JP2006506054A - 遺伝情報の増幅のための方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、遺伝情報の増幅のための方法であって、ここで、極めて小さなサンプル量から非制限的部分量の遺伝物質の頻度を分析することが可能である方法に関する。本発明の方法は、それぞれの部分量の特異的標的配列の平行増幅およびその同時定性分析ならびにその後の相対量分析を可能にし、ここで、多くの標的配列を含有するいくつかの高濃度増幅産物および品質的に高い値の増幅産物が提供される。

Description

本発明は、遺伝物質の遺伝情報の増幅のための方法であって、遺伝情報が区別可能な部分量の遺伝物質に割り当てられ得る方法に関する。

遺伝物質内の部分量とは、例えば、ゲノム内の染色体である。この場合、染色体は、いくつかの異なる染色体を含有する部分量のゲノムを表す。しかし、区別可能な部分量はまた、個々の染色体内の欠失および／または挿入であってもよい。この場合、欠失および／または挿入は区別可能な部分量を表し、個々の染色体は遺伝物質を表す。染色体由来の遺伝情報は、例えば、この染色体上にのみ生じる、即ち、この染色体に特異的である標的配列である。

区別可能な部分量がゲノムの異なる染色体を表す系は、例えば、極体である。

極体は、脊椎動物において、卵細胞の形成および成熟中に発達し、関連するタイプを再生するのに必要である。

ヒトの場合、子供のいないカップルまたは女性に対し、子供を切望する彼らの要求を満たすための生殖補助医療が提供され得る。現在、この目的のために利用可能ないくつかの手順が存在し、卵細胞あたり約１０％の平均妊娠率が得られている。卵細胞の極体を介して行われる間接的分析により、高い割合の卵細胞が個々の染色体について不均衡配分を有することが示されている。これらの異数体は、胚の生育不能をもたらし、生殖補助医療後の着床率が低いようである。

母集団中、すべてのカップルのうち約１０％は、欲しくない訳ではないが子供ができない状態である。不妊の理由は、一方では女性または男性の有機的欠損によるが、これらは遺伝的原因をも有し得る。流産の７０％までについては、遺伝的原因、主に染色体の不均衡配分に原因があり得る（グリフィン(Griffin) １９９６）。

これらの染色体異数体は、主に、卵円孔開存形成の不完全性による（アンゲル(Angell) １９９３）。精子形成において、わずか２〜４％の異数性細胞しか認められない（ゼンセス(Zenses) １９９２）。これらおよび他の原因により、天然の条件下では、すべての受精卵細胞のうち高い割合が無傷の妊娠には至らないという事実がもたらされる。

既に記載のように、子供のいないカップルまたは女性に対し、体外受精または例えば、卵細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ）などの別の生殖補助医療方法が提供され得る。現在利用可能な体外受精方法により、卵細胞あたり１０％の平均妊娠率を得ることができる。大規模研究の分析により、３５歳を超える女性の妊娠率は顕著に低下し、４０歳を超える女性では１０％未満である。このことは、年齢が３５歳を超える母親は、染色体不均衡配分を伴う子供の危険率が増加するという観察を支持する。

出生前診断では、少なくとも診断時まで生存可能である染色体不均衡配分を伴うこれらの子供しか診断されない。従って、これらの多くの子供は妊娠の過程で死亡するため、例えば、羊水穿刺の時点では、誕生時よりも多くのトリソミーまたはモノソミーを伴う子供が認められる。

トリソミーについて考慮する場合、本質的に、２１トリソミーまたは１本の過剰を伴うかあるいはＸもしくはＹ染色体を欠く子供のみが生存可能である。上記の低着床率は、着床が認められないかまたは極めて早期の流産のいずれかをもたらす他の染色体に関する卵細胞の異数体によっても説明することができる。このことは、流産実質に対する染色体分析によって支持される。

卵細胞の成熟中、初期の二倍体卵細胞はその染色体相補体を減少しなければならない。このプロセスは、第１および第２の成熟分裂中に完了する。第１の成熟分裂（１回目の減数分裂）では、相同染色体が分離する。第２の成熟分裂では、染色分体が分離する。極体の形態のそれぞれの場合において、得られる娘細胞の遺伝物質が卵細胞の囲卵腔に移行する。それらの細胞では、極体は細胞に対応するが、最小限の細胞質内容物しか有さない。第１の極体は排卵中に生じる一方、第２の極体は、精子が卵細胞に侵入した３〜４時間後に抽出される。２つの極体は、それらの遺伝物質の量が異なる。第１の極体は２つの染色分体（２ｎ）を伴う２３本の染色体を含有する一方、第２（成熟卵細胞に類似する）は、ただ１つの染色分体（１ｎ）のみを伴う２３本の簡単な染色体のみを有する。極体はまったく機能を有さず、胚の早期発達において吸収される。胚の生物学的重要性については知られていない（Controversies in Obsterics,Gynaecology&Infertility、チェコ共和国プラハ（Prague,Czech Republic）における第１回世界会議の「着床前遺伝子診断、極体生検(Preimplantation Genetic Diagnosis,Polar Body Biopsy)」、１９９９年、Ｙ.バーリンスキー(Y.Verlinsky)、Ａ.クリエ(A.Kuliew)の要約、およびに出生前医学センター(Prenatal Medical Centre)、ミュンヘン(Munich)、医学博士カール−フィリップ グローニング(Karl-Philip Gloning)ら、極体診断に関するパンフレットを参照のこと）。Controversies in Obsterics,Gynaecology&Infertility、チェコ共和国プラハ(Prague,Czech Republic)における第１回世界会議の「着床前遺伝子診断、極体生検(Preimplantation Genetic Diagnosis,Polar Body Biopsy)」、１９９９年、Ｙ.バーリンスキー(Y.Verlinsky)、Ａ.クリエ(A.Kuliew)の要約では、極体のサンプリングを想定している「配列試験」による第１および第２の極体の分析が開示されている。１７９例の人工妊娠が成功し、この介入による障害が認められない１３５例の健常な子供が出生した。

Ｍ.モンタグ(M.Montag)、Ｋ.ファン・デル・ベン(K.van der Ven)、Ｈ.ファン・デル・ベン(H.van der Ven)「独国における極体診断による初めての臨床経験(Erste klinische Erfahrungen mit der Polkoerperchendiagnostik in Deutschland)」は、極体診断を使用する妊娠率が十分に高い診断に従って、独国における極体診断による初めての臨床経験について報告している。

「着床前診断の導入(Einfuehrung in die Praeimplantationsdiagnostik)」、Ｅ.シュウィンガー,リューベック(E.schwinger,Luebeck)、出典：http://www.studgen.uni-mainz.de/manuskripte/schwinger.pdfには、極体または胚盤胞分析によるＰＩＤ後の不均衡配分率の増加が認められ得ないことが述べられている。該書面は、受精前診断（ＰＦＤ）に利用可能な狭いタイムウィンドウを明確にしている。

出生前医学センター(Prenatal Medical Centre)、ミュンヘン(Munich)、医学博士カール−フィリップ グローニング(Karl-Philip Gloning)ら、極体診断に関するパンフレットに従えば、現在までに公開された結果より、極体サンプリングを行っても、発達異形が一般的な基本的危険率である２〜４％より増加することは認められないことが示唆されている。

従って、第１の極体が取り出され、この介入による障害を受けていない卵細胞に由来する現存の人間が既に存在している。従って、極体分析は、首尾よい受精に対するそれらの適合性のために卵細胞を試験するのに好適な方法としてそれ自体を示唆する。

極体は、卵細胞内の染色体の数を表し、遺伝子解析の実行に利用可能である。

極体に関する個々の細胞分析は、卵細胞の囲卵腔からのその無菌的取り出しを想定している。古典的な取り出し方法は、マイクロマニピュレーターを使用して透明帯を開放し、続いて、極体を単離することである。

体外受精（ＩＶＦ）中の受精プロセスを正確に観察すると、卵細胞のいくつかは受精することができないこと、または既に受精した細胞がさらに卵割しないことが認められる可能性がある。これらの不十分な受精の試みの多くは、おそらく、卵細胞の異数体による。いくつかの研究グループは、極体の遺伝子解析に従事している。これらの研究では、極体が単離され、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）に供される。この解析では、所定の染色体に特異的であり、蛍光染料で標記される分子が、極体の染色体に対してハイブリダイズされる。染色体についてシグナルの逸脱した番号が見出される場合、卵形成中の異常な染色体分布が示される。１９９９年に３９４３個の卵母細胞について使用されたこの方法の援助により、卵母細胞のうち４３％は染色体不均衡配分を有し、第１および第２の成熟分裂の両方において後者が生じることが見出された。この研究では、正確な分布について、第１３、１８および２１染色体が分析された（バーリンスキー(Verlinsky) １９９８）。該技術を改良することにより、現在、５つの異なる染色体の分析が可能である。各染色体は異なる蛍光色素の使用を必要とし、シグナルが重複しない場合にのみ明白な評価が可能であるため、本方法は、基本的に、分析し得る染色体の数によって制限される。

極体の援助による動物の卵細胞の遺伝情報の変動のための方法は、米国特許第６,１４３,５６４号明細書より公知である。

第１および第２の極体が分析される受精卵細胞の特定の遺伝子の存在を証明するための方法は、ＪＰ２０８６８００号公報より公知である。

ＦＩＳＨ方法によるインサイチュハイブリダイゼーションのための染色体特異的捕捉分子については、米国特許第５,８１７,４６２号明細書より公知である。ここで、異なる蛍光段の多様な組合せを介して、すべてのヒト染色体を同時に検出することができる。染色体の数がより多くなると、適切な蛍光団の必要とされる組合せの数は複雑さを増し、分析も同様に複雑になる。必要であれば、個々の染色体は、それらのサイズの援助により顕微鏡下で区別しなければならない。

従って、ＦＩＳＨ実験は、遺伝物質内の染色体の同時定量に対し限られた程度でしか適切ではない。そのような方法による区別可能な部分量の遺伝物質の定量は、染色体に係わる時間について制限される。組み合わせることができる染料の数も制限され、極体分析の場合、ＦＩＳＨが行われた後に極体は消費される。現在のところ、上記の方法によって完全な染色体の相補体の完全性について信頼できる供述を行うのが不可能であることが証明されている。極体のゲノムＤＮＡはさらに分割し得ず、かつ極体の染色体は従来の染色体のように短縮し得ないため、このことはまた、極体に関与するＦＩＳＨハイブリダイゼーションの調製が、中期細胞において確立されたＦＩＳＨ手順の場合のように行うことはできないという事実による。

多様な研究において使用された方法に依存して、広範な異常率が見出されているため、ＦＩＳＨ以外の染色体分染法または従来の均質染色の方法は十分でないないこと証明されている（エッケル(Eckel)ら、２００１）。

ゲノムＤＮＡが増幅され、標記剤によって提供されるゲノムＤＮＡを含有するサンプルの染色体同一性を決定するための方法は、米国特許第６,０６０,２５１号明細書より公知である。記載の増幅方法は、プライマー結合部位として反復配列が使用される非特異的増幅方法である。次いで、増幅産物は、ＤＮＡライブラリーを使用して分析される。検出は、ハイブリッドの検出を介して行われ、ここで、ＤＮＡライブラリー由来の捕捉分子を固体キャリアに適用することができる。

原則として、特異的増幅の部分として特定の染色体においてのみ発生する標的配列を増幅し、次いで、捕捉−標的配列ハイブリッドを作製することによりこの標的配列を検出することによって、サンプル中の染色体の存在に関する供述を行うことは可能である。そのような捕捉−標的配列ハイブリッドを検出することを可能にするために、それらの最小量が要求され、対応する最小量のコピーの標的配列を作製しなければならず、この理由のため、増幅が必要である。特異的増幅の過程では、原則として、特異的標的配列のコピーのみが作製されるため、関連のハイブリッドだけが、この標的配列を有する染色体の存在に関する結論を可能にする。すべての細胞の染色体組成を決定するための方法および手段は、国際公開第００／２４９２５号パンフレットより公知であって、分析しようとする遺伝物質は、非特異的ＰＣＲ増幅によって最初に増幅され、極体もまた同様にそのような遺伝物質の供給源として称される。以下のＰＣＲ方法が引用される。ＤＯＰ−ＰＣＲ、プライマー伸張増幅ＰＣＲ、連結仲介ＰＣＲ、タグ化ＰＣＲおよびａｌｕ−ＰＣＲ。これらの増幅方法では、極端な非特異的プライマーは、細胞に存在する遺伝物質の代表的な染色体相補体が増幅されることを確実にする。個々の染色体に割り当てられ得る標的配列の他に、ここでは、多数の完全に非特異的な配列が生じる。増幅産物は、遺伝子チップを使用して分析することができる。記載の方法により、染色体の差異および異数体を検出することが可能であるべきである。同時に、分析しようとするサンプルに加えて、平行参照サンプルが増幅される。異なる標記剤によって２つのサンプルが提供され、関連する標的配列とハイブリッドを形成することが可能な捕捉分子を有するチップに適用される。しかし、多数の同時増幅非特異的配列により、以下の問題が発生する。
−究極的に検出することが重要である標的配列が、多数の完全に非特異的配列との混合物中において希釈される、
−多数の同時増幅された非特異的配列は、捕捉分子がハイブリッドを形成するほど標的配列に類似する配列を含み得ることであって、該ハイブリッドは検出においてそれぞれの捕捉分子に割り当てられた標的配列が存在するという意味に解釈され、次いで、このことは現実に対応しないか、または極限られた範囲にしか対応しない、
−直接的に増幅方法の非特異的性質により、多数の非特異的配列内の標的配列が希釈されるため、検出可能な最小量の捕捉−標的配列ハイブリッドを生じることができる最小量の標的配列を生成するためにのより大きなサイクル数が必要とされるが；しかし、各サイクルは欠損を伴う増幅産物の危険性を増加し、次に、所望される「正確な」捕捉−標的配列ハイブリッドの作製、および所望されない欠陥のあるハイブリッドとの区別が困難となる、
−高サイクル数により、標的配列に基づくＰＣＲ産物の作製は、もはや指数的に増加せず、その代わりに所定のサイクルより先は停滞する。これが生じるサイクルは、特に、この標的配列の初期濃度に依存する。従って、ＰＣＲおよび異なる初期濃度の標的配列によって、遺伝物質の異なる増幅された標的配列の濃度の増加は、増幅の異なる段階で停滞し始める。次いで、これらの標的配列の相対量について供述することはもはや不可能である。

国際公開第００／２４９２５号パンフレットによれば、本来の物質における特異的増幅の標的配列の存在について供述することができるように、非特異的増幅から得られる産物は、以後の特異的増幅を経験し得る。特異的増幅により、かなり特異的な標的配列のみが増幅される。従って、第２の増幅の産物は、その場合において増幅される標的配列の存在に関する供述のみを可能にする。異なる第２の増幅実験の産物の相対量の比較は、先の非特異的増幅における不可量物のため、有用な供述をもたらさない。それぞれの増幅実験自体も、再現が困難である複数のパラメータの影響を受けるという事実も存在する。従って、必然的に、これらの組み合わされた増幅プロセスの結果は、変動し易い。従って、国際公開第００／２４９２５号パンフレットより公知である方法を使用して、最大比較可能性の条件下でのそのような標的配列を同時分析することは不可能である。さらに、国際公開第００／２４９２５号パンフレットに従って分析される細胞の標的配列の存在に関する具体的な供述には、物質的かつ時間的に負担の大きい困難な手順を必要とする。

ＮＣＢＩのＰｕｂＭｅｄデータベース、アドレスwww.ncbi.nlm.nih.gov.に記載されている非培養の羊水細胞(amniocyte)に対する定量的蛍光ＰＣＲによる一般的な常染色体の異数体の迅速な検出、ラヒルＨ.(RAHIL.H.)ら、Eur.J Hum.Genet.（２００２年８月）１０（８）４６２−６の要約は、ＤＳＣＲ１、ＤＣＣおよびＲＢ１の同時増幅であって、これらの遺伝子のそれぞれについて個別のプライマー対（結果的に、３つの遺伝子領域に３つのプライマー対）が必要とされる。

ＮＣＢＩのデータベースＰｕｂＭｅｄ、アドレスwww.ncbi.nlm.nih.gov.、オリゴヌクレオチドマイクロアレイとのハイブリダイゼーションによる白血病における染色体転座の同定(Identification of chromosomal translocations in leukaemia by hybridisation with oligonucleotide microarrays)、ナセドキナ、Ｔ.（ＮＡＳＥＤＫＩＮＡ,Ｔ.）ら、Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ（２００２年４月）８７（４）３６３−７２の要約およびＮＣＢＩのデータベースＰｕｂＭｅｄ、アドレスwww.ncbi.nlm.nih.gov.、新生児スクリーニングのためのＤＮＡマイクロアレイ技術(ＤＮＡ microarray technology for neonatal screening)、ドブロウォルスキー、Ｓ.Ｆ.(DOBROW LSKI,S.F.)ら、Acta Paediatr.補遺（１９９９）８８（４３２）６１−４の要約は、いくつかの異なる配列が同時に増幅される多様なＰＣＲ反応について記載している。

国際公開第０２／４４４１１号パンフレットは、発現プロファイリングに基づいて異数体を検出する方法について記載している。このことは、染色体に対して生じる遺伝子の発現を同定すること、およびこのことから染色体を決定することに関与する。

染色体拡散の援助によって行われる方法は、国際公開第００／２４９２５号パンフレットより公知である。

欧州特許出願公開第１ ０２６ ２６０ Ａ１号明細書は、組織サンプルおよびｍＲＮＡ、従って、多数の細胞由来の物質の分析について記載している。

独国特許出願公開第１０１ ０２ ６７８ Ａ１号明細書および独国特許出願公開第１００ ５９ ７７６ Ａ１号明細書は異数体の検出に関連するが、記載の方法は単一の細胞または極体から開始する異数体を検出するために使用することができる。

米国特許第６,３２９,１４０号明細書は、クローニングした生物体の選択のための方法と組み合わせたＤＮＡチップ技術の原理および可能な使用について概略している。

ＤＮＡアレイを使用して、遺伝子発現および遺伝子異常の同時決定のための方法であって、記載のＤＮＡアレイは、組織サンプルにおける遺伝子発現および染色体異常の検出に適切である、上記方法は、欧州特許出願公開第１ ０２６ ２６０号明細書より公知である。この目的のため、特定の染色体に割り当てられ得る捕捉分子を伴うチップが提供される。この方法および記載のＤＮＡチップを使用して、発現および非発現サンプル物質を区別することができる。

一般に、区別可能な部分量の存在および遺伝物質内のそれらの相対量に関する分析の実行、特に、極体に対する染色体分析のための技術的援助の拡大は歓迎されるといってよい。

１９９０年１２月１３日の胚保護法の下で、ヒト胚における染色体異常の検出のための着床前診断の独国での実行が禁止され、それらの選択は不可能である。このことは、ヒト卵細胞の第２の極体の分析を不可能にする。しかし、第１の極体が発達する場合、卵細胞はなお受精しておらず、受精が行われない限り、卵細胞は胚保護法の対象にならない。従って、第１の極体の細胞遺伝学的分析を介して、妊娠率の改善を得ることができる。このことは、受精前の異数性卵簿細胞の検出に関与し、次いで、これらは、さらなる受精プロセスから除外され得る（エッケル(Eckel)ら、２００１）。このため、卵細胞の受精が成功し得る限られた期間にのみを利用することができる。この期間には１〜２日間のばらつきがある。

この種の方法はまた、他の脊椎動物の生殖、例えば、絶滅危惧種の生殖において有用であることを証明し得る。そのような場合においてもまた、原則として、第２の極体の分析が禁止され得る。しかし、第２の極体のサンプリング時に、受精細胞の着床前に利用可能な時間は、一般に、第１の極体のサンプリング後に利用可能な時間より明らかに短い。

卵細胞は、短期間内においてのみ首尾よく受精されるため、該方法は迅速であるべきであり、個々の染色体の相対量に関して最も信頼できる供述を可能にすべきである。

従って、本発明の問題は、極少量で利用可能な遺伝物質内の区別可能な部分量の同時定量分析を可能にし、極体に存在する染色体の検出および相互に対して相対的なそれらの定量に適切である遺伝物質の増幅のための方法を提供することである。

問題は、請求項１または請求項１２に記載の特徴を伴う方法によって解決される。その有利な発達は、さらなる従属的請求項において明確に記載されている。

問題は、いくつかの点で遺伝物質に存在し、そして所定の長さの標的配列に隣接し、かつそれぞれの場合において１部分量に特異的であるプライマー結合部位に相補的であるプライマーが使用されるポリメラーゼ連鎖反応による相互に区別可能ないくつかの部分量を含有する遺伝物質由来の遺伝情報の増幅のための方法によって解決される。従って、所定の長さの標的配列を含有し、かつ関連する遺伝情報に特異的な増幅された配列のみを実質的に有し、ハイブリダイゼーションによる検出に適切である増幅産物が得られる。

本発明に従う増幅方法は、異なり、遺伝物質の１部分量にそれぞれ特異的である標的配列を同時に増幅するために使用される。これらの標的配列は、すべて、同じ反応条件下で増幅される。それらは、先行分野に従う非特異的増幅方法よりも有意に高い濃度で、本発明に従う増幅方法の産物中に存在する。結果として、ハイブリダイゼーションによって検出可能な量の標的配列を産生するために、要求されるサイクルが先行技術より少ない。このことは、増幅でのエラーの割合が減少することにより達成され、検出事象において誤りのあるハイブリダイゼーションの数がより少なくなる。従って、本発明に従う方法の産物は、同時に異なる多くの配列が増幅される既知の増幅配列の産物で起こり得るより迅速な、より信頼できる、かつより意味のある分析を可能にする。

本発明に従う方法によって作製される増幅産物は、所定の長さの標的配列を含有し、関連する遺伝情報に特異的な増幅された配列のみを実質的に含有し、ハイブリダイゼーションによる検出に適切である。実質的に、少なくとも８０％、好ましくは９０％または９５％が特異的標的配列に関与し得る。

首尾よい定量検出のために、少なくとも１０、２０、３０、５０または１００個の特異的標的配列が区別可能な部分量あたりで増幅されるように、使用するプライマーのプライマー結合部位が、区別可能な部分量の少なくとも１０、２０、３０、５０または１００個の特異的標的配列の隣接に配列されることが、統計的理由に役立つ。

問題はまた、以下の工程を伴う方法によっても解決される。
−区別可能な部分量に割り当てられ得る標的配列を含有する配列を有し、ハイブリダイゼーションによる検出に適切である増幅産物が得られるように、相互に区別可能な遺伝物質のいくつかの部分量を含有する遺伝物質由来の遺伝情報の増幅のための方法を行うこと、
−捕捉分子と部分量の増幅産物とのハイブリッドが形成されるように、増幅産物とＤＮＡチップ上の捕捉分子とを混和することであって、ここで、ＤＮＡチップは少なくとも２つの群のスポットを含有し、ここで、群内のスポットは異なる捕捉分子を有し、スポットの各群は１つの区別可能な部分量の遺伝物質に割り当てられ得ること、
−各スポットについて検出値が得られるように、ＤＮＡチップの異なる捕捉分子を伴うスポットに各場合において形成されるハイブリッドを定量的に検出すること、
−ＤＮＡチップ上に存在するスポットの群の検出値を平均化すること、
−平均値の比較によって、遺伝物質内の部分量の遺伝物質の相対頻度を決定すること。

ＤＮＡチップを使用する本発明に従うこの種の方法は、遺伝物質の区別可能な部分量の遺伝物質に割り当てられ得るシグナルの検出値の平均化を可能にし、増幅プロセスに関連する他の不利な影響の強化に対して高い程度の忍容性を有するという利点を有する。

プライマーとそれぞれのプライマー結合部位との間の相同性が８０〜１００％の範囲、好ましくは９０〜１００％の範囲にある本発明に従う方法では、増幅産物における標的配列の含有量は特に高い。

プライマー結合部位と隣接する特異的標的部位との間の距離は１０００以下、好ましくは３００以下、特に１００以下の塩基である本発明に従う方法では、本発明を行うために必要な時間は短く、増幅産物における標的配列の割合は特に高い。

特異的標的配列の所定の長さが１５〜８０塩基、好ましくは２０〜５０塩基である本発明に従う方法では、それぞれの部分に対する標的配列の特異性は極めて容易に確実にされ得る。

すべての特異的配列が実質的に同じ長さである本発明に従う方法では、検出のために提供される捕捉オリゴヌクレオチドと共にハイブリッドを形成し、極めて類似の特性を有する標的配列のプールが得られる。例えば、ハイブリッドは、それらが等しい長さを有する場合、類似の融解温度を有し、即ち、それらは同様に安定であり、例えば、そのようなハイブリッドの形成は比較可能な速度で進行する。

ポリメラーゼ連鎖反応の過程において、標識されたヌクレオチド成分が使用される本発明に従う方法では、標的配列と、対応する捕捉オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーション後に、それぞれ組み入れられた標識の援助により容易に検出される増幅産物が得られる。

以下の工程、
−捕捉分子と標的配列とのハイブリッドが形成されるように、増幅産物と捕捉分子とを混和すること、および
−ハイブリッドを検出すること、
も採用する本発明に従う方法では、検出されるハイブリッドの性質およびそれらが存在する量を使用して、遺伝物質におけるそれぞれの区別可能な部分量の量および存在に関する供述を行うことができる。

以下の工程、
−捕捉分子と標的配列とのハイブリッドが形成されるように、増幅産物と捕捉分子とを混和すること、および
−ハイブリッドを検出すること、
も採用し、捕捉分子がＤＮＡチップ上に配列される本発明に従う方法では、形成されるすべてのハイブリッドを同時に検出し、極めて小さな空間内で相互に比較することができる。

以下の工程、
−捕捉分子と標的配列とのハイブリッドが形成されるように、増幅産物と捕捉分子とを混和すること、および
−ハイブリッドを検出すること、
も採用し、捕捉分子がオリゴヌクレオチドによって形成される本発明に従う方法では、ハイブリダイゼーションの高い程度の確度が確実にされ得る。

各場合における個々のスポットにおいて同一の捕捉分子が提供されるＤＮＡチップが使用される本発明に従う方法では、このスポット内の検出強度を使用して、増幅産物内の特異的標的配列の存在に関する供述を行うことが可能である。

個々のスポットにおいて異なる標的配列について異なる捕捉分子が提供され、すべてが遺伝物質の１つの区別可能な部分量に割り当てられるＤＮＡチップが使用される本発明に従う方法では、そのようなスポットにおける強度の測定は、
−遺伝物質にけるこの区別可能な部分量の存在に関して行おうとする供述に対し、そして
−他のスポットの強度と比較して、遺伝物質における区別可能な部分量の相対量に関して行おうとする信頼できる供述に対し、
十分である。

遺伝物質が単一の細胞に由来するかまたは単一の細胞を起源とする本発明に従う方法は、卵細胞の遺伝物質内の区別可能な部分量の品質に関する迅速、信頼できるおよび高品質の供述を可能にする。

遺伝物質が卵細胞の極体由来の染色体相補体である本発明に従う方法は、卵細胞自体が損傷を受けない受精のための卵細胞の安定性に関する迅速、信頼できるおよび高品質の供述を可能にする。

区別可能な部分量が１つもしくはそれ以上の染色体よりなる本発明に従う方法は、遺伝物質の染色体組成の強度に関する供述を可能にする。

区別可能な部分量が１つもしくはそれ以上の遺伝子よりなる本発明に従う方法は、遺伝物質内の欠失または挿入の存在に関する供述を可能にする。

平行であること以外は同一の反応条件下で遺伝子参照物質の遺伝情報が増幅される本発明に従う方法は、遺伝物質の区別可能な部分量およびそれらの相互に対する相対的な量の決定を可能にする一方、作製しようとするこの定量化の確認を可能にする。

Ｄ１におけるような方法とは対照的に、本発明に従う方法は、遺伝物質内のいくつかの点において生じ、それぞれの部分量に特異的な標的配列にそれぞれ隣接するプライマー結合部位に相補的であるプライマーを有する。このことは、同一または実質的に同一なプライマー結合部位が異なる標的配列に隣接することを意味し、次いで、個々のプライマーまたは個々のプライマー対がいくつかの特異的標的配列を増幅するための位置にあることを暗示する。

複数のＰＣＲ反応と比較すると、本発明に従う方法の顕著な特徴は、ここで、所定の長さの標的配列を含有し、関連する遺伝情報に特異的な増幅された配列のみを実質的に有し、ハイブリダイゼーションによる検出に適切である増幅産物が得られることである。

異なるプライマーの古典的な同時増幅または従来のＰＣＲ実験は、大量の物質、例えば、全ＤＮＡ、細胞培養物または新生児の血液から開始する。発現プロファイリング方法は、ｍＲＮＡから開始し、ゲノムＤＮＡに含有されているのものの微量選択（ｓｍａｌｌ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）を表す。それは、例えば、極体の染色体ＤＮＡとはかなり異なる出発物質に関与する。極体は転写活性ではなく、従って、ｍＲＮＡを含有しない。ｍＲＮＡの定量に基づくすべての方法は、極体分析に不適切である。従って、既知の方法は、特に、単一細胞における染色体異数体の検出に不適切である。しかし、本発明に従う方法は、この仕事を実施することが可能である。

その理由のため、確かに、すべての核酸は、ハイブリダイゼーションによる検出に適切である。しかし、ここで、適切な量の物質が検出自体のプロセスに利用可能である。

いずれにせよ、捕捉物に結合した標的核酸の単一の分子または若干の分子は、この目的に不十分である。従って、量が検出閾値未満である場合、サンプル物質を増幅しなければならない。

本発明に従う方法は、単一の細胞に含有されるゲノムＤＮＡに基づく定量分析を可能にする。そのような分析はまた、他の方法も容易にする。

本発明に従う方法は、単一細胞の物質との併用に限定されない。このことは、本発明に従う方法のただ１つのアプリケーションを表す。

該方法は、事実、原則として、遺伝物質の部分量の検出および全遺伝物質内のそれらの相対頻度に関与するすべての場合における使用に適切である。そのような検出のための他の方法が存在してもよい。しかし、既知の方法のうち、本発明に従う方法の特徴および利点を有し、単一細胞に適用可能である方法は存在しない。

上記の問題、ならびに本発明の特徴および利点については、以下の図面の詳細な説明、好適な変形例、および本発明の実施態様を考慮することにより、さらに理解することができる。

上記で詳細に説明されなかった本発明の特徴については、特に本発明の発明の請求の範囲および図面を参照されたい。

第１の変形例および図面により、以下に、本発明を詳細に説明する。

第１の変形例において、遺伝物質は、半数体染色体相補体に存在するゲノム（精子）に関与し、区別可能な部分量は、染色体相補体に生じ得るすべての染色体Ｃｈｒに関与する。染色体相補体はヒト精子であり、この理由のため、区別可能な部分量の数は２３である。これは染色体相補体に存在する可能な染色体Ｃｈｒ１〜Ｃｈｒ２３の数に対応する。

それぞれの区別可能な部分量Ｃｈｒ１、Ｃｈｒ２、....Ｃｈｒ２３について、１つのまたは制限された数の区別可能な部分量の部分のみである標的配列が存在する。このことは、これらの標的配列が、これらの標的配列が生じる関連の染色体に独特であることを意味する。それぞれの染色体について、多数のそのような特異的標的配列が存在する。

本発明に従う方法について、２つの段階の選択プロセスにおいて、適切なパラメータが決定される。

図１は、標的配列の選択のための選択プロセスを概略的に示す。この方法は、工程Ｓ１から開始する。工程Ｓ２では、すべての区別可能な部分量に対するすべての可能な標的配列を決定する。このことは、遺伝物質におけるすべての可能な増幅可能なセクションが決定されることを意味する。次いで、これらの標的配列のうちどれが、それぞれの場合における単一の区別可能な部分量に特異的であるかが決定される（Ｓ３）。区別可能な部分量は、例えば、染色体であってもよい。標的配列は、それがただ１つの単一の区別可能な部分量で生じるが、いくつかの区別可能な部分量では生じない場合、特異的である。

それぞれの区別可能な部分量について、異なるいくつかの標的配列が選択される（Ｓ４）。好ましくは、標的配列は、所定の基準に基づいて選択され、例えば、高度に特有である標的配列は、他の標的配列に好適である。言い換えれば、他の標的配列に対する相同性または相補性が最も低い標的配列は、選択において好適である。また、類似のハイブリダイゼーション特性（例えば、融解温度、形成速度）を伴う標的配列を選択することが有用である。

選択プロセスは工程Ｓ５で終了する。

第２のプロセスセクション（図２）では、それぞれの場合において、具体的には、以下の工程を伴う選択プロセスにおいて、本発明に従う増幅に適切であるプライマーが決定される。
ａ）遺伝物質内において、第１の工程において決定される標的配列の３'末端の近傍に位置するプライマー結合部位が決定される（Ｓ７）。増幅反応において、これらのプライマー結合部位でハイブリダイズしたプライマーは、標的配列を超えて伸張され、標的配列に対する相補体が産生される。
ｂ）ａ）において決定されたプライマー結合部位から、どれが相互に実質的に相同であるかが選択される（Ｓ８）。ここで、ａ）の下で決定された他のプライマー結合部位に対する相同性が低いそれらのプライマー結合部位が拒絶される。本質的に相同であるとは、プライマー結合部位が、相互に少なくとも８０％の相同性を有することを意味する。
ｃ）ａ）において決定されたプライマー結合部位から、どれが標的配列またはその相補体の３'末端の実質的に近傍にあるかが選択される（Ｓ９）。ここでは、近接とは、本質的に、プライマー結合部位の少なくとも５０％が標的配列またはその相補体の３'末端の近傍にあることのみを意味する。これらのプライマー結合部位を組み合わせて、プライマー結合部位の群を形成する。この群のプライマー結合部位のそれぞれについて、該群のすべてのプライマー結合部位に実質的に相補的であるプライマーが決定される（Ｓ１０）。ここで、相補性とは、適切な反応条件下で、プライマーが、該群のすべてのプライマー結合部位とのハイブリダイズを形成することを本質的に意味する。

該群のプライマー結合部位は、すべての標的配列の増幅に必要なプライマー結合部位を含む必要はない。この目的のために、標的配列のそれぞれの３'末端の近傍のプライマー結合部位が標的配列の両鎖で必要であり、このため、後者は２つのプライマー結合部位によってそれぞれの場合において隣接される。

この場合、プライマー結合部位および関連するプライマーの１つもしくはそれ以上のさらなる群を決定するように、第２のプロセス工程を反復してもよい。

この方法では、標的配列の増幅に必要とされるすべてのプライマー結合部位と共にハイブリッドを形成する１つもしくはいくつかのプライマーが形成される。即ち、プライマー結合部位は、標的配列またはそれらの相補体の３'末端の近傍においてのみ実質的に見出されるべきである。

標的分子のみの増幅は、本質的に、本明細書において、少なくとも５０％の増幅された分子が、少なくとも１つの区別可能な部分量に特異的であるが、すべての区別可能な部分量を起源とし得ない標的配列を含有する標的分子であることを意味する。

もちろん、記載の選択プロセスを、様々な反復プロセスに供してもよく、即ち、指定された様々な基準を異なる要因に当てはめてもよく、個々の工程を、先に得られた結果に依存して交換してもよく、または数回反復してもよい。特に、このことはまた、第１の工程において既知である非特異的プライマーを使用することができ、上記の標的配列の増幅を可能にし、その後に、第１の工程の基準（標的配列の特異性、特殊性、類似のハイブリダイゼーション特性など）に適合しているかを確認することを意味する。

記載の選択プロセスの範囲内において、例えば、ＤＯＰ−ＰＣＲまたは相互−ＡＬＵ−ＰＣＲにおいて使用されるような先行分野に従う非特異的プライマーを、それらが上記の選択基準に適合するように改変してもよい。

染色体相補体の利用可能な遺伝物質は、本発明に従う増幅プロセスを経験する。これにおいて、各ハイブリダイゼーションにおけるプライマーは、実質的に標的配列を含有する標的分子のみが増幅されるように、標的配列の３'末端の近傍に位置するプライマー結合部位に結合する。

増幅産物において、各染色体は、関連する染色体に特異的であり、この染色体に特異的である異なる多くの標的配列によって提示される。

増幅反応は、式Ｙ＝Ｓ×(１＋Ｅ)ｎ［式中、Ｙは産生された増幅標的配列のコピー数であり、Ｅは増幅効率であり、ｎはサイクル数であり、Ｓは特定の標的配列の本来現存する「開始コピー」数である（染色体に特異的な標的配列は関連する染色体上に数回生じ得る）］。

精子または正常に発達した卵細胞の極体において、染色体は、それぞれの場合においてただ１回のみ生じる。不均衡配分の場合、所定の染色体が、異なる数、例えば、０または２で存在する。

これは、開始コピーとして単一分子のみを伴う標的配列（Ｓ＝１）の増幅において、１回目の増幅サイクルにおいて、規定された染色体特異的標的配列が確実に検出され、増幅されることが、定量的供述について実験的に確実にされなければならないことを意味する。しかし、個々の分子について、これは、一般に可能ではない。１回目のサイクルが失敗した場合、終了時には、これらの標的配列の半数のコピーしか増幅されない。増幅におけるエラーは、染色体が精子または極体において提示される頻度を定量化する（因子１、２、３...）ことを目的とした範囲より大きな範囲であり得る。従って、開始配列として単一の分子を伴う定量的供述は、事実、価値がなくなるほどにまで顕著に不確実になりやすい。

同じことが効率Ｅにも当てはまり、これは、理想的な場合、即ち、各増幅サイクルにおいて出発物質、即ち、すべての利用可能なコピーの倍化が生じる場合にのみ１である。しかし現実には、理想的な効率は決して生じず、Ｅの値は常に＜１に設定される。効率は、制御が困難である多数の因子、例えば、特定の場合において増幅される配列、およびゲノムの増幅されたセクションの長さに付随的に依存する。それは、原則として、実験によって変動する。理想的な増幅効率１からの効率Ｅの偏差が小さければ、増幅プロセスに対してｎ＝２０〜３０の典型的なサイクル数で極めて大きな効果がもたらされる。

本発明に従う方法の援助によって、精子または極体に存在するそれぞれの染色体について、異なる多数の標的配列が増幅され、それらのうち実質的にすべて（少なくとも８０％）が少なくとも１つの染色体に特異的であり、具体的には、１つもしくはそれ以上のプライマーによって援助される。増幅プロセスの効率が実験ごとに変動することによる実験的不可量物は、すべての標的配列を単一プロセスにおいて同時に増幅させるという事実によって、除外される。１回目のサイクルにおいて染色体の所定の標的配列の増幅が不十分であることから生じる増幅のエラーは、いずれにせよ、染色体に特異的である標的配列の実質的部分が第１の工程で増幅されるという事実により相殺される。

例えば、染色体相補体の第１染色体Ｃｈｒ１が、この染色体に対してのみ生じ、１つもしくはそれ以上のプライマーを使用して本発明に従う方法の援助により同時に増幅される２６個の標的配列ａ〜ｚを含有する場合、および標的配列ａ、ｂが１回目の増幅サイクルにおいて増幅されないが、しかし標的配列ｃ〜ｚが１回目の工程において増幅される場合、究極的に、染色体に特異的な増幅された標的配列ａ〜ｚの全体を使用して精子または極体における染色体の量に関する供述を提供する限り、標的配列ａ、ｂに関するエラーは増幅産物において重要ではない。

次いで、増幅産物を、それぞれが同一の捕捉分子を伴う列およびカラムに配列されたスポットである表面上のＤＮＡチップに適用してもよい。捕捉分子は、関連する標的配列と捕捉−標的配列ハイブリッドを形成することができる。ここで、各標的配列または圧倒的多数の標的配列に対しチップ上の適切なスポットが提供される。それらの上に位置するプローブ分子に依存して、スポットは、１つの標的配列に特異的であり、従って、少なくとも１つの染色体に特異的である。

増幅産物をハイブリダイゼーション条件下でそのようなＤＮＡチップに適用する場合、捕捉−標的配列ハイブリッドが形成され、次いで、これらが検出される。蛍光マーカーが提供されたヌクレオチド三リン酸を使用して増幅が行われる場合、個々のスポットの蛍光強度を測定することが可能である。

染色体Ｃｈｒ１の標的配列ａ〜ｚに割り当てるべきそれらのスポットＣｈｒ１ａ〜Ｃｈｒ１ｚは、
−染色体が染色体相補体にまったく存在しない場合、蛍光を伴わないかまたは不純物による極微量を伴うもの
−染色体が染色体相補体において１つもしくはそれ以上存在した場合、平均蛍光強度ＩＣｈｒ１を伴うもの
である。

第１染色体の標的配列ａ、ｂを低い効率で増幅する場合、スポットＣｈｒ１ａ、Ｃｈｒ１ｂをもたらし、ここでは蛍光強度が測定されないかまたは極最小限の蛍光強度しか測定されず、ハッチングを伴わない測定点として図３に示す。他の標的配列ｃ〜ｚを高い効率で増幅する場合、スポットＣｈｒ１ｃ〜Ｃｈｒ１ｚにおいて、対応する高い蛍光強度が測定され、ラインハッチングを伴う測定点として図３に示す。染色体Ｃｈｒ１が染色体相補体に１つ存在し、第２染色体が染色体相補体に２つ存在した場合、第１染色体に割り当てられたスポットＣｈｒ１ａ〜Ｃｈｒ１ｚの蛍光の平均強度ＩＣｈｒ１は、第２染色体に割り当てられたスポットＣｈｒ２ａ〜Ｃｈｒ２ｚの蛍光の平均強度ＩＣｈｒ２の半分であり、クロスハッチングにより図３に示す。

染色体Ｃｈｒ１に特異的である標的配列ａａが、同時に、さらなる染色体に特異的であり、染色体相補体のすべての染色体には特異的ではないことも起こり得る。両方の染色体がサンプル中に頻繁に生じる場合、この標的配列ａａに割り当てられたスポットにおいて測定される蛍光の強度は、標的配列が染色体上において１回だけ生じるスポットにおいて測定される強度の約２倍になる。

本発明に従う増幅の産物の分析のために、多数のさらなるハイブリダイゼーション実験が当業者に利用可能である。従って、増幅された配列は、例えば、電気泳動法、キャピラリー電気泳動または質量分析によって分析してもよい。

第２の変形例により、以下に、本発明を詳細に説明する。

ヒト染色体相補体の遺伝情報は、増幅方法によって増幅され、増幅産物は、多数の標的配列を含有し、極体に存在するそれぞれの染色体がこの染色体上にだけ生じるか、またはそれから由来し得る割り当てられた標的配列であり得る。

この目的のために、上記の実施態様に従う増幅方法を行ってもよいが、先行分野に従う非特異的増幅方法を使用してもよく、一方、原則として、他の方法もまた、例えば、ＮＡＳＢＡ、Ｑβレプリカーゼ、またはＳＤＡを使用するＰＣＲ法として使用してもよい（Ｋ.ハーゲン−マン(K.Hagen-Mann)、Ｗ.マン(W.Mann)、１９９５,Exp.Clin.Endocrinol １０３：１５０−１５５）。ここで、すべてまたはできるだけ多くの標的配列を増幅産物に含有させる、即ち、該標的配列を平行に増幅させることだけは重要である。

増幅産物を、それぞれの染色体が１０個のスポットによって提示されるＤＮＡチップと組み合わせる。同時に、それぞれのスポットは、標的配列とハイブリッドを形成することが可能である捕捉オリゴヌクレオチドを含有し、これらのハイブリッドは１つの染色体に特異的である。１つのスポットは、標的配列とハイブリッドを形成することが可能である１０の異なる捕捉オリゴヌクレオチドを含有し、これらのハイブリッドは相互に異なるが、すべて同じ染色体に割り当てられている。これと同じことが、同じ染色体に割り当てられる他の９個のスポットにも当てはまる。２６個の標的配列ａ〜ｚが捕捉オリゴヌクレオチドによってチップ上に捕捉され得る染色体Ｃｈｒｎの場合、スポットは、以下として、混合される。第１のスポットＣｈｒｎ／１は標的配列ａ〜ｊに対する捕捉分子を含有し、第２のスポットＣｈｒｎ／２は標的配列ｊ〜ｔに対する捕捉オリゴヌクレオチドを含有し、第３のスポットＣｈｒｎ／３は標的配列ｕ〜ｄに対する捕捉オリゴヌクレオチドを含有し、第４のスポットＣｈｒｎ／４は標的配列ｅ〜ｏに対する捕捉オリゴヌクレオチドを含有し、第５のスポットＣｈｒｎ／５は標的配列ｐ〜ｚに対する捕捉オリゴヌクレオチドを含有し、第６のスポットＣｈｒｎ／６は標的配列ａ、ｃ、ｅ、ｇ、ｉ、ｋ、ｍ、ｏ、ｑ、ｔに対する捕捉オリゴヌクレオチドを含有し、第７のスポットＣｈｒｎ／７は標的配列ｂ、ｄ、ｆ、ｈ、ｊ、ｌ、ｎ、ｐ、ｒ、ｔに対する捕捉オリゴヌクレオチドを含有し、第８のスポットＣｈｒｎ／８は標的配列ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ、ｗ、ｙ、ｚ、ｖに対する捕捉オリゴヌクレオチドを含有し、第９のスポットＣｈｒｎ／９は標的配列ａ、ｅ、ｉ、ｊ、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｒ、ｓに対する捕捉オリゴヌクレオチドを含有し、第１０のスポットＣｈｒｎ／１０は標的配列ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｖ、ｗ、ｘ、ｙ、ｚに対する捕捉オリゴヌクレオチドを含有する。ヒト卵細胞の染色体相補体に存在し得る染色体相補体の２３個の染色体Ｃｈｒ１〜Ｃｈｒ２３のそれぞれについて、１０個のそのようなスポットＣｈｒｎ／１〜Ｃｈｒｎ１０を伴うが提供され、各場合において、２６捕捉オリゴヌクレオチドのうち１０は上記のように混合される。関連する標的配列が特異的である染色体が染色体に存在する場合、これらの捕捉オリゴヌクレオチドは、非特異的増幅の家庭において基本的に増幅されている標的配列とハイブリダイズすることが可能である。

増幅産物を、ＤＮＡチップに適用する。ここで、捕捉オリゴヌクレオチドは、それらに相補的であるそれぞれの染色体の標的配列ａ〜ｚとハイブリダイズする。増幅の部分として、標記剤が増幅された標的配列に組み入れられる（Ｃｙ−３蛍光マーカー）。チップを洗浄し、個々のスポットの蛍光を同時に決定する。これは、染色体ｎに割り当てられたそれぞれの個々のスポットｘの強度ＩＣｈｒ／ｘを検出することに関与する。染色体ｎのすべての強度ＩＣｈｒ／ｘを、染色体に特異的であるスポットの強度を平均化するのに使用する（平均強度Ｉｎが得られる）。強度Ｉ１〜Ｉ２３を相互に比較する。染色体に割り当てられるスポットの平均強度の大きさのオーダー＝約０である場合、この染色体は染色体相補体に含有されない。染色体に割り当てられるスポットの平均強度が他の強度の大部分に対応する値を有する場合、このことから、これらのスポットが割り当てられる染色体は染色体相補体において正確に１回生じると結論される。１つの染色体を表すスポットの平均強度が、他の強度の２倍、３倍または数倍である場合、これらの染色体は染色体相補体において２、３もしくは４倍またはそれ以上生じるものとみなされる。

染色体内の特異的標的配列の頻度は高くてもまたは低くてもよい。この頻度は、該当する場合、適切な因子、およびまた、平行増幅を行った後のスポットにおける特異的ハイブリッドの形成に対する標的配列の開始コピーの頻度の影響を決定することによって、考慮すべきである。特異的染色体の標的配列の頻度もまた、関連する染色体のサイズに依存しうる。得られる結果もまた、該当する場合、分析において使用される適切な補正因子に組み入れるべきである。

染色体相補体のすべての染色体がそれにおいて２回生じる可能性は極めて高く、その理由のため、本発明に従う方法の援助により行われる染色体相補体における染色体の量に関する供述は極めて信頼性が高い。しかし、この信頼性を増強するために、参照サンプルを平行で増幅させ、分析用サンプルと同時に分析することができる。

そのようなＤＮＡチップのスポットの１つが、製造上の理由、例えば、それた十分にスポットされなかったために欠陥がある場合、染色体相補体における染色体の相対量に関する供述を可能にするために、９個のさらなるスポットがなお利用可能である。１つの染色体に対して異なるが、この染色体由来の異なる標的配列に特異的な捕捉配列を１つのスポット内で混合することにより、統計的手段に対応して、適切な開始物質が染色体相補体に存在する限り（関連する標的配列に関する増幅の効率が一様でなくても）、各スポットは測定可能な強度を有する。従って、各スポット自体は、ただ１つのタイプの捕捉分子が提供されているスポットよりも意義がある。異なる混合された捕捉分子をも含有する染色体あたりにいくつかのそのような混合型スポットの存在を介して、増幅の不正確さは先行の方法よりも迅速に排除される。

それぞれが、染色体相補体の染色体Ｃｈｒ１〜Ｃｈｒ２３の１つに割り当てられた第１、第２、第３....第１０の混合型スポット１、２、３....１０の測定された強度について相互関係を設定する場合、ヒト染色体相補対において天然に存在する２３までの染色体の量的発生に関する１０の異なる供述が得られる。これは、分析結果を複数回確認したことに等しい。

前述の１０個の異なるスポットの代わりに、(実施態様の変形例に従って)染色体の標的配列ａ〜ｚに対応する２６の捕捉分子を含有する各染色体について１つのスポットを提供することも可能である。算術平均は必要なく、染色体に特異的なすべてのハイブリッドの平均強度は、１つのスポット内に捕捉分子を混合することによって得られる。

染色体相補体に存在する染色体について決定された数から、卵細胞の染色体数に関して直接結論付けることができる。この方法では、卵細胞の染色体の完全性を、高いレベルの信頼度で決定することができる。

本発明における捕捉分子は、好ましくは、合成オリゴヌクレオチドを含んでなる。しかし、それらはまた、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ａＲＮＡ、ＬＮＡおよび／または他の改変された核酸を含有してもよい。

実施態様
特定の実施態様の援助により、以下に、本発明を説明する。各場合において単一細胞から単離された染色体物質の増幅について、図２の方法に従って、以下のプライマーを選択した。
Ａｌｅ１−ｋ

このプライマー配列により、ＰＣＲ増幅を以下の条件下で行う。異なるいくつかのサンプルを最初にすべて５分間、９５℃に加熱し、次いで、９５℃を３０秒間、６２℃を３０秒間および７２℃を３０秒間を３５回行う。最後のサイクル終了時に、サンプルを１０分間７２℃まで加熱し、次いで、４℃にまで冷却する。

プライマーＡｌｅ１−ｋは、本発明に従う方法の実行において極めて効率的であることが証明されている。１つの塩基を別の塩基に置き換えても、特に末端プライマーセクションが影響を受ける場合、プライマーはなお、その機能を実行することが可能である。２末端塩基が欠如した場合であっても、有用な結果をなお得ることができる。しかし、当業者に公知であるそのような変形例は、品質の著しい消失をもたらす。本発明に従うプライマーの２を超える塩基が置き換えられるかまたは欠如する場合、本発明に従う方法はほとんど履行することができない。プライマーがその機能を実行するという事実を、以下の図４および５の援助によって説明する。

増幅産物をゲルに適用し、ゲル電気泳動に供する。得られる電気泳動ゲルの図を図４に示す。ここで、左から右へ配列された９個のトレース１〜９を認めることができる。トレース１は分子量標準、トレース２はネガティブコントロール、トレース３〜９は異なるサンプルの同一種であり、それぞれ、出発物質として１つの半数体細胞を伴う。

図１に示される方法に従って、イン・シリコで予想されている配列が、図４に示されるゲル上で検出される。

例えば、２つの配列、ＳＨＧＣ−６８３３およびＲＨ１０２６３６が指定され、それらは、ＮＣＢＩデータベースにおいてそれらのそれぞれの名称で見出されるべきである。両配列は、Ａｌｅ１−ｋによって増幅される特定の配列の部分である。ＳＨＧＣ−６８３３は第２１染色体上において特異的に見出されるべきである。ＳＨＧＣ−６８３３の配列（以下、配列タグ化部位配列またはＳＴＳ配列として記載する）は、

を示す。

標記化ＳＴＳプローブ、即ち、図４に示されるゲル上において標記化剤が組み入れられている（トレース３）ＳＴＳ配列に対する相補体とハイブリダイズさせることによって、図５に示されるように、予想されるサイズの特定のシグナルが得られる。このシグナルは出発物質においてＳＨＧＣ−６８３３の存在、従って、第２１染色体の存在を証明する。

ＲＨ１０２６３６は、第１染色体上に特異的に見出されるべきである。ＲＨ１０２６３６の配列は、以下の通りである。

ゲル上のＲＨ１０２６３６の検出は、同時に、ＲＨ１０２６３６が出発物質に存在したことの証明、従って、第１染色体の存在の証明である。

関連する配列は、特定の染色体上に単一の時間にのみ生じる。２つの配列トレースの蛍光強度がほぼ同じである点では、関連するサンプルにおいて、第１および第２１染色体が等量存在するといえる。

イン・シリコでは、それぞれ特定の染色体上において１回だけ生じるさらなる配列が予想されている。表１に、現在予想される配列の概要を示す。

表中の第１のカラムは、各ヒト染色体を列挙している。第２のカラムは、関連する染色体について、イン・シリコで予想されるＡｌｅ１−ｋによる増幅の異なる増幅産物の数を示す。第２のカラムにおけるほとんどすべての増幅産物は特異的である。第３のカラムには、特定の染色体について、以前より既知かつ公開されている特異的配列（ＳＴＳ配列）の数であって、公的データベースにおいてアクセス可能であり、それぞれの場合におけるカラム２の関連ＰＣＲ産物の部分量を表す。第４のカラムは、関連する染色体上のＡｌｅ１−ｋに対するプライマー結合部位の数を示す。プライマーは、セクションの首尾よい増幅のための第１の結合部位に必要な近傍において常に結合部位を有するわけではなく、該地点ではプライマーはまた逆方向で相補体にハイブリダイズしえるため、ＰＣＲ産物は常に自動的に生じるとは限らない。本発明に従うプライマーＡｌｅ１−ｋでは、これは、一部の場合においてのみ生じる。従って、第１染色体の７１４８５個のプライマー部位により、３５０００個のＰＣＲ産物が得られるが、それらの数はわずか４５１２であるとみなすことができる。

本発明に従う増幅から得られる反応混合物の分析に使用されるＤＮＡチップまたはマイクロアレイは、図６ａまたは図６ｂの概略図に示されるように設計することができる。

１つのオプションは、各ＳＴＳ配列について、ただ１つの個別の測定点を提供することである。そのような測定点は、関連するＳＴＳ配列またはそのセクションとの特異的なハイブリッドを形成する捕捉分子のみを含有する。次いで、測定点における蛍光トレースは、この配列がサンプル内に存在したことを示す。例えば、第１染色体では、３０個までの異なる測定点を、マイクロアレイ上に提供することができる。増幅過程において、例えば、第１染色体に関するマイクロアレイ上において検出可能な３０個のＳＴＳ配列のうちの１つが、例えば、この配列における１回目の増幅サイクルにおいて、プライマーが、提供されるプライマー結合部位に結合しなかったために、良好に増幅されない場合、なおさらに２９個の配列が利用可能であり、それらの検出は、同時に、サンプルにおける第１染色体の存在が乏しいことを示す。この種の増幅エラーが他の配列に関連するこの配列の増幅量の低下をもたらす場合、この配列を表す測定点において、他の測定点よりも低い蛍光強度が得られる（ハッチングを伴わない測定点、図６ａの左上）。第１染色体に特異的な他の２９個の増幅産物のそれぞれについて、測定点がマイクロアレイ上に提供されるという事実のため、欠陥のある増幅産物をそのようなものとして同定することができる。次いで、他の２９個の測定点のいくつかのみを分析に使用して、第１染色体の相対量が決定される（図６ａに示されるマイクロアレイの第１のカラムにおけるラインハッチングを伴う測定点２〜２９）。それらの強度が、それぞれの場合において第２染色体の１つのＳＴＳ配列を特異的に表す測定点について測定される強度にほぼ等しい場合、第１および第２染色体のそれぞれ増幅されるＳＴＳ配列の量はほぼ等しいと言える（ラインハッチングを伴う図６ａにおける測定点のカラム２）。次いで、このことから、第１および第２染色体は、関連するサンプルに同じ相対比で存在するといえる。第３染色体形の染色体よりも２倍多くサンプルにおいて生じる場合、対応する測定点は、他の測定点の２倍の蛍光強度を示す（クロスハッチングを伴う測定点、図６ａの第３のカラム）。増幅エラーのため、極めて微量からの増幅過程において規則的に生じる個々の測定点は、第１染色体の第１の測定点について記載されているように、まったく蛍光強度を有さないかまたは最小限の蛍光強度しか有さず、染色体あたり少なくとも１つのＳＴＳ配列が正確に増幅される限り、分析を妨害しない。増幅エラーによって、染色体のすべてのＳＴＳ配列が別の染色体のＳＴＳ配列よりも良好に増幅されない確率は、統計的に極めて低い。従って、捕捉分子が異なる測定点において提供され、等しい濃度でそこに存在し、それぞれが表１由来の特異的ＳＴＳ配列とハイブリダイズを形成するマイクロアレイは、Ａｌｅ１−ｋによって増幅されているサンプル内の染色体の相対量に関する供述を、迅速かつ信頼できる様式で提供するのに理想的に適している。

本発明に従うマイクロアレイの１つの測定点はまた、所定の染色体に特異的であるすべてのＳＴＳ配列、または所定の数のそのような配列とハイブリダイズすることが可能である捕捉分子を含有してもよい。そのようなマイクロアレイの概略を図６ａに示す。各スポットにおいて、検出することを目的とする染色体を示す。個々の測定点で、それぞれ表１の染色体の１つに特異的なすべてのＳＴＳ配列が検出可能である場合、相互に相対的な検出されるハイブリッドの強度は、シグナル分析において、それぞれの染色体について検出されるＳＴＳ配列の数と同様に挙動する（即ち、スポットＣｈｒ１におけるクロスハッチングおよびスポットＣｈｒ１９におけるラインハッチングによって図６ｂに示される最大約１：１０の第１９染色体：第１染色体；残りのスポットまたは測定点は、明確にするためにハッチングを付していない）。

個々の測定点で、染色体に特異的である異なるがすべてではないＳＴＳ配列が検出可能であるマイクロアレイもまた適切である。従って、これらは、測定される強度の分析において重みを付けるべきである。最後に、異なるタイプの測定点を１つのマイクロアレイ上に組み込むことができ、即ち、マイクロアレイは、図６ａの測定点に一致する測定点、図６ｂに一致する測定点、または記載の測定点を有することができる。単一のマイクロアレイに多数の異なるタイプの測定点の組み込むことにより、結果がより容易に確認することができるように、記載のすべての可能なタイプの分析を可能にする。このことは、本発明に従う方法を特に信頼できるものにする。

引用した変形例および実施態様において、精子分析の援助により本発明を説明した。本発明に従う方法はまた、精子に含有されるゲノム以外の他の遺伝物質、特に単一のヒト細胞またはヒト極体に含有されるゲノムおよびその染色体にも適用してよい。本発明に従う方法はまた、遺伝物質内、例えば、遺伝物質としての個々の染色体またはそのセクション内の区別可能な部分量としての特定の欠失もしくは挿入にも適用してよい。

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標的配列の選択のための選択手順を示すフローチャートを表す。 プライマー結合部位およびプライマーの選択のための選択手順を示すフローチャートを表す。 本発明に従うマイクロアレイの表面上の測定点の選択の光度を概略的に表す。 本発明の実施態様に従う電気泳動ゲルの平面図を表す。 電気泳動ゲルにおけるバンドの平面図を表す。 本発明に従うマイクロアレイの表面の略図を表す。

Claims (21)

1. 所定の長さの標的配列を含有し、かつ関連する遺伝情報に特異的な増幅された配列のみを実質的に有し、ハイブリダイゼーションによる検出に適切である増幅産物が得られるように、いくつかの点で遺伝物質に存在し、そして、所定の長さの標的配列に隣接し、かつそれぞれの場合において１部分量に特異的であるプライマー結合部位に相補的であるプライマーが使用されるポリメラーゼ連鎖反応によって、相互に区別可能ないくつかの部分量を含有する遺伝物質由来の遺伝情報の増幅のための方法。
2. プライマーとそれぞれのプライマー結合部位との間の相同性は８０〜１００％の範囲、好ましくは９０〜１００％の範囲にあることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
3. プライマー結合部位と隣接する特異的標的配列との間の距離は１０００以下、好ましくは３００以下、特に１００以下の塩基であることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
4. 特異的標的配列の所定の長さは１５〜８０塩基の間、好ましくは２０〜５０塩基の間であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
5. すべての特異的標的配列は実質的に同じ長さであることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
6. ポリメラーゼ連鎖反応の過程において、標識されたヌクレオチド成分が使用されることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
7. −捕捉分子と標的配列とのハイブリッドが形成されるように、増幅産物と捕捉分子とを混和すること、および
   −ハイブリッドを検出すること、
   を特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
8. 捕捉分子がＤＮＡチップ上に配列されることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
9. 捕捉分子がオリゴヌクレオチドによって形成されることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
10. 各場合において個々のスポットに同一の捕捉分子が提供されるＤＮＡチップの使用を含むことを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
11. 個々のスポットにおいて、異なる標的配列に対し異なる捕捉分子が提供され、すべてのスポットが１つの区別可能な部分量遺伝物質に割り当てられるＤＮＡチップの使用を含むことを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
12. 以下の工程：
    −区別可能な部分量に割り当てられ得る標的配列を含有する配列を有し、ハイブリダイゼーションによる検出に適切である増幅産物が得られるように、相互に区別可能な遺伝物質のいくつかの部分量を含有する遺伝物質由来の遺伝情報の増幅のための方法を行うこと、
    −捕捉分子と部分量の増幅産物とのハイブリッドが形成されるように、増幅産物とＤＮＡチップ上の捕捉分子とを混和することであって、ここで、ＤＮＡチップは少なくとも２つの群のスポットを含有し、ここで、群内のスポットは異なる捕捉分子を有し、スポットの各群は１つの区別可能な部分量の遺伝物質に割り当てられ得ること、
    −各スポットについて検出値が得られるように、ＤＮＡチップの異なる捕捉分子を伴うスポットに各場合において形成されるハイブリッドを定量的に検出すること、
    −ＤＮＡチップ上に存在するスポットの群の検出値を平均化すること、
    −平均値の比較によって、遺伝物質内の部分量の遺伝物質の相対頻度を決定すること、
    を含む、特に請求項１〜１１のいずれか１項に記載の増幅のための方法。
13. 遺伝物質は単一の細胞に由来するか、または単一の細胞を起源とすることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
14. 遺伝物質は卵細胞の極体からの染色体組であることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
15. 区別可能な部分量は１つもしくはそれ以上の染色体よりなることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
16. 区別可能な部分量は１つもしくはそれ以上の遺伝子よりなることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
17. 所定の長さの標的配列を含有し、かつ関連する遺伝情報に特異的な増幅された配列のみを実質的に有し、ハイブリダイゼーションによる検出に適切である増幅産物が得られるように、平行であること以外は同一の反応条件下で遺伝子参照物質の遺伝情報が増幅されることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
18. プライマー結合部位の少なくとも８０％、好ましくは９０％または９５％が特異的標的配列に隣接して位置していることを特徴とする、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
19. 少なくとも１０、２０、３０、５０または１００個の特異的標的配列が区別可能な部分量あたりで増幅されるように、使用されるプライマーのプライマー結合部位が少なくとも１０、２０、３０、５０または１００個の特異的標的配列の区別可能な部分量に隣接して配列されることを特徴とする、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
20. 特に請求項１〜１９のいずれか１項に記載の特徴を有する方法で増幅を行うためのプライマーＡｌｅｌ〜ｋであって、ここで、プライマーは塩基配列
    

    

    を有するプライマー。
21. 請求項１８に記載のプライマーは増幅のために使用される、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。

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