NL9100132A - Werkwijze voor het detecteren van dna sequentievariatie. - Google Patents

Description

Werkwijze voor het detecteren van DNA sequentievariatie

De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het detecteren van genetische variatie door DNA fragmenten, afgeleid van een te onderzoeken DNA monster, aan een tweedimensionale elektroforetische scheiding te onderwerpen waarbij de fragmenten in de ene dimensie op basis van verschillen in lengte en in de andere dimensie op basis van verschillen in basevolgorde worden gescheiden, het resulterende scheidingspatroon over te brengen naar een membraan filter en het overgebrachte scheidingspatroon aan een hybridisatie analyse te onderwerpen onder toepassing van een of meerdere DNA of RNA probes.

Zo'n methode vindt toepassing in het gebied van de zg. DNA diagnostiek, d.w.z. het gebruik van methoden om genetische variatie aan te tonen op die plaatsen welke een indicatie kunnen zijn voor bepaalde eigenschappen, zoals de vatbaarheid voor bepaalde ziektes en andere medisch en economisch belangrijke karakteristieken. Onder genetische variatie verstaat men verschillen tussen individuen in de basepaarvolgorde van hun DNA.

Genetische variatie kan op verschillende manieren worden gedetecteerd. Een bekende manier is d.m.v. hybridisatie analyse na elektroforetische scheiding van DNA fragmenten, verkregen na behandeling van genomisch DNA met een restrictieenzym (Southern blot hybridisatieanalyse; Southern, 1975). Hybridisatie met een specifiek gelabeld DNA fragment (probe) resulteert in een of meer selecte banden. Elke band vertegenwoordigt een DNA fragment dat hybridiseert met de gebruikte probe. De positie van de banden is een maat voor de grootte van de DNA fragmenten die zij vertegenwoordigen. Indien voor een bepaalde probe de positie van de ermee gegenereerde banden per individu varieert als gevolg van deleties, inserties en/of de aan- of afwezigheid van een herkenningsplaats voor het gebruikte restrictieenzym, spreekt men van een restrictie-fragment-lengte-polymorfisme (RFLP). Uit ervaring weten we dat sommige stukken in het genoom (het totaal aan erfelijke informatie) van mensen, dieren of planten veel polymorfer zijn dan andere stukken. Probes voor zulke stukken kunnen uiterst nuttig zijn als merkers voor bepaalde erfelijke eigenschappen. Zo is bijvoorbeeld in een humane familie, waarin een bepaalde erfelijke ziekte voorkomt, de overerving van de ziekte samen met een variant van een polymorfe DNA sequentie een aanwijzing dat het defecte gen, betrokken bij de ziekte, daar dichtbij gelegen is; er is sprake van genetische koppeling. De desbetreffende variant van de polymorfe DNA sequentie kan dan als diagnostische merker dienen voor de desbetreffende ziekte. Tevens kan dan met behulp van de merker het ziektegen geïsoleerd worden.

Probes die polymorfe DNA sequenties detecteren, kunnen op vergelijkbare wijze gebruikt worden bij plantenveredeling en bij het fokken van vee en andere economisch belangrijke dieren. Immers, indien bekend is dat een bepaalde DNA variant altijd overerft samen met een bepaalde eigenschap, dan kan het al of niet hebben van die eigenschap vroegtijdig worden vastgesteld, hetgeen in de veredeling van groot belang is omdat op deze wijze het generatieinterval wordt vermeden (dit principe noemt men "Marker Assisted Selection").

Teneinde zoveel mogelijk erfelijke eigenschappen te koppelen aan polymorfe merkers is het uiteraard van belang enige informatie te hebben over de locatie van die merkers, zowel ten opzichte van elkaar als voor wat betreft hun precieze plaats op de chromosomen. Indien voor de mens en een aantal belangrijke plante- en diersoorten genetische merkerkaarten ter beschikking zouden staan, met een merker voor elke ca. 2 miljoen baseparen, zou het koppelen van merkers aan erfelijke eigenschappen een routineaangelegenheid zijn. Dergelijke kaarten zijn er echter nog niet; de kaarten die er zijn, zijn onvolledig en/of bestaan voor een groot deel uit merkers die niet altijd even informatief zijn, d.w.z. niet erg polymorf (zie bijvoorbeeld Donis-Keller et al., 1987). Zelfs met zo’n nauwkeurige kaart zal het bovendien nog altijd veel werk kosten om een bepaald erfelijk kenmerk aan een bepaalde merker te koppelen omdat elke merker apart moet worden onderzocht op koppeling met een bepaald kenmerk.

Aangezien het humane genoom ca. 3 miljard baseparen groot is, houdt dit voor deze species bijvoorbeeld in dat, elke keer dat men een erfelijke eigenschap in kaart wil brengen, zo'n 1500 merkers getest zouden moeten worden.

Recent is door ons een methode voorgesteld met behulp waarvan een groot aantal hyperpolymorfe DNA plaatsen tegelijk kan worden geanalyseerd door middel van een elektroforetische scheiding in twee dimensies, gevolgd door overbrenging van het scheidingspatroon naar membraanfilters en hybridisatie met zg. minisatelliet core probes (ΕΡ-Α-0 349 024; Uitterlinden et al., 1989; Uitterlinden en Vijg, 1989). Bij deze elektroforetische scheiding van DNA fragmenten in twee dimensies werd gebruik gemaakt van een eerder ontwikkeld systeem waarbij scheiding op grootte wordt gevolgd door scheiding op basis van basepaar-samenstelling, loodrecht op de richting van de eerste scheiding (Fischer en Lerman, 1979). Scheiding op basis van basepaar-samenstelling werd door Fischer en Lerman gerealiseerd door gebruik te maken van zg. denaturerende gradiënten (Fischer en Lerman, 1979; Fischer en Lerman, 1983). Daarbij migreert het dubbelstrengig DNA in een elektrisch veld in een gel (bijv. een polyacrylamidegel) waarin tevoren een gradiënt van denaturans (een mengsel van ureum en formamide) is aangebracht. De DNA fragmenten ontmoeten tijdens hun migratie een steeds hogere concentratie van het denaturans en zullen tenslotte op een bepaald punt in de gradiënt uitsmelten. Dit punt is sterk afhankelijk van de basepaarsamenstelling van het DNA fragment (zie Lerman et al., 1984). Door ons is aangetoond dat scheiding van DNA fragmenten (o.a. verkregen door restrictieenzym-digestie van humaan DNA) in twee dimensies op basis van bovengenoemd principe, gevolgd door overbrenging van het scheidingspatroon naar membraanfilters en hybridisatie met GC-rijke minisatelliet core probes, tot een patroon leidt waarin, afhankelijk van de gebruikte probe, 300-700 DNA plaatsen als vlekken kunnen worden onderscheiden (zie Figuur 1). Uit onze gegevens blijkt dat ca. 20% van deze plaatsen tot het hyperpolymorfe type behoort dat zo karakteristiek is voor VNTR-type (variable number of tandem repeats) loci. Dit betekent dat op deze wijze ca. 60-140 allelen en daarmee 30-70 hyperpolymorfe loei tegelijkertijd gescreend kunnen worden. Herhybridisatie met andere GC-rijke core probes resulteert in vergelijkbare patronen waarin de meeste vlekken zullen corresponderen met andere plaatsen in het genoom dan de plaatsen welke met de eerste probe werden gedetecteerd. M.a.w. de verschillende core probes detecteren verschillende groepen loei, hoewel enige overlap aantoonbaar is (gemiddeld 10-15%).

Met behulp van bovenbesproken methode (2-D DNA typering) kunnen dus in korte tijd een groot aantal hyperpolymorfe loei in een genoom worden gescreend, hetgeen de mogelijkheid verschaft erfelijke kenmerken snel in kaart te brengen. Als zodanig is het systeem een stap voorwaarts ten opzichte van de bijna klassiek te noemen Southern hybridisatie analyse.

Het kwam ons voor dat 2-D DNA typering als efficient meetsysteem in genetische studies nog aanzienlijk zou kunnen worden verfijnd en meer specifiek zou kunnen worden toegepast indien de volgende nadelen zouden kunnen worden opgeheven: (1) De door de core probes gedetecteerde sequenties zijn onregelmatig verspreid in het genoom. Bijvoorbeeld minisatelliet VNTR-type sequenties komen bij de mens veel vaker voor aan de telomeren (uiteinden van de chromosomen) dan elders (Royle et al., 1989). Voor andere VNTR-type sequenties is hier niet veel van bekend en ook in andere diersoorten dan de mens en bij planten bestaat slechts weinig informatie omtrent het voorkomen en de verdeling van VNTR-type sequenties.

(2) De 2-D DNA typeringsmethode is aspecifiek; het gebied in het genoom dat met bepaalde core probes wordt bestreken is niet a priori bekend. Het is daarom noodzakelijk om van elke vlek de genomische locatie vast te stellen. Hoewel tijdrovend, is dit zeker wel haalbaar en gezien het veelvuldig voorkomen van VNTR-type sequenties mag verondersteld worden dat met een juiste combinatie van core probes en een goede strategie voor het localiseren van de vlekken er uiteindelijk wel een fijnmazige genoomkaart valt te construeren (zie ook EP-A-0 349 024). De tijd die daarmee gepaard zal moeten gaan, blijft echter aanzienlijk.

(3) Een derde punt betreft het feit dat slechts 20-30% van de door de core probes gedetecteerde sequenties polymorf en dus nuttig voor de analyse is. M.a.w. de meerderheid van de vlekken is onbruikbaar voor het karteren en neemt slechts ruimte in het scheidingspatroon in.

Het zou daarom veel beter zijn gebruik te maken van sequenties die ten minste om de ca. 2 miljoen baseparen eenmaal voorkomen, vrijwel altijd polymorf zijn en gelijkelijk over het genoom zijn verdeeld. Een sequentie met deze eigenschappen is bijvoorbeeld het repeterend element Alu. Eerder is door ons echter al aangetoond dat hybridisatie van een twee-dimensionaal scheidingspatroon van zoogdier DNA met Alu als probe resulteert in een ongestruktureerde smeer zonder duidelijke vlekken. Dit werd verklaard, enerzijds door het grote aantal Alu kopieën per genoom (ca. 700.000; voor een beschouwing over de verdeling van Alu en andere repeats over het genoom, zie Schmid en Jelinek, 1982; Korenberg en Rykowski, 1988; Moyzis et al., 1989), en anderzijds door het niet bijzonder GC-rijke karakter van Alu. Dit laatste is in tegenstelling tot de met de GC-rijke core probes gedetecteerde sequenties die op basis van hun GC-rijke karakter als "clamp" (i.e. highest melting domain) fungeren tijdens de scheiding in de denaturerende gradiënt (2e dimensie' scheiding) hetgeen resulteert in een focussering als spot van dit soort sequenties in de tweede dimensie. Aangezien de naast de VNTR liggende sequenties van locus tot locus zullen verschillen en bovendien als lowest melting domain fungeren, zullen de resulterende spots goed gescheiden kunnen worden. Echter, veel van de DNA fragmenten die Alu bevatten zullen ongeveer tegelijk uitsmelten en zodoende aanleiding geven tot clustering in de gel (voor een uitgebreide beschouwing hieromtrent, zie EP-A-0 349 024 en Uitterlinden en Vijg, 1989). Het komt er dus op neer dat het aantal Alu fragmenten per genoom te groot is voor gebruik als merkers en hun uitsmeltkarakteris-tieken niet erg geschikt zijn voor het bij 2-D DNA typering gebruikte gelscheidingssysteem. Een en ander staat het gebruik in hybridisatieexperimenten van Alu repeats als "ankerpunten" voor een tweedimensionale screening van het genoom in de weg.

Het feit dat Alu zo frequent in het genoom voorkomt (gemiddeld om de 4000 baseparen), maakt het echter mogelijk om zg. inter-Alu gebieden te onderscheiden en direkt met behulp van de polymerase chain reaction (PCR) te isoleren. Recentelijk is door Nelson et al. (1989) aangetoond dat inter-Alu gebieden met behulp van PCR kunnen worden vermenigvuldigd door gebruik te maken van primers die speciek zijn voor Alu. Bijvoorbeeld kunnen onder toepassing van primer TC65 in principe van het humane genoom alle gebieden die gelegen zijn tussen 2 in omgekeerde oriëntatie liggende Alu kopieën worden vermenigvuldigd. In Figuur 2 is een schematisch overzicht van deze methode te zien en in Figuur 3 staat een overzicht van de bindingsplaatsen op de Alu repeat van de in Tabel 1 opgesomde geschikte Alu-specifieke primers.

TABEL 1: herkomst en sequentie van inter-Alu specifieke primers Nelson et al., 1989: TC 65 (559) 5'-AAGTCGCGGCCGCTTGCAGTGAGCCGAGAT-3' 517 51-CGACCTCGAGATCT(C/T)(A/G)GCTCACTGCAA-31 P. de Jong, persoonlijke mededeling: PD J3 3 51-GCCTCCCAAAGTGCTGGGATTACAGGCGTGAGCCA-3' PDJ34 5'-TGAGCCGAGATCGCGCCA(T/C)TGCACTCCAGCCTGGG3’ niet gepubliceerd: PDJ33A 51-GGATCCGCCTCCCAAAGTGCTGGGATTACAGG-3* PDJ3 4A 5'-GAATTCTGAGCCGAGATCGCGCCACTGC-3'

Cotter et al., 1990: PRIM IV 5’-CAGAATTCGCGACAGAGCGAGACTCCGTCTC-3'

De uitvinding verschaft nu een werkwijze voor het detecteren van genetische variatie door DNA fragmenten, afgeleid van een te onderzoeken DNA monster, aan een tweedimensionale elektroforetische scheiding te onderwerpen waarbij de fragmenten in de ene dimensie op basis van verschillen in lengte en in de andere dimensie op basis van verschillen in basevolgorde worden gescheiden, het resulterende scheidingspatroon over te brengen naar een membraan filter en het overgebrachte scheidingspatroon aan een hybridisatie analyse te onderwerpen onder toepassing van een of meerdere DNA of RNA probes, welke werkwijze gekenmerkt wordt doordat men DNA fragmenten gebruikt die bestaan uit inter-repeat sequenties die op basis van het te onderzoeken DNA zijn gegenereerd door middel van een polymerase chain reaction (PCR) met repeat-specifieke primer(s).

Een zeer belangrijke voorkeursuitvoeringsvorm van de uitvinding wordt gekenmerkt doordat men in de hybridisatie analyse als probe gebruik maakt van een of meer inter-repeat sequenties die door middel van een PCR met repeat-specifieke primer(s), uitgevoerd aan subgenomisch DNA, bijvoorbeeld DNA van één chromosoom of een deel daarvan, zijn gegenereerd.

Aldus maakt de uitvinding het mogelijk om genetische variatie op specifieke chromosomen of gedeeltes daarvan te detecteren, gebruik makend van een selectieve vermenigvuldiging van dubbelstrengs DNA op bepaalde plaatsen, ten minste om de 2 miljoen baseparen, een elektroforetische scheiding van de vermenigvuldigingsprodukten in twee dimensies, overbrenging van het scheidingspatroon naar een membraanfilter, gevolgd door een hybridisatie met gelabelde DNA-fragmenten die afkomstig kunnen zijn van (a) gekloneerd DNA, zoals cosmide- en YAC (yeast artificial chromosome) klonen, of (b) chromosomen of gedeeltes daarvan zoals verkregen na flow-sortering van chromosomen of zoals die aanwezig zijn in een humaan-hamster somatische cel hybride.

Het te onderzoeken DNA zal meestal bestaan uit het DNA van een volledig genoom van een dier of plant, waarbij de belangrijkste toepassingen humaan DNA zullen betreffen.

In plaats van totaal humaan DNA kan men ook uitgaan van DNA afkomstig van een bepaald humaan chromosoom of een gedeelte daarvan. Individuele chromosomen kan men verkrijgen d.m.v. flow sortering, maar dit resulteert meestal niet in een volkomen zuivere chromosoompopulatie. Een andere, vaker toegepaste methode is om uit te gaan van zg. hybride cellijnen. Daarbij wordt bijvoorbeeld een humane cellijn gefuseerd met een hamster cellijn. Meestal zullen dan na de fusie van de kernen de humane chromosomen vrijwel allemaal worden verwijderd. Hierdoor is het betrekkelijk gemakkelijk mens-hamster hybride cellijnen te verkrijgen met slechts één humaan chromosoom of een gedeelte daarvan. Door nu uit te gaan van DNA dat afkomstig is van een mens-hamster hybride cellijn, kan men in principe alle inter-Alu gebieden die gelegen zijn op een bepaald humaan chromosoom of een stuk daarvan selektief vermenigvuldigen. Een en ander is uitgebreid beschreven door Nelson et al. (1989) . Het belang van deze procedure heeft betrekking op de nieuwe mogelijkheden die ze verschaft tot het verkrijgen van DNA fragmenten uit bepaalde gedefiniëerde gedeeltes van het genoom. Deze DNA fragmenten kunnen vervolgens gebruikt worden als probes en/of geanalyseerd worden. Een en ander is expliciet door Nelson et al. (1989) vermeld (zie ook Ledbetter et al., 1990a en b; Lichter et al., 1990).

Het kwam ons voor dat inter-Alu PCR, gekoppeld aan 2-D DNA typering, gebruikt zou kunnen worden voor genoom scanning op een wijze die in ten minste twee opzichten superieur is aan de eerder beschreven genetische analyse met een elektroforetische scheiding van restrictiefragmenten in twee dimensies en een hybridisatie met GC-rijke minisatelliet core probes.

(1) Ten eerste zijn Alu, en dus ook inter-Alu, sequenties veel regelmatiger door het genoom verspreid dan minisatelliet-type sequenties (de kans dat uit een genoomfragment van 2 miljoen baseparen niet ten minste 1 inter-Alu fragment kan worden geïsoleerd middels PCR is zeer gering); de mogelijk ongunstige uitsmelteigenschappen van de Alu repeat zelf in denaturerende gradiënten speelt geen rol omdat we hier voor het merendeel te maken hebben met inter-Alu gebieden waarbij doorgaans slechts een klein gedeelte van de Alu sequentie zelf wordt meegenomen.

(2) In de tweede plaats maakt de inter-Alu methode het mogelijk om, na een twee-dimensionale scheiding van de fragmenten die zijn gegenereerd met totaal genomisch DNA als substraat, bepaalde specifieke gebieden te herkennen door hybridisatie met een probe-mengsel bestaande uit inter-Alu PCR produkten welke afkomstig zijn van een specifiek chromosoom (verkregen via flow-sortering of als hybride cellijn) of een deel daarvan, bijv. in de vorm van cosmide- of YAC klonen.

Omdat bekend is dat de 3' uiteinden van Alu sequenties een AT-rijk VNTR type polymorfisme kunnen hebben (Economou et al., 1990; Epstein et al., 1990; Zuliani en Hobbs, 1990) kunnen verschillende allelen van een "inter-Alu" locus op een isotherm in de denaturerende gradiënt dimensie op lengte van elkaar worden onderscheiden. Zodoende kan een 2-D scheidingspatroon van inter-Alu PCR produkten afkomstig van totaal genomisch DNA van verschillende individuen direkt informatie verschaffen omtrent genetische verschillen en overeenkomsten, en wel specifiek voor bepaalde chromosomen of delen daarvan, afhankelijk van het gebruikte probe-mengsel. Als probemengsels kunnen bijvoorbeeld dienen inter-Alu produkten afkomstig uit mens-hamster hybride cellijnen die een of meerdere chromosomen van de mens bevatten, of delen daarvan. De desbetreffende DNAs kunnen worden gelabeld en vervolgens gebruikt als hybridisatieprobe voor de analyse van 2-D scheidingspatronen van inter-Alu PCR produkten (wegens gebrek aan homologie zal het hamster DNA niet binden). Dit zal resulteren in een individu-specifiek vlekkenpatroon, waarbij elke vlek in principe een variant is van een inter-Alu DNA fragment dat gelocaliseerd is in het gebied dat wordt gespecificeerd door het humane chromosoom (of deel daarvan) aanwezig in de hybride cellijn.

Tevens kunnen als probemengsels inter-Alu produkten van YAC- en cosmideklonen worden gebruikt, afkomstig uit referentie-bibliotheken, met als voordeel dat een direct verband kan worden gelegd tussen de fysische kaart (= de plaats in de sequentie volgorde) en de genetische kaart van het genoom (=de plaats op een van de chromosomen zoals bepaald door koppelingsonderzoek) .

Het voor de probe gebruikte label is op zichzelf niet kritisch en alle voor DNA of RNA probes bekende labels kunnen worden toegepast. Zo is bijvoorbeeld mogelijk dat de probe die in de hybridisatie analyse wordt toegepast, gelabeld is met een radioisotoop zoals 32P en 35S, met een hapteen zoals biotine en digoxigenine, met een fluorescente stof of met een combinatie van dergelijke labels.

De hierboven beschreven methode kan worden toegepast bij de bepaling van genetische variatie in elke dier- of plante- soort, mits individuele chromosomen of delen daarvan beschikbaar zijn, bijv. in de vorm van geflowsorteerde chromosomen, hybride cellijnen (het DNA van de andere species mag dan geen homologie hebben met de "Alu-achtige" priming sites in DNA van de te onderzoeken species) en cosmide- of YAC klonen.

De methode is ook niet beperkt tot de Alu of Alu-achtige repeat familie maar kan tevens worden toegepast op andere humane repeat families, zoals de Kpn familie (zie Ledbetter et al., 1990a; zie verder Tabel 2 voor een overzicht van Kpn specifieke primers en Figuur 4 voor een schematisch overzicht van de opbouw van Kpn repeats en de bindingsplaatsen van de Kpn primers) of repeat families waarvan de localisatie beperkt is tot bijv. de centromeren of de telomeren (zelfs van bepaalde chromosomen; zie Tabel 3 voor een overzicht van primers die specifiek zijn voor een centromeer repeat op chromosoom 21; zie Devilee et al., 1988) en op repeat families in andere dier- en plantesoorten. Bovendien is het natuurlijk mogelijk combinaties van repeats te gebruiken zodat inter-repeat gebieden kunnen worden gedetecteerd die ingesloten liggen tussen bijvoorbeeld een Alu aan de ene kant en een Kpn aan de andere kant.

TABEL 2: herkomst en sequentie van Kpn/LINE specifieke primers Niet gepubliceerd:

KpnA 5'-CGCGGGCGGCCGC-CCTAATGCTAGATGACGAGTTAGTGGG-3'

KpnB 5'-CGCGGGCGGCCGC-GGGTGCAGCACACCAACATGGC-3'

KpnBl 5'-CGCGGGCGGCCGC-GGGTGCAGCACACAAC-3'

KpnC 5'-CGCGGGCGGCCGC—GGCACATGTATACATATGTAACAAACCTGC—3*

KpnC1 5'-CGCGGGCGGCCGC-CATGGCACATGTATAC-31

KpnD 5 *-CGCGGGCGGCCGC-GCACGTTGTGCACATGTACCCTAGAACTTAA-3*

Ledbetter et al., 1990a:

LlHs 5'-CATGGCACATGTATACATATGTAAC(A/T)AACC-3' TABEL 3: herkomst en sequentie van humaan chromosoom 21 centromeer-specifieke LI.26 primers Niet gepubliceerd: L1265a 51-CGCGGGCGGCCGC-CATTCTCAAGAAACTGCTTTGTGATG-3' L1265b 51-CGCGGGCGGCCGC-CATCAGAAAGCAGTTTCTTGAGAATG-31 L12 63 5'-CGCGGGCGGCCGC-CATTCTCAAGAAACTGCTTTGTGATA-3’ L126W 5 *-CGCGGGCGGCCGC-CATTCTCAAGAACT(T/G)GTT(T/C) (G/C)TGATG-31 L1263' 5'-CGCGGGCGGCCGC-GGA(G/T)(C/T)GCTTTGACGATTTCG-3' L126N 51-CGCGGGCGGCCGC-GACAGAAGCATTCTCAGAAAC-3’

De uitvinding kan worden toegepast in de genetische diagnostiek, waarbij de opsporing van DNA merker probes voor erfelijke kenmerken centraal staat. Dit is het geval in de medische diagnostiek waarbij de methode kan worden gebruikt om in korte tijd een groot aantal polymorfe plaatsen in een tevoren gedefiniëerd gebied binnen een chromosoom te screenen op individuele verschillen, welke informatie direkt kan worden gebruikt voor de verkrijging van een merker voor een erfelijk kenmerk, zoals bijvoorbeeld een erfelijke ziekte. Blijkt een bepaalde variant van een inter-Alu gebied bijv. steeds over te erven samen met een bepaald erfelijk kenmerk, dan is het mogelijk het desbetreffende DNA fragment uit het hybridisatie-membraan te isoleren middels PCR. Het desbetreffende fragment kan vervolgens in detail worden gelocaliseerd. Een alternatief is het tevoren localiseren van alle vlekken (inter-Alu varianten) die men in een 2-D chromosoom-specifieke DNA-scan aan kan treffen en deze te herleiden tot een bepaalde recombinant DNA kloon in één van de voor publiek toegankelijke referentie-bibliotheken. De vorming van zo'n database van polymorfe DNA sequenties als vlekken in een 2-D scheidingspatroon is op een uitgebreide wijze besproken in Uitterlinden en Vijg, 1989 en EP-A-0 3'49 024.

De uitvinding heeft dus betrekking op het volgende: 1. Elektroforetische scheiding in 2 dimensies (d.w.z. grootte en basepaarsamenstelling) van inter-repeat PCR produkten verkregen uit totaal genomisch DNA van een mens, dier of plant m.b.v. een of meerdere primers specifiek voor een of meerdere repeterende sequenties.

2. Hybridisatie van het scheidingspatroon verkregen onder 1 met een probe-mengsel bestaande uit inter-repeat PCR fragmenten verkregen van (1) gezuiverde chromosomen, of delen daarvan, van het organisme dat bestudeerd wordt, en/of (2) genomisch DNA afkomstig van somatische celhybriden met daarin als complement het chromosoom of de chromosomen, of gedeelten daarvan, van het organisme dat bestudeerd wordt, en/of (3) cosmide- en/of YAC klonen.

De uitvinding kan worden geïllustreerd aan de hand van de volgende experimenten.

Experiment 1

Met als substraat een aantal genomische DNA monsters van verschillende herkomst werd een PCR reactie uitgevoerd, gebruik makend van PCR primer TC65. De primer werd gesynthetiseerd op een Gene Assembler Plus (Pharmacia, Zweden) en werd direct na de deprotectie-isolatiestap gebruikt zonder verdere opzuivering. De sequentie van deze primer, bestaande uit 30 nucleotiden, is 5'-AAGTCGCGGCCGCTTGCAGTGAGCCGAGAT-3' (zie ook Nelson et al., 1989). De PCR reacties werden uitgevoerd in een totaal volume van 50 μΐ (microliter) met daarin 400 ng genomisch DNA, 1 μΜ primer TC65, 50 mM KC1, 10 mM Tris.HCl pH 8.0, 1.5 mM MgCl2/ 200 μΜ dATP, 200 μΜ dTTP, 200 μΜ dCTP, 200 μΜ dGTP en 1 unit Taq polymerase (Gibco-BRL, Bethesda, Maryland, USA). Gebruikmakend van een geautomatiseerde "thermal cycler" (BIOMED, Duitsland) werden in totaal 30 cycli doorlopen waarbij een cyclus bestond uit achtereenvolgens 2 min denaturatie bij 95°C, 1 min annealing bij 60°C, en 4 min extensie bij 72°C. De eerste denaturatie stap werd met 5 min verlengd en de laatste extensie stap werd met 4 min verlengd. De gebruikte genomische DNA monsters waren Chinese Hamster Ovary (CHO) totaal genomisch DNA en Hela humaan totaal genomisch DNA, en CHO-humaan somatische celhybriden genomisch DNA van de volgende cellijnen: 643C-13, 21q+, R2-10W, ACEM, 2Fur-l, 7253X-6, en 153E7b (zie Gardiner et al., 1990). In Figuur 5A is het humane chromosoom 21 complement van deze hybriden weergegeven. Na afloop van de reactie werd 25 μΐ van het reactiemengsel op een 1 mm dikke 5% polyacrylamide (PAA) gel (acrylamide : bisacrylamide = 37:1) geëlektroforeerd, gebruik makend van een gelapparaat zoals beschreven in Fischer en Lerman, 1979. De elektroforese (2 uur en 250 Volt) vond plaats in lxTAE (40 mM Tris.HCl pH 7.4, 20 mM Na-acetaat, 1 mM Na-EDTA) bij 50°C. Na afloop werd het scheidingspatroon zichtbaar gemaakt door kleuring met ethidiumbromide (0.1 μg per ml) en ontkleuring in water gedurende 30 min. Uit Figuur 5B blijkt dat de TC65 PCR reactie specifiek is voor humaan DNA aangezien geen kleuring optreedt in de laan met PCR produkten van totaal genomisch hamster DNA. In de laan met totaal genomisch humaan DNA is een smeer te zien met een enkele band erin. Dit is te wijten aan het zeer grote aantal verschillende inter-Alu produkten afkomstig van alle humane chromosomen tezamen. In de lanen met de CHO-mens celhybriden zijn echter discrete banden te zien. Aangezien deze hybriden alleen het humane chromosoom 21 hebben, moeten deze banden afkomstig zijn van inter-Alu gebieden op het humane chromosoom 21. De bandenpatronen verschillen onderling hetgeen een afspiegeling is van de verschillende stukken van chromosoom 21 die de desbetreffende cellijn heeft (zie Fig. 5A). Op deze wijze kunnen specifieke banden als afkomstig uit specifieke gebieden op het chromosoom worden geïdentificeerd.

Experiment 2

Zoals beschreven onder experiment 1 werd een TC65 PCR reactie uitgevoerd, waarbij nu als substraat genomisch DNA van de cellijn 7253X6 werd vergeleken met Hela humaan genomisch DNA. Na de PCR reactie werd 25 μΐ van beide reaktieprodukten gescheiden op een PAA gel zoals boven beschreven. Na kleuring van dit 1-D scheidingspatroon werden de fragmenten met een lengte gelegen tussen 10 kilobaseparen (kb) en 600 baseparen (bp) als laantjes uitgesneden en opgebracht op een 2-D PAA gel. De 2-D gel was een 1 mm dikke 6% PAA gel (zie boven) die een 10-75% lineaire gradiënt bevatte van de denaturantia ureum en formamide (100 % denaturantia komt overeen met 7.0 M ureum, 40% formamide) parallel aan de richting van de electroforese. De gels werden bereid door de twee oplossingen met de twee uiterste denaturantia concentraties, welke het traject van de gradiënt bepalen, te mengen in een gradiënt mixer (Gibco-BRL) hierbij gebruik makend van een peristaltische pomp (LKB, Zweden). De electroforese voor de tweede dimensie scheiding werd uitgevoerd bij 55°C in lxTAE, gedurende 12 uur. Na afloop van de scheiding werd de 2-D gel gekleurd zoals boven beschreven (zie Figuur 6). Het scheidingspatroon van 7253X6 toont aan dat de TC65 inter-Alu PCR fragmenten focusseren als spots in de 2-D gel. Op de plaats waar de TC65 inter-Alu PCR produkten van totaal genomisch humaan Hela DNA zich bevinden is niets op gel te zien omdat de concentratie van individuele PCR fragmenten te laag is om met ethidiumbromide kleuring aan te tonen.

Om deze fragmenten zichtbaar te maken werd het 2-D scheidingspatroon overgebracht op een nylon membraan (Hybond N-plus, Amersham, UK) door middel van electroblotting tussen horizontale grafiet platen met de anode aan de bovenkant (zie ook Vijg en Uitterlinden, EP-A-0 349 024) . Hiertoe werd de 2-D gel eerst gedurende 4 min bestraald met UV licht van 302 nm (Transilluminator, UV products, CA, USA) . De gel werd op het nylon membraan gelegd en vervolgens tussen aan weerszijden drie Whatmann 3MM papierbladen gelegd die met lxTBE (89 mM Tris. boraat pH 8.0, 89 mM boorzuur, 2 mM Na-EDTA) verzadigd waren. Deze sandwich werd tussen de grafietplaten gelegd en de electro-blotprocedure werd 1 uur uitgevoerd waarbij de spanning opliep van 6 tot 28 Volt en de stroom constant op 400 mA werd gehouden. Na de electroblotting werd het nylon membraan op een blad Whatmann 3MM gelegd dat verzadigd was met 0.4 N natriumhydroxide en vervolgens 10 min in de 1 M Tris.HCl pH 8.0 gelegd voor de neutralisatie, om zodoende de DNA fragmenten op het membraan enkelstrengs te maken. Het membraan werd aan de lucht gedroogd en vervolgens met 302 nm UV bestraald om de DNA fragmenten aan het membraan te binden door cross-linking. Dit membraan werd vervolgens onderworpen aan hybridisatieanalyse waarbij als probe gebruikt werd 3 μΐ van het TC65 inter-Alu PCR mengsel verkregen met 7253X6 als substraat (en waarvan 25 μΐ in de eerste dimensie gescheiden werd op gel, zie Figuur 5 en 6). Deze fragmenten werden met a32P-dCTP gelabeld in de random prime labelling (Feinberg en Vogelstein, 1984). Voor gebruik in de hybridisatie werd dit gelabelde probe mengsel enkelstrengs gemaakt door het 5 min te laten koken en werd het vervolgens gepreïncubeerd met 200 μg gedeeltelijk afgebroken humaan DNA in een totaal volume van 1 ml gedurende 1 uur bij 65°C, om kruishybridisatie met de Alu repeats zelf te onderdrukken en alleen de inter-Alu sequenties te laten hybridiseren.

Hybridisatieanalyse werd uitgevoerd in glazen buizen in een hybridisatie oven (GFL, Duitsland) bij 65°C. Het membraan werd eerst 15 min gepreïncubeerd in de hybridisatievloeistof die bestond uit 7 % SDS, 0.5 M Na-fosfaat pH 7.2, 1 mM Na-EDTA. Hierna werd de gelabelde en gepreïncubeerde 7253X6 TC65 inter-Alu probe erbij gedaan en vond de hybridisatiereaktie plaats gedurende 16 uur. Hierna werd het membraan achtereenvolgens gewassen in 2,5 x SSC/0.1 % SDS, 1 x SSC/0.1 % SDS, en 0,1 x SSC/0.1 % SDS (1 x SSC komt overeen met 150 mM NaCl en 15 mM Na-citraat) bij 65°C gedurende 30 min voor iedere wasstap. Aan het membraan werd vervolgens een Kodak XAR film blootgesteld gedurende 5 uur en daarna gedurende 48 uur bij -80°C. Figuur 7 toont dat na hybridisatie hetzelfde scheidingspatroon voor de 7253X6 TC65 inter-Alu PCR produkten wordt zichtbaar gemaakt als hetgeen we na ethidiumbromide kleuring zagen. Belangrijker is dat we op de plaats van de Hela TC65 inter-Alu produkten ook spots kunnen waarnemen. Dit toont aan dat het mogelijk is om in een inter-Alu PCR reaktie op totaal genomisch humaan Hela DNA bepaalde inter-Alu produkten zichtbaar te maken door middel van hybridisatie met gelabelde inter-Alu produkten. De plaats van de spots in het Hela patroon komt overeen met die in het 7253X6 patroon.

Experiment 3

De onder experiment 1 en 2 beschreven analyses zijn verricht met een primer (TC65) die specifiek is voor het 3’ uiteinde van de Alu repeat en die een inter-Alu produkt oplevert indien de flankerende Alu repeats in een bepaalde geïnverteerde oriëntatie gelegen zijn. Het is echter ook mogelijk een primer (517) te kiezen die specifiek is voor Alu en die inter-repeat PCR produkten oplevert indien de flankerende Alu repeats juist de omgekeerde oriëntatie hebben (zie tevens de Figuren 2 en 3). Verder zijn vergelijkbare PCR produkten te verkrijgen indien primers worden gekozen voor repeats zoals de Κρη I repeats (zie Tabel 3) . Deze hebben een soortgelijke verspreiding door het genoom en een vergelijkbaar kopie aantal. Met behulp van de beschreven Kpn primers in combinatie met de Alu primers werden PCR experimenten onder vergelijkbare condities verricht en werden eveneens bandenpatronen verkregen vergelijkbaar met die verkregen met de Alu primers alleen (zie de Figuren 8 en 9) .

Experiment 4

Naast primers specifiek voor repeats die verspreid door het genoom voorkomen, zijn inter-repeat primers te gebruiken die specifiek zijn voor in de centromeren gelegen repeats zoals de alphoïde satellite repeats (LI.26 en anderen). Indien deze primers in combinatie met Alu en/of Kpn primers gebruikt worden in soortgelijke experimenten als experimenten 1, 2 en 3, kunnen bandenpatronen worden verkregen (zie Figuur 9), vergelijkbaar met die welke in de Figuren 5 en 8 zijn getoond.

Bijschriften bij de Figuren

Ficuur 1

Tweedimensionaal scheidingspatroon, gegenereerd met behulp van minisatellite core probe 33.6 van humane HaelII DNA restrictiefragmenten afkomstig van een moeder (cirkel), vader (vierkant rechts) en hun zoon (vierkant midden).

Figuur 2

Schematisch overzicht van het principe van de inter-Alu PCR amplificatie met behulp van primers TC65 en 517 (zie Nelson et al., 1989).

Figuur 3

Schematisch overzicht van de bindingsplaatsen van de Alu-specifieke primers op de Alu repeat.

Figuur 4 A. Schematisch overzicht van de opbouw en kopieaantal in het humane genoom van Kpn/LINE repetitieve sequenties.

B. Schematisch overzicht van de bindingsplaatsen van de Kpn/LINE-specifieke PCR primers.

Figuur 5 A. Schematisch overzicht van de samenstelling voor wat betreft de chromosoom 21 inhoud van humaan-hamster somatische cel hybriden gebruikt voor de inter-repeat PCR amplifikaties.

B. Met ethidiumbromide aangekleurd ééndimensionaal scheidingspatroon van de PCR produkten, verkregen na een inter-Alu PCR amplifikatie met behulp van primer TC65 op de leden van het somatische hybriden panel getoond in 5A en op totaal hamster genomisch DNA en totaal humaan genomisch DNA.

Eig.uur, 6

Met ethidiumbromide aangekleurd tweedimensionaal scheidingspatroon van inter-Alu PCR amplifikatie produkten, verkregen met primer TC65 uit de somatische cel hybride 72532X6.

Figuur 7

Autoradiogrammen (A is de korte en B is de lange belichting) van een tweedimensionaal scheidingspatroon van inter-Alu PCR amplifikaties met primer TC65 van humaan totaal genomisch DNA (Hela) en van de somatische cel hybride 72532X6. Pijlen verwijzen naar spots in het Hela scheidingspatroon na de lange belichting die op eenzelfde plaats in het 72532X6 patroon te herkennen zijn.

Figuur 8

Met ethidiumbromide aangekleurd ééndimensionaal scheidingspatroon van inter-repeat PCR amplifikatie produkten, verkregen met een combinatie van de Alu-specifieke primer TC65 met de Kpn-specifieke PCR primers KpnA, -B, -C, en -D met als substraat totaal hamster genomisch DNA en DNA uit de somatische celhybride 72532X6.

Figuur 9

Met ethidiumbromide aangekleurd ééndimensionaal scheidingspatroon van inter-repeat PCR amplifikatie produkten, verkregen met de Alu-specifieke primers 517 en TC65 in combinatie met de Kpn-specifieke primers KpnA, -B, -C, en -D en in combinatie met de chromosoom 21-specifieke centromeerprimers 26.5B, 26W en 26.3 met als substraat totaal hamster genomisch DNA en DNA van de somatische celhybride 153E7b.

REFERENTIES

Cotter, F.E., Hampton, G.M., Nasipuri, S., Bodmer, W.F., and Young, B.D. (1990) Genomics 7, 257-263.

Devilee, P., Slagboom, P., Cornelisse, C.J., and Pearson, P.L. (1988) Nucl. Acids Res. 14, 2059-2073.

Donis-Keller, H. et al. (1987) Cell 51, 319-337. Economou, E.P., Bergen, A.W., Warren, A.C., and Antonarakis, S.E. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 2951-2954.

Epstein, N., Nahor, 0., and Silver, J. (1990) Nucl.

Acids Res. 18, 4634.

Feinberg, A.P., and Vogelstein, B. (1984) Anal. Biochem. 137, 266-267.

Fischer, S.G., and Lerman, L.S. (1979) Cell 16, 191-200. Fischer, S.G., and Lerman, L.S. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 1579-1583.

Gardiner, K. Horisberger, M., Kraus, J., Tantravahi, U., Korenberg, J., Rao, V., Reddy, S., and Patterson, D. (1990) EMBO

J. 9, 25-34.

Korenberg, J.R., and Rykowsky, M.C. (1988) Cell 53, 391- 400.

Ledbetter, S.A., Nelson, D.L., Warren, S.T., and Ledbetter, D.H. (1990a) Genomics 6, 475-481.

Ledbetter, S.A., Garcia-Heras, J., and Ledbetter, D.H. (1990b) Genomics 8, 614-622.

Lengauer, C., Riethman, H., and Cremer, T. (1990) Hum. Genet. 86, 1—6.

Lerman, L.S., Fischer, S.G., Hurley, I., Silverstein, K. , and Lumelsky, N. (1984) Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 13, 399-423.

Lichter, P., Ledbetter, S.A., Ledbetter, D.H., and Ward, D.C. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 6634-6638.

Moyzis, R.K., Torney, D.C., Meyne, J., Buckingham, J.M., Wu, J.-R., Burks, C., Sirotkin, K.M., and Goad, W.B. (1989) Genomics 4, 273-289.

Nelson, D.L., Ledbetter, S.A., Corbo, L., Victoria, M.F., Ramirez-Solis, R., Webster, T.D., Ledbetter, D.H., and Caskey, C.T. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 6686-6690.

Orita, M., Sekiya, T., and Hayashi, K. (1990) Genomics 8, 271-278.

Royle, N.J., Clarkson, R.E., Wong, Z., and Jeffreys, A.J. (1989) Genomics 3, 352-360.

Schmid, C.W., and Jelinek, W.R. (1982) Science 216, 1065-1070.

Southern, E.M. (1975) J. Mol. Biol. 98, 503-517. Uitterlinden, A.G., Slagboom, P.E., Knook, D.L., and Vijg, J. (1989) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86, 2742-2746.

Uitterlinden, A.G., and Vijg, J. (1989) TIBTECH 7, 336- 341.

Zuliani, G., and Hobbs, H.H. (1990) Am. J. Hum. Genet. 46, 963-969.

Claims (15)

1. Werkwijze voor het detecteren van genetische variatie door DNA fragmenten, afgeleid van een te onderzoeken DNA monster, aan een tweedimensionale elektroforetische scheiding te onderwerpen waarbij de fragmenten in de ene dimensie op basis van verschillen in lengte, en in de andere dimensie op basis van verschillen in basevolgorde worden gescheiden, het resulterende scheidingspatroon over te brengen naar een membraan filter en het overgebrachte scheidingspatroon aan een hybridisatie analyse te onderwerpen onder toepassing van een of meerdere DNA of RNA probes, met het kenmerk, dat men DNA fragmenten gebruikt die bestaan uit inter-repeat sequenties die op basis van het te onderzoeken DNA zijn gegenereerd door middel van een polymerase chain reaction (PCR) met repeat-specifieke primer(s).

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat men in de hybridisatie analyse als probe gebruik maakt van een of meer inter-repeat sequenties die door middel van een PCR met repeat-specifieke primer(s), uitgevoerd aan subgenomisch DNA, bijvoorbeeld DNA van één chromosoom of een deel daarvan, zijn gegenereerd.

3. Werkwijze volgens conclusie 2, met het kenmerk, dat het subgenomisch DNA door flow-sortering uit totaal genomisch DNA is verkregen.

4. Werkwijze volgens conclusie 2, met het kenmerk, dat het subgenomisch DNA afkomstig is uit een hybride cellijn.

5. Werkwijze volgens conclusie 2, met het kenmerk, dat het subgenomisch DNA afkomstig is uit een cosmide- of yeast artificial chromosome (YAC) kloon.

6. Werkwijze volgens een of meer van de voorgaande conclusies, met het kenmerk, dat men inter-Alu sequenties toepast die door middel van een PCR met Alu-specifieke primer(s) zijn gegenereerd.

7. Werkwijze volgens conclusie 6, met het kenmerk, dat in de PCR gebruik wordt gemaakt van Alu-specifieke primer(s), gekozen uit de groep bestaande uit TC65, 517, PDJ33, PDJ34, PDJ33A, PDJ34A en PRIM IV.

8. Werkwijze volgens een of meer van de conclusies 1-5, met het kenmerk, dat men inter-Kpn sequenties toepast die door middel van een PCR met Kpn-specifieke primer(s) zijn gegenereerd.

9. Werkwijze volgens conclusie 6, met het kenmerk, dat in de PCR gebruik wordt gemaakt van Kpn-specifieke primer(s), gekozen uit de groep bestaande uit KpnA, KpnB, KpnBl, KpnC, KpnCl, KpnD en LIHs.

10. Werkwijze volgens een of meer van de conclusies 1-5, met het kenmerk, dat men inter-repeat sequenties, gelegen tussen een Alu-repeat en een Kpn-repeat, toepast die door middel van een PCR met een Alu-specifieke en een Kpn-specifieke primer zijn gegenereerd.

11. Werkwijze volgens conclusie 10, met het kenmerk, dat in de PCR gebruik wordt gemaakt van een Alu-specifieke primer, gekozen uit de groep bestaande uit TC65, 517, PDJ33, PDJ34, PDJ33A,. PDJ34A en PRIM IV, en een Kpn-specifieke primer, gekozen uit de groep bestaande uit KpnA, KpnB, KpnBl, KpnC, KpnCl, KpnD en LIHs.

12. Werkwijze volgens een of meer van de conclusies 1-5, met het kenmerk, dat men inter-centromeerrepeat sequenties toepast die door middel van een PCR met centromeerrepeat-specifieke primer(s) zijn gegenereerd.

13. Werkwijze volgens conclusie 12, met het kenmerk, dat in de PCR gebruik wordt gemaakt van een centromeerrepeat-specifieke primer, gekozen uit de groep bestaande uit Ll265a, Ll265b, L1263, L126W, L1263’ en L126N.

14. Werkwijze volgens een of meer van de conclusies 1-5, met het kenmerk, dat men inter-telomeerrepeat sequenties toepast die door middel van een PCR met telomeerrepeat-specifieke primer(s) zijn gegenereerd.

15. Werkwijze volgens een of meer van de voorgaande conclusies, met het kenmerk, dat de probe die in de hybridisatie analyse wordt toegepast, gelabeld is met een radioisotoop zoals 32p en 35s, een hapteen zoals biotine en digoxigenine, en/of met een fluorescente stof.