通过PCR扩增UBE3B基因组序列和UBE3B基因第9号外显子区域；
3)DNA测序；
4)将待检测样本DNA测序结果与正常人基因组DNA序列比对，判断UBE3B基因的第13号内含子区是否存在c.1283-6T>G的单核苷酸碱基突变，将待检测样本DNA测序结果与UBE3B基因转录本序列比对，判断UBE3B基因转录本的第9号外显子的第649～653位碱基是否缺失；
所述检测方法不用于疾病的诊断和治疗目的。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述PCR的反应条件为：95℃变性5min，以95℃30s,57℃30s,72℃90s循环35次；72℃5min。
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