CN1329673A - 利用改进的循环测序方法进行多点基因组分析 - Google Patents

利用改进的循环测序方法进行多点基因组分析 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种方法,用于在一种反应混合物中对含有第一和第二靶核酸序列的核酸进行测序。该靶序列可存在于相同的或不同的核酸分子上。提供的第一和第二标记测序引物可分别与第一和第二靶核酸序列杂交。第二测序引物的长度应至少与第一测序引物加第一靶序列的总长度相同。由第二测序引物开始的各测序引物延伸产物要长于样品中由第一测序引物开始的引物延伸产物。一旦测序反应完成,即可通过已知方法,如凝胶电泳法,对该样品中引物延伸产物的长度进行检测。

Description

利用改进的循环测序方法 进行多点基因组分析
发明领域
本发明涉及核酸分析的方法,其中包括可用于序列分析以及细胞类型的诊断鉴别,如病理组织鉴定,的方法。
发明背景
已知有多种核酸测序的方法。当今使用的大多数DNA测序方法均来源于Sanger的双脱氧链终止法(Sanger,F.,S.Nicklen and A.R.Coulson(1977)“用能够使链终止的抑制物对DNA进行测序”PNAS USA74:5463-5467)。这些方法都是在聚合酶的催化下由一种与待测序链的一部分互补的标记引物引发复制。这些方法通常需要进行四组聚合酶反应,每组使用四种双脱氧核苷酸(ddNTPs)中的一种与普通的脱氧核苷酸混合。ddNTPs不能与随后的核苷酸形成磷酸二酯键,因此各反应混合物中的链聚合作用随机终止于一种ddNTP,从而产生一系列被标记的链,这些链的长度可表明序列中特定碱基的位置。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳可依据大小将所得标记片段分离。片段在凝胶中的位置可通过对标记的检测来加以确定,例如,放射自显影方法可用来检测放射性标记的片段。最近对Sanger测序法的一些变化进行了修改,使其适于在采用多荧光标记及毛细管凝胶电泳方法的大规模自动测序中使用。
测序前的序列扩增可采用聚合酶链反应(PCR)。PCR方法的各方面公开于以下美国专利中,在此均引入作为参考:Mullis et al.于1987年7月28日发布的4,683,195和Mullis于1987年7月28日发布的4,683,202(另外还可参考美国专利号4,965,188;Saiki et al.,(1988)Science 239:487-491;以及Mullis,K.B.et al.(eds.),1994,“聚合酶链反应”,Springer Verlag,ISBN 0817637508)。PCR是利用能够在间插序列的任一端与对立链退火的引物来扩增该间插序列的。在活性聚合循环之间要将聚合酶链反应混合物加热,以使互补链分离。在适当条件下,这些循环可使靶序列扩增上百万倍。然后即可对扩增DNA进行测序。
核酸扩增技术可有效用于许多种病原体或其它生物的检测。同样,将基因组的可变区扩增可用来区分不同的生物,该方法有时被称为DNA指纹法。但是当出现非特异性扩增时,由扩增反应可能会获得假阳性结果。此问题的一种改进方法是对单一样品进行多次扩增反应,这有时被称为多重扩增法,其实例公开于Caskey et al.在1996年12月10日发布的美国专利号5,582,989、Diamandis et al.在1996年9月3日发布的美国专利号5,552,283以及Atwood et al.在1995年4月4日发布的美国专利号5,403,707(在此均引入作为参考)。专利号5,582,989指出,在上文提到的Mullis及Mullis et al的专利中公开的原始PCR方法不适用于同时发生的多重扩增反应。美国专利号5,403,707指出,在多重扩增反应中适合于使用长度非常相似因而解链温度也类似的引物。
为了提供序列信息,可将核酸扩增技术加以修改并与测序反应化学相结合。这种系统可称为“循环测序系统”,该系统通常涉及使用一对与扩增引物相似并且能够在所需序列的任一端与对立链退火的引物。对常规扩增反应化学的修改可包括,在反应混合物中加入一种链终止核苷酸(如一种ddNTP)以使某些引物延伸产物终止于所需序列中出现该核苷酸的位置。但有些引物扩增产物会延伸至对立的引发位点(opposite priming site),从而可作为下一轮扩增反应中引物延伸的模板。在该方法的一种修改方案中,可利用两种各带一独特标记的链特异性引物对双链DNA的两条链同时进行双向测序。有多种商品形式的试剂盒可以使用,它们可提供适当的试剂以及利用热稳定性聚合酶实现这些反应的说明:SequiTherm Long-Read循环测序试剂盒LC(目录号S36100LC),Epicentre Technologies,Madison,Wisconsin,U.S.A.;SequiTherm Excel Long-Read DNA 测序试剂盒LC(目录号SE6100LC),epicentre Technologies,Madison,Wisconsin,U.S.A.;带有7-deaza-dGTP的热测序酶荧光标记引物循环测序试剂盒(目录号RPN2438),Amersham Life Science,Cleveland,Ohio,U.S.A.;以及CircumVent热循环测序试剂盒(目录号430-100),New EnglandBiolabs,Beverly,Mass,U.S.A。
粘膜疾病(MD)是最常见于牛的一种可引起巨大经济损失的病毒性疾病。MD的特征为发热、流涎、鼻分泌物、腹泻、厌食、脱水和流产。该疾病是由一种称为牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的RNA病毒引起的。几种BVDV变体的基因组序列已被了解(Collett,M.S.et al.,1988,“瘟病毒牛腹泻病毒的分子克隆及核苷酸序列”,Virolgogy165:191-199;Pellerin et al.,1994,“伴有重度蔓延及高死亡率的一种牛病毒性腹泻病毒株新组群的鉴定”,Virolgogy 203:260-268)。BVDV属于瘟病毒家族,它与导致寄生性疾病和猪霍乱的病毒有很多相似之处。BVDV在非致细胞病变(ncp)及致细胞病变(cp)的毒株中均存在。ncp毒株可在不造成任何破坏的情况下存活于动物组织中,这可作为一种潜在的发明。cp毒株则会导致细胞瓦解和疾病。
作为一种多态性RNA病毒,BVDV是众多生物的一个实例,针对这些生物需要有可靠的诊断协议,并且应该有高效的多态性测定技术,这些多态性可表明与该生物的不同品系相关的不同病变。特定病原体的完整或部分核酸序列可作为其进化谱系的证据,可有效确定该进化谱系的技术还将提供有关该生物的流行病学信息。
发明概述
本发明的目的是提供一些方法,用于在单个反应中同时分析多种核酸区段。例如,这些方法适于分析由多重扩增反应获得的序列。这些信息可有效地用于可靠的诊断和病理组织的鉴别。这些信息还可用于通过常被称为“DNA指纹”的方法对个体进行基因组鉴别。
在一项实施方案中,本发明提供一种方法,用于在一种反应混合物中对含有第一和第二靶核酸序列的核酸进行测序。该靶序列可存在于相同的或不同的核酸分子上。提供的第一和第二标记测序引物可分别与第一和第二靶核酸序列杂交。第二测序引物的长度应至少与第一测序引物加第一靶序列的总长度相同。该反应混合物可含有一种DNA聚合酶、脱氧核糖核苷酸和一种链终止脱氧核糖核苷酸,该反应的条件需使第一和第二靶序列可通过第一和第二测序引物在聚合酶作用下的分别延伸而复制。与典型的Sanger测序反应相同,链终止核苷酸在聚合酶作用下的定期掺入可使聚合作用终止,从而产生长度各异的引物延伸样品库。根据本发明,该样品中由第二测序引物开始的各引物延伸产物要长于由第一测序引物开始的引物延伸产物。一旦测序反应完成,即可通过已知方法,如凝胶电泳法,对该样品中引物延伸产物的长度进行检测。
本发明的方法经过修改可在含有附加靶核酸序列的情况下使用。在此类实施方案中,需额外提供能够与附加靶序列杂交的标记测序引物。该附加测序引物的长度应至少与引物延伸产物样品库中最长的序列相同。
这些测序引物可有一种或多种是含有与靶核酸序列不同源的一部分序列的“加尾”测序引物。加尾测序引物的非同源部分可位于其能够与靶序列杂交的加尾测序引物区段的5’端。在可选实施方案中,该测序引物的“加尾”部分可含有非线性DNA分子,如支链DNA或枝状核酸。作为选择,也可由非DNA形成该测序引物,以使该引物具有适于在本发明中使用的分子量。
本发明的方法包括利用一种扩增反应对第一和第二靶核酸序列进行扩增的步骤。有多种扩增反应可以使用,其中包括聚合酶链反应。举例来说,该扩增反应可包括,在反应混合物中加入各含有互补链的第一和第二双链核酸待扩增区段,其互补链需具有限定待扩增区段的反向5’端。提供的第一对扩增引物之一需能够与第一待扩增区段的互补链的各5’端杂交。第一待扩增区段可包含或等同于将成为本发明所述测序反应的主体的第一靶核酸序列。提供的第二对扩增引物之一需能够与第二待扩增区段的两条互补链的各5’端杂交。第二待扩增区段可包含或等同于将至少被部分测序的第二靶核酸序列。该反应混合物可含有一种DNA聚合酶,以及脱氧核糖核苷三磷酸,该反应的条件需使第一和第二待扩增区段可通过第一和第二对扩增引物在DNA聚合酶作用下的分别延伸而复制。此后则与典型的聚合酶链反应相同,即通过该反应混合物在第一温度和第二温度间的循环来扩增该核酸区段,其中第一温度能够使该待扩增区段的互补链解链,第二温度则能够使扩增引物与该待扩增区段的互补链5’端退火,并能够使第一和第二待扩增区段在聚合酶的催化下分别由第一对和第二对扩增引物延伸并复制。
本发明的测序反应和扩增反应可在一次循环测序反应中结合使用,其中第一对和第二对扩增引物之一分别等同于第一和第二标记测序引物。
在一项可选实施方案中,本发明的方法可进一步包括在扩增过程中使序列延伸的步骤(可称为“递升”(step up)扩增)。在该实施方案中,第一对扩增引物之一可含有能够与第一待扩增区段的一条互补链的5’端杂交的序列。该递升扩增引物还可含有不能与该互补链的5’端杂交的附加序列。这些附加序列可用来在扩增过程中使该序列延伸。
本发明所述在扩增过程中使序列延伸的方法包括,在反应混合物中加入一种双链核酸待扩增区段。该待扩增区段含有第一和第二互补链。该待扩增区段由第一和第二互补链的5’端界定。提供的第一扩增引物含有与第一互补链的5’端互补的序列,并且含有不与第一互补链的5’端互补的附加序列。第一扩增引物的这些附加序列可位于其靶序列互补序列的5’端。提供的第二扩增引物含有与靶序列的第二链的5’端互补的序列。该反应混合物可含有一种DNA聚合酶,以及脱氧核糖核苷三磷酸,该反应的条件应适于使扩增引物在聚合酶的催化下延伸。通过该反应混合物在第一温度和第二温度间的循环可使待扩增区段扩增和延伸,其中第一温度能够使靶核酸序列的互补链解链,第二温度则能够使扩增引物与互补链的5’端退火,并能够使扩增引物在聚合酶的催化下延伸。
应该了解的是,使序列延伸并扩增的方法经过修改可使用均带有附加序列的系列引物,从而可使待扩增区段的大小进一步递升。在上述实例的基础上,通过提供一种含有第一扩增引物附加序列的互补序列的第三扩增引物可使待扩增区段进一步扩增和延伸。该第三扩增引物继而可进一步含有不与第一扩增引物或待扩增核酸序列互补的“增补”序列。这些增补序列可作为待扩增区段进一步延伸的基础。该增补序列可位于第三扩增引物中能够与第二扩增引物的附加序列互补的序列的5’端。
附图简述
图1为多点基因组分析方案的示意图,显示对α、β、δ三种基因组区段的分析。这三种区段的扩增各使用了一对PCR引物,α区段扩增使用引物i和i’,β区段扩增使用引物ii和ii’,δ区段扩增使用引物iii和iii’。在α、β和δ区段被扩增后即可对其进行测序。α区段中A片段的测序使用测序引物a,β区段中B片段的测序使用测序引物b,δ区段中D片段的测序使用“加尾”测序引物d。测序引物b的长度大于测序引物a加A片段的总长度。测序引物d的长度大于测序引物b加B片段的总长度。另外还显示了测序胶10的图示。
图2显示利用引物e和e’以及选择使用测序终止子t进行的双向测序示意图。该终止子的Tm应高于引物e和e’的Tm。
图3显示对F片段进行“递升”扩增以用于由测序引物f进行测序的示意图。第一回合扩增使用PCR引物v和v’,产生多聚核苷酸F’,第二回合扩增使用测序引物vi和v’,产生多聚核苷酸F”,第三回合扩增使用PCR引物vii和v’,产生多聚核苷酸F”’
发明详述
本发明提供一种对至少含有第一和第二待测区段的核酸,如DNA或RNA,进行测序的方法。该待测区段可存在于相同的核酸分子(或基因组)上,也可存在于同一样品中的不同分子上。
选择的测序引物需能够在适当条件下与待测区段杂交,即该引物能够与该区段的5’端退火以引发聚合作用。引物的选择应能够使其在测序反应中各产生一组不同的片段。例如,两种引物中第二种引物的选择应使其长度至少与第一测序引物加第一待测区段的总长度相同。因此,由第二种引物起始的测序反应产物将始终长于由第一种测序引物起始的测序反应产物。
该测序反应可通过在存在聚合酶、核苷酸和一种链终止核苷酸的情况下将测序引物与待测核酸相混合的已知方法来实现。采用的条件应能够使所需区段在聚合酶作用下由测序引物起始并复制。链终止核苷酸的定期掺入可使聚合作用终止,从而产生长度各异的一组序列样品。在选择适当长度的引物方面,必须使该样品中起始于一种引物的各序列的长度不同于由另一引物起始的序列的长度。某些实施方案中选定的适当条件适合于使用优选长度为10-600碱基对(bp)的测序引物,更优选的则为16-500bp。举例来说,当使用两种引物并且第二引物的长度大于第一引物加上由第一引物测定的第一区段的总长度时,由第二引物产生的所有序列的长度都将大于该样品中由第一引物起始的序列的长度。图1中的测序胶10图示说明了测序反应产物的这种长度差异。用长度大于由其它任何引物进行的测序反应中的产物的引物当然可对附加区段进行类似的测序。
通过对待测核酸的特定长度的选择可限定测序反应产物的长度。举例来说,对特定长度的限制性片段(可利用已知技术进行亚克隆)或扩增产物进行测序可产生一组长度各异的测序反应产物样品,其长度的最小值为测序引物的长度,最大值为待测核酸片段的长度。
作为选择,也可利用含有一种能与待测区段3’端杂交的寡聚核苷酸的测序终止子来限定测序反应产物的长度,其中该测序终止子带有一种不会启动聚合作用的3’末端,如3’端ddNTP。图2说明了选择使用测序终止子t来限定由测序引物e延伸的测序反应产物长度的实例。终止子t可以是,例如,带有3’双脱氧核苷酸的一种多聚核苷酸,或3’端不能进一步延伸的任何其它核苷酸或部分。
事实上,根据本发明所述使用加长的测序引物可提高由测序反应产生的引物延伸产物的分子量,由一个引物产生的测序反应产物不同于另一个引物产生的测序反应产物。在可选实施方案中,也可使用带有其它化学修饰的测序引物来类似地改变测序引物延伸产物的分子量,以使这些引物延伸产物能够被区分开来。可选修饰包括使用已知类型的非线性DNA分子,如支链DNA或枝状核酸。有关支链DNA技术的描述可参考,例如:Cao Y,et al,1995,“用于人血浆中1型HIV定量的支链DNA信号扩增技术的临床评价”,AIDS研究与人逆转录病毒11(3):353-361;Collins M.L.et al.,1995,“用于支链DNA杂交定量测定的RNA标准的制备及其特性”,Analytical Biochemistry226(1):120-129;Dewar R.et al.,1994,“利用支链DNA信号扩增技术来监测人血浆中的I型人免疫缺陷病毒”,Journal of InfectiousDiseases 170:1172-1179。枝状核酸为高度分支的分子,其创建可通过单链核酸的受控杂交和交连来实现,有关这方面的描述可参考:Nilsen,T.W.et al.,1997,“枝状核酸结构”,J.Theor.Biol.187(2):273-84。一种可选方法是用亚磷酰胺对引物进行修饰,以适当增加其分子量。这些对测序引物的可选化学修饰方法经过修改可使测序反应产物的表现分子量发生改变,使得开始于一种引物的所有片段与开始于另一种引物的测序反应产物在表观分子量上有所不同。
因此,提供的测序引物除应满足第一和第二测序引物可分别与第一和第二靶序列杂交,以便对该靶序列进行分析之外,还应满足“第二”引物在凝胶电泳上的表观分子量至少等于延伸的“第一”测序引物,即延伸并包含了第一靶序列的第一测序引物,的表观分子量。
对测序反应产物的分析可采用已知的测序技术,如根据长度将样品中的序列分离,并检测该样品中序列的长度。由放射性标记测序引物产生序列,然后在聚丙烯酰胺凝胶上分离,再进行放射自显影的方法即属于此类技术。可选方法还包括,将荧光标记的测序反应产物经毛细管凝胶电泳分离后进行检测。
作为一个方面,本发明的测序反应可以只使用一种链终止核苷酸。在该实施方案中,只能获得所需区段的四种核苷酸中的一种核苷酸序列信息。该方法的优点在于只需进行一次测序反应,其结果也可由单次检测过程,如聚丙烯酰胺测序凝胶上的单一泳道,来加以测定。这种技术特别适用于已知区段的常规序列,并希望测定所需样品中包含的该区段是否与该已知序列相符的情况。例如,为了排除发生假阳性扩增反应的可能性,需要对扩增反应正确扩增了靶序列的结果加以证实。部分序列信息也可用来区分特定机体的亚类。举例来说,诸如病毒等病原体的不同变异体或与疾病或疾病易感性相关的等位基因可通过部分测序来加以区分。
在一项可选实施方案中,可如图2所示对所需区段进行双向测序。图2显示的双向测序引物e和e’标定出待测区段E。在本发明的一项派生方案中,当使用了诸如能在不同波长下吸收或发射的荧光标记引物等可辨别标记进行双向测序反应时,则可利用测序凝胶上的单一泳道对两次双向测序反应的测序反应产物进行电泳。根据本项发明,这些技术可应用于多种所需区段。
作为本发明的一个方面,待测区段可首先被扩增。待测区段的扩增可采用,例如,聚合酶链反应方法。待测区段可含有全部的或只含部分的扩增序列。若只有部分扩增区段要测序,那么测序引物将嵌套在扩增区段范围内。若整个扩增区段都要测序,那么测序引物可选自扩增引物,每个扩增区段选择一种测序引物。图1的示意图说明了本发明该方面的多点基因组分析协议,该图显示了对α、β、δ三种基因组区段的分析。在该实施方案中,这三种区段的扩增各使用一对PCR引物:α区段扩增使用引物i和i’,β区段扩增使用引物ii和ii’,δ区段扩增使用引物iii和iii’。在α、β和δ区段被扩增后即可对其进行测序。在该说明性实施方案中,α区段中A片段的测序使用测序引物a,β区段中B片段的测序使用测序引物b,δ区段中D片段的测序使用“加尾”测序引物d。如图1的公式“b>a+A”所示,测序引物b的长度大于测序引物a加A片段的总长度。与此类似,如图1的公式“d>b+B”所示,测序引物d的长度大于测序引物b加B片段的总长度。另外还显示了测序胶10的图示,a与a+A之间的带为α区段测序产生的片段,b与b+B之间的带为β区段测序产生的片段,d与d+D之间的带为δ区段测序产生的片段。
有关PCR实施方法的描述可见,例如,Innis et al.(eds)1995“PCR策略”,Academic Press,Inc.San Diego;及Erlich(ed),1992,“PCR技术”,Oxford University Press,New York,它们均在此引入作为参考。常规PCR扩增可在缓冲水溶液中进行,溶液的优选pH为7-9,最优选的约为8。加入适量(与靶序列的适当摩尔比)的引物对。再将过量的脱氧核糖核苷三磷酸dATP、dCTP、dGTP和dTTP加入合成混合物,并将所得溶液加热至约85℃-100℃,保持约1-10分钟,优选的为1-4分钟。然后将该溶液冷却,一般冷却至约20℃-40℃,即适于引物杂交的温度。在冷却的混合物中引发聚合作用,一般是通过加入酶,如DNA聚合酶,来实现。在特定实施方案中,可用于此的适当的酶包括,例如,E.coli DNA聚合酶I、E.coli DNA聚合酶I的Klenow片段、T4 DNA聚合酶或其它DM聚合酶、逆转录酶或其它酶,其中包括可促进脱氧核糖核苷三磷酸以适当方式结合从而形成与各核酸链模板互补的引物延伸产物的热稳定酶。该合成通常起始于引物的3’端,并沿模板链持续进行,直至合成终止。新合成的互补链可作为模板用于随后的扩增步骤。下一步,如上文所述将互补链分离,并作为可与引物杂交的单链分子用于链的延伸。链的分离和延伸步骤可根据需要屡次重复,以产生预期量的靶核酸序列。由此可以使产生的靶核酸序列的量呈指数累加。
适当的扩增条件可由本发明所涉及领域的技术人员根据已知技术来建立。例如,在某些实施方案中,适当的条件包括:0.2mM dNTP、2.2mMMgCl2、50mM KCl、10mM Tris-HCl pH9.0、0.1%Triton X-100。
利用该领域的已知标准,如上述有关常规扩增的参考文献中拟定的标准,可选定适用于本发明所述特定分析方法的扩增引物。就PCR扩增而言,设计的引物一般应使各引物沿双链靶序列的杂交位置能够使一种引物合成的延伸产物在与模板分离后可作为另一种引物延伸的模板。扩增引物的长度一般约为10-30个核苷酸,更常见的约为14-24个核苷酸。但在本发明的“循环测序”反应和“递升”扩增反应中,优选的是使用更长的引物。
也可根据本发明的不同方面使用替代的序列扩增方法。例如,该领域的技术人员可由以下技术修改出适当的方法:链置换扩增法(可参考,例如,Persing et al.(eds)“诊断分子微生物学:原理及应用”,American Society for Microbiology,Washington,D.C.);连接酶链反应法(可参考,例如,Wu(1989)Genomics 4:560或Landegrin(1988)Science 241:1077或Barringer(1990)Gene 89:117);基于转录的扩增方法(可参考,例如,Kwoh Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,86:1173(1989));自动维持序列扩增法(参考Guatelli(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,97:1874);Q Beta复制酶扩增法;或其它使用RNA聚合酶的技术(如NASBA,Cangene Corporation,Mississauga,Ontario)。有助于该领域技术人员实施本发明所述方法的可选参考文献如下:Berger and Kimmel,“分子克隆技术指南”,Methods in Enzymology 152:307-316,Academic Press,Inc.,SanDiego,California U.S.A;Sambrook et al.(1989)“分子克隆实验手册”(第二版)Vol.1-3,Cold Spring Harbour Laboratory,ColdSpring Harbour Press,New York。
由生物资源分离出用于本发明所述分析方法的核酸可通过多种已知方法或其等效方法或改进方法中的任意方法来实现。如Rothbart etal.(1989),“PCR技术”,Stockton Press,New York和Han et al.(1987)Biochemistry 26:1617-1625中描述的方法。也可根据厂商说明利用商品形式的试剂盒来方便地实现此目的,例如可由以下厂商购得的试剂盒:Invitrogen,San Diego,California U.S.A.;Stratagene,La Jolla,California U.S.A.。
在如图3所示的可选实施方案中,本发明采用“递升”扩增协议来增加要进行序列分析的区段的长度。该“递升”扩增法可通过如1PCR、2PCR和3PCR所示的逐次反复扩增来产生图3中显示为s和s’的一种合成区段,该区段可位于图3中显示为F、F’、F”和F”’的所需基因组区段的一端(如图所示)或两端(未显示)。图3以线性表示法用一条直线来简单显示待扩增分子,事实上,扩增底物一般为双链分子,这与常规PCR反应中的情况相同。如图3所示,第一回合扩增使用PCR引物v和v’,产生含有F’区段的多聚核苷酸。第二回合扩增(在图3中显示为2PCR)使用测序引物vi和v’,产生含有F”区段和新合成的s区段的多聚核苷酸,其中s区段相当于vi引物中不与F’区段互补的区段。第三回合扩增,3PCR,使用PCR引物vii和v’,产生含有F”’区段和合成的s’区段的多聚核苷酸,其中s’区段含有与扩增引物vi和vii互补的区段。该递升扩增法可如图3所示用来在所需区段的一端创建合成区段,也可将图3所示方法经适当修改后用来在所需区段的两端创建合成区段。利用递升扩增法产生一个或多个用来与测序引物f杂交的合成区段s的方法可作为使用“加尾”测序引物,如d,的替代方法,也可在不了解所需区段5’或3’端,如图3中F的5’端,的基因组区段序列的情况下使用。在区段两端进行递升扩增有利于使用Tms连续增加的扩增引物对。
在一项实施方案中,利用以下引物组可对BVDV基因组的一部分(BVDV基因组的6941-7255序列)进行递升扩增。在一项实施方案中,将引物组3的一种引物作为标记测序引物可进行“循环测序”(扩增反应和测序反应同时进行,即在存在一种ddNTP和一种标记引物的情况下进行扩增)。
引物组1:
5’-GTA GGT AGA GTG AAA CCC GG-3’
(与BVDV基因组的6941-6961序列互补,并且与图3中的扩增引物v类似)
5’-CGG GAC CTG GAC TTC ATA GC-3’
(与BVDV基因组的7255-7245序列互补)
引物组2:
5’-(dG)30GTA GGT AGA GTG AAA CCC GG-3’
(与图3中的扩增引物vi类似)
5’-(dG)30CGG GAC CTG GAC TTC ATA GC-3’
引物组3:
5’-(dA)30(dG)30GTA GGT AGA GTG AAA CCC GG-3’
(与图3中的扩增引物vii类似)
5’-(dA)30(dG)30CGG GAC CTG GAC TTC ATA GC-3’
作为本发明的另一方面,递升扩增引物的选择应能够使各连续扩增所用引物的解链温度高于前一扩增所用引物的解链温度。Tm最低的引物对可首先加入,然后再顺序加入Tms较高的引物对。由此,各延伸反应可在足够高的温度下进行,以防止前一扩增反应使用的引物退火。这样可以使递升扩增反应在无需插入自前一扩增反应中去除扩增引物这一步骤的情况下连续进行,同时也有助于确保每一步扩增只发生于最近加入的扩增引物。例如在图3中,引物的解链温度应符合v<vi<vii的顺序。
在另一项可选实施方案中,可在第二引物及后随引物被融点渐增物质,如蜡,封装的情况下将各连续递升扩增引物于一开始即加入扩增反应。由此,当需要释放下一种引物时,可将反应混合物升高到可使引物释放的下一较高温度。该方法无需在扩增过程中将引物逐次加入反应混合物。
作为一个方面,本发明的一种或多种测序引物可含有不与使用该引物的待测区段同源的区段。此类引物可被称为“加尾”测序引物。如图1的测序引物d所示,加尾引物的非同源区段可位于该引物的5’端,因此,为了引发聚合作用,该引物的同源3’端可与所需区段退火。在可选实施方案中,该加尾引物的非同源部分可位于与所需区段同源的3’端和同样与所需区段同源的5’端区域之间。非同源序列在“加尾”引物中的任何排列方式均可接受(因此其必然具有的错配片段可能并不形成一种字面上的“尾巴”),前提是该引物仍能够引发所需区段的聚合作用。加尾引物中非同源序列的存在将影响其解链温度,从而会影响由该领域已知的测序引物杂交参数确定的实施测序反应的条件。
本发明的测序方法可有效地与核酸扩增技术结合使用,以减少扩增反应产生假阳性结果。例如,可利用PCR(对于RNA病毒可先进行逆转录,即以一种RNA分子为模板并以一种寡核苷酸为引物产生cDNA拷贝,其缩写为“RT PCR”)来检测诸如病毒核酸等样品中的靶核酸序列存在情况。该方法的公认优点是能够检测极少量的靶核酸。但如果非目的核酸被错误地扩增,那么该扩增反应会产生假阳性结果。通过对所需核酸的一个以上的目标进行扩增可增加扩增测定的可靠性,这种方法被称为多重PCR。但如果发生对一个以上区段的非特异性扩增,那么仍会产生假阳性结果。本发明的测序方法可通过提供被扩增区段的部分或完整序列而被用来检测此类假阳性结果的发生情况。因此,本发明的测序方法特别适用于利用单次测序反应对至少两种非同源区段同时进行测序。
由本发明所述方法产生的序列数据可用来提供有关生物亚型的信息。举例来说,阳性扩增反应可表明样品中存在来自该生物的靶核酸,而该检测的可靠性可通过本发明的测序方法来加以证实。由此产生的序列信息可随目标生物的不同亚型而有所不同。例如,病毒核酸经常随毒株的不同而表现出明显的可变性,尤其是诸如HIV等RNA病毒。通过选择与该生物所有毒株的普遍保守序列同源的扩增引物可对其众多毒株进行检测。然后可通过评定根据本发明产生的序列数据来测定毒株间的差异。
实施例1
该实施例公开的是本发明可用来检测牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的方面。该实施例的方法经过修改可用来检测和鉴别来自其它生物,如其它RNA病毒,的核酸。
该实施例的序列分析采用了一种双染料系统。该系统利用两种激光来检测其测序反应的标记产物。一种激光在700nm波长下激发,另一种在800nm波长下激发。测序反应的引物用两种不同的近红外荧光染料(如购于LI-COR,Inc.of Lincoln,Nebraska,U.S.A.的染料)进行标记,一种染料可对700nm激光的照射起反应,记为IRD700,另一种染料可对800nm激光起反应,记为IRD800。利用该系统可将不同测序反应产生的分子大小相同但各自被不同染料标记的两种不同的DNA片段通过其在可选波长的激光照射下的发射来加以区分。在电泳过程中可利用荧光扫描显微镜来自动检测染料标记的DNA片段。该实施例中使用的两组引物为:
引物组1
[IRD700标记的]5’GTA GGT AGA GTG AAA CCC GG
(可在6941-6961位置与BVDV基因组的第一链杂交)
[IRD800标记的]5’CGG GAC CTG GAC TTC ATA GC
(可在7255-7245位置与BVDV基因组的互补链杂交)
引物组1可扩增一种314个碱基对的区段,即第6941-7255位的区段。
引物组2
[IRD700标记的]5’(dG)300AGG CTA GCC ATG CCC TTA GT
(可在99-118位置与BVDV基因组杂交)
[IRD800标记的]5’(dG)300TCT GCA GCA CCC TAT CAG G
(可在324-342位置与BVDV基因组的互补链杂交)
引物组2可扩增一种243个碱基对的区段,即第99-342位的区段,以及两端各300bp的一段合成序列,整个片段的总长度为843。
在该实施例中,基因组分析的实施方法如下:
1.总RNA制备
总RNA提取采用的是TRIZOLTM试剂以及其厂商,LifeTechnologies,Inc.,Gaithersburg,Maryland,U.S.A.,推荐的该试剂的使用方法。作为选择,也可使用该领域技术人员所了解的任何适当方法来制备总RNA(一种可选试剂盒为购于Stratagene Corp.of LaJolla,CA,USA的RNA分离试剂盒;也可参考Chomczynski,et al.(1987)Analytical Biochemistry 162,156.“利用硫氰酸胍-酚-氯仿抽提方法单步法分离RNA”)。一项实施方案采用的方法如下:
a.在750μl Trizol试剂中加入250μl细胞悬浮液
b.室温下放置5分钟
c.加入200μl氯仿,充分混合15秒
d.混合物在12800rpm和4℃条件下离心10分钟
e.将上层的水性部分转移到新的1.5ml Eppendorf管中。
f.加入500μl异丙醇,混匀
g.室温下放置5分钟
h.混合物在12800rpm和4℃条件下离心10分钟
i.弃上清,再加入200μl 85%乙醇
j.混合物在12800rpm和4℃条件下离心10分钟
k.弃上清,并将管空气干燥
1.将总RNA悬浮于20μl焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的水中。
2.cDNA制备
可根据该领域已知的方法由分离的RNA制备出cDNA。一种实施方案如下:
a.在1.5ml离心管中将以下试剂混合:
总RNA 1-2μl;
下游引物(10pM/ml)2μl;
水8μl
b.将混合物加热至70℃,保持10分钟;
c.在加热的混合物中加入以下试剂:
5×第一链合成缓冲液4μl;
dNTP(10mM)1μl;0.1M DTT 2μl;
d.将混合物加热至42℃,保持2分钟;
e.在上述混合物中加入1μl SUPERSCRIFT II(一种购于LifeTechnologies,Inc.,Gaithersburg,Maryland,U.S.A.的逆转录酶);
f.42℃保温50分钟;
g.加热至70℃并保持10分钟,以终止反应。
3.特定区段的扩增
cDNA扩增的实施可采用该领域技术人员所了解的任何适当方法。在该实施例的实施方案中,使用的方法如下:
利用该实施例指定的引物对,在GeneAmpTM2400热循环仪上根据其厂商,Perkin-Elmer Corporation,指定的方法由2μl逆转录混合物扩增出该cDNA的两种区段:
a.在下列25μl反应混合物中进行反应:
dH2O 16.0μl
模板 2.0μl
b.将混合物加热至95℃,保持10分钟
c.制备如下标准混合物:
引物1(10pmol/μl)5μl
引物2(10pmol/μl)5μl
dNTP(10mM)  2.5μl
10×缓冲液  2.5μl
MgCl2 25mM  7.5μl
Taq 5U/μl  2.5μl
加入7.0μl标准混合物
d.PCR可根据厂商说明在GeneAmpTM2400热循环仪(Perkin-ElmerCorporation)上进行。
4.PCR产物的纯化
从未反应引物中分离扩增产物的方法可任意选择,如选择凝胶过滤方法。在该实施例中,扩增物的纯化采用的是SephadexTMG-50凝胶过滤填料(购于Sigma Chemical,St.Louis,MO,USA)。也可使用该领域所了解的其它方法来纯化扩增产物,也可将该步骤省略。
5.测序
用于双向多点循环测序的(荧光)标记引物组1和2可用来对扩增片段进行循环测序。在每组引物中,一种引物用可在700nm下吸收的荧光染料标记,另一种引物用可在800nm下吸收的荧光染料标记。在该实施方案中只使用一种双脱氧核苷酸(单道测序)。作为选择,也可制备4管,每管加入四种可能的双脱氧核苷酸中的一种,这样就可获得完整序列。
用自动测序仪(LI-COR Inc.,Lincoln,NE,USA)以1500伏电压在0.25mm厚的6%聚丙烯酰胺凝胶上分离循环测序产物。
单道序列的分析可使用适当的计算机软件,并将其与BVDV DNA亚型数据库进行比较。这种分析方法可用来鉴定该样品中的BVDV亚型。
实施例2
该实施例提供的是利用不同分子量的引物和不同的荧光标记对BVDV基因组的四种区段进行分析。该实施方案是利用实施例1所述的双染料测序系统来分辨由引物组1和2产生的共迁移测序反应产物,以及分辨由引物组3和4产生的共迁移测序反应产物,而引物组1和2的延伸产物是通过分子量与引物组3和4的延伸产物区分开来。该实施例使用的引物如下:
引物组1
[IRD700标记的]5’GTA GGT AGA GTG AAA CCC GG
(可在6941-6961位置与BVDV基因组的第一链杂交)
[未标记的]5’CGG GAC CTG GAC TTC ATA GC
(可在7255-7245位置与BVDV基因组的互补链杂交)
引物组1可扩增一种314个碱基对的区段,即第6941-7255位的区段。
引物组2
[IRD800标记的]5’AGG CTA GCC ATG CCC TTA GT
(可在99-118位置与BVDV基因组杂交)
[未标记的]5’TCT GCA GCA CCC TAT CAG G
(可在7255-7245位置与BVDV基因组的互补链杂交)
引物组2可扩增一种243个碱基对的区段,即第99-342位的区段。
加尾引物组3
[IRD700标记的]5’(dG)300GCA GAT TTT GAA GAA AGA CA
(可在4937-4960位置与BVDV基因组杂交)
[未标记的]5’(dG)300TTG GTG TGT GTA AGC CCA
(可在5591-5609位置与BVDV基因组的互补链杂交)
加尾引物组4
[IRD800标记的]5’(dG)300ACG TGG ACG AGG GCA TGC CC
(可在234-253位置与BVDV基因组杂交)
[未标记的]5’(dG)300TGT GCC ATG TAC AGC AGA GA
(可在365-384位置与BVDV基因组的互补链杂交)
基因组分析的实施可采用与实施例1公开的类似方法一致的已知方法,或其已知的可选方法。
尽管文中公开了本发明的多种实施方案,但根据该领域技术人员的常规知识可在本发明的范围内进行多种修改和更正。这些修改包括能够以基本相同的方式获得相同结果的与本发明各方面等效的替代方案。

Claims (16)

1.一种核酸测序方法,该方法包括
a.在一种反应混合物中加入第一和第二靶核酸序列;
b.在该反应混合物中加入可分别与第一和第二靶核酸序列杂交的第一和第二标记测序引物,第二测序引物的长度至少与第一测序引物加第一靶序列的总长度相同;
c.在该反应混合物中加入一种DNA聚合酶、脱氧核糖核苷和一种链终止脱氧核糖核苷酸,并置于使第一和第二靶序列可通过第一和第二测序引物在聚合酶作用下的分别延伸而复制的条件下,其中,链终止核苷酸在聚合酶作用下的定期掺入可使聚合作用终止,从而产生长度各异的一组引物延伸产物样品库,该样品库中由第二测序引物开始的各引物延伸产物要长于由第一测序引物开始的引物延伸产物;以及
d.检测该样品库中引物延伸产物的长度。
2.权利要求1的方法,该方法进一步包括利用一种扩增反应对第一和第二靶核酸序列进行扩增的步骤。
3.权利要求2的方法,其中的扩增反应为聚合酶链反应。
4.权利要求2的方法,其中的扩增反应包括:
a.在该反应混合物中加入各含有互补链的第一和第二双链核酸待扩增区段,其互补链需具有界定待扩增区段的反向5’端;
b.在该反应混合物中加入第一对扩增引物,第一对扩增引物之一需能够与第一待扩增区段的两条互补链的各5’端杂交,第一待扩增区段包含有第一靶核酸序列;
c.在该反应混合物中加入第二对扩增引物,第二对扩增引物之一需能够与第二待扩增区段的两条互补链的各5’端杂交,第二待扩增区段包含有第二靶核酸序列;
d.在该反应混合物中加入一种DNA聚合酶和脱氧核糖核苷三磷酸,并置于使第一和第二待扩增区段可通过第一和第二对扩增引物在DNA聚合酶作用下的分别延伸而复制的条件下;
e.通过该反应混合物在第一温度和第二温度间的循环来扩增该核酸区段,其中第一温度能够使该待扩增区段的互补链解链,第二温度能够使扩增引物与该待扩增区段的互补链5’端退火,并能够使第一和第二待扩增区段在聚合酶的催化下分别由第一对和第二对扩增引物延伸并复制。
5.权利要求4的方法,该方法进一步包括一种循环测序反应,其中第一对和第二对扩增引物之一分别等同于第一和第二标记测序引物。
6.权利要求4的方法,该方法进一步包括在扩增过程中使序列延伸的步骤,其中第一对扩增引物之一包含有能够与第一待扩增区段的一条互补链的5’端杂交的序列,以及不能与该互补链的5’端杂交的附加序列。
7.一种在在扩增过程中使序列延伸的方法,该方法包括:
a.在该反应混合物中加入一种双链核酸待扩增区段,该待扩增区段含有第一和第二互补链,该待扩增区段由第一和第二互补链的5’端界定;
b.在该反应混合物中加入第一扩增引物,该第一扩增引物含有与第一互补链的5’端互补的序列,并含有不与第一互补链的5’端互补的附加序列;
c.在该反应混合物中加入第二扩增引物,该第二扩增引物含有与靶序列的第二链的5’端互补的序列;
d.在该反应混合物中加入一种DNA聚合酶和脱氧核糖核苷三磷酸,并置于适合扩增引物在聚合酶的催化下延伸的条件下;
e.通过该反应混合物在第一温度和第二温度间的循环来使待扩增区段扩增和延伸,其中第一温度能够使靶核酸序列的互补链解链,第二温度能够使扩增引物与互补链的5’端退火,并能够使扩增引物在聚合酶的催化下延伸。
8.权利要求7的方法,其中,通过提供一种含有第一扩增引物附加序列的互补序列的第三扩增引物来使该待扩增区段进一步扩增和延伸,该第三扩增引物可进一步含有不与第一扩增引物或待扩增区段互补的增补序列。
9.权利要求7的方法,其中第一扩增引物的附加序列位于第一扩增引物中与靶序列互补的序列的5’端。
10.权利要求8的方法,其中第三扩增引物的增补序列位于第三扩增引物中与第二扩增引物的附加序列互补的序列的5’端。
11.权利要求1的方法,该方法进一步包括利用凝胶电泳方法将该样品库中的序列根据长度加以分离的步骤。
12.权利要求1的方法,其中第一和第二靶核酸序列存在于不同的核酸分子上。
13.权利要求1的方法,其中的反应混合物进一步含有:
a.一种附加靶核酸序列;以及
b.一种能够与附加靶序列杂交的附加标记测序引物,该附加测序引物的长度至少与引物延伸产物样品库中最长的序列相同。
14.权利要求1的方法,其中至少有一种测序引物为加尾测序引物,该加尾测序引物含有与靶核酸序列不同源的一部分序列。
15.权利要求14的方法,其中加尾测序引物的非同源部分位于其能够与靶序列杂交的加尾测序引物区段的5’端。
16.一种核酸测序方法,该方法包括:
a.在一种反应混合物中加入第一和第二靶核酸序列;
b.在该反应混合物中加入可分别与第一和第二靶核酸序列杂交的第一和第二标记测序引物,当第一测序引物延伸并包含了第一靶序列时,第二测序引物在凝胶电泳上的表观分子量至少与该第一测序引物的表观分子量相同;
c.在该反应混合物中加入一种DNA聚合酶、脱氧核糖核苷和一种链终止脱氧核糖核苷酸,并置于使第一和第二靶序列可通过第一和第二测序引物在聚合酶作用下的分别延伸而复制的条件下,其中,链终止核苷酸在聚合酶作用下的定期掺入可使聚合作用终止,从而产生长度各异的一组引物延伸产物样品,该样品库中由第二测序引物开始的各引物延伸产物在凝胶电泳上的表观分子量至少等于由第一测序引物开始的引物延伸产物的表观分子量;以及
d.检测该样品中引物延伸产物的表观分子量。
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