CN114891787B

CN114891787B - 随机探针、制备方法及应用

Info

Publication number: CN114891787B
Application number: CN202210531129.XA
Authority: CN
Inventors: 黄萌; 叶莘
Original assignee: Zhuhai Livzon Cynvenio Diagnostics Ltd
Current assignee: Zhuhai Livzon Cynvenio Diagnostics Ltd
Priority date: 2022-05-09
Filing date: 2022-05-16
Publication date: 2023-06-27
Anticipated expiration: 2042-05-16
Also published as: CN114891787A; WO2023216938A1

Abstract

本发明涉及分子生物学技术领域，尤其是涉及随机探针、制备方法及应用。本发明提供了一种随机探针、制备方法及应用，所述制备方法使用转座酶对靶标序列随机片段化，片段化的过程中，在得到的随机靶标片段两端添加转座酶识别序列，而后以得到的随机靶标片段为扩增模板，以靶向转座酶识别序列的序列为扩增引物，在dUTP与dTTP+dUTP数量比为50％～100％的扩增体系中进行扩增，得到靶向靶标序列的随机探针。采用该方法制备得到的随机探针中均匀含有能够作为标记位点的碱基U，因此，采用本发明提供的制备方法得到的随机探针，能够实现全序列范围内的标记，用于检测时能够表现出更加优异的灵敏度和准确度。

Description

随机探针、制备方法及应用

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，尤其是涉及随机探针、制备方法及应用。

背景技术

荧光原位杂交探针制备常用的方法为，通过基因扩增或序列合成的方法获取目的片段，然后用缺口平移的方法插入荧光标记的核苷酸，或使用荧光标记的引物扩增目的片段。缺口平移的方法需要的DNA起始量较大(μg级)，且插入荧光标记的核苷酸效率较低，探针产量低，不适合进行大规模生产。并且使用荧光标记的引物进行扩增所获得的探针仅在末端标记有荧光信号分子，荧光强度较低，需要针对不同的模板及目的片段大小设计引物。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种针对靶标序列利用转座酶制备随机探针的方法，该方法能够一步得到大量不同序列的随机探针，显著提高了探针生产效率，同时，本发明在随机探针的全序列范围内中引入dUTP，为后续探针检测引入更多标记位点，从而降低检测限，提高检测灵敏度和准确度。

本发明第二个目的在于，提供基于上述制备方法得到的随机探针在杂交测定中的应用。

为了解决上述技术问题，实现上述目的，本发明提供以下技术方案：

第一方面，本发明提供随机探针的制备方法，使用转座酶对靶标序列随机片段化，同时在得到的随机靶标片段两端添加转座酶识别序列，而后以随机靶标片段为扩增模板，以靶向转座酶识别序列的序列为扩增引物，在dUTP与dTTP+dUTP数量比为50％～100％的扩增体系中进行扩增，得到靶向靶标序列的随机探针。

在可选的实施方式中，所述转座酶选自Tn1、Tn2、Tn3、Tn4、Tn5、Tn6、Tn7、Tn9、Tn10、Tn551、Tn971、Tn916、Tn1545、Tn1681、Tgf2、Tol2、MuA、Himar1或HARBI1，所述转座酶识别序列包括转座酶的ME序列。

在可选实施方式中，所述转座酶为Tn5，所述转座酶Tn5的ME序列为5’-AGATGTGTATAAGAGACAG-3’。

在可选的实施方式中，扩增使用的DNA聚合酶选自Taq DNA聚合酶，Tth DNA聚合酶，Tfl DNA聚合酶、TLI DNA聚合酶、Tne DNA聚合酶、Tma DNA聚合酶、vent^TMDNA聚合酶、Phusion^TMDNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶和KOD DNA聚合酶中的一种或多种。

在可选的实施方式中，所述随机探针中的dUTP还带有标记；标记方法包括：将dUTP标记后再加入扩增体系中，随扩增反应进行实现对随机探针中dUTP的标记；或者，扩增反应过程中或扩增完成后，对得到的随机探针中的dUTP进行标记。

在可选的实施方式中，所述标记为荧光基团标记；所述荧光基团选自荧光素类染料、罗丹明类染料或菁染料。

在可选的实施方式中，dUTP的标记方法包括，dUTP与荧光基团的活性基团直接偶联，或者，通过修饰基团连接dUTP和荧光基团的活性基团；所述修饰基团包括第一修饰基团或第二修饰基团；所述第一修饰基团为氨基，与第一修饰基团连接的第一活性基团包括异硫氰酸酯、活性酯、活性羧酸或磺酰氯化物；所述第二修饰基团为生物素，与第二修饰基团连接的荧光基团包括链霉亲和素修饰的染料，或者，辣根过氧化物酶-链霉亲和素偶联物。

在可选的实施方式中，在靶标序列片段化之后，扩增反应之前，还包括补全缺口序列反应步骤；或者，在靶标序列片段化之后的扩增反应步骤中，首先经过以补全缺口序列为目的的延伸程序，而后再调整参数进行扩增。

在可选的实施方式中，所述转座酶识别序列包括转座酶的ME序列和连于转座酶的ME序列5’端的接头序列；所述接头序列中碱基A的数量为1～20；所述接头序列包括TCGTCGGCAGCGTC、ACGATGTCAGCGAC、或AAGAGACCACCAGAGTAGCAACGATGTCAGCGAC。

第二方面，本发明提供采用前述实施方式所述制备方法在制备得到的随机探针。

在可选的实施方式中，所述随机探针的长度为100～500bps，所述随机探针中每100个核苷酸含有标记的数量为3～10个。

第三方面，本发明提供了前述任一实施方式所述随机探针在核酸杂交测定中的应用。

本发明提供了一种随机探针的制备方法，该方法使用转座酶对靶标序列随机片段化，在片段化的过程中，在得到的随机靶标片段两端添加转座酶识别序列，而后以得到的随机靶标片段为扩增模板，以靶向转座酶识别序列的序列为扩增引物，在dUTP与(dTTP+dUTP)数量比为50％～100％的扩增体系中进行扩增，得到靶向靶标序列的随机探针。采用该方法制备的探针序列为来源于靶序列的随机片段，均可用于靶序列的检测。由于其制备过程并不限定具体序列，因此，生产效率得到显著提高，同时，得到的随机探针的全序列中常规的T碱基会部分地被U碱基取代，被U取代的位点能够作为标记位点使用，因此，采用本发明提供的制备方法得到的随机探针，能够实现全序列范围内的标记，用于检测时能够表现出更加优异的灵敏度和准确度。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实验例4得到的不同聚合酶对dUTP兼容及扩增效率影响结果。

图2为实验例4得到的不同比例dUTP条件下FISH杂交信号结果。

图3为实验组5中不同dUTP荧光标记基团标记后，FISH杂交信号结果。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。

因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

应注意到：相似的标号和字母在下面的附图中表示类似项，因此，一旦某一项在一个附图中被定义，则在随后的附图中不需要对其进行进一步定义和解释。此外，术语“第一”或“第二”等仅用于区分描述，而不能理解为指示或暗示相对重要性。

在具体实施方式中，第一方面，本发明提供随机探针的制备方法，使用转座酶对靶标序列随机片段化，同时在得到的随机靶标片段两端添加转座酶识别序列，而后以随机靶标片段为扩增模板，以靶向转座酶识别序列的序列为扩增引物，在dUTP与dTTP+dUTP数量比为50％～100％的扩增体系中进行扩增，得到靶向靶标序列的随机探针。

所述的“dUTP与dTTP+dUTP数量比”是指三磷酸鸟苷的数量与“三磷酸鸟苷和三磷酸胸苷”的数量之和的比例。

在可选实施方式中，所述转座酶为Tn5，所述转座酶Tn5的ME序列为5’-AGATGTGTATAAGAGACAG-3’(SEQ ID No.1)。

上述其他转座酶的ME序列部分举例如下表所示。

在可选的实施方式中，扩增使用的DNA聚合酶选自兼容dUTP的DNA聚合酶，选自TaqDNA聚合酶，Tth DNA聚合酶，Tfl DNA聚合酶、TLI DNA聚合酶、Tne DNA聚合酶、Tma DNA聚合酶、vent^TM DNA聚合酶、Phusion^TMDNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶和KOD DNA聚合酶中的一种或多种；优选地，选自Taq DNA聚合酶、PfuTurbo Cx Hotstart DNA聚合酶、Robustart TaqDNA聚合酶的一种或多种，所述PfuTurbo Cx Hotstart DNA聚合酶和Robustart Taq DNA聚合酶为上述混合聚合酶。

其中，“兼容dUTP的DNA聚合酶”可用扩增效率作为评价指标，是指在50％dTTP替换为dUTP条件下，扩增效率仍保持50％以上的DNA聚合酶。

在可选的实施方式中，所述标记为荧光基团标记；所述荧光基团选自荧光素类染料、罗丹明类染料、菁染料或其他具有相似荧光强度和抗淬灭能力的荧光染料。

所述荧光素类染料包括标准荧光素及其衍生物，如异硫氰酸荧光素(FITC)、羟基荧光素(FAM)、四氯荧光素(TET)等。

所述罗丹明类染料料包括R101、四乙基罗丹明(RB200)和羧基四甲基罗丹明(TAMRA)等。

所述菁染料包括，Ⅰ类菁染料：噻唑橙(thiazole orange,TO)、噁唑橙(oxazoleorange,YO)系列及其二聚体染料和Ⅱ类菁染料：多甲川系列菁染。

应当理解的是，本发明使用荧光染料作为标记基团，主要依赖于荧光染料的荧光强度和抗淬灭能力，以满足实际检测需求，因此，凡是荧光强度和抗淬灭能力两项指标与上述三个系列染料相比，不低于50％的荧光染料均可用于本发明作为标记基团，而不应当理解为仅限定为上述三类染料。

需要说明的是，如使用HRP-链霉亲和素偶联物或HRP直接标记，下游还可使用基于过氧化物酶原理的Power Styramide^TM信号放大(PSA)或酪酰胺信号放大(TSA)系统，如标记的是磷酸酶，则可使用基于磷酸酶原理的信号放大系统。诸如此类，本领域技术人员基于本发明做出了进一步常规选择，均应认定为本发明所述的使用HRP-链霉亲和素偶联物或HRP直接标记的标记方式。

需要说明的是，上述的“缺口序列”是指由转座酶对靶标序列片段化过程中得到的双链DNA片段中天然形成的核苷酸缺口，在保留该缺口的情况下难以实现后续的扩增步骤，因此，本发明还设置了补全缺口序列的步骤，而该步骤既可以单独实施，也可以整合入扩增步骤，通过增加前置延伸步骤来实现。“补全缺口序列反应步骤”和“以补全缺口序列为目的的延伸程序”均以补全序列缺口为目的，具体的延伸参数本领域技术人员可以进行常规选择，例如在扩增体系执行扩增反应之前，首先在72℃下延伸3～5min即可实现缺口补全。

而上述扩增反应体系，通过实验验证，本发明在补全缺口后，进行扩增能够使用含量少于50ng的靶标序列片段扩增得到靶标序列片段含量为2～3μg/50μL。在dUTP与dTTP+dUTP数量比为50％～100％的扩增体系中进行扩增，能够使用含量为0.01～0.1μg的靶标序列片段得到靶标序列片段含量为4～6μg/50μL，显著优于现有技术中探针的扩增效果。

在可选的实施方式中，所述转座酶识别序列包括转座酶的ME序列和连于转座酶的ME序列5’端的接头序列；所述接头序列中碱基A的数量为1～20；所述接头序列包括TCGTCGGCAGCGTC(SEQ ID No.5)、ACGATGTCAGCGAC(SEQ ID No.6)、或AAGAGACCACCAGAGTAGCAACGATGTCAGCGAC(SEQ ID No.7)。

第二方面，本发明提供采用前述实施方式所述制备方法制备得到的随机探针。

在可选的实施方式中，所述随机探针的长度为100～500nts，所述随机探针中每100个核苷酸含有标记的数量为3～10个。

需要说明的是，“核酸杂交测定”是指，相应的测定方法依赖于核酸的碱基互补配对原则来实现。由于本发明提供的转座酶对靶标序列不存在特异选择，因此，能够利用本发明提供的片段化方法对大量的靶标序列进行片段化，并制备得到相应的探针，所以，本发明所述的核酸杂交测定包括但不限于“荧光原位杂交、核酸捕获、免疫细胞化学、流式细胞或纳米流式及其信号扩增”等众多以核酸杂交为基础的测定方法。

同理，本发明适用的靶标序列也包括了所有通过扩增、提取或合成的方式获取的核苷酸序列，包括但不限于BAC库和PAC库。而基于转座酶的片段化原理，靶标序列的具体形式也适用包括DNA序列、RNA序列以及DNA-RNA混合序列在内的多种形式。

例如，在一次具体的实施方式中，本发明的选取来源于BAC库(BacterialArtificial Chromosome,细菌人工染色体库)的靶标序列，通过细菌培养和质粒提取的步骤，获取大量的靶标序列作为模板，所述质粒大小约150kb～200kb。

而后通过Tn5转座酶对上述得到的靶标序列进行随机片段化，同时在序列两端添加转座酶识别序列，该转座酶识别序列可作为后续扩增的通用引物，靶标序列片段化产物主峰在300～500bps，不同序列和长度的BAC DNA片段化效果均一性好。使用通用引物扩增对序列无偏好性，可用含量少于50ngDNA起始量扩增得到2～3μg DNA/50μL。

此外，转座酶识别序列除保留影响Tn5转座酶识别和活性的ME序列外，还可以包含接头序列，在接头序列中，通过调整碱基A的含量来调整扩增步骤中插入dUTP碱基的数量，且不影响Tn5转座酶的效率及扩增效率。

在扩增时通过将PCR反应体系内部分dTTP替换为dUTP，使用可兼容dUTP的DNA聚合酶将dUTP随机插入到探针序列内，由此扩增反应可将10ng模板扩增至4～6μg/50μL。

在一次具体的实施方式中，本发明通过与dUTP修饰基团反应的荧光素对随机探针进行标记，所述反应可以是氨基与活性基团的反应，或生物素与链霉亲和素反应，或通过TSA等进行信号放大，该反应还可通过调整dUTP的比例来调整插入效率，从而影响探针标记的效率，通过该方法一般可插入3～10个染料分子/100个碱基，不同的染料可能存在差异。

需要说明的是，随机探针序列中碱基U含量的提高能够提高随机探针的标记度和靶标序列的检出率，但是碱基U含量的提高会使得随机探针与靶标序列的结合强度降低，从而影响检出的灵敏度和准确度，因此，需要对随机探针全序列中碱基U的含量进行调整，而本发明添加接头序列的目的，即为根据靶标序列碱基A含量的差异，在接头序列中设计性地调整碱基A的含量，来实现对随机探针中碱基U含量的调整，从而提高包括标记度、检出的灵敏度和准确度在内的综合检出效果。

下面结合附图，对本发明的一些实施方式作详细说明。在不冲突的情况下，下述的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

实施例1

本实施例提供了一种靶向BAC菌株随机探针的制备方法，具体包括以下步骤：

(1)序列获取

使用含氯霉素的LB培养基培养BAC菌株，按照BAC DNA纯化试剂盒或质粒纯化试剂盒(NucleoBond Xtra BAC，厂家：MACHEREY-NAGEL)提取BAC DNA。

(2)转座体(TTE Mix)制备

根据转座酶Tn5设计19bps的ME互补序列，序列如下：

ME-A：5’-AGATGTGTATAAGAGACAG-3’(SEQ ID No.1)

ME-B：5’-phos-CTGTCTCTTATACACATCT-NH₂-3’(SEQ ID No.8)

将ME-A和ME-B等摩尔浓度混合并复性成双链，按转座酶(TruePrep TagmentEnzyme，诺维赞)使用说明制备转座体。

(3)DNA片段化及接头添加

将BAC DNA稀释至50ng/μL，根据反应管数按下表配制反应体系，55℃反应10分钟：

组分	μL/反应
		BAC DNA(50ng/μL)	1
5×Tagment Buffer L	10
		TTE Mix	5
水	加至50μL

反应结束后使用磁珠或柱纯化片段化产物。

(4)PCR扩增

以片段化的DNA为模板，能与ME序列互补结合的序列作为通用引物(所述通用引物可以与ME序列全序列对应互补，也可以与其部分互补)，进行PCR扩增，扩增反应中将部分或全部的dTTP替换为带修饰的dUTP进行多组实验，扩增时将dUTP随机插入到核酸序列中，所述dUTP与dTTP+dUTP数量比为50％、67％、75％、80％和100％。

根据反应管数按下表配制反应体系：

组分	μL/反应
		DNA(片段化产物)	15
5×TAB	10
		引物(20μM)	2
TAE	1
		水	加至50μL

运行以下程序：

纯化PCR产物，使用超微量分光光度计测核酸浓度。取10ng产物作为模板进行下一轮扩增及修饰，反应体系如下：

组分	μL/反应
		DNA(片段化扩增产物，1ng/μL)	10
10×PCR Buffer	5
		dNTP Mix(10mM，含修饰的dUTP)	1
引物(20μM)	5
		DNA聚合酶	2.5
水	加至50μL

运行以下程序：

纯化PCR产物，得到随机探针。

实施例2～4

本组实施例与实施例1的区别仅在于，本组实施例构建的转座体使用的互补序列中还含有接头序列，以及对应的扩增引物与实施例1不同，具体序列如下：

本组实施例在ME序列的5’端还连有可根据需要在A链序列5’端添加核苷酸片段，将碱基A随机插入到核苷酸片段中，避免重复序列和内部互补序列形成，添加序列不影响转座酶的识别和接头插入效果。

实施例5～8

本组实施例分别对实施例1～4中加入到扩增体系中的dUTP进行基于氨基修饰的荧光标记，具体方法如下：

插入氨基标记dUTP的核酸分子与iFlour 488-NHS染料在pH为8.3～8.5的碳酸氢钠溶液中，于室温(20～25℃)条件下反应2h，其中核酸分子浓度为0.1～0.5μg/μL，iFlour488-NHS染料浓度为4μg/μL。

实施例9～12

本组实施例分别对实施例1～4中加入到扩增体系中的dUTP进行基于生物素修饰的荧光标记，具体方法如下：

插入生物素标记dUTP的核酸分子与链霉亲和素偶联-iFluor488在pH为中性的1×PBS中进行，室温或4℃反应0.5h以上，染料浓度为20μg/mL。

为了表征不同实施例获得的随机探针取得的技术效果，本发明提供了标记度及探针浓度计算方法如下：

对标记后对随机探针进行纯化，测量260nm和染料最大激发波长下被随机探针标记的DNA片段的吸光度，标记度可以通过计算荧光基团与片段中碱基(染料/碱基)的比例来估计，计算探针浓度。

光密度测量：在260nm(A260)和最大激发波长(λexc)下测量被随机探针标记的DNA片段的吸光度(Adye)；要获得核酸的准确吸光度测量值，必须校正染料在260nm处的吸光值。使用下列公式校正A260读数：

Abase＝A260-(Adye×CF260)。

不同染料的参数可在厂家官网查询：

CF260为Correction Factor at 260nm(A260校正系数)；

εdye为Extinction coefficients of dye(染料消光系数)。

计算标记效率，染料/碱基计算方法如下:

dye/base＝(Adye×εbase)/(Abase×εdye)；

dsDNA:εbase＝6600cm^-1M^-1；

ssDNA:εbase＝8900cm^-1M^-1；

oligonucleotide:εbase＝10000cm^-1M^-1。

例：dye/base＝0.05相当于将5个染料dUTP插入含有100个核苷酸的DNA片段中，或50bp的PCR片段中。假设dATP、dCTP、dGTP和dTTP在DNA片段中的分布是相等的，相当于25个dTTP中有5个被染料-dUTP取代。

标记度可体现染料分子的标记效率，不同荧光染料化学性质和分子大小差异等原因，标记度可能存在差异，不可相互比较。

计算探针浓度，浓度计算方法如下：

探针浓度(mg/mL)＝(Abase×MWbase)/(εbase×path length)；

dsDNA:MWbase＝330g/mol；

dsDNA:εbase＝6600cm^-1M^-1。

用乙醇沉淀法沉淀标记后的探针，用杂交缓冲液重悬探针至2.5ng/μL浓度。

荧光原位杂交：用卡诺氏固定液室温固定细胞30min，用2×SSC 73℃浸泡2min，随后用含有0.5mg/mL胃蛋白酶溶液37℃消化10min，PBS清洗后用1％多聚甲醛固定，重复一遍，梯度乙醇脱水晾干。将3微升探针溶液(2.5ng/μL)滴在细胞区域，盖上盖玻片，用封片胶将盖玻片四周密封，置杂交仪杂交(77℃变性3min，37℃杂交过夜)。用0.3％NP-40的0.4×SSC 70℃清洗2min，0.1％NP-40的2×SSC溶液室温清洗2min，随后用DAPI染细胞核，用荧光显微镜进行扫描及图像分析。

实施例13

本实施例提供了3组随机探针制备方法，与实施例1相比，区别仅在于使用的转座酶不同，对应的ME序列不同和引物不同，具体如下表所示：

所述转座酶还可以为Tn1、Tn2、Tn3、Tn4、Tn6、Tn9、Tn551、Tn971、Tn916、Tn1545、Tn1681、Tgf2、Tol2、Himar1或HARBI1，可应用的ME序列均为本领域技术人员容易获得的序列，在此不再穷举。

实施例14

本实施例与实施例2相比，区别仅在于将转座酶Tn5替换为转座酶Tn7，相应ME序列替换为实施例13所示的转座酶Tn7的ME序列，扩增引物替换为与转座酶Tn7对应的扩增引物。

实施例15

本实施例与实施例2相比，区别仅在于将转座酶Tn5替换为转座酶Tn10，相应ME序列替换为实施例13所示的转座酶Tn10的ME序列，扩增引物替换为与转座酶Tn10对应的扩增引物。

实施例16

本实施例与实施例2相比，区别仅在于将转座酶Tn5替换为转座酶Tn10，相应ME序列替换为实施例13所示的转座酶MuA的ME序列，扩增引物替换为与转座酶MuA对应的扩增引物。

实施例17

本实施例提供了多组实施例，与实施例8相比，区别仅在于选用的荧光基团如下所示。

实施例18

本实施例提供了多组实施例，与实施例8相比，区别仅在于选用的DNA聚合酶如下所示。

/>

实验例1

按照以下反应体系通过缺口平移法制备靶向BAC DNA的探针，反应体系参考下表：

下游荧光标记步骤与本实施例5一致。

按探针浓度2.5ng/μL，每人份探针4μL，计算生产5000人份探针需要的反应管数。

结论：本发明提供的随机探针技术方案的探针得率明显优于缺口平移法。

实验例2

荧光标记引物与dUTP标记效果对比。

方法：对比使用荧光标记的引物直接标记效果与插入dUTP后间接标记荧光素的效果。标记的荧光基团为FAM。

引物：

引物1	5′-AGATGTGTATAAGAGACAG-3′FAM
		引物2	5′FAM-AGATGTGTATAAGAGACAG-3′
引物3	5′-AGATGTGTATAAGAGACAG-3′

分组：

反应体系和反应程序如下表：

产量及标记度对比结果：

/>

3’标记的引物由于-OH被修饰，无法有效扩增，5’-FAM标记引物虽然扩增效率较高，但是标记度明显低于dUTP随机插入后标记的标记度。

杂交效果图：(显微镜扫描使用相同光源强度，Set&Run扫描模式可设置固定曝光参数，Auto模式根据样本自动调价曝光参数)。

在相同光源和曝光参数的条件下，5’-FAM标记的探针荧光信号强度明显低于dUTP随机插入后标记的探针。增强曝光后信号仍然较弱，部分细胞信号肉眼不可见。

实验例3

采用上述标记度的检测方法，对实施例5～8提供的4种随机探针的标记度进行检测，结果如下：

可以看出，在接头处增加A碱基的数量可提高探针的标记度。

实验例4

本实验例考察不同聚合酶对dUTP兼容及扩增效率影响，在实施例8的反应体系内使用dUTP部分或全部替代dTTP会使聚合酶扩增效率下降，不同聚合酶对dUTP的兼容性不同，导致扩增产量存在差异，从而考察选择不同的DNA聚合酶在不同dUTP含量下的扩增效率，dUTP：(dUTP+dTTP)的数量比例分别为0％、50％、80％和100％。

使用的聚合酶信息如下：

扩增结果如图1所示，可以看出，三种聚合酶均可兼容dUTP的反应体系，在50％～80％dUTP下单管产量在5～7μg，全部替换为dUTP后扩增效率显著下降，与另外两种聚合酶相比，全部替换条件下，Robustart Taq的扩增效率下降较低，显示出较好的兼容性。

按照上述检测标记的方法检测DNA聚合酶为Robustart Taq，而dUTP替换比例分别为50％、67％、80％、100％条件下的标记度，结果如下：

由上表可以看出，标记度与dUTP的比例正相关，dUTP比例升高可提高插入效率，使标记度提高。

dUTP替换比例分别为50％、67％、80％、100％条件下，FISH杂交信号结果如图2所示，可以看出，在相同显微镜光源强度和扫描曝光参数条件下，杂交信号强度与dUTP比例呈正相关。dUTP比例升高可提高探针标记度，标记度升高可使探针荧光强度增加，杂交信号增强，dUTP替换比例为67％和80％信号强度明显高于50％，替换比例为100％与80％相比差异不显著，可能是由于下游染料标记的效率已经达到饱和。

实验例5

本组实验考查了在实施例8的基础上，不同dUTP荧光标记基团标记对于标记度和FISH杂交结果的影响，荧光标记基团信息如下：

按照上述标记度检测方法，检测结果如下：

由上表可以看出，iFluor 488-dUTP直接标记的探针标记度较高，且杂交信号最强，由于链霉亲和素分子量较大，空间位阻影响染料的标记效率，使得使用生物素与链霉亲和素连接标记荧光的标记度较低。

不同dUTP荧光标记基团标记后，FISH杂交信号结果如图3所示，iFluor-488-dUTP直接标记的信号最强，生物素分子过大导致探针无法有效进入细胞核与目的序列结合，使得使用生物素与链霉亲和素连接标记的探针无法与目标有效杂交(信号点在细胞核外，图3箭头所示)，表明生物素不适用于细胞的FISH杂交，但不排除可用于非细胞的原位杂交。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 珠海圣美生物诊断技术有限公司

<120> 随机探针、制备方法及应用

<160> 24

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> Transposase Tn5

<400> 1

agatgtgtat aagagacag 19

<210> 2

<211> 28

<212> DNA

<213> Transposase Tn7

<400> 2

cagtttaaga ctttattgtc cgcccaca 28

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> Transposase Tn10

<400> 3

ctgatgaatc ccctaatgat ttt 23

<210> 4

<211> 50

<212> DNA

<213> Transposase MuA

<400> 4

gttttcgcat ttatcgtgaa acgctttcgc gtttttcgtg cgtcagttca 50

<210> 5

<211> 14

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 接头序列1

<400> 5

tcgtcggcag cgtc 14

<210> 6

<211> 14

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 接头序列2

<400> 6

acgatgtcag cgac 14

<210> 7

<211> 34

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 接头序列3

<400> 7

aagagaccac cagagtagca acgatgtcag cgac 34

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> Transposase Tn5

<400> 8

ctgtctctta tacacatct 19

<210> 9

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 接头序列1-Tn5 ME

<400> 9

tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cag 33

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 实施例2的扩增引物

<400> 10

tcgtcggcag cgtcagatg 19

<210> 11

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 接头序列2-Tn5 ME

<400> 11

acgatgtcag cgacagatgt gtataagaga cag 33

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 实施例3的扩增引物

<400> 12

acgatgtcag cgacagatg 19

<210> 13

<211> 53

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 接头序列3-Tn5 ME

<400> 13

aagagaccac cagagtagca acgatgtcag cgacagatgt gtataagaga cag 53

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 实施例14的扩增引物

<400> 14

aagagaccac cagagtagc 19

<210> 15

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 实施例1的扩增引物

<400> 15

agatgtgtat aagagacag 19

<210> 16

<211> 28

<212> DNA

<213> Transposase Tn7

<400> 16

cagtttaaga ctttattgtc cgcccaca 28

<210> 17

<211> 28

<212> DNA

<213> Transposase Tn7

<400> 17

tgtgggcgga caataaagtc ttaaactg 28

<210> 18

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Tn7 ME扩增引物

<400> 18

actttattgt ccgcccaca 19

<210> 19

<211> 23

<212> DNA

<213> Transposase Tn10

<400> 19

ctgatgaatc ccctaatgat ttt 23

<210> 20

<211> 23

<212> DNA

<213> Transposase Tn10

<400> 20

aaaatcatta ggggattcat cag 23

<210> 21

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Tn10 ME扩增引物

<400> 21

ctgatgaatc ccctaatga 19

<210> 22

<211> 50

<212> DNA

<213> Transposase MuA

<400> 22

gttttcgcat ttatcgtgaa acgctttcgc gtttttcgtg cgtcagttca 50

<210> 23

<211> 53

<212> DNA

<213> Transposase MuA

<400> 23

tgctgaactg acgcacgaaa aacgcgaaag cgtttcacga taaatgcgaa aac 53

<210> 24

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> MuA ME扩增引物

<400> 24

tttttcgtgc gtcagttca 19

Claims

1.随机探针组合物的制备方法，其特征在于，使用转座酶对靶标序列随机片段化，同时在得到的随机靶标片段两端添加转座酶识别序列，而后以随机靶标片段为扩增模板，以靶向转座酶识别序列的序列为扩增引物，在dUTP与dTTP+dUTP数量比为50%~100%的扩增体系中进行扩增，得到靶向靶标序列的随机探针组合物；

所述转座酶识别序列包括转座酶的ME序列和连于转座酶的ME序列5’端的接头序列；

所述接头序列中碱基A的数量为4~20，在接头序列中，通过调整碱基A的含量来调整扩增步骤中插入dUTP碱基的数量，且不影响转座酶的效率及扩增效率；

所述随机探针组合物中的dUTP还带有标记，标记方法包括：

将dUTP标记后再加入扩增体系中，随扩增反应进行实现对随机探针组合物中dUTP的标记；或者，扩增反应过程中或扩增完成后，对得到的随机探针组合物中的dUTP进行标记；

所述标记为荧光基团标记；所述荧光基团选自荧光素类染料、罗丹明类染料或菁染料。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述转座酶选自Tn1、Tn2、Tn3、Tn4、Tn5、Tn6、Tn7、Tn9、Tn10、Tn551、Tn971、Tn916、Tn1545、Tn1681、Tgf2、Tol2、MuA、Himar1或HARBI1，所述转座酶识别序列包括转座酶的ME序列。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述转座酶为Tn5，所述转座酶Tn5的ME序列为5’-AGATGTGTATAAGAGACAG-3’。

4. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，扩增使用的DNA聚合酶选自Taq DNA聚合酶，Tth DNA聚合酶，Tfl DNA聚合酶、TLI DNA聚合酶、Tne DNA聚合酶、Tma DNA聚合酶、vent^TMDNA聚合酶、Phusion^TMDNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶或KOD DNA聚合酶中的一种或多种。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，dUTP的标记方法包括，dUTP与荧光基团的活性基团直接偶联，或者，通过修饰基团连接dUTP和荧光基团的活性基团；

所述修饰基团包括第一修饰基团或第二修饰基团；

所述第一修饰基团为氨基，与第一修饰基团连接的第一活性基团包括异硫氰酸酯、活性酯、活性羧酸或磺酰氯化物；

所述第二修饰基团为生物素，与第二修饰基团连接的荧光基团包括链霉亲和素修饰的染料，或者，辣根过氧化物酶-链霉亲和素偶联物。

6.根据权利要求1~4任一项所述的制备方法，其特征在于，在靶标序列片段化之后，扩增反应之前，还包括补全缺口序列反应步骤；或者，

在靶标序列片段化之后的扩增反应步骤中，首先经过以补全缺口序列为目的的延伸程序，而后再调整参数进行扩增。

7. 根据权利要求1~4任一项所述的制备方法，其特征在于，所述接头序列包括ACGATGTCAGCGAC 或AAGAGACCACCAGAGTAGCAACGATGTCAGCGAC。

8.采用权利要求1~7任一项所述制备方法制备得到的随机探针组合物。

9.根据权利要求8所述的随机探针组合物，其特征在于，所述随机探针组合物中随机探针的长度为100~500bps，所述随机探针中每100个核苷酸含有标记的数量为3~10个。

10.权利要求8或9所述随机探针组合物在核酸杂交测定中的应用。