JPH0686697A

JPH0686697A - 反復配列染色体特異的核酸プローブ

Info

Publication number: JPH0686697A
Application number: JP4117042A
Authority: JP
Inventors: Heinz-Ulrich G Weier; グンターウェイアーハインツ−ウールリッヒ; Joe W Gray; ウイリアムグレイジョー
Original assignee: University of California
Current assignee: University of California
Priority date: 1991-04-09
Filing date: 1992-04-09
Publication date: 1994-03-29
Also published as: EP0511750A1

Abstract

(57)【要約】【目的】変性オリゴヌクレオチドプライマーを使用す
る染色体−特異的反復DNAを効率的に分離するプライマ
ーディレクティドDNA増幅法、染色体−特異性のために
スクリーニングする反復配列プローブ、非変形プライマ
ーを使用するPCR法において生成したプローブを任意に
選択する方法を開示する。【構成】プローブは、染色体特異的染色体試薬としてブ
ロッキングDNAとともに使用できる不均一混合物で、混
合物の成分はパラメータ中高特異性、サイズ、高度の反
復のためにスクリーニングされる。変性プライマーは、
配列において変異するが実質的に高度に反復した核酸配
列に相補的で、鋳型DNA例えばアルファサテライト反復
配列内でクラスターされるプライマーのセットである。
鋳型DNAはむしろ染色体特異的である。プローブは、中
期スプレッド、生殖系および体細胞間期核、小核、組織
切片における特異的タイプの染色体数を決定するため使
用される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、反復配列染色体特異的
核酸プローブおよびその調製方法に関する。

【０００２】

【従来技術・発明が解決しようとする課題】ヒト細胞お
よび組織物質の細胞遺伝子学的分析は一般的には、バン
デッド中期染色体の顕微鏡的観察を基礎とする［Buckto
n and Evans 1973］。ヒト腫瘍から得た細胞試料はしか
しながら通常中期における細胞をわずかしか含まず、細
胞増殖を刺激するためにマイトジェンが使用されなけれ
ばならない。固形腫瘍において、間期細胞の細胞成長の
刺激は特に困難であり、また少しも達成することができ
ない［Gahrton et.al1980; Knuutila et al.1986］。染
色体−特異的核酸プローブをともなうインシトゥハイ
ブリダイゼーションによる細胞遺伝子学的分析は、間期
核の分析を許容することにより腫瘍細胞と正常細胞との
間の区別を促進する。かかる分析は中期染色体の調製の
ために要求された時間と労力を低減し、かつ細胞培養の
間に生じる選択を最小限にする［Cremer et al. 1986;
Pinkel et al.1986; Hopman et al.1988; Trask et al.
1988; Nederlof et al.1989］。

【０００３】染色体−特異的ハイブリダイゼーションの
ためのクローン化プローブは、現在ヒト染色体の２／３
以上に対して報告されている。そのようなプローブのあ
るものは、ヒトサテライト III DNA配列に対して特異
的である［Cooke and Hindley1979; Berdize 1987; Wei
er et al. 1990］。しかしながら、かかるプローブの多
くのものは、染色体の動原体（ペリセントロメリック）
においてまたはその近傍で発見されたアルファサテラ
イト DNAに結合する［Manuelidis 1978; Willard and W
ay 1987］。アルホイド DNA(alphoid DNA)配列は、約17
1塩基対(bp)のタンデムに繰り返されたモノマーからな
っている［Wu and Manuelidis 1980］。171bp アルホイ
ドモノマーのある部分は、全ヒト染色体の中に保持さ
れているように思われる。より高いオーダの反復物とし
て構成された他の部分は、実質的な染色体−特異的バリ
エーションを示し、かつ染色体−特異的プローブの標的
として使用される［Devilee et al.1986; Jorgensen et
al.,1986; Murray and Martin 1987; Willaard and Wa
ye 1987］。ある著者は、染色体−特異性はより高いオ
ーダの反復物における個々のモノマーの構成に関連する
ものと示唆している［Waye et al.,1987a and 1987b; W
illard and Waye 1987; Hulsebos et al.1988］。しか
しながら、あるモノマーは十分に特異的であり、それら
が間期の染色体の列挙のためにハイブリダイゼーション
の標的として使用できるほど高度に反復されているとい
う証明がある［Meyne and Moyzis 1987］。

【０００４】これまでに報告されたプローブの多くのも
のは、すでに染色体のコピー数の分析を許容する［Choo
et al. 1990］。しかしながら、他のものは非標的染色
体を伴う相当なクロスハイブリダイゼーション(cross-h
ybridization)を示し、かつきつい条件の高いレベルで
のハイブリダイゼーションを要求する［Waye et al.198
7b; Devilee et al. 1988］。このような条件のもと
で、シグナルの強度はしばしば減少し、そのためこのよ
うなプローブは臨界的な応用には使用し得ない。例え
ば、高度に濃縮された精子クロマチン［Wyrobek et al.
1990 ］またはプローブの拡散が不十分な組織切片［Em
merich etal. 1989 ］へのハイブリダイゼーションの場
合、またはハイブリダイゼーションの標的が特に細胞物
質の変性のために厳格にコントロールし得ない場合。

【０００５】重要なプローブのパラメータは標的染色体
タイプのための高い特異性に加えて、プローブ分子のサ
イズと塩基対(bp)で測定されたハイブリダイゼーション
の標的領域の伸長である。例えば、それぞれのプローブ
分子は、緻密にパックされた精子のクロマチンへの拡散
を促すサイズであることが必要である。反復サテライト
DNAのごとき高反復DNA標的配列に相補的である比較的短
いプローブ分子は、特異性を損なうことなく高分子量の
プローブ分子を標的 DNAに結合することにより高いシグ
ナル強度を可能にする。好ましいプローブは最大限可能
なシグナル−ノイズ比を与える。

【０００６】本発明は、染色体−特異的反復 DNAを分離
する有効な手段として、変性プライマーをともなうポリ
メラーゼ鎖反応(PCR)を使用するプライマーディレクテ
ィドDNA増幅法(a primer directed DNA amplification
methode)を提供する［Saikiet al.1988b］。 DNA反復の
タイプ、例えばアルファサライトDNA以外の先行知識が
存在しないため、本発明の方法は染色体−特異的反復配
列プローブ DNAの産出を許容する。インシトゥハイブ
リダイゼーション実験において高いシグナル強度をとも
なう高い特異性を有する、ヒト染色体−特異的アルホイ
ド DNAのための典型的なプローブが記述される。

【０００７】ウェイアー等(Weier et al. 1990)は、二
本鎖ビオチン化標識DNAプローブの生成のためにインビ
トロDNA増幅の使用を述べている。この記述において、Y
染色体−特異的3.5kb反復の 124bpセグメントが非変性
プライマーをともなうPCRを使用するヒトゲノムDNAから
増幅された。

【０００８】コッホ等(Koch et al.1989)は、ビオチン
標識化ハイブリダイゼーションプローブがポリメラー
ゼ鎖反応(PCR)において生成され、また２つの合成オリ
ゴヌクレオチドプライマーが同じアルホイドモノマー
内でアニーリングする、プライムドアンプリフィケー
ションラベリング(PAL)(Primed Amplifikation Labeli
ng)と呼ばれる DNA分析法を開示した。本発明の方法
は、多くの重要な手段においてコッホ等のPAL法とは相
違する。コッホ等により使用されたプライマーは、共
通モノマー(consensus monomer)内でのプライマーアニ
ーリング座位の位置およびプライマーの伸長方向のみな
らず、より重要なことでは、コッホ等のプライマーは非
変性のものであるという点で、本発明のプライマーとは
相違する。このように、コッホ等により記述された増幅
機構は、むしろ限定された数の異なるアルホイドDNA配
列を増幅することのようであり、典型的なPCR条件のも
とではクローン化DNAフラグメント、例えば塩基対のミ
スマッチを持つ以下で検討されたpBS609-5169およびpBS
609-52におけるフラグメントの増幅を許さないであろ
う。

【０００９】本発明の方法により調製されたプローブ D
NA分子はクローン化され、かつインビトロ DNA増幅、ジ
デオキシヌクレオチドシーケンシングおよびインシト
ゥハイブリダイゼーションの組合せにより分析され
た。プローブはパラメータの中で、特異性、反復量およ
びサイズのためにスクリーンされたる。本発明の方法
は、シグナルが従来の技術により調製されたクローン化
反復配列プローブからのシグナルより明るくかつ強い、
高度に反復された配列のプローブおよびプローブコレ
クションを生成する。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本明細書では、染色体−
特異的反復 DNAを有効に分離するために変性プライマー
を使用するプライマーディレクティド DNA増幅法が記
述される。本発明の方法は、染色体−特異的反復配列の
産出のために提供される。本発明の典型的なプローブは
ヒト染色体−特異的アルホイドDNAである。

【００１１】下記の事項からなる方法が、染色体−特異
的反復配列核酸プローブを調製するために提供される。
変性オリゴヌクレオチドの第１のセットを染色体−特異
的である鋳型 DNAにおける反復配列ユニットに結合する
こと；変性オリゴヌクレオチドプライマーの第２のセ
ットを前記反復配列ユニットに、プライマーの前記第１
のセットの各５’末端がプライマーの第２のセットの１
つの５’末端に対向し、かつプライマーの前記第１のセ
ットの結合座位がプライマーの前記第２のセットの結合
座位の約20bp 〜約5キロベース(kb)の範囲の距離内にあ
るように結合すること；染色体−特異的反復配列核酸プ
ローブを生成するために、第１，第２のプライマー間で
かつ両プライマーを含めてポリメラーゼ鎖反応(PCR)法
により鋳型DNAを増幅すること。

【００１２】これらのプローブは、反復配列を有する染
色体に対して特異的であるように調製される。好ましく
は、これらのプローブはヒト染色体1〜22、X およびYに
対して特異的である。

【００１３】好ましくは、反復配列ユニットはクラスタ
ーされ、より好ましくは前記クラスターされた反復配列
ユニットはアルホイドモノマーである。典型的な好ま
しい変性プライマーは特に、表Iに示したようにWA1 お
よびWA2、および／またはWA11およびWA12である。好ま
しくは、鋳型DNAは染色体−特異的DNAである；好ましく
は、染色体−特異的鋳型 DNAはフローソートされ、顕微
解剖により分離され、または密度勾配法により分離さ
れ、またはハイブリッドセル中にある。

【００１４】プローブは、少なくとも後のPCRサイクル
において修飾dNTPsの存在下で、増幅ステップを遂行す
ることにより標識することができる。プローブは、PCR
反応の完了後に PCR生成物の化学的または酵素的修飾の
いずれかにより標識することができる。

【００１５】さらに、本発明のプローブを調製するため
のプライマー、およびプローブそれ自体が開示される。
さらに、本発明のプローブを使用する方法が開示され
る。これらの方法において、例えばヒトゲノム DNA、Co
t1 DNAおよび／またはヒトアルホイドDNAのごとき非標
識ブロッキングDNAがクロスハイブリダイゼーションを
減少するために使用し得る。

【００１６】増幅生成物の異種混合物としてゲノム DNA
から一度分離された染色体−特異的反復配列プローブ
は、高特異性およびその他の所望のプローブパラメー
タのためにスクリーンすることができる。それらは PCR
および関連された方法を含む種々の方法によりさらに増
幅することができる。クローン化プローブは例えば、適
切なサイズのものを得るためにゲル電気泳動によりスク
リーンすることができる。選択されたクローンは高特異
的反復配列プローブを産出するための好適な鋳型であ
る。

【００１７】本発明のプローブは間期核（生殖系列細胞
および体細胞の両者）、小核、中期スプレッドおよび／
または組織切片における特異的染色体を数えることに有
用である。本発明の典型的なプローブは、特異的染色体
例えばあるヒト染色体のペリセントロメリックおよび／
または動原体の領域を染色するために使用することがで
きる。

【００１８】さらに、任意に反復プローブを選択する方
法が本明細書に開示されている。この中で反復ユニット
CAGGを有する DNA配列に結合する変性プライマーJun1が
鋳型としてゲノムおよび／または染色体−特異的DNAを
ともなうPCR反応において使用される。

【００１９】さらに、下記のごとき非変性プライマーに
より調製されたプローブが開示されている。プライマー
がW21R1 およびW21R2であるポリメラーゼ鎖反応(PCR)に
より染色体21−特異的鋳型 DNAから調製されたヒト染色
体21および13のためのヒト動原体−特異的核酸プロー
ブ；プライマーがWXR1 およびWXR2であるPCR法によりヒ
ト染色体X−特異的鋳型 DNAから調製されたヒト染色体X
−特異的反復配列プローブ；プライマーがWYR9およびWY
R10であるPCR法によりヒト染色体9−特異的鋳型DNAから
調製されたヒト染色体9−特異的反復配列プローブ；プ
ライマーがWGS1およびWGS2であるPCR法によりマウス全
ゲノム鋳型DNAから調製されたマウス動原体−特異的反
復配列プローブ。

【００２０】

【発明の作用・効果】本発明は、変性オリゴヌクレオチ
ドプライマーが使用される染色体−特異的反復DNAを
効率的に分離するプライマーディレクティド DNA増幅
法が開示される。生成されたプローブは、染色体−特異
的染色体試薬としてブロッキング DNAをともなって使用
することができる不均一混合物であり、および／または
混合物の成分は数あるパラメータの中で高特異性、サイ
ズおよび／または高度の反復のためにスクリーニングす
ることができる。変性プライマーは、配列において変異
するが実質的に高度に反復した核酸配列に実質的に相補
的であり、好ましくは鋳型DNA、例えばアルファサテラ
イト反復配列内でクラスターされるプライマーのセット
である。鋳型 DNAはむしろ染色体−特異的である。本発
明のプローブは、中期スプレッド、生殖系列細胞および
／または体細胞間期核、小核および／または組織切片に
おける特異的タイプの染色体の数を決定するために使用
することができる。染色体−特異性のためにスクリーニ
ングすることができる反復配列プローブ、および非変
形プライマーを使用するPCR法において生成されたプロ
ーブを任意に選択する方法もまた提供される。

【００２１】図１〜図９は、染色体10−特異的プローブ
DNAのインシトゥハイブリダイゼーションを示す顕微鏡
写真である。図１、図２および図６〜図８におけるビオ
チン化プローブ分子はアビジン−FITC（グリーン蛍光発
光）で可視化され（グリーン蛍光発光）、図４および図
５に示されたAAF−標識DNAプローブはFITC−結合抗体
（グリーン蛍光発光）で検出された（グリーン蛍光発
光）。図２および図９におけるジゴキシゲニン標識 DNA
プローブはFITC−結合抗体で可視化された（グリーン蛍
光発光）。図２におけるビオチン化プローブはアビジン
−テキサスレッドを使用して検出された（レッド蛍光発
光）。バウンドプローブのドメインは図１および図３
〜図９においてレッドとグリーンの重ね合せによるイエ
ローに現れる。

【００２２】Ａ．ビオチン化プローブ DNAは増幅鋳型と
して分離されたヒト染色体を使用するPCRにより産出さ
れた。正常なドナーからのリンパ細胞からの中期スプ
レッドは、染色体10の動原体領域において反復DNAをと
もなうプローブDNAのハイブリダイゼーションを示し
た。しかしながら、他の染色体の動原体またはその近く
で反復DNAに対するプローブ分子の結合がある。

【００２３】Ｂ．間期細胞核は、Alu反復ファミリーのD
NAのためのジゴキシゲニン標識プローブと共同して、図
１に示されたビオチン化された染色体10アルファサテラ
イトDNA を含む混合物とハイブリダイズされた。核はビ
オチン化アルファサテライトDNAを非常に多くの座位に
結合することを示す（レッド蛍光発光）。

【００２４】Ｃ．プローブ特異性は、より少ない特異的
DNAフラグメントの結合をブロッキングにより増大され
た。正常なドナーからのリンパ細胞からの中期スプレッ
ドは、ハイブリダイゼーション混合物が標識されない全
体のヒトアルホイド DNAを含む場合に、染色体10の動原
体領域で反復DNAと優先的にハイブリダイズする。

【００２５】Ｄ．ヒト腎臓細胞の単細胞サスペンジョン
にAAF−標識DNAのハイブリダイゼーション。細胞物質は
異数体腫瘍に近接した組織の酵素ダイジェションにより
得られた。染色体10の2つのコピーの正常な補体をとも
なう間期細胞核は、変性プローブDNAがブロッキング剤
としてヒトゲノムDNAの存在においてハイブリダイズさ
れた場合には、染色体10−特異的アルホイドDNAのドメ
インを表す2つの輝点を示した。

【００２６】Ｅ．図４で示された調製物における細胞の
あるものは、これらの細胞中に染色体10のエキストラコ
ピー(an extra copy)の存在を指摘するバウンドプロー
ブの3つのドメインを示した。

【００２７】Ｆ．ビオチン化変性プローブ DNAは、卵巣
癌組織のパラフィン化されていないスィリアルな切片(d
eparaffinized serial section)にハイブリダイズされ
た。

【００２８】Ｇ．クローナルプローブDNApBS609-51は、
DNAのブロツキングなしに、卵巣腫瘍からのスィリアル
な切片にビオチン化され、かつハイブリダイズされた。

【００２９】Ｈ．中期スプレッドは、他のクローンから
のDNA(pBS609-13)のヒト染色体10の動原体領域に対する
独占的な結合を示した。

【００３０】Ｉ．ジゴキシゲニン標識プローブは、染色
体10の動原体領域で他の染色体のアルホイドDNAドメイ
ンに対するクロスハイブリダイゼーションの徴候なくし
てDNAに非常に特異的に結合されたバクテリアクローンP
bs609-51から調製された。この写真における染色体に
沿って観察することができるレッドバンドは、ビオチン
化Alu−反復DNAプローブの同時に生じるハイブリダイゼ
ーションにより算出され、それはアビジン−テキサスレ
ッドにより検出された。

【００３１】図１０は、プライマーWA1およびWA2、およ
び増幅鋳型として分離されたヒト染色体10を使用するイ
ンビトロDNA増幅生成物のサイズの分布を示す。（レー
ン1）はモノマーサイズインターバル('m')における単
一バンドを示す。プライマーWA11 およびWA12で得られ
たPCR生成物のサイズの分布は、付加的な小フラグメン
トを示す（レーン2）。異なる DNAフラグメントはプラ
スミドDNAを消化したBam H1において見つけることがで
きる（レーン3）。（'m'はモノマーサイズインターバ
ルのインサートを示す。'pBS'は線状にされたプラスミ
ドDNAを示す）。サイズマカー DNAレーン(szm)は、 400
ngのφX174 RF DNA／Hae III ダイジェストを含む。

【００３２】図１１は、アルファサテライト DNA反復の
推定構造、およびオリゴヌクレオチドプライマーの可
能なアニーリング位置を概略的に示す。矢印は、DNAポ
リメラーゼによるプライマーの伸長方向を示す。明暗を
付けた領域は、アルホイド共通配列をともなうより高い
相同性を有するアルホイドDNAの範囲を示す。PCRプロト
コルにおけるプライマーWA1およびWA2を使用するプライ
マー伸長生成物の期待されるサイズが同図の下部に示さ
れている。

【００３３】

【発明の一般的記述】本明細書においては下記の略語が
使用される：略語 A- アデニン AB- 抗体 AAF- N-アセトキシ-2-アセチルアミノフルオレ
ン AMCA- 7-アミノ-4-メチルクマリン-3-アセチッ
クアシド bcip/npt- 5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルホスフ
ェート／ニトロブルーテトラゾリウム Buffer A- （緩衝液A）20℃でpH8.4の10mM Tris-HC
l；1.5mM MgCl₂；50mM KCl；dATP，dCTP，dGTPおよびdT
TP各0.2mMからなる増幅緩衝液［Sigma Chem. Co.からの
dNTPs(St. Louis, MO USA )］ bp- ベースペア（塩基対） BRL- ベセスダリサーチラボラトリーズBethe
sda Reserch Laboratries［Gaithersburg, MD (USA)］ C- シトシン ℃- 温度（摂氏） DAPI- 4,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール dATP- 2'-デオキシアデノシン 5'-トリホスフェ
ート dCTP- 2'-デオキシシチジン 5'-トリホスフェー
ト dGPT- 2'-デオキシグアノシン 5'-トリホスフェ
ート dITP- 2'-デオキシイノシン 5'-トリホスフェー
ト DNA- デオキシリボ核酸 dNTP- デオキシヌクレオチドトリホスフェート dTTP- 2'-デオキシチミジン 5'-トリホスフェー
ト dUMP- 2'-デオキシウリジン 5'-モノホスフェー
ト dUTP- 2'-デオキシウリジン 5'-トリホスフェー
ト EB- エチジウムブロマイド EDTA- エチレンジアミンテトラアセテート FA- フォルムアミド FCM- フローサイトメトリー FITC- フルオレセインイソチオシアネート G- グアニン g- グラム，グラビティ HPLC- 高性能液体クロマトグラフィー h- 時間 IPTG- イソプロピルチオ-ベータ-D-ガラクトシ
ダーゼ kb- キロベース KCl ポタシュームクロライド LB- ルリア-ベルタニ(Luria-Bertani) M- モーラル Mb- メガベース Mg- ミリグラム min- 分 ml- ミリリットル mm- ミリメートル mM- ミリモル N- 規定濃度 ng- ナノグラム NP-40- Nonidet P-40としてSigma(St.Louis, MO)
から商業的に入手できる非イオン洗剤 nt- ヌクレオチド pBR- BRLから入手できるプラスミドクローニ
ングベクター(Gibco/BRL Catalog and Reference Gued
e) PBS- ホスフェード-バッファーサリン pBS- ブルースクライブプラスミドクローニ
ングベクター pH- 水素イオン濃度 PCR- ポリメラーゼ鎖反応 PI- プロピジウムイオダイド PN buffer- pH8で0.1M NaH₂PO₄と0.1M Na₂HPO₄、およ
び0.1%NP-40の混合物 PNM buffer- 5%非脂肪ドライミルク（遠心分離）をと
もなう；0.02% Na アジンPn緩衝液 RCC- 腎臓細胞癌 RT- 室温 sec- 秒 SSC- 0.15M NaCl/0.015M Na サイトレート，pH
7 T- チミン Taq- サーマスアクアティカス TE- 10mM Tris-HCl,pH7.5, 0.5mM Na-EDTA TR- テキサスレッド Tris- トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタ
ン ug- マイクログラム ul- マイクロリットル um- マイクロメートル w/v- 重量／体積 w/w- 重量／重量 X-Gal- 5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-ベータ
-D-ガラクトシダーゼ下記の参考文献が本明細書において引用される。 Baldini et al.,Am. J. Hum. Genet.,46: 784-788(199
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【００３４】本発明は染色体の反復配列に対して特異的
であるプローブ、およびそれらを生成するための方法を
記述する。本明細書における実施例の大部分のものはヒ
ト染色体に向けられているが、本発明の方法は他の種、
好ましくは哺乳類に対する高い特異性の反復配列プロー
ブを生成するために使用することができる。

【００３５】反復配列は、 2〜数10万のコピーの範囲に
及ぶ多数のコピーのゲノムにおいて生じる。反復配列の
コピーは、動原体、末端小粒または種々の数のタンデム
反復(VNTR)のごとき、1または複数の位置にクラスター
される［Nakamura et al. 1987］。反復配列のコピー
はクラスターされ、またはそれらは散在させられる。す
なわち、1または複数の染色体にまたはゲノムのいたる
ところに分散される。

【００３６】アルファ、ベータ（Sau 3Aファミリーとも
呼ばれる）およびガンマサテライト、または他のグルー
プ、ヒトサテライトI，II，IIIおよびIVとして言及さ
れたものを含む、サテライト DNAの種々のファミリーが
記述されている。これらのサテライト DNAの構造の一般
的特徴は、これらが小さな反復されたユニットで構成さ
れることであり、例えばヒトにおけるアルファサテライ
ト反復ユニットはおよそ171bpの長さである。典型的な
クラスターされた反復配列はアルファサテライト；ベー
タサテライト；サテライトI，II，IIIおよびIV；ならび
に1p36に位置する39bp反復である。

【００３７】（プライマー配列）一般的には、プローブ
プライマー配列は望ましいプローブ配列の隣りに位置
するもののみならず、分離のための要求を回避するため
にプローブ配列それ自身に含まれるものからも選択され
る。本発明の１つの好ましい実施例においては、変性プ
ライマーの１つのセットの結合座位は、プライマーの第
２のセットの結合座位の約20bpから約5kbの範囲内であ
る。プライマーは8〜100bpの長さの範囲に及び、より
好ましくは20-30bpである。非常に小さなプライマーが
選択される場合には、たいてい4℃という非常に低温で
アニーリングがなされる。最も有効なプライマーは、
選択された反復配列が増幅生成物における望ましくない
配列を得ることを回避することを準備される領域にのみ
結合するものである。

【００３８】望ましい反復配列のための適切なプライマ
ーは選択することにより、また種々の異なるヌクレオチ
ド配列を含むセットを作製すことにより作られる。それ
らのおのおのは、標的核酸における知られた反復配列の
核酸の特異的ストレッチ(a specific stretch)に対して
むしろ相同ではない。それらは 1または複数の塩基によ
り、標的 DNAにおける結合配列とは異なる。例えば、化
学的オリゴヌクレオチド合成により導入されたプライマ
ー配列の縮重は 8〜16ホールド、特に好ましくは12ホー
ルド縮重(eight to 16-fold, with a 12-fold degenera
cy)である。付加的な制限酵素認識座位が、さらに分子
クローニングを促進するためにプライマーに付与され
る。実施例において使用されたオリゴヌクレオチドプ
ライマーおよび他の非変性プライマーの配列が表１に示
されている。

【００３９】

【表１】

【００４０】ヒト動原体の反復配列のためのプローブ
は、 171bpアルファサテライト（アルホイド）反復配列
の2つの領域に相同である変性オリゴヌクリオチドを選
択することにより作製することができる。この反復配列
は全ヒト染色体に保持される。特に、好ましい実施例に
おいては、bp ポジション37-52 および10-26でアルファ
サテライト反復共通配列にそれぞれ結合する2つのプラ
イマー、WA1 およびWA2が生成される。アルファサテラ
イトDNAのための共通配列はウェイおよびウィラード(Wa
ye and Willard 1987)により発表されている。

【００４１】アルファサテライト反復配列のための変性
プライマーは、ゲノム DNA鋳型にアニールされる場合に
5'末端が互いに対向するように配置される。予期される
最小限の生成物サイズは、アニーリング座位間の距離を
基準として 175bpである（図１１）。より長い生成物の
増幅の間、それぞれのモノマー反復ユニットが共通配列
に対して相同性の程度が低い場合、多数の170bp反復配
列がプライマーとアニーリング座位間で生じ、このため
プライマーは各反復モノマーにおいてはアニールできな
い。この実施例においては、プライマーアニーリング
座位は1または複数の反復ユニットにより分離される。
このようにして、増幅されたDNAセグメントは1または複
数の171bp反復ユニットを加えた175bpのDNAセグメント
を含む。

【００４２】本明細書の表１に列挙されたプライマー配
列は、全ての自然に発生するアルホイド配列に好適であ
るとはいえない。しかしながら、プライマーの縮重は増
幅機構を使用することに最高の柔軟性(a maximum flexi
bility )を導入し、また通常の当業者は異なる染色体、
例えばY染色体のために本発明に関する種々のプライマ
ーを調製することを知るであろう。

【００４３】後述の実施例１で検討しかつ表２に示され
たごときクローンpBS609-51および-52の配列分析により
指摘されたごとく、異なるプライマー配列はプローブ増
幅プロセスに含まれ、そしてプライマー配列は共通配列
とは相違する。WA1およびWA2により示されたプライマー
配列のプールからの異なるプライマー配列は、図３に概
略的に表されたごとく鋳型 DNAのそれぞれの伸長範囲に
アニールする。これにより、増幅生成物のコンプレッキ
シティが増大される

【００４４】（任意に選択された反復プローブ）アニー
リング座位が逆方向反復の部位である場合には、反応は
１プライマーで遂行される。アニーリング座位が染色体
に沿って同じ配向を有する場合（すなわちpターからqタ
ー方向）(pter to qter direction)には、オリゴヌクレ
オチドプライマーの1または複数のペアが使用され得
る。プライマー分子は、１PCRサイクルの間での互いの
アニーリングがその後のサイクルの間でのプライマー分
子のアニーリングを妨げないかぎりにおいては、互いに
相補的であり得る。長さにおいて4-10bpほどの配列に結
合するオリゴヌクレオチドは、プライマーとして使用す
ることができる。

【００４５】任意にプライミング(priming )するための
本発明の好適なプライマーは、下記の29ヌクリオチドを
有するJun1と呼ばれる： 5'-CCCAAGCTTGCATGCGAATTCXXXXCAGG-3' ここでXは4DNA塩基--A，C，G またはTのいずれかを表
す。それ故、当該プライマーは4Xの位置を変更すること
により 256の可能な結合を有する(4×4×4×4=256)。
これらのXの位置は、スプライスされた接合点で維持さ
れることを見い出された4塩基認識配列に関して5'であ
る。 5'において、Jun1の末端はハイブリダズされたス
トランドを互いにキープするC-Gクランプとして役立つ
トリプレット配列CCCである。次の18ヌクリオチドは多
数の異なる制限酵素認識座位を提供する。

【００４６】Jun1プライマーは染色体−特異的反復 DNA
を増幅するために、例えばフローソートされた染色体の
ごとき、ヒトゲノムDNAまたは染色体−特異的DNAと組
み合わせて使用することができる。Jun1プライマーが使
用される場合には、1p36に位置する39bp反復が選択的に
増幅される。

【００４７】（プローブの合成）プローブの合成は、
従来のポリメラーゼ鎖反応(PCR)プロセスにより遂行さ
れる。PCRのメカニズムは下記の文献に説明されてい
る。Saiki et al., Science 230:1350(1985)、U.S.Pate
nt Nos.4,683,195 および4,683,202（両者とも1987年7
月28日に発行）、U.S.Patent Nos.4,800,159（1989年1
月24日発行）。PCRアダプターリンカー法(PCR adapter-
linker method)がSaunder等(1990)、Johnson(1990)、PC
T 90/00434(1990年8月9日公告)により説明されている。
プライマーの混合物を採用する他のPCR法が下記の文献
により記述されている。Meltzer et al.,"Generation o
f Region Specific Probes by Chromosome Microdissec
tion: A Novel Approach to Idetify Cryptic Chromoso
mal Rearrangements," Natuer--Genetics,(1992)。

【００４８】一度、変性プライマーを使用するPCRを採
用する本発明の方法が反復配列プローブ配列をゲノム D
NAから分離された場合には、スクリーニング、シーケン
シングおよび／またはインシトゥハイブリダイゼーシ
ョン実験における使用のための大量のプローブを調製す
るために多くの異なる方法が使用し得る。例えば、PCR
増幅生成物はPCRプロセスによりさらに増幅され、およ
び／または実施例２で示されているように種々のベクタ
ーで分子的にクローンされ得る。

【００４９】クローニング計略において、フランキング
ベクター配列にアニールするプライマーは各プライマ
ーがプローブ分子内に伸長することができるために有利
であり、そして単一ペアのベクタープライマーは異な
る種類のインサートを増幅するために使用することがで
きる。インサートが配列された場合には、それはインサ
ートの5'末端にマッチする非変性プライマーを合成する
ことができる。それ故、２対のプライマーは改良され
た特異性(Lo et al.1990;Weier et al.1991c)のため
に、上記したプローブ合成機構に類似するステップ反応
においてネスティドセット(nested sets)として使用す
ることができる。自動化されたプログラム可能なPCR法
は、ウェイアーおよびグレイ(Weier and Gray 1988)に
より記述された熱安定性の DNAポリメラーゼを使用する
プローブ合成のごとき、大規模なプローブ合成のために
使用される。

【００５０】Q-ベータレプリカーゼシステム(Lizardi
et al. 1988)、またはバイオテクニカインターナシ
ョナルインコ(BioTechnica International Inc. Cambr
idgeMA USA)により商業化されたごときリガーゼ鎖反応
を使用するより新しい技術は、所望のプローブのコピー
を作成するために使用することができる。さらに、制限
酵素DNAポリメラーゼシステムを使用するこれらのDNA
配列の等温インビトロ増幅(isothermal in vitro ampli
fication)は、ワルカー等(Walker et al. 1992)、グア
テリー等(Giatelli et al. 1990)、およびキエビット等
(Kievits et al.1991)により記述されたごとく使用する
ことができる。

【００５１】（鋳型DNA）鋳型 DNAのコンプレッキシテ
ィを限定することは、本発明により調製された増幅生成
物の染色体−特異性にとって重要である。特に、本発明
のプローブの産出のために、フローソーティングにより
分離された染色体は鋳型 DNAとして使用される。染色体
−特異的 DNAはまた、ハイブリッド細胞から分離され、
顕微解剖によりまたは密度勾配法により分離され、また
はその他の手段により分離される。さらに、染色体−特
異的鋳型 DNAは染色体−特異的ライブラリーであること
ができる。

【００５２】（プローブの標識）本発明のプローブは、
適切に修飾されたdNTPsの存在のもとでPCR増幅の間に標
識することができ、またはPCR反応の完了後にPCR生成物
の化学的または酵素的修飾により標識される。限定され
ないが、蛍光性化学物質、放射性物質、化学的ハプテ
ン、または酵素修飾因子を含む種々の標識技術が、直接
的または間接的に、プローブを標識するために使用され
る。好的に修飾されたdNTPsは限定されないが、ビオチ
ン-11-dUTP；ジゴキシゲニン-11-dUTP；dATPのビオチン
誘導物；フルオレセイン化-dUTP；dUTPのローダミン標
識誘導体； dCTPのローダミン標識誘導体；dUTPのヒド
ロキシクマリン−標識誘導体；およびレゾルフィン-11
-2'-dUTPを含む。好適な標識は限定されないが、AAF、
硫黄および水銀を含む。

【００５３】プローブを使用して達成される染色強度は
限定されないが、アビジンおよび／または標識された抗
体に結合された蛍光色素を含む種々のシステムで増幅さ
れる。DNAは限定されないが、DAPIを含むDNA−特異的染
料で対比染色することができる。それは、バウンドプ
ローブ分子の可視化のために選択された機構に依存する
異なる波長間隔で蛍光を発する。

【００５４】（インシトゥハイブリダイゼーション）
実施例１に指摘したように、本発明のプローブは中期ス
プレッド、間期核および／または組織切片のためのイン
シトゥハイブリダイゼーションのために使用すること
ができる。間期核は生殖系列細胞および／または体細胞
から得ることがてきる。小核の染色体物質はまた、本発
明の適切なサイズとされたプローブの標的であることが
できる。ピンケル等(Pinkel et al.1988)により詳述さ
れたごとき標準ハイブリダイゼーションプロトコルの
修飾物が使用される。

【００５５】実施例１においては、動原体反復 DNAは一
対の変性アルファサテライト共通プライマーを使用する
ことにより選択的に増幅することができることが示され
ている。PCRは、アルホイドモノマー反復の最も保持さ
れた部位においてアニールするオリゴヌクレオチドプ
ライマーを使用することにより、プライマーアニーリ
ング座位の間の塩基配列において自然に生じる変形(var
iation)を再生する。結果として生じたプローブ DNA
は、種々のヌクレオチド配列をともなう異なるサイズの
範囲の DNAフラグメントの不均一混合物である。PCR-変
性プローブ DNAの縮重は、従来のクローナルDNAプロー
ブの使用に比較してインシトゥハイブリダイゼーショ
ンの間で有利である。何故ならば、それは染色体標的に
沿って非常に緻密な配列の析出を許すからである。

【００５６】ウェイアー等(Weier et al. 1991a)に指摘
されたごとく、実施例１の染色体10-特異的DNAと同様に
それらに必須的に記述されたごとく調製された染色体8-
特異的DNAを3つの異なるサイズのクラスへの分離、標識
およびそれらをインシトゥでハイブリダイジングするこ
とは、クロスハイブリダイゼーションが主として単量体
フラクションに依存することを示した。一方、より長い
DNAフラグメントは標的染色体8に対してより高い特異
性を示した。増幅生成物を誘導された染色体10のサイ
ズの分布は、染色体8−特異的鋳型DNAで観測された分布
に非常に類似する［Weier et. al. 1991a］。また同様
に、ビオチン化プローブDNAは、非標識全ヒトアルホイ
ド DNAの付加によりブロックすることができる他の染色
体と重要なクロスハイブリダイゼーションを示す。この
ブロツキング DNAはまた、全ヒトゲノムDNAおよび／ま
たはCot1DNAであることができる。

【００５７】本発明の標識プローブに対するヒトアルホ
イドブロッキングDNAの好ましい比率(w/w)は約2:1〜約
5:1である。本発明の標識プローブに対する全ヒトゲノ
ムDNAの好ましい比率(w/w)は約10:1〜30:1、特に25:1で
ある。ブロッキングDNAは、プローブのわずかな特異的
成分を結合することから阻止するために使用される。

【００５８】（分子クローニング）上記に述べたごと
く、プライマーを使用する本発明のPCR法は多少染色体-
特異的であるプローブの不均一混合物を生成する。併せ
て上記に述べたごとく、プロッキング DNAは混合物のわ
ずかな特異的成分を結合することから阻止する。従っ
て、プロッキング DNAの付加は、不均一混合物から染色
体−特異的染色試薬を作成する。

【００５９】実施例１に例示したごとく、高度に特異的
反復プローブは、高度に特異的プローブ成分のための不
均一な混合物をスクリーニングすることにより調製する
ことができる。典型的なスクリーニング法においては、
プローブ成分は分子的にクローン化され、また適切なサ
イズの範囲においてインサートを含むクローンは先づ選
択される。適切なサイズとされた成分はその後、染色体
特異性のためにインシトゥハイブリダイゼーション実
験により標識されかつスクリーニングされる。クローン
はまた、より多くの標的座位を有しかつより強いハイブ
リダイゼーションのシグナルを出す、 DNAを高度に反復
したインサートを含んでいるとして選択される。スクリ
ーニングプロトコルには多くのバリエイションがある
が、実施例１に示したものは好適なスクリーニング法で
ある。

【００６０】染色体10−特異的クローンがpBS609-51お
よびpBS609-52であるごとく、クローンが高度に特異的
反復配列を含むことを見い出された場合には、このよう
なクローンはプローブ生成を基礎としたPCRにとって好
ましい鋳型である。PCRによるクローンの鋳型からのプ
ローブの産出の他の有用な状況は、プライマーがプロー
ブにベクター配列のある部分を組み込むことをデザイン
することができるという事実である(Lo et al. 1988; W
eier and Rosette 1988 )。プローブ分子の5'末端上の
非相同ベクターテールは、多くの場合、ハイブリダイ
ゼーションの間アニーリングするプローブに対して阻害
せず(Frommer et al. 1988; Weier et al. 1991c)、し
かし実質的にはハイブリダイゼーション標的を広げ、
かつ増大した数のレポーター分子(reporter molecules)
を結合することによりシグナル強度を増大するに違いな
い。ある好適なベクターはブルースクライブプラスミ
ドを含み、より一般的にはpUC誘導プライミドを含む。
好適なプライマーは限定されないが、WBS2，WBS4（表
１），M13 前逆シーケンシングプライマー(M13 forwar
d and reverse sequencing primer)，およびT3 およびT
7 RNAポリメラーゼプロモータに結合するプライマーを
含む。

【００６１】アメリカ合衆国政府は、同国エネルギー省
とユニバーシィティオブカリフォルニアとの間の、ロ
ーレンスリバーモアナショナルラボラトリーの運営
のための契約書番号W-7405-ENG-48に従って、本発明に
おける権利を有する。次の実施例は単に例示の目的のた
めであり、いずれにしても本発明の範囲を限定すること
を意図するものではない。

【００６２】

【実施例】

実施例１ヒト染色体10-特異的アルファサテライトDNAに対する
プローブａ．オリゴヌクレオチドプライマーアルファサテライト共通配列[Waye and Willard 1987]
またはクローニングベクターpBSの部分に相同なオリゴ
ヌクレオチドプライマー--WA1,WA2,WBS2およびWBS4
が、DNA合成機によりホスホラミダイト化学を用いて合
成された[Applied Biosystems, Foster City, CA (US
A), model 380B]。 C₁₈逆相クロマトグラフィーとHPLC
によるオリゴヌクレオチドの合成とその先の純化は、メ
ーカーの仕様書に従って行った[Waters Chromatograph
y, Milford, MA (USA)]。

【００６３】変性(degenerate)位置を含めて、オリゴヌ
クレオチドプライマーの配列を表１に示す。プライマ
ーWA11とWA12とは2N NH₃中で一夜インキュベートするこ
とによりデプロテクト(deprotect)された。それから、
プライマーは親液性化され、水中に再懸濁しエタノール
沈澱させた[Maniatis et al. 1986]。全てのプライマー
は、30 uMストック水溶液として準備し、-20℃で貯蔵し
た。

【００６４】変性アルファサテライトプライマーWA1,
WA2,WA11およびWA12は非相同塩基を有するので、PCR産
生物の分子クローニングを容易にする。プライマーWA1
とWA2とはそれぞれ 5' Hind IIIとPst I認識配列を有す
る。WA11とWA12とはそれぞれBam HI, Pst IおよびHind
III、またはBam HI, Hind IIIおよびPstIに対する5'か
ら3'の制限酵素認識座位を表す短いポリリンカー配列を
有する。１つまたは３つの余分の塩基がプライマー合成
の間にそれぞれWA1とWA2またはWA11とWA12の5'末端に付
加され、PCRとその後のダイジェスションの間のTaq DNA
ポリメラーゼによる制限座位の正常な再産生を確実にし
た。プライマーWBS2とWBS4とは、マルチクローニング座
位の側面に位置する(flanking) pBS-DNA配列に特異的に
アニールする[Weier and Rosette 1988 and 1990]。

【００６５】ｂ．染色体10-特異的アルファサテライト
DNAの増幅ヒトｘハムスター細胞系 R342-A4からフローソーティン
グによって分離されたほぼ2,000のヒト染色体10 [Trask
et al. 1991]が最初の反応におけるDNAテンプレートと
して用いられた。反応緩衝液は前記のように、200 ul
の増幅緩衝液[10mM Tris-HCl, pH 8.4 at 20℃, 1.5 mM
MgCl₂, 50 mM KCl]と混合した5単位のTaq DNAポリメラ
ーゼ,各0.2 mMのdATP,dCTP,dGTP,dTTPおよび各1.2 uMの
WA1,WA2からなるものであった。PCR中の蒸発を防止する
ために、鑛油[100 ul, Squibb, Princeton, NJ (USA)]
の層を反応混合物の表面に作った。DNA増幅は、パーキ
ンエルマーシータスサーマルサイクラー( Perkin E
lmer Cetus Thermal Cycler)[Norwalk, CT (USA)]を用
いて45サイクルの間行った。各サイクルは、94℃120秒
の変性ステップ（最初の変性に対しては180秒）、53℃6
0秒のプライマーアニーリング、72℃120秒のプライマ
ー伸長を含んでいた。有機および水溶液相は、反応チ
ューブ中で1.5容積のクロロホルムの添加により逆転(in
vert)され、またPCR産生物は清浄なチューブ中に移し
た。アルファサテライトDNAの増幅は、0.5 ug/mlのEB
を含む40 mMトリス-アセテート, 1 mM EDTA, pH 8.0中4
%のアガロース中における10 ulアリコートのPCR反応物
の電気泳動によって目で確認された[Maniatis et al. 1
986]。反応物中の二重鎖DNAの濃度は、TK 100フルオロ
メーターをメーカーのプロトコルに従って使用するヘキ
スト(Hoechst)33258蛍光によって測定した[Hoefer Scie
ntific, San Franciaco, CA (USA)]。

【００６６】プライマーWA1とWA2とを使用した最初の増
幅反応からの非標識染色体10−特異的PCR産生物のゲル
電気泳動は、アルホイド(alphoid)モノマー配列の増幅
の成功を表すほぼ175塩基対の強いバンドを示した（図
１０、レーン１）。より高い分子量のDNA断片はずっと
低い効率で生成され、より大量のPCR産生物をゲルに負
荷したときに、底にある高分子量DNAのスメア(smear)を
伴ってほぼ 346塩基対のバンドとして現れた（データは
省略）。1.8%アガロース上における産生物の分離は、60
0塩基対ないし20kbの範囲で不均一のサイズのDNA断片の
バックグラウンドを示した。

【００６７】ｃ．染色体10-特異的アルホイドDNAの標識
化最初の反応からのPCR溶液の4マイクロリットルのアリコ
ートを200 ulのビオチン化緩衝液に再懸濁したが、この
緩衝液ではdTTPがビオチン-11-dUTPによって置換され、
また各1.2 uMのプライマーWA1とWA2、8ユニットのTaqが
存在する。この混合物を 100 ulの鑛油によって覆い、
アルホイドDNAはさらに20サイクル増幅しビオチン化し
た。鑛油はクロロホルムの添加後除去され、標識プロ
ーブDNAはインシトゥハイブリダイゼーション用とし
て使用されるまでさらに純化することなくマイナス20℃
で貯蔵した。

【００６８】最初のPCR反応からのアリコート200 ul
は、ワイヤー等(Weier et al.)(1991b)によって記載さ
れたように、ランデジェント等(Landegent et al.)(198
4)によって開示された手法を僅かに変更してAFFによっ
て標識した。反応後、DNAはフェノール／クロロホルム
／イソアミルアルコールによって3回抽出し[Maniatis
et al. 1986]、ついで室温で2回エーテル-抽出した。 D
NAはついでエタノール, 0.1MNa アセテートの 2.5容積
中で再沈澱し、乾燥し、500 ul 10 mM トリス-HCl, pH
8.0, 1 mMEDTA中で再懸濁した。

【００６９】PCR 産生物のジゴキシゲニンによる標識化
は、上記ビオチン化反応と類似の方法で行ったが、標識
化緩衝液がビオチン-11-dUTPの代わりに、ジゴキシゲニ
ンとdTTP(それぞれ0.16 mM、0.04 mM)の混合物を含む点
を除く。

【００７０】ｄ．アルホイドブロッキングDNAの合成非標識化全ヒトアルホイドDNAは、他に記載したように
男のヒトゲノムDNAから合成した[Weier et al. 1991
a]。簡単に言えば、分離した 200 ngのゲノムDNAを前記
のようにWA1とWA2を含む100 ulの増幅混合液と混合し
た。PCRは 30サイクル行い、二重鎖DNAの濃度はフルオ
ロメトリーによって測定した。ヒトの胎盤DNAは、平均
サイズがほぼ300−400塩基対であることがアガロース
ゲル電気泳動によって判断されるまで、提供された DNA
を音波処理することによって、ブロッキング剤用として
準備した。

【００７１】ｅ．試料の調製中期スプレッドは、ハーパー等(Harper et al.)(1981b)
によって記載された手法に従って、フィトヘマグルチニ
ン−刺激短期リンパ球培養から作られた。酢酸／メタノ
ール(1:3, Carnoy's fixative)固定の中期スプレッド
は、他に記載したようにして調製した[ Weier et al. 1
990]。スライドは、使用されるまで、乾燥窒素下で密封
したプラスチックバッグ中で-20℃で貯蔵した。細胞お
よび染色体DNAは、プローブ混合物の使用前に、スライ
ドを4分間74℃で70%ホルムアミド, 2×SSC, pH 7.0中で
インキュベートすることによって熱的に変性した。つ
いで、スライドを 70, 90, 100%エタノールシリーズ中
で脱水し、室温で簡単に空気乾燥した。腎臓組織の試
料は、腎細胞癌(RCC)患者から腫瘍のある腎臓を外科手
術により除去した後に取得した。一次腫瘍に隣接する正
常組織からの新鮮な試料は、リン酸緩衝液(PBS)中で2回
洗浄し、ついで5 mlの30 mM EDTA中に置いた。組織は小
刀で細かく切り、54 umのナイロン網でろ過した[Kunick
a et al. 1987]。細胞懸濁物は600 gで5分間遠心分離
し、上澄を捨て、ペレットは新しく調製したカーノイ固
定液中で20分間室温で固定した。検鏡用スライドは他に
記載したように洗浄した[ Weier et al. 1991a]。固定
した細胞はさらにカーノイ固定液を2回取り替えて洗浄
しスライド上に落とした。タッチングインプリント(to
uching imprint )は、冷凍組織試料を予備処理なしで清
浄なスライドガラスに向けて押しつけることによって準
備した。ガラスに付着した細胞は、直接にカーノイ固定
液中で20分間固定した。

【００７２】固定した腎臓細胞核の予備処理は、ペプシ
ン(0.01 N HCl中100 ug/ml)を用い10分間室温で行った
[ Hopman et al. 1989]。間期細胞はさらにパラホルム
アルデヒド[4% (w/v)in PBS]中での10分間浸漬によって
固定した。それから、スライドは、2×SSC中で洗浄し、
70%ホルムアミド, 2×SSC,pH 7.0中で10分間72℃で変性
した。スライドはそれから 70%,80%,100%エタノールシ
リーズ中で脱水し、空気乾燥し、プローブ混合物の添加
前に37℃で予備加熱した。

【００７３】ｆ．インシトゥハイブリダイゼーション標識化プローブDNA(ほぼ20 ng)および選択された量の非
標識ヒトゲノムDNAまたは全ヒトアルファサテライト
DNAを純化しないで、ピンケル等(Pinkel et al.)(1986)
により記載された8 ulのハイブリダイゼーション混合物
に添加した。必要により、水を 10 ulになるまで加えた
ので、ハイブリダイゼーション混合物中における最終濃
度は、55%ホルムアミド, 10%デキストランサルフェー
ト, 1 ug/ulヘリングスパーム( herring sperm)DNA, 2
×SSC, pH 7.0であった。ハイブリダイゼーション混合
物中のDNAは74℃で5分間変性した。氷上で冷やした後、
混合物は熱変性したスライドへ加え、22 mm×22 mmのカ
バースリップで覆い、37℃で一夜ハイブリダイズした。
それから、スライドを 50%ホルムアミド, 2×SSC, pH7.
0中で42℃で15分間洗浄し、ついで15分間2回PN緩衝液中
で37℃で洗浄した。ビオチン化プローブは、20分間室温
でアビジン-FITC(5 ug/ml in PNM buffer)中でのインキ
ュベーションにより検出した。過剰のアビジン-FITC
は、室温でPN緩衝液を2回取り替えることにより洗浄、
除去し、DNAは中期染色体の識別のため、1%p-フェニレ
ンジアミン, 15 mM NaCl, 1 mM H₃PO₄, pH 8.0, 90%グ
リセロール[antifade solution, Johnson and de C. No
queira Araujo 1981]中それぞれ1 ug/mlまたは0.5 ug/m
l濃度のPIまたはDAPIにより対比染色した。

【００７４】4umの厚さのパラフィン封埋組織切片は、
組織加工のためプロナーゼとHClとの続いての使用を含
むブリガティ等(Brigati et al.)のプロトコルに続い
て、インシトゥハイブリダイゼーションのための準備
としてパラフィンの除去を行った。ついで、切片は20分
間70%ホルムアミド, 2×SSC中で74℃で変性し、70%, 80
%,100%エタノールシリーズ中で脱水し、前記のように
ハイブリダイズした。組織切片のハイブリダイゼーショ
ン後の洗浄は、30分間3回に延ばし、50%ホルムアミド,
2×SSC中で42℃で行い、ついでPN緩衝液中で37℃で 3回
洗浄した。それから、組織切片は、前記のように20分間
アビジン−FITCを用いてインキュベートし、PN緩衝液を
15分間ごとに4回取り替えて洗浄し、0.5ug/ml PIを含む
アンチフェード(antifade)にマウントした。

【００７５】AAF-標識化プローブDNAは、AAFに対するモ
ノクローナル抗体を産生する２つのネズミ細胞系 (MBL4
FとMBL6B)からの10 ulの上澄を用いてインキュベートし
た後に検出した。［これら２つの細胞系はDr. R. Baan,
TNO, Rijswijk, The Netherlandsにより快く提供され
た。］ついで、スライドは、PN緩衝液中で室温で2回洗
浄し、15分間室温で1×PBS( Mg, Caなし), 2%正常ヤギ
血清, 0.05%トゥイーン20中フルオレセイン標識化ヤギ
抗−マウス抗体の1:25希釈液によりインキュベートさ
れ、室温でPN緩衝液を2回取り替えて洗浄した。

【００７６】ジゴキシゲニン-標識化DNAの検出は、ジゴ
キシゲニンに対する抗体によって行った。これらの実験
において、ジゴキシゲニン−標識化プローブは、ビオチ
ン化プローブと同時にハイブリダイズした。ある実験で
は、非クローン−ビオチン化染色体10プローブが、ジゴ
キシゲニン-標識化DNAを用いてハイブリダイズされた。
Alu DNAプローブは、本書中に記載されたのと類似の手
法で、クローンされたAlu反復DNA断片から産生された。
Aluプローブの同時ハイブリダイゼーションは、R-バン
ドへの結合と非常によく似た様式でのこのプローブの特
異的染色体領域への選択的結合によって、染色体の識別
に対して有用である[ Baldini and Ward1991 ]。他の実
験においては、クローナル染色体10-特異的テンプレー
トDNAから産生されたシゴキシゲニン−標識化プローブ
が、それぞれビオチンまたはジゴキシゲニン標識化Alu
プローブによってハイブリダイズされた。

【００７７】スライドは、前記のようにポスト−ハイブ
リダイゼーション溶液中で洗浄し、PNMによる10分間室
温でのインキュベーションによってブロックした。同
量のフルオレセイン標識化抗−ジゴキシゲニン抗体(20
ug/ml in PNM)とアビジン-テキサスレッド(2 ug/ml in
PNM)とを混合し、スライドに施した。インキュベーショ
ンは、カバースリップの下で25分間室温で暗所で行っ
た。それから、スライドは、PN緩衝液を2回取り替え 37
℃で洗浄し、アンチフェード溶液中のDAPIにマウントし
た。

【００７８】検鏡は、ツァイススタンダード蛍光顕微
鏡( Zeiss, Oberkochen, FRG)で行ったが、これはPI蛍
光の同時観察を可能にするFITC用エピ-イルミネーショ
ンフィルターセット、またはFITCとTRとの同時観察用
フィルターセットを使用するプラン-ネオフルアー(Pla
n−Neofluar)63×/1.20油浸対物レンズ付きのものであ
った[ Omega Optical, Brattleboro, VT (USA)]。写真
は、コダックエクタクロム400フィルムにより記録し
た。

【００７９】ｇ．PCR産生物のクローニング PCR産生物は、プライマーWA11とWA12(表１に示す)(1.2
uM)とを含む 400 ulの反応緩衝液中に、ほぼ12,000のフ
ローソートされたヒト染色体10( 1530 per ul)を、４つ
の非修飾dNTP( 各0.25 mM)と8ユニットのTaqポリメラー
ゼの存在下で再懸濁することによって、pBSベクター[ S
tratagene, San Diego, CA (USA)]のBamHIへのクローニ
ングに対して増幅した。

【００８０】サーマルサイクラー(thermal cycler)
は、40℃のプライマーアニール温度を有する最初の6サ
イクルと、ついで50℃のプライマーアニール温度を有
する29の増幅サイクルとを行うようにプロクラムを作っ
た。DNAの増幅後、10分の1容積の5 M Naアセテートを添
加し、DNAを同量のイソプロパノール中で沈澱させ、70%
エタノールで洗浄し、空気乾燥し、20ユニットのBam HI
を含む 20 ulの1× Bam HIダイジェスション緩衝液中で
再懸濁させた。反応物は、37℃で30分間インキュベート
し、DNAを2-プロパノール中で沈澱させ、ペレットは70%
エタノールで洗浄した。ついで、PCR産生物を100 ulの
水中で再懸濁させた。それから、2マイクロリットルのD
NA断片を10ユニットのT4 DNAリガーゼとほぼ 1 ug Bam
HI-ダイジェストpBS DNAとを含む30 ul 1×リガーゼ緩
衝液中に再懸濁させた。連結反応は、15℃で一夜行っ
た。1 ulアリコートの連結反応物を、1×TE緩衝液(10 m
M Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0)により1:5に希釈し
た。この希釈液1マイクロリットルが、提供者のプロト
コルに従って適当量のDH5アルファ細胞を形質転換(tran
sform)させるために使用された。ついで、細菌細胞は、
100ug/mlのアンピシリンを含むルリア-ベルタニ(Luria-
Bertani)(LB)媒体[Maniatis et al. 1986]中で1:10に希
釈し、100ug/mlのアンピシリン, 4ug/mlのIPTG, 40ug/m
lのX-Galを含むLB寒天上にプレートさせた。

【００８１】ｈ．PCRによるライブラリースクリーニン
グ個々の白色コロニーを滅菌したピペットチップを用い
て取り上げ、100 ug/mlのアンピシリンを含むLBブイヨ
ン中で増殖させた。１対のプライマーが多数の異なった
DNA配列を増殖するために用いられる複合(multiplex)PC
Rプロトコル[Chamberlain et al. 1988 ]の変形が使用
された。PCRは、異なった一夜培養物からの1 ulアリコ
ート４つを、プライマーWBS2とWBS4,４つの非標識化dNT
P,塩およびTaqポリメラーゼを前記のように最初の増幅
用として含む50 ulの増幅緩衝液中で結合させ再懸濁さ
せることによって行った。PCRは、53℃でのプライマー
アニーリングを 40サイクル行った。ついで、所望のサ
イズ範囲のPCR産生物を含むクローンは、細胞培養物か
らの1 ulアリコートを、プライマー対WBS2とWBS4または
WA11とWA12のいずれかを含む 40 ul反応緩衝液中に再懸
濁することによって、40サイクルPCR反応において個々
に増幅させた。 8 ulのアリコートのゲル電気泳動分析
は、200 ngサイズマーカーDNA (φX174 RF DNA/Hae III
digest)を用い4%アガロース中で別々のレーンで行っ
た。

【００８２】ｉ．細菌クローンからの標識化プローブの
産生ベクター-特異的プライマーWBS2とWBS4とを用い、代表
的クローン、pBS609-51およびpBS609-52からの細胞を使
用する反応の増幅産生物(1 ul)を、インサート-特異的
プライマーWA11とWA12とを含むビオチン化緩衝液中に再
懸濁した。 DNA断片の標識化は、前記のように20サイク
ルPCRで行った。ジゴキシゲニンによるPCR産生物の標識
化と同時的増幅は、ビオチン化反応と類似した20サイク
ル中に行ったが、ジゴキシゲニン−標識化緩衝液がビオ
チン-11-dUTPの代わりにジゴキシゲニン-11-dUTPとdTTP
との混合物(それぞれ0.16 mMと0.04 mM)を含む点が異な
る。

【００８３】ビオチン化DNAのインシトゥハイブリダ
イゼーションは、非クローンプローブに対して前記し
たようにして行った。1マイクロリットルのジゴキシゲ
ニン-標識化DNAを、1 ulのビオチン化Alu DNAプローブ,
8 ulのマスターミックス(MasterMix)2.1( マスターミ
ックス2.1は78.6%ホルムアミド, 14.3%デキストランサ
ルフェート, 2.9 ×SSC, pH 7.0である)および1 ulのヘ
リングスパームDNA (10 mg/ml)と混合した。

【００８４】ｊ．プローブDNAシークエンシングプラスミドDNAは、LB-媒体中の細胞クローンの一夜培養
物500 mlからマキシプレップ(Maxiprep)カラム[ Qiage
n, Studio City, CA (USA)]を用い、メーカーの指図書
に従って分離した。DNAシークエンシングは、サンガー
等(Sanger et al.)(1977)によって記載されたプロトコ
ルに従ってジデオキシヌクレオチドシークエンシング
反応によって行った。二重鎖DNAは、反応緩衝液中での
T3-またはT7-プライマーのdATP,dCTP,dTTPおよびdGTPま
たはdITPによる伸長によって配列化した。DNA配列は、
オリジナルのX-線フィルムから読みとった。DNA配列の
さらなる加工は、インテリジェネティクス社( IntelliG
enetics, Inc.)から得たジーンワークス(GeneWorks)ソ
フトウエアーを用いて行った[Mountain View. CA (US
A)]。

【００８５】結果ｋ．ブロッキングDNA存在下の変性プローブDNAのインシ
トゥハイブリダイゼーションビオチン化染色体10−特異的プローブの正常な中期スプ
レッドへのブロッキングDNAなしでのハイブリダイゼー
ションは、多数の染色体上の動原体領域の標識化を示
した(図１)。間期細胞核は典型的にいくつかの蛍光ド
メインを示した(図２)。

【００８６】ほぼ20 ngのビオチン化DNAを含むハイブリ
ダイゼーション混合物への100 ngの全ヒトアルホイド
ブロッキングDNAの添加は、クロスハイブリダイゼーシ
ョンを減らしたので、標的染色体10は明るく標識された
動原体領域によって容易に識別できた(図３)。これらの
条件下では、染色体10-特異的動原体DNAを含むドメイン
は、間期細胞核において容易に観察できカウントできた
(図４)。この効果は、500 ngのヒトゲノムDNAをハイブ
リダイゼーションカクテルに加えたときに非常に類似
していた。

【００８７】ヒトゲノムDNAを用いた競合ハイブリダイ
ゼーションレジメンが、外科手術によって除去された
腫瘍に隣接する腎臓組織の単一細胞懸濁物中における染
色体10の数を決定するために用いられた。ハイブリダイ
ゼーション混合物は、典型的に20 ngのAAF−標識化プロ
ーブDNAと500 ngの非標識ヒトゲノムDNAとを含んでい
た。AAF-標識化プローブの47, XY, ＋10腫瘍核型を有す
る腎臓細胞癌患者からの細胞試料へのハイブリダイゼー
ションの結果を図４と図５とに示す。図４に示す細胞
は、染色体10-特異的アルホイドDNAを表す２つの明るい
ドメインを示した。しかしながら、図５の間期細胞は、
染色体10の余分のコピーの存在を示す３つの黄色蛍光ド
メインを示した(矢印)。このように、単一細胞のこの特
定の調製においては、核型的に異常な細胞の相対的割合
を、３つのドメインを有する細胞を数えることによって
数パーセントの概略誤差限度をもって迅速に評価するこ
とができた。

【００８８】この例の変性プローブDNAは、パラフィン
を除去した組織断片へのハイブリダイゼーションに適用
された。ビオチン化プローブによる一夜のインキュベー
ションは、クロスハイブリダイゼーションをブロックす
るために、非標識ヒトゲノムDNAの存在下で行った。し
かしながら、ブロック用DNAを省略した場合でも低レベ
ルのクロスハイブリダイゼーションしか観察されなかっ
た。図６に示すように、結合したプローブDNAのドメイ
ンは観察でき、アビジン-FITCの施用後数えることがで
きた。

【００８９】ｌ．PCR産生物の分子クローニングと配列
分析組み換えクローンは、アンピシリンプレート上で白色
のコロニーとして識別され、取り上げて、アンピシリン
を含むLB媒体中で一夜増殖させた。後の分析のために64
コロニーを選別した。細胞クローンは、ベクター−特異
的オリゴヌクレオチドWBS2とWBS4とを用いる複合PCRに
よって分析した。ゲル電気泳動は、いくつかの試料に
対して異なったサイズの増幅産生物を示した。インサー
トのサイズは、114塩基対、すなわちアニールしたとき
のプライマーの5'−末端のpBS DNAへの距離を引くこと
によって産生物のサイズから求めることができる。

【００９０】インシトゥハイブリダイゼーションは、
細胞クローンをDNAテンプレートとして用いるPCR増幅と
標識化によって産生したプローブを用いて行った。ビ
オチン化プローブ(図７と図８) およびジゴキシゲニン
標識化DNAプローブ(図９)は、間期核と中期染色体につ
いて高度のシグナル強度と特異性を示した。標的染色体
10上の強度は、変性プローブを用いて観察されるのと少
なくとも同程度に高かったが、他の染色体とのクロスハ
イブリダイゼーションの徴候はなかった。

【００９１】DNAシークエンシングは、クローンpBS609-
51とpBS609-52から分離されたDNAについて行った。 DNA
配列分析の結果を表２に示す。シークエンシング反応
は、それぞれ pBS609-51とpBs609-52のBam HI部位にお
ける191塩基対のインサートを示した。両インサートと
も PCRプライマー配列によってフランクされたアルファ
サテライトDNA反復モノマーであり、アルホイド共通モ
ノマーと 87%(pBS609-51)と88.3%(pBS609-52)の相同性
を有する(Willard and Waye 1987)。5'-ポリリンカーを
含む 162塩基対を、染色体12-特異的であると報告され
ているテトラメリックアルホイドDNA断片(pBR12; Baldi
ni et al. 1990; EMBL/GenBank accession number M282
21) と比較すると、クローンpBS609-51とpBS609-52とは
個々のモノマーと高度の相同性を示した。83.3%(pBS609
-51)と84.6%(pBS609-52)に等しい配列相同性が pBS12の
第２モノマーについて見出された(表２)。これらの配列
に対するGenBank/EMBO受託番号は (pBS609-5
1) (pBS609-52)である。

【００９２】

【表２】

【００９３】この実施例で示された染色体10-誘導のア
ルホイドDNAのクローニング実験の結果は、１つまたは
いくつかの特異的モノマー配列の存在を示唆する。染色
体10−特異的DNAの分離に対して用いられた簡単なクロ
ーニング戦略は、アルファサテライトDNAインサートを
含む多数の組み換え体を産生した。しかしながら、64
の任意に選択した組み換え体の分析は、プライマーア
ニーリング部位を提供し、かつ恐らくプライマーWA11と
WA12とによって増幅された小さな断片を示す多数のイン
サートがあることを示した(図１０,レーン３)。64クロ
ーンの中で、4つのクローンはアルホイドモノマーを
含み、かつヒト染色体10と比較的に特異的にハイブリダ
イズしたことが見出された。

【００９４】PCRと細菌細胞を用いるライブラリースク
リーニング手法は、非常に迅速かつ効率的である。 PCR
の高度の感受性は、１つの反応において４つ以上のクロ
ーンからのDNAのプーリングと増殖を可能にする(Green
and Olsen 1990; Weier et al.1991c)。コロニーの迅速
なスクリーニングに対しては、ガッソウとクラクソン(G
ussow and Clackson)(1989) とによって記載された手法
に類似した加速プロトコルを用いることができる。この
計画は、適当なオリゴヌクレオチドと増幅テンプレート
とを用いて始め、２週間以内で新規なハイブリダイゼー
ションプローブを産生することを可能にする。

【００９５】実施例２ヒト染色体8-特異的アルファサテライトDNAに対して特
異的なプローブが、実施例１に詳説した手法に非常に類
似した手法で調製された。発明者等のこれら染色体8-特
異的プローブについての研究は、Weier et al., Hum. G
enet., 87: 489-494 (1991)に報告されている。

【００９６】実施例３染色体17および染色体3に対する染色体-特異的動原体プ
ローブ本質的には実施例１に記載したような手法が、２つの動
原体−特異的なアルファサテライトプローブ、すなわ
ち１つは染色体17の動原体に対し、もう１つは染色体3
の動原体に対するプローブを調製するために用いられ
た。WA1プライマーとWA2プライマーとを用い、また染色
体17からのほぼ50 ngのDNAをDNAテンプレートとして用
いた。DNAテンプレートは、染色体17に対するブルース
クライブプラスミドライブラリー(pBS17)から分離し
たが、これはデポジットライブラリーLL17NS01 または
LA17NS03として公に入手可能な全染色体17ライブラリー
をサブクローニングすることにより調製したものである
[Van Dilla et al. 1986]。

【００９７】DNA増幅と同時的ビオチン化は、90秒間94
℃の熱変性ステップ(最初の変性に対し120秒間)を伴う
自動化された熱サイクリングシステム[Weier and Gray
1988]を用い45サイクルの間行った。各サイクルの第
２のステップ間のプライマーアニーリングは、53℃で9
0秒間行った。それから温度を徐々に72℃まで上げた(7
℃/分)。サイクルは、プライマー伸長のため120秒間こ
の温度に保持して完了させた。

【００９８】ヒト染色体3上のアルファサテライト動原
体反復に対して特異的なプローブは、WA1プライマーとW
A2プライマーと、増幅DNAテンプレートとして染色体3に
対するブルースクライブプラスミドライブラリー(pBS
3)からの CsCl勾配分離DNAをほぼ80 ng(400 ng/ml)用い
るインビトロDNA増幅によって同様に調製した。PCRは、
自動化サーマルサイクラーを用い30サイクル行った[Per
kin-Elmer/Cetus, Norwalk, CT (USA)]。DNAテンプレー
トは94℃で1分間変性した。プライマーアニーリングと
伸長はそれぞれ53℃と72℃とで行った。プローブビオ
チン化はビオチン-11-dUTPの存在下で起こり、その後の
増幅は追加の 20PCRサイクル間に完了した。

【００９９】実施例４染色体21および13に対する動原体-特異的プローブ 13/21動原体プローブは、本質的には実施例１におい
て、またワイヤー等によって記載された(1991a)ような
手法に従ってPCR反応によって調製したが、非変性プラ
イマーを用いたことが違う。簡単に言えば、プローブ
は、テンプレートとしてフローソートされたヒト染色体
21と、前記表１に示したアルホイド配列に対して特異的
な２つのプライマー(30 uM)、すなわちプライマー W21R
1とW21R2とを用いるPCRによって作った。産生物はPCR中
にビオチン11-dUTP(100%)を含ませることによって標識
した。オリゴヌクレオチドブライマーは、実施例１に
示したようにして合成し純化した。フローソートされ
た染色体DNAをテンプレートとして用いて、135塩基対の
産生物が産生された。

【０１００】実施例５染色体9上の反復配列に対する染色体-特異的プローブもっぱら染色体9に結合するプローブをオリゴヌクレオ
チドプライマーWYR9とWYR10( 表１に示す)を選ぶこと
によって調製したが、これらのプローブはヒト染色体
1,7,9,15,16,17,21,22およびY上の主要なプロックとし
て見出されるサテライトIII DNAのペンタメリック反復
モチーフであるTTCCAへ結合する。WYR9とWYR10とはそれ
ぞれY染色体特異的3.4 kbサテライトIII反復配列中の位
置2813-2840と2777-2743に結合する[Nakahori et al. 1
986]。

【０１０１】これらのプライマーは、テンプレートとし
て男もしくは女のヒトゲノムDNAまたは分離した染色体
9 DNAを用いたPCRによって増幅した。男ヒトゲノムテ
ンプレートによって増幅したプローブDNAは、 Y染色体
の長いアームおよび染色体9のサテライトIII領域上の反
復DNAならびにいくつかの他の染色体と強くハイブリダ
イズした。女ヒトゲノムDNAがテンプレートのときに
は、産生されたプローブは、類似の常染色体DNAとはハ
イブリダイズしたが、Y染色体とは弱いクロスハイブリ
ダイゼーションを示すのみであった。

【０１０２】分離した染色体9がテンプレートのときに
は、産生されたプローブは染色体9へ9q12位置において
結合し、他の染色体とはごく僅かにクロスハイブリダイ
ゼーションを生じた。少なくともこの実施例において
は、PCR中に用いられたプライマーは、用いられたDNA
テンプレートの性質よりも結合特異性の点で有意性は低
かった。

【０１０３】実施例６染色体X上の反復配列に対する染色体-特異的プローブ表１に示すオリゴヌクレオチドプライマー WXR1とWXR2
とが選ばれたが、これらはX染色体-特異的アルファサ
テライトDNA反復配列の2.0 kb対中の位置1595から位置1
664までの70塩基対断片にフランクする[Waye et al. 19
85]。これらのプライマーは実施例１で示したように合
成し純化した。プライマーWXR1とWXR2とのPCR増幅によ
って産生されたプローブは124塩基対であった。

【０１０４】産生されたプローブは、もっぱら X染色体
と結合し、この染色体、特に胎児組織中においての迅速
識別に対して用いることができる。また、このプローブ
は性的に組み合わせを誤った提供者と受領者の骨髄移植
の経過を監視し、またはヒト精液中のX染色体の存在の
決定にも用いることができる。

【０１０５】実施例７マウス動原体プローブオリゴヌクレオチドプライマー WGS1とWGS2(表１)、こ
れらはマウスDNAの234塩基対ガンマーサテライト反復
の保存(conserved)領域においてアニールするが、これ
らがガンマーサテライト反復プローブを増幅するために
選ばれた。プライマーアニーリング部位は、ガンマー
サテライトDNA共通配列中においてごく近接するように
選んだ(Vissel and Choo 1989)。公にされた30のクロー
ンされたガンマーサテライトモノマーの半分以上は、
プライマーを14塩基対の距離において各3'末端とアニー
ルさせることができる。PCRは、55塩基対DNA断片を選択
的に増幅させることが期待された。

【０１０６】マウス全ゲノムDNAがテンプレートであるP
CR産生物のゲル電気泳動分析は、約290塩基対において
非標識PCR産生物の強いバンドを示した。発明者等のこ
の先の研究はワイヤー等(1991c)において見ることがで
きる。

【０１０７】この発明の好ましい実施態様の上記記載
は、説明と記述の目的のために提示したものである。こ
の発明を開示された厳密な形態に論じつくしたものでは
なく、またこれに限定したものでもなく、明らかに多数
の変形や変化が上記教示に徴して可能である。実施態様
はこの発明の原理とその実際的適用を最もよく説明する
ために選択し記載したものであって、これにより他の当
業者がこの発明を種々の態様において、また種々の変形
によって、期待される特定の用途に適するように最もよ
く利用することを可能にする。この発明の範囲は、前記
請求の範囲によって定義することが意図されている。こ
こに引用した全ての参考文献は参考として組み込まれて
いる。

【図面の簡単な説明】

【図１】染色体10-特異的プローブDNAのハイブリダイゼ
ーションの状態を示す顕微鏡写真であり、ビオチン化
プローブ分子はアジピン-FITC（グリーン蛍光発光）で
可視化（グリーン蛍光発光）され、バウンドプローブ
のドメインはレッドとグリーンの重ね合わせによるイエ
ローが現れる。

【図２】同ハイブリダイゼーションの状態を示す顕微鏡
写真であり、ジゴキシゲニン標識DNAプローブはFITC-結
合抗体で可視化（グリーン蛍光発光）され、ビオチン化
プローブはアジピン−テキサスレッドを使用して検出さ
れた（レッド蛍光発光）。

【図３】同ハイブリダイゼーションの状態を示す顕微鏡
写真であり、ビオチン化プローブ分子はアジピン−FITC
（グリーン蛍光発光）で可視化（グリーン蛍光発光）さ
れ、バウンドプローブのドメインはレッドとグリーン
の重ね合わせによるイエローが現れる。

【図４】同ハイブリダイゼーションの状態を示す顕微鏡
写真であり、AAF-標識DNAプローブはFITC-結合抗体（グ
リーン蛍光発光）で検出され（グリーン蛍光発光）、バ
ウンドプローブのドメインはレッドとグリーンの重ね
合わせによるイエローが現れる。

【図５】同ハイブリダイゼーションの状態を示す顕微鏡
写真であり、AAF-標識DNAプローブはFITC-結合抗体（グ
リーン蛍光発光）で検出され（グリーン蛍光発光）、バ
ウンドプローブのドメインはレッドとグリーンの重ね
合わせによるイエローが現れる。

【図６】同ハイブリダイゼーションの状態を示す顕微鏡
写真であり、ビオチン化プローブ分子はアジピン−FITC
（グリーン蛍光発光）で可視化（グリーン蛍光発光）さ
れ、バウンドプローブのドメインはレッドとグリーン
の重ね合わせによるイエローが現れる。

【図７】同ハイブリダイゼーションの状態を示す顕微鏡
写真であり、ビオチン化プローブ分子はアジピン−FITC
（グリーン蛍光発光）で可視化（グリーン蛍光発光）さ
れ、バウンドプローブのドメインはレッドとグリーン
の重ね合わせによるイエローが現れる。

【図８】同ハイブリダイゼーションの状態を示す顕微鏡
写真であり、ビオチン化プローブ分子はアジピン−FITC
（グリーン蛍光発光）で可視化（グリーン蛍光発光）さ
れ、バウンドプローブのドメインはレッドとグリーン
の重ね合わせによるイエローが現れる。

【図９】同ハイブリダイゼーションの状態を示す顕微鏡
写真であり、ジゴキシゲニン標識DNAプローブはFITC-結
合抗体で可視化（グリーン蛍光発光）され、バウンド
プローブのドメインはレッドとグリーンの重ね合わせに
よるイエローが現れる。

【図１０】プライマーWA1WA2、および増幅鋳型として分
離されたヒト染色体10を使用するインビトロDNA増幅生
成物のサイズの分布を示す写真である。

【図１１】アルファサテライトDNA反復の推定構造、お
よびオリゴヌクレオチドプライマーの可能なアニーリン
グ座位を概略的に示す説明図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ハインツ−ウールリッヒグンターウェイアーアメリカ合衆国カリフォルニア州 95376 トレーシーバレランドロード 1151 (72)発明者ジョーウイリアムグレイアメリカ合衆国カリフォルニア州 94116 サンフランシスコイレブンスアベニュー 1921

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】下記の事項からなる染色体−特異的反復配
列核酸プローブを調製する方法：変性オリゴヌクレオチ
ドプライマーの第１のセットを染色体特異的である鋳
型DNAにおける反復配列ユニットに結合すること；変性
オリゴヌクレオチドプライマーの第２のセットを前記
反復配列ユニットに、プライマーの前記第１のセットの
各５’末端がプライマーの前記第２のセットの１つの
５’末端に対向し、かつプライマーの前記第１のセット
の結合座位がプライマーの前記第２のセットの結合座位
の約20bp 〜約5キロベース(kb)の範囲の距離内にあるよ
うに結合すること；染色体−特異的反復配列核酸プロー
ブを生成するために、第１および第２のプライマー間で
かつこれら両プライマーを含むポリメラーゼ鎖反応(PC
R)法により鋳型DNAを増幅すること。
【請求項２】反復配列ユニットはクラスターされ、かつ
アルファサテライト；ベータサテライト；サテライ
トI,II,IIIおよびVI；ならびに1p36に位置する39bp反復
からなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項３】変性オリゴヌクレオチドプライマーの前
記第１のセットはオリゴヌクレオチドプライマーの前
記第２のセツトと同じである請求項１に記載の方法。
【請求項４】プライマーセットがJun1である請求項１に
記載の方法。
【請求項５】反復配列ユニットがアルファサテライト
モノナーであり、かつ変性プライマーの第１および第２
のセットがWA1およびWA2，WA11およびWA12からなる群か
ら選択される請求項２に記載の方法。
【請求項６】染色体−特異的鋳型 DNAがフローソーティ
ング、顕微解剖または密度勾配法により分離され；ハイ
ブリッドセル中にあり；または染色体−特異的ライブラ
リからのものである請求項１に記載の方法。
【請求項７】染色体−特異的DNAがヒト染色体1〜22、X
およびYからなる群から選択されたフローソートされた
染色体である請求項６に記載の方法。
【請求項８】前記方法が増幅ステップの間に修飾された
dNTPsを組み込むステップを含む請求項１に記載の方
法。
【請求項９】増幅ステップがプローブ分子を化学的また
は酵素的に修飾することにより完了される後に反復配列
プローブを標識するステップを含む請求項１に記載の方
法。
【請求項１０】前記増幅ステップの後前記プローブをク
ローニングベクターにインサートするステップおよび
前記プローブをクローニングするステップを含む請求項
１に記載の方法。
【請求項１１】生成されたクローンが単一染色体に高度
に特異的であるクローンを見いだすためにスクリーンさ
れる請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】前記反復配列に高度に特異的であること
を見いだされるクローンはPCRのためのクローン鋳型と
して使用される請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】請求項1〜12の方法から選択された方法
により調製され、かつ増幅ステップの間またはその後
に標識された染色体−特異的反復配列プローブ。
【請求項１４】下記のステップからなるヒトゲノムDNA
から反復DNA配列の任意の選択により染色体−特異的反
復配列DNAプローブを調製する方法：CAGG反復配列、変
性プライマーJun1を含むヒトゲノム鋳型 DNAをアニーリ
ングすること；前記鋳型DNAをポリメラーゼ鎖反応(PCR)
により増幅すること。
【請求項１５】前記鋳型DNAが染色体−特異的である請
求項１４に記載の方法。
【請求項１６】表IIに示されたごときpBS609-51またはp
BS609-52のインサートとして示されたヌクレオチド配列
を有する染色体−10動原体に対して特異的な変性アルフ
ァ反復配列プローブを含む組成物。
【請求項１７】下記のステップからなる中期スプレッ
ド、生殖系列細胞または体細胞間期核および／または小
核における特異的染色体を数える方法：反復配列ユニッ
トがアルファサテライトDNAである請求項１３の染色体
−特異的反復配列プローブにインシトゥハイブリダイ
ズすること；前記標的プローブを可視的にすること；前
記標識プローブにより染色される動原体領域および／ま
たはペリセントロメリック領域の数を数えること。
【請求項１８】前記ハイブリダイジングステップの
間、ブロッキングDNAが使用される請求項１７に記載の
方法。
【請求項１９】WA1，WA11，WA12および Jun1からなる群
から選択されたプライマーの変性オリゴヌクレオチド
セットを含む組成物。
【請求項２０】下記の群から選択された染色体−特異的
反復配列プローブを含む組成物：プライマーがW21R1 お
よびW21R2であるポリメラーゼ鎖反応(PCR)法により染色
体21−特異的鋳型 DNAから調製されたヒト染色体21およ
び13に対するヒト動原体−特異的核酸プローブ；プライ
マーがWXR1およびWXR2であるPCR法によりヒト染色体X−
特異的鋳型 DNAから調製されたヒト染色体X−特異的反
復配列プローブ；プライマーがWYR9およびWYR10であるP
CR法によりヒト染色体9−特異的鋳型DNAから調製された
ヒト染色体9−特異的反復配列プローブ；プライマーがW
GS1およびWGS2であるPCRによりマウスの全ゲノム鋳型DN
Aから調製されたマウス動原体−特異的反復配列プロー
ブ。
【請求項２１】W21R1，W21R2，WGS1，WGS2，WXR1，WXR
2，WYR9 およびWYR10からなる群から選択されたオリゴ
ヌクレオチドプライマーを含む組成物。