CN108300775B

CN108300775B - 一种环状哑铃形探针及其应用

Info

Publication number: CN108300775B
Application number: CN201810076030.9A
Authority: CN
Inventors: 戴宗; 陈俊; 邹小勇
Original assignee: Sun Yat Sen University
Current assignee: Sun Yat Sen University
Priority date: 2018-01-26
Filing date: 2018-01-26
Publication date: 2021-06-01
Anticipated expiration: 2038-01-26
Also published as: CN108300775A

Abstract

本发明公开了一种环状哑铃形探针及其应用，本发明设计了两种环形哑铃状探针，然后再利用此探针进行链杂交反应扩增检测待测目标物的浓度并应用于细胞内靶序列的原位成像。该方法较现有的链杂交扩增方法克服线性探针或发夹探针在细胞内易水解的缺陷，发现了环形核酸探针有强的耐水解性能，并将环形探针结合链杂交反应用于活细胞内靶序列成像降低了假阳性和背景信号，提高了检测准确度。

Description

一种环状哑铃形探针及其应用

技术领域

本发明属于分子检测技术领域，具体涉及一种环状哑铃形探针及其应用。

背景技术

MiRNA是一类对基因表达具有调控作用的非编码小分子RNA(18-24)碱基)。它在动植物生长、发育、分化和生殖等过程中发挥着重要作用。人类约30％的基因受miRNA调控，且miRNA的表达水平与人类重大疾病密切相关。对miRNA的定量检测有助于深入理解其作用机制，对疾病的诊断与治疗以及相关基因药物的开发等具有重要意义。由于miRNA的序列短，在细胞或者体液内的表达水平非常低、易降解且同源miRNA之间仅相差1-2个碱基，一般方法难以实现检测；另一方面由于microRNA与疾病的发生发展有密切关系，活细胞内microRNA的原位检测有助于实时的了解疾病的发展过程，然而大多数方法难以实现在活细胞内实时检测microRNA，因此，开发高选择性高灵敏度的原位检测活细胞内microRNA的方法是一个大的挑战。Northern印迹技术是当前分析miRNA的标准方法，但是该方法操作繁琐、耗时长、灵敏度低，分析检测时需要大量的样品及分离富集步骤，且对RNase污染非常敏感，实验中每一步操作不当都会影响分析结果。Microarray方法可实现高通量、多组分同时检测miRNA，但该方法的特异性低、灵敏度低难以解决，并且微阵列芯片的制作和检测费用很高。RT-PCR是检测miRNA的很灵敏的方法，但是由于miRNA序列短不能直接用于PCR，需要多种技术将miRNA转换成cDNA，使该方法花费高，耗时长，同时该方法需要精确的控制各个扩增步骤的温度，使该方法的操作相当复杂。同时，上述方法都只能在体外进行microRNA的检测，无法实现活细胞内microRNA的原位检测。

杂交链反应(hybridization chain reaction(HCR))技术是由Dirks和Pierce等在2004年建立起来的一种基于两种特殊的DNA发夹设计的高效核酸扩增技术。该方法可以在恒温无酶条件下对核酸进行简单高效的扩增。一般可对目标核酸放大10⁴-10⁶倍。与PCR扩增技术相比，HCR扩增方法不需要精确的热循环和昂贵的DNA聚合酶或切口酶。由于HCR是一个恒温的无酶参与的核酸扩增技术，是进行细胞内microRNA检测的理想方法，因此，HCR扩增反应技术已被广泛应用于核酸的细胞内成像研究。

然而，HCR反应已经被广泛用于细胞内核酸的检测，但是该方法在应用于活细胞内核酸的原位成像研究时存在的假阳性和高背景这两个缺陷大大限制了该方法的准确度。(1)传统HCR反应主要由线性探针或发夹探针作为反应物，这些探针进入活细胞后，一段时间后其3’端和5’端易被活细胞内的水解酶所识别并导致探针被水解引起假阳性。(2)传统HCR反应尤其是基于发夹探针的反应具有较慢的反应速率，一般需要反应4h才能完成，较长的反应时间将导致探针水解产生较高背景和低的信噪比同时可能导致细胞活性降低。

发明内容

为了解决上述存在的问题，本申请通过设计两个抗水解能力强的稳定的环状哑铃形探针，用于检测靶序列，尤其是检测目标microRNA，该检测方法建立了一个新型的环形链杂交反应(c-HCR)，克服了传统HCR反应缺陷，建立了一种更为快速、准确的恒温链杂交扩增技术并应用于核酸的活细胞原位检测。

本发明的目的之一在于提供一种检测靶序列的环状哑铃形探针。

本发明的另一目的在于提供上述环状哑铃形探针在活细胞中原位检测靶序列的应用。

本发明所采取的技术方案是：

一种检测靶序列的环状哑铃形探针，所述探针包括2种不同环状哑铃形探针，分别记为P1和P2，P1和P2均为闭合的碱基序列，均呈哑铃形，两端的环部通过中间的颈部连接在一起，颈部由反向互补配对的碱基对组成；

P1中含有与靶序列反向互补配对的片段X，X中的部分碱基序列位于环部，该部分序列称为toehold序列，X中剩下序列位于颈部；

P2中含有能够与P1部分序列进行反向互补配对的片段Y，片段Y与片段X不能反向互补配对，Y中的部分碱基序列位于环部，该部分序列称为toehold序列，Y中剩下序列位于颈部；

P2中还含有片段Z能够与P1部分序列进行反向互补配对；Z中的部分碱基序列位于环部，该部分序列称为toehold序列，Z中剩下序列位于颈部；

当有靶序列存在时，靶序列与探针P1中的片段X互补配对后，打开探针P1；打开的探针P1与P2中的片段Y互补配对后，打开探针P2；打开的探针P2再通过片段Z与探针P1互补配对后，打开探针P1；打开的探针P1再与新的探针P2结合而打开新的探针P2，打开的新探针P2再与新的探针P1结合，如此循环往复；

当没有靶序列存在时，探针P1和P2能够彼此稳定独立存在，保持环状哑铃形；

探针P1或/和P2中含有荧光标记，使P1或/和P2发生链杂交反应后发出荧光信号。

进一步的，在探针P1或/和P2颈部的两条碱基序列上分别标记有报告荧光基团、淬灭荧光基团，当有靶序列存在时，发生链杂交反应，探针P1或/和P2颈部被打开，报告荧光基团、淬灭荧光基团分离，发出荧光信号；

或者，将P1和P2中的一条探针标记荧光供体，另一条标记荧光受体，当P1和P2之间发生链杂交反应后，荧光供体和荧光受体靠拢，产生荧光共振能量转移信号。

进一步的，所述片段Z能够与片段X完全或部分互补配对杂交，或存在1～3个碱基错配的互补配对杂交。

进一步的，所述探针P1和P2颈部分别存在1～3对碱基错配。

进一步的，颈部碱基对数与靶序列碱基数的比为1：1.2～1.9；环部碱基数与颈部碱基对数的比为1：1.2～2.2。

进一步的，所述toehold序列的碱基数占其所处环部碱基数的60％以上。

上述任一项所述的环状哑铃形探针在检测microRNA中的应用。

一种检测miR-27a的环状哑铃形探针，由环状哑铃形探针H1.2和H2组成，或者由环状哑铃形探针mH1.2和mH2组成，或者由环状哑铃形探针mH1.3和mH2.3组成，各探针的碱基序列如下：

H1.2:3-T(FAM)GAATCGGTAAAAGTGTCACCGATT(BHQ1)CAAGGCGCCCACACACCGCCT-5；

H2:5-AAGTTCCGCAAGTGTGTGGCGGAACTTAGCCAAATTCACAGTGGCT-3；

mH1.2:3-T(FAM)GAATCGGTAAAAGTGTCACCGATT(BHQ1)CAAGGCGCCCACACACCGGCT-5；

mH2:5-AAGTTCCGCAAGTGTGTGGCCGAACTTAGCCAAATTCACAGTGGCT-3；

mH1.3:3-TGAAT(cy3)CGGTAAAAGTGTCACCGATTCAAGGCGCCCACACACCGGCT-5；

mH2.3:5-AAGTTCCGCAAGTGTGTGGCCGAACTT(cy5)AGCCAAATTCACAGTGGCT-3。

一种靶序列检测方法，包括如下步骤：将上述任一项所述的环状哑铃形探针加入到待检测样品中，反应后检测荧光强度，根据荧光检测结果判定样品中是否含有靶序列，或计算靶序列的含量。

一种活细胞内原位检测靶序列的方法，包括如下步骤：将上述任一项所述的环状哑铃形探针转染到待检测活细胞样品中，反应后检测荧光强度，根据荧光检测结果判定样品中是否含有靶序列，或计算靶序列的含量。

本发明的有益效果是：

本发明设计了两种环形哑铃状探针，然后再利用此探针进行链杂交反应扩增检测待测目标物的浓度并应用于细胞内microRNA的原位成像。该方法较现有的链杂交扩增方法，具有以下优点：

1、克服线性探针或发夹探针在细胞内易水解的缺陷，发现了环形核酸探针有强的耐水解性能，并将环形探针结合链杂交反应用于活细胞内microRNA成像降低了假阳性和背景信号，提高了检测准确度。

2、相同目标物，检测速度更快，扩增所需的时间更少，缩短了检测的时间。

3、该方法能够实时原位观察细胞内核酸变化过程，有望用于临床上对相关疾病的研究。

4、该方法表现出很好的精确性，重复性，稳定性，以及高选择性和高灵敏度，可发展成为试剂盒并向市场推广。

附图说明

图1为本发明环状哑铃形探针基于c-HCR反应原理用于细胞内microRNA的原位成像原理的示意图，其中a和a*序列互补，b和b*序列互补；

图2为合成环状哑铃探针H1各个步骤所得产品的电泳检测结果，1、T4连接酶处理前；2、T4连接酶处理后；3、核酸外切酶处理后；

图3为不同探针耐水解能力检测结果，a,不同探针与不同浓度细胞裂解液温育；b,环状哑铃形探针CP长时间在不同量细胞裂解液作用下的荧光变化图；

图4为不同探针在活细胞耐水解情形；

图5为不同环状哑铃形探针的c-HCR反应动力学曲线，a,完全匹配环状哑铃形探针(H1.2和H2)的c-HCR反应动力学曲线；b,含单碱基错配环状哑铃形探针(mH1.2和mH2)的c-HCR反应动力学曲线；

图6为PAGE电泳验证本发明环状哑铃形探针c-HCR反应的可行性；

图7为原子力显微镜验证本发明环状哑铃形探针c-HCR反应可行性，a：无miR-27a存在；b：有miR-27a存在；

图8为荧光验证本发明探针的c-HCR反应情况，a)为能量共振转移曲线；b)HCR反应特异性；

图9为本发明环状哑铃形探针检测不同浓度靶序列的荧光曲线和标准曲线，a)：本发明探针检测不同浓度miR-27a时能量共振转移比率图；b)标准拟合曲线；

图10为本发明探针在A549细胞内成像检测miR-27a，a)加入10nM miR-27a反义序列，b)正常癌细胞，c)加入10nM miR-27a相同的序列；

图11为本发明探针在肺癌和正常细胞内成像检测miR-27a的结果。

具体实施方式

优选的，在探针P1或/和P2颈部的两条碱基序列上分别标记有报告荧光基团、淬灭荧光基团，当有靶序列存在时，发生链杂交反应，探针P1或/和P2颈部被打开，报告荧光基团、淬灭荧光基团分离，发出荧光信号；

优选的，所述片段Z能够与片段X完全或部分互补配对杂交，或存在1～3个碱基错配的互补配对杂交。

优选的，所述探针P1和P2颈部分别存在1～3对碱基错配。

优选的，在距离环部2～5bp处的颈部存在1个碱基错配。

优选的，颈部碱基对数与靶序列碱基数的比为1：1.2～1.9。

优选的，环部碱基数与颈部碱基对数的比为1：1.2～2.2。

优选的，所述toehold序列的碱基数占其所处环部碱基数的60％以上。

优选的，所述靶序列长度为12bp以上，优选为12～48bp，更优选为14～30bp。

优选的，所述靶序列包括DNA序列、RNA序列、microRNA序列。

上述任一所述的环状哑铃形探针在检测microRNA中的应用。

优选的，所述检测microRNA为原位检测microRNA。

优选的，所述原位检测microRNA为活细胞中原位检测microRNA。

H1.2:3-T(FAM)GAATCGGTAAAAGTGTCACCGATT(BHQ1)CAAGGCGCCCACACACCGCCT-5；

H2:5-AAGTTCCGCAAGTGTGTGGCGGAACTTAGCCAAATTCACAGTGGCT-3；

mH1.2：3-T(FAM)GAATCGGTAAAAGTGTCACCGATT(BHQ1)CAAGGCGCCCACACACCGGCT-5；

mH2:5-AAGTTCCGCAAGTGTGTGGCCGAACTTAGCCAAATTCACAGTGGCT-3；

mH1.3:3-TGAAT(cy3)CGGTAAAAGTGTCACCGATTCAAGGCGCCCACACACCGGCT-5；

mH2.3:5-AAGTTCCGCAAGTGTGTGGCCGAACTT(cy5)AGCCAAATTCACAGTGGCT-3。

一种靶序列检测方法，包括如下步骤：将上述任一所述的环状哑铃形探针加入到待检测样品中，反应后检测荧光强度，根据荧光检测结果判定样品中是否含有靶序列，或计算靶序列的含量。

优选的，所述反应的时间为1.5～2.5h。

优选的，所述反应的温度为25℃～40℃。

优选的，所述待检测样品为RNA、microRNA、DNA。

一种活细胞内原位检测靶序列的方法，包括如下步骤：将上述任一所述的环状哑铃形探针转染到待检测活细胞样品中，反应后检测荧光强度，根据荧光检测结果判定样品中是否含有靶序列，或计算靶序列的含量。

优选的，所述反应的时间为1.5～2.5h。

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1一种检测靶序列的环状哑铃形探针

本实施例以检测miR-27家族中miR-27a：5'-UUC ACA GUG GCU AAG UUC CGC-3'(SEQ ID NO:9)为例。

根据靶序列miR-27a的设计2种不同环状哑铃形探针，分别记为H1(SEQ ID NO:1)和H2(SEQ ID NO:3)，H1和H2均为闭合的碱基序列，均呈哑铃形，两端的环部通过中间的颈部连接在一起，颈部由反向互补配对的碱基对组成；

H1中含有与靶序列miR-27a反向互补配对的片段X，X中的部分碱基序列(7bp)位于环部，该部分序列称为toehold序列，X中剩下序列(14bp)位于颈部；

H2中含有能够与H1部分序列进行反向互补配对的片段Y，片段Y与片段X不能反向互补配对，Y中的部分碱基序列(7bp)位于环部，该部分序列称为toehold序列，Y中剩下序列(14bp)位于颈部；

H2中还含有片段Z能够与H1部分序列进行反向互补配对；Z中的部分碱基序列位于环部(7bp)，该部分序列称为toehold序列，Z中剩下序列(14bp)位于颈部；所述片段Z能够与片段X完全互补配对杂交。

将H1、H2离环部3bp处的颈部设计1个碱基错配，得探针mH1(SEQ ID NO:4)和mH2(SEQ ID NO:7)。

当没有靶序列存在时，探针H1和H2、mH1和mH2能够彼此稳定独立存在，保持环状哑铃形；当有靶序列存在时，靶序列与探针H1(或mH1)中的片段X互补配对后，打开探针H1(或mH1)；打开的探针H1(或mH1)与H2(或mH2)中的片段Y互补配对后，打开探针H2(或mH2)；打开的探针H2(或mH2)再通过片段Z与探针H1(或mH1)互补配对后，打开探针H1(或mH1)；打开的探针H1(或mH1)再与新的探针H2(或mH2)结合而打开新的探针H2(或mH2)，打开的新探针H2(或mH2)再与新的探针H1(或mH1)结合，如此循环往复(如图1所示)；

在探针H1或mH1颈部的两条碱基序列上分别标记报告荧光基团、淬灭荧光基团后，得H1.2(SEQ ID NO:2)或mH1.2(SEQ ID NO:5)，当有靶序列存在时，发生链杂交反应，探针H1.2或mH1.2颈部被打开，报告荧光基团、淬灭荧光基团分离，发出荧光信号；

或者，在mH1和mH2中的一条探针标记荧光供体，另一条标记荧光受体，得mH1.3(SEQ ID NO:6)、mH2.3(SEQ ID NO:8)，当H1和H2之间发生链杂交反应后，荧光供体和荧光受体靠拢，产生荧光共振能量转移信号。

H1:3-TGAATCGGTAAAAGTGTCACCGATTCAAGGCGCCCACACACCGCCT-5(SEQ ID NO:1)；

H1.2:3-T(FAM)GAATCGGTAAAAGTGTCACCGATT(BHQ1)CAAGGCGCCCACACACCGCCT-5(SEQ ID NO:2)；

H2:5-AAGTTCCGCAAGTGTGTGGCGGAACTTAGCCAAATTCACAGTGGCT-3(SEQ ID NO:3)；

mH1:3-TGAATCGGTAAAAGTGTCACCGATTCAAGGCGCCCACACACCGGCT-5(SEQ ID NO:4)；

mH1.2:3-T(FAM)GAATCGGTAAAAGTGTCACCGATT(BHQ1)CAAGGCGCCCACACACCGGCT-5(SEQ ID NO:5)；

mH1.3:3-TGAAT(cy3)CGGTAAAAGTGTCACCGATTCAAGGCGCCCACACACCGGCT-5(SEQ IDNO:6)；

mH2:5-AAGTTCCGCAAGTGTGTGGCCGAACTTAGCCAAATTCACAGTGGCT-3(SEQ ID NO:7)；

mH2.3:5-AAGTTCCGCAAGTGTGTGGCCGAACTT(cy5)AGCCAAATTCACAGTGGCT-3(SEQ IDNO:8)。

综上所述，本发明方法通过将链杂交反应所需探针设计成一个环状的哑铃形探针mH1和mH2(如图1)，mH1和mH2为闭合碱基序列，提高了探针的耐水解能力。两个环形探针的颈部杂交区域分别设计1～3对错配碱基主要是为了提高链杂交反应的动力学。当没有靶序列引物存在时，两个环形探针mH1和mH2分别能够稳定存在，两者之间不发生反应；当存在靶序列引物时，通过toehold链置换作用，靶序列可与环状模板mH1上与其完全互补的序列杂交打开mH1的颈部，mH1被打开的序列又可通过toehold链置换作用与mH2反应打开mH2的颈部，此时mH2被打开的序列又可通过toehold链置换作用与mH1反应打开mH1的颈部，mH1被打开的序列又可通过toehold链置换作用再与mH2反应打开mH2的颈部，mH2和mH1经过多次循环往复从而发生基于环形探针的链杂交扩增反应。当分别在两个环形探针合适位点分别标记荧光供体和荧光受体，发生链杂交反应后将产生能量共振转移，能够用于活细胞内核酸原位检测(如图1)。

实施例2环状哑铃形探针的合成与检测

2.1环状哑铃形探针的合成

设计一系列不同类型的哑铃型探针(SEQ ID NO:1～8)，通过委托上海生物生工合成，在探针的5’端修饰有磷酸基团，通过T4DNA连接酶的连接以及核酸外切酶I、核酸外切酶III的处理所合成的探针后，可以获得纯化的环状哑铃型DNA探针，具体操作如下：

将委托合成的探针在95℃变性5min，自然冷却到室温使探针成为开口的环。分别取30μL该探针溶液，在16下加入5μL 10×T4 DNA连接酶缓冲液、2μL T4 DNA连接酶(100U/μL)，反应2h后在65℃变性10min终止连接反应。然后向连接后的溶液中加入核酸外切酶I(20U/μL)、核酸外切酶III(100U/μL)在37℃反应14h后彻底水解溶液中未闭合环的核酸探针之后在85℃变性20min，冷却至室温后用nanodrop 2000测定反应后的溶液浓度，稀释至1μM保存在-20℃备用。

2.2电泳检测合成的环状哑铃探针

选取2.1中合成制得的环状哑铃探针H1各个步骤所得产品进行电泳实验，验证最后所得探针的成功与否。配置15％的非变性凝胶电泳，在180V电压下进行电泳，电泳图如图2，图中第3个条带只有1个明显的条带，证明合成的环状哑铃形模板成功了。

实施例3环状哑铃形探针耐水解能力测定

为了验证环状探针耐水解能力，首先根据靶序列miR-27a设计含有FAM-BHQ1标记的线性探针L和P(L和P完全互补，将L和P等比例混合杂交形成LP探针)，发夹探针HP以及本发明环状哑铃形探针CP(H1.2)，miR-27a反义探针block probe。各探针序列如下：

L：5'-TTCACAGTGGCTAAGTTCCGC(BHQ1)-3'(SEQ ID NO:10)；

P：5-(FAM)GCGGAACTTAGCCACTGTGAA-3(SEQ ID NO:11)；

HP：5-(FAM)CGCGCGGAACTTAGCCACTGTGAACGCGCG(BHQ1)-3(SEQ ID NO:12)；

Block probe:5-GCGGAACTTAGCCACTGTGAA-3(SEQ ID NO:13)；

CP(H1.2)：

3-T(FAM)GAATCGGTAAAAGTGTCACCGATT(BHQ1)CAAGGCGCCCACACACCGCCT-5(SEQ IDNO:2)。

3.1探针耐水解能力检测

将上述标记FAM-BHQ1的线性探针LP，发夹探针HP，环状哑铃形探针CP(H1.2)分别与定量细胞裂解液混合，检测荧光随时间变化情况，具体操作如下。

取1×10⁴/μL A549细胞，通过反复冻融加热将细胞裂解，然后向细胞裂解液加入足量blockprobe与细胞内mir-27a杂交(通过提前加入大量反义探针和mir-27a杂交，防止mir-27a和标记FAM-BHQ1的线性探针LP，发夹探针HP，环状哑铃形探针CP(H1.2)杂交)，得到封闭的细胞裂解液。将标记FAM-BHQ1的线性探针LP，发夹探针HP，环状哑铃形探针CP(H1.2)分别与定量细胞裂解液混合(1μL细胞裂解液约含1×10⁴A549细胞)，检测荧光随时间变化情况。从图3可知本发明环状哑铃形探针CP(H1.2)相比线性探针以及发夹探针有更强的耐水解能力，本发明环状哑铃形探针在细胞裂解液中有效存在的时间达25h以上。

3.2活细胞内成像观察探针水解能力

将标记FAM-BHQ1的线性探针LP，发夹探针HP，本发明环状哑铃形探针CP(H1.2)分别通过脂质体3000转染到A549活细胞，通过共聚焦显微镜观察细胞情况，具体操作如下。

将block probe通过LP 3000转染到A549活细胞，洗涤后将标记FAM-BHQ1的线性探针LP，发夹探针HP，本发明环状哑铃形探针CP(H1.2)分别通过脂质体3000转染A549细胞，通过共聚焦显微镜观察细胞情况，从图4可知，环形探针CP在细胞内16个小时才开始水解，线性探针LP和发夹探针HP在2h内被水解现象严重。

实施例4环状哑铃形探针基于环杂交链反应(C-HCR)体外检测靶序列

由于环形探针具有良好的耐水解能力，本实验将本发明耐水解环状哑铃形探针用于HCR反应，并测定细胞中microRNA的含量，以microRNA中miR-27a为target引物，miR-27b为错配引物(与miR-27a仅存在一个碱基的差异)，序列如下：

27a:5'-UUCACAGUGGCUAAGUUCCGC-3'(SEQ ID NO:9)；

27b:5'-UUCACAGUGGCUAAGUUCUGC-3'(SEQ ID NO:14)。

4.1环形探针设计

设计toehold长度为7bp的环状哑铃型探针H1(SEQ ID NO:1)、H2(SEQ ID NO:3)以及单碱基错配探针mH1(SEQ ID NO:4)、mH2(SEQ ID NO:7)，通过NUPACK软件进行理论计算研究反应热力学变化。

4.2 c-HCR反应动力学

在H1和mH1探针茎上分别标记一对报告荧光基团FAM和淬灭荧光基团BHQ1，标记后的探针命名为H1.2(SEQ ID NO:2)和mH1.2(SEQ ID NO:5)，分别在有无target(miR-27a)以及含错配碱基序列(miR-27b)的target(miR-27a)上进行c-HCR反应，通过荧光分光光度计实时观察荧光随时间变化情况，具体操作方法为：

取待检测样品，分为5组(验证无错配C-HCR反应动力学采用H1.2和H2作为反应物，验证错配情况下动力学情况采用mH1.2和mH2作为反应物)：

第1组，5μL PBS缓冲液(pH＝8.4)，5μL miR-27a(100nM)，10μL H1.2(1μM)或mH1.2(1μM)，DEPC水补足至50μL；

第2组，5μL PBS缓冲液(pH＝8.4)，5μL miR-27b(100nM)，10μL H1.2(1μM)或mH1.2(1μM)，DEPC水补足至50μL；

第3组，5μL PBS缓冲液(pH＝8.4)，10μL H1.2(1μM)或mH1.2(1μM)，10μL H2(1μM)或mH2(1μM)，DEPC水补足至50μL；

第4组，5μL PBS缓冲液(pH＝8.4)，5μL miR-27b(100nM)，10μL H1.2(1μM)或mH1.2(1μM)，10μL H2(1μM)或mH2(1μM)，DEPC水补足至50μL；

第5组，5μL PBS缓冲液(pH＝8.4)，5μL miR-27a(100nM)，10μL H1.2(1μM)或mH1.2(1μM)，10μL H2(1μM)或mH2(1μM)，DEPC水补足至50μL；

通过荧光分光光度计实时观察每组荧光随时间变化情况。

检测结果如图5所示，从中可以看出，在链的环部添加错配碱基后的mH1.2和mH2的c-HCR反应速率明显增强，区别错配能力无明显变化，表面在环形探针上添加一对错配碱基后可以提高反应速率，因此选择插入错配的探针mH1和mH2，另从图中可知后期反应逐渐达到平衡，这里选择2h为最佳反应时间。

4.3电泳验证本发明探针的可行性

确定最优反应探针为mH1和mH2后，然后将选取的最优哑铃形环状探针进行c-HCR反应，这里选择带有荧光供体和荧光受体的mH1.3和mH2.3进行试验，在100V条件下通过非变性PAGE电泳验证在有无target(miR-27a)条件以及不同浓度target(miR-27a)条件下，c-HCR反应生成物的电泳情况。

从图6可知在只有mH1.3和mH2.3存在下，只有一个条带；在存在target(miR-27a)下，产生了一个新的条带，并且随着target(miR-27a)浓度的增加，条带更深，证明本发明环状哑铃形探针的c-HCR反应可行。

4.4原子力显微镜验证本发明探针的可行性

通过原子力显微镜观察存在target和无target条件链杂交反应产物的生成情况。理论上，在存在target时反应发生c-HCR反应将产生尺寸较大的DNA链，无target存在时，不发生c-HCR反应，无大尺寸DNA结构产生。

本实施选择带有荧光供体和荧光受体的mH1.3和mH2.3进行试验，利用原子力显微镜来检测其是否可发生c-HCR反应，即通过原子力显微镜观察无miR-27a和存在miR-27a条件链杂交反应产物的生成情况。从图7可知，无targe(miR-27a)存在时，不发生c-HCR反应，无大尺寸DNA结构产生(图7a)，存在target(miR-27a)时反应发生c-HCR反应将产生尺寸较大的DNA链(图7b)。

4.5本发明环状哑铃形探针的可行性及特异性检测

为了进一步验证反应可行性以及后续通过能量共振转移进行细胞内核酸target的观察，分别选取在两个哑铃形探针上标记荧光供体和荧光受体的mH1.3和mH2.3进行试验，研究有无miR-27a以及含有错配碱基miR-27b时发生c-HCR反应后荧光共振能量转移变化情总，进一步验证本发明探针c-HCR反应的可行性和特异性。具体操作方法为：取待检测样品，分为5组：

第1组，5μL PBS缓冲液(pH＝8.4)，10μL mH1.3(1μM)，DEPC水补足至50μL；

第2组，5μL PBS缓冲液(pH＝8.4)，10μL mH2.3(1μM)，DEPC水补足至50μL；

第3组，5μL PBS缓冲液(pH＝8.4)，10μL mH1.3(1μM)，10μL mH2.3(1μM)，DEPC水补足至50μL；

第4组，5μL PBS缓冲液(pH＝8.4)，10μL mH1.3(1μM)，10μL mH2.3(1μM)，5μL miR-27b(100nM),DEPC水补足至50μL；

第5组，5μL PBS缓冲液(pH＝8.4)，10μL mH1.3(1μM)，10μL mH2.3(1μM)，5μL miR-27a(100nM),DEPC水补足至50μL；

上述溶液反应2h后通过荧光分光光度计观察每组荧光强度。

从图8a可知当存在miR-27a时，对比空白曲线(曲线mH1.3和mH2.3)，受体荧光增强，证明了本发明探针能够发生c-HCR反应，当加入相同量miR-27b进行反应后，所得曲线和空白曲线(只存在mH1.3时的曲线)几乎一样。图8b是能量共振转移比率图，可知miR-27b对miR-27a的检测几乎无影响，验证了本发明探针具有很好的特异性。

4.6灵敏度检测

将两个哑铃形探针上标记荧光供体和荧光受体的探针作为反应探针，配制一系列不同target浓度的待测溶液；然后在冰上配制一定体积溶液，包含PBS缓冲液、target探针、两种哑铃形探针、DEPC水补足，反应一定时间后，通过荧光分光光度计测定能量共振转移荧光强度。通过不同target浓度以及相应的能量共振转移强度比值做标准曲线。

将两个哑铃形探针上标记荧光供体和荧光受体的探针作为反应探针，即mH1.3和mH2.3探针，然后配制一系列不同target(miR-27a)浓度的待测溶液；在冰上配制一定50μL溶液，包含PBS缓冲液、target(miR-27a)、两种探针mH1.3和mH2.3、DEPC水，反应一定时间后，通过荧光分光光度计测定能量共振转移荧光强度(如图9)。通过不同target(miR-27a)浓度以及相应的能量共振转移强度比值做标准曲线。从图9可知，线性范围为100nM-10pM，拟合曲线为Y＝0.072lgc(mol L^-1)+0.8771，R²＝0.9988。方法检出限为3.18pM(n＝11)。

实施例5环状哑铃形探针在活细胞内原位成像检测靶序列

5.1活细胞microRNA成像准确度

上述结果说明本发明环状哑铃形探针体外检测核酸target性能良好，再将本发明c-HCR反应用来研究活细胞内检测miR-27a的含量，取三组相同的细胞，第一组a预先用LP3000转染一定量和miR-27a序列互补的探针，第二组b不做任何处理，第三组c预先用LP3000转染一定量和miR-27a序列相同的DNA序列，然后三组细胞分别用LP 3000转染一定量标记荧光供体的环形探针以及标记荧光受体的环形探针进入细胞，孵育一定时间后，通过共聚焦显微镜观察三组细胞内能量共振转移的荧光强度，

从图10可以看出，加入miR-27a相同序列第三组c的细胞FRET最强，不做任何处理的第二组b次之，加入反义序列的第一组a的最暗，该结果证明了本发明方法可以成功检测细胞内miR-27a含量。

5.2不同类型细胞内microRNA原位成像

验证C-HCR反应在细胞内检测target的可行后，该方法被用来检测相关癌细胞和正常细胞内target的含量，将培养好的癌细胞和正常细胞种板后，用LP 3000转染一定量标记荧光供体的环形探针以及标记荧光受体的环形探针进入细胞，孵育一定时间后，通过共聚焦显微镜观察三组细胞内能量共振转移的荧光强度，验证细胞内检测核酸target的准确度。

由于基于c-HCR反应在细胞内检测microRNA具有较好的效果，该方法被用来检测相关癌细胞和正常细胞内miR-27a的含量。将培养好的癌细胞和正常细胞种板后，用LP3000转染一定量标记荧光供体的环形探针mH1.3以及标记荧光受体的环形探针mH2.3进入细胞，孵育2h后，通过共聚焦显微镜观察三组细胞内能量共振转移的荧光强度。已知miR-27a在肺癌细胞中低表达，从图11可知，正常细胞内FRET颜色(黄色)更强，验证了该方法可以用作microRNA相关疾病标志物的诊断。

实施例6环状哑铃形探针检测靶序列的方法

将待测样本(DNA或RNA)中加入本发明环状哑铃形探针，还可以加入PBS缓冲液(pH＝8.4)，于25℃～40℃反应1.5～2.5h，通过荧光分光光度计观察荧光强度，判定样品中是否含有靶序列，并且可以根据标准曲线对样品中的靶序列进行定量。

或者将待检测细胞样本还可以加入PBS缓冲液(pH＝8.4)，于25℃～40℃反应1.5～2.5h，通过共聚焦显微镜检测荧光强度，判定细胞中靶序列的含量情况，并且可以根据标准曲线对样品中的靶序列进行定量。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 中山大学

<120> 一种环状哑铃形探针及其应用

<130>

<160> 14

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tgaatcggta aaagtgtcac cgattcaagg cgcccacaca ccgcct 46

<210> 2

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tgaatcggta aaagtgtcac cgattcaagg cgcccacaca ccgcct 46

<210> 3

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

aagttccgca agtgtgtggc ggaacttagc caaattcaca gtggct 46

<210> 4

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tgaatcggta aaagtgtcac cgattcaagg cgcccacaca ccggc 45

<210> 5

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tgaatcggta aaagtgtcac cgattcaagg cgcccacaca ccggct 46

<210> 6

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tgaatcggta aaagtgtcac cgattcaagg cgcccacaca ccggct 46

<210> 7

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

aagttccgca agtgtgtggc cgaacttagc caaattcaca gtggct 46

<210> 8

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

aagttccgca agtgtgtggc cgaacttagc caaattcaca gtggct 46

<210> 9

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 9

uucacagugg cuaaguuccg c 21

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ttcacagtgg ctaagttccg c 21

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

gcggaactta gccactgtga a 21

<210> 12

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

cgcgcggaac ttagccactg tgaacgcgcg 30

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

gcggaactta gccactgtga a 21

<210> 14

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 14

uucacagugg cuaaguucug c 21

Claims

1.一种检测靶序列的环状哑铃形探针，所述探针包括2种不同环状哑铃形探针，分别记为P1和P2，P1和P2均为闭合的碱基序列，均呈哑铃形，两端的环部通过中间的颈部连接在一起，颈部由反向互补配对的碱基对组成；

2.根据权利要求1所述的环状哑铃形探针，其特征在于，在探针P1或/和P2颈部的两条碱基序列上分别标记有报告荧光基团、淬灭荧光基团，当有靶序列存在时，发生链杂交反应，探针P1或/和P2颈部被打开，报告荧光基团、淬灭荧光基团分离，发出荧光信号；

3.根据权利要求1所述的环状哑铃形探针，其特征在于，所述片段Z能够与片段X完全或部分互补配对杂交，或存在1～3个碱基错配的互补配对杂交。

4.根据权利要求1所述的环状哑铃形探针，其特征在于，所述探针P1和P2颈部分别存在1～3对碱基错配。

5.根据权利要求1所述的环状哑铃形探针，其特征在于，颈部碱基对数与靶序列碱基数的比为1：1.2～1.9；环部碱基数与颈部碱基对数的比为1：1.2～2.2。

6.根据权利要求1～5任一项所述的环状哑铃形探针，其特征在于，所述toehold序列的碱基数占其所处环部碱基数的60%以上。

7.权利要求1～6任一项所述的环状哑铃形探针在检测microRNA中的应用，其特征在于：所述检测为非疾病诊断目的的检测。

8.一种检测miR-27a的环状哑铃形探针，由环状哑铃形探针H1.2和H2组成，或者由环状哑铃形探针mH1.2和mH2组成，或者由环状哑铃形探针mH1.3和mH2.3组成，各探针的碱基序列如下：

H1.2:3-T(FAM)GAATCGGTAAAAGTGTCACCGATT(BHQ1)CAAGGCGCCCACACACCGCCT -5；

H2:5-AAGTTCCGCAAGTGTGTGGCGGAACTTAGCCAAATTCACAGTGGCT-3；

mH1.2:3-T(FAM)GAATCGGTAAAAGTGTCACCGATT(BHQ1)CAAGGCGCCCACACACCGGCT -5；

mH2:5-AAGTTCCGCAAGTGTGTGGCCGAACTTAGCCAAATTCACAGTGGCT-3；

mH1.3:3-TGAAT(cy3)CGGTAAAAGTGTCACCGATTCAAGGCGCCCACACACCGGCT -5；

mH2.3:5-AAGTTCCGCAAGTGTGTGGCCGAACTT(cy5)AGCCAAATTCACAGTGGCT-3。

9.一种靶序列检测方法，其特征在于，包括如下步骤：将权利要求1～6任一项所述的环状哑铃形探针加入到待检测样品中，反应后检测荧光强度，根据荧光检测结果判定样品中是否含有靶序列，或计算靶序列的含量。

10.一种活细胞内原位检测靶序列的方法，其特征在于，包括如下步骤：将权利要求1～6任一项所述的环状哑铃形探针转染到待检测活细胞样品中，反应后检测荧光强度，根据荧光检测结果判定样品中是否含有靶序列，或计算靶序列的含量。