ES2780775A1 - METODO PARA DETECTAR DUPLICACIONES Y/O DELECIONES EN LA REGION CROMOSOMICA 22q11.2 - Google Patents

Abstract

Método para detectar duplicaciones y/o deleciones en la región cromosómica 22q11.2. La presente invención se refiere a un método para detectar duplicaciones y/o deleciones en el cromosoma 22, particularmente en la región cromosómica 22q11.2, que comprende determinar el número de alelos que tienen un conjunto de marcadores genéticos presentes entre las regiones de baja repetición de copias (Low Copy Repeats, LCR22, en sus siglas en inglés), siendo de aplicación dicho método en el diagnóstico de enfermedades asociadas con dichas anomalías genéticas, tales como cardiopatías congénitas y síndrome de DiGeorge entre otras. Asimismo, la presente invención también se relaciona cebadores capaces útiles en la detección del número de alelos, el kit que comprende dichos cebadores y el uso de los mismos para el diagnóstico de las enfermedades asociadas a dichas anomalías genéticas.

Description

DESCRIPCIÓN

MÉTODO PARA DETECTAR DUPLICACIONES Y/O DELECIONES EN LA REGIÓN CROMOSÓMICA 22q11.2

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a un método para detectar duplicaciones y/o deleciones en el cromosoma 22, particularmente en la región cromosómica 22q11.2, basado en determinar el número de alelos que tienen un conjunto de marcadores genéticos presentes entre las regiones de baja repetición de copias (Low Copy Repeats, LCR, en sus siglas en inglés) del cromosoma 22 (LCR22s), siendo de aplicación dicho método en el diagnóstico de las causas genéticas de las cardiopatías congénitas, también a nivel prenatal. Asimismo, la presente invención también se relaciona con las parejas de cebadores empleadas en la detección de los marcadores genéticos y así detectar el número de alelos, el kit que comprende dichas parejas de cebadores y el uso de los mismos para el diagnóstico de patologías asociadas a modificaciones cromosómicas en la región 22q11.2, tales como, por ejemplo, cardiopatías congénitas, esquizofrenia e inmunodeficiencia, entre otras.

ESTADO DE LA TÉCNICA

Las cardiopatías congénitas se pueden definir como anomalías del corazón que se originan durante la vida fetal, y que por tanto son causados por problemas del desarrollo. Las cardiopatías congénitas son el defecto congénito más frecuente y presentan una elevada incidencia de alrededor del 1% de los nacimientos. Una de las causas genéticas más conocidas de las cardiopatías congénitas, responsable de un 2 % de casos, son las deleciones o duplicaciones de la región 22q11.2 (dup/del22q11.2) que a su vez tienen una incidencia estimada de 1/2000-4000 nacimientos.

El 22q11.2DS es el síndrome microdelecional más frecuente en humanos y está causado por la pérdida de unos 40 genes en la región cromosómica 22q11.2. Los síndromes de DiGeorge y Velocardiofacial (VCF) incluidos en el 22q11.2DS son entidades asociadas a un cuadro clínico que puede presentar defectos congénitos del corazón, inmunodeficiencia causada por la ausencia o hipoplasia del timo, retraso mental moderado, insuficiencia velofaríngea, fisura palatina, alteraciones psiquiátricas como esquizofrenia, rasgos dismórficos, hipoparatiroidismo e hipocalcemia. Un 80-90% de pacientes con síndrome de DiGeorge/VCF independientemente de su grado de afectación son portadores de una deleción idéntica de 3 Mb, mientras que un 5 % son portadores de una deleción idéntica de 1,5 Mb, en la mencionada región cromosómica 22q11.2. Sin embargo, a pesar de la homogeneidad genética de los afectos, existe una variabilidad muy grande en la presencia de todos o alguno de los rasgos clínicos incluso en individuos afectos de una misma familia, pudiendo observarse desde individuos con ningún o con un solo rasgo clínico, a individuos con varios o con todos los rasgos clínicos mencionados.

Una característica de la práctica totalidad de los pacientes que presentan deleciones o duplicaciones en la región 22q11.2 independientemente del tamaño de las mismas, es que estas están causadas por una recombinación anómala entre regiones del cromosoma que se hallan repetidas y que en inglés se llaman “Low Copy Repeats” (LCRs), ya que se encuentran en un numero bajo de copias en el genoma. Hay un total de 8 LCR22s en la región 22q11.2 que podrían mediar una deleción o duplicación entre ellos y que por tanto, determinarían un total de 7 intervalos susceptibles a perderse o ganarse con cierta frecuencia (Yamagishi, 2002. Keio J Med, 2: 77-88).

La detección de una deleción o duplicación en el locus 22q11.2 asociada, en particular, a una cardiopatía congénita es importante por las siguientes razones:

1) Porque permite evaluar si el paciente presenta otros rasgos clínicos asociados al síndrome,

2) Porque permite hacer un diagnóstico temprano y ofrecer un consejo genético, y 3) Porque las cardiopatías congénitas causadas por una deleción en el locus 22q11.2 están asociadas a una mayor mortalidad en el acto quirúrgico debido sobre todo a la inmunodeficiencia y la hipocalcemia (Mahle et al. Ann Thorac Surg. 2003;76(2):567-71).

Así, una detección temprana de la presencia de deleción y/o duplicación en el locus 22q11.2 (del/dup22q11.2) permitirá además del diagnóstico y tratamiento temprano de las cardiopatías congénitas, un tratamiento temprano de las anomalías no cardiacas asociadas y el consejo genético a la familia con información de la recurrencia del defecto heredado o de novo.

Las cardiopatías congénitas son a día de hoy una de las principales causas de morbilidad y mortalidad neonatal asociada a defectos en el desarrollo, afectando aproximadamente al 1% de neonatos. Son 6 veces más comunes que las anomalías cromosómicas y 4 veces más comunes que los defectos del tubo neural. A pesar de los avances actuales, la mortalidad perinatal en recién nacidos con cardiopatías congénitas es todavía considerablemente elevada (9.2% al "Heart Disease and Stroke Statistics" 2016). Además, los enfermos con cardiopatías congénitas tienen una probabilidad 10 veces superior a la de la población normal de sufrir una insuficiencia cardíaca (IC). Se sabe que prácticamente la cuarta parte de los enfermos con cardiopatías congénitas desarrollarán IC a los 30 años y que la probabilidad de desarrollar IC en enfermos con cardiopatías congénitas con lesiones del tipo Tetralogía de Fallot y transposición de grandes vasos es del 80% a los 50 años. Las cardiopatías congénitas pueden presentarse como malformaciones aisladas o en combinación con otros defectos de nacimiento y su riesgo general de recurrencia a priori se ha estimado que es de entre el 3 y 9%. Además, las cardiopatías congénitas van asociadas a un elevado coste para la Sanidad Pública que debe asumir los gastos de las intervenciones quirúrgicas, así como los tratamientos posteriores que en ciertos casos se requieren. Por todo ello, es muy importante identificar marcadores genéticos inequívocos para poder diagnosticar lo antes posible las cardiopatías congénitas in útero, así como el resto de patologías asociadas a la deleción y/o duplicación de la región cromosómica 22q 11.2, sobre los que poder actuar.

Hoy en día, las mejoras en las técnicas diagnósticas prenatales (principalmente ecográficas) permiten la detección de más del 90% de las cardiopatías congénitas de forma prenatal (Allan 2007. Am J Med Genet C Semin Med Genet;145C(1):73-76). Estas se pueden detectar por un incremento de la translucencia nucal en el primer trimestre o una visualización directa de la anomalía cardiaca en el segundo trimestre de gestación. También pueden realizarse análisis genéticos sobre el ADN extraído de cualquier muestra biológica, y hoy en día es rutinario realizarlos sobre muestras prenatales como el líquido amniótico o la biopsia coriónica extraídos entre la semana 10 y la 20 de gestación. La confirmación de una deleción/duplicación 22q11.2 supone que el recién nacido quizás no solamente sufrirá una cardiopatía congénita sino quizás toda una serie adicional de rasgos clínicos de carácter más o menos grave que además podrá transmitir a su descendencia.

Históricamente, la determinación de la presencia de una del22q11.2 se ha hecho mediante hibridación in situ fluorescente (FISH) utilizando una única sonda (TUPLE1 o N25) que hibrida con una zona común entre las deleciones más frecuentes de 1,5 y 3 Mb. Por tanto, una determinación FISH tiene sensibilidad para detectar las deleciones conocidas más frecuentes y a priori una cobertura del 95% de pacientes con del22q11.2. Sin embargo, esta prueba no detecta deleciones que no abarquen la región hibridada por la sonda utilizada. Dado que retrospectivamente la gran mayoría de estudios para detectar del22q11.2 están basados en la técnica FISH, es posible que haya una distorsión en cuanto a la frecuencia de deleciones atípicas y estas sean mucho más frecuentes que las estimaciones actuales. Si esto fuera así, la sensibilidad del FISH con la sonda TUPLE1 podría ser bastante menor al 95% esperado. De hecho, las deleciones y duplicaciones “atípicas” son más frecuentes de lo que se creía y los fenotipos de estas no son fáciles de distinguir del fenotipo que causan las deleciones y duplicaciones “clásicas” de 1.5 y 3 Mb. Todo esto indica que a priori los rasgos típicos de la del22q11.2 podrían estar causados por deleciones o duplicaciones entre cualquier LCR22 de la región y muchas de ellas no serían detectadas mediante la técnica FISH con la sonda TUPLE1.

Se han descrito métodos moleculares que sustituyen o complementan a la técnica FISH. Dichos métodos se pueden agrupar según la técnica molecular en que se basan, destacando las técnicas de RT-PCR (Hwang et al. BMC Med Genet, 2014; 15:106), pirosecuenciación (Koontz et al. J Mol Diagn, 2014,16: 5). MALDI-TOF (Kobrynski. Clin. Chem., 2016, 62:1), MLPA (Múltiple Ligation-dependent Probe Amplification) (Zhang et al. BMC Genomics, 2015, 16:364), microarrays (Beaujard et al. Eur J Med Genet, 2009, 52: 321-327), análisis por STR (Short tandem repeats) o microsatellite, entre otras.

Existe mucha información en el estado de la técnica relacionada con el uso de marcadores STR para la detección de deleciones en la región cromosómica 22q11.2, pero dichos marcadores van dirigidos a la identificaciones de regiones o intervalos de los LCR ampliamente conocidos, dando lugar a la identificación de las deleciones típicas (Bonnet et al. Am.J.Med. Genet, 1997, 68, 182-184; Driscoll et al. Gen. Testing, 1997, 1, 2; Vittorini et al. Clin Chem Lab Med 2001; 39(12):1249-1258; Yang et al.

Electrophoresis, 2009, 30, 465-471). Ninguno de los marcadores STR descritos detectan deleciones atípicas en dicha región 22q11.2.

Por otro lado, también en la solicitud de patente internacional WO2008070249 se describe un ensayo para detectar la presencia de aberraciones cromosómicas, como por ejemplo, las deleciones en la región cromosómica 22q11.2 en diagnóstico prenatal, mediante el empleo de diferentes marcadores STR que cubren diferentes regiones cromosómicas, tales como D22S420, D22S446, D22S689, D22S685, AMXY y DXS8377. También en la solicitud de patente internacional WO1993007293A1 se describe un método para el diagnóstico del síndrome de DiGeorge que comprende la identificación de la pérdida de copias funcionales de la región denominada "loci de la región crítica del síndrome de DiGeorge”, correspondiente a una región de 5 Mb del cromosoma 22 flanqueada por los polimorfismos D22S9 y D22S43 e identificado por los marcadores D22S75 y D22S259.

Todas estas técnicas y marcadores permiten también determinar la presencia de deleciones y duplicaciones en la región cromosómica 22q11.2, pero están limitadas a las deleciones y duplicaciones "clásicas” de la región 22q11.2, al utilizar las sondas, cebadores, o SNPs diseñadas para las regiones ya conocidas, pero siguen sin ser útiles para la identificación de las deleciones y duplicaciones "atípicas”.

Así, existe la necesidad de desarrollar un método que permita detectar de manera rápida, sencilla, económica y en presencia o ausencia de muestras de ADN maternas, todas las deleciones y/o duplicaciones posibles de la región 22q11.2, tanto las típicas como las atípicas, además de poder detectar contaminación materna en las pruebas prenatales, como la amniocentesis y la biopsia de corion.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención soluciona los problemas mencionados anteriormente en relación con la identificación de deleciones y/o duplicaciones, tanto típicas como atípicas, en la región cromosómica 22q11.2, mediante el uso de marcadores específicos dirigidos a la identificación de zonas de dicha región cromosómica que hasta ahora no se habían descrito. Así la presente invención ha identificado 38 nuevos STRs que han sido diseñados específicamente y que están distribuidos estratégicamente en todos los intervalos inter-LCR22 para detectar cualquier deleción y/o duplicación atípica en la región 22q11.2.

Las regiones LCR22 presentes en la región cromosómica 22q11.2 tienen diferentes denominaciones, en la Tabla 1 (primera y segunda columna) se muestran dos de las denominaciones comúnmente utilizadas para cada una de dichas regiones. Además, en la Tabla 1 se indica la delimitación de cada una de dichas regiones LCR, así como la delimitación de las regiones inter-LCRs dentro de la región 22q11.2 a partir de la versión NCBI37/hg19 de la secuencia del genoma humano disponible en UCSC (http://genome.ucsc.edu/).

Tabla 1. Delimitación de las regiones LCR22s en la región cromosómica 22q11.2

*se muestran las dos denominaciones más comunes utilizadas para identificar as diferentes regiones LCR localizadas en la región cromosómica 22q11.2.

Así, en un primer aspecto, la invención se relaciona con un método in vitro para detectar duplicaciones y/o deleciones en la región cromosómica 22q11.2 (del/dup22q11.2), de aquí en adelante, primer método in vitro de la invención, en una muestra biológica aislada de un sujeto que comprende determinar en dicha muestra, preferiblemente una muestra de ADN, el número de alelos que presentan los marcadores genéticos localizados en las siguientes regiones del cromosoma 22:

(i) la región anterior a la región LCR22A situada entre las posiciones 18,642,491-19,023,012 pb del cromosoma 22;

(ii) la región inter-LCR22A-B delimitada por las LCR22A y LCR22B localizadas en las posiciones 18,642,491-19,023,012 pb y 20,249,559-20,731,985 pb del cromosoma 22, respetivamente;

(iii) la región inter-LCR22B-C delimitada por las LCR22B y LCR22C localizadas en las posiciones 20,249,559-20,731,985 pb y 21,021,869-21,074,326 pb del cromosoma 22, respectivamente; (iv) la región inter-LCR22C-D delimitada por las LCR22C y LCR22D localizadas en las posiciones 21,021,869-21,074,326 pb y 21,465,674-21,917,116 pb del cromosoma 22, respectivamente; y (v) la región inter-LCR22D-E delimitada por las LCR22D y LCR22E localizada en las posiciones 21,465,674-21,917,116 pb y 22,963,079-22,997,578 pb del cromosoma 22, respectivamente, en donde un número de alelos inferior a dos en al menos uno de los marcadores de al menos una de las regiones (i) a (v) es indicativo de una deleción en dicha región 22q11.2, y donde un número de alelos igual o superior a tres en al menos uno de los marcadores de al menos una de las regiones (i) a (v) es indicativo de una duplicación en dicha región 22q11.2.

La identificación de las regiones mencionadas anteriormente se lleva a cabo mediante marcadores genéticos, preferiblemente marcadores polimórficos, más preferiblemente marcadores STR (short tándem repeats). Una vez identificados dichos marcadores STR se diseñan cebadores o primers para la identificación del número de alelos que presenta un individuo para dicho marcador en la región concreta de ADN en la que se localiza el mismo. De esta manera, pudiendo identificar el número de alelos de, al menos, un marcador entre cada una de las regiones inter-LCR22 y/o en las regiones LCR22, indicadas anteriormente y también en la Tabla 1, es posible detectar cualquier deleción/duplicación, tanto típica como atípica, que pueda presentar un sujeto en la región cromosómica 22q11.2.

Así, en una realización preferida del método de la invención, los marcadores que identifican cada una de las regiones i) a v) del cromosoma 22 se seleccionan de la lista que consiste en:

(i) CATCH5 (SEQ ID NO: 111), CATCH53 (SEQ ID NO: 112) y CATCH52 (SEQ ID NO: 113), son marcadores que identifican la región anterior a la región LCR22A;

(ii) CATCH4 (SEQ ID NO: 114), CATCH6 (SEQ ID NO: 115), CATCH48 (SEQ ID NO: 116), CATCH22 (SEQ ID NO: 117), CATCH19 (SEQ ID NO: 118), CATCH7 (SEQ ID NO: 119) y CATCH23 (SEQ ID NO: 120) son marcadores que identifican la región inter-LCR22A-B;

(iii) CATCH45 (SEQ ID NO: 121), CATCH10 (SEQ ID NO: 122) y CATCH20 (SEQ ID NO: 123), son marcadores que identifican la región inter-LCR22B-C;

(iv) CATCH42 (SEQ ID NO: 124), CATCH41 (SEQ ID NO: 125), CATCH11 (SEQ ID NO: 126), CATCH12 (SEQ ID NO: 127), CATCH13 (SEQ ID NO: 128), CATCH14 (SEQ ID NO: 129), CATCH39 (SEQ ID NO: 130), CATCH38 (SEQ ID NO: 131) y CATCH37 (SEQ ID NO: 132), son marcadores que identifican la región inter-LCR22C-D; y

(v) CATCH36 (SEQ ID NO: 133), CATCH35 (SEQ ID NO: 134), CATCH31 (SEQ ID NO: 135), CATCH25 (SEQ ID NO: 136), CATCH24 (SEQ ID NO: 137), CATCH26 (SEQ ID NO: 138), CATCH30 (SEQ ID NO: 139), CATCH29 (SEQ ID NO: 140), CATCH15 (SEQ ID NO: 141), CATCH16 (SEQ ID NO: 142), CATCH28 (SEQ ID NO: 143), CATCH17 (SEQ ID NO: 144), CATCH18 (SEQ ID NO: 145), CATCH33 (SEQ ID NO: 146), CATCH27 (SEQ ID NO: 147) y CATCH51 (SEQ ID NO: 148), son marcadores que identifican la región inter-LCR22D-E.

Todos estos marcadores pueden utilizarse de manera independiente, en combinación entre ellos, o incluso en combinación con otros marcadores ya conocidos y descritos en el estado de la técnica, para la determinación de la presencia de deleciones y/o duplicaciones en la región 22q11.2.

En otro aspecto, la invención se relaciona con el uso del método in vitro de la presente invención, para el diagnóstico de patologías asociadas con deleciones y/o duplicaciones de la región 22q11.2, tales como cardiopatías congénitas, síndrome de DiGeorge/22q11.2DS, síndrome velocardiofacial, esquizofrenia, retraso mental e inmunodeficiencia, entre otros, de aquí en adelante, método de diagnóstico in vitro de la invención, en donde si una duplicación y/o deleción es detectada en el ADN procedente de una muestra biológica de un individuo, entonces dicho individuo tiene una alta probabilidad de padecer una patología de este tipo.

En una realización particular del método de diagnóstico in vitro de la invención, dicho diagnóstico es un diagnóstico prenatal, que comprende llevar a cabo el método de diagnóstico in vitro objeto de la presente invención a partir de una muestra biológica aislada que contiene células fetales, pudiendo además contener o no ADN materno, en donde si una duplicación y/o deleción es detectada en el ADN procedente del feto, entonces el feto tiene una alta probabilidad de padecer una patología de este tipo.

En otro aspecto, la invención se relaciona con una pareja de cebadores capaz de identificar, de manera independiente, el número de alelos que presentan los marcadores CATCH5 (SEQ ID NO: 111), CATCH53 (SEQ ID NO: 112), CATCH52 (SEQ ID NO: 113), CATCH4 (SEQ ID NO: 114), CATCH6 (SEQ ID NO: 115), CATCH48 (SEQ ID NO: 116), CATCH22 (SEQ ID NO: 117), CATCH19 (SEQ ID NO: 118), CATCH7 (SEQ ID NO: 119), CATCH23 (SEQ ID NO: 120), CATCH45 (SEQ ID NO: 121), CATCH10 (SEQ ID NO: 122), CATCH20 (SEQ ID NO: 123), CATCH42 (SEQ ID NO: 124), CATCH41 (SEQ ID NO: 125), CATCH11 (SEQ ID NO: 126), CATCH12 (SEQ ID NO: 127), CATCH13 (SEQ ID NO: 128), CATCH14 (SEQ ID NO: 129), CATCH39 (SEQ ID NO: 130), CATCH38 (SEQ ID NO: 131), CATCH37 (SEQ ID NO: 132), CATCH36 (SEQ ID NO: 133), CATCH35 (SEQ ID NO: 134), CATCH31 (SEQ ID NO: 135), CATCH25 (SEQ ID NO: 136), CATCH24 (SEQ ID NO: 137), CATCH26 (SEQ ID NO: 138), CATCH30 (SEQ ID NO: 139), CATCH29 (SEQ ID NO: 140), CATCH15 (SEQ ID NO: 141), CATCH16 (SEQ ID NO: 142), CATCH28 (SEQ ID NO: 143), CATCH17 (SEQ ID NO: 144), CATCH18 (SEQ ID NO: 145), CATCH33 (SEQ ID NO: 146), CATCH27 (SEQ ID NO: 147) y CATCH51 (SEQ ID NO: 148), donde dichos cebadores se describen en la Tabla 4.

En otro aspecto, la presente invención se refiere al uso in vitro de los marcadores, así como de los cebadores que reconocen dichos marcadores, para detectar duplicaciones y/o deleciones en la región cromosómica 22q11.2, preferiblemente para el diagnóstico in vitro de cardiopatías congénitas, síndrome de DiGeorge y/o síndrome velocardiofacial y/o para el diagnóstico in vitro de esquizofrenia, retraso mental moderado y/o inmunodeficiencia, según se ha descrito anteriormente.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un kit, de aquí en adelante kit de la invención, que comprende al menos un conjunto de parejas de cebadores, que identifican el número de alelos que presentan al menos uno de los marcadores de la invención, y/o cualquier combinación de marcadores de la invención, tal y como se han descrito anteriormente (Tabla 4), y, opcionalmente, reactivos para llevar a cabo una PCR y/o reactivos para aislar ADN a partir de una muestra biológica.

En otro aspecto, la invención se refiere al uso del kit de la invención para detectar duplicaciones y/o deleciones en la región cromosómica 22q11.2, y/o para el diagnóstico de cardiopatías congénitas, síndrome de DiGeorge, síndrome velocardiofacial, esquizofrenia, retraso mental y/o inmunodeficiencia, en una muestra biológica aislada de un sujeto.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

FIG. 1. Representación gráfica que muestra un mapa de la región cromosómica 22q11.2, donde se localizan los marcadores empleados en las dos reacciones de amplificación PCR multiplex descritas en el Ejemplo 2. Las letras A a F representan los diferentes LCR22s que delimitan los intervalos utilizados para la detección de las deleciones y/o duplicaciones típicas y atípicas en la región cromosómica 22q11.2.

En la figura se muestra también las regiones donde se producen las deleciones más frecuentes (típicas) y las más atípicas. En la parte superior de la figura se han indicado los porcentajes de los pacientes (n=1448) a los que se les ha podido descartar la presencia de deleciones (Informatividad) en dicha región 22q11.2 tras completar el estudio mediante el método in vitro de la invención utilizando la PCR multiplex descrita en el Ejemplo 2, poniendo de manifiesto como se observa mediante un secuenciador automático los marcadores utilizados en dicha PCR multiplex cuando existe una deleción en la muestra analizada.

FIG. 2. Visualización tras una electroforesis capilar de los productos resultantes de las dos PCRs multiplex con las once parejas de cebadores propuestas en un individuo control sano (ver Ejemplo 2). Los picos marcados con la letra A hace referencia a la identificación con marcadores marcados con el fluorocromo fluoresceína. Los picos indicados con la letra B hace referencia a la identificación con marcadores marcados con el fluorocromo HEX. Los picos indicados con la letra C hace referencia a la identificación con marcadores marcados con el fluorocromo TAMRA. Las letras A1, B1 y C1 corresponden a la PCR multiplex 1 y A2 y B2 a la PCR multiplex 2. Los marcadores identificados con las 11 parejas de cebadores son los siguientes: 1: D22S427; 2: CATCH48; 3: CATCH13; 4: CATCH19; 5: D22S264; 6: CATCH53; 7: CATCH18; 8: D22S941; 9: CATCH16; 10: CATCH23 y 11: D22S686. Los cebadores que identifican dichos marcadores se describen en la Tabla 1. Los resultados mostrados indican que el individuo es heterocigoto para los marcadores 2: CATCH48; 3: CATCH13; 4: CATCH19; 5: D22S264, 7: CATCH18; 8: D22S941 y 10: CATCH23, lo que indica que no es portador de deleción alguna.

FIG. 3. Visualización tras una electroforesis capilar de los productos resultantes de las dos PCRs multiplex con las once parejas de cebadores propuestas en un individuo que presenta la deleción de 3 Mb (ver Ejemplo 2). Los picos marcados con la letra A hace referencia a la identificación con marcadores marcados con el fluorocromo fluoresceína. Los picos indicados con la letra B hace referencia a la identificación con marcadores marcados con el fluorocromo HEX. Los picos indicados con la letra C hace referencia a la identificación con marcadores marcados con el fluorocromo TAMRA. Las letras A1, B1 y C1 corresponden a la PCR multiplex 1 y A2 y B2 a la PCR multiplex 2. Los marcadores identificados con las 11 parejas de cebadores son los siguientes: 1 (D22S427), 2 (CATCH48), 3 (CATCH13), 4 (CATCH19), 5 (D22S264), 6 (CATCH53), 7 (CATCH18), 8 (D22S941), 9 (CATCH16), 10 (CATCH23) y 11 (DS22S686). Los cebadores que identifican dichos marcadores se describen en la Tabla 1. Los resultados mostrados indican que el individuo es homocigoto para los marcadores 2 (CATCH48), 3 (CATCH13), 4 (CATCH19), 5 (D22S264), 8 (D22S941) y 10 (CATCH23), por lo que teniendo en cuenta que es altamente improbable que 3 marcadores seguidos en un intervalo flanqueado por LCR22s sean homocigotos (p=0,075), se puede concluir que el individuo es portador de la deleción más común de 3 Mb.

FIG. 4. Visualización tras una electroforesis capilar de los productos resultantes de las dos PCRs multiplex con las once parejas de cebadores propuestas en un individuo con la deleción de 3 Mb y mapa de la región. La figura muestra de arriba abajo: Posición en el mapa genético de los marcadores: 1 (D22S427), 2 (CATCH48), 3 (CATCH13), 4 (CATCH19), 5 (D22S264), 6 (CATCH53), 7 (CATCH18), 8 (D22S941), 9 (CATCH16), 10 (CATCH23) y 11 (D22S686); el mapa de la región con las LCR22s (A, B, C, D, E, F) causantes de las deleciones y/o duplicaciones marcados como cuadrados negro; las deleciones más frecuentes mostradas como barras grises; la posición de la sonda FISH TUPLE1 (rectángulo cuadriculado); y en la parte inferior el resultado del análisis de los once marcadores. En la parte inferior se muestran los porcentajes de informatividad (% por intervalo de al menos un marcador heterozigoto en individuos normales). Todos los marcadores que se hallan en el intervalo entre los LCR22s A y D que limita la deleción más frecuente de 3Mb son homocigotos lo que indica la presencia de la deleción tal como se ha explicado en la Figura 3. Dicho intervalo delecionado se muestra mediante sombreado en gris con rayas horizontales.

FIG. 5. Visualización de un individuo que presenta la deleción de 3 Mb en paralelo con la visualización de sus progenitores analizado mediante electroforesis. La figura también muestra en la parte superior el mapa de la región cromosómica 22q11. 2. En esta figura se muestra de arriba abajo: Posición en el mapa de los marcadores: 1 (D22S427), 2 (CATCH48), 3 (CATCH13), 4 (CATCH19), 5 (D22S264), 6 (CATCH53), 7 (CATCH18), 8 (D22S941), 9 (CATCH16), 10 (CATCH23) y 11 (D22S686); el mapa de la región con las LCR22s (A, B, C, D, E, F) causantes de las deleciones y/o duplicaciones marcados como cuadrados negros, las deleciones más frecuentes mostradas como barras grises; la posición de la sonda FISH TUPLE1 (rectángulo cuadriculado); y en la parte inferior el resultado del análisis de algunos de los microsatélites propuestos para el kit marcados con plata (D22S427, CATCH48, CATCH13, CATCH16). Se presentan los resultados de un individuo y de sus padres, que se representan por la genealogía, en la parte inferior de la Tabla. Se trata de un individuo que presenta la deleción de 3Mb. Dicho intervalo delecionado se muestra mediante sombreado de rayas horizontales. Se incluye el tipaje del individuo delecionado y sus padres. Esta prueba cuando se realiza en presencia de los padres es concluyente: en este caso para la presencia de la deleción, al no heredarse en este caso el alelo paterno. Se trata por lo tanto de una deleción de novo de origen paterno.

FIG: 6. Visualización tras una electroforesis capilar de los productos resultantes de las dos PCRs multiplex con las once parejas de cebadores propuestas en un individuo con una duplicación de 1 Mb. La figura también muestra en la parte superior el mapa de la región cromosómica 22q11. 2. En esta figura se muestra de arriba abajo: Posición en el mapa de los marcadores de microsatélite: 1 (D22S427), 2 (CATCH48), 3 (CATCH13), 4 (CATCH19), 5 (D22S264), 6 (CATCH53), 7 (CATCH18), 8 (D22S941), 9 (CATCH16), 10 (CATCH23), 11 (D22S686); el mapa de la región con las LCR2222s (A, B, C, D, E, F) causantes de las deleciones y/o duplicaciones marcados como cuadrados negros; las deleciones más frecuentes mostradas como barras grises; la posición de la sonda FISH TUPLE1 (rectángulo cuadriculado); y en la parte inferior el resultado del análisis de los once microsatélites. En la parte de abajo se muestran los porcentajes de informatividad (% por intervalo de al menos un marcador heterozigoto en individuos normales). Los marcadores CATCH13 (3) y D22S264 (5) presentan tres alelos lo que es prueba concluyente de una duplicación atípica de esta región. Dicho intervalo duplicado se muestra mediante sombreado de rayas verticales.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Los autores de la presente invención han desarrollado y validado un método in vitro para detectar duplicaciones y/o deleciones en la región cromosómica 22q11.2 basado en la detección del número de alelos que presentan un conjunto de marcadores genéticos localizados en cada uno de los intervalos delimitados por las regiones repetidas de bajo número de copias de la región del cromosoma 22q11.2 (LCR22). En la Tabla 1 se indica la delimitación de dichas regiones LCR22, así como de las regiones inter-LCRs, a partir de la versión NCBI37/hg19 de la secuencia del genoma humano disponible en UCSC (http://genome.ucsc.edu/), con las dos nomenclaturas al uso hoy en día (primera y segunda columna de la Tabla 1).

Para la obtención de dichos marcadores, tal como se muestra en el Ejemplo 1 que acompaña a la presente descripción, los inventores localizaron con precisión la posición exacta de regiones LCR22 en la región cromosómica 22q11.2, para posteriormente identificar marcadores genéticos de tipo STR localizados en cada uno de los intervalos delimitados por dichas regiones LCR22, específicamente en los intervalos inter-LCRs, y una vez identificados dichos nuevos marcadores polimórficos en los intervalos inter-LCR22, diseñar parejas de cebadores capaces de amplificar dichos marcadores y así poder determinar el número de alelos de los mismos en una muestra biológica aislada de un sujeto. De esta manera, se determina el número de alelos mediante la identificación de, al menos un marcador de tipo STR para cada una de las regiones inter-LCR22 y/o LCR22 identificadas (Tabla 1), permitiendo así la detección de cualquier deleción/duplicación, tanto típica como atípica, que se produzca en la región cromosómica 22q11.2, siendo de utilidad para el diagnóstico de patologías asociadas con la presencia de deleciones y/o duplicaciones en dicha región 22q11.2, más preferiblemente para el diagnóstico prenatal de dichas patologías.

Como sabe el experto en la materia, la determinación de regiones cromosómicas que presenten deleciones y/o duplicaciones se realiza estudiando el tamaño de los amplicones producidos en el proceso de PCR, a partir de una muestra biológica aislada de un sujeto o paciente, más concretamente, en la presente invención, la muestra biológica aislada comprende ADN.

A efectos de la presente invención, para determinar si un individuo es portador de una deleción se analizará si los marcadores STRs analizados en la presente invención son homocigotos y/o que dicho alelo corresponda únicamente a uno de los padres con los que se compara la muestra biológica aislada del individuo problema. Si no se tiene ADN de los padres para comparar, la homocigosidad de varios marcadores dentro de un intervalo será suficiente para asignar inicialmente la presencia de una deleción.

A efectos de la presente invención, para determinar si un individuo es portador de duplicaciones, la identificación de la presencia de al menos tres alelos será diagnostica de una duplicación si comparando con el ADN de los padres dos alelos provengan de uno de los padres y el tercero del otro progenitor. Si se detectan al menos tres alelos en muestras prenatales, será indicativo de contaminación materna, que se deberá descartar comparando con los alelos parentales, o mediante la utilización de otras técnicas conocidas en el estado de la técnica para el mismo fin.

En una realización preferida, el diagnóstico de una deleción y/o duplicación se podrá hacer con total seguridad en muestras que se han podido comparar con las de los padres, particularmente con la de la madre. Sin embargo, en el caso de que no se pueda acceder a una muestra biológica de los padres, preferiblemente se deberá confirmar la deleción y/o duplicación mediante otras técnicas, tales como FISH, MLPA, PCR a tiempo real, CGH arrays, o cualquier otra conocida por el experto en la materia.

Aunque en principio es suficiente con el ADN del feto o paciente para confirmar la sospecha de las deleciones y/o duplicaciones en la región cromosómica 22q11.2 sin necesidad de muestras de los padres, puede ser útil el uso de los marcadores de tipo STR descritos en la presente invención en combinación de otros marcadores genéticos utilizados para el mismo fin en el estado de la técnica, principalmente para evitar posibles errores diagnósticos debidos a potenciales contaminaciones de la muestra analizada, siempre que dicha muestra sea de un feto, con la muestra materna. Por lo tanto, el diagnóstico de patologías asociadas a la ganancia y/o perdida genética en la región 22q11.2 mediante el método in vitro descrito en la presente invención, se puede realizar en presencia de ADN de los padres o únicamente con el ADN del propositus (feto y su entorno como por ejemplo líquido amniótico). Una deleción será detectada con un 100% de seguridad, preferiblemente en los casos en que se realice el análisis conjuntamente con el ADN de los padres, cuando la muestra procedente del propositus presente un solo alelo en un marcador y este alelo corresponda a sólo uno de los padres y no haya heredado alelo alguno del otro progenitor. Una duplicación se detectará con un 100% de seguridad cuando haya al menos tres alelos en un marcador, dos de uno de los padres y el tercero del otro progenitor.

La detección de deleciones y/o duplicaciones en ausencia de muestras paternas es posible mediante dos características del método in vitro de la invención. La primera de dichas características es el uso de nuevos marcadores de tipo STR, preferiblemente junto con sus cebadores, para cada uno de los intervalos descritos para la región cromosómica 22q11.2, donde dichos nuevos marcadores de tipo STR poseen además una elevada heterozigosidad (0,7-0,8) y, por tanto, información asociada. Es altamente improbable que tres marcadores seguidos en un intervalo flanqueado por LCR22s sean homozigotos sin que ello corresponda a una deleción. La segunda de dichas características es que la identificación de una deleción y/o duplicación en la región cromosómica 22q11.2 vendrá determinada por el carácter semi-cuantitativo de la técnica utilizada, en este caso de la técnica de PCR.

Así, el método in vitro para detectar duplicaciones y/o deleciones en la región cromosómica 22q11.2, a partir de una muestra biológica aislada de un sujeto, se ha aplicado a muestras de individuos que podían padecer dichas modificaciones genéticas, con una tasa de éxito del 100%. Principalmente se ha llevado a cabo en muestras biológicas prenatales. Por lo tanto, la utilidad del método in vitro de la invención radica preferiblemente en la detección de duplicaciones y/o deleciones en la región cromosómica 22q11.2, en muestras prenatales. Las ventajas que presenta el método in vitro de la invención son las siguientes:

• Rapidez: obtención de los resultados en 4-5 horas,

• Detección de la contaminación por muestra materna evitando falsos negativos, • Información de qué progenitor ha producido la deleción y/o duplicación aunque sea de novo, siendo la única técnica conocida hasta la fecha que ofrece dicha característica,

• Tecnología muy barata ya que sólo es necesario usar los cebadores descritos aquí para determinar la presencia de los marcadores STR descritos en la invención, y llevar a cabo una técnica de PCR.

En base a esto, los inventores han desarrollado una serie de aspectos inventivos que serán descritos en detalle a continuación.

MÉTODO IN VITRO DE DETECCIÓN DE DUPLICACIONES Y/O DELECIONES EN LA REGIÓN CROMOSÓMICA 22q11.2

En un primer aspecto, la invención se relaciona con un método in vitro para detectar duplicaciones y/o deleciones en la región cromosómica 22q11.2 en una muestra biológica aislada de un sujeto, de aquí en adelante "primer método in vitro de la invención”, donde dicho método in vitro comprende determinar en la muestra biológica aislada de dicho sujeto, el número de alelos que presentan los marcadores genéticos localizados en al menos una de las siguientes regiones del cromosoma 22:

(i) la región anterior a la región LCR22A que comprende los marcadores polimórficos seleccionados de la lista que consiste en: CATCH5 (SEQ ID NO: 111), CATCH53 (SEQ ID NO: 112), CATCH52 (SEQ ID NO: 113), y/o cualquier combinación de los mismos;

(ii) la región inter-LCR22A-B que comprende los marcadores polimórficos seleccionados de la lista que consiste en: CATCH4 (SEQ ID NO: 114), CATCH6 (SEQ ID NO: 115), CATCH48 (SEQ ID NO: 116), CATCH22 (SEQ ID NO: 117), CATCH19 (SEQ ID NO: 118), CATCH7 (SEQ ID NO: 119), CATCH23 (SEQ ID NO: 120), y/o cualquier combinación de los mismos;

(iii) la región inter-LCR22B-C delimitada por las regiones LCR22B que comprende los marcadores polimórficos seleccionados de la lista que consiste en: CATCH45 (SEQ ID NO: 121), CATCH10 (SEQ ID NO: 122), CATCH20 (SEQ ID NO: 123), y/o cualquier combinación de los mismos;

(iv) la región inter-LCR22C-D que comprende los marcadores polimórficos seleccionados de la lista que consiste en: CATCH42 (SEQ ID NO: 124), CATCH41 (SEQ ID NO: 125), CATCH11 (SEQ ID NO: 126), CATCH12 (SEQ ID NO: 127), CATCH13 (SEQ ID NO: 128), CATCH14 (SEQ ID NO: 129), CATCH39 (SEQ ID NO: 130), CATCH38 (SEQ ID NO: 131), CATCH37 (SEQ ID NO: 132) y/o cualquier combinación de los mismos;

(v) la región inter-LCR22D-E que comprende los marcadores polimórficos seleccionados de la lista que consiste en: CATCH36 (SEQ ID NO: 133), CATCH35 (SEQ ID NO: 134), CATCH31 (SEQ ID NO: 135), CATCH25 (SEQ ID NO: 136), CATCH24 (SEQ ID NO: 137), CATCH26 (SEQ ID NO: 138), CATCH30 (SEQ ID NO: 139), CATCH29 (SEQ ID NO: 140), CATCH15 (SEQ ID NO: 141), CATCH16 (SEQ ID NO: 142), CATCH28 (SEQ ID NO: 143), CATCH17 (SEQ ID NO: 144), CATCH18 (SEQ ID NO: 145), CATCH33 (SEQ ID NO: 146), CATCH27 (SEQ ID NO: 147), CATCH51 (SEQ ID NO: 148), y/o cualquier combinación de los mismos;

donde un número de alelos inferior a dos en al menos uno de los marcadores, preferiblemente de todos los marcadores, de al menos una de las regiones (i) a (v), preferiblemente en al menos dos de las regiones (i) a (v), más preferiblemente en al menos tres de las regiones (i) a (v), más preferiblemente en al menos cuatro de las regiones (i) a (v), más preferible aún, en todas las regiones (i) a (v), es indicativo de una deleción en dicha región 22q11.2; y donde un número de alelos igual o superior a tres en al menos uno de los marcadores, preferiblemente de todos los marcadores, de al menos una de las regiones (i) a (v), preferiblemente en al menos dos de las regiones (i) a (v), más preferiblemente en al menos tres de las regiones (i) a (v), más preferiblemente en al menos cuatro de las regiones (i) a (v), más preferible aún, en todas las regiones (i) a (v), es indicativo de una duplicación en dicha región 22q11.2.

En la presente invención se entiende por “duplicaciones en la región cromosómica 22q11.2” al reordenamiento del material genético que comprende un incremento en el número de copias de un fragmento de ADN en la región 11.2 del brazo largo del cromosoma 22.

En la presente invención se entiende por "deleciones en la región cromosómica 22q11.2” al reordenamiento del material genético que comprende la pérdida de un fragmento de ADN en la región 11.2 del brazo largo del cromosoma 22.

El término LCR22 or low copy repeat, según se usa en la presente invención, se refiere a una región del genoma eucariota que presenta un alto grado de homología de secuencia (94-99%) con otros LCR22s y que tienen un tamaño de 200-400 kb. Los LCR22s aparecen a consecuencia del proceso de duplicación segmental, se localizan frecuentemente en la región pericentromérica o subtelomérica de los cromosomas y pueden contener genes y pseudogenes. Las regiones cromosómicas ricas en LCR22s tienen tendencia a dar lugar a deleciones y/o duplicaciones en dicha región debido a un mal alineamiento de los LCSs durante recombinación homóloga no alélica, lo que habitualmente resulta en la pérdida o duplicación de una o varias de las regiones cromosómicas que se encuentran entre dos LCR22s consecutivos (definidas en la presente invención como regiones interLCR22). En el caso particular de la presente invención, las delecciones y/o duplicaciones objeto de estudio son las que aparecen en las regiones interLCR22 delimitadas por las LCR22s que aparecen en la región 22q11.2 que podrían mediar una deleción y/o duplicación entre ellos y que determinarían un total de 7 intervalos susceptibles a perderse y/o ganarse con cierta frecuencia (Yamagishi, 2002. Keio J Med, 2: 77-88). Estas LCR22s en la región cromosómica 22q11.2 se denominan convencionalmente como LCR22-A, LCR22-B, LCR22-C, LCR22-D, LCR22-E y LCR22F y la posición dentro de la región cromosómica 22q11.2 está descrita a partir de la versión NCBI37/hg19 de la secuencia del genoma humano disponible en UCSC (http://genome.ucsc.edu/) y se muestran en la Tabla 1. En dicha Tabla 1 se muestra también las regiones inter-LCR22 que se describen en la presente invención.

Una vez conocida la localización de cada una de las regiones LCR22, e inter-LCR22 en la región cromosómica 22q11.2, el método in vitro de la invención comprende determinar en una muestra biológica aislada de un sujeto, el número de alelos que presenta cada marcador genético localizado en cada una de las regiones inter-LCR y/o alternativamente también en las regiones LCR22 del segmento 22q11.2.

Las secuencias nucleotídicas que definen cada uno de los marcadores STR denominados como CATCH en la presente invención, y que se localizan en las diferentes regiones inter-LCR mencionadas anteriormente, se describen en la Tabla 2.

Tabla 2. Marcadores STR de la región 22q11.2 entre las posiciones 18,270,416 pb y 26,013,117 pb del cromosoma 22 descritos en la presente invención.

1 Posición de la primera base del marcador en número de nucleótido en el cromosoma 22 humano (NCBI37/hg19).

La determinación del número de alelos presentes en cada una de las regiones descritas en la Tabla 1 para la región cromosómica 22q11.2, se lleva a cabo mediante la detección, en cada una de dichas regiones, de al menos un marcador polimórfico, preferiblemente un marcador STR, según se describen en la Tabla 2, o de las combinaciones específicas de cada uno de dichos marcadores STR para cada región LCR22 identificada.

A efectos de la presente invención, el término "muestra biológica" se refiere a cualquier muestra que permita el aislamiento de ácidos nucleicos, preferiblemente ADN, e incluye, pero sin limitarnos, fluidos biológicos o tejidos de un individuo, obtenidos mediante cualquier método conocido por un experto en la materia que sirva para tal fin. La muestra biológica podría ser, por ejemplo, pero sin limitarse, una muestra de fluido, como sangre, plasma, suero, líquido amniótico, o tejido. La muestra biológica en la presente invención puede ser fresca, congelada, fijada o fijada y embebida en parafina. Ejemplos de muestras biológicas de las que se puede obtener ADN incluyen, sin limitar a, fluidos biológicos, tales como sangre, líquido amniótico, saliva, orina, esperma, etc., y tejidos. El método in vitro de la invención puede utilizarse para el diagnóstico de patologías en es estadío prenatal. En este sentido, la muestra biológica aislada se obtiene de células procedentes del embrión o del feto en desarrollo directamente por biopsia, mediante una amniocentesis o la obtención de villi coriónico, sin dañar al embrión. Cualquiera de los procedimientos existentes en el estado de la técnica puede emplearse para extraer la muestra biológica del individuo, la cual, para simplificar la conservación y manejo de la misma, puede fijarse en formalina y embeber en parafina o congelar primero y después embeber en un medio criosolidificable, tal como compuesto OCT, mediante inmersión en un medio altamente criogénico que permite la congelación rápida.

Una vez que se ha obtenido la muestra biológica del individuo a analizar, ésta debe ser procesada para obtener la muestra de ADN. La muestra biológica se puede tratar para disgregar de forma física o mecánica la estructura del tejido o la célula, liberando los componentes intracelulares en una solución acuosa u orgánica para preparar el ADN. La fracción de ADN adecuada para la puesta en práctica de la invención es el ADN nuclear o ADN genómico. La extracción del ADN puede ser llevado a cabo usando cualquier método conocido por los expertos en la materia (Sambrock et al., 2001. "Molecular cloning: a Laboratory Manual”, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., Vol. 1-3) que incluyen sin limitación, centrifugaciones en gradientes de densidad, extracción en dos fases usando fenol acuoso o cloroformo con etanol, cromatografía en columna, métodos basados en la capacidad del ADN para unirse en superficies de cristal y/o silicatos, como preparaciones de tierra diatomeas o lechos de cristal, empleando kits comerciales, por ejemplo, los kits "Q-Biogene fast DNA kit” o el "QIAamp(R) DNA Blood Mini Kit” (Qiagen, Hilden, Alemania) el "G-Spin Ilp” (Intron Biotechnology, Corea) o el "Fast Prep System Bio 101” (Qbiogene, Madrid, España).

En la presente invención los términos "sujeto" e "individuo" se usan indistintamente y se refieren a todos los animales clasificados como mamíferos e incluye, pero no se limita a, animales de granja y domésticos, primates y humanos, por ejemplo, seres humanos, primates no humanos, vacas, caballos, cerdos, ovejas, cabras, perros, gatos o roedores. Preferiblemente, el sujeto es un ser humano hombre o mujer de cualquier edad o raza. Dicho término también comprende nasciturus, preferiblemente embriones o fetos, sin que implique en ningún momento la obtención de dicha muestra, el daño al embrión o feto.

En la presente invención, se entiende por "alelo” a la secuencia de nucleótidos en que puede presentarse un gen o un marcador genético. Los términos "marcador genético”, o simplemente "marcador”, son análogos y puede ser empleados indistintamente a lo largo de la presente descripción. En un individuo sin anomalías genéticas, hay dos alelos por gen o marcador (un alelo paterno y otro alelo materno). Un individuo es "homocigoto” para un marcador genético cuando ambos alelos son idénticos en ambos cromosomas homólogos, y es "heterocigoto” cuando ambos alelos son distintos. Se entiende por "marcador genético” al segmento o secuencia de ADN, codificante o no, con una ubicación física identificable en un cromosoma. Los marcadores genéticos funcionan como señaladores de diferentes regiones del genoma. Asimismo, los marcadores genéticos pueden ser polimórficos o no polimórficos.

A efectos de la presente invención, un "microsatélite” es una secuencia de ADN en las que un fragmento de 2 a 8 nucleótidos de longitud se repite de manera consecutiva y está flanqueado por secuencias únicas. La variación en el número de repeticiones crea diferentes alelos. Ejemplos de secuencias microsatélites son las repeticiones cortas en tándem o STR (Short Tándem Repeats) o las secuencias de repeticiones cortas o SSR (Short Sequence Repeat). Un "indel" es una forma común de polimorfismo que comprende una pequeña inserción o eliminación que es típicamente solamente de unos cuantos nucleótidos en longitud.

A efectos de la presente invención, un marcador es "polimórfico” cuando existen distintas variantes o alelos del marcador dentro de la población bajo estudio. El marcador puede comprender cualquier alelo de cualquier tipo variante encontrado en el genoma, incluyendo polimorfismos de nucleótido único o SNP (Single Nucleotide Polymophism) y microsatélites (STR).

A efectos de la presente invención, un "Polimorfismo de Nucleótido único" o "SNP” es una variación de la secuencia de ADN que ocurre cuando un nucleótido individual en una ubicación específica en el genoma difiere entre los miembros de una especie o entre cromosomas emparejados en un individuo. La mayor parte de los polimorfismos SNP tienen dos alelos. Cada individuo está en esta instancia ya sea homocigoto para un alelo de polimorfismo (es decir ambas SNP cromosómicas del individuo tienen el mismo nucleótido en el lugar (rs) o el individuo es heterocigoto (es decir, los dos cromosomas hermanos del individuo contiene diferentes nucleótidos). Los SNPs se designan habitualmente con una etiqueta de identificación ID (rs) de referencia oficial asignada para cada SNP a través del Centro Nacional para Información Biotecnológica (National Center for Biotechnology Information o NCBI).

A efectos de la presente invención, un marcador es "no polimórfico”, cuando el marcador no presenta variantes dentro de la población de estudio. Entre los marcadores no polimórficos se encuentran los sitios de secuencia específica o STS (Sequence-Tagged Sites), que son secuencias únicas de ADN de entre 200 y 500 pares de bases que se encuentran en el genoma; y los marcadores de secuencia expresada o EST (Expressed Sequence Tags) que son STS derivados de ADNc.

En una realización preferida del primer método in vitro de la invención, los marcadores que definen cada una de las regiones inter-LCR22s, así como las regionesLCR22s, descritas en el presente documento, son preferiblemente marcadores polimórficos, más preferiblemente, marcadores STR.

En otra realización más preferida del primer método in vitro de la invención, éste se caracteriza por que comprende determinar el número de alelos que presentan los marcadores:

(i) CATCH53 (SEQ ID NO: 112), localizado en la región anterior a la región LCR22A; (ii) CATCH48 (SEQ ID NO: 116), CATCH19 (SEQ ID NO: 118), CATCH23 (SEQ ID NO: 120), y/o cualquiera de sus combinaciones, localizados en la región inter-LCR22A-B;

(iii) CATCH45 (SEQ ID NO: 121), CATCH10 (SEQ ID NO: 122), CATCH20 (SEQ ID NO: 123), y/o cualquiera de sus combinaciones, localizados en la región inter-LCR22B-C;

(iv) CATCH13 (SEQ ID NO: 128), localizado en la región inter-LCR22C-D; y

(v) CATCH16 (SEQ ID NO: 142), CATCH18 (SEQ ID NO: 145), y/o cualquiera de sus combinaciones, localizados en la región inter-LCR22D-E.

En otra realización más preferida, el primer método in vitro de la presente invención, se caracteriza por que comprende identificar el número de alelos que presentan los marcadores:

(i) CATCH5 (SEQ ID NO: 111), CATCH53 (SEQ ID NO: 112) y CATCH52 (SEQ ID NO: 113), localizados en la región anterior a la región LCR22A;

(ii) CATCH4 (SEQ ID NO: 114), CATCH6 (SEQ ID NO: 115), CATCH48 (SEQ ID NO: 116), CATCH22 (SEQ ID NO: 117), CATCH19 (SEQ ID NO: 118), CATCH7 (SEQ ID NO: 119) y CATCH23 (SEQ ID NO: 120), localizados en la región inter-LCR22A-B;

(iii) CATCH45 (SEQ ID NO: 121), CATCH10 (SEQ ID NO: 122) y CATCH20 (SEQ ID NO: 123) localizados en la región inter-LCR22B-C;

(iv) CATCH42 (SEQ ID NO: 124), CATCH41 (SEQ ID NO: 125), CATCH11 (SEQ ID NO: 126), CATCH12 (SEQ ID NO: 127), CATCH13 (SEQ ID NO: 128), CATCH14 (SEQ ID NO: 129), CATCH39 (SEQ ID NO: 130), CATCH38 (SEQ ID NO: 131) y CATCH37 (SEQ ID NO: 132), localizados en la región inter-LCR22C-D, y

(v) CATCH36 (SEQ ID NO: 133), CATCH35 (SEQ ID NO: 134), CATCH31 (SEQ ID NO: 135), CATCH25 (SEQ ID NO: 136), CATCH24 (SEQ ID NO: 137), CATCH26 (SEQ ID NO: 138), CATCH30 (SEQ ID NO: 139), CATCH29 (SEQ ID NO: 140), CATCH15 (SEQ ID NO: 141), CATCH16 (SEQ ID NO: 142), CATCH28 (SEQ ID NO: 143), CATCH17 (SEQ ID NO: 144), CATCH18 (SEQ ID NO: 145), CATCH33 (SEQ ID NO: 146), CATCH27 (SEQ ID NO: 147) y CATCH51 (SEQ ID NO: 148), localizados en la región inter-LCR22D-E,

Adicionalmente, se puede combinar la detección de los marcadores STR descritos en la presente invención (Tabla 2), junto con otros marcadores ya conocidos en el estado de la técnica para cada una de las regiones descritas para 22q11.2 (Tabla 1).

En la Tabla 3 se muestra, a modo de ejemplo no limitativo, un listado de marcadores polimórficos de tipo STR conocidos en el estado de la técnica, que reconocen diferentes regiones de la región cromosómica 22q11.2, y que se pueden utilizar en combinación con los marcadores polimórficos (CATCH) descritos en la presente invención para la determinación de deleciones y/o duplicaciones en dicha región cromosómica.

Tabla 3. Marcadores STR de la región 22q11.2 conocidos en el estado de la técnica.

En una realización preferida, el método de la invención comprende la combinación de los marcadores de la invención descritos en la Tabla 2, junto con al menos uno de los marcadores conocidos, descritos en la Tabla 3, y/o cualquiera de sus combinaciones.

Así, en otra realización preferida, el primer método in vitro de la presente invención se caracteriza por que, además de identificar el número de alelos de los marcadores de la invención (CATCH) según se ha descrito anteriormente, comprende determinar el número de alelos de al menos uno de los marcadores que se seleccionan de entre:

2posición en número de nucleótidos en el cromosoma 22 humano (NCBI37/hg19).

(i) D22S420 (SEQ ID NO: 149), D22S427 (SEQ ID NO: 150) y/o cualquier combinación de los mismos, localizados en la región anterior a la región LCR22A;

(ii) D22S1638 (SEQ ID NO: 151), 22K48-2 (SEQ ID NO: 152), D22S1648 (SEQ ID NO: 153), D22S941 (SEQ ID NO: 154), D22S944 (SEQ ID NO: 155), D22S1623 (SEQ ID NO: 156), y/o cualquier combinación de los mismos, localizados en la región inter-LCR22A-B;

(iii) D22S264 (SEQ ID NO: 157), localizado en la región inter-LCR22B-C;

(iv) D22S311 (SEQ ID NO: 158), D22S1709 (SEQ ID NO: 159), y/o cualquier combinación de los mismos, localizados en la región inter-LCR22C-D;

(v) D22S446 (SEQ ID NO: 160), D22S539 (SEQ ID NO: 161), D22S308 (SEQ ID NO: 162), D22S306 (SEQ ID NO: 163), y/o cualquier combinación de los mismos, localizados en la región inter-LCR22D-E; y

(vi) D22S686 (SEQ ID NO: 164), D22S425 (SEQ ID NO: 165), D22S1174 (SEQ ID NO: 167), y D22S257 (SEQ ID NO: 166), y/o cualquier combinación de los mismos, localizados en la región posterior a la región LCR22E (posiciones 22,963,079-22,997,578pb), del cromosoma 22;

donde un número de alelos inferior a dos en al menos uno de los marcadores de al menos una de las regiones (i) a (vi) es indicativo de una deleción en dicha región 22q11.2, y donde un número de alelos igual o superior a tres en al menos uno de los marcadores de al menos una de las regiones (i) a (vi) es indicativo de una duplicación en dicha región 22q11.2.

En otra realización más preferida aún, el primer método in vitro de la invención se caracteriza por que se determina el número de alelos que presentan los marcadores que se seleccionan de la lista que consiste en:

(i) CATCH53 (SEQ ID NO: 112) y D22S427 (SEQ ID NO: 150), localizados en la región anterior a la región LCR22A;

(ii) CATCH48 (SEQ ID NO: 116), CATCH19 (SEQ ID NO: 118), CATCH23 (SEQ ID NO: 120) y D22S941 (SEQ ID NO: 154), localizados en la región inter-LCR22A-B;

(iii) D22S264 (SEQ ID NO: 157) localizado en la región inter-LCR22B-C;

(iv) CATCH13 (SEQ ID NO: 128) localizado en la región inter-LCR22C-D;

(v) CATCH16 (SEQ ID NO: 142) y CATCH18 (SEQ ID NO: 145), localizados en la región inter-LCR22D-E; y

(vi) D22S686 (SEQ ID NO: 194), localizado en la región posterior a la región LCR22E situada entre las posiciones 22,963,079-22,997,578 del cromosoma 22.

En otra realización más preferida aún, el primer método in vitro de la invención se caracteriza por que para la determinación del número de alelos en la región cromosómica 22q11.2 según se describe en el presente documento, se utiliza una combinación de marcadores polimórficos STR de la invención (CATCH), junto con marcadores polimórficos STR conocidos, tal y como:

(i) CATCH5 (SEQ ID NO: 111), CATCH53 (SEQ ID NO: 112), CATCH52 (SEQ ID NO: 113), D22S420 (SEQ ID NO: 149), D22S427 (SEQ ID NO: 150) y D22S1638 (SEQ ID NO: 151), localizados en la región anterior a la región LCR22A;

(ii) CATCH4 (SEQ ID NO: 114), CATCH6 (SEQ ID NO: 115), CATCH48 (SEQ ID NO: 116), CATCH22 (SEQ ID NO: 117), CATCH 19 (SEQ ID NO: 118), CATCH7 (SEQ ID NO: 119), CATCH23 (SEQ ID NO: 120), 22K48-2 (SEQ ID NO: 152), D22S1648 (SEQ ID NO: 153), D22S941 (SEQ ID NO: 154), D22S944 (SEQ ID NO: 155), D22S1623 (SEQ ID NO: 156), localizados en la región inter-LCR22A-B;

(iii) CATCH45 (SEQ ID NO: 121), CATCH10 (SEQ ID NO: 122), CATCH20 (SEQ ID NO: 123), D22S264 (SEQ ID NO: 157), localizados en la región inter-LCR22B-C;

(iv) CATCH42 (SEQ ID NO: 124), CATCH41 (SEQ ID NO: 125), CATCH11 (SEQ ID NO: 126), CATCH 12 (SEQ ID NO: 127), CATCH 13 (SEQ ID NO: 128), CATCH14 (SEQ ID NO: 129), CATCH39 (SEQ ID NO: 130), CATCH38 (SEQ ID NO: 131), CATCH37 (SEQ ID NO: 132), D22S311 (SEQ ID NO: 158), y D22S1709 (SEQ ID NO: 159), localizados en la región inter-LCR22C-D;

(v) CATCH36 (SEQ ID NO: 133), CATCH35 (SEQ ID NO: 134), CATCH31 (SEQ ID NO: 135), CATCH25 (SEQ ID NO: 136), CATCH24 (SEQ ID NO: 137), CATCH26 (SEQ ID NO: 138), CATCH30 (SEQ ID NO: 139), CATCH29 (SEQ ID NO: 140), CATCH 15 (SEQ ID NO: 141), CATCH16 (SEQ ID NO: 142), CATCH28 (SEQ ID NO: 143), CATCH17 (SEQ ID NO: 144), CATCH18 (SEQ ID NO: 145), CATCH33 (SEQ ID NO: 146), CATCH27 (SEQ ID NO: 147) y CATCH51 (SEQ ID NO: 148), D22S446 (SEQ ID NO: 160), D22S539 (SEQ ID NO: 161), D22S308 (SEQ ID NO: 162), D22S306 (SEQ ID NO: 163), y localizados en la región inter-LCR22D-E; y

(vi) D22S686 (SEQ ID NO: 164), D22S425 (SEQ ID NO: 165), D22S257 (SEQ ID NO: 166), D22S1174 (SEQ ID NO: 167), localizados en la región posterior a la región LCR22E.

Adicionalmente, los inventores han observado que, mediante el método in vitro de la presente invención, particularmente cuando para cada una de las regiones inter-LCR y LCR descritas se combinan los marcadores de la invención (CATCH) con marcadores conocidos en el estado de la técnica que presentan mayor heterocigosidad, se consigue una identificación muy precisa de la presencia de deleciones y/o duplicaciones en la región cromosómica 22q11.2.

En la presente invención, se entiende por “heterocigosidad” al concepto poblacional que mide la variabilidad genética de un determinado locus. La heterocigosidad de un determinado locus es el resultado de dividir el número de heterocigotos encontrados en un determinado locus por el número total de individuos analizados. Los marcadores que presentan una heterocigosidad igual o superior al 0,6 pueden considerarse bastante informativos, es decir, proporcionan información fiable sobre la presencia/ausencia de un determinado locus. A efectos de la presente invención se prefiere que los marcadores presenten una heterocigosidad de al menos un 60%, más preferiblemente al menos un 70%, más preferiblemente de entre un 70 a un 80%, más preferiblemente al menos un 80% y más preferiblemente al menos un 90%. La selección de marcadores que presentan dichos niveles de heterocigosidad para el método de la invención, permiten la detección de deleciones y y/o duplicaciones en la región cromosómica 22q11.2 en ausencia de muestras paternas. Esta ventaja técnica del método in vitro de la invención es debida a que sería prácticamente imposible que la identificación de tres marcadores seguidos en un intervalo flanqueado por LCR22s sean homocigotos/heterocigotos sin que ello se corresponda a una deleción y/o duplicación.

Por lo tanto, en otra realización más preferida del método in vitro de la invención, los marcadores polimórficos de la invención que presentan una mayor heterocigosidad son: CATCH53, CATCH18, CATCH13, CATCH23, CATCH48, CATCH16 y CATCH19. En otra realización más preferida, los marcadores polimórficos del estado de la técnica que presentan una alta heterocigosidad son: D22S941, D22S686, D22S427 y D22S264. En otra realización más preferida aún, el conjunto de marcadores polimórficos descritos en la presente invención que presentan una alta heterocigosidad son: CATCH53, CATCH18 CATCH13, CATCH23, CATCH48, CATCH16, CATCH19, D22S941, D22S686, D22S427 y D22S264 (Tabla 5).

En general, todos los marcadores STR utilizados en el presente documento, tanto los nuevos marcadores denominados CATCH en el presente documento, como el resto de marcadores utilizados y conocidos en el estado de la técnica, se amplifican mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), una técnica estándar en los laboratorios de biología molecular. Los cebadores para la amplificación por PCR pueden sintetizarse fácilmente mediante técnicas estándar, por ejemplo, mediante síntesis en fase sólida a través de la química de fosforamidita.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a los cebadores complementarios a las secuencias de los marcadores polimórficos denominados CATCH en la presente invención (Tabla 2), utilizados para amplificar dichas regiones.

En la Tabla 4 se muestra el conjunto de cebadores diseñados para la amplificación de todos los marcadores polimórficos tipo CATCH descritos en la presente invención.

TABLA 4. Marcadores de la región 22q11.2 descritos en la presente invención junto con las secuencias de los cebadores utilizados para su identificación. En negrita se muestran los cebadores directos. Repetición se refiere a la secuencia nucleotídica de tipo STR amplificada en cada marcador.

La determinación del número de alelos de los marcadores genéticos presentes en cada una de las regiones indicadas puede realizarse mediante cualquiera de las técnicas descritas en el estado de la técnica. Por ejemplo, técnicas con base fluorescencia, utilizando PCR, PCR anidado y otras técnicas para amplificación de ácido nucleico. Las metodologías específicas disponibles para genotipificación de SNP incluyen, pero no se limitan a, ensayos de genotipificación TaqMan y plataformas SNPlex (Applied Biosystems), espectrometría de masas (por ejemplo, el sistema MassARRAY de Sequenom), métodos de minisecuenciación, PCR en tiempo real, el sistema Bio-Plex (BioRad), sistemas CEQ y SNPstream (Beckman), tecnología de arreglo de sonda de inversión moléculas (por ejemplo, Affymetrix GeneChip), y tecnologías BeadArray (por ejemplo, los ensayos Illumina GoldenGate e Infinium).

La detección del número de alelos también puede llevarse a cabo por métodos de hibridación, incluyendo pero no limitando a, análisis Southern, análisis northern y/o hibridaciones in situ (ver, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F. y otros, eds., John Wiley & Sons, incluyendo todos los suplementos). La presencia de más de un alelo marcador específico puede indicarse mediante el uso de varias sondas de ácido nucleico específicas de la secuencia, cada una siendo específica para un alelo particular.

Una sonda específica de secuencia puede dirigirse para hibridar el ADN, ARN, o ADNc genómico. Una "sonda de ácido nucleico", tal como se utiliza en la presente invención, puede ser una sonda de ADN o una sonda de ARN que hibrida con una secuencia complementaria. Un experto en la técnica sabrá como diseñar una sonda de tal forma que la hibridación específica de la secuencia ocurrirá solamente si el alelo particular está presente en una secuencia genómica de una muestra biológica procedente del individuo. La sonda de ácido nucleico puede ser de cualquier tamaño adecuado, siempre y cuando suficiente para hibridar específicamente bajo condiciones severas el ARN apropiado o ADN genómico. La sonda puede ser de entre 5-100 nucleótidos, preferiblemente, entre 10-50 nucleótidos de longitud, más preferiblemente, entre 12-30 nucleótidos de longitud. La sonda puede contener un segmento de la región genómica 22q11.2 comprendiendo, al menos, un alelo de un marcador presente en dicha región genómica, o la secuencia complementaria a dicho segmento. Como sabe el experto en la materia, la sonda puede comprender una fracción fluorescente o un grupo en su extremo 3’ y un extintor en su extremo 5’. Asimismo, la sonda puede incluir bases modificadas, como por ejemplo, adeninas o guaninas modificadas, que pueden ser útiles para ajustar la temperatura de fusión en regiones que contienen un bajo porcentaje de bases G o C (por ejemplo, una adenina modificada para formar tres enlaces de hidrógeno a su timina complementaria). Alternativamente, se puede utilizar una sonda de ácido nucleico de péptido (PNA) además de, o en lugar de, una sonda de ácido nucleico como las descritas previamente. Una PNA es una emulación de ADN que tiene una estructura inorgánica de tipo péptido, tales como unidades de N-(2-aminoetil)glicina, con una base orgánica (A, G, C, T o U) unidad al nitrógeno de glicina a través de un enlazador de metilencarbonilo.

A través de éstos y otros métodos disponibles para el experto en la técnica se pueden identificar el número de alelos en los marcadores polimórficos y/o no polimórficos.

No obstante, en una realización particular del método de la invención, la determinación del número de alelos de los marcadores se lleva a cabo mediante al menos una reacción de amplificación en cadena de la polimerasa o PCR, preferiblemente, mediante al menos una reacción PCR multiplex, más preferiblemente dos reacciones de PCR multiplex.

PCR corresponde a las siglas de reacción en cadena de la polimerasa (Polymerase Chain Reaction) mediante la cual se pueden obtener millones de copias de las regiones de ADN deseadas. La PCR se caracteriza por el empleo de parejas de cebadores que acotan la región de la que se realizarán millones de copias, lo que también se conoce como “amplificar ADN” durante la PCR, y está compuesta por un número determinado de ciclos, compuestos a su vez por tres fases en las que las hebras de ADN se separan, se unen los cebadores y se elongan las nuevas hebras de ADN. En cada ciclo, si la eficiencia de la reacción es del 100% se produce un crecimiento exponencial de los fragmentos de ADN objeto de la amplificación. En la presente invención se entiende por “reacción de amplificación multiplex” a la reacción PCR en la cual se amplifica más de un marcador en una misma reacción, mediante el empleo de dos o más parejas de cebadores en único tubo junto con el resto de los reactivos de la reacción con el fin de amplificar simultáneamente múltiples secuencias de ADN o marcadores.

Por lo tanto, tras obtener el ADN de la muestra biológica, éste es sometido, al menos, a una reacción de amplificación multiplex, aunque como entiende el experto en la materia, también pueden llevarse a cabo 2, 3 o más PCR multiplex a partir de la muestra de ADN.

La expresión "PCR multiplex”, según se usa en la presente invención, se refiere a una reacción de PCR en la cual se amplifica más de una secuencia en una misma reacción. Para ello se combina en un solo tubo dos o más pares de cebadores específicos para los segmentos que se desee amplificar junto con el resto de los reactivos de la reacción en cantidades suficientes. De esta forma se obtiene la información de varios loci en una sola reacción, menor cantidad de molde para el análisis, menor cantidad de reactivos, rápida construcción de base de datos. Con el fin de distinguir los productos de cada reacción de amplificación que tiene lugar en una PCR multiplex, es posible marcar cada reacción con un fluorocromo diferente de forma que se puedan detectar los productos de amplificación a una longitud de onda adecuada. Fluorocromos adecuados para su uso en la presente invención incluyen, sin limitación, fluoresceina, hexaclorofluoresceina (HEX), N,N,N',N'-tetrametil-6-carboxirodamine (TAMRA), 5-carboxifluoresceina (5-FAM), 2',7'-dimetoxi-4',5'-dicloro-6- carboxifluoresceina (JOE), 6-carboxi-X-rodamina (ROX), CY3, NED, VIC, PET, tetraclorofluoresceina (TET) y similares

Así, en otra realización todavía más particular del método in vitro de la invención, el número de alelos de los marcadores descritos en la presente invención se determinan mediante PCR multiplex, más preferiblemente mediante al menos dos reacciones de PCR multiplex.

En una realización más particular del primer método in vitro de la invención, en una primera PCR multiplex se determina el número de alelos que presentan los marcadores: CATCH53, CATCH18, D22S941, CATCH13, CATCH23 y D22S686, mediante su amplificación utilizando los cebadores descritos en el presente documento para tal fin. En una segunda PCR multiplex se determina el número de alelos que presentan los marcadores: D22S427, CATCH48, CATCH16, CATCH19 y D22S264, mediante el conjunto de cebadores específicos descritos en la presente invención para tal fin. A efectos de la presente invención, es posible el uso de otros cebadores capaces de amplificar los marcadores descritos. Un experto en la materia podrá obtener mediante métodos conocidos, cebadores alternativos a los descritos en la presente invención y que sean útiles para amplificar los marcadores descritos.

En otra realización particular del método in vitro de la invención, los cebadores utilizados para la determinación de la presencia de los marcadores mencionados anteriormente se describen en la Tabla 4.

En la presente invención se entiende por "cebador” o "primer” u "oligonucleótido” ("oligo”) a la secuencia de nucleótidos a partir de la cual la ADN polimerasa inicia la síntesis de una molécula nueva de ADN. Los cebadores son secuencias nucleotídicas cortas, aproximadamente de 15-24 nucleótidos de longitud que se pueden alinear con una hebra de ADN diana gracias a la complementariedad de bases para formar un híbrido entre el cebador y la hebra diana de ADN. Después, el enzima ADN polimerasa puede extender el cebador a lo largo de la hebra diana de ADN. Los métodos para preparar y usar cebadores se describen, por ejemplo, en Sambrook et al. (2001) y Ausubel et al. (1999).

En el contexto de la presente invención se entiende por "pareja de cebadores” o "primer pair’, al conjunto de dos cebadores que, empleados en una misma reacción de amplificación o PCR, permiten obtener múltiples copias de una secuencia diana de ADN. Cada uno de los cebadores hibrida con la secuencia diana, de manera que se amplifica la secuencia de nucleótidos acotada mediante cada pareja de cebadores. La extensión de los cebadores durante los ciclos de PCR determina la multiplicación exponencial 2N de la secuencia de nucleótidos acotada por los cebadores, siendo N el número de ciclos de la reacción PCR.

La amplificación de los diferentes marcadores descritos en la presente invención requiere condiciones y procedimientos de reacción específicos para cada una de las parejas de cebadores empleadas, las cuales pueden conseguirse mediante variación sistemática de cada parámetro. El número de ciclos y la temperatura de alineamiento empleada en la reacción de PCR deben de ser adecuados para la obtención de resultados fiables.

USOS DEL MÉTODO IN VITRO DE DETECCIÓN DE DUPLICACIONES Y/O DELECIONES EN LA REGIÓN CROMOSÓMICA 22q11.2

Tal como se ha explicado en los antecedentes de la invención, una de las causas genéticas más conocidas de las cardiopatías congénitas, síndrome de DiGeorge y síndrome velocardiofacial, son las deleciones y/o duplicaciones de la región 22q11.2. Por lo tanto, averiguar la presencia de una deleción y/o duplicación en dicha región es útil para diagnosticar si un individuo va a sufrir o no una cardiopatía congénita o el síndrome de DiGeorge, lo cual puede hacerse mediante el método in vitro de la invención. Por otro lado, el síndrome del22q11.2 no es solo la causa genética conocida más frecuente de cardiopatías congénitas (mínimo un 2% de todas ellas), sino que también causar esquizofrenia (1%) pues el padecer una del22q11.2 incrementa 30 veces el riesgo de padecer dicha enfermedad, además, de ser responsable de retraso mental moderado y/o inmunodeficiencia.

Por lo tanto, en otro aspecto, la presente invención se relaciona con un método in vitro para el diagnóstico y/o pronóstico de cardiopatías congénitas, síndrome de DiGeorge, o síndrome VCF, en una muestra biológica aislada de un sujeto, mediante el método in vitro descrito anteriormente en el presente documento, donde la detección de una del/dup22q11.2, tal y como se ha mencionado en el método in vitro de la invención descrito anteriormente, es indicativo de que dicho sujeto tiene una alta probabilidad de padecer una cardiopatía congénita, síndrome de DiGeorge o el síndrome VCF.

En otro aspecto, la presente invención también se refiere a un método in vitro para el diagnóstico de esquizofrenia, retraso mental y/o inmunodeficiencia, en una muestra biológica aislada de un sujeto, mediante el método in vitro descrito anteriormente en el presente documento, donde la detección de una del/dup22q11.2, tal y como se ha mencionado en el método in vitro de la invención descrito anteriormente, es indicativo de que dicho sujeto tiene una alta probabilidad de padecer dichas patologías mencionadas, todas ellas relacionadas con una del/dup22q11.2.

Los términos “duplicación”, “deleción”, "individuo” y “muestra biológica” han sido definidos previamente y son igualmente aplicables al presente aspecto inventivo.

Se entiende por “diagnóstico” al procedimiento por el cual se identifica una enfermedad, entidad nosológica, patología o síndrome, a partir de unos indicadores, parámetros o síntomas. En el contexto de la presente invención, la enfermedad a identificar es un conjunto de enfermedades clasificadas dentro de las “cardiopatías congénitas”, donde el parámetro empleado es la presencia/ausencia de del/dup22q11.2.

En la presente invención, se entiende por “cardiopatía/s congénita/s” al conjunto de enfermedades o patologías caracterizadas porque la estructura y funcionamiento del corazón es anómalo en comparación con un corazón sano debido a un desarrollo anormal de éste antes del nacimiento. En general, son lesiones anatómicas de una o varias de las cuatro cámaras cardíacas, de los tabiques que las separan, o de las válvulas o tractos de salida (zonas ventriculares por donde sale la sangre del corazón) de origen congénito (de nacimiento). Hay múltiples cardiopatías congénitas, unas de carácter y evolución y/o tratamiento leve con buen pronóstico, y otras mucho más severas y de pronóstico reservado. Es frecuente que las lesiones congénitas cardiacas se combinen entre sí de forma que un mismo paciente puede tener múltiples lesiones congénitas cardiacas.

En una realización particular, la cardiopatía congénita se selecciona de entre el grupo de consiste en tetralogía de Fallot, transposición de los grandes vasos, atresia tricúspide, drenaje venoso pulmonar anómalo total, tronco arterial, corazón izquierdo hipoplásico, atresia pulmonar, algunas formas de drenaje venoso pulmonar anómalo total, anomalía de Ebstein, comunicación interventricular (CIV), comunicación interauricular (CIA), conducto arterial persistente (CAP), estenosis aórtica, estenosis pulmonar, coartación de la aorta, canal auriculoventricular (defecto de relieve endocárdico), malformaciones congénitas de las cámaras cardiacas y sus conexiones (transposición de los grandes vasos, truncus arteriosus persistente), malformaciones del septo cardiaco (comunicación interauricular, comunicación interventricular, malformaciones de la válvula pulmonar y tricúspide (atresia pulmonar, atresia tricuspidea, anomalía de Ebstein), malformaciones de la válvula aórtica y mitral, dextrocardia, malformaciones congénitas de las grandes arterias (coartación de aorta, ductus arterioso persistente), defecto septal atrial, defecto del septo ventricular, transposición completa de los grandes vasos, estenosis de la válvula aórtica o estenosis aórtica, atresia pulmonar, doble salida ventricular derecha, interrupción del arco aórtico tipos A, B o C, persistencia del ductus arterioso, síndrome de hipoplasia del corazón izquierdo, tronco arterioso persistente o tronco arterioso, ventrículo único, entre otras.

Por otro lado, como se ha explicado previamente, el método in vitro de la invención se realiza a partir de una muestra biológica aislada de un individuo que, en el contexto de la presente invención, se refiere tanto al nasciturus (embriones y fetos) como a individuos ya nacidos en cualquier estado de desarrollo. Por lo tanto, en caso de que la muestra biológica aislada proceda del nasciturus, el método in vitro de la invención puede emplearse para el diagnóstico prenatal de las cardiopatías congénitas, síndrome de DiGeorge, síndrome VCF, esquizofrenia, retraso mental y/o inmunodeficiencia.

Así, en otro aspecto, la invención se relaciona con un método in vitro de diagnóstico prenatal de patologías asociadas con delecines y/o duplicaciones de la región cromosómica 22q11.2, en una muestra biológica aislada que contiene células fetales, donde la detección de una dup/del22q11.2 en dicha muestra biológica aislada, donde la detección de una duplicación y/o deleción en la región cromosómica 22q11.2 es indicativo de que el sujeto presenta una patología que se selecciona de la lista que consiste en: cardiopatía congénita, síndrome de DiGeorge, síndrome Velocardiofacial, esquizofrenia, retraso mental e inmunodeficiencia.

En una realización todavía más particular, la muestra biológica aislada que contiene células fetales se selecciona del grupo que consiste en sangre, biopsia de corion o líquido amniótico.

La estrategia diagnóstica llevada a cabo sobre los resultados obtenidos mediante el método de la invención en una muestra biológica aislada de un individuo, para concluir si es portador o no de una dup/del22q.11.2 se lleva a cabo de la siguiente manera:

- Se parte de una muestra biológica obtenida de un sujeto según se ha descrito en la presente invención.

- A partir de dicha muestra biológica, se extrae el ADN.

- Sobre dicho ADN extraído, se analiza o tipa los 11 marcadores descritos en la Tabla 6 mediante las dos PCR multiplex descritas anteriormente, y la posterior electroforesis capilar con un secuenciador automático.

- Se analiza el número de alelos que presenta cada uno de los marcadores utilizados en las PCRs multiplex llevada a cabo, para llegar a un diagnóstico del individuo analizado.

Si los resultados obtenidos ponen de manifiesto que los 6 intervalos inter-LCR22 (anterior a LCR22A, Inter-LCR22A-B, Inter-LCR22B-C, Inter-LCR22CD, Inter-LCR22D-E, posterior a LCR22E) analizados mediante el método de la invención, tienen al menos un marcador heterocigoto con 2 alelos, se pone de manifiesto que en dicha muestra analizada no existe ni deleción, ni duplicación en dichos intervalos y, por tanto, el sujeto no presenta ninguna deleción y/o duplicación en la región cromosómica 22q11.2.

Si por el contrario, los resultados obtenidos ponen de manifiesto que uno o más de los marcadores analizados presentan más de dos alelos, se pone de manifiesto que la muestra biológica aislada presenta una duplicación en el intervalo LCR22 donde esté situado el marcador o marcadores que presenten más de dos alelos, y por lo tanto, dicho sujeto presentará una duplicación en dicho intervalo LCR22 en la región cromosómica 22q11.2. Opcionalmente, para no tener ninguna duda de la presencia de una duplicación en la región donde se ha detectado la presencia de más de dos alelos para al menos uno de los marcadores analizados, se puede utilizar cualquier otra técnica ya conocida en el estado de la técnica para corroborar dichos resultados. Entre las técnicas que pueden ser utilizadas para corroborar los resultados obtenidos con el método de la invención, destacan, por ejemplo, MLPA, FISH o CGH-array, entre otras. Alternativamente, también para confirmar la presencia de una duplicación en la región analizada, se pueden utilizar los resultados de segregación obtenidos tras analizar una muestra de los padres del sujeto en cuestión.

Por otra parte, si los resultados obtenidos ponen de manifiesto que en uno de los intervalos interLCR22 todos los marcadores son homocigotos (1 solo alelo), se pone de manifiesto que la muestra biológica aislada es indicativa de la presencia de una deleción en el intervalo LCR22 donde esté situado el marcador o marcadores que presenten un único alelo, y por lo tanto, dicho sujeto tendrá una elevada probabilidad de presentar una deleción en dicho intervalo LCR22 en la región cromosómica 22q11.2. Para corroborar la presencia de dicha deleción en la región detectada mediante el método de la invención, se analizará dicho intervalo delecionado con marcadores adicionales que reconozcan o mapeen dicha región cromosómica concreta, y además se comparan los resultados obtenidos, con los resultados de segregación obtenidos en la muestra analizada de los padres del sujeto en cuestión. Si los resultados obtenidos con dichos marcadores adicionales, y con los datos de los padres, pusiesen de manifiesto que ninguno de ellos es heterocigoto para dicha región, se podría concluir sin ninguna duda de que dicho sujeto presenta una deleción en el intervalo interLCR22 donde no hay ningún marcador heterocigoto con 2 alelos. Dicha deleción, también se podrá corroborar con el uso de cualquier otra técnica conocida en el estado de la técnica, tales como por ejemplo, MLPA, FISH o CGH-array, entre otras.

CEBADORES DE LA INVENCIÓN

Para llevar a cabo el método in vitro de la invención, así como los métodos de diagnóstico in vitro descritos anteriormente, los inventores no solo han tenido que determinar los límites de las regiones LCR22 de la región cromosómica 22q11.2 sino que, además, han tenido que identificar nuevos marcadores genéticos entre las regiones LCR22 identificadas (regiones inter-LCR22) y diseñar parejas de cebadores específicos para los marcadores genéticos identificados en dichas regiones inter-LCR22.

Por lo tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con los cebadores descritos en la Tabla 4. En una realización particular, la invención se refiere a al menos una pareja de cebadores seleccionada del grupo que consiste en las parejas de oligonucleótidos SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4, capaces de amplificar el marcador CATCH5; SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6 capaces de amplificar el marcador CATCH53; SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8 capaces de amplificar el marcador CATCH52; SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 14 capaces de amplificar el marcador CATCH4; SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16 capaces de amplificar el marcador CATCH6; SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 24 capaces de amplificar el marcador CATCH48; SEQ ID NO: 29 y SEQ ID NO: 30 capaces de amplificar el marcador CATCH22; SEQ ID NO: 31 y SEQ ID NO: 32 capaces de amplificar el marcador CATCH7; SEQ ID NO: 33 y SEQ ID NO: 34 capaces de amplificar el marcador CATCH23; SEQ ID NO: 35 y SEQ ID NO: 36 capaces de amplificar el marcador CATCH19; SEQ ID NO: 39 y SEQ ID NO: 40 capaces de amplificar el marcador CATCH45; SEQ ID NO: 41 y SEQ ID NO: 42 capaces de amplificar el marcador CATCH10; SEQ ID NO: 43 y SEQ ID NO: 44 capaces de amplificar el marcador CATCH20; SEQ ID NO: 45 y SEQ ID NO: 46 capaces de amplificar el marcador CATCH42; SEQ ID NO: 47 y SEQ ID NO: 48 capaces de amplificar el marcador CATCH41; SEQ ID NO: 49 y SEQ ID NO: 50 capaces de amplificar el marcador CATCH11; SEQ ID NO: 53 y SEQ ID NO: 54 capaces de amplificar el marcador CATCH12; SEQ ID NO: 55 y SEQ ID NO: 56 capaces de amplificar el marcador CATCH13; SEQ ID NO: 57 y SEQ ID NO: 58 capaces de amplificar el marcador CATCH14; SEQ ID NO: 59 y SEQ ID NO: 60 capaces de amplificar el marcador CATCH39; SEQ ID NO: 63 y SEQ ID NO: 64 capaces de amplificar el marcador CATCH38; SEQ ID NO: 65 y SEQ ID NO: 66 capaces de amplificar el marcador CATCH37; SEQ ID NO: 67 y SEQ ID NO: 68 capaces de amplificar el marcador CATCH36; SEQ ID NO: 69 y SEQ ID NO: 70 capaces de amplificar el marcador CATCH35; SEQ ID NO: 73 y SEQ ID NO: 74 capaces de amplificar el marcador CATCH51; SEQ ID NO: 75 y SEQ ID NO: 76 capaces de amplificar el marcador CATCH33; SEQ ID NO:79 y SEQ ID NO: 80 capaces de amplificar el marcador CATCH31; SEQ ID NO: 81 y SEQ ID NO: 82 capaces de amplificar el marcador CATCH25; SEQ ID NO: 83 y SEQ ID NO: 84 capaces de amplificar el marcador CATCH24; SEQ ID NO: 85 y SEQ ID NO: 86 capaces de amplificar el marcador CATCH26; SEQ ID NO: 87 y SEQ ID NO: 88 capaces de amplificar el marcador CATCH30; SEQ ID NO: 89 y SEQ ID NO: 90 capaces de amplificar el marcador CATCH29; SEQ ID NO: 93 y SEQ ID NO: 94 capaces de amplificar el marcador CATCH15; SEQ ID NO: 97 y SEQ ID NO: 98 capaces de amplificar el marcador CATCH16; SEQ ID NO: 99 y SEQ ID NO: 100 capaces de amplificar el marcador CATCH28; SEQ ID NO: 101 y SEQ ID NO: 102 capaces de amplificar el marcador CATCH17; SEQ ID NO: 103 y SEQ ID NO: 104 capaces de amplificar el marcador CATCH27; SEQ ID NO: 105 y SEQ ID NO: 106 capaces de amplificar el marcador CATCH18; SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO:2 capaces de amplificar el marcador D22S420; SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10 capaces de amplificar el marcador D22S427; SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12 capaces de amplificar el marcador D22S1638; SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18 capaces de amplificar el marcador 22K48-2; SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 20 capaces de amplificar el marcador D22S1648; SEQ ID NO: 21 y SEQ ID NO: 22 capaces de amplificar el marcador D22S941; SEQ ID NO: 25 y SEQ ID NO: 26 capaces de amplificar el marcador D22S944; SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO: 28 capaces de amplificar el marcador D22S1623; SEQ ID NO: 37 y SEQ ID NO 38 capaces de amplificar el marcador D22S264; SEQ ID NO: 51 y SEQ ID NO: 52 capaces de amplificar el marcador D22S311; SEQ ID NO: 61 y SEQ ID NO: 62 capaces de amplificar el marcador D22S1709; SEQ ID NO: 71 y SEQ ID NO 72 capaces de amplificar el marcador D22S446; SEQ ID NO: 77 y SEQ ID NO: 78 capaces de amplificar el marcador D22S539; SEQ ID NO: 91 y SEQ ID NO: 92 capaces de amplificar el marcador D22S308; SEQ ID NO: 95 y SEQ ID NO: 96 capaces de amplificar el marcador D22S306; SEQ ID NO: 107 y SEQ ID NO: 108 capaces de amplificar el marcador D22S686; SEQ ID NO: 109 y SEQ ID NO: 110 capaces de amplificar el marcador D22S1174.

En una realización más preferida, los cebadores se seleccionan de la lista que consiste en: SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO 4, capaces de amplificar el marcador CATCH5; SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6 capaces de amplificar el marcador CATCH53; SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8 capaces de amplificar el marcador CATCH52; SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 14 capaces de amplificar el marcador CATCH4; SEQ D NO: 15 y SEQ ID NO: 16 capaces de amplificar el marcador CATCH6; SEQ D NO: 23 y SEQ ID NO: 24 capaces de amplificar el marcador CATCH48; SEQ ID NO: 29 y SEQ ID NO: 30 capaces de amplificar el marcador CATCH22; SEQ ID NO: 31 y SEQ ID NO: 32 capaces de amplificar el marcador CATCH7; SEQ D NO: 33 y SEQ ID NO: 34 capaces de amplificar el marcador CATCH23; SEQ ID NO: 35 y SEQ ID NO: 36 capaces de amplificar el marcador CATCH19; SEQ ID NO: 39 y SEQ ID NO: 40 capaces de amplificar el marcador CATCH45; SEQ ID NO: 41 y SEQ ID NO: 42 capaces de amplificar el marcador CATCH10; SEQ ID NO: 43 y SEQ ID NO: 44 capaces de amplificar el marcador CATCH20; SEQ ID NO: 45 y SEQ ID NO: 46 capaces de amplificar el marcador CATCH42; SEQ ID NO: 47 y SEQ ID NO: 48 capaces de amplificar el marcador CATCH41; SEQ ID NO: 49 y SEQ ID NO: 50 capaces de amplificar el marcador CATCH11; SEQ ID NO: 53 y SEQ ID NO: 54 capaces de amplificar el marcador CATCH12; SEQ ID NO: 55 y SEQ ID NO: 56 capaces de amplificar el marcador CATCH13; SEQ ID NO: 57 y SEQ ID NO: 58 capaces de amplificar el marcador CATCH14; SEQ ID NO: 59 y SEQ ID NO: 60 capaces de amplificar el marcador CATCH39; SEQ ID NO: 63 y SEQ ID NO: 64 capaces de amplificar el marcador CATCH38; SEQ ID NO: 65 y SEQ ID NO: 66 capaces de amplificar el marcador CATCH37; SEQ ID NO: 67 y SEQ ID NO: 68 capaces de amplificar el marcador CATCH36; SEQ ID NO: 69 y SEQ ID NO: 70 capaces de amplificar el marcador CATCH35; SEQ ID NO: 73 y SEQ ID NO: 74 capaces de amplificar el marcador CATCH51; SEQ ID NO: 75 y SEQ ID NO: 76 capaces de amplificar el marcador CATCH33; SEQ ID NO:79 y SEQ ID NO: 80 capaces de amplificar el marcador CATCH31; SEQ ID NO: 81 y SEQ ID NO: 82 capaces de amplificar el marcador CATCH25; SEQ ID NO: 83 y SEQ ID NO: 84 capaces de amplificar el marcador CATCH24; SEQ ID NO: 85 y SEQ ID NO: 86 capaces de amplificar el marcador CATCH26; SEQ ID NO: 87 y SEQ ID NO: 88 capaces de amplificar el marcador CATCH30; SEQ ID NO: 89 y SEQ ID NO: 90 capaces de amplificar el marcador CATCH29; SEQ ID NO: 93 y SEQ ID NO: 94 capaces de amplificar el marcador CATCH15; SEQ ID NO: 97 y SEQ ID NO: 98 capaces de amplificar el marcador CATCH16; SEQ ID NO: 99 y SEQ ID NO: 100 capaces de amplificar el marcador CATCH28; SEQ ID NO: 101 y SEQ ID NO: 102 capaces de amplificar el marcador CATCH17; SEQ ID NO: 103 y SEQ ID NO: 104 capaces de amplificar el marcador CATCH27; SEQ ID NO: 105 y SEQ ID NO: 106 capaces de amplificar el marcador CATCH18; y/o cualquiera de sus combinaciones.

En otra realización preferida, los cebadores se seleccionan de la lista que consiste en: SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6 capaces de amplificar el marcador CATCH53; SEQ ID NO: 105 y SEQ ID NO: 106 capaces de amplificar el marcador CATCH18; SEQ ID NO: 55 y SEQ ID NO: 56 capaces de amplificar el marcador CATCH13; SEQ ID NO: 33 y SEQ ID NO: 34 capaces de amplificar el marcador CATCH23; SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 24 capaces de amplificar el marcador CATCH48; SEQ ID NO: 97 y SEQ ID O: 98 capaces de amplificar el marcador CATCH16; SEQ ID NO: 35 y SEQ ID NO: 36 capaces de amplificar el marcador CATCH19.

En otra realización más preferida, los cebadores se seleccionan de la lista que consiste en: SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6 capaces de amplificar el marcador CATCH53; SEQ ID NO: 105 y SEQ ID NO: 106 capaces de amplificar el marcador CATCH18, SEQ ID NO: 21 y SEQ ID NO: 22 capaces de amplificar el marcador D22S941, SEQ ID NO: 55 y SEQ ID NO: 56 capaces de amplificar el marcador CATCH13, SEQ ID NO: 33 y SEQ ID NO: 34 capaces de amplificar el marcador CATCH23, SEQ ID NO: 107 y SEQ ID NO: 108 capaces de amplificar el marcador D22S686, SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10 capaces de amplificar el marcador D22S427, SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 24 capaces de amplificar el marcador CATCH48, SEQ ID NO: 97 y SEQ ID NO: 98 capaces de amplificar el marcador CATCH16, SEQ ID NO: 35 y SEQ ID NO: 36 capaces de amplificar el marcador CATCH19, y SEQ ID NO: 37 y SEQ ID NO: 38 capaces de amplificar el marcador D22S264.

En otro aspecto, la presente invención se refiere al uso in vitro de los cebadores de la invención para detectar dup/del22q11.2, en una muestra biológica aislada de un sujeto.

En otro aspecto, la presente invención se refiere al uso in vitro de los cebadores de la invención para el diagnóstico y/o pronóstico de patologías relacionadas con deleciones y/o duplicaciones de la región cromosómica 22q11.2, preferiblemente donde las patologías se seleccionan de la lista que consiste en: cardiopatías congénitas, síndrome de Digeorge y/o síndrome velocardiofacial, esquizofrenia, retraso mental y/o inmunodeficiencia.

KIT DE LA INVENCIÓN

Las parejas de cebadores diseñados para la puesta en práctica de los métodos in vitro descritos en la presente invención se pueden encontrar formando parte de un "kit”.

Por "kit” se entiende, en el contexto de la presente invención, un producto que contiene los diferentes reactivos para poner en práctica el método de la invención, empaquetados para permitir su transporte y almacenamiento. Materiales adecuados para el empaquetamiento de los componentes del kit incluyen, sin limitar a, cristal, plástico (polietileno, polipropileno, policarbonato y similares), botellas, viales, papel, sobres y similares.

Así, en otro aspecto la invención se relaciona con un kit, de aquí en adelante kit de la invención, que comprende al menos un conjunto de parejas de cebadores capaces de identificar los marcadores que se seleccionan de la lista que consiste en: CATCH53, CATCH48, CATCH23, CATCH19, CATCH13, CATCH16, CATCH18, CATCH5, CATCH52, CATCH4, CATCH6, CATCH22, CATCH7, CATCH45, CATCH10, CATCH20, CATCH42, CATCH41, CATCH11, CATCH12, CATCH14, CATCH39, CATCH38, CATCH37, CATCH36, CATCH35, CATCH51, CATCH33, CATCH31, CATCH25, CATCH24, CATCH26, CATCH30, CATCH29, CATCH15, CATCH28, CATCH17, CATCH27 y/o cualquiera de sus combinaciones, y, opcionalmente, reactivos para llevar a cabo una PCR y/o reactivos para aislar ADN a partir de una muestra biológica aislada, según se describe en la presente memoria.

En otra realización más preferida, el kit de la invención comprende además al menos una pareja de cebadores capaces de identificar los marcadores que se seleccionan de la lista que consiste en: D22S420, D22S1638, D22S420, 22K48-2, D22S1648, D22S944, D22S1623, D22S311, D22S1709, D22S446bis, D22S539, D22S308, D22S306, D22S1174, y/o cualquiera de sus combinaciones.

En otra realización preferida, el kit de la invención comprende el conjunto de parejas cebadores capaces de identificar los marcadores que se seleccionan de la lista que consiste en: CATCH53, CATCH48, CATCH23, CATCH19, CATCH13, CATCH16, CATCH18, CATCH5, CATCH52, CATCH4, CATCH6, CATCH22, CATCH7, CATCH45, CATCH10, CATCH20, CATCH42, CATCH41, CATCH11, CATCH12, CATCH14, CATCH39, CATCH38, CATCH37, CATCH36, CATCH35, CATCH51, CATCH33, CATCH31, CATCH25, CATCH24, CATCH26, CATCH30, CATCH29, CATCH15, CATCH28, CATCH17, CATCH27.

En otra realización preferida, el kit de la invención comprende el conjunto de parejas cebadores capaces de identificar los marcadores que se seleccionan de la lista que consiste en: CATCH53, CATCH48, CATCH23, CATCH19, CATCH13, CATCH16, CATCH18, CATCH5, CATCH52, CATCH4, CATCH6, CATCH22, CATCH7, CATCH45, CATCH10, CATCH20, CATCH42, CATCH41, CATCH11, CATCH12, CATCH14, CATCH39, CATCH38, CATCH37, CATCH36, CATCH35, CATCH51, CATCH33, CATCH31, CATCH25, CATCH24, CATCH26, CATCH30, CATCH29, CATCH15, CATCH28, CATCH17, CATCH27, D22S420, D22S1638, D22S420, 22K48-2, D22S1648, D22S944, D22S1623, D22S311, D22S1709, D22S446bis, D22S539, D22S308, D22S306, D22S1174.

En una realización preferida, el kit de la invención comprende un conjunto de parejas de cebadores capaces de identificar los marcadores que se seleccionan de la lista que consiste en: CATCH53, CATCH48, CATCH23, CATCH19, CATCH13, CATCH16 y CATCH18. Más preferiblemente el kit de la invención comprende además, el conjunto de parejas de cebadores capaces de identificar los marcadores que se seleccionan de la lista que consiste en: CATCH53, CATCH48, CATCH23, CATCH19, CATCH13, CATCH16, CATCH18, D22S427, D22S941, D22S264 y D22S686.

Tal y como se ha mencionado anteriormente en el presente documento, las secuencias nucleotídicas de los cebadores que identifican cada uno de los marcadores de la invención se describen en la Tabla 4.

Como entiende el experto en la materia, el kit de la invención además de comprender al menos una de las parejas de cebadores antes indicadas, puede incluir, opcionalmente, los reactivos necesarios para llevar a cabo la reacción de amplificación multiplex, entre los que se incluyen, sin limitar a, desoxinucleótidos trifosfato (dNTPs), iones divalentes y/o monovalentes, una solución tampón (buffer) que mantiene el pH adecuado para el funcionamiento de la ADN polimerasa, ADN polimerasa o mezcla de distintas polimerasas, etc. No obstante, si el kit de la invención no comprende los reactivos necesarios para poner en práctica el método de la invención, éstos están disponibles comercialmente y pueden encontrarse formando parte de un kit. Cualquier kit de los disponibles comercialmente que contenga los reactivos necesarios para llevar a cabo una reacción de amplificación, como por ejemplo Qiagen Multiplex PCR Kit (Qiagen, Valencia, CA), puede emplearse con éxito en la puesta en práctica del método de la invención. Asimismo, otros de los reactivos empleados en la puesta en práctica del método de la invención y que pueden formar parte del kit son el material necesario para obtener la muestra biológica del individuo tales como pinzas, gasas, torundas, hisopos, jeringuillas, etc., y los reactivos empleados en el aislamiento del ADN a partir de la muestra biológica obtenida, como por ejemplo, alcoholes, detergentes, etc.

Adicionalmente, los kits pueden contener instrucciones para el empleo de los distintos componentes que se encuentran en el kit. Dichas instrucciones pueden encontrarse en forma de material impreso o en forma de un soporte electrónico capaz de almacenar instrucciones de forma que puedan ser leídas por un sujeto, tales como medios de almacenamientos electrónicos (discos magnéticos, cintas y similares), medios ópticos (CD-ROM, DVD) y similares. Adicional o alternativamente, los medios pueden contener direcciones de internet que proporcionen dichas instrucciones.

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.

EJEMPLOS.

EJEMPLO 1. Desarrollo del método in vitro de la invención para la detección de deleciones y/o duplicaciones en la región cromosómica 22q11.2.

Identificación de los LCR22s de la región 22q11.2

La identificación precisa de los límites de los LCR22 de la región 22q11.2 se ha llevado a cabo en el contexto de la última versión de la secuencia del genoma humano (UCSC; versión de febrero 2009 Human Reference Sequence (GRCh37)). Para ello, se compararon ventanas de secuencias consecutivas de 25 Kb (entre las posiciones 16 y 23 Mb del cromosoma 22) con la secuencia completa del genoma humano, empleando los programas BLAST del NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) y BLAT del UCSC Genome Browse (http://genome.ucsc.edu/). Esta estrategia permitió detectar secuencias idénticas o casi idénticas localizadas en posiciones diferentes a las conocidas en el cromosoma 22 o incluso en otros cromosomas formando LCR22s.

Las posiciones y medidas precisas obtenidas para los LCR22s fueron las siguientes (Ver Tabla 1): LCR22-A 18,642,491-19,023,012 (380,521 Kb); LCR22-B 20,249,559­ 20,731,985 (482,426 Kb); LCR22-C 21,021,869-21,074,326 (52,457 Kb); LCR22-D 21,465,674-21,917,116 (451,422 Kb); LCR22-E 22,963,079-23,136,903 (173,824 Kb) y LCR22-F 23,649,113- 24,021,303 (372,219 Kb).

Identificación de nuevos marcadores STRs para la región cromosómica 22q11.2

Las repeticiones que forman los nuevos marcadores polimórficos STR se identificaron empleando el buscador “Tándem Repeats Finder” de la secuencia del genoma humano de referencia del “UCSC Genome Browser” (http://genome.ucsc.edu/). Mediante este software se identifican todas las repeticiones en tándem o microsatélite a lo largo del genoma.

Los marcadores polimórficos STR identificados en la presente invención se muestran en la Tabla 2 y se les ha dado el nombre genérico de “CATCH” seguido de una numeración. Tal y como se observa en dicha Tabla 2, se han identificado un total de 38 nuevos marcadores polimórficos STR que identifican la región genómica 22q11.2.

Por otro lado, para obtener una identificación aún más precisa y fidedigna de los individuos analizados mediante el método in vitro descrito en la invención, los marcadores CATCH de la invención se han combinado con marcadores polimórficos STR ya conocidos en el estado de la técnica, y que también identifican la región genómica 22q11.2. Dichos marcadores polimórficos conocidos se describen en la Tabla 3.

Todos estos marcadores polimórficos STR, tanto los nuevos aquí descritos (CATCH) como los ya conocidos, se localizan entre las posiciones 17,859,476 (D22S420) pb y 24,488,486 (D22S1174) pb del cromosoma 22 que corresponde aproximadamente con la zona comprendida entre el LCR22-A y el LCR22-F (Tabla 1), y se describen en la Tabla 2.

Una vez identificados los marcadores polimórficos CATCH de la invención, se diseñaron los cebadores específicos para amplificarlos mediante técnicas de PCR.

Diseño de los cebadores utilizados en la técnica PCR que reconocen los marcadores de la invención

El diseño de los cebadores para la amplificación mediante técnicas de PCR de los marcadores STR de la invención se llevó a cabo empleando el programa “Oligos 9.6” disponible en la página web del Instituto de Biotecnología de la Universidad de Helsinki (www.biocenter.helsinki.fi/bi/DNA/links.htm). Una vez obtenidas las secuencias de los mismos, se compararon las secuencias que rodean las STRs con el resto del genoma empleando los programas BLAST del NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) y BLAT del UCSC Genome Browser, para asegurar la existencia de una sola copia de los marcadores.

Los cebadores diseñados de novo para la identificación de los nuevos marcadores STR de la presente invención denominados CATCH se muestran en la Tabla 4, junto con los cebadores que identifican los marcadores STR ya conocidos en el estado de la técnica, y los cebadores que identifican los marcadores no polimórficos STS, también conocidos en el estado de la técnica.

Determinación de la heterozigosidad de los marcadores analizados en la presente invención.

La heterozigosidad de los marcadores se determinó tipando cada uno de ellos en 100 muestras de ADNs de la población de estudio analizada. La heterozigosidad se calculó dividiendo el número de muestras de ADN heterocigotas que no tenían parentesco entre el número total de muestras analizado. Los resultados de heterozigosidad para cada uno de los marcadores analizados se muestran en la Tabla 5.

Tabla 5. Heterozigosidad de los marcadores analizados en la presente invención. OBS HET indica la heterozigosidad calculada para cada marcador. nd= no determinado.

Selección de los marcadores CATCH de la invención utilizados para su identificación en una muestra de un sujeto mediante técnicas de PCR multiplex

Para seleccionar los marcadores que se iban a utilizar en las PCR multiplex se separaron aquellos marcadores más polimórficos (con mayor heterocigosidad) y que daban mejores resultados.

A continuación, se seleccionaron once marcadores, comprendiendo marcadores polimórficos STR de la presente invención (CATCH), así como marcadores polimórficos ya conocidos, de manera que hubiera al menos uno de los marcadores en cada intervalo delimitado por LCR22. Los once marcadores seleccionados son los siguientes:

- marcador localizado en la región anterior a la región LCR22A: CATCH53 y D22S427,

- marcador localizado en la región inter-LCR22A-B: CATCH48, CATCH 19, CATCH23 y D22S941,

- marcador localizado en la región inter-LCR22B-C: D22S264,

- marcador localizado en la región inter-LCR22C-D: CATCH13,

- marcador localizado en la región inter-LCR22D-E: CATCH16 y CATCH18, y - marcador localizado en la región posterior al LCR22E: D22S686.

Con los once marcadores seleccionados se diseñaron dos reacciones PCR multiplex. Se tuvo en cuenta en cuenta el tamaño de los marcadores a amplificar para marcar con diferentes fluorocromos aquellos que presentaban tamaños similares. De esta manera se diseñaron dos PCR multiplex (M1 y M2) tal y como se muestra en la Tabla 6.

Una vez obtenidos los cebadores marcados se realizó la puesta a punto para determinar las condiciones óptimas de amplificación. En primer lugar, se probaron dos condiciones (condición A y condición B) de PCR diferentes:

Condición A.- En un volumen final de 25 pl con 100-150 ng de ADN, tampón 1,4x, 0.3 mM dNTP, 80 nM de cada cebador, 2 mM de cloruro de magnesio, y 2U de Taq ADN polimerasa.

Condición B.- En un volumen final de 25 pl con 100-150 ng de ADN, tampón 1x, 0.2 mM dNTP, 80 nM de cada cebador, 1.5 mM de cloruro de magnesio, y 2U de Taq ADN polimerasa.

Las reacciones de amplificación se llevaron a cabo con un termociclador "MJ research”. Los parámetros para la amplificación fueron 30 ciclos de desnaturalización durante 10 segundos a 94 °C (2 minutos para el primer ciclo), hibridación a 54°C durante 45 segundos y extensión a 65°C durante 2 minutos. Finalmente, las reacciones se analizaron con un secuenciador automático.

Después de analizar los resultados obtenidos con cada una de las condiciones A o B, se concluyó que la mejor opción es la Condición A.

TABLA 6. PCRs Multiplex. Marcadores genéticos que forman las dos PCR multiplex (M1 y M2) y el tamaño de los alelos más frecuentes.

EJEMPLO 2. Validación del método in vitro de la invención para la detección de deleciones y/o duplicaciones en la región cromosómica 22q11.2

Para poner de manifiesto la utilidad del método in vitro de la invención para la identificación de deleciones y/o duplicaciones en la región 22q11.2, se analizaron las muestras de ADN de un total de 104 pacientes con sospecha de la presencia de deleciones y/o duplicaciones en dicha región 22q11.2.

Tal y como se ha mencionado a lo largo del presente documento, la región genómica 22q11.2 se dividió en seis intervalos delimitados por los diferentes LCR22 (Tabla 1). En cada una de las PCR multiplex llevadas a cabo, M1 y M2, se incluyeron al menos 3 marcadores polimórficos STR de la invención (CATCH) en cada mezcla, donde dichos marcadores CATCH identificaban los intervalos de la región 22q11.2 identificados, para así descartar cualquier deleción y/o duplicación en dicha región 22q11.2 sin necesidad de la muestra de ADN de los progenitores. Sólo en los casos de diagnóstico prenatal se utilizó ADN materno, ya que el ADN se extrajo a partir de líquido amniótico y es necesario el ADN materno para poder descartar contaminación materna. Así, la presencia de dos alelos en uno o más de los marcadores utilizados para cada intervalo inter-LCR22, permite descartar la presencia de cualquier deleción mediada por LCRs.

Los resultados obtenidos mediante las dos PCR multiplex (M1 y M2) en las muestras de los 104 pacientes, fueron la presencia de 5 pacientes que presentaban deleciones (que posteriormente fueron confirmadas por FISH).

Como se observa en la FIG. 1, los demás pacientes restantes presentaron al menos un marcador informativo con 2 alelos (heterocigoto) en el intervalo entre el LCR22A en (18,642,491-19,023,012 pb) y LCR22B, (20,249,559-20,731,985 pb) quedando descartadas las deleciones más frecuentes de 1,5 y 1,3 Mb en el 100% de los casos, dado que ambas deleciones incluyen el intervalo LCR22A-LCR22B.

En la FIG. 2 se muestra la electroforesis capilar de los productos resultantes de las dos PCRs multiplex de la invención llevadas a cabo sobre una muestra biológica de ADN procedente de un individuo normal sano. Como se puede apreciar claramente en dicha figura, este individuo es heterocigoto (presenta 2 alelos) para los marcadores CATCH48, CATCH13, CATCH19, D22S264, CATCH18, D22S941 y CATCH23, lo que indica que no es portador de deleciones en la región cromosómica 22q11.2.

En la FIG. 3 se muestra una electroforesis capilar de los productos resultantes de las dos PCRs multiplex de la invención llevadas a cabo sobre una muestra biológica de ADN procedente de un individuo que presenta una deleción de 3 Mb. Como se puede observar en dicha figura, la electroforesis muestra que dicho individuo es homocigoto (presenta 1 solo alelo) para los marcadores CATCH48, CATCH13, CATCH19, D22S264, CATCH53, D22S941 y CATCH23, lo que confirma, haciendo uso del método descrito en la presente invención, que el individuo es portador de una deleción de 3 Mb.

En la FIG. 4 se muestran los resultados de una electroforesis capilar de los productos resultantes de las dos PCRs multiplex de la invención sobre una muestra biológica de ADN procedente de un individuo con una deleción de 3 Mb junto con el mapa de la región 22q11.2 analizada. Todos los marcadores que se hallan en el intervalo entre los LCR22 A y D (D22S427, CATCH48, CATCH13, CATCH19, D22S264, CATCH53, D22S941, CATCH23). incluidos en la deleción de 3 Mb son homocigotos (presentan 1 solo alelo), lo que indica la presencia de dicha deleción de 3 Mb.

En a FIG. 5 se muestran los resultados obtenidos mediante geles de electroforesis de los productos resultantes de las dos PCR multiplex de la invención en una muestra biológica de ADN procedente de un individuo con una deleción de 3 Mb en la región 22q11.2 y también en una muestra biológica de ADN de sus progenitores. El intervalo delecionado se muestra en la figura mediante sombreado de rayas horizontales. Esta prueba cuando se realiza en presencia de los padres es concluyente: en este caso para la presencia de la deleción, al no heredarse en este caso el alelo paterno. Se trata por lo tanto de una deleción de novo de origen paterno.

En la FIG. 6 se muestra una electroforesis capilar de los productos resultantes de las dos PCRs multiplex de la invención sobre una muestra biológica de ADN procedente de un individuo con una duplicación de 1 Mb. La electroforesis muestra como los marcadores CATCH13 y D22S264 presentan tres alelos, lo que es prueba concluyente de una duplicación atípica en dicha región.

Claims (19)

REIVINDICACIONES

1. Método in vitro para detectar duplicaciones y/o deleciones en la región cromosómica 22q11.2 de un sujeto que comprende determinar en una muestra biológica aislada de dicho sujeto el número de alelos que presentan los marcadores localizados en las regiones del cromosoma 22:

(i) la región anterior a la región LCR22A situada entre las posiciones 18,642,491-19,023,012 pb del cromosoma 22, mediante la identificación de al menos uno de los marcadores seleccionados de la lista que consiste en: CATCH5 (SEQ ID NO: 111), CATCH53 (SEQ ID NO: 112), CATCH52 (SEQ ID NO: 113) y/o cualquier combinación de los mismos;

(ii) la región inter-LCR22A-B, delimitada por las regiones LCR22A (situada entre las posiciones 18,642,491-19,023,012 pb) y LCR22B (situada entre las posiciones 20,249,559-20,731,985 pb) del cromosoma 22, mediante la identificación de al menos uno de los marcadores seleccionados de la lista que consiste en: CATCH4 (SEQ ID NO: 114), CATCH6 (SEQ ID NO: 115), CATCH48 (SEQ ID NO: 116), CATCH22 (SEQ ID NO: 117), CATCH19 (SEQ ID NO: 118), CATCH7 (SEQ ID NO: 119), CATCH23 (SEQ ID NO: 120) y/o cualquier combinación de los mismos;

(iii) la región inter-LCR22B-C delimitada por las regiones LCR22B (situada entre las posiciones 20,249,559-20,731,985 pb) y LCR22C (situada entre las posiciones 21,021,869-21,074,326 pb), del cromosoma 22, mediante la identificación de al menos uno de los marcadores seleccionados de la lista que consiste en: CATCH45 (SEQ ID NO: 121), CATCH10 (SEQ ID NO: 122), CATCH20 (SEQ ID NO: 123), y/o cualquier combinación de los mismos;

(iv) la región inter-LCR22C-D delimitada por las regiones LCR22C (situada entre las posiciones 21,021,869-21,074,326 pb) y LCR22D (situada entre las posiciones 21,465,674-21,917,116 pb), del cromosoma 22, mediante la identificación de al menos uno de los marcadores seleccionados de la lista que consiste en: CATCH42 (SEQ ID NO: 124), CATCH41 (SEQ ID NO: 125), CATCH11 (SEQ ID NO: 126), CATCH12 (SEQ ID NO: 127), CATCH13 (SEQ ID NO: 128), CATCH14 (SEQ ID NO: 129), CATCH39 (SEQ ID NO: 130), CATCH38 (SEQ ID NO: 131), CATCH37 (SEQ ID NO: 132), y/o cualquier combinación de los mismos; y

(v) la región inter-LCR22D-E delimitada por las regiones LCR22D (situada entre las posiciones 21,465,674-21,917,116 pb) y LCR22E (situada entre las posiciones 22,963,079-22,997,578pb), del cromosoma 22, mediante la identificación de al menos uno de los marcadores seleccionados de la lista que consiste en: CATCH36 (SEQ ID NO: 133), CATCH35 (SEQ ID NO: 134), CATCH31 (SEQ ID NO: 135), CATCH25 (SEQ ID NO: 136), CATCH24 (SEQ ID NO: 137), CATCH26 (SEQ ID NO: 138), CATCH30 (SEQ ID NO: 139), CATCH29 (SEQ ID NO: 140), CATCH15 (SEQ ID NO: 141), CATCH16 (SEQ ID NO: 142), CATCH28 (SEQ ID NO: 143), CATCH17 (SEQ ID NO: 144), CATCH18 (SEQ ID NO: 145), CATCH33 (SEQ ID NO: 146), CATCH27 (SEQ ID NO: 147), CATCH51 (SEQ ID NO: 148), y/o cualquier combinación de los mismos;

donde un número de alelos inferior a dos en al menos uno de los marcadores de al menos una de las regiones (i) a (v) es indicativo de una deleción en dicha región 22q11.2, y donde un número de alelos igual o superior a tres en al menos uno de los marcadores de al menos una de las regiones (i) a (v) es indicativo de una duplicación en dicha región 22q11.2.

2. Método in vitro según la reivindicación 1, caracterizado por que comprende:

(i) Identificar el número de alelos que presenta el conjunto de marcadores seleccionados de la lista que consiste en: CATCH5 (SEQ ID NO: 111), CATCH53 (SEQ ID NO: 112) y CATCH52 (SEQ ID NO: 113), localizados en la región anterior a la región LCR22A;

(ii) Identificar el número de alelos que presenta el conjunto de marcadores seleccionados de la lista que consiste en: CATCH4 (SEQ ID NO: 114), CATCH6 (SEQ ID NO: 115), CATCH48 (SEQ ID NO: 116), CATCH22 (SEQ ID NO: 117), CATCH19 (SEQ ID NO: 118), CATCH7 (SEQ ID NO: 119) y CATCH23 (SEQ ID NO: 120), localizados en la región inter-LCR22A-B;

(iii) Identificar el número de alelos que presenta el conjunto de marcadores seleccionados de la lista que consiste en: CATCH45 (SEQ ID NO: 121), CATCH10 (SEQ ID NO: 122) y CATCH20 (SEQ ID NO: 123), localizados en la región inter-LCR22B-C;

(iv) Identificar el número de alelos que presenta el conjunto de marcadores seleccionados de la lista que consiste en: CATCH42 (SEQ ID NO: 124), CATCH41 (SEQ ID NO: 125), CATCH11 (SEQ ID NO: 126), CATCH12 (SEQ ID NO: 127), CATCH13 (SEQ ID NO: 128), CATCH14 (SEQ ID NO: 129), CATCH39 (SEQ ID NO: 130), CATCH38 (SEQ ID NO: 131) y CATCH37 (SEQ ID NO: 132), localizado en la región inter-LCR22C-D;

(v) Identificar el número de alelos que comprende el conjunto de marcadores seleccionados de la lista que consiste en: CATCH36 (SEQ ID NO: 133), CATCH35 (SEQ ID NO: 134), CATCH31 (SEQ ID NO: 135), CATCH25 (SEQ ID NO: 136), CATCH24 (SEQ ID NO: 137), CATCH26 (SEQ ID NO: 138), CATCH30 (SEQ ID NO: 139), CATCH29 (SEQ ID NO: 140), CATCH15 (SEQ ID NO: 141), CATCH16 (SEQ ID NO: 142), CATCH28 (SEQ ID NO: 143), CATCH17 (SEQ ID NO: 144), CATCH18 (SEQ ID NO: 145), CATCH33 (SEQ ID NO: 146), CATCH27 (SEQ ID NO: 147) y CATCH51 (SEQ ID NO: 148), localizados en la región inter-LCR22D-E.

3. Método in vitro según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2 caracterizado por que además comprende:

(i) Identificar el número de alelos que presentan al menos uno de los marcadores seleccionados de la lista que consiste en: D22S420 (SEQ ID NO: 149), D22S427 (SEQ ID NO: 150), y/o cualquier combinación de los mismos, localizados en la región anterior a la región LCR22A; (ii) Identificar el número de alelos que presentan al menos uno de los marcadores seleccionados de la lista que consiste en: D22S1638 (SEQ ID NO: 151), 22K48-2 (SEQ ID NO: 152), D22S1648 (SEQ ID NO: 153), D22S941 (SEQ ID NO: 154), D22S944 (SEQ ID NO: 155), D22S1623 (SEQ ID NO: 156), y/o cualquier combinación de los mismos, localizados en la región inter-LCR22A-B;

(iii) Identificar el número de alelos que presenta el marcador: D22S264 (SEQ ID NO: 157), localizado en la región inter-LCR22B-C

(iv) Identificar el número de alelos que presentan al menos uno de los marcadores seleccionados de la lista que consiste en: D22S311 (SEQ ID NO: 158), D22S1709 (SEQ ID NO: 159), y/o cualquier combinación de los mismos, localizado en la región inter-LCR22C-D;

(v) Identificar el número de alelos que presentan al menos uno de los marcadores seleccionados de la lista que consiste en: D22S446 (SEQ ID NO: 160), D22S539 (SEQ ID NO: 161), D22S308 (SEQ ID NO: 162), D22S306 (SEQ ID NO: 163), y/o cualquier combinación de los mismos, localizado en la región inter-LCR22D-E, e

(vi) Identificar el número de alelos que presentan al menos uno de los marcadores seleccionados de la lista que consiste en: D22S686 (SEQ ID NO: 164), D22S425 (SEQ ID NO: 165), D22S1174 (SEQ ID NO: 167), y D22S257 (SEQ ID NO: 166), y/o cualquier combinación de los mismos, localizados en la región posterior al LCR22E.

donde un número de alelos inferior a dos en al menos uno de los marcadores de al menos una de las regiones (i) a (vi) es indicativo de una deleción en dicha región 22q11.2, y donde un número de alelos igual o superior a tres en al menos uno de los marcadores de al menos una de las regiones (i) a (vi) es indicativo de una duplicación en dicha región 22q11.2.

4. Método in vitro según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 3 caracterizado por que comprende:

(i) Identificar el número de alelos que presentan los marcadores seleccionados de la lista que consiste en: CATCH53 (SEQ ID NO: 112) y D22S427 (SEQ ID NO: 150), localizados en la región anterior a la región LCR22A del cromosoma 22;

(ii) Identificar el número de alelos que presentan los marcadores seleccionados de la lista que consiste en: CATCH48 (SEQ ID NO: 116), CATCH19 (SEQ ID NO: 118), CATCH23 (SEQ ID NO: 120) y D22S941 (SEQ ID NO: 154), localizados en la región inter-LCR22A-B del cromosoma 22;

(iii) Identificar el número de alelos que presentan los marcadores polimórficos seleccionados de la lista que consiste en: D22S264 (SEQ ID NO: 157), localizados en la región inter-LCR22B-C del cromosoma 22;

(iv) Identificar el número de alelos que presentan los marcadores polimórficos seleccionados de la lista que consiste en: CATCH13 (SEQ ID NO: 128), localizados en la región inter-LCR22C-D del cromosoma 22;

(v) Identificar el número de alelos que presentan los marcadores polimórficos seleccionados de la lista que consiste en: CATCH16 (SEQ ID NO: 142) y CATCH18 (SEQ ID NO: 145), localizados en la región inter-LCR22D-E del cromosoma 22; e

(vi) Identificar el número de alelos que presenta el marcador D22S686 (SEQ ID NO: 194), localizado en la región posterior a la región LCR22E del cromosoma 22,

5. Método in vitro según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 caracterizado por que comprende:

(i) Identificar el número de alelos que presentan los marcadores seleccionados de la lista que consiste en: CATCH5 (SEQ ID NO: 111), CATCH53 (SEQ ID NO: 112), CATCH52 (SEQ ID NO: 113), D22S420 (SEQ ID NO: 149), D22S427 (SEQ ID NO: 150) y D22S1638 (SEQ ID NO: 151), localizados en la región anterior a la región LCR22A del cromosoma 22;

(ii) Identificar el número de alelos que presentan los marcadores seleccionados de la lista que consiste en: CATCH4 (SEQ ID NO: 114), CATCH6 (SEQ ID NO: 115), CATCH48 (SEQ ID NO: 116), CATCH22 (SEQ ID NO: 117), CATCH19 (SEQ ID NO: 118), CATCH7 (SEQ ID NO: 119), CATCH23 (SEQ ID NO: 120), 22K48-2 (SEQ ID NO: 152), D22S1648 (SEQ ID NO: 153), D22S941 (SEQ ID NO: 154), D22S944 (SEQ ID NO: 155), D22S1623 (SEQ ID NO: 156), localizados en la región inter-LCR22A-B del cromosoma 22;

(iii) Identificar el número de alelos que presentan los marcadores seleccionados de la lista que consiste en: CATCH45 (SEQ ID NO: 121), CATCH10 (SEQ ID NO: 122), CATCH20 (SEQ ID NO: 123), D22S264 (SEQ ID NO: 157), localizados en la región inter-LCR22B-C del cromosoma 22;

(iv) Identificar el número de alelos que presentan los marcadores seleccionados de la lista que consiste en: CATCH42 (SEQ ID NO: 124), CATCH41 (SEQ ID NO: 125), CATCH11 (SEQ ID NO: 126), CATCH12 (SEQ ID NO: 127), CATCH13 (SEQ ID NO: 128), CATCH14 (SEQ ID NO: 129), CATCH39 (SEQ ID NO: 130), CATCH38 (SEQ ID NO: 131), CATCH37 (SEQ ID NO: 132), D22S311 (SEQ ID NO: 158), y D22S1709 (SEQ ID NO: 159), localizados en la región inter-LCR22C-D del cromosoma 22;

(v) Identificar el número de alelos que presentan los marcadores seleccionados de la lista que consiste en: CATCH36 (SEQ ID NO: 133), CATCH35 (SEQ ID NO: 134), CATCH31 (SEQ ID NO: 135), CATCH25 (SEQ ID NO: 136), CATCH24 (SEQ ID NO: 137), CATCH26 (SEQ ID NO: 138), CATCH30 (SEQ ID NO: 139), CATCH29 (SEQ ID NO: 140), CATCH15 (SEQ ID NO: 141), CATCH16 (SEQ ID NO: 142), CATCH28 (SEQ ID NO: 143), CATCH17 (SEQ ID NO: 144), CATCH18 (SEQ ID NO: 145), CATCH33 (SEQ ID NO: 146), CATCH27 (SEQ ID NO: 147) y CATCH51 (SEQ ID NO: 148), D22S446 (SEQ ID NO: 160), D22S539 (SEQ ID NO: 161), D22S308 (SEQ ID NO: 162), D22S306 (SEQ ID NO: 163), localizados en la región inter-LCR22D-E del cromosoma 22; e

(vi) Identificar el número de alelos que presentan los marcadores seleccionados de la lista que consiste en: D22S686 (SEQ ID NO: 164), D22S425 (SEQ ID NO: 165), D22S257 (SEQ ID NO: 166), D22S1174 (SEQ ID NO: 167), localizados en la región posterior a la LCR22E.

6. Método in vitro según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 donde la identificación del número de alelos de cada marcador se lleva a cabo mediante técnicas de PCR.

7. Método in vitro según la reivindicación 6 donde la PCR es una PCR multiplex.

8. Método in vitro según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 donde la identificación del número de alelos, dependiendo del marcador seleccionado, se lleva a cabo mediante las parejas de cebadores seleccionadas de la lista que consiste en: SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 29 y SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 y SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33 y SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35 y SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 39 y SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41 y SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43 y SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45 y SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47 y SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49 y SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 53 y SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55 y SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57 y SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59 y SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 63 y SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65 y SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67 y SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69 y SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 73 y SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75 y SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 79 y SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81 y SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83 y SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85 y SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87 y SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89 y SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 93 y SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 97 y SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99 y SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101 y SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103 y SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105 y SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 y SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 25 y SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 37 y SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 51 y SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 61 y SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 71 y SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 77 y SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 91 y SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 95 y SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 107 y SEQ ID NO: 108 y SEQ ID NO: 109 y SEQ ID NO: 110.

9. Método in vitro de diagnóstico de patologías relacionadas con deleciones y/o duplicaciones de la región cromosómica 22q11.2, en una muestra biológica aislada de un sujeto, que comprende llevar a cabo el método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, donde la detección de una duplicación y/o deleción en la región cromosómica 22q11.2 es indicativo de que el sujeto presenta una patología que se selecciona de la lista que consiste en: cardiopatía congénita, síndrome de DiGeorge, síndrome Velocardiofacial, esquizofrenia, retraso mental e inmunodeficiencia.

10. Método según la reivindicación 9 donde la cardiopatía congénita se selecciona de la lista que consiste en: defecto septal atrial, defecto del septo ventricular, tetralogía de Fallot, transposición completa de los grandes vasos, estenosis de la válvula aórtica, atresia pulmonar, doble salida ventricular derecha, interrupción del arco aórtico, persistencia del ductus arterioso, síndrome de hipoplasia del corazón izquierdo, tronco arterioso persistente o tronco arterioso, comunicación interauricular, comunicación interventricular, atresia tricuspidea, anomalía de Ebstein, dextrocardia, coartación de aorta, ductus arterioso persistente, síndrome de la cimitarra y ventrículo único.

11. Método según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 10 donde el diagnóstico es un diagnóstico prenatal.

12. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 donde la muestra biológica aislada se selecciona de la lista que consiste en: fluidos biológicos y/o tejidos.

13. Método in vitro según la reivindicación 12 donde la muestra de fluido biológico se selecciona de la lista que consiste en: sangre, plasma, suero, líquido amniótico.

14. Kit o array para detectar duplicaciones y/o deleciones en la región cromosómica 22q11.2, que comprende al menos una pareja de cebadores que se seleccionan de la lista que consiste en: SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 35 y SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 33 y SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 55 y SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 97 y SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 105 y SEQ ID NO: 106 y/o cualquiera de sus combinaciones.

15. Kit o array según la reivindicación 14 que comprende además al menos una de las parejas los cebadores que se seleccionan de la lista que consiste en: SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 29 y SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 y SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 39 y SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41 y SEQ ID NO: 42, S

44, SEQ ID NO: 45 y SEQ ID NO: 46,

: 48, SEQ ID NO: 49 y SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 53 y SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 57 y SEQ ID NO: 58; SEQ ID NO: 59 y SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 63 y SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65 y SEQ ID NO: 66, S

68, SEQ ID NO: 69 y SEQ ID NO: 70, : 74, SEQ ID NO: 75 y SEQ ID NO: 76 , SEQ ID NO:79 y SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81 y SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83 y SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85 y SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87 y SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89 y SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 93 y SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 99 y SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101 y SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103 y SEQ ID NO: 104, y/o cualquiera de sus combinaciones.

16. Kit o array según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 15 que comprende las parejas de cebadores que se selecciona de la lista que consiste en: SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 35 y SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 33 y SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 55 y SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 97 y SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 105 y SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 29 y SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 y SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 39 y SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41 y SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43 y SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45 y SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47 y SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49 y SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 53 y SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 57 y SEQ ID NO: 58; SEQ ID NO: 59 y SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 63 y SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65 y SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67 y SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69 y SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 73 y SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75 y SEQ ID NO: 76 , SEQ ID NO:79 y SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81 y SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83 y SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85 y SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87 y SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89 y SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 93 y SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 99 y SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101 y SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103 y SEQ ID NO: 104.

17. Kit o array según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16 que comprende además al menos una de las parejas de cebadores que se selecciona de la lista que consiste en: SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 y SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 25 y SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 37 y SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 51 y SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 61 y SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 71 y SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 77 y SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 91 y SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 95 y SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 107 y SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109 y SEQ ID NO: 110, y/o cualquiera de sus combinaciones.

18. Kit o array según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 17 que comprende las parejas de cebadores que se selecciona de la lista que consiste en: SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 35 y SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 33 y SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 55 y SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 97 y SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 105 y SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 29 y SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 y SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 39 y SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41 y SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43 y SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45 y SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47 y SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49 y SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 53 y SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 57 y SEQ ID NO: 58; SEQ ID NO: 59 y SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 63 y SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65 y SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67 y SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69 y SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 73 y SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75 y SEQ ID NO: 76 , SEQ ID NO:79 y SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81 y SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83 y SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85 y SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87 y SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89 y SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 93 y SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 99 y SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101 y SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103 y SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 y SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 25 y SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 37 y SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 51 y SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 61 y SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 71 y SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 77 y SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 91 y SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 95 y SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 107 y SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109 y SEQ ID NO: 110.

19. Uso del kit o array según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 18 para detectar duplicaciones y/o deleciones en la región cromosómica 22q11.2.