CN1288250C

CN1288250C - 一种消除基因组重复序列的新方法及其在fish探针制备中的应用

Info

Publication number: CN1288250C
Application number: CNB018236057A
Authority: CN
Inventors: 关新元
Original assignee: University of Hong Kong HKU
Current assignee: University of Hong Kong HKU
Priority date: 2001-07-27
Filing date: 2001-07-27
Publication date: 2006-12-06
Anticipated expiration: 2021-07-27
Also published as: CN1545559A; WO2003014385A1

Abstract

本发明公开了一种聚合酶链反应扩增方法，其中以人工染色体或长度为50-5000kb的大片段DNA分子为模板，并且以Alu特异性引物为引物，所述的Alu特异性引物都特异性地结合于Alu序列的5′端且延伸方向为Alu序列的3′→5′方向，或者都结合于Alu序列的3′端且延伸方向为Alu序列的5′→3′方向。本发明还包括了该方法在制备基因组芯片上的应用。用本发明方法获得扩增产物可消除Alu重复序列，因此用其制备的FISH探针的非特异性背景信号可显著降低。

Description

一种消除基因组重复序列的新方法及其在FISH探针制备中的应用

技术领域

本发明涉及在利用人工染色体制备FISH探针过程中消除基因组重复序列的新方法。利用该新方法得到的基因组DNA序列中不含有基因组重复序列，因此有效地消除了因重复序列引起的非特异性杂交信号，提高了FISH探针的准确性。

背景技术

2000年6月，人类基因组计划公布了人类基因组的“工作草图”。2000年1月15日，“正式版”人类基因组图谱也已面世。随着人类基因组逐渐被破译，一张生命之图将被绘就，人们的生活也将发生巨大变化。人类基因组计划的飞速发展为生物技术的开发提供了新的机会。

含有大片段DNA分子的各类人工染色体是发展人类基因组计划的副产品之一。人工染色体包括酵母人工染色体(Yeast Artficial Chromosome，YAC。其插入片段约为1,000千碱基对)，噬菌体人工染色体(Phage ArtificialChromosome，PAC。其插入片段约为100千碱基对)，细菌人工染色体(Bacterial Artificial Chromosome，BAC。其插入片段约为100千碱基对)。

这类人工染色体可以被用于作为染色体荧光原位杂交(Fluorescence InSite Hybridization，FISH)探针，用于多种用途，其中包括遗传病诊断(主要是各种染色体异常)，产前诊断(孕妇遗传病筛查)，肿瘤分型、诊断和预后检验，观测放射线和其他环境因素对人体的损害。另外，由于这些人工染色体大多数已被定位，所以它们可以被用来制作基因组芯片。

在人类基因组中存在许多重复的DNA序列。这些序列非常相似，在整个基因组中不断出现。其中，以Alu序列出现频率最高，大约每隔4千碱基对就会出现一次。Alu序列占人类基因组总DNA量5％左右，高达900,000拷贝，其中60％序列成员含有限制性内切酶Alu的切口，故叫做Alu家族，主要集中在细胞分裂晚期的R带，大部分属于非编码DNA，但也有一部分位于mRNA的非翻译区，甚至位于编码区内。Alu序列最长的约150碱基对。人类Alu序列长度约300bp，本身又由120bp和150bp的重复序列组成，两者之间由富含A的区域分开，两端又有一段7-10bp的正向重复序列。Alu序列之间并不完全一样，存在一些差异。由于这些重复序列可以相互杂交而产生非特异背景信号，因而会干扰特异性杂交信号。这是目前用人工染色体制作FISH探针所面临的最大难题。

因此，本领域迫切需要开发消除Alu重复序列的技术，以便获得降低非特异性背景信号的FISH探针。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的扩增人基因组DNA的方法，该方法用于扩增人工染色体中的人基因组DNA序列时可以有效地去除重复序列，从而消除因重复序列导致的非特异性杂交信号的干扰，提高杂交结果的准确性和可靠性。

在本发明的第一方面，提供了一种聚合酶链反应扩增方法，其中，以人工染色体或长度为50-5000kb的大片段DNA分子为模板，并且以Alu特异性引物为引物，所述的Alu特异性引物都特异性地结合于Alu序列的5′端且延伸方向为Alu序列的3′→5′方向，或者都结合于Alu序列的3′端且延伸方向为Alu序列的5′→3′方向。

在本发明的一优选例中，所述的Alu特异性引物长度为15-25bp。在另一优选中，所述的Alu特异性引物选自下组：

Alu-N1：5′-TTA CAG GYR TCA GCC ACY AC-3′(SEQ ID NO：1)

Alu-N2：5′-RCC AYT GCA CTY CAG CCT G-3′(SEQ ID NO：2)

其中：Y＝C或T；R＝A或G。

在本发明的第二方面，提供了一种产生荧光标记探针的方法，它包括步骤：

(a)通过聚合酶链反应扩增出多核苷酸产物，在所述聚合酶链反应中以人工染色体或长度为50-5000kb的大片段DNA分子为模板，并且以Alu特异性引物为引物，所述的Alu特异性引物都特异性地结合于Alu序列的5′端且延伸方向为Alu序列的3′→5′方向，或者都结合于Alu序列的3′端且延伸方向为Alu序列的5′→3′方向；

(b)对步骤(a)中的多核苷酸产物进行荧光标记，产生荧光标记探针。

在本发明的一优选例中，所述的荧光标记探针是荧光原位杂交探针。

在本发明的第三方面，还提供了用上述方法制得的荧光标记探针。

附图说明

图1是用Alu引物扩增的PCR产物的电泳图，其中模板是BAC克隆的DNA。图中，分子量标记物(M)是1kb的DNA梯(DNA ladder)。RPII-497 I 24等为BAC克隆的编号，其中RPII是BAC克隆文库(由许多盘子组成)的名称，“RP11-”后的一组数字(如497)是该文库中其中一个盘子的名称，再后面的英文字母(如I)和另一组数字(如24)分别指该BAC克隆在这个盘中所处位置的横坐标和纵坐标。

图中的5′表示5′引物，即Alu-N1：5′-TTA CAG GYR TCA GCC ACY AC-3(SEQID NO：1)；3′表示3′引物，即Alu-N2：5′-RCC AYT GCA CTY CAG CCT G-3′(SEQID NO：2)，其中：Y＝C或T；R＝A或G。

图2是用Alu引物扩增的PCR产物的Southern印迹图。其中分子量标记物(M)是1kb的DNA梯(DNA ladder)。阳性对照1和2(CTRL1和CTRL2)是BACDNA。图中，作为探针的是整个BAC克隆DNA。该BAC克隆的编号为RPII-110-0-7，大小为120kb。

具体实施方式

如本文所用，术语“人工染色体”指人工构建的具有染色体特性(如含有着丝粒、端粒及DNA复制起始点，同时还带有转化筛选标记)的，可自我复制的载体。代表性的人工染色体包括但并不限于：酵母人工染色体(YeastArtficial Chromosome，YAC)，噬菌体人工染色体(Phage ArtificialChromosome，PAC)，细菌人工染色体(Bacterial Artificial Chromosome，BAC)，哺乳动物人工染色体(Mammalian Artificial Chromosome，MAC)。例如，YAC使用酵母染色体着丝粒、端粒，依此类推。

如本文所用，术语“Alu特异性引物”指特异性结合于Alu序列的末端，从而使聚合酶链反应扩增产物不含有或基本上不含有Alu重复序列的引物。Alu特异性引物分为二类：第一类Alu特异性引物是特异性地结合于Alu序列的5′端且延伸方向为Alu序列的3′→5′方向；第二类Alu特异性引物是结合于Alu序列的3′端且延伸方向为Alu序列的5′→3′方向。

本发明人经过广泛而深入的研究，建立了一种用于在人工染色体中高效扩增人DNA序列的新方法。该方法采用了设计独特的扩增引物和扩增条件，其中扩增引物在位于人基因组DNA中高频率出现的Alu重复序列的5′端和3′端。该方法的特点是，利用这种引物通过PCR方法扩增例如细菌人工染色体(BAC)中的人基因组DNA序列，可以有效地去除人基因组DNA中高频率出现的Alu重复序列。

本技术方法的原理是利用Alu序列出现频率的特点，以Alu一端的序列为模板，设计相应的引物。当两个Alu序列相隔不远，即在一个正常PCR反应扩增范围内(一般在2千碱基对内)并且这两个Alu序列的方向相对(如5′端对5′端)时，就可以扩增出在此两个Alu序列之间的基因组DNA序列。由于用本方法扩增出的DNA序列位于两个Alu重复序列之间，所以它不再含有重复序列。

以细菌人工染色体(BAC)为例，其大小一般在100千碱基对左右。以平均每4千碱基对出现一次Alu序列计算，通常在一个BAC中可以有25个左右的Alu序列，其中相当一部分相隔距离在PCR反应扩增范围内。因此，当使用本发明的Alu特异引物扩增BAC中的人基因组DNA时，就可以大大增加得到单一序列的机会。

在本发明中，对PCR反应条件没有特别限制，常规的特异性扩增的PCR条件都可用于本发明。一种常用的条件是90-95℃变性45-75秒，50-65℃退火30-90秒，70-74℃延伸30-90秒，共25-35个循环。

实验结果证明了此新技术方法的可行性和高效率。本发明人选取了100个来自人3号染色体及16号染色体是的BAC克隆，分别用本发明设计的Alu序列5′端和3′端特异引物扩增。所有的BAC都得到至少一种PCR产物，最多的可以得到十几种PCR产物。

此外，还选用一个含有多种重复序列的BAC作探针(RP-11-110-0-7)，经放射性同位素³²P标记后与这些PCR产物进行分子杂交反应。反应结果表明：所有的PCR产物均不含重复序列。

进一步对一些PCR产物做了DNA序列测定分析。测序结果也证明这些PCR产物的大小在400-2000碱基对之间，平均约800碱基对，并且都不含重复序列。

因此，利用本发明的新技术方法可以快速从诸如BAC克隆等人工染色体或大片段DNA中扩增出不含重复序列的单一人基因组DNA序列。

本发明的技术有多种用途，其中包括但并不限于：

(1).这些被扩增得到的单一序列可以作为基因探针，进行Southern印迹分子杂交；

(2).这些被扩增得到的单一序列可以经过荧光标记，进行染色体荧光原位杂交(FISH)；

(3).这些被扩增得到的单一序列可以结合在固相载体表面制成基因组DNA芯片，进行基因检测和诊断。

用本发明方法获得的寡核苷酸或其片段可以用于制备探针，例如染色体荧光原位杂交(FISH)探针。因此，本发明还提供了一种产生荧光标记探针，尤其是FISH探针的方法。本发明制备FISH探针的方法与现有技术的区别仅在于用作探针的DNA不同。因此，常规的各种制备FISH探针的方法和荧光染料(如荧光素、罗丹明等)都可用于本发明。

由于用本发明方法获得扩增产物消除了Alu重复序列，因此，用其制备的FISH探针的非特异性背景信号可显著降低。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

引物合成

用人工合成的方法分别合成如下引物：

Alu-N1：5′-TTA CAG GYR TCA GCC ACY AC-3′(SEQ ID NO：1)

Alu-N2：5′-RCC AYT GCA CTY CAG CCT G-3′(SEQ ID NO：2)

其中：Y＝C或T；R＝A或G。

实施例2

用Alu特异性引物扩增细菌人工染色体(BAC)

①.培养细菌人工染色体(BAC)克隆，涂布培养基平板，培养，挑选单个克隆，摇瓶培养该克隆菌，从该菌中抽提BAC DNA。

②.用PCR反应扩增不含重复序列的BAC DNA片段的方法如下：

取50ng BAC DNA(作为PCR反应的模板)，在50μl(微升)反应总体积中进行反应。该反应体系中的成分为：10mM Tris-HCl，pH 8.4，2mMMgCl，50mM KCl，0.1mM gelatin，200mM Dntp，0.5mM引物Alu-N1或Alu-N2，2单位Taq polymerase)。PCR反应的条件为：94℃1分钟，60℃1分钟，72℃2分钟，30循环。

以不同的BAC克隆为模板进行PCR反应的电泳结果如图1所示。PCR产物平均为2-5个。

实施例3

对PCR产物的Southern印迹分析

将实施例2中获得的PCR产物经凝胶电泳后，转移至尼龙膜上。用³²P标记过的完整的BAC克隆(RP11-110-0-7)DNA作为探针，与所述Southern印迹膜杂交。

Southern印迹分析结果如图2所示。因为所用的探针(完整的BAC)中含有大量的DNA重复序列，而用Alu引物扩增出的PCR产物没有杂交，因此这说明PCR产物中不含DNA重复序列。

实施例4

对PCR产物的保存、筛选和鉴定

将上述获得的PCR扩增产物克隆到TA-Vector载体中，以便于保存及今后大量复制。

然后，用Alu序列筛选阴性克隆。即用细菌人工染色体克隆RPII-110-0-7(大小为120kb)筛选出不含Alu重复序列的阴性克隆。

接着，用PCR反应扩增出插入片段，并通过凝胶电泳法测定插入片段的大小。此外，还进一步对一些PCR产物做了DNA序列测定分析。

测序结果也证明这些PCR产物的大小在400-2000碱基对之间，平均约800碱基对，并且都不含重复序列。

实施例5

FISH探针的制备

在本实施例中，用上述实施例中用Alu特异性引物制备的PCR产物，通过常规的随机引物标记法来制备FISH探针。此方法使用随机引物来标记DNA分子，通过标记反应可以产生数倍于初始DNA量的标记探针。一般可以使用Life Technologies公司的随机引物标记试剂盒。

(1)将100mg DNA溶入24μ水中，置于冰上，加入20μl随机引物溶液(2.5X)。将混合后的DNA煮沸变性5分钟，立即置于冰上。

(2)加入5μl 10XdNTP溶液，轻轻地将离心管内试剂彻底混匀，再加入1μl的酶溶液。

(3)混匀后，将反应物在37℃中培养1小时，取2μl做凝胶电泳检查。如果被标记的DNA探针片段在200-2000bp之间，标记效果最佳。

(4)终止反应可通过加热到75℃，10分钟，或加5μl反应终止缓冲液。得到FISH探针。

序列表

<110>香港大学

关，新元

<120>一种消除基因组重复序列的新方法及其在FISH探针制备中的应用

<130>014160 PCWO

<160>2

<170>PatentIn version 3.0

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>合成的引物

<220>

<221>misc_feature

<223>Y＝C，T；R＝A，G

<400>1

ttacaggyrt cagccacyac 20

<210>2

<211>19

<212>DNA

<213>合成的引物

<220>

<221>misc_feature

<223>Y＝C，T；R＝A，G

<400>2

rccaytgcac tycagcctg 19

Claims

1.一种聚合酶链反应扩增方法，其特征在于，以人工染色体或源自人基因组序列的长度为50-5000kb的大片段DNA分子为模板，并且以Alu特异性引物为引物，所述的Alu特异性引物都特异性地结合于Alu序列的5′端且延伸方向为Alu序列的3′→5′方向，或者都结合于Alu序列的3′端且延伸方向为Alu序列的5′→3′方向；

其中，所述的Alu特异性引物选自下组：

Alu-N1：5′-TTA CAG GYR TCA GCC ACY AC-3′(SEQ ID NO：1)

Alu-N2：5′-RCC AYT GCA CTY CAG CCT G-3′(SEQ ID NO：2)

其中：Y＝C或T；R＝A或G。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述人工染色体选自下组：酵母人工染色体，噬菌体人工染色体，细菌人工染色体和哺乳动物人工染色体。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的PCR反应条件是：90-95℃变性45-75秒，50-65℃退火30-90秒，70-74℃延伸30-90秒，共25-35个循环。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的Alu特异性引物长度为15-25bp。

5.一种产生荧光标记探针的方法，其特征在于，它包括步骤：

(a)通过聚合酶链反应扩增出多核苷酸产物，在所述聚合酶链反应中以人工染色体或源自人基因组序列的长度为50-5000kb的大片段DNA分子为模板，并且以Alu特异性引物为引物，所述的Alu特异性引物都特异性地结合于Alu序列的5′端且延伸方向为Alu序列的3′→5′方向，或者都结合于Alu序列的3′端且延伸方向为Alu序列的5′→3′方向；

其中，所述的Alu特异性引物选自下组：

Alu-N1：5′-TTA CAG GYR TCA GCC ACY AC-3′(SEQ ID NO：1)

Alu-N2：5′-RCC AYT GCA CTY CAG CCT G-3′(SEQ ID NO：2)

其中：Y＝C或T；R＝A或G；

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的荧光标记探针是荧光原位杂交探针。

7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述人工染色体选自下组：酵母人工染色体，噬菌体人工染色体，细菌人工染色体和哺乳动物人工染色体。

8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的Alu特异性引物长度为15-25bp。