CN1288252C

CN1288252C - 扩增显微切割的染色体dna的方法及其应用

Info

Publication number: CN1288252C
Application number: CN02827308.7A
Authority: CN
Inventors: 关新元; J·S·T·沙姆; 胡亮
Original assignee: University of Hong Kong HKU
Current assignee: University of Hong Kong HKU
Priority date: 2002-08-22
Filing date: 2002-08-22
Publication date: 2006-12-06
Anticipated expiration: 2022-08-22
Also published as: CN1615367A; WO2004018691A1

Abstract

本发明公开了一种扩增显微切割的染色体DNA的方法，包括步骤：以显微切割的染色体DNA为模板，并且以Alu特异性引物为引物，进行扩增反应，其中所述的Alu特异性引物都特异性地结合于Alu序列的5′端且延伸方向为Alu序列的3′→5′方向，或者都结合于Alu序列的3′端且延伸方向为Alu序列的5′→3′方向。本发明还包括了该方法在制备荧光探针上的应用。用本发明方法可消除Alu重复序列，因此用其制备的FISH探针的非特异性背景信号可显著降低。

Description

扩增显微切割的染色体DNA的方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种扩增显微切割的染色体DNA的方法。利用该新方法得到的扩增产物中基本上不含有基因组重复序列。利用该扩增产物制备的FISH探针可有效地消除了因重复序列引起的非特异性杂交信号，从而提高了FISH探针的准确性。

背景技术

染色体显微切割技术是1980年代建立起的一项细胞分子生物学技术，1990年初，Meltzer等人将其与染色体荧光原位杂交技术相结合，创立了显微-荧光原位杂交技术(Micro-FISH)(Meltzer PS，Guan X-Y，Burgess A，Trent JM：Nature Genetics，1：24，1992)。此后，经过近十年的努力，Micro-FISH技术已广泛地被用于细胞生物学及分子生物学研究中，成为染色体诊断中的关键技术之一。

以下是染色体显微切割技术应用较广泛的几个方面：

1.被用来制备染色体特异区带DNA文库。此文库可以用来做分子定位克隆(Guan X-Y，Meltzer PS，Cao J，and Trent JM：Genomics，14：680，1992)。

2.被用来制备各类染色体相关涂染探针，比如全染色体涂染探针(GuanX-Y，Meltzer PS，and Trent JM：Genomics，22：101，1994)，染色体臂涂染探针(Guan X-Y，Zhang HE，Bitter M，Jiang Y，Meltzer PS，and TrentJM：Nature Genetics，12：10，1996)，染色体区带特异性探针(Guan X-Y，Meltzer PS，Burgess A，and Trent JM：Human Genetics，95：637，1995)等，此类探针已被广泛地应用于实体肿瘤染色体变异及先天性染色体畸变的研究中，并已被用来进行产前诊断。

3.被用来直接检测未知来源的标记染色体(Unknown Marker)，以确定该染色体的组成及来源(Guan X-Y，Meltzer PS，Dalton WS，Trent JM：Nature Genetics，8：155，1994；Guan X-Y，Horsman D，Zhang H，MeltzerPS，and Trent JM：Blood，88：1418，1996)。

4.被用来筛选染色体特异性区带扩增的癌基因相关基因(Guan X-Y，XuJ，Anzick SL，Zhang HE，Trent JM，and Meltzer PS：Cancer Research，56：3446，1996；)。

传统的显微荧光原位杂交技术过程复杂，且非常容易被外源性DNA污染，所以成功的机率不高。它主要包括二个部分，(a)染色体显微切割及(b)将切割的DNA片段进行PCR扩增。具体步骤如下：1)用细玻璃针将显微镜所看到的想要切割的染色体片段切割下来，然后将被切割下的DNA片段转移到0.5毫升的小试管中，在试管中装有5微升的PCR扩增试剂。一般需要切割5-20拷贝的DNA片段。2)用Topo I酶处理DNA，其DNA双链解螺旋(美国专利5,545,524)，或者用胃蛋白酶预处理DNA(美国专利6,228,587)，然后用一种被称为UN1的PCR引物扩增DNA(CCGACTCGAGNNNNNNATGTGG，SEQID NO：3)，UN1中含有22个碱基，其中前6个碱基为特异序列，从第7到12这六个为随机组合，所以该引物只要前6个碱基与被扩增的DNA相对应，就可以与该DAN序列中的12个碱基配对，从而扩增DNA。该引物的主要优点是特异性低，可以将各种DNA扩增。但是UN1也存在着许多缺点：1)由于缺乏特异性，该引物不仅可以扩增被切割的人DNA，也可同时扩增包括细菌在内其它DNA，由于被切割的DNA量很小，所以任何外源性DNA污染都会导致实验失败。2)由于该物仅有12个特异相配对的碱基，所以与变性的被切割的DNA相配对时所要求的温度很低，一般30℃左右，与一般的PCR所要求的56℃相差甚远，所以必须加一步预PCR，此步骤非常繁琐，而且在进行时容易导致外源性DNA污染，使整个实验失败。3)由于该引物的22个碱基中有6个是随机的，所以该引物实际上包含有4096(4⁶)个不同组合的引物，对其中每一种引物来说，其浓度都不高。由于上述几种主要缺点，该技术的使用受到了很大的限制。另外，由UN1引物所扩增的DNA中含有大量的重复序列，这些重复序列在进行原位杂交时会与散布在人基因组中的大量相应的重复序列进行非特异性杂交，而增加杂交的背景信号。所以在进行染色体原位杂交前，必须先与未标记的人重复序列(如Alu序列，卫星体序列等)进行预杂交，从而阻断这些被标记的重复序列与基因组中的重复序列杂交。

在人类基因组中存在许多重复的DNA序列。这些序列非常相似，在整个基因组中不断出现。其中，以Alu序列出现频率最高，大约每隔4千碱基对就会出现一次。Alu序列占人类基因组总DNA量5％左右，高达900,000拷贝，其中60％序列成员含有限制性内切酶Alu的切口，故叫做Alu家族，主要集中在细胞分裂晚期的R带，大部分属于非编码DNA，但也有一部分位于mRNA的非翻译区，甚至位于编码区内。Alu序列最长的约150碱基对。人类Alu序列长度约300bp，本身又由120bp和150bp的重复序列组成，两者之间由富含A的区域分开，两端又有一段7-10bp的正向重复序列。Alu序列之间并不完全一样，存在一些差异。由于这些重复序列可以相互杂交而产生非特异背景信号，因而会干扰特异性杂交信号。这是目前用显微切割的染色体DNA制作FISH探针所面临的最大难题。

由于荧光原位杂交(Fluorescence In Site Hybridization，FISH)探针可用于多种用途，其中包括遗传病诊断(主要是各种染色体异常)，产前诊断(孕妇遗传病筛查)，肿瘤分型、诊断和预后检验，观测放射线和其他环境因素对人体的损害，因此，本领域迫切需要改进显微-荧光原位杂交技术，以便获得非特异性背景信号降低的FISH探针。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的扩增显微切割的染色体DNA的方法及其在制备FISH中的应用，该方法可以有效地去除重复序列，从而消除因重复序列导致的非特异性杂交信号的干扰，提高杂交结果的准确性和可靠性。

在本发明的第一方面，提供了一种扩增显微切割的染色体DNA的方法，它包括步骤：以显微切割的染色体DNA为模板，并且以Alu特异性引物为引物，进行扩增反应，

其中所述的Alu特异性引物都特异性地结合于Alu序列的5′端且延伸方向为Alu序列的3′→5′方向，或者都结合于Alu序列的3′端且延伸方向为Alu序列的5′→3′方向。

在另一优选例中，所述扩增反应是聚合酶链反应。

在一优选例中，所述的Alu特异性引物长度为15-25bp。在另一优选中，所述的Alu特异性引物选自下组：

AD-1：5′-ACA GAG YRA GAC TCY RTC TCA AC-3′(SEQ ID NO：1)

AD-2：5′-ACC AAC GAA TTC AGA CTC YRT CTC AAC-3′(SEQ ID NO：2)

其中：Y＝C或T；R＝A或G。

在本发明的第二方面，提供了一种产生荧光标记探针的方法，它包括步骤：

(a)通过扩增反应扩增出多核苷酸产物，在所述扩增反应中以显微切割的染色体DNA为模板，并且以Alu特异性引物为引物，其中所述的Alu特异性引物都特异性地结合于Alu序列的5′端且延伸方向为Alu序列的3′→5′方向，或者都结合于Alu序列的3′端且延伸方向为Alu序列的5′→3′方向；

(b)对步骤(a)中的多核苷酸产物进行荧光标记，产生荧光标记探针。

在本发明的一优选例中，所述的荧光标记探针是荧光原位杂交探针。

在本发明的第三方面，还提供了用上述方法制得的荧光标记探针。

附图说明

图1是用Alu引物扩增的PCR产物的电泳图，其中分子量标记物(SM)是100bp的DNA梯(DNA ladder)。泳道1表示不加任何DNA模板；泳道2表示以AD-2为引物，以显微切割的DNA为模板；泳道3表示以AD-2为引物，以全基因组DNA为模板。

图2是用上述方法制得的荧光标记探针所作的荧光原位杂交(FISH)图。以AD-2为引物，用PCR方法荧光标记第一轮PCR产物，产生荧光标记探针。图2A表示以AD-2为引物，以显微切割的DNA为模板制得的17号全染色体荧光标记探针(红色信号)，其中chromosome 17表示17号染色体。图2B表示以AD-2为引物，以显微切割的DNA为模板制得的11q13HSR荧光标记探针(红色信号)。

具体实施方式

如本文所用，术语“显微切割的染色体DNA片段”指通过显微切割术而获得的染色体片段，其长度没有特别限制，通常为5,000-20,000kb。

如本文所用，术语“Alu特异性引物”指特异性结合于Alu序列的3′端末端，从而使聚合酶链反应扩增产物不含有或基本上不含有Alu重复序列的引物。Alu特异性引物分为二类：第一类Alu特异性引物是特异性地结合于Alu序列的5′端且延伸方向为Alu序列的3′→5′方向；第二类Alu特异性引物是结合于Alu序列的3′端且延伸方向为Alu序列的5′→3′方向。

本发明人经过广泛而深入的研究，建立了一种以显微切割的染色体DNA为模板，高效扩增DNA序列的新方法。该方法采用了设计独特的扩增引物(即Alu特异性引物)来替代UN1引物，其中扩增引物在位于人基因组DNA中高频率出现的Alu重复序列的3′端或5′端。该方法的特点是，利用这种引物通过PCR方法扩增显微切割的染色体DNA中的人基因组DNA序列，可以有效地去除人基因组DNA中高频率出现的Alu重复序列。

本技术方法的原理是利用Alu序列出现频率的特点，以Alu一端的序列为模板，设计相应的引物。当两个Alu序列相隔不远，即在一个正常PCR反应扩增范围内(一般在2千碱基对内)并且这两个Alu序列的方向相对(如3′端对3′端)时，就可以扩增出在此两个Alu序列之间的基因组DNA序列。由于用本方法扩增出的DNA序列位于两个Alu重复序列之间，所以它不再含有重复序列。

以大小为约5000千碱基对的、显微切割的染色体DNA片段为例，以平均每4千碱基对出现一次Alu序列计算，通常在一个片段中可以有1250个左右的Alu序列，其中相当一部分相隔距离在PCR反应扩增范围内。因此，当使用本发明的Alu特异引物扩增该显微切割的DNA片段中的人基因组DNA时，就可以大大增加得到单一序列的机会。

在本发明中，对PCR反应条件没有特别限制，常规的特异性扩增的PCR条件都可用于本发明。一种常用的条件是90-95℃变性45-75秒，50-65℃退火30-90秒，70-74℃延伸30-90秒，共25-45个循环(较佳地30-40个循环)。

实验结果证明了此新技术方法的可行性和高效率。以例如5-10个显微切割的染色体DNA片段为模板，分别用本发明设计的Alu序列3′端特异引物扩增时，所有的PCR都得到多种PCR产物。

因此，利用本发明的新技术方法可以快速从显微切割的染色体DNA中扩增出基本上不含重复序列的单一人基因组DNA序列。

与传统的用UN1引物引物扩增被显微切割的人染色体DNA相比较，用AD-1或AD-2引物扩增被显微切割的人染色体DNA具有以下三个主要优点：

1)由于Alu序列是人基因组中特异性重复序列，因此，AD-1或AD-2只能特异性地扩增来源于人基因组的DNA序列，从而大大减少扩增时被外源DNA(如细菌DNA)污染的可能性，提高染色体显微切割的成功率。

2)该方法可以简化扩增DNA的步骤，不再需要用Topo I酶或胃蛋白酶处理被显微切割的染色体DNA，也不再需要另加一步预PCR，从而减少了染色体显微切割所需的时间并减少了成本。(当然，如果需要，仍然可以在PCR扩增之前用Topo I酶或胃蛋白酶进行预处理)。

3)该方法在扩增被显微切割的染色体DNA时，可以有效地去除DNA中的重复序列，从而消除因重复序列导致的非特异性杂交信号干扰。

本发明的技术有多种用途，其中包括但并不限于：

(1).这些被扩增得到的单一序列可以作为基因探针，进行Southern印迹分子杂交；

(2).这些被扩增得到的单一序列可以经过荧光标记，进行染色体荧光原位杂交(FISH)；

(3).这些被扩增得到的单一序列可以结合在固相载体表面制成基因组DNA芯片，进行基因检测和诊断。

用本发明方法获得的多核苷酸产物或其片段可以用于制备探针，例如染色体荧光原位杂交(FISH)探针。因此，本发明还提供了一种产生荧光标记探针，尤其是FISH探针的方法。本发明制备FISH探针的方法与现有技术的区别仅在于用作探针的DNA不同。因此，常规的各种制备FISH探针的方法和荧光染料(如荧光素、罗丹明等)都可用于本发明。

由于用本发明方法获得扩增产物消除了Alu重复序列，因此，用其制备的FISH探针的非特异性背景信号可显著降低。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

引物合成

用人工合成的方法分别合成如下引物：

AD-1：5′-ACA GAG YRA GAC TCY RTC TCA AC-3′(SEQ ID NO：1)

AD-2：5′-ACC AAC GAA TTC AGA CTC YRT CTC AAC-3′(SEQ ID NO：2)

其中：Y＝C或T；R＝A或G。

这两个引物都特异性地结合于Alu序列的3′端且延伸方向为Alu序列的5′→3′方向。

实施例2

染色体显微切割

在显微镜下找到要切割的染色体，用显微操作器控制的细玻璃针切割相应的染色体片段，将被切割的染色体DNA转入含有AD-1或AD-2引物的PCR反应液中，一般一次显微切割需要切割5-10个拷贝的染色体片段。当显微切割完成后，被切割的染色体DNA用于PCR扩增反应。

实施例3

PCR扩增

本实施例中，取实施例1中取5-10个拷贝显微切割的染色体DNA(作为PCR反应的模板)，在50μl(微升)反应总体积中进行反应。该反应体系中的成分为：10mM Tris-HCl，pH 8.4，2mM MgCl，50mM KCl，0.1mM明胶，200mMDNTP，0.5mM引物AD-1或AD-2，2单位Taq polymerase)。

所述的PCR反应条件是：92-95℃变性45-75秒，50-65℃退火30-90秒，70-74℃延伸60-120秒，共30-40个循环。

通过凝胶电泳来检测PCR产物。结果如图1所示，PCR产物的大小分布在300-800个碱基对之间。此外，PCR结果还显示Alu特异性引物如AD-2引物可以特异性地扩增来源于人基因组的DNA序列(泳道3)，而不会非特异性地扩增其他来源的DNA。同时也显示AD-2引物可以有效地扩增显微切割的DNA(泳道2)。与AD-2引物一样，AD-1引物也能有效扩增显微切割的染色体DNA。

实施例4

染色体荧光原位杂交(FISH)

通过染色体荧光原位杂交来检测染色体显微切割的结果。其具体过程如下：

用PCR方法荧光标记第一轮PCR产物，产生荧光标记探针。所述的PCR反应条件是：92-95℃变性45-75秒，50-65℃退火30-90秒，70-74℃延伸60-120秒，共20-30个循环。其中的模板是实施例3中的扩增产物，引物是AD-1或AD-2引物。

荧光标记探针经沉淀离心后，溶于TE缓冲液中。每一次FISH反应需要100-200纳克的荧光探针，探针被溶于10微升的FISH反应缓冲液中，经过在75℃十分钟变性后，与也经过变性的分裂中期染色体进行过夜杂交(参看Guan X-Y，Trent JM，and Meltzer PS：Human Molecular Genetics，2：1117，1993)。杂交后经冲洗及荧光测定处理，即可在荧光显微镜显微下观察杂交结果(见图2)。

实施例5

对PCR产物的保存、筛选和鉴定

将上述获得的PCR扩增产物克隆到质粒载体(pBS)中，以便于保存及今后大量复制。在AD-2引物中设计了一个限制性内切酶EcoRI切点(GAATTC)，经EcoRI消化后，可以将PCR扩增产物克隆到EcoRI消化的质粒载体中。

然后，用Alu序列筛选阴性克隆。即用含多种人基因组重复序列的细菌人工染色体(BAC)克隆RPII-110-0-7(大小为120kb)筛选出不含Alu重复序列的阴性克隆。接着，用PCR反应扩增出插入片段，并通过凝胶电泳法测定插入片段的大小。此外，还可以进一步对一些PCR产物做了DNA序列测定分析。

序列表

<110>香港大学

关，新元

<120>一种消除基因组重复序列的新方法及其在基因组芯片中的应用

<130>014159 PCWO

<160>3

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>Y＝C，T；R＝A，G

<220>

<221>misc_feature

<223>合成的引物

<400>1

acagagyrag actcyrtctc aac 23

<210>2

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>Y＝C，T；R＝A，G

<220>

<221>misc_feature

<223>合成的引物

<400>2

accaacgaat tcagactcyr tctcaac 27

<210>3

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(11)..(16)

<223>n＝a，t，c或g

<220>

<221>misc_feature

<223>合成的引物

<400>3

ccgactcgag nnnnnnatgt gg 22

Claims

1.一种扩增显微切割的人染色体DNA的方法，其特征在于，包括步骤：以显微切割的人染色体DNA为模板，并且以Alu特异性引物为引物，进行扩增反应，

其中，所述的Alu特异性引物都特异性地结合于Alu序列的5′端且延伸方向为Alu序列的3′→5′方向，或者都结合于Alu序列的3′端且延伸方向为Alu序列的5′→3′方向。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述扩增反应是聚合酶链反应。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的PCR反应条件是：90-95℃变性45-75秒，50-65℃退火30-90秒，70-74℃延伸30-90秒，共25-45个循环。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的Alu特异性引物长度为15-25bp。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的Alu特异性引物选自下组：

AD-1：5′-ACA GAG YRA GAC TCY RTC TCA AC-3′(SEQ ID NO：1)

AD-2：5′-ACC AAC GAA TTC AGA CTC YRT CTC AAC-3′(SEQ ID NO：2)

其中：Y＝C或T；R＝A或G。

6.一种产生人染色体荧光标记探针的方法，其特征在于，它包括步骤：

(a)通过扩增反应扩增出多核苷酸产物，在所述扩增反应中以显微切割的人染色体DNA为模板，并且以Alu特异性引物为引物，其中所述的Alu特异性引物都特异性地结合于Alu序列的3′端且延伸方向为Alu序列的5′→3′方向。

(b)对步骤(a)中的多核苷酸产物进行荧光标记，产生人染色体荧光标记探针。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的荧光标记探针是荧光原位杂交探针。

8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述扩增反应是聚合酶链反应。

9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的Alu特异性引物长度为15-25bp。

10.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的Alu特异性引物选自下组：

AD-1：5′-ACA GAG YRA GAC TCY RTC TCA AC-3′(SEQ ID NO：1)

AD-2：5′-ACC AAC GAA TTC AGA CTC YRT CTC AAC-3′(SEQ ID NO：2)

其中：Y＝C或T；R＝A或G。