CN114381496A - 一种原位杂交探针及其制备方法与应用 - Google Patents
一种原位杂交探针及其制备方法与应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114381496A CN114381496A CN202111650562.7A CN202111650562A CN114381496A CN 114381496 A CN114381496 A CN 114381496A CN 202111650562 A CN202111650562 A CN 202111650562A CN 114381496 A CN114381496 A CN 114381496A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- situ hybridization
- hybridization probe
- dna
- rolling circle
- probe
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 239000000523 sample Substances 0.000 title claims abstract description 139
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 title claims abstract description 64
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 13
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims abstract description 43
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 37
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 37
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 33
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 28
- 238000005096 rolling process Methods 0.000 claims abstract description 26
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims abstract description 17
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 claims abstract description 15
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims abstract description 14
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 14
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims abstract description 13
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 claims abstract description 8
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 22
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 claims description 15
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 claims description 12
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 claims description 12
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 claims description 12
- 238000013519 translation Methods 0.000 claims description 12
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 claims description 11
- AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N Deoxyuridine 5'-triphosphate Chemical class O1[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N 0.000 claims description 10
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 9
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 claims description 8
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 7
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 4
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 claims description 4
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims description 4
- 238000012296 in situ hybridization assay Methods 0.000 claims description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 abstract description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 26
- 102100027100 Echinoderm microtubule-associated protein-like 4 Human genes 0.000 description 16
- 101001057929 Homo sapiens Echinoderm microtubule-associated protein-like 4 Proteins 0.000 description 15
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 11
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 10
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 9
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 9
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 9
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 8
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 6
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 6
- 238000013461 design Methods 0.000 description 6
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 6
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 101150023956 ALK gene Proteins 0.000 description 3
- 208000010507 Adenocarcinoma of Lung Diseases 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 3
- 101150068690 eml4 gene Proteins 0.000 description 3
- 201000005249 lung adenocarcinoma Diseases 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 238000009640 blood culture Methods 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000011901 isothermal amplification Methods 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 210000004976 peripheral blood cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 1
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- 108020004518 RNA Probes Proteins 0.000 description 1
- 239000003391 RNA probe Substances 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010923 batch production Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 210000000448 cultured tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000031864 metaphase Effects 0.000 description 1
- 238000007902 molecular cytogenetic technique Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 230000011218 segmentation Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6841—In situ hybridisation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
Abstract
本发明公开了一种原位杂交探针及其制备方法与应用。以目标基因组为模板使用滚环扩增试剂进行滚环扩增,获得原位杂交探针前体,对所述原位杂交探针前体进行超声处理或PCR扩增,得到所述原位杂交探针,所述滚环扩增试剂包括结合序列C‑seq、DNA连接酶、DNA聚合酶和dNTPs。所述方法能够高效制备原位杂交探针,且可有效避免重复片段的杂交探针,所制备探针杂交后背景低,信号清晰,无需COT DNA封闭。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学检测技术领域,涉及一种原位杂交探针及其制备方法与应用。
背景技术
原位杂交技术(In-Situ Hybridization,简称ISH)是以带有标记物的DNA小片段,即杂交探针,与组织或细胞内的DNA同源靶序列进行杂交,通过检测标记物所产生的信号,来检测标本中DNA(或基因)或染色体数目或位置变化的一种分子细胞遗传学技术。荧光原位杂交技术(Florescence In-Situ Hybridization,简称FISH)是以荧光标记的DNA探针与组织或细胞内的DNA同源序列进行杂交,通过在荧光显微镜下观察和计数各种荧光信号的数量和分布来记录和分析结果。
通常使用的探针包括克隆化酶标探针和化学合成探针。克隆化酶标探针使用较广泛,以包含基因组片段的克隆(YAC、PAC、BAC等)为DNA模板,通过各种酶扩方法制备探针,优点在于实现过程相对简单,但缺点表现在因为基因组中含有重复区段和一些非靶序列,无法选择标记,且受限于克隆库本身,只能对经过确认的克隆进行标记;化学合成探针是通过化学合成的方法制备的寡核苷酸探针,但受限于合成技术,当合成长度大于59nt时,合成成本翻倍,且合成难度直线上升。
CN109439751A公开了一种用于KIAA1549-BRAF融合基因检测的探针制备方法,使用两个标记不同颜色的探针库进行检测,去重复序列分析后,进行序列分割1kb左右区块,使用OligoArray进行探针设计、筛选,要求长度50bp,TM值85-99℃,探针最小间隔5bp,随后在两端分别加上通用接头进行合成,单条序列的合成长度约85bp,以合成的寡核苷酸库为模板,使用带有荧光标记的通用引物进行扩增,得到两组荧光探针。该方法通过人工合成制备模板库,然后使用带标记的通用引物,基于PCR方法扩增得到探针库,可以实现对于间隔较小的融合检测,但人工合成探针数量较高(约60条长片段合成),且方法是借助于通用引物的荧光基团实现荧光检测,每100bp带有两个标记,标记效率略显不足,且受限于PCR扩增的体积和设备制约,批量化生产时产能有限。
综上所述,如何提供一种高效、低成本的原位杂交探针制备方法,制备高特异性探针,是分子生物学检测技术领域亟需解决问题之一。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求,本发明提供一种原位杂交探针及其制备方法与应用,通过酶连成环和等温扩增实现高效、低成本制备原位杂交探针,制备的原位杂交探针具备高特异性,且能够进行特殊易位类型检测。
为达上述目的,本发明采用以下技术方案:
第一方面,本发明提供一种制备原位杂交探针的方法,所述方法包括:
以目标基因组为模板使用滚环扩增试剂进行滚环扩增,获得原位杂交探针前体,对所述原位杂交探针前体进行超声处理或PCR扩增,得到所述原位杂交探针,所述滚环扩增试剂包括结合序列C-seq、DNA连接酶、DNA聚合酶和dNTPs,所述结合序列C-seq从5’端至3’端依次包括5’靶结合区、通用引物结合区F、T7启动子区、通用引物结合区R和3’靶结合区,所述5’靶结合区和3’靶结合区能够与目标基因组互补结合。
本发明中,分析目标基因组序列,选择非重复区设计并合成与靶区域互补的结合序列C-seq,所述结合序列C-seq在DNA连接酶作用下能形成环状模板,结合示意图如图1所示,在聚合酶作用下进行滚环扩增,获得原位杂交探针前体,并进一步通过超声处理或PCR扩增获得原位杂交探针,能够有效避免重复片段的杂交探针,杂交后背景低,信号清晰,无需COT DNA封闭。
本发明中,滚环扩增是一个等温扩增过程,扩增效率高,能够富集含靶序列的片段,便于后续的探针制备,与传统FISH探针制备的缺口平移技术相比,人工合成区段受限制较少,可方便的满足各种基因检测的需要。
本发明中,滚环扩增得到单链片段,可以无需变性,直接用于单链模板杂交,也可以通过预设的T7启动子,实现RNA探针的制备。
优选地,所述通用引物结合区F的核酸序列包括SEQ ID NO.1所示的序列。
优选地,所述T7启动子区的核酸序列包括SEQ ID NO.2所示的序列。
优选地,所述通用引物结合区R的核酸序列包括SEQ ID NO.3所示的序列。
SEQ ID NO.1:ATGATACGGCGACCACCGAG。
SEQ ID NO.2:TAATACGACTCACTATAG。
SEQ ID NO.3:CAAGCAGAAGACGGCATACG。
优选地,所述5’靶结合区和3’靶结合区与目标基因组互补结合的区域位于目标基因组非重复区。
优选地,所述DNA连接酶包括T4 DNA连接酶。
优选地,所述DNA聚合酶包括phi29 DNA聚合酶。
优选地,所述制备原位杂交探针的方法包括以下步骤:
(1)以目标因组DNA为模板使用滚环扩增试剂进行滚环扩增,获得原位杂交探针前体,所述滚环扩增试剂包括结合序列C-seq、DNA连接酶、DNA聚合酶和dNTPs,所述dNTPs包括dATP、dCTP、dGTP、dTTP和修饰dUTP,所述修饰dUTP包括红色-dUTP、绿色-dUTP或DIG-dUTP;
(2)超声处理所述原位杂交探针前体,并电泳获得所述原位杂交探针。
优选地,步骤(1)所述滚环扩增产物长度大于15kb。
优选地,步骤(2)所述电泳收集500bp以下单链核酸片段。
优选地,步骤(1)所述dTTP和修饰dUTP的比例为(1~2):(2~3),包括但不限于1:1、1:2或2:3。
本发明中,通过控制修饰dUTP和dTTP比例,能够进一步提高探针标记效率更高。
优选地,所述制备原位杂交探针的方法包括以下步骤:
(1’)以目标因组DNA为模板使用滚环扩增试剂进行滚环扩增,获得原位杂交探针前体,所述滚环扩增试剂包括结合序列C-seq、DNA连接酶、DNA聚合酶和dNTPs,所述dNTPs包括dATP、dCTP、dGTP和dTTP;
(2’)使用通用引物,以所述原位杂交探针前体为模板进行PCR扩增,获得双链DNA;
(3’)使用缺口平移法对所述双链DNA进行标记,得到所述杂交探针。
优选地,步骤(1’)所述滚环扩增产物长度大于15kb。
优选地,步骤(3’)所述缺口平移法包括利用DNase I和DNA聚合酶进行标记。
优选地,步骤(1’)所述dATP、dCTP、dGTP和dTTP的比例为1:1:1:1。
优选地,步骤(3’)所述缺口平移法使用的试剂还包括dATP、dCTP、dGTP、dTTP和修饰dUTP,所述dATP、dCTP、dGTP、dTTP和修饰dUTP的比例为1:1:1:0.5:0.8。
优选地,所述制备原位杂交探针的方法还包括对探针进行纯化的步骤。
优选地,所述纯化包括醋酸钠纯化。
第二方面,本发明提供第一方面所述的制备原位杂交探针的方法制备得到的原位杂交探针。
第三方面,本发明提供第二方面所述的原位杂交探针在制备用于原位杂交检测产品中的应用。
第四方面,本发明提供一种原位杂交检测试剂盒,所述原位杂交检测试剂盒包括第二方面所述的原位杂交探针。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
本发明中,选择非重复区设计并合成与靶区域互补的结合序列C-seq,所述结合序列C-seq在DNA连接酶作用下能形成环状模板,在聚合酶作用下进行滚环扩增,获得原位杂交探针前体,并进一步通过超声处理或PCR扩增获得原位杂交探针,能够高效低成本制备探针,且有效避免重复片段的杂交探针,所制备探针杂交后背景低,信号清晰,无需COT DNA封闭。
附图说明
图1为结合序列C-seq与目标基因组结合示意图;
图2为EML4/ALK基因融合探针示意图;
图3为RCA产物电泳图;
图4为探针电泳图;
图5为CSP 16杂交背景和亮度分析结果图;
图6为CSP 16对照组与最优组方案1-2的人外周血培养细胞检测图(×1000);
图7为CSP 16杂交图(×1000);
图8为GSP EML4/GSPALK杂交背景和亮度分析结果图(×1000);
图9为EML4/ALK对照组与最优组方案(方案1-4)的人外周血培养细胞检测图(×1000);
图10为EML4/ALK对照组与最优组方案(方案1-4)的阴性组织样本的检测图(×1000);
图11为EML4/ALK对照组与最优组方案(方案1-4)的阳性组织样本的检测图(×1000);
图12为肺腺癌样本检测图(×1000)。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果,以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是,此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明,而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者,按照本领域内的文献所描述的技术或条件,或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
本发明实施例中以EML4和ALK基因为例,基于滚环扩增(RCA)技术制备了包含EML4和ALK基因的探针库,标记为不同颜色的探针组合得到EML4/ALK融合基因探针(双色),以人外周血培养细胞和肺腺癌细胞株H2228为样本进行检测,与对照基于BAC缺口平移(非去重复)探针(图2)比较,信号类型一致,但RCA制备的探针信号点更集中,对于阴阳性信号的判断也更加明确。
实施例1
本实施例进行滚环扩增(RCA)获得长片段模板,包括以下步骤:
(1)设计并合成结合序列C-seq,包括CSP-RCA-16序列组,GSP-RCA-EML4序列组,GSP-RCA-ALK序列组,同时按照常规技术合成CSP16--PCR扩增标记,GSP EML4/GSP ALK--BAC克隆提取质粒后缺口平移标记;
(2)制备RCA模板:使用Qiagen血液/组织基因组DNA提取试剂盒DNeasy Blood&Tissue Kit提取人外周血样本(400μL)的基因组DNA,根据厂商说明书进行操作,经过Nanodrop定量,要求OD260/OD230=1.8~2.2、OD260/OD280=1.8~2.2,基因组DNA用于下一步RCA扩增中的模板;
(3)连接反应:配制T4连接体系,反应体积为50μL,含有1×T4DNA连接缓冲液、5UT4 DNA连接酶(EL0011)、10pmol C-seq基因组DNA 8ng,于37℃反应1小时,使用GeneJETTMPCR纯化试剂盒(#K0701)纯化产物;
(4)RCA扩增:冰上配制RCA体系,反应体系为20μL,含有2μL 10×ReactionBuffer,dNTPs的使用包括方案一和方案二,方案一使用dATP:dCTP:dGTP:dTTP:TexasRed-dUTP按不同比例(1:1:1:0.5:0.5、1:1:1:0.5:1、1:1:1:0.4:0.8和1:1:1:0.6:0.9)混合;方案二使用1μL dNTPs(dATP:dCTP:dGTP:dTTP按等比例混合,每种浓度为2.5mM);另外加入≥5ng环状模板,20pmol通用引物F(核酸序列为ATGATACGGCGACCACCGAG),纯化水补足至20μL,95℃孵育5min,冰浴2min;在冷却的反应体系中加入1μL phi29 DNA Polymerase,30℃水浴孵育2h,65℃孵育10min终止反应,使用1%琼脂糖凝胶电泳检测其扩增效果,结果如图3所示,泳道2~6为方案一RCA产物结果,对应RCA反应中dATP、dCTP、dGTP、dTTP和TexasRed-dUTP比例分别为1:1:1:0.5:0.5(泳道2)、1:1:1:0.5:1(泳道3)、1:1:1:0.4:0.8(泳道4)、1:1:1:0.6:0.9(泳道5),可见控制dTTP和TexasRed-dUTP为2:3,RCA反应高效,滚环复制得到的扩增产物更长,且未见二聚体或低分子量产物干扰;泳道1为方案二RCA结果图,箭头示优选的体系,从电泳图可见phi29 DNA Polymerase很好地完成环状模板扩增质粒,两种方案的产物均大于15kbp。
实施例2
本实施例进行RCA产物处理。
方案一得到带有标记的RCA产物,将RCA产物放置于冰上,使用超声波发生器破碎样品,以破碎片段100~800bp为最适条件,超声6sec暂停5sec,重复15次和25次,得到预期大小的DNA片段(图4),泳道1~2表示方案一超声破碎后的探针,分别为超声15次和25次的结果,15次破碎时得到的产物在100~500bp间,分布较均匀;25次破碎时产物集中到100~200bp间,长度较短;考虑到FISH短探针杂交易出现非特异条带,剪切在500bp左右的探针杂交效果更优,优选15次(泳道1)作为片段破碎条件。
方案二得到不带标记的RCA产物,使用通用引物(通用F和通用R)进行PCR扩增,并使用缺口平移方法标记,PCR扩增反应体系如表1所示,反应条件为:95℃、2min;95℃、30sec,55℃、90sec,72℃、60sec,35个循环;72℃、5min;4℃保存;缺口平移标记条体系如表2所示,缺口平移标记条件为:16℃、2h,80℃、10min。
通用F(20nt):ATGATACGGCGACCACCGAG。
通用R(20nt):CAAGCAGAAGACGGCATACG。
表1
组分 | 体积 |
10×缓冲液 | 2μL |
dNTPs(20mM) | 0.4μL |
DNA(13ng) | 1μL |
热启动Taq酶(5U/μL) | 0.2μL |
通用F/R(10μM) | 各1μL |
纯化水 | 补足20μL |
表2
1~4种标记比例得到的产物电泳结果如图4所示,泳道3~6表示方案二缺口平移标记后的探针,对应使用dATP、dCTP、dGTP、dTTP和修饰dUTP的比例分别为:1:1:1:0.6:0.4、1:1:1:0.5:0.5、1:1:1:0.5:0.8和1:1:1:0.8:0.8。优选片段在500bp及以下条带明亮的产物进行后续的杂交验证,从电泳结果可见探针片段逐渐缩小,其中泳道5亮度佳,条带分散在100bp~750bp间;泳道6亮度佳,条带分布在100bp~500bp间,考虑到信号与探针长度和修饰基团掺入比率的影响,选择条带小于750bp,产物更多的泳道5的标记产物纯化,配制杂交体系1;选择小于500bp较亮条带的泳道6的标记产物纯化,配制杂交体系2,以人外周血培养细胞为检测对象,观察杂交效果,结果表明,配方一致(探针量一致)的情况下,泳道5亮度优于泳道6产物。除了探针长度的影响,杂交信号还与修饰基团掺入相关。优选(图4,泳道5)比例1:1:1:0.5:0.8,即优选反应3的产物进行杂交液对比配制。
实施例3
本实施例进行原位杂交探针纯化。
在实施例2得到的标记产物中,按照1/10V 3M醋酸钠和2.5V乙醇加入,-80℃放置30min,随后13000rpm离心15min,弃上清,管底可见明显核酸沉淀,使用75%乙醇洗涤沉淀,再次13000rpm离心15min,弃上清,自然干燥,加入10μL纯化水,充分溶解,得到标记好的原位杂交探针:CSP-RCA-16探针组,GSP-RCA-EML4探针组和GSP-RCA-ALK探针组。
实施例4
本实施例利用实施例3纯化的原位杂交探针进行杂交检测。
按照常规技术合成对照探针,包括:CSP 16--PCR扩增标记;GSP EML4/GSP ALK--BAC克隆提取质粒后缺口平移标记。实验组探针包括两个技术方案方案一和方案二制备的探针:CSP-RCA-16探针组1和组2,GSP-RCA-EML4探针组1和组2,GSP-RCA-ALK探针组1和组2,组1对应方案一,组2对应方案二。
(1)按表3配制16号染色体计数杂交液,其中实验组分别使用CSP-RCA-16探针组1和组2,按表3四种方案(方案1-4)配制不同探针添加量(0.2μL、0.5μL和1.0μL),不同的COT-human DNA添加量(0μL和1.0μL)体系,使用组1探针命名为方案1-1、方案1-2、方案1-3方案1-4;使用组2探针命名为方案2-1、方案2-2、方案2-3方案2-4,按表4配制EML4/ALK融合基因检测杂交液,其中实验组分别使用GSP-RCA-EML4探针组1和组2、GSP-RCA-ALK探针组1和组2,按表4四种方案(方案1-4)配制不同探针添加量(0.5μL、0.8μL和1.0μL),不同的COT-human DNA添加量(0μL和1.0μL)体系,使用组1探针命名为方案1-1、方案1-2、方案1-3方案1-4;使用组2探针命名为方案2-1、方案2-2、方案2-3方案2-4;
表3
表4
(2)以人外周血培养细胞和肿瘤细胞株为样本进行杂交检测,从信号亮度、背景,杂交的灵敏度、特异性和准确度评估各种探针方案,CSP16杂交背景和亮度分析结果如图5所示,比较杂交背景,本发明制备CSP-RCA-16探针的背景均优于对照组,表现出杂交背景降低20%~31%,而同时,实验组方案1-2,1-4,2-4信号较对照组提升2~8%;图6为CSP 16对照组与最优组方案1-2的人外周血培养细胞检测图,从图中可见中期染色体上仅特定位置见荧光信号,信号明亮,染色体的其他位置无非特异杂交信号;图7为CSP 16杂交图(白色箭头示非特异信号),当提高探针用量时,会出现非特异杂交情况,即除预期靶位点外,染色体的其他位置也出现杂交信号;GSP EML4/GSP ALK杂交背景和亮度分析结果如图8所示,GSPEML4(绿色)信号亮度均较对照组有提升4%~16%,GSP ALK(红色)信号亮度有差异,方案1优于方案2,最优方案1-4信号提升8%;信号背景上均表现出背景降低,绿色背景降低8%~16%,红色背景降低6%~14%;图9为EML4/ALK对照组与最优组方案(方案1-4)的人外周血培养细胞检测图,在2号染色体特定区域可见杂交信号,其他位置未见非特异杂交,图10为EML4/ALK对照组与最优组方案(方案1-4)的阴性组织样本的检测图,实验组核内外背景较对照组低,信号明亮,符合预期;图11为EML4/ALK对照组与最优组方案(方案1-4)的阳性组织样本的检测图,与阴性样本检测结果相似在于对照组背景更高,信号亮度表现相似。综合上述结果表明,三种类探针均表现出对照组杂交背景高于实验组,实验组是否加入COTHuman DNA不影响杂交背景,表明本发明设计的非重复序列探针无需额外加入COT Human进行封闭,验证了非重复序列探针的设计优势;从信号亮度比较看,GSP类探针使用量增加表现相近信号,差异不显著,增加探针用量,表现出荧光强度增加,但同时背景会有提升,差异不显著;对于CSP类探针,探针量增加会增加非特异杂交(CSP 16方案1-4和方案2-4,图7),但通过洗涤条件(如温度提升,低盐洗涤)可改善非特异杂交。
实施例5
本实施例使用本发明原位杂交探针进行临床样本检测,通过与对照探针进行平行比对,验证检测准确性。
收集20例肺腺癌样本,包括经RT-PCR检测确定的5例EML4/ALK阳性样本和15例EML4/ALK阴性样本,按FFPE样本处理流程进行荧光原位杂交(FISH)前处理,完成变性杂交检测,结果如图12所示,箭头为对照组的假融合信号,而本发明基于RCA方法的去重复探针设计能够更好的避免因基因间距小导致的假融合,降低除三维结构因素导致的假阳性信号比例,使用对照组探针检测出6例阳性,14例阴性,出现一例假阳性结果,而本发明原位杂交探针检测出5例阳性,15例阴性,准确率100%,针对假阳性样本,说明传统FISH判断时存在偏差,判断为低比例融合(阳性细胞),而本发明的去重复的原位杂交探针表现明显的分离信号,判断为阴性。
综上所述,本发明分析目标基因组序列,选择非重复区设计并合成与靶区域互补的结合序列C-seq,所述结合序列C-seq在DNA连接酶作用下能形成环状模板,结合示意图如图所示,在聚合酶作用下进行滚环扩增,获得原位杂交探针前体,并进一步通过超声处理或PCR扩增获得原位杂交探针,能够有效避免重复片段的杂交探针,所制备探针杂交后背景低,信号清晰,无需COT DNA封闭。
申请人声明,本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法,但本发明并不局限于上述详细方法,即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了,对本发明的任何改进,对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等,均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
序列表
<110> 广州安必平医药科技股份有限公司
<120> 一种原位杂交探针及其制备方法与应用
<130> 2021-12-30
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atgatacggc gaccaccgag 20
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
taatacgact cactatag 18
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
caagcagaag acggcatacg 20
Claims (10)
1.一种制备原位杂交探针的方法,其特征在于,所述方法包括:
以目标基因组为模板使用滚环扩增试剂进行滚环扩增,获得原位杂交探针前体,对所述原位杂交探针前体进行超声处理或PCR扩增,得到所述原位杂交探针;
所述滚环扩增试剂包括结合序列C-seq、DNA连接酶、DNA聚合酶和dNTPs;
所述结合序列C-seq从5’端至3’端依次包括5’靶结合区、通用引物结合区F、T7启动子区、通用引物结合区R和3’靶结合区,所述5’靶结合区和3’靶结合区能够与目标基因组互补结合。
2.根据权利要求1所述的制备原位杂交探针的方法,其特征在于,所述通用引物结合区F的核酸序列包括SEQ ID NO.1所示的序列;
优选地,所述T7启动子区的核酸序列包括SEQ ID NO.2所示的序列;
优选地,所述通用引物结合区R的核酸序列包括SEQ ID NO.3所示的序列;
优选地,所述5’靶结合区和3’靶结合区与目标基因组互补结合的区域位于目标基因组非重复区。
3.根据权利要求1所述的制备原位杂交探针的方法,其特征在于,所述DNA连接酶包括T4 DNA连接酶;
优选地,所述DNA聚合酶包括phi29 DNA聚合酶。
4.根据权利要求1-3任一项所述的制备原位杂交探针的方法,其特征在于,所述方法包括以下步骤:
(1)以目标因组DNA为模板使用滚环扩增试剂进行滚环扩增,获得原位杂交探针前体,所述滚环扩增试剂包括结合序列C-seq、DNA连接酶、DNA聚合酶和dNTPs,所述dNTPs包括dATP、dCTP、dGTP、dTTP和修饰dUTP,所述修饰dUTP包括红色-dUTP、绿色-dUTP或DIG-dUTP;
(2)超声处理所述原位杂交探针前体,并电泳获得所述原位杂交探针。
5.根据权利4所述的制备原位杂交探针的方法,其特征在于,步骤(1)所述dTTP和修饰dUTP的比例为(1~2):(2~3)。
6.根据权利要求1-3任一项所述的制备原位杂交探针的方法,其特征在于,所述方法包括以下步骤:
(1’)以目标因组DNA为模板使用滚环扩增试剂进行滚环扩增,获得原位杂交探针前体,所述滚环扩增试剂包括结合序列C-seq、DNA连接酶、DNA聚合酶和dNTPs,所述dNTPs包括dATP、dCTP、dGTP和dTTP;
(2’)使用通用引物,以所述原位杂交探针前体为模板进行PCR扩增,获得双链DNA;
(3’)使用缺口平移法对所述双链DNA进行标记,得到所述杂交探针。
7.根据权利要求6所述的制备原位杂交探针的方法,其特征在于,步骤(1’)所述dATP、dCTP、dGTP和dTTP的比例为1:1:1:1。
8.权利要求1-7任一项所述的制备原位杂交探针的方法制备得到的原位杂交探针。
9.权利要求8所述的原位杂交探针在制备用于原位杂交检测产品中的应用。
10.一种原位杂交检测试剂盒,其特征在于,所述原位杂交检测试剂盒包括权利要求8所述的原位杂交探针。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202111650562.7A CN114381496A (zh) | 2021-12-30 | 2021-12-30 | 一种原位杂交探针及其制备方法与应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202111650562.7A CN114381496A (zh) | 2021-12-30 | 2021-12-30 | 一种原位杂交探针及其制备方法与应用 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN114381496A true CN114381496A (zh) | 2022-04-22 |
Family
ID=81199803
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202111650562.7A Pending CN114381496A (zh) | 2021-12-30 | 2021-12-30 | 一种原位杂交探针及其制备方法与应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN114381496A (zh) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN114891787B (zh) * | 2022-05-09 | 2023-06-27 | 珠海圣美生物诊断技术有限公司 | 随机探针、制备方法及应用 |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101906488A (zh) * | 2010-08-09 | 2010-12-08 | 宁波大学 | 传染性脾肾坏死病毒的超分支滚环扩增检测方法 |
CN103276074A (zh) * | 2013-05-21 | 2013-09-04 | 昆山彭济凯丰生物科技有限公司 | 一种合成短单链脱氧核糖核苷酸探针的方法 |
CN109161542A (zh) * | 2018-02-23 | 2019-01-08 | 广州简册生物技术有限公司 | 荧光原位杂交探针及其制备方法和应用 |
CN111996235A (zh) * | 2020-08-25 | 2020-11-27 | 广州鼓润医疗科技有限公司 | 一种检测探针、其制备方法及应用 |
CN113046453A (zh) * | 2021-03-24 | 2021-06-29 | 复旦大学 | 一种基于锁式探针介导的茎环连接的扩增技术检测dna点突变的方法及试剂盒 |
-
2021
- 2021-12-30 CN CN202111650562.7A patent/CN114381496A/zh active Pending
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101906488A (zh) * | 2010-08-09 | 2010-12-08 | 宁波大学 | 传染性脾肾坏死病毒的超分支滚环扩增检测方法 |
CN103276074A (zh) * | 2013-05-21 | 2013-09-04 | 昆山彭济凯丰生物科技有限公司 | 一种合成短单链脱氧核糖核苷酸探针的方法 |
CN109161542A (zh) * | 2018-02-23 | 2019-01-08 | 广州简册生物技术有限公司 | 荧光原位杂交探针及其制备方法和应用 |
CN111996235A (zh) * | 2020-08-25 | 2020-11-27 | 广州鼓润医疗科技有限公司 | 一种检测探针、其制备方法及应用 |
CN113046453A (zh) * | 2021-03-24 | 2021-06-29 | 复旦大学 | 一种基于锁式探针介导的茎环连接的扩增技术检测dna点突变的方法及试剂盒 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
LULU XU等: "Recent advances in rolling circle amplification-based biosensing strategies-A review", 《ANALYTICA CHIMICA ACTA》, vol. 1148, pages 1 - 16 * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN114891787B (zh) * | 2022-05-09 | 2023-06-27 | 珠海圣美生物诊断技术有限公司 | 随机探针、制备方法及应用 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US5827658A (en) | Isolation of amplified genes via cDNA subtractive hybridization | |
CN105861678B (zh) | 一种用于扩增低浓度突变靶序列的引物和探针的设计方法 | |
CN107109401A (zh) | 使用crispr‑cas系统的多核苷酸富集 | |
WO2002086163A1 (en) | Methods for high throughput genome analysis using restriction site tagged microarrays | |
AU2001264610B2 (en) | Single copy genomic hybridization probes and method of generating same | |
JPH10509594A (ja) | 遺伝的多型の検出のための複合ミクロサテライトプライマー | |
AU2001264610A1 (en) | Single copy genomic hybridization probes and method of generating same | |
WO1997007244A1 (en) | ISOLATION OF AMPLIFIED GENES VIA cDNA SUBTRACTIVE HYBRIDIZATION | |
EP3653730B1 (en) | Mutant cell-free dna isolation method and kit | |
JP7248228B2 (ja) | Rnaライブラリーの構築のための方法及びキット | |
CN114958997A (zh) | 用于检测伴侣基因的方法 | |
CN107603971B (zh) | 一种原位杂交探针的制备方法 | |
WO2018045109A1 (en) | Methods and compositions for phased sequencing | |
WO2019149958A1 (en) | Generation of single-stranded circular dna templates for single molecule | |
CN107338245B (zh) | 一种大规模制备单链dna的方法 | |
CN110387400B (zh) | 一种同时捕获基因组目标区域正反义双链的平行液相杂交捕获方法 | |
CN114381496A (zh) | 一种原位杂交探针及其制备方法与应用 | |
CN109337956B (zh) | 基于ngs技术富集多基因茎环探针设计方法及试剂盒 | |
CN101875970A (zh) | Apc基因突变的快速检测 | |
KR101525495B1 (ko) | 덤벨 구조 올리고뉴클레오티드, 이를 포함한 핵산 증폭용 프라이머 및 이를 이용한 핵산 증폭 방법 | |
CN107208091A (zh) | 杂交探针和方法 | |
CN110241211B (zh) | 诊断结直肠癌的分子组合标志物及检测试剂盒 | |
CN109234388A (zh) | 用于dna高甲基化区域富集的试剂、富集方法及应用 | |
WO2020243597A1 (en) | Flexible and high-throughput sequencing of targeted genomic regions | |
KR100868760B1 (ko) | 그람 음성 및 양성 박테리아를 구별하기 위한 프라이머세트, 프로브 세트, 방법 및 키트 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |