JPH07501691A - ディジョージ症候群変異の検出 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ディジョージ症候群変異の検出 関連した出願との関係 本出願は１９９１年１０月４日付の出願第７７０，７５８号“デイジョージ症候 群（ＤｉＧｅｏｒｇｅ　Ｓｙｄｒｏｍｅ）　、ベロカルディオフエイシャ）Ｌｒ 症候群（Ｖｅｌｏｃａｒｄｉｏｆａｃｉａｌ　Ｓｙｄｒｏｍｅ）、ＣＨＡＲＧＥ 関連病（ＣＨＲＧＥ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｉｏｎ）、およびコノトランカルな心臓 欠損（Ｃｏｎｔｒｕｎｃａｌ　Ｄｅｆｅｃｔ）の診断法”の一部継続出願であり 、原出願の全内容は、本明細書中に参考文献として取り入れる。

発明の分野 本発明はヒト診断学の分野に関する。より具体的には、本発明はデイジョージ症 候群（ＤＧＳ）　、並びにべロ力ルデイオフエイシャル（シュプリンツエン）症 候群、ＣＨＡＲＧＥ関連病、コノトランカルな心臓欠損およびヒドロ蓋裂（Ｃ１ ｅｆｔ　ｐａｌａｔｅ）等の関連する症候群に関連した遺伝的欠失および変異の 検出に関し、これらの病気に関連した全ての欠失および変異について実質的に重 複している共通領域の中にあるプローブを用いる。

発明の背景 ディジョージ症候群（ＤＧＳ）は、胸腺無形成症（ｔｈｙｍｉｃ　ａｐｌａｓｉ ａ）または発育不全（ｈｙｐｏｐｌａｓｉａＬ上皮小体（ｐａｒａｔｈｙｒｏｉ ｄ）欠如または発育不全およびコノトランカルな心臓欠損によって特徴付けられ る第３および第４咽頭嚢（ｔｈｉｒｄ　ａｎｄ　ｆｏｕｒｔｈ　ｐｈａｒｙｎｇ ｅａｌ　ｐｏｕｃｈｅｓ）の発生期の疾患である。病因は、常染色体性優性、常 染色体性劣性、Ｘ染色体の遺伝様式を示す、既に報告されているケースによると ベテロ接合性であると推定される（Ｌａｍｍｅｒおよび０ｐｉｔｚ、（１９８６ ）Ａｍ、Ｊ、Ｍｅｄ、Ｇｅｎｅｔ、２＋１１３−１２７）。ＤＧＳを患う患者の うち約１５〜２０％には、検知可能な染色体異常が見られる（Ｇ　ｒ　ｅ　ｅ　 ｎ　ｂ　ｅｒｇ、ら（１９８８）Ａｍ、Ｊ、Ｈｕｍ、Ｇｅｎｅｔ、４３：６０５ −６１１）。

染色体欠失と、Ｐｒａｄｅｒ−Ｗｉ　Ｉ　Ｉ　ｉ症候群（Ｌｅｄｂｅｔ　ｔｅｒ ら（１９８２）Ａｍ、Ｊ、Ｈｕｍ、Ｇｅｎｅｔ、３４：２７８−２８５）、Ｌａ ｎｅｒ−Ｇｉｄｅｏｎ症候群（Ｌａｎｇｅｒら（１９８４）、Ａｍ、Ｊ、Ｍｅｄ 、Ｇｅｎｅｔ、１９：８ｌ−１１１）、Ｍｉ　１ｌｅｒ−Ｄｉｅｋｅｒ症候群（ ＤｏｂｙｎＳら、（１９８３）、Ｊ、Ｐｅｄｉａｔｒ１０２：５５２−５５８； ５ｔｒａｔｔｏｎら、（１９８４）、Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅｔ６７：１９３−２ ００）、ａｎ　ｉ　ｒ　ｉｄ　１ａ−Ｗｉ　１ｍｓ癌関連病（Ｒｉｃｃａｒｄｉ ら（１９７８）Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ６１：６０４−６１ＯＬ網膜芽腫（Ｌｅｌ ｅら（１９６３）、Ａｎｎ、Ｈｕｍ　Ｇｅｎｅｔ　２７：１７１−１７４）を含 む病気の間には特別な関係があることを示すいくつかの例がある。ディジョージ 症候群は２２番目の染色体の染色体欠失と関連している。これらの症候群のすべ ては分子技術を用いて分析されてきた（Ｓｃｈｉｎｚｅｌによる総説（１９８８ ）、Ｊ、Ｍｅｄ、Ｇｅｎｅｔ、５：４５４　４６２）、ＤＧＳにはＳｃｈｍｉｃ ｋｅｌ　［（１９８６）Ｊ、Ｐｅｄｉａｔｒ、１０９：２３１−２４１］によっ て“隣接遺伝子症候群”として言及されている、この一群の欠失症候群に関連す る多（の特徴を有している。これらの症候群は比較的稀で、しばしば散発性であ り、疾患が家族性である例は非常に少ない。患者が伴う症状の重さが多様性を示 すこと、およびしばしば表現型の追加的な特徴が現れることから、いくつかの遺 伝子が係わっていることを反映している可能性がある。

すでに報告されたＤＧＳの細胞遺伝学的に異常なケースの大多数は２２番目の染 色体を含み家族性平衡転位の異常分離（ｍａｌｓｅｇｒｅｇａｔ　１ｏｎ）によ って２２ｐ　ｔ　ｅ　ｒ　−−−＞２２ｑ　１１のモノソミー（ｍｏ　ｎ　ｏ　 ｓ　ｏｍｙ）が生じる。

（Ｂａｃｋら（１９８０）、Ａｎｎ、Ｇｅｎｅｔ、２３：２４４−２８８；ｄｅ Ｉａ　Ｃｈａｐｅｌｌｅら（１９８１）、Ｈｕｍ　Ｇｅｎｅｔ、５７：２５３− ２５６；Ｋｅｌｌｅｙ、ら（１９８２）Ｊ、Ｐｅｄｉａｔｒ、１０１：１９７− ２００　（１９８２）：Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇら、（１９８４）、Ｈｕｍａｎ　Ｇ ｅｎｅｔ、６５：３１７−３１９；Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇら（１９８８）Ａｍ、Ｊ 、Ｈｕｍ、Ｇｅｎｅｔ、４３：６０５−６１１＋Ａｕｇｕｓｓｅａｕ、ら（１９ ８６）Ｈｕｍ、Ｇｅｎｅｔ、７４：２０６；Ｂｏｗｅｎら、（１９８６）、Ｃｌ １ｎ、Ｇｅｎｅｔ、２９＋１７４−１７７；Ｆａｅｄ、ら（１９８７）　、Ｊ、 Ｍｅｄ／Ｇｅｎｅ　ｔ　２４　：　２２５−２３４　（１９８７）、２人の患者 については介在性欠失ｄｅｌ　（２２）（ｑｌｌ、２１−−＞ｑｌｌ、２３）と して報告されている（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇら（１９８８）、Ａｍ、Ｊ、Ｈｕｍａ ｎ　Ｇｅｎｅｔ４３：６０５−６１１；Ｍａｓｃａｒｅｌｌｏら（１９８９）、 Ａｍ、Ｊ、Ｍｅｄ、Ｇｅｎｅｔ　３２：１１２−１１４；Ｅｌ−Ｆｏｕｌｅｙら （１９９１）。

Ａｍ、Ｊ、Ｍｅｄ、Ｇｅｎｅｔ　３８：５６９　５７８およびＤｒｉｓｃｏｌｌ ら（１９９２）、Ａｍ、Ｊ、Ｈｕｍ　Ｇｅｎｅｔ、５０：９２４−９３３）、細 胞遺伝学的研究に基づくと、第２２番染色体上に位置する隣接した遺伝子が欠失 するとＤＧＳになり、ＤＧＳに決定的な領域（ＤＧＣＲ）は２２Ｑ１１にあると ということが推定される（ｄｅ　Ｉ　ａ　Ｃｈａｐｅ　ｌ　Ｉｅら、（１９８１ ）、Ｈｕｍ、Ｇｅｎｅｔ５７：２５３−２５６：Ｋｅｌｌｅｙら、（１９８２） 、Ｊ。

Ｐｅｄｉａｔｒ、１０１：１９７−２００；Ｓｃｈｍｉｃｋｅｌ、（１９８６） 。

Ｊ、　Ｐｅｄｉａｔｒ、　１０９：２３１−２４１）、　Ｄ２２Ｓ７５．　Ｄ２ ２Ｓ６６およびＤ２２Ｓ２５９の遺伝子座の共欠失（ｃｏｄｅ　Ｉ　ｅ　ｔ　１ ｏｎ）を例外なく含む２２ｑｌｌ中のＤＧＳに関連した領域の報告により、ディ ジョージ症候群染色体領域（ＤＧＣＲ）と定義されるようになった（Ｄｒｉｓｃ ｏｌｌら（１９９２）、Ａｍ　Ｊ、Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅｔ、５０：９２４−９ ３３）。

ベロカルディオフエインヤル症候群（ＶＣＦ）は口蓋裂、心臓欠損、学習能力障 害および典型的な顔面異形症（ｆａｃｉａｌ　ｄｙｓｍｏｒｐｈｉｓｍ）（Ｓｈ ｐｒｉｎｔｚｅｎら（１９７８）、Ｃ１ｅｆｔ　Ｐａ１ａｔｅ　Ｊ、１５：５６ ：５ｐｐｒｉｎｔｚｅｎら（１９８１）、Ｐｅｄｉａｔｒ、６７：１６７−１７ ２およびＷｉｌｌｉａｍｓら（１９８５）、Ｊ、ＣｒａｎｉｏｆａｃｉａｌＧｅ ｎｅｔ　５：１７５−１８０）が特徴的な常染色体性優性異常である。さらなる 特徴として、異常小頭（ｍｉｃｒｏｃｅｐｈａｌｙ）、小人、鼠けい部およびへ そ部のヘルニア、ロビンンークエンス（Ｒｏｂｉｎ　５ｅｑｕｅｎｃｅ）。

側わん症（ｓｃｏｌｉｏｓｉｓ）、偏平頭底症（ｐｌａｔｙｂａｓｉａＬ眼科学 的異常（ｏｐｔｈａｌｍｏｌｏｇｉｃ　ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓＬ新生児の 低カルシウム症（ｈｙｐｏｃａｌｃｅｍｉａ）およびリンパ組織の減少について 述べられている（Ｓｈｐｒｉｎｔｚｅｎら（１９８５）、Ａｍ　Ｊ、Ｈｕｍａｎ 　Ｇｅｎｅｔ　３７：Ａ７７；　Ｗｉｌｌｉａｍｓら（１９８５）、Ｊ、Ｃｒａ ｎｉｏｆａｃｉａｌ　Ｇｅｎｅｔ、５：１７５−１８０）ｏ新生児の低カルシウ ム症、リンパ組織の欠失または形成不全、およびＴ細胞機能異常という現象はデ ィジョージ症候群（ＤＧＳ）の特徴であり、ＤＧＳとＶＣＦは共通の病因から生 じる可能性があることを示唆している（Ｇｏｌｄｂｅｒｇら（１９８５）、Ａｍ 。

Ｊ、Ｈｕｍ、Ｇｅｎｅｔ、３７：Ａ３４）。以前に報告された常染色体性優性遺 伝のおこるＤＧＳのケースを再検討すると、これらの一群の病気には実際にＶＣ Ｆの診断と一致する臨床上の特徴があることを示唆している（Ｌａｍｍｅｒおよ び０ｐｊｔｚ、（１９８６）、Ａｍ、Ｊ９Ｍｅｄ、Ｇｅｎｅｔ、２９：１１３− １２７；５ｔｅｖｅｎｓら（１９９０）、Ｐｅｄｆａｔｒｉｃｓ　８５：５２６ −５３０）。ＤＧＳおよびＶＣＦ間の表現型のオーバーラツプに基づくと、ＶＣ ＦはＤＧＣＲの内部またはＤＧＣＲと部分的にオーバーラツプしている領域の遺 伝子の欠失によって生じる可能性があると確信される。

ＣＨＡＲＧＥ関連病およびコノトランカルな心臓欠損は、ＤＧＳの原因となる異 常も重大な役割を果たすような病気である。

高分解能を備えた細胞遺伝学的研究でさえも必ずしもＤＧＳ、ＶＣＦのような病 気、並びにＣＨＡＲＧＥ関連病、コノトランカル欠損、および口蓋裂のような関 連する病気に関連した遺伝的欠損を検知するのに十分ではない。多くの場合、第 ２２染色体中の欠失は分子学的研究の手法によってはじめて検知される可能性の ある分子欠失である。大きな分子欠失は、例えば、ＤＧＣＲ中に位置するいくつ かの無名のＤＮＡマーカーを用いる制限断片長多形（ＲＦＬＰ）分析により検知 可能である。しかし、ＲＦＬＰ分析は必ずしもいつも十分な情報を提供するとは 限らない。以前は、まだ情報の得られていない患者の研究には、母方と父方の第 ２２染色体ホモローグの異なる体細胞雑種への分離が含まれていた。しかし、体 細胞雑種の構築は重労働であり、日常の診断学的手段としては実際的ではない。

ＤＧＳ、ＶＣＦ、ＣＨＡＲＧＥ関連病、コノトランカルな欠損および口蓋裂のよ うな、第２２染色体上の欠失が関連する病気を検知する速い効率的な方法が大い に必要とされる。

欠失領域に対するプローブが診断学的に用いられてきた。例えば、１７ｐ１３゜ ３領域からつ（ったコスミドブローブを利用した蛍光ｉｎ　５ｉｔｕハイブリダ イゼーシヨン（ＦＩＳＨ）が、超顕微鏡的欠失を同定することおよびＭｉｌ１６ ｒ−Ｄｉｅｋｅｒ症候群（Ｋｕｗａｎｏら（１９９１）、Ａｍ、Ｊ、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、４９ニア０７−７１４）の患者の潜在的転位を定めることに 使われてきた。

それゆえ、ディジョージ症候群、並びにべロ力ルディオフェイシャル症候群、Ｃ ＨＡＲＧＥ関連病、コノトランカルな心臓欠損および口蓋裂等の関連する病気に 関連する遺伝的欠失および変異の検知能力を上げるために、ディジョージ症候群 の決定領域を標的としたプローブが非常に望まれている。欠失または変異の診断 によって、臨床医は、病気の発端者及びその家族に再発の危険性についての正確 な判断を提供すること、並びにその後妊娠した場合に欠失を検知するための出生 前チェックをすることが可能になるだろう。口蓋裂および先天性心臓欠損の検知 のための超音波映像および心エコー映像の使用に加えて、羊膜はく刺または絨毛 膜のウィルスのサンプリングは細胞遺伝学、蛍光ｉｎ　５ｉｔｕハイブリダイゼ ーシヨン（ＦＩＳＨ）、並びに２２ｑｌｌの欠失および変異に対する胎児の分子 進化に利用されうる（Ｄｒｉｓｃｏｌｌら（１９９１）Ｌａｎｃｅｔ３３８：１ ３９０−１３９１）。

発明の概要 本発明によって、ヒトの病気であるディジョージ症候群、ベロカルディオフェイ シャル症候群、ＣＨＡＲＧＥ関連病、コノトランカルな心臓欠損、および口蓋裂 から成るグループの中から選択される少なくとも一つの病気に関連する遺伝的欠 失および変異を検出するための新規な方法が提供される。本方法は、上述のヒト の病気から取られたＤＮＡを含む試験試料を調製し：そして、ディショージ症候 群決定領域遺伝子座の機能コピー数が２つ未満しかないかを同定する：工程から なり、ディジョーシ症候群決定領域遺伝子座の機能コピー数が２つ未満であると いう同定を、述べられた人がディジョージ症候群、ベロカルディオフエイシャル 症候群、ＣＨＡＲＧＥ関連病、コノトランカルな心臓欠損および口蓋裂を含むグ ループから選択されるの少なくとも１つの病気に関連した遺伝的欠失または変異 を持つ可能性を指標とする。

本発明の別の側面によって、ディジョージ症候群、ベロカルディオフエイシャル 症候群、ＣＨＡＲＧＥ関連病、コノトランカルな心臓欠損および口蓋裂をから成 るグループカラ選択される少なくとも１つの病気に関連した遺伝的欠失または変 異を検知するのに有用な診断学的プローブを調製するための新規な方法が提供さ れる。本発明は、ディジョージ症候群に決定領域中の特異的配列として示された ２２Ｑ１１染色体領域を効果的に増幅するプライマー対を調製し：該プライマー 対を用いたＰＣＲ増幅によって正常のヒトのゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡの領域 に実質的に相補的なりＮＡを合成し；そして、該実質的に相補的なりＮＡを用い て、ヒト第２２染色体を含むライブラリーからディジョージ症候群決定領域のプ ローブを単離する、ことからなる。好ましい態様においては、プライマーは５ｉ ＣＡＣＴＧＧＴＣＣＡＣＡＧＴＧＣＣＡＧ３−　（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ０Ｉ）およ び５−ＴＧＴＧＡＧＧＧＣＴＴＧＣＴＣＴＧＡＧＣ３−（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ。

２）；５−ＴＧＧＴＡＣＣＧＣＴＧＣＴＣＡＧＡＧＧＧＣ３−（ＳＥＱ　ＩＤＮ ０３）および５−ＴＣＣＣＡＧＣＣＴＣＴＧＧＣＣＴＧＡＧＴＧ３−　（ＳＥＱ ＩＤ　Ｎ０４）；および５〜ＣＴＡＡＣＡＣＣＴＡＴＣＣＴＣＣＧＣＣＧ３″（ ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ０５）および５−ＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＡＡＡＣＡＧＡＡＡＣ ３−（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ０６）を含むグループの中から選択される。本発明によ って、これらによってつくられたプローブもまた提供される。

さらに、本発明の別の側面によって、ディジョージ症候群、ベロカルディオフエ インヤル症候群、ＣＨＡＲＧＥ関連病、コノトランカルな心臓欠損および口蓋裂 をから成るグループから選択される少なくとも１つの病気に関連した遺伝的欠失 または変異を検知するのに有用な、新規な診断学的プローブが提供される。これ らの方法はプローブを含むクローンを識別するために第２２染色体を含むライブ ラリー由来のクローンを増幅するＰＣＲを含む。本発明によって、これらによっ てつくられたプローブもまた提供される。

さらに、本発明によって、ディジョージ症候群、ペロカルディオフ二イシャル症 候群、ＣＨＡＲＧＥ関連病、コノトランカルな心臓欠損および口蓋裂から成るグ ループから選択される少なくとも１つの病気に関連した遺伝的欠失または変異を 検知するための診断用キットであって、本発明の方法によって調製された一群の プローブ、またはディジョージ症候群決定領域中の特異的配列であると示されて いる２２Ｑ１１染色体領域を効果的に増幅する一群のプライマ一対から成るグル ープの中から選択された診断用プローブを含む診断学的キットが提供される。

本発明のこれらの側面および別の側面は以下の図と共に、以下に述べる詳しい叙 述によってより明らかとなるであろう。

図の簡単な説明 図１はＲＦＬＰおよびＷＡ胞遺伝学的な結果に従ってグループ分けされた１４人 のＤＧＳ発端者の遺伝子量決定を図に表したものである。“■”はｄｅｌ（２２ ）（Ｑｌｌ、２ＩＱ１１．２３）を表し、“ＩＩ”は２２ｑｌｌの欠失の可能性 を表し；　“Ｉ　Ｉ　Ｉ”は正常の核型（ｋａｒｙｏｔｙｐｅ）を表している。

プローブはセントロメア（中央）からテロメア（右）まで配列されている。棒は ハイブリダイゼーション実験の結果を表し、ａい陰の棒はその遺伝子座のコピー 数が２つ存在することを表し：平行線の入った棒はコピー数を決定するための遺 伝子量決定が行われなかったために情報がないまたは冬型性でない遺伝子座を表 し：白い棒は欠失（対立遺伝子が片方のみ）を表している。オーバーラツプの最 小領域は四角によって示されており、プローブＮ２５．ｐＨ１６０ｂおよびｐＲ ３２を含む。

発明の詳細な説明 本明細書中で使用される”ディジョージ症候群決定領域（ＤｉＧｅｏｒｇｅ　Ｓ ｙｎｄｒｏｍｅＣｒｉｔｉｃａｌ　Ｒｅｇｉｏｎ：ＤＧＣＲ）　”によって意味 されるものは、図１において箱で囲われた部分に示される第２２染色体の領域で ある。Ｎ２５からＲ３２に渡るこの領域は、およそ０．５メカベースと考えられ ている。ＤＧＣＲには、プローブＨ１１により認識される染色体上の遺伝子座位 （Ｄ　２２　Ｓ　３６）およびプローブＢＣＲＬ２により認識される座位のいず れも含まれないが、しかし、ＤＧＣＲはプローブＮ２５およびＲ３２により認識 される遺伝子座位の両側、少なくとも約０゜５メガベースに及ぶものと考えられ る。

細胞遺伝学的および分子学的研究によって、染色体２２ｑ１１に位置するディノ ヨージ症候群決定領域の部分的な特徴付けがなされている。前述の介在性欠失の ２人の発端者の分子学的研究により、遺伝子座位Ｄ２２Ｓ９およびＤ２２Ｓ４３ が決定領域の基部側に隣接することが示された。より末端側の遺伝子座位である ＢＣＲＬ２における一方の対立遺伝子の欠失がこれらの発端者の１人において示 され、これはＤＯ３決定領域の末端側の境界がＢＣＲＬ２座位の基部側にあるこ とを示唆している（フィビソン（Ｆｉｂｉｓｏｎ）ら、（１９９０））。最近の 研究では、マーカーＫＩ−５０６、ＫＩ−１９７およびＫ１−７１６が隣接マー カーとして提供されている。加えて、４００バンドの分解段階での細胞遺伝学的 ルーチン分析において核型が正常な２人の発端者においてＤＮＡのミクロ欠失が 示された（スカンブラ−（Ｓｃａｍｂｌｅｒ）ら、（１９９１）、Ｇｅｎｏｍｉ ｃｓ、ＬＯ：２Ｑｌ−２０６）。

染色体バンド２２Ｑ１１内の欠失およびルーチン染色体分析による正常な核型と いう細胞遺伝学的証拠に基づ＜ＤＯ３発端者の研究は、２２ｑｌｌ内にＤＯ８症 候群に関連する決定領域、ＤＧＣＲの詳細な理解は、新たなそしてより良い診断 法を導き出した。例えば、Ｎ２５、ｐＨ１６０およびＲ３２などの（ＤＧＳ決定 領域に由来する）プローブを含むコスミドクローンを利用した、蛍光±ｎ５ｉｔ ｕハイブリダイゼーションは、ＤＯ５並びに、ベロカーディオフェイシャル（Ｖ ｅｌｏｃａｒｄｉｏｆａｃｉａｌ）症候群、ＣＨＡＲＧＥ関連病（ａｓｓｏｃｉ ａｔｉｏｎ）　、：Ｉノドランカル（ｃｏｎｏｔｒｕｎｃａｌ）心臓欠損および 口蓋裂といった関連症候群の診断に使用することができる。表７には本明細書中 で言及されるプローブが、その対応する遺伝子座位と共に並べられている。場合 によっては、遺伝子座位の表示は、該遺伝子座位に対するプローブを括弧に入れ て対応させた表示を伴うこともあろう。

Ｄ＃／ラベル名　挿入断片（ｋＢ）　ベクター　位置Ｄ２２Ｓ７５／Ｎ２５　２ ０．ＯＮｏｔｌ／ＥＭＢＬ４Ｎ　２２Ｑ１１Ｄ２２Ｓ２５９／ｐＲ３２７，ＯＲ １／ＳＫ＋　２２ｑｌｌＤ２２Ｓ６６／ｐＨ１６０ｂ　３．ＯＨｄ３／ｐＵｃ１ ８　２２Ｑ１１Ｄ２２Ｓ５７／ｐＨ９８０，７Ｈｄ３／ｐＵｃ１８　２２ｑｌｌ Ｄ２２Ｓ３６／ｐＨ１１１，ＯＨｄ３／ｐＵｃ１８　２２ｑｌｌＤ２２Ｓ６８／ ｐＨ１６２５，ＯＨｄ３／ｐＵｃ１８　２２Ｑ１１１４人のＤＧＳ発端者（８人 は細胞遺伝学的に見ることのできる若しくは予想される欠失を２２Ｑ１１内に持 ち、６人は細胞遺伝学的に正常な発端者）中１４人において欠失している２つの 遺伝子座位、Ｄ２２Ｓ７５　（Ｎ２５）およびＤ２２Ｓ２５９　（ｐＨ３２）が 同定されている。加えて、Ｄ２２Ｓ６６　（ｐＨ１６０ｂ）の欠失が、正常な抜 型を持つ３人を含む調べられた発端者８人中８人において示されている。この遺 伝子座位は、Ｄ２２Ｓ７５とＤ２２Ｓ２５９　（共にこれら１４人のＤＧＳ発端 者において一貫して欠失している）の間に位置していることから、残り６人の発 端者においても欠失しているものと考えられる。ＤＯ８決定領域中の遺伝子座位 のｄｅ　ｎｏｖｏ欠失は、ＲＦＬＰ分析によっても示されている。ＤＧＳ臨界欠 失領域および最小型なり領域の存在が確立されている。予備的なパルスフィール ドゲル電気泳動のデータから、本領域の大きさはおよそ０゜７５メガベースと見 積もられている。

基部側の遺伝子座位Ｄ２２Ｓ３６　（ｐＨ１１）におけるヘミ接合ＤＧＳ発端者 がＲＦＬＰ分析を用いて同定されているが、ペテロ接合の発端者の証拠はこの遺 伝子座位を最小決定領域から排除する。ＤＧＳ発端者の遺伝子量（ｄｏｓａｇｅ ）研究は、より末端側のＢＣＲＬ２遺伝子座位がＤＧＳにおいて一貫して欠失し ているわけではないことを示す。それ故、基部側ではＤ２２Ｓ３６が、末端側で はＢＣＲＬ２が決定領域に隣接すると結論されている。

ＦＬＰ分析によって確立した。５人中４人の発端者は母親の対立遺伝子を受け継 ぐことができず；１人の発端者は父親の対立遺伝子を受け継がなかった。このデ ータ並びにＤＧＳ患者において母方および父方の両方から受け継いだ転座に関す る報告を基づくと、起源もしくは刷り込み効果について一貫した親は存在しない ウィリ（Ｐｒａｄｅｒ−ｆｉｌｌｉ）およびエンジェルマン（＾ｎｇｅ１ｍａｎ ）症候群などの、父親および母親の欠失がそれぞれ規則的に遺伝されるような池 のミクロ欠失症候群（ノール（Ｋｎｏｌｌ）ら、（１９８９）、３ｍ、　Ｊ、　 Ｍｅｄ、　Ｇｅｎｅｔ、　３２：２８５−２９０）で観察されるものとは対照的 である。

ＤＧＳに関連して観察される様々な遺伝パターンを説明し得るいくつかの特徴が 第２２染色体にある。これには、高い組み換え率、末端動原体形態（ａｃｒ。

ｃｅｎｔｒｉｃ　ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ）および頻繁に転座に関わることが含ま れる。減数分裂マツピング研究から、２２ａｌｌの基部領域における高い組み換 え率に関する証拠がある（フィビソンら、（１９９０）、＾ｍ、Ｊ、Ｈｕｍ、Ｇ ｅｎｅｔ、４７（３）：Ａ１７８；フィビソンら、投稿中）。これによりｄｅ　 ｎｏｖｏな２２ｑｌｌ介在性欠失を生じることがあり、ＤＧＳの散発性ケースを 説明できよう。ｐＨ３２（Ｄ２２Ｓ２５９）を用いた遺伝チェ分析は、Ｄ２２Ｓ ２５９へテロ接合の親から生じた、ＤＧＳに冒された子孫（ＤＧＳ−７）におい て一方の対立遺伝子が喪失していることを示した。これらの結果は、多分減数分 裂中に生じた、恐らく組み換えの結果としての発端者におけるｄｅ　ｎｏｖｏ欠 失と一致している。生殖腺モザイク現象は、稀だが、疾患に冒された兄第を生じ 得る。

末端動原体（ａｃｒｏｃｅｎｔｒｉｃ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）の長腕基部間の 平衡転座は、ＤＧＳのい（つかのケースを説明し得る。減数分裂の際に、末端動 原体の５組すべてが核小体の周囲で合体する。ロバートソニアン（ＲＯｌ）ｅｒ ｔｓｏｎｉａｎ）転座は、この時起こることが示唆されている。末端動原体の長 腕基部間の平衡転座も、減数分裂のこの段階で起こり得る。２２Ｑ１１および他 の末端動原体のいずれかのａｌｌ領域における切断点（ｂｒｅａｋｐｏｉｎｔ） についての転座の不完全分離は、２２ｐｔｅｒ−”ｑｌｌｌｌモノ−および他の 関与する末端動原体のｐｔｅｒ−Ｑｌｌに関するトリソミー（標準的な細胞遺伝 学的分析では未検出のままになることがある）を生じ得る。そのような隠れた平 衡転座の不完全分離は、家族においてＤＧＳに冒された兄第を生じ、関与した他 の末端動原体常染色体に関するトリソミーは、ＤＯ３患者間で見られる表現型の 多様性を説明し得る。

構成的な染色体異常の中で、予想より多（の目に見える転座が染色体バンド２２ ｑ１１に含まれることが観察されている（ニー（Ｙｕ）ら、１９７８）。これら の発見は、家族性ＤＯＳケースの発生に対して提供されたスキームを支持する。

これらのＤＧＳを発生させる機構の調査は、ＤＯ８患者およびその両親について 、末端するハイブリダイゼーションプローブと共に利用することによって、容易 になる。

研究された１４のＤＧＳケース全てにおいて、高い分解能を持つバンディング技 術を利用して細胞遺伝学的に見ることのできる欠失、または２２Ｑ１１からのプ ローブを用いた分子分析により検出される超顕微鏡的な欠失が見られる。このこ とは、高い分解能を持つ細胞遺伝学的解析および決定領域に対するプローブでの 分子分析の両方を組み合わせた、ＤＧＳにおける欠失の検出に対する系統的アプ ローチ法を強（支持する。染色体分析は第２２染色体以外の染色体の転座もしく は細胞遺伝学的異常を検出することもできるが、しかし、結果は、小さな介在性 欠失の検出に関しては、分子研究の方が高い分解能を持つ細胞遺伝学的解析より も実際感度が高いことを示唆している。これらの欠失は、この小さな、主に真正 染色質（ｅｕｃｈｒｏｍａｔｉｃ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）の染色体中で視覚化 するのは実に困難である。従って、決定領域中に同定された遺伝子座位に対する 第２２染色体特異的なコスミドは、ＤＧＳの診断におけるミクロ欠失の迅速な検 出に有用な試薬であることを証明すべきである。

より小さな介在性欠失は、例えば、いわゆる部分的ディノヨージ症候群に関連す る表現型などの、それほど深刻でない表現型を生じると考えられる。それほど深 刻に冒されていない患者についての生殖は損なわれないようで、欠失に関連した ＤＧＳは、少なくともいくつかのケースでは、常染色体優性疾患として分離し得 るようである。この仮説を支持することとして、ＤＯ３決定領域内の遺伝子座位 の欠失が、ＤＧＳの特徴としばしば関連する常染色体優性疾患である、ベロヵー ディオフエインヤル症候群を有する母親および子供において示されている（未た 欠失は、ＤＧＳとベロカーディオフェイシャル症候群の間で重なった表現型特性 を説明し得る。研究された１５人のＶＣＦ患者のうち１４人が、細胞遺伝学的に 見ることのできる２２Ｑ１１．２の介在性欠失もしくはＤＧＣＨ内のＤＮＡの超 顕微鏡的欠失を有している。これらの１４人の患者は、ＤＧＣＨの最も基部側の マーカー（Ｎ２５）および末端側のマーカー（ｐＨ３２）の両方の欠失を有して いる。これにより、ＶＣＦとＤＧＳに観察される重なった表現型特性が説明され るだろう。現在のところ、ＶＣＦ患者間もしくはこれら２つの患者群の間の表現 型の多様性を説明する分子レベルの相違は同定されていない。ＤＧＣＲの予備的 研究から、この領域が太きく　（７５０ｋｂ以上）、いくっがの遺伝子を含んで いることが示唆される（トリスコル（Ｄｒｉｓｃｏｌｌ）ら、（１９９２）、３ ｍ、　Ｊ、　Ｈｕｍ、　Ｇｅｎｅｔ、　５０　：９２４−９３３）。いくつかの ケースでは、２２Ｑ１１内の異なる遺伝子座位の欠失もしくは変異が、口蓋裂、 心臓欠損および胸腺形成不全もしくは無形成などの、個々の臨床学的特徴の存在 と相関し得ると考えられる。しかし、患者間もしくは家族内の表現型の相違は、 子宮内環境のほかに遺伝的背景における相違からも生じ得る。

これは、疾患に冒された親と子供（ＶＣＦ−４／ＶＣＦ−５およびｖＣＦ−１０ ／ＶＣＦ−１１）の両方のＲＦＬＰ分析によって、ＶＣＦ発端者において一方の ２２Ｑ１１対立遺伝子が受け継がれなかったことを示した最初の研究である。

これらの家族では、Ｄ２２Ｓ７５およびＤ２２Ｓ２５９でのヘミ接合性も、遺伝 チェ分析によって疾患に冒された親とその子孫において確認された。Ｎ−２５Ｙ ＡＣおよびコスミドブローブを用いた蛍光ｉｎ　５ｉｔｕハイブリダイゼーシヨ ンアツセイによって、ＶＣＦ−１０およびＶＣＦ−１１において単一の対立遺伝 子の存在が確認された。

この研究のＶＣＦ家族に観察される常染色体優性遺伝パターンは、優性遺伝され た常染色体遺伝子中の変異というより、欠失を持った染色体の遺伝の結果である 。この研究結果は、大抵の場合、ＶＣＦが部分的な異数染色体性疾患であること を示唆する。しかし、研究された発端者の１人（ＶＣＦ−６）はＤ２２Ｓ７５（ Ｎ２５）およびＤ２２Ｓ２５９　（ｐＲ３２）のいずれも欠失していない。その 発端者が、これら２つのマーカー内で、ＤＧＣＲに関するより小さな欠失を持つ か否かを決定する研究が進行中である。さらに、彼の臨床的特徴のいくつかはＶ ＣＦに典型的なものではない。それ故、この発端者はＶＣＦを持たない可能性が ある。

ＤＧＣＲからのプローブを用いた分子細胞遺伝学的研究の分子分析が、２２ｑ１ １内の欠失を検出する最も感度の高い手段であることは明白である。高い分解能 を持つバンディング技術を利用した細胞遺伝学的解析では、この領域中の欠失の 約２０％しか検出されない（ＶＣＦ−１、ＶＣＦ−９、ＶＣＦ−１４）。従って 、細胞遺伝学的解析は限られた有用性しか持たないと考えられる。ＤＯ８患者に おける欠失の検出と同様に、これらのデータはＶＣＦの患者の分析に対する分子 アプローチ法を支持する。ＤＧＣＲからのプローブを用いたＲＦＬＰおよびＤＮ Ａｌｌ１ｌ’Ｆ−究は有用だが、しかし、ＦＩＳＨが欠失検出についてより迅速 で経済的な方法であろうと考えらる。

ＣＨＡＲＧＥ関連病の患者１７人も研究されている。１４人はＮ２５に関する遺 伝子量によって研究されて、１人の患者において欠失が検出されている。この個 体はＲ３２に関しては欠失していない。１７人の患者全てがＲ３２に関する遺伝 子量によって研究され、ただ１人の患者のみ欠失が示された。

加えて、コノトランカル心臓奇形の患者９人が研究されている。これらの患者の うち、４人がＮ２５に関して欠失している。これらの患者のうち３人がＲ３２に ついても欠失している。これらのデータは、これらの疾患に対する遺伝的病因と しての、２２ａ１１．２の重なったセグメントの欠失を示唆する。

ＤＧＳ１ベロカーディオフェイシャル症候群、ＣＨＡＲＧＥ関連病、コノトラン カル心臓欠損および口蓋裂に関連した遺伝的欠失および変異の、プローブを用い た検出法と同様に、ＤＧＣＲに対するプローブおよびその製造方法が本発明によ って提供される。これらの遺伝的欠失および変異を検出するのに有用なキットも 提供される。本明細書中で使用される”変異”という用語の意味するところは、 遺伝子の天然に存在する核酸配列がら１塩基でも変化した核酸配列などの、遺伝 子の構造変化に関する。

従って、本発明は、ヒト患者におけるディジョージ症候群、ベロカーディオフェ イシャル症候群、ＣＨＡＲＧＥ関連病、コノトランカル心臓欠損および口蓋裂か らなるグループから選択される病状に関連した欠失および変異を検出する方法を 提供する。ヒト患者におけるベロカーディオフエインヤル症候群、ＣＨＡＲＧＥ 関連病、コノトランカル心臓欠損および口蓋裂は、ディジョージ症候群決定領域 中の遺伝子座位（群）の欠失もしくは変異によって生じると考えられる。カレー （Ｃａｒｅｙ）　、Ｊ、Ｃ，、Ｊ、Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ、９６：９５５−９５ ６　（１９８０）；ラメール（Ｌａｍｍｅｒ）ら、Ａｓ。

Ｊ、　Ｍｅｄ、　Ｇｅｎｅｔ、　、　２（増刊）、　１１３−１２７　（＋９８ ６）。本方法は、該ヒト患者がらのＤＮＡを含む試験試料を提供する工程を含む 。血液などの適当な試験試料は当業者に良く知られている。最終的には、試験試 料中に存在するディジョージ症候群決定領域の機能的コピーが２つ未満か否かに 関する同定がある。同定は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）　、または±ｎ　 ５ｉｔｕハイブリダイゼーション若しくは制限断片長における冬型性（ＲＦ　Ｌ 　Ｐ）などのハイブリダイゼーション法によるなどの多くのやり方で成すことが できる。ＰＣＲはマリス（Ｍｕｌｌｉｓ）によって発表された米国特許第４．３ ８６，２０２号に記載されている（この特許は本明細書中に完全に記載された参 考事項として取り入れられる）。

１旦　５ｉｔｕハイブリダイゼーシヨンは、ディジョージ症候群決定領域中に独 特な配列に実質的に相補的な、検出可能な標識をした核酸プローブをハイブリダ イズする条件下で該試験試料と接触させ；そして該検出可能な標識をしたプロー ブの第２２染色体ＤＮＡとのハイブリダイゼーションを検出することによって達 成することができる。

検出可能な標識をしたプローブとＤＧＣＲとのハイブリダイゼーションは、当該 分野の知識を有するものには明らかであろうハイブリダイゼーション条件下（本 明細書中に記される実施例で記載されている）で起こる。本発明のある態様テハ 、５０％ホルムアミド、０．１ｘＳＳＣ，０，１％５ＤＳ１３ｘＳＳＣ，１％Ｓ ＤＳ、５％デキストランサルフェート、変性ニシン精子ＤＮＡ（１００μｇ／ｍ １）を用いて４２℃でハイブリダイゼーションを行った。本発明の別の態様では 、１％ＳＤＳ、ＬＭ　ＮａＣ１および１０％デキストランサルフェートを用いて ６５℃で行ってもよい。

該ＤＧＣＲに実質的に相補的な、本発明の検出可能な標識プローブは、ハイブリ ダイズする条件下で該ＤＧＣＲにノゾブリダイズするであろう。“実質的に相補 的な“という用語は、本明細書中では、広く理解された、相補的な塩基対の相互 作用を記載するために使用される。欠失もしくは不完全な塩基適合（即ち、変異 ）による不完全な対合は、該対合がハイブリダイゼーションをもたらす場合、本 発明によって明らかにされる。

ディノヨージ症候群決定領域遺伝子座位の機能的コピーが２つ未満しか同定され ないことは、被験者がディジョージ症候群、ベロカーディオフェイシャル症候群 、ＣＨＡＲＧＥ関連病、コノトランカル心臓欠損および口蓋裂のうち少なくとも １つに関連した遺伝的欠失もしくは変異を有している可能性を示唆する。

本発明の別の側面によって、ディジョージ症候群、ベロカーディオフェイシャル 症候群、ＣＨＡＲＧＥ関連病、コノトランカル心臓欠損および口蓋裂から成るグ ループから選択される病状に関連した欠失および変異の検出に有用な診断用プロ ーブを調製する方法が提供される。ディジョージ症候群決定領域に特異的な配列 であることが示されている染色体２２Ｑ１１の領域を効果的に増幅するプライマ ー対が調製される。該プライマ一対を用いたＰＣＲ増幅によって、正常なヒトゲ ノムＤＮＡもしくはｃＤＮＡの一部に実質的に相補的なりＮＡを合成し：そして 、その実質的に相補的なりＮＡを用いてヒト第２２染色体を含むライブラリーか らディジョージ症候群決定領域プローブを単離する。

便宜的に、プライマーは、５−ＡＣＡＣＴＧＧＴＣＣＡＣＡＧＴＧＣＣＡＧ３− （ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１）および５　’ＴＧＴＧＡＧＧＧＣＴＴＧＣＴＣＴＧ ＡＧＣ：３’　（ＳＥＱ　ｒＤ　ＮＯ：２）；５−ＴＧＧＴＡＣＣＧＣＴＧＣＴ ＣＡＧＡＧＧＧＣ３−（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ・３）および５−ＴＣＣＣＡＧＣＣ ＴＣＴＧＧＣＣＴＧＡＧＴＧ３−　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ＋４）；並びｉ、：５ −ＣＴＡＡＣＡＣＣＴＡＴＣＣＴＣＣＧＣＣＧ３−　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５ ）お、Ｊ：び５−ＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＡＡＡＣＡＧＡＡＡＣ３”　（ＳＥＱ　 ＩＤ　ＮＯ：６）から成るグループから選択される。

または、ディジョージ症候群、ベロカーディオフェイシャル症候群、ＣＨＡＲＧ Ｅ関連病、コノトランカル心臓欠損および口蓋裂から成るグループから選択され る病状に関連した遺伝的欠失および変異の検出に有用なプローブは、以下の工程 にしたがって調製される：　５−ＡＣＡＣＴＧＧＴＣＣＡＣＡＧＴＧＣＣＡＧ３ −（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１）および５　′ＴＧＴＧＡＧＧＧＣＴＴＧＣＴＣＴ ＧＡＧＣ３”　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２）；５−ＴＧＧＴＡＣＣＧＣＴＧＣＴ ＣＡＧＡＧＧＧＣ３−（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ・３）および５−ＴＣＣＣＡＧＣＣ ＴＣＴＧＧＣＣＴＧＡＧＴＧ３−　（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ・４）；並びに５−Ｃ ＴＡＡＣＡＣＣＴＡＴＣＣＴＣＣＧＣＣＧ３−（ＳＥＱ　Ｉ［ＮＯ：５）および ５′ＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＡＡＡＣＡＧＡＡＡＣ３−（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６ ）から成るグループから選択されるＰＣＲプライマー対を用いて正常なヒトゲノ ムＤＮＡの一部をＰＣＲ増幅し：そして、該増幅されたＤＮＡをプローブに用い てヒト第２２染色体配列を含むライブラリーのスクリーニングを行い、該増幅さ れたＤＮＡとハイブリダイズする断片もしくはクローンを単離する。

また別に、ディジョージ症候群、ベロカーディオフェイシャル症候群、ＣＨＡＲ ＧＥ関連病、コノトランカル心臓欠損および口蓋裂から成るグループから選択さ れる病状に関連した遺伝的欠失および変異の検出に有用な診断用プローブは、第 ２２染色体を含むライブラリーからのクローンをＰＣＲ増幅しプローブを含むク ローンを同定することによって、調製される。

ディジョージ症候群、ベロカーディオフエインヤル症候群、ＣＨＡＲＧＥ関連病 、コノトランカル心臓欠損および口蓋裂から成るグループから選択される病状に 関連した遺伝的欠失および変異を検出する診断用キットは、本明細書中に記載さ れたように調製されたプローブおよびプライマーから成るグループから選択され る診断用プローブを含む。

以下の実施例は例示であって、本発明の制限を意味するものではない。

３つの細胞系列（０ＭＯ７２１５，０ＭＯ７９３９，ＧＭＯ５８７６）がＣ。

ｒｉｅｌｌ　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ（Ｃｏｒｉｅｌｌ　Ｉｎ５ｔｉｔ ｕｔｅ　ｆｏｒ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、Ｃａｍｄｅｎ、ＮＪ）が ら得られた。さらに２つの細胞系列が既に記載されている；７２４８　（Ｇｒｅ ｅｎｂｅｒｇら（１９８８）　、Ａｍ、Ｊ、Ｈｕｍ、Ｇｅｎｅｔ、４３：６０５ −６１１）およびＫＭ４９８７　（Ｍａｓｃａｒｅ　ｌ　Ｉｏら（１９８９）　 、Ａｍ、Ｊ、Ｍｅｄ。

Ｇｅｎｅｔ、３２：１１２−１１４）、患者はＣｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ　Ｈｏ５ｐ ｉｔａｌ　ｏｆ　Ｐｅｎｎｙｓｙｌｖａｎｉａ　（Ｐｈｉ　１ａｄｅｌｐｈｉａ 、Ｐｅｎｎ５ｙｌｖａｎｉａ）および関連する医者から得た。血液または皮膚は リンパ芽細胞または繊維芽細胞の細胞系列を確立するために得られた。リンパ芽 細胞の細胞系列は可能な限り両親のものを確立した。分析は５つのＤＧＳ群及び ３つのＶＣＦ群の全部を含む。

本研究に使用されたプローブはフローサイトメーターで分離された（ｆｌｏｗｓ ｏｒｔｅｄ）第２２染色体ライブラリーから単離したｐＨ９８（Ｄ２２Ｓ５７） 、ｐＨ１１（Ｄ２２Ｓ３６）、ｐＨ３２（Ｄ２２Ｓ５９）、ｐＨ１６０ｂ（Ｄ２ ２Ｓ６６）、ｐＨ１６２（Ｄ２２８６８）の無名のマーカーを含む（Ｂｕｄａｒ ｆら（１９９１）、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ３：１６８−１７１）、ＮｏｔＩでつない だライブラリーから単離されたクローンＮ２５　（Ｄ２２Ｓ７５）（ＭｃＤｅｒ ｍｉｄら（１９８９）、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ５：１−８）；第２２染色体が豊富な ライブラリーから単離され、ｉｎ　５ｉｔｕハイブリダイゼーシヨンより遺伝子 座が２２Ｑ１１と定められたプローブｐ２２／３４　（Ｄ２２Ｓ９）（ＭｃＤｅ ｒｍｉｄら、（１９８６）、５ｃｉｅｎｃｅ２３２：６４６−６４８）；および フローサイトメーターで分離された第２２染色体ライブラリー由来のプローブＷ ２１Ｇ　（Ｄ２２Ｓ２４）　（Ｒｏｕｌｅａｕら、　（１９８９）　、Ｇｅｎｏ ｍｉ　ｃｓ４：１−６）もまた使用された。ＢＣＲ関連遺伝子に対して使用した プローブは、ＢＣＲ遺伝子の３゛末端から得られた１６０ｂｐのｃＤＮＡのＨｉ ｎｄＩ１１／ＥｃｏＲＩ断片である（Ｂｕｄａｒｆら、（１９８８）　、Ｇｅｎ ｏｍｉｃｓｌｏ：９９６−１００２；Ｃｒｏｃｅら、　（１９８７）Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、８４ニア１７４−７１７８）、βｌＶＳ２およ びＣＲＩ　−Ｒ３６５（Ｄ１１Ｓ１２９）のプローブは遺伝子量（ｄｏｓａｇｅ ）実験の内部コントロールプローブとして使用した。両プローブとも第１１染色 体中に位置し、ＤＧＳによって影響されない。βｌＶＳ２はβグロビン遺伝子の 第二介在配列から由来した９２０ｂｐの特異的断片である。ＣＲＩ−Ｒ３６５は 特異的な２ｋｂのＨｉｎｄｌｌＩ断片である（Ｄｏｎ　ｉ　５−Ｋｅ　ｌ　ｌ　 ｅ　ｒら、（１９８７）　、Ｃｅ１１５１　：３１９−３３７）。

臨床上の情報は関連した医者または公表されたケースの文献より得られた。８０ ０−８５０バンドステージの高分解能細胞遺伝学的分析は常法の技術を使用して 行った。

ＣＣＲ（Ｃｏｒｉｅｌ　Ｉ　Ｃｅｌ　Ｉ　Ｒｅｐｏｓ　１ｔｏｒｙ）より得られ た３つの細胞系列の細胞遺伝学的分析は分解能４００−４５０バンドステージに おいて正常であるとして当初報告された。高分解能バンディング技術を用いて再 度分析したところ、０ＭＯ７２１５およびＧＭＯ７９３９において２２ａｌｌの 目に見える介在性欠失が明示された。　ＧＭＯ５８７６は欠失の可能性がある。

７２４８、ＫＭ４９８７およびＤＧＳ−４の患者にはｄｅ１２２　（ｑｌｌ、２ ｌ−ｑｌｌ。

２３）がある。ＤＧＳ−２およびＤＧＳ−３の患者には２２Ｑ１１の中に細胞遺 伝学的な欠失がある可能性がある。ＤＧＳ−１，ＤＧＳ−５，ＤＧＳ−６，ＤＧ Ｓ−７，ＤＧＳ−８およびＤＧＳ−９の患者は高分解能バンディング技術を用い ると正常な抜型を持っている。表１は患者の細胞遺伝学的および臨床的観察のま とめである。

ＤＧＳおよび両親の細胞系列から常法に従ってＤＮＡを抽出し、製造業者（Ｎｅ ｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂｓ）によって提示されたように制限酵素で切 断した。切断されたＤＮＡをアガロースゲル電気泳動により分離し、サザン法（ Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、（１９７５Ｌ　Ｊ、Ｍｏ＋、Ｂｉｏｌ、９８：５０３−５１ ７）によりＩｍｍｏｂｉ　Ｊｏｎ　（Ｍｉ　Ｉ　ｌ　１ｐｏｒｅ）またはＧｅｎ ｅ　５ｃｒｅｅｎ　Ｐｌａｓ　（Ｄｕｐｏｎｔ）のいずれかにトランスファージ た。ＤＮＡプローブを適当な制限酵素で切断し、低融点アガロース中でゲル電気 泳動により精製した。ＤＮＡプローブはランダムプライマー法（Ｆｅｉｎｂｅｒ ｇおよびＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎ、（１９８４）、Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、１ ３７：２６６−２６７）を用いて［α−３２Ｐ］　ｄＣＴＰでラベルした。ラベ ルされたプローブＮ２５．１）Ｒ３２およびｐ１６０ｂは音波処理した胎盤（ｐ ｌａｃｅｎｔａｌ）ＤＮＡ　［Ｌｉ　ｔ　ｔおよびＷｈ　ｉ　ｔ　ｅ、（１９８ ５）　、Ｐｒｏｃ、Ｎａ　ｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｒ、Ｕ、Ｓ、Ａ、８２：６２ ０６−６２１０１とともにプレアニールした。ハイブリダイゼーションは４２° Ｃで５０％ホルムアミド、０．ｌＸ５ＳＣ。

０．１％ＳＤＳ、３ｘＳＳＣ，１％ＳＤＳ、５％デキストランスルフェート、変 性したニノン精子ＤＮＡ　（１００μｇ／ｍ＋）とともに、または６５℃で１％ ＳＤＳ、ＩＭＮａＣＩおよび１０％デキストランスルフェートとともに行った。

フィルターは０．２ＸＳＳＣ，０，１％ＳＤＳで６５℃で２回洗い、コダックＸ ＡＲ−５フィルムに一７０°Ｃで様々な時間感光させた。

ＤＧＳの也者とその両親の細胞系列から得られたＤＮＡは上述のようにＲＦＬＰ 分析により調べられた。両親の対立遺伝子を受け継がないことの証明によって欠 失が検知された。もし両親のＤＮＡが手に入らない場合は、ＤＯ８患者の細胞系 列は２つの選択的な対立遺伝子の存在について分析した。ＲＦＬＰを用いて情報 が得られなかった家系及び試験した遺伝子座に１つの対立遺伝子のみが出た発端 者については次に遺伝子量決定を行った。プローブｐＨ１１（Ｄ２２Ｓ３６）。

Ｎ２５　（Ｄ２２Ｓ７５）およびｐＨ３２（Ｄ２２Ｓ２５９）は両親のＤＮＡが 手に入った５人のＤＧＳ患者における欠失を検知した。正常抜型をもつ２人の患 者、目に見える介在性欠失を有する２人の患者、及び、細胞遺伝学的研究で欠失 についての情報が得られなかった５人目の患者において欠失が検知された。

プローブｐＲ３２（Ｄ２２Ｓ２５９）は５つの家系のうち３つについて情報をも たらした。このプローブは１０．ｌｋｂおよび９．４ｋｂの対立遺伝子を検知ス ル。プ０−ブｐＲ３’２は７２４８、ＤＧＳ−４おＪ：びＤＧＳ−５発端者（７ ）３つの家系において情報を与えた。どの家系においても父はへテロ接合性であ る。７２４８および細胞遺伝学的には正常なり０８−５の母は９．４ｋｂの対立 遺伝子についてはホモ接合性である。これらの２つの家系の発端者は父から受け 継いだ１０、ｌｋｂの単一のバンドを保持している。このように、これら２つの 家系の子供は母方の対立遺伝子である９、４ｋｂのバンドを受け継いでいない。

ＤＧＳ＝４の母は１０．１ｋｂの対立遺伝子についてホモ接合性である。発端者 は父がら受け継いだ９．４ｋｂの単一のバンドを保持する。このことはこれら３ つの家系における母方の対立遺伝子の欠失と一致する。５つのＤＧＳ家系のうち ２つはこの遺伝子座について情報が得られなかった。さらに試験が行われた９人 の独立なりＯ８発端者は単一のＲＦＬＰ対立遺伝子を示し、このことは、この遺 伝子座が単接合型（ｈｅｍｉｚｙｇｏｓｊｔｙ）または全接合型（ｄ　ｉ　ｚｙ ｇｏｓ　ｉ　ｔｙ）であることに一致する。遺伝子量決定を行い、これらの情報 が得られなかった１１人の発端者において、遺伝子座Ｄ２２Ｓ２５９が１コピー であるか２コピーであるか決定した。

プローブＮ２５　（Ｄ２２Ｓ７５）は５つの家系のうち１つについて情報を与え た。２２Ｑ１１の目に見える介在性欠失を持つ発端者、ＤＧＳ−４はＤ２２Ｓ７ ５　（Ｎ２５）遺伝子座の母方の対立遺伝子の欠落を示した。プローブＮ２５は Ｔａｑｌ多型性を検知し、３．３あるいは２．３および０．９６ｋｂの対立遺伝 子、および１．６ｋｂの必ず存在するバンドを生じる（Ｆｉｂｉｓｏｎら、投稿 中）。

ＤＧＳ−４の父は３．３ｋｂの対立遺伝子をホモに持ち：母は２．３および０゜ ９６ｋｂの対立遺伝子をホモに持つ。ＤＧＳ−４発端者は父から受け継いだ３゜ ３ｋｂの単一のバンドを保持する。これはこの家系について上述したＤ２２Ｓ２ ５９　（ｐＨ３２）遺伝子座の母方の対立遺伝子の欠落と一致する。９人の独立 なりＧＳ患者のサザンプロット解析は単一の対立遺伝子を示し、再び接合型を決 定するために遺伝チェ分析をする必要が生じた。

５つのＤＯ５家系のうち２つはＤ２２３３６　（ｐＨ１１）遺伝子座について情 報を与えた。細胞遺伝学的欠失がある可能性のあるＤＧＳ−３発端者および正常 の核型を持つＤＧＳ−９では、プローブｐＨ１１によるＲＦＬＰ分析により両親 の対立遺伝子の欠落が示された。プローブｐＨ１１は２つの対立遺伝子３．３お よび１．６ｋｂ、および２つの必ず存在するバンド３．７および２．３ｋｂの産 物を生じるＭｓｐｌ多型性を検知する。ＤＧＳ−３の患者の両親は異なる対立遺 伝子についてホモ接合型である。ＤＧＳ−３は父からの３．３ｋｂの対立遺伝子 を持ち、母の対立遺伝子（１，６ｋｂ）を受け継いでいない。ＤＧＳ−９発端者 の父は１．６ｋｂの対立遺伝子についてホモ接合型であり、母はこの遺伝子座に 関してヘテロ接合型である。発端者ＤＯ５−９には母からもらった３、３ｋｂの 単一の対立遺伝子が現れる。彼女は父親の対立遺伝子は受け継いでいない。９人 の発端者はこの遺伝子座について単接合型または全接合型ということと一致する 単一の対立遺伝子を示すけれども、３人の発端者（ＫＭ４９８７．ＧＭＯ７２１ ５、ＧＭＯ７９３９）はへテロ接合型である。ヘテロ接合型のＤＯ３発端者が存 在することから、Ｄ２２Ｓ３６位置が最小決定的領域から排除される。

表２は先に２２ａｌｌに位置することを示した８つの各型性を示すプローブを用 いた、ＤＯ５細胞系列のＲＦＬＰ分析の結果のまとめである。単接合型の患者は ＲＦＬＰ分析により片方の親の対立遺伝子を受け継いていないものである。８つ の遺伝子座について５つの家系におけるＲＦＬＰの状況を調べられた。５人のＤ Ｏ８発端者の調べられた４０の遺伝子座のうち、６つの欠失遺伝子座が片方の親 の対立遺伝子を受け継いでいないと確認された。８つの遺伝子座のうち３つＤ２ ２Ｓ３６　（ｐＨ１１）、Ｄ２２Ｓ７５　（Ｎ２５）およびＤ２２Ｓ２５９　（ ｐＨ３２）で全欠失が観察された。欠失はＲＦＬＰに基づく家系の研究によって 、５入金ての発端者において検知された。さらに付は加えて、９人の独立なりＧ Ｓ発端者においてこれら３つの遺伝子座のへテロ接合型の存在について調べられ た。

コレラノ発端者全てがＤ２２Ｓ７５（Ｎ２５）およびＤ２２ｓ２５９（ｐＨ３２ ）にて単一の対立遺伝子を示し、遺伝チェ実験の必要が生じた。３人の発端者は Ｄ２２Ｓ３６（ｐＨ１１）についてヘテロ接合型テアッタノテ、Ｄ２２Ｓ３６１ ｔＤＧＳ決定領域ノ外側ニ位置サレタ。Ｄ２２Ｓ２４　（Ｗ２１Ｇ）、Ｄ２２Ｓ ９　（ｐ２２／３４）およびＤ２２Ｓ５７　（ｐＨ９８）の基部側の遺伝子座、 並びにＤ２２Ｓ１０　（２２Ｃ１−１８）およびＤ２２Ｓ６８　（ｐＨ１６２） の末端側の遺伝子座についてのＲＦＬＰ分析を行ったが、調べた５つの家系にお いて欠失を検知せず、および試験した発端者の３０〜４０パーセントはこの遺伝 子座においてへテロ接合型であった。従って、ＲＦＬＰ分析に基づくとＤ２２Ｓ ２４．Ｄ２２Ｓ９、Ｄ２２Ｓ５７およびＤ２２Ｓ３６の基部１１（７）遺伝子座 、並びにＤ２２ｓ１０およびＤ２２Ｓ６８の末端側の遺伝子座はＤＧＳの最小決 定領域の外に存在するにちがいない。

遺伝子座位Ｄ２２Ｓ７５　（Ｎ２５）およびＤ２２Ｓ２５９　（ｐＨ３２）が単 一の対立遺伝子であることが示されている細胞系列に関して、Ｈｉｎｄｌ　Ｉ　 Ｉ消化したＤＮＡのサザンプロットをＡＭＢＩＳラジオアナリティックイメージ ングシステムによって分析し、存在している対立遺伝子の数を決定した。プロー ブＮ２５は２．６ｋｂ　ＨｉｎｄＩ　ＩＩ断片を検出する。実験内対照プローブ であるβｌＶＳ２は別の７．８ｋｂ断片を認識する。２人のＤＯ３発端者におけ るＮ２５に対する等価なハイブリダイゼーションのシグナル強度は、βｌＶＳ２ に対するハイブリダイゼーションシグナルと比較した場合、対照において観察さ れる強度より小さく、サザンプロット分析は利用可能である。およそ２分の１と いう、Ｎ２５のβＩＶＳに対して得られる計数の予想比が、１３人中１３人の発 端者において観察された（表３）。これらの結果はＤ２２Ｓ７５　（Ｎ２５）で の一方の対立遺伝子の喪失と一致している。

プローブｐＲ３２（Ｄ２２Ｓ２５９）は、およそ２３ｋｂのＨｉｎｄｌｌＩ断片 を検出する。βｌＶＳ２に対するｐＨ３２から得られるシグナル比は１／２未満 であり、試験した１３のＤＧＳ発端者において単一の対立遺伝子しか存在しない ことと一致した（表４）。これら１３人のうちの２人（ＤＧＳ−４、ＤＧＳ−５ ）を含む３人の発端者は、ＲＦＬＰ分析によって一方の親の対立遺伝子が喪失し ていることを示した。

体細胞ハイブリッドマツピングパネルへのハイブリダイゼーションによって２２ ｑｌＮ＝位置付ケラレテイル非多型プｏ−ブｐＨ１６０ｂ　（Ｄ２２Ｓ６６）（ バダーフ（Ｂｕｄａｒｆ）ら、（１９９１）、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　１０：　９９ ６−１００２）について、遺伝子量研究ヲ行ツタ。コノ遺伝子座位１；！Ｄ２２ Ｓ７５　（Ｎ２５）　およびＤ２２Ｓ２５９（ｐＨ３２）の間にあるようである （Ｍ、バダーフ、未発表の結果）。プローブｐＨ１６０ｂは２．３ｋｂのＨｉｎ ｄｌｌｌ断片を認識する。研究した８人の患者のうち８人において、一方の対立 遺伝子の喪失が示された（表５）。

ＢＣＲ遺伝子の３゛端に由来するプローブは、４つの遺伝子座位：ＢＣＲ，ＢＣ ＲＬ２、ＢＣＲＬ３、およびＢＣＲＬ４を検出する。これらの遺伝子座位は２２ ｑ１１の異なる離れた部分に位置し、ＢＣＲＬ２がこれらの４遺伝子座位の最も 基部側にある。Ｈｉｎｄｌｌ＋消化は、それぞれＢＣＲ，ＢＣＲＬ３、ＢＣＲＬ ２、およびＢＣＲＬ４を認識する２３．１９．５．１３および９ｋｂの断片を生 じる（クローチェ（Ｃｒｏｃｅ）ら、（１９８７）、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、 ＾ｃａｄ、　５ｃｉｅｎｃｅ、　Ｕ、　Ｓ、　Ａ、　８４@ニア１７ ４−７１７８）。プローブβｌＶＳ２もしくは２ｋｂの断片を認識するプローブ ＣＲＩ−Ｒ３６５を対照プローブとして使用した。対照プローブに対するＢＣＲ Ｌ２がら得られた計数比は、２つのＤＧＳ細胞系列におけるＢＣＲＬ２欠失と一 致した。

しかし、試験プローブと対照プローブの間の比は７つの細胞系列において同様で あった（表６）。従って、ＢＣＲＬ２はＤＧＳの最小決定領域の外側にある。

表１．ＤＧＳ患者の臨床学的所見および細胞遺伝学的解析のまとめ胸腺無形成（ ａ） ７２４８　動脈幹　＋　十　顔形態異常■ＳＤ 右大動脈弓 ＫＭ４９８７　不整　十　−顔形態異常大動脈弓、ＶＳＤ ＤＧＳ−４ファロット　＋ （Ｆａｌｌｏｔ）の ４徴候 ＧＭＯ７２１５不整　十　− 大動脈弓 ＶＳＤ ＧＭＯ７９３９動脈幹　＋（ｂ）　十　顔形態異常ＩＩ　予想される介在性欠失 ＧＭＯ５８７６不整　＋　十　顔形態異常大動脈弓 ５Ｄ ＤＧＳ−２ＶＳＤ　＋（ｂ）　＋　ｌＩ形態異常ＤＧＳ−３ＰＤ＾　＋（ｂ）　 十　顔形態異常Ｉ　Ｉ　１．正常な核型 ＤＧＳ−１動脈幹　＋　十　顔形態異常ＶＳＤ　胆硬変 左心形成不全　肺葉異常 ＤＧＳ−５不整　＋　十　顔形態異常 大動脈弓 大動脈および 弁の形成不全、 ＶＳＤ 茜Ｓ−６不整　＋（ｂ）　＋　（ｃ）　顔形態異常大動脈弓 副大動脈性 狭窄、ＡＳＤ　。

ＶＳＤ　、　ＰＤＡ ＤＧＳ−７動脈幹右　＋　＋（Ｃ）　二重の出口大動脈弓　ＲＶを持つ 一卵生双生児 胸腺形成不全 低カルシウム血症 ＤＧＳ−８上に重なった　＋（ｂ）　十　顔形態異常大動脈、ＶＳＤ　。

漏斗状狭窄 ＤＧＳ−９不整　＋　十　顔形態異常 大動脈弓、ＶＳＯ多重嚢胞性 腎臓 十および−はそれぞれ、臨床学的特徴の有無を示す；（ａ）は、放射線写真上で の胸腺形の欠如、外科手術もしくは検層において欠如した若しくは小さな胸腺を 含む；（ｂ）は、細胞性免疫不全の記録を表す：（Ｃ）は、血清カルシウムの一 時的な減少を表す。

表２．多型プローブで研究したＤＯ３細胞系列のＲＦＬＰ状態のまとめヘミ接合 （ａ）０００２１３０　０ へテロ接合（ｂ）５５　２　３００　５　４未確認（ｃ）　１８　５　９１３１ １７　３研究した　６　１３　７　１４１４１４　１２　７細胞系列総数 （ａ）ヘミ接合は、一方の親の対立遺伝子を遺伝し損ねたことが示されている発 端者数を示す（５家族を研究）。

（ｂ）へテロ接合は、２つの異なる対立遺伝子を持つ発端者を示す。

（ｃ）未確認は、１つ若しくは２つの対立遺伝子に一致しうる単一のバンドを持 つ発端者で遺伝チェ分析を必要とするものを示す。

表５．遺伝チェ分析：Ｄ２２Ｓ６６　（ｐＨ１６０ｂ）Ｈ１６０ｂ／β１ｖＳｔ の比 患者　１　２　３　平均　対立遺伝子数対照　１．３　１．３　１．１　１．２ 　２ＧＭＯ５８７６０，５０，５０，３０，４０，７ＤＧＳ−１０，７０，６０ ，５０，６１，０ＤＧＳ−２０，３０，４０，６０，４０，７ＤＧＳ−７０，８ ０，３０，７０，６１，０対照　１．６　１．６　−　１．６　２ＫＭ４９８７ 　０．７　０．５　０．７　０．６　０．８ＤＧＳ−３０，８０，６０，４０， ６０，８ＤＧＳ−４−０，７０，６０，７０，９ＤＧＳ−５０，３０，９０，５ ０，６０，８表６．遺伝チェ分析：　ＢＣＲＬ２ ＢＣＲＬ２／βＩＶＳ２（７）比 患者　１　２　３　平均　対立遺伝子数対照　０．４９　０．５５　０．４６　 ０．５０　２ＤＧＳ−６０，２１０，１７０，２１０，２００，８ＤＧＳ−８０ ，２２０，３１０，２４０，２６１，０ＤＧＳ−９０，３８０，６３０，４８０ ，５０２対照　０．３１　０．３８　０，４３　０．３７　、２ＤＧＳ−４０， ４３０，２４０，４６０，３８２７２４８０，４６０，３８０，５３０，４６２ ，４ＢＣＲＬ２／ＣＲＩ−Ｒ３６５の比 患者　１　２　３　平均　対立遺伝子数対照　０．６２　０．５６　０．６５　 ０．６１　２Ｇ關０７２１５　０．４ｇ　０．５５　０．４８　０．５０　１． ７ＧＭＯ７９３９０，４９０，５４０，５１０，５２１，７ＫＭ４９８７　０． ４８　０．５５　０，５９　０．５４　１．８ＧＭＯ５８７６０，５１０，４６ ０，５６０，５１１，７実施例６ ＶＣＦ患者の臨床および細胞遺伝学的研究２人の疾患に冒された母およびその娘 （疾患に冒されている）を含む１５人の患者をＶＣＦについて診断した。

細胞分裂中期の染色体についての細胞遺伝学解析を、標準技術を用０て８０〇− ８５０バンドレベルの分解能で行った。研究されたＶＣＦ患者の臨床学的特徴を 表８にまとめである。

表８．ＶＣＦ患者の臨床学的発見のまとめ患者　口蓋異常　心臓欠損　学習不能 　典型的な顔　その他ＶＣＦ−３＋　−＋　＋　３人の患者 子孫の親（ｄ） ＶＣＦ−４＋　ＰＤＡ　＋　十　成長遅延、甲状腺機能低下 鼠葭ヘルニア、 網膜管の捩れ ２−３合格 ＶＣＦ−５（ａ）　＋　ＶＳＤ　＋　十　網膜管の捩れ外斜視、 ２−３合格 ＶＣＦ−６＋　周辺膜性ＶＳＤ　＋　千成長遅延、尿道下要 ＶＣＦ−７＋　ＶＳＤ、　＋　＋ Ｒｔ　大動脈弓 ＶＣＦ−ｇ　＋　Ｒｔ、大動脈弓　＋　＋ＶＣＦ−９＋　ＴＯＦ　＋　十　小頭 症、Ｒｔ、大動脈弓　規格 ＶＣＦ−１０（ｂ）＋　−＋　＋ ＶＣＦ−１１＋　十　、＋ ＶＣＦ−１２＋　＋　十　網膜管の捩れＶＣＦ−１３＋　ＶＳＤ　＋　＋ 大動脈のくびれ ＶＣＦ−１４＋　ＶＳＤ　＋　＋　咽１を膜、精神的大動脈のくびれ　疾患 ＶＣＦ−１５＋＋　十　成長遅延、 低カルシウム血症 （＋）は、臨床学的特徴があることを示す：（−）は、臨床学的特徴がないこと を示す。ＶＳＤ＝心室隔壁の欠損、ＴＯＦ＝ファロットの４徴候；（ａ）ＶＣＦ −４の母親；（ｂ）ＶＣＦ−１１の母親：（Ｃ）高鼻音（ｈｙｐｅｒｎａｓａｌ 　５ｐｅｅｃｈ）　；　（ｄ）子孫については研究されていない。

全てのも者は、シュプリンツエンら（１９７８）、Ｃ１ｅｆｔ　Ｐｌａｔｅ　Ｊ 、　１５：５６およびシュプリンツエンら（１９８１）、　Ｐｅｄｉａｔｒ、　 ６７：１６７−１７２によって記載された独特な顔の臨床学的特徴および学習不 能を持つ。しかし、口蓋裂、周辺膜性ＶＳＤおよび尿道下要に加えて、患者ＶＣ Ｆ−６は、以前にＶＣＦで報告されたものより重度の発育遅延および成長遅延を 有すようである。１４人の患者は、口蓋裂および咽頭縁不全を含む口蓋異常を持 つ。残りの患者（ＶＣＦ−２）は高鼻音を持つ。心臓欠損は１５人中８人の患者 で見出だされた。

１５人中３人（７）患者（ＶＣＦ−１、ＶＣＦ−９、ＶＣＦ−１４）は、２２ｑ １１の介在性欠失［ｄｅｌ　（２２）（ｑｌｌ、２１ｑ１１．２３）］を持つ。

残りの１２人の壱者は、高い分解能のバンディング技術（８００−８５０バンド レベルの分解能）を用いたところ、正常な抜型を有している。

１５人のＶＣＦ患者および、入手可能であれば、その親の細胞系列から得られた ＤＮＡを、プローブＮ２５　（Ｄ２２Ｓ７５）およびｐＲ３２（Ｄ２２Ｓ２５９ ）を用いたＲＦＬＰ分析により研究した。遺伝子座位Ｄ２２Ｓ２５９もしくはＤ ２２Ｓ７５において一方の親からの対立遺伝子を受け継げなかったことを示すこ とによって、正常な抜型を持つ３人の患者において欠失が検出された。ＴａｑＩ で消化しｐＲ３２（Ｄ２２Ｓ２５９）をプローブに用いたゲノムＤＮＡの２つの サザンプロットのオートラジオグラムは、プローブが１０．１もしくは９．　４ ｋｂの対立遺伝子を検出することを示す。疾患に冒されていない患者は、いずれ かの対立遺伝子に関してホモ接合である。発端者（ＶＣＦ−８）は、その母親と 同じ単一の対立遺伝子を持ち、彼女は父親の対立遺伝子を受け継がなかった。別 のケースでは、母親（ＶＣＦ−５）は１０．１ｋｂの対立遺伝子を持つが、一方 、その娘は（ＶＣＦ−４）は９．４ｋｂの対立遺伝子を持つ。従って、ＶＣＦ− ４は母親の１０．１ｋｂの対立遺伝子を受け継がなかった。ある家族（ＶＣＦ− １０、ＶＣＦ−１１）は、Ｄ２２Ｓ７５　（Ｎ２５）遺伝子座位に関して有益な 情報を提供した。発端者ＶＣＦ−１１および疾患に冒された彼女の母親（ＶＣＦ −１０）は、同じバンドを共有しておらず、それ故、ＶＣＦ−１０は母親の対立 遺伝子を受け継がなかった。研究された残りの１１人の発端者は、遺伝子座位Ｄ ２２Ｓ７５およびＤ２２Ｓ２５９において単一のバンドを示した。これは、遺伝 子座位が１若しくは２コピー（それぞれヘミもしくはホモ接合）であることと一 致し、存在する対立遺伝子数を決定するには遺伝チェ分析を必要とする。

ＲＦＬＰ分析によって欠失が示されている患者を含め、全てのＶＣＦ患者を、遺 伝子座位Ｄ２２Ｓ７５　（Ｎ２５）およびＤ２２Ｓ２５９　（ｐＲ３２）でのコ ピー数に関して分析した。制限酵素消化したＤＮＡのサザンブロノトをＡＭＢＩ Ｓラジオアナリティックイメージングシステムによって分析し、存在する対立遺 伝子数を決定した。これらの定量実験の結果は表９にまとめられている。

表９．定量ハイブリダイゼーションにょるＶＣＦ細胞系列の遺伝チェ分析のまと め ＶＣＦ−１１，００１，０４ ＶＣＦ−２領５７　０．７３ ＶＣＦ−３１，０６（ｂ）　０．９０ ＶＣＦ−４領８２　０．５９（ａ） ＶＣＦ−５領４１　０．８０ ＶＣＦ−６１，９９２，０１ ＶＣＦ−７１，１９０，９８ ＶＣＦ−８１，０８（ｂ）　０．　７６（ａ）ＶＣＦ−９１，１２１，２９ ＶＣＦ−１０１，０２（ｂ）　０．６６ＶＣＦ−１１１８２（ａ、ｂ）　１９６ ＶＣＦ−１２１，２３１，０１ ＶＣＦ−１３’　１．１１　１．０８ ＶＣＦ−１４１，０４０，９１ ＶＣＦ−１５１，０９１，０５ （ａ）コピー数はＲＦＬＰ分析によっても証明された。

表９の値は、対照プローブで得られたハイブリダイゼーションシグナルに対する 試験プローブで得られたシグナルの定量分析により標準化された、遺伝子座位コ ピー数を表す。それらは、対照に対する患者の３つの独立した比の平均値を取る ことによって得られた。１．５０未満の値は欠失と一致した。１５人中１４人の 患者が両遺伝子座位でヘミ接合であった。１人の患者（ＶＣＦ−６）において、 どちらの遺伝子座位での欠失も検出されなかった。

配列表 （２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１の情報：（ｉ）配列の特徴； （Ａ）長さ＝２０塩基対 （Ｂ）配列の型　核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直線状 （ｉ　ｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノミック）（ｘＤ配列：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ ：１：＾ＣＡＣＴＧＧＴＣＣＡＣＡＧＴＧＣＣＡＧ　２０（２）ＳＥＱ　ＩＤ　 ＮＯ：２の情報：（１）配舛の特徴： （Ａ）長さ：２０塩基対 （Ｂ）配列の型、核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー二直線状 （ｆ　ｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノミック）（ｘｉ）配列：ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ Ｏ：２：ＴＧＴＧＡＧＧＧＣＴ　ＴＧＣＴＣＴＧＡＧＣ２０（２）ＳＥＱ　ＩＤ 　ＮＯ＋３の情報：（ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２１塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直線状 （ｉ　ｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノミック）（ｘｉ）配列：ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ Ｏ：３：ＴＧＧＴＡＣＣＧＣＴ　ＧＣＴＣＡＧＡＧＧＧ　Ｃ２１（２）ＳＥＱ　 ＩＤ　ＮＯ：４の情報：（ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ＝２１塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニ一本舗 （Ｄ）トポロジー二直線状 （ｉ　ｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノミック）（ｘｉ）配列：ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ Ｏ：４：ＴＣＣＣＡＧＣＣＴＣＴＧＧＣＣＴＧＡＧＴ　Ｇ　２１（２）ＳＥＱ　 ＩＤ　ＮＯ：５の情報：（＋）配列の特徴： （Ａ）長さ＝２０塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニ一本舗 （Ｄ）トポロジー：直線状 （ｉ　ｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノミツク）（ｘ　ｉ）配列：ＳＥＱ　ＩＤ　 ＮＯ：５：ＣＴＡＡＣＡＣＣＴＡ　ＴＣＣＴＣＣＧＣＣＧ　２０（２）ＳＥＱ　 ＩＤ　ＮＯ：６の情報；（ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２０塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニ一本舗 （Ｄ）トポロジー二直線状 （ｉ　ｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノミツク）（ｘｉ）配列：ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ Ｏ：６：ＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧ　ＡＡＡＣＡＧ＾＾＾Ｃ２０−ｍ−−ｍ−−一− 手続補正書

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. １．ヒト患者からＤＮＡを含む試験試料を調製し；そしてディジョージ症候群決 定領域の機能的コピーが２つ未満しかないかを同定する、工程から成る、ディジ ョージ症候群、ベロカーディオフェイシャル（Ｖｅｌｏｃａｒｄｉｏｆａｃｉａ ｌ）症候群、ＣＨＡＲＧＥ関連病（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）、コノトランカル （ｃｏｎｏｔｒｕｎｃａｌ）心臓欠損および口蓋裂から成るグループから選択さ れる病状の少なくとも１つに関連した遺伝的欠失および変異を該ヒト患者におい て検出するための方法であって、 ディジョージ症候群決定領域遺伝子座位の機能的コピーが２つ未満であるという 同定を、ディジョージ症候群、ベロカーディオフェイシャル症候群、ＣＨＡＲＧ Ｅ関連痛、コノトランカル心臓欠損および口蓋裂の少なくとも１つに関連した遺 伝的欠失もしくは変異を該人物が持つ可能性をの指標とする方法。
2. ２．ヒト患者からＤＮＡを含む試験試料を調製し；ディジョージ症候群決定領域 中に独特な配列に実質的に相補的な、検出可能に標識をした核酸プローブをハイ ブリダイズする条件下で該試験試料と接触させ；そして 該検出可能に標識したプローブの第２２染色体ＤＮＡとのハイブリダイゼーショ ンを検出する、 工程から成る、ディジョージ症候群、ベロカーディオフェイシャル症候群、ＣＨ ＡＲＧＥ関連病、コノトランカル心臓欠損および口蓋裂から成るグループから選 択される病状の少なくとも１つに関連した遺伝的欠失および変異を該ヒト患者に おいて検出するための方法であって、 該検出可能に標識したプローブのハイブリダイゼーションの欠如を、ディジョー ジ症候群、ベロカーディオフェイシャル症候群、ＣＨＡＲＧＥ関連痛、コノトラ ンカル心臓欠損および口蓋裂の少なくとも１つに関連した遺伝的欠失もしくは変 異を該ヒトが持つ可能性の診断とする方法。
3. ３．ヒト患者からＤＮＡを含む試験試料を調製し；請求項５、６および７に記載 の方法により調製されたプローブからなるグループから選択される検出可能に標 識した核酸プローブを、ハイブリダイズする条件下で該試験試料からのＤＮＡと 接触させ；そして該検出可能に標識したプローブの、該試験試料からの該ＤＮＡ とのハイブリダイゼーシヨンを検出する、 工程から成る、ディジョージ症候群、ベロカーディオフェイシャル症候群、ＣＨ ＡＲＧＥ関連病、コノトランカル心臓欠損および口蓋裂から成るグループから選 択される病状の少なくとも１つに関連した遺伝的欠失および変異を該ヒト患者に おいて検出するための方法であって、 該検出可能な標識をしたプローブのハイブリダイゼーションの欠如を、ディジョ ージ症候群、ベロカーディオフェイシャル症候群、ＣＨＡＲＧＥ関連病、コノト ランカル心臓欠損および口蓋裂の少なくとも１つに関連した欠失もしくは変異を 該ヒトが持つ可能性の診断とする方法。
4. ４．ディジョージ症候群決定領域中に特異的な配列であることが示されている染 色体２２ｑ１１の一部を効果的に増幅するプライマー対を調製し；該プライマー 対を用いたＰＣＲ増幅によって正常なヒトゲノムＤＮＡ若しくはｃＤＮＡの一部 に実質的に相補的なＤＮＡを合成し；そして該実質的に相補的なＤＮＡを用いて 、ヒト第２２染色体を含むライブラリーからディジョージ症候群決定領域プロー ブを単離する、工程から成る、ディジョージ症候群、べロカーディオフェイシャ ル症候群、ＣＨＡＲＧＥ関連病、コノトランカル心臓欠損および口蓋裂から成る グループから選択される病状の少なくとも１つに関連した遺伝的欠失および変異 の検出に有用な診断用プローブを調製するための方法。
5. ５．該プライマーが、５′【配列があります】（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）および５ ′【配列があります】（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）；５′【配列があります】（ＳＥ ＱＩＤＮＯ：３）および５′【配列があります】（ＳＥＱＩＤＮＯ：４）；並び に５′【配列があります】（ＳＥＱＩＤＮＯ：５）および５′【配列があります 】（ＳＥＱＩＤＮＯ：６）から 成るグループから選択される、請求項４に記載の方法。
6. ６．５′【配列があります】（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）および５′【配列がありま す】（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）５′【配列があります】（ＳＥＱＩＤＮＯ：３）お よび５′【配列があります】（ＳＥＱＩＤＮＯ：４）；並びに５′【配列があり ます】（ＳＥＱＩＤＮＯ：５）および５′【配列があります】（ＳＥＱＩＤＮＯ ：６）から成るグループから選択されるＰＣＲプライマーの対を用いて、正常な ヒトゲノムＤＮＡの一部をＰＣＲ増幅し； 該増幅されたＤＮＡをプローブに用いて、ヒト第２２染色体配列を含むライブラ リーをスクリーニングして、該増幅されたＤＮＡとハイブリダイズする断片もし くはクローンを単離する、 工程に従って調製される、ディジョージ症候群、ベロカーディオフェイシャル症 候群、ＣＨＡＲＧＥ関連病、コノトランカル心臓欠損および口蓋裂から成るグル ープから選択される病状の少なくとも１つに関連した遺伝的欠失および変異の検 出に有用な診断用プローブ。
7. ７．第２２染色体を含むライブラリーからのクローンをＰＣＲ増幅して下記プロ ーブを含むクローンを同定することによって調製される、ディジョージ症候群、 ベロカーディオフェイシャル症候群、ＣＨＡＲＧＥ関連病、コノトランカル心臓 欠損および口蓋裂から成るグループから選択される病状の少なくとも１つに関連 した遺伝的欠失および変異の検出に有用な診断用プローブ。
8. ８．請求項５、６および７に記載の方法によって調製されるプローブから成るグ ループから選択される診断用プローブを含む、ディジョージ症候群、ベロカーデ ィオフェイシャル症候群、ＣＨＡＲＧＥ関連痛、コノトランカル心臓欠損および 口蓋裂から成るグループから選択される病状の少なくとも１つに関連した遺伝的 欠失および変異を検出するための診断用キット。
9. ９．ディジョージ症候群決定領域中に特異的な配列であることが示されている染 色体２２ｑ１１の一部を効果的に増幅するプライマー対を含む、ディジョージ症 候群、ベロカーディオフェイシャル症候群、ＣＨＡＲＧＥ関連病、コノトランカ ル心臓欠損および口蓋裂から成るグループから選択される病状の少なくとも１つ に関連した遺伝的欠失および変異を検出するための診断用キット。
10. １０．プライマーが、５′【配列があります】（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）および５ ′【配列があります】（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）５′【配列があります】（ＳＥＱ ＩＤＮＯ：３）および５′【配列があります】（ＳＥＱＩＤＮＯ：４）；並びに ５′ （ＳＥＱＩＤＮＯ：５）および５′【配列があります】（ＳＥＱＩＤＮＯ：６） から 成るグループから選択される、請求項９に記載のキット。