ES2333715T3 - Procedimiento para la amplificacion de informacion genetica por medio de cebadores que se unen en varios sitios en el genoma. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para la determinación de la frecuencia relativa de unos conjuntos parciales delimitables de un material genético, siendo amplificado el material genético mediante una reacción en cadena de la polimerasa, en la que se utilizan unos cebadores, que son complementarios con unos sitios de fijación a cebadores, que están presentes en el material genético en varios sitios, y que están en cada caso contiguos con respecto a una secuencia diana, que tiene una longitud predeterminada, y es específica en cada caso un conjunto parcial, de tal manera que se obtiene un producto de amplificación, que en lo esencial tiene solamente unas secuencias amplificadas, que comprenden una secuencia diana, que tiene una longitud predeterminada, y es específica para la respectiva información genética, la cual es adecuada para la detección mediante hibridación, siendo analizado el producto de amplificación mediante un experimento de hibridación para la determinación de la frecuencia relativa de los conjuntos parciales delimitables.
Description
Procedimiento para la amplificación de
información genética por medio de cebadores que se unen en varios
sitios en el genoma.
El presente invento se refiere a procedimientos
para la determinación de la frecuencia relativa de unos conjuntos
parciales delimitables de un material genético.
Unos conjuntos parciales dentro de un material
genético son, por ejemplo, los cromosomas dentro de un genoma. En
este caso, un cromosoma constituye un conjunto parcial procedente de
un genoma, que contiene varios cromosomas diferentes. Unos
conjuntos parciales delimitables pueden ser también supresiones o
respectivamente inserciones dentro de un cromosoma individual. En
este caso, las supresiones o respectivamente las inserciones
constituyen los conjuntos parciales delimitables y el cromosoma
individual constituye el material genético. Unas Informaciones
genéticas de un cromosoma son p.ej. unas secuencias dianas, que sólo
se pueden presentar en este cromosoma, es decir, que son
específicas de este cromosoma.
Un sistema, en el que los conjuntos parciales
delimitables constituyen diferentes cromosomas de un genoma, es
p.ej. un corpúsculo polar.
Los corpúsculos polares se forman en los
vertebrados al realizarse la formación y la maduración de los
óvulos, que son requeridos para la reproducción de una respectiva
especie.
En el caso de los seres humanos, a las parejas o
a las mujeres que no tienen hijos, se les puede ofrecer una
reproducción asistida, para satisfacer su deseo de tener hijos. Para
ello, actualmente están a disposición varios procedimientos, que
conducen a una tasa promedia de embarazos de aproximadamente 10% por
cada óvulo. Unos análisis indirectos, llevados a cabo a través de
los corpúsculos polares, han mostrado que los óvulos tienen en un
alto porcentaje una distribución errónea para cromosomas
individuales. Estas aneuploidías conducen a unos embriones que no
son capaces de sobrevivir, y constituyen presuntamente el fundamento
de la baja tasa de implantación después de una reproducción
asistida.
En la población, aproximadamente un 10% de todas
las parejas no tienen hijos indeseadamente. Los motivos de esta
infertilidad se encuentran, por una parte, en defectos orgánicos en
las mujeres y los varones, pero ella también puede tener unas
causas genéticas. Hasta un 70% de las interrupciones del embarazo
pueden tener motivos genéticos, haciéndose responsables de ello en
la mayoría de los casos a unas distribuciones cromosómicas erróneas
(Griffin 1996).
Estas aneuploidías cromosómicas resultan en la
mayoría de los casos a partir de una ovogénesis perturbada (Angell
1993). En el caso de la espermiogénesis se encuentran células
aneuploides sólo en un 2-4% (Zenzes 1992). Esta y
otras causas conducen a que, en unas condiciones naturales, un alto
porcentaje de todos los óvulos fecundados no conduzca a un embarazo
intacto.
Tal como ya se ha expuesto más arriba, a las
parejas o mujeres que no tienen hijos, se les puede ofrecer una
fecundación in vitro u otra técnica distinta de reproducción
asistida, tal como p.ej. la inyección intracitoplasmática de
espermatozoides (ICSI), pudiéndose alcanzar con los métodos de
fecundación in vitro, que están a disposición actualmente,
una tasa promedia de embarazos de 10% por cada óvulo. La evaluación
de unos estudios extensos ha mostrado que la tasa de embarazos en
el caso de las mujeres con una edad de más que 35 años disminuye
manifiestamente, y que en el caso de las mujeres con una edad de
más que 40 años, ésta se sitúa por debajo de 10%. Esto está en
concordancia con la observación de que las madres presentan a partir
de la edad de 35 años un riesgo aumentado de tener un hijo con una
distribución cromosómica errónea.
En el diagnóstico prenatal sólo son
diagnosticados los niños que tienen una distribución cromosómica
errónea, que son capaces de vivir por lo menos hasta el momento del
diagnóstico. Así, p.ej. en el momento de la amniocentesis se
encuentran más niños con trisomías o monosomías que en el momento
del parto, puesto que muchos de estos niños fallecen en el
transcurso del embarazo.
Si se consideran solamente las trisomías,
entonces en lo esencial solamente son capaces de vivir los niños
que tienen una trisomía 21 o que tienen un cromosoma X o
respectivamente Y excedente o ausente. Las pequeñas tasas de
implantación, antes mencionadas, podrían estar fundamentadas por
aneuploidías de los óvulos también para otros cromosomas, que o
bien no conducen a ninguna implantación, o que conducen a un aborto
muy temprano. Este hecho es apoyado por análisis cromosómicos en
materiales procedentes de abortos.
Durante la maduración del óvulo, el óvulo
diploide inicial tiene que reducir su grupo de cromosomas. Este
proceso tiene lugar en las divisiones de maduración primera y
segunda. En la primera división de maduración (1ª división de
reducción) son separados los cromosomas homólogos. En la segunda
división de maduración se efectúa la separación de los cromátidos.
El material genético de las células hijas, que resultan en este
caso, es transferido al espacio perivitelino del óvulo en cada caso
en forma de los corpúsculos polares. Los corpúsculos polares
corresponden en su estructura a una célula, pero tienen una
proporción solamente mínima en el citoplasma. El primer corpúsculo
polar resulta durante la ovulación, y el segundo corpúsculo polar es
expulsado a las 3-4 h después de la penetración del
espermatozoide en el óvulo. Los dos corpúsculos polares se
diferencian en la cantidad de su material genético. El primer
corpúsculo polar contiene 23 cromosomas con dos cromátidos (2n),
mientras que el segundo así como también el óvulo maduro sólo tienen
23 cromosomas sencillos con solamente un cromátido (1n). Los
corpúsculos polares no tienen ninguna función y son resorbidos en el
desarrollo embrionario temprano. No se conoce ninguna importancia
biológica del corpúsculo polar para el embrión (véase el resumen de
"Preimplantation Genetic Diagnosis, Polar Body Biopsy"
(Diagnóstico genético previo a la implantación, biopsia de
corpúsculos polares) de The First World Congress On: Controversies
in Ostetrics, Gynecology & Infertility (Primer congreso mundial
sobre controversias en la obstetricia, la ginecología y la
infertilidad), Praga, República Checa - 1999 de Y. Verlinsky, A.
Kuliew y panfleto acerca del diagnóstico de corpúsculos polares del
centro médico Pränatal Medizin München, de Dr. Med
Karl-Philip Gloning y colaboradores. En el resumen
de "Preimplantation Genetic Diagnosis, Polar Body Biopsy" de
The First World Congress On: Controversies in Ostetrics, Gynecology
& Infertility, Praga, República Checa - 1999 de Y. Verlinsky y
A., Kuliew, se divulga la investigación de los corpúsculos polares
primero y segundo mediante un ensayo secuencial (del inglés
"sequential testing", lo que presupone una extracción del
corpúsculo polar. A partir de 179 embarazos artificiales exitosos
resultaron 135 niños sanos, que no habían sufrido daños de ningún
tipo mediante esta intervención.
M. Montag, K. van der Ven, H. van der Ven
"Erste klinische Erfahrungen mit der Polkörperchendiagnostik in
Deutschland" (Primeras experiencias clínicas con el diagnóstico
de corpúsculos polares en Alemania) informan acerca de sus primeras
experiencias con el diagnóstico de corpúsculos polares en Alemania,
según las cuales, las tasas de embarazos son agradablemente altas
mediando inclusión del diagnóstico de corpúsculos polares.
La cita "Einführung in die
Präimplantationsdiagnostik" (Introducción al diagnóstico antes de
la implantación), E. Schwinger, Lübeck, Alemania, fuente:
http://www.studgen.uni-mainz.de/manuskripte/schwinger.pdf.,
describe que no se puede comprobar ningún aumento de la tasa de
malformaciones después de un diagnóstico antes de la implantación
(PID) mediante un análisis de los corpúsculos polares o de los
blastocitos. El documento ilustra los estrechos intervalos de
tiempo que están a disposición en el caso de un diagnóstico antes de
la fecundación (PFD).
De acuerdo con un panfleto acerca del
diagnóstico de corpúsculos polares del Pränatal Medizin München, Dr.
Med Karl-Philip Gloning y colaboradores, los datos
publicados hasta ahora apuntan a que una extracción de corpúsculos
polares no está vinculada con ningún aumento digno de mención del
riesgo básico general de perturbaciones del desarrollo, que es de 2
- 4%.
Por lo tanto, ya existen individuos humanos que
han procedido de unos óvulos, a los que se les había extraído el
primer corpúsculo polar, que no han sufrido daños de ningún tipo,
provocados por esta intervención. Por consiguiente, el análisis de
los corpúsculos polares se ofrece como el método que se ha de
elegir, cuando se trate de investigar los óvulos en cuanto a su
idoneidad para una fecundación exitosa.
Los corpúsculos polares representan el número de
cromosomas en el óvulo y están a disposición para la realización de
un análisis genético.
El diagnóstico de células individuales en un
corpúsculo polar presupone su extracción en condiciones estériles
desde el espacio perivitelino del óvulo. La técnica clásica de
extracción es la apertura apoyada por medio de un micromanipulador
de la zona pelúcida y un subsiguiente aislamiento del corpúsculo
polar.
Mediante la posibilidad de la observación exacta
del proceso de fecundación durante la fecundación in vitro
(IVF), se ha mostrado que una parte de los óvulos no puede ser
fecundada, o que unos óvulos ya fecundados no se dividen
ulteriormente. Muchos de estos frustrantes ensayos de fecundación
son debidos presuntamente a aneuploidías de los óvulos. Varios
grupos de trabajo se han ocupado del análisis genético de los
corpúsculos polares. Para estos estudios, se aislaron los
corpúsculos polares y se sometieron a una hibridación in situ
con fluorescencia (FISH). En el caso de este análisis, unas
moléculas que son específicas para determinados cromosomas, y que
están marcadas con un colorante fluorescente, son hibridadas en los
cromosomas de los corpúsculos polares. Si se encuentra aquí para un
cromosoma un número diferente de señales, este hecho permite sacar
la conclusión de una distribución cromosómica aberrante durante la
ovogénesis. Con ayuda de este método, mediante el análisis de 3.943
ovocitos en el año 1999, se pudo mostrar que un 43% de los ovocitos
tenía una distribución cromosómica errónea, presentándose las
distribuciones erróneas tanto en la primera como también en la
segunda división de maduración. En el caso de este estudio se han
analizado sólo los cromosomas 13, 18 y 21 en lo que respecta a su
distribución correcta (Verlinsky 1998). Un refinamiento de esta
técnica permite hoy en día el análisis simultáneo de 5 cromosomas
diferentes. Este método está limitado ya en su enfoque en cuanto al
número de cromosomas analizables, puesto que para cada cromosoma se
tiene que utilizar otro fluorocromo diferente, y sólo es posible
una evaluación inequívoca cuando las señales no se solapan.
A partir del documento de patente de los EE.UU.
US 6.143.564 se conoce un procedimiento para la variación de la
información genética del óvulo de animales mediando toma de ayuda de
corpúsculos polares.
A partir del documento de patente japonesa JP
2086800 se conoce un procedimiento para la detección acerca de la
presencia de un determinado gen en un óvulo fecundado, en el que se
investigan los corpúsculos polares primero y segundo.
Unas moléculas captadoras específicas para
ciertos cromosomas, para hibridaciones in situ por la vía del
procedimiento FISH, se conocen a partir del documento US 5.817.462.
Mediante diferentes combinaciones de diferentes fluoroforos se
pueden detectar simultáneamente en este caso todos los cromosomas
humanos. En el caso de unos números más altos de cromosomas, el
número de las combinaciones necesarias de fluoroforos adecuados es
cada vez más complejo, al igual que su análisis. Eventualmente,
entonces se tienen que diferenciar los cromosomas individuales bajo
un microscopio con ayuda de su tamaño.
Los experimentos de FISH son adecuados, por lo
tanto, solamente en un grado limitado para cuantificar
simultáneamente los cromosomas dentro de un material genético. La
cuantificación de unos conjuntos parciales delimitables de un
material genético mediante tales procedimientos está limitada en
primer lugar a los cromosomas. El número de colores combinables es
limitado, y en el caso de una investigación de un corpúsculo polare,
el corpúsculo polar ya se ha consumido después de haber realizado
el análisis de FISH. Hasta ahora, con el mencionado procedimiento
es imposible realizar una afirmación confiable acerca de la
integridad de un conjunto global de cromosomas. Esto tiene también
como fundamento el hecho de que la preparación previa para
hibridaciones de FISH en el caso del corpúsculo polar no se puede
llevar a cabo tal como en el caso del procedimiento consagrado de
FISH en unas células que se encuentran en la metafase, puesto que
el ADN genómico de un corpúsculo polar no se puede dividir
adicionalmente, y puesto que los cromosomas de un corpúsculo polar
no se pueden condensar igual a como los cromosomas usuales.
Unas técnicas de tinción de cromosomas, que son
aplicadas también junto a la técnica de FISH, o de una coloración
homogénea convencional no se han acreditado como satisfactorias,
puesto que, según sea la técnica aplicada, en diferentes estudios
han resultado las más diversas tasas de anomalías (Eckel y
colaboradores 2001).
A partir del documento US 6.060.251 se conoce un
procedimiento para la determinación de la identidad cromosómica de
una muestra, que contiene un ADN genómico, siendo el ADN genómico
amplificado y provisto de medios de marcación. El procedimiento de
amplificación que se describe es un procedimiento inespecífico de
amplificación, en el que unas secuencias repetitivas sirven como
sitios de fijación a cebadores. El producto de amplificación es
investigado entonces mediante una biblioteca de ADN. La comprobación
se efectúa a través de la detección de híbridos, pudiendo las
moléculas captadoras procedentes de la biblioteca de ADN ser
aplicadas sobre un soporte sólido.
Fundamentalmente, existe la posibilidad de
realizar una afirmación acerca de la presencia de un cromosoma en
una muestra, amplificando, dentro del marco de una amplificación
específica, una secuencia diana, la cual se presenta sólo en un
determinado cromosoma, y detectando esta secuencia diana mediante la
formación de un híbrido a base de una molécula captadora y la
secuencia diana. A fin de detectar tales híbridos a base de una
molécula captadora y la secuencia diana es necesaria una cantidad
mínima de éstos, y se debe de generar una correspondiente cantidad
mínima de copias de la secuencia diana, por lo que es necesaria una
amplificación. Puesto que, dentro del marco de una amplificación
específica, por regla general sólo se producen copias de una
determinada secuencia diana, a partir de la detección de los
correspondientes híbridos sólo se puede sacar una conclusión acerca
de la presencia de unos cromosomas, que tienen esta secuencia diana.
A partir del documento de solicitud de patente internacional WO
00/24925 se conocen unos procedimientos y unos agentes para la
determinación de la composición cromosómica de una célula, en los
que el material genético, que se debe de investigar, es amplificado
primeramente mediante una amplificación inespecífica por PCR, siendo
mencionados unos corpúsculos polares asimismo como fuente para un
tal material genético. Se exponen las siguientes técnicas de PCR: la
DOP-PCR, la primer extension preamplification PCR
(una PCR con una preamplificación por prolongación de cebadores),
la ligation mediated PCR (una PCR mediada por una ligación), la
tagged PCR (una PCR marcada) y la Alu-PCR. En los
casos de estos procedimientos de amplificación, mediante unos
cebadores extremadamente inespecíficos, se asegura que sea
amplificado un perfil representativo del material genético, que está
presente en una célula. Junto a las secuencias dianas, que pueden
ser asociadas con cromosomas individuales, se presenta allí un gran
número de secuencias totalmente inespecíficas. El producto de
amplificación puede ser investigado con un chip génico. Con el
procedimiento descrito ha de ser posible detectar diferencias
cromosómicas y aneuploidías. En este caso, junto a la muestra que
se ha de investigar, se amplifica paralelamente una muestra de
referencia, las dos muestras son provistas de diferentes agentes de
marcación y son aplicadas sobre un chip, que tiene unas moléculas
captadoras, que pueden formar híbridos con las respectivas
secuencias dianas. A causa del gran número de secuencias
inespecíficas amplificadas conjuntamente, se establecen, sin
embargo, los siguientes problemas:
- -
- las secuencias dianas, de cuya detección se trata en definitiva, se presentan diluidas en una mezcla con un gran número de secuencias totalmente inespecíficas,
- -
- el gran número de secuencias inespecíficas, amplificadas conjuntamente, puede comprender unas secuencias, que son tan parecidas a las secuencias dianas, que las moléculas captadoras forman unos híbridos, que al realizar una detección pueden ser interpretados en el sentido de que está presente la secuencia diana asociada a la respectiva molécula captadora, lo que no se corresponde con la realidad o sólo se corresponde de una manera condicionada,
- -
- mediante la dilución de secuencias dianas dentro de un gran número de secuencias inespecíficas, que se remonta directamente a la inespecificidad del procedimiento de amplificación, es necesario un número más alto de ciclos, a fin de producir una cantidad mínima de secuencias dianas, que pueda conducir a una cantidad mínima detectable de híbridos a base de una molécula captadora y una secuencia diana; con cada ciclo aumenta sin embargo también el peligro de que resulten unos productos de amplificación con sitios erróneos, lo que conduce, por su parte, a unas dificultades al realizarse la formación de los deseados híbridos "correctos" a base de una molécula captadora y una secuencia diana, y su diferenciación con respecto de los híbridos erróneos indeseados,
- -
- unos altos números de ciclos conducen a que la formación de productos de PCR, que se remontan a una secuencia diana, ya no aumente de una manera exponencial, sino que se estanque. A partir de qué ciclo sucede esto, es dependiente entre otras cosas de la concentración inicial de esta secuencia diana. Por lo tanto, los aumentos de las concentraciones de diferentes secuencias dianas amplificadas de un material genético, en el caso de una amplificación simultánea mediante una PCR y de diferentes concentraciones iniciales de las secuencias dianas, comienzan a estancarse en unos estadios en cada caso diferentes de amplificación. Ya no se puede realizar ninguna afirmación acerca de la cantidad relativa de estas secuencias dianas.
\vskip1.000000\baselineskip
De acuerdo con el documento WO 00/24925, el
producto obtenido en el caso de amplificación inespecífica puede
ser sometido a una subsiguiente amplificación específica, con el fin
de realizar una afirmación acerca de la presencia de la secuencia
diana de amplificación específica en el material original. Con una
amplificación específica se amplifica solamente una secuencia diana
muy determinada. Con el producto de la segunda amplificación sólo
se puede realizar, por lo tanto, una afirmación acerca de la
presencia de la secuencia diana amplificada allí. El hecho de
comparar la cantidad relativa de productos de diferentes segundos
experimentos de amplificación no conduce ya, debido a unas
imponderabilidades en la amplificación inespecífica precedente, a
ninguna afirmación útil - a esto se agrega el hecho de que cada
experimento de amplificación, tomado por sí mismo, es influido por
un gran número de parámetros, que son difíciles de reproducir.
Forzosamente, por lo tanto, fluctúan los resultados de estos
procedimientos combinados de amplificación. Un análisis simultáneo
de tales secuencias dianas, en unas condiciones lo más comparables
que sean posible, no es posible por lo tanto mediando utilización
de los procedimientos conocidos a partir del documento WO 00/24925.
Con el fin de realizar una afirmación concreta acerca de la
presencia de una secuencia diana de una célula investigada de
acuerdo con el documento WO 00/24925, es necesario, además, un modo
de proceder complicado, largo y costoso en cuanto al material.
En la base de datos PubMed en el NCBI (en inglés
"National Center for Biotechnology Information", Centro
nacional para información sobre biotecnología), dirección
www.ncbi.nlm.nih.gov., resumen de "Rapid detection of
common autosomal aneuploidies by quantitative fluorescent PCR on
uncultured amniocytes" (Detección rápida de aneuploidías
autosómicas usuales por una PCR cuantitativa fluorescente en
amniocitos no cultivados). RAHIL, H. y otros, Eur. J. Hum. Genet.
(Agosto del 2002) 10(8) 462-6, se describe
una amplificación conjunta de DSCR1, DCC y RB1, requiriéndose para
cada uno de estos genes una pareja propia de cebadores, y para la
amplificación conjunta total se requieren, por lo tanto, tres
parejas de cebadores para las tres regiones génicas.
A partir del documento WO 02/29066 A se conoce
un cebador, que se ha empleado en una ERS-PCR, con
el fin de aislar determinados fragmentos de ADN.
La base de datos PubMed en el NCBI, dirección
www.ncbi.nlm.nih.gov., resumen de "Identification of
chromosomal translocations in leukemias by hybridization with
oligonucleotide microarrays" (Identificación de translocaciones
cromosómicas en leucemias por hibridación con microconjuntos de
oligonucleótidos), NASEDKINA, T. y otros, Haematologica (abril del
2002) 87 (4) 363-72, y la base de datos PubMed en el
NCBI, dirección www.ncbi.nlm.nih.gov., resumen de: "DNA
microarray technology for neonatal screening" (Tecnología de
microconjuntos de ADN para el escrutinio neonatal) DOBROWOLSKI,
S.F. y otros, Acta Paediatr. Suppl. (1999) 88 (432)
61-4 describen reacciones de PCR múltiple (en
inglés "multiplex-PCR"). En este caso, son
amplificadas simultáneamente varias secuencias diferentes.
El documento WO 02/44411 describe un
procedimiento para la comprobación de aneuploidías, que se basa en
un perfilamiento por expresión (en inglés
"expression-Profiling"). En este caso se
identifica la expresión de unos genes, que están presentes en un
cromosoma, y a partir de ello se saca una conclusión acerca del
cromosoma.
A partir del documento WO 00/24925 se conocen
unos procedimientos que se llevan a cabo mediando toma de ayuda de
un desparramamiento de cromosomas.
El documento de solicitud de patente europea EP
1.026.260 A1 describe el análisis de muestras de tejidos y de ARNm,
a saber, de un material a base de un gran número de células.
Armstrong y colaboradores (Cytometry
(Citometría), 2000, tomo 40, páginas 202 y siguientes) describen la
determinación de la frecuencia de alelos de un gen por medio de una
PCR y de muestras específicas para alelos, que están fijadas a
partículas. Las muestras son homólogas en un 100% con respecto a la
secuencia diana. No obstante, los cebadores no se fijan a varios
sitios de fijación en el material genético.
Los documentos de solicitudes de patentes
alemanas DE 101.02.678 A1 y DE 100.59.776 A1 se ocupan de la
detección de aneuploidías, no siendo útiles los métodos descritos
para detectar aneuploidías partiendo de una única célula o incluso
de un corpúsculo polar.
McCarthey y colaboradores (Proceedings of The
National Academy of Sciences of the United States [Actas de la
Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América],
tomo 92, nº12, 1995, página 5.302 y siguientes) describe el
cartografiado de genomas (RH-Mapping). La finalidad
del cartografiado de genomas es el cartografiado físico de unos
sitios (loci) individuales pero no la cuantificación de un material
genético.
A partir del documento US 6.329.140 se ilustran
los fundamentos y las posibilidades de la tecnología de chips de
ADN en conexión con unos procedimientos para la elección de
organismos clonados.
A partir del documento EP 1.026.260 se conoce un
procedimiento para la determinación simultánea de la expresión
génica y de anormalidades genéticas mediando utilización de
conjuntos de ADN, siendo adecuado el conjunto de ADN descrito para
el análisis de la expresión génica y para la comprobación de
anormalidades cromosómicas en una muestra de tejido. En el chip
están previstos para ello unas moléculas captadoras, que pueden ser
asociadas con determinados cromosomas. Con el procedimiento y con
el chip de ADN descrito se diferencian entre sí un material de
muestra expresado y uno no expresado.
De una manera general se puede decir que es
deseable una ampliación de los medios auxiliares técnicos para la
realización de análisis acerca de la presencia de unos conjuntos
parciales delimitables y de su cantidad relativa dentro de un
material genético, en particular de análisis de los cromosomas en
corpúsculos polares.
De acuerdo con la Ley para la Protección de
Embriones (en alemán "Embryonenschutzgesetz") del 13.12.1990,
en Alemania está prohibida la realización de un medio de diagnóstico
antes de la implantación para la detección de anomalías
cromosómicas en embriones humanos y no es posible su selección. Por
consiguiente, se suprime el análisis del segundo corpúsculo polar
en el caso de óvulos humanos. Al resultar el primer corpúsculo
polar, el óvulo, sin embargo, todavía no ha sido fecundado, y
mientras tanto que no haya tenido lugar ninguna fecundación, el
óvulo no es objeto de la Ley para la Protección de Embriones. Por lo
tanto, se podría conseguir un mejoramiento de las tasas de
embarazos mediante el análisis citogenético del 1^{er} corpúsculo
polar. En este caso, se haría posible un reconocimiento de ovocitos
aneuploides antes de la fecundación, y éstos se podrían excluir del
procedimiento ulterior de fecundación (Eckel y colaboradores, 2001).
Para ello, está a disposición sólo un limitado período de tiempo,
en el transcurso del cual el óvulo puede ser fecundado con éxito.
Este período de tiempo es de un orden de magnitud de
1-2 días.
Un método de este tipo podría acreditarse
también como útil para la reproducción de otros vertebrados, p.ej.
en el caso de la reproducción de especies de animales, que están en
peligro de desaparecer. En tales casos, tampoco estaría
fundamentalmente prohibido un análisis del 2º corpúsculo polar. En
el caso de la extracción del segundo corpúsculo polar, el período
de tiempo que está disposición para la implantación de la célula
fecundada es, por regla general, manifiestamente más corto que el
período de tiempo que está a disposición después de la extracción
del 1^{er} corpúsculo polar.
Puesto que los óvulos sólo pueden ser fecundados
con éxito en el transcurso de un breve período de tiempo, el
procedimiento debería de ser rápido y permitir una afirmación lo más
confiable que sea posible acerca de la cantidad relativa de los
cromosomas individuales.
Una misión del invento es poner a disposición un
procedimiento para la determinación de la frecuencia relativa de
unos conjuntos parciales delimitables de un material genético, que
se presenta en una pequeñísima cantidad, y que es adecuado para
detectar los cromosomas que están presentes en un corpúsculo polar,
y su cantidad relativa.
El problema planteado por esta misión es
resuelto mediante un procedimiento con las características de la
reivindicación 1. Unas formas ventajosas de realización de esto se
indican en las otras reivindicaciones que dependen de ella.
El problema planteado por esta misión se
resuelve mediante un procedimiento para la determinación de la
frecuencia relativa de unos conjuntos parciales delimitables de un
material genético, siendo amplificado el material genético mediante
una reacción en cadena de la polimerasa (PCR), en cuyo caso se
utilizan unos cebadores, que son complementarios con respecto a
unos sitios de fijación a cebadores, que están presentes en el
material genético en varios lugares, y que están en cada caso
contiguos a una secuencia diana, con una longitud predeterminada,
que es específica en cada caso para un conjunto parcial, de tal
manera que se obtiene un producto de amplificación, que tiene en lo
esencial solamente unas secuencias amplificadas, que comprenden una
secuencia diana con una longitud predeterminada, que es específica
para la respectiva información genética, las cuales son adecuadas
para la detección mediante una hibridación, siendo analizado el
producto de amplificación mediante un experimento de hibridación
para la determinación de la frecuencia relativa de los conjuntos
parciales delimitables.
Se amplifican simultáneamente unas secuencias
dianas, que son diferentes, y que son específicas en cada caso para
un conjunto parcial del material genético. Estas secuencias dianas
son amplificadas, todas ellas, en las mismas condiciones de
reacción. Ellas se presentan en el producto del procedimiento de
amplificación en una concentración en lo esencial más alta que en
procedimientos de amplificación inespecíficos de acuerdo con el
estado de la técnica. De esta manera, son necesarios unos números
más pequeños de ciclos que los que son necesarios de acuerdo con el
estado de la técnica, a fin de producir por medio de una hibridación
unas cantidades detectables de secuencias dianas. Este hecho va
acompañado de una tasa disminuida de errores al realizar la
amplificación, y de un número más pequeño de hibridaciones erróneas
al realizar una detección. El producto del procedimiento permite,
por lo tanto, llevar a cabo unos análisis más rápidos, más seguros
y más expresivos que con los productos de los conocidos
procedimientos de amplificación, en los que se amplifican al mismo
tiempo muchas secuencias diferentes.
El producto de amplificación, producido con el
procedimiento, contiene en lo esencial solamente unas secuencias
amplificadas, que comprenden una secuencia diana con una longitud
predeterminada, que es específica para la respectiva información
genética. El concepto "en lo esencial" puede significar por lo
menos un 80%, de manera preferida un 90% o un 95% de secuencias
dianas específicas.
Para una detección cuantitativa exitosa es
conveniente por motivos estadísticos que los sitios de fijación a
cebadores del o respectivamente de los cebador(es)
utilizado(s) estén dispuestos contiguos a por lo menos 10,
20, 30, 50 ó 100 secuencias dianas específicas de un conjunto
parcial delimitable, de tal manera que sean amplificadas 10, 20,
30, 50 ó 100 secuencias dianas específicas por cada conjunto parcial
delimitable.
El problema planteado por esta misión es
resuelto además por medio de un procedimiento con las siguientes
etapas:
- -
- realización de un procedimiento para la amplificación de informaciones genéticas a partir de un material genético, que comprende varios conjuntos parciales delimitables entre sí de un material genético, de tal manera que se obtiene un producto de amplificación, cuyas secuencias comprenden unas secuencias dianas, que pueden ser asociadas con los conjuntos parciales delimitables, y que se adecua para la detección mediante hibridación,
- -
- una mezcladura del producto de amplificación con unas moléculas captadoras en un chip de ADN, de tal manera que se forman unos híbridos a base de las moléculas captadoras y de partes del producto de amplificación, comprendiendo el chip de ADN por lo menos dos grupos de motas, teniendo las motas situadas dentro de un grupo diferentes moléculas captadoras y estando asociado un grupo de motas en cada caso a uno de los conjuntos parciales delimitables del material genético,
- -
- una detección cuantitativa de los híbridos con diferentes moléculas captadoras del chip de ADN, que se han formado en cada caso en una mota, de tal manera que para cada mota se obtiene en cada caso un valor de detección,
- -
- formación del valor medio de los valores de detección de los conjuntos de motas, que están presentes en el chip de ADN,
- -
- determinación de la frecuencia relativa de conjuntos parciales de un material genético dentro del material genético mediante comparación de los valores medios.
Un tal procedimiento conforme al invento,
mediando utilización de un chip de ADN, permite una formación del
valor medio de los valores de detección de unas señales, que pueden
ser asociadas a unos conjuntos parciales delimitables del material
genético, y tiene la ventaja de que el procedimiento presenta una
alta tolerancia frente al reforzamiento de unos efectos, que en
caso contrario son desventajosos, y que están vinculados con el
procedimiento de amplificación.
En el caso de un procedimiento conforme al
invento, en el que la homología entre los cebadores y los
respectivos sitios de fijación de los cebadores se sitúa en un
intervalo de 80% - 100%, y de manera preferida en un intervalo de
90% - 100%, la proporción de las secuencias dianas en el producto de
amplificación es especialmente alta.
En el caso de un procedimiento, en el que la
distancia entre los sitios de fijación a cebadores y las secuencias
dianas específicas contiguas es de no más que 1.000, de manera
preferida de no más que 300, y en particular de no más que 100
bases, el período de tiempo que se requiere para la realización del
procedimiento es pequeño y la proporción de las secuencias dianas
en el producto de amplificación es especialmente alta.
En el caso de un procedimiento, en el que las
longitudes predeterminadas de las secuencias dianas específicas
están comprendidas entre 15 y 80 bases, y de manera preferida entre
20 y 50 bases, la especificidad de las secuencias dianas para el
respectivo conjunto parcial delimitable se puede garantizar
especialmente bien.
En el caso de un procedimiento, en el que todas
las secuencias dianas específicas tienen en lo esencial las mismas
longitudes, se obtiene una agrupación de secuencias dianas, que
forman híbridos con oligonucleótidos captadores, previstos para su
detección, los cuales tienen unas propiedades muy similares. P.ej.
los híbridos tienen unas similares temperaturas de fusión, cuando
ellos son igual de largos, es decir que son similarmente estables,
y p.ej. la formación de tales híbridos transcurre con unas
velocidades comparables.
En el caso de un procedimiento conforme al
invento, en el que en el transcurso de la reacción en cadena de la
polimerasa se utilizan unos eslabones de nucleótidos provistos de
marcaciones, se obtiene un producto de amplificación, que se puede
detectar fácilmente después de una hibridación de las secuencias
dianas con los correspondientes oligonucleótidos captadores con
ayuda de la marcación que está incorporada en cada caso.
En el caso de un procedimiento conforme al
invento, en el que además se llevan a cabo las etapas de
- -
- mezclar el producto de amplificación con unas moléculas captadoras, de tal manera que se forman unos híbridos a base de las moléculas captadoras y de las secuencias dianas, y de
- -
- detectar los híbridos,
con ayuda del tipo de los híbridos detectados y
de la cantidad que está presente de ellos, se puede realizar una
afirmación acerca de la cantidad y de la presencia de los
respectivos conjuntos parciales delimitables en el material
genético.
En el caso de un procedimiento conforme al
invento, en el que además se llevan a cabo las etapas de
- -
- mezclar el producto de amplificación con unas moléculas captadoras, de tal manera que se forman unos híbridos a base de las moléculas captadoras y de las secuencias dianas, y de
- -
- detectar los híbridos,
y en el que las moléculas captadoras están
dispuestas en un chip de ADN, todos los híbridos que se han formado
pueden ser detectados al mismo tiempo y pueden ser comparados entre
sí en un recinto muy pequeño.
En el caso de un procedimiento conforme al
invento, en el que además se llevan a cabo las etapas de
- -
- mezclar el producto de amplificación con unas moléculas captadoras, de tal manera que se forman unos híbridos a base de las moléculas captadoras y de las secuencias dianas, y de
- -
- detectar los híbridos,
y en el que las moléculas captadoras se componen
de oligonucleótidos, se puede garantizar bien la exactitud de la
hibridación.
En el caso de un procedimiento conforme al
invento, en el que se utiliza un chip de ADN, en el que en una mota
individual están previstas unas moléculas captadoras que son en cada
caso idénticas, con ayuda de la intensidad de la detección dentro
de esta mota se puede realizar una afirmación acerca de la presencia
de una determinada secuencia diana dentro del producto de
amplificación.
En el caso de un procedimiento conforme al
invento, en el que se utiliza un chip de ADN, en el que en una mota
individual están previstas diferentes moléculas captadoras para
diferentes secuencias dianas, todas las cuales están asociadas a
una de los conjuntos parciales delimitables del material genético,
es suficiente la medición de la intensidad en una tal mota:
- -
- a fin de poder realizar una afirmación acerca de la presencia de este conjunto parcial delimitable en el material genético, y
- -
- a fin de poder realizar una afirmación confiable acerca de la cantidad relativa del conjunto parcial delimitable en el material genético en comparación con la intensidad de las otras motas.
Un procedimiento conforme al invento, en el que
el material genético procede de una célula individual o se puede
atribuir a ésta, permite realizar una afirmación rápida, segura y de
alto valor cualitativo acerca de la cantidad de los conjuntos
parciales delimitables en el material genético de la célula
individual.
Un procedimiento conforme al invento, en el que
el material genético es un grupo de cromosomas procedente de un
corpúsculo polar de un óvulo, permite realizar una afirmación rápida
y de alto valor cualitativo acerca de la idoneidad del óvulo para
una fecundación, sin que el óvulo sea dañado.
Un procedimiento conforme al invento, en el que
un conjunto parcial delimitable se compone de uno o varios
cromosomas, permite realizar una afirmación acerca de la integridad
de la composición cromosómica de un material genético.
Un procedimiento conforme al invento, en el que
un conjunto parcial delimitable se compone de uno o varios genes,
permite realizar una afirmación acerca de la presencia de
supresiones o inserciones dentro de un material genético.
Un procedimiento conforme al invento, en el que
es amplificado en paralelo un material genético de referencia, en
unas condiciones de reacción, que son por lo demás idénticas, pone a
disposición un producto de amplificación, que permite, por una
parte, determinar los conjuntos parciales delimitables de un
material genético y su cantidad relativa entre ellos, y que permite
adicionalmente llevar a cabo una verificación de esta
cuantificación.
El procedimiento conforme al invento presenta
unos cebadores, que son complementarios con respecto a los sitios
de fijación a cebadores, que se presentan en varios sitios dentro de
un material genético, y que están en cada caso contiguos a una
secuencia diana que es específica cada vez para un conjunto parcial.
Esto significa que unos sitios de fijación a cebadores, idénticos o
en lo esencial idénticos, están contiguos con respecto a diferentes
secuencias dianas, lo que implica, a su vez, que un cebador
individual o una pareja individual de cebadores es capaz de
amplificar a varias secuencias dianas específicas diferentes.
\newpage
En comparación con las reacciones de PCR
múltiple, constituye una característica esencial del procedimiento
conforme al invento el hecho de que en este caso se obtiene un
producto de amplificación, que tiene en lo esencial solamente unas
secuencias amplificadas, que comprenden una secuencia diana
específica para la respectiva información genética, con una
longitud predeterminada, las cuales son adecuadas para la detección
mediante una hibridación.
Unas amplificaciones conjuntas clásicas de
diferentes cebadores o unos experimentos convencionales de PCR
múltiple parten de grandes cantidades de material, por ejemplo, de
un ADN fetal, de cultivos de células o de sangre de neonatos. Los
procedimientos de perfilamiento por expresión parten de un ARNm; el
ARNm constituye una pequeña selección de lo que está contenido en
un ADN genómico. Se trata de un material de partida que es
totalmente diferente de, por ejemplo, el ADN cromosómico de un
corpúsculo polar. El corpúsculo polar no es activo en transcripción
y, conforme a ello, no contiene ningún ARNm. Todos los métodos, que
se basan en la cuantificación de un ARNm, no son adecuados para la
investigación de corpúsculos polares. Los procedimientos conocidos
no son adecuados, por lo tanto, en particular para la detección de
anomalías cromosómicas de una única célula. Esta prestación la
aporta, por el contrario, el procedimiento conforme al invento.
Según su fundamento, todos los ácidos nucleicos
son ciertamente adecuados para la detección mediante una
hibridación. No obstante, en este caso se presupone que está
presente una cantidad de material, que es suficiente para el
proceso de detección.
Una molécula individual o unas pocas moléculas
de un ácido nucleico diana, que está(n) fijad(as) a una
molécula captadora, no es suficiente en ningún caso para ello. Por
esta razón, se tiene que amplificar el material de la muestra
cuando se trate de una cantidad situada por debajo del límite de
detección.
El procedimiento conforme al invento hace
posible una analítica cuantitativa partiendo de un ADN genómico,
que está contenido en una única célula. Una tal analítica hace
posibles también otros procedimientos.
El procedimiento conforme al invento no se
limita a ser utilizado solamente en conexión con el material de una
célula individual. Esto constituye sólo una aplicación del
procedimiento conforme al invento. El procedimiento se adecua, en
efecto, fundamentalmente para ser empleado en todos los casos en los
que se trata de la detección de unos conjuntos parciales de un
material genético y de su frecuencia relativa dentro de un material
genético global. Para tales detecciones pueden existir otros
procedimientos. Sin embargo, entre los procedimientos conocidos,
ninguno tiene las características y las ventajas del procedimiento
conforme al invento, ni sería aplicable a una célula
individual.
La misión precedente, las características y las
ventajas del presente invento se pueden entender mejor tomando en
consideración la siguiente descripción detallada de las figuras, de
unas formas de realización preferidas y de un ejemplo de
realización del presente invento.
Allí muestran:
La Fig. 1 un diagrama de flujos, que tiene por
objeto un procedimiento de selección para la selección de secuencias
dianas,
La Fig. 2 un diagrama de flujos, que tiene por
objeto un procedimiento de selección para la selección de sitios de
fijación a cebadores y de cebadores,
La Fig. 3 esquemáticamente la intensidad de la
luminiscencia de una selección de puntos de medición sobre la
superficie de un microconjunto conforme al invento,
La Fig. 4 una vista superior sobre un gel de
electroforesis de acuerdo con un ejemplo de realización del
invento,
La Fig. 5 una vista superior sobre una banda en
un gel de electroforesis, y
Las Figs. 6a, 6b unas representaciones
esquemáticas de las superficies de unos microconjuntos conformes al
invento.
En lo que respecta a las características del
invento, que no se han ilustrado precedentemente de una manera más
detallada, se remite, por lo demás, de manera expresa a las
reivindicaciones y a las Figuras.
El invento se ilustra en lo sucesivo con ayuda
de una primera forma de realización y con ayuda de las Figuras.
Dentro del marco de la primera forma de
realización, en el caso del material genético se trata del ADN
genómico (un espermatozoide), que está presente en un conjunto
haploide de cromosomas, y en el caso de los conjuntos parciales
delimitables se trata de todos los cromosomas Chr, que se pueden
presentar en el grupo de cromosomas. El grupo de cromosomas es un
espermatozoide humano, por lo que el número de los conjuntos
parciales delimitables es de 23. Esto corresponde al número de los
cromosomas Chr1 - Chr 23, que están posiblemente presentes en el
grupo de cromosomas.
Para cada conjunto parcial delimitable Chr1,
Chr2,.... Chr23 hay unas secuencias dianas, que constituyen
solamente una parte o un número limitado de los conjuntos parciales
delimitables. Esto significa, que estas secuencias dianas son
únicas para el o respectivamente para los respectivo(s)
cromosoma(s), en el que o los que se presentan estas
secuencias dianas. Para cada cromosoma hay un gran número de tales
secuencias dianas específicas.
Para el procedimiento conforme al invento se
determinan unos cebadores adecuados en un procedimiento de selección
en dos etapas.
La Figura 1 muestra esquemáticamente un
procedimiento de selección para la selección de secuencias dianas.
Este procedimiento comienza con la etapa S1. En la etapa S2 se
determinan todas las posibles secuencias dianas para todos los
conjuntos parciales delimitables. Esto quiere decir que se
determinan todos los posibles segmentos amplificables en el
material genético. Después de esto se determina (en S3), cuales de
estas secuencias dianas son específicas en cada caso para un único
conjunto parcial delimitable. Los conjuntos parciales delimitables
pueden ser p.ej. cromosomas. Una secuencia diana es específica en el
caso de que ella se presenta sólo en un único conjunto parcial
delimitable, pero no en varios de los conjuntos parciales
delimitables.
Para cada conjunto parcial delimitable se
seleccionan varias secuencias dianas diferentes (en S4). De manera
preferida, la selección de las secuencias dianas se efectúa según
unos criterios determinados. P.ej. se prefieren unas secuencias
dianas con un alto poder de diferenciación con respecto a las otras
secuencias dianas, es decir unas secuencias dianas, que tienen una
homología o respectivamente una complementariedad lo más pequeña
que sea posible con respecto a otras secuencias dianas. Además, es
conveniente seleccionar unas secuencias dianas, que tienen unas
similares propiedades de hibridación (p.ej. la temperatura de
fusión, la tasa de formación).
Con la etapa S5 finaliza el procedimiento de
selección.
En un segundo tramo del procedimiento (Fig. 2),
se determina en cada caso un cebador, que es adecuado para la
amplificación, y ciertamente en un procedimiento de selección con
las siguientes etapas:
- a)
- Se determinan unos sitios de fijación a cebadores dentro del material genético (en S7), que se encuentran en contigüidad al extremo 3' de las secuencias dianas determinadas en la primera etapa. En el caso de una reacción de amplificación, un cebador hibridado con estos sitios de fijación a cebadores, es prolongado más allá de la secuencia diana, y se produce un complemento de la secuencia diana.
- b)
- De los sitios de fijación a cebadores, que han sido determinados dentro de a), se seleccionan (en S8) aquellos, que son en lo esencial homólogos entre ellos. En este caso se desechan aquellos sitios de fijación a cebadores que tienen una pequeña homología con respecto a otros de los sitios de fijación a cebadores que han sido determinados dentro de a). El concepto "en lo esencial homólogos" significa que los sitios de fijación a cebadores tienen una homología de por lo menos 80% entre ellos.
- c)
- De los sitios de fijación a cebadores, que han sido determinados dentro de b), se seleccionan (en S9) aquellos, que se encuentran en lo esencial solamente en contigüidad al extremo 3' de una secuencia diana o respectivamente de su complemento. El concepto "en lo esencial solamente" significa en este contexto que por lo menos un 50% de los sitios de fijación a cebadores se encuentra en contigüidad al extremo 3' de una secuencia diana o respectivamente de su complemento. Estos sitios de fijación a cebadores se reúnen para formar un grupo de sitios de fijación a cebadores. Para cada uno de los sitios de fijación a cebadores de este grupo se determina un cebador (S10), que es en lo esencial complementario con todos los sitios de fijación a cebadores del grupo. El concepto "en lo esencial complementario" significa en este contexto, que el cebador, en el caso de unas correspondientes condiciones de reacción, forma híbridos con todos los sitios de fijación a cebadores del grupo.
\vskip1.000000\baselineskip
Los sitios de fijación a cebadores del grupo no
comprenden indispensablemente los sitios de fijación a cebadores,
que son necesarios para la amplificación de todas las secuencias
dianas. Para esto, junto a las dos cadenas de una secuencia diana
se necesita en cada caso un sitio de fijación a cebadores en
contigüidad al respectivo extremo 3' de la secuencia diana, de tal
manera que la secuencia diana es flanqueada por en cada caso dos
sitios de fijación a cebadores.
En caso de que esto ocurra, se puede repetir el
segundo tramo del procedimiento, con el fin de determinar uno o
varios grupos adicionales de sitios de fijación a cebadores y los
correspondientes cebadores.
De esta manera se selecciona(n) un
cebador o unos pocos cebador(es), que forma(n)
híbridos con todos los sitios de fijación a cebadores que son
necesarios para la amplificación de las secuencias dianas. Esto
quiere decir que los sitios de fijación a cebadores se encuentran
en lo esencial solamente en contigüidad al extremo 3' de las
secuencias dianas o respectivamente de sus complementos.
El concepto "amplificar en lo esencial
solamente moléculas dianas" significa que por lo menos un 50% de
las moléculas amplificadas son unas moléculas dianas, que
comprenden unas secuencias dianas, que son específicas para por lo
menos un conjunto parcial delimitable, pero que no se pueden
remontar a todos los conjuntos parciales delimitables.
Se da por entendido que el procedimiento
expuesto de selección puede ser sometido a diversos procesos de
iteración - es decir, que se pueden ponderar distintamente varios
diferentes de los criterios mencionados y que se pueden permutar
unas etapas individuales o se pueden llevar a cabo múltiples veces
en dependencia de los resultados obtenidos antes de ellas. En
particular, esto puede significar también que en una primera etapa
se utilizan unos conocidos cebadores inespecíficos, que hacen
posible la amplificación de las secuencias dianas antes descritas y
tan sólo después de esto se comprueba si ellas cumplen los criterios
de la primera etapa (la especificidad de las secuencias dianas, el
poder de diferenciación, unas similares propiedades de hibridación,
etc.).
Dentro del marco del procedimiento de selección
expuesto se pueden modificar también unos cebadores inespecíficos
de acuerdo con el estado de la técnica, p.ej. como los que se
utilizan dentro del marco de la DOP-PCR o de la
Inter-ALU-PCR, de tal manera que
ellos satisfagan los criterios de selección expuestos.
El material genético que está a disposición del
grupo de cromosomas es sometido a un procedimiento de amplificación.
En este caso, el o los cebador(es) se fija(n) en cada
etapa de hibridación a los sitios de fijación a cebadores, que se
encuentran en contigüidad a los extremos 3' de las secuencias
dianas, de tal manera que en lo esencial son amplificadas solamente
unas moléculas dianas, que comprenden las secuencias dianas.
En el producto de amplificación, cada cromosoma
es representado por un número, que es específico para el respectivo
cromosoma, de diferentes secuencias dianas, que son específicas para
éste.
La reacción de amplificación obedece a la
fórmula Y=Sx(1+E)^{n}, en la que Y es el número de
las copias resultantes de una secuencia diana amplificada, E es la
eficiencia de amplificación, n es el número de los ciclos, y S es
el número de las "copias de partida", que están presentes
originalmente, de una respectiva secuencia diana (una secuencia
diana específica para un cromosoma puede presentarse múltiples veces
en el respectivo cromosoma).
En el espermatozoide o en un corpúsculo polar de
un óvulo desarrollado normalmente, los cromosomas se presentan en
cada caso solamente una vez. En el caso de unas distribuciones
erróneas de cromosomas, unos determinados cromosomas se presentan
en un número que se desvía de éste, p.ej. de 0 ó 2.
Esto significa que, en el caso de unas
amplificaciones de secuencias dianas con solamente una única
molécula como copia de partida (S=1), para realizar una afirmación
cuantitativa se tiene que garantizar experimentalmente que en el
primer ciclo de amplificación se determine y amplifique con
seguridad una secuencia diana definida, que es específica para un
cromosoma, lo cual, sin embargo, no es posible por lo general en lo
que respecta a una molécula individual. Si falla el primer ciclo,
al final sólo habrá sido amplificada la mitad de las copias de
estas secuencias dianas. El error en la amplificación puede estar
situado en una región mayor, en la que también se tiene que
cuantificar (en un factor de 1, 2, 3...) la frecuencia con la que
está presente un cromosoma en un espermatozoide o corpúsculo polar.
Unas afirmaciones cuantitativas en el caso de una única molécula
como secuencia de partida adolecen, por ello, de unas inseguridades
tan altas, que ellas carecen propiamente de valor.
Igualmente, para la eficiencia E se realiza que
ella tiene un valor de 1 sólo en el caso ideal, es decir que en
cada ciclo de la amplificación tiene lugar una duplicación del
material de partida, es decir de todas las copias que están
presentes. Sin embargo, en la realidad nunca existe una eficiencia
ideal, y el valor de E se tiene que suponer siempre como < 1. La
eficiencia depende, por lo demás, de un gran número de factores,
que son difíciles de controlar, p.ej. de la secuencia amplificada en
cada caso y de la longitud de las regiones amplificadas de un
genoma. Ella varía fundamentalmente de un experimento a otro
experimento. Unas pequeñas desviaciones de la eficiencia E con
respecto de la eficiencia ideal de una amplificación 1 provocan unos
efectos muy grandes con unos típicos números de ciclos de los
procedimientos de amplificación de n = 20 - 30.
Con ayuda del procedimiento descrito, para cada
cromosoma que está presente en el espermatozoide o en el corpúsculo
polar se amplifica un gran número de secuencias dianas diferentes,
las cuales son casi todas (por lo menos aproximadamente en un 80%
de ellas) específicas para por lo menos un cromosoma, y ciertamente
con ayuda de un cebador o de unos pocos cebadores. Las
imponderabilidades experimentales de los procedimientos de
amplificación, que resultan de la eficiencia que fluctúa de un
experimento a otro experimento, son excluidas mediante el recurso
de que se amplifican todas las secuencias dianas de una manera
simultánea en un único proceso. Los errores de la amplificación,
que resultan del hecho de que unas determinadas secuencias dianas de
un cromosoma no son amplificadas en el primer ciclo, son
compensados por medio del recurso de que en la primera etapa se
amplifica en cualquier caso una parte esencial de las secuencias
dianas, que son específicas para un cromosoma.
Cuando p.ej. en el primer cromosoma Chr1 de un
grupo de cromosomas están contenidas 26 secuencias dianas
a - z, que sólo se presentan en este cromosoma, y que son amplificadas simultáneamente con ayuda del procedimiento descrito, con un cebador o con unos pocos cebadores, y las secuencias dianas a, b no son amplificadas en el primer ciclo de amplificación, pero sí lo son las secuencias dianas c - z, el error en lo que respecta a las secuencias dianas a, b en el producto de amplificación no tiene ninguna repercusión, siempre y cuando que al final se tome en cuenta la totalidad de las secuencias dianas a - z amplificadas, que son específicas para el cromosoma, con el fin de realizar una afirmación acerca de la cantidad del cromosoma en el espermatozoide o en el corpúsculo polar.
a - z, que sólo se presentan en este cromosoma, y que son amplificadas simultáneamente con ayuda del procedimiento descrito, con un cebador o con unos pocos cebadores, y las secuencias dianas a, b no son amplificadas en el primer ciclo de amplificación, pero sí lo son las secuencias dianas c - z, el error en lo que respecta a las secuencias dianas a, b en el producto de amplificación no tiene ninguna repercusión, siempre y cuando que al final se tome en cuenta la totalidad de las secuencias dianas a - z amplificadas, que son específicas para el cromosoma, con el fin de realizar una afirmación acerca de la cantidad del cromosoma en el espermatozoide o en el corpúsculo polar.
El producto de amplificación se puede poner en
vinculación a continuación con un chip de ADN, sobre cuya superficie
se encuentran unas motas distribuidas en filas y columnas, que
tienen en cada caso las mismas moléculas captadoras. Las moléculas
captadoras pueden formar con las respectivas secuencias dianas unos
híbridos a base de moléculas captadoras y de secuencias dianas. En
este caso, para cada una de las secuencias dianas o para el número
predominante de las secuencias dianas está prevista una
correspondiente mota en el chip. Las motas son específicas para una
secuencia diana en dependencia de las moléculas de sonda que se
encuentran en ellas, y por consiguiente, son específicas para por
lo menos un cromosoma.
Cuando el producto de amplificación es aplicado
en las condiciones de hibridación sobre un tal chip de ADN, se
forman unos híbridos a base de moléculas captadoras y secuencias
dianas. Éstos son detectados a continuación. Siempre y cuando que
la amplificación se hubiera llevado a cabo mediando utilización de
unos nucleótido-trifosfatos provistos de marcadores
de fluorescencia, se recomienda la medición de la intensidad de la
fluorescencia.
Aquellas motas CHr1a - Chr1z, que están
asociadas con las secuencias dianas a - z del cromosoma Chr1,
- -
- siempre y cuando que el cromosoma no hubiese estado presente ninguna vez en el grupo de cromosomas, no tendrán ninguna fluorescencia o sólo tendrán una pequeña fluorescencia, que se debe atribuir a unas impurezas,
- -
- siempre y cuando que el cromosoma hubiese estado presente una vez o múltiples veces en el grupo de cromosomas, tendrán en promedio una intensidad de la fluorescencia I_{Chr1}.
\vskip1.000000\baselineskip
En el caso de que las secuencias dianas a, b del
cromosoma 1 sean amplificadas con una mala eficiencia, este hecho
conduce a unas motas Chr1a, Chr1b en las que no se mide ninguna
intensidad de fluorescencia o se mide sólo una pequeña intensidad
de fluorescencia, lo que se representa en la Figura 3 en forma de
puntos de medición sin esgrafiado. En el caso de que las secuencias
dianas c - z restantes sean amplificadas con una alta eficiencia,
en las motas
Chr1c - Chr1z se medirá una intensidad de fluorescencia correspondientemente alta, lo que se representa en la Figura 3 como unos puntos de medición con un esgrafiado de líneas. Siempre y cuando que el cromosoma Chr1 esté presente una vez en el grupo de cromosomas, y que el cromosoma 2 esté presente dos veces en el grupo de cromosomas, la intensidad media I_{Chr1} de la fluorescencia de las motas Chr1a - Chr1z asociadas con el cromosoma 1 tendrá la mitad de la magnitud de la intensidad media I_{Chr2} de la fluorescencia de las motas Chr2a - Chr2z asociadas con el cromosoma 2, lo que se representa en la Figura 3 con un esgrafiado cruzado.
Chr1c - Chr1z se medirá una intensidad de fluorescencia correspondientemente alta, lo que se representa en la Figura 3 como unos puntos de medición con un esgrafiado de líneas. Siempre y cuando que el cromosoma Chr1 esté presente una vez en el grupo de cromosomas, y que el cromosoma 2 esté presente dos veces en el grupo de cromosomas, la intensidad media I_{Chr1} de la fluorescencia de las motas Chr1a - Chr1z asociadas con el cromosoma 1 tendrá la mitad de la magnitud de la intensidad media I_{Chr2} de la fluorescencia de las motas Chr2a - Chr2z asociadas con el cromosoma 2, lo que se representa en la Figura 3 con un esgrafiado cruzado.
Puede presentarse el caso de que una secuencia
diana aa, que es específica para el cromosoma Chr1, sea al mismo
tiempo específica para otro cromosoma, pero no para todos los
cromosomas de un grupo de cromosomas. Cuando los dos cromosomas se
presentan con la misma frecuencia en una muestra, la intensidad de
la fluorescencia medida en la mota asociada a este secuencia diana
aa será aproximadamente el doble de la que se mide en las motas,
cuya secuencia diana sólo se presenta en un cromosoma.
Para el análisis del producto de la
amplificación descrita están a disposición de un experto en la
especialidad un gran número de otros experimentos de hibridación
adicionales. Así, las secuencias amplificadas se pueden analizar,
por ejemplo, también mediante métodos de electroforesis, de
electroforesis capilar o de espectrometría de masas.
Seguidamente, el invento se ilustra más
detalladamente con ayuda de una segunda forma de realización.
La información genómica de un grupo de
cromosomas humanos es amplificada mediante un procedimiento de
amplificación, conteniendo el producto de amplificación un gran
número de secuencias dianas, y pudiéndose asociar con cada uno de
los cromosomas que están presentes en el corpúsculo polar, unas
secuencias dianas, que sólo se presentan en este cromosoma o que
proceden de éste.
El producto de amplificación se pone en
vinculación con un chip de ADN, en el que cada cromosoma está
representado por 10 motas. En este caso, en una mota están
contenidos en cada caso unos oligonucleótidos captadores, que
pueden formar híbridos con unas secuencias dianas que son
específicas para un cromosoma. En este caso, en una mota están
contenidos 10 oligonucleótidos captadores diferentes, que pueden
formar híbridos con unas secuencias dianas, las cuales se
diferencian entre sí, pero que pueden ser asociadas todas ellas con
el mismo cromosoma. Lo mismo es válido para las otras nueve motas,
que están asociadas con el mismo cromosoma. En el caso de un
cromosoma Chrn, del que se pueden capturar en el chip 26 secuencias
dianas a - z por medio de oligonucleótidos captadores, las motas
están mezcladas de la siguiente manera: en la primera mota Chrn/1 se
encuentran unas moléculas captadoras para las secuencias dianas a -
j, en la segunda mota Chrn/2 se encuentran unos oligonucleótidos
captadores para las secuencias dianas j - t, en la tercera mota
Chrn/3 se encuentran unos oligonucleótidos captadores para las
secuencias dianas u - d, en la cuarta mota Chrn/4 se encuentran unos
oligonucleótidos captadores para las secuencias dianas e - o, en la
quinta mota Chrn/5 se encuentran unos oligonucleótidos captadores
para las secuencias dianas p - z, en la sexta mota Chrn/6 se
encuentran unos oligonucleótidos captadores para las secuencias
dianas a, c, e, g, i, k, m, o, q, t, en la séptima mota Chrn/7 se
encuentran unos oligonucleótidos captadores para las secuencias
dianas b, d, f, h, j, l, n, p, r, t, en la octava mota Chrn/8 se
encuentran unos oligonucleótidos captadores para las secuencias
dianas m, n, o, p, q, r, w, x, y, z, v, en la novena mota Chrn/9 se
encuentran unos oligonucleótidos captadores para las secuencias
dianas a, e, i, j, m, n, o, p, r, s, y en la décima mota Chrn/10 se
encuentran unos oligonucleótidos captadores para las secuencias
dianas a, b, c, d, e, v, w, x, y, z. Para cada uno de los 23
cromosomas Chr1 - Chr23 de un grupo de cromosomas que procede de un
óvulo humano, que están presentes posiblemente en un grupo de
cromosomas, en el chip están previstas 10 de tales motas Chrn/1 -
Chrn/10, en las que se han mezclado, tal como se acaba de exponer,
en cada caso 10 de 26 oligonucleótidos captadores, que se pueden
hibridar con unas secuencias dianas, que son amplificadas
fundamentalmente dentro del marco de una amplificación inespecífica,
cuando el cromosoma, para el que son específicas las respectivas
secuencias dianas, está presente en el grupo de cromosomas.
El producto de amplificación es aplicado sobre
el chip de ADN. En este caso los oligonucleótidos captadores se
hibridan con las secuencias dianas a - z, que son complementarias
con éstos, en cada caso de un cromosoma. Dentro del marco de la
amplificación se incorporó un agente de marcación en las secuencias
dianas amplificadas (un marcador fluorescente
Cy-3). El chip se lava, y simultáneamente se
determina la fluorescencia de las motas individuales. En este caso,
se determina la intensidad I_{Chrn/x} de cada mota individual x,
que es asociada con un cromosoma n. Todas las intensidades
I_{Chrn/x} de un cromosoma n se utilizan para la formación del
valor medio de la intensidad de las motas, que son específicas para
un cromosoma (la intensidad media resultante es: I_{n}). Las
intensidades I_{1}-I_{23} se comparan unas con
otras. Si el orden de magnitud de la intensidad media de las motas,
que están asociadas con un cromosoma, es aproximadamente = 0,
entonces este cromosoma no está contenido en el grupo de
cromosomas. Si la intensidad media de las motas, que están asociadas
con un cromosoma, tiene un valor que corresponde a la mayoría de
las demás intensidades restantes, entonces de esto se saca la
conclusión de que el cromosoma, con el que están asociadas estas
motas, se presenta exactamente una vez en el grupo de cromosomas.
Si la intensidad media de las motas, que representan a un cromosoma,
es el múltiplo doble, triple o más veces mayor que las intensidades
restantes, se ha de partir del hecho de que estos cromosomas se
presentan dos, tres, cuatro o más veces en el grupo de
cromosomas.
La frecuencia de unas secuencias dianas
determinadas dentro de un cromosoma puede ser alta o baja. Esta
frecuencia se debe de tomar en cuenta eventualmente mediante una
determinación de un factor correspondiente, o respectivamente de la
influencia de la frecuencia de las copias de partida de una
secuencia diana sobre la formación de determinados híbridos en una
mota después de haber llevado a cabo una amplificación paralela. La
frecuencia de las secuencias dianas de un determinado cromosoma
puede depender también del tamaño del respectivo cromosoma. Los
efectos que resultan de esto se han incluir eventualmente asimismo
en un correspondiente factor de corrección, que se aprovecha en la
evaluación.
El hecho de que todos los cromosomas de un grupo
de cromosomas se presenten dos veces en éste, es muy improbable,
por lo que la afirmación realizada con ayuda de un procedimiento
conforme al invento acerca de la cantidad de los cromosomas en un
grupo de cromosomas es bastante segura. Con el fin de aumentar esta
seguridad, sin embargo, paralelamente se puede amplificar al mismo
tiempo conjuntamente o en paralelo una muestra de referencia y
analizar a ésta simultáneamente con la muestra que se ha de
investigar.
Si una de las motas de tal chip de ADN falla por
motivos de producción, p.ej. porque fue aplicada defectuosamente,
entonces están a disposición todavía nueve motas adicionales, para
poder realizar afirmaciones acerca de la cantidad relativa de un
cromosoma en el grupo de cromosomas. Mediante la mezcladura de unas
secuencias captadoras diferentes para un cromosoma, pero que son
específicas para unas secuencias dianas de éste, en una mota -
también en el caso de presentarse unas eficiencias desiguales de la
amplificación en lo que se refiere a la respectiva secuencia diana
- cada mota tendrá una intensidad medible - siempre y cuando que
estuviese presente un correspondiente material de partida en el
grupo de cromosomas - la cual corresponde a un valor medio
estadístico. Cada mota considerada por sí misma, por lo tanto, es
ya más expresiva que una mota, en la que se hubiese previsto
solamente un tipo de moléculas captadoras. Mediante la previsión de
varias de tales motas mixtas por cada cromosoma, las cuales tienen
además unas moléculas captadoras mezcladas diferentemente, se pueden
excluir las inexactitudes en la amplificación de mejor modo que
según los procedimientos actuales.
Si se ponen en relación entre sí las
intensidades medidas de las primera, segunda, tercera, .... décima
motas mixtas 1, 2, 3, ...10, que son asociadas en cada caso con uno
de los cromosomas Chr1 - Chr23 de un grupo de cromosomas, entonces
se obtienen 10 afirmaciones diferentes acerca de la presencia
cuantitativa de los hasta 23 cromosomas que se presentan
normalmente en un grupo de cromosomas humanos. Esto corresponde a
una verificación múltiple del resultado de un análisis.
En lugar de 10 diferentes motas, tal como se
acaba de exponer, para cada cromosoma puede estar prevista también
solamente una mota, que - según una variante del ejemplo de
realización - contiene 26 moléculas captadoras, que corresponden a
las secuencias dianas a-z de un cromosoma. Se hace
innecesaria una formación por cálculo del valor medio - el valor
medio de la intensidad de todos los híbridos que son específicos
para un cromosoma se establece mediante de la mezcladura de las
moléculas captadoras, que está prevista en cada caso en una
mota.
A partir del número determinado de los
cromosomas que están presentes en un grupo de cromosomas se puede
sacar una conclusión directamente acerca del número de los
cromosomas en el óvulo. De esta manera se puede comprobar la
integridad cromosómica de un óvulo con una alta seguridad.
Las moléculas captadoras, que se encuentran
dentro del marco del invento, se componen de manera preferida de
oligonucleótidos sintéticos. Sin embargo, ellas pueden comprender
también: ADN, ADNc, ARN, ARNa, LAN, y/o ácidos nucleicos
modificados de otra manera distinta.
\newpage
Ejemplo de
realización
En lo sucesivo se describe el invento con ayuda
de un ejemplo concreto de realización. Para la amplificación del
material cromosómico, que se había aislado en cada caso a partir de
una célula individual, se seleccionó el siguiente cebador de
acuerdo con el procedimiento de la Figura 2:
- Ale1-k
- 5'-CCAAAGTGCTGGGATTACAG-3'
Con esta secuencia de cebador se lleva a cabo
una amplificación por PCR en las siguientes condiciones: varias
muestras diferentes se calientan a 95ºC primeramente durante cinco
minutos, a continuación se calientan 35 veces durante 30 segundos a
95ºC, durante 30 segundos a 62ºC y durante 30 segundos a 72ºC. Al
final del último ciclo se atemperan las muestras durante 10 minutos
a 72ºC y a continuación se enfrían a 4ºC.
El cebador Ale1-k se ha
acreditado como extraordinariamente eficiente en el caso de la
realización del procedimiento conforme al invento. Al intercambiar
solamente una base por otra base diferente, el cebador puede cumplir
todavía su función, en particular cuando solamente están afectadas
las regiones situadas en los extremos del cebador. También la
supresión de dos bases situadas en los extremos en el cebador puede
conducir todavía a unos resultados útiles. Tales modificaciones,
que son conocidas para un experto en la especialidad, conducen no
obstante a unas considerables pérdidas de calidad. Cuando se
intercambian o suprimen más de dos bases del cebador conforme al
invento, ya casi no es realizable el procedimiento conforme al
invento. El hecho de que el cebador cumple su función se ilustra en
lo sucesivo con ayuda de las Figuras 4 y 5.
Los productos de amplificación se aplican sobre
un gel y son sometidos a una electroforesis en gel. En la Figura 4
se reproduce una vista desde arriba sobre el gel de electroforesis
resultante. En ella se pueden reconocer, dispuestas de izquierda a
derecha, 9 trazas 1 - 9. La traza 1 es el patrón del peso molecular,
la traza 2 es un testigo negativo, y las trazas
3 - 9 son unos modelos idénticos de diferentes muestras en cada caso con una célula haploide como material de partida.
3 - 9 son unos modelos idénticos de diferentes muestras en cada caso con una célula haploide como material de partida.
En el gel mostrado en la Figura 4 se pueden
detectar unas secuencias, que se habían predicho con ayuda de un
ordenador de acuerdo con un procedimiento tal como el que se ha
representado en la Figura 1.
A modo de ejemplo se mencionan dos secuencias:
SHGC-6833 y RH102636, que se pueden encontrar bajo
su respectiva denominación en la base de datos del NCBI. Las dos
secuencias son una parte constituyente de las secuencias
específicas amplificadas por medio de Ale1-k. La
SHGC-6833 se puede encontrar específicamente en el
cromosoma 21. La secuencia (en lo sucesivo designada en inglés
"sequence tagged site sequence" o respectivamente secuencia de
STS) de SHGC-6883 es la siguiente:
Si se hibrida con una sonda de STS marcada, es
decir con un complemento con respecto a la secuencia de STS, en el
que está incorporado un agente de marcación, en el gel mostrado en
la Figura 4 (traza 3), entonces se obtiene una señal específica con
el tamaño esperado, tal como se representa en la Figura 5. Esta
señal constituye la prueba de la presencia de la
SHGC-6833 en el material de partida, y por
consiguiente, de su presencia en el cromosoma 21.
La RH102636 se puede encontrar específicamente
en el cromosoma 1. La secuencia de RH-102636 es la
siguiente:
La detección de la RH-102636 en
el gel constituye al mismo tiempo la prueba de que la
RH-102636 estaba presente en el material de
partida, y por consiguiente, la prueba de la presencia del cromosoma
1.
La respectiva secuencia sólo se presenta una
única vez en el respectivo cromosoma. Allí donde la intensidad de
la fluorescencia de las dos detecciones de secuencias es
aproximadamente la misma, se puede realizar la afirmación de que
los cromosomas 1 y 21 están presentes en la respectiva muestra en
unas proporciones idénticas.
En un ordenador (in silico) se predijeron otras
secuencias adicionales, cada una de las cuales se presenta sólo una
vez en un determinado cromosoma. Una recopilación acerca de las
secuencias, que se han predicho hasta ahora en el ordenador, se
deduce de la Tabla 1.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Allí, en la primera columna se designa el
respectivo cromosoma humano. En la segunda columna, para los
respectivos cromosomas se indica el número de los diferentes
productos de amplificación, predichos en el ordenador, de una
amplificación con Ale1-k. Casi todos los productos
de amplificación, que están contenidos en la segunda columna, son
específicos. En la tercera columna se expone el número de las
secuencias específicas para el respectivo cromosoma (secuencias de
STS), que se conocen y se han publicado hasta la fecha, las cuales
son accesibles en bases de datos públicas, y que representan en
cada caso un conjunto parcial de los respectivos productos de PCR
en la columna 2. En la cuarta columna se indica el número de los
sitios de fijación al cebador para Ale-1k en el
respectivo cromosoma. Puesto que el cebador no siempre tiene un
sitio de fijación en una contigüidad respecto a un primer sitio de
fijación, que es necesaria para una amplificación exitosa de un
segmento, en el cual él también se puede hibridar de una manera
complementaria en la dirección inversa, no siempre resulta
automáticamente un producto de PCR. En el caso del cebador
Ale1-k conforme al invento esto sucede solamente en
una parte fraccionaria. Así, se podría estimar que en el caso de
71.485 sitios de fijación al cebador del cromosoma 1, resultarían
aproximadamente 35.000 productos de PCR, cuyo número, no obstante,
es solamente de 4.512.
Un chip de ADN o microconjunto, que se emplea
para el análisis de una mezcla de reacción obtenida a partir de una
amplificación conforme al invento, puede estar equipado tal como se
representa esquemáticamente en la Figura 6a o Figura 6b.
Una posibilidad consiste en prever para cada
secuencia de STS solamente un punto de medición separado. En un tal
punto de medición se encuentran sólo moléculas captadoras, que pasan
a formar específicamente un híbrido con la correspondiente
secuencia de STS o con un segmento de ésta. Una detección de la
fluorescencia en un punto de medición significa entonces que esta
secuencia estaba presente en la muestra. Para el cromosoma 1 pueden
estar previstos, por ejemplo, hasta 30 diferentes puntos de medición
en un microconjunto. Cuando en el caso de la amplificación se
amplifica mal una de 30 de las secuencias de STS que son detectables
en el microconjunto para el cromosoma 1, por ejemplo, puesto que en
el primer ciclo de amplificación, en el caso de esta secuencia el
cebador no se ha fijado al previsto sitio de fijación del cebador,
todavía están a disposición 29 secuencias adicionales, cuya
detección representa simultáneamente una prueba de la presencia del
cromosoma 1 en la muestra. Cuando uno de tales errores en la
amplificación conduce a una disminución de la cantidad amplificada
de esta secuencia en relación con las otras secuencias, en el punto
de medición, que representa a esta secuencia, se podrá observar una
intensidad más baja de la fluorescencia que en los otros puntos de
medición (el punto de medición sin esgrafiado situado arriba a la
izquierda en la Figura 6a). Mediante el hecho de que para otros 29
productos de amplificación, que son específicos para el cromosoma 1,
está previsto en cada caso un punto de medición en el
microconjunto, el producto de amplificación defectuoso puede ser
identificado como tal. En la evaluación para la determinación de la
cantidad relativa del cromosoma 1 participan entonces solamente
algunos de los demás 29 puntos de medición restantes (puntos de
medición 2 - 29 con esgrafiado de líneas en la primera columna del
microconjunto mostrado en la Figura 6a). Si su intensidad se puede
equiparar aproximadamente a la intensidad, que se mide en unos
puntos de medición que representan específicamente en cada caso a
una secuencia de STS del cromosoma 2, entonces de esto se deduce que
las cantidades de las respectivas secuencias de STS amplificadas de
los cromosomas 1 y 2 son aproximadamente iguales (columna 2 de los
puntos de medición representados en la Figura 6a con un esgrafiado
de líneas). De esto se deduce, a su vez, que los cromosomas 1 y 2
se presentan en la muestra afectada en la misma relación
cuantitativa entre sí. Si el cromosoma 3 está contenido en la
muestra el doble de veces que los demás cromosomas restantes, en los
correspondientes puntos de medición se puede observar una
intensidad de fluorescencia duplicada en comparación con los demás
puntos de medición restantes (puntos de medición con un esgrafiado
cruzado, tercera columna en la Figura 6a). Unos puntos de medición
individuales, que, debido a unos errores en la amplificación, que se
presentan regularmente en el caso de una amplificación a partir de
una muy pequeña cantidad de material de partida, no tienen ninguna
intensidad de fluorescencia o tienen solamente una escasa intensidad
de fluorescencia, tal como se acaba de exponer en lo que respecta
al primer punto de medición referido al cromosoma 1, no constituyen
ningún obstáculo para el análisis, siempre y cuando que se
amplifique correctamente por lo menos una secuencia de STS por cada
cromosoma. La probabilidad de que, debido a unos errores en la
amplificación, todas las secuencias de STS de un cromosoma sean
amplificadas peor que las secuencias de STS de otro cromosoma
distinto, es estadísticamente muy pequeña. Un microconjunto, en el
cual están previstas en cada caso en diferentes puntos de medición
unas moléculas captadoras, que se presentan allí en unas
concentraciones iguales, y que forman en cada caso unos híbridos
con una secuencia de STS específica de la Tabla 1, es, por lo tanto,
sobresalientemente adecuado para realizar de una manera rápida y
confiable unas afirmaciones acerca de la cantidad relativa de los
cromosomas en una muestra, que se había amplificado por medio de
Ale1-k.
En un punto de medición de un microconjunto
conforme al invento pueden estar contenidas también unas moléculas
captadoras, que pueden pasar a formar híbridos con todas las
secuencias de STS, que son específicas para un determinado
cromosoma, o con un determinado número de tales secuencias. Un tal
microconjunto se representa esquemáticamente en la Figura 6a. Para
cada mota se indica el cromosoma para cuya detección ha de servir
éste. Cuando en un punto de medición individual se pueden detectar
todas las secuencias de STS, que son específicas en cada caso para
uno de los cromosomas de la Tabla 1, las intensidades relativas de
los híbridos detectados al realizar la evaluación de las señales se
comportan entre sí igual que el número de las secuencias de STS
detectadas por cada cromosoma (por lo tanto, como máximo
aproximadamente 1:10, cromosoma 19: cromosoma 1, representado en la
Figura 6b mediante un esgrafiado cruzado en la mota Chr1 y mediante
un esgrafiado de líneas en la mota Chr19; las motas o los puntos de
medición restantes no se han esgrafiado por motivos de buena
visibilidad).
También es adecuado un microconjunto, en el que
en unos puntos de medición individuales se pueden detectar
diferentes secuencias de STS, pero no todas las secuencias de STS,
que son específicas para un cromosoma. En el caso de la evaluación
de las intensidades medidas, éstas se han de ponderar de manera
correspondiente. Finalmente, en un microconjunto pueden estar
integrados diferentes tipos de puntos de medición, es decir que el
microconjunto puede tener unos puntos de medición, que corresponden
a los que se han representado en la Figura 6a, unos puntos de
medición, que corresponden a los de la Figura 6b, o unos puntos de
medición, tal como los que se acaban de describir. Mediante la
integración de un gran número de diferentes puntos de medición en
un único microconjunto, están a disposición todos los tipos posibles
presentados de evaluación, de tal manera que los resultados se
pueden verificar mejor. De esta manera, los procedimientos conformes
al invento se vuelven especialmente fiables.
\newpage
En las formas de realización expuestas y en el
ejemplo de realización se ilustró el invento con el Ejemplo de un
análisis de espermatozoides. Los procedimientos descritos se pueden
aplicar también a otro material genético diferente que el del
genoma, que está contenido en un espermatozoide, en particular que
el del genoma que está contenido en una célula individual humana o
en un corpúsculo polar humano, y a sus cromosomas. Además, el
procedimiento descrito se puede aplicar a determinadas supresiones o
inserciones en forma de unos conjuntos parciales delimitables
dentro de un material genético, p.ej. dentro de un cromosoma
individual o de un segmento de éste como material genético.
\vskip1.000000\baselineskip
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Documento WO 02144411
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Dr. Med Karl-Philip Gloning y colaboradores.
Claims (15)
1. Procedimiento para la determinación de la
frecuencia relativa de unos conjuntos parciales delimitables de un
material genético, siendo amplificado el material genético mediante
una reacción en cadena de la polimerasa, en la que se utilizan unos
cebadores, que son complementarios con unos sitios de fijación a
cebadores, que están presentes en el material genético en varios
sitios, y que están en cada caso contiguos con respecto a una
secuencia diana, que tiene una longitud predeterminada, y es
específica en cada caso un conjunto parcial, de tal manera que se
obtiene un producto de amplificación, que en lo esencial tiene
solamente unas secuencias amplificadas, que comprenden una
secuencia diana, que tiene una longitud predeterminada, y es
específica para la respectiva información genética, la cual es
adecuada para la detección mediante hibridación, siendo analizado
el producto de amplificación mediante un experimento de hibridación
para la determinación de la frecuencia relativa de los conjuntos
parciales delimitables.
2. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1,
caracterizado porque la homología entre
los cebadores y los respectivos sitios de fijación a cebadores se
sitúa en un intervalo de 80% - 100%, y de manera preferida en un
intervalo de 90% - 100%.
3. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1-2,
caracterizado porque en el transcurso de
la reacción en cadena de la polimerasa se utilizan unos eslabones
de nucleótidos provistos de marcaciones.
4. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1-3,
caracterizado por
- -
- una mezcladura del producto de amplificación con unas moléculas captadoras, de tal manera que se forman unos híbridos a base de las moléculas captadoras y de las secuencias dianas específicas, y
- -
- una detección de los híbridos.
\vskip1.000000\baselineskip
5. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 4,
caracterizado porque las moléculas
captadoras están dispuestas en un chip de ADN.
\vskip1.000000\baselineskip
6. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 4,
caracterizado porque las moléculas
captadoras están constituidas por oligonucleótidos.
\vskip1.000000\baselineskip
7. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1-6,
caracterizado porque en él se utiliza un
chip de ADN, en el que en una mota individual están previstas en
cada caso las mismas moléculas captadoras.
8. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1-7,
caracterizado porque en él se utiliza un
chip de ADN, en el que en una mota individual están previstas
diferentes moléculas captadoras específicas para diferentes
secuencias dianas, todas las cuales son asociadas a uno de los
conjuntos parciales delimitables del material genético.
9. Procedimiento para la determinación de la
frecuencia relativa de unos conjuntos parciales delimitables de un
material genético de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 8,
con las siguientes etapas:
- -
- realización de un procedimiento para la amplificación de informaciones genéticas a partir de un material genético, que comprende varios conjuntos parciales delimitables entre sí de un material genético, de tal manera que se obtiene un producto de amplificación, que comprende unas secuencias dianas, que se adecuan para la detección mediante hibridación y que pueden ser asociadas a los conjuntos parciales delimitables,
- -
- mezcladura del producto de amplificación con unas moléculas captadoras en un chip de ADN, de tal manera que se forman unos híbridos a base de las moléculas captadoras y de unas secuencias dianas procedentes del producto de amplificación, comprendiendo el chip de ADN por lo menos dos grupos de motas, teniendo las motas situadas dentro de un grupo diferentes moléculas captadoras y estando asociado un grupo de motas en cada caso a una de los conjuntos parciales delimitables del material genético,
- -
- detección cuantitativa de los híbridos, que se han formado en cada caso en una mota, con diferentes moléculas captadoras del chip de ADN, de tal manera que para cada mota se obtiene en cada caso un valor de detección,
- -
- formación de un valor medio de los valores de detección de los grupos de motas, que están presentes en el chip de ADN,
- -
- determinación de la frecuencia relativa de unos conjuntos parciales de un material genético dentro de un material genético mediante comparación de los valores medios.
\vskip1.000000\baselineskip
10. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1-9,
caracterizado porque el material genético
procede de una célula individual o se puede atribuir a ésta.
\vskip1.000000\baselineskip
11. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1-9,
caracterizado porque el material genético
es un grupo de cromosomas procedente de un corpúsculo polar de un
óvulo.
\vskip1.000000\baselineskip
12. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1-9,
caracterizado porque un conjunto parcial
delimitable se compone de uno o varios cromosomas.
\vskip1.000000\baselineskip
13. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1-9,
caracterizado porque un conjunto parcial
delimitable se compone de uno o varios genes.
\vskip1.000000\baselineskip
14. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1-9,
caracterizado porque se amplifican
paralelamente unas informaciones genéticas acerca de un material
genético de referencia en unas condiciones de reacción que son por
lo demás las mismas, de tal manera que se obtiene un producto de
amplificación, que tiene en lo esencial solamente secuencias
amplificadas, que comprenden unas secuencias dianas con una
longitud predeterminada, que son específicas para la respectiva
información genética, las cuales se adecuan para la detección
mediante hibridación.
15. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1-14, en el que para la
amplificación se utiliza el cebador Ale1-k, que
tiene la secuencia de bases
5'-CCAAAGTGCTGGGATTACAG-3'.
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