CN110144384A

CN110144384A - 一种检测端粒内氧化性损伤的荧光化学传感器及其检测方法和应用

Info

Publication number: CN110144384A
Application number: CN201910478044.8A
Authority: CN
Inventors: 张春阳; 张艳; 华若男; 相东雪
Original assignee: Shandong Normal University
Current assignee: Shandong Normal University
Priority date: 2019-06-03
Filing date: 2019-06-03
Publication date: 2019-08-20
Anticipated expiration: 2039-06-03
Also published as: CN110144384B

Abstract

本发明提供一种检测端粒内氧化性损伤的荧光化学传感器及其检测方法和应用。本发明中将修复酶的特异性与末端脱氧核苷酸转移酶介导的聚合延伸相结合，以启动核酸内切酶IV诱导的循环切割信号探针，诱导Endo IV裂解信号探针中的AP位点，导致信号探针上AF488荧光团的释放，同时产生具有游离3'‑OH末端的信号探针。具有游离3'‑OH的每个信号探针可以通过TdT有效地延长以产生长的poly‑A序列。释放的poly‑A序列和新产生的poly‑A序列可以诱导信号探针的多次循环切割，释放出更多的AF488荧光团。在磁力分离下，上清液中的荧光团可以通过单分子成像定量。具有良好的实际应用之价值。

Description

一种检测端粒内氧化性损伤的荧光化学传感器及其检测方法和应用

技术领域

本发明属于生物检测和分子生物学技术领域，具体涉及一种检测端粒内氧化性损伤的荧光化学传感器及其检测方法和应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

端粒由双链的重复序列(TTAGGG)n组成且具有单链的突出末端。端粒封闭真核染色体的末端并在基因组的稳定性和细胞活力中发挥关键作用。TTAGG G重复序列的富含G的特性使端粒极易受氧化损伤，特别是在单链区域，因为它更容易与氧化剂反应。氧化性损伤8-oxoG和FapyG是脱氧鸟苷(dG)最常见的氧化产物，可以通过引起复制错误和转录干扰诱导遗传毒性。端粒中富含的G碱基有助于氧化应激过程中G氧化性损伤的优先积累，而且它的修复效率比基因组中其他序列中的G损伤偏低。端粒的氧化损伤与端粒长度和完整性的变化有关，这将导致多种疾病的发生，如心血管疾病，糖尿病和癌症。因此，检测端粒中的氧化损伤水平将为分子医学，早期诊断和化学品的遗传毒性提供巨大益处。

目前，检测基因组中8-oxoG的最常用方法包括高效液相色谱(HPLC)与电化学检测相结合(HPLC-ECD)以及HPLC与气相色谱-质谱联用(HPLC-MS) /MS)。这些方法可以提供更准确的8-oxoG计数，但需要把DNA序列消化成单个核苷酸碱基，而且需要复杂的仪器设备及繁琐的实验步骤。迄今为止，由于低丰度和高度重复的基因区域，很少有方法可用于检测端粒中的氧化性损伤水平。最近，纳米孔技术和基于定量PCR(q-PCR)的方法可以用于检测人端粒序列中的氧化性损伤。然而，发明人发现，它们需要特定的损伤标记和复杂的热循环仪来精确控制热循环。利用腺苷的衍生物三磷酸Adap可用于区分人端粒序列中的 8-oxoG损伤和正常的G碱基，但是该方法难以定量8-oxoG损伤。

发明内容

针对上述现有技术的不足，本发明提供一种检测端粒内氧化性损伤的荧光化学传感器及其检测方法和应用。本发明中将修复酶的特异性与末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)介导的聚合延伸相结合，以启动核酸内切酶IV(Endo IV)诱导的循环切割信号探针，诱导EndoIV裂解信号探针中的AP位点，导致信号探针上 AF488荧光团的释放，同时产生具有游离3'-OH末端的信号探针。具有游离3'-OH 的每个信号探针可以通过TdT有效地延长以产生长的poly-A序列。释放的poly-A 序列和新产生的poly-A序列可以诱导信号探针的多次循环切割，释放出更多的 AF488荧光团。在磁力分离下，上清液中的荧光团可以通过单分子成像定量。本发明无需复杂的仪器或繁琐的程序，同时检测灵敏度高，具有良好的实际应用之价值。

本发明是通过如下技术方案实现的：

本发明的第一个方面，提供一种检测端粒内氧化性损伤的荧光化学传感器，所述荧光化学传感器至少包括信号探针、捕获探针和辅助探针。

其中，所述信号探针为具有脱嘌呤嘧啶位点(AP位点)的富T单链DNA 序列，所述信号探针5'端修饰有生物素，所述信号探针3'端修饰有荧光基团，优选使用AF488进行修饰；

进一步的，所述信号探针与链霉抗生物素蛋白包被的磁珠进行缀合。

所述捕获探针用于捕获富集端粒，其具有与端粒杂交的单链DNA序列，所述捕获探针3'端进行生物素化修饰；

所述辅助探针为3'端用ddC修饰的单链DNA序列，其与单链端粒杂交形成甲酰胺嘧啶[fapy]-DNA糖基化酶的dsDNA底物。

进一步的，所述荧光化学传感器还包括甲酰胺嘧啶[fapy]-DNA糖基化酶、末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)、核酸内切酶IV和T4-多核苷酸激酶。

进一步的，所述端粒内氧化性损伤包括8-oxoG损伤。

本发明的第二个方面，提供基于上述荧光化学传感器检测端粒内氧化性损伤的方法，所述方法包括：

S1、用dsDNA片段酶消化提取基因组DNA，获得具有50-200bp的DNA；

S2、加入捕获探针和链霉抗生物素蛋白包被的磁珠孵育处理，捕获探针用于捕获富集端粒；

S3、加入TdT进行孵育处理，催化三磷酸脱氧核苷酸(dATPs)重复加入 DNA分子的3'-羟基末端(3'-OH)；

S4、加入辅助探针、甲酰胺嘧啶[fapy]-DNA糖基化酶进行孵育处理，其中辅助探针用于与单链端粒杂交以形成甲酰胺嘧啶[fapy]-DNA糖基化酶的 dsDNA底物；

S5、加入TdT、核酸内切酶IV和磁珠偶联信号探针进行孵育处理；

S6、磁分离后，对上清液进行单分子检测。

本发明的第三个方面，提供上述荧光化学传感器和/或检测方法在检测端粒内氧化性损伤中的应用。所述端粒内氧化性损伤包括8-oxoG损伤。

本发明首次提出了能够检测和量化人类端粒氧化损伤的超灵敏单分子成像技术。单分子检测是生物分子分析的有力工具，具有灵敏度高，样品消耗低，信噪比高的优点，并已成为DNA糖基化酶，DNA表观遗传修饰，蛋白质修饰和生物过程动态研究的有前途的方法。

在本发明中，将修复酶的特异性与末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)介导的聚合延伸相结合，以启动核酸内切酶IV(Endo IV)诱导的循环切割信号探针，导致AF488荧光团的释放。值得注意的是，TdT是一种无模板的聚合酶，它可以催化三磷酸脱氧核苷酸(dATPs)重复加入DNA分子的3'-羟基末端(3'-OH)。因此，每个端粒片段在氧化受损碱基的位置产生3'-OH，并且通过TdT有效地延长产生长的poly-A序列。信号探针与生成的polyA序列结合之后，诱导Endo IV 裂解信号探针中的AP位点，释放出AF488荧光团，poly-A序列，同时产生具有游离3'-OH末端的信号探针。具有游离3'-OH的每个信号探针可以通过TdT 有效地延长以产生长的poly-A序列。释放的poly-A序列和新产生的poly-A序列可以诱导信号探针的多次循环切割，释放出更多的AF488荧光团。在磁力分离下，上清液中的荧光团可以通过单分子成像定量。该方法可以在混合体系中检测到0.001％的氧化性损伤。此外，该方法可以灵敏地检测不同浓度的H2O2诱导的氧化应激中端粒内氧化性损伤的变化，甚至可以检测到从1000μM H2O2处理的HeLa细胞中提取的0.1ng基因组DNA中端粒内的氧化性损伤。而且通过标准的线性关系方程可以计算出每个HeLa细胞中端粒中含有34-44个氧化性损伤位点。

本发明有益效果：

(1)本发明整个反应在等温条件下进行：传统的检测8-oxoG的方法往往需要复杂的仪器或繁琐的程序，与之相比，本发明整个反应在等温条件下进行不需要复杂的仪器或繁琐的程序。

(2)本发明利用TDT和Endo IV的结合不仅消除了模板或特异性限制酶识别序列对切口酶切裂的参与还大大提高了检测灵敏度。TDT介导的模板非依赖性聚合延伸和Endo IV介导的信号探针切割消除了模板或特异性限制酶识别序列对切口酶切裂的参与，并且TDT和Endo IV的结合可诱导信号探针的环状切割和延伸，触发后续的信号放大级联反应，大大提高了检测灵敏度。

(3)本发明引入磁分离和单分子法的高信噪比提供了接近零的背景信号，进一步提高了检测灵敏度。单分子检测是生物分子分析的有力工具，具有灵敏度高，样品消耗低，信噪比高的优点。本发明引入单分子法的高信噪比使得背景信号接近于零，进一步提高了检测的灵敏度。利用低背景信号，结合高效TdT激活的Endo IV催化信号放大和单分子检测的高灵敏度，该方法对氧化鸟嘌呤损伤具有超高灵敏度，检出限低至9.3×10^-17M，它可以识别低丰度的氧化鸟嘌呤损伤的存在，低至0.001％。具有良好的实际应用之前景。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为本发明实施例1中荧光化学传感器检测端粒内氧化性损伤的机理图；

图2为检测可行性的实验图；图2A为本发明实施例1中TdT介导的去除8-oxoG碱基后聚合反应的凝胶电泳成像图；泳道1，0.5μMTero-1/辅助探针+3U PNK+4U TdT；泳道2，0.5μMTero-1/辅助探针+1.6U Fpg+3U PNK+4U TdT；图2B为本发明实施例1中含有两个8-oxoG碱基的10nM(Telo-2)和10nM正常端粒(Telo-0) 的荧光信号图；图2C为检测10pM Telo-2(I)和10pM Telo-0(II)的单分子成像得到的AF488的荧光图；比例尺为2.5μm。

图3为分别检测含有两个8-oxoG碱基的1nM端粒(Telo-2)，1nM含有两个8-oxoG 碱基的合成KRAS序列(KRAS)，1nM含有两个8-oxoG碱基随机的合成DNA序列(Random DNA)和反应缓冲液(control)的AF488计数图。误差棒为三组实验的标准偏差。

图4为在最佳实验条件下，氧化损伤检测方法的灵敏度示意图；图4A为在1×10^-16至1×10^-11M范围内的氧化碱基损伤浓度对应的AF488的对数线性相关性图；图4B 为在Telo-2和Telo-0的混合物中测出与实际输入氧化损伤水平之间的相关性图；其中，Telo-2和Telo-0的总浓度为10pM。误差棒为三组实验的标准偏差。

图5为由活性氧引起的基因组DNA端粒内的氧化性损伤检测图；图5A为暴露于不同浓度的H₂O₂的HeLa细胞的端粒中的氧化损伤的AF488计数变化图；其中，端粒是从50ng基因组DNA中分离出；图5B为在0.1至100ng范围内，AF488计数与来自1000μMH₂O₂处理的HeLa细胞的基因组DNA量的对数线性关系图。误差棒为三组实验的标准偏差。

图6为Fpg诱导的氧化损伤碱基的去除的凝胶电泳成像图；其中，泳道1,0.5μMTero-Cy5/辅助探针；泳道2,0.5μM Telo-Cy5/辅助探针+1.6U Fpg。

图7为Endo IV的量对应的AF488计数图。Telo-2浓度为10pM。误差棒为三组实验的标准偏差。

图8为TdT的量对应的AF488计数图；其中，Telo-2浓度为10pM。误差棒为三组实验的标准偏差。

图9为输入的氧化损伤在含有两个8-oxoG碱基(Telo-2)和没有氧化碱基损伤(Telo-0)的正常端粒的混合物的AF488计数图。误差棒为三组实验的标准偏差。

图10为来自用1000μMH₂O₂处理的不同人细胞系(即，HeLa细胞，A549细胞， SW480细胞和HL-7702细胞)的端粒中的不同氧化损伤水平图；其中，基因组DNA 的量为50ng。误差棒为三组实验的标准偏差。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

如前所述，目前检测基因组中8-oxoG的最常用方法包括高效液相色谱 (HPLC)与电化学检测相结合(HPLC-ECD)以及HPLC与气相色谱-质谱联用(HPLC-MS)/MS)。这些方法可以提供更准确的8-oxoG计数，但需要把DNA 序列消化成单个核苷酸碱基，而且需要复杂的仪器设备及繁琐的实验步骤。迄今为止，由于低丰度和高度重复的基因区域，很少有方法可用于检测端粒中的氧化性损伤水平。

有鉴于此，本发明的一个具体实施方式中，提供一种检测端粒内氧化性损伤的荧光化学传感器，所述荧光化学传感器至少包括信号探针、捕获探针和辅助探针。

本发明的又一具体实施方式中，所述信号探针为具有脱嘌呤嘧啶位点(AP 位点)的富T单链DNA序列，所述信号探针5'端修饰有生物素，所述信号探针 3'端修饰有荧光基团，优选使用AF488进行修饰；

本发明的又一具体实施方式中，所述信号探针与链霉抗生物素蛋白包被的磁珠进行缀合。

本发明的又一具体实施方式中，所述信号探针的碱基序列如下：

5'-Biotin-TTT TTT TTT XTT TTT TTT-AF488-3'；

其中X代表脱嘌呤嘧啶位点；

本发明的又一具体实施方式中，所述捕获探针的碱基序列如下：

CCT AAC CCT AAC CCT AAC CCT TTT-Biotin；

本发明的又一具体实施方式中，所述辅助探针为3'端用ddC修饰的单链DNA 序列，其与单链端粒杂交形成甲酰胺嘧啶[fapy]-DNA糖基化酶的dsDNA底物。

本发明的又一具体实施方式中，所述辅助探针的碱基序列如下：

5'-CCT AAC CCT AAC CCT AAddC-3'。

本发明的又一具体实施方式中，所述荧光化学传感器还包括甲酰胺嘧啶 [fapy]-DNA糖基化酶、末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)、核酸内切酶IV和T4-多核苷酸激酶。

本发明的又一具体实施方式中，所述端粒内氧化性损伤包括8-oxoG损伤。

本发明的又一具体实施方式中，提供基于上述荧光化学传感器检测端粒内氧化性损伤的方法，所述方法包括：

S1、用dsDNA片段酶消化提取基因组DNA，获得具有50-200bp的DNA；

S2、加入捕获探针孵育处理，用于捕获富集端粒；

S3、加入TdT进行孵育处理，催化三磷酸脱氧核苷酸(dATPs)重复加入DNA分子的3'-羟基末端(3'-OH)；

S6、磁分离后，对上清液进行单分子检测。

本发明的又一具体实施方式中，所述步骤S2中，孵育处理条件为于90～100℃ (优选95℃)温育3～8分钟(优选5分钟)；

本发明的又一具体实施方式中，所述步骤S3中，孵育处理过程中还加入 ddCTP，防止端粒发生非特异性扩增；

孵育处理条件为于30～40℃(优选37℃)孵育20～40分钟(优选30分钟)；

本发明的又一具体实施方式中，所述步骤S4中，孵育处理条件为30～40℃ (优选为37℃)下孵育40～80分钟(优选为60分钟)；

本发明的又一具体实施方式中，所述步骤S5中，孵育处理条件为30～40℃ (优选为37℃)下孵育40～80分钟(优选为60分钟)；

本发明的又一具体实施方式中，所述步骤S6中，采用全内反射荧光(TIRF) 技术进行单分子检测；同时，通过荧光分光光度计测量反应产物的荧光光谱；具体为：在488nm的激发波长下测量AF488荧光，并使用532nm的荧光强度进行定量分析。

本发明的又一具体实施方式中，提供上述荧光化学传感器和/或检测方法在检测端粒内氧化性损伤中的应用。所述端粒内氧化性损伤包括8-oxoG损伤。

以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。另外，实施例中未详细说明的分子生物学方法均为本领域常规的方法，具体操作可参看分子生物指南或产品说明书。

实施例1

1.本发明检测原理及方法步骤：

首先用dsDNA片段酶消化提取基因组DNA，以获得具有50-200bp的DNA。在人类基因组中，端粒由重复序列(TTAGGG)_n组成，其形成终止于单链3'G-富集突出端的双链DNA的长区域。为了富集端粒，3'-生物素化捕获探针设计用于与端粒杂交并利用链霉抗生物素蛋白包被的磁珠将端粒从基因组DNA中分离出来。所有分离的端粒通过使用TdT聚合用ddCTP进行末端标记，以防止非特异性扩增。随后，为了提高碱基切除修复反应的效率，还设计了在3'末端用ddC修饰的辅助探针与单链端粒杂交以形成甲酰胺嘧啶[fapy]-DNA糖基化酶(Fpg)的 dsDNA底物。

该方法涉及三个连续步骤：(1)在辅助探针的辅助下，Fpg诱导8-oxoG碱基切除修复反应，(2)TdT介导的延伸反应激活的Endo IV-辅助信号探针的循环切割，和(3)释放的AF488荧光团的单分子检测。

来自大肠杆菌的Fpg含有DNA糖基化酶活性和β，δ-消除AP裂解酶活性，可以去除dsDNA中受损的氧化性损伤碱基并切割DNA骨架，与5'-磷酸和3'-磷酸酯残留物形成单核苷酸缺口。如图1所示，端粒-辅助探针杂交体中受损的氧化性损伤碱基可以通过Fpg除去，在5'和3'磷酸基团的修饰位点产生核苷酸缺口，导致端粒和辅助探针的解离。切割的端粒的3'-磷酸基团可以通过多核苷酸激酶(PNK)除去以产生游离的3'-OH末端，其随后用作引物以启动TdT催化的模板独立的聚合延伸以产生在dATP存在下的聚腺苷(polyA)。设计了磁珠(MB)-缀合的富含 T的信号探针，其在序列的中间用AP位点修饰，并在3'末端用AF488标记。得到的poly-A序列可以与MB连接的富含T的信号探针的杂交以形成具有完整AP位点的polyA-信号探针DNA双链体，其可以被Endo IV切割，导致信号探针的断裂和释放polyA序列，AF488荧光团和切割的含有游离的3'-OH末端的MB共轭信号探针。释放的polyA序列可与新信号探针结合形成具有完整AP位点的新dsDNA，从而启动Endo IV诱导的polyA-信号探针双链体的环状切割和更多AF488荧光团的释放。此外，具有游离3'-OH末端的裂解的MB-缀合的信号探针可以作为引物在dATP存在下引发新的TdT介导的延伸并产生大量的长polyA产物。得到的MB 连接的polyA产物可以与多个MB缀合的信号探针杂交以形成具有完整AP位点的新dsDNA，其启动Endo IV诱导的polyA产物-信号探针双链体的循环切割，释放出更多AF488荧光团，MB-连接的polyA产物和具有游离的3'-OH末端的MB-缀合的信号探针。因此，所有释放的polyA产物和具有游离3'-OH末端的MB缀合的信号探针可以诱导信号探针的多次循环切割和更多AF488荧光团的释放，直到酶没有活性。最后，释放的AF488荧光团可以通过磁分离后的单分子检测进行简单定量。

信号探针与链霉抗生物素蛋白包被的磁珠的缀合：

根据Invitrogen Corporation的方案进行信号探针与磁珠(MB)的偶联。对于信号探针，将100μL链霉抗生物素蛋白包被的MBs溶液(10mg/mL)转移到600μL 离心管中，用1×B&W缓冲液(5mM Tris-HCl(pH 7.5)，0.5mM EDTA，1M NaCl) 洗涤两次。通过磁力分离除去上清液，并将MB重悬于2×B&W缓冲液(10mM Tris-HCl(pH 7.5)，1mM EDTA，2M NaCl)中至终浓度为5μg/μL。然后将200μL 的1μM生物素化的信号探针与200μL的5μg/μLMBs溶液混合，在室温下在辊式混合器中在黑暗中温育10分钟。然后将混合物洗涤三次以除去未偶联的信号探针，并将剩余的信号探针-MB缀合物重悬于100μL的TE缓冲液中。

8-oxoG碱基切除修复和TdT介导的延伸反应激活的信号探针的Endo IV-辅助切割。为了切除8-oxoG，将含有各种浓度的含有8-oxoG损伤的合成端粒，10pM辅助探针，1x末端转移酶反应缓冲液，1.6U Fpg和3U T4-多核苷酸激酶(PNK)的反应混合物(10μL)在37℃中温育1小时。然后将4U TdT，5U核酸内切酶IV， 1x末端转移酶反应缓冲液，0.25mMCoCl₂,250μM dATP和磁珠偶联信号探针加入到反应混合物中，总体积为50μL，然后在37℃下孵育60分钟。最后，通过磁力分离将链霉抗生物素蛋白包被的MB分离3分钟，并对上清液进行单分子检测。

基于全内反射荧光(TIRF)的单分子检测：

通过全内反射荧光显微镜(TIRF)(Nikon，Ti-E，Japan)获得单分子的图像。稀释1000倍后，将10μL反应产物样品用于TIRF成像，488nm激光器用于激发 AF488。使用油浸100×物镜收集光子。来自AF488的光子通过相机收集 (Photometrics，Evolve 512)。对于数据分析，使用Image J软件选择600×600像素的成像区域用于AF488分子计数。通过计算十帧获得平均AF488计数。

荧光光谱的测量：

通过Hitachi F-7000荧光分光光度计(Tokyo，Japan)测量50μL反应产物的荧光光谱。在488nm的激发波长下测量AF488荧光，并使用532nm的荧光强度进行定量分析。

凝胶电泳分析：

通过14％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳在1×Tris-硼酸盐-EDTA(TBE)缓冲液 (9mMTris-HCl，9mM硼酸，0.2mM EDTA，pH7.9)中在110V下分析用SYBR Gold 染色的产物。在室温下恒定电压40分钟。通过ChemiDoc MP成像系统(Hercules， CA，U.S.A。)使凝胶电泳图像可视化。

细胞培养和基因组DNA的制备：

将细胞在含有10％胎牛血清(FBS，Invitrogen，USA)的Dulbecco改良的Eagle 培养基(DMEM；Gibco，U.S.A。)中于37℃，5％CO₂下培养。为了在体内诱导氧化性DNA损伤，用PBS缓冲液洗涤细胞，并在37℃，5％CO₂的潮湿室中用不同浓度的H₂O₂处理1小时。按照制造商的建议，使用DNAMini试剂盒提取细胞基因组DNA。根据制造商的推荐，用dsDNA片段酶(NEB)将基因组DNA消化至50-200bp。通过NanoDrop 2000c分光光度计(ThermoScientific， Wilmington，DE)测定基因组DNA的浓度。

检测HeLa细胞端粒内8-oxoG损伤：

为了从基因组DNA中富集端粒，将生物素化的捕获探针和消化的基因组 DNA在1×末端转移酶反应缓冲液中于95℃温育5分钟，然后缓慢冷却至室温。然后通过磁珠(MB)分离生物素化的捕获探针。磁力分离并洗涤三次后，加入4U TdT，200μM ddCTP，1×末端转移酶反应缓冲液和0.25mM CoCl₂，总体积为10μL，并在37℃下孵育30分钟。通过磁力分离除去过量的TdT和ddCTP。然后将100nM 辅助探针，1x末端转移酶反应缓冲液，3U甲酰胺嘧啶[fapy]-DNA糖基化酶 (Fpg)，5U T4-多核苷酸激酶加入到反应体系中，总体积为10μL，并在37℃下孵育1小时。然后将4U TdT，5U核酸内切酶IV，1×末端转移酶反应缓冲液，0.25mMCoCl₂,250μM dATP和磁珠偶联信号探针加入到反应混合物中，总体积为50μL，然后在37℃下孵育60分钟。磁分离后，按照上述步骤进行单分子检测。

实验所需核苷酸序列

试验结果分析

1.检测可行性实验

氧化性碱基损伤，尤其是8-oxoG和FapyG是最常见的氧化性DNA损伤。使用含有一个8-oxoG碱基(Telo-Cy5)的Cy5标记的合成端粒来验证Fpg可以消除氧化性DNA损伤和切割DNA骨架以产生新的切割产物(图6)。然后选择含有一个 8-oxoG(Telo-1)的合成端粒来验证氧化损伤的去除是否可以诱导TdT介导的聚合反应。进行了非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)来分析扩增产物(图2A)。在PNK+TdT存在的情况下，仅观察到Telo-1/辅助探针双链的条带(图2A，泳道1)。当存在Fpg，PNK和TdT酶时，观察到明确定义的扩增产物条带(图2A，泳道2)，表明Fpg可从端粒中除去8-oxoG碱基并启动随后的TdT催化的聚合延伸。此外，使用含有两个8-oxoG碱基(Telo-2)的合成端粒作为目标来研究所提出的氧化损伤检测方法的可行性(图2B和C)。如图2B所示，在Telo-2存在下观察到明显的AF488荧光信号(图2B，红线)。相反，在没有氧化损伤(Telo-0)的正常端粒中没有检测到明显的AF488信号(图2B，黑线)。通过单分子计数进一步证实了这些结果(图2C)。观察到Telo-2对应的不同的AF488荧光信号(图2C， I)，但没有检测到响应于Telo-0的AF488荧光信号(图2C，Ⅱ)。

2.选择性的检测

氧化性DNA损伤的位置在整个基因组中可能是随机的。为了研究所提出的方法检测端粒氧化损伤的选择性，使用含有两个8-oxoG碱基的端粒序列(Telo-2) 和含有两个8-oxoG碱基的合成KRAS序列(KRAS)，随机DNA(Random DNA) 作为对照。将端粒特异性捕获探针与磁珠组合分别用于分离Telo-2，KRAS和 Random DNA，然后通过所提出的方法检测氧化损伤。在相同条件下，Telo-2 观察到高荧光信号，而对于KRAS，RandomDNA和仅具有反应缓冲液的对照组没有观察到明显的荧光信号(图3)。这可以通过端粒特异性捕获探针仅捕获端粒的事实来解释。这些结果清楚地表明，所提出的方法可用于选择性检测端粒中的氧化损伤。

3.单分子检测低丰度端粒内8-oxoG损伤

在最佳实验条件下(图7和图4)，使用合成的Telo-2来研究所提出的氧化损伤检测方法的灵敏度。如图4A所示，AF488计数与氧化损伤浓度在1×10^-16至 1×10^-11M的5个数量级范围内呈现对数线性相关。回归方程为N＝1632.6+101.16 log₁₀C，相关系数为0.984，其中N是测量的AF488计数，C是氧化损伤浓度 (Telo-2)。通过评估阴性对照的平均响应值加上标准偏差的三倍，计算出检测限为9.3×10^-17M。与基于毛细管电泳的荧光法(2.9×10^- ¹²M)相比，该方法的灵敏度提高了4个数量级，与基于适体的传感器的(3×10^-9M)方法相比提高了7个数量级。此外，检测了不同比例的含有两个8-oxoG碱基的Telo-2和正常端粒(Telo-0)的混合物中的氧化损伤水平。AF488计数随着混合物中输入氧化损伤量的增加而增强(图9)，并且在测量的氧化损伤水平与实际输入氧化损伤水平之间获得线性关系(图4B)。该结果表明，所提出的方法可以量化低至0.001％的氧化损伤水平，而不受复杂样品中大量正常DNA序列的干扰，优于报道的基于qPCR的测定。该方法的高灵敏度可归因于以下因素：(1)Fpg可有效去除端粒中的氧化损伤；(2)只有由切除的氧化损伤位点产生的游离3'-OH才能引发TdT 诱导的聚合反应，导致极低的背景信号；(3)TdT介导的聚合延伸可以诱导Endo IV辅助的信号探针的循环切割，显著放大荧光信号；(4)引入磁分离和单分子检测，进一步降低了背景信号，提高了检测灵敏度。

4.检测由活性氧引起的基因组DNA端粒内的氧化性损伤

该方法测量了从暴露于不同浓度的过氧化氢(H₂O₂)的人宫颈癌细胞系 (HeLa细胞)中提取的端粒氧化损伤水平。人端粒含有数千个碱基对和100～200 个核苷酸单个3'末端的链状突出端，可折叠成独特的二级结构(即Gquadruplex)。基因组DNA中分离的端粒含量估计为0.018％-0.032％(表1)。随着H₂O₂浓度从 0增加到1000μM，AF488计数增强，表明氧化损伤与H₂O₂浓度的增加成正比(图 5A)。该方法进一步测量了来自用1000μM H₂O₂处理的HeLa细胞的不同量的基因组DNA中分离的端粒的氧化损伤。如图5B所示，AF488计数随着基因组DNA 量的增加而提高，并且在AF488计数和基因组DNA量的对数之间获得0.1至100ng范围内的线性相关性。相应的方程是N＝94.02+82.28log₁₀A，相关系数为0.97，其中N代表AF488计数，A代表基因组DNA的数量。通过评估阴性对照的平均响应加上标准偏差的三倍，计算检测限为0.078ng。重要的是，根据标准曲线(N＝ 1632.6+101.16log₁₀C，图4A)，计算出每个细胞端粒含有为34-44个氧化性损伤碱基(表2)。值得注意的是，与基于HPLC的方法(25-50μg)相比，该方法具有仅涉及少量DNA(0.1ng)的显着优点。并且进一步测量了不同细胞系中端粒的氧化损伤水平。癌细胞中的氧化损伤水平高于正常细胞(图10)。

表1.分离的端粒含量来自基因组DNA

基因组DNA量	20μg	30μg	50μg	60μg
					分离的端粒含量(％)	0.018％	0.028％	0.032％	0.027％

表2.计算的每个细胞中端粒的氧化损伤数

5.验证Fpg介导的氧化损伤的去除

使用含有一个8-oxoG碱基(Telo-Cy5)的Cy5标记的合成端粒来验证Fpg是否可以去除氧化性DNA损伤。辅助探针可以与Telo-Cy5杂交形成Telo-Cy5/辅助探针双链体。非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分析显示在没有Fpg的情况下仅观察到Telo-Cy5/辅助探针双链体的条带(图6，泳道1)，表明没有8-oxoG 被切割。在存在Fpg的情况下，观察到对应于裂解产物大小的新条带(图6，泳道2)，表明Fpg可以去除Telo-Cy5中的8-oxoG碱基损伤并切割DNA骨架以产生一种新的裂解产物。

6.实验条件的优化

为了获得最佳的分析性能，分别优化了Endo IV和TdT的量。如图7所示，当TdT的量固定在8U时，AF488计数随着的增加而增加，并且Endo IV的量到4U 时达到最大值。因此，4U的Endo IV用于后续研究。如图8所示，当Endo IV的量固定在4U时，AF488计数随着的增加而增加，并且TdT量到6U时达到最大值。因此，使用6U的TdT在随后的研究中。

7.基因组DNA分离的端粒含量的检测

为了收集基因组DNA端粒，将端粒特异性3'-生物素化的捕获探针和消化的基因组DNA片段在95℃加热5分钟，然后缓慢冷却至室温，通过磁珠分离生物素化的捕获探针，再将磁珠与200mM NaOH在室温下孵育30分钟以释放端粒链，最后将具有端粒链的上清液与磁珠分离，并通过NanoDrop 2000c分光光度计测量端粒量。

8.计算端粒中氧化损伤个数

在该方法中，所有游离的3'羟基(3'-OH)仅由切除的氧化损伤位点产生，并且它们可以诱导TdT介导的聚合延伸从而启动Endo IV辅助环状切割信号探针以释放丰富的AF488荧光团。测得的AF488计数与氧化损伤水平成正比。氧化碱损伤，尤其是8-oxoG和FapyG是最常见的氧化性DNA损伤。因此，在的研究中，通过稀释已知浓度的含有两个8-oxoG碱基(Telo-2)的合成端粒来建立标准曲线，得到的对数线性回归方程N＝1632.6+101.16log₁₀C，其中N是测量的AF488计数，C是Telo-2的浓度(图4A)。进一步测量了从不同量的基因组DNA中分离的端粒中的氧化损伤(图5B)。在0.1到100ng范围内，AF488计数随着基因组DNA 数量的增加而提高。标准曲线用于计算人端粒的绝对氧化损伤水平。每个细胞中人端粒的Fpg敏感性氧化损伤位点的数量计算如下：

(1)将从不同量的基因组DNA分离的人端粒中获得的AF488计数(图5B) 分别代入标准曲线N＝1632.6+101.16log₁₀C。因此，回归方程是：获得的AF488 计数＝1632.6+101.16log₁₀C并且可以计算浓度C。

(2)从不同基因组DNA分离的人端粒中对Fpg敏感的氧化损伤位点(N-telo) 的数量为：N-telo＝计算浓度C×2(标准曲线中的Telo-2含有两个8-oxoG碱基)×反应体积(10μL)×阿伏加德罗常数＝计算浓度C(mol/L)×2×10×10^-6L×6.02×10²³。

(3)每个细胞中人端粒的Fpg敏感性氧化损伤位点的数量计算如下：计算的 N-telo/细胞数对应的基因组DNA量。

因此，估计每个细胞端粒中的氧化损伤的数量为每个HeLa细胞34-44(表2)。

9.检测不同人细胞系端粒的氧化损伤

该方法测量了不同人细胞系中端粒的氧化损伤水平，包括人肺腺癌细胞系 (A549细胞)，人结肠癌细胞系(SW480细胞)和正常人肝细胞系(HL-7702 细胞)。如图10所示，观察到端粒中不同的氧化鸟嘌呤损伤水平，癌细胞(即 HeLa细胞，A549细胞和SW480细胞)中的氧化鸟嘌呤损伤水平远高于正常细胞 (即HL-7702细胞)，与癌症患者的氧化损伤一致。

应注意的是，以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实例对本发明进行了详细说明，但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东师范大学

<120> 一种检测端粒内氧化性损伤的荧光化学传感器及其检测方法和应用

<130>

<160> 9

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

ttagggttag ggttagggtt aggg 24

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

ttagggttag ggttagggtt addc 22

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

ttagggttag ggttagggtt aggg 24

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

ttagggttag ggttagggtt a 21

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

cctaacccta accctaaddc 18

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

cctaacccta accctaaccc tttt 24

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

tttttttttx tttttttt 18

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

gtagttggag ctggtggcgt aggc 24

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

atgcaacgga caagaagatc agta 24

Claims

1.一种检测端粒内氧化性损伤的荧光化学传感器，其特征在于，所述荧光化学传感器至少包括信号探针、捕获探针和辅助探针；

所述信号探针为具有脱嘌呤嘧啶位点的富T单链DNA序列，所述信号探针5'端修饰有生物素，所述信号探针3'端修饰有荧光基团，优选使用AF488进行修饰；

优选的，所述信号探针与链霉抗生物素蛋白包被的磁珠进行缀合；

2.如权利要求1所述的检测端粒内氧化性损伤的荧光化学传感器，其特征在于，所述信号探针的碱基序列如下：

5'-Biotin-TTT TTT TTT XTT TTT TTT-AF488-3'；

其中X代表脱嘌呤嘧啶位点；

所述捕获探针的碱基序列如下：

CCT AAC CCT AAC CCT AAC CCT TTT-Biotin；

所述辅助探针的碱基序列如下：

5'-CCT AAC CCT AAC CCT AAddC-3'；

优选的，所述荧光化学传感器还包括甲酰胺嘧啶[fapy]-DNA糖基化酶、末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)、核酸内切酶IV和T4-多核苷酸激酶。

3.如权利要求1或2任一项所述的检测端粒内氧化性损伤的荧光化学传感器，其特征在于，所述端粒内氧化性损伤包括8-oxoG损伤。

4.基于权利要求1-3任一项所述荧光化学传感器检测端粒内氧化性损伤的方法，其特征在于，所述方法包括：

S1、用dsDNA片段酶消化提取基因组DNA；

S2、加入捕获探针和链霉抗生物素蛋白包被的磁珠孵育处理；

S3、加入TdT进行孵育处理；

S4、加入辅助探针、甲酰胺嘧啶[fapy]-DNA糖基化酶进行孵育处理，；

S6、磁分离后，对上清液进行单分子检测。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤S2中，孵育处理条件为于90～100℃(优选95℃)温育3～8分钟(优选5分钟)。

6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤S3中，孵育处理过程中还加入ddCTP；

孵育处理条件为于30～40℃(优选37℃)孵育20～40分钟(优选30分钟)。

7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤S4中，孵育处理条件为30～40℃(优选为37℃)下孵育40～80分钟(优选为60分钟)。

8.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤S5中，孵育处理条件为30～40℃(优选为37℃)下孵育40～80分钟(优选为60分钟)。

9.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤S6中，采用全内反射荧光(TIRF)技术进行单分子检测；同时，通过荧光分光光度计测量反应产物的荧光光谱；具体为：在488nm的激发波长下测量AF488荧光，并使用532nm的荧光强度进行定量分析。

10.权利要求1-3任一项所述荧光化学传感器和/或权利要求4-9任一项检测方法在检测端粒内氧化性损伤中的应用；优选的，所述端粒内氧化性损伤包括8-oxoG损伤。