WO2003014385A1 - Nouveau procede d'elimination d'une sequence de repetition dans le genome, et sa mise en oeuvre pour la preparation d'une sonde fish - Google Patents

Nouveau procede d'elimination d'une sequence de repetition dans le genome, et sa mise en oeuvre pour la preparation d'une sonde fish Download PDF

Info

Publication number
WO2003014385A1
WO2003014385A1 PCT/CN2001/001209 CN0101209W WO03014385A1 WO 2003014385 A1 WO2003014385 A1 WO 2003014385A1 CN 0101209 W CN0101209 W CN 0101209W WO 03014385 A1 WO03014385 A1 WO 03014385A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
alu
artificial chromosome
sequence
primers
specific primers
Prior art date
Application number
PCT/CN2001/001209
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Xinyuan Guan
Original Assignee
The University Of Hong Kong
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by The University Of Hong Kong filed Critical The University Of Hong Kong
Priority to CNB018236057A priority Critical patent/CN1288250C/zh
Priority to PCT/CN2001/001209 priority patent/WO2003014385A1/zh
Publication of WO2003014385A1 publication Critical patent/WO2003014385A1/zh
Priority to US11/061,719 priority patent/US20050214834A1/en

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6841—In situ hybridisation

Definitions

  • the present invention relates to a novel method for eliminating genomic repeat sequences in the process of preparing FISH probes using artificial chromosomes.
  • the genomic DNA sequence obtained by this new method does not contain genomic repeat sequences, thus effectively eliminating non-specific hybridization signals caused by repeated sequences, and improving the accuracy of FISH probes. Background technique
  • Artificial chromosomes include yeast artificial chromosome (Yeast Artficial Chromosome, YAC. Its insert is about 1,000 kilobase pairs), phage artificial chromosome (Phage Artificial Chromosome, PAC. Its insert is about 100 kilobase pairs), bacteria Artificial chromosome (Bacterial Artificial Chromosome, BAC. Its insert is about 100 kilobase pairs).
  • Such artificial chromosomes can be used as chromosome fluorescence in site hybridization (FISH) probes for a variety of purposes, including genetic disease diagnosis (mainly various chromosomal abnormalities), prenatal diagnosis (pregnant women Genetic disease screening), tumor typing, diagnosis and prognosis tests, to observe radiation and other environmental factors for human damage.
  • genetic disease diagnosis mainly various chromosomal abnormalities
  • prenatal diagnosis pregnant women Genetic disease screening
  • tumor typing diagnosis and prognosis tests
  • diagnosis and prognosis tests to observe radiation and other environmental factors for human damage.
  • FISH chromosome fluorescence in site hybridization
  • Alu sequence There are many repeated DNA sequences in the human genome. These sequences are very similar and continue to appear throughout the genome. Among them, the Alu sequence appears most frequently, appearing about every 4 kilobase pairs.
  • the Alu sequence accounts for about 5% of the total DNA of the human genome, up to 900,000 copies, of which 60% of the sequence members contain the cut of the restriction enzyme Alu, so it is called the Alu family, which is mainly concentrated in the R band in the late stage of cell division. It belongs to non-coding DNA, but some of it is located in the untranslated region of rnRNA, even in the coding region.
  • the longest Alu sequence is about 150 base pairs.
  • Human Alu The sequence is about 300bp in length, and is composed of 120bp and 150bp repeats.
  • the purpose of the present invention is to provide a new method for amplifying human genomic DNA.
  • the method can effectively remove the repeated sequences when amplifying the human genomic DNA sequence in an artificial chromosome, thereby eliminating non-specific hybridization caused by the repeated sequences Signal interference, improve the accuracy and reliability of hybridization results.
  • a polymerase chain reaction amplification method in which an artificial chromosome or a large fragment DNA molecule having a length of 50-5000 kb is used as a template, and an Alu-specific primer is used as a primer, wherein Alu-specific primers specifically bind to the 5 'end of the Alu sequence and extend in the 3'-5' direction of the Alu sequence, or both bind to the 3 'end of the Alu sequence and extend in the 5' direction of the Alu sequence — 3 'direction.
  • the length of the Alu-specific primer is 15-25bp.
  • the Alu-specific primer is selected from the following group:
  • a method for generating a fluorescently labeled probe which includes steps:
  • a polynucleotide product is amplified by a polymerase chain reaction, in which an artificial chromosome or a large DNA molecule of 50-5000 kb in length is used as a template, and Alu-specific primers are used as primers,
  • the Alu-specific primers all specifically bind to the 5 'end of the Alu sequence and extend in the 3' ⁇ 5 'direction of the Alu sequence, or all bind to the 3' end of the Alu sequence and the extension direction 5 ' ⁇ 3' direction of the Alu sequence;
  • step (b) Fluorescently labeling the polynucleotide product in step (a) to generate a fluorescently labeled probe.
  • the fluorescently labeled probe is a fluorescent in situ hybridization probe.
  • a fluorescently labeled probe prepared by the above method is also provided.
  • Figure 1 is an electrophoresis image of the PCR product amplified with Alu primers, where the template is the DNA of the BAC clone.
  • the molecular weight marker (M) is a 1 kb DNA ladder.
  • RPII-497 I 24 etc. are the numbers of BAC clones, where RPII is the name of the BAC clone library (consisting of many plates), and the set of numbers after "RP11-" (such as 497) is the name of one of the plates in the library
  • the following English letters (such as I) and another set of numbers (such as 24) refer to the abscissa and ordinate of the position of the BAC clone in this disc, respectively.
  • Figure 2 is a Southern blot of PCR products amplified with Alu primers.
  • the molecular weight marker (M) is a 1 kb DNA ladder.
  • Positive controls 1 and 2 are BAC DNA.
  • the entire BAC clone DNA is used as a probe.
  • the BAC clone is numbered RPII-110-0-7 and is 120kb in size.
  • artificial chromosome refers to an artificially constructed, self-replicating vector with chromosomal characteristics (such as containing centromere, telomere, and DNA replication origin, but also with a transformation screening marker).
  • Representative artificial chromosomes include but are not limited to: Yeast Artficial Chromosome (YAC), Phage Artificial Chromosome (PAC), Bacterial Artificial Chromosome (BAC), Mammalian Artificial Chromosome (MAC).
  • YAC uses yeast chromosomes, centromeres, telomeres, and so on.
  • Alu-specific primer refers to a primer that specifically binds to the end of an Alu sequence such that the polymerase chain reaction amplification product contains no or substantially no Alu repeats.
  • Alu-specific primers are divided into two types: The first type of Alu-specific primers specifically bind to the 5 'end of the Alu sequence and extend in the 3'-5' direction of the Alu sequence; the second type of Alu-specific primers are Binding to the 3 'end of the Alu sequence and the extension direction is the 5' ⁇ 3 'direction of the Alu sequence.
  • This method uses uniquely designed amplification primers and amplification conditions, where the amplification primers are located at the 5 'and 3' ends of the Alu repeats that occur at high frequency in human genomic DNA.
  • the characteristic of this method is that by using this primer to amplify the human genomic DNA sequence in, for example, bacterial artificial chromosome (BAC) by PCR method, it is possible to effectively remove the high-frequency Alu repeats appearing in human genomic DNA.
  • BAC bacterial artificial chromosome
  • the principle of this technical method is to take advantage of the frequency of Alu sequences, and use Alu-end sequences as templates to design corresponding primers.
  • the two Alu sequences are not far apart, that is, within a normal PCR reaction amplification range (generally within 2 kilobase pairs) and the directions of the two Alu sequences are opposite (such as 5 'end to 5' end)
  • the genomic DNA sequence between these two Alu sequences can be amplified. Because the DNA sequence amplified by this method is located between two Alu repeats, it no longer contains duplicates.
  • BAC bacterial artificial chromosomes
  • their size is generally around 100 kilobase pairs.
  • Alu sequences once every 4 kilobase pairs, usually there can be about 25 Alu sequences in a BAC, and a considerable part of them are separated by the PCR reaction amplification range. Therefore, when using the Alu-specific primers of the present invention to amplify human genomic DNA in BAC, the chance of obtaining a single sequence can be greatly increased.
  • the PCR reaction conditions are not particularly limited, and conventional specific amplification PCR conditions can be used in the present invention.
  • a common condition is 90-95 ⁇ denaturation 45-75 seconds, 50-65 V annealing 30-90 seconds, 70-74 ° C extension 30-90 seconds, a total of 25-35 cycles.
  • the experimental results prove the feasibility and high efficiency of this new technical method.
  • the present inventors selected 100 BAC clones from human chromosome 3 and 16 and amplified them with primers specific for the 5 ′ and 3 ′ ends of the Alu sequence designed by the present invention. All BACs get at least one PCR product, up to Can get more than a dozen kinds of PCR products.
  • a BAC containing multiple repetitive sequences was used as a probe (RP-11-110-0-7), which was labeled with a radioisotope 32 P for molecular hybridization with these PCR products.
  • the results showed that all the PCR products contained no repeats.
  • DNA sequencing was performed on some PCR products. The sequencing results also proved that the size of these PCR products was between 400-2,000 base pairs, with an average of about 800 base pairs, and they did not contain repeats.
  • a single human genomic DNA sequence without repeating sequences can be rapidly amplified from artificial chromosomes or large DNA fragments such as BAC clones.
  • the technology of the present invention has a variety of uses, including but not limited to:
  • amplified single sequences can be used as gene probes for Southern blot molecular hybridization
  • amplified single sequences can be fluorescently labeled for chromosomal fluorescence in situ hybridization (FISH);
  • the oligonucleotides or fragments thereof obtained by the method of the present invention can be used to prepare probes, such as chromosomal fluorescent in situ hybridization (FISH) probes. Therefore, the present invention also provides a method for generating a fluorescently labeled probe, especially a FISH probe.
  • the method for preparing the FISH probe of the present invention is different from the prior art only in the DNA used as the probe. Therefore, various conventional methods for preparing FISH probes and fluorescent dyes (such as fluorescein, rhodamine, etc.) can be used in the present invention.
  • Bacterial artificial chromosome (BAC) clones are cultured, coated on a culture plate, cultured, single clones are picked, the cloned bacteria are shaken, and BAC DNA is extracted from the bacteria.
  • BAC Bacterial artificial chromosome
  • the method to amplify BAC DNA fragments without repeats by PCR is as follows-Take 50 ng BAC DNA (as template for PCR reaction), and perform the reaction in 50 ⁇ 1 (microliter) reaction volume.
  • the components in this reaction system are: 10 raM Tris-HCl, pH 8. 4, 2 raM MgCl, 50 mM KCl, 0.1 mM gelatin, 200 mM Dntp, 0.5 raM primers Alu- Nl or Alu- N2, 2 units of Taq polymerase;).
  • the PCR conditions were: 1 minute at 94 ° C, 1 minute at 60 ° C, 2 minutes at 72 ° C, and 30 cycles.
  • Example 2 The PCR product obtained in Example 2 was subjected to gel electrophoresis and then transferred to a nylon membrane. A 32 P-labeled intact BAC clone (RP11-110- 0-7) was used as a probe to hybridize with the Southern blot membrane.
  • the PCR amplification product obtained above was cloned into a TA-Vector vector for storage and subsequent replication in large quantities.
  • Alu sequences were then used to screen negative clones.
  • the bacterial artificial chromosome clone RPII-110- 0-7 (120 kb in size) was used to screen for negative clones without Alu repeats.
  • the insert was amplified by a PCR reaction, and the size of the insert was determined by gel electrophoresis. In addition, DNA sequencing was performed on some PCR products.
  • the FISH probe was prepared by using the PCR product prepared using the Alu-specific primer in the above example by a conventional random primer labeling method.
  • This method uses random primers to label the DNA molecules, and the labeling reaction can generate labeled probes that are several times the original DNA amount.
  • a random primer labeling kit from Life Technologies can be used.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

一种消除基因组重复序列的新方法及其在 FISH探针制备中的应用 技术领域
本发明涉及在利用人工染色体制备 FISH 探针过程中消除基因组重复序 列的新方法。 利用该新方法得到的基因组 DNA 序列中不含有基因组重复序 列， 因此有效地消除了因重复序列引起的非特异性杂交信号， 提高了 FISH探 针的准确性。 背景技术
2000年 6月， 人类基因组计划公布了人类基因组的 "工作草图"。 2000 年 1月 15日， "正式版"人类基因组图谱也已面世。 随着人类基因组逐渐被 破译， 一张生命之图将被绘就， 人们的生活也将发生巨大变化。 人类基因组 计划的飞速发展为生物技术的开发提供了新的机会。
含有大片段 DNA分子的各类人工染色体是发展人类基因组计划的副产品 之一。 人工染色体包括酵母人工染色体（Yeast Artficial Chromosome ， YAC。其插入片段约为 1， 000千碱基对），噬菌体人工染色体（Phage Artificial Chromosome ， PAC 。 其插入片段约为 100 千碱基对）， 细菌人工染色体 (Bacterial Artificial Chromosome， BAC。其插入片段约为 100千碱基对）。
这类人工染色体可以被用于作为染色体荧光原位杂交（Fluorescence In Site Hybridization , FISH)探针， 用于多种用途， 其中包括遗传病诊断（主 要是各种染色体异常）， 产前诊断（孕妇遗传病筛査）， 肿瘤分型、 诊断和预后 检验， 观测放射线和其他环境因素对人体的损害。 另外， 由于这些人工染色 体大多数己被定位， 所以它们可以被用来制作基因组芯片。
在人类基因组中存在许多重复的 DNA序列。 这些序列非常相似， 在整个 基因组中不断出现。 其中， 以 Alu序列出现频率最高， 大约每隔 4千碱基对 就会出现一次。 Alu序列占人类基因组总 DNA量 5%左右，高达 900, 000拷贝， 其中 60%序列成员含有限制性内切酶 Alu的切口， 故叫做 Alu家族， 主要集 中在细胞分裂晚期的 R带， 大部分属于非编码 DNA， 但也有一部分位于 rnRNA 的非翻译区， 甚至位于编码区内。 Alu序列最长的约 150碱基对。 人类 Alu 序列长度约 300bp，本身又由 120bp和 150bp的重复序列组成， 两者之间由富 含 A的区域分开，两端又有一段 7- 10bp的正向重复序列。 Alu序列之间并不 完全一样， 存在一些差异。 由于这些重复序列可以相互杂交而产生非特异背 景信号， 因而会干扰特异性杂交信号。 这是目前用人工染色体制作 FISH探针 所面临的最大难题。
因此， 本领域迫切需要幵发消除 Alu重复序列的技术， 以便获得降低非 特异性背景信号的 FISH探针。 发明内容
本发明的目的在于提供一种新的扩增人基因组 DNA的方法， 该方法用于 扩增人工染色体中的人基因组 DNA序列时可以有效地去除重复序列， 从而消 除因重复序列导致的非特异性杂交信号的干扰， 提高杂交结果的准确性和可 靠性。
在本发明的第一方面， 提供了一种聚合酶链反应扩增方法， 其中， 以人 工染色体或长度为 50-5000kb的大片段 DNA分子为模板， 并且以 Alu特异性 引物为引物， 所述的 Alu特异性引物都特异性地结合于 Alu序列的 5'端且延 伸方向为 Alu序列的 3'— 5'方向， 或者都结合于 Alu序列的 3'端且延伸方向 为 Alu序列的 5'— 3'方向。
在本发明的一优选例中， 所述的 Alu特异性引物长度为 15-25bp。 在另 —优选中， 所述的 Alu特异性引物选自下组：
Alu-Nl : 5--TTA CAG GYR TCA GCC ACY AC-3* (SEQ ID N0 : 1)
Alu-N2 : 5'-RCC AYT GCA CTY CAG CCT G- 3' (SEQ ID NO : 2)
其中： Y=C或 T ; 1^ 或6 。
在本发明的第二方面， 提供了一种产生荧光标记探针的方法， 它包括步 骤：
(a)通过聚合酶链反应扩增出多核苷酸产物，在所述聚合酶链反应中以人 工染色体或长度为 50-5000kb的大片段 DNA分子为模板， 并且以 Alu特异性 引物为引物， 所述的 Alu特异性引物都特异性地结合于 Alu序列的 5'端且延 伸方向为 Alu序列的 3'→ 5'方向， 或者都结合于 Alu序列的 3'端且延伸方向 为 Alu序列的 5'→ 3'方向；
(b)对步骤（a)中的多核苷酸产物进行荧光标记， 产生荧光标记探针。 在本发明的一优选例中， 所述的荧光标记探针是荧光原位杂交探针。 在本发明的第三方面， 还提供了用上述方法制得的荧光标记探针。
附图说明
图 1 是用 Alu 引物扩增的 PCR产物的电泳图， 其中模板是 BAC克隆的 DNA。 图中， 分子量标记物（M)是 lkb的 DNA梯（DNA ladder)。 RPII-497 I 24 等为 BAC克隆的编号， 其中 RPII是 BAC克隆文库（由许多盘子组成）的名称， " RP11-"后的一组数字（如 497)是该文库中其中一个盘子的名称， 再后面的 英文字母（如 I)和另一组数字（如 24)分别指该 BAC克隆在这个盘中所处位置 的横坐标和纵坐标。
图中的 5'表示 5'引物， 即 Alu-Nl : 5'- TTA CAG GYR TCA GCC ACY AC- 3 (SEQ ID N0 : 1)； 3'表示 3'引物， g卩 Alu_N2： 5'- RCC AYT GCA CTY CAG CCT G- 3' (SEQ ID NO : 2)， 其中： Y二 C或 T ; 1?=八或6。
图 2是用 Alu引物扩增的 PCR产物的 Southern印迹图。其中分子量标记 物 (M)是 lkb的 DNA梯 (DNA ladder)。 阳性对照 1和 2 (CTRL1和 CTRL2)是 BAC DNA。 图中， 作为探针的是整个 BAC克隆 DNA。 该 BAC克隆的编号为 RPII- 110-0—7， 大小为 120kb。
具体实施方式
如本文所用， 术语"人工染色体"指人工构建的具有染色体特性（如含有 着丝粒、 端粒及 DNA复制起始点， 同时还带有转化筛选标记）的， 可自我复制 的载体。 代表性的人工染色体包括但并不限于： 酵母人工染色体（Yeast Artficial Chromosome ， YAC)， 噬菌体人工染色体（Phage Artificial Chromosome , PAC)， 细菌人工染色体 (Bacterial Artificial Chromosome， BAC) , 哺乳动物人工染色体（Mammalian Artificial Chromosome, MAC)。 例 如， YAC使用酵母染色体着丝粒、 端粒， 依此类推。 如本文所用， 术语 " Alu特异性引物"指特异性结合于 Alu序列的末端， 从而使聚合酶链反应扩增产物不含有或基本上不含有 Alu重复序列的引物。 Alu特异性引物分为二类： 第一类 Alu特异性引物是特异性地结合于 Alu序 列的 5'端且延伸方向为 Alu序列的 3'— 5'方向； 第二类 Alu特异性引物是结 合于 Alu序列的 3'端且延伸方向为 Alu序列的 5'→ 3'方向。 本发明人经过广泛而深入的研究， 建立了一种用于在人工染色体中高效 扩增人 DNA序列的新方法。 该方法采用了设计独特的扩增引物和扩增条件， 其中扩增引物在位于人基因组 DNA中高频率出现的 Alu重复序列的 5'端和 3' 端。 该方法的特点是， 利用这种引物通过 PCR方法扩增例如细菌人工染色体 (BAC)中的人基因组 DNA序列，可以有效地去除人基因组 DNA中高频率出现的 Alu重复序列。
本技术方法的原理是利用 Alu序列出现频率的特点， 以 Alu—端的序列 为模板， 设计相应的引物。 当两个 Alu序列相隔不远， 即在一个正常 PCR反 应扩增范围内（一般在 2千碱基对内）并且这两个 Alu序列的方向相对（如 5' 端对 5'端）时， 就可以扩增出在此两个 Alu序列之间的基因组 DNA序列。 由于 用本方法扩增出的 DNA序列位于两个 Alu重复序列之间， 所以它不再含有重 复序列。
以细菌人工染色体 (BAC)为例， 其大小一般在 100千碱基对左右。 以平均 每 4千碱基对出现一次 Alu序列计算， 通常在一个 BAC中可以有 25个左右的 Alu序列， 其中相当一部分相隔距离在 PCR反应扩增范围内。 因此， 当使用 本发明的 Alu特异引物扩增 BAC中的人基因组 DNA时， 就可以大大增加得到 单一序列的机会。
在本发明中， 对 PCR反应条件没有特别限制， 常规的特异性扩增的 PCR 条件都可用于本发明。 一种常用的条件是 90-95 Ό变性 45-75秒， 50-65 V 退火 30-90秒， 70-74 °C延伸 30-90秒， 共 25-35个循环。
实验结果证明了此新技术方法的可行性和高效率。 本发明人选取了 100 个来自人 3号染色体及 16号染色体是的 BAC克隆， 分别用本发明设计的 Alu 序列 5'端和 3'端特异引物扩增。 所有的 BAC都得到至少一种 PCR产物， 最多 的可以得到十几种 PCR产物。
此外， 还选用一个含有多种重复序列的 BAC作探针（RP-11- 110-0-7)， 经 放射性同位素 32P标记后与这些 PCR产物进行分子杂交反应。 反应结果表明： 所有的 PCR产物均不含重复序列。
进一步对一些 PCR产物做了 DNA序列测定分析。测序结果也证明这些 PCR 产物的大小在 400— 2000碱基对之间， 平均约 800碱基对， 并且都不含重复 序列。
因此， 利用本发明的新技术方法可以快速从诸如 BAC克隆等人工染色体 或大片段 DNA中扩增出不含重复序列的单一人基因组 DNA序列。 本发明的技术有多种用途， 其中包括但并不限于：
(1) .这些被扩增得到的单一序列可以作为基因探针， 进行 Southern 印 迹分子杂交；
(2) .这些被扩增得到的单一序列可以经过荧光标记， 进行染色体荧光原 位杂交（FISH) ;
(3) .这些被扩增得到的单一序列可以结合在固相载体表面制成基因组 DNA芯片， 进行基因检测和诊断。 用本发明方法获得的寡核苷酸或其片段可以用于制备探针， 例如染色体 荧光原位杂交（FISH)探针。 因此， 本发明还提供了一种产生荧光标记探针， 尤其是 FISH探针的方法。 本发明制备 FISH探针的方法与现有技术的区别仅 在于用作探针的 DNA不同。 因此， 常规的各种制备 FISH探针的方法和荧光染 料（如荧光素、 罗丹明等）都可用于本发明。
由于用本发明方法获得扩增产物消除了 Alu重复序列， 因此， 用其制备 的 FISH探针的非特异性背景信号可显著降低。 下面结合具体实施例， 进一步阐述本发明。 应理解， 这些实施例仅用于说 明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方 法， 通常按照常规条件如 Sambrook等人， 分子克隆： 实验室手册（New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件， 或按照制造厂 商所建议的条件。 实施例 1
引物合成
用人工合成的方法分别合成如下引物：
Alu-Nl : 5'- TTA CAG GYR TCA GCC ACY AC- 3' (SEQ ID N0 : 1)
Alu-N2 : 5'-RCC AYT GCA CTY CAG CCT G- 3' (SEQ ID NO : 2)
其中： Y=C或 T ; R二八或。。 实施例 2
用 Alu特异性引物扩增细菌人工染色体 (BAC)
①. 培养细菌人工染色体 (BAC)克隆， 涂布培养基平板， 培养， 挑选单个 克隆， 摇瓶培养该克隆菌， 从该菌中抽提 BAC DNA。
②. 用 PCR反应扩增不含重复序列的 BAC DNA片段的方法如下- 取 50 ng BAC DNA (作为 PCR反应的模板）， 在 50 μ 1 (微升）反应总体 积中进行反应。 该反应体系中的成分为： 10 raM Tris-HCl, pH 8. 4, 2 raM MgCl, 50 mM KCl, 0. 1 mM gelatin, 200 mM Dntp, 0. 5 raM 引物 Alu- Nl或 Alu— N2， 2 单位 Taq polymerase；)。 PCR 反应的条件为： 94 °C 1分钟， 60 °C 1分钟， 72 °C 2分钟， 30 循环。
以不同的 BAC克隆为模板进行 PCR反应的电泳结果如图 1所示。 PCR产 物平均为 2- 5个。 实施例 3
对 PCR产物的 Southern印迹分析
将实施例 2中获得的 PCR产物经凝胶电泳后， 转移至尼龙膜上。用 32P标 记过的完整的 BAC克隆（RP11- 110- 0- 7) DNA作为探针, 与所述 Southern印迹 膜杂交。
Southern印迹分析结果如图 2所示。 因为所用的探针（完整的 BAC)中含 有大量的 DNA重复序列， 而用 Alu引物扩增出的 PCR产物没有杂交， 因此这 说明 PCR产物中不含 DNA重复序列。 实施例 4
对 PCR产物的保存、 筛选和鉴定
将上述获得的 PCR扩增产物克隆到 TA- Vector载体中， 以便于保存及今 后大量复制。
然后， 用 Alu序列筛选阴性克隆。 即用细菌人工染色体克隆 RPII-110- 0-7 (大小为 120kb)筛选出不含 Alu重复序列的阴性克隆。
接着， 用 PCR反应扩增出插入片段， 并通过凝胶电泳法测定插入片段的 大小。 此外， 还进一步对一些 PCR产物做了 DNA序列测定分析。
测序结果也证明这些 PCR产物的大小在 400― 2000碱基对之间，平均约 800碱基对， 并且都不含重复序列。 实施例 5
FISH探针的制备
在本实施例中， 用上述实施例中用 Alu特异性引物制备的 PCR产物， 通 过常规的随机引物标记法来制备 FISH探针。 此方法使用随机引物来标记 DNA 分子， 通过标记反应可以产生数倍于初始 DNA量的标记探针。 一般可以使用 Life Technologies公司的随机引物标记试剂盒。
(1)将 lOOmg DNA溶入 24μ1水中， 置于冰上， 加入 20μ1随机引物溶液 (2. 5Χ)。 将混合后的 DNA煮沸变性 5分钟， 立即置于冰上。
(2) 加入 5μ1 lOXdNTP溶液， 轻轻地将离心管内试剂彻底混匀， 再加入 Ιμΐ的酶溶液。
(3) 混勾后， 将反应物在 37 °C中培养 1小时， 取 2μ1做凝胶电泳检査。 如果被标记的 DNA探针片段在 200-2000bp之间， 标记效果最佳。
(4) 终止反应可通过加热到 75 Ό , 10分钟，或加 5μ1反应终止缓冲液。 得到 FISH探针。

Claims

权 利 要 求 书
1.一种聚合酶链反应扩增方法， 其特征在于， 以人工染色体或长度为 50-5000kb的大片段 DNA分子为模板， 并且以 Alu特异性引物为引物， 所述 的 Alu特异性引物都特异性地结合于 Alu序列的 5'端且延伸方向为 Alu序列 的 3'— 5'方向，或者都结合于 Alu序列的 3'端且延伸方向为 Alu序列的 5'— 3' 方向。
2.如权利要求 1 所述的方法， 其特征在于， 所述人工染色体选自下组： 酵母人工染色体， 噬菌体人工染色体， 细菌人工染色体和哺乳动物人工染色 体。
3.如权利要求 1所述的方法，其特征在于，所述的 PCR反应条件是： 90-95 °C变性 45-75秒， 50-65 °C退火 30-90秒， 70-74 °C延伸 30-90秒， 共 25-35 个循环。
4.如权利要求 1所述的方法， 其特征在于， 所述的 Alu特异性引物长度 为 15-25bp。
5.如权利要求 1所述的方法， 其特征在于， 所述的 Alu特异性引物选自 下组：
Alu-Nl : 5'-TTA CAG GYR TCA GCC ACY AC-3*(SEQ ID NO: l)
Alu-N2: 5'-RCC AYT GCA CTY CAG CCT G-3' (SEQ ID NO:2)
其中： Y=C或 T ; 1 =八或0。
6.—种产生荧光标记探针的方法， 其特征在于， 它包括步骤：
(a)通过聚合酶链反应扩增出多核苷酸产物， 在所述聚合酶链反应中以人 工染色体或长度为 50-5000kb的大片段 DNA分子为模板， 并且以 Alu特异性 引物为引物， 所述的 Alu特异性引物都特异性地结合于 Alu序列的 5'端且延 伸方向为 Alu序列的 3'— 5'方向， 或者都结合于 Alu序列的 3'端且延伸方向 为 Alu序列的 5'→ 3'方向；
(b)对步骤 (a)中的多核苷酸产物进行荧光标记， 产生荧光标记探针。
7.如权利要求 6所述的方法， 其特征在于， 所述的荧光标记探针是荧光 原位杂交探针。
8.如权利要求 6所述的方法， 其特征在于， 所述人工染色体选自下组： 酵母人工染色体， 噬菌体人工染色体， 细菌人工染色体和哺乳动物人工染色 体。
9.如权利要求 6所述的方法， 其特征在于， 所述的 Alu特异性引物长度 为 15-25bp。
10.如权利要求 6所述的方法， 其特征在于， 所述的 Alu特异性引物选自 下组：
Alu-Nl : 5'-TTA CAG GYR TCA GCC ACY AC-3'(SEQ ID NO: l)
Alu-N2: 5，-RCC AYT GCA CTY CAG CCT G-3' (SEQ ID NO:2) 其中： Y=C或 T ; 1 =八或0。
PCT/CN2001/001209 2001-07-27 2001-07-27 Nouveau procede d'elimination d'une sequence de repetition dans le genome, et sa mise en oeuvre pour la preparation d'une sonde fish WO2003014385A1 (fr)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CNB018236057A CN1288250C (zh) 2001-07-27 2001-07-27 一种消除基因组重复序列的新方法及其在fish探针制备中的应用
PCT/CN2001/001209 WO2003014385A1 (fr) 2001-07-27 2001-07-27 Nouveau procede d'elimination d'une sequence de repetition dans le genome, et sa mise en oeuvre pour la preparation d'une sonde fish
US11/061,719 US20050214834A1 (en) 2001-07-27 2005-02-22 Methods for eliminating repeat sequences in genome

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/CN2001/001209 WO2003014385A1 (fr) 2001-07-27 2001-07-27 Nouveau procede d'elimination d'une sequence de repetition dans le genome, et sa mise en oeuvre pour la preparation d'une sonde fish

Related Child Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US10489759 A-371-Of-International 2001-07-27
US11/061,719 Continuation-In-Part US20050214834A1 (en) 2001-07-27 2005-02-22 Methods for eliminating repeat sequences in genome

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2003014385A1 true WO2003014385A1 (fr) 2003-02-20

Family

ID=4574839

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/CN2001/001209 WO2003014385A1 (fr) 2001-07-27 2001-07-27 Nouveau procede d'elimination d'une sequence de repetition dans le genome, et sa mise en oeuvre pour la preparation d'une sonde fish

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN1288250C (zh)
WO (1) WO2003014385A1 (zh)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103409506A (zh) * 2013-06-26 2013-11-27 武汉康录生物技术有限公司 一种用于检测alk基因不含重复序列的fish探针、试剂盒及其检测方法
CN103409504A (zh) * 2013-06-26 2013-11-27 武汉康录生物技术有限公司 一种用于检测Her2基因不含重复序列的FISH探针、试剂盒及其检测方法
CN103409507A (zh) * 2013-06-26 2013-11-27 武汉康录生物技术有限公司 一种用于检测ros1基因不含重复序列的fish探针、试剂盒及其检测方法
CN103409505A (zh) * 2013-06-26 2013-11-27 武汉康录生物技术有限公司 一种用于检测bcr/abl融合基因不含重复序列的fish探针、试剂盒及其检测方法
CN110205357A (zh) * 2019-06-22 2019-09-06 福建农林大学 一种多引物oligo探针的制备方法

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107083417B (zh) * 2016-02-16 2020-01-31 益善生物技术股份有限公司 Aml1/eto融合基因检测试剂盒和检测方法
CN107083418B (zh) * 2016-02-16 2020-08-25 益善生物技术股份有限公司 PML/RARα融合基因检测试剂盒以及检测方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5773649A (en) * 1996-06-10 1998-06-30 Centre De Recherche De L'hopital Sainte-Justine DNA markers to detect cancer cells expressing a mutator phenotype and method of diagnosis of cancer cells
WO2000022164A1 (fr) * 1998-10-15 2000-04-20 Genset Sondes fluorescentes de peinture chromosomique

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5773649A (en) * 1996-06-10 1998-06-30 Centre De Recherche De L'hopital Sainte-Justine DNA markers to detect cancer cells expressing a mutator phenotype and method of diagnosis of cancer cells
WO2000022164A1 (fr) * 1998-10-15 2000-04-20 Genset Sondes fluorescentes de peinture chromosomique

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Proc. NAtl. Acad. Sci. USA, 1996; Vol. 93, No. 9: pages 4474 to 4479 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103409506A (zh) * 2013-06-26 2013-11-27 武汉康录生物技术有限公司 一种用于检测alk基因不含重复序列的fish探针、试剂盒及其检测方法
CN103409504A (zh) * 2013-06-26 2013-11-27 武汉康录生物技术有限公司 一种用于检测Her2基因不含重复序列的FISH探针、试剂盒及其检测方法
CN103409507A (zh) * 2013-06-26 2013-11-27 武汉康录生物技术有限公司 一种用于检测ros1基因不含重复序列的fish探针、试剂盒及其检测方法
CN103409505A (zh) * 2013-06-26 2013-11-27 武汉康录生物技术有限公司 一种用于检测bcr/abl融合基因不含重复序列的fish探针、试剂盒及其检测方法
CN110205357A (zh) * 2019-06-22 2019-09-06 福建农林大学 一种多引物oligo探针的制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN1288250C (zh) 2006-12-06
CN1545559A (zh) 2004-11-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2651483B2 (ja) ポリメラーゼ連鎖反応によるヒト乳頭腫ウイルスの検出
JP2843675B2 (ja) メッセンジャーｒｎａの同定、単離およびクローニング
WO2017186117A1 (zh) 扩增dna的方法
EP2212430B1 (en) Reduced inhibition of one-step rt-pcr
JPH05505528A (ja) ヌクレオチドの差に基づいて核酸を区別する方法
WO2017036374A1 (zh) 扩增dna的方法
CN115725789A (zh) 一种用于检测猴痘病毒的核酸组合、试剂盒及方法
WO2003014385A1 (fr) Nouveau procede d'elimination d'une sequence de repetition dans le genome, et sa mise en oeuvre pour la preparation d'une sonde fish
JP4196236B2 (ja) 核酸増幅用試薬および配列特異的な核酸増幅法
Barrett et al. High-quality RNA and DNA from flow cytometrically sorted human epithelial cells and tissues
CN106636069B (zh) 一种菰cDNA文库的构建方法
US20050009047A1 (en) Global linear non-biased nucleic acid amplification
US6316192B1 (en) Method for enrichment of unique DNA fragments through cyclical removal of PCR adapter attached to DNA fragments whose sequences are shared between two DNA pools
Vitek et al. The isolation of ecdysterone inducible genes by hybridization subtraction chromatography
JPH0686697A (ja) 反復配列染色体特異的核酸プローブ
CN114381496A (zh) 一种原位杂交探针及其制备方法与应用
WO2003014384A1 (fr) Nouveau procede d'elimination d'une sequence de repetition dans le genome, et sa mise en oeuvre pour la preparation de puces genomiques
JP2022515466A (ja) 標的化された相補的ｄｎａ富化のための方法
CN109825569A (zh) 基因dpy19l2外显子的pcr引物组、试剂盒、扩增体系和检测方法
CN109957615B (zh) 一种单细胞基因组目标区域捕获的方法
CN117448448B (zh) Il-1b基因检测引物探针组合、试剂盒及其应用
US20220154268A1 (en) System and Methods for Detection of Low-Copy Number Nucleic Acids and Protein
JP2005160387A (ja) 核酸の増幅法および核酸増幅用プライマーセット
EP3696279A1 (en) Methods for noninvasive prenatal testing of fetal abnormalities
CN117417978A (zh) 病毒裂解液及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): CN JP US

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): CN JP

DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 20018236057

Country of ref document: CN

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: JP